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Neue Therapiemöglichkeiten der chronischen Transplantatnephropathie Untersuchungen an Tiermodellen der chronischen Niereninsuffizienz in der Ratte Den naturwissenschaftlichen Fakultäten der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg zur Erlangung des Doktorgrades Dr. rer. nat. vorgelegt von Regina Vogelbacher aus Erlangen Als Dissertation genehmigt von der Naturwissenschaftlichen Fakultäten der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg. Tag der mündlichen Prüfung: 21. Juni 2010 Vorsitzender der Promotionskommission: Prof. Dr. Eberhard Bänsch Erstberichterstatter: Prof. Dr. Thomas Winkler Zweitberichterstatterin: Prof. Dr. Kerstin Amann Man muß das Leben nicht verstehen, dann wird es werden wie ein Fest. R M Rilke Kurzfassung Die chronische Transplantatnephropathie ist die Hauptursache für den Verlust einer transplantierten Niere und führt von einer Funktionsverschlechterung bis hin zur Niereninsuffizienz, so dass das mittlere Transplantatüberleben 10-15 Jahre beträgt. Die derzeitige immunsuppressive Therapie nach einer Nierentransplantation basiert meist auf Calcineurin-Inhibitoren, wie Ciclosporin A oder Tacrolimus. Speziell die Calcineurin-Inhibitoren wirken nephrotoxisch und pro-fibrotisch und fördern den Prozess der Transplantatnephropathie. An der Entstehung einer Transplantatnephropathie sind sowohl nicht-immunologische als auch immunologische Faktoren beteiligt. Um das Transplantatüberleben zu verbessern, ist es dringend notwendig andere Medikamente auf ihre Wirksamkeit bezüglich einer effektiven Therapie zur Verhinderung einer chronischen Transplantatnephropathie zu testen. In der vorliegenden Arbeit wurde zum einen der Einfluss von Everolimus, einem mTOR-Inhibitor, auf die Vernarbung des Nierengewebes in einem nichtimmunologisch bedingten chronisch progressiven Nephronenverlust-Modell, der 5/6 Nephrektomie der Ratte, untersucht. Everolimus wirkt anti-fibrotisch, antiproliferativ und anti-angiogenetisch. Im 5/6 Nephrektomiemodell der Ratte kommt es als Folge eines glomerulären Schadens zu einer Vernarbungsreaktion, der Endothel, Mesangium und Podozyten gleichermaßen betrifft. Eine mTORInhibition in der Anfangsphase (ab Tag 3) nach Modellinduktion führt zu einer verzögerten Reparatur des glomerulären Schadens und zu vermehrter Defektheilung des Gewebes mit Glomerulosklerose und interstitieller Fibrose. Es kam außerdem zu einer Steigerung der Proteinurie und einer Verschlechterung der Nierenfunktion. Im zweiten Teil der Arbeit wurde der Einfluss des mTOR-Inhibitors Sirolimus und des Proteasomen-Inhibitors Bortezomib, allein und in Kombination, auf die immunologische Abstoßungsreaktion nach Nierentransplantation im FischerLewis-Modell der Ratte untersucht. Hierbei konzentrierten wir uns auf die Beeinflussung der chronisch-humoralen Abstossungsreaktion, die durch die Entstehung von Antikörpern gegen Epitope der Spenderniere gekennzeichnet ist. Durch Depletion der Antikörper-produzierenden Plasmazellen in der Milz und im Knochenmark konnten Sirolimus und Bortezomib die weitere Abstoßungsreaktion vermindern. Die behandelten Tiere zeigten zusätzlich histologische Verbesserungen bezüglich der glomerulären, tubulointerstitiellen und vaskulären Strukturen der Niere. Neben den Plasmazellen wurden auch andere Zellen des Immunsystems wie zytotoxische T-Zellen, T-Helferzellen, Makrophagen, Monozyten und B-Zellen durch Sirolimus und Bortezomib moduliert und die Immunantwort abgeschwächt. In dieser Arbeit konnten wir somit zeigen, dass sich der Einsatz des mTORInhibitors Everolimus in einem komplexen glomerulären Schaden negativ auf den Heilungsprozess auswirken und zu einer Verschlechterung der Funktion führen kann. Die Wirkungsweise von Everolimus scheint ganz entscheidend von der Schwere der Schädigung, der Medikamentendosis und dem Behandlungszeitpunkt abhängig zu sein. In der Situation der Antikörper-vermittelten Abstoßungsreaktion können der mTOR-Inhibitor Sirolimus oder der Proteasomen-Inhibitor Bortezomib, sowohl in Kombination als auch einzeln, immunmodulierend wirken und durch Depletion der Plasmazellen vermindern. die chronisch-humorale und zelluläre Abstoßungsreaktion Summary The chronic allograft nephropathy is the leading cause for graft loss after kidney transplantation and causes a progressive decline in renal function leading to end stage renal disease mostly within 10-15 years. The current immunosuppressive therapy after kidney transplantation is based on calcineurin inhibitors like cyclosporine A or tacrolimus. These drugs are nephrotoxic and profibrotic, and hereby stimulate the process resulting in chronic allograft nephropathy. To improve graft survival after kidney transplantation, it is absolutely necessary to test additional drugs regarding their effectiveness in preventing or inhibiting chronic allograft nephropathy. In this work the effects of the mTOR-inhibitor everolimus was investigated in the non-immunological chronic progressive nephron loss model of 5/6 nephrectomy in the rat. In general everolimus has anti-fibrotic, anti-proliferative and antiangiogenetic actions. In the 5/6 nephrectomy model of the rat glomerular injury affects endothelial, mesangial cells and podocytes similarly. An mTOR-inhibition (after day 3) in the initial stage after model induction led to a delayed healing reaction of the glomerular damage and to an increase in glomerulosclerosis and interstitial fibrosis. Furthermore a raise in proteinuria and a decline in kidney function also occurred. In the second chapter of this work we investigated the influence of the mTORinhibitor sirolimus and the proteasome inhibitor bortezomib, alone or in combination, regarding the immunological rejection after kidney transplantation in the fischer-lewis transplantation model in the rat. Hereby, we focused on the chronic-humoral aspect of this chronic allograft model, where antibodies against epitopes of the donor kidney are produced. Sirolimus and bortezomib caused depletion of antibody-producing plasma cells in spleens and bone marrows ameliorating the chronic-humoral rejection. The treated animals showed histological improvements of glomerular, tubulointerstitial and vascular structures of the kidney. In addition to the plasma cells, other cell types of the immune system like cytotoxic T cells, T helper cells, macrophages, monocytes and B cells were also decreased by sirolimus and bortezomib demonstrating their activity against the humoral and cellular immunological response. Therefore, we demonstrate that treatment with everolimus in the situation of a complex glomerular injury can negatively influence the healing process and can lead to a decline in renal function. The effectiveness of everolimus depends on the severity of injury, the drug doses and the right time of treatment. In the situation of a chronic humoral or mixed rejection situation, sirolimus and bortezomib are potent inhibitors of an ongoing chronic rejection mainly via depletion of plasma cells and other immune cells. Inhaltverzeichnis Inhaltverzeichnis Seite Kurzfassung...................................................................................................... 4 Summary ........................................................................................................... 6 Inhaltverzeichnis .............................................................................................. 8 Abbildungsverzeichnis .................................................................................. 11 Tabellenverzeichnis ....................................................................................... 12 Abkürzungsverzeichnis ................................................................................. 13 1 Einleitung .............................................................................................. 16 1.1 Die chronische Transplantatnephropathie .............................................. 16 1.2 Tiermodelle ............................................................................................ 21 1.2.1 Das 5/6 Nephrektomiemodell ................................................................. 21 1.2.2 Das Fischer-Lewis Transplantationsmodell ............................................ 23 1.3 Mögliche Therapeutika zur Behandlung der CAN .................................. 24 1.3.1 mTOR-Inhibition durch Sirolimus und Everolimus .................................. 25 1.3.2 Proteasomen-Inhibition durch Bortezomib ............................................. 29 2 Aufgabenstellung ................................................................................. 32 3 Ergebnisse ............................................................................................ 34 3.1 Eine Therapie mit Everolimus kann den progessiven Nephronenverlust im 5/6 Nephrektomiemodell verstärken ................................................. 34 Allgemeiner Verlauf des Modells ............................................................ 34 Die Behandlung mit Everolimus führt zu vermehrter Glomerulosklerose, interstitieller Fibrose und Proteinurie, und verschlechtert die Nierenfunktion ohne den Blutdruck zu beeinflussen .............................. 35 Histologische Veränderungen des 5/6 Nephrektomiemodells ................ 38 Everolimus fördert die fehlerhafte Ausheilung der glomerulären Läsionen durch die Inhibierung der Proliferation ohne die Apoptoserate zu beeinflussen ...................................................................................... 40 Everolimus beeinflusst die Ausheilung des glomerulären Schadens durch seine anti-proliferative Wirkung auf Endothel und Mesangium ..... 43 Everolimus führt zu einer Reduktion der glomerulären Matrixausdehnung .................................................................................. 46 Everolimus steigert die Anzahl an glomerulären Thromben während es VEGF mRNA und Proteinexpression reduziert ...................................... 48 3.1.1 3.1.2 3.1.3 3.1.4 3.1.5 3.1.6 3.1.7 Regina Vogelbacher Seite 8 von 126 Inhaltverzeichnis 3.2 3.2.1 3.2.2 3.2.3 3.2.4 3.2.5 3.2.6 3.2.7 3.2.8 Können Sirolimus und Bortezomib die humorale Immunantwort im F344-LEW Transplantationsmodell inhibieren? ...................................... 50 Allgemeiner Verlauf des Versuchs ......................................................... 50 Im F344-LEW Transplantationsmodell kommt es zu einer humoralen Abstoßungsreaktion ............................................................................... 52 Eine Behandlung mit Sirolimus oder Bortezomib vermindert den Transplantatschaden .............................................................................. 56 Sirolimus und Bortezomib beeinflussen die Funktionalität des Transplantats ......................................................................................... 58 Sirolimus und Bortezomib vermindern den Einstrom an Entzündungszellen in das Transplantat.................................................. 60 Sirolimus und Bortezomib beeinflussen die Proliferation v.a. der Zellen des Interstitiums ..................................................................................... 62 Sirolimus und Bortezomib reduzieren die humorale Immunantwort durch Depletion der B-Zellen und Plasmazellen im Knochenmark................... 63 Sirolimus und Bortezomib reduzieren die Anzahl von B- und T-Zellen sowie IgG-sezernierenden Zellen in der Milz ......................................... 65 4 Diskussion ............................................................................................ 68 4.1 Derzeitige Probleme einer Behandlung der CAN ................................... 68 4.2 Ist der mTOR-Inhibitor Everolimus ein geeignetes Therapeutikum beim chronischen Nephronenverlust? ............................................................. 71 4.2.1 Everolimus fördert den kontinuierlichen Nephronenverlust im 5/6 Nephrektomiemodell .............................................................................. 71 4.2.2 Die Art des glomerulären Schadens bestimmt die Effektivität einer mTOR-Inhibition ..................................................................................... 73 4.3 mTOR- und Proteasomen-Inhibition wirken sich positiv auf die humorale Abstoßung nach Transplantation aus ..................................................... 77 4.3.1 Der Einfluss von Sirolimus auf die humorale Abstoßungsreaktion ......... 78 4.3.2 Der Einfluss von Bortezomib auf die humorale Abstoßung .................... 79 4.3.3 Additiver oder synergistischer Effekt von Sirolimus und Bortezomib? .... 81 5 Material und Methoden ........................................................................ 83 5.1 5.1.1 5.1.2 5.1.3 Tierversuche .......................................................................................... 83 Versuchstiere ......................................................................................... 83 Experimentelles Design des 5/6 Nephrektomiemodells ......................... 83 Experimentelles Design des Sirolimus Bortezomib Transplantations Projektes ................................................................................................ 84 5.2 5.2.1 5.2.2 5.2.3 Nierentransplantation an der Ratte......................................................... 85 Allgemeine Vorgehensweise .................................................................. 85 Explantation ........................................................................................... 86 Implantation............................................................................................ 87 5.3 Gewinnung und Analyse von Probenmaterial ........................................ 89 5.3.1 24 h Sammelurin .................................................................................... 89 Regina Vogelbacher Seite 9 von 126 Inhaltverzeichnis 5.3.2 5.3.3 5.3.4 5.3.5 5.3.6 Serumgewinnung ................................................................................... 89 Proteinbestimmung im Urin .................................................................... 89 Bestimmung von Serum- und Urinkreatinin und Serumharnstoff ........... 90 Ermittlung der Kreatinin-Clearance ........................................................ 90 Isolierung der Glomeruli ......................................................................... 90 5.4 5.4.1 5.4.2 5.4.3 Aufbereitung der Gewebe für die Immunhistochemie............................. 90 Prozessieren der Biopsien ..................................................................... 90 Anfertigung der Paraffinschnitte ............................................................. 93 Anfertigen der Schnitte aus Gefriergewebe............................................ 93 5.5 5.5.1 5.5.2 5.5.3 5.5.4 5.5.5 5.5.6 5.5.7 5.5.8 Immunhistologische Färbungen ............................................................. 93 Immunperoxidasefärbung an MC-, PFA- und ZN-fixiertem Gewebe ...... 93 Immunfluoreszenzfärbung ...................................................................... 94 Perjodsäure-Schiff-Färbung (PAS) ......................................................... 95 Säurefuchsin-Orange-G- Färbung (SFOG) ............................................ 95 TUNEL-Färbung (TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling) ............ 97 Silberfärbung .......................................................................................... 98 Antikörper ............................................................................................... 99 Mikroskopische Auswertungen ............................................................. 100 5.6 5.6.1 5.6.2 5.6.3 Real-Time PCR .................................................................................... 103 RNA-Isolierung ..................................................................................... 103 Herstellung der cDNA........................................................................... 103 Real-Time PCR .................................................................................... 103 5.7 ELISA ................................................................................................... 104 5.7.1 GBM-Isolierung .................................................................................... 104 5.7.2 GBM-ELISA.......................................................................................... 105 5.8 ELISpot ................................................................................................ 106 5.8.1 Gewinnung von Zellen aus Knochenmark und Milz ............................. 107 5.8.2 Nachweis von IgG-sezernierenden Zellen in Knochenmark und Milz mittels ELISpot ..................................................................................... 107 5.9 Durchflusszytometrische Analyse (FACS)............................................ 108 5.10 Statistische Auswertung ....................................................................... 108 5.11 Material ................................................................................................ 110 5.11.1 Chemikalien ......................................................................................... 110 5.11.2 Geräte .................................................................................................. 111 5.11.3 Verbrauchsmaterial .............................................................................. 111 5.11.4 Lösungen ............................................................................................. 112 6 Literatur............................................................................................... 113 7 Anhang ................................................................................................ 123 Regina Vogelbacher Seite 10 von 126 Abbildungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Seite Abb. 1 Nicht-immunologische und immunologische Faktoren beeinflussen die Entstehung einer chronischen Transplantatnephropathie (CAN) ........... 17 Abb. 2 Signaltransduktionskaskade von mTOR ............................................... 26 Abb. 3 Chemische Struktur von Sirolimus und Everolimus .............................. 27 Abb. 4 Chemische Strukturformel von Bortezomib ........................................... 29 Abb. 5 Schematisches Design des 5/6 Nephrektomiemodells in der Ratte ...... 35 Abb. 6 Überlebenszeitanalyse des 5/6 Nephrektomiemodells ......................... 36 Abb. 7 Eine Everolimus Therapie verschlechtert den Krankheitsverlauf im 5/6 Nephrektomiemodell der Ratte .............................................................. 37 Abb. 8 Charakteristische histologische Veränderungen im 5/6 Nephrektomiemodell .............................................................................. 39 Abb. 9 Everolimus Therapie fördert die Entstehung einer komplexen glomerulären Läsion .............................................................................. 42 Abb. 10 Everolimus wirkt anti-proliferativ auf die Endothelzellen ..................... 44 Abb. 11 Everolimus inhibiert die Proliferation des Mesangiums ....................... 45 Abb. 12 Einfluss von Everolimus auf die glomerulären Matrixausdehnung ...... 47 Abb. 13 Everolimus erhöht die Anzahl an glomerulären Thromben während die VEGF Expression reduziert wird. ........................................................... 49 Abb. 14 Experimentelles Design des F344-LEW Transplantationsversuchs mit Sirolimus und Bortezomib ...................................................................... 51 Abb. 15 Überlebenszeitanalyse der Versuchsgruppen..................................... 52 Abb. 16 Bortezomib und Sirolimus inhibieren die Entwicklung einer Humoralen Immunantwort ........................................................................................ 53 Abb. 17 Sirolimus und Bortezomib vermindern die Ablagerung von C4d, einem Kennzeichen der humoralen Abstoßung ................................................ 54 Abb. 18 BZ und SRL/BZ inhibieren die Ablagerung von Antikörpern im Nierengewebe ........................................................................................ 55 Abb. 19 Sirolimus und Bortezomib vermindern den Transplantatschaden ....... 57 Abb. 20 Funktionelle Daten während des Versuches ....................................... 59 Abb. 21 Bortezomib und Sirolimus vermindern den Einstrom von verschiedenen Entzündungszellen in das Transplantat ......................... 61 Abb. 22 Sirolimus und Bortezomib zeigen einen anti-proliferativen Effekt ....... 62 Abb. 23 Sirolimus und Bortezomib depletieren die Anzahl an B-Zellen und Plasmazellen im Knochenmark.............................................................. 64 Abb. 24 Sirolimus und Bortezomib beeinflussen die B- und T-Zellpopulation sowie die Plasmazellen in der Milz ........................................................ 66 Abb. 25 Überblick über den abdominalen Blutkreislauf einer Ratte.................. 87 Abb. 26 Schematischer Überblick der ELISpot Technik ................................. 106 Regina Vogelbacher Seite 11 von 126 Tabellenverzeichnis Tabellenverzeichnis Seite Tab. 1 Prozessierschema für MC- und PFA-fixiertes Gewebe ......................... 92 Tab. 2 Prozessierschema für ZN-fixiertes Gewebe .......................................... 92 Regina Vogelbacher Seite 12 von 126 Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis °C Grad Celsius µg Mikrogramm µl Mikroliter µm² Quadratmikrometer 4EBP1 eIF4E binding protein 1 Abb. Abbildung ABTS Diammonium- 2,2‘-Azinobis- (3-ethylbenzthiazolin-6-sulfonsäure) ACR akute zelluläre Abstoßung (acute cellular rejection) AHR akute humorale Abstoßung (acute humoral rejection) Ak Antikörper APC Antigen-präsentierende Zelle (antigen presenting cell) BSA Bovines Serum Albumin BZ Bortezomib bzw. beziehungsweise C4d Komplementfaktor 4d (Spaltprodukt der Komplementaktivierung) CAN chronische Transplantatnephropathie (chronic allograft nephropathy) cDNA Komplementäre DNA cm Zentimeter Cy3 Carbocyanin 3 d Tag d.h. das heißt DAB 3,3‘- Diaminobenzidin DAPI 4,6-diamidino-2-phenylindol-dihydrochlorid DC dendritische Zelle (dendritic cell) DNA Desoxyribonukleinsäure ELISA enzyme linked immunosorbent assay ELISpot enzyme linked immune spot technique etc. et cetera F344 Fischer (Rattenstamm) FACS Durchflusszytometrische Analyse (fluorescence activated cell sorting) FCS Fötales Kälberserum FKBP12 FK506-binding protein 12kDa FSGS Fokalsegmentale Glomerulosklerose Regina Vogelbacher Seite 13 von 126 Abkürzungsverzeichnis g Gramm GBM glomeruläre Basalmembran GFR glomeruläre Filtrationsrate h Stunde HLA humanes Leukozyten-Antigen (human leucocyte antigen) HRP Meerrettich-Peroxidase (horse-radish peroxidase) IgG / IgM Immunglobulin G/ M IHC Immunhistochemie IL Interleukin kDA Kilodalton (relative Masse) kg Kilogramm KG Körpergewicht LEW Lewis (Rattenstamm) MC Methyl Carnoy Mda Megadalton (relative Masse) mg Milligramm MHC Haupthistokompatibilitätskomplex (major histocompatibility complex) min Minute ml Milliliter mRNA messenger Ribonukleinsäure mTOR mammalian target of rapamycin mTORC ½ mammalian target of rapamycin complex ½ NaCl Natriumchlorid NF-κB nuclear factor ‘kappa-light-chain-enhancer‘ of activated B cells ng Nanogramm nM Nanomolar nm Nanometer OD Optische Dichte OP Operation P Placebo p70S6K p70 ribosomal S6 Kinase PBS Phosphate buffered saline PCNA proliferating cell nuclear antigen PCR Polymerase-Ketten-Reaktion PFA Paraformaldehyd PMSF Phenylmethylsulfonylfluorid rpm Umdrehungen pro Minute Regina Vogelbacher Seite 14 von 126 Abkürzungsverzeichnis RPMI Roswell Park Memorial Institute RT Raumtemperatur sec Sekunde SFOG Säurefuchsin-Orange G-Färbung SRL Sirolimus SRL/ BZ Sirolimus/ Bortezomib Tab. Tabelle TBS Tris buffered saline TGF-β transforming growth factor beta TNF-α Tumornekrosefaktor alpha Tris Tris (hydroxymethyl)- aminomethan TSC tuberous sclerosis complex TUNEL TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling Tx Transplantation u.a. unter anderem ü.N. über Nacht v.a. vor allem VEGF vascular endothelial growth factor z.B. zum Beispiel ZN Zinklösung Regina Vogelbacher Seite 15 von 126 1 Einleitung 2010 1 Einleitung 1.1 Die chronische Transplantatnephropathie Eine chronische Nierenerkrankung ist durch eine progressive Verschlechterung der glomerulären Filtrationsrate (GFR) charakterisiert und geht meist mit der Entstehung einer Proteinurie einher. Die Ursachen einer chronischen Nierenerkrankung können sehr vielfältig sein. So sind z.B. Diabetes und Bluthochdruck in 2/3 aller Fälle für das Entstehen einer chronischen Nierenerkrankung verantwortlich. Aber auch andere Erkrankungen wie Lupus erythematodes, Glomerulonephritiden, Polyzystische Nierenerkrankung, Obstruktionen (Tumore, Nierensteine) und Nierenbeckenentzündungen können der Grund für eine chronische Nierenerkrankung sein [1][2]. Bei anhaltender Verschlechterung der Nierenfunktion bis zur vollständigen Niereninsuffizienz steht am Ende der Therapie die Dialyse bzw. eine Nierentransplantation. Nach Nierentransplantation kommt es in der Regel zu einer deutlichen Verbesserung der Lebenssituation, v.a. da der Patient meist nicht mehr zur Dialyse muss. Um eine Abstoßung der Spenderniere zu vermeiden und die Funktion des Organs aufrecht zu erhalten muss der Patient immunsuppressive Medikamente einnehmen. Diese Medikamente modulieren das Immunsystem des Empfängers, so dass die Spenderniere nicht als Fremdkörper erkannt und abgestoßen wird. Allerdings sind diese Medikamente mit verschiedenen Nebenwirkungen behaftet. Selbst wenn eine akute Abstoßung erfolgreich unterdrückt wird, kann es zu einem kontinuierlichen Verlust der Nierenfunktion kommen. Während das Transplantatüberleben nach einem Jahr bei über 90 % liegt, beträgt das mittlere Transplantatüberleben einer Niere etwa 11 Jahre [3]. Das Entstehen einer chronischen Transplantatnephropathie (chronic allograft nephropathy, CAN) ist die Hauptursache für einen Funktionsverlust einer transplantierten Niere. An diesem Prozess sind sowohl immunologische als auch nicht-immunologische Faktoren beteiligt (Abb. 1). Regina Vogelbacher Seite 16 von 126 1 Einleitung 2010 Verzögerte Transplantatfunktion Spender Größe Alter Geschlecht Ischämiezeit Hirntot HLAHistoinkompatibilität Frühe Phase Akute Abstoßung Direkte Antigenpräsentation CAN Indirekte Antigenpräsentation Späte Phase Empfänger Alter Vorerkrankungen Infektionen Chronische Abstoßung Diabetes Bluthochdruck Übergewicht Medikamenten-bedingte Toxizität Suboptimale Immunsuppression Abb. 1 Nicht-immunologische und immunologische Faktoren beeinflussen die Entstehung einer chronischen Transplantatnephropathie (CAN) Bei der Entstehung der CAN kommt es zu glomerulären, interstitiellen und vaskulären Veränderungen im Transplantat, die zu einer Verschlechterung der Nierenfunktion bis zur vollständigen Niereninsuffizienz führen. Histologisch können diese Schäden anhand der Banff Klassifikation [4] beurteilt werden. Die Banff Klassifikation umfasst mehrere Kategorien in denen die interstitielle Fibrose, tubuläre Atrophie, glomeruläre Veränderungen und Arteriosklerose beurteilt werden. Diese Klassifizierung ist kein starres System, sondern wird immer wieder dem derzeitigen Erkenntnisstand angepasst. So wurde die Ablagerung des Komplementfaktors C4d in den peritubulären Kapillaren im Jahre 2007 in die Banff Klassifikation aufgenommen [5]. C4d entsteht bei der Komplementaktivierung und impliziert das Vorhandensein und die Aktivität von Alloantikörpern, also Antikörpern die gegen das Transplantat gerichtet sind. Die Ablagerungen von C4d gelten deshalb als Zeichen einer Antikörper-vermittelten Abstoßungsreaktion [6]. Regina Vogelbacher Seite 17 von 126 1 Einleitung 2010 Im Prinzip kann man zwei Arten der immunologischen Transplantatabstoßung unterscheiden (Abb. 1). Die akute Abstoßung kann unter dem humoralen und dem zellulären Aspekt betrachtet werden. In der akuten humoralen Abstoßung (acute humoral rejection; AHR) spielen allospezifische Antikörper eine entscheidende Rolle. Es kommt zu einer Komplementaktivierung und anschließender Fibrinablagerung in den Gefäßen des Transplantats. So wird die Durchblutung unterbrochen und das Nierengewebe stirbt ab [7]. Die Alloantikörper schädigen dabei in erster Linie die peritubulären und glomerulären Kapillaren [8]. Bei der akuten zellulären Abstoßung (acute cellular rejection; ACR) wird das Transplantat durch zytotoxische T-Lymphozyten infiltriert und durch diese geschädigt [9]. Hauptangriffspunkt dieser T-Lymphozyten sind die Tubuli und das arterielle Endothel [8]. Die akute Abstoßung kann direkt bzw. Wochen nach Transplantation auftreten. Im Gegensatz dazu stellt die chronische Abstoßung einen schleichenden Prozess dar, der sich über mehrere Jahre hinziehen kann. Sie führt zu einer langsamen aber kontinuierlichen Verschlechterung der Nierenfunktion, die oft von einer Proteinurie und Bluthochdruck begleitet wird. Kennzeichen einer chronischen Abstoßung sind das Auftreten von mononukleären Zellen in den Glomeruli und peritubulären Kapillaren, sowie eine Multilamellierung der glomerulären Basalmembran [8]. Nach Transplantation kommt das Immunsystem des Empfängers mit verschiedenen Antigenen des Spenderorgans in Kontakt. Alle fremden Antigene können prinzipiell Empfängers kann eine diese Immunantwort fremden auslösen. Epitope des Das Immunsystem des Nierentransplantats auf unterschiedliche Weise erkennen und. Die direkte Antigen-Präsentation, also das Erkennen von Antigenen auf Antigenpräsentierenden Zellen (APC) des Spenders durch T-Zellen des Empfängers spielt eine entscheidende Rolle in der akuten Abstoßung. Da nach Transplantation auch die APC Zellen des Spenders, die mit dem Organ transplantiert wurden, nach und nach absterben, nimmt diese Art der Antigenerkennung mit der Zeit ab. Im Gegensatz dazu erfolgt eine chronische Abstoßung nach indirekter AntigenPräsentation. Dabei werden Antigene des Spenderorgans erst in APCs des Regina Vogelbacher Seite 18 von 126 1 Einleitung 2010 Empfängers aufgenommen, prozessiert und anschließend von T- und B-Zellen des Empfängers erkannt [9]. In der humanen Situation wird v.a. darauf geachtet, dass Spender und Empfänger eine hohe Histokompatibilität aufweisen, d.h. bezüglich ihrer HLA-Gene (human leukocyte antigen) möglichst ähnlich sind. Die HLA-Merkmale werden in Klasse I und II unterschieden. Völlig identische HLA-Merkmale finden sich nur bei eineiigen Zwillingen. Haben Spender und Empfänger gemeinsame HLA Klasse I Antigene, kommt es auf lange Sicht seltener zu einer Abstoßungsreaktion [10]. In Tieren wird der Histokompatibilitätskomplex als MHC (major histocompatibility complex) bezeichnet. Generell kann es zu jedem Zeitpunkt nach Transplantation zu einer Manifestation einer CAN kommen [9] und die Entstehung scheint von vielen Faktoren beeinflusst zu sein. Die immunologischen, oben beschriebenen Prozesse begünstigen die Entstehung einer CAN [11]. Als nicht-immunologische Faktoren gelten ein hohes Alter des Spenders Bedingungen der und bereits Transplantation vorhandene (Hirntoter Erkrankungen, Spender, sowie Ischämiezeit) die [12]. Spenderorgane von Männern sind seltener von einer CAN betroffen. Dies hängt vermutlich mit der höheren Anzahl an Nephronen und dem größeren glomerulären Volumen männlicher Nieren zusammen [13]. Wichtige Faktoren der Progredienz sind auch das Alter des Empfängers und sein Gesundheitszustand, bzw. Infektionen mit Viren Nierenerkrankungen wie wie Cytomegalovirus die fokal [14] segmentale oder vorhandene Glomerulosklerose, die membranoproliferative Glomerulonephritis oder die IgA-Nephropathie. Die zuletzt genannten Nierenerkrankungen können auch im Transplantat wieder auftreten und zu entsprechenden Rezidiven führen [12]. Das Entstehen von Schäden des Spenderorgans, die zu einer CAN beitragen, lässt sich grob in zwei Phasen unterteilen. Die erste Phase umfasst in etwa das erste Jahr nach Transplantation in dem es besonders zu einem tubulointerstitiellen Schaden kommt. Hier spielen v.a. immunologische Faktoren eine Rolle. In der zweiten Phase danach, kommt es nach und nach zu Veränderungen der glomerulären und vaskulären Strukturen [15], an diesen Prozessen sind auch nicht-immunologische Faktoren beteiligt. In den Glomeruli kommt es nach Transplantation Regina Vogelbacher zu einer Hypertrophie, Endothel- und Mesangiumzellen Seite 19 von 126 1 Einleitung 2010 vergrößern sich und es wird vermehrt mesangiale Matrix abgelagert. Mononukleäre Zellen wandern in die Glomeruli ein und sezernieren Zytokine, die u.a. die glomeruläre Basalmembran (GBM) beeinflussen und zu einem Aufsplittern der GBM in mehrere Schichten führen [16][17]. Dadurch verliert dieser Glomerulus seine Filtrationsfähigkeit und es kommt zu einer vermehrten Proteinausscheidung. Durch einen fortschreitenden Verlust an funktionsfähigen Nephronen verliert das Transplantat seine Filtrationsfähigkeit. Während Schäden des endokapillaren Kompartiments (Mesangium und glomeruläre Kapillaren) wahrscheinlich sehr gut repariert werden können, führt eine Schädigung des extrakapillaren Kompartiments (Podozyten, parietales Epithel) meist zu einem irreparablen glomerulären Schaden. Besonders die Podozyten erscheinen als eine Schwachstelle des Glomerulus. Diese Zellen sind hochdifferenziert und nicht mehr in der Lage eine Zellteilung durchzuführen, d.h. ein Verlust an Podozyten kann nicht durch Zellteilung ersetzt werden. Ist die Filtrationsbarriere erst einmal gestört, kommt es meist zu einer Adhäsion oder zu einem „Crescent möglicherweise in Abhängigkeit einer Entzündungsreaktion. Bei diesen Veränderungen, lagern sich die äußeren Zellen des Glomerulus oder die glomeruläre Basalmembran an das parietale Epithel an. Es kommt zu einer Vernarbung oder proliferativen Aktivität an dieser Stelle. Die gestörte Filtrationsbarriere führt zu einer vermehrten Proteinurie und zieht eine vermehrte Protein-Adsorption im proximalen Tubulus nach sich. Dies fördert wiederum einen tubulointerstitiellen Schaden [18]. Regina Vogelbacher Seite 20 von 126 1 Einleitung 2010 1.2 Tiermodelle Die Entstehung der chronischen Transplantatnephropathie wird von verschiedenen Faktoren beeinflusst. Zu diesen gehören sowohl immunologische Faktoren, wie das Entstehen einer Immunantwort gegen Epitope des Spenderorgans, sowie nicht-immunologische Faktoren, wie eine Reduktion der Nephronenanzahl. Die zugrunde liegenden Mechanismen sind in der humanen Situation nur schwer zu erforschen, da sich eine Nierenschädigung nur über eine Funktionsänderung der Niere äußert, wenn sich eine Veränderung im Nierentransplantat bereits manifestiert hat. Tiermodelle sind in der klinischen Forschung sehr wichtig, um die Mechanismen die zu einer Veränderung des Transplantats führen zu erforschen. In Tiermodellen ist es leichter funktionelle und immunhistologische Daten gleichzeitig zu gewinnen und diese zueinander in Bezug zu setzen. Zwar sind die Mechanismen einer Erkrankung im Tiermodell nicht eins zu eins auf den Menschen übertragbar, aber dennoch helfen sie Teilaspekte einer Erkrankung zu untersuchen und basale Vorgänge aufzuklären. 1.2.1 Das 5/6 Nephrektomiemodell Nicht-immunologische Faktoren, wie der progressive Nephronenverlust einer Niere, fördern das Entstehen einer CAN. Das 5/6 Nephrektomiemodell in der Ratte simuliert den graduellen Funktionsverlust einer transplantierten Niere mit einem progressiven Nephronenverlust ohne einen Einfluss immunologischer Aspekte [19]. In diesem Tiermodell wird die vorhandene Nierenmasse um 5/6 reduziert, d.h. eine Niere wird vollständig entfernt, die andere Niere zu 2/3 eingeschränkt. Diese massive Ablation der Nierenmasse kann entweder durch Ligatur der Blutzufuhr oder durch chirurgisches Abtrennen des Nierengewebes erfolgen. Nach Induktion spiegelt dieses Modell den Verlauf einer chronisch progressiven Nierenerkrankung wieder, inklusive der Entstehung einer Proteinurie, Glomerulosklerose und interstitieller Fibrose [20]. Prinzipiell lassen sich drei verschiedene Stadien in diesem Modell feststellen. Nachdem die Nierenmasse um mehr als die Hälfte reduziert wurde, kommt es in den verbliebenen Nephronen zu einer glomeruläre Hypertension. Das Restgewebe beginnt zu hypertrophieren um den Nephronenverlust auszugleichen. Regina Vogelbacher Seite 21 von 126 1 Einleitung In 2010 Folge dessen kommt es und einer Entzündungsanzeichen zu vermehrtem Hochregulation oxidativen von Stress, verschiedenen Wachstumsfaktoren (z.B. TGF-β, CTGF, VEGF und PDGF). Das zweite Stadium ist von mesangialer Sklerose und einer vermehrten Ablagerung von Matrixproteinen geprägt. Im dritten und letzten Stadium kommt es in den Podozyten und den Mesangiumzellen zu Hypertrophie, vermehrter Matrixproduktion und Apoptose. Im Interstitium kommt es zu einer Aktivierung der Myofibroblasten, die daraufhin proliferieren. Die vaskulären Zellen exprimieren vermehrt Adhäsionsmoleküle auf ihrer Oberfläche. An diese Adhäsionsmoleküle können Entzündungzellen des Blutes binden und leichter in das Nierengewebe übertreten. All diese Prozesse führen zur Entstehung von Glomerulosklerose und interstitieller Fibrose und gehen mit dem kontinuierlichen Funktionsverlust des Nierengewebes einher [1][21]. Der fortschreitende Verlust der Nierenfunktion korreliert mit der verstärkten Akkumulation von extrazellulären Matrixmolekülen, wie Fibronektin oder Collagen IV. Unter physiologischen Bedingungen ist die Matrix-Akkumulation ein Reparaturversuch des Gewebes im Rahmen der Wundheilung und dient der Normalisierung der Organfunktion. Wenn der Schädigungsreiz über einen längeren Zeitraum anhält, führt der anhaltende Versuch einer Gewebereparatur zu einer inadäquat gesteigerten MatrixAkkumulation [22]. Bereits kurz nach 5/6 Nephrektomie kommt es außerdem zu einer verstärkten Apoptose-Induktion, die zeitabhängig alle Kompartimente der Niere, also Tubuli, Interstitium und Glomeruli betrifft. Dadurch wird die Reparatur des Gewebes zusätzlich unterbunden [23]. Nach Induktion des 5/6 Nephrektomiemodell kann es zur Entstehung eines Bluthochdrucks kommen, der die glomeruläre Architektur zusätzlich belastet und eine Schädigung weiter fördert. Allerdings kommt es nach 5/6 Nephrektomie nur zu einem Bluthochdruck, wenn das Nierengewebe durch Infarkt, d.h. durch Unterbinden der Blutzufuhr über die Nierenarterien, zerstört wird. Bei einer chirurgischen Reduktion der Nierenmasse, d.h. dem Abtrennen des Nierengewebes, kommt es nicht zu einer Blutdruckerhöhung [20]. Im der humanen Situation gibt es eine Korrelation zwischen der Anzahl der Nephronen und dem Blutdruck [24], d.h. Menschen mit Bluthochdruck haben meist eine geringere Regina Vogelbacher Seite 22 von 126 1 Einleitung 2010 Anzahl funktionstüchtiger Nephronen. Somit ist der Blutdruck ein wichtiger Mediator, der eine chronische Nierenschädigung weiter fördern kann. 1.2.2 Das Fischer-Lewis Transplantationsmodell Um den Einfluss immunologischer Faktoren auf die chronische Transplantatnephropathie im Tiermodell zu untersuchen haben wir das FischerLewis-Transplantationsmodell verwendet. Dieses Tiermodell wurde 1969 von White et al., zum ersten Mal beschrieben [25]. Die Inzuchtstämme Fischer (F344) und Lewis (LEW) weisen eine hohe Histokompatibilität auf. Der major histocompatibility complex (MHC) bezeichnet eine chromosomale Region, deren Gene in der Regulation von Immunreaktionen eine Rolle spielen. Die RT1.A und RT1.B Genloki der Ratte, auf denen die vorwiegenden MHC Klasse I und II Moleküle kodiert sind, sind in LEW und F344 gleich. Die Tierstämme unterscheiden sich bezüglich ihres RT1.C Genlokus, auf dem ein nicht-klassisches MHC Klasse Ib Molekül kodiert wird. Dieses ist bei einer Immunantwort von marginaler Bedeutung, da MHC Ib Moleküle generell auf wenigen Zelltypen exprimiert werden [26]. Würden sich die beiden Rattenstämme bezüglich ihres RT1.A und RT1.B Genlokus unterscheiden, käme es nach Nierentransplantation zu einer heftigen Abstoßung. Das Beobachten einer chronischen Abstoßung über einen längeren Zeitraum wäre dann nicht möglich. Die beide Tierstämme unterscheiden sich genetisch in verschiedenen nicht-MHC Genloki, Lymphozytenund Erythrozyten-Antigenen [27]. Auf all diesen Unterschieden beruht die chronisch verlaufende Abstoßungsreaktion. So konnte die Entstehung von Antikörpern gegen Komponenten der glomerulären Basalmembran nachgewiesen werden. Diese Antikörper richten sich gegen Perlecan, die α1-Kette von Collagen VI und die α5-Kette von Collagen IV [28]. Auch eine Produktion von Antikörper gegen Epitope der Mesangiumzellen wurde in diesem Tiermodell bereits nachgewiesen [29]. Nach Transplantation einer F344-Niere in ein LEW-Tier kommt es zu einer schleichenden Verschlechterung der Nierenfunktion und vermehrter Proteinurie bis zur endgültigen Abstoßung des Transplantats nach ca. 32 Wochen. Histologisch lässt sich 4 Wochen nach Transplantation eine geringe Infiltration mit mononukleären Zellen, eine gelegentliche Verbreiterung der GBM und eine geringe Proliferationsrate der Mesangiumzellen feststellen. Nach 8-12 Wochen ist Regina Vogelbacher Seite 23 von 126 1 Einleitung 2010 in diesem Modell schon eine ausgeprägte Proteinurie, ein hoher Anteil an mononukleären Zellen im Transplantat und eine deutliche Schädigung der Glomeruli zu sehen. Auch fokale tubuläre Nekrosen und Verdickungen der tubulären Basalmembran gehören zum Erscheinungsbild. Nach 28 Wochen zeigt sich ein ausgeprägter Nierenschaden mit interstitieller Fibrose, Glomerulosklerose und vaskulären Veränderungen, die schließlich in einer Niereninsuffizienz enden. Interessanterweise führt die umgekehrte Kombination mit LEW-Spender und F344-Empfänger nicht zu einer so ausgeprägten Nierenschädigung [25]. Um die Progression der chronischen Abstoßung in diesem Tiermodell besser untersuchen zu können, wird oftmals die Phase der akuten Abstoßung durch eine 10-tägige Gabe von Ciclosporin A direkt nach Transplantation unterbunden [30]. Die Vorgänge nach F344-LEW Transplantation lassen sich grob in drei Phasen einteilen. Zuerst eine Antikörper-vermittelte Phase, bei der die Produktion von IgGund IgM-Antikörpern nach 2-4 Woche ihren höchsten Punkt erreicht. Darauf folgt eine Phase der zellulären Abstoßung mit einem vermehrten Einstrom an Makrophagen und T-Lymphozyten in das Transplantat. In dieser Phase werden von den einwandernden Zellen verschiedene Zytokine ausgeschüttet die stark profibrotisch wirken, wie z.B. TGF-β [31]. Und zuletzt eine Phase bei dem es zur Vernarbung des Gewebes bzw. zur Entstehung einer Fibrose mit vermehrter Synthese und reduziertem Abbau von Matrixmolekülen kommt. Diese Prozesse gehen einher mit einem zunehmenden Nephronenverlust und führen letzten Endes zum Funktionsverlust des Transplantats [32]. 1.3 Mögliche Therapeutika zur Behandlung der CAN Die derzeitige Therapie nach Nierentransplantation beruht vorwiegend auf einer Immunsuppression durch Calcineurin-Inhibitoren, wie Ciclosporin A und Tacrolimus. Allerdings sind diese Medikamente pro-fibrotisch und nephrotoxisch. Damit sind diese Medikamente langfristig ungeeignet, eine kontinuierliche Fibrosierung des Nierengewebes zu verhindern. Außerdem zeigen diese Medikamente vermutlich keinerlei inhibitorischen Effekt auf die Entstehung einer Antikörper-vermittelten Abstoßungsreaktion. Darum sollte das Wirkungsspektrum anderer Medikamente die eine Fibrosierung bzw. eine Antikörper-Produktion Regina Vogelbacher Seite 24 von 126 1 Einleitung 2010 unterdrücken könnten dahingehend untersucht werden, ob diese Medikamente nicht auch in Modellen der CAN einen positiven Effekt haben. 1.3.1 mTOR-Inhibition durch Sirolimus und Everolimus Mammalian target of rapamycin (mTOR) ist eine 289 kDa große, atypische Serine/ Threonin Proteinkinase, die in allen eukaryotischen Organismen vorkommt und damit stark konserviert ist (Abb. 2). Im Zellstoffwechsel der Zelle ist mTOR eine zentrale Schaltstelle um auf die Bedingungen des umliegenden Milieus (nährstoffreich/ nährstoffarm) reagieren zu können. Diese Kinase spielt schon in der Embryogenese eine wichtige Rolle, mTOR knock-out Mäuse sterben bereits in einem embryologischem Stadium [33]. Im Zytoplasma liegt mTOR in zwei Komplexen vor: mTORC1 und mTORC2 [34]. Die Unterschiede dieser Komplexe liegen zum einen in den Interaktionspartnern. Im Komplex mTORC1 interagiert mTOR mit Raptor (regulatory associated protein of TOR), in mTORC2 interagiert mTOR mit Rictor (rapamycin-insensitive companion of TOR). Zum anderen haben beide Komplexe unterschiedliche Aufgaben [35]. Der mTORC2 Komplex wird durch Sirolimus und Everolimus nicht beeinflusst. Die vorgeschalteten Regulatoren dieses Komplexes sind noch nicht bekannt [35], allerdings scheint dieser Komplex ein wichtiger Signalweg zur Organisation des Aktin-Zytoskeletts beim Zellwachstum zu sein. Außerdem wird durch mTORC2 das Protein Akt phosphoryliert, welches eine Rolle in der Signaltransduktionskaskade oberhalb von mTORC1 spielt [34]. Normalerweise wird mTORC1 durch den TSC1/ TSC2-Komplex (tuberous sclerosis complex) gehemmt. Wachstumsfaktoren wie Insulin, Zytokine und costimulatorische Moleküle bewirken über PI3K, eine Aktivierung von Akt. Dieses wiederum wirkt inhibitorisch auf TSC1/ TSC2 und führt somit zu einer Aktivierung von mTORC1. Im Gegensatz dazu führt Stress und Hypoxie zu einer Stabilisierung von TSC2 und damit einer Inaktivierung von mTORC1. Das Vorhandensein von Nährstoffen im Sinne von Aminosäuren im Zytoplasma bewirkt über Rheb (Ras homolog enriched in brain) eine direkte Aktivierung von mTORC1. Zwei gut erforschte Zielproteine des aktiven mTORC1-Komplexes sind die p70S6-Kinase (p70 ribosomal protein S6 kinase) und 4EBP1 (eIF4E binding Regina Vogelbacher Seite 25 von 126 1 Einleitung protein 1). 2010 Diese beiden Moleküle sind für die mRNA-Synthese und Proteintranslation verantwortlich. Beide Prozesse sind essentiell für das Zellwachstum. Die anti-proliferative Wirkung von Sirolimus und Everolimus wird durch eine inhibitorische Interaktion des Sirolimus/ Everolimus- FKBP12Komplexes (FK506-binding protein 12 kDa) mit mTORC1 hervorgerufen [34][35]. Über die Induktion des Wachstumsfaktors vascular endothelial growth factor (VEGF) ist mTORC1 auch an der Angiogenese neuer Gefäße beteiligt [36]. Wachstumsfaktoren Stress Hypoxie Aminosäuren PI3K Akt TSC1 SRL TSC2 Rheb FKBP12 mTOR mTOR mTORC2 Rictor Organisation des Aktin-Zytoskeletts mTORC1 Raptor 4EBP1 p70S6K VEGF Proteintranslation und Proliferation Angiogenese Abb. 2 Signaltransduktionskaskade von mTOR Die Kinase mTOR kommt intrazellulär in zwei verschiedenen Protein-Komplexen vor. Der mTORRictor (mTORC2) Komplex reguliert die Organisation des Aktin-Zytoskeletts während des Zellzyklus. Der mTOR-Raptor-Komplex (mTORC1) reguliert das Zellwachstum durch p70S6K und 4EBP1. Durch Nährstoffe, Wachstumsfaktoren und andere Einflüsse wird mTOR-Raptor durch vorgeschaltete Proteine (TSC1/2 und Rheb) reguliert. Nur der mTOR-Raptor-Komplex kann durch Sirolimus gehemmt werden. Regina Vogelbacher Seite 26 von 126 1 Einleitung 2010 Im Jahre 1969 wurde die Actinobakterienart Streptomyces hygroscopicus in Bodenproben der Osterinsel Rapa Nui entdeckt. Ein natürliches Produkt dieser Bakterien ist Sirolimus (ursp. Bezeichnung Rapamycin), ein makrozyklisches Immunsuppressivum mit einem Molekulargewicht von 914 g/mol. Sirolimus und sein Derivat Everolimus haben eine sehr ähnliche chemische Struktur und unterscheiden sich nur in einer Seitenkette (Abb. 3). Beide Medikamente verfügen über starke immunsuppressive und anti-proliferative Eigenschaften und werden nach Herz- und Nierentransplantationen und zur Vermeidung einer Restenose nach Stentangioplastie eingesetzt. Derzeit laufen klinischen Studien, um diese Medikamente auch in der Chemotherapie einiger Krebsarten anzuwenden [34][35]. Sirolimus Everolimus Abb. 3 Chemische Struktur von Sirolimus und Everolimus Sirolimus und Everolimus gehören zur Gruppe der mTOR-Inhibitoren. Sie binden intrazellulär an das Immunophilin FKBP12. Dieser Komplex ist in der Lage die Kinase mTOR zu inhibieren, welche eine zentrale Schaltstelle im Zellstoffwechsel darstellt und für Zellwachstum, Zellgröße und Proliferation verantwortlich ist [34]. Diese Prozesse sind auch für die Zellen des Immunsystems bei der Erkennung von und Reaktion auf Pathogene wichtig. Regina Vogelbacher Seite 27 von 126 1 Einleitung 2010 So benötigen Dendritische Zellen (DC) zu ihrer Aktivierung und Reifung einen intakten mTOR- Signaltransduktionsweg. Wird dieser gehemmt sind die DCs nicht mehr in der Lage T-Zellen adäquat zu stimulieren, d.h. es wird vermehrt T-Zell-Toleranz induziert. Nach mTOR-Inhibition entstehen so vermehrt regulatorische und anerge T-Zellen [37]. Aber auch andere Zellen des Immunsystems wie B-Zellen und natürliche Killerzellen werden in ihrer Reifung bzw. Proliferation gehemmt. Sirolimus ist in der Lage neutrophile Zellen in ihrer Chemotaxis und Chemokinese zu hemmen [38]. Die anti-proliferative Wirkung von Sirolimus und Everolimus ist aber nicht auf Immunzellen beschränkt. Endothelzellen [39], mesangiale Zellen [40][41] und die vaskulären glatten Muskelzellen [42][43] werden ebenfalls durch Sirolimus oder Everolimus in ihrer Proliferation gehemmt. Im Streptozotocin-induzierten Diabetesmodell der Ratte verbesserte Sirolimus die glomerulären Veränderungen der diabetischen Nephropathie. Die diabetischen, behandelten Ratten zeigten weniger Hypertrophie, Matrixablagerungen und eine geringere Albuminurie [44]. In einem Modell der progressiven membranösen Nephropathie der Ratte führte Sirolimus zu einer Verbesserung des Krankheitsverlaufes. Hier kam es durch die mTOR-Inhibition zu weniger glomerulärer Hypertrophie, einer Reduktion pro-inflammatorischer und pro-fibrotischer Zytokine und einer verzögerten Fibrose [45]. In einem chronischen mesangioproliferativen Glomerulonephritismodell, induziert durch einen anti-Thy-1 Antikörper, führten sogar sub-immunsuppressive Sirolimus Dosen zu einer Inhibierung der mesangialen Zellproliferation und der glomerulären Matrixablagerung [46]. In all diesen Experimenten kommt es sowohl auf die Dosis des Medikamentes, als auch auf den richtigen Behandlungszeitpunkt an. Nach einem Ischämie- Reperfusionsschaden im Tiermodell, der experimentell einen akuten Nierenschaden simuliert, steigt die mTOR-Aktivität normalerweise stark an. Eine Behandlung mit Sirolimus in dieser Phase führt zu einer verzögerten Reparatur des Schadens [47]. In der humanen Situation nach Nierentransplantation kann es durch einen Wechsel auf eine Sirolimus bzw. Everolimus Therapie zu einer Verschlechterung der Nierenfunktion und einer erhöhten Proteinurie kommen [48][49][50]. Regina Vogelbacher Seite 28 von 126 1 Einleitung Calcineurin-Inhibitoren 2010 stellen nach wie vor die Standardtherapie nach Nierentransplantation dar. Diese Medikamente sind jedoch per se nephrotoxisch und zeigten bisher keinerlei Einfluss auf die B-Zellen und Plasmazellen, die für eine Antikörper-vermittelte Immunantwort verantwortlich sind. Sirolimus zeigte bereits in in vitro Versuchen einen deutlichen Einfluss auf B-Zellen [51]. Bislang war unklar ob eine mTOR-Inhibition bei einer humoralen Abstoßung eine geeignete Therapie darstellt und so das Entstehen einer CAN verhindert werden kann. 1.3.2 Proteasomen-Inhibition durch Bortezomib Das Medikament Bortezomib (Handelsname Velcade) ist ein modifiziertes Borsäuredipeptid mit den Aminosäuren Leucin und Phenylalanin (Abb. 4). Es zählt zu der Gruppe der Proteasom-Inhibitoren und ist seit 2004 in Deutschland zur Behandlung des Multiplen Myeloms zugelassen. Bortezomib Abb. 4 Chemische Strukturformel von Bortezomib Das Multiple Myelom, auch Plasmozytom genannt, ist eine Blutkrebserkrankung bei der es zur Entartung einer Plasmazelle im Knochenmark kommt. Diese Plasmazelle teilt sich ungehemmt und produziert monoklonale Antikörper, die in den Blutkreislauf gelangen und anhand derer man die Erkrankung diagnostiziert. Da diese Plasmazellen auch das blutbildende System im Knochenmark Regina Vogelbacher Seite 29 von 126 1 Einleitung 2010 verdrängen, kann es zu einer Abnahme der roten und weißen Blutkörperchen kommen. Weitere Symptome sind Knochenschmerzen und Osteoporose. Durch die Ablagerung der monoklonalen Antikörper im Gewebe sind auch Durchblutungsstörungen verschiedener Organe und Nierenversagen möglich [52]. Bortezomib inhibiert reversibel und selektiv das 26S Proteasom. Dieses ist ein ca. 2,5 MDa großer Proteinkomplex und besteht aus 2 regulatorischen Einheiten (19S) und einer katalytischen Einheit (20S), wobei Bortezomib die chymotrypsinähnliche Aktivität in der β5 Untereinheit des 20S Proteasoms inhibiert. Proteasomen befinden sich in allen eukaryotischen Zellen im Zytoplasma und im Nukleus. Sie dienen dem Proteinabbau, in ihnen werden falsch gefaltete oder ungefaltete Proteine, nicht mehr benötigte Zell-Zyklus-Regulatoren, Transkriptionsfaktoren und Tumorsuppressoren abgebaut [53]. Da Proteasomen diese intrazellulären Proteine sehr schnell abbauen können, wirken sie aktiv an Zellprozessen wie Zellzyklus [54], Signaltransduktion [55] oder Apoptose [56] mit. Proliferierende Zellen, wie z.B. maligne Zellen haben eine erhöhte Sensitivität gegenüber einer Proteasom-Inhibition durch Bortezomib. Darum konzentrierte sich die Forschung zunächst auf die Wirkung in malignen Erkrankungen [57]. In Autoimmunitätserkrankungen wie Lupus erythematodes, die durch die Bildung von autoreaktiven Antikörpern hervorgerufen werden, kommt es ebenfalls zu einer gesteigerten Proteinsynthese und Proliferation verschiedener Zellen. In diesen Erkrankungen könnte Bortezomib ebenfalls einen positiven Einfluss haben. Nach Bortezomib-Gabe kommt es in den Zellen zu einer gesteigerten ApoptoseInduktion [52]. Welcher Mechanismus hier die entscheidende Rolle spielt, ist noch nicht vollständig geklärt. Über die Hemmung des Proteinabbaus und der Akkumulierung von Proteinen im Endoplasmatischen Retikulum kann es zur Aktivierung einer Stressantwort, der Unfolded Protein Response, kommen. Myeloide Zellen mit einer hohen IgG-Produktion scheinen besonders sensibel auf eine Proteasomen-Inhibition zu reagieren [58]. Aber auch über die Inhibition des Transkriptionsfaktors NF-κB kann es zur Apoptose-Induktion kommen. Das Protein NF-κB wirkt einer Apoptose entgegen und fördert die Zellteilung [53]. Es wurde bereits durch in vitro Versuchen gezeigt, dass Bortezomib neben Plasmazellen auch andere Zellen des Immunsystems beeinflusst. So induziert eine Behandlung mit Bortezomib in Monozyten [59] und aktivierten T-Zellen [60] Regina Vogelbacher Seite 30 von 126 1 Einleitung 2010 den programmierten Zelltod. In Dendritischen Zellen wird durch die ProteasomInhibition die natürliche Reifung inhibiert. Dadurch sind diese nicht mehr in der Lage Antigene an T-Zellen adäquat zu präsentieren und die weitere Aktivierung der T-Zellen wird unterbunden [61][62]. Um das Wirkungsspektrum der Proteasom-Inhibitoren voll auszuschöpfen werden nun in vivo Versuche durchgeführt, in denen die Produktion von Antikörpern ein Problem darstellt. In Mäusen mit einer Lupus-ähnlichen Erkrankung führte die Gabe von Bortezomib zu einer Depletierung der Plasmazellen, insbesondere der langlebigen Plasmazellen, und zu weniger Nephritis in diesen Tieren [63]. Es konnte auch bereits gezeigt werden, dass in einem Mausmodell mit Collageninduzierter Arthritis Bortezomib zu einer Verbesserung der Erkrankung führt. Die Verbesserung der Krankheitsbildes ist auf die Hemmung von pro- inflammatorischen Zytokinen wie TNF-α, IL-6, IL-1β zurückzuführen [64]. Die Zellen des Immunsystems, besonders die Plasmazellen, sind wichtige Mediatoren bei der Entstehung einer humoralen Abstoßungsreaktion der CAN. Eventuell könnten diese Zellen durch eine Proteasomen-Inhibition mit Bortezomib gehemmt und so die Antikörper-vermittelte Abstoßung nach Nierentransplantation unterbunden werden. Regina Vogelbacher Seite 31 von 126 2 Aufgabenstellung 2 2010 Aufgabenstellung Trotz verschiedener Interventionen mit unterschiedlichen immunsuppressiven und immunmodulierenden Medikamenten, ist die chronische Transplantatnephropathie nach wie vor der Hauptgrund für einen kontinuierlichen Verlust der Transplantatfunktion. Da das Entstehen einer CAN von vielen unterschiedlichen Faktoren beeinflusst wird, kann es auch nicht die eine definitive Standardtherapie zur Vermeidung einer CAN geben. Ein wesentliches Nephronenverlust Problem, bei das bereits die CAN deutlich fördert, ist vorgeschädigter ein progressiver Niere. Dieser Nephronenverlust ist durch eine fortschreitende Vernarbung des Nierengewebes gekennzeichnet und stellt einen nicht-immunologischen Faktor der CANEntstehung dar. Kommt es in der Niere zu einem Schaden der glomerulären Struktur, kann dieser nur bedingt repariert werden. Dabei ist die genaue Art des Schadens, bzw. welche Strukturen in der Niere hauptsächlich betroffen sind von entscheidender Bedeutung. Im ersten Teil dieser Arbeit soll der Einfluss von Everolimus im 5/6 Nephrektomiemodell der Ratte untersucht werden. Dieses Modell spiegelt die Situation einer chronisch progressiven Nierenerkrankung wieder, mit einem kontinuierlichen Verlust an funktionsfähigen Nephronen. Auch nach Transplantation kann es zu einer Einschränkung der Nephronenanzahl kommen, entweder durch Komplikationen bei der Operation oder durch die Transplantation eines bereits vorgeschädigten Organs. Die anschließende Hypertrophie des Restgewebes mit einem verstärkten Umbau der glomerulären Struktur, dem Entstehen einer Proteinurie und der fortschreitenden Fibrosierung der Glomeruli und des Tubulointerstitiums wird im 5/6 Nephrektomiemodell der Ratte nachgestellt. In wie weit die Fibrosierungsreaktion durch mTOR-Inhibition moduliert werden kann, soll in dieser Arbeit untersucht werden. Dieses Projekt kann zwar für sich alleine betrachtet werden. Es sollte jedoch auch in Kontext mit anderen Projekten unserer Arbeitsgruppe gestellt werden, in denen wir bereits eine mTOR-Inhibition in anderen Tiermodellen untersucht haben [43][41][65]. Humorale Abstoßungsreaktionen sind ein weiterer wichtiger Aspekt, welche die Entstehung einer CAN fördern. Im Mittelpunkt steht hier besonders die chronisch Regina Vogelbacher Seite 32 von 126 2 Aufgabenstellung 2010 humorale Abstoßung, die über einen längeren Zeitraum zum Transplantatverlust führt. Behandelt wird eine solche humorale Abstoßungsreaktion im Menschen durch Plasmapherese und B-Zell-depletierende Antikörper. Allerdings können die Antikörper-produzierenden Zellen, durch diese Therapie nicht zerstört werden, sondern bleiben erhalten. Im zweiten Teil dieser Arbeit soll der Einfluss von Sirolimus und Bortezomib im F344-LEW Transplantationsmodell der Ratte untersucht werden. In diesem histokompatiblen Tiermodell kommt es zu einer Antikörper-Produktion gegen Antigene des Spenderorgans. Diese langsam verlaufende Abstoßungsreaktion führt zu einer chronischen Verschlechterung der Nierenfunktion bis hin zur Niereninsuffizienz. Ähnlich wie in der humanen Situation zeigt eine C4d Ablagerung in den peritubulären Kapillaren der transplantierten Niere eine Antikörper-vermittelte Abstoßungsreaktion an. Außerdem kommt es zu typischen Veränderungen der glomerulären, tubulointerstitiellen und vaskulären Strukturen des Transplantats. In diesem Tiermodell soll untersucht werden ob Sirolimus und Bortezomib, in einer Situation mit bereits vorhandenen Antikörpern gegen das Transplantat, die Immunantwort positiv modulieren können. Regina Vogelbacher Seite 33 von 126 3 Ergebnisse 2010 3 Ergebnisse 3.1 Eine Therapie mit Everolimus kann den progessiven Nephronenverlust im 5/6 Nephrektomiemodell verstärken 3.1.1 Allgemeiner Verlauf des Modells In der chronischen Transplantationsnephropathie kommt es über einen längeren Zeitraum zu einem progressiven Nephronenverlust, der u.a. durch eine fortschreitende Fibrosierung der Glomeruli verursacht wird. Die mTOR-Inhibitoren wirken nicht nur immunsuppressiv, sondern auch anti-proliferativ und anti-angiogenetisch. In diesem Teil der Dissertation wurde der Einfluss von Everolimus in einem chronischen Niereninsuffizienzmodell der Ratte untersucht. Eine zentrale Frage war ob eine frühe mTOR-Inhibition in diesem Modell die entstehende Fibrosierung hemmen und so zu einer Verbesserung des Krankheitsverlaufes beitragen kann. Das 5/6 Nephrektomiemodell wurde, wie in Abb. 5 graphisch dargestellt, in zwei Schritten induziert. Dazu wurde die rechte Niere vollständig entfernt, sieben Tage später erfolgte die Ligatur von zwei der drei arteriellen Äste der linken Niere. Bereits drei Tage nach Ligatur wurde mit der Behandlung mit Everolimus bzw. Placebo begonnen. Diese Behandlung wurde bis Tag 22 bzw. Tag 38 fortgesetzt. Zur Überprüfung der funktionellen Parameter wurden in regelmäßigen Abständen Serum- und Urinproben von den Tieren gewonnen. Regina Vogelbacher Seite 34 von 126 3 Ergebnisse 2010 UniNx Ligatur 0 3 -7 Tage vor oder nach Ligatur 10 20 30 Everolimus Serum-und Urinprobe 38 Placebo Abb. 5 Schematisches Design des 5/6 Nephrektomiemodells in der Ratte 3.1.2 Die Behandlung Glomerulosklerose, mit Everolimus interstitieller Fibrose führt und zu vermehrter Proteinurie, und verschlechtert die Nierenfunktion ohne den Blutdruck zu beeinflussen Während des Versuches sind in der Everolimus-behandelten Gruppe 3 Tiere und in der Placebo-behandelten Gruppe 2 Tiere verstorben (Abb. 6). Obwohl keine Autopsie durchgeführt werden konnte (all diese Tiere verstarben während der Nacht), sind diese Tiere höchstwahrscheinlich an Nierenversagen und nicht durch Toxizität des Medikaments gestorben. Die Überlebenszeitanalyse beider Gruppen wurde mit dem Kaplan-Meier Log-rank Test überprüft und zeigte keinen signifikanten Unterschied zwischen den beiden Gruppen (p = 0,54). Erwähnenswert ist, dass das Experiment bereits nach 38 Tagen beendet wurde. Zu diesem Zeitpunkt lag die Mortalitätsrate in den Gruppen bereits bei über 22 % und in beiden Gruppen befanden sich einige Ratten in einem schlechten Allgemeinzustand. Regina Vogelbacher Seite 35 von 126 3 Ergebnisse 2010 Überleben [%] 100 80 60 40 20 Placebo Everolimus 20 30 0 0 10 Tage nach Modellinduktion Abb. 6 Überlebenszeitanalyse des 5/6 Nephrektomiemodells Da während des Versuches Tiere verstarben (Placebo: 2 Tiere; Everolimus: 3 Tiere) wurde eine Überlebenszeitanalyse mit dem Kaplan-Meier Log-rank Test durchgeführt (p = 0,54). Dieses Tiermodell ist durch eine fortschreitende Vernarbung des Nierengewebes gekennzeichnet. Darum wurde zunächst die Nierenhistologie anhand von PAS gefärbten Gewebeschnitten beurteilt. Tendenziell zeigte die Everolimusbehandelte Gruppe schon am Tag 22 vermehrt Glomerulosklerose (Abb. 7 A) und interstielle Fibrose (Abb. 7 B). Statistisch signifikant wurde dieser Unterschied zur Placebo-behandelten Gruppe hinsichtlich vermehrter Glomerulosklerose (p < 0,05) und interstitieller Fibrose (p < 0,01) erst am 38. Tag. Die Everolimus Gruppe hatte somit zum späten Zeitpunkt eine deutliche schlechtere Nierenhistologie. Ein Kriterium, nachdem die Funktionalität einer Niere bzw. das Fortschreiten einer Nierenerkrankung beurteilt werden kann, ist die Proteinurie. Die randomisierte Gruppenaufteilung der Tiere erfolgte drei Tage vor Ligatur. Zu diesem Zeitpunkt hatten beide Gruppen eine vergleichbare Proteinurie (im Mittel 7 mg/ 24 h) und damit die gleichen Ausgangsbedingungen. Die Proteinurie nahm in beiden Gruppen bis Tag 22 stetig und in einem ähnlichen Umfang zu (Abb. 7 C). Im weiteren Verlauf kam es v.a. in den Everolimus-behandelten Tieren zu einem Anstieg der Proteinurie, so dass die Proteinausscheidung dieser Tiere am Tag 38 dreimal höher war als die der Placebo-behandelten Tiere (p < 0,01). Die glomeruläre Filtration wurde anhand der Kreatinin-Clearance ermittelt. Am Tag 22 gab es keinen Unterschied zwischen den beiden Gruppen (Abb. 7 D). Regina Vogelbacher Seite 36 von 126 3 Ergebnisse 2010 Zum Tag 38 fiel die Kreatinin-Clearance in der Everolimus-behandelten Gruppe jedoch signifikant ab (p < 0,05) im Vergleich mit der Placebo-behandelten Gruppe. Da die Reduktion der Nierenmasse durch Ablation der Nierenarterie im 5/6 Nephrektomiemodell der Ratte auch zu einem Bluthochdruck führt, wurde in regelmäßigen Abständen der Blutdruck der Versuchstiere mit einem plethysmographischen Verfahren überprüft. Der systolische Blutdruck (Abb. 7 E) stieg nach Induktion des Modells in allen Tieren und wurde weder durch die Behandlung mit Everolimus noch mit Placebo beeinflusst. 4 * 1.5 Interstitielle Fibrose [Score 0-4] Glomerulosklerose [Score 0-4] 2.0 1.0 0.5 22 A 38 B Tag 22 38 8 Kreatinin-Clearance [ml/min/kg] Proteinurie [mg/24h] 1 Tag 250 200 150 * 100 50 6 -3 22 38 D Tag 300 * 4 2 0 0 C Blutdruck [mmHg] 2 0 0.0 * 3 22 38 Tag Behandlung Placebo Everolimus 200 100 0 E -7 -3 13 23 32 Tag Abb. 7 Eine Everolimus Therapie verschlechtert den Krankheitsverlauf im 5/6 Nephrektomiemodell der Ratte Die Histologie der Nieren zeigte unter Everolimus Behandlung deutlich vermehrte Glomerulosklerose (A) und interstitielle Fibrose (B) in Vergleich zur Placebo Gruppe (beide wurden anhand PAS gefärbter histologischer Schnitte mit semiquantitativen Scores evaluiert). Die Behandlung mit Everolimus führte am Tag 38 zu einer vermehrten Proteinurie (C) und einer Regina Vogelbacher Seite 37 von 126 3 Ergebnisse 2010 eingeschränkten Kreatinin-Clearance (D). Der systolische Blutdruck der Tiere (E) wurde in regelmäßigen Abschnitten mit einem plethysmographischen Verfahren ermittelt. Signifikanzniveau p ˂ 0,05. 3.1.3 Histologische Veränderungen des 5/6 Nephrektomiemodells Nach Induktion des 5/6 Nephrektomiemodells in der Ratte kommt es zu charakteristischen Veränderungen der Nierenhistologie. In Abb. 8 sind verschiedene Veränderungen, die wir in dieser Studie beobachtet haben, anhand einer PAS Färbung dargestellt. Im Vergleich zu einem Glomerulus einer normalen gesunden und unbehandelten Ratte (Abb. 8 A), zeigten die Glomeruli nach Modellinduktion und unter Placebo Behandlung bereits eine deutliche Vergrößerung und Hyperzellularität (Abb. 8 B). Ein kleiner Bruchteil an Glomeruli der Placebo Gruppe zeigt zum Endzeitpunkt eine deutlich veränderte Struktur mit Mikroaneurysmen und Adhäsionen. In der Everolimus-behandelten Gruppe gab es einen Anteil an Glomeruli mit noch intakter Struktur, welche sich klar von dem durchschnittlichen Erscheinungsbild der Glomeruli unter Placebo Behandlung unterschieden, d.h. diese Glomeruli wiesen keine Volumenzunahme und keine Hyperzellularität auf und scheinen von der Everolimus Behandlung profitiert zu haben (Abb. 8 C). Der Anteil dieser „eher gesunden“ Glomeruli in der Everolimusbehandelten Gruppe war jedoch von Tier zu Tier sehr variabel. Im 5/6 Nephrektomiemodell entsteht ein breites Spektrum an unterschiedlichen Schäden der Nierenarchitektur. Einige Glomeruli wiesen nur leichte Schädigungen (Abb. 8 D) mit Matrix-Akkumulation auf. Diese leichten Veränderungen kamen sowohl in der Placebo- wie auch in der Everolimus-behandelten Gruppe vor. Dagegen traten Glomeruli mit starken Schäden wie massiven Matrix- Ablagerungen (Abb. 8 E) oder schweren Veränderungen der Kapillaren (Abb. 8 F und G) signifikant häufiger in den Everolimus-behandelten Tieren auf. Die in Abb. 8 F und G gezeigten Glomeruli sind so stark geschädigt, dass sie vermutlich keinerlei Filtrationsfunktion mehr besitzen. Aufgrund ihrer äußeren Erscheinung werden diese Glomeruli im Weiteren als ballonierte Glomeruli bezeichnet. Unter Everolimus Behandlung kam es auch häufiger zur Schädigung des tubulointerstitiellen Nierengewebes mit dilatierten Tubuli bzw. interstitieller Fibrose (Abb. 8 H, s.a. Abb. 7 B). Regina Vogelbacher Seite 38 von 126 3 Ergebnisse 2010 A B C D E F G H Abb. 8 Charakteristische histologische Veränderungen im 5/6 Nephrektomiemodell Alle Bilder sind einer PAS Färbung entnommen. Ein Glomerulus einer normalen gesunden Ratte (A) im Vergleich zu einem Glomerulus eines Placebo-behandelten Tieres mit deutlicher Hyperzellularität am Tag 38 (B). Einige Glomeruli der Everolimus-behandelten Gruppe (C) zeigten am Tag 38 keine Hyperzellularität. Fehlerhafte Reparaturmechanismen nach der 5/6 Nephrektomie resultierten in veränderten Strukturen wie einer leichten (D) oder ausgeprägten (E) MatrixAkkumulierung, ballonierten Glomeruli mit komplettem Funktionsverlust (F und G) und tubulären Dilatationen im Cortex (H). Diese schweren Veränderungen traten vermehrt in der Everolimus Gruppe auf. Die Bilder C bis H stammen von Tieren, die mit Everolimus behandelt wurden. Regina Vogelbacher Seite 39 von 126 3 Ergebnisse 2010 3.1.4 Everolimus fördert die fehlerhafte Ausheilung der glomerulären Läsionen durch die Inhibierung der Proliferation ohne die Apoptoserate zu beeinflussen Im 5/6 Nephrektomiemodell kommt es bereits kurz nach Induktion zu einer Schädigung der glomerulären Struktur, die später in einer Vernarbung des Gewebes führt. Um diesen Verlauf möglichst von Anfang an zu beeinflussen wurde mit der mTOR-Inhibition am Tag 3 nach 5/6 Nephrektomie-Induktion begonnen. Die Therapie mit Everolimus förderte in unserem Modell die fehlerhafte Reparatur der glomerulären Struktur. Dies spiegelte sich in einer deutlich erhöhten Anzahl an stark veränderten Glomeruli wider. Glomeruli, die wie aufgeblasen aussehen mit thrombotischen Verschlüssen der Kapillaren und Proteinablagerungen in der gesamten Bowman’schen Kapsel (vgl. Abb. 8 F und G) wurden sehr häufig beobachtet. Die Anzahl dieser ballonierten Glomeruli ist am Tag 22 zwischen den Gruppen noch nicht unterschiedlich (Abb. 9 A). Am Tag 38 finden sich in der Everolimus-behandelten Gruppe jedoch 6-mal mehr und damit signifikant mehr solcher ballonierten Glomeruli (p < 0,002). Diese Glomeruli haben höchstwahrscheinlich keinerlei Funktion mehr. Der Prozentsatz an Glomeruli mit deutlich veränderter Struktur (Abb. 9 B) lag zum späten Zeitpunkt in der Everolimus-behandelten Gruppe bei 41 % ± 18,1. In der Placebo-behandelten Gruppe waren es zu diesem Zeitpunkt nur 18,8 % ± 8,7 (p < 0,03) und damit signifikant weniger. Nach Induktion der 5/6 Nephrektomie kam es in den verbliebenen Glomeruli zu einer hypertrophen und proliferativen Aktivität der Zellen. Ohne die ballonierten Glomeruli in beiden Gruppen mit einzubeziehen, bewirkte eine Everolimus Behandlung eine Reduktion der glomerulären Fläche um 32 % für Tag 22 und 20 % am Tag 38 im Vergleich zu den Tieren mit Placebo Behandlung (Abb. 9 C; p < 0,02). Die Anzahl an Zellen pro Glomerulusquerschnitt war zu beiden Zeitpunkten um 25 % reduziert in der Everolimus-behandelten Gruppe im Vergleich zur Placebo-behandelten Gruppe (Abb. 9 D; p < 0,01). Dies bedeutet, dass eine mTOR-Inhibition die natürliche Anpassung des Restgewebes an die veränderte Situation inhibiert. Regina Vogelbacher Seite 40 von 126 3 Ergebnisse 2010 Die reduzierte Zellanzahl pro Glomerulusquerschnitt unter Everolimus Behandlung wurde durch eine reduzierte Proliferationsrate verursacht und nicht durch eine unterschiedliche Apoptoserate in beiden Behandlungsguppen. Die Anzahl proliferierender Zellen wurde anhand einer PCNA Färbung bestimmt. In der Placebo-behandelten Gruppe konnte zu beiden Zeitpunkten die doppelte Menge an proliferierenden Zellen pro Glomerulusquerschnitt ermittelt werden im Vergleich mit der Everolimus-behandelten Gruppe (Abb. 9 E; p < 0,01). Anhand einer TUNEL-Färbung der Nierengewebsschnitte konnte kein Unterschied hinsichtlich der Apoptoserate der glomerulären Zellen zwischen den beiden Gruppen festgestellt werden (Abb. 9 F). Die Apoptoserate der Zellen im Tubulointerstitium war ebenfalls nicht unterschiedlich zwischen den beiden Behandlungsgruppen (keine Graphik gezeigt). Regina Vogelbacher Seite 41 von 126 3 Ergebnisse 2010 80 * 20 10 0 22 A * * 6000 4000 2000 20 0 38 Tag 100 80 * * 60 40 20 0 22 C 22 38 D Tag 4 38 Tag 15 3 * * 1 Apoptotische Zellen pro Glomerulusquerschnitt Proliferierende Zellen pro Glomerulusquerschnitt 40 22 0 0 22 E * B Tag 2 60 38 8000 Glomeruläre Fläche [µm²] Glomeruli mit stark veränderter Struktur in % 30 Zellzahl pro Glomerulusquerschnitt Ballonierte Glomeruli in % 40 Behandlung 5 0 38 Tag 10 22 F Placebo 38 Tag Everolimus Abb. 9 Everolimus Therapie fördert die Entstehung einer komplexen glomerulären Läsion Der prozentuale Anteil an ballonierten Glomeruli (A) und Glomeruli mit stark veränderter Struktur (B) wurde durch Auszählen und Beurteilung aller Glomeruli in PAS gefärbten Gewebeschnitten evaluiert. Die durchschnittliche Fläche pro Glomerulusquerschnitt (C) wurde mit einer computergestützten Bildquantifizierung ermittelt. Die Anzahl an Zellen pro Glomerulusquerschnitt (D) wurde durch Auszählen der Zellkerne ermittelt. Die Proliferation der glomerulären Zellen (E) wurde anhand einer immunhistologischen Färbung gegen den Proliferationsmarker PCNA ermittelt. Die Apoptoserate der glomerulären Zellen (F) wurde anhand einer TUNEL-Färbung ausgewertet. Signifikanzniveau p ˂ 0,03. Regina Vogelbacher Seite 42 von 126 3 Ergebnisse 2010 3.1.5 Everolimus beeinflusst die Ausheilung des glomerulären Schadens durch seine anti-proliferative Wirkung auf Endothel und Mesangium Da die Proteinkinase mTOR im Zellstoffwechsel u.a. für Prozesse der Zellteilung von entscheidender Bedeutung ist, wirkt sich eine Inhibition durch Everolimus antiproliferativ aus. Dies konnten wir bereits in Abschnitt 3.1.4 für die Gesamtanzahl an proliferierenden Zellen pro Glomerulusquerschnitt zeigen. Im 5/6 Nephrektomiemodell der Ratte kommt es direkt nach Induktion zu einer Schädigung des Endothels und des Mesangiums. Dieser komplexe Schaden erfordert eine zeitlich koordinierte Reparatur. Bei der glomerulären Kapillarrarefizierung, die in unserem Modell das Gleichgewicht zwischen dem vorhandenen endothelialen Schaden und seiner Reparatur reflektiert, wurde mittels eines semiquantitativen Scores der Verlust an JG-12 positivem gesunden Endothel beurteilt. Am Tag 22 gab es noch keinen Unterschied zwischen beiden Gruppen. Der Verlust von funktionsfähigem Endothel war in der Everolimusbehandelten Gruppe nach 38 Tagen deutlich fortgeschritten verglichen mit den Placebo-behandelten Tieren (Abb. 10 A; p < 0,05). Die fortschreitende Kapillarrarefizierung in der Everolimus Gruppe wurde zum Teil durch eine reduzierte Proliferationsrate des Endothels verursacht. So konnten wir zeigen, dass die endotheliale Zellproliferation in den Glomeruli unter Everolimus Behandlung am Tag 22 um 50 % und am Tag 38 um 65 % signifikant niedriger war im Vergleich zu den Tieren die nur Placebo erhielten (Abb. 10 B; p < 0,01). Regina Vogelbacher Seite 43 von 126 Glom. Kapillarrarefizierung [Score 0-4] 3 Ergebnisse 2010 2.5 2.0 * 1.5 Placebo 1.0 Everolimus 0.5 0.0 22 A Proliferierende Endothelzellen pro Glomerulusquerschnitt Behandlung 38 Tag 0.6 * 0.4 * 0.2 0.0 B 22 38 Tag C Abb. 10 Everolimus wirkt anti-proliferativ auf die Endothelzellen Die Kapillarrarefizierung (A) wurde anhand einer JG-12 Färbung mit einem semiquantitativen Score beurteilt und ergab einen Verlust an JG-12 positivem, gesundem Endothel unter Everolimus Therapie zum Endzeitpunkt. Die Anzahl proliferierender Zellen des Endothels (B; PCNA/JG-12 Doppelfärbung) wurde durch Auszählen der doppeltpositiven Zellen ermittelt und ergaben eine signifikante Inhibierung der Proliferation durch Everolimus im Vergleich mit Placebo. Als doppeltpositiv (C; Pfeile) wurden die Zellen gewertet, wenn sie einen grün angefärbten Zellkern (PCNA Färbung) in einer JG-12 positiven Kapillarschlinge (Endothel) aufwiesen. Signifikanzniveau p ˂ 0,05. Regina Vogelbacher Seite 44 von 126 3 Ergebnisse 2010 Der Verlust an funktionsfähigem Mesangium wurde in unserem Tiermodell mit einem semiquantitativen Mesangiolyse-Score bewertet. Zum Endzeitpunkt nach 38 Tagen konnten wir einen 3-mal höheren Schaden unter Everolimus Behandlung feststellen (Abb. 11 A; p < 0,003). Analog zu unseren Ergebnissen bezüglich des Endothels verhinderte die Everolimus Behandlung durch seine anti-proliferative Wirkung die Reparatur des geschädigten Mesangiums. Zu beiden Zeitpunkten war die Anzahl an glomerulären PCNA/ OX-7 doppeltpositiven Zellen (Abb. 11 B; p < 0,05) in der Everolimus-behandelten Gruppe um 50 % signifikant niedriger im Vergleich zur Mesangiolyse [Score 0-4] 2.0 1.5 * 1.0 0.5 0.0 22 A 38 Tag Proliferierende Mesangiumzellen pro Glomerulusquerschnitt Placebo-behandelten Gruppe (Abb. 11 C; Pfeil: doppeltpositive Zelle). 1.0 0.8 * * 0.6 0.4 0.2 0.0 22 B 38 Tag Behandlung Placebo Everolimus C Abb. 11 Everolimus inhibiert die Proliferation des Mesangiums Die Mesangiolyse (A) wurde anhand einer OX-7 Färbung mit einem semiquantitativen Score beurteilt und ergab einen Verlust an funktionsfähigem Mesangium unter Everolimus Therapie zum Endzeitpunkt. Die Anzahl proliferierender Zellen des Mesangiums (B; PCNA/ OX-7 Doppelfärbung) wurde durch Auszählen der doppeltpositiven Zellen ermittelt und ergaben eine signifikante Inhibierung der Proliferation durch Everolimus im Vergleich mit Placebo. Als doppeltpositiv (C; Pfeil) wurden all die Zellen gewertet, die einen grün angefärbten Zellkern (PCNA Färbung) in einer OX-7 positiven mesangialen Region aufwiesen. Signifikanzniveau p ˂ 0,05. Regina Vogelbacher Seite 45 von 126 3 Ergebnisse 2010 3.1.6 Everolimus führt zu einer Reduktion der glomerulären Matrixausdehnung Kennzeichen des verwendeten Tiermodells ist die Entstehung einer fortschreitenden Nierenfibrose, die terminal in der Niereninsuffizienz endet. Der kontinuierliche Funktionsverlust der Niere korreliert dabei mit der Akkumulation von extrazellulären Matrixmolekülen im Nierengewebe. Da diese Entwicklung eventuell auch von Everolimus beeinflusst werden könnte, haben wir die Ablagerung der Matrixmoleküle Collagen IV und Fibronektin in unserem Modell untersucht. Die glomeruläre Collagen IV Ablagerung war am Tag 22 nicht unterschiedlich zwischen beiden Gruppen. Am Tag 38 zeigte sich allerdings eine signifikante Reduktion (um 50 %) an glomerulärem Collagen IV in der Everolimusbehandelten Gruppe im Vergleich zur Placebo-behandelten Gruppe (Abb. 12 A; p < 0,003). Die Ablagerungen von Fibronektin in den Glomeruli war generell schwächer ausgeprägt als die des Collagen IV und in beiden Gruppen vergleichbar (Abb. 12 B). Wenn man jedoch nur die Glomeruli mit einer intakten Struktur analysierte, so zeigte sich in der mit Everolimus-behandelten Gruppe tendenziell weniger Fibronektin-Akkumulation zum Endzeitpunkt (p-Wert am Tag 38: 0,10). Die Zellaktivierung mesangialer Zellen wurde in einer alpha-smooth muscle-Aktin (alpha-sm-Aktin) Färbung untersucht. Generell kam es zu einer schwachen Zellaktivierung, diese war am Tag 22 in beiden Gruppen gleich (Abb. 12 C). Für Tag 38, zeigte sich eine leichte Tendenz zu vermehrter alpha-sm-Aktin Expression in den Everolimus-behandelten Tieren (Score: 0,27 ± 0,20 versus Placebo: 0,12 ± 0,04; p ˂ 0,09; Abb. 12 C). Um mögliche Mechanismen aufzuspüren, die zur Collagen IV Reduktion unter Everolimus Therapie führten, analysierten wir den Einfluss der Behandlung auf das pro-fibrotische Zytokin transforming growth factor β (TGF-β). In der Organfibrosierung nimmt TGF-β eine Schlüsselfunktion ein. Eine Überexpression von TGF-β führt zu vermehrter Produktion und vermindertem Abbau von renaler Matrix. Wir ermittelten den prozentualen Anteil an Zellen, die positiv für die phosphorylierte Form von smad 2/3 waren, ein Signaltransduktionsmolekül von TGF-β. Everolimus zeigte hierbei keinen Einfluss auf p-smad 2/3 und damit auch keinen Einfluss auf die TGF-β Signaltransduktionskaskade (Abb. 12 D). Regina Vogelbacher Seite 46 von 126 3 Ergebnisse 2010 1.5 40 30 * 20 10 Glom. Fibronektin [Score 0-4] Glom. Collagen IV positive Fläche [%] 50 0 22 A 38 Tag 0.6 0.4 0.2 0.0 C 22 38 Tag Behandlung 0.5 0.0 22 B P-smad 2/3 pos. Zellen pro Glomerulusquerschnitt [%] Glom. alpha sm- Aktin [Score 0-4] 0.8 1.0 38 Tag 50 40 30 20 10 0 22 D Placebo 38 Tag Everolimus Abb. 12 Einfluss von Everolimus auf die glomerulären Matrixausdehnung Die Ablagerung von Collagen IV im Glomerulus (A; mit computergestützter Bildanalysesoftware ermittelt) zeigte eine Reduktion an Collagen IV durch Everolimus am Tag 38. Die glomeruläre Fibronektin Ablagerung (B; semiquantitativer Score) wurde durch die Behandlung nicht beeinflusst. Aktivierte Mesangiumzellen wurden anhand einer alpha-sm-Aktin Färbung evaluiert (C). Es wurde außerdem der prozentuale Anteil an p-smad 2/3 positiven Zellen (D), als indirekter Indikator der TGF-β-Aktivierung untersucht. Alle vier Ergebnisse wurden durch Auswertungen immunhistologisch gefärbter Nierengewebsschnitte mit entsprechenden Antikörpern gewonnen. Signifikanzniveau p ˂ 0,003. Regina Vogelbacher Seite 47 von 126 3 Ergebnisse 2010 3.1.7 Everolimus steigert die Anzahl an glomerulären Thromben während es VEGF mRNA und Proteinexpression reduziert Die Ablagerung von Fibrin in den Glomeruli (vgl. Abb. 13 B), d.h. die Bildung von Thromben in den Kapillaren, ist ein indirektes Anzeichen für die Schädigung des Endothels und der glomerulären Basalmembran. Da wir in unserem Versuch bereits eine Verzögerung der endothelialen Reparatur durch Everolimus zeigen konnten, führten wir auch Untersuchungen zur Ablagerung von Fibrin durch. Die Bildung von Fibrinablagerungen wurde nur sehr selten in der Placebo-behandelten Gruppe beobachtet. Unter Everolimus Therapie führte der Verlust von funktionellem Endothel zu einer signifikant häufigeren Thrombenbildung in den Glomeruli, so dass diese Tiere am Tag 38 bis zu 9-fach höhere Score-Werte der Fibrinablagerung in den Glomeruli erreichten als die Tiere mit Placebo Behandlung (Abb. 13 A; p < 0,005). Die Fibrinablagerung in den Glomeruli wird zum Teil auch durch Makrophagen gefördert. In unserem Versuch ging die vermehrte Aktivierung der Gerinnungskaskade unter Everolimus Therapie einher mit einem erhöhten Einstrom an Makrophagen und Monozyten am Tag 38 (Abb. 13 C; p < 0,005). Im Tubulointerstitium konnte ebenfalls ein Einstrom an Makrophagen und Monozyten in der Everolimus-behandelten Gruppe beobachtet werden (keine Grafik gezeigt). Der pro-angiogenetische Wachstumsfaktor vascular endothelial growth factor (VEGF) wird bei der Reparatur von Endothelien benötigt. Die Hemmung der glomerulären Reparatur durch Everolimus steht in direkter Verbindung mit einer verringerten Produktion und Expression von VEGF. Immunhistologisch konnte eine Reduktion an VEGF im Glomerulus auf Proteinebene am Tag 38 in den Everolimus-behandelten Tieren nachgewiesen werden (Abb. 13 D; p < 0,02). Darüber hinaus konnten wir in den Everolimus-behandelten Tieren mit Real-Time PCR auch eine Reduktion der VEGF mRNA im cortikalen Nierengewebe nachweisen (Abb. 13 E). Eine mTOR-Inhibition führt somit in unserem Modell zu einer Reduktion von VEGF auf mRNA- und auf Proteinebene, dies trägt außerdem zu einer Verringerung der Endothelzellreparatur bei. Regina Vogelbacher Seite 48 von 126 3 Ergebnisse 2010 Glomeruläres Fibrin [Score 0-4] 2.0 1.5 * 1.0 0.5 0.0 22 A 38 B Tag 3.0 * 2 1 0 22 C Glomeruläres VEGF [Score 0-4] Makrophagen pro Glomerulusquerschnitt 3 Tag Tag 38 mRNA VEGF 2.0 1.5 1.0 38 * 2.5 D 22 38 Tag Placebo Everolimus 1 0,472 ± 0,35 * E p = 0,04 Behandlung Placebo Everolimus Abb. 13 Everolimus erhöht die Anzahl an glomerulären Thromben während die VEGF Expression reduziert wird. Die Akkumulation von Fibrin in den Glomeruli wurde anhand einer SFOG-Färbung mit einem semiquantitativen Score bewertet (A). Typisches Bild einer glomerulären Fibrinablagerung (rot) aus + der SFOG-Färbung (B). Der Einstrom an ED-1 Makrophagen und Monozyten wurde anhand einer immunhistologischen Färbung durch Auszählen positiver Zellen ermittelt (C). Die glomeruläre Expression von VEGF wurde in einer immunhistologischen Färbung mit einem semiquantitativen Score beurteilt (D). Die Menge an cortikaler VEGF mRNA wurde durch Real-Time PCR evaluiert und gegen β-Aktin mRNA normalisiert (E). Signifikanzniveau p ˂ 0,02. Regina Vogelbacher Seite 49 von 126 3 Ergebnisse 3.2 Können 2010 Sirolimus Immunantwort im und Bortezomib F344-LEW die humorale Transplantationsmodell inhibieren? In diesem Experiment wurden neue Therapieansätze für die immunologische, insbesondere die chronisch-humorale Vermittlung der chronischen Transplantatnephropathie untersucht. 3.2.1 Allgemeiner Verlauf des Versuchs Die Entstehung einer Antikörper-Produktion gegen Epitope des Transplantats ist ein wichtiger Mediator der zu einer chronischen Transplantationsnephropathie beitragen kann. Sirolimus und Bortezomib haben beide in in vitro Versuchen bzw. im Multiplen Myelom einen Einfluss auf B-Zellen und Plasmazellen gezeigt, also den Zellen, die bei einer humoralen Immunantwort eine zentrale Rolle spielen. Um das Wirkungsspektrum beider Medikamente näher zu charakterisieren, haben wir in der folgenden Studie den Einfluss einer Sirolimus bzw. Bortezomib Therapie auf die humorale Abstoßungsreaktion im F344-LEW Transplantationsmodell der Ratte evaluiert. Der Transplantationsversuch wurde wie in Abb. 14 graphisch dargestellt durchgeführt. Zehn Tage nach Transplantation einer Fischer-Niere in eine LewisRatte wurde die rechte ursprüngliche Niere vollständig entfernt. Ab diesem Zeitpunkt verfügten die Lewis-Ratten nur noch über die transplantierte Niere. Drei Wochen nach der Transplantation wurde mit der Behandlung mit Placebo (P), Sirolimus (SRL), Bortezomib (BZ) oder einer Kombination aus Sirolimus und Bortezomib (SRL/BZ) begonnen. Diese Behandlung wurde bis Woche 12 nach Transplantation fortgesetzt. In regelmäßigen Abständen wurden Serumproben und 24 h-Urin gewonnen. Regina Vogelbacher Seite 50 von 126 3 Ergebnisse 2010 Start der Behandlung Wochen Tx 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 P SRL BZ SRL/BZ Serum-und Urinprobe Abb. 14 Experimentelles Design des F344-LEW Transplantationsversuchs mit Sirolimus und Bortezomib Während des Versuches sind 3 Tiere über Nacht verstorben (jeweils ein Tier aus Placebo, BZ und SRL). Drei weitere Tiere mussten aus dem Versuch genommen werden (jeweils ein Tier aus Placebo, BZ und SRL/BZ), da sie stark an Gewicht abgenommen hatten und sich in einem schlechten Allgemeinzustand befanden. Nach Beendigung des Versuches wurde ein weiteres Tier der BZ Gruppe aufgrund einer zu engen Anastomose der Vena cava von der Statistik ausgeschlossen. Es wurde eine Überlebenszeitanalyse aller Gruppen mit dem Mantel-Cox Log-rank Test (Abb. 15) angefertigt, dieser zeigte keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen (p = 0,986). Regina Vogelbacher Seite 51 von 126 3 Ergebnisse 2010 Überleben [%] 100 80 60 40 20 P SRL BZ SRL/BZ 0 0 10 20 30 40 50 60 70 80 Tage nach Transplantation Abb. 15 Überlebenszeitanalyse der Versuchsgruppen Eine Überlebenszeitanalyse wurde mit dem Mantel-Cox Log-rank Test angefertigt. Es ergaben sich keine signifikanten Unterschiede zwischen den Gruppen (p = 0,986). 3.2.2 Im F344-LEW Transplantationsmodell kommt es zu einer humoralen Abstoßungsreaktion Das Entstehen einer humoralen Immunantwort nach der Nierentransplantation wurde anhand eines ELISAs überprüft. Mit diesem ELISA werden Antikörper, die gegen Epitope der Spender-GBM gerichtet sind, nachgewiesen. Im F344-LEW Tiermodell wird häufig in den ersten zehn Tagen nach Transplantation Ciclosporin A verabreicht, um eine akute Abstoßung des Transplantats zu verhindern. Da dies aber auch zu einer Unterdrückung der humoralen Immunantwort führt, wurde in unserem Versuch auf die Ciclosporin A-Gabe gänzlich verzichtet. Seren, die den Tieren vor Transplantation abgenommen wurden (Pre-Tx) zeigten im GBM-ELISA nur eine geringe unspezifische Reaktivität (Abb. 16). Drei Wochen nach Transplantation der F344-Niere in LEW-Tiere konnte eine deutlich Alloantikörper-Produktion gegen die GBM der Spender nachgewiesen werden. Alle Tiere zeigten zwischen 88 und 100% mehr Reaktivität über dem basalen Hintergrund der Seren von vor der Transplantation. Zwischen den Gruppen gab es bezüglich der Antikörpertiter drei Wochen nach Transplantation keinen Unterschied, d.h. zum Behandlungsbeginn starteten alle Gruppen auf dem gleichen Niveau. Nach 9 Wochen mit Behandlung der Tiere stiegen die GBMRegina Vogelbacher Seite 52 von 126 3 Ergebnisse 2010 Antikörpertiter im Serum v.a. in der Placebo-behandelten Gruppe weiter an, aber nicht in einer der anderen Gruppen (Abb. 16). Zum Endzeitpunkt war der Antikörpertiter in der Placebo-behandelten Gruppe signifikant höher im Vergleich zu den drei anderen Behandlungsgruppen (p < 0,01). Während die SRL und SRL/BZ Behandlung sogar zu einer Reduktion der Antikörpertiter im Vergleich zum Behandlungsbeginn (3 Wochen) führte, stagnierten die Antikörpertiter unter der Behandlung mit BZ. P SRL GBM-ELISA [OD value] 0.8 A 0.6 BZ P SRL BZ SRL/BZ SRL/BZ * * 0.4 0.2 0.0 * Pre-Tx 3 Wochen * 12 Wochen Abb. 16 Bortezomib und Sirolimus inhibieren die Entwicklung einer Humoralen Immunantwort Die während des Versuches abgenommenen Seren wurden in einem ELISA auf Antikörper gegen Epitope der Spender-GBM untersucht. Seren vor Transplantation (Pre-Tx) zeigten nur eine geringe unspezifische Reaktivität im ELISA. Drei Wochen nach Transplantation zeigten alle Seren eine deutliche Menge an Antikörpern. Die Gruppen sind zum Behandlungsbeginn (3 Wochen) untereinander nicht unterschiedlich. Unter Behandlung stieg der Antikörpertiter nur in der Placebobehandelten Gruppe weiter an. Die SRL, BZ und SRL/BZ Behandlung führte dagegen zu signifikant niedrigeren Antikörperlevel zum Endzeitpunkt nach 9 Wochen mit Behandlung (12 Wochen nach Transplantation). Signifikanzniveau p < 0,05. In humanen Biopsien besteht eine Korrelation zwischen dem Auftreten des Komplementfaktors C4d in den peritubulären Kapillaren und zirkulierenden antiHLA Antikörpern. Das C4d ist ein Spaltprodukt, welches in der Komplementkaskade im klassischen und Lektin-vermittelten Aktivierungsweg entsteht und für einige Zeit kovalent gebunden im Gewebe verbleibt. Die Ablagerung von C4d in den peritubulären Kapillaren der Niere ist somit ein allgemein anerkannter immunhistologischer Marker für eine Antikörper-vermittelte Regina Vogelbacher Seite 53 von 126 3 Ergebnisse 2010 Abstoßungsreaktion nach Nierentransplantation. Die Placebo-behandelten Tiere in unserem Versuch zeigten signifikant mehr C4d Ablagerung in den peritubulären Kapillaren (vgl. Abb. 17 A und B; p < 0,001) als die Tiere die mit SRL, BZ oder der Kombination SRL/BZ (vgl. Abb. 17 A und C) behandelt wurden. Dies deutet auch auf weniger antikörpervermittelte Komplementaktivierung in unserem Modell unter Peritubuläre C4d Ablagerung [Score 0-4] SRL, BZ und SRL/BZ Behandlung hin. A B Placebo 4 3 2 * * 1 * 0 P SRL BZ C SRL / BZ SRL / BZ Abb. 17 Sirolimus und Bortezomib vermindern die Ablagerung von C4d, einem Kennzeichen der humoralen Abstoßung Die C4d Ablagerung in den peritubulären Kapillaren (A) wurde anhand immunhistologisch gefärbter Gewebeschnitte mit einem semiquantitativen Score beurteilt. C4d Ablagerungen waren vorwiegend in der Placebo-behandelten Gruppe (B) vorhanden und nahezu abwesend in der SRL/BZbehandelten Gruppe (C). Die Fotos sind einer immunhistologischen Färbung mit einem C4dspezifischem Antikörper entnommen, diese Färbung wurde auch zur Evaluierung verwendet. Signifikanzniveau p < 0,001. Regina Vogelbacher Seite 54 von 126 3 Ergebnisse 2010 Parallel zur Ablagerung des Komplementfaktors C4d wurde auch die Ablagerung von IgG-Antikörpern im Nierengewebe untersucht. Um diese sichtbar zu machen, wurden Gewebeschnitte mit einem fluoreszenzmarkierten Antikörper gegen Ratten-IgG angefärbt. Mithilfe einer computergestützten Bildanalysesoftware wurde der prozentuale Anteil an gefärbter cortikaler Fläche pro Bild bestimmt (Abb. 18). Die Behandlung mit BZ und SRL/BZ führte zu einer signifikanten Reduktion an IgG-positiv gefärbter Fläche, d.h. in diesen Tieren kam es zu signifikant weniger IgG-Antikörper Ablagerung im Cortex der Transplantate (p < 0,024). SRL alleine führte nur zu einer numerischen Reduktion der IgG- cortikale Antikörper-Ablagerung positive Fläche [%] Ablagerungen im Cortex. A B Placebo 15 10 * * 5 0 P SRL BZ C SRL / BZ SRL / BZ Abb. 18 BZ und SRL/BZ inhibieren die Ablagerung von Antikörpern im Nierengewebe Die Behandlung mit BZ und SRL/BZ führte zu signifikant weniger IgG-Antikörper-Ablagerung im Cortex (A), wie eine Auswertung mit computergestützter Bildanalysesoftware an immunhistologisch gefärbten Gewebeschnitten ergab (20 Bilder pro Nierenautopsie; 20fache Vergrößerung). IgGAntikörper Ablagerungen waren deutlich in der Placebo-behandelten Gruppe (B) vorhanden und sehr viel schwächer ausgeprägt in der SRL/BZ-behandelten Gruppe (C). Die Fotos sind einer immunhistologischen Färbung mit einem Cy3-fluoreszenzmarkierten Antikörper gegen Ratten-IgG entnommen, diese Färbung wurde auch zur Evaluierung verwendet. Signifikanzniveau p < 0,024. Regina Vogelbacher Seite 55 von 126 3 Ergebnisse 2010 3.2.3 Eine Behandlung mit Sirolimus oder Bortezomib vermindert den Transplantatschaden Die Entstehung von fokal segmentalen Glomerulosklerose (FSGS) Läsionen ist ein Indikator für einen chronischen glomerulären Schaden. In unserem Versuch zeigten alle drei Behandlungsarten im Vergleich zu Placebo eine Tendenz zur Reduktion der FSGS Läsionen, jedoch reichte diese Reduktion nicht zu einer statistischen Signifikanz (Abb. 19 A; p = 0,083). Bei einer FSGS Läsion kommt es zuerst zu einer Schädigung der Podozyten. Danach lagern sich die Podozyten an die Bowman‘schen Kapsel an. An dieser Stelle kommt es zur Vernarbung des Gewebes wie in Abb. 19 B (PAS Färbung eines Placebo-behandelten Tieres) gezeigt. Als Konsequenz einer chronischen humoralen Abstoßung kann es zu einer Verdopplung bzw. Verbreiterung der GBM kommen. Zur Bestimmung des Schweregrades der chronischen GBM-Schädigung wurde eine Silberfärbung der Nierengewebsschnitte herangezogen. Die Verdopplung der GBM (Abb. 19 C) wurde zwar durch alle drei Behandlungsarten verhindert, aber nur SRL und SRL/BZ führten auch zu einer signifikanten Reduktion (p < 0,02) im Vergleich zur Placebo-behandelten Gruppe. Ein typisches Beispiel der GBM-Verdopplung aus der Placebo-behandelten Gruppe ist in Abb. 19 D gezeigt. Abb. 19 E zeigt einen typischen Glomerulus aus der SRL/BZ Gruppe, in dem beinahe keine Veränderung der GBM im Vergleich zum Normalzustand einer GBM zu finden sind. Nach einer Nierentransplantation kommt es nicht nur zu Schädigungen der glomerulären Strukturen. Auch Tubuli und Gefäße können betroffen sein. Ein interstitieller Schaden kennzeichnet sich durch vermehrte PAS-Positivität, sowie Tubulusdilatation und einer Infiltration von Entzündungszellen aus. Das Entstehen eines solchen Schadens wurde in unserem Tiermodell durch SRL, BZ und SRL/BZ (Abb. 19 F, p < 0,001) im Vergleich zur Placebo Behandlung vermindert (Abb. 19 G als Beispiel; PAS Färbung). Die Kombination SRL/BZ zeigte dabei den stärksten Effekt und damit das gesündeste Nierengewebe. Vaskuläre Veränderungen, im Sinne einer Verengung des Gefäßlumens, traten wesentlich häufiger und in stärkerem Ausmaß in der Placebo-behandelten Gruppe auf als bei der Behandlung mit SRL, BZ oder SRL/BZ (Abb. 19 H; p < 0,046). Regina Vogelbacher Seite 56 von 126 3 Ergebnisse 2010 In Abb. 19 I ist eine typische vaskuläre Verengung eines mit Placebo-behandelten FSGS Läsionen [Score 0-4] Tieres dargestellt, Abb. 19 J zeigt das Gefäß eines SRL/BZ-behandelten Tieres. A 1.0 0.5 0.0 P SRL BZ SRL / BZ B GBM Lamellierung [Score 0-3] 2.0 C 1.5 1.0 * * 0.5 0.0 P SRL BZ * * SRL BZ SRL / BZ D P E SRL/BZ P J SRL/BZ Interstitielle Schädigung [Score 0-4] 2.5 F 2.0 1.5 1.0 * 0.5 0.0 P SRL / BZ G Verbreiterung der Intima [Score 0-3] 1.5 H 1.0 * 0.5 * *# 0.0 P SRL BZ SRL / BZ I Abb. 19 Sirolimus und Bortezomib vermindern den Transplantatschaden Regina Vogelbacher Seite 57 von 126 3 Ergebnisse 2010 FSGS Läsionen (A) wurden anhand einer PAS Färbung mit einem Score beurteilt. Abb. B zeigt eine FSGS Läsion (PAS Färbung) eines mit Placebo-behandelten Tieres. Die Verdoppelung der GBM (C) wurde anhand einer Silberfärbung evaluiert. In der Placebo-behandelten Gruppe (D) zeigte sich eine auffällige Multilamellierung der GBM (Pfeil), die selten in der Kombinationsgruppe SRL/BZ (E) auftrat. Der interstitielle Schaden (F) wurde anhand einer PAS Färbung mit einem Score beurteilt. Unter Placebo Behandlung kam es zu interstitiellen Veränderungen wie tubuläre Dilatationen und vermehrter PAS Positivität (G). Die vaskulären Veränderungen (H) im Sinne einer Verengung des vaskulären Lumens wurden anhand einer PAS Färbung mit einem Score beurteilt. Repräsentative Aufnahmen der PAS Färbung zeigen schwere (I) und leichte (J) vaskuläre Veränderungen. Signifikanzniveau p < 0,05; * versus Placebo; # versus Sirolimus. 3.2.4 Sirolimus und Bortezomib beeinflussen die Funktionalität des Transplantats Während des Versuches wurden in regelmäßigen Abständen funktionelle Daten der Tiere erhoben. Das Entstehen und die Verschlechterung einer Proteinurie dienen als Maßstab für die Schwere einer Nierenschädigung. Die Proteinurie (Abb. 20 A) stieg in allen Gruppen während des Versuchszeitraumes an. Tendenziell war dieser Anstieg in der Kombinationsgruppe SRL/BZ am geringsten. Aufgrund der hohen Varianz innerhalb der verschiedenen Gruppen kam es allerdings zu keinem Zeitpunkt zu einem statistisch signifikanten Unterschied zwischen den Behandlungsgruppen. Die Serum-Harnstoff Werte wurden ebenfalls in regelmäßigen Abständen überprüft. Betrachtet man die Veränderungen zwischen dem Endzeitpunkt und dem Behandlungsbeginn, so zeigt sich eine tendenzielle Serum-Harnstoff Zunahme (Abb. 20 B) in der Placebo-behandelten Gruppe. SRL und BZ führten zu keiner nennenswerten Veränderung. In der Kombinationsgruppe SRL/BZ scheint es dagegen zu einer Verringerung des Serum-Harnstoffs im Laufe des Versuches gekommen zu sein. Jedoch sind auch diese Ergebnisse statistisch nicht signifikant unterschiedlich (ANOVA p = 0,09). Da die Gabe von Placebo, SRL und BZ immer abhängig vom aktuellen Körpergewicht der Tiere war, wurde jeden Tag das Körpergewicht der einzelnen Tiere überprüft. Über den gesamten Versuchszeitraum stieg das Tiergewicht (Abb. 20 C) in allen Gruppen an, die verabreichten Dosen der Medikamente führten nicht zu einem Gewichtsverlust. Ab der siebten Woche nach Transplantation, d.h. nach der vierten Behandlungswoche blieben die Tiere der Regina Vogelbacher Seite 58 von 126 3 Ergebnisse 2010 Kombinationsgruppe SRL/BZ signifikant leichter als die Tiere der Placebobehandelten Gruppe. P ∆-Serum Harnstoff [mg/dl] Proteinurie [mg/24h] 100 BZ 80 SRL SRL / BZ 60 40 20 0 A 50 0 -50 1 3 5 7 9 SRL BZ SRL / BZ P 380 BZ SRL 360 Gewicht [g] P B Behandlungswochen SRL / BZ 340 320 * 300 * * * * * 280 C 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 Wochen nach Transplantation Abb. 20 Funktionelle Daten während des Versuches Die Tiere wurden in regelmäßigen Abständen zur Gewinnung von 24 h Sammelurin in metabolische Käfige gesetzt. Der Proteingehalt des Urins wurde mittels Bradford-Methode bestimmt und die Proteinurie in mg/24h (A) berechnet. Den Tieren wurden zur Bestimmung des Serum-Harnstoffs in regelmäßigen Abständen Blut abgenommen. Der delta Serum-Harnstoff Wert (B) wurde durch Subtraktion des Wertes zu Behandlungsbeginn vom Endzeitpunkt berechnet und spiegelt somit die Veränderungen unter Behandlung wieder. Die Tiere wurden außerdem täglich gewogen (C). Ab der 7 Woche nach Transplantation waren und blieben die Tiere der Kombinationsgruppe SRL/BZ signifikant leichter als die Tiere der Placebo Gruppe. Signifikanzniveau p < 0,05; * versus Placebo. Regina Vogelbacher Seite 59 von 126 3 Ergebnisse 3.2.5 Sirolimus 2010 und Bortezomib vermindern den Einstrom an Entzündungszellen in das Transplantat Eine akute oder chronische Abstoßungsreaktion nach Organtransplantation hängt von der Erkennung fremder Epitope des Transplantats durch inflammatorische Zellen wie z.B. B- und T-Zellen ab. In unserem Versuch wurde darum die Anzahl an Monozyten/ Makrophagen, zytotoxischen T-Zellen, T-Helferzellen, B-Zellen und MHC Klasse II positiven Zellen im Tubulointerstitium der Transplantate anhand von immunhistologischer Färbungen der jeweiligen Zelltypen untersucht. Das Oberflächenmolekül MHC II wird auf verschiedenen inflammatorischen Zelltypen exprimiert, die an Abstoßungsprozessen beteiligt sind. Im Vergleich mit der Placebo Gruppe, befanden sich in den Transplantaten der mit SRL, BZ und SRL/BZ-behandelten Tiere signifikant weniger MHC II+ Zellen (Abb. 21 A; p < 0,005) im Tubulointerstitium. Makrophagen können mit der Expression von verschiedenen pro-inflammatorischen Zytokinen die Fibrosierung des Gewebes fördern. Im tubulointerstitiellen Kompartiment der Transplantate befanden sich signifikant weniger ED-1+ Monozyten/ Makrophagen (Abb. 21 B; p < 0,02) in den SRL, BZ und SRL/BZ Tieren im Vergleich mit den Placebo Tieren. Das F344-LEW Transplantationsmodell ist nicht nur durch eine humorale Abstoßungsreaktion geprägt, sondern auch durch eine zelluläre Immunantwort, die im Wesentlichen durch T-Lymphozyten vermittelt wird. Der Einstrom an CD8+ zytotoxische T-Zellen (Abb. 21 C; p < 0,005) in die Spenderorgane war in den mit SRL, BZ oder SRL/BZ-behandelten Tieren signifikant niedriger als in der Placebo-behandelten Gruppe. Desweiteren wurde das Einwandern von CD4+ T-Helferzellen durch BZ und die Kombination SRL/BZ um etwa 50 % reduziert (Abb. 21 D; p < 0,02) im Vergleich mit der Placebo Behandlung. Das Oberflächenmolekül CD45R wird auf B-Zellen in verschiedenen Entwicklungsstadien exprimiert, nicht jedoch auf reifen Plasmazellen. Die B-Zellen stellen einen wichtigen Bestandteil der peripheren humoralen Immunantwort dar. In unserem Versuch konnten wir für die mit BZ- und mit SRL/BZ-behandelten Tiere eine signifikante Reduktion der B-Zellen im Tubulointerstitium der Nierentransplantate feststellen (Abb. 21 D; p < 0,005). Die hervorgerufene numerische Reduktion durch SRL erreichte keine statistische Signifikanz. Regina Vogelbacher Seite 60 von 126 3 Ergebnisse 2010 Die Infiltrierung des Spenderorgans mit all diesen Zelltypen war in der Kombinationsgruppe SRL/BZ immer am niedrigsten und erreichte im Fall der CD4+ T-Helferzellen und CD45R+ B-Zellen sogar statistische Signifikanz im Vergleich mit SRL (p< 0,032). Dies lässt vermuten, dass es einen additiven Effekt bezüglich der anti-inflammatorischen und immunsuppressiven Wirkungsweise beider Medikamente gibt. 80 200 * * *# 100 A 0 P SRL BZ SRL / BZ ED1 positive Zellen pro Gesichtsfeld MHCII positive Zellen pro Gesichtsfeld 300 B 40 30 * 20 * * 10 0 P SRL BZ SRL / BZ CD4 positive Zellen pro Gesichtsfeld CD8 positive Zellen pro Gesichtsfeld * 40 * * 20 0 P SRL BZ SRL / BZ 60 50 C 60 D 40 * *# 20 0 P SRL BZ SRL / BZ CD45R positive Zellen pro Gesichtsfeld 25 E 20 15 * 10 *# 5 0 P SRL BZ SRL / BZ F Abb. 21 Bortezomib und Sirolimus vermindern den Einstrom von verschiedenen Entzündungszellen in das Transplantat Die Infiltration verschiedener Zelltypen in das Transplantat wurde durch Auszählen der Zellen im Tubulointerstitium in Nierengewebsschnitten evaluiert, die immunhistologisch mit entsprechenden Antikörpern angefärbt wurden (400fache Vergrößerung; 30 Gesichtsfelder pro Tier). Die + Behandlung mit BZ oder SRL führte zu einer signifikanten Reduktion an MHC II Zellen (A), + + + ED1 Monozyten/ Makrophagen (B) und CD8 zytotoxischen T-Zellen (C). Die CD4 T-Helferzellen Regina Vogelbacher Seite 61 von 126 3 Ergebnisse 2010 + (D) und CD45R B-Zellen (E) waren unter BZ und SRL/BZ Behandlung im Vergleich zur Placebo Gruppe signifikant reduziert. Gezählt wurden alle positiv gefärbten Zellen im tubulointerstitiellen Kompartiment (F), hier am Beispiel der CD8 Färbung (brauner Zellkern, Pfeile zeigen einige Beispiele in diesem Bild). Signifikanzniveau p < 0,032; * versus Placebo; # versus SRL. 3.2.6 Sirolimus und Bortezomib beeinflussen die Proliferation v.a. der Zellen des Interstitiums Sowohl SRL als auch BZ verfügen über einen anti-proliferativen Effekt. Darum wurden die Transplantate auch hinsichtlich der proliferierenden Zellen untersucht. Als Proliferationsmarker diente hierbei PCNA (Proliferating Cell Nuclear Antigen). Sowohl SRL als auch BZ reduzierten die Anzahl der proliferierenden Zellen (Abb. 22; p < 0,01) in den Transplantaten im Vergleich zu der Placebo Gruppe. Die Kombination SRL/BZ führte in diesem Fall jedoch nicht zu einer weiteren Reduktion der proliferierenden Zellen. Der Unterschied beruhte v.a. auf proliferierenden Zellen die sich im Interstitium befanden. Aber auch proliferierende Zellen der Tubuli konnten in der Placebo-behandelten Gruppe deutlich öfter detektiert werden als in einer der drei anderen Behandlungsarme. Proliferierende Zellen pro Gesichtsfeld 150 100 * * SRL BZ * 50 0 A B Placebo P C SRL / BZ SRL / BZ Abb. 22 Sirolimus und Bortezomib zeigen einen anti-proliferativen Effekt Regina Vogelbacher Seite 62 von 126 3 Ergebnisse 2010 Der Anteil an proliferierenden Zellen wurde mit Hilfe einer immunhistologischen Färbung gegen PCNA evaluiert (A). Es wurden die PCNA positiven Zellen in 20 Gesichtsfeldern mit 400-facher Vergrößerung am Mikroskop ausgezählt. In der Placebo-Gruppe (B) wurden deutlich mehr proliferierende Zellen im Interstitium gezählt, als in der SRL/BZ Gruppe (C). Fotografien wurden der immunhistologischen PCNA-Färbung entnommen, die auch zur Evaluierung verwendet wurde. Signifikanzniveau p < 0,01. 3.2.7 Sirolimus und Bortezomib reduzieren die humorale Immunantwort durch Depletion der B-Zellen und Plasmazellen im Knochenmark Nach ihrer Differenzierung zirkulieren reife B-Zellen und B-Gedächtniszellen durch die peripher-lymphatischen Organe und das Knochenmark. Auch ausdifferenzierte Plasmazellen wandern in das Knochenmark ein, in dem sie für längere Zeit Überlebenssignale von den Stromazellen erhalten und Antikörper produzieren. Um den Einfluss von SRL und BZ auf die humorale Immunantwort zu untersuchen, haben wir die Anzahl der B-Zellen und Plasmazellen im Knochenmark mittels FACS Analyse bestimmt. Sowohl SRL als auch BZ reduzierten die Anzahl an B-Zellen (Abb. 23 A; p < 0,002) im Knochenmark. Hierbei führte die Kombination SRL/BZ zur geringsten Anzahl an B-Zellen. Im Vergleich zur Placebo Gruppe kam es in diesen Tieren zu einer Erniedrigung um mindestens 74 % der B-Zellen. Das Auftreten von Plasmazellen (Abb. 23 B; p < 0,033) im Knochenmark wurde durch SRL, BZ und SRL/BZ zwischen 69 und 90 % im Vergleich zur Placebo Behandlung reduziert. Zusätzlich wurde die Anzahl an IgG-sezernierenden Zellen (Abb. 23 C; p < 0,001) im Knochenmark mit einem ELISpot bestimmt. Analog zur FACS Analyse, führte die Behandlung mit SRL und BZ zu einer deutlichen Reduktion der IgG-sezernierenden Zellen im Vergleich zur Placebo-behandelten Gruppe. Auch in diesem Fall war die Kombination beider Medikamente am effektivsten und reduzierte die Anzahl der IgG-sezernierenden Zellen um ungefähr 90 % im Vergleich mit Placebo. Regina Vogelbacher Seite 63 von 126 3 Ergebnisse 2010 Plasmazellen im Knochenmark [1 x 105] B Zellen im Knochenmark [1 x 105] 30 20 * 10 A * *# 0 P SRL BZ SRL / BZ B 5 4 3 2 * 1 0 P SRL * * BZ SRL / BZ IgG-sezernierende Zellen im KM pro 1 x 106 Zellen 700 C 600 500 400 * 300 * 200 *# 100 0 P SRL BZ SRL / BZ Abb. 23 Sirolimus und Bortezomib depletieren die Anzahl an B-Zellen und Plasmazellen im Knochenmark + + - Die totale Anzahl an B-Zellen (A; CD45R / IgM ) und Plasmazellen (B; CD45R / zytoplasmatisches + IgG ) im Knochenmark wurde mittels FACS Analyse und Bestimmung der Gesamtzellzahl des Knochenmarks bestimmt. Die Anzahl an IgG-sezernierenden Zellen (C) im Knochenmark wurde mit einem ELISpot untersucht. In diesen drei Fällen führte eine Therapie mit SRL, BZ und SRL/BZ zu einer signifikanten Reduktion dieser Zelltypen im Knochenmark im Vergleich mit Placebo Behandlung. Signifikanzniveau p < 0,034; * versus Placebo; # versus SRL. Regina Vogelbacher Seite 64 von 126 3 Ergebnisse 2010 3.2.8 Sirolimus und Bortezomib reduzieren die Anzahl von B- und T-Zellen sowie IgG-sezernierenden Zellen in der Milz Die Milz ist, wie die Lymphknoten, ein lymphatisches Organ und ist wichtig für die Immunabwehr. In der Milz kommt es zur antigeninduzierten Differenzierung und Vermehrung von B- und T-Zellen. Die Anzahl an IgG-sezernierenden Zellen (Abb. 24 A; ELISpot) und Plasmazellen (Abb. 24 C; FACS Analyse) in der Milz wurden durch SRL, BZ und SRL/BZ zwischen 50 und 90 % im Vergleich mit der Placebo-behandelten Gruppe reduziert. Im Gegensatz zu den Ergebnissen bezüglich der B-Zellen im Knochenmark, wurde die B-Zellpopulation der Milz (Abb. 24 D) weder durch SRL noch BZ alleine beeinflusst. Einzig die Behandlung mit der Kombination SRL/BZ führte zu einer Reduktion um 53 % im Vergleich mit der Placebo-behandelten Gruppe. Während die zytotoxischen T-Zellen (Abb. 24 E; p < 0,002) in der Milz durch SRL und SRL/BZ, nicht jedoch durch BZ signifikant verringert wurden, führte bei den T-Helferzellen (Abb. 24 F) nur die Kombination SRL/BZ zu einer signifikanten Reduktion. Die Gesamtanzahl an CD4+/CD25+ regulatorischen T-Zellen (Abb. 24 G) blieb von der Behandlungsart unbeeinflusst. In der Literatur wird häufig der relative Anteil der regulatorischen T-Zellen angegeben, da dieser die Ausprägung der Immunantwort wesentlich beeinflusst. In unserem Modell könnte er für die richtige Interpretation der Immunantwort wichtig sein. Betrachtet man die CD4+/CD25+ Zellen als relativen Anteil der CD4+ Zellen, so sind die regulatorischen T-Zellen in den mit SRL und SRL/BZ behandelten Tieren signifikant erhöht (Abb. 24 H; p < 0,025) im Vergleich mit Placebo und mit BZ. Eine Behandlung mit BZ alleine führte zu keiner Veränderung der regulatorischen T-Zellpopulation in der Milz. Regina Vogelbacher Seite 65 von 126 2010 IgG-sezernierende Zellen in der Milz pro 1 x 106 Zellen 3 Ergebnisse ELISpot 150 100 * * 50 *# 0 A P SRL BZ SRL / BZ P B SRL / BZ 3 2 1 * * SRL BZ 0 C P * SRL / BZ B-Zellen in der Milz [1 x 107] Plasmazellen in der Milz [1 x 106] 8 2 P 4 3 * *§ 2 1 0 P SRL BZ SRL / BZ F CD4+ CD25+ T-Zellen in der Milz [%] CD4+ CD25+ T-Zellen in der Milz [1 x 105] BZ SRL / BZ 15 10 *§ 5 0 P 1.5 G SRL 20 T-Helferzellen in der Milz [1 x 107] zytotoxische T-Zellen in der Milz [1 x 107] * 4 0 D 5 E * 6 15 10 5 0 P SRL BZ SRL / BZ H SRL BZ * 1.0 SRL / BZ *§ # 0.5 0.0 P SRL BZ SRL / BZ Abb. 24 Sirolimus und Bortezomib beeinflussen die B- und T-Zellpopulation sowie die Plasmazellen in der Milz - Der Anteil an IgG-sezernierende Zellen (A) und die Gesamtanzahl an Plasmazellen (C; CD45R / + zytoplasmatisches IgG ) in der Milz wurde durch SRL, BZ und SRL/BZ signifikant reduziert. Repräsentative Vertiefungen einer ELISpot Platte (B) von mit Placebo und SRL/BZ behandelten + + Tieren, in der jeder Punkt eine IgG-sezernierende Zelle darstellt. Die B-Zellen (D; CD45R / IgM ) in der Milz wurden durch die Kombination SRL/BZ reduziert. Die Behandlung mit SRL oder SRL/BZ + erniedrigte auch die Anzahl an CD8 zytotoxischen T-Zellen (E), während nur die Kombination Regina Vogelbacher Seite 66 von 126 3 Ergebnisse 2010 + + SRL/BZ die Anzahl der CD4 T-Helferzellen (F) reduzieren konnte. Die Gesamtanzahl an CD4 / + CD25 regulatorischen T-Zellen (G) war vergleichbar in allen Gruppen, aber als prozentualer Anteil + der CD4 Zellen betrachtet, führte SRL und SRL/BZ zu einem erhöhten Anteil an regulatorischen T-Zellen (H). Grafik A wurde mittels ELISpot bestimmt, Grafik C bis H wurden durch FACS Analyse und Validierung der Gesamtanzahl an Milzzellen ermittelt. Signifikanzniveau p < 0,034; * versus Placebo; # versus SRL; § versus BZ. Regina Vogelbacher Seite 67 von 126 4 Diskussion 2010 4 Diskussion 4.1 Derzeitige Probleme einer Behandlung der CAN Nach einer Nierentransplantation im Menschen wird die Abstoßung des Organs derzeit durch eine Behandlung mit einer Kombination aus Calcineurin-Inhibitoren, Proliferationshemmern und Steroiden verhindert. Für lange Zeit war das Auftreten einer akuten Abstoßung die Hauptursache für einen Verlust des Spenderorgans. Durch Verbesserungen in der immunsuppressiven Therapie ist dieses Problem mittlerweile gut beherrschbar geworden und so liegt das Organüberleben ein Jahr nach Transplantation bei über 90 %. Dennoch kommt es häufig zu einer chronischen Verschlechterung der Organfunktion bis hin zum Funktionsverlust der Niere. Das mittlere Transplantatüberleben einer Niere beträgt nur ca. 11 Jahre [3][66]. Die Ursachen eines chronischen Funktionsverlusts umfassen sowohl immunologische als auch nicht-immunologische Aspekte. Eine Immunantwort mit der Entstehung von Antikörpern trägt zu Veränderungen des Gewebes bei. Es kommt zu Glomerulosklerose, arteriellen Veränderungen und einer interstitiellen Fibrose in der transplantierten Niere. Ein fortschreitender Nephronenverlust per se führt zu einer Vernarbung des Gewebes und zu einer kontinuierlichen Zerstörung des Nierengewebes. Die derzeitige Therapie scheint nicht in der Lage zu sein, eine chronische Transplantatnephropathie effektiv und für lange Zeit zu verhindern. Da man Veränderungen der humanen Niere meist nur durch Veränderungen der Funktionalität (wie Serum-Kreatinin und Proteinurie) feststellen kann, ist es unerlässlich die zugrundeliegenden Mechanismen des chronischen Transplantatverlustes in geeigneten Tiermodellen aufzuklären. Die bisherige Standardtherapie mit Ciclosporin A (Calcineurin-Inhibitor) ist mit einer Reihe von Nebenwirkungen behaftet. Eine längere Behandlung mit Ciclosporin A wirkt sich per se nephrotoxisch aus, außerdem hat das Medikament einen pro-fibrotischen und pro-angiogenetischen Effekt. Eine längere Verwendung von Ciclosporin A führt zu nicht-reversiblen Veränderungen der Niere, die durch Regina Vogelbacher Seite 68 von 126 4 Diskussion 2010 interstitielle Fibrose und arterielle Verengungen mit einer Verdickung der Intima gekennzeichnet sind [67]. Die mTOR-Inhibitoren Sirolimus und Everolimus gelten als erfolgversprechende Medikamente zur Immunsuppression nach Organtransplantation, da sie nicht nephrotoxisch sind [12] und außerdem auch anti-proliferativ und anti- angiogenetisch wirken und einen anti-tumor Effekt besitzen. Beide Medikamente inhibieren selektiv die intrazelluläre Kinase mTOR, die eine wichtige Schaltstelle im Zellstoffwechsel darstellt. Als Medikamente wurden Everolimus und Sirolimus bereits vor mehr als 10 Jahren zugelassen, dennoch werden aktuell nur etwa 10 % der transplantierten Patienten mit diesen Medikamenten behandelt. Ihre Verwendung führte bei transplantierten Patienten relativ häufig zu Nebenwirkungen, die einer umfangreichen Anwendung dieser Medikamente an vielen Patienten bisher verhinderte. Mögliche Nebenwirkungen der mTOR-Inhibition sind Wundheilungsstörungen, Lymphozelen, Pneumonien [68], Mundulzera [69], pro-inflammatorische Effekte [70] und eine verzögerte Transplantatfunktion. Manche dieser Nebenwirkungen lassen sich auf die generelle anti-proliferative Wirkung der mTOR-Inhibitoren zurückführen. Wenn Patienten nach Transplantation erst mit Calcineurin-Inhibitoren behandelt werden und mit der mTOR-Inhibitor basierenden Medikation erst einige Wochen bis Monate nach Transplantation begonnen wird, lassen sich einige dieser Nebenwirkungen gut verhindern. In einigen Patienten kam es dennoch nach Konversion von Ciclosporin A auf Sirolimus zur Entwicklung einer schweren Proteinurie oder zur Zerstörung des Nierentransplantats [49][71][72]. Ein Risikofaktor scheint eine bereits bestehende Proteinurie und eine GFR unter 40 ml/min zu sein. Ein besseres Verständnis und eine bessere Vorhersage von nachteiligen Effekten bei der Behandlung mit mTOR-Inhibitoren würde das Sicherheitsprofil von Everolimus und Sirolimus deutlich verbessern. Findet die Konversion von Ciclosporin A auf Sirolimus in den ersten sechs Monaten nach der Nierentransplantation statt, so sind die Ciclosporin A- vermittelten Veränderungen im Transplantat wahrscheinlich noch reversibel. Sirolimus-behandelte Patienten zeigten ein bis vier Jahre nach Transplantation eine signifikant bessere GFR als mit Ciclosporin A-basierender Therapie [73][74]. Wurde die Konversion auf Sirolimus erst später als sechs Monate nach Transplantation durchgeführt [75][76][77], so konnte die Behandlung mit Sirolimus Regina Vogelbacher Seite 69 von 126 4 Diskussion 2010 die Anzeichen der CAN zumindest abschwächen bzw. verzögern. Diese Patienten zeigten zwei Jahre nach Konversion zumindest weniger Glomerulosklerose und interstitielle Fibrose [77] als die weiterhin mit Ciclosporin A-behandelte Kontrollgruppe. Um den Einfluss einer mTOR-Inhibition auf den kontinuierlichen Nephronenverlust und die Vernarbungsreaktion des Nierengewebes zu untersuchen, der eine CAN fördert, haben wir Everolimus im 5/6 Nephrektomiemodell der Ratte eingesetzt. Die chronische Transplantatnephropathie wird außerdem durch das Entstehen einer Immunantwort auf zellulärer und humoraler Ebene gefördert. In den letzten Jahren wurde besonders die humorale Immunantwort als kritischer Faktor in akuten und chronischen Abstoßungsprozessen nach Organtransplantation identifiziert. Leider gibt es bisher keine wirkungsvolle immunsuppressive Standardtherapie, mit der eine gegen das Transplantationsorgan gerichtete Alloantikörper-Produktion verhindert oder zumindest effektiv behandelt werden könnte. Patienten mit einer akuten humoralen Abstoßungsreaktion werden derzeit mit einem Wechsel auf Tacrolimus, mit Plasmapherese oder Immunadsorption, bzw. T- und B-Zell-depletierenden Antikörpern behandelt. Der beste therapeutische Ansatz für eine Behandlung von C4d-positiven Transplantaten, die mit einer ungünstigen Krankheitsprognose verbunden sind, ist jedoch noch nicht gefunden. Im Moment ist weder die Dosis noch eine geeignete Medikamenten-Kombination zur Behandlung einer chronisch humoralen Abstoßung bekannt oder wird durch geeignete Beweise favorisiert. Vorläufige Ergebnisse deuten darauf hin, dass Calcineurin-Inhibitoren sich in dieser Situation nicht positiv auswirken. Um die potentiellen anti-humoralen Effekte der mTOR-Inhibitoren, wie Sirolimus [51] und die des Proteasomen-Inhibitors Bortezomib [78] zu untersuchen, haben wir diese allein und in Kombination im F344-LEW Transplantationsmodell der Ratte eingesetzt. Regina Vogelbacher Seite 70 von 126 4 Diskussion 4.2 2010 Ist der mTOR-Inhibitor Everolimus ein geeignetes Therapeutikum beim chronischen Nephronenverlust? 4.2.1 Everolimus fördert den kontinuierlichen Nephronenverlust im 5/6 Nephrektomiemodell Unsere Ergebnisse einer mTOR-Inhibition im 5/6 Nephrektomiemodell der Ratte zeigen, dass eine Behandlung mit Everolimus eine Proteinurie, Glomerulosklerose und interstitielle Fibrose hervorrufen kann. Es kommt in den Everolimusbehandelten Tieren unserer Studie zu einer Verschlechterung der Nierenfunktion. Der für das Modell charakteristische Blutdruckanstieg wird von der Behandlung mit Everolimus nicht beeinträchtigt, d.h. die beobachteten Veränderungen in der Niere beruhen nicht auf einem zusätzlichen Anstieg des Blutdruckes. Diese Studie ist einer der ersten Berichte, der negative Effekte der mTORInhibition in einer chronisch progressiven Situation einer Nierenerkrankung untersucht. Unser Versuch verlief in punkto Blutdruckentwicklung, Proteinurie und Serum-Kreatinin analog zu anderen Studien im 5/6 Nephrektomiemodell der Ratte [23][79][80] in denen das Modell ebenfalls durch Ligatur der arteriellen Äste ausgelöst wurde. Unsere Arbeitsgruppe veröffentlichte in der Vergangenheit bereits verschiedene Studien in denen die mTOR-Inhibition in experimentellen akuten Nierenerkrankungen evaluiert wurde [43][41]. Betrachtet man unsere Daten und die bisher veröffentlichte Literatur zur mTORHemmung in experimentellen Nierenerkrankungen, so scheint der Einsatz von Sirolimus/ Everolimus besonders bei einem komplexem glomerulären Schaden kritisch zu sein. Solch ein komplexer Schaden beinhaltet sowohl eine Schädigung des Endothels als auch des Mesangiums und erfordert eine zeitgerechte, koordinierte Reparatur, um nicht über eine indirekte podozytäre Schädigung zum Verlust des Glomerulus zu führen. Nach 5/6 Nephrektomie kommt es zu einer volumenausgleichenden glomerulären Vergrößerung im Restgewebe. Diese Vergrößerung ist die Hauptursache für die anhaltende Zellschädigung des Endothels und des Mesangiums [81]. Everolimus inhibiert in unserer Studie sowohl die Proliferation des glomerulären Endothels als auch die des Mesangiums. So kommt es verstärkt zu einer anhaltenden Kapillarrarefizierung Regina Vogelbacher Seite 71 von 126 4 Diskussion 2010 und einer anhaltenden Mesangiolyse, wie gezeigt für Tag 38 nach Modellinduktion in unserem Versuch. Die Reparatur des Endothels wird durch Everolimus inhibiert und die Endothelzellschädigung führt zu einer höheren Thromboserate und verstärkten Entzündungsanzeichen. So konnten wir am Tag 38 in unserer Studie vermehrt Fibrinablagerungen in den Glomeruli und eine Ansammlung an Monozyten/ Makrophagen in der Everolimus-behandelten Gruppe feststellen. In in vitro und in vivo Versuchen wurde von einer primären pro-inflammatorischen Wirkung der mTOR-Inhibitoren berichtet. So führt eine mTOR-Inhibition in LPSstimulierten humanen mononukleären Zellen des peripheren Blutes zu einer vermehrten Produktion des pro-inflammatorischen IL-12 und einer Suppression des anti-inflammatorischen Zytokins IL-10 [82]. Das Signalmolekül VEGF spielt eine zentrale Rolle in der Vaskulo- und Angiogenese. In der Niere ist es für die Entwicklung, Aufrechterhaltung und Reparatur des Endothels verantwortlich. Eine fehlerhafte Regulation der VEGF Expression während der Embryogenese, führt zu einer fehlerhaften Ausbildung der glomerulären Struktur [83][84]. VEGF wird außerdem in der Tumorgenese für die Bildung neuer Blutgefäße benötigt. Eine Therapie mit Everolimus in der Situation eines humanen Nierenkarzinoms inhibiert die VEGF Expression und kann den Krankheitsverlauf verzögern [85]. Da mTOR auch an der Regulation von VEGF beteiligt ist, führt eine mTOR-Inhibition zu einer Hemmung von VEGF [43][65][86]. In unserer 5/6 Nephrektomie Studie wäre eine Reparatur des Endothels für den Erhalt der Filtrationsfähigkeit der Niere besonders wichtig. Die anti-angiogenetische Wirkung von Everolimus, durch Inhibierung von VEGF (mRNA und Protein) trägt darüber hinaus zu einer Hemmung der EndothelzellReparatur bei und fördert die Defektheilung. Regina Vogelbacher Seite 72 von 126 4 Diskussion 2010 4.2.2 Die Art des glomerulären Schadens bestimmt die Effektivität einer mTOR-Inhibition Im akuten reversiblen Anti-Thy1 Modell der Ratte verzögerte die frühe Verabreichung von Everolimus die Reparatur einer komplexen glomerulären Läsion [43]. Hier dient v.a. die endotheliale Reparatur als strukturelle Grundlage für eine koordinierte Regeneration des Mesangiums. Die Behandlung mit Everolimus (1-3 mg/kg KG) in der Proliferationsphase führte in 30 % der Glomeruli zu einer Defektheilung der glomerulären Architektur. Besonders die Hemmung der Endothelzell-Proliferation scheint ein kritischer Faktor im Heilungsprozess zu sein. Eine niedrige Dosis von Everolimus (0,3 mg/kg KG), bei der die Proliferation des Mesangiums aber nicht die des Endothels inhibiert wurde, führte nicht zu einer nachteiligen Defektheilung. Die mit niedriger Dosis behandelten Tiere hatten 13 Tage nach Modellinduktion eine bessere Nierenfunktion und zeigten histologisch deutlich weniger Mikroaneurysmen und Glomeruli mit veränderter Struktur [43], als Tiere mit einer höheren Dosis (1-3 mg/kg KG). Die zugrunde liegenden Mechanismen einer Defektheilung unter Everolimus-Therapie im reversiblen Anti-Thy1 Modell ähneln den Mechanismen im 5/6 Nephrektomiemodell. In diesem kommt es nach Modellinduktion zu einer kontinuierlichen Schädigung des Endothels sowie des Mesangiums. Die Reparatur wird durch Everolimus verzögert, eine vermehrte Defektheilung mit einem hohen Anteil an alterierten und ballonierten Glomeruli ist die Folge. Ob es unter mTOR-Inhibition zu negativen Folgeerscheinungen kommt, liegt hauptsächlich an der genauen Art des Nierenschadens. Everolimus selbst ist nicht nephrotoxisch. Gesunde Ratten, die für 33 Tage mit Everolimus (3 mg/kg KG) behandelt wurden, zeigten keine Veränderungen der Niere bzw. in der Nierenfunktion [43]. Es kam auch zu keinerlei nachteiligen Effekten unter Everolimus wenn sich die Schädigung nur auf das Mesangium [43] oder nur auf das Endothel [41] beschränkte. Unsere Arbeitsgruppe konnte außerdem bereits eine positive Beeinflussung des Krankheitsverlaufs durch Everolimus in einem chronischen Anti-Thy1 Modell der Ratte zeigen [65]. In der akuten proliferativen Phase nach Modellinduktion kam es zu einer weitgehenden Restaurierung von Mesangium und Endothel, die etwa 14 Tage dauerte. Mit der Everolimus Behandlung wurde erst nach dieser akuten Regina Vogelbacher Seite 73 von 126 4 Diskussion 2010 proliferativen Phase begonnen. Drei Monaten nach Modellinduktion zeigte die mit Everolimus-behandelte Tiergruppe im chronischen Anti-Thy1 Modell weniger FSGS Läsionen, interstitielle Fibrose und eine geringere Proteinurie im Vergleich zur unbehandelten Kontrollgruppe [65]. Unsere Ergebnisse mit Everolimus und den verschiedenen experimentellen Tiermodellen impliziert eine gewisse Instabilität der glomerulären Architektur, sobald Endothel und Mesangium gleichzeitig geschädigt werden. Diese Situation liegt im 5/6 Nephrektomiemodell vor, in dem wir sowohl einen endothelialen als auch einen mesangialen Schaden feststellten. Der hohe prozentuale Anteil an ballonierten (20%), kollabierten oder anderweitig stark veränderten Glomeruli in der Everolimus-behandelten Gruppe ist offensichtlich auf eine fehlerhafte Regeneration des Endothels und des Mesangiums zurückzuführen. Interessanterweise gibt es neben diesem Anteil an Glomeruli mit Everolimusinduziertem Schaden, eine verbleibende Gruppe an Glomeruli mit intakter Struktur. Diese erscheinen sogar „gesünder“ als die Glomeruli der Placebobehandelten Gruppe zu sein, zeigen sie doch keine Anzeichen von Hypertrophie, Hyperzellularität oder eine Matrixverbreiterung. Unsere Interpretation steht mit experimentellen Studien anderer Arbeitsgruppen im Einklang, wie der Aminonukleosid-Nephritis [70], dem Modell der Quecksilberinduzierten Glomerulopathie [87] und dem Heymann-Nephritis Modell [45]. In diesen Studien war eine mTOR-Inhibition für den Krankheitsverlauf von Vorteil. Allerdings kommt es in keinem der oben genannten Modelle zu einer gleichzeitigen Schädigung des Endothels und des Mesangiums. Somit bestand auch nicht die Notwendigkeit einer komplexen glomerulären Reparaturreaktion wie in unserer Studie des 5/6 Nephrektomiemodells. Das Hauptaugenmerk all dieser Studien lag auf den Podozyten, die durch mTOR-Inhibition evtl. geschützt werden. Die Arbeitsgruppe um Diekmann et al., hat sich ebenfalls intensiv mit den Auswirkungen einer mTOR-Inhibition im 5/6 Nephrektomiemodell der Ratte beschäftigt [88][89]. In einer dieser Studien wurde eine Behandlung mit Everolimus erst sechs Wochen nach Modellinduktion begonnen, also zu einem Zeitpunkt bei dem Mesangium und Endothel bereits eine proliferative Phase durchschritten haben und die glomeruläre Architektur zum Teil wieder hergestellt bzw. an die Nierenmassenreduktion adaptiert ist [88]. Die späte mTOR-Inhibition Regina Vogelbacher Seite 74 von 126 4 Diskussion konnte eine 2010 Proteinurie, Glomerulosklerose und interstitielle Fibrose abschwächen. In einer weiteren Studie dieser Arbeitsgruppe wurde die Behandlung bereits vor Modellinduktion begonnen. Hier wurde die glomeruläre Hypertrophie und Proteinurie-Entwicklung durch Sirolimus unterbunden [89]. Leider gibt die zweite Studie keine Aussage über die Proteinurie-Entwicklung direkt nach Modellinduktion, hier wurde die Proteinurie der Tiere zum ersten Mal fünf Wochen nach Induktion der 5/6 Nephrektomie erfasst. Diese beiden Studien unterscheiden sich von der unseren ganz entschieden. Zum einen wurde die Nierenmasse durch Kryoablation reduziert, eine Methode bei der es im weiteren Verlauf des Modells nicht direkt zu einem Blutdruckanstieg kommt, wie in unserem Modell gezeigt. Die Blutdruckerhöhung in unserer Studie führt zu einer Verschärfung des glomerulären Schadens und zu einem ausgeprägteren Nephronenverlust, v.a. in der Anfangsphase nach Modellinduktion. Zum anderen wurden die Tiere mit einer geringeren mTOR-Inhibitor Dosis behandelt (1 mg/kg KG intra peritoneal; 3-mal pro Woche). Vermutlich beruhen die positiven Effekte der mTOR-Inhibition in diesen beiden Studien auf der geringeren Proliferationshemmung, da die verwendete Dosis in diesen Experimenten 7-mal niedriger als in unserer Studie ist. Die Mechanismen unserer Studie und dieser beiden Studien lassen sich nur schwer, wenn überhaupt miteinander vergleichen. Natürlich sollte man auch die Grenzen unseres Modelles nicht außer Acht lassen. Obwohl unsere experimentellen Ergebnisse ähnliche Mechanismen des Nephronenverlustes aufzeigen wie sie nach Nierentransplantation im Menschen oder in Nierenerkrankungen vorkommen, lassen sich die Erkenntnisse nicht eins zu eins in eine klinische Situation übertragen. Die Hemmung von mTOR im Menschen führt bevorzugt zu Problemen, wenn die Nierenfunktion bereits eingeschränkt ist (GFR unter 40 ml/min bei chronisch geschädigten Transplanten) oder bereits eine Veränderung der glomeruläre Architektur vorliegt (wie z.B. mesangialproliferative Glomerulonephritis, Transplantatglomerulopathie, FSGS oder IgA-Nephropathie). Im Patienten kann es durch andere Medikamente wie z.B. Calcineurin-Inhibitoren und ACE-Hemmer, zu einer weiteren Verstärkung der Wirkung der mTOR-Inhibition kommen. Unsere Ergebnisse im 5/6 Nephrektomiemodell in der Ratte zeigen, dass eine mTOR-Inhibition eine Proteinurie, Glomerulosklerose und interstitielle Fibrose Regina Vogelbacher Seite 75 von 126 4 Diskussion 2010 hervorrufen und die Nierenfunktion verschlechtern kann. Dabei lassen unsere Untersuchungen in erster Linie die Hemmung der VEGF vermittelten Reparatur der Kapillaren und die generelle Proliferationshemmung von Everolimus als Ursache für eine Defektheilung der glomerulären Schädigung vermuten. Die unter mTOR-Inhibition verzögerte Heilung des komplexen Schadens, der Endothel wie auch Mesangium betrifft, scheint für die negative Entwicklung des Krankheitsverlaufes verantwortlich zu sein. Bei einer bereits vorhandenen Reduktion der Nephronenanzahl im Patienten wäre es deshalb vorstellbar, vorab eine histologische Einstufung des Schädigungstypes und –grades vorzunehmen, bevor es zu einer Behandlung mit mTOR-Inhibitoren kommt. Leider ist es aber derzeit noch nicht möglich, aufgrund der histologischen Veränderungen bei menschlichen Transplantaten, eine Vorhersage für ein Ansprechen oder Versagen eines Wechsels der Therapie auf einen mTOR-Inhibitor zu treffen. Regina Vogelbacher Seite 76 von 126 4 Diskussion 4.3 2010 mTOR- und Proteasomen-Inhibition wirken sich positiv auf die humorale Abstoßung nach Transplantation aus Das Entstehen einer humoralen Immunantwort gegen das Nierentransplantat ist neben einem kontinuierlichen Nephronenverlust ein weiterer wichtiger Faktor für eine chronische Verschlechterung der Transplantatfunktion. Das F344-LEW Tiermodell ist dazu geeignet einen chronischen Krankheitsverlauf nachzustellen. Unser Versuch verlief hinsichtlich Proteinurie und Sterblichkeit der Tiere vergleichbar mit anderen Studien. White et al., beschrieb dieses Modell 1969 zum ersten Mal [25] und zeigte eine natürliche Sterblichkeit von 20 % nach 12 Wochen. Auch in unserem Modell lag die Sterblichkeit der Placebo-behandelten Gruppe nach 12 Wochen bei etwa 20 %. Oftmals sind Veröffentlichungen des F344-LEW Modells nicht einfach miteinander vergleichbar. Ein Faktor der oftmals nicht erwähnt wird ist die kalte Ischämiezeit des Transplantats. Generell gilt je länger die kalte Ischämiezeit, desto heftiger verläuft das Tiermodell. Bei einer kalten Ischämiezeit von 5 Stunden kommt es zu einer Sterblichkeit von 33 % zum Tag 15 und 76 % zum Tag 120 [90]. Bei einer kalten Ischämiezeit von 24 Stunden und dem Entfernen beider nativer Nieren zum Transplantationszeitpunkt kommt es sogar zu einer Sterblichkeit von 77 % zum Tag 10 [91]. In unserem Modell betrug die kalte Ischämiezeit im Mittel 50 Minuten. Die genauen Prozesse in der Niere während dieser Zeit sind nicht geklärt, vermutlich kommt es zu einer Hochregulation von verschiedenen Adhäsionsmolekülen auf den Endothelzellen, die eine Abstoßungsreaktion begünstigen. Die stattfindende humorale Abstoßungsreaktion im F344-LEW Modell beruht wahrscheinlich auf der Produktion von Antikörpern gegen Moleküle die nicht vom MHC-Genlokus kodiert werden, wie Komponenten der GBM [28] oder Mesangiumzellen [29]. Um den Einfluss einer mTOR-Inhibition und einer Proteasomen-Inhibition auf die humorale Immunantwort nach Nierentransplantation zu untersuchen, haben wir Sirolimus und Bortezomib im F344-LEW Modell der Ratte eingesetzt. Mit der Behandlung haben wir erst in der 3. Woche nach Transplantation begonnen, d.h. zu einem Zeitpunkt bei dem bereits eine humorale Immunantwort mit gegen das Transplantat gerichteten Antikörpern nachweisbar ist. Regina Vogelbacher Seite 77 von 126 4 Diskussion 2010 4.3.1 Der Einfluss von Sirolimus auf die humorale Abstoßungsreaktion Sirolimus ist ein nicht-nephrotoxisches Immunsuppressivum, das spezifisch die intrazelluläre Kinase mTOR hemmt. In unserer Studie inhibierte Sirolimus wirkungsvoll das weitere Voranschreiten der chronischen glomerulären, tubulointerstitiellen und vaskulären Veränderungen im F344-LEW Modell der Ratte. Unser Experiment zeigt, dass Sirolimus in der Lage ist eine bereits existierende humorale Immunantwort zu kontrollieren. Durch die Behandlung mit Sirolimus kommt es zu einer Reduktion der gegen Spender-GBM gerichteten zirkulierenden Alloantikörper und zu weniger C4d Ablagerungen in den peritubulären Kapillaren des Organs. Die Sirolimus Behandlung reduzierte die Anzahl an B-Zellen im Transplantat und im Knochenmark, hatte aber unerklärlicherweise keinen Einfluss auf die B-Zell-Population in der Milz. Die Anzahl an Plasmazellen, die Quelle der Antikörper-Produktion, wurde durch Sirolimus sowohl im Knochenmark als auch in der Milz signifikant verringert. In einer kürzlich veröffentlichten Studie inhibierte Sirolimus auf beeindruckende Weise sowohl die Proliferation als auch die Immunglobulin-Produktion in humanen B-Zellen in vitro v.a. durch Induktion der Apoptose [51]. Desweiteren wurde bereits gezeigt, dass durch mTOR-Inhibition die anti-DNA Antikörper-Produktion und Nephritisausbildung in Lupus-veranlagten Mäusen [92][93] reduziert werden kann. Unsere Ergebnisse der mTOR-Inhibition im F344-LEW Modell stehen im Einklang mit einer Studie, in der Sirolimus die Bildung von anti-Pferd-Antikörpern nach Nierentransplantation im Menschen hemmt. Diese Patienten wurden zuvor mit anti-Thymozytenglobulin aus dem Pferd behandelt [94]. In einem anderen experimentellen Transplantationsmodell mit sensibilisierten Ratten verbesserte der mTOR-Inhibitor Everolimus die chronische Transplantatnephropathie. In dieser Studie wurde mit einem modifizierten F344LEW-Modell mit athymischen LEW-Ratten und dem Transfer von konditionierten T-Lymphozyten gearbeitet. Everolimus konnte die Entstehung von anti-MHC Klasse I Antikörpern in diesem Modell nicht gänzlich verhindern, obwohl die Autoren eine Reduktion der Antikörpermenge im Vergleich zur Kontrollgruppe berichteten [27]. Dieses Modell unterscheidet sich deutlich von unserem bezüglich der Mechanismen der chronischen Abstoßung und des Zeitverlaufs. Regina Vogelbacher Seite 78 von 126 4 Diskussion 2010 Während es in unserem Transplantationsmodell nicht möglich ist, anti-MHC Antikörper zu messen, liegt die Stärke unserer Studie in der kombinierten Analyse von chronischen Veränderungen im Spenderorgan und den Analysen der Zellpopulationen der Milz und des Knochenmarks des Empfängers. Auch wenn unsere Daten keine sichere Unterscheidung zulassen, vermuten wir bei Sirolimus eine Beeinflussung der Antikörper-Produktion v.a. durch die Inhibierung der Plasmazell-Vorläufer und deren weiterer Entwicklung zu reifen Plasmazellen. Zusätzlich wurden durch Sirolimus viele andere Zelltypen, die in der Immunabwehr eine Rolle spielen wie MHC II positive Zellen, Monozyten, Makrophagen, B-Zellen und zytotoxische T-Zellen, jedoch nicht die T-Helferzellen, vor der Infiltrierung in das Spenderorgan gehemmt. Bezüglich der T-Lymphozyten wurden diese Ergebnisse durch die Analyse der T-Zell-Subpopulationen (CD4/CD8) in der Milz des Empfängers bestätigt. Dass eine mTOR-Inhibition zu einer Erhöhung der regulatorischen T-Zellen führen kann, ist bereits bekannt [95][96][97]. Entsprechend zu anderen Studien erhöhte Sirolimus den prozentualen Anteil an CD4+CD25+ regulatorischen T-Zellen Verschiebung des Verhältnisses in der Milz des zwischen Empfängers. regulatorischen T-Zellen Die zu T-Helferzellen lässt einen weiteren positiven Effekt von Sirolimus hinsichtlich einer Unterdrückung der entstehenden Immunantwort gegen das Spenderorgan vermuten. In einem experimentellen Modell der autoimmunen Enzephalomyelitis konnte durch Sirolimus der Anteil an regulatorischen T-Zellen im relativen Verhältnis zu den Effektor-T-Zellen erhöht werden, wodurch der Krankheitsverlauf gemildert wurde [98]. 4.3.2 Der Einfluss von Bortezomib auf die humorale Abstoßung Der Proteasom-Inhibitor Bortezomib hat sich bei der Behandlung des Multiplen Myeloms bewährt. Bortezomib beeinflusst verschiedene Zellvorgänge. Dies beinhaltet die Inhibition von NF-κB und verschiedener Zytokine, sowie eine Induktion der Zellapoptose durch Aktivierung der terminalen Unfolded Protein Response nach Stress des Endoplasmatischen Retikulums (ER) [58]. Plasmazellen reagieren besonders sensibel auf Bortezomib. Durch die hohe Immunoglobulin-Synthese kommt es im ER der Plasmazellen zu einer Akkumulation von ungefalteten Proteinen. Kann die Zelle diesen Stress nicht Regina Vogelbacher Seite 79 von 126 4 Diskussion 2010 abbauen und wird durch Bortezomib sogar noch im Proteinabbau durch die Proteasomen gehemmt, kommt es zur Induktion des programmierten Zelltods [58]. Die Arbeitsgruppe um Reinhard Voll konnte außerdem zeigen, dass nicht nur maligne Plasmazellen sondern auch autoreaktive Plasmazellen, welche in einem Maus-Stamm mit einer Lupus-ähnlichen Erkrankung Antikörper gegen doppelsträngige DNA produzieren, durch Bortezomib inhibiert werden [63]. Diese Ergebnisse ließen uns vermuten, dass alloreaktive Plasmazellen in einer akuten oder chronischen Abstoßungsreaktion ebenfalls auf eine Behandlung mit Bortezomib sensibel reagieren. In unserem Tiermodell der CAN, verhinderte Bortezomib die Progression der glomerulären, tubulointerstitiellen und vaskulären Veränderungen. Ebenso wie Sirolimus, verminderte Bortezomib die humorale Immunantwort, gezeigt durch Reduktion der zirkulierenden Antikörper gegen Spender-GBM und weniger C4d Ablagerung in den peritubulären Kapillaren des Transplantationsorgans. Die Reduktion bzw. Depletion der IgG-sezernierenden Zellen und Plasmazellen durch Bortezomib in Milz und Knochenmark war deutlich nachweisbar und vergleichbar mit der Reduktion dieser Zellen durch Sirolimus Behandlung. In kleineren Studien mit wenigen Transplantationspatienten, zeigte Bortezomib einen anti-humoralen Effekt während der akuten Abstoßungsphase nach Nierentransplantation [78][99]. Hier konnte Bortezomib langfristig die anti-HLA Antikörpermenge verringern ohne dabei die Transplantatfunktion zu verschlechtern [100]. Dieser Effekt von Bortezomib scheint jedoch nur voll zum Tragen zu kommen, wenn die Patienten gleichzeitig Steroide und eine Plasmapherese erhalten [100][101]. In unserem F344-LEW Modell wirkte Bortezomib nicht nur auf die humorale Abstoßungsreaktion durch Depletion der Plasmazellen, sondern konnte darüber hinaus auch den Einstrom an MHC Klasse II positiven Zellen sowie Monozyten, Makrophagen, B-Zellen, zytotoxischen T-Zellen und T-Helferzellen in das Transplantat verhindern. Wir können nicht feststellen, ob es sich dabei um einen direkten oder indirekter Effekt von Bortezomib handelt, vor allem da die CD4+CD25+ Subpopulation der T-Zellen in der Milz durch Behandlung nicht beeinflusst scheinen. Regina Vogelbacher Seite 80 von 126 4 Diskussion 2010 Allerdings zeigen andere Studien einen pro-apoptotischen Effekt von Bortezomib auf Monozyten, dendritische Zellen [59] und T-Zellen [60]. Diese Ergebnisse deuten auch auf einen direkten anti-inflammatorischen Effekt in unserem F344-LEW Transplantationsmodell der Ratte hin. Bortezomib wurde in unserem Tierversuch durchgehend zweimal pro Woche verabreicht. Im Multiplen Myelom erfolgt die Therapie des Patienten in Intervallen, d.h. der Patient erhält vier Injektionen über 11 Tage verteilt, gefolgt von einer 10-tägigen Pause. Im Falle einer Behandlung der chronischen Antikörpervermittelten Abstoßung nach Transplantation könnte ein Bortezomib Intervall als kurzfristige Einstiegstherapie zur Eliminierung der Plasmazellen eine Möglichkeit zur Behandlung darstellen. 4.3.3 Additiver oder synergistischer Effekt von Sirolimus und Bortezomib? Vor unserem Versuch vermuteten wir, dass Sirolimus vor allem auf die T-Zellen und Bortezomib mehr auf die humoralen Aspekte der Nierenabstoßung einwirken würden. Das beide Medikamente eine deutliche Überschneidung ihrer Wirkung auf humoraler und zellulärer Ebene der chronischen Abstoßung zeigen, war unerwartet. Die Kombination beider Medikamente scheint besonders geeignet für die Prävention und die Therapie der chronischen Transplantatnephropathie zu sein. In unserem Versuch kam es zwischen der Einzeltherapie und der Kombinationstherapie zwar nur in einigen Parameter zu einem signifikanten Unterschied (Anzahl der infiltrierenden MHC Klasse II positiven und B-Zellen im Transplantat, Reduktion der B-Zellen und IgG-sezernierenden Zellen im Knochenmark oder der Milz), dennoch war die Kombination Sirolimus/ Bortezomib zahlenmäßig immer die beste Therapie in den untersuchten Parametern. Deshalb kann man durchaus von einem additiven Effekt, wenn auch nicht synergistischem Effekt beider Medikamente sprechen. Dass es zwischen Sirolimus und Bortezomib zu einem additiven Wirkmechanismus kommt, lässt auch eine andere Studie vermuten, in der in vitro der Einfluss beider Medikamente auf verschiedene T-Lymphozyten untersucht wurde [102]. Die in unserem Versuch verwendeten Regina Vogelbacher Seite 81 von 126 4 Diskussion 2010 Dosen sind für Nagetiere etabliert. Additive oder synergistische Effekte würden sich bei suboptimalen Dosen sicher leichter nachweisen lassen. Erwähnenswert ist auch, dass es in der Milz nur zu einer Reduktion der CD4+ T-Zellen in der Kombination Sirolimus/ Bortezomib kommt. Die Subpopulation der regulatorischen T-Zellen ist in der Kombinationsgruppe sowie in der Sirolimus Gruppe erhöht. Dies spricht für eine selektive Stabilisierung der regulatorischen T-Zell-Population unter mTOR-Inhibition. Abschließend zeigt dieses Projekt, dass sowohl Sirolimus als auch Bortezomib in der Lage sind, eine bereits existierende humorale Abstoßung durch Depletion der Antikörper-produzierenden Zellen im F344-LEW Transplantationsmodell der Ratte einzudämmen. Beide Medikamente reduzieren die Menge an zirkulierenden Antikörpern gegen Spender-Epitope. Dies geht einher mit einer Verbesserung der glomerulären, tubulointerstitiellen und vaskulären Histologie des Transplantats. Unsere in vivo Ergebnisse deuten auf additive Effekte beider Medikamente hin, die auf die chronisch humorale Abstoßungsreaktion durch Eliminierung der B- und Plasmazellen, sowie auf die zellulären Komponenten der Immunantwort, wie T-Zell Subpopulationen einwirken. Diese Daten lassen vermuten, dass sowohl Sirolimus als auch Bortezomib effektiv zur Behandlung einer chronischen Antikörper-vermittelten Abstoßung eingesetzt werden könnten. Vor allem die Kombination aus Sirolimus und Bortezomib könnte ein günstiger Ansatz bei der Behandlung einer chronisch humoralen bzw. gemischten Abstoßungsreaktion sein, für die bis jetzt noch keine sichere Behandlungsmethode gibt. Regina Vogelbacher Seite 82 von 126 5 Material und Methoden 5 Material und Methoden 5.1 Tierversuche 2010 5.1.1 Versuchstiere Für die Versuche wurden Ratten der Stämme Sprague-Dawley, Lewis und Fischer verwendet. Sämtliche Tiere wurden von der Firma Charles-River, Sulzfeld bezogen und unter Artgerechten Bedingungen gehalten. Im Tierhaltungsraum wurde ein 12-stündiger Wechsel von Tag und Nacht simuliert. Die Tiere wurden in Makrolonkäfigen Typ IV gehalten und erhielten Standardfutter (Altromin 1324, Spezialfutterwerke GmbH, Lage) und Trinkwasser ad libitum. 5.1.2 Experimentelles Design des 5/6 Nephrektomiemodells Dieser Tierversuch wurde von der Nationalen Tieraufsichtsbehörde (Regierung von Mittelfranken: 621-2531.31-17/05) genehmigt. Es wurden 31 männliche Sprague-Dawley-Ratten mit einem Gewicht zwischen 180 und 220 g verwendet. Das 5/6 Nephrektomiemodell wurde in zwei Schritten induziert. Zuerst erfolgte eine Uninephrektomie der rechten Niere. Dazu wurde die Ratte mit Isofluran (3,5 % bis 2 % in Sauerstoff) sediert und die rechte Flanke des Tieres auf Nierenhöhe rasiert und desinfiziert. Danach wurden zuerst die Oberhaut, und dann die Unterhaut mit einer sauberen Schere durchschnitten. Die rechte Niere wurde weitestgehend vom umliegenden Fett befreit und die Nierenkapsel entfernt. Mit einem sterilen Baumwollfaden wurden Nierenarterie und Nierenvene am Nierenhilus abgebunden und anschließend wurde die rechte Niere vollständig entfernt. Die Unterhaut wurde mit einer kontinuierlichen Naht, die Oberhaut mit Einzelknopfnähten verschlossen. Eine Woche später wurden zwei der drei arteriellen Äste der verbleibenden linken Niere ligiert. Dazu wurde die Ratte wie bei der Uninephrektomie vorbereitet. Zwei der drei arteriellen Äste der Nierenarterie wurden vor ihrer Mündung in den Nierenhilus freipräpariert und mit einem 6-0 Monofilament ligiert. Novartis Pharamaceuticals (Basel, Schweiz) stellte die Mikroemulsionen zur oralen Verabreichung von Everolimus und Placebo zu Regina Vogelbacher Seite 83 von 126 5 Material und Methoden 2010 Verfügung. Diese Mikroemulsionen wurden im Versuch mit PBS auf die entsprechende Konzentration verdünnt. Placebo und Everolimus wurden einmal täglich mittels oraler Gavage in einer Dosis von 2,5 mg/kg Körpergewicht verabreicht. Diese Dosis führte zu einem Talspiegel im Blut von 8,1 ± 1,9 ng/ml Everolimus, bestimmt mit Hilfe der Tandem Massenspektrometrie. Dieser Wert ist vergleichbar mit den Ergebnissen anderer Studien [103]. Die Ratten wurden anhand ihrer Proteinurie am 3 Tag nach Uninephrektomie in zwei Gruppen unterteilt, eine Placebo behandelte Gruppe (n=14) und eine Everolimus behandelte Gruppe (n=17). Die Behandlung begann am dritten Tag nach Ligatur. Die Endbiopsie der Tiere fand zu zwei verschiedenen Zeitpunkten statt: 22 Tage nach Ligatur (jeweils 5 Tiere pro Gruppe) und am Tag 38 nach Ligatur (Everolimus n=9; Placebo n=7). Fünf Tiere verstarben während der Versuchszeit und wurden nicht für die Evaluierung des Versuches verwendet. Es wurden Urin- und Serumproben zur Bestimmung von Proteinurie, Urinkreatinin, Serumkreatinin und Serumharnstoff am 4 Tag vor Ligatur und an d12, d20, d32 und d37 nach Ligatur genommen. Außerdem wurde der systolische Blutdruck regelmäßig mittels Schwanzplethysmographie gemessen. 5.1.3 Experimentelles Design des Sirolimus Bortezomib Transplantations Projektes Dieser Tierversuch wurde von der Nationalen Tieraufsichtsbehörde (Regierung von Mittelfranken: 54-2532.1-31/08) genehmigt. Es wurden männliche Fischer (F344) und Lewis (LEW) Ratten mit einem Gewicht zwischen 200 und 250 g verwendet. F344 Ratten dienten als Nierenspender, die LEW Ratten waren Empfänger. Zum Vorgehen einer Nierentransplantation siehe Abschnitt 5.2. Die kalte Ischämiezeit betrug durchschnittlich 50 min, die warme Ischämiezeit 35 min. Die linke Niere der LEW Ratten wurde bei der Transplantation entfernt, die verbleibende rechte Niere wurde erst 10 Tage nach Transplantation entnommen. Um die Entstehung einer gegen das Transplantat gerichteten Alloantikörperantwort zu ermöglichen, gaben wir keine Immunsuppressiva in den ersten 3 Wochen nach Transplantation. Drei Wochen nach Transplantation wurden die Tiere in 4 Gruppen aufgeteilt und entweder mit dem Lösungsträgerstoff von Sirolimus als Placebo (P; n=10; Phosal 50PG von Phospholipid GmbH, Köln), Sirolimus (SRL; Regina Vogelbacher 1 mg/kg Körpergewicht; n=8; Rapamune von Wyeth Seite 84 von 126 5 Material und Methoden 2010 Pharmaceuticals, UK), Bortezomib (BZ; 0,2 mg/kg Körpergewicht; n=8; Velcade von Janssen-Cilag, Neuss) oder einer Kombination aus Sirolimus und Bortezomib (SRL/BZ; n=8) behandelt. Placebo und Sirolimus wurden täglich per oraler Gavage gegeben, Bortezomib wurde zweimal pro Woche intra venös verabreicht. Der Versuch wurde 12 Wochen nach Transplantation, also 9 Wochen nach Behandlungsbeginn beendet. Drei Tiere mussten wegen rapidem Gewichtsverlust und schlechter körperlicher Verfassung aus dem Versuch genommen werden (P-Tier d 45; BZ-Tier d 64 und SRL/BZ-Tier d 55). Drei weitere Tiere verstarben durch unbekannte Ursache über Nacht (P-Tier 60; SRL-Tier d 29 und BZ-Tier d 41). Ein Tier der BZ Gruppe musste aufgrund einer zu engen Anastomose am Übergang der Nierenvene in die Vena cava aus der Statistik ausgeschlossen werden. Somit gingen acht Tiere der Placebo, fünf Tiere der Bortezomib und jeweils sieben Tiere der Sirolimus und der Sirolimus/Bortezomib Gruppe in die statistische Auswertung des Versuches ein. Es wurden regelmäßig Urin- und Serumproben zur Bestimmung von Proteinurie, Urinkreatinin, Serumkreatinin und Serumharnstoff genommen (w 3 nur Serum; w 4, w 6, w 8, w 10 und w 12 nach Transplantation sowohl Urin als auch Serum). 5.2 Nierentransplantation an der Ratte 5.2.1 Allgemeine Vorgehensweise Die Ratte wird in einer Narkosebox bei 600 ml/min Sauerstoff mit 3,5 % Isofluran sediert. Die nachfolgende Operation erfolgt auf einem auf 37°C beheiztem Operationstisch. Abhängig von der Atemfrequenz der Ratte wird die Narkose bis auf 2 % Isofluran in Laufe der OP reduziert. Nachdem die Bauchpartie großzügig rasiert und desinfiziert wurde, wird die Haut mit einem medianen Schnitt von kurz oberhalb der Hüfte bis knapp über das Sternum mit einer Schere aufgeschnitten. Anschließend wird der Bauchraum entlang der weißen, sehnigen Linea alba zwischen den geraden Bauchmuskeln mit einer Schere auf der oben erwähnten Länge geöffnet. Mit Hilfe von vier Haken wird die Abdominalhöhle auf gespreizt. Beim Empfänger werden dabei die Wundränder mit in physiologischer NaCl-Lösung getränkten Tüchern sorgfältig bedeckt, um ein Austrocknen zu verhindern. Der gesamte Darm (Dünndarm, Caecum und Dickdarm) wird in ein gut mit NaCl-Lösung durchfeuchtetes Tuch verpackt und auf die rechte Körperhälfte Regina Vogelbacher Seite 85 von 126 5 Material und Methoden 2010 verlegt. Dazu muss auch das dünne Häutchen, welches den unteren Teil des Dickdarms (Colon descendens und Mastdarm) in der Körpermitte festhält, durchtrennt werden. Dieses Tuch sollte während der OP mehrmals mit frischer NaCl-Lösung befeuchtet werden. 5.2.2 Explantation Zur Explantation der linken Niere werden alle abgehenden Gefäße der Aorta und Vena cava oberhalb und unterhalb der linken Niere (in Abb. 25 rot unterlegt) mit einem 6-0 Monofilament ligiert. Darüber hinaus werden auch die zum Rückenmark abgehenden Gefäße ligiert. Es sollte möglichst viel Fettgewebe um die Niere und den Ureter belassen bleiben, um eine bessere Funktionalität im Empfänger zu gewährleisten. Der Ureter wird auf halber Strecke zur Blase durchtrennt und mit einem 10-0 Monofilament markiert. Anschließend wird die Niere so präpariert, dass sie nur noch an Nierenarterie und Nierenvene mit dem Tier verbunden ist. Die Aorta wird nun zuerst oberhalb, dann unterhalb der Nierenarterie mit einer atraumatischen Klammer abgeklemmt. Anschließend wird die Vena cava erst unterhalb, dann oberhalb der Nierenvene abgeklemmt. Die Nierenvene wird entlang ihrem Übergang in die Vena cava durchtrennt, um beim Spülen mit Konservierungslösung den Druck auf das Organ zu minimieren. Es erfolgt sogleich das Spülen der Niere mit mindestens 1 ml eisgekühlter Viaspan-Lösung (Organkonservierungslösung) über die Aorta. Die Nierenarterie wird mit einem „Patch“ abgeschnitten und die Niere bis zur Implantation in eisgekühlter ViaspanLösung aufbewahrt. Regina Vogelbacher Seite 86 von 126 5 Material und Methoden 2010 Abb. 25 Überblick über den abdominalen Blutkreislauf einer Ratte Die Abbildung wurde dem Buch „The Laboratory Rat“ von Georg J. Krinke, erschienen in Academic Press, 2000 entnommen. 5.2.3 Implantation Um die Spenderniere heterotroph „end-to-side“ zu implantieren, werden alle abgehenden Gefäße der Aorta und Vena cava unterhalb der nativen linken Niere ligiert (ca. 2 cm). Die Vena cava und Aorta selbst, werden so freipräpariert, dass sie weitestgehend voneinander getrennt vorliegen. Vor den Anastomosen wird zuerst die Aorta oben und unten und danach die Vena cava unten und oben mit atraumatischen Klammern abgeklemmt. Das Spenderorgan wird in ein mit eiskaltem Viaspan getränktes Tuch gewickelt und in das Empfängertier gelegt. Dann wird in die Aorta ein Schlitz geschnitten dessen Länge der Öffnung des „Patches“ entspricht und die Aorta mit Viaspan-Lösung gespült. Nach Möglichkeit sollte immer der posteriore Teil des „Patches“ angenäht werden, da hierbei die Nierenvene praktisch automatisch in eine ideale Position gerückt wird. Der Regina Vogelbacher Seite 87 von 126 5 Material und Methoden 2010 „Aortenpatch“ wird mit einem 9-0 Monofilament und Einzelknopfnähten zuerst anterior und posterior fixiert und dann mit weiteren Einzelknopfnähten (jeweils mindestens 5 Stück) erst an der Vorderseite, dann an der Hinterseite angenäht. Um die Hinterseite anzunähen, wird das Organ mitsamt seiner Tuchverpackung einmal nach links verlegt. Die Nadelführung ist beim Annähen immer von außerhalb des Gefäßes nach innen und von innerhalb wieder nach außen. Das andere Ende des „Patches“ wird durch einen Knoten mit einem 6-0 Monofilament verschlossen. Um die Nierenvene anzunähen wird zuerst ein entsprechend langer Schlitz in die Vena cava geschnitten und diese mit Viaspan-Lösung gespült. Beachtet werden sollte, dass die Vene sich mit Blut gefüllt noch ausdehnen wird und die Nahtstelle keinesfalls zu eng angelegt werden darf. Die Nierenvene wird mit einer fortlaufenden Naht an die Vena cava genäht. Dabei wird die Vene zuerst mit einem Knoten am posterioren Ende des Schlitzes fixiert. Dann wird die Rückwand mit einer fortlaufenden Naht angenäht. Dabei sollten für eine normale Vene drei bis vier Stiche genügen. Der Faden wird am anterioren Ende mit etwa 1 cm Überhang abgeschnitten. Für die Vorderseite wird die Vene zuerst mit einem festen Knoten anterior an der Vena cava fixiert und dann mit einer fortlaufenden Naht nach posterior festgenäht. Wieder wird der Faden mit ca. 1 cm Überhang abgeschnitten. Anschließend werden die atraumatischen Klammern in umgekehrter Reihenfolge als beim Abklemmen geöffnet. Die Niere sollte nun sehr rasch wieder gleichmäßig durchblutet sein und eine gesunde Farbe annehmen. Die Anastomose der Nierenvene kann anhand der überhängenden Fäden bei Bedarf noch leicht manipuliert werden. Nun wird der Harnleiter des Spenderorgans „end-to-end“ an den ursprünglichen linken Harnleiter mit einem 10-0 Monofilament mit 3 bis 4 Stichen angenäht. Die Nahtstelle sollte auf halber Strecke zwischen Niere und Harnblase liegen und der Harnleiter sollte noch genügend Spielraum für seine natürliche Peristaltik haben. Zuletzt wird noch die ursprüngliche linke Niere (die nun keinen Abgang mehr in die Harnblase hat) entfernt. Der Darm wird wieder in das Tier gelegt und die Bauchdecke mit einer durchgehenden Naht, die Haut mit Einzelknopfnähten Regina Vogelbacher Seite 88 von 126 5 Material und Methoden 2010 verschlossen. Um eine eventuelle Verkühlung des Tieres entgegenzuwirken sollte die Ratte unter einer Wärmelampe aus der Narkose erwachen. Die kalte Ischämiezeit, also die Zeit zwischen Explantation und Beginn der Anastomosen kann je nach Modell variiert werden. Die warme Ischämiezeit, also die Zeitspanne die für die Anastomosen selbst benötigt wird, bevor das Organ wieder durchblutet ist, sollte möglichst kurz sein und keinesfalls 45 min überschreiten. 5.3 Gewinnung und Analyse von Probenmaterial 5.3.1 24 h Sammelurin Die Tiere wurden einzeln für 24 h in metabolische Stoffwechselkäfige gesetzt. Dabei stand jedem Tier ausreichend Wasser und Futter zur Verfügung. Die gesammelte Urinmenge wurde notiert und ein Teil des Urins wurde bis zur weiteren Analyse bei -20°C gelagert. 5.3.2 Serumgewinnung Mit einer Kanüle (Gr.16, blau) wurde eine der lateralen Schwanzvenen punktiert und das austretende Blut in einem Reaktionsgefäß gesammelt. Anschließend wurden die zellulären Bestandteile des Blutes für 10 min bei 8000 rpm sedimentiert und das im Überstand befindliche Serum abpipettiert. Die Proben wurden bei -20°C gelagert. 5.3.3 Proteinbestimmung im Urin Die Bestimmung der Proteinurie erfolgte mittels des BioRad Protein Kits (BioRad, München) nach Angaben des Herstellers. Als Standard wurde BSA in Konzentrationen von 10 bis 500 µg/ml verwendet. Dieser Test beruht auf der Proteinbestimmung nach Bradford. Es wurden 10 µl Standard oder Probe mit 200 µl Bio-Rad Reagenz in die Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen pipettiert. Die Bestimmung (Doppelbestimmung) der Proteinmenge erfolgte durch Auslesen der Absorption bei 595 nm an einem Mikrotiterplatten-Photometer. Regina Vogelbacher Seite 89 von 126 5 Material und Methoden 2010 5.3.4 Bestimmung von Serum- und Urinkreatinin und Serumharnstoff Kreatinin im Serum und Urin und Serumharnstoff wurden mit einem automatischen Analysegerät (Beckmann Instruments GmbH, München) ermittelt. Diese Analyse wurde im Chemielabor der Kinderklinik Erlangen durchgeführt. 5.3.5 Ermittlung der Kreatinin-Clearance Die Berechnung der Kreatinin-Clearance erfolgte nach folgender Formel: 24ℎ ÷ ℎ 1440 − × − = ⁄⁄ 5.3.6 Isolierung der Glomeruli Nach Entnahme der Niere wurden die Nierenkapsel und das Mark entfernt und die Niere in ein mit eiskaltem PBS gefülltes 50 ml Reaktionsgefäß überführt. Die anschließenden Schritte fanden in einem Kühlraum bei 4°C statt. Der Nierencortex wurde mit einer Rasierklinge in etwa 0,5 mm³ große Stücke gehackt und dann mit einem Stößel unter kontinuierlichem Spülen mit PBS durch ein Sieb der Maschengröße von 106 µm² gedrückt. In dem darunter befindlichen Sieb mit einer Maschengröße von 180 µm² wurden größere Verunreinigungen v.a. Bruchstücke der Tubuli aufgefangen. Die Glomeruli sammelten sich auf einem dritten Sieb mit einer Maschengröße von 75 µm². Kleiner Kontaminationen wurden durch alle Siebe gewaschen. Die gesammelten Glomeruli wurden in ein steriles 50 ml Reaktionsgefäß überführt und mittels Zentrifugation (1000 rpm, 5 min) verdichtet. Der Überstand wurde entfernt und die Glomeruli in verschiedene Puffer für spätere Analysen (Real-Time PCR, Western Blot) portioniert. Die Proben wurden bei -70°C gelagert. 5.4 Aufbereitung der Gewebe für die Immunhistochemie 5.4.1 Prozessieren der Biopsien Die Niere wurde nach der Entnahme in mehrere Stücke zerteilt. Ein Teil wurde als Gefriergewebe in Tissue Tek (Lab-Tek Products, Naperville, USA) eingebettet und Regina Vogelbacher Seite 90 von 126 5 Material und Methoden 2010 in flüssigem Stickstoff zunächst schockgefroren, um anschließend bei -70°C gelagert zu werden. Alternativ wurden Gewebestücke in Methyl Carnoy, Paraformaldehyd oder Zinklösung für mindestens 24 h fixiert. Danach wurden die Gewebe wie in den folgenden Tabellen beschrieben prozessiert und danach mit einer Ausblockeinheit in Paraffinblöcke gegossen. Methyl Carnoy Lösung (MC) 60 % Methanol 30 % Chloroform 10 % Eisessig Die MC Lösung wurde bei 4°C gelagert und innerhalb von 6 Monaten verwendet. Paraformaldehyd (PFA) 3 g Paraformaldehyd wurden in 100 ml PBS bei 60°C im Wasserbad gelöst. Diese Lösung wurde bei 4°C im Dunkeln gelagert und innerhalb einer Woche aufgebraucht. Zinklösung (ZN) 0,5 g Calciumacetat 5 g Zinkacetat 5 g Zinkchlorid Ad 1000 ml 0,1 M Trispuffer pH 7,4 Die Lösung wurde bei 4°C bis zur Verwendung gelagert. Regina Vogelbacher Seite 91 von 126 5 Material und Methoden 2010 Tab. 1 Prozessierschema für MC- und PFA-fixiertes Gewebe Tag 1 Tag 2 Tag 3 MC PFA 24 h 70 % Methanol Isopropanol 40 min (oder länger) 80 % Methanol Isopropanol 40 min 96 % I Methanol Isopropanol 40 min 96 % II Methanol Isopropanol 40 min 100 % I Isopropanol 40 min 100 % II Isopropanol 40 min 100 % III Isopropanol ü.N. bei RT 100 % Isopropanol 1 h 60°C Isopropanol-Paraffin (1:1) 1 h 60°C Paraffin I 2 h 60°C Paraffin II 2 h 60°C Paraffin III 2 h 60°C Tab. 2 Prozessierschema für ZN-fixiertes Gewebe Tag 1 Tag 2 ZN ü.N. 4°C 70 % Ethanol 1 h (oder länger) 90 % Ethanol 1h 95 % Ethanol 1h 100 % I Ethanol 1h 100 % II Ethanol 1h 100 % I Xylol 50 min 100 % II Xylol 50 min Tag 3 Regina Vogelbacher Paraffin I 2 h 60°C oder ü.N. Paraffin II 2 h 60°C Paraffin III 2 h 60°C Seite 92 von 126 5 Material und Methoden 2010 5.4.2 Anfertigung der Paraffinschnitte Zunächst wurden die Paraffinblöcke mittels einer Kühlplatte auf -10°C gekühlt. Die Blöcke wurden dann in ein Rotationsmikrotom eingespannt und Gewebeschnitte mit 2 µm Dicke angefertigt. Die Schnitte wurden zum Strecken in ein Wasserbad mit 45°C überführt und dann auf Objektträger aufgezogen. Danach wurden die Objektträger zum Abschmelzen des Paraffins für 20 min in einen Wärmeofen mit 60°C gestellt. 5.4.3 Anfertigen der Schnitte aus Gefriergewebe Die Gewebe wurden hierfür auf -20°C erwärmt. Im Gefriermikrotom wurden 5 µm dicke Schnitte angefertigt, auf Super Frost Objektträger aufgezogen und für 10 min in -20°C kaltem Aceton fixiert. Nach 10 min Lufttrocknen wurden die Objektträger einzeln in Alufolie verpackt und bis zur weiteren Verwendung bei -70°C gelagert. 5.5 Immunhistologische Färbungen Als Immunhistochemie (IHC) wird eine Methode bezeichnet, mit der Proteine mit Hilfe von Antikörpern sichtbar gemacht werden können. Der Nachweis beruht auf der Affinität von Antikörpern (Ak) zu einem bestimmten Epitop. 5.5.1 Immunperoxidasefärbung an MC-, PFA- und ZN-fixiertem Gewebe Die Gewebeschnitte wurden für 3 x 5 min in Xylol entparaffiniert, anschließend in einer absteigenden Alkoholreihe rehydriert (3 x 3 min 100 % Ethanol, 2 x 2 min 95 % Ethanol, 1 x 70 % Ethanol) und danach für 20 min mit 3 % H2O2/ Methanol zum Blocken der endogenen Peroxidase inkubiert. Danach folgte ein Waschschritt (3 x 3 min TBS). Nun wurden die Gewebeschnitte mit einem Fettstift umkreist und der verdünnte Primärantikörper (entsprechende Verdünnung in 1 % BSA/ TBS) auf das Gewebe aufgebracht. Die Inkubation erfolgte in einer feuchten Kammer bei 4°C über Nacht. Am nächsten Tag wurden die Gewebe mit einem entsprechenden Biotin-konjugiertem Sekundärantikörper (1:500 Verdünnung in 1 % BSA/ TBS, 30 min, RT), und anschließend mit Avidin-D-Peroxidase (1:2000 Regina Vogelbacher Seite 93 von 126 5 Material und Methoden 2010 Verdünnung in 1 % BSA/TBS, 30 min, RT) inkubiert (beides Vector Laboratories, Burlingame, USA). Zwischen jeder dieser Inkubationen wurden die Gewebe 3 x 3 min in TBS gewaschen. Als Substrat/ Chromogen wurde 3,3-Diaminobenzidin (DAB; Vector Laboratories, Burlingame, USA) verwendet. Dieses wurde nach Herstellerangaben angesetzt und für genau 10 min bei RT auf den Schnitten belassen. Anschließend wurden die Schnitte für 5 min in Aqua dest. gestellt. Als Gegenfärbung der Zellkerne wurde Hämatoxylin III nach Gill (Merck, Darmstadt) verwendet. Nach kurzem Eintauchen in Hämatoxylin (ca. 2 sec) wurden die Gewebe für 10 min unter laufendem Leitungswasser gebläut. Danach wurden die Schnitte mittels einer aufsteigenden Alkoholreihe dehydriert (1 x 2 min 70 % Ethanol, 2 x 2 min 95 % Ethanol, 3 x 3 min 100 % Ethanol) und 3 x 5 min in Xylol inkubiert, bevor sie mit Entellan (Merck, Darmstadt) eingedeckt wurden. Änderungen bei Doppelfärbungen: Sollte noch ein zweites Antigen gefärbt werden, so wurden die Schnitte nach der DAB-Farbreaktion erneut für 20 min mit 3 % H2O2/ Methanol zum Blockieren der verbliebenen Peroxidase inkubiert. Danach wurden die Schnitte für jeweils 10 min mit dem Biotin/ Avidin Blocking Kit (Vector Laboratories, Burlingame, USA) behandelt. Anschließend erfolgte nacheinander die Inkubation mit Primärantikörper, dem entsprechenden Biotin-gekoppelten Sekundärantikörper bzw. der Avidin-D-Peroxidase. Die Färbereaktion erfolgte mit dem Histogreen Substrat (Linaris, Wertheim-Bettingen) für maximal 5 min, welches zu einem grünen Farbniederschlag führte. Auf eine Gegenfärbung wurde gänzlich verzichtet. Da die Histogreen Färbung wasserlöslich ist, wurden die Schnitte rasch in 100 % Ethanol und Xylol entwässert und mit Entellan eingedeckt. 5.5.2 Immunfluoreszenzfärbung Bei einer Fluoreszenzfärbung wurden die Gewebe ebenfalls durch die Alkoholreihe abwärts geführt. Da jedoch ein Fluoreszenzfarbstoff zur Detektion der Primärantikörper verwendet wird und nicht wie in 5.5.1 eine Peroxidasereaktion, ist ein Blocken der endogenen Peroxidase überflüssig. Die Gewebeschnitte wurden über Nacht mit dem Primärantikörper bei 4°C inkubiert. Als Sekundärantikörper wurde ein entsprechender Alexa-Fluor 555 oder Alexa-Fluor Regina Vogelbacher Seite 94 von 126 5 Material und Methoden 2010 488 gekoppelter Antikörper verwendet. Die Zellkerne wurden gegebenenfalls mit 4,6-diamidino-2-phenylindol-dihydrochlorid (DAPI) gefärbt. Zuletzt wurden die Gewebe mit Mowiol eingedeckt. Da Fluoreszenzfarbstoffe im Tageslicht leicht ausbleichen, wurden die Schnitte nach Inkubation mit dem Sekundärantikörper möglichst kühl und dunkel gehalten, d.h. in abgedunkelten Küvetten gewaschen und nach dem Eindecken mit Mowiol im Kühlschrank aufbewahrt. 5.5.3 Perjodsäure-Schiff-Färbung (PAS) Mit dem Perjodsäure-Schiff-Reagenz können kohlenhydratreich Strukturen der Zellen wie z.B. Matrixmoleküle angefärbt werden. Die PAS-Färbung ist eine histochemische Reaktion zum Nachweis von bestimmten Kohlenhydraten, deren Glykolgruppen durch Perjodsäure zu Aldehydgruppen oxidiert werden. Diese lassen sich dann mit fuchsinschwefeliger Säure (Schiff-Reagenz) durch Bildung eines roten, basischen Farbstoffes nachweisen. Dazu erfolgt nach Deparaffinierung und Rehydrierung der Gewebe in der Alkoholreihe eine 15-minütige Inkubation in 2 % Periodsäure. Nach dem Waschen (2 x 3 min in Aqua dest.) wurde 25 min mit Schiff’schem Reagenz gefärbt. Nach einem Waschschritt (5 min in Aqua dest.) erfolgte die Gegenfärbung mit Hämatoxylin III nach Gill. Nach Dehydrierung und der Inkubation in Xylol wurden die Gewebe mit Entellan eingedeckt. 5.5.4 Säurefuchsin-Orange-G- Färbung (SFOG) Es handelt sich bei dieser Methode um eine simultane Trichromfärbung mit den Farbstoffen Orange-G, Säurefuchsin und Anilinblau, die eine selektive Anfärbung von Muskel, kollagenen Fasern, Fibrin und Erythrozyten bewirkt. Die PFA-Gewebeschnitte werden nach folgendem Schema gefärbt: Entparaffinieren Für 24 h in Bouin-Lösung nachfixieren In fließendem Leitungswasser wässern (ca. 20 min) Kernfärbung mit Weigert’s Eisenhämatoxylin (1 min) Kurz in fließendem Leitungswasser wässern Differenzierung in 0,5 % Salzsäure in Alkohol Bläuen in fließendem Leitungswasser (10 min) Regina Vogelbacher Seite 95 von 126 5 Material und Methoden Phosphormolybdänsäure 1 % (5 min) Abspülen mit Aqua dest. SFOG-Färbelösung (10 min) Kurz in Aqua dest. spülen Rasch in aufsteigender Alkoholreihe entwässern Eindecken mit Entellan 2010 Benötigte Lösungen: Bouin-Lösung: 15 Teile gesättigte Pikrinsäure wässrig (Fluka) 5 Teile 37 % Formalin (Merck) 1 Teil Eisessig Weigert’s Eisenhämatoxylin: Lösung 1: 10 g Hämatoxylin crystalin (Merck) in 1 l 96 % Alkohol lösen und ca. 1 Monat im Licht reifen lassen Lösung 2: 40 ml Liquor ferrisesquichloratum (KBS Apotheke) 10 ml Salzsäure 1 l Aqua dest. Lösung 1 und 2 kurz vor Gebrauch zu gleichen Teilen zusammengießen. SFOG-Färbelösung (pH 1,09): 5 g Wasserblau (Fluka) in 1 l Aqua dest. aufkochen und abkühlen lassen 10 g Orange G (Chroma Art) 15 g Säurefuchsin (Chroma Art) Regina Vogelbacher Seite 96 von 126 5 Material und Methoden 2010 5.5.5 TUNEL-Färbung (TdT-mediated dUTP-biotin nick end labeling) Diese Methode dient der Darstellung von Zellkernen apoptotischer Zellen. Während der Apoptose wird der DNA-Strang des Zellkerns durch die Aktivität von Endonukleasen fragmentiert. Die an den Bruchenden freiwerdenden Hydroxylgruppen (3‘-OH-Gruppen) werden durch das Enzym TdT (terminale Desoxynukleotidyl-Transferase) mit biotinylierten Nukleotiden markiert, welche dann mit entsprechenden Peroxidase-konjugiertem Avidin sichtbar gemacht werden können. Um DNAse Kontaminationen zu vermeiden, sollte auf eine sterile Arbeitsweise und das Tragen von Handschuhen geachtet werden. Die PFA-Gewebeschnitte werden nach folgendem Schema gefärbt: Entparaffinieren (3 x 3 min Xylol) Rehydrieren (3 x 3 min 100 % Ethanol) Blocken der endogenen Peroxidase 15 min in 3 % H2O2/ Methanol Weiter Rehydrieren (2 x 3 min 100 % Ethanol, 2 x 3 min 95 % Ethanol, 3 x 3 min PBS) In Zitratpuffer 2 min kochen, anschließend Küvette in Eiswasser stellen und 15 min abkühlen 3 x 3 min PBS Proteinase K-Verdau für 20 min bei RT (66,67 µl Proteinase K Stocklösung von Qiagen + 200 ml Aqua dest.) 3 x 3 min PBS 5 min One-Phor All Puffer (Amersham Pharmacia Biotech) 1 h RT TdT/ Bio-14-dATP (beide Amersham Pharmacia Biotech) (18,75 µl TdT + 18,75 µl Bio-14-dATP pro 1 ml One-Phor-All Puffer) 3 x 3 min PBS 2 % BSA/ TBS 10 min RT 3 x 3 min PBS ABC-Solution (Vector Laboratories, Burlingame, USA) 30 min, RT 3 x 3 min PBS 0,05 M Tris-Puffer pH 7,6 für 5 min, RT DAB (Vector Laboratories, Burlingame, USA) 10 min, RT 3 min Aqua dest. Gegenfärbung mit Methylgrün 8 min Regina Vogelbacher Seite 97 von 126 5 Material und Methoden 3 x 3 min 100 % Ethanol 3 x 3 min Xylol Eindecken mit Entellan 2010 Benötigte Lösungen: Zitratpuffer (100 mM Stocklösung) 10,5 g Citric Acid auf 500 ml mit Aqua dest. auffüllen Zitratpuffer (Arbeitslösung) 20 ml Stocklösung auf 200 ml mit Aqua dest. auffüllen Mit NaOH auf pH 6,0 einstellen Methylgrün 10 g Methylgrün 370 ml 0,1 M Essigsäure 132 ml 0,1 M Natriumazetat Mit NaOH auf pH 4,2 einstellen 5.5.6 Silberfärbung Zur Darstellung der glomerulären Basalmembran diente die PerjodsäureSilbermethenamine-Imprägnation nach Gomori/ Jones. Basalmembranen beinhalten einen gewissen Anteil an Glykoproteinen, der durch Versilberung dargestellt werden kann. Diese Färbung wurde in der Arbeitsgruppe von Prof. Amann in der Pathologie durchgeführt. Regina Vogelbacher Seite 98 von 126 5 Material und Methoden 2010 5.5.7 Antikörper Folgende Primärantikörper wurden verwendet: PCNA, ein monoklonaler Maus-IgG1-Ak gegen humanes proliferierendes Zellkern-Antigen (clone PC10; DAKO, Glostrup, Dänemark)[104][105] VEGF, ein polyklonaler Kaninchen-Ak gegen humanen vascular endothelial growth factor A (sc-152; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)[106] Fibronektin, ein polyklonaler Kaninchen-Ak gegen Ratten Fibronektin (Chemicon, CA, USA)[107] ED-1, ein monoklonaler Maus-IgG1-Ak gegen zytoplasmatisches Antigen der Ratte (CD68), welches in Monozyten, Makrophagen und dendritischen Zellen exprimiert wird (AbD Serotec, Düsseldorf)[104][105] Phospho-smad 2/3, ein polyklonaler Kaninchen-Ak gegen die phosphorylierte Form von humanem Smad 2/3 (sc-11769; Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA)[108] OX-7, ein monoklonaler Maus-Ak gegen das Thy1-Epitop auf Mesangiumzellen der Ratte (Serotec Ltd., Oxford, UK)[109] JG-12, ein monoklonaler Maus-Ak gegen Aminopeptidase P, exprimiert auf endothelialen Zellen der Ratte (Bender MedSystems GmbH, Wien, Österreich)[110][111] alpha-smooth muscle Aktin, ein monoklonaler Maus-Ak gegen humanes alpha-Glattmuskel Aktin, exprimiert in aktivierten Mesangiumzellen von Maus, Ratte und des Menschen (1A4; DAKO, Glostrup, Dänemark)[112][109] Collagen IV, ein polyklonaler Ziegen-Ak gegen humanes Collagen IV (Southern Biotechnology Associates, Birmingham, UK)[109][112] CD4, ein monoklonaler Maus-Ak gegen das Oberflächenantigen der THelferzellen der Ratte (clone W3/25; AbD Serotec, Düsseldorf) CD8, ein monoklonaler Maus-Ak gegen das Ratten-Antigen CD8 exprimiert auf zytotoxischen T-Zellen (Clone OX-8, ECACC, Salisbury, UK) Complement factor 4d, ein Kaninchen-Ak gegen C4d der Ratte von Prof. Baldwin, Johns Hopkins University, Baltimore, USA bereitgestellt MHC II, ein monoklonaler Maus-Ak gegen das Oberflächenmolekül MHC Klasse II (RT18, AbD Serotec, Düsseldorf)[113] Regina Vogelbacher Seite 99 von 126 5 Material und Methoden 2010 CD45R, ein monoklonaler Maus-Ak gegen das B-Zell-Antigen CD45R (BD Pharmingen, Heidelberg)[113] Ein Cy3-konjugiertes Esel-F(ab‘)-Fragment gegen Ratten-IgG (Jackson Immuno Research, Suffolk, UK) 5.5.8 Mikroskopische Auswertungen Die Quantifizierung der immunhistochemischen Färbungen erfolgte verblindet, d.h. ohne Kenntnis der Gruppenzugehörigkeit einer Biopsie. In der Regel wurden für jede Biopsie zwischen 30 und 50 Querschnitte durch den Glomerulus bei 400-facher oder 600-facher Vergrößerung, bzw. im Falle cortikaler Auswertungen 20 bis 40 Gesichtsfelder bei 200-facher oder 400-facher Vergrößerung evaluiert. Je nach Färbung wurden entsprechende Bewertungskriterien angewandt. Die glomeruläre Schädigung wurde anhand der PAS-Färbung mittels eines semiquantitativen Glomerulosklerose-Indexes beurteilt. Dabei wurde ein Score von 0 bis 4 für die mesangiale Expansion angelegt (0 = normal, 1 ˂ 25 %, 2 ˂ 50 %, 3 ˂ 75 %, 4 ≥ 75 %) Die tubulointerstitielle Schädigung wurde anhand der PAS-Positivität, das Vorhandensein von Entzündungszellen und tubulären Dilatationen beurteilt und ebenfalls mit einem semiquantitativen Score bewertet (0 = normal; 1 = Tubuläre Dilationen oder Entzündungszellen in weniger als 25 % des Gesichtsfeldes, 2 = Tubuläre Schäden, Entzündungszellen und PASPositivität bis 50 %; 3 = Tubuläre Schäden, Entzündungszellen und PASPositivität bis 75 %; 4 = Tubuläre Schäden, Entzündungszellen und PASPositivität über 75 % des Gesichtsfeldes. Die fokalsegmentalen Glomerulosklerose-Läsionen (FSGS) wurden anhand der PAS-Färbung mit einem semiquantitativen Score von 0 bis 4 bewertet. Bei diesem Prozess kommt es zu einem Verschmelzen des Glomerulus mit der Bowmanschen Kapsel, der Glomerulus drückt invasiv auf das umliegende Gewebe. Fibrinablagerungen wurden anhand der SFOG-Färbung evaluiert. Die Beurteilung erfolgte anhand eines semiquantitativen Scores von 0 bis 4 Regina Vogelbacher Seite 100 von 126 5 Material und Methoden 2010 (0 = normal, 1 ˂ 25 %, 2 ˂ 50 %, 3 ˂ 75 %, 4 ≥ 75 % des glomerulären Schnittes von Fibrinablagerungen betroffen). Die glomeruläre Expression von Collagen IV wurde mittels einer computergestützten Bildanalysesoftware (MetaVue, Visitron Systems GmbH, Puchheim) ermittelt. Die Expression wurde prozentual zur glomerulären Fläche dargestellt. Die glomeruläre Expression von Fibronektin wurde anhand eines semiquantitativen Scores von 0 bis 4 eingeschätzt und reflektiert Veränderungen in der mesangialen Region (0 = normal, 1 ˂ 25 %, 2 ˂ 50 %, 3 ˂ 75 %, 4 ≥ 75 %) Die glomeruläre Expression von VEGF wurde anhand eines semiquantitativen Scores von 0 bis 4 eingeschätzt und reflektiert Veränderungen in der mesangialen Region (0 = normal, 1 ˂ 25 %, 2 ˂ 50 %, 3 ˂ 75 %, 4 ≥ 75 %) Der Anteil proliferierender Zellen wurde anhand der PCNA-Färbung ermittelt. PCNA-positive Zellen wurden gezählt und pro glomerulären Querschnitt bzw. pro Gesichtsfeld angegeben. Der Anteil apoptotischer Zellen wurde anhand der TUNEL-Färbung ermittelt. TUNEL-positive Zellen wurden gezählt und pro 50 glomeruläre Querschnitte bzw. pro tubulointerstitielles Gesichtsfeld angegeben. Die Einwanderung von Monozyten und Makrophagen wurde mittels der ED-1 Färbung bestimmt. Positiv gefärbte Zellen wurden gezählt und pro glomerulärem Querschnitt bzw. tubulointerstitielles Gesichtsfeld angegeben. Die glomeruläre Hypertrophie wurde durch Ausmessen der Glomerulischnittfläche mit einer computergestützten Bildanalysesoftware (MetaVue, Visitron Systems GmbH, Puchheim) ermittelt. Eine eventuell vorhandene Hyperzellularität wurde durch Auszählen der vorhandenen Zellkerne in der glomerulären Schnittfläche ermittelt. Um die Aktivierung des TGF-β-Signalweges indirekt zu bestimmen, wurde die Anzahl an phospho-smad 2/3 positiven Zellkernen ermittelt. Schädigungen des Endothels (JG-12 Färbung) bzw. des Mesangiums (OX7 Färbung) wurden mit einem semiquantitativen Score von 0 bis 4 evaluiert Regina Vogelbacher Seite 101 von 126 5 Material und Methoden 2010 (0 = normale Kapillar- / Mesangiumstruktur, 1 ˂ 25 %, 2 ˂ 50 %, 3 ˂ 75 %, 4 ≥ 75 % Verlust an Endothel/ Mesangium). Um die Proliferation des Endothels bzw. des Mesangiums zu ermitteln wurden in den entsprechenden Doppelfärbungen (JG-12/ PCNA bzw. OX-7/ PCNA) die doppelt-positiven Zellen gezählt und pro glomerulären Querschnitt angegeben. Die glomeruläre Expression von α-Glattmuskel Aktin wurde anhand eines semiquantitativen Scores von 0 bis 4 ermittelt und reflektiert Veränderungen in der mesangialen Region (0 = normal, 1 ˂ 25 %, 2 ˂ 50 %, 3 ˂ 75 %, 4 ≥ 75 %) Die Einwanderung von MHC II, CD8, CD4 oder CD45R positiven Zellen in die Niere wurde anhand der jeweiligen Färbung bestimmt. Die positiven Zellen wurden gezählt und pro tubulointerstitielles Gesichtsfeld angegeben. Die Deposition von C4d in den peritubulären Kapillaren der Niere wurde anhand eines semiquantitativen Scores von 0 bis 4 evaluiert (0 = keine Deposition, 1 ˂ 25 %, 2 ˂ 50 %, 3 ˂ 75 %, 4 ≥ 75 % C4d Deposition im Gesichtsfeld). Der Schädigungsgrad der glomerulären Basalmembran (GBM) wurde anhand der Silberfärbung nach Gomori/Jones mit einem semiquantitativen Score von 0 bis 3 evaluiert (0 = normal, 1 = leichte Verbreiterung der GBM, aber nicht den ganzen Glomerulus betreffend, 2 = leichte bis mittlere Verbreiterung der GBM, den ganzen Glomerulus betreffend, 3 = starke Verbreiterung der GBM) Die cortikale Gesamt-IgG-Ak Ablagerung im Nierentransplantat wurde mittels einer computergestützten Bildanalysesoftware (MetaVue, Visitron Systems GmbH, Puchheim) ermittelt. Die Ablagerung wurde prozentual zur Gesamtfläche dargestellt. Regina Vogelbacher Seite 102 von 126 5 Material und Methoden 5.6 2010 Real-Time PCR 5.6.1 RNA-Isolierung Ein Teil der isolierten Glomeruli wurde nach der Isolierung in 600 µl RLT-Puffer aufgenommen. Die Isolierung der RNA erfolgte mittels des RNeasy Mini Kit (Qiagen, Hilden) gemäß den Herstellerangaben. Alle Arbeitsschritte wurden mit RNAse-freien Pipettenspitzen und Reaktionsgefäßen durchgeführt. Die Konzentration der RNA wurde photometrisch bei einer OD von 260 nm bestimmt. Die RNA-Proben wurden bis zur weiteren Verarbeitung bei -70°C gelagert. 5.6.2 Herstellung der cDNA Die cDNA Synthese wurde mit dem Verso cDNA Kit (Abgene, UK) entsprechend dem Protokoll des Herstellers durchgeführt. Es wurden jeweils 50 ng RNA in 20 µl Reaktionsvolumen eingesetzt. Zum Schluss wurden die Proben noch 1:1 mit RNase-freiem Wasser verdünnt. 5.6.3 Real-Time PCR Die Real-Time PCR ist eine Vervielfältigungsmethode für Nukleinsäuren, die auf dem Prinzip der herkömmlichen Polymerase-Kettenreaktion beruht, aber zusätzlich eine Quantifizierung der Ausgangsmenge an DNA ermöglicht. Diese Quantifizierung erfolgt durch Fluoreszenzmessungen, die innerhalb eines jeden PCR-Zyklus erfasst werden. Dabei nimmt die Fluoreszenz proportional mit der Menge der PCR-Produkte zu. Am Ende eines Real-Time PCR Laufs wird anhand der erhaltenen Fluoreszenzsignale die Quantifizierung in der exponentiellen Phase der PCR vorgenommen, da während dieser Phase die optimalen Reaktionsbedingungen vorherrschen in der mit jedem Zyklus die DNA exponentiell vermehrt wird. Eine Möglichkeit der Quantifizierung der PCR-Produkte ist die Nutzung von in DNA interkalierenden Fluorophoren wie z.B. SYBR-Green. Die Zunahme der Target-DNA korreliert dabei mit der Zunahme der Fluoreszenz von Zyklus zu Zyklus. Die cDNA der entsprechenden Zielgene wurde mittels Real-Time PCR amplifiziert und quantifiziert (Abi Prism 7000, Applied Biosystems). Für die PCR wurden 3 µl Regina Vogelbacher Seite 103 von 126 5 Material und Methoden 2010 cDNA und 17 µl SYBR-Green Master Mix (2 x SYBR-Green Lösung und Target Primer) eingesetzt. Die Endkonzentrationen für Vorwärts- und Rückwärtsprimer war 100 nM. Die Auswertung erfolgte nach der delta-delta-CT-Methode und die Ergebnisse wurden gegen das konstitutiv exprimierte Gen β-Aktin normalisiert. Die Ergebnisse waren reproduzierbar. Folgende Primer wurden für die Real-Time PCR Analyse genutzt: β-Aktin [114] Forward: 5’ CGCGAGAAGATGACCCAGATCATG 3‘ Reverse: 5' AGGATCTTCATGAGGTAGTCAGT 3' VEGF [115] Forward: 5' AACGAAAGCGCAAGAAATCC 3' Reverse: 5' GCTCACAGTGAACGCTCCAG 3' 5.7 ELISA Mit Hilfe eines enzyme linked immunosorbent assays können Proteine oder niedermolekulare Verbindungen wie Toxine und Pestizide in einer Probe (Serum, Urin, etc.) quantitativ nachgewiesen werden. Es werden spezifische Antikörper genutzt, die an den nachzuweisenden Stoff (Antigen) binden. Diese Antikörper sind mit einem Enzym markiert, welches mit einem spezifischen Substrat zu einer messbaren Farbveränderung führt. Diese Farbreaktion dient als Nachweis für das Vorhandensein des Antigens. Im Transplantationsversuch mit SRL/BZ wurde ein ELISA entwickelt um die Menge an Alloantikörpern, die gegen die glomeruläre Basalmembran (GBM) des Spenderorgans gerichtet sind, zu bestimmen. 5.7.1 GBM-Isolierung Die gesamte beschriebene Prozedur wurde, wenn nicht anders beschrieben, mit eisgekühlten Lösungen, Kühlzentrifugen bzw. im Kühlraum bei 4°C durchgeführt. Zuerst wurden die Glomeruli aus 12 F344-Rattennieren isoliert (siehe Abschnitt 5.3.6 Isolierung der Glomeruli). Diese wurden mit PBS/ Na-Azid gewaschen und in Regina Vogelbacher Seite 104 von 126 5 Material und Methoden 2010 einer Kühlzentrifuge (5810R Eppendorf AG, Hamburg) bei 1200 rpm für 5 min sedimentiert. Danach wurden die im Pellet befindlichen Glomeruli in PBS/ Na-Azid mittels Ultraschall aufgeschlossen (insgesamt 200 Impulse; 70 % Amplitude, ½ sec Impuls mit anschließend ½ sec Pause), wobei die Probe nach jeweils 50 Impulsen für 1 min auf Eis gekühlt wurde. Danach wurde die Probe 3-mal mit PBS/ Na-Azid gewaschen und jeweils bei 800 rpm für 15 min sedimentiert. Danach folgten 3 weitere Waschschritte mit eiskaltem Aqua dest. Anschließend wurde der Überstand möglichst vollständig abgenommen und das Pellet ü.N. eingefroren. Am nächsten Tag wurde das Pellet in 600 µl Tris/ Calciumazetat Puffer (0,1 Tris; 0,005 M Calciumazetat; pH 7,4) aufgenommen und nach Zugabe von Collagenase 1A (1 mg/ml Endkonzentration; Sigma, Taufkirchen) bei 37°C für 1 h inkubiert. Der Verdau wurde durch Hitzeinaktivierung (15 min, 60°C) gestoppt und die gewonnene Proteinmenge an GBM mit Hilfe des BioRad Protein Kits (BioRad, München) ermittelt. 5.7.2 GBM-ELISA Die Beschichtung mit GBM-Lysat (1 µg/ml) oder 1 % BSA/ PBS (Negativkontrolle) erfolgte auf Nunc Maxisorp F96 Mikrotiterplatten ü.N. bei 4°C. Die Platten wurden dreimal mit PBST gewaschen und die freien Bindungsstellen mit 1 % BSA/ PBS für 1 h bei RT blockiert. Die Seren, die an verschiedenen Zeitpunkten während des SRL/BZ-Projektes gewonnen wurden, wurden 1:200 in PBS verdünnt, als Tripletts aufgetragen und 1,5 h inkubiert. Nach erneutem Waschen wurde die Platte mit einem HRP-gekoppelten Anti-Ratten Gesamt-IgG Antikörper (Jackson Immuno Research, Suffolk, UK) in einer 1:2000 Verdünnung in PBS für 1,5 h bei RT inkubiert. Nicht gebundene Antikörper wurden durch Waschen mit PBST entfernt und die Platten mit je 100 µl ABTS-Färbereagenz (1 ABTS Tablette in 50 ml ABTS-Puffer; Roche Applied Science, Mannheim) gefärbt. Die Farbintensität wurde bei zwei Wellenlängen (405 nm und 650 nm) im MikotiterplattenPhotometer bestimmt. Um Schwankungen der Messung zwischen den verschiedenen Platten zu vermeiden wurde ein Serum auf jeder Platte als Kontrolle mitgeführt. Von den OD Werten der unterschiedlichen Tiere wurde der BSA-OD Wert als Hintergrund abgezogen. Regina Vogelbacher Seite 105 von 126 5 Material und Methoden 5.8 2010 ELISpot Mit der enzyme linked immuno spot technique kann man die Freisetzung von Zytokinen oder Antikörpern einzelner Immunzellen messen (s.a. Abb. 26). Dabei verwendet man Antikörper, die spezifisch an diese sezernierten Proteine binden. Ein Farbstoffsubstrat umsetzendes Enzym erlaubt es, diese Proteine als kleine Punkte am Boden einer 96-Well-Platte sichtbar zu machen. Mit entsprechender Computersoftware können diese Punkte ausgezählt werden. Diese Methode ist sehr nützlich um die spezielle Aktivität von Immunzellen zu ermitteln und ist in der Forschung und Diagnostik in den Bereichen Autoimmunerkrankungen, Transplantationsrisiken und Allergien von entscheidender Bedeutung. Im SRL/BZ-Tx Projekt wurde mit dieser Methode die Menge an IgGsezernierenden Zellen im Knochenmark und in der Milz bestimmt. Coating-Antikörper 1 YYYYYYYYYYYYY ELISpot Membran Zelle 2 YYYYYYYYYYYYY Antikörper-sezernierende Zelle sezernierte Antikörper 3 YYYYYYYYYYYYY 4 An Platte gebundene Antikörper Enzymgekoppelter Sekundärantikörper YYY YYYYYYYYYYYYY Spot 5 Farbreaktion mit Chromogen YYY YYYYYYYYYYYYY Abb. 26 Schematischer Überblick der ELISpot Technik Die ELISpot 96-Well-Platten haben anstelle eines Bodens eine Membran, an die sich der CoatingAntikörper, der gegen das gesuchte Protein (hier IgG-Antikörper) gerichtet ist, anlagern kann (1). Im nächsten Schritt wird die Platte mit der Zellsuspension (aus Knochenmark oder Milz) in einem Regina Vogelbacher Seite 106 von 126 5 Material und Methoden 2010 Brutschrank inkubiert (2). Einige Immunzellen sezernieren dabei IgG-Antikörper, die durch den Coating-Antikörper auf der Membran regional gebunden werden (3). In einem weiteren Schritt wird die Mikrotiterplatte mit einem spezifischen enzymgekoppelten-Antikörper inkubiert (4), der gegen die sezernierten IgG-Antikörper gerichtet ist. Bei der anschließenden Farbreaktion setzt das Enzym ein Chromogen frei und zwar überall dort, wo auch eine Immunzelle IgG-Antikörper sezerniert hat (5). So werden diese Zellen als kleine Punkte am Boden der 96-Well-Platte sichtbar gemacht. 5.8.1 Gewinnung von Zellen aus Knochenmark und Milz Zuerst wurde aus Knochenmark und Milz eine Einzelzellsuspension gewonnen. Dazu wurde nach Ausbluten des Tieres die Milz entnommen und mit PBS und einem Stößel durch ein Sieb mit der Maschenweite 100 µm (Cell Strainer, BD Falcon, Bedford, USA) gedrückt. Das Knochenmark wurde mit Hilfe einer Spritze mit Kanüle Gr.16 und 1-2 ml PBS aus einem Oberschenkelknochen gespült und ebenfalls durch ein Sieb mit der Maschenweite 100 µm gedrückt. Die Zellen wurden in einer Zentrifuge (5810R Eppendorf AG, Hamburg) bei 1500 rpm, 4°C für 8 min sedimentiert. Anschließend erfolgte der Aufschluss der Erythrozyten (5 min, RT) mit einem Erythrozyten-Lysepuffer. Diese Reaktion wurde durch Zugabe von R5-Medium (RPMI 1640 + 5 % FCS) abgestoppt. Nach erneuter Zentrifugation wurden die Zellen in R5-Medium resuspendiert und in einer Neubauerzählkammer die Gesamtzellmenge jeder Präparation ermittelt. Im ELISpot wurden bei den Milzzellen 8 x 105 Zellen/ Well in 100 µl und bei den Knochenmarkszellen 4 x 105 Zellen/ Well in 100 µl in siebenfacher Wiederholung eingesetzt. Die erforderliche Zellmenge wurde abgenommen, 4-mal mit eiskaltem PBS gewaschen und vor dem Einpipettieren in die Mikrotiterplatte in vorgewärmtes R10-Medium (RPMI + 10 % FCS) aufgenommen. 5.8.2 Nachweis von IgG-sezernierenden Zellen in Knochenmark und Milz mittels ELISpot Die Membran in einer 96 well- Multiscreen HTS Mikrotiterplatte (Millipore, USA) wurden mit 70 % Methanol für 1 min aktiviert. Nach 3-maligem Waschen der Platte mit PBS (pH 7,4; 150 µl pro well) wurde die Platte mit dem Coating- Ak (Ziege-Ak gegen Ratten-IgG, 10 µg/ml, 100 µl pro well, Jackson Immuno Research, Suffolk, UK) ü.N. bei 4°C beschichtet. Am nächsten Tag wurde die Platte 6-mal mit Aqua dest. (150 µl pro well) gewaschen und durch Zugabe von PBS/ 2 % FCS die freien Bindungsstellen blockiert (Inkubation 3 h bei RT, 1 h vor Zugabe der Zellen bei 37°C). Die Blockierlösung wurde abgeschüttet und die Zellsuspensionen aus Regina Vogelbacher Seite 107 von 126 5 Material und Methoden 2010 Knochenmark und Milz aufgetragen. Die Platte wurde nun für 2 h im Zellinkubator möglichst erschütterungsarm bei 37°C inkubiert. Anschließend wurde die Platte 6-mal mit PBS gewaschen und mit dem HRP-gekoppelten Zweitantikörper (ZiegeAk gegen Ratten-IgG, Jackson Immuno Research, Suffolk, UK) zur Detektion der sezernierten IgG-Moleküle 1 h bei RT inkubiert. Nach abermaligem Waschen mit PBS erfolgte die Farbreaktion mit dem TMB-1 component membrane peroxidase substrat system (KPL, USA) nach Angaben des Herstellers. Die Enzymreaktion wurde durch Spülen der Platte mit Aqua dest. abgebrochen und die Membran ü.N. getrocknet. Die Spots wurden mit dem ELISpot reader (AID Diagnostika GmbH, Straßberg) in digitale Bilder umgewandelt und ausgewertet. 5.9 Durchflusszytometrische Analyse (FACS) Die FACS Analysen für das SRL/BZ-Tx Projekt wurden allesamt von der Arbeitsgruppe Reinhard Voll durchgeführt. Für die Färbung von Oberflächenmolekülen wurden die Zellsuspensionen von Knochenmark und Milz mit Fluorochrom-konjugierten Anti-Ratte Antikörpern CD25-PE (BD Bioscience, USA), CD45R-FITC, CD4-FITC, CD8-PE (eBioscience Inc, USA), IgM-APC, IgG-PE (Jackson Immuno Research, Suffolk, UK) für 20 min im Dunkeln auf Eis inkubiert. Für intrazelluläre Färbungen wurden die Oberflächengefärbten Zellen fixiert und permeabilisiert mit der Cytofix/ Cytoperm Lösung (Invitrogen) und anschließend mit den entsprechenden Antikörpern inkubiert. Plasmazellen wurden beispielsweise durch CD45R- auf der Oberfläche und intrazelluläres IgG+ charakterisiert. Die Zellen wurden durchflusszytometrisch in einem FACS Calibur (BD Biocience, USA) analysiert. Die Datenanalyse erfolgte mit FlowJo Software (Tree Star, USA). 5.10 Statistische Auswertung Das 5/6 Nephrektomiemodell wurde mit dem Statistikprogramm SPSS evaluiert. Die Werte wurden als Mittelwert ± SD angegeben, wobei das Signifikanzniveau bei p ˂ 0,05 liegt. Aufgrund der nicht parametrischen Verteilung der Daten wurde Regina Vogelbacher Seite 108 von 126 5 Material und Methoden 2010 der Mann-Whitney Test zur Evaluierung herangezogen. Auch der Kaplan-Meier Log-rank Test zur Überprüfung der Überlebenskurve wurde mit SPSS ausgeführt. Die Statistik für den Transplantationsversuch mit Sirolimus und Bortezomib wurde mit dem Programm GraphPad Prism 5.0 durchgeführt. Alle Werte wurden als Mittelwert ± SEM angegeben, wobei das Signifikanzniveau bei p ˂ 0,05 liegt. Es wurde eine ANOVA-Analyse mit Tukey’s Multiple Comparision Test durchgeführt. Der Mantel-Cox Log-rank Test zur Überprüfung der Überlebenskurve wurde ebenfalls mit GraphPad Prism durchgeführt. Die Evaluierung des GBM-ELISAs, Proteinurie und des Körpergewichtes erfolgte mit einer 2-seitigen ANOVA Analyse mit anschließendem Bonferroni-Test. Regina Vogelbacher Seite 109 von 126 5 Material und Methoden 2010 5.11 Material 5.11.1 Chemikalien β-Mercaptoethanol ABTS Aceton Ammoniumchlorid Aprotinin Kits zur Proteinbestimmung: BioRad Protein Assay BioRad DC Protein Assay Bortezomib (Velcade) BSA (Rinderserumalbumin) Calciumacetat Chloroform Chymostatin DAB Entellan Essigsäure Ethanol Ethylendiamintetraacetat (EDTA) Everolimus Forene (Isofluran) Fötales Kälberserum Hämatoxylin III nach Gill Hepes Histogreen Substrat Isopropanol Leupeptin Methanol Methylgrün Mowiol Natriumazetat Natriumazid Natriumchlorid Natriumchlorid Infusionslösung 154 (0,9 %) Natriumdodecylsulfat Natriumfluorid Natriumhydroxid Natriumorthovanadat Nonidet P40 Paraffin Paraformaldehyd PBS Dulbecco Pepstatin A Periodsäure Phosal 50PG PMSF RPMI 1640-Medium Salzsäure Schiff-Reagenz Sirolimus (Rapamune) Tris Tween 20 Viaspan (Organkonservierungslösung) Wasserstoffperoxid 30% Xylol Zinkacetat Zinkchlorid Regina Vogelbacher Sigma, Taufkirchen Roche, Mannheim Chem solute, Renningen Merck, Darmstadt Appli Chem, Darmstadt BioRad, München BioRad, München Janssen-Cilag, Neuss Merck, Darmstadt Merck, Darmstadt Geyer GmbH, Renningen Appli Chem, Darmstadt Vector Laboratories, USA Merck, Darmstadt Roth, Karlsruhe Merck, Darmstadt Merck, Darmstadt Novartis, Nürnberg Abbott, Wiesbaden PAA, Pasching Merck, Darmstadt Merck, Darmstadt Linearis, Wertheim-Bettingen Merck, Darmstadt Appli Chem, Darmstadt Merck, Darmstadt Merck, Darmstadt Merck, Darmstadt Merck, Darmstadt Merck, Darmstadt Merck, Darmstadt Berlin Chemie, Berlin Roth, Karlsruhe Appli Chem, Darmstadt Merck, Darmstadt Appli Chem, Darmstadt Sigma, Taufkirchen Merck, Darmstadt Merck, Darmstadt Biochrom AG, Berlin Appli Chem, Darmstadt VWR, Darmstadt Phospholipid GmbH, Köln Appli Chem, Darmstadt PAA, Pasching Merck, Darmstadt Merck, Darmstadt Wyeth Pharmaceuticals, UK Merck, Darmstadt Merck, Darmstadt Fresenius HemoCare, Niederlande Chem solute, Renningen Merck, Darmstadt Merck, Darmstadt Sigma, Taufkirchen Seite 110 von 126 5 Material und Methoden 2010 5.11.2 Geräte Brutschrank Hera Cell 240 Deionisierungsanlage Seralpur pro90C Magnetrührer Heidolph MR3001 Mikroskope: Nikon eclipse 80i Zeiss OPMI 1-FC Mikroskopkamera Mikrotiterplatten-Photometer Sunrise Mikrotiterplatten-Washer Tecan M12/4R Multikanalpipette Real-Time-PCR ABI Prism 7000 SDS Rotationsmikrotom Microm HM335E Narkoseanlage ZUA-82-GME Gasmisch-Einheit Operationsbesteck OP-Tisch für Kleintiere Paraffinausblockeinheit Leica EG1120 pH-Meter CG812 Thermomixer compact Vortexer Heidolph REAX top Waagen: Feinwaage U4100S Tierwaage FTC3KO1 Wasserbad Zentrifugen: Biofuge fresco, Heraeus 5810R Heraeus, Hanau Veolia Water Systems GmbH, Wien Heildorf, Schwabach Nikon, Düsseldorf Carl Zeiss, Jena Visitron Systems GmbH, Puchheim Tecan, Crailsheim Tecan, Crailsheim Eppendorf, Hamburg Applied Biosystems, USA Mikrom GmbH, Walldorf Föhr Medical Instruments GmbH, Seeheim-Ober Beerbach Fine Science Tools, Heidelberg Hans Sachs Elektronik, March-Hugstetten Leica, Bensheim Schott Geräte, Mainz Eppendorf, Hamburg Heidolph, Schwabach Sartorius Universal, Göttingen Kern & Sohn, Balingen-Frommern Gesellschaft für Labortechnik, Burgwedel Thermo Scientific, Dänemark Eppendorf, Hamburg 5.11.3 Verbrauchsmaterial Deckgläser 24 x 50 mm Einwegskalpelle No. 21 und 11 Fettstift: ImmEdge Pen Liquid Blocker Injektionskanülen Gr.16, 18 und 20 Kombispitzen Mikrotiterplatten (96 well): Proteinbestimmung ELISA Nunc Maxisorp F96 ELISPOT Multiscreen HTS Mikrotommesser Nahtmaterial: 6-0 Monofilament, Prolene 9-0 Monofilament, Ethilon 10-0 Monofilament, Ethilon Objektträger Parafilm M Regina Vogelbacher Menzel Gläser, Braunschweig PFM, Köln Vector Laboratories, USA SCI Science Services, München B.Braun, Melsungen Sarstedt, Nümbrecht Thermo Scientific, Dänemark Millipore, USA Leica, Bensheim Ethicon, Norderstedt Ethicon, Norderstedt Ethicon, Norderstedt R.Langenbrinck, Emmendingen Pechiney, USA Seite 111 von 126 5 Material und Methoden 2010 Pipettenspitzen 10 µl 200 und 1000 µl Polypropylenröhrchen 15 und 50 ml Reaktionsgefäße 1,5 und 2 ml Spritzen Biozym Scientific GmbH, Hess. Oldendorf Sarstedt, Nümbrecht Greiner Bio-One , Frickenhausen Eppendorf, Hamburg B.Braun, Melsungen 5.11.4 Lösungen PBS/Na-Azid: PBS mit 0,001 % Natriumazid PBST: PBS mit 0,01 % Tween 20 TBS pH 7,6: 6,055 g Tris 8,52 g NaCl auf 1 l Aqua dest. TBS/ BSA: TBS mit 1 % BSA TBST: TBS mit 0,01 % Tween 20 Erythrozyten-Lysepuffer: Regina Vogelbacher 4 g Ammoniumchlorid 2,35 g Hepes 100 µl EDTA (0,5 M stock pH 8,0) auf 500 ml Aqua dest. Seite 112 von 126 6 Literatur 6 2010 Literatur [1] Abboud H & Henrich WL. Clinical practice. stage iv chronic kidney disease. N. Engl. J. Med. (2010) 362: pp. 56-65. [2] Thomas C & Thomas L. Renal failure--measuring the glomerular filtration rate. Dtsch Arztebl Int (2009) 106: pp. 849-854. [3] Sola E, Gonzalez-Molina M, Cabello M, Burgos D, Ramos J, Gutierrez C, Lopez V, Soler J, de la Vega E & Hernandez D. Long-term improvement of deceased donor renal allograft survival since 1996: a single transplant center study. Transplantation (2010) 89: pp. 714-720. 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Regina Vogelbacher Seite 122 von 126 7 Anhang 7 2010 Anhang Lebenslauf Persönliche Daten: Regina Vogelbacher Diplom-Biologin Geb. am 29.November 1980 in Erlangen Schulausbildung: 1987-1991 Grundschule Pestalozzischule in Erlangen 1991-2000 Emmy-Noether-Gymnasium in Erlangen Abschluss: Allgemeine Hochschulreife Hochschulausbildung: Okt 2000- Okt 2004 Diplomstudiengang der Biologie an der Universität Erlangen Nov 2004 Diplomprüfung in den Fächern Biochemie, Botanik, Entwicklungsbiologie und Immunologie Dez 2004- Sept 2005 Diplomarbeit am Lehrstuhl der Molekularen Immunologie unter Anleitung von Prof. Dr. Hans-Martin Jäck Thema: Identifizierung mRNA-Decay-Faktoren purification-Methode neuer Nonsense-mediatedmit der Tandem-affinity- Abschluss: Diplom-Biologe Univ., Feb 2006- Mai 2010 Dissertation in der Nephrologischen Forschung der Medizinischen Klinik IV in Erlangen unter Anleitung von Prof. Dr. Christian Hugo Thema: Neue Therapiemöglichkeiten der chronischen Transplantatnephropathie – Untersuchungen an Tiermodellen der chronischen Niereninsuffizienz der Ratte Regina Vogelbacher Seite 123 von 126 7 Anhang 2010 Publikationen und Vorträge Publikationen: Vogelbacher, Regina; Wittmann, Sandra; Braun, Andrea; Daniel, Christoph; Hugo, Christian. The mTOR inhibitor everolimus induces proteinuria and renal deterioration in the remnant kidney model in the rat. Transplantation 2007; 84:1492-9. Wittmann, Sandra; Daniel, Christoph; Braun, Andrea; Vogelbacher, Regina; Shimizu, Fuijo; Kawachi, Hiroshi; Hugo, Christian. The mTOR inhibitor everolimus attenuates the time course of chronic anti-Thy1 nephritis in the rat. Nephron Exp Nephrol 2008; 108: e45-56 Wittmann, Sandra; Daniel, Christoph; Stief, Andrea; Vogelbacher, Regina; Amann, Kerstin; Hugo, Christian. Long-term treatment of sirolimus but not cyclosporine ameliorates diabetic nephropathy in the rat. Transplantation 2009; 87: 1290-1299. Regina Vogelbacher Seite 124 von 126 7 Anhang 2010 Vorträge und Poster: Sept 2007 38. Kongress der Gesellschaft für Nephrologie in München Der mTOR Inhibitor Everolimus induziert Proteinurie und eine Verschlechterung der Nierenmorphologie im 5/6 Nephrektomie-Modell der Ratte (Vortrag) Nov 2007 The American Society of Nephrology ASN Renal Week 2007 in San Francisco The mTOR Inhibitor Everolimus Induces Proteinuria and Renal Deterioration in the Remnant Kidney Model in the Rat (Poster) Nov 2007 3. Novartis Forschungstage in Wiesenthau Der mTOR Inhibitor Certican induziert Proteinurie und eine Verschlechterung der Nierenmorphologie im 5/6 Nephrektomie-Modell der Ratte (Poster) Sept 2009 Kongress für Nephrologie 2009 in Göttingen Bortezomib humorale und Sirolimus Immunantwort inhibieren in Nierentransplantations-Modell synergistisch einem der Ratte die experimentellen (Poster und Posterpreis) Okt 2009 Young Investigator Forum 2009 Trilateral- Czech- German- Polish Symposium in Prag Bortezomib and Sirolimus inhibit the humoral immune response in experimental renal transplantation in the rat (Vortrag) Regina Vogelbacher Seite 125 von 126 7 Anhang 2010 Danksagung Ich bedanke mich herzlich bei Prof. Dr. Christian Hugo für die Bereitstellung des sehr interessanten Themas, die Betreuung der Arbeit und seinen fachlichen Rat. Weiterhin möchte ich mich für die Unterstützung und das Vertrauen bedanken, die es mir erlaubten viele verschiedene Erkenntnisse und Erfahrungen zu sammeln. Herrn Prof. Dr. Thomas Winkler möchte ich für die Übernahme des Erstgutachtens seitens der Naturwissenschaftlichen Fakultät danken. Frau Prof. Dr. Kerstin Amann möchte ich für die Übernahme des Zweitgutachtens meiner Dissertation danken. Mein besonderer Dank gilt Dr. Christoph Daniel, für die Einarbeitung, seine erstklassige Betreuung und seine wissenschaftliche und moralische Unterstützung bei vielen unserer Projekte. Ein ganz herzliches Dankeschön geht an meine Laborkolleginnen Andrea, Tanja, Tina, Susann, Andy und Sandra. Ich habe gerne mit euch gearbeitet, ich danke euch für eure Hilfsbereitschaft, Unterstützung, Zusammenarbeit und das herzliche Arbeitsumfeld. Es war eine sehr schöne Zeit mit euch, sowohl in der Arbeit als auch privat. Andrea möchte ich besonders für ihre Geduld und Motivation danken. Vor allem möchte ich mich bei Sandra für ihre Geduld und Hilfsbereitschaft bedanken. Danke, dass du immer ein offenes Ohr für meine Probleme in „unserer“ Doktorandenzeit hattest. Vielen Dank auch an Sebastian und den immerwährenden Kaffeenachschub. Mein größter Dank gilt jedoch meinen Freunden und meiner Familie. Regina Vogelbacher Seite 126 von 126
