Tierärztliche Hochschule Hannover

Tierärztliche Hochschule Hannover
Multiplex Branched DNA Assay zur Untersuchung der
Genexpression von Hormonrezeptoren kaniner
Mammatumoren und tumorassoziierter Gene in der
Zellkultur
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer
Doktorin der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Annika Esther Mohr
Münster
Hannover 2016
Wissenschaftliche Betreuung:
1.
Prof. Dr. Ingo Nolte
Klinik für Kleintiere
Tierärztliche Hochschule Hannover
2.
PD Dr. Hugo Murua Escobar
Klinik für Hämatologie, Onkologie und
Palliativmedizin
Universitätsmedizin Rostock
1. Gutachter:
Prof. Dr. Ingo Nolte
2. Gutachterin:
Prof. Dr. Anne-Rose Günzel-Apel
Tag der mündlichen Prüfung:
03.11.2016
Meiner Familie
Das folgende Manuskript wurde am 20.09.2016 publiziert:
Hormone Receptor Expression Analyses in Neoplastic and Non-neoplastic Canine
Mammary Tissue by a Bead Based Multiplex Branched DNA Assay: A Gene Expression
Study in Fresh Frozen and Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Samples
Annika Mohr, Florenza Lüder Ripoli, Susanne Conradine Hammer, Saskia Willenbrock,
Marion Hewicker-Trautwein, Zdzisław Kiełbowicz, Hugo Murua Escobar, Ingo Nolte
PLoS ONE 11(9): e0163311. doi:10.1371/journal.pone.0163311
Das folgende Manuskript wurde zur Publikation eingereicht:
Longitudinal analysis of 20 tumor-associated genes in non-neoplastic and neoplastic
canine mammary tissues and their corresponding cultivated cells
Annika Mohr, Susanne Conradine Hammer, Florenza Lüder Ripoli, Saskia Willenbrock,
Marion Hewicker-Trautwein, Bertram Brenig, Hugo Murua Escobar, Ingo Nolte
Eingereicht bei BMC Cancer am 17.08.2016
Teile der Ergebnisse dieser Dissertation wurden in Vorträgen auf den folgenden
Fachtagungen präsentiert:
24. Jahrestagung der FG Innere Medizin und klinische Labordiagnostik der DVG, InnLab (29.
Januar 2016, Berlin)
Luminex basierte Untersuchung der Genexpression von Hormonrezeptoren in
Mammagewebe des Hundes
Annika Mohr, Florenza Lüder Ripoli, Susanne Conradine Hammer, Saskia Willenbrock,
Marion Hewicker-Trautwein, Hugo Murua Escobar, Ingo Nolte
DVG-Vet-Congress 2016 (27.10.-30.10.2016, Berlin)
Bedeutung von Hormonrezeptoren bei Mammatumoren des Hundes
A. Mohr, F. L. Ripoli, S. C. Hammer, S. Willenbrock, M. Hewicker-Trautwein, Z.
Kiełbowicz, H. Murua Escobar, I. Nolte
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung
1
2. Literaturübersicht
5
2.1
Hormonrezeptoren
5
2.2
Tumorassoziierte Gene
8
2.3
Multiplex Branched DNA Assay
10
3. Material und Methoden
13
3.1
Kryokonservierte Proben
13
3.2
Formalin-fixierte, paraffin-eingebettete Proben
13
3.3
Zellkultur-Proben
13
3.4
RNA-Isolierung
15
3.5
Zellpellets
15
3.6
Multiplex Branched DNA Assay
16
3.7
Housekeeping-Gene
16
3.8
Daten-Analyse und statistische Analyse
16
4. Ergebnisse
18
4.1
Studie 1
18
4.2
Studie 2
20
5. Diskussion
43
6. Zusammenfassung
50
7. Summary
52
8. Literaturverzeichnis
54
9. Abkürzungsverzeichnis
79
10. Danksagung
81
Einleitung
__________________________________________________________________________________
1. Einleitung
Tumoren der Gesäugeleiste sind die häufigste Tumorart bei der Hündin (DORN et al. 1968;
RICHARDS et al. 2001; MERLO et al. 2008) und das Ergebnis der histopathologischen
Diagnose ist in ca. 50% der Fälle bösartig (MOULTON et al. 1970; BOSTOCK 1986; MOE
2001; BRONDEN et al. 2010). Obwohl die mediane Überlebenszeit bei malignen
Mammatumoren in Abhängigkeit vom histopathologischen Grad des Tumors weniger als
zwei Jahre beträgt (YAMAGAMI et al. 1996; PHILIBERT et al. 2003; CHANG et al. 2005;
BETZ et al. 2012), sind, im Gegensatz zum Menschen, noch keine diesbezüglichen
prognostischen Biomarker für die verschiedenen Tumorsubtypen bekannt. Ebenso werden
bisher kaum endokrinologische Ansätze oder Targetgene für eine gezielte Tumortherapie
genutzt (MORRIS et al. 1993; TAVARES et al. 2010; GUIL-LUNA et al. 2011; SINGER et
al. 2012; PEÑA et al. 2014).
Die Routinediagnostik von Karzinomen der Brust beim Menschen schließt regelmäßig die
Untersuchung von Östrogen- und Progesteronrezeptoren (PAYNE et al. 2008; HAMMOND
et al. 2010) sowie des humanen epidermalen Wachstumsfaktors (HER2) mit ein (PAYNE et
al. 2008; WOLFF et al. 2013). Aufgrund der möglicherweise ähnlichen hormonabhängigen
Inzidenz von Mammatumoren des Hundes wurden bereits Studien bezüglich des
prognostischen und therapeutischen Potenzials von Östrogen- und Progesteronrezeptoren
durchgeführt. Mehrere Autoren berichten von einem Zusammenhang zwischen dem
Vorhandensein von Steroidhormonrezeptoren und der Prognose von Mammatumoren (NIETO
et al. 2000; CHANG et al. 2009), während andere Studien diesen Zusammenhang nicht
bestätigen konnten (MARTIN DE LAS MULAS et al. 2005; MILLANTA et al. 2005). Auch
im
Hinblick
auf
die
therapeutische
Vorgehensweise
werden
Östrogen-
und
Progesteronrezeptoren beim Hund bisher nicht berücksichtigt (MORRIS et al. 1993;
TAVARES et al. 2010; GUIL-LUNA et al. 2011; PEÑA et al. 2014).
Um die Tumorentwicklung zu untersuchen, aber auch, um mögliche prognostische Marker zu
finden, welche in die Routinediagnostik integriert werden könnten, wurden beim Hund in
Anlehnung an den Menschen auch andere Hormonrezeptoren (Prolaktin, Somatotropin) sowie
weitere tumorassoziierte Gene untersucht. Das beim Menschen im Fokus stehende Gen HER2
liegt beim Hund in ähnlicher Verteilung überexprimiert vor (17,6 bis 38%) (RUNGSIPIPAT
1
Einleitung
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et al. 1999; MARTIN DE LAS MULAS et al. 2003; HSU et al. 2009; RESSEL et al. 2013;
SHINODA et al. 2014) wie in Karzinomen der Brust (20-30%) (SLAMON et al. 1987;
REVILLION et al. 1998; ALMASRI u. HAMAD 2005). Es konnte jedoch bisher nur in einer
Studie eine Korrelation mit der Überlebenszeit von Hündinnen mit Mammatumoren
festgestellt werden (HSU et al. 2009).
Für die Tumorsuppressor-Gene PTEN, BRCA1 und BRCA2 sowie für die Prolaktin- und
Somatotropinrezeptoren ergab sich in mehreren voneinander unabhängigen Studien ein
Zusammenhang zwischen maligner Transformation von Tumoren der Mamma und einer
Abnahme der Protein- oder Genexpression (VAN GARDEREN et al. 1999; NIETO et al.
2003; QIU et al. 2008; RESSEL et al. 2009; MICHEL et al. 2012; SPOERRI et al. 2015;
YOSHIKAWA et al. 2015; RIPOLI et al. 2016). Auch die Tumorsuppressorgene TP53,
PFDN5 und FOXO3 sollen mit der Entstehung von Mammatumoren des Hundes assoziiert
sein (MUTO et al. 2000; LEE u. KWEON 2002; LEE et al. 2004; KOLTAI u. VAJDOVICH
2014; HENNECKE et al. 2015; RIPOLI et al. 2016). Weitere mit Brustkrebs der Frau
assoziierte Gene sind GATA4 (HUA et al. 2009; TAKAGI et al. 2014), HMGA1
(CHIAPPETTA et al. 2004; SHAH et al. 2013), HMGA2 (SUN et al. 2013; WU et al. 2016),
HMGB1 (SUN et al. 2015), MAPK1 (SLATTERY et al. 2014), MAPK3 (MUELLER et al.
2000), MCL1 (O'DRISCOLL et al. 2004; WANG et al. 2014), MYC (PEREIRA et al. 2013)
und PIK3CA (LOPEZ-KNOWLES et al. 2010; ZARDAVAS et al. 2014), welche jedoch bei
Mammatumoren des Hundes noch nicht näher charakterisiert sind.
Die molekularbiologische Untersuchung zielt beim Menschen nicht nur auf prognostische
Aspekte, sondern auch auf die Entwicklung neuer Therapiemöglichkeiten basierend auf in
Brustkrebs exprimierten Genen (HIGGINS u. BASELGA 2011; KALIMUTHO et al. 2015;
SANTA-MARIA u. GRADISHAR 2015; ZEICHNER et al. 2016). Zur orientierenden
Evaluierung der Wirksamkeit von Therapeutika eignen sich aus dem Organismus isolierte
Zellen (SHARMA et al. 2010; DOKE u. DHAWALE 2015). Voraussetzung ist, dass das Gen,
welches gezielt ausgewählt wird, sowohl im Ursprungsgewebe, als auch in der Zellkultur
exprimiert wird.
Um für den Hund Zelllinien mit der Expression von tumorassoziierten Genen (BRCA1,
BRCA2, FOXO3, GATA4, HER2, HMGA1, HMGA2, HMGB1, MAPK1, MAPK3, MCL1,
2
Einleitung
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MYC, PFDN5, PIK3CA, PTEN und TP53) und der Genexpression von Östrogen-,
Progesteron-, Prolaktin- und Somatotropinrezeptoren (ESR1, PGR, PRLR und GHR) zu
etablieren, wurden 10 neoplastische und 6 nicht-neoplastische Mammagewebeproben und aus
diesem Gewebe gewonnene Zellkulturen untersucht. Daraus ergaben sich die Fragestellungen,
(i) spiegeln die kultivierten Zellen die Genexpression des Originalgewebes wider? und (ii)
lassen sich Primärkulturen oder daraus hervorgehende Zelllinien identifizieren, die eine
gleichmäßige Genexpression über mehrere Passagen vorweisen und damit für zukünftige
Versuche zur Evaluierung von therapeutischen Ansätzen geeignet sind?
Bei der für die Genexpressionsanalyse in der vorliegenden Arbeit genutzten Methode handelt
es sich um einen Multiplex Branched DNA Assay, der die Möglichkeit bietet, gleichzeitig bis
zu 100 Targets in einer Probe zu messen (FLAGELLA et al. 2006). Die gängige Methode
zum Nachweis insbesondere von Östrogen-/Progesteronrezeptoren und HER2 in malignen
Mammatumoren des Menschen ist die Immunhistochemie (IHC) (PAYNE et al. 2008;
HAMMOND et al. 2010; WOLFF et al. 2013). Dabei werden in der Regel formalin-fixierte,
paraffin-eingebettete (FFPE) Proben genutzt (GJERDRUM et al. 2004; PAYNE et al. 2008).
Für die Untersuchung von Hormonrezeptoren, aber auch anderer Marker in der
Tumorforschung, stellen Genexpressionsanalysen eine Alternative dar, durch die zudem eine
weitergehende Charakterisierung von Tumoren erfolgen kann (PEROU et al. 2000;
SOTIRIOU u. PUSZTAI 2009). Im Allgemeinen ermöglichen Genexpressionsanalysen im
Gegensatz zur semi-quantitativen IHC eine quantitative Evaluierung von Tumormarkern und
objektivieren damit den Vergleich verschiedener Gewebe. Dabei dienen kryokonservierte
Proben als Goldstandard für Genexpressionsanalysen (SCICCHITANO et al. 2006;
PENLAND et al. 2007; LEHMANN-CHE et al. 2011; CALLARI et al. 2014). Solche Proben
liegen jedoch nur im Einzelfall frisch vor oder werden in aufwendigen Gewebebänken
konserviert (PENLAND et al. 2007; RIBEIRO-SILVA et al. 2007; CALLARI et al. 2014). Im
Vergleich dazu bilden FFPE-Proben aus der Routinediagnostik einen großen und
interessanten Probenpool für retrospektive Studien (LEWIS et al. 2001; RIBEIRO-SILVA et
al. 2007; SCHWEIGER et al. 2009; WEBSTER et al. 2015). Allerdings ist die RNA von
FFPE-Proben häufig durch zu lange Exposition in Formalin und anschließende Lagerung
degradiert oder fragmentiert (RIBEIRO-SILVA et al. 2007; BASS et al. 2014; NAM et al.
3
Einleitung
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2014; WEBSTER et al. 2015). Daher werden für die Genexpressionsanalyse Methoden
benötigt, die auch mit FFPE-Proben repräsentative Ergebnisse liefern.
Der Branched DNA Assay wurde bereits mit verlässlichen und reproduzierbaren Ergebnissen
an FFPE-Proben vom Menschen getestet (KNUDSEN et al. 2008; YIM et al. 2010). Da aus
FFPE-Proben im Allgemeinen nur geringe Mengen an RNA extrahiert werden können
(ROBERTS et al. 2009; NAM et al. 2014), ist es von besonderem Vorteil, dass für die
Analyse von zahlreichen Genen mit dem Multiplex Branched DNA Assay nur wenig RNA
eingesetzt werden muss. Durch den schnellen und einfachen Arbeitsablauf bietet er zusätzlich
die Möglichkeit, eine große Anzahl an Proben gleichzeitig zu messen (FLAGELLA et al.
2006; KNUDSEN et al. 2008). Die Analyse der Gene ESR1, PGR und HER2 aus FFPEProben hat mit diesem Assay in Tumoren der Brust bereits vielversprechenden Ergebnissen
erbracht (YIM et al. 2010).
Mit der vorliegenden Arbeit sollte daher geprüft werden, ob der Multiplex Branched DNA
Assay für die Genexpressionsanalyse der Hormonrezeptoren ESR1, PGR, PRLR und GHR im
Mammagewebe des Hundes geeignet ist und, ob die gemessenen Expressionslevel in
verschiedenen Entitäten von kryokonservierten und FFPE-Proben vergleichbar sind. An
diesem unterschiedlich gelagerten Probenmaterial sollte in einem weiteren Schritt untersucht
werden, ob ESR1, PGR, PRLR und GHR in nicht-neoplastischem Mammagewebe, benignen
und malignen Mammatumoren unterschiedlich exprimiert werden und ob ein Einfluss der
Kastration oder der Rasse erkennbar ist.
4
Literaturübersicht
__________________________________________________________________________________
2. Literaturübersicht
2.1 Hormonrezeptoren
Die Steroidhormone Progesteron und Östrogene führen in jedem Zyklus dazu, dass das
Mammagewebe zur Proliferation angeregt wird (DANIEL et al. 1987; CLARKE 2000;
LYDON et al. 2000). Abhängig von der Zyklusphase befindet sich das Mammagewebe
entweder unter Östrogeneinfluss, sodass duktales Wachstum gefördert wird (DANIEL et al.
1987) oder aber unter Progesteroneinfluss, sodass es zu einer Entwicklung der
lobuloalveolären Zellen kommt (LYDON et al. 2000). Im Zusammenhang mit dem
proliferativen
Effekt
von
Progesteron
wird
zudem
eine
Hochregulierung
des
Wachstumshormons Somatotropin angenommen, welches vermutlich einen Einfluss auf
Stammzellen des Gesäuges besitzt (MOL et al. 1996; GINESTIER u. WICHA 2007). Deren
Anregung zur Teilung, könnte den ersten Schritt der Karzinogenese darstellen (REYA et al.
2001; MARTINEZ-CLIMENT et al. 2006). Da Hormone über ihre jeweiligen Rezeptoren
wirken und da Östrogen- und Progesteronrezeptoren beim Menschen bereits eine
prognostische und prädiktive Bedeutung bei Brustkrebs zugesagt wird (PAYNE et al. 2008;
HAMMOND et al. 2010), beschäftigen sich auch verschiedene Studien mit der Untersuchung
von Hormonrezeptoren in Mammatumoren des Hundes (RUTTEMAN et al. 1988; NIETO et
al. 2000; MARTIN DE LAS MULAS et al. 2005; MILLANTA et al. 2005; CHANG et al.
2009; MAINENTI et al. 2014). Dabei konnte bestätigt werden, dass die Anzahl der
Rezeptoren von Östrogenen und Progesteron im gesunden Mammagewebe über benigne
Mammatumoren bis hin zu malignen abnimmt (MARTIN DE LAS MULAS et al. 2005;
CHANG et al. 2009; SPOERRI et al. 2015). Bei einer differenzierten Betrachtung der
malignen Mammatumoren wurde festgestellt, dass eine höhere Immunreaktivität von
Östrogenrezeptoren in Adenokarzinomen vorhanden ist, verglichen mit der Gruppe von
Neoplasien mit tubulärer Formation, wie beispielsweise solide Karzinome (NIETO et al.
2000). Auch wurden niedrigere Proteinlevel bei Tumoren mit aggressivem Verhalten
(MAINENTI et al. 2014) und bei invasiven Karzinomen verglichen mit In-situ-Karzinomen
(MILLANTA et al. 2005) nachgewiesen. Ähnliche Ergebnisse für Östrogen- und
Progesteronrezeptoren wurden bei Brustkrebs festgestellt, wobei die Immunreaktivität mit
zunehmendem histopathologischen Grad des Tumors sank (DUNNWALD et al. 2007;
AZIZUN
et
al.
2008).
Während
beim
5
Menschen
bereits
eine
Nutzung
des
Literaturübersicht
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Steroidrezeptorstatus für die prognostische Einschätzung erfolgt (PAYNE et al. 2008;
HAMMOND et al. 2010), gehen die Ergebnisse bezüglich einer prognostischen Bedeutung
beim Hund auseinander. Ein Teil der Studien berichtet von einem Zusammenhang zwischen
der Expression von Steroidhormonrezeptoren auf die Überlebenszeit von Hündinnen mit
Mammatumoren (NIETO et al. 2000; C. C. CHANG et al. 2009), während in anderen Studien
dieser Zusammenhang nicht nachweisbar war (MARTIN DE LAS MULAS et al. 2005;
MILLANTA et al. 2005).
Bei der Untersuchung der Hormonrezeptor-Verteilung ist es auch von Bedeutung, die
Situation nach Kastration zu betrachten. Studien, die zwischen kastrierten und unkastrierten
Hündinnen differenzierten, fanden bislang entweder keinen Unterschied (MARTIN DE LAS
MULAS et al. 2005; CHANG et al. 2009) oder einen niedrigeren Gehalt an
Östrogenrezeptoren bei Tumoren kastrierter Tiere (NIETO et al. 2000; MAINENTI et al.
2014). Gleichzeitig war eine geringe Menge an Östrogenrezeptoren mit Tumoren schlechterer
Prognose (MAINENTI et al. 2014) oder einer kürzeren Überlebenszeit (NIETO et al. 2000)
assoziiert. In einer weiteren Studie wurde gezeigt, dass Hündinnen, bei denen das Intervall
zwischen Kastration und Mammatumor-Operation weniger als 2 Jahre betrug, eine höhere
Überlebenszeit besaßen (SORENMO et al. 2000). Die Autoren folgerten daraus, dass eine
spätere Kastration für die Entwicklung von östrogenrezeptor-positiven Tumoren von Vorteil
sein könnte. Dementsprechend wird die Empfehlung für eine frühe Kastration von
SCHNEIDER et al. (1969) angezweifelt. Nach dieser Untersuchung haben Hündinnen, die
vor der ersten Läufigkeit kastriert werden, das geringste Risiko (0,5%) für ein späteres
Auftreten von Mammatumoren. Dieses Risiko steigt bei Kastration nach 2 Läufigkeiten auf
26%. Andere Studien konnten diesen Zusammenhang zwischen Kastration und geringerer
Inzidenz von Mammatumoren nicht feststellen (RICHARDS et al. 2001; TORRES DE LA
RIVA et al. 2013; HART et al. 2014). Zusätzlich wurde in einem systematischen Review,
welches den Einfluss der Kastration auf die Ausbildung von Mammatumoren untersucht, die
Evidenz der durchgeführten Studien als „schwach“ bezeichnet (BEAUVAIS et al. 2012).
Trotzdem ist die häufigste Begründung, weshalb Tierärzte Patientenbesitzern empfehlen, ihre
Hündinnen kastrieren zu lassen, das verminderte Auftreten von Mammatumoren (DIESEL et
al. 2010). Weitere Studien sind notwendig, um den Einfluss der Kastration auf die Ausbildung
von Mammatumoren und auf die Expression von Hormonrezeptoren zu beurteilen.
6
Literaturübersicht
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Bei Brustkrebs profitieren Frauen, bei denen mittels IHC Östrogenrezeptoren im Tumor
festgestellt wurden, von einer hormonellen Therapie mit Aromatasehemmern oder
Östrogenrezeptormodulatoren (HAMMOND et al. 2010). Die Behandlung von Hunden mit
dem Östrogenrezeptormodulator Tamoxifen wird durch das Auftreten von teilweise starken
Nebenwirkungen limitiert (MORRIS et al. 1993; TAVARES et al. 2010). Dabei handelt es
sich einerseits um Veränderungen des Genitaltrakts, andererseits um ophthalmologische
Nebenwirkungen (TAVARES et al. 2010), weshalb der therapeutische Ansatz beim Hund bis
jetzt nicht genutzt wird (PEÑA et al. 2014). Eine weitere Möglichkeit der Behandlung könnte
der Progesteron-Rezeptor-Antagonist Aglepriston sein, welcher bei rezeptor-positiven
Mammatumoren eine Verminderung des Proliferations-, nicht aber des Apoptose-Index
auslösen konnte (GUIL-LUNA et al. 2011). Obwohl die Studie vielversprechende Ergebnisse
lieferte, war die Zahl der Patienten (n=22) und Kontrolltiere (n=8) zu klein, um die Eignung
des Medikaments abschließend zu beurteilen.
Weitere beim Hund bis jetzt nicht im Detail untersuchte Einflüsse auf die Entstehung von
Mammatumoren sind die Hormone Prolaktin und Somatotropin. Für beide Hormone wurde
sowohl beim Menschen als auch beim Hund nachgewiesen, dass sie auch vom
Mammagewebe produziert werden können, sodass von einer autokrinen/parakrinen Wirkung
ausgegangen wird (CLEVENGER et al. 1995; GINSBURG u. VONDERHAAR 1995; VAN
GARDEREN et al. 1997; RACCURT et al. 2002; QUEIROGA et al. 2005). Beim Menschen
sind Prolaktin- und Somatotropinrezeptoren in Karzinomen der Brust höher exprimiert als in
gesundem Brustgewebe (TOURAINE et al. 1998; GEBRE-MEDHIN et al. 2001), weshalb
Prolaktinrezeptoren bereits als potenzielle Targets für therapeutische Ansätze untersucht
werden (DAMIANO et al. 2013; AGARWAL et al. 2016). Beim Hund sind sowohl Prolaktinals auch Somatotropinrezeptoren in malignen Mammatumoren gering exprimiert (VAN
GARDEREN et al. 1999; MICHEL et al. 2012; SPOERRI et al. 2015), vergleichbar mit
Östrogen- und Progesteronrezeptoren. Im Gegensatz zu den Steroidhormonrezeptoren wurden
noch keine Studien über die Verteilung von Prolaktin- oder Somatotropinrezeptor in
histopathologischen Untergruppen von Mammatumoren des Hundes durchgeführt. Auch
Studien über eine mögliche prognostische Bedeutung fehlen bis jetzt. In humanem
Brustgewebe waren prolaktinrezeptor-negative Tumoren mit einer schlechteren Prognose
assoziiert (FAUPEL-BADGER et al. 2014; HACHIM et al. 2015).
7
Literaturübersicht
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Untersuchungen von Hormonrezeptoren im Mammagewebe des Hundes auf der RNA-Ebene
sind bis jetzt selten (MICHEL et al. 2012; KIM et al. 2014; SPOERRI et al. 2015).
Stattdessen wird in Anlehnung an die Humanmedizin meist eine Beurteilung mittels IHC
vorgenommen, obwohl die quantitative Analyse der Genexpression durchaus Vorteile hat.
Insbesondere bei malignen Mammatumoren, welche grundsätzlich niedrige Mengen an
Hormonrezeptoren aufweisen, besteht das Risiko, dass diese Mengen mit semiquantitativen
Methoden übersehen werden und fälschlicherweise eine Einstufung als „hormonrezeptornegativ“ erfolgt (KIM et al. 2014).
2.2 Tumorassoziierte Gene
Im Gegensatz zum Menschen ist das Wissen über die genetischen Grundlagen der Entstehung
von Mammatumoren beim Hund begrenzt. Es wird jedoch aufgrund der Tatsache, dass
Mammatumoren bei bestimmten Hunderassen gehäuft vorkommen, von einer genetischen
Prädisposition ausgegangen (SLEECKX et al. 2011; DOBSON 2013). Einen zusätzlichen
Hinweis für eine genetische Prädisposition liefern die beim Menschen untersuchten Gene
BRCA1 und BRCA2. Vererbte Mutationen führen bei betroffenen Frauen zu einem bis zu 82%
erhöhten Risiko, an Brustkrebs zu erkranken (KING et al. 2003). Beim Hund konnte eine
verminderte BRCA1- und BRCA2-Expression bei malignen Mammatumoren gefunden werden
(NIETO et al. 2003; YOSHIKAWA et al. 2015), welche beim Englischen Springer Spaniel
und Shih Tzu rassebedingt sein könnte (RIVERA et al. 2009; IM et al. 2013). Auch andere
Gene sind beim Menschen mit der Tumorgenese oder Tumorprogression von Brustkrebs
assoziiert, auf deren Basis auch Studien im Mammagewebe des Hundes durchgeführt wurden.
HER2 ist bei ca. 30% der Frauen in Tumoren der Brust überexprimiert und weist auf eine
schnelleres Wiederauftreten und eine kürzere Überlebenszeit hin (SLAMON et al. 1987).
Zudem können HER2-positive Tumoren bei der Frau heute teils erfolgreich mit Trastuzumab,
einem monoklonalen Antikörper gegen HER2 behandelt werden (COBLEIGH et al. 1999;
SLAMON et al. 2001; PAYNE et al. 2008). Ähnlich wie bei der Frau konnte in 17,6-38% der
malignen kanine Mammatumoren eine Überexpression von HER2 nachgewiesen werden
(RUNGSIPIPAT et al. 1999; MARTIN DE LAS MULAS et al. 2003; HSU et al. 2009;
RESSEL et al. 2013; SHINODA et al. 2014). Diese war in einigen Untersuchungen mit einer
8
Literaturübersicht
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höheren Überlebensrate oder besseren Prognose assoziiert (HSU et al. 2009; SHINODA et al.
2014).
Vielversprechende Ergebnisse liefern auch Studien mit dem Tumorsuppressorgen TP53.
Dabei wird zumeist die mutierte Form von TP53 untersucht, da diese das TumorsuppressorPotenzial verliert und Onkogen-Aktivität erlangt (ELIYAHU et al. 1984; FINLAY et al.
1988; HINDS et al. 1989). Der Mutationsstatus von TP53 ist ein möglicher prognostischer
Faktor sowohl für Brustkrebs der Frau (SILVESTRINI et al. 1993; OVERGAARD et al.
2000; LANGEROD et al. 2007), als auch für Mammatumoren des Hundes (LEE et al. 2004;
ŁOPUSZYŃSKI et al. 2010). Außerdem sollen die Tumorsuppressor-Gene PTEN, PFDN5
und FOXO3 mit der Entstehung von Mammatumoren assoziiert sein. PTEN zeigt eine geringe
Expression in malignen Neoplasien des Gesäuges (RESSEL et al. 2009). Dabei hat es, ähnlich
wie beim Menschen (BOSE et al. 2002; TSUTSUI et al. 2005), das Potenzial eines
prognostischen Markers, da der Verlust von PTEN mit prognostischen Faktoren wie
„Metastasierung“, „Rezidiven“ und „kürzere Überlebenszeit“ korreliert war (RESSEL et al.
2009). In einer Microarray-Analyse von SNPs in Mammatumoren des Hundes konnte zudem
festgestellt werden, dass PTEN häufig dereguliert ist und damit potenziell zur Entwicklung
von Mammatumoren beitragen könnte (BORGE et al. 2015). Bei PFDN5 handelt es sich um
ein bis dato unzureichend charakterisiertes Gen. Während beim Menschen lediglich eine
verringerte Expression in 69% der untersuchten Brustkrebs-Proben gefunden werden konnte
(SCHUMMER et al. 2010), hat eine Studie über kanine Mammatumoren ergeben, dass eine
Deletion von PFDN5 mit höheren Proliferationsaktivitäten des Tumors assoziiert ist (BECK
et al. 2013). Weitere Studien bestätigten, dass die Deletion hauptsächlich in malignen
Neoplasien zu finden ist, insbesondere in soliden Karzinomen (HENNECKE et al. 2015) und,
dass die Genexpression in malignen Neoplasien vermindert ist (RIPOLI et al. 2016). Während
FOXO3 bei Brustkrebs der Frau als potenzieller prognostischer Faktor zur Einschätzung der
Überlebenszeit angesehen wird (HABASHY et al. 2011; JIANG et al. 2013) und bereits
mögliche gezielte Therapieansätze für FOXO3-negative Tumoren untersucht werden
(TAYLOR et al. 2015; PARK et al. 2016), ist über seine Bedeutung beim Hund bis jetzt
wenig bekannt. Eine kürzlich durchgeführte Analyse von neoplastischem und nichtneoplastischem Mammagewebe des Hundes hat allerdings gezeigt, dass die Expression von
FOXO3 in malignen Tumoren vermindert ist (RIPOLI et al. 2016). Weitere tumorassoziierte
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Literaturübersicht
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Gene, die in Mammatumoren des Hundes noch nicht im Detail untersucht wurden, sind die
Tumorsuppressorgene GATA4, MAPK1 und MAPK3, sowie die Onkogene HMGA1, HMGA2,
HMGB1, MCL1, MYC und PIK3CA. Ein mögliches prognostisches Potenzial im Hinblick auf
die Überlebenszeit von Patienten mit Brustkrebs konnte beim Menschen für die Gene GATA4
(TAKAGI et al. 2014), HMGA2 (WU et al. 2016), HMBG1 (KOSTOVA et al. 2010; SUN et
al. 2015), MCL1 (DING et al. 2007), MYC (PEREIRA et al. 2013) und PIK3CA (CIZKOVA
et al. 2012) bestätigt werden.
Trotz der teilweise schon betrachteten Expression der genannten Gene im Mammagewebe des
Hundes, wurde bis jetzt kaum ihre Brauchbarkeit als Targets für die gezielte Tumortherapie
getestet. Lediglich die Wirkung von Trastuzumab als monoklonaler Antikörper gegen HER2
wurde bereits geprüft (SINGER et al. 2012). Dabei konnte in kaninen Mammazelllinien eine
verminderte Proliferation der Zellen als Folge der Bindung des Antikörpers festgestellt
werden. Bei Brustkrebs des Menschen wurden neben HER2 von den bereits erwähnten Genen
FOXO3 (PARK et al. 2016), HMGA1 (DI CELLO et al. 2013; SHAH et al. 2013), MCL1
(MODUGNO et al. 2015) und PIK3CA (SHE et al. 2016) für die gezielte Tumortherapie
untersucht. Um eine erste Einschätzung der Behandlungsmöglichkeiten vorzunehmen, werden
häufig Zelllinien genutzt (GOODSPEED et al. 2016), da die aus dem Organismus isolierten
Tumorzellen, das Originalgewebe repräsentieren sollen (BURDALL et al. 2003). Erste
Einschätzungen über die Wirksamkeit des Medikaments können über die Beurteilung der
Zellproliferation oder der Vitalität der Zellen vorgenommen werden (ASTASHKINA et al.
2012). Für die spätere Anwendbarkeit in in-vivo-Versuchen ist es von Bedeutung, dass die
Genexpression in der Zellkultur die im Originalgewebe widerspiegelt.
2.3 Multiplex Branched DNA Assay
Bei dem Multiplex Branched DNA Assay handelt es sich um eine Kombination aus Branched
DNA Assay und xMAP® magnetische Beads, welche einen quantitativen Nachweis von
mehreren Genen in einer Probe ermöglicht (FLAGELLA et al. 2006). Dabei ist der Branched
DNA Assay eine Methode, die aufgrund ihrer Sensitivität und Spezifität von der US Food and
Drug Administration als Technik für die klinische Diagnostik anerkannt ist (TSONGALIS
2006). Das direkte Detektieren der RNA steht im Gegensatz zur quantitativen PCR (qPCR),
10
Literaturübersicht
__________________________________________________________________________________
bei der eine Amplifikation der Zielsequenz und nicht des Reportersignals erfolgt
(TSONGALIS 2006; ZHENG et al. 2006). Der initiale Schritt des Branched DNA Assays ist
die Hybridisierung der nachzuweisenden RNA-Zielsequenzen an die sogenannten
zielsequenz-spezifischen DNA-Fangsonden („Capture Probe“) und an eine Detektionssonde
(„Capture Extender“). In darauffolgenden Hybridisierungsschritten werden synthetisch
verzweigte und chemisch markierte Oligonukleotid-Sonden an die Detektionssonde
gebunden, welche als „Signalverstärker-DNA" („Label Extender“) wirken sollen. Die
letztendliche Quantifizierung erfolgt durch die Bindung von „Label Probe“-Molekülen, an die
wiederum ein Reporterfarbstoff (Streptavidin-konjugiertes R-Phycoeryhrin, SAPE) bindet
(COLLINS et al. 1997; TSONGALIS 2006; YANG et al. 2006; KNUDSEN et al. 2008).
Während die qPCR als eine der Standardmethoden zur Untersuchung von Genexpressionen
(LEWIS et al. 2001), ein geringes Multiplex-Potential aufweist, können mittels des Branched
DNA Assays in Kombination mit xMAP® magnetische Beads bis zu 100 Gene parallel in
einer Probe nachgewiesen werden (FLAGELLA et al. 2006). Die Anfangs erwähnten DNAFangsonden sind an die Beads gekoppelt. Durch Auslesen der Beads, also durch Anregen der
bead-spezifischen Wellenlänge mittels Laserlicht, können diese in Verbindung mit den
Zielsequenz-Komplexen einem bestimmten Targetgen zugeordnet werden. Gleichzeitig ist die
ermittelte Fluoreszenzintensität des Reporterfarbstoffes proportional zu der gebundenen
Menge der RNA-Zielsequenz (FLAGELLA et al. 2006). Weitere Vorteile des Branched DNA
Assays sind der schnelle Arbeitsablauf und die Möglichkeit mit Lysaten des Gewebes zu
arbeiten, anstatt eine RNA-Isolierung durchzuführen. Dadurch können extraktionsbedingte
Fehler vermieden werden (YANG et al. 2006; KNUDSEN et al. 2008).
FFPE-Proben stellen einen großen und interessanten Pool für retrospektive Studien dar
(LEWIS et al. 2001; RIBEIRO-SILVA et al. 2007; SCHWEIGER et al. 2009; WEBSTER et
al. 2015), während kryokonservierte Proben auf wenige Gewebebänke beschränkt sind
(PENLAND et al. 2007; RIBEIRO-SILVA et al. 2007; CALLARI et al. 2014). Jedoch liefern
Genexpressionsanalysen mit FFPE-Proben aufgrund ihrer degradierten oder fragmentierten
RNA (RIBEIRO-SILVA et al. 2007; BASS et al. 2014; NAM et al. 2014; WEBSTER et al.
2015) häufig weniger verlässliche Ergebnisse (YANG et al. 2006; WEBSTER et al. 2015). In
einer Studie von 2008 konnte dagegen festgestellt werden, dass die Analyse von FFPE-
11
Literaturübersicht
__________________________________________________________________________________
Proben des Menschen mittels Branched DNA Assay verlässliche und reproduzierbare
Ergebnisse liefert (KNUDSEN et al. 2008).
Da über die genetischen Grundlagen von Mammatumoren des Hundes bisher wenig bekannt
ist, bietet der Multiplex Branched DNA Assay die Möglichkeit, eine große Anzahl an Targets
und, aufgrund des schnellen und einfachen Arbeitsablaufs (KNUDSEN et al. 2008), auch eine
große Anzahl an Proben zu messen, um für die Tumorentwicklung relevante Gene zu
detektieren. Gleichzeitig ermöglicht die Sensitivität des Assays eine differenzierte
Betrachtung von Tumorsubtypen. Basierend auf der Literatur soll der Branched DNA Assay
beim Menschen auch für FFPE-Proben geeignet sein (YANG et al. 2006; KNUDSEN et al.
2008). Ein Vergleich zwischen kryokonservierten und FFPE-Proben im Mammagewebe des
Hundes wurde bisher noch nicht durchgeführt.
12
Material und Methoden
__________________________________________________________________________________
3. Material und Methoden
3.1 Kryokonservierte Proben
In der vorliegenden Arbeit wurden insgesamt 119 kryokonservierte Proben untersucht, die im
Rahmen von Mammatumor-Operationen in den Jahren 2003 bis 2011 in der Klinik für
Kleintiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover (n=105) und im Jahr 2014 in der
Kleintierklinik des Tierärztlichen Instituts der Georg-August-Universität Göttingen (n=11),
sowie in der Kleintierpraxis Dr. M. Schilling, Bielefeld (n=3) entnommen wurden. Die
Gewebeproben wurden in ca. 1x1cm große Stücke zugeschnitten und in 1,8ml Kryoröhrchen
(Nunc™, Fisher Scientific GmbH, Schwerte, Deutschland) in flüssigem Stickstoff
schockgefrostet. Anschließend wurden die Proben bei -80°C in einer Gewebebank gelagert.
Für die histopathologische Klassifizierung wurde ein Stück der kryokonservierten Proben in
10% gepuffertes Formalin gegeben, in Paraffin eingebettet und im Institut für Pathologie der
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover routinemäßig verarbeitet. Nach der Anfertigung
von 3-4 µm Schnitten wurde mit Hämatoxylin-Eosin angefärbt und die Proben gemäß einer
modifizierten Klassifizierung nach GOLDSCHMIDT et al. (2011) histopathologisch
befundet. Nähere Information zu der Rassenverteilung und des Kastrationsstatus der
Patienten, sowie zu den histopathologischen Diagnosen der Proben sind der Studie 1 zu
entnehmen.
3.2 Formalin-fixierte, paraffin-eingebettete Proben
Das FFPE-Gewebe beinhaltete 180 Proben, welche in den Jahren 1993 bis 2000 in der Klinik
für Kleintiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover operativ entfernt und im
dortigen Institut für Pathologie routinemäßig histopathologisch befundet wurden. Dafür
wurden die Proben in 10% gepuffertes Formalin gegeben und dann in Paraffin eingebettet.
Die anschließende Lagerung der FFPE-Blöcke erfolgte bei Raumtemperatur. Für die
vorliegende Arbeit erfolgte am Institut für Pathologie eine zusätzliche Befundung der Proben
nach einer Klassifizierung von GOLDSCHMIDT et al. (2011). Nähere Information zu der
Rassenverteilung und des Kastrationsstatus der Patienten, sowie zu den histopathologischen
Diagnosen der Proben sind der Studie 1 zu entnehmen.
13
Material und Methoden
__________________________________________________________________________________
3.3 Zellkultur-Proben
Gewebeproben für die Zellkultur stammten von 10 Mammatumoren (4 benigne und 6
maligne) und 6 nicht-neoplastichen Mammageweben, welche in den Jahren 2014 und 2015 im
Rahmen von Mammatumor-Operationen in der Kleintierklinik des Tierärztlichen Instituts der
Georg-August-Universität Göttingen (n=11), der Klinik für Kleintiere der Stiftung
Tierärztliche Hochschule Hannover (n=2) und der Kleintierpraxis Dr. M. Schilling, Bielefeld
(n=3) entnommen wurden. Die Proben wurden bis zu ihrer Weiterverarbeitung in Hank’s
Lösung (Hank‘s Balanced Salt Solution, Biochrom GmbH, Berlin, Deutschland) gelagert. Je
nach Größe des Tumors wurden zusätzlich kleine Stücke abgeteilt, schockgefrostet und bei
-80°C gelagert.
Für die Isolation der Zellen wurden die Gewebeproben unter sterilen Kautelen zuerst
mechanisch zerkleinert und anschließend mit 0,26%iger Kollagenase (4ml, 200U/ml,
Collagenase NB 8 Broad Range, SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Deutschland)
enzymatisch behandelt. Die Einwirkung der Kollagenase erfolgte im Inkubator (5%CO2,
37°C) für 1 bis 2 Stunden bis die Zellen dissoziiert waren. Anschließend wurden die Zellen
mit Medium 199 (Life Technologies GmbH, Darmstadt, Deutschland) gewaschen und bei
1000 rpm 10 Minuten zentrifugiert (Raumtemperatur, Universal 230R centrifuge, Hettich,
Lauenau, Deutschland). Das Zellpellet wurde in Zellkulturflaschen (25cm2, TPP Techno
Plastic Products AG, Trasadingen, Schweiz) mit Medium 199 mit 20% fetalem Kälberserum
(Biochrom GmbH, Berlin, Deutschland) und 2% Penicillin/Streptomycin (10.000 U/ml /
10.000 µg/ml, Biochrom GmbH) überführt und bei 37°C, 98% relativer Luftfeuchtigkeit und
5% CO2 kultiviert. Sobald eine Konfluenz der Zellen von ca. 80% erreicht war, wurden die
Zellen nach enzymatischer Ablösung (1ml TrypLE™ Express Enzyme no phenol red, Life
Technologies GmbH, Darmstadt, Deutschland) in zwei neue Zellkulturflaschen passagiert.
Abhängig vom Wachstum der Zellen wurden Zellkulturen, die Passage 20 (P.20) oder darüber
hinaus erreicht hatten, als „Zelllinien“ bezeichnet. Erreichten die Kulturen die Passage 20
nicht, wurden sie „Primärkultur“ genannt.
Für die histopathologische Klassifizierung der Zellkulturen wurden Zellpellets angefertigt, in
4%igem Paraformaldehyd gelagert und in Paraffin eingebettet. Anschließend wurde von den
eingebetteten Proben im Institut für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule
14
Material und Methoden
__________________________________________________________________________________
Hannover 3-4 µm Schnitte angefertigt, mit Hämatoxylin-Eosin angefärbt und gemäß einer
modifizierten Klassifizierung nach GOLDSCHMIDT et al. (2011) bewertet. Nähere
Information zu der Rassenverteilung und des Kastrationsstatus der Patienten, sowie zu den
histopathologischen Diagnosen der Proben sind der Studie 2 zu entnehmen.
3.4 RNA-Isolierung
Vor der RNA-Isolierung wurden die kryokonservierten Proben mithilfe des TissueLyser II
(Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland) und 5mm großen Edelstahl-Beads homogenisiert.
Anschließend wurde die RNA mit dem RNeasy Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden,
Deutschland) isoliert. Dabei wurde ein zusätzlicher DNA-Verdau mit dem RNase-free DNase
Set (Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland) und der RQ1 RNase-free DNase (Promega GmbH,
Mannheim, Deutschland) durchgeführt.
Von den FFPE-Blöcken wurden mit einem Mikrotom 20µm-Schnitte hergestellt. Diese
wurden in RNAse freie Eppendorf Röhrchen gegeben und das Paraffin mit einer
Deparaffinisierungs-Lösung
(Deparaffinization
Solution,
Qiagen
GmbH,
Hilden,
Deutschland) entfernt. Anschließend wurde die RNA mit dem AllPrep DNA/RNA FFPE Kit
(Qiagen GmbH, Hilden, Deutschland) isoliert.
Die isolierte RNA der kryokonservierten und der FFPE-Proben wurde mit dem Synergy Multi
Mode Reader, der Take3 Micro-Volume Plate und der Gen5™ Reader Control und Data
Analysis Software (Biotek, Bad Friedrichshall, Deutschland) quantifiziert. Die Lagerung der
RNA erfolgte bei -80°C bis zum weiteren Gebrauch.
3.5 Zellpellets
Für die Genexpressionsanalyse wurden von den Zellkulturen Zellpellets angefertigt. Dafür
wurden die Zellen zuerst enzymatisch aus den Zellkulturflaschen abgelöst (1ml TrypLE™
Express Enzyme no phenol red, Life Technologies GmbH, Darmstadt, Deutschland), mit
phosphatgepufferter Salzlösung (phosphate buffered saline, PBS) gewaschen und in 15ml
Polypropylen-Röhrchen überführt (CELLSTAR® Centrifuge Tubes, Polypropylene, Steril,
Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Deutschland). Anschließend wurden die Zellen
mithilfe eines Zellometers (Cellometer Auto T4, Nexcelom Bioscience, Lawrence,
Massachusetts, USA) gezählt, zentrifugiert (1000 rpm, 10 min) und in RNAse-freie
15
Material und Methoden
__________________________________________________________________________________
Eppendorf-Röhrchen (Eppendorf, Hamburg, Deutschland) überführt, welche bei -80°C
gelagert wurden. Je nach Wachstum der Zellen wurden Pellets der Passage 0-3 (im Weiteren
bezeichnet als P.0), Passage 5-10 (P.10), Passage 15-20 (P.20) und Passage 30 (P.30)
untersucht. Von den Zellpellets wurden anschließend als Vorbereitung für die
Genexpressionsanalyse mithilfe einer Lösung zur Zelllyse (Working Lysis Mixture,
Affymetrix, Santa Clara, USA) Zelllysate vorbereitet, um eine finale einheitliche
Konzentration von 400 Zellen/µl zu erreichen.
3.6 Multiplex Branched DNA Assay
Die Genexpression wurde mit dem QuantiGene 2.0 Plex Assay (Affymetrix, Santa Clara,
USA) und dem Luminex100/200TM-System (Luminex Corporation, Austin, Texas, USA)
analysiert. Für jedes Gen (BRCA1, BRCA2, ESR1, FOXO3, GATA4, GHR, HER2, HMGA1,
HMGA2, HMGB1, MAPK1, MAPK3, MCL1, MYC, PFDN5, PIK3CA, PGR, PRLR, PTEN,
und TP53) und die Housekeeping-Gene Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase
(GAPDH), Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase 1 (HPRT1) und Beta-actin (ACTB),
welche als Referenzgene dienten, wurden von Affymetrix spezifische bead-basierte
Oligonukleotid Probe Sets hergestellt. Das Assay wurde nach Herstellerangaben durchgeführt
(Affymetrix, Santa Clara, USA). Die Proben wurden mit dem Luminex100/200TM-System
(Luminex Corporation, Austin, Texas, USA) ausgelesen. Dabei ist das detektierte Signal
(dargestellt als mittlere Fluoreszenz-Intensität, MFI) von jedem Bead proportional zu der
Menge der Target-RNA in der Probe.
3.7 Housekeeping-Gene
Die Housekeeping-Gene (HKG) GAPDH, HPRT1 und ACTB wurden in der vorliegenden
Arbeit genutzt, um die Genexpression der Targetgene zu normalisieren. Die Auswahl basierte
auf für Studien beim Menschen empfohlenen Referenzgenen (DE KOK et al. 2005;
MAJIDZADEH et al. 2011; KILIC et al. 2014). Wie in anderen Studien bereits durchgeführt
oder empfohlen (LYNG et al. 2008; YIM et al. 2010), wurde in der vorliegenden Arbeit der
Mittelwert der HKG für die Normalisierung der Daten genutzt.
16
Material und Methoden
__________________________________________________________________________________
3.8 Daten-Analyse und statistische Analyse
Die mediane Fluoreszenz wurde zuerst vom Hintergrund abgezogen und anschließend zum
Mittelwert der Housekeeping-Gene (GAPDH, HPRT1 und ACTB) normalisiert. Nach
Herstellerangaben
wurden Proben, welche Signale unterhalb
der Nachweisgrenze
(Hintergrund plus 3 mal Standardabweichung des Hintergrunds) aufwiesen, von der Analyse
ausgeschlossen.
Die statistische Auswertung wurde mithilfe des SAS Enterprise Guide 7.1 (SAS Institute Inc.,
Cary, North Carolina, USA) durchgeführt. Für die Analyse der HormonrezeptorGenexpression wurden die Daten auf Normalverteilung getestet. Da keine Normalverteilung
vorlag, wurde der Mann-Whitney-U-Test für den Vergleich der Genexpression in den
verschieden gelagerten Proben und in den verschiedenen Diagnosegruppen durchgeführt. Der
Vergleich der Genexpression zwischen Originalgewebe und den Passagen der kultivierten
Zellen erfolgte mittels t-Test für gepaarte Proben. Die Genexpression in den kultivierten
Zellen wurde als „niedrig“ bezeichnet, wenn die normalisierten Expressions-Level unterhalb
von 0,1 lagen.
17
Ergebnisse
__________________________________________________________________________________
4.
Ergebnisse
4.1
Studie 1
Das folgende Manuskript wurde in dem Journal „PLoS ONE“ am 20.09.2016 publiziert
(doi:10.1371/journal.pone.0163311).
Hormone Receptor Expression Analyses in Neoplastic and Non-neoplastic Canine
Mammary Tissue by a Bead Based Multiplex Branched DNA Assay: A Gene Expression
Study in Fresh Frozen and Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded Samples
Annika Mohr1,2, Florenza Lüder Ripoli1,2, Susanne Conradine Hammer1,2, Saskia
Willenbrock1, Marion Hewicker-Trautwein3 , Zdzisław Kiełbowicz4, Hugo Murua Escobar1,2,
Ingo Nolte1*
1: Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, Hannover,
Germany
2: Division of Medicine Clinic III, Hematology, Oncology and Palliative Medicine,
University of Rostock, Rostock, Germany
3: Institute of Pathology, University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation,
Hannover, Germany
4: Department and Clinic of Veterinary Surgery, Faculty of Veterinary Medicine, Wroclaw
University of Environmental and Life Sciences, Wrocław, Poland
* Corresponding author
E-mail: [email protected]
Abstract
Immunohistochemistry (IHC) is currently considered the method of choice for steroid
hormone receptor status evaluation in human breast cancer and, therefore, it is commonly
utilized for assessing canine mammary tumors. In case of low hormone receptor expression,
18
Ergebnisse
__________________________________________________________________________________
IHC is limited and thus is complemented by molecular analyses. In the present study, a
multiplex bDNA assay was evaluated as a method for hormone receptor gene expression
detection in canine mammary tissues. Estrogen receptor (ESR1), progesterone receptor
(PGR), prolactin receptor (PRLR) and growth hormone receptor (GHR) gene expressions
were evaluated in neoplastic and non-neoplastic canine mammary tissues. A set of 119 fresh
frozen and 180 formalin-fixed, paraffin-embedded (FFPE) was comparatively analyzed and
used for assay evaluation. Furthermore, a possible association between the hormone receptor
expression in different histological subtypes of canine malignant mammary tumors and the
castration status, breed and invasive growth of the tumor were analyzed. The multiplex bDNA
assay proved to be more sensitive for fresh frozen specimens. Hormone receptor expression
found was significantly decreased in malignant mammary tumors in comparison to nonneoplastic tissue and benign mammary tumors. Among the histological subtypes the lowest
gene expression levels of ESR1, PGR and PRLR were found in solid, anaplastic and ductal
carcinomas. In summary, the evaluation showed that the measurement of hormone receptors
with the multiplex bDNA assay represents a practicable method for obtaining detailed
quantitative information about gene expression in canine mammary tissue for future studies.
Still, comparison with IHC or quantitative real-time PCR is needed for further validation of
the present method.
19
Ergebnisse
__________________________________________________________________________________
4.2
Studie 2
Das folgende Manuskript wurde bei dem Journal „BMC Cancer“ am 17.08.2016 zur
Publikation eingereicht.
Longitudinal analysis of 20 tumor-associated genes in non-neoplastic and neoplastic
canine mammary tissues and their corresponding cultivated cells
A. Mohr1,2, S. C. Hammer1,2, F. L. Ripoli1,2, S. Willenbrock1, M. Hewicker-Trautwein3, B.
Brenig4, H. Murua Escobar1,2, I. Nolte1*
1: Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, D-30559
Hannover, Germany; [email protected] (AM);
[email protected] (SCH); [email protected] (FLR);
[email protected] (SW); [email protected] (HME);
[email protected] (IN)
2: Division of Medicine Clinic III, Hematology, Oncology and Palliative Medicine,
University of Rostock, D-18057 Rostock, Germany
3: Institute of Pathology, University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation, D-30559
Hannover, Germany; [email protected] (MHT)
4: Institute of Veterinary Medicine, Georg-August-University Göttingen, D-37077 Göttingen,
Germany; [email protected] (B.B.)
* Corresponding author: I. Nolte ([email protected])
Abstract
Background: Cell lines are widely used as in vitro models to identify potential therapeutic
targets and several canine mammary cell lines have been established in the last years. As long
term cell cultivation leads to genetic alterations, clonal selection could reduce the identity of
stable cell lines to original tissues. Therefore, the usage of primary cultures and early passages
bears significant potential as these are considered to closely resemble the biological behavior
in original samples. Referring to promising targets for human breast cancer, several genes
were already investigated in canine mammary tumors. However, the gene expression in
cultivated cells of canine mammary neoplastic and non-neoplastic origin in comparison to the
20
Ergebnisse
__________________________________________________________________________________
original tissue has not previously been evaluated. Modulations of key pathways resulting from
cultivation conditions reduce the value of in vitro systems. Thus, the expression stability
among cultivation periods is the key to defining the actual value of cell lines.
Methods: Therefore, in the present study, gene expression of 20 tumor-associated genes
(BRCA1, BRCA2, ESR1, FOXO3, GATA4, GHR, HER2, HMGA1, HMGA2, HMGB1,
MAPK1, MAPK3, MCL1, MYC, PFDN5, PIK3CA, PGR, PRLR, PTEN, and TP53) analysis
was performed using a multiplex branched DNA assay (QuantiGene Plex Assay) in six nonneoplastic, ten neoplastic mammary tissues and thereof isolated cultivated cells (until passage
30). Differences in gene expression between cultivated cells and corresponding original tissue
were analyzed using the t-test for paired samples. Thereby, stable primary cultures or cell
lines derived from canine mammary tumors suitable for the development of novel treatment
options should be identified.
Results: HMGA1, HMGB1, MYC and PTEN were the genes which showed stable expression
levels and no significant differences between cultured cells and the original neoplastic tissue.
HMGB1 and PTEN exhibited high and stable expression levels (>0.1) in all neoplastic
primary cultures or cell lines. Regarding HMGA1, solely one of ten and for MYC three of ten
neoplastic primary cultures or cell lines showed high and stable expression levels.
Conclusion: The identified cell cultures could serve for future studies analyzing the value of
targeted therapeutic approaches for canine mammary tumors.
Keywords: canine mammary tumors; cell lines; primary cultures; gene expression
Background
The usage of research cell lines is an important tool to identify and evaluate potential
therapeutic targets [1, 2]. In the dog, several mammary cell lines have been established in the
last years, enclosing benign mammary tumors [3] as well as mammary carcinomas [4-7] to
initiate studies about the pathobiology of canine mammary tumors and to evaluate adjuvant
medical treatment options. The advantages of established cell lines are easy handling and the
possibility of replacing these from frozen stocks [1]. Therefore, in principal, they represent an
infinite source for studying potential initiation or progression factors within a stable system
[2]. However, long term cultivation leads to genetic alteration in cultured cells [1] possibly
21
Ergebnisse
__________________________________________________________________________________
due to shorter population-doubling times and consequently the higher frequency of mutational
changes in comparison to the original corresponding tissue [8]. Thus, cell lines might lose the
clinical starting situation leading to the necessity for viable alternatives, such as the usage of
primary cultures [9]. Although the majority of primary cultures have a limited lifespan [10],
their advantage is the close resemblance to the primary tumor’s biological behavior when
compared to established cell lines [11]. Furthermore, primary cultures can be generated from
individual patients to analyze patient-specific differences characterizing tumor behavior and
potentially predict responsiveness [12].
Referring to promising targets for human breast cancer, several genes were already
investigated in canine mammary tumors, such as hormone receptors [13], BRCA1 and BRCA2
[14], TP53 [15]; PTEN [16-18]; PFDN5 [17, 19]; MYC [18] and HER2 [20]. However, their
expression in primary cultures or cell lines of canine mammary neoplastic and non-neoplastic
origin in comparison to the original tissue has not been evaluated yet.
Therefore, the aim of the present study was to analyze the expression of 20 tumor-associated
genes (BRCA1, BRCA2, ESR1, FOXO3, GATA4, GHR, HER2, HMGA1, HMGA2, HMGB1,
MAPK1, MAPK3, MCL1, MYC, PFDN5, PIK3CA, PGR, PRLR, PTEN, and TP53) in nonneoplastic and neoplastic canine mammary tissue and thereof isolated cultivated cells using a
multiplex branched DNA (bDNA) assay. The combination of bDNA assay and xMAP ®
Luminex® magnetic beads enables amplification-free and quantitative determination of up to
100 genes from one sample [21]. Herein, the assay was applied to detect possible similarities
or changes between the corresponding original tissue and the cultivated cells, as well as to
determine the expression levels of the analyzed targets in cultivated cells. Thereby, primary
cultures or cell lines derived from canine mammary tumors which mirror the original tissue
and exhibit a stable expression of target genes should be identified which could be suitable for
the development of novel treatment options.
Methods
Sample population
Samples were taken from 10 canine mammary tumors (CMT) and 6 non-neoplastic mammary
tissues (CNT) that were aseptically obtained from dogs during routine surgery at the Clinic
22
Ergebnisse
__________________________________________________________________________________
for Small Animals, Institute of Veterinary Medicine, Georg-August-University of Goettingen
(n=11), at the Small Animal Clinic, University of Veterinary Medicine Hannover, Foundation
(n=2) and the veterinary practice of Dr. M. Schilling, Bielefeld, Germany (n=3). The samples
were maintained in Hank’s balanced salt solution (Biochrom GmbH, Berlin, Germany).
Diagnosis was confirmed by histopathological evaluation according to Goldschmidt [22]
(Tables 1 and 2). Of 10 samples, small parts were snap frozen using liquid nitrogen and
archived for long-term storage at -80 °C until further usage.
Table 1: Reached passage (P.) of the primary cultures and information about their origin
Original
tissue
P.0
P.10
P.20
P.30
Diagnosis
Age at
diagnosis
Breed
Castration
status
Non-neoplastic: n=3
x
normal
mammary
tissue
x
x
normal
mammary
tissue
x
x
CNT1
(DT14/05
S2)
x
x
CNT4
(DT14/07 R)
CNT6
x
lobular
hyperplasia
(DT14/08R)
Poodle
11
intact
10
German
wirehaired
pointer
intact
8
Borzoi
intact
10
German
wirehaired
pointer
intact
Canine mammary tumors: malignant n=2
simple
tubular
carcinoma
CMT8
x
x
x
(DT14/07T)
x
(P.16)
invasive
simple
tubular
carcinoma
CMT9
x
x
x
(DT14/09T)
23
Crossbreed
12
neutered
Ergebnisse
__________________________________________________________________________________
Table 2: Reached passage (P.) of the cell lines and information about their origin
Original
tissue
P.0
P.10
P.20
P.30
Diagnosis
Age at
diagnosis
Breed
Castration
status
Non-neoplastic: n=3
x
normal
mammary
tissue
11
normal
mammary
tissue
6
CNT2
x
x
x
Poodle
intact
(DT14/05R)
CNT3
(DT14/06 R)
x
CNT5
(T124)
x
x
x
x
x
x
x
x
lobular
hyperplasia
Rhodesian
Ridgeback
intact
9
Cocker
Spaniel
intact
Jack Russell
Terrier
intact
Canine mammary tumors: benign n=4;
malignant n=4
x
x
x
x
simple
adenoma
6
x
x
x
x
benign
mixed tumor
7
x
x
x
x
benign
mixed tumor
10
x
x
x
CMT1
x
(DT14/04 T)
CMT2
Crossbreed
neutered
(DT14/10T)
CMT3
Golden
Retriever
intact
(DT15/02T)
CMT4
(T121)
CMT5
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
x
(T126)
complex
adenoma
11
carcinoma
arising in a
benign tumor
9
carcinoma
complex type
CMT6
carcinoma
complex type
carcinoma
complex type
CMT10
(T120A)
24
Russian
Terrier
intact
intact
6
Rhodesian
Ridgeback
intact
6
Rhodesian
Ridgeback
intact
(DT14/06 T)
CMT7
(DT14/06
Ts)
Cocker
Spaniel
Crossbreed
8
intact
Ergebnisse
__________________________________________________________________________________
Cell culture
Samples were disaggregated, using a combination of mechanical disruption and short-term
enzymatic treatment with 4 mL of 0.26 % collagenase (200 U/mL, Collagenase NB 8 Broad
Range, SERVA Electrophoresis GmbH, Heidelberg, Germany) maintained in a humidified
incubator (5 % CO2 at 37 °C) until tissue dissociation. Cells were then washed using Medium
199 (Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany) and centrifuged (1000 rpm, 10 min, at
room temperature; Universal 230R centrifuge, Hettich, Lauenau, Germany). Cells were
cultivated in 25 cm2 culture flasks (TPP Techno Plastic Products AG, Trasadingen,
Switzerland) in Medium 199 (Life Technologies GmbH, Darmstadt, Germany) supplemented
with 20% fetal calf serum (Biochrom GmbH, Berlin, Germany), 2 % penicillin/streptomycin
(10.000 U/mL / 10.000 µg/mL, Biochrom GmbH) and incubated at 37 °C, 98 % relative
humidity and 5 % CO2. When confluence was attained, the cells were subcultured after
enzymatic dissociation (1 mL TrypLE™ Express Enzyme no phenol red, Life Technologies
GmbH, Darmstadt, Germany). Depending on the growth of the cells, cultivated cells that
reached passage 20 (P.20) and above were further referred to as “cell lines”, whereas
cultivated cells below P.20 were referred to as “primary “cultures”, respectively.
Cell pellets
Of the cultivated cells, pellets of passages 0-3 (P.0), passages 5-10 (P.10), passages 15-20
(P.20) and passage 30 (P.30) were prepared if possible depending on the growth of the cells
(Tables 1 and 2). Cells were enzymatically dissociated (1 mL TrypLE™ Express Enzyme),
washed with 5 mL of phosphate buffered saline (Biochrom GmbH, Berlin, Germany) and
transferred to 15 mL polypropylene tubes (CELLSTAR® Centrifuge Tubes, Polypropylene,
Sterile, Greiner Bio-One GmbH, Frickenhausen, Germany). Afterwards, they were counted
using a Cellometer (Cellometer Auto T4, Nexcelom Bioscience, Lawrence, Massachusetts,
USA), centrifuged (1000 rpm, 10 min), transferred to RNAse free Eppendorf Cups
(Eppendorf, Hamburg, Germany) and stored at -80°C until further usage.
Sample preparation
Cell lysates were prepared using a Working Lysis Mixture (supplied by the QuantiGene 2.0
Plex Assay from Affymetrix, Santa Clara, USA) following manufacturer’s instructions to
25
Ergebnisse
__________________________________________________________________________________
determine a final concentration of 400 cells/µL. Tissue samples were homogenized with 5
mm stainless steel beads using the TissueLyser II (Qiagen GmbH, Hilden, Germany). The
RNA was isolated with the RNeasy Mini Kit (Qiagen GmbH, Hilden, Germany) with an
additional step of digestion using the RNase-free DNase Set (Qiagen GmbH, Hilden,
Germany) according to the manufacturer’s protocol. Additionally, genomic DNA was
digested using RQ1 RNase-free DNAse (Promega GmbH, Mannheim Germany). Total RNA
was quantified using Synergy multi-mode reader utilizing the Gen5™ Reader Control, the
Take3 Micro-Volume Plates and Data Analysis Software (Biotek, Bad Friedrichshall,
Germany) and stored at -80 °C until further usage.
Analysis and statistical analysis
The gene expression was determined using the QuantiGene 2.0 Plex Assay (Affymetrix). For
each gene (BRCA1, BRCA2, ESR1, FOXO3, GATA4, GHR, HER2, HMGA1, HMGA2,
HMGB1, MAPK1, MAPK3, MCL1, MYC, PFDN5, PIK3CA, PGR, PRLR, PTEN, and TP53)
specific bead-based oligonucleotide probe sets were custom designed by Affymetrix. The
genes and their respective accession numbers are shown in Table 3. The assay was performed
according to the manufacturer’s protocol. The samples were analyzed using a Luminex®
100/200™ System (Luminex Corporation, Austin, Texas, USA). The signal (expressed as
mean fluorescence intensity, MFI) of each bead is proportional to the amount of target RNA
in the sample. The RNA levels of the housekeeping genes Glyceraldehyde 3-phosphate
dehydrogenase (GAPDH), Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase 1 (HPRT1) and Betaactin (ACTB) were measured to normalize the RNA levels of the target genes. Gene
expression was defined as “low” if the normalized expression levels were lower than 0.1.
Following manufacturer’s instructions, samples below the limit of detection (background plus
3 standard deviations of the background) had to be excluded from the analysis.
Statistical analysis was performed using the SAS Enterprise Guide 7.1 (SAS Institute Inc.,
Cary, North Carolina, USA). Differences between gene expression of original tissue samples
and cultivated cells at different passages were determined by using the t-test for paired
samples.
26
Ergebnisse
__________________________________________________________________________________
Table 3: List of genes and Accession Numbers used for the QuantiGene Plex Assay
Symbol
Accession Number
Analyzed genes
BRCA1
NM_001013416
BRCA2
NM_001006653
ESR1
NM_001286958
FOXO3
XM_003639400
GATA4
NM_001048112
GHR
NM_001003123
HER2
NM_001003217
HMGA1
NM_001003387
HMGA2
XM_005625590
HMGB1
NM_001002937
MAPK1
NM_001110800
MAPK3
NM_001252035
MCL1
NM_001003016
MYC
NM_001003246
PFDN5
NM_001251949
PGR
NM_001003074
PIK3CA
XM_545208
PRLR
XM_536502
PTEN
NM_001003192
TP53
NM_001003210
Housekeeping genes
ACTB
XM_536888
GAPDH
NM_001003142
HPRT1
NM_001003357
27
Ergebnisse
__________________________________________________________________________________
Results
Establishment of primary cultures and cell lines (Table 1 and 2)
Three of the non-neoplastic (CNT 1, 4, 6) and two neoplastic (CMT 8 and 9; derived from
malignant mammary tumors) cell cultures could not be cultivated beyond passage 20 and thus
were classified as “primary cultures”. Three non-neoplastic cell cultures (CNT 2, 3, 5) and
eight neoplastic cell cultures (CMT 1, 2, 3, 4 benign mammary tumors; CMT 5, 6, 7, 10
malignant mammary tumors) grew in culture beyond P.20 and were classified as “cell lines”,
respectively.
Gene expression
The genes BRCA1, BRCA2, GATA4 and HMGA2 showed low expressions (levels below 0.1)
in the measured tissue specimens as well as in samples of cultivated cells of primary cultures
and cell lines independent of neoplastic or non-neoplastic origin.
Comparison of original tissue and cultivated cells (Table 4)
Non-neoplastic
FOXO3, HMGB1, MCL1 and PRLR proved to be significantly higher expressed (p<0.05) in
the original tissue of non-neoplastic mammary tissue compared to P.0 of cultivated cells,
wheras MAPK1 and TP53 showed significantly lower expressions (p<0.05) in the original
tissue. No significant differences in the gene expressions of ESR1, GHR, HER2, HMGA1,
MAPK3, MYC, PFDN5, PIK3CA, PGR and PTEN were found between the original tissue and
P.0 of cultivated cells. Still, the gene expression differed significantly between the original
tissue and P.10 of cultivated cells in non-neoplastic tissue of ESR1 (p<0.05), HER2 (p<0.05),
HMGA1 (p<0.05), HMGB1 (p<0.01), MCL1 (p<0.05) and PRLR (p<0.05) with a significant
higher expression in the original tissue (Table 4).
Canine mammary tumors
Regarding the malignant mammary tumors, FOXO3 and HER2 showed significantly higher
expressions (p<0.05) in the original tissue samples, whereas MAPK1 (p<0.01) and TP53
(p<0.05) proved to be significantly lower expressed compared to P.0 of cultivated cells. No
significant differences were found in the gene expressions of ESR1, GHR, HMGA1, HMGB1,
28
Ergebnisse
__________________________________________________________________________________
MAPK3, MCL1, MYC, PFDN5, PIK3CA, PGR, PRLR and PTEN regarding the comparison
between original tissue and P.0 of cultivated cells. Comparing the corresponding tissue to the
later passages (P.10, P.20 or P.30) of cell culture, gene expressions of ESR1 (P.20, p<0.05),
FOXO3 (P.30, p<0.05) GHR (P.20, p<0.01), HER2 (P.10, p<0.05), MAPK1 (P.10, p<0.01;
P.20, p<0.01), MAPK3 (P.10, p<0.05; P.20, p<0.01) MCL1 (P.10, p<0.05; P.20, p<0.05),
PFDN5 (P.10, p<0.05; P.20, p<0.05; P.30, p<0.001) and TP53 (P.20, p<0.05) showed
significant differences.
Table 4: Comparison of original tissue with the passages of cultivated cells of non-neoplastic and
neoplastic origin
Gene
Non-neoplastic
T-P.0
ESR1
FOXO3
T-P.10
Neoplastic
T-P.20
T-P.30
T-P.0
T-P.10
*>
T-P.30
*>
*>
*>
*>
GHR
** >
HER2
*>
HMGA1
*>
HMGB1
*>
MAPK1
*<
*>
*>
** <
** <
** <
*<
** <
*>
*>
*<
*<
** >
MAPK3
MCL1
T-P.20
*>
*>
MYC
PFDN5
*** <
PIK3CA
PGR
PRLR
*>
*>
PTEN
TP53
*<
*<
*<
T=Original tissue; asterisk indicate significant differences (*=p<0.05, **=p<0.01, ***=p<0.001,
***=p<0.0001 with > significant differences with a higher expression in original tissue, < significant
differences with a lower expression in original tissue)
29
Ergebnisse
__________________________________________________________________________________
Gene expression levels
Of the non-neoplastic cultivated cells GHR, MAPK3, MYC, PFDN5, PIK3CA, PGR and
PTEN showed similar expression levels compared to the original tissue. GHR and PIK3CA
exhibited expression levels lower than 0.1 in all passages of cultivated cells. Gene expression
of MAPK3 was high in three cell lines (CNT 2, 3 and 5) and two primary cultures (CNT 4
and 6). Regarding gene expression of MYC and PGR, solely one cell line (CNT 5) exhibited
high expression levels (higher than 0.1). Gene expression of PTEN was high in two cell lines
(CNT 2 and 3) and one primary culture (CNT 6) and all non-neoplastic cell cultures exhibited
high expression of PFDN5 (see Additional file 1).
Statistical analyses revealed HMGA1, HMGB1, MYC, PIK3CA, PGR, PRLR and PTEN to
exhibit similar expression levels compared to the original tissue of neoplastic origin.
Regarding the gene expressions of PIK3CA, PGR and PRLR all cell cultures showed low
expression levels (lower than 0.1). In contrast, HMGB1 and PTEN exhibited high expression
levels in all the cell cultures of canine mammary tumors (Figs. 1 and 2). Gene expression of
HMGA1 was the high in one cell line (CMT 4). Regarding the gene expression of MYC, two
neoplastic cell lines (CMT 1 and 10) and one primary cultures (CMT 8) exhibited high
expression levels (see Additional file 2).
30
Ergebnisse
__________________________________________________________________________________
Fig.1 Normalized gene expression of PTEN
Expression levels of PTEN in the original tissue (T) of canine malignant mammary tumors and the
derived passages thereof of primary culture and cell lines
Fig.2 Normalized gene expression of HMGB1
Expression levels of HMGB1 in the original tissue (T) of canine malignant mammary tumors and the
derived passages thereof of primary culture and cell lines
31
Ergebnisse
__________________________________________________________________________________
Discussion
In the present study the expression of 20 tumor-associated genes (BRCA1, BRCA2, ESR1,
FOXO3, GATA4, GHR, HER2, HMGA1, HMGA2, HMGB1, MAPK1, MAPK3, MCL1, MYC,
PFDN5, PIK3CA, PGR, PRLR, PTEN, and TP53) associated with tumor development or
progression in human breast cancer [23-38] and some of them in canine mammary tumors
[13-15, 17, 18, 39, 40] were analyzed using a multiplex bDNA assay in neoplastic and nonneoplastic canine mammary tissue and thereof derived cultivated cells. The assay was applied
to detect possible similarities or changes between the corresponding original tissue and the
cultivated cells. Thereby, primary cultures (<P.20) or cell lines (>P.20) derived from canine
mammary tumors which mirror the original tissue and exhibit a stable expression of target
genes should be identified. To the best of our knowledge no studies have been performed
comparing the molecular profiles of these genes between canine mammary tissues and
derived cultivated cells thereof.
HMGA1, HMGB1, MYC and PTEN were the genes, which revealed stable expression levels
and no significant differences between cultivated cells of early or later passages compared to
the original tissue of canine mammary tumors. Especially PTEN and HMGB1 showed
auspicious results with all primary cultures and cell lines exhibiting high expression levels.
Seven cell lines and three primary cultures of canine mammary tumors could be identified
with a stable expression. Thus, they could represent possibilities for future studies targeting
these pathways. A study analyzing the status of PTEN in canine mammary tumors by
immunohistochemistry revealed it to be a useful prognostic marker; loss of PTEN at the
protein level was associated with tumor recurrence and shorter survival time [16]. Similar
results have been found in human breast cancer tissue samples [36, 41]. Thus, different
strategies have been developed to target PTEN-deficient tumors, mostly concentrating on the
PI3K-pathway [42]. Further approaches propose restoring PTEN to deficient tumors [43] or
upregulating PTEN RNA levels [44].
The HMGB1 protein is located in the nucleus and works as a regulator of transcription [45],
but it is also suggested that it plays a role in tumor metastasis [46, 47]. Anticancer therapy
comprises HMGB1 antagonists [48] or inhibitors [49] which result in lower proliferation and
migration rates of cancer cells. Similar to human cancer, HMGB1 is suspected to play a role
32
Ergebnisse
__________________________________________________________________________________
in canine tumor progression [50] and growth [51]. Due to the identical protein sequences of
the canine and human HMGB1, therapeutic approaches targeting HMGB1 in human cancer
cells could be of use for the treatment options in canine mammary tumors [52].
Furthermore, cell cultures derived from canine mammary tumors that express HMGA1 and
MYC have been identified in the present study. HMGA1 has been considered as a potential
target as well, as its silencing has influence on cell growth and morphology of highly
aggressive breast cancer cells [53]. Inhibition of HMGA1 in breast cancer cells already
showed promising results with a reduction in the tumorigenic and metastatic potential in the
treated cells [30]. Although MYC is deregulated in most cancer cells [54-56], there are
concerns regarding its credibility as an anticancer strategy [57]. Especially when MYC
function is blocked systemically, side effects on normal regenerating tissue are found [57].
Thus, further studies are needed to evaluate MYC as an appropriate therapeutic target. For
this, the two neoplastic cell lines and one neoplastic primary culture expressing MYC, as well
as the one neoplastic cell line expressing HMGA1 detected in the present study, could serve as
a suitable tool for assessing new treatment options in canine mammary tumors.
The utilized method (multiplex bDNA assay) herein has proven to be practical for analyzing
tissue specimens as well as for the longitudinal gene expression analysis of cell culture
samples due to its applicability for both origins of samples. In contrast to other methods for
gene expression analysis, such as quantitative real-time PCR, the bDNA assay does not
depend on a pre-amplification of the nucleic acid (which is a major source of gene-specific
measurement errors). The simple assay format with consequently decreasing pipetting errors
is a major advantage of the bDNA assay [58]. Moreover, the combination of bDNA assay and
xMAP® Luminex® magnetic beads enables analysis of multiple samples as well as target
genes of interest to be performed [21]. It thus, presents a method with high multiplexing
capacity when several genes needto be analyzed.
Conclusion
In conclusion, the majority of the analyzed genes in the present study were found to have
significant differences in expression when comparing the original tissue with either the first
passages or later passages of cultivated cells. This underlines the importance of determining
gene expression status of both cultivated cells and original tissue before specific studies are
33
Ergebnisse
__________________________________________________________________________________
carried out. Seven cell lines and three primary cultures of canine mammary tumors could be
identified with a stable expression of HMGB1 and PTEN. Furthermore, two neoplastic cell
lines and one neoplastic primary culture expressing MYC, as well as one neoplastic cell line
expressing HMGA1 were detected. Thus, those primary cultures and cell lines, which were
found to mirror their original tissue, present valuable tools for future studies evaluating
specific therapeutic approaches in mammary tumors.
List of Abbreviations
ACTB: Beta-actin; bDNA assay: Branched-DNA assay; BRCA1: BRCA1, DNA repair
associated; BRCA2: BRCA2, DNA repair associated; CMT: Canine mammary tumor; CNT:
Canine non-neoplastic tissue; ESR1: Estrogen receptor; FOXO3: Forkhead box O3; GAPDH:
Glyceraldehyde 3-phosphate dehydrogenase; GATA4: GATA binding protein 4; HER2: Erbb2 receptor tyrosine kinase 2; HMGA1: High mobility group AT-hook 1; HMGA2: High
mobility group AT-hook 2; HMGB1. High mobility group box 1; HPRT1: Hypoxanthine
phosphoribosyltransferase 1; MAPK1: Mitogen-activated protein kinase 1; MAPK3:
Mitogen-activated protein kinase 3; MCL1: Myeloid cell leukemia 1; MYC: V-myc avian
myelocytomatosis viral oncogene homolog; PFDN5: Prefoldin subunit 5; PGR: Progesterone
Receptor; PIK3CA: Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3-kinase catalytic subunit alpha;
PRLR: Prolactin Receptor; PTEN: Phosphatase and tensin homolog; PCR: polymerase chain
reaction; RNA: ribonucleic acid; TP53: Tumor protein p53
34
Ergebnisse
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Additional Files
Additional File 1: Table S1. Normalized gene expression in non-neoplastic cultivated cells.
CNT1
GHR
P.0
P.10
P.20
P.30
MAPK3 P.0
P.10
P.20
P.30
MYC
P.0
P.10
P.20
P.30
PFDN5 P.0
P.10
P.20
P.30
PIK3CA P.0
P.10
P.20
P.30
PGR
P.0
P.10
P.20
P.30
PTEN
P.0
P.10
P.20
P.30
CNT2
CNT3
CNT4
CNT5
CNT6
0.05771
0.01422
0.04810
0.07848
0.05647
0.08524
0.01400
0.07224
0.01503
0.03108
0.00242
0.10575
0.02302
0.00676
0.04479
0.00546
0.00266
0.13974
0.15542
0.10935
0.17141
0.42622
0.16311
0.08692
0.26180
0.14966
0.10083
0.54520
0.16176
0.18445
0.30090
0.68895
0.17978
0.85571
0.11722
0.08344
0.09083
0.22307
0.16545
0.17185
0.02246
0.14502
0.12095
0.03126
0.46906
0.08482
0.07219
0.13564
0.42458
0.06934
0.55694
0.38611
0.30132
0.27043
0.57663
0.45382
0.56725
0.13127
0.54874
0.39916
0.20170
0.48581
0.35484
0.30547
0.40666
0.70974
0.34813
0.68434
0.04063
0.02679
0.06590
0.06422
0.08102
0.07688
0.01746
0.06292
0.09010
0.03857
0.04479
0.04376
0.03806
0.06503
0.05422
0.04231
0.05497
0.20283
0.02434
0.09620
0.12194
0.13492
0.21591
0.05508
0.02492
0.12260
0.04667
0.19236
0.05105
0.01031
0.00955
0.22213
0.00352
0.13724
0.21428
0.18900
0.20215
0.28870
0.02034
0.28680
0.05377
0.26825
0.23142
0.09604
0.00175
0.17999
0.10834
0.18406
0.00107
0.15081
0.00109
The table shows the longitudinal gene expression of GHR, MAPK3, MYC PFDN5, PIK3CA, PGR and
PTEN in cell cultures of non-neoplastic origin. (xlsx)
35
Ergebnisse
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Additional File 2: Table S2. Normalized gene expression in neoplastic cultivated cells.
CMT1
HMGA1 P.0
P.10
P.20
P.30
HMGB1 P.0
P.10
P.20
P.30
MYC
P.0
P.10
P.20
P.30
PIK3CA P.0
P.10
P.20
P.30
PGR
P.0
P.10
P.20
P.30
PRLR P.0
P.10
P.20
P.30
PTEN P.0
P.10
P.20
P.30
0.129693
CMT2
CMT3
CMT4
CMT5
0.00824 0.005841
CMT6
CMT7
CMT8
CMT9
0.280995 0.006436 0.011042 0.007321 0.008659 0.013632
0.03266 0.066263 0.088634 0.019378
0.14925 0.014548 0.005461 0.013707 0.023552 0.031392 0.022639 0.077396
0.095939
0.08644 0.009665
0.00854
0.661216 0.583877 0.263231
0.842467
0.43645 0.684656
0.040205 0.021284
0.224773
0.896229
0.3152 0.670764 0.681245 0.458567 0.428916
0.26525 0.460174 0.396508
0.52647 0.557223 0.435969 0.498501
0.730407 0.574218 0.451181 0.559136 0.314212 0.503387 0.528834 0.465357
0.571701 0.742837 0.736819
0.224426 0.083352
CMT10
0.006984 0.230546 0.101975 0.032277 0.141235
0.2536
0.03607
0.517511 0.483063
0.083846 0.241845 0.110231
0.569795
0.94839
0.11972 0.067564
0.421751 0.074531 0.128678 0.044669 0.085848 0.072974 0.081938 0.203514 0.113378 0.167907
0.323698 0.101952 0.076512 0.094664 0.047787 0.098676 0.099031 0.186828
0.123781
0.260894 0.130449 0.094629 0.038959
0.197759
0.051376 0.031472 0.009124
0.118793 0.071537
0.027899 0.037549 0.032623
0.03747 0.030849
0.11792 0.104699 0.067767 0.094804 0.063646 0.032111 0.025347 0.018592 0.104747 0.020322
0.09847
0.07278 0.062434 0.076838 0.077824 0.055707 0.040222 0.030404
0.091865 0.051317 0.070382 0.082441
0.147694 0.004403 0.001194
0.102897 0.030459
0.028254
0.042481
0.002397 0.016297 0.025444 0.025314 0.046101
0.273574 0.019332 0.004614 0.008189 0.004884 0.005184 0.008883 0.001383 0.194138 0.009883
0.077601 0.026958 0.003788 0.011157 0.005834 0.017187 0.012044 0.002445
0.101581
0.044575 0.008692 0.002656 0.005355
0.190464
0.016129 0.014904
0.000757 0.000119 0.000512
0.0003 0.000672 0.000718 0.000692 0.000828
0.001381 0.000305 0.000264
0.00042 0.000385 0.000404 0.000459 0.000615 0.000504 0.010661
0.0017 0.000916 0.000758 0.000305 0.000621 0.000607 0.000149 0.000978
0.001779 0.000773
0.00059 0.000369
0.288528 0.241963 0.179814
0.00093 0.000373
0.189599
0.001177
0.000786
0.22328 0.176593 0.200046 0.188751
0.450627 0.203242 0.395658 0.158367 0.171104 0.192061 0.153691 0.142974 0.304994 0.182787
0.351986
0.19833 0.269622 0.188587 0.124928 0.193206 0.170256 0.198647
0.290579 0.205589 0.313545 0.186318
0.215565 0.149874
0.178103
0.286706
The table shows the longitudinal gene expression of HMGA1, HMGB1, MYC, PIK3CA, PGR, PRLR
and PTEN in cell cultures of non-neoplastic origin. (xlsx)
Declarations
Ethics approval and consent to participate
All herein utilized tissue samples were removed with consent of the owners. Therefore,
ethical approval was not necessary according to the german regulations. All experiments were
performed on cell lines and primary cultures and no animals were used.
Consent for publication
Not applicable.
36
Ergebnisse
__________________________________________________________________________________
Funding
The research was funded by the Hannoversche Gesellschaft zur Förderung der
Kleintiermedizin (HGFK).
This publication was supported by Deutsche Forschungsgemeinschaft and University of
Veterinary Medicine Hannover, Foundation within the funding program Open Access
Publishing.
Availability of data and materials
The data supporting the conclusions of this article is included within the article and its
additional files.
Competing interests
The authors declare that they have no competing interests.
Authors' contributions
IN and HME performed the primary study design, manuscript editing and final approval;
MHT checked and diagnosed all samples utilized herein; SW participated in the study design
and provided technical assistance; BB provided tumor samples and participated in the
manuscript editing; AM, FLR and SCH performed the experiments; AM analyzed the data
and wrote the manuscript. All authors read and approved the final manuscript.
Acknowledgments
The authors would like to thank Martin Beyerbach for his support with statistical analysis.
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Diskussion
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Obwohl Mammatumoren bei der Hündin eine große Bedeutung haben (DORN et al. 1968;
RICHARDS et al. 2001; EGENVALL et al. 2005; MERLO et al. 2008; VASCELLARI et al.
2016), ist unser Wissen über die Bedeutung der hormonellen Steuerung und die genetischen
Grundlagen im Vergleich zum Menschen (PAYNE et al. 2008; HAMMOND et al. 2010;
OLSSON et al. 2013; WOLFF et al. 2013) sehr begrenzt. Um die Tumorentwicklung zu
verstehen und auch, um differenzierte Therapien zu entwickeln, sind molekulargenetische
Untersuchungen notwendig. Bei der Differenzierung tumorassoziierter Gene wird gezielt nach
Markern für die Einschätzung der Prognose von Neoplasien gesucht. Um geeignete Gene
beim Hund zu identifizieren sind jedoch genügend viele, gut charakterisierte Tumorproben
notwendig. Deshalb wurden für die vorliegende Arbeit kryokonservierte und FFPE-Proben
aus den zurückliegenden Jahren zusammengefasst mit dem Ziel, die Aussagekraft der
Ergebnisse und die statistische Power zu erhöhen. Da die malignen Mammatumoren des
Hundes ein heterogenes histologisches Erscheinungsbild haben (GOLDSCHMIDT et al.
2011; RASOTTO et al. 2012), wurde eine detaillierte histopathologische Differenzierung
(GOLDSCHMIDT et al. 2011) der kryokonservierten und FFPE-Proben vorgenommen, um
anschließend einen Bezug zum Genexpressionsmuster zu erhalten.
FFPE-Proben stellen ein wertvolles Material dar, da sie routinemäßig im Rahmen der
histopathologischen Untersuchung von Gewebeproben gewonnen werden (LEWIS et al.
2001; RIBEIRO-SILVA et al. 2007; SCHWEIGER et al. 2009; WEBSTER et al. 2015).
Damit besteht auch die Möglichkeit, seltene Tumorsubtypen retrospektiv zu untersuchen
(PENLAND et al. 2007). Allerdings weisen FFPE-Proben häufig eine geringere RNAQuantität und -Qualität auf, welches durch die gegebenenfalls längere Lagerungsdauer und
die Formalinexposition begründet ist (YANG et al. 2006). Mit der vorliegenden Arbeit
konnten mittels des Multiplex Branched DNA Assays jedoch weitgehend vergleichbare
Ergebnisse in der Genexpression von kryokonservierten und FFPE-Proben nachgewiesen
werden. Lediglich 15 von 180 FFPE-Proben wiesen Werte auf, die unter der Nachweisgrenze,
und damit für die Analyse der Genexpression unbrauchbar waren. Dabei waren die
exkludierten Proben auch diejenigen, die die niedrigsten extrahierten RNA-Mengen
aufwiesen. Möglicherweise lag eine zu starke Degradation der RNA vor, um eine erfolgreiche
Analyse durchführen zu können. Da die Menge der isolierten RNA bei FFPE-Proben häufig
43
Diskussion
__________________________________________________________________________________
geringer ist und kryokonservierte Proben nur an wenigen Standorten mit Gewebebänken zur
Verfügung stehen (PENLAND et al. 2007; RIBEIRO-SILVA et al. 2007; CALLARI et al.
2014), ist der Multiplex Branched DNA Assay eine Methode, die nicht nur die gleichzeitige
Messung mehrerer Targets in einer Probe erlaubt (FLAGELLA et al. 2006), sondern auch den
Verbrauch von Probenmaterial minimiert. In der vorliegenden Arbeit reichte die Menge von
200ng RNA bei FFPE-Proben aus, um ein aussagekräftiges Ergebnis zu erreichen.
Um den
Hormoneinfluss
bei
Mammatumoren des
Hundes
auf
RNA-Ebene zu
charakterisieren, wurden die Tumorproben nach ihrer histologischen Diagnose gruppiert.
Zusätzlich wurde von den Karzinomen eine Einteilung in histopathologische Untergruppen
vorgenommen. Die Expression der Gene ESR1, PGR und PRLR war in der eigenen
Untersuchung in soliden und anaplastischen Karzinomen am niedrigsten. Beide Untergruppen
sind Tumorarten, welche häufig invasiv wachsen und ein hohes Maß an Metastasierung in
regionale Lymphknoten zeigen (RASOTTO et al. 2012; IM et al. 2014). Auch duktale
Karzinome wiesen im vorliegenden Tumormaterial eine auffällig geringe Expression von
ESR1, PGR und PRLR auf. Als bis jetzt selten untersuchte Untergruppe von malignen
Mammatumoren, wird das duktale Karzinom zumeist als malignes Pendant des duktalen
Adenoms bezeichnet (MISDORP et al. 1999), das durch eine geringe Tendenz in
lymphatische Gefäße einzubrechen, charakterisiert ist (RASOTTO et al. 2012; IM et al.
2014). Im Gegensatz dazu, zeigten erstaunlicherweise 45% (9/20) der duktalen Karzinome in
der vorliegenden Studie ein invasives Wachstum, was zumindest im Zusammenhang mit den
niedrigen Expressionslevel steht. Obwohl für das solide und anaplastische Karzinom bei der
Bestimmung von ESR1 und PGR auf der Proteinebene bereits ähnliche Ergebnisse wie in der
vorliegenden Arbeit festgestellt werden konnten (MAINENTI et al. 2014), wurde dies für
duktale Karzinome bis jetzt nicht berichtet. Weitere Untersuchungen an Mammatumoren des
Hundes sind daher notwendig, um den möglichen Zusammenhang zwischen der Untergruppe
des duktalen Karzinoms und dem Malignitätsgrad sowie der Expression von ESR1, PGR und
PRLR zu beleuchten.
Verglichen mit ESR1, PGR und PRLR konnte in der vorliegenden Studie für GHR kein
deutlicher Zusammenhang zwischen der assoziierten Prognose der histopathologischen
Untergruppen und der Genexpression gefunden werden. Lediglich maligne Tumoren mit
invasivem Wachstum zeigten eine deutlich niedrigere GHR-Expression als solche mit nicht
44
Diskussion
__________________________________________________________________________________
invasivem Wachstum. Soweit aus der zugänglichen Literatur bekannt, wurden bisher keine
Studien
über
die
GHR-Expression
in
detaillierten
Untergruppen
von
malignen
Mammatumoren des Hundes durchgeführt. Lediglich eine Studie konnte gleichermaßen eine
Herunterregulierung von GHR in weniger differenzierten
Karzinomen feststellen (VAN
GARDEREN et al. 1999). Während beim Menschen keine Korrelation zwischen einer
erhöhten GHR-Expression in Karzinomen der Brust und aggressivem Tumorverhalten
bestätigt werden konnte (GEBRE-MEDHIN et al. 2001), überrascht das Ergebnis und sollte
daher weiter verifiziert werden.
Bei der Analyse der Genexpression von Hormonrezeptoren im Mammagewebe sollte auch die
Auswirkung der Kastration berücksichtigt werden, da die Steroidhormonproduktion einen
Einfluss auf die Formation der Rezeptoren besitzt (SORENMO et al. 2000). In der
vorliegenden Studie handelte es sich bei 65% der von kastrierten Hündinnen analysierten
Proben um maligne Mammatumoren. Obwohl die Expressionslevel von ESR1 in malignen
Tumoren von kastrierten Hündinnen niedriger waren, konnte dies statistisch nicht abgesichert
werden. Ähnlich verhielt es sich für die Expression von PGR, wobei hier nur in FFPE-Proben,
aber nicht in kryokonservierten Proben niedrigere Level gefunden wurden. Als Ursache für
die fehlenden statistischen Signifikanzen ist die niedrige Probenzahl zu vermuten
(kryokonserviert n=16, FFPE n=13), zumal
in einer anderen Studie eine statistisch
signifikante Abnahme der Proteinmenge von Östrogen- und Progesteronrezeptoren in
malignen Mammatumoren von 30 kastrierten Hündinnen im Vergleich zu entsprechenden
Proben unkastrierter Hündinnen nachgewiesen werden konnte (MAINENTI et al. 2014).
Für bestimmte tumorassoziierte Gene, wie BRCA1 und BRCA2, ist bereits ein Zusammenhang
mit spezifischen Rassen (Englischer Springer Spaniel, Shih Tzu) bekannt (RIVERA et al.
2009; IM et al. 2013). Bezogen auf die Hormonrezeptorexpression konnte dagegen bei den in
der vorliegenden Studie am häufigsten vorkommenden Rassen (Dackel, Terrier, Cocker
Spaniel und Deutscher Schäferhund) keine Auffälligkeit festgestellt werden.
Neben der Suche nach prognostischen Markern für Mammatumoren des Hundes ist auch die
Untersuchung von potenziellen Genen für therapeutische Ansätze von Bedeutung. Dabei
orientiert sich die Forschung beim Hund zunächst an für den Menschen vielversprechenden
Targets. Zur orientierenden Evaluierung der Wirksamkeit von Therapeutika eignen sich aus
45
Diskussion
__________________________________________________________________________________
dem Organismus isolierte Zellen (SHARMA et al. 2010; DOKE u. DHAWALE 2015). In der
vorliegenden Arbeit wurde daher die Genexpression von in Kultur gebrachten Mammazellen
untersucht und die Ergebnisse mit denen des Herkunftsgewebes verglichen. Von den
evaluierten Genen (BRCA1, BRCA2, ESR1, FOXO3, GATA4, GHR, HER2, HMGA1,
HMGA2, HMGB1, MAPK1, MAPK3, MCL1, MYC, PFDN5, PGR, PIK3CA, PRLR, PTEN
und TP53) zeigte der Großteil auffällige Expressionsunterschiede in der Zellkultur im
Vergleich zum Ausgangsgewebe. Lediglich die Gene HMGA1, HMGB1, MYC und PTEN von
Zellen neoplastischer, sowie die Gene MAPK3, MYC, PFDN5, PGR und PTEN nichtneoplastischer Herkunft, wiesen weitgehend gleichbleibende Expressionslevel auf. Dabei
konnten Zellkulturen identifiziert werden, deren Genexpression auch über mehrere Passagen
stabil blieb und damit die Voraussetzung für die Evaluierung therapeutischer Ansätze
erfüllten. Erste Ansätze für eine danach ausgerichtete Tumortherapie beim Menschen
existieren bereits für HMGA1 (DI CELLO et al. 2013; SHAH et al. 2013), HMGB1
(ARUMUGAM et al. 2012; SMOLARCZYK et al. 2012) und PTEN (TERESI et al. 2006;
HOPKINS et al. 2013). Nun gilt es in einem weiteren Schritt zu prüfen, ob die Ansätze auch
für Mammatumoren des Hundes genutzt werden können.
Obwohl die Expression von PGR, PIK3CA und PRLR in isolierten neoplastischen Zellen in
der vorliegenden Arbeit ebenfalls derjenigen im Originalgewebe entsprach, waren lediglich
niedrige Expressionslevel sowohl unter Kultivierungsbedingungen als auch im Gewebe
feststellbar. Dessen ungeachtet könnten die Zellkulturen für weitergehende Versuche von
Bedeutung sein, um mögliche Therapieansätze für PGR-, PIK3CA- oder PRLR-negative
Tumoren zu untersuchen.
Gleichwohl Genexpressionsanalysen zahlreiche Vorteile bieten, stellt die IHC weiterhin die
klinisch validierte Methode zur Beurteilung von Hormonrezeptoren bei Brustkrebs der Frau
dar (HAMMOND et al. 2010). Durch die Erhaltung der Gewebemorphologie können
Hormonrezeptoren direkt dem zugehörigen Gewebe zugeordnet werden (KRAUS et al. 2012).
Dementsprechend müssen quantitative Genexpressionsanalysen mit der Standardmethode
verglichen und evaluiert werden. In Untersuchungen von Brustkrebs der Frau wurde bereits
ein hohes Maß an Übereinstimmung zwischen quantitativen Expressionsanalysen und IHC
nachgewiesen (BADVE et al. 2008; YIM et al. 2010; KRAUS et al. 2012). Zusätzlich müssen
Cut-Off-Werte festgelegt werden, die in Anlehnung an die IHC einen rezeptorpositiven bzw –
46
Diskussion
__________________________________________________________________________________
negativen Status beschreiben. Für ESR1, PGR und HER2 ist im Rahmen der Analyse von
Brustkrebs der Frau mit dem Branched DNA Assay eine solche Definition bereits erfolgt
(YIM et al. 2010). Für die gemessenen Hormonrezeptoren im Mammagewebe des Hundes
steht eine Evaluierung des Multiplex Branched DNA Assays noch aus. Dazu muss ein
Vergleich mit immunhistochemisch untersuchten Mammatumorproben durchgeführt und CutOff-Werte im direkten Vergleich unter Berücksichtigung der klinischen Daten erstellt werden.
Bei dem Vergleich der Genexpression in kryokonservierten und FFPE-Proben wäre eine
größere Aussagekraft erzielt worden, wenn zusätzlich kryokonservierte und FFPE-Proben
desselben Tumors verglichen worden wären. Trotz der hohen Übereinstimmung der
Genexpression zwischen den unterschiedlich gelagerten Proben in der vorliegenden Arbeit,
sind vom direkten Vergleich von zueinander passenden Proben verlässlichere Ergebnisse zu
erwarten. Diese Proben standen aber nicht zur Verfügung. Eine weitere Schwachstelle der
vorliegenden Studie ist, dass zwar die RNA-Quantität betrachtet wurde, nicht aber die
Qualität. Insbesondere für die 15 FFPE-Proben, die von der Analyse ausgeschlossen werden
mussten, wäre es von Interesse die RNA-Qualität zu bestimmen.
Für die Hormonrezeptoren ESR1, PGR und PRLR in Tumoren konnte eine Assoziation von
einer geringen Expression und einer schlechteren histopathologischen Prognose festgestellt
werden. Die Kenntnis des klinische Verlaufs und der Überlebenszeiten der Hündinnen wäre
hilfreich, um die mögliche Relevanz dieser Gene als prognostische Marker näher einschätzen
zu können.
Mit der in den unterschiedlichen Gruppen zur Verfügung stehenden Probenzahl für die
Analyse der Hormonrezeptor-Genexpression konnten im Vergleich „kastriert“/„nicht
kastriert“ sowie verschiedener Rassen kein signifikanter Unterschied herausgearbeitet werden.
Bezogen auf die Rassen lässt sich zwar nachvollziehen, welche Rassen häufig betroffen sind,
doch waren Rückschlüsse auf ein rassebedingtes Muster der Hormonrezeptor-Genexpression
nicht sicher möglich. Dazu müsste die Gruppengröße erweitert werden. Zusätzlich wäre es für
die Diskussion zum Einfluss der Kastration (SCHNEIDER et al. 1969; SORENMO et al.
2000; BEAUVAIS et al. 2012) wichtig das Alter zum Zeitpunkt der Ovariektomie, sowie bei
den unkastrierten Hündinnen den Zyklusstand und gegebenenfalls vorausgegangene
47
Diskussion
__________________________________________________________________________________
Hormontherapien in die Auswertung einzubeziehen. Diese Informationen standen für die
vorliegende retrospektive Arbeit nicht zur Verfügung.
Bezüglich der Analyse der Zellkulturen war es aufgrund der variierenden Tumorgröße nicht
möglich, für jede Primärkultur/Zelllinie zum Vergleich ein zugehöriges Gewebestück
bereitzustellen. Das Hauptziel bei einem kleinen Tumor war es, möglichst viele Zellen zu
isolieren, um das beste Kultivierungsergebnis zu erreichen. Allerdings konnten nicht von
allen Passagen Zellpellets generiert werden, da die Zellkulturen unterschiedliches Wachstum
zeigten. Die Verfügbarkeit von Originalgewebe von jeder Probe und Zellpellets von allen
Zellkulturen zu jedem Messzeitpunkt hätten eine höhere statistische Power ergeben.
Schlussfolgerung: Der Multiplex Branched DNA Assay ist zur Messung der Genexpression
von Hormonrezeptoren in kaninem Mammagewebe des Hundes geeignet. Sowohl in FFPEProben als auch in kryokonservierten Proben lieferte die Genexpression quantifizierbare
Ergebnisse. Für ein Screening im Rahmen epidemiologischer Fragestellungen können deshalb
auch FFPE-Proben genutzt werden. Für individuelle Genexpressions-Studien sollte aber,
wenn möglich, auf kryokonservierte Proben zurückgegriffen werden.
Die Vorteile des Multiplex Branched DNA Assays liegen insbesondere in der Messung von
bis zu 100 Targets in einer Probe, aber auch in der Möglichkeit mit wenig Probenmaterial
verlässliche Ergebnisse zu erzielen. Somit könnte es in der Zukunft möglich sein, bei einem
zeitlichen Aufwand von 2 Tagen ein individuelles molekularbiologisches Screening von
Hündinnen mit Mammatumoren durchzuführen. Dadurch könnte die Expression von
prognostisch oder therapeutisch relevanten Genen gemessen werden, um für die Hündin den
bestmöglichen Therapieplan zu erstellen.
In der vorliegenden Arbeit konnte mittels Genexpressionsanalyse Unterschiede der
Hormonrezeptoren
innerhalb
der
histopathologischen
Untergruppen
von
malignen
Mammatumoren des Hundes aufgezeigt werden. Insbesondere ESR1, PGR und PRLR waren
in Tumoren, die mit einer schlechten histopathologischen Prognose assoziiert sind, am
geringsten exprimiert. Dementsprechend können diese Gene als mögliche prognostische
Marker in Betracht gezogen werden. Entsprechend sollte in zukünftigen Studien die
differenzierte Expression der histopathologischen Subtypen einbezogen werden. Maligne
Mammatumoren zeigen nicht nur histologisch, sondern auch in der Expression von
48
Diskussion
__________________________________________________________________________________
Hormonrezeptoren eine auffällige Heterogenität. Dies könnte, ähnlich wie bei Subtypen des
Brustkrebses des Menschen, auch für andere Gene gelten und würde eine differenzierte
Charakterisierung von Untergruppen des Hundes erlauben. Die molekularbiologische
Charakterisierung kann bei Entdeckung möglicher prognostischer oder therapeutischer
Marker ein weiterer wichtiger Schritt für ein besseres Verständnis der Entstehung und
Progression von Mammatumoren bei der Hündin sein.
Zur Evaluierung verschiedener Therapieansätze auf molekularer Ebene können auch die in
der vorliegenden Arbeit untersuchten Zellkulturen helfen. Über die Betrachtung der
Genexpression in den Zellkulturen und ihren zugehörigen Originalgeweben konnte eine
vergleichbare Expression der Gene HMGA1, HMGB1, MYC und PTEN nachgewiesen
werden. Für drei der vier identifizierten Targetgene stehen für den Menschen schon erste
Ansätze einer gezielten Tumortherapie zur Verfügung, welche in einem nächsten Schritt
mithilfe der hier identifizierten Zellkulturen in Bezug auf die Anwendbarkeit bei
Mammatumoren des Hundes in vitro überprüft werden sollten.
49
Zusammenfassung
__________________________________________________________________________________
6. Zusammenfassung
Annika Esther Mohr
Multiplex
Branched
DNA
Assay
zur
Untersuchung
der
Genexpression
von
Hormonrezeptoren kaniner Mammatumoren und tumorassoziierter Gene in der Zellkultur
Trotz der großen Bedeutung von Mammatumoren beim Hund, liegen bisher kaum
Genexpressionsanalysen von Hormonrezeptoren für verschiedene Subtypen vor. Zur Prüfung
therapeutischer Ansätze in vitro fehlt zudem eine Differenzierung tumorrelevanter Targetgene
in geeigneten kaninen Mammatumorzelllinien.
Um Tumoren der Mamma weitergehend zu charakterisieren, sind molekulargenetische
Methoden notwendig. Bevor solche Genanalysen durchgeführt werden, ist eine differenzierte
histologische Diagnostik erforderlich. Für die verschiedenen Subtypen beim Hund sind
jedoch oft nicht genügend Fälle vorhanden. Um die Fallzahl zu erhöhen, ist die Verwendung
von Archivmaterial, wie beispielsweise FFPE-Proben, notwendig. Da deren Lagerung zur
Degradierung von DNA und RNA führt, musste zunächst in der vorliegenden Arbeit ein
Vergleich zu kryokonservierten Proben durchgeführt werden, um die Anwendbarkeit der
molekularbiologischen Technik für FFPE-Proben, einschätzen zu können. Mit dem
angewendeten Multiplex Branched DNA Assay können auch sehr kleine RNA-Fragmente in
sehr geringen Mengen analysiert werden. Für die Gene der Hormonrezeptoren (ESR1, PGR,
PRLR und GHR) aus Mammagewebe des Hundes verschiedener Entitäten wurde daher ein
Vergleich von Proben aus kryokonserviertem und FFPE-Material mit dieser Technik
durchgeführt.
Daraus
ergab
sich
eine
hohe
Übereinstimmung
hinsichtlich
des
Expressionslevels. Nur bei einer geringen Zahl der FFPE-Proben (15 von 180) lag die
Genexpression unter der Nachweisgrenze.
Die Expressionsmuster der Hormonrezeptoren waren abhängig von der Dignität des
Tumorgewebes. Es bestanden deutliche Unterschiede zwischen malignem, benignem und
nicht-neoplastischem Gewebe, welche sich auch statistisch absichern ließen. In den
Untergruppen der malignen Tumoren war außerdem die Expression von ESR1, PGR und
PRLR mit der pathohistologischen Prognose assoziiert, was die Hoffnung weckt, dass sie auch
als Prognosemarker geeignet sind. Kastrierte Hündinnen zeigten zwar niedrigere
50
Zusammenfassung
__________________________________________________________________________________
Expressionslevel von ESR1 und PGR in malignen Mammatumoren, doch war der Unterschied
zu Tumoren unkastrierter Hündinnen nicht statistisch signifikant. Dies kann auf die relativ
kleine Probenanzahl in der
Gruppe der kastrierten Hündinnen (kryokonservierte Proben
n=16, FFPE-Proben n=13) zurückzuführen sein. Bezüglich der am häufigsten untersuchten
Rassen lagen keine Unterschiede in der Hormonrezeptorexpression vor.
Zellkulturen von Mammatumoren des Hundes, die als Medium für orientierende Studien
verschiedener Substanzen in vitro genutzt werden können, gibt es nur wenige. Für die
entsprechende Etablierung von Zelllinien wurde geprüft, ob die Expression potenzieller
Targetgene aus dem Originalgewebe nach mehreren Passagen in der Zellkultur erhalten
bleibt. Dazu wurden verschiedene tumorassoziierte Gene (BRCA1, BRCA2, FOXO3, GATA4,
HER2, HMGA1, HMGA2, HMGB1, MAPK1, MAPK3, MCL1, MYC, PFDN5, PIK3CA, PTEN
und TP53) und die Gene der Hormonrezeptoren ESR1, PGR, PRLR und GHR untersucht. Es
wurden
10
Zellkulturen
von
neoplastischen
und
von
6
nicht-neoplastischen
Mammagewebeproben hergestellt und die Genexpression mit derjenigen im Herkunftsgewebe
verglichen. Eine Vielzahl der untersuchten Gene veränderte das Expressionsniveau im
Verlauf von 30 Passagen im Vergleich zum Ausgangswert. Eine gleichbleibende und stabile
Expression über mehrere Passagen zeigten die Gene HMGA1, HMGB1, MYC und PTEN in
Proben neoplastischer und die Gene MAPK3, MYC, PFDN5, PGR und PTEN in Proben nichtneoplastischer Herkunft. Diese können folglich für weitergehende Therapiestudien geprüft
werden.
Der Multiplex Branched DNA Assay war sowohl für die Expressionsanalyse aus
unterschiedlich gelagertem Gewebe, als auch aus kultivierten Zellen geeignet. Für die FFPEProben liegt der entscheidende Vorteil darin, RNA geringer Quantität ausreichend sicher zu
analysieren. Zudem können mit dem Assay bis zu 100 Gene aus einer Probe gleichzeitig
gemessen werden. Dies wurde in der vorliegenden Arbeit insbesondere für die longitudinale
Charakterisierung von 20 Genen in der Zellkultur genutzt.
51
Summary
__________________________________________________________________________________
7. Summary
Annika Esther Mohr
Gene expression analyses of hormone receptors in canine mammary tumors and of tumorassociated genes in cell culture by a multiplex branched DNA assay
Despite the importance of mammary tumors in the female dog, only few studies have been
performed analyzing hormone receptor gene expression in histological subtypes. Moreover,
for the examination of therapeutic approaches in vitro, a differentiation of tumor-associated
target genes in suitable neoplastic mammary cell lines of the dog is missing.
Molecular genetic methods are necessary to further characterize canine mammary tumors.
Still, a differentiated histological classification is essential before gen analysis is carried out.
As some of the histological subtypes of canine mammary tumors are less frequent than others,
it can be challenging to achieve a sufficient number of samples. Therefore, archived material,
as for example FFPE specimens, is a valuable source to enlarge the sample size. Because the
storage of FFPE samples leads to RNA and DNA degradation, the first step in the present
work was to perform a comparison to fresh frozen specimens to evaluate the reliability of the
utilized multiplex branched DNA assay for FFPE samples. The referred technique offers the
possibility to analyze not only short fragmented RNA, but also low amounts of RNA.
Therefore, gene expression of hormone receptors was compared between fresh frozen and
FFPE specimens in different entities of canine mammary tissue. The comparison revealed
widely comparable expression levels. Only a low amount of FFPE samples (15 of 180) had to
be excluded from the analysis due to values below the limit of detection.
The expression pattern of the hormone receptors was associated with the diagnosis of the
samples. A marked difference was found between malignant, benign and non-neoplastic
tissue which was statistically significant. Regarding the subtypes of mammary carcinomas,
gen expressions of ESR1, PGR and PRLR were associated with the histopathological
prognosis. This finding raises hope, if the referred genes could be of interest for future
prognostic markers in canine mammary tumors. Neutered dogs showed lower expression
levels of ESR1 and PGR in malignant mammary tumors, although no statistically significant
differences could be found in comparison to tumors of intact dogs. This might be due to the
52
Summary
__________________________________________________________________________________
small sample number (fresh frozen samples n=16, FFPE samples n=13). Regarding the most
common breeds, no alterations of hormone receptor gene expression could be demonstrated.
There are still few cell cultures of canine mammary tumors, which serve as models for
orientating studies evaluating therapeutic substances in vitro. In the present study, gene
expressions of potential target genes were analyzed in cell cultures to check if the expression
levels in the original tissue are preserved in cultivated cells over several passages. 16 tumorassociated genes (BRCA1, BRCA2, FOXO3, GATA4, HER2, HMGA1, HMGA2, HMGB1,
MAPK1, MAPK3, MCL1, MYC, PFDN5, PIK3CA, PTEN and TP53) and the hormone
receptors ESR1, PGR, PRLR and GHR were analyzed. Ten neoplastic and 6 non-neoplastic
mammary cell cultures were established and the gene expression levels were compared to the
original tissue. Most of the analyzed genes showed alterations regarding their expression
levels in cell culture compared to the starting value. In contrast to that, comparable and stable
expressions in both original tissue and cultivated cells was found for HMGA1, HMGB1, MYC
and PTEN in neoplastic and for MAPK3, MYC, PFDN5, PGR und PTEN in non-neoplastic
cells which could be of usage for further therapeutic studies
The multiplex branched DNA assay revealed to be feasible for the gene expression analysis of
different stored tissues, as well as out of cultivated cells. The assay permits to perform
analyses with low amounts of RNA which is advantageous for the analysis of FFPE
specimens. In addition, up to 100 genes can be examined within a single sample, a fact which
was particularly important in the present study for the longitudinal characterization of 20
genes in cultivated cells.
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9. Abkürzungsverzeichnis
ACTB
Beta-actin
BRCA1
BRCA1, DNA repair associated
BRCA2
BRCA2, DNA repair associated
DNA
Desoxyribonukleinsäure (deoxyribonucleic
acid)
ESR1
Östrogenrezeptor (Estrogen receptor 1)
FFPE
Formalin-fixiert, paraffin-eingebettet
FOXO3
Forkhead box O3
GAPDH
Glycerinaldehyd-3-phosphat-Dehydrogenase
GATA4
GATA binding protein 4
GHR
Somatotropinrezeptor (Growth hormone
receptor)
HER2
humaner epidermaler Wachstumsfaktor 2
(human epidermal growth factor receptor 2)
HMGA1
High mobility group AT-hook 1
HMGA2
High mobility group AT-hook 2
HMGB1
High mobility group box 1
HPRT1
Hypoxanthin-Phosphoribosyl-Transferase 1
IHC
Immunhistochemie
MAPK1
Mitogen-activated protein kinase 1
79
MAPK3
Mitogen-activated protein kinase 3
MCL1
Myeloid cell leukemia 1
MYC
V-myc avian myelocytomatosis viral oncogene
homolog
PFDN5
Prefoldin subunit 5
PIK3CA
Phosphatidylinositol-4,5-bisphosphate 3kinase catalytic subunit alpha
PGR
Progesteronrezeptor
PRLR
Prolaktinrezeptor
PTEN
Phosphatase and tensin homolog
qPCR
quantitative PCR
RNA
Ribonukleinsäure (Ribonucleic acid)
TP53
Tumor protein p53
80
10. Danksagung
Zuallererst möchte ich meinem Doktorvater Prof. Dr. Ingo Nolte danken für die Bereitstellung
des Themas, aber auch für seine Unterstützung während der Doktorarbeit und die
umfangreiche Betreuung.
Ein weiterer Dank gilt Herrn PD Dr. Hugo Murua Escobar für die wissenschaftliche
Betreuung insbesondere des molekularbiologischen Anteils der Arbeit.
Zusätzlich möchte ich meiner Arbeitsgruppe danken für die gemeinsamen Stunden im Labor,
aber auch mal bei Kaffee und Kuchen. Ohne euch hätte die Doktorarbeit viel weniger Spaß
gemacht!
Ein ganz besonderer Dank geht an die allerallerbeste Arbeitskollegin und Freundin Florenza
ohne die die zahlreichen Zellkultur- und Laborstunden nur halb so lustig gewesen wären.
Danke für dein offenes Ohr, deine vielen „historys“ und deine immerwährende Unterstützung,
wenn es um alle möglichen Fragen, oder aber Korrekturen auf Englisch ging, as well.
Danke auch an meine allerliebsten Bürokollegen, Heike, Camila, Eva und quasi auch Leona
und José. Mit euch hat das Arbeiten immer viel mehr Spaß gemacht und die kleinen
Kaffeepausen haben immer einen neuen Energieschub geliefert. Ihr habt es immer geschafft
mir den Tag zu versüßen.
Mein größter Dank geht an meine Eltern, meine Schwester, an meinen Freund und an Martha.
Danke, Danke, Danke für eure Unterstützung sowohl während des Studiums, als auch
während meiner Doktorarbeit. Schön, dass es euch gibt!
81
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