Molekulare Bildgebung: Die Detektion von Tumoren über

Anatomisches Institut – Medizinische Fakultät
der Christian - Albrechts - Universität zu Kiel
Molekulare Bildgebung:
Die Detektion von Tumoren über
Nahinfrarot-Sonden sowie magnetische Liposomen
Dissertation
zur Erlangung des Doktorgrades der
Mathematisch - Naturwissenschaftlichen Fakultät
der Christian - Albrechts - Universität zu Kiel
vorgelegt von Diplom - Pharmazeutin
Manuela Meincke
Kiel, Mai 2009
Referent/in:
Professor Dr. Rolf Mentlein
Korreferent/in:
Professor Dr. Eric Beitz
Tag der Disputation:
06.07.2009
zum Druck genehmigt:
06.07.2009
Professor Dr. Lutz Kipp
(Dekan)
6 Zusammenfassung
Mit Hilfe der molekularen Bildgebung ist es möglich, Tumorerkrankungen aufgrund molekularer Veränderungen des Tumors im Vergleich zu bisherigen Standardverfahren viel
früher nachzuweisen. Das Auswählen geeigneter Zielstrukturen auf den Tumorzellen,
die Entwicklung optimaler Kontrastmittel sowie die Wahl eines bildgebenden Verfahrens
sind dabei Voraussetzungen, um Tumorzellen frühzeitig bildgebend darzustellen.
Eine Aufgabe dieser Arbeit war es, Eisenoxid - beladene Liposomen für die unspezifische
Aufnahme in Tumorzellen herzustellen, um sie über MRT visualisieren zu können. Dafür
wurde zunächst ein geeignetes Herstellungsverfahren der Liposomen etabliert. Größenbestimmungen ergaben einen optimalen Durchmesser von 100 nm über einen Zeitraum
von zwölf Tagen, wodurch eine Agglomeration ausgeschlossen und eine Anreicherung
der Liposomen im Tumorgewebe über Endotheldefekte gesichert werden konnten. Im
Vergleich zu anderen Eisenoxid - Nanopartikel wurde die höchste intrazelluläre Eisenaufnahme über Eisenoxid - beladene Liposomen erreicht und über histochemische Anfärbungen nachgewiesen. Eine gute Bioverträglichkeit konnte über ein unverändertes
Proliferationsverhalten der Gliomazellen in Gegenwart der Liposomen bestätigt werden.
Abschließende Magnetresonanzmessungen ergaben die Detektierbarkeit von Eisenoxid beladenen Tumorzellen und belegen die Eignung von Liposomen für die unspezifische
Markierung von Tumorzellen mit Eisenoxid - Nanopartikeln.
Eine weiteres Ziel dieser Arbeit bestand darin, Tumorzellen optisch über geeignete NIR Sonden spezifisch zu markieren. Dazu wurde zunächst ein geeigneter Fluoreszenzfarbstoff (IRDye 800CW) hinsichtlich verschiedener Kriterien ausgewählt. Da die Chemokinrezeptoren CXCR4 und CXCR7 sowie der Rezeptor des epidermalen Wachstumsfaktors (epidermal growth factor (EGF) - Rezeptor) auf Tumorzellen überexprimiert sind, wurden diese als mögliche Zielstrukturen ausgewählt und entsprechende Liganden (stromal
cell - derived factor - 1, SDF-1 = CXCL12, und EGF) an den Fluoreszenzfarbstoff konjugiert.
Über In - vitro - Untersuchungen konnten Aussagen über die Markierungseffektivität und
- effizienz der Fluoreszenzkonjugate in Abhängigkeit verschiedener Parameter getroffen werden. So wurde eine optimale SDF-1 - IRDye - Konzentration von 0,1 μM bestimmt
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6 Zusammenfassung
werden, mit der bereits nach zehnminütiger Inkubation eine spezifische Markierung
der Tumorzellen erreicht wurde. In weiteren Versuchen zeigte sich eine selektive Markierung von maximal 500 Zellen mittels SDF-1 - Konjugat. Eine spezifische Bindung bzw.
kompetitive Hemmung des Chemokinkonjugats an den CXCR7 konnte in Verdrängungsexperimenten nachgewiesen werden. Die Überprüfung der biologischen Aktivität ergab
keine Aktivierung der MAPK - Kaskade, was gerade hinsichtlich fehlender proliferationsfördernder Eigenschaften bei einer Anwendung in der Diagnosestellung und/oder
Therapieverfahren von Tumorerkrankungen von Vorteil ist. Einen Einfluss auf das Proliferationsverhalten der Zellen in Gegenwart des Chemokinkonjugats bzw. ein zytotoxisches
Potential wurde nicht festgestellt. Da das SDF-1 - IRDye 800 - Konjugat in Bezug auf Spezifität und Selektivität gegenüber anderen NIR - Konjugaten in den In - vitro - Versuchen
sich überlegen zeigte, wurde es für anschließende In - vivo - Versuche ausgesucht.
Um die Spezifität und Selektivität des SDF-1 - Konjugats in vivo zu untersuchen, wurden
MCF 7 - Mammakarzinomzellen und A 764 Gliomazellen Versuchsmäusen subkutan injiziert und SDF-1 - IRDye über die Schwanzvene verabreicht. Eine spezifische Markierung
der Tumorzellen konnte sowohl bei vaskularisierten als auch bei unvaskularisierten Tumoren nach 24 - 48 Stunden nach Kontrastmittelgabe festgestellt werden. SDF-1 - IRDye
800 stellt somit ein vielversprechendes optisches Kontrastmittel für die Bildgebung kleinster Tumorareale dar.
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7 Summary
Molecular Imaging is defined as the visualization, characterization and measurement of
biological processes at the molecular and cellular levels in humans and other living systems. The technique commonly utilizes a molecular imaging probe such as an antibody
or ligand as tracer to visualize pathologic alterations or a physiologic process. The tracer
provides the signal (light, radiation, magnetic resonance contrast agents such as gadolinium or iron oxide, ultrasound microbubble) that enables detection. The various existing
imaging technologies differ with respect to detection threshold of the probe and spatial
resolution. For example, MRI has a high spatial resolution while radioactive or optical
imaging have the advantage of high sensitivity.
The aim of this project was to develop optimal contrast agents for MRI and near infrared
optical imaging to detect tumors based on molecular changes. The selection of suitable
targets on tumor cells, the development of optimal contrast agents as well as appropriate
imaging methods are requirements for early detection of tumor cells.
In the application of MRI, lipid - based nanoparticles are promising multimodal contrast
agents since MR detectable and fluorescent amphiphilic molecules could easily be incorporated in lipidic nanoparticles. In this study a liposome cell labeling system was initially
developed for a non - target - specific labeling of tumor cells with liposomes filled with
superparamagnetic iron oxide nanoparticles for magnetic resonance imaging. The cytotoxicity and cell viability induced by liposomes was assessed and found to be minimal.
Over a period of twelve days the liposomes remained stable in size (100 nm) with no
aggregation. In comparison to other iron oxide nanoparticles, the highest uptake into
cells was obtained by using liposomes with no saturation within 24 hours. Liposomes are
effective contrast agents for MRI. Cells treated with iron oxide - liposomes showed a clear
signal (T2 - relaxivity).
The selection of suitable targets on tumor cells was pursued with optical imaging using
near infrared fluorescent conjugates. The chemokine receptors CXCR4 and CXCR7 as
well as the epidermal growth factor (EGF) - receptor are overexpressed on distinct tumor
cells/tumor vasculature and served as potential targets for detecting tumors. The ligand
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7 Summary
for CXCR4 and CXCR7, namely the 8 kDa peptide stromal cell - derived factor - 1 (SDF1 = CXCL12) as well as EGF were conjugated to the fluorescent cyanine dye IRDye 800CW
and purified. The SDF-1 - conjugate detected specifically as low as 500 A764 - glioma cells
which express CXCR7 at high levels. Binding was time - and concentration - dependent
and the label was competively displaced by the native peptide. The NIR - conjugates showed no cytotoxic properties and no influence on cell growth. To test the feasibility and
selectivity in vivo mice bearing subcutanous tumors of MCF 7 breast cancer and A 764
glioma cells were injected the SDF-1 - conjugate through the tail vein. A specific labeling
of these cells could be found of vascularized as well as non - vascularized tumors within
24 - 48 hours post injection of SDF-1 - IRDye. Finally, SDF-1 - IRDye showed great promise
for detecting tumors in vivo by optical imaging.
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