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Aus der Universitäts-Augenklinik der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Wirkung eines SDF-1-bindenden Spiegelmers auf die Gefäßneubildung im Mausauge Inaugural-Dissertation zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau vorgelegt 2011 von Meike Bauer geboren in Lindenberg im Allgäu 2 Dekan: Prof. Dr. Dr. h. c. mult. Hubert Blum 1. Gutachter: Prof. Dr. Hansjürgen Agostini 2. Gutachter: Prof. Dr. Antje Aschendorff Jahr der Promotion: 2012 3 Meiner Familie 4 Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung ................................................................................................ 8 1.1 1.1.1 1.1.2 1.1.3 1.1.4 1.1.5 Das Auge .................................................................................................. 8 Aufbau des Auges .................................................................................... 8 Die Blutversorgung ................................................................................... 9 Die Entwicklung des Auges, der Retina und der Chorioidea .................. 10 Vaskulogenese und Angiogenese .......................................................... 11 Entwicklung der retinalen Gefäße beim Menschen und der Maus.......... 13 1.2 Frühgeborenen-Retinopathie (Retinopathia praematurorum) ................. 15 1.3 OIR-Modell ............................................................................................. 18 1.4 AMD ....................................................................................................... 18 1.5 CNV-Modell ............................................................................................ 20 1.6 Chemokine ............................................................................................. 21 1.6.1 SDF-1 und sein Rezeptor CXCR4 .......................................................... 23 1.7 Rolle von SDF-1 bei Mobilisierung und Homing von HSC ...................... 28 1.8 Spiegelmere ........................................................................................... 29 2 Material und Methoden ........................................................................ 32 2.1 2.1.1 2.1.2 2.1.3 2.1.4 2.1.5 2.1.6 2.1.7 OIR-Mausmodell..................................................................................... 32 Sauerstoffinkubation ............................................................................... 33 Anästhesie .............................................................................................. 33 Intraokulare Injektion .............................................................................. 33 FITC-Dextranperfusion ........................................................................... 35 Präparation der Flatmounts .................................................................... 35 Bestimmung des Retinopathie-Scores (RP-Score)................................. 36 Statistik ................................................................................................... 41 2.2 CNV-Mausmodell ................................................................................... 41 2.2.1 Durchführung der Laserung .................................................................... 42 2.2.2 Statistik ................................................................................................... 43 2.3 Nachweis des intravitreal injizierten Stoffes ........................................... 43 2.4 2.4.1 2.4.2 2.4.3 2.4.4 PCR ........................................................................................................ 44 RNA-Isolierung ....................................................................................... 44 Reverse Transkription ............................................................................ 45 PCR-Reaktion......................................................................................... 46 Agarose-Gel-Elektrophorese .................................................................. 47 2.5 Immunhistochemie ................................................................................. 47 5 2.5.1 Verwendeter Mäusestamm ..................................................................... 47 2.5.2 Kryoschnitte ............................................................................................ 48 2.5.3 Immunfärbung ........................................................................................ 48 3 Ergebnisse ............................................................................................ 52 3.1 Immunhistochemischer Proteinnachweis ............................................... 52 3.2 RNA-Nachweis von SDF-1 und CXCR4 in der Retina ............................ 56 3.3 Lokalisierung des intravitreal injizierten Spiegelmers ............................. 58 3.4 Übersicht über die Injektionsversuche im OIR-Mausmodell ................... 59 3.5 SDF-1-Spiegelmer im CNV-Modell ......................................................... 69 4 Diskussion ............................................................................................ 72 4.1 Blockade von SDF-1 und CXCR4 in in vivo-Modellen ............................ 72 4.2 Das SDF-1-Spiegelmer .......................................................................... 80 4.3 Lokalisation ............................................................................................ 82 4.4 SDF-1 und sein Rezeptor CXCR4 .......................................................... 87 5 Zusammenfassung ............................................................................... 90 6 Literaturverzeichnis ............................................................................. 91 7 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis .............................................. 101 7.1 Abbildungen ......................................................................................... 101 7.2 Tabellen................................................................................................ 102 Danksagung .................................................................................................. 103 Lebenslauf………………………………………………………………………………. Ehrenwörtliche Erklärung……………………………………………………………. 6 Abkürzungsverzeichnis A. Arterie, Arteria AMD Altersabhängige Makuladegeneration Angpt2 Angiopoietin 2 BMP4 Bone morphogenetic protein 4 bp Basenpaare CNV Chorioidale Neovaskularisationen CGRP Calcitonin gene-related peptide DME Diabetisches Makula-Ödem EPC Endothelial progenitor cell FITC Fluoresceinisothiocyanat GFP Grün fluoreszierendes Protein HIF1 Hypoxia-inducible factor 1 hIGF Human insulin-like growth factor HMEC Human microvascular endothelial cells HSC Hematopoietic stem cells IGF Insulin-like growth factor IHC Immunhistochemie IL Interleukin LIF Leukemia inhibitory factor MIP Macrophage inflammatory protein MCP Membrane cofactor protein MW Molecular weight NF-KB Nuclear factor-KB NOSs Nitric oxide synthases 7 OIR Oxygen-induced retinopathy PAF Platelet-activating factor PDGF-CC Platelet derived growth factor CC Pecam-1 Platelet endothelial cell adhesion molecule-1 PEDF Pigment epithelium-derived factor PHA Phytohaemagglutinin PKC Proteinkinase C PMA Postmenstrual age ROP Retinopathia praematurorum, Frühgeborenenretinopathie ROS Reactive oxygen species RPE Retinales Pigmentepithel SMC Smooth muscle cells Str. Stratum, Schicht TNF Tumor necrosis factor V. Vena, Vene VCAM Vascular cell adhesion molecule VEGF Vascular endothelial growth factor WG Weeks of gestation ZNS Zentralnervensystem 8 1 Einleitung 1.1 Das Auge 1.1.1 Aufbau des Auges Unsere Augen befähigen uns, elektromagnetische Strahlung mit Wellenlängen zwischen 400 und 750 nm als Licht wahrzunehmen und Hell-/Dunkelkontraste zu unterscheiden. Für den Menschen ist der Lichtsinn von sehr großer Bedeutung. Er ist der Leitsinn, der Menschen und anderen visuell ausgerichteten Lebewesen eine sichere Orientierung ermöglicht. Der Augapfel ist bei Normalsichtigen 23 - 24 mm lang, nahezu kugelförmig, und besteht aus drei Schichten: Tunica interna bulbi (innere Augenhaut): Retina, RPE Tunica vasculosa bulbi (mittlere Augenhaut): Iris, Ziliarkörper und Chorioidea Tunica fibrosa bulbi (äußere Augenhaut): Sklera und Kornea (Sobotta 2003). Die Retina besteht aus neun Schichten und enthält etwa 127 Millionen Photorezeptoren. Die Lichtreize werden von den Photorezeptoren aufgenommen und über Signale an die bipolaren Zellen, Horizontalzellen und amakrinen Zellen an die Ganglienzellen weitergeleitet. Der Sehnerv wird aus deren Axonen gebildet. Das Licht muss zuerst alle Schichten der Netzhaut durchdringen, bis es in den Photorezeptoren einen photochemischen Prozess auslöst und zu einer Hyperpolarisation führt. Die Potentialänderung wird im Anschluss über die bipolaren Zellen an die Ganglienzellen weitergeleitet (Lüllmann-Rauch 2003). In der Area striata werden diese Potentialänderungen zu Seheindrücken verarbeitet. 9 ChK Choriokapillaris PE Pigmentepithel (Retinal pigment epithelium) St+Z Stäbchen und Zapfen (Photoreceptor layer) ÄGr äußere Grenzschicht (External limiting membrane) ÄK äußere Körnerschicht (Outer nuclear layer) ÄP äußere plexiforme Schicht (Outer plexiform layer) IK innere Körnerschicht (Inner nuclear layer) IP innere plexiforme Schicht (Inner plexiform layer) GZ Ganglienzellschicht (Ganglion cell layer) NF Nervenfaserschicht (Nerv fiber layer) Igr innere Grenzschicht (Inner limiting membrane) Abbildung 1 Aufbau der Retina aus Lüllmann-Rauch, 2003 1.1.2 Die Blutversorgung Die Orbita und der Augapfel werden über Äste der A. ophthalmica versorgt. Daneben gibt es am Augapfel drei Gefäßsysteme (Bindehaut-, Netzhaut-, Ziliargefäße). Die inneren Schichten der Netzhaut einschließlich der inneren Körnerschicht werden durch die A. centralis retinae über Kapillarnetze im Str. plexiforme externum, internum und Str. ganglionicum mit Blut versorgt. Ihre Netzhautarteriolen sind Endgefäße. Ein Verschluss der Arteriolen bringt innerhalb von Sekunden die Funktion des versorgten Gebiets zum Erliegen. Das venöse Blut fließt über die Netzhautvenolen in die V. centralis retinae ab, die in die V. ophthalmica superior mündet (Lippert 2002). Die Versorgung der äußeren Retinaschichten erfolgt durch Diffusion aus dem Kapillarnetz der Chorioidea, gespeist durch die Aa. ciliares posteriores und anteriores. 10 50 µm Abbildung 2 Retina Maus (Fluoreszeinperfusion): oberflächliches (links) und tiefes Gefäßnetz (rechts) 1.1.3 Die Entwicklung des Auges, der Retina und der Chorioidea Die Augenbläschen entstehen als Ausstülpung des zukünftigen Dienzephalons. Während die Verbindung zum ZNS aufrechterhalten wird, wachsen die Augenbläschen seitlich gegen das Oberflächenektoderm der Gesichtsregion vor. Die Entwicklung der Linsenplakoden wird durch die Augenblasen (BMP4) induziert. Gleichzeitig entsteht aus dem Augenbläschen ein doppelwandiger Becher. Aus dem proximalen dem Gehirn zugewandten Blatt entstehen das Pigmentepithel sowie die beiden Muskeln der Iris (Lippert 2002). Die Photorezeptoren, die vom Pigmentepithel geschützt werden, entstehen wie die bipolaren Interneurone, amakrinen Zellen, Horizontalzellen, Ganglienzellen und Gliazellen (die ektodermnahen Astrozyten wandern Augenbecheranteil entstehende fötale Augenspalte über (Christ, dringen den Sehnerven Brand-Saberi Blutgefäße ein) 2004). (arterielle aus Durch und dem die venöse Hyaloidgefäße) sowie Mesenchym, das den Glaskörper bildet, in den Augenbecher ein. Nach der Vereinigung der Augenspaltenränder obliterieren die hyaloidalen Gefäße. Nur ihre proximalen Anteile bleiben erhalten und bilden die A. und V. centralis retinae. 11 Nach dem Abschnüren der Linsenbläschen vom Oberflächenektoderm werden diese vom Rand des Augenbechers umschlossen. Das Mesenchym, das den Augenbecher umgibt und sich vorwiegend von Neuralleistenzellen ableitet, wird durch den induzierenden Einfluss des Pigmentepithels zur Differenzierung angeregt und bildet daraufhin eine innere vaskularisierte, später auch stark pigmentierte Schicht, die Chorioidea. Diese ist mit der Pia mater des Gehirns vergleichbar. Außerdem wird eine äußere fibröse, zunächst nur wenig vaskularisierte Schicht gebildet, die Sklera, die sich in die Dura mater des N. opticus fortsetzt (Moll 2005). In der Anlage der Sklera verdichtet sich das Mesenchym und geht am sog. Limbus cornea nahtlos in das Corneastroma über. Im Bereich des Augenbecherrandes wird die Chorioidea modifiziert und bildet dort den Kern der Ziliarkörperfortsätze die hauptsächlich aus Kapillaren bedeckt vom zweischichtigen Ziliarepithel bestehen. Das RPE ist außen fest mit der Chorioidea verwachsen. Der Spalt zwischen den beiden Blättern (Spatium intraretinale) verschwindet, kann jedoch z. B. im Rahmen einer Ablatio retinae wieder auftreten. Zum Zeitpunkt der Geburt ist die Retina weitgehend ausdifferenziert. Eine Ausnahme wird hierbei von der Fovea-Region gebildet. Die Myelinisierung der Optikusfasern ist erst etwa 10 Wochen nach Lichtexposition abgeschlossen. Die Photorezeptoren differenzieren sich in den ersten 4 Lebensmonaten aus, was den Abschluss der Entwicklung des Auges bedeutet. 1.1.4 Vaskulogenese und Angiogenese Die Gefäßbildung beginnt im Embryo in der 3. Schwangerschaftswoche im extraembryonalen Mesoderm von Dottersack, Haftstiel und Chorion. Eine Woche später ist ein frühembryonale funktionstüchtiger Gefäßbildung Blutkreislauf durch vorhanden. Interaktionen zwischen Dabei wird Entoderm die und Mesoderm gesteuert. Durch verschiedene Signalkaskaden werden die endothelialen Progenitorzellen zur Teilung und Migration angeregt. 12 Abbildung 3 Embryonale Vaskulogenese nach Joussen, 2007 Die Abbildung zeigt die Entwicklung des Gefäßsystems während der Embryogenese. Endotheliale Vorläuferzellen formieren sich zu einem primitiven arteriell-venösen Gefäßnetzwerk. Durch Angiogenese vergrößert sich das Netzwerk. Perizyten (PC) und glatte Muskelzellen (SMC) bedecken die entstehenden Endothelkanälchen. Ein typisches organisiertes Gefäßnetzwerk entsteht. Zwei verschiedene Arten der Gefäßneubildung können unterschieden werden. Bei der Vaskulogenese differenzieren sich mesodermale Mesenchymzellen zu Angioblasten. Diese Zellen flachen sich ab und lagern sich zu Gefäßendothelien zusammen, welche ein Lumen begrenzen. Aus den inneren Zellen entstehen die vorläufigen Blutzellen (Christ 1998). Der zweite Mechanismus der Gefäßneubildung wird als Angiogenese bezeichnet, wobei vier Arten unterschieden werden können (Risau 1997). 1. Sprouting angiogenesis (sprossende Angiogenese) Als sprossende Angiogenese wird die Gefäßbildung durch den Abbau umgebener Gewebe mit anschließender Invasion, Migration und Proliferation von Endothelzellen bezeichnet. 2. Intussuszeption (nichtsprossende Angiogenese) Mittels einer Längsteilung gegenüberliegenden der Gefäße Endothelflächen Angiogenese neue Gefäße. über entstehen die durch Einstülpung die von sich nichtsprossende 13 Weitere Mechanismen sind 3. die Formation endothelialer Zellbrücken mit anschließender Auftrennung in einzelne Kapillaren und 4. die Bildung von großen Gefäßen durch die Fusion kleinerer Gefäße. Die Gefäßneubildung durch Sprossung gefäßbildender Zellen erfolgt in zelldichten Geweben, z. B. bei der Anlage des Nervensystems. Periendotheliale Zellen, wie Perizyten, Fibrozyten, Myofibroblasten, Myoblasten und Adventitiazellen, umhüllen im weiteren Verlauf die Gefäßbäume. Die Zellen können sich, im Unterschied zu den Endothelzellen, entweder aus allen Mesodermkompartimenten oder aus der Neuralleiste entwickeln. Astrozyten gehören der Makroglia an und sind ektodermalen Ursprungs. Die Fortsätze der Astrozyten bedecken die Kapillaren und sind an der Bildung der Blut-Retina-Schranke beteiligt. Im adulten Organismus findet die Bildung neuer Gefäße durch die Rekrutierung von Progenitorzellen (EPC und Myeloidzellen) aus dem Knochenmark statt. Die Freisetzung von proangiogenen Faktoren, die zu Gefäßneubildung durch Proliferation, Migration und Gefäßformation bereits bestehender reifer endothelialer Zellen führen, wird durch Knochenmarkprogenitorzellen stimuliert. 1.1.5 Entwicklung der retinalen Gefäße beim Menschen und der Maus Das retinale Gefäßsystem wird beim Menschen hauptsächlich im zweiten und dritten Trimester gebildet und findet seinen Abschluss nach der Geburt. Im frühen Verlauf wird die Retina von der Chorioidea und von hyaloidalen Gefäßen versorgt. Durch die Weiterentwicklung und Differenzierung der neuronalen Zellschichten findet sich die Retina in einer hypoxischen Umgebung wieder und ist deshalb auf eine eigenständige Gefäßversorgung angewiesen. Zu Beginn der Entwicklung formen die Gefäße drei Gefäßplexus. 14 Zuerst wird der oberflächliche Gefäßplexus in der Ganglienzellschicht gebildet. Dieser wächst radial von der Optikuspapille in Richtung Peripherie. Im weiteren Verlauf bilden sich der mittlere Plexus am inneren Rand der inneren Körnerschicht und der tiefe Plexus am äußeren Rand der inneren Körnerschicht aus. Dabei werden sowohl der tiefe wie auch der mittlere Plexus durch Angiogenese gebildet. Als eine Antwort auf die steigende Hypoxie wird von RPE, Müllerzellen, retinalen Astrozyten und Photorezeptoren ein Cytokingradient produziert, sowie die VEGF-, NOSs- und IGF-1-Expression dieser Zellen gesteigert (Foulds 2010). Daraus resultiert ein Wachstum der oberflächlichen Gefäße in Richtung tiefere Gefäßschichten (Risau 1997). Im Gegensatz zum Menschen haben Mäuse bei der Geburt ein unreifes retinales Gefäßnetz und persistierende hyaloidale Gefäße. Zum Zeitpunkt der Geburt entspricht der Entwicklungsstand des murinen retinalen Gefäßsystems dem eines Feten in der 16. - 20. Schwangerschaftswoche. Am 7. Lebenstag zeigt dabei das murine retinale Gefäßsystems große Ähnlichkeit mit dem Frühgeborener. Die hyaloidalen Gefäße haben sich in diesem Stadium bereits sehr weit zurückgebildet, was physiologisch in der ersten Lebenswoche geschieht (Smith 1994). In der neonatalen Maus vollzieht sich die Gefäßentwicklung in den ersten 3 Wochen nach der Geburt. Dabei wird der oberflächliche Gefäßplexus in den ersten 10 Tagen gebildet. Das tiefe Gefäßnetz entsteht in der zweiten Woche ab Tag 8 durch Knospung und Sprossung des oberflächlichen Gefäßnetzes und findet seinen Abschluss am Tag 12. 15 Frühgeborenen-Retinopathie (Retinopathia praematurorum) 1.2 Die Retinopathia praematurorum (ROP) gewinnt durch die zunehmende Anzahl von frühgeborenen Babys, deren Leben durch verschiedene Maßnahmen gesichert werden, auch in den Industrieländern an Bedeutung. Sie betrifft vor allem frühgeborene Babys mit einem niedrigen Geburtsgewicht und zusätzlicher Sauerstoffgabe. Eine verzögerte postnatale Gewichtszunahme, Mangelernährung, Schwankungen im Sauerstofflevel, die Höhe des Sauerstofflevels und die Zeitdauer der Sauerstoffzufuhr scheinen ebenfalls einen Einfluss auf die Entwicklung und Progression der ROP zu nehmen (Penn 1993; Cunningham 1995; York 2004; Stahl 2010) Ebenso wird die fördernde Rolle genetischer Faktoren diskutiert (Hiraoka 2001; Chen 2007). Die retinale Vaskulogenese beginnt in der 16. Gestationswoche (4. Gestationsmonat) und findet ihren Abschluss in der 40. Gestationswoche (10. Gestationsmonat). Zum regelrechten Geburtstermin ist deshalb die Retina komplett vaskularisiert. Im Gegensatz dazu ist die Retina von Frühgeborenen unvollständig vaskularisiert und besitzt eine periphere avaskuläre Zone (Hughes 2000). Die pathophysiologische Entwicklung der Retina kann in zwei Phasen eingeteilt werden: Phase 1: Hyperoxieinduzierter Gefäßwachstumsstop – Geburt bis 30. Woche postmenstrual Age (PMA) Phase 2: Hypoxieinduziertes Gefäßwachstum – ab 32./34. Woche PMA Die Phase 1 wird gekennzeichnet durch die oxidative Zerstörung des Gefäßendothels, der Downregulation von angiogenetischen Faktoren wie VEGF und IGF-1 und die Upregulation von antiangiogenetischen und modulierenden Faktoren (ROS, PAF, PEDF, Wachstumsstopp. Endothelin). Durch die Aus erhöhte der Gefäßschädigung O2-Konzentration resultiert unterbleibt ein das Gefäßwachstum in Richtung Netzhautperipherie (Ora serrata). Dabei muss keine Sauerstoffbehandlung (z. B. bei Atemnotsyndrom) erfolgt sein. 16 Oftmals reicht die O2-Konzentrationsdifferenz zwischen intra- und extrauterin aus, um das Gefäßwachstum zu stoppen. Durch die entstehende Hypoxie aufgrund mangelnder Gefäßversorgung (Phase 2) wird die Netzhautperipherie ischämisch. Dies hat eine erhöhte Expression verschiedener Faktoren (z. B. HIF1, Angpt2, VEGF) zur Folge. In der zweiten Phase kommt es durch einen Kompensationsmechanismus zur Förderung des Wachstums pathologischer Gefäße. Die Gefäßneubildung beginnt dabei an der Grenze zwischen vaskularisierter und nicht-vaskularisierter Retina. Die pathologischen (fragilen) Gefäße können sodann in den Glaskörper einsprossen und über Blutungen und Bindegewebsstrangbildung zur Traktionsablatio führen. Das klinische Bild der frühgeborenen Retinopathie ist durch eine akute Phase in den ersten Lebensmonaten, oft mit rasanter Befundverschlechterung, gekennzeichnet. An diese Phase kann sich eine lebenslange Narbenphase anschließen. Reife Neugeborene, mit einer Netzhautvaskularisation bis zur Ora serrata, entwickeln trotz Sauerstoffbeatmung keine Retinopathie. Dagegen findet man bei 20 % der frühgeborenen Kinder mit einem Geburtsgewicht von 500 – 800 g eine Retinopathia praematurorum. Ein Viertel dieser Kinder erblinden. 17 Stadieneinteilung der Frühgeborenenretinopathie (ROP) Stadien Plus-Disease Stadium1 Demarkationslinie Iris-Gefäßerweiterung Stadium2 Prominente Leiste, ggf. vaskularisiert Rigide Pupille Stadium3 Leiste und extraretinale Proliferation Glaskörpertrübung Stadium4 Extraretinale Proliferation und Ablatio retinae Tortuositas d. Retinagefäße Stadium5 Totale Ablatio Blutungen Typ-1-ROP Frühzeitige Koagulation! Zone-I-ROP Jedes Stadium mit Plus-Disease Zone-II-ROP Stadium 3 mit oder ohne Plus-Disease Zone-III-ROP Stadium 2 oder 3 mit Plus-Disease Typ-2-ROP Engmaschige Kontrollen! Zone-I-ROP Stadium 1 oder 2 ohne Plus-Disease Zone-II-ROP Stadium 3 ohne Plus-Disease Tabelle 1 Stadieneinteilung der Frühgeborenenretinopathie (ROP) aus Grehn, 2008 Zone 1: 2fache Makulapapillendistanz; Zone 2: Kreis mit einem Radius von der Papille bis zur nasalen Ora serrata; Zone 3: alles jenseits davon. Die Therapie der ROP erfolgt mit Laserkoagulation, in fortgeschrittenen Stadien mit Vitrektomie. Wichtiger sind die Prophylaxe durch Kontrolle des O2-Partialdrucks bei der Beatmung Frühgeborener und regelmäßige Funduskontrollen. 18 1.3 OIR-Modell Das OIR-Mausmodell wurde in der jetzigen Form 1994 von Smith et al. etabliert. Es ermöglicht qualitativ und quantitativ, durch Ischämie entstandene Gefäßneubildungen am Auge zu reproduzieren und so die Ursachen dieser Gefäßneubildungen zu erforschen und neue Therapieansätze zu entwickeln (Smith 1994). Für eine detaillierte Darstellung siehe Kapitel „Material und Methoden“. Durch die systemische (intravenöse) oder lokale (intravitreale oder subretinale) Injektion verschiedener angiogenwirksamer Substanzen am Tag 7 oder 8, bevor sich das tiefe Gefäßnetz zu bilden beginnt, kann die Wirkung der Substanz auf die Bildung des tiefen Gefäßnetzes in vivo gut abgeschätzt werden. Ebenso können toxische Auswirkungen auf das bereits bestehende oberflächliche Gefäßnetz beurteilt werden (Smith 1994; Joussen 2007). Nach der Exposition von neugeborenen Tieren mit Sauerstoff kommt es zu einem sofortigen Rückgang, bzw. einer Verzögerung der Gefäßentwicklung. Eine pathologische Neovaskularisation bei normaler Sauerstoffkonzentration in der Luft folgt ihr. Der Rückgang, bzw. die Verzögerung der Gefäßentwicklung aufgrund der hypoxischen Bedingungen wird auf die Reduktion von VEGF zurückgeführt. Verminderte VEGF-Konzentrationen führen zur Apoptose von Endothelzellen und somit der Gefäße. Nach Zurückverlagern der Mäuse an die Raumluft werden vermehrt Gefäßwachstumsfaktoren wie VEGF und SDF-1 ausgeschüttet (Gao 2001; Butler 2005; Ehlken 2007). Es kommt zu retinalen Neovaskularisationen. Dieses Modell spiegelt die Vorgänge bei der Frühgeborenen-Retinopathie und der ischämischen Retinopathie wieder. 1.4 AMD Die altersabhängige Makuladegeneration (AMD) ist die häufigste Erblindungsursache im Alter über 65 Jahre. Durch die Anhäufung von Stoffwechselprodukten wird die Macula lutea („gelber Fleck“) zerstört, woraus ein irreversibler Sehverlust resultiert (Grehn 2008). 19 Als Risikofaktoren für die AMD sind Rauchen, Alter > 50 Jahre, sowie eine genetische Disposition. Bei der späten AMD gibt es zwei Formen: die trockene (nichtexsudative, atrophe) und die feuchte (exsudative, neovaskuläre) Makuladegeneration, wobei zu 80 – 85 % der Patienten an der trockenen Form leiden (Moshfeghi, Lewis 2003). Die trockene Form der AMD beginnt mit der Bildung von Drusen, welche meist noch nicht die Sehschärfe beeinflussen. Der Großteil der Patienten mit Drusen entwickeln keine AMD, doch sind Drusen in der Frühphase der AMD der häufigste Befund. Lipofuscin entsteht intrazellulär als Abfallprodukt u. a. aus der (Per-)Oxidation von Lipiden und Proteinen. Lipofuscin hemmt den liposomalen Abbau und führt zu einer verminderten Autophagie was auf Dauer das RPE schädigt. Durch Ablagerung von Proteinen, Membranbestandteilen und Lipiden unter dem retinalen Pigmentepithel entstehen die sogenannten Drusen. Mit der Zeit können die Drusen zusammenfließen. In der Spätphase der AMD kommt es zum Verlust des RPEs und Degeneration der Photorezeptoren mit Verlust der Sehschärfe. Diese trockene AMD führt normalerweise nicht zum plötzlichen Sehverlust, kann jedoch in die feuchte Form übergehen. Die Ursache der „feuchten“ AMD sind chorioidale Neovaskularisationen (CNV). Die chorioidalen Neovaskularisationen enthalten neugebildete „unreife“ Blutgefäße, die von der Aderhaut ausgehen, die Bruchmembran durchdringen und in Richtung RPE bzw. unter die neurosensorische Retina wachsen. Diese können sich ausdehnen und zu Flüssigkeitsleckagen führen. Hämorrhagische Abhebungen des RPEs, Exsudatanhäufung, intraretinale Blutungen und Makulanarben können die Folge sein. Unbehandelt führen die Gefäßneubildungen der Aderhaut zu einem irreversiblen Sehverlust. Dieser Prozess kann schnell voranschreiten und zu einem dauerhaften Sehverlust führen. 20 Neben VEGF spielen bei der Bildung chorioidaler Neovaskularisationen unter anderem IGF-1, CCL2 und macrophage derived tissue factor eine bedeutende Rolle. IGF-1 und SDF-1 sind in der Lage die VEGF-Produktion zu stimulieren (Rosenthal, Strauss 2003). IGF-1 wird von Neuronen und im RPE gebildet. Durch CCL2 werden Makrophagen an die Oberfläche des retinalen Pigmentepithels gelockt. Diese produzieren gemeinsam mit dem RPE VEGF, um die Angiogenese zu initiieren, bzw. aufrechtzuerhalten. SDF-1 ist für die Rekrutierung von zirkulierenden Endothelprogenitorzellen verantwortlich. Diese Zellpopulation ist ebenso vermehrt bei Patienten mit aktiver CNV zu finden (Yodoi 2007). Zur Therapie der AMD werden deshalb Substanzen wie Ranizumab (VEGF-A-Inhibitor) eingesetzt, um die Gefäßneubildung zu hemmen. Eine Hemmung von SDF-1 könnte somit ebenfalls ein Ansatzpunkt sein, die Bildung von CNV zu verhindern bzw. zu verlangsamen. Zur Therapie der „feuchten“ AMD mit chorioidalen Neovaskularisationen stehen zusätzlich die Laserkoagulation und die photodynamische Therapie zur Verfügung (Emminger 2007). 1.5 CNV-Modell Das am häufigsten verwendete Tiermodell zur Untersuchung chorioidaler Neovaskularisationen ist das laserinduzierte CNV-Modell bei Ratte und Maus. Das laserinduzierte CNV-Modell ist ein sehr gut reproduzierbares Modell. Das Durchdringen der chorioidalen Gefäße durch die Bruchmembran, Akkumulation von subretinaler Flüssigkeit, die Ansammlung von Leukozyten, die fibrovaskuläre Narbenbildung, die Rekrutierung von Makrophagen, sowie das Ansteigen von VEGF im retinalen Pigmentepithel sind Merkmale, die bei der „feuchten“ Form der AMD vorkommen, und sich auch im CNV-Modell wiederfinden lassen (Penn, Yanni 2007). 21 1.6 Chemokine Cytokine sind wichtige Proteine der interzellulären Kommunikation in multizellulären Organismen. Die Zellproliferation, -differenzierung, -reifung und der Zelltod werden über diese Polypeptide reguliert (Balkwill 1998). Cytokine können in vier große Gruppen eingeteilt werden: Wachstumsfaktoren, Interleukine, Interferone und Chemokine. Dabei ist die Chemokinfamilie die größte bekannteste Gruppe der Cytokine. Es gibt zwei große Familien der Chemokine: die CC-Chemokine (MCP1-5, MIP1, etc.) und die CXC-Chemokine (IL8, SDF-1, etc.). Bei den CC-Chemokinen liegen zwei konservierte N-terminal lokalisierte Cysteine direkt nebeneinander. Bei den CXC-Chemokinen befindet sich zwischen den beiden Cysteinen noch eine weitere Aminosäure. CXC-Chemokine binden an Rezeptoren mit der Bezeichnung CXCR, CC-Chemokine hingegen an CCR-Rezeptoren. Daneben bestehen noch zwei kleinere Chemokinfamilien: XC-Chemokine und CX3C-Chemokine (Löffler 2007). CC-Chemokine (CCL1 bis CCL28) CXC-Chemokine XC-Chemokine (CXCL1 bis 15) Eotaxine Macrophage inflammatory proteins (MIP) Interleukin 8 (CXCL8) Chemokine Lymphotactin Fractalkin (XCL1) (CX3CL1) Stromal derived factor 1 (CXCL12) Regulated on activation, normal T-cell Growth related expressed and secreted (RANTES) oncogens (GRO) CX3C- Monocyte chemoattractant proteins (MCP) Tabelle 2 Die vier Chemokinfamilien aus Löffler u. Petrides, 2007 22 Cytokine sind Polypeptide und wirken para- oder autokrin. Chemokine sind normalerweise in ruhenden Zellen nicht vorhanden (Balkwill 1998). Durch bestimmte Reize und Noxen werden sie schnell synthetisiert und sezerniert. Ein typischer Induktionsreiz erfolgt durch proinflammatorische Cytokine wie z. B. TNF-α, LIF, Hypoxie und einer großen Anzahl von bakteriellen Modulatoren, wie Lipopolysaccaride und Thrombin. IL10 regelt das Cytokinnetzwerk herunter, was die Chemokinproduktion inhibieren kann. Dagegen ist das Glukokortikoid Dexamethason ein spezieller Inhibitor der CCund CXC-Produktion. Zudem ist bekannt, dass eine hohe Chemokinkonzentration die Chemokinaktivität limitieren kann (Balkwill 1998). Chemokine (Chemotactic cytokine) sind, im Vergleich zu anderen Cytokinen, sehr klein (7000 - 10000 MW) und bestehen aus 70 bis 80 Aminosäuren. Die Gene der CXC Chemokine liegen auf dem Chromosom 4q12-q21, die Gene der CC Chemokine auf dem Chromosom 17q11-q21 (Balkwill 1998). Chemokine sind in ihrer aktiven Form Homodimere. Die Strukturen der Monomere für CC und CXC Chemokine sind sehr ähnlich, unterscheiden sich jedoch in der Dimerstruktur (Ganten, Bader 2003). Die Wirkung der Chemokine erfolgt über G-Protein-gekoppelte Rezeptoren. Die Rezeptoren besitzen sieben Transmembrandomänen. Die extrazelluläre Schleife des Rezeptors ist für die Ligandenbindung verantwortlich, über die intrazelluläre Schleife wird das Signal an das heterotrimere G-Protein weitergegeben. Dabei wird an der alpha-Untereinheit des heterotrimeren G-Proteins GDP mit GTP ausgetauscht. Die aktivierte alpha-Untereinheit interagiert anschließend mit verschiedenen Effektorproteinen (z. B. Adenylatcyclase) und kann auf diese einen hemmenden (GiProtein) oder fördernden Einfluss (Gs-Protein) ausüben. Die Chemokinsignale bewirken schlussendlich eine Transkription ihrer Zielgene, welche in Zellinvasion, -bewegung, -interaktion mit Extrazellularmatrix und im Überleben der Zelle involviert sind (Balkwill 2004). 23 Chemokine sind vor allem bei Entzündungsprozessen, Regulation des Stammzellwachstums, Angiogenese, sowie dem homöostatischen Transport von hämatopoetischen Stammzellen (HSC), Lymphozyten und dendritischen Zellen beteiligt (Balkwill 1998). Doch auch in der frühen Embryonalentwicklung spielen sie schon eine entscheidende Rolle (Broxmeyer 2008). Die Zellbewegung findet hierbei entlang eines chemischen Gradienten – dem Chemokingradienten – statt, der von gewebeständigen Leukozyten, Fibroblasten, endothelialen und epithelialen Zellen erzeugt wurde. Die Verteilung der Chemokinrezeptoren und die Expression der Liganden im Gewebe korreliert im Allgemeinen mit der Anzahl und der Art der Leukozyten, die ein Gewebe infiltrieren. Dabei können gesunde wie maligne Zellen Chemokingradienten erzeugen. Die Synthese der Chemokine wird durch inflammatorische Cytokine, Wachstumsfaktoren und pathogene Stimuli Chemokinrezeptoren kann das Ergebnis einer induziert. Das Fehlen von Downregulation durch hohe Chemokinkonzentrationen und inflammatorischen Cytokinen (TNF-) sein (Balkwill 2004). 1.6.1 SDF-1 und sein Rezeptor CXCR4 Bis heute wurden über 50 Chemokine identifiziert, die an 18 Siebentransmembranrezeptoren gebunden werden. Jeweils nur ein Cytokin wird von sechs Rezeptoren gebunden: CXCR4, CXCR5, CXCR6, CCR6, CCR9, CX3CR1. SDF-1, auch als CXCL12 bezeichnet, ist der einzige Ligand des CXCR4-Rezeptors. Neben CXCR4 wird SDF-1 auch vom CXCR7-Rezeptor gebunden. Das LigandenRezeptoren-Paar SDF-1/CXCR4 unterscheidet sich von anderen Chemokinen und ihren Rezeptoren durch das Fehlen von Redundanz und Pleiotropismus (Hildebrandt, Schabath 2008). 24 Mitglieder der VEGF-, SDF-1- und IGF1-Familie werden u. a. durch Hypoxie reguliert und beeinflussen so das Verhalten von Gefäßendothelien, HSC und EPC. SDF-1 wird an den CXCR4-Rezeptor gebunden und führt über den Signalweg PI3K/Aktzu Reendothelialisierung und RAS- Zellmigration, und zur Reparatur von Gefäßkapillaren. Abbildung 4 Signalkaskaden von VEGFR1/2, IGF1R und CXCR4 nach Afzal, 2007 Der Ligand SDF-1 SDF-1 ist ein hochkonserviertes Gen, das auf Chromosom 10q11.1 liegt. Die Sequenz ist ungewöhnlich stark zwischen den Spezies konserviert. Zwischen Maus und Mensch gibt es lediglich eine Substitution von Isoleucin (Ile) nach Valin (Val) (Shirozu 1995). SDF-1 besitzt drei verschiedene Splicevarianten SDF-1, SDF-1 und SDF-1y. Diese Splicevarianten unterscheiden sich in der Anzahl der Aminosäuren (Gleichmann 2000). SDF-1 besitzt vier zusätzliche Aminosäuren am C-Terminus, SDF-1y wird aus 67 Aminosäuren gebildet und wird erst im erwachsenen Stadium stärker exprimiert. Dagegen sind SDF-1 und SDF-1 embryonal prädominant (Shirozu 1995). Einige Studien zeigten keine funktionellen Unterschiede zwischen SDF-1 und SDF-1. 25 Myofibroblasten und Gefäßendothelzellen sind die beiden Zellarten, die hauptsächlich SDF-1 exprimieren. SDF-1 wird jedoch konstant von den meisten Organen wie dem normalen Nierengewebe (distaler Tubulus) exprimiert. Leberzellen produzieren SDF-1 zellzyklusabhängig. Die Höhe der Expression von CXCR4 im Gewebe beeinflusst die Aktivität von SDF-1. Durch FGF2 und P53 wird die Produktion von SDF-1 downreguliert, bzw. unterdrückt. Nanomolare Mengen von SDF-1 induzieren über einen PKC (Proteinkinase C)abhängigen und VEGF-unabhängigen Mechanismus HO1 in Endothelzellen. Dabei soll ein in CXC-Chemokinen vorkommendes Aminosäurenmotiv (E-L-R), wie z. B. in IL8, mit der Angiogenesestimulation assoziiert sein. Chemokine, denen dieses Motiv fehlt (z. B. IP10), können hemmend auf die Angiogenese wirken (Balkwill 1998, Mirshahi 2000). Tachibana et al. konnten in Knockout-Versuchen zeigen, dass ein Fehlen von CXCR4 oder SDF-1 zu schweren Gefäßfehlbildungen führt, was die Bedeutung von SDF-1 in der Angiogenese unterstreicht (Tachibana 1998). Neben Angiogenesefaktoren wie VEGF, FGF2, PDGF-CC und Angiopoietin-2 ist SDF-1 als ein Chemoattractant für hämatopoetische Progenitorzellen bekannt, der die Migration von Endothelzellen induziert und somit an der Angiogenese beteiligt ist (Joussen 2007). Zirkulierende Endothelvorläuferzellen wandern als Antwort auf die SDF-1-Expression zum Ort der Neovaskularisation, um an dieser teilzunehmen (Brooks 2004). Eine große Bedeutung kommt SDF-1 bei der Entstehung von Tumoren, Metastasen und hämatopoetischen Erkrankungen zu. SDF-1 wird u. a. von Fibroblasten des Brusttumorstromas sezerniert. SDF-1 ist essentiell für das Tumorwachstum, da es über den CXCR4 Rezeptor die Zellproliferation und Migration stimuliert (Orimo 2005). So wird auch das Wachstum von kolorektalen Metastasen durch eine Beschleunigung der Angiogenese und Induktion der Tumorzellproliferation sowie Inhibition der Apoptose durch SDF-1 gefördert (Arbogast 2008). Als Inhibitor von SDF-1 wurde von Hachet-Haas et al. Chalcone 4 beschrieben. Chalcone 4 zeigt eine antiinflammatorische Wirkung durch Bindung an SDF-1, im Gegensatz zu bekannten pharmakologischen Agenzien wie AMD3100, ALX40-4C oder T22/T140, die an den CXCR4-Rezeptor binden (Hachet-Haas 2008). 26 Der Rezeptor CXCR4 CXCR4 ist ein G-protein-gekoppelter Transmembranrezeptor mit 7-TransmembranDomänen. Der NH2-Terminus dieser Rezeptoren befindet sich extrazellulär, der CTerminus intrazellulär. Im Gegensatz zu anderen Chemokinrezeptoren bindet CXCR4 spezifisch nur SDF-1. Die Bindung von SDF-1 an CXCR4 erfolgt in zwei Stufen: 1. Stufe: Interaktion der N-terminalen Region mit den Aminosäuren 12–17 von SDF-1 2. Stufe: Bioaktive Konformation des Rezeptors (Crump 1997). In neben stehender Abbildung ist SDF-1 und sein Rezeptor CXCR4 abgebildet (links). CXCR4 ist ein 7Transmembranrezeptor mit einem Nund C-terminalen Ende. Nach Bindung von SDF-1 (mittig) kommt es zu einer Konformationsänderung des Rezeptors und so zur Aktivierung (rechts). Abbildung 5 Modell für die Interaktion von SDF-1 mit dem CXCR4-Rezeptor nach Crump, 1997 CXCR4 wird von Tumorzellen vieler solider und hämatopoetischen Tumoren (u. a. Brust-, Ovarial-, Prostata-, Pankreas-, Schilddrüsen-Ca., CLL) exprimiert. Er ist der meist exprimierte Rezeptor auf Tumorzellen von Mensch und Maus. Die CXCR4Expression geht mit einer steigenden Tumoragressivität einher (Balkwill 2004). Eine physiologische Expression von CXCR4 findet durch HSC, Thymocyten, T-Zellen, B-Zellen, unreife und reife dendritische Zellen, einige Endothelien, Makrophagen und Neutrophile statt. 27 Die Expression des CXCR4-Rezeptors kann schnell durch Hypoxie, hIGF, VEGF, NF-KB und Östrogene induziert und durch IL2 oder Phytohaemagglutinin (PHA) über eine T-Zell-Stimulation, hochreguliert werden (Balkwill 1998, 2004). Ebenso führt ein Verlust des von Hippel-Lindau Gens (Vhlh) zu einer vermehrten CXCR4-Expression (Broxmeyer 2008). Die VEGF-Expression wird über den PI3K/Akt-Signalweg mittels Phosphorylierung von Akt durch CXCR4 induziert. Liang et al. zeigten, dass über den SDF1-Signalweg, mit der Folge einer steigenden VEGF-Expression, die Angiogenese und die Tumorprogression durch die Aktivierung des PI3K/Akt-Pathways gefördert wird. Dabei phosphoryliert SDF-1 Akt konzentrationsabhängig. Neben dem PI3K/AktSignalweg wird auch über den Her2/Neu-Signalweg die VEGF-Transkription gesteigert (Liang 2007). Über den Dll4-Signalweg kann eine Downregulation des VEGF2- und CXCR4-Rezeptor induziert werden. Da Dll4 bei Hypoxie verstärkt exprimiert wird, spielt der Dll4-Signalweg aus diesem Grund eine Rolle bei der Regulation der Angiogenese (Williams 2008). Der Abbau erfolgt mittels Endozytose durch die Zielzelle und anschließender Protolyse. Die Endozytose von CXCR4 geschieht über Clathrin-bedeckte Einsenkungen. Dieser Prozess findet kontinuierlich statt und kann bei Bedarf beschleunigt werden (Begley 2005). 28 1.7 Rolle von SDF-1 bei Mobilisierung und Homing von HSC Hämatopoetische Stammzellen werden durch verschiedene Signalmoleküle aufgefordert, sich zu differenzieren, in die Peripherie zu wandern und an der Neovaskularisation teilzunehmen. Eine Gefäßschädigung bewirkt über die Ausschüttung des granulocyte colony stimulating factors (G-CSF) die Freisetzung von Signalmolekülen wie SDF-1, VEGF und IL8 (Li Calzi 2010). Diese Moleküle geben, nachdem sie über die Blutzirkulation ins Knochenmark gelangt sind, einen Mobilisierungsbefehl ab. Alle drei Faktoren, SDF-1, IL8 und VEGF, sind an der Freisetzung und Differenzierung von hämatopoetischen Stammzellen beteiligt. Über weitere Mechanismen kommt es zur Differenzierung der HSC in multipotente und anschließend in endotheliale Progenitorzellen. Durch eine hohe Konzentration an Mobilisierungsfaktoren im Bereich der geschädigten Gefäße werden die EPC dazu veranlasst, die Blutzirkulation zu verlassen und sich an den Reparations- und Regenerationsprozessen zu beteiligen. Durch Brunner et al. konnte bei der diabetischen proliferativen Retinopathie ein dramatischen Anstieg von CD34+Endothelprogenitorzellen nachgewiesen werden (Brunner 2009). Endotheliale Zellen in sich entwickelnden Gefäßbetten exprimieren den SDF1-Rezeptor CXCR4 (Gupta 1998). CD34-positive Zellen exprimieren CXCR4 und reagieren auf SDF-1 mit einer Migration. In endothelialen Zellen steigt die CXCR4Expression nach Exposition mit VEGF oder FGF2 an. Jeder Expression von SDF-1 folgt einer Mobilisierung von hämatopoetischen Stammzellen vom Knochenmark ins jeweilige Gewebe. SDF-1 reguliert die Adhäsion von Progenitorzellen in vitro und in vivo. Eine bedeutende Rolle spielt SDF-1 bei der Differenzierung der Progenitorzellen zu reifen Endothelzellen z. B. im Rahmen von Reparationsprozessen bei Gefäßschäden. Vor allem die Regeneration von Gewebe und Organen ist von der Rekrutierung der Progenitorzellen abhängig. CXCR4 wurde auf CD34+ Progenitorzellen aus dem Knochenmark, im peripheren und im Nabelschnurblut nachgewiesen. 29 Für das Homing von Stammzellen werden durch SDF-1 HSC/HPC stimuliert, die daraufhin Integrine, wie very late antigen 4 (VLA-4) und hyaluronan binding cellular adhesion molecule (CD44) exprimieren. Durch die Interaktion mit dem vascular cell adhesion molecule 1 (VCAM-1), intercellular adhesion molecule 1 (ICAM-1) sowie E- und F-selectin, welche auf den Endothelzellen des Knochenmarks exprimiert werden, werden die zirkulierenden HSC/HPC über das sogenannte „Rolling“ an der Gefäßwand abgebremst und über weitere Schritte (Adhäsion und transendotheliale Migration) in die Stammzellnische des Knochenmark zurückgeführt (Li Calzi 2010). 1.8 Spiegelmere Spiegelmere® sind L-Oligonukleotide, entwickelt von der NOXXON Pharma AG. Sie stellen das Spiegelbild zu den Aptameren mit einer D-RNA-Konfiguration dar. NOXXON Pharma AG vereint dabei SELEX (selection of ligands by exponential enrichment) mit ihrer chemischen „mirroring technology“ (Spiegelmer-Technology), einem Verfahren, das zur in vitro Synthese von Spiegelmeren entwickelt wurde. Aptamere sind kurze einzelsträngige Nukleinsäure-Oligomere (RNA oder ssDNA). Sie leiten sich vom lateinischen aptur (=passend) und dem griechischen meros (=Teil) ab, was das „Schlüssel-Schloss-Prinzip“ zwischen den Aptameren und ihren Bindungspartner veranschaulichen soll. Aptamere können über ihre dreidimensionale Struktur ein spezifisches Molekül erkennen und dieses exakt – analog einer AntigenAntikörper-Bindung - binden. Die Aptamer-Target-Bindung erfolgt dabei über elektrostatische Wechselwirkungen, Wasserstoffbrückenbindung oder „Stacking Interactions“. Stacking Interactions treten bei aromatischen Ringstrukturen Elektronenwechselwirkungen Ringstrukturen. mit auf und bezeichnen Stapelkräfte pi-Elektronensystemen durch aromatischer 30 Aptamere erreichen eine sehr hohe Bindungsspezifität und –affinität. Natürliche DRNA-Aptamere sind jedoch äußerst labil in biologischen Flüssigkeiten und benötigen stabilisierende Modifikationen an den Ribose-Einheiten. Die Modifikation aller Ribose-Einheiten ist jedoch nicht immer möglich, da dies die Bindungseigenschaften beeinträchtigen kann. Spiegelmere, hingegen sind biostabil. Die bisherigen präklinischen und klinischen Studien deuten auf eine gute Verträglichkeit und keine Immunstimulation hin. Das generelle Prinzip von Selex: 1 Herstellung eines Pools von Oligonukleotiden und anschließender Inkubation mit dem Target 2 Selektion der Oligonukleotide, die eine Bindung mit Target eingegangen sind, und Entfernung der noch freien Oligonukleotide 3 Extraktion der gebundenen Sequenzen 4 Amplifikation der wiedererlangten Sequenzen mit Hilfe von (RT-)PCR und erneutes Eintreten in den Zyklus, um Sequenzen zu spezifizieren 5 Klonierung, Sequenzierung, Test der Affinität der Aptamere (Pestourie 2005) Angewendet werden Aptamere in der Medizin, um gezielt einzelne Proteine auszuschalten. Im Bereich der Augenheilkunde wurde 2006 Pegaptanib (RNA- Aptamer) zugelassen, das sehr spezifisch mit einer hohen Affinität an VEGF bindet und so bei der Behandlung der AMD Anwendung findet (Ng 2006). Das Besondere an den von NOXXON entwickelten Spiegelmeren ist, dass ihnen durch ihre L-RNAKonfiguration besonders viel Stabilität in allen biologischen Milieus verliehen wird, da die natürlich vorkommenden Nukleasen diese nicht abbauen können. 31 Abbildung 6 Reziproke Spezifität von (D-) Aptamer und (L-) Spiegelmer Die Spiegelmer-Technologie stellt eine Erweiterung des oben dargestellten SELEX-Prozesses dar: Zunächst wird eine Aptamer-Selektion gegen das Spiegelbild des gewünschten Targets durchgeführt. Im Falle eines Peptides als Target, wird dieses aus D-Aminosäuren chemisch hergestellt. Die durch den SELEX-Prozess erhalten Aptamere binden somit an ein unnatürliches Spiegeltarget. Synthetisiert man die Aptamere nun aber aus spiegelbildlichen Bausteinen (L-Nukleotiden), erhält man ein Spiegelmer, das mit gleichen Eigenschaften an das natürlich konfigurierte Target bindet. Spiegelmere wurden entwickelt, um spezifisch an extrazelluläre Moleküle (z. B. Chemokin) - analog zu einem Antikörper - zu binden. Jedoch sind Spiegelmere auch in der Lage, intrazelluläre Prozesse zu beeinflussen (NOXXON Pharma AG 2008). 32 2 Material und Methoden 2.1 OIR-Mausmodell Zum Nachweis der Wirkung des SDF-1-Spiegelmers und des SDF-1-Antikörpers in vivo wurde das OIR-Mausmodell verwendet. Alle Versuche wurden von der Tierschutzkommission der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg genehmigt. Sieben Tage nach der Geburt (p7) wurden die Mäuse (C57BL/6J, Jackson Laboratories) samt Mutter für 5 Tage in einen Sauerstoffinkubator bei 75%iger Sauerstoffkonzentration gesetzt. Am 12. Tag post partum (p12) erfolgte die intravitreale Injektion des SDF-1-Spiegelmers (NOX-A12) in das eine bzw. der Kontrollsubstanz in das andere Auge. Die untersuchte Substanz NOX-A12 enthält L-Oligonukleotide, die analog einer Antigen-Antikörper-Bindung über elektrostatische Wechselwirkungen, Wasserstoffbrückenbindung oder „Stacking Interactions das Chemokin SDF-1 binden sollen. Anschließend wurden die Mäuse wieder bei normalem Luftsauerstoff gehalten. Am 17. postpartalen Tag wurden die Mäuse mit Fluoreszeindextran perfundiert und anschließend dekapitiert. Im Anschluss an die Enukleation wurden die Retinae als Flatmounts präpariert. Abbildung 7 Übersicht der Therapiezeitpunkte im OIR-Model 33 2.1.1 Sauerstoffinkubation Am 7. Tag post partum wurden die kleinen Mäuse zusammen mit ihrer Mutter samt Käfig und Futter in den Sauerstoffinkubator gesetzt. Der luftdicht abgeschlossene Plexiglaskasten besaß eine sauerstoffzuführenden Vorrichtung, mit der angefeuchtete Luft mit einem Sauerstoffgehalt von 75 % in die Kammer geleitet wurde. Überschüssige Luft wurde über ein Schlauchsystem abgleitet. Eine Lampe, die über eine Zeitschaltuhr gesteuert wurde, simulierte den Tag-NachtRhythmus. Um einen konstanten Sauerstoffgehalt von 75% zu gewährleisten, wurde die 02-Konzentration 3 mal am Tag mit einer Sauerstoffmesssonde (Oxygen Monitor 819, Kontron Instruments) gemessen und bei Bedarf reguliert. Inzwischen wurde das System durch einen automatischen Sauerstoffregler ersetzt, was die Arbeit erleichtert, vor allem aber für eine konstante Sauerstoffkonzentration sorgt. 2.1.2 Anästhesie Über einen mit Isofluran (Forene®, Abbott GmbH und Co KG Schweiz) gefüllten Vaporizer (Dräger, Lübeck) wurde Sauerstoff zum Narkosekasten aus Plexiglas und zum OP-Tisch geleitet. Abhängig vom Alter der Mäuse wurden die Tiere ca. 5 - 10 min narkotisiert, bis sie tief schliefen. Erst dann wurde unter ständiger Narkosegaszufuhr die Operation auf dem OP-Tisch begonnen. 2.1.3 Intraokulare Injektion Die Mäuse wurden unter ständiger Narkosegaszufuhr auf dem OP-Tisch in Bauchlage mit Klebeband fixiert. Anschließend wurden die Lidspalten mit einem Lidhaken geöffnet, der mit Ophtocain benetzt war. Der Bulbus wurde mit einer Pinzette so gedreht und fixiert, sodass der Limbus gut zu sehen war. Mit einer Glaskanüle (150 µm Durchmesser) wurde hinter dem oberen Limbus eingestochen. Über ein Schlauchsystem, das an einer Hamilton-Pipette angeschlossen war, wurden in das rechte und das linke Auge jeweils 2 µl Lösung injiziert. Danach wurde die Narkose beendet und durch einen Schmerzreiz der Atemantrieb gesteigert. Die noch leicht benommen Mäuse wurden zusammen mit ihrer Mutter in einen frischen Käfig gesetzt. 34 Versuchs- Therapieauge Kontrollauge NOX-A12 - low concentration (0,65 mg/ml 5%ige Glucoselösung nummer 1 bzw. 44 µM*) in 5%iger Glucoselösung NOX-A12 - high concentration (6,5 mg/ml 2 5%ige Glucoselösung bzw. 440 µM*) in 5%iger Glucoselösung NOX-A12 – high concentration (6,5 mg/ml 3 PBS bzw. 440 µM*) in Ringerlösung NOX-A12 – high concentration (6,5 mg/ml 4 Ringerlösung bzw. 440 µM*) in Ringerlösung NOX-A12 – high concentration (6,5 mg/ml 5 Ringerlösung bzw. 440 µM*) in Ringerlösung Doppelinjektion NOX-A12 – high 6 Ringerlösung concentration (6,5 mg/ml bzw. 440 µM*) in (p12 + p15) 7 Ringerlösung SDF-1-Antikörper (0,5 mg/ml, MAB 310, PBS R&D Systems, Minneapolis) 8 Tabelle PBS 3 Versuchsübersicht 5%ige Glucoselösung (*Die Dosierungen beziehen sich auf den Oligonukleotidanteil als wasserfreie Säure (ohne Gegenionen) pro µl.) Bei den Injektionsversuchen wurden verschiedene Substanzen als Kontrolle (5%ige Glucoselösung, Ringerlösung, PBS) verwendet. Um mögliche Effekte der Glucose auf die Angiogenese ausschließen zu können, wurde PBS gegen 5%ige Glucoselösung getestet. 35 2.1.4 FITC-Dextranperfusion Für die Perfusion wurde 50 mg/ml FITC-Dextran (Fluoreszein Isothiocyanate Dextran, FD 2000 S, Sigma- Aldrich Chemie GmbH, Steinheim) in physiologischer Kochsalzlösung (NaCl 0,9 %, Braun) gelöst. Nachdem die Mäuse, wie oben beschrieben, tief narkotisiert waren, wurden sie am Tag 17 mithilfe von Leukoplast® (1,25 cm x 9,2 m) in Rückenlage auf dem Operationstisch befestigt. Bevor die Öffnung des Thorax erfolgte, wurde in einer 1 ml-Spritze mit einer 30 G-Kanüle 1 ml FITC-Dextran-Lösung aufgezogen. Der Öffnung des Thorax ging die Abpräparation des Fells voraus. Dabei wurde in der Axillarlinie von kaudal nach kranial ein Schnitt vorgenommen. Durch zwei waagrechte Entlastungsschnitte nach links wurde das Fell nach links abpräpariert. Das Peritoneum wurde entfernt und das Diaphragma von rechts lateral nach links lateral durch drei kleine Schnitte entfernt. Dabei wurde auf das Perikard geachtet, das oft am Diaphragma klebt und nicht verletzt werden durfte. In den beiden vorderen Axillarlinien wurde der Brustkorb durchtrennt und angehoben. Mit einer Insulinspritze (oder 1 ml-Spritze mit 30 G-Kanüle) wurden nun 1 ml FITCDextranlösung in den linken Ventrikel injiziert, bis die Lösung in der Leber zu sehen war. In diesem Moment wurde der rechte Vorhof im Sinne einer Volumenentlastung punktiert. Im Anschluss daran wurde die Maus mit einem Genickbruch getötet und dekapitiert. Die Lidspalten wurden seitlich eingeschnitten, und mit einer VanasSchere wurden die Augen stumpf herauspräpariert. Anschließend wurden die Augen 30 min in 4%igem Formalin fixiert und zu Flatmounts verarbeitet. 2.1.5 Präparation der Flatmounts Nach einer halbstündigen Formalinfixation wurden die den Bulbus umgebenen Strukturen (Muskeln, Bindegewebe, Tränendrüse) entfernt. Mit einer Vanas-Schere wurde entlang des Limbus ein zirkulärer Schnitt vorgenommen. Die Cornea wurde angehoben und entfernt. Anschließend wurde die Linse entnommen. Mit Hilfe zweier Irispinzetten wurde die Retina stumpf von der Sklera gelöst. 36 Der Retinabecher wurde mit NaCl von Pigmentepithelresten gereinigt. Sodann wurde er auf einen trockenen silanisierten Objektträger (SuperFrost, Plus, Menzler-Gläser, Braunschweig) gelegt, bei 12, 3, 6 und 9 Uhr eingeschnitten und das entstandene Flatmount ausgestrichen. Die überschüssige Flüssigkeit wurde mit einem Pinsel abgetragen. Mit einem Glasspatel wurde halbmondförmig Glyercin (Kaisers Glycerin Gelatine) um das Flatmount aufgebracht und vorsichtig mit einem Deckglas (Langenbrinck, 21 x 26 mm) bedeckt. Bis zur Auswertung wurden die Flatmounts bei 4° Celsius dunkel gelagert. 2.1.6 Bestimmung des Retinopathie-Scores (RP-Score) Die Flatmounts wurden für die Auswertung mit einer Kamera unter einem Mikroskop (OLYMPUS BH2-RFCA, OLYMPUS HAMBURG) fotografiert. Dabei wurden eine Gesamtaufnahme, eine Aufnahme der avaskulären Zone und eine Aufnahme jedes einzelnen Flügels gemacht. Die Auswertung erfolgt unter dem FluoreszenzMikroskop. Dabei wurden im Vorfeld die Präparatenummern abgeklebt, um eine blinde Auswertung zu ermöglichen. In einem Auswertbogen wurden die Tufts und Cluster in die jeweiligen Zonen eingezeichnet. Dadurch ist es möglich, die Ergebnisse durch eine zweite Auswertung zu überprüfen. Ausgewertet wurde nach einem von Lange modifizierten Punktesystem, welches ursprünglich von Higgins beschrieben wurde (Lange 2006). Anders als bei der Auswertung nach Lange erfolgte bei dieser Arbeit die Errechnung des Punktescores der avaskulären Zone nach anderen Richtlinien. Die Unterschiede werden unter „die avaskuläre Zone“ genauer erläutert. Es wurden vier Kriterien für die Berechnung des Retinopathie-Scores berücksichtigt: Avaskuläre Zone, Tuftanzahl, Clusteranzahl, Gefäßschlängelung, die im Folgenden genauer erläutert werden. 37 Kategorien Avaskuläre Zone Punkteverteilung Q4–0% 0 Punkte Q9–5% 1 Punkte Q 14 – 10 % 2 Punkte Q 19 – 15 % 3 Punkte Q 20 – 24 % 4 Punkte Q ≥ 25 % 5 Punkte Zone 1 > 1 Tuft 1 Punkt Zone 2 pro Feld > 1 Tuft 1 Punkt Max. 4 Punkte Zone 3 pro Feld > 1 Tuft 1 Punkt Max. 12 Punkte Zone 4 pro Feld > 1 Tuft 1 Punkt Max. 12 Punkte Zone 1 > Cluster 1 Punkt Zone 2 pro Feld > 1 Cluster 1 Punkt Max. 4 Punkte Zone 3 pro Feld > 1 Cluster 1 Punkt Max. 4 Punkte Zone 4 pro Feld > 1 Cluster 1 Punkt Max. 4 Punkte (Q) Max. 5 Punkte Tufts Max. 29 Punkte Cluster Max. 13 Punkte Gefäßschlängelung geschlängelte Gefäße / Gefäße gesamt × 6 Punkte = erreichte Punktzahl Max. 6 Punkte Zusätzliche Kategorien: Absolute Tuftanzahl, absolute Clusteranzahl, Clusterfläche Tabelle 4 Modifiziertes Scoringsystem für die hypoxieinduzierte proliferative Retinopathie 38 2.1.6.1 Die avaskuläre Zone (AZ, zentrale Vasokonstriktion) Die Retina wurde von Higgins et al. in 13 Areale eingeteilt. Dabei wurde für jedes Areal der prozentuale avaskuläre Flächenanteil bestimmt. Für eine avaskuläre Fläche, größer als 50 % in einem Areal, gibt es einen Punkt. Maximal können bei diesem Kriterium 13 Punkte erreicht werden. Die Punkteverteilung wurde von uns so abgeändert, dass das Verhältnis der avaskulären Zone zur Gesamtfläche (Q) die Punkteanzahl bestimmt. Die Auswahl der Grenzen geschah dabei über die Funktion „Bereich frei per Hand wählen“ im Bildbearbeitungsprogramm Gimp. Maximal können für dieses Kriterium 5 Punkte erreicht werden. Diese Methode ist einfach und rein quantitativ, was sie objektiv und reproduzierbar macht Dabei ist Q das Verhältnis der avaskulären Fläche (AZ) im Verhältnis zur Gesamtfläche. Daraus resultiert: je größer die AZ zur Gesamtfläche desto größer ist Q je langsamer die Revaskularisation, desto größer ist die AZ je größer Q und damit die AZ, desto mehr Score-Punkte pro Auge, desto geringer ist die Revaskularisation nach Sauerstoffinkubation. Abbildung 8 Avaskuläre Zone (grün unterlegt) einer Mäuseretina 39 2.1.6.2 Tuftanzahl Tufts sind kleine Proliferationsknospen. Um die Tuftanzahl zu quantifizieren wurde von Higgins et al. die Retina in 29 Felder eingeteilt. Sind ein oder mehrere Tufts in einem Feld vorhanden, gab es einen Punkt. So können maximal 29 Punkte erreicht werden. Zusätzlich wurde die absolute Tuftanzahl ausgewertet. 100 µm Abbildung 9 Tufts einer Mäuseretina (die roten Pfeile markieren Tufts) 2.1.6.3 Clusteranzahl Als Cluster werden zusammenhängende Proliferationsbeete bezeichnet. Zu deren Quantifizierung wurde die Retina in 13 Felder eingeteilt. Enthält ein Feld ein oder mehrere Cluster, so wurde diesem Feld ein Punkt zugeteilt. Zusätzlich wurde die absolute Clusteranzahl berechnet. Bei Versuch 3, 4 und 5 wurde zur genaueren Beurteilung der Cluster zusätzlich die absolute Clusterfläche bestimmt, indem über die Funktion „Bereich frei per Hand wählen“ im Bildbearbeitungsprogramm Gimp die Cluster umfahren wurden. 40 50 µm Abbildung 10 Cluster ohne (links) und mit (rechts) Einzeichnung der Clusterfläche 2.1.6.4 Die Gefäßschlängelung Für dieses Kriterium wurde das Verhältnis von geschlängelten zu geraden Gefäßen berücksichtigt. Die Berechnung der Punkteanzahl erfolgte dabei über folgende Formel: Erreichte Punkteanzahl = geschlängelte Gefäße / gesamte Gefäße × 6 Punkte Lagen nur geschlängelte Gefäße vor, wurde die maximale Punkteanzahl von 6 Punkten erreicht. In unseren Versuchen konnte dies nie beobachtet werden. 600 µm Abbildung 11 Gerade (G) und geschlängelte (K) Gefäße einer Mäuseretina 41 Die erreichte Punktzahl pro Retina und Augenpaar wurde in einer Tabelle zusammengetragen - je größer die erreichte Punktzahl, desto ausgeprägter die Retinopathie. Dabei diente ein Auge jeweils als individuelles Kontrollauge. Zwei Injektionsversuchen im OIR-Mausmodell (NOX-A12 versus Ringerlösung) wurden nach Unsöld 2005 bzw. Gogaki 2003 ausgewertet. Die Unterschiede zwischen den verschiedenen Auswertmethoden werden im Kapitel „Diskussion“ näher erläutert. 2.1.7 Statistik Bei den Injektionsversuchen wurden die Testsubstanz samt Lösungsmittel in das linke Auge und die Kontrollsubstanz in das rechte Auge injiziert. Es war deshalb möglich die analytische Methode von gepaarten Stichproben anzuwenden. Es wurde der Wilcoxon Signed Rank Test benutzt, der die Irrtumswahrscheinlichkeit angibt. Eine statistische Signifikanz wurde bei einem P-Wert von < 0,05 angenommen. Der Test wurde auf folgender Internetseite durchgeführt: http://www.fon.hum.uva.nl/Service/Statistics/Signed_Rank_Test.html. CNV-Mausmodell 2.2 Versuchs- Therapieauge Kontrollauge 1 NOX-A12 in Ringerlösung high concentration Ringerlösung 2 revNOX-A12 in Ringerlösung Ringerlösung nummer Mäuse (C57BL/6J, Jackson Laboratories) in einem Alter von 10 – 12 Wochen wurden anästhesiert und mit 3 Laserherden (Argon laser, 100 ms, 100 µm und 150 mV, 532 nm, Visulas 532s, pro Auge behandelt. Carl Zeiss Meditec AG, Jena, Germany) 42 Abbildung 12 Übersicht der Therapiezeitpunkte im CNV-Modell Dabei wurde die Bruchmembran durch den Laser zerstört, und die Tiere entwickelten daraufhin an diesen Laserherden chorioidale Neovaskularisationen. Einen Tag später wurden 2 µl einer 440 mikromolaren Lösung des pegylierten SDF-1bindenden Spiegelmers gelöst in Ringerlösung (NOX-A12 (Lot A1307L1-2M3)) intravitreal in das eine und 2 µl Ringerlösung in das andere Auge injiziert (Dosis: 0.88 nmol = 12.9 µg [Oligonukleotidanteil] = 48 µg [Gesamtmolekül inkl. PEG]). In einem weiteren Versuch wurden 2 µl revNOX-A12 (nicht-funktionales PEG-modifiziertes Kontrollspiegelmer) gelöst in Ringerlösung in das eine und 2 µl Ringerlösung in das andere Auge injiziert. 14 Tage nach der Laserbehandlung wurden die Tiere mit FITC-Dextran (Fluoreszein Isothiocyanate Dextran, FD 2000 S Sigma- Aldrich Chemie GmbH, Steinheim) perfundiert und chorioidale Wholemounts hergestellt. Anschließend wurden die vaskulären Veränderungen der Chorioidea im Areal der CNV-Membran untersucht. Zur Auswertung gelangte das mit FITC-Dextran perfundierte Areal abzüglich eines evtl. entstandenen Loches durch den Laser. 2.2.1 Durchführung der Laserung Die Anästhesie der Mäuse wurde mithilfe einer intraperitonealen Narkose durchgeführt. Anschließend wurden die Augen mit einem Mydriatikum und Neosynephrin Augentropfen weitgetropft. Die Mäuse wurden gekennzeichnet und die Kennzeichnung dokumentiert. Die Mäuseaugen wurden alle 10 Minuten mit einem Corneregel-Augengel vor dem Austrocknen geschützt 43 Nach der Installation des Maushalters vor dem Laser wurde die Maus mit Klebeband fixiert und der Laser hochgefahren. Nach Einstellung der Laseroptionen (100 ms; 100 µm; 150 MW) wurde der Augenhintergrund scharf gestellt. Jedes Auge wurde mit drei Laserherden, die je zwei Papillendurchmesser Abstand zur Papille besitzen, behandelt. Nachdem Ausschalten des Lasers wurden die Herde dokumentiert und der Laser deaktiviert. 2.2.2 Statistik Hier wurde ebenfalls der Wilcoxon Signed Rank Test benutzt, der die Irrtumswahrscheinlichkeit angibt. Eine statistische Signifikanz wurde bei einem PWert von < 0,05 angenommen. Der Test wurde auf folgender Internetseite durchgeführt: http://www.fon.hum.uva.nl/Service/Statistics/Signed_Rank_Test.html. 2.3 Nachweis des intravitreal injizierten Stoffes Um sicher zu gehen, dass das Spiegelmer durch die intraokuläre Injektion in die Retina gelangt, wurde eine in situ-Hybridisierung durchgeführt. Dazu wurde eine markierte Nukleinsäure-Sonde eingesetzt, die über Basenpaarung mit der gesuchten Nukleinsäure hybridisiert – in unserem Fall mit dem SDF-1-bindenden Spiegelmer – und dadurch identifiziert. Dazu wurden 2 µl SDF-1-Spiegelmer (high concentration, 6,5 mg/ml bzw. 440 µM in 5%iger Glucoselösung) intravitreal in 14 Tage alte Mäuse injiziert. Acht Stunden später wurde die Maus wie im Kapitel 2.1.2 beschrieben anästhesiert und dekapitiert. Als negative Kontrolle diente das Augenpaar einer Maus ohne Injektion. Die Augen wurden enukleiert, in TissueTec® eingebettet und bei -30 ° Celsius tiefgefroren. Anschließend wurden von den Mäusebulbi Kryoschnitte mit einer Dicke von 5 µm hergestellt. Die Objektträger mit den Kryoschnitten wurden an der Luft getrocknet und hitzefixiert. Die in situHybridisierung wurde durch die NOXXON Pharma AG durchgeführt. 44 2.4 PCR Um RNA von SDF-1 und CXCR4 in der Retina nachzuweisen, wurde RNA aus OIR-behandelten Mäusen (C57BL/6J, Jackson Laboratories) isoliert. Über eine reverse Transkriptions-Reaktion und anschließende PCR wurden DNA-Fragmente der beiden Faktoren hergestellt. Durch Gelelektrophorese und Sequenzierung wurden die Fragmente als zu SDF-1 und CXCR4 gehörig identifiziert. Dasselbe Procedere wurde ebenfalls mit den anderen Gewebearten (Leber-, Nieren- und Gehirngewebe) durchgeführt. 2.4.1 RNA-Isolierung RNA aus Retina, Herz, Niere, Gehirn und Leber wurde aus Mäusen unterschiedlichen Alters mit Hilfe des RNeasy Mini Kits von Qiagen isoliert. Die Organe wurden unter Inhalationsnarkose wie im vorherigen Kapitel beschrieben entfernt und in PBS-Lösung gewaschen. Bei allen Schritten wurde darauf geachtet, dass die Proben nicht mit fremder RNA/ DNA kontaminiert werden. Die Augen wurden aus der PBS-Lösung genommen und auf einen sterilen Objektträger (Langenbrinck, 76 x 26 mm) gelegt. Mit einer sterilen Irispinzette und einer sterilen Vanas-Schere wurde ein circulärer Schnitt entlang des Limbus vorgenommen. Die Cornea und die Linse wurden entfernt, die Sklera stumpf von der Retina abpräpariert. Die fertig präparierte Retina wurde zum Schluss erneut mit PBS gewaschen und in ein steriles Eppendorfgefäß (2 ml) mit 500 µl RLT-Puffer und 5 µl beta-Mercaptoethanol überführt. Herz, Niere, Gehirn und Leber wurden ebenfalls mit PBS gewaschen und in jeweils ein Eppendorfgefäß mit 500 µl RLT-Puffer und 5 µl beta-Mercaptoethanol überführt. Mit einem Rotor-Stator-Homogenisierer wurden die Organe für 20 s homogenisiert. Die RNA-Isolierung wurde nach Anleitung des Herstellers durchgeführt. Die RNAKonzentrationen der Proben wurden mithilfe des Spectrophotometers Cary 50 (Varian, Darmstadt) bestimmt. 45 2.4.2 Reverse Transkription Für die reverse Transkription wurden x µg⃰ RNA eingesetzt. Erreichte die RNA die dazu benötigte Konzentration nicht, wurden nur 24 µl RNA dazugegeben. Alter P13 P14 P15 P17 Adult Adult Adult Adult Gewebe Retina Retina Retina Retina Herz Gehirn Leber Niere OIR Ja Ja Ja Nein Nein Nein Nein Nein 235,6 166,29 99,47 66,50 60 970 932 185 8,5 12 20 24 24 2,2 2,1 10,8 RNAKonzentration (ng/µl) ⃰verwendete RNA-Menge (µl) Tabelle 5 Darstellung der verwendeten RNA-Konzentrationen und -Mengen RNA x µg dNTPs 10 mM 2 µl Oligo-dT (0,5 µg/µl) 1 µl DEPEC-Wasser ad 27 µg _______________ Ansatz Die 27 µl Reagenzien wurden 5 min bei 70 °C in der PCR-Maschine (Mastercycler gradient, Eppendorf) inkubiert und auf Eis abgekühlt. Nach kurzem Zentrifugieren wurden First Strand Buffer 8 µl DTT (0, 1 M) 4 µl Superscript II RT (200 U/µl) 1 µl 46 dazugegeben und gemischt. Nun wurde der Ansatz 50 min bei 42°C, 15 min bei 70°C und zuletzt 2 min bei 4°C inkubiert. 2.4.3 PCR-Reaktion Für die RT-PCR wurden folgende Reagenzien zusammengemischt: cDNA 1 µl PCR-Puffer 2 µl 25 mM MgCl2 1,6 µl dNTPs (je 2 mM) 2 µl Primer1 5 µM 1 µl Primer2 5 µM 1 µl HotStarTaq (5U/µl) 0,1 µl Wasser 11 µl Folgende Primer wurden verwendet: RT-PCR SDF-1-a SDF-1-b 5´-cct cgg tgt cct ctt ctt gct gt-3´ 5´-gat gct tga cgt cgt tgg ctc tg-3´ Cxcr4-a Cxcr4-b 5´-tct gag gcg ttt ggt gct c-3´ 5´-gaa gca ggg ttc ctt gtt gg-3` Fragmentgröße SDF-1-a/b 198 bp Cxcr4-a/b 146 bp Nested PCR SDF-1-c SDF-1-d 5´-aag gtc gtc gcc gtg ctg-3´ 5´-gcg atg tgg ctc tcg aag aa-3´ Cxcr4-c Cxcr4-d 5´-cgt ttg gtg ctc cgg taa-3´ 5´-tct cca gaa ccc act tct tca-3´ Tabelle 6 Primersequenzen: RT-PCR und nested PCR PCR-Programm: SDF-1-c/d 110 bp Cxcr4-c/d 112 bp 47 1x 95 °C 5 min 35 x 94 °C 30 s 56 °C 30 s 72 °C 30 s 1x 72 °C 5 min Für die Nested-PCR wurde 1 µl einer 50fachen Verdünnung des PCR-Produkts der ersten PCR in eine weitere PCR eingesetzt. Die eingesetzten Primer sind in der obigen Tabelle aufgeführt. Mit der Nested-PCR können sehr geringe RNA-Mengen nachgewiesen werden. Das Primerpaar der zweiten PCR liegt dabei zwischen den Primern der ersten Reaktion. Dadurch wurden unspezifische Fragmente der ersten PCR nicht amplifiziert. 2.4.4 Agarose-Gel-Elektrophorese Um das Produkt der PCR sichtbar zu machen, folgte der PCR eine EthiumbromidAgarose-Gel-Elektrophorese. Dazu wurde 1 g Agarose (Agarose, Electrophoresis grade, Invitrogen, UK) in 70 ml TBE (Tris-Borat-EDTA-Puffer)-Puffer (ergibt 1,5 %) durch Aufkochen gelöst. Sodann wurden 2 µl Ethiumbromid in einer Konzentration von 0,5 µg/ml dazugegeben und das Agarose-Gel hergestellt. Nach dem Abkühlen des Gels wurde jeder PCR-Ansatz mit 6 µl Puffer (Perqlab, DNA Leiter-Mix) gemischt und in die Geltaschen übertragen. Zur Identifikation der Banden wurde ein 100 bpMarker (MBI Fermentas) aufgetragen. Die Proben wurden bei 110 V max. 1 Stunde durch das Gel laufen gelassen. Anschließend wurden die Banden unter UV-Licht sichtbar gemacht und dokumentiert. 2.5 Immunhistochemie 2.5.1 Verwendeter Mäusestamm Für die immunhistochemischen Färbungen mit Pecam-1 und SDF-1 wurden BlackSix Mäuse (C57BL/6J, Jackson Laboratories) sowie Ang2-defiziente Mäuse (Wildtyp) verwendet. 48 2.5.2 Kryoschnitte Augen wurden enukleiert und in OCT Compound Medium bei -80 °C tiefgefroren. Anschließend wurden Kryoschnitte von 6 µm Dicke hergestellt (Gefriermikrotom, Leica c3050s). Die Kryoschnitte wurden für einen Tag bei Raumtemperatur luftgetrocknet. Die Fixierung der Kryoschnitte erfolgt direkt vor der Färbung durch eisgekühltes Aceton für 6 min. 2.5.3 Immunfärbung Pecam-1-Färbung Zum Nachweis von Endothelzellen in der Mäuseretina wurde der polyklonale Pecam-1 (Platelet Endothelial Cell Adhesion Molecule-1)-Antikörper verwendet, da Pecam-1 auf der Oberfläche von Endothelzellen konstitutiv exprimiert wird. Antikörper- Herkunftstier Reaktivität Firma Bestellnummer Verdünnung Typ/Antigen Primärantikörper Affinity Rat IgG2a, Purified K Mouse eBioscience 14-0311-81 1:50 Rat Sigma- F6258 1:100 anti-mouse PECAM-1 Sekundärantikörper FITC Goat IgG- Conjugate- whole Goat anti- molecule Aldrich rat IgGwhole molecule Tabelle 7 Verwendete Antikörper bei der PECAM-1-Immunfärbung Unspezifische Reaktionen im Hintergrund wurden durch eine 15minütige Inkubation in Trispuffer (50 mM Tris-HCl pH 7,5, 0,9 % NaCl) mit 20 % Rinderserum verhindert. 49 Der PECAM-1-Antikörper Rat anti Maus wurde dazu mit Aqua ad injectabilia (B. Braun Melsungen AG) auf 1:50 verdünnt. Pro Objektträger wurden 80 µl Lösung benötigt. Sodann erfolgte die Inkubation des primären Antikörpers bei Raumtemperatur für 1 Stunde in einer feuchten Kammer, um das Austrocknen der Schnitte zu verhindern. Nach dem Waschen Sekundärantikörper Raumtemperatur wurden die (Sigma-Aldrich) in einer Schnitte in der abgedunkelten mit einem Verdünnung Kammer FITC-gekoppelten 1:100 inkubiert, 1 um h bei eine Signalabschwächung zu verhindern. Nach dem Waschen wurden die Schnitte mit Aqua-Mount® (Aquaous mounting agent for microscopy, Lerner Laboratories, Pittsburgh, PA) bedeckt und mit einem Deckglas versehen. Die Schnitte wurden unter einem Fluoreszenzmikroskop (OLYMPUS BH2-RFCA, OLYMPUS HAMBURG) ausgewertet. 50 SDF-1-Färbung Um das Expressionsmuster von SDF-1 in der Retina genauer zu untersuchen wurde eine immunhistochemische Färbung mit SDF-1 durchgeführt. Es wurden folgende Antikörper verwendet: Antikörper- Herkunftstier Reaktivität Firma Bestellnummer Verdünnung Rabbit Mouse/Rat eBioscience 14-7992-81 1:100 Rabbit Mouse/Rat Abcam ab18919 (nicht 1:50 Typ/Antigen Primärantikörper CXCL12-rabbitanti-mouse/rat (SDF-1α, polyclonal) CXCL12-rabbitanti-mouse/rat mehr erhältlich) (SDF-1β, polyclonal) Sekundärantikörper FITC-goat-anti- Goat Rabbit KPL 1721506 1:500 Sheep Rabbit Abcam ab6793 1:100 rabbit Sheep polyclonal to rabbit IgG (Texas-Red®) Tabelle 8 Verwendete Antikörper bei der SDF-1-Immunfärbung 51 Hintergrundreaktionen wurden mit Ultra V Block TA-123-UB (Lab Vision, Fremont, CA USA) für 10 Minuten geblockt. Der Primärantikörper wurde mit Diluent (UltraAB Diluent, TA-125-UD, Lab Vision, Fremont, CA USA) verdünnt und auf die Schnitte aufgetragen. Nach dreistündiger Inkubationszeit in der feuchten Kammer wurde der Primärantikörper mit TBST (Tris-Buffered Saline Tween-20) abgespült. Der Sekundärantikörper wurde ebenfalls mit Diluent (UltraAB Diluent, TA-125-DU, Lab Vision, Fremont, Inkubationszeit CA in USA) der verdünnt feuchten und aufgetragen. abgedunkelten Nach Kammer einstündiger wurde der Sekundärantikörper mit TBST abgespült. Sodann wurden die Schnitte mit AquaMount® (Aquaous mounting agent for microscopy, Lerner Laboratories, Pittsburgh, PA) eingedeckelt und unter einem Fluoreszenzmikroskop (OLYMPUS BH2-RFCA, OLYMPUS HAMBURG) ausgewertet. Die IHC-Färbungen mit dem polyklonalen Primärantikörper gegen SDF-1β (CXCL12rabbit-anti-mouse/rat, Abcam) und dem Sekundärantikörper Texasred® (Goat-antirabbit-IgG, Vector Laboratories) wurden nach dem PECAM-1-Färbeprotokoll angefertigt. 52 3 Ergebnisse 3.1 Immunhistochemischer Proteinnachweis PECAM-1-Färbung In der unten abgebildeten histologischen Färbung b ist gut zu erkennen, dass vor allem das Gefäßendothel fluoresziert. Die drei Gefäßnetze, die die innere Retina versorgen und von der A. centralis retinae gespeist werden, liegen in der Ganglienzellschicht (Abb. 13 d 1), in der inneren plexiformen Schicht (Abb. 13 d 2) und in der äußeren plexiformen Schicht (Abb. 13 d 3). Der äußerste Bereich der Netzhaut wird bis zur äußeren Körnerschicht (Abb. 13 d 4) von einem Kapillarnetz der Chorioidea versorgt 53 a b 1 2 3 4 c d Abbildung 13 Kryoschnittfärbung eines Mäuseauges (OIR, p17), a) HE-Färbung b) PECAM-1-Färbung/Fluorescein c) Auflicht PECAM-1/Fluorescein, HE; (Balken = 125 µm) PECAM-1/Fluorescein d) Auflicht, 54 SDF1-Färbung Abbildung 14 zeigt das Ergebnis der immunhistochemischen Färbungen zum Nachweis von SDF-1. Es wurde ein Primärantikörper gegen SDF-1α (eBioscience) und ein Primärantikörper gegen SDF-1β (Abcam) verwendet. Das Expressionsmuster von SDF-1 unterscheidet sich in der Retina von OIR-Mäusen an p17 und normalen Mäusen nicht wesentlich. Während Pecam-1 vor allem das Gefäßendothel in der Ganglienzellschicht, in der inneren plexiformen Schicht, sowie in der äußeren plexiformen Schicht kenntlich macht, wird SDF-1 überwiegend in den Außensegmenten des Sinnesepithels (Abb. 14 b), der inneren Körnerschicht (Abb. 14 d) und in der Ganglienzellschicht (Abb. 14 e) exprimiert. 55 A D e d c b a B E C F Abbildung 14 SDF-1-Kryoschnittfärbung eines Mäuseauges. 56 A: Ang2 (-/+) Retina p17 OIR, B: Ang2 (-/+) Retina p17, C: Ang2 (-/+) Retina p17 OIR Negativkontrolle; D: Retina p17 OIR, E: Retina p17, F: Retina p17 OIR (A + B SDF1α, eBioscience; D + E SDF-1β, Abcam); Abkürzungen: a RPE, b Außensegmente der Rezeptoren, c äußere Körnerzellschicht, d innere Körnerzellschicht, e Ganglienzellen 3.2 RNA-Nachweis von SDF-1 und CXCR4 in der Retina RNA-Nachweis mit RT-PCR Durch die RT-PCR wurde in allen Gewebeproben RNA von SDF-1 und seinem Rezeptor CXCR4 nachgewiesen. Abbildung 15 Ergebnis der 1. Gelelektrophorese 57 Abbildung 15: Gelelektrophorese zum Nachweis von PCR-Produkten. Es wurde ein 100 bp-Marker verwendet. Die Banden von SDF-1-a/b sind auf der Höhe von 198 bp von SDF-1-c/d bei 110 bp (grüner Pfeil Abb. a), Cxcr4-a/b sind bei 146 bp und Cxcr4-c/d bei 112 bp (grüner Pfeil Abb. b) zu finden. Zum Ausschluss unspezifischer Reaktionen wurde eine Negativkontrolle (nK, kompletter Ansatz ohne RNA) verwendet. Da mehrere Banden auftraten, wurde eine Nested PCR durchgeführt. In der Nested PCR mit den Primern SDF-1 c/d bzw. CXCR4 c/d wurde in jeder Probe SDF-1, bzw. CXCR4 nachgewiesen. Abbildung 16 Nested PCR: 1. Primer SDF-1 a/b, SDF-1 c/d; 2. Primer CXCR4 a/b, CXCR4 c/d Die Banden von SDF-1 c/d sind auf Höhe von 110 bp, bzw. von CXCR4 c/d auf Höhe von 112 bp zu finden. Es wurde ebenfalls ein 100 bp-Marker verwendet. Abkürzung L N 13 14 15 17 He Hi Alter Adult Adult P13 P14 P15 P17 Adult Adult Gewebe Leber Niere Retina Retina Retina Retina Herz Gehirn OIR Nein Nein Ja Ja Ja Nein Nein Nein Tabelle 9 Erklärung der Abkürzungen und verwendete Gewebearten beim PCRVersuch 58 3.3 Lokalisierung des intravitreal injizierten Spiegelmers In Abb. 17a ist ein sagittaler Kryoschnitt von einem Mäuseauge in 20-facher Vergrößerung gezeigt, wobei die Enukleation und Kryofixierung 8 h nach Injektion des Spiegelmers® stattfand. Das Spiegelmer wurde nach der Hybridisierung durch eine violette Farbreaktion sichtbar gemacht (Pfeile). Besonders ausgeprägt war die violette Farbreaktion im Bereich der Ganglienzellschicht und der inneren Körnerschicht. Die nachfolgende Abbildung zeigt rechts die Negativkontrolle ohne Injektion des SDF-1-Spiegelmers. Mit diesem Versuch konnte gezeigt werden, dass das SDF-1-Spiegelmer nach der intravitrealen Injektion in die Retina gelangt. a b Abbildung 17 Lokalisierung des intravitreal injizierten Spiegelmers durch in situ Hybridisierung Abb. 17b: Negativkontrolle (Längsschnitts durch einen Mäusebulbus) in 4facher Vergrößerung. 17a Längsschnitt eines Mäusebulbus 8 h nach Injektion des Spiegelmers in 20facher Vergrößerung nach in situ-Hybridisierung. Besonders die Ganglienzellschicht (schwarze Pfeile) und die innere Körnerschicht lassen eine kräftige Färbung im Vergleich zur Negativkontrolle erkennen, ebenso die Photozellrezeptorenschicht. 59 Übersicht über die Injektionsversuche im OIR-Mausmodell 3.4 Retinopathie-Score Substanz Substanz Therapieauge Kontrollauge NOX-A12 – lc NOX-A12 – hc n Mäuse p Median Median Therapieauge Kontrollauge 20 11 13 0,784 26 10 9 0,830 PBS 24 5,5 8 0,009 Ringerlösung 20 22 21,5 0,579 Ringerlösung 24 6 4 0,014 Ringerlösung 8 15 17,5 0,383 PBS 20 5 4 0,159 29 12,5 13,5 0,484 5%ige Glucoselösung 5%ige Glucoselösung NOX-A12 – hc (Auswertung nach Gogaki) NOX-A12 – hc (Auswertung nach Bauer) NOX-A12 – hc (Auswertung nach Unsöld) NOX-A12 – hc Doppelinjektion SDF-1-Antikörper (5 mg/ml) PBS 5%ige Glucoselösung Tabelle 10 Übersicht über die OIR-Versuche (high concentration (hc) = 6,5 mg/ml bzw. 440 µM*, low concentration (lc) = 0,65 mg/ml bzw. 44 µM*) *Die Dosierungen beziehen sich auf den Oligonukleotidanteil als wasserfreie Säure (ohne Gegenionen) pro Volumen. 60 NOX-A12 - low concentration in 5%iger Glucoselösung Für diesen Versuch wurden 2 µl SDF-1-Spiegelmer low concentration (Lot A0846L1M1) in 5%iger Glucoselösung in das linke Auge injiziert. Die 5%ige Glucoselösung diente auch als Kontrollsubstanz für das rechte Auge. Für diesen Versuch standen uns 20 Mäuse zur Verfügung. Die Auswertung erfolgte an Flatmounts (Retinaflachpräparate) mithilfe von Retinopathie-Scores (RP-Score). Abbildung 18 Retinopathie-Werte Injektionsversuch: NOX-A12 low concentration Jedes Quadrat in der Grafik repräsentiert den Retinopathie-Score eines individuellen Augenpaares. Große Quadrate repräsentieren zwei Mäuse mit den gleichen Ergebnissen. Der Median des therapierten Auges betrug 11 Punkte, der des nicht therapierten Auges 13 Punkte. Der Wilcoxon-Matched-Pairs Signed Ranks Test* ergab keinen signifikanten Unterschied (p = 0,784) zwischen der Ausprägung der angioproliferativen Retinopathie im therapierten und nicht-therapierten Auge. Ausschließlich die avaskuläre Zone wies einen signifikanten Unterschied (p ≤ 0,05) auf. Dabei zeigte das therapierte Auge eine deutlich kleinere avaskuläre Zone (Median 2 Punkte) im Gegensatz zum Kontrollauge (Median 2,5 Punkte). 61 NOX-A12 - high concentration in 5%iger Glucoselösung Nachdem das SDF-1-Spiegelmer mit niedriger Konzentration im ersten Versuch keine antiproliferative Wirkung gezeigt hat, wurde im zweiten Versuch ebenfalls ein SDF-1-Spiegelmer, jedoch mit einer höheren Konzentration (high concentration; Lot A1307L1-2M3) verwendet. Im zweiten Versuch wurden 2 µl SDF-1-Spiegelmer high concentration in 5%iger Glucoselösung in das linke Auge injiziert. Die 5%ige Glucoselösung diente auch als Kontrollsubstanz für das rechte Auge, in das ebenfalls 2 µl Lösung injiziert wurde. Für diesen Versuch standen 26 Black Six Mäuse zur Verfügung. Die Auswertung erfolgte ebenfalls an Flatmounts mithilfe des Retinopathie-Scores. Abbildung 19 Retinopathie-Werte Injektionsversuch: NOX-A12 high concentration 62 Der Median des therapierten Auges betrug 10 Punkte, der des nicht therapierten Auges 9 Punkte. Auch hier zeigte sich kein signifikanter Unterschied zwischen dem therapierten Auge und dem Kontrollauge (p = 0,830). Zudem wies in diesem Versuch die avaskuläre Zone von Therapie- und Kontrollauge (p = 0,119) keinen signifikanten Unterschied auf. NOX-A12 – high concentration in Ringerlösung Bei diesem Versuch wurden 2 µl SDF-1-Spiegelmer high concentration, gelöst in Ringer-Infusionslösung in das linke Auge injiziert. Als Kontrollsubstanz wurde PBS verwendet. Für diesen Versuch standen 24 Mäuse zur Verfügung. Die Auswertung erfolgte nach Gogaki. Der Median des therapierten Auges betrug 5,5 Punkte, der Median des nicht therapierten Auge 8 Punkte. Hier war ein signifikanter antiproliferativer Effekt des SDF1-Spiegelmers zu beobachten (p = 0,009). Bei Aufgliederung des Ergebnisses war eine verminderte Tuftanzahl im therapierten Auge für den signifikanten Effekt des SDF-1-Spiegelmers verantwortlich. Abbildung 20 Retinopathie-Werte Injektionsversuch: NOX-A12 high concentration 63 NOX-A12 – high concentration in Ringerlösung (Auswertung n. Bauer) Es wurden 2 µl SDF-1-Spiegelmer high concentration, gelöst in RingerInfusionslösung in das linke Auge injiziert. Die Ringer-Infusionslösung diente auch als Kontrollsubstanz für das rechte Auge. Für diesen Versuch standen 20 Mäuse zur Verfügung. Die Auswertung erfolgte nach Bauer. Der Median des therapierten Auges betrug 22 Punkte, der Median des nicht therapierten Auge 21,5 Punkte. Auch hier war kein signifikanter Unterschied zwischen dem therapierten und dem nicht therapierten Auge zu sehen (p = 0,579). Abbildung 21 Retinopathie-Werte Injektionsversuch: NOX-A12 high concentration NOX-A12 – high concentration in Ringerlösung (Auswertung n. Unsöld) In einem weiteren Versuch wurden 2 µl SDF-1-Spiegelmer high concentration, gelöst in Ringer-Infusionslösung in das linke Auge injiziert. Die Ringer-Infusionslösung diente auch als Kontrollsubstanz für das rechte Auge. Für diesen Versuch standen 24 Mäuse zur Verfügung. Die Auswertung erfolgte bei diesem Versuch nach Unsöld. 64 Der Median des therapierten Auges betrug 6 Punkte, der Median des nicht therapierten Auges 4 Punkte. Hier war ein signifikanter proliferativer Effekt des SDF1-Spiegelmers zu beobachten (p = 0,013). Bei Aufgliederung des Ergebnisses war die vermehrte Tuft- (p = 0,005) und Clusteranzahl (p = 0,042) im therapierten Auge für den signifikanten Effekt verantwortlich. Abbildung 22 Retinopathie-Werte Injektionsversuch: NOX-A12 high concentration 65 NOX-A12 – high concentration in Ringerlösung mit Doppelinjektion Der nächste Versuch bestand aus einer intravitrealen Doppelinjektion, da eine zu niedrige Anreicherung des SDF-1-Spiegelmers durch die einmalige intravitreale Injektion vermutet wurde. Dabei wurden in acht Mäuse an P12 und P15 jeweils 2 µl SDF-1-Spiegelmer high concentration gelöst in Ringer-Infusionslösung in das linke Auge und 2 µl Ringer-Infusionslösung in das rechte Auge injiziert. Die Auswertung erfolgte nach Bauer. Abbildung 23 Retinopathie-Werte Injektionsversuch: NOX-A12 high concentration, Doppelinjektion Der Median des therapierten Auges betrug 15 Punkte, der des nicht therapierten Auges 17,5 Punkte. Auch hier war kein signifikanter Unterschied zu sehen (p ≤ 0,383). 66 SDF-1-Antikörper im OIR-Mausmodell In einem weiteren Versuch wurde der SDF-1-Antikörper von R&D Systems (0,5 mg/ml) im OIR-Mausmodell getestet. Als Kontrollsubstanz diente PBS. Versuche mit einem SDF-1-Antikörper wurden bereits von Butler et al. in einem adulten Retinopathiemodell der Maus (Butler 2005) und von Sengupta et al. im CNV-Modell (Sengupta 2005) durchgeführt. Sengupta et al. verwendeten ebenfalls den SDF-1Antikörper von R&D Systems mit einer Konzentration von 5 mg/ml. Im vorliegenden Versuch wurden 2 µl SDF-1-Antikörper in das Therapieauge und 2 µl PBS in das Kontrollauge injiziert. Für diesen Versuch standen uns 20 Mäuse zur Verfügung. Der Median des therapierten Auges betrug 5 Punkte, der des Kontrollauges 4 Punkte. Der Wilcoxon-Matched-Pairs Signed Ranks Test* ergab keinen signifikanten Unterschied (p = 0,159). Abbildung 24 Retinopathie-Werte Injektionsversuch: SDF-1-Antikörper 67 Glukose versus PBS Da eine indirekte antiangiogene Wirkung durch die injizierte Glucoselösung nicht ausgeschlossen werden konnte, wurde ein Vergleich mit 5%iger Glucoselösung (rechtes Auge) und PBS (linkes Auge) durchgeführt. Für diesen Versuch standen 28 Mäuse zur Verfügung. Abbildung 25 Retinopathie-Werte Injektionsversuch: Glucose versus PBS Der Median des linken Auges (PBS) betrug 12,5 Punkte, der des rechten Auges (Glucose) 13,5 Punkte. Es zeigte sich kein signifikanter Unterschied im Proliferationsscore der beiden Augen (p = 0,484). 68 Proliferationswerte aller Injektionsversuche mit dem SDF-1-Spiegelmer Fasst man sämtliche Proliferationsscores der Injektionsversuche mit dem SDF-1Spiegelmer im OIR-Modell zusammen, und werden weder Konzentration, noch das Lösungsmittel und die Injektionshäufigkeit berücksichtigt, ergibt sich ebenfalls keine signifikante antiangioproliferative Wirkung des SDF-1-Spiegelmers (p ≤ 0,220). Abbildung 26 Zusammenfassung der Retinopathie-Werte aller Injektionsversuche mit NOX-A12 Bei fünf von sechs Versuchen konnte keine antiangioproliferative Wirkung des SDF-1-Spiegelmers nachgewiesen werden. Ebenso konnte durch den SDF-1Antikörper keine Reduktion der Gefäßneubildung induziert werden. Weder der Gesamtscore, noch die Anzahl der Clusters, der Tufts und der Gefäße, sowie die Clusterflächen und die Punktescores der Clusters, der Tufts und der Gefäße wiesen signifikante Unterschiede auf. 69 Eine Ausnahme bildete hierbei ein Versuch mit dem SDF-1-Spiegelmer high concentration, wo ein antiproliferativer Effekt des Spiegelmers beobachtet wurde. Dabei war im therapierten Auge der Tuftscore signifikant erniedrigt. In einem weiteren Versuch mit dem SDF1-Spiegelmer high concentration zeigte jedoch das therapierte Auge eine signifikante Zunahme des Proliferationscores. Die Tuft- und Clusterscores waren signifikant verändert. Bei der Verwendung des Spiegelmers in der niedrigen Konzentration gelöst in 5%iger Glucose ergab die Versuchsauswertung einen signifikanten Unterschied im Punktescore der avaskulären Zone (p ≤ 0,05) was eine beschleunigte pathologische Revaskularisation durch unkontrollierte Epithelzellproliferationen nahe legt. Bei Gesamtbetrachtung aller OIR-Versuche lässt sich keine eindeutige antiangiogene Wirkung des SDF-1-Spiegelmers nachweisen. 3.5 Substanz SDF-1-Spiegelmer im CNV-Modell Substanz n Therapieauge Kontrollauge Mäuse Mittelwert CNV- Mittelwert CNV- P Flächen, Therapieauge Flächen, Kontrollauge NOX-A12 Ringerlösung 13 48,8 µm² revNOX-A12 Ringerlösung 13 209,6 µm 2 77,5 µm² 0,021 2 0,033 81,6 µm Bei 22 Mäusen wurden einen Tag nach der Laserung 2 µl NOX-A12 (Dosis: 0.88 nmol = 12.9 µg [Oligonukleotidanteil] = 48 µg [Gesamtmolekül inkl. PEG]) in das Therapieauge und 2 µl Ringerlösung in das andere Auge injiziert. 13 Mäuseaugenpaare konnten ausgewertet werden. Der Mittelwert der CNV-Flächen, die mit dem SDF-1-Spiegelmer behandelt wurden (Mittelwert = 48,8 µm2), war deutlich kleiner als der Mittelwert der mit Ringerlösung behandelten Augen (Mittelwert = 77,5 µm2). Der Wilcoxon matched-pairs signed-ranks test ergab p = 0,021. Dieses Ergebnis lässt darauf schließen, dass das Spiegelmer NOX-A12 die chorioidalen Neovaskularisationen signifikant reduzieren kann. 70 Abbildung 27 Chorioidale Neovaskularisationen durch laserinduzierte Ruptur der Bruchmembran Auf der oben dargestellten Abbildung ist links ein Laserherd mit chorioidaler Neovaskularisation nach Injektion des SDF-1-Spiegelmers abgebildet. Rechts im Bild ist die Kontrolle dargestellt, wobei Gefäße aus der gelaserten Stelle austreten (Pfeil). In einem weiteren Versuch wurden 21 Mäuse mit 2 µl nicht-funktionalem PEG-modifizierten Kontrollspiegelmer revNOX-A12 behandelt. Davon konnten 13 Mäuseaugenpaare ausgewertet werden. Der Mittelwert des nicht-funktionalen Spiegelmers (Mittelwert = 209,6 µm2) war deutlich höher als der Mittelwert der Ringerlösung (Mittelwert = 81,6 µm2). Der Wilcoxon matched-pairs signed-ranks test ergab p = 0,033. Somit kann durch revNOX-A12 eine Steigerung der chorioidalen Neovaskularisationen im laserinduzierten CNV-Maus-Modell erzielt werden. 71 Abbildung 28 CNV-Werte: NOX-A12 high concentration, Werte in mm2 Durch das Spiegelmer NOX-A12 konnte im CNV-Modell der Maus eine signifikante Reduktion der chorioidalen Neovaskularisationen erzielt werden (Abb. 28). Nach intravitrealer Injektion von revNOX-A12, ein PEGyliertes Kontrollspiegelmer mit reverser Nukleotid-Sequenz, wurde eine signifikante Steigerung der chorioidalen Neovaskularisationen beobachtet (ohne Abbildung). 72 4 Diskussion 4.1 Blockade von SDF-1 und CXCR4 in in vivo-Modellen Seit einiger Zeit ist bekannt, dass SDF-1 und CXCR4 in der menschlichen Retina eine wichtige Funktion bei der Bildung neuer Gefäße haben. Neben der erhöhten Expression von CXCR4 und SDF-1 durch Gliazellen, Makrophagen und anderen zirkulierenden Zellen, soll die Rekrutierung CXCR4-positiver endothelialer Progenitorzellen durch Angiogenesefaktoren wie VEGF und SDF-1 aus dem Knochenmark zur Gefäßneubildung beitragen (Lima e Silva 2007). SDF-1 kann zum einen die Expression von VCAM (häufiger Rezeptor auf hämatopoetischen Vorläuferzellen für very late antigen-4) auf Endothelzellen erhöhen, zum anderen die Zell-Zell-Kontakte (tight cellular junctions) reduzieren. Beide Mechanismen erleichtern die Migration und das Homing von EPCs (Butler 2005). Hämatopoetische Stammzellen besitzen eine funktionelle Hämangioblastenaktivität, wonach sie in der Lage sind, sich zu Zellen der hämatopoetischen Reihe sowie auch zu Zellen der endothelialen Reihe zu differenzieren (Grant 2002). Butler et al. konnten 2005 in ihren Versuchen zeigen, dass die SDF-1- und VEGFSpiegel im Glaskörper von Patienten mit diabetischer Retinopathie mit deren Schweregrad ansteigen. In der Glaskörperflüssigkeit von Patienten mit fulminanten Neovaskularisationen der Iris fanden sich im Durchschnitt 1000 pg SDF-1/ml Glaskörperflüssigkeit. Bei Patienten mit diabetischem Makulaödem (DME) und proliferativer diabetischer Retinopathie fanden sich im Durchschnitt 200 pg SDF-1/ml Glaskörperflüssigkeit, während Patienten mit einem DME im Durchschnitt 75 pg SDF-1/ml Glaskörperflüssigkeit aufwiesen (Butler 2005). Erhöhte VEGF- und SDF-1Konzentrationen konnten ebenfalls in Glaskörperproben von kindlichen Augen mir frühkindlicher Retinopathie nachgewiesen werden (Sonmez 2008). Dabei waren die SDF-1-Konzentrationen in den Glaskörperproben mit gefäßbildender ROP im Vergleich zu denen einer fulminanten Neovaskularisation der Iris hoch. 73 Von Sengupta et al. wurde gezeigt, dass allein die Laserläsionen, die zur Ruptur der Bruchmembran führen, über einen Ausschüttung von Wachstumsfaktoren zur Rekrutierung von Stammzellen führen und diese anschließend zur Bildung chorioidaler Neovaskularisationen beitragen (Sengupta 2003). Aufgrund dieser Ergebnisse sollte es auch im CNV- und OIR-Mausmodell möglich sein, durch eine intravitreale Injektion von NOX-A12 die Gefäßneubildungen zu reduzieren, vorausgesetzt es ist genügend SDF-1 vorhanden. CNV-Modell Im CNV-Modell können chorioidale (subretinale) Neovaskularisationen durch das Setzen von Laserherden induziert werden (Sengupta 2003). Makrophagen und die erhöhte Expression von Cytokinen (z. B. TNF-α, CCR3) sowie endotheliale Progenitorzellen aus dem Knochenmark tragen im geschädigten Gewebe zur Entwicklung der laserinduzierten CNV bei (Jasielska 2010, Takeda 2009, Sengupta 2003, 2005). In Versuchen von Sakurai et al. konnte die Größe und Durchlässigkeit der laserinduzierten CNV durch eine pharmakologische Depletierung der Makrophagen signifikant reduziert werden (Sakurai 2003). Diese Ergebnisse unterstützen die Hypothese, dass Makrophagen bei der Bildung von CNV beteiligt sind. VEGF wird derzeit wohl die bedeutendste Rolle bei der Entstehung von chorioidalen Neovaskularisationen zugeschrieben (Kohly 2011, Cao 2010, Sakurai 2003). Der VEGF-Antikörper Ranibizumab und das VEGF-RNA-Aptamer Pegaptanib konnten bereits in zahlreichen klinischen Studien die antiangioproliferative Wirkung in Hinblick auf die altersbedingte Makuladegeneration bestätigen (Colquitt 2008). Lima e Silva et al. zeigten eine antiangiogene Wirkung der CXCR4-Inhibitoren AMD8664 (1 µl, 0,9 mM), TCl4012 (1 µl, 0,3 mM) und Merck compound 3 (1 µl, 1,25 mM) im CNV-Modell. Die periokuläre Injektion im CNV-Modell fand unmittelbar nach der 1. Laserung und sieben Tage später statt (Lima e Silva 2007). 74 Ebenfalls wurden von Sengupta et al. mit einem CXCR4-Antikörper im CNVMausmodell Versuche durchgeführt. Durch eine subretinale Injektion des CXCR4Antikörpers (0,5 µg CXCR4-Antikörper) einen Tag vor der Laserung konnte die Größe der laserinduzierten CNV signifikant reduziert werden (Sengupta 2010). Ebenso konnte durch die subretinale Injektion von 1 µl SDF-1-Antikörper (0.5 mg/ml; R&D Systems, Minneapolis) 7 Tage vor, 1 Tag vor und 1 Tag nach der Laserung eine Reduktion der Neovaskularisation beobachtet werden (Sengupta 2005). Die intraperitoneale Injektion von 1 µg des CXCR4-Antagonisten NefM1 dreimal pro Woche über einen Zeitraum von drei Wochen konnte dagegen keine antiangiogene Wirkung im CNV-Modell erzielen (Sengupta 2010). Im CNV-Modell der Ratte konnte die Arbeitsgruppe von Lee et al. mit dem CXCR4Inhibitor AMD3100 ebenfalls Erfolge erzielen. An P0 und P1 wurde eine Laserung durchgeführt. Den Tieren wurde 14 tagelang 30 mg/kg/d AMD3100 über eine subkutane Pumpe injiziert, was zu einer Reduktion der Neovaskularisationen führte (Lee, Rewolinski 2010). Die intravitreale Injektion des CXCR4-Antikörpers (0,5 µg/µl, R&D Systems) sofort nach der Laserprozedur konnte die Größe der laserinduzierten CNV nicht reduzieren (Sengupta 2010). Bei den vorliegenden Versuchen im CNV-Modell konnte dagegen die intravitreale Injektion von 2 µl SDF-1-Spiegelmer (Dosis: 0.88 nmol = 12.9 µg [Oligonukleotidanteil] = 48 µg [Gesamtmolekül inkl. PEG]) einen antiangiogenen Effekt erzielen (p ≤ 0,02). Durch die Injektion des nicht-funktionalen PEGylierten Kontrollspiegelmers revNOX-A12 konnte ein proangiogener Effekt erzielt werden (p ≤ 0,033). Somit zeigte sich eine signifikante Reduktion der chorioidalen Neovaskularisation durch Injektion des SDF-1-Spiegelmers NOXA-12 im CNVMausmodell. Der Injektionszeitpunkt war ein Tag nach Laserbehandlung. 75 OIR-Modell Im OIR-Mausmodell sind die VEGF- sowie die SDF-1-mRNA-Level in hypoxischen Retinas einen Tag nach Beginn der relativen Hypoxiephase (P13) im Vergleich zu normalen Netzhäuten erhöht. Das mRNA-Level von SDF-1 steigt konstant bis 3 Tage nach Beginn der Hypoxiephase (P15) an (Lima e Silva 2007). Lima e Silva et al. konnten im OIR-Modell der Maus durch die periokuläre Injektion von 3 µl des CXCR4-Inhibitors Merck compound 3 (1,25 mM) die retinalen Neovaskularisationen signifikant reduzieren. Die periokuläre Injektion fand täglich von P12 bis P17 statt (Lima e Silva 2007). In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass die Ausprägung der sauerstoffinduzierten Retinopathie durch eine lokale Therapie mit dem SDF-1-Spiegelmer NOX-A12, welches intravitreal injiziert wurde, keine signifikante Reduktion ergab. Das Spiegelmer wurde intravitreal in zwei verschiedenen Konzentrationen (Dosis high concentration: 880 µM = 12.9 µg [Oligonukleotidanteil] = 48 µg [Gesamtmolekül inkl. PEG] bzw. Dosis low concentration: 88 µM = 1,3 µg [Oligonukleotidanteil] = 4,8 µg [Gesamtmolekül inkl. PEG]), gelöst in Glucose bzw. Ringerlösung, verabreicht. Zudem wurde eine Doppelinjektion mit dem high concentration-Spiegelmer durchgeführt, was ebenso keine signifikante Verringerung der sauerstoffinduzierten angioproliferativen Retinopathie ergab. Nur bei einem von sechs Versuchen mit dem high concentration-Spiegelmer konnte eine signifikante Reduktion der Gefäßneubildung beobachtet werden. Der Retinopathie-Score des Kontrollauges betrug 8, der des Therapieauges 5,5 Punkte (p ≤ 0,009). Ein weiterer Injektionsversuch mit dem high concentration-SDF-1Spiegelmer bewirkte jedoch eine signifikante Steigerung der Gefäßneubildung im Therapieauge. Der Retinopathie-Score des Therapieauges lag bei 6, der des Kontrollauges bei 4 Punkten (p ≤ 0,014). Somit erfolgte die pathologische Revaskularisation beim therapierten Auge deutlich schneller als beim Kontrollauge. Die avaskuläre Zone bei der Verabreichung des Spiegelmers in niedriger Konzentration, gelöst in Glucose, zeigte ebenfalls im Gegensatz zur Kontrollgruppe eine signifikant Sauerstoffexposition. schnellere pathologische Revaskularisation nach 76 Dies würde eine proangiogene Wirkung des SDF-1-Spiegelmers, eine antiproliferative Wirkung der injizierten Glucoselösung, bzw. eine proangiogene Wirkung des Spiegelmers in Verbindung mit der Glucoselösung bedeuten. Um auszuschließen, dass die Glucoselösung für die proliferativen Effekte verantwortlich war, wurde in einem weiteren Versuch PBS gegen Glucose geprüft. In diesem weiteren Versuch wurden diese Hypothesen nicht bestätigt. Fasst man die Injektionsergebnisse mit dem SDF-1-Spiegelmer zusammen, lässt sich keine reproduzierbare Reduktion der Gefäßneubildung beobachten. Anlass für weitere Versuche im OIR-Mausmodell waren die durch Butler et al. erzielten Ergebnisse. Eine signifikante Reduktion der Gefäßneubildung wurde durch die Arbeitsgruppe von Butler et al. mit einem SDF-1-Antikörper in einem Mausmodell erzielt, das den Pathomechanismus bei der proliferativen diabetischen Retinopathie wiederspiegelt. In diesem Mausmodell, dass zuvor von Grant et al. beschrieben wurde, wurden chimäre Mäuse (C57BL/6 gfp radiation chimeric mice) generiert, indem diese zuerst mit 9,5 Gy bestrahlt und anschließend einer intraokuläre Injektion mit angereicherten hämatopoetischen Stammzellen von GFP +-Spendermäusen unterzogen worden sind. Nach Akzeptanz der hämatopoetischen Zellen durch das Knochenmark wurde eine intravitreale Injektion von adeno-associated virus-VEGF durchgeführt. Alsdann wurde innerhalb von einem Monat eine Photocoagulation der Hälfte des blinden Flecks mittels Argonlaser vorgenommen. Ab dem Laserzeitpunkt wurde vier Wochen lang eine wöchentliche intravitreale Injektion des SDF-1Antikörpers (Zielkonzentration: 1 µg/µl Glaskörperflüssigkeit) durchgeführt (Butler 2005). Eine signifikante antiangiogene Wirkung des SDF-1-Antikörpers (Injektionsvolumen 2 µl, 0,5 mg/ml) konnte bei Versuchen im OIR-Mausmodell in unserem Labor nicht beobachtet werden. Nach Injektion des SDF-1-Antikörpers an Tag 12 und Perfusion und Präparation der Netzhäute an Tag 17 wurden die Flatmounts nach Lange et al. ausgewertet. Der Retinopathie-Score im Therapieauge lag bei 5, der im Kontrollauge bei 4 Punkten. Der Wilcoxon Signed Rank Test zeigte eine nicht signifikante Änderung der Retinopathie im therapierten Auge (p < 0,159). 77 Autor Modell Tier CNV-Modell Maus CNV-Modell Maus CNV-Modell Lima e Silva 2005 Sengupta 2010 Sengupta 2010 Lee 2010 Sengupta 2010 Bauer 2010 CXCR4-Inhibitoren: AMD8664, Injektionsart Ergebnis periokulär + CXCR4-Antikörper (R&D Systems) subretinal + Maus SDF1-Antikörper (R&D Systems) subretinal + CNV-Modell Maus CXCR4-Antagonist: NefM1 intraperitoneal - CNV-Modell Ratte CXCR4-Inhibitor: AMD3100 subkutan + CNV-Modell Maus CXCR4-Antikörper (R&D Systems) intravitreal - CNV-Modell Maus SDF-1-Spiegelmer (NOXXON®) intravitreal + OIR-Modell Maus CXCR4-Inhibitor: Merck compound 3 periokulär + OIR-Modell Maus SDF-1-Spiegelmer (NOXXON®) intravitreal - OIR-Modell Maus intravitreal - intravitreal + 2007 Sengupta Hemmstoff TCl4012, Merck compound 3 Lima e Silva 2007 Bauer 2010 Bauer 2010 Butler 2005 Adultes RetinopathieModell Maus SDF-1-Antikörper (MAB 310, R&D Systems) SDF-1-Antikörper (MAB 310, R&D Systems) Tabelle 11 Zusammenfassung der Ergebnisse vorangegangener und aktueller Versuche (+ antiangiogene Wirkung, - keine signifikante Wirkung) 78 Die Versuchsübersicht zeigt, dass bislang in CNV-Modellen, sowie in einem weiteren Mausmodell, eine signifikante Hemmung der Gefäßneubildung durch ein SDF-1Spiegelmer/ –Antikörper bzw. CXCR4-Antagonisten/ -Antikörper erzielt werden konnte. Eine signifikante Reduktion der Neovaskularisation ergab unterdessen auch die periokuläre Injektion des CXCR4-Inhibitors Merck compound 3 im OIR-Modell. In der Übersicht wird die Bedeutung der Injektionsform veranschaulicht. Auswertung der Proliferationsscores Die Auswertung der Proliferationsscores im OIR-Versuch erfolgte mithilfe des beschriebenen Auswertschemas. Ursprünglich wurde der Score von Higgins 1999 zur klinischen Beurteilung der Frühgeborenenretinopathie entwickelt (Higgins 1999). Inzwischen bestehen modifizierte Auswertschemata zur Beurteilung des Schweregrads der sauerstoffinduzierten Retinopathie. Zwei der Versuche mit dem Spiegelmer high concentration wurden nicht nach Bauer, sondern nach Gogaki (Gogaki 2003) bzw. Unsöld (Unsoeld 2004) auswertet. Es trat bei beiden Versuchen ein signifikanter Effekt auf, der jedoch gegensätzlich war. Bei Aufgliederung des Gesamtscores waren die Tuft- bzw. Tuft- und Clusterscores signifikant erniedrigt bzw. erhöht. Diese zwei Bewertungsschemata sollen nun miteinander verglichen werden, um Einflüsse der verschiedenen Scoringsysteme auf das Ergebnis der OIR-Versuche genauer beurteilen zu können. Von beiden Autorinnen wurden die Bewertungskriterien avaskuläre Zone, Tufts, Cluster und die Gefäßschlängelung in die Bewertung einbezogen. Gogaki verwendete zusätzlich das Kriterium Papillenproliferation. Die maximal erreichbare Punkteanzahl lag nach Unsöld bei 13 Punkten, nach Gogaki bei 56 Punkten. 79 Punkteverteilung Unsöld 2004 Gogaki 2003 0 P. Keine Tufts 1 P. in < 3 Uhrzeiten Zone 2 pro Feld >1 Tuft 1 Punkt; max. 4 Punkte 2 P. in 3 – 5 Uhrzeiten Zone 3 pro Feld >1 Tuft 1 Punkt; max. 12 Punkte 3 P. in 6 – 8 Uhrzeiten Zone 4 pro Feld >1 Tuft 1 Punkt; max. 12 Punkte 4 P. in 9 – 12 Uhrzeiten max. 28 Punkte max. 4 Punkte 0 P. Keine Cluster 1 P. in < 3 Uhrzeiten 1 Punkt für jedes Cluster, das mehr als 3 2 P. in 3 – 6 Uhrzeiten Uhrzeiten bedeckt 3 P. in > 6 Uhrzeiten max. 8 Punkte max. 3 Punkte Papillenproliferation 0 P. Keine 1 P. < 1/3 der Gefäße Gefäßschlängelung 2 P. 1/3 – 2/3 der Gefäße 3 P. > 2/3 der Gefäße max. 3 Punkte 0 P. keine oder < 50 % der inneren Zone 1 P. < 25 % der inneren und mittleren Zone Avaskuläre Zone 2 P. 25 – 50 % der inneren und mittleren Zone 3 P. > 50 % der inneren und mittleren Zone max. 3 Punkte Max. Punktzahl 13 Punkte Zone 1 > 1 Tuft 1 Punkt; max. 1 Punkt 1 – 2 P. < 1/3 der Gefäße 3 – 4 P. 1/3 – 2/3 der Gefäße 5 – 6 P. > 2/3 der Gefäße max. 6 Punkte 1 P. > 50 % der Zone 1 1 P. > 50% jedes Flügels der Zone 2 und 3 Max: Zone 1: 1 Punkt Zone 2: 4 Punkte Zone 3: 4 Punkte Zone 4: 4 Punkte max. 13 Punkte 56 Punkte Tabelle 12 Gegenüberstellung der Punkteverteilung bei Auswertung nach Unsöld 2004 bzw. Gogaki 2003 80 In der Übersicht lässt sich erkennen, dass im Bereich der Tuft-Punktevergabe das Auswertschema von Gogaki aufgrund exakterer Zuteilung der Punkte nach Tuft-Lokalisation besser reproduzierbar ist. Das Schema nach Gogaki legt mehr Gewicht auf Substanz Therapieauge NOX-A12 – hc Unsöld 2004 die Anzahl Substanz der n Mäuse Kontrollauge Cluster und kleinerer Score Score Therapieauge Kontrollauge Cluster. P Gefäßproliferation Ringerlösung 24 6 4 0,013 ˄ PBS 24 5,5 8,0 0,009 ˅ NOX-A12 – hc Gogaki 2003 Tabelle 13 NOX-A12 hc im Vergleich Betrachtet man die erreichten Punktescores, fällt auf, dass bei dem Injektionsversuch mit Auswertung nach Gogaki sehr niedrige Scores im Verhältnis zur maximalen Punktzahl erreicht wurden. Dies lässt auf eine allgemein schwächere Gefäßproliferation z. B. durch schwankende O2-Konzentration während der Sauerstoffexposition schließen. Die Arbeitsgruppe von Stahl et al. zeigte in Ihren Versuchen, dass eine postnatale Mangelernährung und eine langsame Gewichtszunahme zu einer erhöhten Expression von VEGF führen, und so eine Retinopathie ebenso begünstigen kann (Stahl 2010). 4.2 Das SDF-1-Spiegelmer Spiegelmere® sind L-konfigurierte Oligonukleotide, welche nicht durch endogene Nukleasen abgebaut werden. Zudem sind sie nicht in der Lage, mit natürlichen Nukleinsäuren zu hybridisieren. Sie sind metabolisch außergewöhnlich stabil und können schon nach einer einzigen Injektion über eine lange Zeit zu einer Neutralisation des Zielpeptids führen. 81 In zahlreichen Studien wurde bereits die Wirkung von Spiegelmeren untersucht. Die Arbeitsgruppe von Teubner et al. konnte nachweisen, dass beim sibirischen Hamster nach Gabe von exogenem Ghrelin eine vermehrte Nahrungsaufnahme durch die periphere Injektion von Ghrelin-Spiegelmer verhindert werden kann (Teubner 2010). Ebenso wurden mit dem RNA-Spiegelmer NOX-C89, ein CGRP-Inhibitor, erste Erfolge in einem Rattenmodell erzielt, was neue Behandlungsstrategien bei Migräne eröffnen könnte (Denekas 2006). Sayyed et al. konnten an einem Typ 2-Mausmodell der diabetischen Nephropathie zeigen, dass der Einsatz des SDF-1-Spiegelmers NOX A-12 zu einer Reduktion der Glomerulosklerose und zu einer Stabilisierung der Podozytenzahl führt. Eine subkutane Injektion von 50 mg/kg (13.4 mg/kg bezogen auf den Oligonukleotid-Anteil ohne PEG) NOX-A12 in 5%iger Glucose in 4 Monate alte männliche C57BLKS db/db-Mäuse wurde über einen Zeitraum von 8 Wochen an jedem zweiten Tag durchgeführt (Sayyed 2009). Die Phase I-Studie mit der Gabe einer Einzeldosis von NOX-E36, das spezifisch das proinflammatorische Chemokin MCP-1 (CCL2) blockieren und so den Abfall der Nierenfunktion verhindern soll, wurde bereits erfolgreich abgeschlossen. Eine zweite Phase I-Studie mit Mehrfachgabe von NOX-E36 wird derzeit an gesunden Patienten und Patienten mit diabetischer Nephropathie durchgeführt. Eine Phase I-Studie mit systemischer Einmalgabe wurde für NOX-A12 bereits beendet. Auch in dieser Studie zeigte sich eine sehr gute Verträglichkeit des Spiegelmers. Diese Phase I-Studie soll den Weg ebnen für die Anwendung von NOX-A12 in onkologischen Indikationen (NOXXON Pharma AG 10.09.2010). Als ein Grund für die unzureichende antiangiogene Wirkung in den vorliegenden Versuchen könnte die Humanspezifität des SDF-1-Spiegelmers genannt werden. NOX-A12 inhibiert jedoch auch Maus-SDF-1, was durch die Arbeitsgruppe von Sayyed et al. mithilfe eines Chemotaxis-Assay gezeigt wurde. Auch beim vorliegenden Injektionsversuch im CNV-Mausmodell konnte eine signifikante Reduktion der chorioidalen Gefäßneubildung erzielt werden. Zudem ist SDF-1 ein hochkonserviertes Gen, dessen Sequenz ungewöhnlich stark zwischen den Spezies konserviert ist. 82 Die Konzentration für das Spiegelmer zur intravitrealen Injektion in das Mausauge wurde von NOXXON aufgrund der in vivo-Versuchsdaten von Butler et al. errechnet (Butler 2005). Butler et al. verwendeten den SDF-1-Antikörper in einer Konzentration von 1 µg/µl und 0,1 µg/µl. Bei einer Molmasse des Antikörpers von ca. 160 kDa entspricht dies ungefähr 6 µM bzw. 0,6 µM. Das PEGylierte Spiegelmer hat eine Molmasse von 54 kDa. Die Zielkonzentration von 6 µM wurde mit 0,3 µg/µl bzw. 0,03 µg/µl PEGyliertem Spiegelmer erreicht. Um eine Spiegelmer-Konzentration von 0,3 µg/µl zu erreichen, müssen bei einem Volumen des Mausauges von 16 µl 4,8 µg PEGyliertes Spiegelmer injiziert werden (4,8/16 µl = 0,3 µg/µl). Bei einem Injektionsvolumen von 2 µl wurden somit 2,4 mg/ml bzw. 0,24 mg/ml PEGyliertes Spiegelmer injiziert. Bei Zellkulturexperimente (chemotaxis assay mit Jurkatzellen) die durch NOXXON® im Vorfeld durchgeführt wurden, wurde eine halbmaximale inhibitorische Konzentration (IC50) von circa 200 pM gemessen. Die IC90 lag bei 3 nM. Somit müsste bei einer Spiegelmer-Zielkonzentration von 6 µM im Vitreus sämtliches vorhandenes SDF-1 neutralisiert werden. 4.3 Lokalisation In den vorliegenden Versuchen wurden mit einem Antikörper gegen Pecam-1 und SDF-1 immunhistochemische Färbungen an Kryoschnitten durchgeführt. Dabei wurde durch den Pecam-1-Antikörper das Gefäßendothel in der Ganglienzellschicht, in der inneren plexiformen Schicht und in der äußeren plexiformen Schicht angefärbt. Im Gegensatz Außensegmente dazu des wurden durch den Sinnesepithels, die SDF-1-Antikörper innere vor allem die Körnerschicht und die Ganglienzellschicht angefärbt. Für die SDF-1-Expression könnten Müller-Stützzellen verantwortlich sein, da das Expressionsmuster die innere Körnerschicht durchzog und in den Zellkernbereichen der inneren Körnerschicht eine Anfärbung sichtbar war. Zwischen Mäusen mit sauerstoffinduzierter Retinopathie und normalen Mäusen zeigten sich dabei keine Unterschiede im Expressionsmuster. Die Expressionsmuster von SDF-1 und Pecam-1 wiesen nur wenige Übereinstimmungen auf, was bedeutet, dass SDF-1 nicht auf Gefäße exprimiert wird. 83 Ein ähnliches Ergebnis erzielte die Arbeitsgruppe von Lima e Silva mit einer Whole mount-Färbung. CXCR4 positive Zellen waren retinalen Gefäßzellen benachbart, exprimierten jedoch nicht PECAM-1 (Lima e Silva 2007). Von der Arbeitsgruppe wurde zudem vermutet, dass überwiegend retinale Gliazellen für die Expression von CXCR4 und SDF-1 verantwortlich sind. Bei der Färbung mit GFAP (Glial fibrillary acidic protein) was mehrheitlich in aktivierten Astrozyten und einigen Müller-Zellen vorkommt, konnte dies in der inneren Hälfte der ischämischen Retina und in einem Band entlang der äußeren Retina detektiert werden und zeigte dabei ein ähnliches Muster wie CXCR4 und SDF-1. Die Immunhistochemie mit CD45 wies ein ähnliches Muster wie die CXCR4- und die F4/80-Färbung auf. Daraus lässt sich schließen, dass Mikrogliazellen für die Expression von CXCR4 verantwortlich sind (Lima e Silva 2007). In den vorliegenden immunhistochemischen Färbungen wurde ein ähnliches Expressionsmuster beobachtet, was die Vermutung von Lima e Silva unterstützt. Bei immunhistochemischen Versuchen an menschlichen Augen von Feten konnte SDF-1 ebenfalls in der inneren Retina, besonders nahe der inneren Grenzschicht nachgewiesen werden. Die stärkste Intensität zeigte das SDF-1-Muster in der Nervenfaserschicht, wohin Angioblasten einwandern. Zwischen der 7 und 12 WG konnten in der inneren Retina Vorläuferzellen entdeckt werden, die positiv für CXCR4 und c-Kit (CD117, Stammzellfaktorrezeptor) waren. Von einigen Vorläuferzellen wurde zusätzlich CD39 (NTPDase-1 auf Endothelzellen) exprimiert. Während der Zellmigration und der Bildung von Zellsträngen wurde CXCR4 von CD39-positiven Zellen weiterhin exprimiert, C-Kit war dagegen downreguliert. Diese CXCR4Expression nahm mit der Kanalisation der Gefäße jedoch ab (Hasegawa 2008). C-Kit wird unter anderem auf multipotenten Progenitorzellen, CD39 auf Lymphozyten, dendritischen Zellen, Makrophagen und Endothelzellen exprimiert. Dies würde die Hypothese unterstützen, dass SDF-1 bei der Angiogenese durch die Rekrutierung von endothelialen Vorläuferzellen eine Rolle spielt. 84 Bhutto et al. unternahmen 2006 ebenfalls erste Versuche SDF-1 und CXCR4 immunhistochemisch im menschlichen Auge bei AMD zu lokalisieren. Das SDF-1Muster war dabei in der inneren Photorezeptorenschicht am intensivsten, aber auch in der inneren Grenzschicht und in großen Gefäßen vorhanden. CXCR4 zeigte ein ähnliches Muster, war jedoch verstärkt an den inneren Photorezeptorsegmenten und an den Endothelzellen von großen Gefäßen vorhanden ist. In der inneren Körnerzellschicht konnten keine Signale entdeckt werden. Ebenfalls wurde im apikalen und basalen Anteil des RPE ein Signal für SDF-1 und CXCR4 gefunden. Das Muster von SDF-1 und CXCR4 war in Augen mit AMD ähnlich dem der Augen ohne AMD (Bhutto 2006). Von der Arbeitsgruppe von Crane et al. wurde mit Hilfe einer RT-PCR gezeigt, dass ein dominierender Rezeptor auf RPE-Zellen CXCR4 ist, durch Flow cytometry und weiteren Versuchen bestätigt wurde (Crane 2000). Die Arbeitsgruppen von Bhutto et al. und Crane et al. nahmen beide eine Expression von CXCR4 durch das RPE an. 85 SDF-1 OIR, Maus Normal, Maus Lima e Silva 2008 - Innerer Teil der Retina, Gliazellen Fetales Auge, Mensch Hasegawa 2007 16. + 20 WG: avaskuläre innere Retina > vaskuläre innere Retina AMD, menschliches Auge Innere Grenzmembran, innere Bhutto 2006 Photorezeptorenschicht, große retinale Blutgefäße, RPE, Chorioidea (inkl. Stroma, Gefäße, Choriokapillaris) CNV, Maus Sengupta 2010 Laserherde, Ganglienzellschicht, vorderer Teil der inneren Körnerschicht, Chorioidea Bauer 2010 Ganglienzellen, Außensegmente des Sinnesepithels, innere Körnerschicht Menschliches Auge (Kontrolle) Innere Grenzmembran, innere Photorezeptorenschicht, große retinale Blutgefäße, RPE Normal, Maus Innerer Teil der Retina, innerer Teil der inneren Körnerschicht, Chorioidea, Laserherde anterior der restlichen einreihigen RPE-Schicht Ganglienzellen, Außensegmente des Sinnesepithels, innere Körnerschicht Tabelle 14 Zusammenfassung der immunhistologischen Ergebnisse anderer Arbeitsgruppen zur Lokalisation von SDF-1 86 CXCR4 Maus, OIR, P17 Maus, normal, P17 Innerer Teil der Retina, Gliazellen Lima e Silva RPE, Chorioidea, (Retina) CNV, Maus 2008 CNV-Herde Fetales Auge, Mensch Hasegawa 16.+ 20 WG: Angioblasten in der Ganglionzellschicht, avaskuläre Retina 2007 Bhutto 2006 AMD, menschliches Auge Menschliches Auge (Kontrolle) Innere Grenzmembran, Innere Grenzmembran, Endothelzellen Endothelzellen großer retinaler großer retinaler Blutgefäße, RPE, Blutgefäße, RPE, Chorioidea Chorioidea CNV, Maus Normal, Maus Zellen anterior des RPEs in den Sengupta 2010 Laserherden, Ganglionzellschicht, Ganglionzellschicht, vorderer Teil der vorderer Teil der inneren inneren Körnerschicht, Photorezeptoren, Körnerschicht, Photorezeptoren, Chorioidea Chorioidea Tabelle 15 Zusammenfassung der immunhistologischen Ergebnisse anderer Arbeitsgruppen zur Lokalisation von CXCR4 In den beiden oben abgebildeten Tabellen sind die immunhistologischen Ergebnisse für SDF-1 und CXCR4 zusammengefasst. Dabei ist auffällig, das SDF-1 nicht konstant auf Gefäßendothelzellen in der Retina nachgewiesen werden konnte, was vielfach postuliert wurde (Schober 2003; Bhutto 2006). Unsere immunhistochemischen Untersuchungen bestätigen die fehlende Expression von SDF-1 durch retinales Gefäßendothel. Dagegen wurde der Rezeptor CXCR4 beinahe konstant im retinalen Pigmentepithel, in der Chorioidea, Photorezeptorenschicht sowie in den CNV-Laserherden nachgewiesen. in der 87 Dies könnte die Tatsache erklären, dass das SDF-1-Spiegelmer seine Wirkung im OIR-Mausmodell nicht entfalten konnte, dagegen im CNV-Mausmodell. Ebenso würde dieses Expressionsmuster erklären, warum eine Inhibition des CXCR4Rezeptors im OIR-Mausmodell zu einer Reduktion der Gefäßneubildung führt, jedoch nicht die Inhibition von SDF-1. Offen bleibt, wie sich die SDF-1-Expression zu den Zeitpunkten p12 bis p16 im OIR-Modell verhält. Eventuell können die unterschiedlichen Expressionsmuster der verschiedenen Arbeitsgruppen dadurch erklärt werden, dass die Expression von SDF-1 durch den SDF1-Promotorbereich vielen Einflüssen unterliegt und es je nach Umgebungsedingungen (Hypoxie, IL1β, mitogene Stimuli, Röntgenstrahlung) zu einer unterschiedlichen Regulierung der SDF-1-Expression kommt. 4.4 SDF-1 und sein Rezeptor CXCR4 Durch Hypoxie wird die Expression von SDF-1 über einen durch Integrin Linked Kinasen und HIF-1 vermittelten Weg gesteigert. Dabei ist die SDF-1-Expression direkt abhängig von der Höhe der Hypoxie (Ceradini 2004). Bereits nanomolare Mengen von SDF-1 können über einen Proteinkinase C-abhängigen und VEGF unabhängigen Weg die HO-1-Produktion in Endothelzellen fördern (Deshane 2007). In vitro Studien konnten belegen, dass durch VEGF und bFGF die SDF-1-Expression in Gefäßendothelzellen gesteigert werden kann. Dabei geht man davon aus, dass durch die Hemmung von SDF-1 auch VEGF deutlich reduziert werden kann. Die Gefäßneubildung in einem Matrigel Angiogenesis Assay in 6 – 8 Wochen alten Mäusen, welche durch VEGF induziert wurde, konnte durch einen Anti-SDF-1Antikörper merklich reduziert werden (Salvucci 2002). Weiterhin wurde entdeckt, dass VEGF die Expression von CXCR4 in Endothelzellen fördert, während SDF-1 die VEGF-Expression in hämatopoetischen und endothelialen Zellen erhöht (Kryczek 2005). So wird von einer positiven Feedback-Schleife zwischen VEGF und SDF-1 bzw. CXCR4 ausgegangen. 88 AMD3100 TGF-β1 AMD8664 p53 TCl4012 Chalcone 4 Merck compound 3 FGF2 Dll4/Notch Steroide CXCR4 VEGF SDF-1 Hypoxie, HIFα, VEGF Hypoxie, HIFα, NF-KB, Östrogene VEGF, FGF, NF-KB Angiogenese Tumorwachstum Metastasierung Mobilisierung und Homing von Stammzellen Embryogenese/ Organogenese Entzündung hIGF, IL2, PHA, FGF Hemmung/Downregulation Förderung/Upregulation Abbildung 29 Regulierung von SDF-1 und CXCR4 Synergistische Effekte von VEGF und SDF-1 wurden von Kryczek et al. bei der Gefäßneubildung in Tumoren beschrieben (Kryczek 2005). In der Gesamtheit betrachtet ist SDF-1 und sein Rezeptor CXCR4 ein Glied in einem AngiogeneseNetzwerk. Eventuell ist es auch bei der Therapie mit dem SDF-1-Spiegelmer im OIRMausmodell nötig, den Synergismus zwischen VEGF und SDF-1 zu nutzen, um eine Hemmung der Gefäßneubildung zu erzielen. 89 Neben CXCR4 ist CXCR7 (RDC 1) als weiterer Rezeptor für SDF-1 bekannt. CXCR7 ist ebenfalls ein G-Protein-gekoppelter 7-Transmembranrezeptor und kann neben SDF-1 (CXCL12) ebenso I-TAC (CXCL11) binden. Die Bindung von SDF-1oder ITAX an CXCR7 führt nicht zu einer Calciummobilisation oder Zellmigration, kann jedoch Zellen zu einem Wachstum- oder Überlebensvorteil verhelfen. Er wird auf vielen Zellen des blutbildenden und lymphogenen Systems exprimiert und reguliert proangiogene Faktoren wie IL-8 und VEGF (Wang 2008). Ebenso kann CXCR4 die CXCR7-Expression regulieren. SDF-1 hat eine 10fach höhere Affinität zu CXCR7 als zu CXCR4 (Balabanian 2010). Auch CXCR7 wird eine Bedeutung bei der Tumorentstehung und Metastasierung zugeschrieben. CXCR7 wird sowohl von Karzinomzellen der Lunge und des Brustdrüsengewebes, als auch auf Tumorgefäße exprimiert (Miao 2007). Die CXCR7-Expression korreliert dabei mit der Lymphknotenmetastasierung und dem Schweregrad der endothelialen und Erkrankung. Ebenso lymphogenen konnte Endothelzellen der CXCR7-Rezeptor während einer auf renalen Allograftreaktion detektiert werden (Neusser 2010). Wird CXCR4 durch einen Antagonisten oder Antikörper gehemmt, so kann SDF-1 weiterhin über CXCR7 seine Wirkung entfalten. Unter der Annahme, dass CXCR7 nicht nur in der Tumorangiogenese eine Rolle spielt, könnte so erklärt werden, weshalb eine Hemmung des CXCR4-Rezeptors durch intravitreale Injektion eines Antikörpers im CNV-Modell zu keiner (Sengupta 2010), jedoch die Injektion des SDF1-Spiegelmers zu einer Neovaskularisationen führt. signifikanten Reduktion der chorioidalen 90 5 Zusammenfassung Bei menschlichen Augen mir frühkindlicher Retinopathie konnten erhöhte SDF-1- und VEGF-Konzentrationen in der Glaskörperflüssigkeit nachgewiesen werden. Eine Hemmung von SDF-1 kann die Rekrutierung von zirkulierenden EPCs, die auch für die Gefäßneubildung von Bedeutung sind, verhindern. Daher wurde in der vorliegenden Arbeit geprüft, ob ein Spiegelmer, das SDF-1 durch seine Bindung hemmt, auch die retinale Gefäßneubildung im OIR-Modell der Maus und die chorioidale Gefäßneubildung im CNV-Mausmodell reduziert. Obwohl SDF-1 und CXCR4 mit RT-PCR und SDF-1 mittels immunhistochemischer Färbung in der Retina nachgewiesen wurden, konnte durch intravitreale Injektion eines Spiegelmers gegen SDF-1 im OIR-Modell keine Reduktion der retinalen Gefäßneubildung erreicht werden. Nach intravitrealer Injektion eines Antikörpers gegen SDF-1 wurde ebenfalls keine signifikante Reduktion der retinalen Gefäßproliferationen im OIR-Modell beobachtet. Im laserinduzierten CNV-Modell der Maus konnte jedoch durch Injektion des SDF-1-Spiegelmers eine signifikante Reduktion der chorioidalen Neovaskularisationen erreicht werden. Nach Abgleich der in vivo-Versuchsdaten mit immunhistochemischen Färbungen ist davon auszugehen, dass das Gefäßendothel in der Retina nicht oder nicht ausreichend zur Expression von SDF-1 und CXCR4 beiträgt. Im Gegensatz dazu kann im CNV-Mausmodell davon ausgegangen werden, das es durch die Laserung ebenfalls zur SDF-1-vermittelten Rekrutierung von hämatopoetischen Vorläuferzellen kommt, die durch die Injektion des SDF-1-bindenden Spiegelmers verhindert wird. 91 6 Literaturverzeichnis Afzal, A.; Shaw, L. C.; Ljubimov, A. V.; Boulton, M. E.; Segal, M. S.; Grant, M. B. (2007): Retinal and choroidal microangiopathies: therapeutic opportunities. In: Microvascular research, Jg. 74, H. 2-3, S. 131–144. Arbogast, Rainer; Bauer, H.; Schackert, H. K. (2008): Chirurgisches Forum 2008. Für experimentelle und klinische Forschung, 125. Kongress der Deutschen Gesellschaft für Chirurgie Berlin. Volume 37, Springer Medizin Verlag, Heidelberg. Balabanian, Karl; Lagane, Bernard; Infantino, Simona; Chow, Ken Y. C.; Harriague, Julie; Moepps, Barbara et al. (2005): The chemokine SDF-1/CXCL12 binds to and signals through the orphan receptor RDC1 in T lymphocytes. In: The Journal of biological chemistry, Jg. 280, H. 42, S. 35760–35766. Balkwill, Fran (1998): The molecular and cellular biology of the chemokines. In: Journal of viral hepatitis, Jg. 5, H. 1, S. 1–14. Balkwill, Fran (2004): Cancer and the chemokine network. In: Nature reviews. Cancer, Jg. 4, H. 7, S. 540–550. Begley, Lesa; Monteleon, Christine; Shah, Rajal B.; Macdonald, James W.; Macoska, Jill A. (2005): CXCL12 overexpression and secretion by aging fibroblasts enhance human prostate epithelial proliferation in vitro. In: Aging cell, Jg. 4, H. 6, S. 291–298. Bhutto, I. A.; McLeod, D. S.; Merges, C.; Hasegawa, T.; Lutty, G. A. (2006): Localisation of SDF-1 and its receptor CXCR4 in retina and choroid of aged human eyes and in eyes with age related macular degeneration. In: The British journal of ophthalmology, Jg. 90, H. 7, S. 906–910. Brooks, H. Logan; Caballero, Sergio; Newell, Charles K.; Steinmetz, Robert L.; Watson, Debbie; Segal, Mark S. et al. (2004): Vitreous levels of vascular endothelial growth factor and stromal-derived factor 1 in patients with diabetic retinopathy and cystoid macular edema before and after intraocular injection of triamcinolone. In: Archives of ophthalmology, Jg. 122, H. 12, S. 1801–1807. 92 Broxmeyer, Hal E. (2008): Chemokines in hematopoiesis. In: Current opinion in hematology, Jg. 15, H. 1, S. 49–58. Brunner, Simon; Schernthaner, Gerit-Holger; Satler, Miriam; Elhenicky, Marie; Hoellerl, Florian; Schmid-Kubista, Katharina E. et al. (2009): Correlation of different circulating endothelial progenitor cells to stages of diabetic retinopathy: first in vivo data. In: Investigative ophthalmology & visual science, Jg. 50, H. 1, S. 392–398. Butler, Jason M.; Guthrie, Steven M.; Koc, Mehmet; Afzal, Aqeela; Caballero, Sergio; Brooks, H. Logan et al. (2005): SDF-1 is both necessary and sufficient to promote proliferative retinopathy. In: The Journal of clinical investigation, Jg. 115, H. 1, S. 86– 93. Ceradini, Daniel J.; Kulkarni, Anita R.; Callaghan, Matthew J.; Tepper, Oren M.; Bastidas, Nicholas; Kleinman, Mark E. et al. (2004): Progenitor cell trafficking is regulated by hypoxic gradients through HIF-1 induction of SDF-1. In: Nature medicine, Jg. 10, H. 8, S. 858–864. Chen, Jing; Smith, Lois E. H. (2007): Retinopathy of prematurity. In: Angiogenesis, Jg. 10, H. 2, S. 133–140. Online verfügbar unter doi:10.1007/s10456-007-9066-0. Christ, Bodo; Brand-Saberi, Beate (2004): Molekulare Grundlagen der Embryonalentwicklung. Für Studierende der Humanmedizin, Molekularmedizin und Biologie. Lehmann Media – LOB, Berlin. Christ, Bodo; Wachtler, Franz; Wilhelm, Christian (1998): Medizinische Embryologie. Molekulargenetik, Morphologie, Klinik. Ullstein Medical, Berlin. Colquitt, J. L.; Jones, J.; Tan, S. C.; Takeda, A.; Clegg, A. J.; Price, A. (2008): Ranibizumab and pegaptanib for the treatment of age-related macular degeneration: a systematic review and economic evaluation. In: Health technology assessment (Winchester, England), Jg. 12, H. 16, S. iii-iv, ix-201. Crane, I. J.; Wallace, C. A.; McKillop-Smith, S.; Forrester, J. V. (2000): CXCR4 receptor expression on human retinal pigment epithelial cells from the blood-retina barrier leads to chemokine secretion and migration in response to stromal cellderived factor 1 alpha. In: Journal of immunology (Baltimore, Md. : 1950), Jg. 165, H. 8, S. 4372–4378. 93 Crump, M. P.; Gong, J. H.; Loetscher, P.; Rajarathnam, K.; Amara, A.; ArenzanaSeisdedos, F. et al. (1997): Solution structure and basis for functional activity of stromal cell-derived factor-1; dissociation of CXCR4 activation from binding and inhibition of HIV-1. In: The EMBO journal, Jg. 16, H. 23, S. 6996–7007. Cunningham, S.; Fleck, B. W.; Elton, R. A.; McIntosh, N. (1995): Transcutaneous oxygen levels in retinopathy of prematurity. In: Lancet, Jg. 346, H. 8988, S. 1464– 1465. Denekas, Thomas; Tröltzsch, Markus; Vater, Axel; Klussmann, Sven; Messlinger, Karl (2006): Inhibition of stimulated meningeal blood flow by a calcitonin gene-related peptide binding mirror-image RNA oligonucleotide. In: British journal of pharmacology, Jg. 148, H. 4, S. 536–543. Deshane, Jessy; Chen, Sifeng; Caballero, Sergio; Grochot-Przeczek, Anna; Was, Halina; Li Calzi, Sergio et al. (2007): Stromal cell-derived factor 1 promotes angiogenesis via a heme oxygenase 1-dependent mechanism. In: The Journal of experimental medicine, Jg. 204, H. 3, S. 605–618. Ehlken, Christoph (2007): Expression Angiogenese-assoziierter Faktoren in der sich postnatal entwickelnden Retina der Maus unter besonderer Berücksichtigung des Eph/Ephrin-Rezeptor-Liganden-Systems. Dissertation. Betreut von Lutz Lothar (Prof ). Hansen. Freiburg. Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, Univ.-Augenklinik. Online verfügbar unter http://www.freidok.uni-freiburg.de/volltexte/7304/. Emminger, Hamid A.; Kia, Thomas (2007): Exaplan. Das Kompendium der klinischen Medizin. 5. Auflage. Urban & Fischer in Elsevier, München. Foulds, W. S.; Kaur, C.; Luu, C. D.; Kek, W. K. (2010): A role for photoreceptors in retinal oedema and angiogenesis: an additional explanation for laser treatment? In: Eye (London, England), Jg. 24, H. 5, S. 918–926. Ganten, Detlev; Bader, Michael (2003): Grundlagen der molekularen Medizin. Mit 28 Tabellen. 2., überarb. und erw. Aufl. Springer, Berlin. Gao, G.; Li, Y.; Zhang, D.; Gee, S.; Crosson, C.; Ma, J. (2001): Unbalanced expression of VEGF and PEDF in ischemia-induced retinal neovascularization. In: FEBS letters, Jg. 489, H. 2-3, S. 270–276. 94 Gleichmann, M.; Gillen, C.; Czardybon, M.; Bosse, F.; Greiner-Petter, R.; Auer, J.; Müller, H. W. (2000): Cloning and characterization of SDF-1gamma, a novel SDF-1 chemokine transcript with developmentally regulated expression in the nervous system. In: The European journal of neuroscience, Jg. 12, H. 6, S. 1857–1866. Gogaki, E. G. (2003): Role of ephrinB2 and ephB4 in mouse retinal angiogenesis. Dissertation. Freiburg. Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, Augenheilkunde. Grant, Maria B.; May, W. Stratford; Caballero, Sergio; Brown, Gary A. J.; Guthrie, Steven M.; Mames, Robert N. et al. (2002): Adult hematopoietic stem cells provide functional hemangioblast activity during retinal neovascularization. In: Nature medicine, Jg. 8, H. 6, S. 607–612. Grehn, Franz (2008): Augenheilkunde. Mit 20 Tabellen ; [jetzt neu mit Fallquiz]. 30. überarb. und aktualisierte Aufl. Springer, Heidelberg. Gupta, S. K.; Lysko, P. G.; Pillarisetti, K.; Ohlstein, E.; Stadel, J. M. (1998): Chemokine receptors in human endothelial cells. Functional expression of CXCR4 and its transcriptional regulation by inflammatory cytokines. In: The Journal of biological chemistry, Jg. 273, H. 7, S. 4282–4287. Hachet-Haas, Muriel; Balabanian, Karl; Rohmer, François; Pons, Françoise; Franchet, Christel; Lecat, Sandra et al. (2008): Small neutralizing molecules to inhibit actions of the chemokine CXCL12. In: The Journal of biological chemistry, Jg. 283, H. 34, S. 23189–23199. Hasegawa, Takuya; McLeod, D. Scott; Prow, Tarl; Merges, Carol; Grebe, Rhonda; Lutty, Gerard A. (2008): Vascular precursors in developing human retina. In: Investigative ophthalmology & visual science, Jg. 49, H. 5, S. 2178–2192. Higgins, R. D.; Mendelsohn, A. L. (1999); et al.: Retinopathy of prematurity: lack of association with prenatal care. In: Journal of AAPOS, Jg. 1999, H. Volume 3, Issue 2, S. 114–116. Hildebrandt, Martin; Schabath, Richard (2008): SDF-1 (CXCL12) in haematopoiesis and leukaemia: impact of DPP IV/CD26. In: Frontiers in bioscience : a journal and virtual library, Jg. 13, S. 1774–1779. 95 Hiraoka, M.; Berinstein, D. M.; Trese, M. T.; Shastry, B. S. (2001): Insertion and deletion mutations in the dinucleotide repeat region of the Norrie disease gene in patients with advanced retinopathy of prematurity. In: Journal of human genetics, Jg. 46, H. 4, S. 178–181. Online verfügbar unter doi:10.1007/s100380170085. Hughes, Suzanne; Yang, Huijun; Chan-Ling, Tailoi: Vascularization of the Human Fetal Retina: Roles of Vasculogenesis and Angiogenesis. In: Investigative ophthalmology & visual science, Jg. 2000, H. 41, S. 1217–1228, zuerst veröffentlicht: Submitted for publication June 28, 1999; revised October 14. Jasielska, Monika; Semkova, Irina; Shi, Xuan; Schmidt, Kristina; Karagiannis, Dimitrios; Kokkinou, Despina et al. (2010): Differential role of tumor necrosis factor (TNF)-alpha receptors in the development of choroidal neovascularization. In: Investigative ophthalmology & visual science, Jg. 51, H. 8, S. 3874–3883. Online verfügbar unter doi:10.1167/iovs.09-5003. Joussen, Antonia M; Gardner, Thomas W; Kirchhof, Bernd; Ryan, Stephen J (2007): Retinal vascular disease. With 330 Tab. Springer, Berlin, Heidelberg. Kohly, Radha P.; Muni, Rajeev H.; Kertes, Peter J.; Lam, Wai-Ching (2011): Management of pediatric choroidal neovascular membranes with intravitreal antiVEGF agents: a retrospective consecutive case series. In: Canadian journal of ophthalmology. Journal canadien d'ophtalmologie, Jg. 46, H. 1, S. 46–50. Online verfügbar unter doi:10.3129/i10-123. Kryczek, Ilona; Lange, Andrzej; Mottram, Peter; Alvarez, Xavier; Cheng, Pui; Hogan, Melina et al. (2005): CXCL12 and vascular endothelial growth factor synergistically induce neoangiogenesis in human ovarian cancers. In: Cancer research, Jg. 65, H. 2, S. 465–472. Lange, Clemens (2006): Pathogenese und Hemmung retinaler Gefäßneubildungen im OIR-Mausmodell. Dissertation. Freiburg. Albert-Ludwigs-Universität Freiburg, Augenheilkunde. Lee, Edwin; Rewolinski, David (2010): Evaluation of CXCR4 inhibition in the prevention and intervention model of laser-induced choroidal neovascularization. In: Investigative ophthalmology & visual science, Jg. 51, H. 7, S. 3666–3672. 96 Li Calzi, Sergio; Neu, Matthew B.; Shaw, Lynn C.; Kielczewski, Jennifer L.; Moldovan, Nicanor I.; Grant, Maria B. (2010): EPCs and pathological angiogenesis: when good cells go bad. In: Microvascular research, Jg. 79, H. 3, S. 207–216. Liang, Zhongxing; Brooks, Joann; Willard, Margaret; Liang, Ke; Yoon, Younghyoun; Kang, Seunghee; Shim, Hyunsuk (2007): CXCR4/CXCL12 axis promotes VEGFmediated tumor angiogenesis through Akt signaling pathway. In: Biochemical and biophysical research communications, Jg. 359, H. 3, S. 716–722. Liapi, Anastasia; Pritchett, James; Jones, Owen; Fujii, Nobutaka; Parnavelas, John G.; Nadarajah, Bagirathy (2008): Stromal-derived factor 1 signalling regulates radial and tangential migration in the developing cerebral cortex. In: Developmental neuroscience, Jg. 30, H. 1-3, S. 117–131. Lima e Silva, Raquel; Shen, Jikui; Hackett, Sean F.; Kachi, Shu; Akiyama, Hideo; Kiuchi, Katsuji et al. (2007): The SDF-1/CXCR4 ligand/receptor pair is an important contributor to several types of ocular neovascularization. In: The FASEB journal : official publication of the Federation of American Societies for Experimental Biology, Jg. 21, H. 12, S. 3219–3230. Lippert, Herbert (2002): Lehrbuch Anatomie. 184 Tabellen. 5., völlig überarb. Aufl., [Nachdr.]. Urban & Fischer, München. Löffler, Georg; Petrides, Petro E; Heinrich, Peter C; Löffler-Petrides-Heinrich (2007): Biochemie und Pathobiochemie. Mit 192 Tabellen ; [+ online specials]. 8., völlig neu bearb. Aufl.. Springer Medizin, Heidelberg. Lüllmann-Rauch, Renate (2003): Histologie. Verstehen, Lernen, Nachschlagen ; 10 Tabellen, 1. Auflage. Thieme, Stuttgart. Miao, Zhenhua; Luker, Kathryn E.; Summers, Bretton C.; Berahovich, Rob; Bhojani, Mahaveer S.; Rehemtulla, Alnawaz et al. (2007): CXCR7 (RDC1) promotes breast and lung tumor growth in vivo and is expressed on tumor-associated vasculature. In: Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, Jg. 104, H. 40, S. 15735–15740. 97 Mirshahi, F.; Pourtau, J.; Li, H.; Muraine, M.; Trochon, V.; Legrand, E. et al. (2000): SDF-1 activity on microvascular endothelial cells: consequences on angiogenesis in in vitro and in vivo models. In: Thrombosis research, Jg. 99, H. 6, S. 587–594. Moll (2005): Anatomie. Kurzlehrbücher und Antwortkataloge zum GK, 18. Auflage. Urban & Fischer bei Elsevier, München. Moshfeghi, Darius M.; Lewis, Hilel (2003): Age-related macular degeneration: evaluation and treatment. In: Cleveland Clinic journal of medicine, Jg. 70, H. 12, S. 1017-8, 1020, 1023-5 passim. Neusser, Matthias A.; Kraus, Anna K.; Regele, Heinz; Cohen, Clemens D.; Fehr, Thomas; Kerjaschki, Dontscho et al. (2010): The chemokine receptor CXCR7 is expressed on lymphatic endothelial cells during renal allograft rejection. In: Kidney international, Jg. 77, H. 9, S. 801–808. Ng, Eugene W. M.; Shima, David T.; Calias, Perry; Cunningham, Emmett T.; Guyer, David R.; Adamis, Anthony P. (2006): Pegaptanib, a targeted anti-VEGF aptamer for ocular vascular disease. In: Nature reviews. Drug discovery, Jg. 5, H. 2, S. 123–132. NOXXON Pharma AG (2008): Spiegelmer Technology. Online verfügbar unter http://medgadget.com/archives/2008/04/spiegelmer_technology.html. NOXXON Pharma AG (10. September 2010): Pressemitteilungen. Herausgegeben von NOXXON Pharma AG. Online verfügbar unter http://145.253.103.53/noxxon15/index.php?option=com_content&view=article&id=71 &Itemid=81. Orimo, Akira; Gupta, Piyush B.; Sgroi, Dennis C.; Arenzana-Seisdedos, Fernando; Delaunay, Thierry; Naeem, Rizwan et al. (2005): Stromal fibroblasts present in invasive human breast carcinomas promote tumor growth and angiogenesis through elevated SDF-1/CXCL12 secretion. In: Cell, Jg. 121, H. 3, S. 335–348. Penn, John S.; Yanni, Susan E. (2007): Ocular Neovascularization: In Vitro and In Vivo Models. The development of these models provides researchers with an important tool for studying the angiogenic process. In: RETINA TODAY, H. Juli/August. Online verfügbar http://www.retinatoday.com/Html%20Pages/0707/0707_macula_yanni.pdf unter: 98 Penn, J. S.; Tolman, B. L.; Lowery, L. A. (1993): Variable oxygen exposure causes preretinal neovascularization in the newborn rat. In: Investigative ophthalmology & visual science, Jg. 34, H. 3, S. 576–585. Pestourie, C.; Tavitian, B.; Duconge, F. (2005): Aptamers against extracellular targets for in vivo applications. In: Biochimie, Jg. 87, H. 9-10, S. 921–930. Risau, W. (1997): Mechanisms of angiogenesis. In: Nature, Jg. 386, H. 6626, S. 671– 674. Rosenthal, Rita; Strauss, Olaf (2003): Investigations of RPE cells of choriodal neovascular membranes from patients with age-related macula degeneration. In: Advances in experimental medicine and biology, Jg. 533, S. 107–113. Sakurai, Eiji; Anand, Akshay; Ambati, Balamurali K.; van Rooijen, Nico; Ambati, Jayakrishna (2003): Macrophage depletion inhibits experimental choroidal neovascularization. In: Investigative ophthalmology & visual science, Jg. 44, H. 8, S. 3578–3585. Salvucci, Ombretta; Yao, Lei; Villalba, Sabrina; Sajewicz, Agatha; Pittaluga, Stefania; Tosato, Giovanna (2002): Regulation of endothelial cell branching morphogenesis by endogenous chemokine stromal-derived factor-1. In: Blood, Jg. 99, H. 8, S. 2703– 2711. Sayyed, S. G.; Hägele, H.; Kulkarni, O. P.; Endlich, K.; Segerer, S.; Eulberg, D. et al. (2009): Podocytes produce homeostatic chemokine stromal cell-derived factor1/CXCL12, which contributes to glomerulosclerosis, podocyte loss and albuminuria in a mouse model of type 2 diabetes. In: Diabetologia, Jg. 52, H. 11, S. 2445–2454. Schober, Andreas; Knarren, Sandra; Lietz, Michael; Lin, Elisa A.; Weber, Christian (2003): Crucial role of stromal cell-derived factor-1alpha in neointima formation after vascular injury in apolipoprotein E-deficient mice. In: Circulation, Jg. 108, H. 20, S. 2491–2497. Sengupta, Nilanjana; Afzal, Aqeela; Caballero, Sergio; Chang, Kyung-Hee; Shaw, Lynn C.; Pang, Ji-Jing et al. (2010): Paracrine modulation of CXCR4 by IGF-1 and VEGF: implications for choroidal neovascularization. In: Investigative ophthalmology & visual science, Jg. 51, H. 5, S. 2697–2704. 99 Sengupta, Nilanjana; Caballero, Sergio; Mames, Robert N.; Butler, Jason M.; Scott, Edward W.; Grant, Maria B. (2003): The role of adult bone marrow-derived stem cells in choroidal neovascularization. In: Investigative ophthalmology & visual science, Jg. 44, H. 11, S. 4908–4913. Sengupta, Nilanjana; Caballero, Sergio; Mames, Robert N.; Timmers, Adrian M.; Saban, Daniel; Grant, Maria B. (2005): Preventing stem cell incorporation into choroidal neovascularization by targeting homing and attachment factors. In: Investigative ophthalmology & visual science, Jg. 46, H. 1, S. 343–348. Shirozu, M.; Nakano, T.; Inazawa, J.; Tashiro, K.; Tada, H.; Shinohara, T.; Honjo, T. (1995): Structure and chromosomal localization of the human stromal cell-derived factor 1 (SDF-1) gene. In: Genomics, Jg. 28, H. 3, S. 495–500. Smith, L. E.; Wesolowski, E.; McLellan, A.; Kostyk, S. K.; D'Amato, R.; Sullivan, R.; D'Amore, P. A. (1994): Oxygen-induced retinopathy in the mouse. In: Investigative ophthalmology & visual science, Jg. 35, H. 1, S. 101–111. Sobotta, Johannes; Putz, Reinhard V; Pabst, Reinhard; Putz, Renate (2003): Atlas der Anatomie des Menschen. Atlas und Interaktiv-Set. Medienkombination, Limitierte Sonder-Ed., 21., neu bearb. Aufl., [2.Dr.]. Urban & Fischer, München. Sonmez, Kenan; Drenser, Kimberly A.; Capone, Antonio; Trese, Michael T. (2008): Vitreous levels of stromal cell-derived factor 1 and vascular endothelial growth factor in patients with retinopathy of prematurity. In: Ophthalmology, Jg. 115, H. 6, S. 10651070.e1. Stahl, Andreas; Chen, Jing; Sapieha, Przemyslaw; Seaward, Molly R.; Krah, Nathan M.; Dennison, Roberta J. et al. (2010): Postnatal weight gain modifies severity and functional outcome of oxygen-induced proliferative retinopathy. In: The American journal of pathology, Jg. 177, H. 6, S. 2715–2723. Online verfügbar unter doi:10.2353/ajpath.2010.100526. Stellos, Konstantinos; Langer, Harald; Daub, Karin; Schoenberger, Tanja; Gauss, Alexandra; Geisler, Tobias et al. (2008): Platelet-derived stromal cell-derived factor-1 regulates adhesion and promotes differentiation of human CD34+ cells to endothelial progenitor cells. In: Circulation, Jg. 117, H. 2, S. 206–215. 100 Tachibana, K.; Hirota, S.; Iizasa, H.; Yoshida, H.; Kawabata, K.; Kataoka, Y. et al. (1998): The chemokine receptor CXCR4 is essential for vascularization of the gastrointestinal tract. In: Nature, Jg. 393, H. 6685, S. 591–594. Takeda, A.: CCR3 is a target for age-related macular degeneration diagnosis and therapy. In: Nature <London>, S. 2009; VOL 460; ISSU 7252, 225-230. Teubner, B. J. W. Bartness T. J. (2010): Anti-ghrelin Spiegelmer NOX-B11-2 inhibits ingestive behavior in the Siberian hamster. In: Appetite, H. Volume 54, Issue 3, S. 678. Unsoeld, Anke S.; Junker, Bernd; Mazitschek, Ralph; Martin, Gottfried; Hansen, Lutz L.; Giannis, Athanassios; Agostini, Hansjürgen T. (2004): Local injection of receptor tyrosine kinase inhibitor MAE 87 reduces retinal neovascularization in mice. In: Molecular vision, Jg. 10, S. 468–475. Wang, Jianhua; Shiozawa, Yusuke; Wang, Jincheng; Wang, Yu; Jung, Younghun; Pienta, Kenneth J. et al. (2008): The role of CXCR7/RDC1 as a chemokine receptor for CXCL12/SDF-1 in prostate cancer. In: The Journal of biological chemistry, Jg. 283, H. 7, S. 4283–4294. Williams, Cassin Kimmel; Segarra, Marta; La Sierra, Maria Luz de; Sainson, Richard C. A.; Tosato, Giovanna; Harris, Adrian L. (2008): Regulation of CXCR4 by the Notch ligand delta-like 4 in endothelial cells. In: Cancer research, Jg. 68, H. 6, S. 1889– 1895. Yodoi, Yuko; Sasahara, Manabu; Kameda, Takanori; Yoshimura, Nagahisa; Otani, Atsushi (2007): Circulating hematopoietic stem cells in patients with neovascular agerelated macular degeneration. In: Investigative ophthalmology & visual science, Jg. 48, H. 12, S. 5464–5472. York, Jackie R.; Landers, Susan; Kirby, Russell S.; Arbogast, Patrick G.; Penn, John S. (2004): Arterial oxygen fluctuation and retinopathy of prematurity in very-low-birthweight infants. In: Journal of perinatology : official journal of the California Perinatal Association, Jg. 24, doi:10.1038/sj.jp.7211040. H. 2, S. 82–87. Online verfügbar unter 101 7 Abbildungs- und Tabellenverzeichnis 7.1 Abbildungen ABBILDUNG 1 AUFBAU DER RETINA AUS LÜLLMANN-RAUCH, 2003 ...................................................................... 9 ABBILDUNG 2 RETINA MAUS (FLUORESZEINPERFUSION): OBERFLÄCHLICHES (LINKS) UND TIEFES GEFÄßNETZ (RECHTS) ...................................................................................................................................................... 10 ABBILDUNG 3 EMBRYONALE VASKULOGENESE NACH JOUSSEN, 2007 ................................................................ 12 ABBILDUNG 4 SIGNALKASKADEN VON VEGFR1/2, IGF1R UND CXCR4 NACH AFZAL, 2007 .................................. 24 ABBILDUNG 5 MODELL FÜR DIE INTERAKTION VON SDF-1 MIT DEM CXCR4-REZEPTOR NACH CRUMP, 1997 .... 26 ABBILDUNG 6 REZIPROKE SPEZIFITÄT VON (D-) APTAMER UND (L-) SPIEGELMER ............................................... 31 ABBILDUNG 7 ÜBERSICHT DER THERAPIEZEITPUNKTE IM OIR-MODEL ................................................................ 32 ABBILDUNG 8 AVASKULÄRE ZONE (GRÜN UNTERLEGT) EINER MÄUSERETINA .................................................... 38 ABBILDUNG 9 TUFTS EINER MÄUSERETINA (DIE ROTEN PFEILE MARKIEREN TUFTS) .......................................... 39 ABBILDUNG 10 CLUSTER OHNE (LINKS) UND MIT (RECHTS) EINZEICHNUNG DER CLUSTERFLÄCHE .................... 40 ABBILDUNG 11 GERADE (G) UND GESCHLÄNGELTE (K) GEFÄßE EINER MÄUSERETINA ....................................... 40 ABBILDUNG 12 ÜBERSICHT DER THERAPIEZEITPUNKTE IM CNV-MODELL ........................................................... 42 ABBILDUNG 13 KRYOSCHNITTFÄRBUNG EINES MÄUSEAUGES (OIR, P17), A) HE-FÄRBUNG B) PECAM-1FÄRBUNG/FLUORESCEIN C) AUFLICHT PECAM-1/FLUORESCEIN D) AUFLICHT, PECAM-1/FLUORESCEIN, HE; (BALKEN = 125 µM)...................................................................................................................................... 53 ABBILDUNG 14 SDF-1-KRYOSCHNITTFÄRBUNG EINES MÄUSEAUGES. ................................................................. 55 ABBILDUNG 15 ERGEBNIS DER 1. GELELEKTROPHORESE...................................................................................... 56 ABBILDUNG 16 NESTED PCR: 1. PRIMER SDF-1 A/B, SDF-1 C/D; 2. PRIMER CXCR4 A/B, CXCR4 C/D ................... 57 ABBILDUNG 17 LOKALISIERUNG DES INTRAVITREAL INJIZIERTEN SPIEGELMERS DURCH IN SITU HYBRIDISIERUNG ..................................................................................................................................................................... 58 ABBILDUNG 18 RETINOPATHIE-WERTE INJEKTIONSVERSUCH: NOX-A12 LOW CONCENTRATION ....................... 60 ABBILDUNG 19 RETINOPATHIE-WERTE INJEKTIONSVERSUCH: NOX-A12 HIGH CONCENTRATION ...................... 61 ABBILDUNG 20 RETINOPATHIE-WERTE INJEKTIONSVERSUCH: NOX-A12 HIGH CONCENTRATION ...................... 62 ABBILDUNG 21 RETINOPATHIE-WERTE INJEKTIONSVERSUCH: NOX-A12 HIGH CONCENTRATION ...................... 63 ABBILDUNG 22 RETINOPATHIE-WERTE INJEKTIONSVERSUCH: NOX-A12 HIGH CONCENTRATION ...................... 64 ABBILDUNG 23 RETINOPATHIE-WERTE INJEKTIONSVERSUCH: NOX-A12 HIGH CONCENTRATION, DOPPELINJEKTION ....................................................................................................................................... 65 ABBILDUNG 24 RETINOPATHIE-WERTE INJEKTIONSVERSUCH: SDF-1-ANTIKÖRPER ............................................ 66 ABBILDUNG 25 RETINOPATHIE-WERTE INJEKTIONSVERSUCH: GLUCOSE VERSUS PBS ........................................ 67 102 ABBILDUNG 26 ZUSAMMENFASSUNG DER RETINOPATHIE-WERTE ALLER INJEKTIONSVERSUCHE MIT NOX-A12 68 ABBILDUNG 27 CHORIOIDALE NEOVASKULARISATIONEN DURCH LASERINDUZIERTE RUPTUR DER BRUCHMEMBRAN........................................................................................................................................ 70 ABBILDUNG 28 CNV-WERTE: NOX-A12 HIGH CONCENTRATION, WERTE IN MM2 ............................................... 71 ABBILDUNG 29 REGULIERUNG VON SDF-1 UND CXCR4 ....................................................................................... 88 7.2 Tabellen TABELLE 1 STADIENEINTEILUNG DER FRÜHGEBORENENRETINOPATHIE (ROP) AUS GREHN, 2008 17 TABELLE 2 DIE VIER CHEMOKINFAMILIEN AUS LÖFFLER U. PETRIDES, 2007 21 TABELLE 3 VERSUCHSÜBERSICHT (*DIE DOSIERUNGEN BEZIEHEN SICH AUF DEN OLIGONUKLEOTIDANTEIL ALS WASSERFREIE SÄURE (OHNE GEGENIONEN) PRO µL.) 34 TABELLE 4 MODIFIZIERTES SCORINGSYSTEM FÜR DIE HYPOXIEINDUZIERTE PROLIFERATIVE RETINOPATHIE 37 TABELLE 5 DARSTELLUNG DER VERWENDETEN RNA-KONZENTRATIONEN UND -MENGEN 45 TABELLE 6 PRIMERSEQUENZEN: RT-PCR UND NESTED PCR 46 TABELLE 7 VERWENDETE ANTIKÖRPER BEI DER PECAM-1-IMMUNFÄRBUNG 48 TABELLE 8 VERWENDETE ANTIKÖRPER BEI DER SDF-1-IMMUNFÄRBUNG 50 TABELLE 9 ERKLÄRUNG DER ABKÜRZUNGEN UND VERWENDETE GEWEBEARTEN BEIM PCR-VERSUCH 57 TABELLE 10 ÜBERSICHT ÜBER DIE OIR-VERSUCHE (HIGH CONCENTRATION (HC) = 6,5 MG/ML BZW. 440 µM*, LOW CONCENTRATION (LC) = 0,65 MG/ML BZW. 44 µM*) *DIE DOSIERUNGEN BEZIEHEN SICH AUF DEN OLIGONUKLEOTIDANTEIL ALS WASSERFREIE SÄURE (OHNE GEGENIONEN) PRO VOLUMEN. 59 TABELLE 11 ZUSAMMENFASSUNG DER ERGEBNISSE VORANGEGANGENER UND AKTUELLER VERSUCHE (+ ANTIANGIOGENE WIRKUNG, - KEINE SIGNIFIKANTE WIRKUNG) 77 TABELLE 12 GEGENÜBERSTELLUNG DER PUNKTEVERTEILUNG BEI AUSWERTUNG NACH UNSÖLD 2004 BZW. GOGAKI 2003 TABELLE 13 NOX-A12 HC IM VERGLEICH 79 80 TABELLE 14 ZUSAMMENFASSUNG DER IMMUNHISTOLOGISCHEN ERGEBNISSE ANDERER ARBEITSGRUPPEN ZUR LOKALISATION VON SDF-1 85 TABELLE 15 ZUSAMMENFASSUNG DER IMMUNHISTOLOGISCHEN ERGEBNISSE ANDERER ARBEITSGRUPPEN ZUR LOKALISATION VON CXCR4 86 103 Danksagung Zuerst möchte ich mich bei Herrn Prof. Dr. med. Agostini für die Überlassung des Themas der Dissertation bedanken. Frau Prof. Dr. Antje Aschendorff gilt mein Dank für die Übernahme des Zweitgutachtens. Für die Betreuung bedanke ich mich ganz herzlich bei Herrn Dr. rer nat. Martin. Bedanken möchte ich mich auch bei Frau Flügel, Frau Mattes, Frau Buchen, Frau Korth, Nikolai Gross, Clemens Lange, Christoph Ehlken, Bernd Junker und Marc Leinweber sowie bei allen Doktoranden, die mir Hilfestellung bei der Durchführung meiner Versuche gegeben haben. Ein weiterer Dank gebührt Herrn Jedynak, der mir sehr oft bei technischen Problemen zur Seite stand. Der letzte Dank gilt meinen Eltern und meinen beiden Schwestern Kerstin und Rikke. Ohne die unermüdliche Förderung und Unterstützung meiner Eltern wäre ich heute nicht an diesem Punkt meines Lebens angelangt. 104 Diese Seiten enthalten persönliche Daten und sind deshalb nicht Bestandteil der Online-Veröffentlichung. 105 Diese Seiten enthalten persönliche Daten und sind deshalb nicht Bestandteil der Online-Veröffentlichung. 106 Diese Seiten enthalten persönliche Daten und sind deshalb nicht Bestandteil der Online-Veröffentlichung. 107 Diese Seiten enthalten persönliche Daten und sind deshalb nicht Bestandteil der Online-Veröffentlichung.
