Molekulare Bildgebung: Die Detektion von Tumoren über
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Anatomisches Institut – Medizinische Fakultät der Christian - Albrechts - Universität zu Kiel Molekulare Bildgebung: Die Detektion von Tumoren über Nahinfrarot-Sonden sowie magnetische Liposomen Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Mathematisch - Naturwissenschaftlichen Fakultät der Christian - Albrechts - Universität zu Kiel vorgelegt von Diplom - Pharmazeutin Manuela Meincke Kiel, Mai 2009 Referent/in: Professor Dr. Rolf Mentlein Korreferent/in: Professor Dr. Eric Beitz Tag der Disputation: 06.07.2009 zum Druck genehmigt: 06.07.2009 Professor Dr. Lutz Kipp (Dekan) 6 Zusammenfassung Mit Hilfe der molekularen Bildgebung ist es möglich, Tumorerkrankungen aufgrund molekularer Veränderungen des Tumors im Vergleich zu bisherigen Standardverfahren viel früher nachzuweisen. Das Auswählen geeigneter Zielstrukturen auf den Tumorzellen, die Entwicklung optimaler Kontrastmittel sowie die Wahl eines bildgebenden Verfahrens sind dabei Voraussetzungen, um Tumorzellen frühzeitig bildgebend darzustellen. Eine Aufgabe dieser Arbeit war es, Eisenoxid - beladene Liposomen für die unspezifische Aufnahme in Tumorzellen herzustellen, um sie über MRT visualisieren zu können. Dafür wurde zunächst ein geeignetes Herstellungsverfahren der Liposomen etabliert. Größenbestimmungen ergaben einen optimalen Durchmesser von 100 nm über einen Zeitraum von zwölf Tagen, wodurch eine Agglomeration ausgeschlossen und eine Anreicherung der Liposomen im Tumorgewebe über Endotheldefekte gesichert werden konnten. Im Vergleich zu anderen Eisenoxid - Nanopartikel wurde die höchste intrazelluläre Eisenaufnahme über Eisenoxid - beladene Liposomen erreicht und über histochemische Anfärbungen nachgewiesen. Eine gute Bioverträglichkeit konnte über ein unverändertes Proliferationsverhalten der Gliomazellen in Gegenwart der Liposomen bestätigt werden. Abschließende Magnetresonanzmessungen ergaben die Detektierbarkeit von Eisenoxid beladenen Tumorzellen und belegen die Eignung von Liposomen für die unspezifische Markierung von Tumorzellen mit Eisenoxid - Nanopartikeln. Eine weiteres Ziel dieser Arbeit bestand darin, Tumorzellen optisch über geeignete NIR Sonden spezifisch zu markieren. Dazu wurde zunächst ein geeigneter Fluoreszenzfarbstoff (IRDye 800CW) hinsichtlich verschiedener Kriterien ausgewählt. Da die Chemokinrezeptoren CXCR4 und CXCR7 sowie der Rezeptor des epidermalen Wachstumsfaktors (epidermal growth factor (EGF) - Rezeptor) auf Tumorzellen überexprimiert sind, wurden diese als mögliche Zielstrukturen ausgewählt und entsprechende Liganden (stromal cell - derived factor - 1, SDF-1 = CXCL12, und EGF) an den Fluoreszenzfarbstoff konjugiert. Über In - vitro - Untersuchungen konnten Aussagen über die Markierungseffektivität und - effizienz der Fluoreszenzkonjugate in Abhängigkeit verschiedener Parameter getroffen werden. So wurde eine optimale SDF-1 - IRDye - Konzentration von 0,1 μM bestimmt 179 6 Zusammenfassung werden, mit der bereits nach zehnminütiger Inkubation eine spezifische Markierung der Tumorzellen erreicht wurde. In weiteren Versuchen zeigte sich eine selektive Markierung von maximal 500 Zellen mittels SDF-1 - Konjugat. Eine spezifische Bindung bzw. kompetitive Hemmung des Chemokinkonjugats an den CXCR7 konnte in Verdrängungsexperimenten nachgewiesen werden. Die Überprüfung der biologischen Aktivität ergab keine Aktivierung der MAPK - Kaskade, was gerade hinsichtlich fehlender proliferationsfördernder Eigenschaften bei einer Anwendung in der Diagnosestellung und/oder Therapieverfahren von Tumorerkrankungen von Vorteil ist. Einen Einfluss auf das Proliferationsverhalten der Zellen in Gegenwart des Chemokinkonjugats bzw. ein zytotoxisches Potential wurde nicht festgestellt. Da das SDF-1 - IRDye 800 - Konjugat in Bezug auf Spezifität und Selektivität gegenüber anderen NIR - Konjugaten in den In - vitro - Versuchen sich überlegen zeigte, wurde es für anschließende In - vivo - Versuche ausgesucht. Um die Spezifität und Selektivität des SDF-1 - Konjugats in vivo zu untersuchen, wurden MCF 7 - Mammakarzinomzellen und A 764 Gliomazellen Versuchsmäusen subkutan injiziert und SDF-1 - IRDye über die Schwanzvene verabreicht. Eine spezifische Markierung der Tumorzellen konnte sowohl bei vaskularisierten als auch bei unvaskularisierten Tumoren nach 24 - 48 Stunden nach Kontrastmittelgabe festgestellt werden. SDF-1 - IRDye 800 stellt somit ein vielversprechendes optisches Kontrastmittel für die Bildgebung kleinster Tumorareale dar. 180 7 Summary Molecular Imaging is defined as the visualization, characterization and measurement of biological processes at the molecular and cellular levels in humans and other living systems. The technique commonly utilizes a molecular imaging probe such as an antibody or ligand as tracer to visualize pathologic alterations or a physiologic process. The tracer provides the signal (light, radiation, magnetic resonance contrast agents such as gadolinium or iron oxide, ultrasound microbubble) that enables detection. The various existing imaging technologies differ with respect to detection threshold of the probe and spatial resolution. For example, MRI has a high spatial resolution while radioactive or optical imaging have the advantage of high sensitivity. The aim of this project was to develop optimal contrast agents for MRI and near infrared optical imaging to detect tumors based on molecular changes. The selection of suitable targets on tumor cells, the development of optimal contrast agents as well as appropriate imaging methods are requirements for early detection of tumor cells. In the application of MRI, lipid - based nanoparticles are promising multimodal contrast agents since MR detectable and fluorescent amphiphilic molecules could easily be incorporated in lipidic nanoparticles. In this study a liposome cell labeling system was initially developed for a non - target - specific labeling of tumor cells with liposomes filled with superparamagnetic iron oxide nanoparticles for magnetic resonance imaging. The cytotoxicity and cell viability induced by liposomes was assessed and found to be minimal. Over a period of twelve days the liposomes remained stable in size (100 nm) with no aggregation. In comparison to other iron oxide nanoparticles, the highest uptake into cells was obtained by using liposomes with no saturation within 24 hours. Liposomes are effective contrast agents for MRI. Cells treated with iron oxide - liposomes showed a clear signal (T2 - relaxivity). The selection of suitable targets on tumor cells was pursued with optical imaging using near infrared fluorescent conjugates. The chemokine receptors CXCR4 and CXCR7 as well as the epidermal growth factor (EGF) - receptor are overexpressed on distinct tumor cells/tumor vasculature and served as potential targets for detecting tumors. The ligand 181 7 Summary for CXCR4 and CXCR7, namely the 8 kDa peptide stromal cell - derived factor - 1 (SDF1 = CXCL12) as well as EGF were conjugated to the fluorescent cyanine dye IRDye 800CW and purified. The SDF-1 - conjugate detected specifically as low as 500 A764 - glioma cells which express CXCR7 at high levels. Binding was time - and concentration - dependent and the label was competively displaced by the native peptide. The NIR - conjugates showed no cytotoxic properties and no influence on cell growth. To test the feasibility and selectivity in vivo mice bearing subcutanous tumors of MCF 7 breast cancer and A 764 glioma cells were injected the SDF-1 - conjugate through the tail vein. A specific labeling of these cells could be found of vascularized as well as non - vascularized tumors within 24 - 48 hours post injection of SDF-1 - IRDye. Finally, SDF-1 - IRDye showed great promise for detecting tumors in vivo by optical imaging. 182
