Inhaltsverzeichnis
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Nukleinsäuren Inhaltsverzeichnis 1.Theoretischer Hintergrund....................................................................................................... 2 1.1 Aufbau der DNA................................................................................................................ 2 1.2 Struktur und Replikation der DNA ...................................................................................... 3 1.3 Struktur und Aufgaben der verschiedenen RNAs ............................................................ 6 1.4 Methoden der Molekularbiologie......................................................................................... 9 2. Material und Methoden.......................................................................................................... 11 2.1 Materialien........................................................................................................................ 11 2.2 Versuchsdurchführung................................................................................................... 11 2.2.1 Gel-Elektrophorese.................................................................................................... 11 2.2.2 Photometrische Bestimmung ..................................................................................... 12 3. Ergebnisse............................................................................................................................ 13 3.1 Ergebnisse der Gel-Elektrophorese................................................................................. 13 3.2 Ergebnisse der Photometrie............................................................................................. 14 4. Diskussion............................................................................................................................. 15 1 Nukleinsäuren 1.Theoretischer Hintergrund Die Molekularbiologie oder Molekulargenetik befasst sich mit den zellulären Vorgängen bei der Vervielfältigung, Übertragung und Expression des genetischen Materials. DNA ist immer Träger der genetischen Information bei Eukaryoten, während bei Prokaryoten auch RNA als Träger vorkommen kann. Zur Proteinbiosynthese ist sowohl bei Prokaryoten als auch bei Eukaryoten RNA notwendig. Bei Eukaryoten entsteht diese durch Transkription, während sie bei Prokaryoten direkt abgelesen wird. Eine Ausnahme stellen die Retroviren dar, die das Enzym Reverse Transkriptase, ein spezielles Enzym, das zur Umwandlung von RNA in DNA dient, besitzen. Das Gemeinsame aller Lebewesen aber ist, dass sie zur Codierung der genetischen Information einen Triplett-Code verwenden (universeller Code), allerdings codieren die Tripletts bei verschiedenen Lebewesen manchmal für unterschiedliche Aminosäuren (z.B. bei der Proteinbiosynthese einiger mitochondrialer Proteine). Die Größe des Genoms und die Anzahl der codierten Gene variieren in großen Bereichen: - Escherichia coli: 4,64 x 106 Basenpaare mit 2500 codierten Genen - Zea mays: 6,6 x 10 9 Basenpaare mit 1000 codierten Genen - Mitochondrium: 3 x 105 Basenpaare mit unbekannter Anzahl codierter Gene - Chloroplast: 1,5 x 105 Basenpaare mit 24 codierten Genen 1.1 Aufbau der DNA Die DNA (Desoxyribonukleinsäure) ist der Träger der genetischen Information, die durch verschiedene Typen von RNA (Ribonukleinsäure) verwirklicht wird. Beide gehören zur Verbindungsklasse der Nukleinsäuren, die sich aus einzelnen Bausteinen, den Nukleotiden, zusammensetzen. Jedes Nukleotid (siehe Abb.1) wiederum besteht aus 3 Einzelbausteinen, einer Purin- oder Pyrimidinbase (Adenin, Guanin, Cytosin, Thymin), einer Pentose (Desoxyribose bei der DNA, Ribose bei der RNA) und einem Phosphatrest. 2 Nukleinsäuren Abb. 1: Struktur der Nukleotide (Campbell, Biologie, S.91, 2.korrigierter Nachdruck 2000, Spektrum-Verlag) Die Basen sind mit dem C’1-Atom des Zuckers über eine N-glycosidische Bindung verknüpft. Dieser Komplex aus Base und Zucker wird als Nukleosid bezeichnet. Die Nukleoside werden je nach Base als Adenosin, Guanosin, Cytidin und Thymidin bezeichnet. Der Phosphatrest ist ebenfalls (über eine Esterbindung am C’5-Atom) mit dem Zucker verknüpft und bildet mit diesem das sogenannte Rückgrat der DNA, von dem die stickstoffhaltigen Basen abstehen. 1.2 Struktur und Replikation der DNA In der Regel liegt die DNA doppelsträngig vor, wobei die beiden Einzelstränge durch Wasserstoffbrücken zwischen komplementären Basen zusammengehalten werden. Es paart sich immer Adenin mit Thymin, unter Bildung von 2 H-Brücken, und Guanin mit Cytosin, unter Bildung von 3 H-Brücken. Die Polynukleotid-Ketten besitzen jeweils ein freies C’5-Atom an ihrem einen Ende und ein freies C’3-Atom an ihrem anderen Ende. Diese unterschiedlichen Enden verleihen dem Strang eine Richtung. Die beiden zu einem Doppelstrang verknüpften Polynukleotid-Stränge verlaufen antiparallel, das heißt, dass das 5’-Ende des einen Stranges dem 3’-Ende des anderen Stranges gegenüber liegt (siehe Abb.2). 3 Nukleinsäuren Abb.2: DNA-Doppelhelix (B-Form) (Campbell, Biologie, S.312, 2.korrigierter Nachdruck 2000, Spektrum-Verlag) Der Doppelstrang ist spiralig gewunden und bildet dadurch eine Doppelhelix, die in unterschiedlichen Formen vorkommen kann: • B-Form: die B-Form ist die häufigste Form der DNA. Sie ist rechts gewunden und die Basenpaare sind senkrecht zu einer imaginären Zentralachse angeordnet. Jede Windung der Doppelhelix umfasst 10 Basenpaare und das Zucker-PhosphatRückgrat bildet eine große und eine kleine Rinne. • A-Form: die A-Form ist ebenfalls rechtsgewunden. Allerdings liegen die Basenpaare hier nicht mehr senkrecht zur Zentralachse, sondern sind um ca. 70° verschoben. Jede Windung umfasst 11 Basenpaare, wodurch sie gedrungener erscheint. Außerdem besitzt sie keine großen und kleinen Rinnen. • Z-Form: die Z-Form ist linksgewunden und besitzt ein zick-zack-förmiges Rückgrat. Man findet sie in bestimmten Abschnitten der B-Form, meist an Stellen mit vielen Guanin-Cytosin-Basenpaaren. Für die Funktion eines Organismus ist es wichtig, dass die genetische Information einer Zelle bei der Mitose fehlerfrei und vollständig an ihre Tochterzellen weiter gegeben wird. Möglich wird dies durch die komplementären Einzelstränge der DNA. Jeder Strang kann als Matrize 4 Nukleinsäuren (Vorlage) zur Neusynthese des anderen dienen. Man bezeichnet diese Art der Replikation als semikonservativ. Ausgeführt wird sie durch DNA-abhängige DNA-Polymerasen. Zur Replikation sind Einzelstränge notwendig. Sie beginnt an bestimmten Nukleotidsequenzen der DNA, den sogenannten Replikationsursprüngen. Bei Prokaryoten gibt es nur einen solchen Ursprung. Bestimmte Proteine binden an diesen und leiten die Replikation in beide Richtungen (bidirektional) fort, bis das gesamte bakterielle Chromosom verdoppelt wurde Bei Eukaryoten gibt es mehrere Replikationsursprünge, diese bilden Replikationsblasen, welche schließlich miteinander verschmelzen und auf diese Weise die Replikation beschleunigen. An jedem Ende einer solchen Replikationsblase bildet sich eine Replikationsgabel (siehe Abb.3) an der sich die Doppelstränge in Einzelstränge auftrennen. Für die Auftrennung der Doppelstränge sorgt das Enzym Helicase, indem es die H-Brücken zwischen den Basenpaaren löst. Damit sich die getrennten Stränge nicht sofort wieder verbinden, heften sich Einzelstrangbindungsproteine an. Die DNA muss zusätzlich aber auch noch weitläufig entwunden werden, da sie sonst mit unglaublicher Geschwindigkeit um ihre eigene Achse rotieren würde. Darum wird das Rückgrat der DNA durch DNATopoisomerasen gebrochen, bis sich die Helix „entdrillt“ hat und anschließend wieder repariert. Nun kann die DNA-Polymerase III an der Replikationsgabel mit der Synthese des neuen Strangs beginnen. Problemlos verläuft dies aber nur in 5’Æ3’ -Richtung, da nur am 3’-Ende des DNA-Stranges Nukleotide angehängt werden können. Man bezeichnet diesen Strang, der kontinuierlich synthetisiert werden kann, auch als Leitstrang. 5 Nukleinsäuren Abb.3: Zusammenfassung der DNA-Replikation (Campbell, Biologie, S.319, 2.korrigierter Nachdruck 2000, Spektrum-Verlag) Der andere Strang wird diskontinuierlich synthetisiert und als Folgestrang bezeichnet. Hier wird durch das Enzym Primase ein Primer aus RNA-Nukleotiden aufgebaut, an welchem die DNA-Polymerase III ansetzen kann, um in 5’Æ3’ -Richtung bis zum nächsten Primer DNA zu synthetisieren. Die hierbei gebildeten DNA-Stücke werden zusammen mit dem Primer als Okazaki-Fragmente bezeichnet. Der RNA-Primer wird durch die Polymerase I durch DNA ersetzt und ein Enzym namens Ligase füllt die restlichen Lücken. 1.3 Struktur und Aufgaben der verschiedenen RNAs RNA bildet gewissermaßen die Verbindung zwischen der in der DNA gespeicherten Information und der Proteinsynthese. Sie ist ebenso wie die DNA aus Nukleotiden aufgebaut, allerdings handelt es sich bei dem Zucker um eine Ribose und anstelle der Base Thymin wird Uracil verwendet. Man kann drei verschiedene Hauptarten von RNA unterscheiden: - m-RNA (Boten-RNA): bei der m-RNA handelt es sich um ein Transkript eines Gens, welches ein bestimmtes Protein kodiert. Um eine Kopie des Stranges, der die genetische Information trägt (sense-Strang, anticodogener Strang) zu erhalten, muss der dazu komplementäre Strange (non-sense-Strang, codogener Strang) transkribiert werden. Dieses Transkript kann dann aus dem Zellkern ins Cytoplasma transportiert werden. Der Vorgang der m-RNA-Synthese wird als Transkription bezeichnet. Bei Eukaryoten katalysieren DNA-abhängige RNA-Polymerasen den im Kern stattfindenden Prozess. Die Transkription beginnt an spezifischen Bereichen der DNA, die als Promotor bezeichnet werden. Diese Bereiche sind bei verschiedenen Organismen relativ ähnlich und werden deshalb auch als Consensussequenzen bezeichnet. Ein häufiger Promotor ist z.B. die TATA-Box mit der Basenfolge „TATAAA“. Die RNA-Polymerase II benötigt allerdings noch weitere Proteine, sogenannte Transkriptionfaktoren, um den Promotor zu erkennen. Erst wenn diese an die DNA gebunden haben, kann die RNA-Synthese beginnen, man bezeichnet dies als Initiation. Die Verlängerung des RNA-Stranges wird als Elongation bezeichnet. Hierbei trennt die Polymerase II die Einzelstränge und entwindet die DNA, während sie in 3’Æ5’ läuft und nach dem Basenpaarungsprinzip RNA-Nukleotide verbindet. Beendet wird Transkription durch eine Terminationssequenz, z.B. „AATAAA“. Bei der entstandenen m-RNA handelt es sich um eine sogenannte Prä-RNA. Diese muss erst noch prozessiert werden, bevor sie den Zellkern verlassen kann. 6 Nukleinsäuren Beim Processing wird an das 5’-Ende der m-RNA ein 7-Methyl-GTP-Rest angehängt, dieser wird als 5’-Cap bezeichnet und soll die m-RNA vor Abbau durch Exonukleasen schützen und dient außerdem als Erkennungsmerkmal für die Ribosomen. An das 3’Ende wird ein Polyadenylat-Schwanz angeheftet, dieser dient der Erhöhung der Stabilität und hilft der m-RNA eventuell beim Verlassen des Zellkerns. Ein weiterer Vorgang während des Processings ist das Spleißen. Beim Spleißen werden nichtcodierende Introns aus der mRNA herausgeschnitten und die verbliebenen codierenden Exons anschließend verbunden (verspleißt). Dieser Vorgang wird durch small nuclear ribonucleoprotein particels (snRNP), Verbindungen aus snRNA (kleine nukleäre RNA) und Proteinen, katalysiert. Bei Prokaryoten findet die Transkription bereits im Cytoplasma statt, da diese keinen Zellkern besitzen. Außerdem wird die mRNA meist nicht mehr prozessiert, da die meisten Prokaryoten keine Introns besitzen. - tRNA (Transfer-RNA): die tRNA hat die Aufgabe, die Basenfolge der mRNA in die Aminosäurefolge eines Proteins zu übersetzen. Dieser Vorgang wird als Translation bezeichnet. Die tRNA besitzt eine charakteristische Kleeblattsruktur (siehe Abb.4), an ihrem 3’-Ende wird durch spezielle Enzyme, den Amino-acyl-tRNA-Synthetasen, die passende Aminosäure angehängt. Um welche AS es sich dabei handelt wird durch das Anticodon der mittleren Schleife bestimmt. 7 Nukleinsäuren Abb.4: Struktur der tRNA (Campbell, Biologie, S.335, 2.korrigierter Nachdruck 2000, Spektrum-Verlag) • rRNA (ribosomale RNA): die rRNA verbindet sich mit zahlreichen Proteinen zu Ribosomen, wobei sie massenmässig ca. 60% ausmacht. Die Ribosomen spielen eine wichtige Rolle bei der Translation, indem sie die Bindung der tRNA an die mRNA-Codons koordinieren und die Aminosäuren zu einer Polypeptidkette verknüpfen. Jedes Ribosom besteht aus einer großen und einer kleinen Untereinheit, die sich bei Beginn der Translation verbinden. • gRNA (guide RNA): die gRNA ist von Bedeutung beim RNA-Editing, sie ist zuständig für die Insertion oder Deletion von Nukleotiden. Das RNA-Editing ändert die Sequenz einer RNA während oder nach der Transkription. Davon betroffene RNAs gelangen meist erst durch eine solche Nachbearbeitung zu einer sinnvollen 8 Nukleinsäuren Codierungssequenz in RNA-Edierungssystemen von Säugern beispielsweise werden einzelne Basen durch die Aminierung verändert. Für eine Änderung der Nukleotidabfolge in der RNA gibt es zwei verschiedene Möglichkeiten: die nachträgliche Modifikation von Basen und das nachträgliche Einfügen oder Herausschneiden von Nukleotiden. Beide Arten des Editings findet man in der Natur, wobei die Modifikation der Basen (Deaminierung bei Eukaryoten) am häufigsten verbreitet ist. Die zweite Art des Editings, das nachträgliche Einfügen oder Herausschneiden von Nukleotiden, wurde bislang nur bei wenigen Organismen (z.B. Trypanosomen) entdeckt. 1.4 Methoden der Molekularbiologie Zur Erforschung des genetischen Codes wurden verschiedene Methoden entwickelt. • Sequenzierung nach Sanger: durch Sequenzierung kann die exakte Nukleotidfolge eines DNA-Abschnitts bestimmt werden. Hierzu verwendet man Didesoxyribonukleotide (2 Sauerstoffatome fehlen), die nach ihrem Einbau eine weitere DNA-Synthese verhindern, da sie kein freies 3’-OH-Ende besitzen. Vier Einzelstränge der Vorlagen-DNA werden jeweils mit dem Didesoxyribonukleotid einer Base und den anderen für die Replikation notwendigen Komponenten versehen. Bei der Replikation des zu untersuchenden DNA-Abschnitts werden nun zufällig die modifizierten Nukleotide eingebaut, so das verschiedene DNA-Fragmente mit je einem Nukleotid Längenunterschied entstehen. Durch Gelelektrophorese können die vier Reaktionsgemische aufgetrennt werden und es kann die Sequenz des neusynthetisierten Strangs sofort abgelesen werden. Daraus kann man die Sequenz des Matrizenstrangs ableiten. • Einsatz von Reverser Transkriptase: Bei der reversen Transkriptase handelt es sich um eine RNA-abhängige DNA- Polymerase. Diese ist in der Lage, aus einer RNA- Matrize einen komplementären DNA- Strang zu erstellen. Dieser DNA- Strang wird copyDNA (cDNA) genannt. Sie ist wesentlich stabiler als die mRNA und erlaubt deshalb eine größere Bandbreite molekularbiologischer Untersuchungen. Gegenüber der DNA, die als Matrize für die mRNA diente, hat sie den Vorteil, dass sie nur den translatierbaren Bereich eines Gens ohne Introns darstellt. • Klonierung: Unter Klonierung versteht man nicht die Herstellung eines Klons, sondern die Veränderung des genetischen Materials eines Organismus. Um fremde DNA in Zellen zu bringen, benötigt man sogenannte Vektoren. Sehr häufig dienen hierzu bakterielle Plasmide. Die Plasmide werden aus dem Bakterium isoliert und es wird durch spezielle Restriktionsenzyme Fremd-DNA eingebracht. Anschließend wird das Plasmid wieder in die 9 Nukleinsäuren Zelle transferiert und die Bakterien mit rekombiniertem Genom werden kloniert. Auch Viren werden sehr häufig als Vektoren verwendet. Hierbei wird wieder unter Verwendung von Restriktionsenzymen und Ligase Fremd-DNA in das Phagengenom eingebracht. Der Phage bringt sein Genom dann über den üblichen Infektionsprozess in ein Bakterium ein, welches dann wieder kloniert wird. Auf diese Weise kann z.B. ein Proteinprodukt hergestellt werden, neue Stoffwechseleigenschaften eingebracht werden (z.B. Resistenzen) oder Gene vermehrt werden. • Die aktive Aufnahme von isoliertem genetischem Material aus der Umgebung (durch spezifische Rezeptorproteine) in eine Zelle (ohne Vektor) wird als Transformation bezeichnet. 10 Nukleinsäuren 2. Material und Methoden 2.1 Materialien Für die Versuche wurde zuvor von uns gesammeltes Pflanzenmaterial verwendet: Blüten der Margherite (Leucanthemum vulgare), Blätter des Löwenzahn (Taraxacum officinale), Blütenstände vom Kriechenden Günsel (Ajuga repens) und Blütenköpfe vom Wiesenklee (Trifolium pratense). 2.2 Versuchsdurchführung Die Versuchsanleitung ist nachzulesen im Skript „Grundpraktikum Pflanzenphysiologie und Molekulare Botanik Sommersemester 2003“. Zu Beginn zerkleinern wir das Pflanzenmaterial (1,0g Leucanthemum vulgare, 0,95g Taraxacum officinale, 1,05g Ajuga repens und 1,01g Trifolium pratense) grob mit den Händen. Anschließend geben wir flüssigen Stickstoff zu und zerreiben das gefrorene Material mit dem Pistill zu einem feinen Pulver (mechanische Zerstörung der Zellwände). Dieses wird schnell zu 4ml vorgewärmter CTAB-Lösung gegeben, und für 20min in ein Wasserbad mit 50°C gestellt. Zusammensetzung des CTAB-Puffers: - CTAB: bindet Polysaccharide in Komplexe ein, zerstört somit Zellwände und denaturiert Proteine. - EDTA: bindet Mg2+, fungiert so als Komplexbildner, der die Ribosomen ausfallen lässt und die rRNA freisetzt - DTT: spaltet Disulfidbrücken und bewirkt so eine Denaturierung der Proteine - PVP: zerstört die Zellwände und fängt Störsubstanzen wie beispielsweise Phenole ab - Tris-HCl: fungiert als pH-Puffer und hält somit das Ionenmilieu konstant - NaCl: verhindert bei richtiger Konzentration das Ausfallen der DNA 2.2.1 Gel-Elektrophorese Herstellung des Agarosegels: 11 Nukleinsäuren 0,5g Agarose und 50ml TBE-Puffer werden in der Mikrowelle zum Kochen gebracht. Die Agarose ist gelöst, wenn keine Schlieren mehr erkennbar sind. Nach dem Abkühlen werden 5Ìl EtBr (Ethidiumbromid)-Lösung hinzugegeben, und die fertige Gellösung in den Gelschlitten gegossen. Nach Einsetzen des Kamms (Taschenformers) erstarrt die Gellösung in den folgenden 15 Minuten. Auf einem Agarosegel sind 1,12 x 1010 Kopien eines Gen, das ein Protein von 560 Aminosäuren kodiert sichtbar. Dies ergibt sich durch folgende Rechnung: - 1 Aminosäure wird über ein Basentriplett kodiert: 3·560 AS = 1680 Nucleotide - Die DNA liegt doppelsträngig vor: 2·1680 = 3360 Nucleotide - Die Stoffmenge eines Nucleotids beträgt 350g/mol: 350g/mol·3360 = 1,176·106g/mol - Die Auflösungsgrenze von EtBr beträgt 20ng: 20ng/(1,176·106g/mol) = 1,7007·10-14mol - Die Avogadrozahl beträgt 6,022·1023: 6,022·1023·1,7007·10-14mol = 1,024·1010 Anschließend wird Chloroform/Isoamylalkohol zugegeben, und 5min mit 5000rpm zentrifugiert. Hierbei werden die Proteine getrennt und befinden sich nach der Zentrifugation in der organischen Phase, die sich unten im Reagenz befindet. Diese wird, ebenso wie die Interphase, verworfen. Wir arbeiten nur mit der wässrigen Phase weiter, da sie die Nukleinsäure in gelöster Form enthält. Die Zugabe von Isopropanol, und erneutes zentrifugieren, bewirken das Ausfällen der Nukleinsäure in einem Pellet, das wir mit TE-Puffer versetzen. Die erstarrte Gellösung wird in die mit TBE-Puffer gefüllte Gelkammer eingesetzt. Wir füllen zwei Vergleichsproben, sogenannte 1kb-Marker auf die Spuren 1 und 6 und geben unsere vier Proben (Spur 4, 5, 7 und 8), versetzt mit Ladelösung, in die Taschen. Die Elektrophorese läuft bei einer Spannung von 90 V für ca. 60 Minuten. Zum Schluss werden die sechs Nukleinsäure-Banden bei UV-Licht photographiert. 2.2.2 Photometrische Bestimmung 12 Nukleinsäuren Neben der Gel-Elektrophorese werden die vier Proben auch auf ihre Wellenlänge untersucht. Mittels eines Photometers wird die Extinktion bei 260nm (Absorptionsmaximum der DNS) und 280nm (Absorptionsmaximum der Proteine) ermittelt. Für die Absorption der Proteine sind die konjugierten Doppelbindungen der aromatischen Ringe der Aminosäuren verantwortlich. Aufgrund der geringen DNS-Ausbeute, werden 100Ìl einer 1/25 Verdünnung gemessen. Als Standard dient demineralisiertes Wasser. Der Rest der vier Proben wird bei -20°C für weitere Versuche aufbewahrt. 3. Ergebnisse 3.1 Ergebnisse der Gel-Elektrophorese Die Photos der Gelelektrophorese im Anhang zeigen unsere sechs Banden: Tab.1: Messergebnisse Spur 1 2 3 4 5 6 7 8 Probe 1kb-Marker / / Trifolium pratense Ajuga repens 1kb-Marker Leucanthemum vulgare Taraxacum officinale Das obere Photo ist heller und unschärfer, da es länger belichtet wurde. Hohe Konzentrationen zeigen sich durch extreme Helligkeit. Die gewanderte Strecke ist proportional zur Größe der Teilchen. So wandern die tRNAs die weiteste Strecke, da sie die geringste Teilchengröße besitzen. Erwartungsgemäß ist auf Spur 2 und 3 nichts erkennbar. Die Spuren 1 und 6 entsprechen sich, da sie beide den 1kb-Marker enthalten. Die 1. Bande haben alle sechs Spuren gemeinsam, da die chromosomale DNA auf Grund ihrer Größe in den Taschen geblieben ist. Die 2. Bande (noch vor 12kb) stellt die plastidäre DNA dar. Bei 2kb und 1kb sind jeweils zwei Doppelbanden erkennbar, die nahe beieinander liegen. Bei 2kb liegen die 28S rRNA der Ribosomen aus dem Cytoplasma und die entsprechende 23S rRNA der Plastiden und Mitochondrien. Bei 1 kb liegt eine weitere Doppelbande, die zunächst die 18S rRNA aus dem Cytoplasma und dann die 16S rRNA der Mitochondrien und Plastiden aufzeigt. In der nächsten Bande befindet sich die tRNA, die auf Grund ihrer geringen Größe weit im Gel wandert. Die folgenden Banden sind verschwommen und lassen sich nicht mehr klar unterscheiden. Es handelt sich dabei um mRNA und Bruchstücke der DNA, die durch 13 Nukleinsäuren mechanische Einwirkung zerkleinert wurden, eine genauere Bestimmung ist jedoch nicht möglich. 3.2 Ergebnisse der Photometrie Die Absorbtionsmessung im Photometer ergab folgende Ergebnisse: Tab.2: Extinktionen und Absorptionsverhältnis Probe OD260 OD280 Reinheitsgrad der NS (OD260/OD280) Leucanthemum vulgare 0,601 0,37 1,62 Taraxacum officinale 0,843 0,566 1,49 Ajuga repens 0,495 0,261 1,9 Trifolium pratense 0,623 0,509 1,22 Der Quotient aus der OD260 und der OD280 sollte zwischen 1,8 und 2,0 liegen, um einen hohen Reinheitsgrad zu bestätigen. Wenn dies der Fall ist, kann angenommen werden, dass eine OD260 von 1 (Extinktion 1.0 bei 260 nm) einer DNA- Konzentration von 40 ng/ml entspricht. Für die Berechnung der DNA-Konzentration in der jeweiligen Probelösung verwenden wir folgende Formel: c DNA = VF·OD260?40ng/Ìl VF=Verdünnungsfaktor=25 Tab.3: DNA-Konzentration Probe DNA-Konzentration (Ìg/Ìl) Leucanthemum vulgare 0,601 Taraxacum officinale 0,843 Ajuga repens 0,495 Trifolium pratense 0,623 Berechnung der isolierten NS-Menge pro Gramm Frischgewicht der Pflanze: - Leucanthemum vulgare: c = 0,601Ìg/Ìl in 500Ìl: 30,05Ìg DNA 1g abgewogen: 30,05Ìg DNA/g Frischgewicht 14 Nukleinsäuren - Taraxacum officinale: c = 0,843Ìg/Ìl in 500Ìl: 42,15Ìg DNA 0,95g abgewogen: 44,37Ìg DNA/g Frischgewicht - Ajuga repens: c = 0,495Ìg/Ìl in 500Ìl: 24,75Ìg DNA 1,05g abgewogen: 23,57Ìg DNA/g Frischgewicht - Trifolium pratense: c = 0,623Ìg/Ìl in 500Ìl: 31,15Ìg DNA 1,01g abgewogen: 30,84Ìg DNA/g Frischgewicht 4. Diskussion Im Gegensatz zu den 1kb-Markern, die eine deutliche Bänderung zeigen, weisen die Proben einen „Nebel“ auf. Der Nebel ist ein Hinweis auf DNA-Bruchstücke die durch mechanische Einwirkung (Vortexen,Pipettieren) entstanden sind. Bei der photometrischen Ermittlung des Nukleinsäuregehalts gibt der Quotient Auskunft über die Reinheit der Probe. Er sollte im Bereich von 1,8 - 2,0 liegen. Bis auf die Probe von Ajuga repens (Quotient von 1,9) liegen unsere Werte unter diesem Idealwert. Als Gründe für die Verminderung des Reinheitsgrades können Ablesefehler beim Wiegen, DNA-Verluste durch Pflanzenmaterial, das im Mörser zurückblieb, oder das Vermischen der organischen mit der wässrigen Phase nach dem Zentrifugieren genannt werden. Die Banden der 4 verschiedenen Proben zeigen in etwa das gleiche Muster, was sich darauf zurückführen lässt, dass sich in allen Pflanzenteilen die selben DNA- und RNA- Arten befinden. Unterschiede in der Deutlichkeit und Ausgeprägtheit der Banden sind auf Unterschiede in der Biosyntheseaktivität der jeweiligen Pflanzen bzw. Pflanzenteile zurückzuführen. Außerdem ist noch anzuführen, dass die verschiedenen Proben unterschiedliche Reinheitsgrade besaßen und dass beim Einfüllen der Proben in die Taschen durch Zittern DNA- und RNA- Material verlorengegangen sein könnte. 5. Zusammenfassung Die Gelelektrophorese zeigt, dass sich Nukleinsäuren sowohl in den verschiedenen Pflanzenteilen, als auch in den unterschiedlichen Pflanzenfamilien in gleichem Maß befinden. 15 Nukleinsäuren Des Weiteren gibt die zurückgelegte Wegstrecke Auskunft unterschiedlichen Nukleinsäuren. 16 über die Größe der Nukleinsäuren Literaturverzeichnis - Campbell: Biologie, 2. korrigierter Nachdruck 2000, Spektrum Verlag - Munk: Grundstudium Biologie, Bd. Genetik, 2001, Spektrum Verlag - Munk: Grundstudium Biologie, Bd. Mikrobiologie, 2001, Spektrum Verlag - Schlegel: Allgemeine Mikrobiologie, 1985, 6. Auflage, Thieme Verlag - Lewin: Molekularbiologie der Gene, 1998, Spektrum Verlag - Skript zum Grundpraktikum Pflanzenphysiologie und molekulare Botanik SS 2003 - Alte Protokolle Anhang 17
