Thema51 Reparatur 12
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Biochemieseminar 5.1: Mutation und Reparatur erstellt von J. Alves 5.1 Mutation und Reparatur Man nimmt an, dass die RNA in der Evolution zuerst entwickelt wurde und sowohl die Speicherung der genetischen Information als auch die Katalyse vor allem der genetischen Reproduktion ausgeführt hat. Die Phosphodiesterbindungen der RNA sind aber sowohl in alkalischer als auch saurer Lösung instabil, weil die freie 2´-OH-Gruppe direkt an der benachbarten Phosphodiesterbindung angreifen kann und die Spaltung unterstützt. Die Entwicklung größerer Genome für komplexere Zellen war so erst mit dem Übergang auf die DNA als genetischem Speichermaterial möglich. Schäden in der DNA: Obwohl die DNA vor allem in Bezug auf die Integrität der Phosphodiesterbindungen sehr stabil ist, unterliegt sie doch seltenen Reaktionen im wässrigen Medium, die aufgrund der Vielzahl der Nukleotide zu signifikanten Veränderungen im gesamten Genom führen (Abb. 1). So werden besonders Purine vom Zucker abgespalten Abb. 1: Angriffspunkte für wässrige Hydrolyse (→),Oxidation durch Sauerstoffradikale (→) und nicht-enzymatische Methylierung durch Adenosylmethionin (→). (Hydrolyse der N-glykosidischen Bindung). Beim diploiden menschlichen Genom schätzt man 10000 Depurinierungen pro Tag und immerhin noch 700 Depyrimidierungen. Das greift natürlich direkt in den Informationsgehalt der DNA ein, da weder eine DNA-Polymerase in der Replikation noch eine RNA-Polymerase in der Transkription gegenüber diesem basenlosen Zucker ein neues Nukleotid einpassen kann. Folgerichtig stoppen diese Enzyme an solchen Stellen in ihrem Template. Seltener sind Angriffe des Wassers auf die exozyklischen Aminogruppen der Basen. Hierbei schätzt man ungefähr 200 Desaminierungen von Cytosin pro diploidem Genom und Tag und 2 von Adenin. Diese Basen wandeln sich danach in Uracil bzw. Hypoxanthin um (Abb. 2). Das ist prinzi- Abb. 2: Basenpaarungen nach Desaminierung 1 Biochemieseminar 5.1: Mutation und Reparatur erstellt von J. Alves piell sogar noch gefährlicher für die Zellen, da Polymerasen dann falsche Nukleotide (Adenosin statt Guanosin bzw. Cytidin statt Uridin oder Thymidin) einbauen. Eine weitere Quelle struktureller Veränderungen der DNA sind Angriffe durch Sauerstoffradikale unterschiedlicher Oxidationsstufen. Ihr Ausmaß hängt nicht nur von der Konzentration des Sauerstoffs ab, sondern auch von der Ausstattung der Zelle mit verschiedenen Enzym-▪ systemen, die solche Radikale unschädlich machen (Superoxiddismutase: 2 O2 + 2 H+ → O2 + H2O2, Katalase: 2 H2O2 → 2 H2O + O2 etc.). Außerdem können ionisierende Strahlungen wie zum Beispiel Röntgenstrahlen die Konzentration von Radikalen erhöhen. Hauptsächlich werden die Basen angegriffen, wobei über Folgereaktionen eine Fülle von Degradationsprodukten entsteht, denen gemeinsam ist, dass sie die spezifische Basenpaarung nicht mehr eingehen können. UV-Strahlung der Wellenlängen um 260 nm, die von den Basen absorbiert wird, kann eine kovalente Verknüpfung zweier in einem Einzelstrang aufeinander folgender Pyrimidine (Pyrimidindimere) auslösen, die so keine Basenpaarung mehr eingehen können. Außerdem kann S-Adenosylmethionin, das von entsprechenden Enzymen dazu genutzt wird, eine Methylgruppe auf verschiedene Substrate zu übertragen, auch unkatalysiert Basen an verschiedenen Stellen methylieren. Zwar erfolgt die Methylierung an O6 des Guanins eher seltener, dafür ist sie aber gefährlich für die Zelle, da die Basenpaarung verändert wird (Abb. 3). Neben dieser endogenen Veränderung können auch Abb. 3: Basenpaarungen von O6-Methylguanin Umweltchemikalien verschiedene Gruppen auf die Basen übertragen. Ein Beispiel ist Benzpyren, das zu den Polyzyklischen aromatischen Kohlenwasserstoffen (PAK) gehört, die bei Verbrennungsprozessen auftreten und sich im Rauch wiederfinden. So gelangen sie zum Beispiel auf geräucherte Waren und auf Grillgut. Wenn die Leber versucht, diese Substanzen zu entgiften, entstehen zum Teil sehr reaktive Verbindungen, die sich an Basen anlagern können Abb. 4: Anlagerung von Benzpyren an Guanin 2 Biochemieseminar 5.1: Mutation und Reparatur erstellt von J. Alves (Abb. 4). Hier ist es vor allem der große Raumbedarf der Anlagerung, der mit der Basenpaarung und mit der Sequenzerkennung durch Proteine interferiert. Neben dem direkten Einfluss von geschädigten Basen auf die Arbeit der Polymerasen resultieren ihre wesentlichen Folgen in der Induktion von Mutationen. Diese Änderungen der Genomsequenz werden aufgrund des vergleichsweise geringen Anteils der Gensequenzen an der Gesamtsequenz in nicht kodierenden Bereichen liegen. Dort können sie entweder ohne Effekte bleiben oder die Regulation der Genexpression verändern. Das modifiziert die Menge an Genprodukt. Außerdem kann der Spleißprozess beeinträchtigt werden. So können ganze Exons nicht in Protein übersetzt werden oder durch falsche Exongrenzen zusätzliche Aminosäuren eingebaut bzw. Abschnitte deletiert werden. Mutationen in den kodierenden Bereichen führen in der Regel zu Änderungen der Aminosäuresequenz (Abb. 5). Dabei führen Punktmutationen nicht notwendigerweise zu einer Änderung der eingebauten Aminosäure, da der genetische Code redundant ist und häufig die dritte Position des Codons unterschiedlichen aus Basen bestehen kann. Die Länge des Proteins kann verändert werden, wenn ein Codon zu einem Stopp-Codon oder das (Verkürzung) Stopp-Codon zu Abb. 5: Folgen von Mutationen in den kodierenden Sequenzen einem normalen Codon (Verlängerung) mutiert. Auch die Insertionen oder Deletionen von einem oder zwei Nukleotiden führen über Leserasterverschiebungen zu längeren oder, sehr viel häufiger, kürzeren Proteinen. Reparatur von Schäden der DNA: Prinzipiell werden in den Zellen geschädigte Strukturen abgebaut und durch neu synthetisierte ersetzt. Diese Vorgehensweise kann sich bei der DNA als dem Speicher der genetischen Information nicht darauf beziehen, dass ein ganzes Chromosom erst abgebaut und dann neu generiert würde. Allerdings ist die genetische Information durch die homologe Basenpaarung in beiden Einzelsträngen äquivalent vorhanden. Ein Schaden einer Base in einem Einzelstrang kann also unter Ausnutzung des Gegenstrangs als Template durch Abbau und Neusynthese dieses Strangs in dem geschädigten Bereich repariert 3 Biochemieseminar 5.1: Mutation und Reparatur erstellt von J. Alves werden. Dazu gibt es folgende enzymatische Reaktionswege in den Zellen: die Basenexzisionreparatur, die Nukleotidexzisionsreparatur und die Mismatch-Reparatur. Basenexzisionreparatur (BER): Die geschädigte Base wird von einem für diesen Schaden spezifischen Enzym, der DNA-Glykosylase erkannt und von dem Zucker abgespalten (Abb. 6). So entsteht eine AP-Stelle (steht gleichermaßen für apurinisch wie für apyrimidinisch). An diesen basenlosen Zuckern, die wie oben beschrieben auch spontan durch Depurinierung und Dypyrimidierung entstehen können, spalten AP-Endonukleasen das Zuckerphosphatrückgrat ein. So schaffen sie den Angriffspunkt für Exonukleasen, die von diesen Enden her die Lücke erweitern. Die Lücke wird von der DNA-Polymerase β in Eukaryonten zupolymerisiert, wobei die letzte Phosphodiesterbindung nach Einbau aller Nukleotide von der DNA-Ligase III geknüpft werden muss. Dafür ist Energie notwendig, die durch ATP bereitgestellt wird AMP wird erst an das 5´-Phosphat gebunden und dann bei Knüpfen der Phosphodiesterbindung wieder Abb. 6: Ablauf der BER abgespalten. Für die BER ist es essentiell, dass die DNAGlykosylasen in ausreichender Menge bereitstehen und dauernd die DNA auf Schäden überprüfen. In vielen Zellarten sind sie deshalb induzierbar, das heißt sie werden bei vermehrtem Auftreten von Schäden in größerer Menge gebildet. Nukleotidexzisionsreparatur (NER): Es war kaum möglich und sicherlich evolutionär nicht vorteilhaft, für jeden noch so seltenen Schaden eine spezielle DNA-Glykosylase zu bilden. Deshalb hat sich noch ein weiteres Reparatursystem entwickelt, das vor allem starke lokale Deformationen der DNA, durch zum Beispiel kovalente Basenaddukte oder auch durch die von UV-Licht induzierte Dimerisierung aufeinander folgender Pyrimidine, erkennt. Es Abb. 7: Ablauf der NER besteht aus einem Proteinkomplex, der in Bakterien 4 Biochemieseminar 5.1: Mutation und Reparatur erstellt von J. Alves nur 3 Proteine (uvrABC Exzinuklease) in höheren Eukaryonten aber mindestens 9 Proteine umfasst. Er lagert sich zentral auf den Schaden und positioniert auf beiden Seiten (5´ und 3´) Nukleasen, die das Zuckerphosphatrückgrat des geschädigten Einzelstrangs spalten und so ein ganzes Oligonukleotid (17-18 Nukleotide lang in Prokaryonten und 27-29 Nukleotide lang in Eukaryonten) freisetzen. Diese Lücke wird dann von einer DNA-Polymerase zupolymerisiert und die letzte Phosphodiesterbindung von der DNA-Ligase geschlossen. Dieses Reparatursystem hat den Vorteil, dass es ein breites Spektrum von Schäden repariert. Außerdem ist es an die Transkriptionsmaschinerie gekoppelt, sodass Schäden in transkribierten Genen bevorzugt repariert werden. Defekte in den Genen des Reparatursystems führen zum Krankheitsbild Xeroderma Pigmentosum (daher die Nomenklatur einiger Proteine XPA, XPF etc.) bei dem vor allem Schäden durch UV-Licht nicht repariert werden. Die Patienten haben starke Hautveränderungen (schuppig trockene Haut mit überpigmentierten Bereichen) und entwickeln vermehrt Hauttumore. Reparatur von Replikationsfehlern (Mismatuc-Reparatur MMR): Die Fehler, die DNAPolymerasen während der Replikation machen, sind Fehleinbauten von Nukleotiden gegenüber einer nicht komplementären Base sowie ein Verrutschen von neu synthetisiertem und Template-Einzelstrang gegeneinander, was zur Ausbildung einzelsträngiger Schleifen führt. Um solche Fehler zu reparieren, muss das Mismatch-Reparatursystem (MMR) entscheiden, welches der ursprüngliche, korrekte Templatestrang und welches der neu synthetisierte, fehlerhafte Strang ist, der repariert werden muss. Erst neuerdings hat man Abb. 8: Mismatch-Reparatur in Eukaryonten 5 Biochemieseminar 5.1: Mutation und Reparatur erstellt von J. Alves herausgefunden, dass es sich dazu an den gleitenden Klammern orientiert, die die Affinität der DNA-Polymerasen zur DNA erhöhen und damit für die Synthese längerer DNA-Stücke sorgen. Diese ringförmigen Proteine (in Eukaryonten das PCNA = proliferating cell nuclear antigen) verbleiben am Ende der DNA-Synthese noch eine Weile auf der DNA und werden in eindeutiger Orientierung an einem neu synthetisierten Primer auf die DNA gesetzt. Die eine Seite des Rings (zum 3´-OH des Primers orientiert) bindet an die DNA-Polymerase, an die andere Seite binden eine Vielzahl von Proteinen, unter anderem die MSH-Proteine, die als Heterodimere Basenfehlpaarungen (Mismatche durch MutSα = MSH2/MSH6) oder heraushängende Einzelstrangschleifen (durch MutSβ = MSH2/MSH3) erkennen. Diese Heterodimere können also gleich nach der Synthese auf einen Fehler reagieren. Sie bilden wie das PCNA einen Ring um die DNA und holen MutLα (Heterodimer aus MLH1/PMS2) heran (Abb. 8A). Dieser Komplex aus beiden Heterodimeren sucht die DNA neben dem Replikationsfehler nach Einzelstrangbrüchen und/oder PCNA-Ringen ab, wie sie sich noch kurz nach der Replikationsgabel auf der DNA befinden. Ob die MutS-Proteine dabei am Fehler gebunden bleiben, ist noch nicht eindeutig geklärt. PMS2 kann durch Kontakt mit PCNA zur Spaltung des Einzelstrangs aktiviert werden, der 5´→3´ durch den Ring auf die Replikationsseite zeigt und somit dem neu synthetisierten Strang entspricht (Abb. 8 B). Von entsprechend neben dem Fehler positionierten vorhandenen (Abb. 8C) oder durch PMS2 erzeugten Strangbrüchen (Abb. 8D) aus baut die Exonuklease I in 5´→3´-Richtung den Einzelstrang über den Fehler hinaus ab. Diese größere Lücke wird durch die DNAPolymerase δ zupolymerisiert. Die DNA-Ligase I bildet dann wieder die letzte Phosphodiesterbindung. In Escherichia coli, wird ein spezielles Methylierungsmuster der DNA dazu genutzt, den Template-Einzelstrang zu erkennen. Das ist aber ein Sonderfall, der nur einige Bakterienarten betrifft. Reparatur von Doppelstrangbrüchen: Die gleichzeitige Schädigung beider Einzelstränge wie zum Beispiel durch einen Doppelstrangbruch kann von den bisher beschriebenen Reparatursystemen nicht bearbeitet werden. Prinzipiell braucht die Zelle dazu ein weiteres DNA-Molekül gleicher oder sehr ähnlicher Sequenz. Dann können in einer Rekombinationsreaktion, bei der nach teilweisem Abbau der Bruch-Enden und Anlagerung einzelsträngiger Bereiche an homologe Sequenzen im zweiten DNA-Doppelstrang Strukturen geschaffen werden, an denen DNA-Polymerasen zusammen mit DNA-Ligase die Lücken wieder schließen können (Abb. 9). So kommt man zu einer Struktur, bei der sich zweimal Einzelstränge überschneiden. Diese Kreuzungspunkte nennt man Holliday-Strukturen. An ihnen können spezielle Endonukleasen spalten, so dass zwei verschiedene Produkte entstehen: 6 Biochemieseminar 5.1: Mutation und Reparatur erstellt von J. Alves entweder ist nur in dem reparierten Bereich die Sequenz verändert und die Enden der DNA-Moleküle sind gleich = Genkonversion (blau bleibt an blau geknüpft und rot an rot, phänotypisch nur in dem reparierten Bereich zu erkennen) oder die Enden sind ausgetauscht = Rekombination (das eine Molekül fängt blau an und hört rot auf und umgekehrt, phänotypisch sind Allele des einen DNA-Moleküls an Allele des anderen geknüpft). Solche homologen Rekombinationen werden aktiv während der Meiose erzeugt, um das genetische Material von mütterlichen und väterlichen Genen vor der Weitergabe an die nächste Generation Ausgangspunkt neu sind zu kombinieren. aktiv Der initiierte Doppelstrangbrüche. Nun ist nur während der DNA-Synthese bis zur Mitose ein zweites DNA-Molekül gleicher Sequenz in physikalischer Nähe zu einem Bruchpunkt. Es gibt aber noch ein zweites System, dass Doppelstrangbrüche „heilen“ kann und in unseren Zellen häufiger genutzt wird: das Verknüpfen nicht homologer Enden (NHEJ = Non-homolgous end joining). Hier werden die Doppelstrangenden von einem Proteinkomplex (Ku-Protein und DNA-abhängige Proteinkinase) Abb. 9: Reparatur von Doppelstrangbrüchen durch Rekombination erkannt und gebunden (Abb. 10). Diese können nun die DNA-Ligase IV mit Hilfsproteinen heranleiten. Eine direkte Ligation der stumpfen Enden ist so möglich. Meist sind sie aber durch ionisierende Strahlung oder andere Noxen entstanden, sodass sie gar nicht direkt ligierbar sind. Dann können eine Nuklease (Artemis) und/oder eine DNA-Polymerase (Pol λ oder Pol µ) die Enden erst bearbeiten, was in der Regel zu Verkürzungen führt. Pol µ kann aber auch Template unabhängig einige Zufallsnukleotide ans 3´OH-Ende anhängen, sodass auch Insertionen resultieren können. Es scheint also wichtiger zu sein, die DNA-Enden schnell wieder zu verknüpfen als die Sequenz genau zu erhalten. Dies muss man auch vor dem Hintergrund der nur geringen Menge wirklich für Proteine kodierender Sequenzen sehen. 7 Biochemieseminar 5.1: Mutation und Reparatur erstellt von J. Alves Abb. 10: Reparatur von Doppelstrangbrüchen durch NHEJ Das NHEJ-System ist auch verantwortlich für die Generierung der Antikörper- und T-ZellRezeptorgene in den Lymphozyten, da die dafür notwendige stellenspezifische Rekombination zwischen V- und J- bzw. V-, D- und J-Genabschnitten jeweils durch einen in spezifischer Sequenz generierten Doppelstrangbruch (Rag1-Rag2 wird nur in diesen Zellen und dieser Entwicklungsphase exprimiert) eingeleitet wird. Hierbei ist die Generierung zusätzlicher Vielfalt über das vorhandene Repertoire von Genabschnitten hinaus ein wichtiger Schritt zu der schier unendlich erscheinenden Adaptierbarkeit unseres Immunsystems an fremde Antigene. Zusammenhang fehlerhafter DNA-Reparatur mit Krebs: Krebs ist eine genetische Erkrankung, bei der viele Gene so verändert werden, dass die kodierten Proteine unkontrolliertes Wachstum der Zelle und damit eine Tumorbildung hervorrufen. Sobald die Balance zwischen DNASchäden und ihrer Reparatur durch defekte Reparaturproteine gestört Abb. 11: Zusammenfassung der DNA-Reparaturwege und ihr Zusammenhang mit Krebs 8 Biochemieseminar 5.1: Mutation und Reparatur erstellt von J. Alves wird, resultieren vermehrt Mutationen, die dann auch Krebs bedingen können. So findet man Erbkrankheiten, in denen Gene von Reparaturproteinen mutiert sind, die mit frühzeitigem Auftreten von Krebs verknüpft sind. Abbildung 11 fasst DNA-Schäden und ihre Reparatur zusammen und zeigt beispielhaft diese Zusammenhänge auf. Bis auf BCRA2 wurden die dort genannten Proteine bereits im Text erwähnt. Für dieses Protein wurde schon früh erkannt, dass Frauen mit einem mutierten Allel eine erhöhte Brustkrebswahrscheinlichkeit haben. Daher der Name BRCA = BReast CAncer. Heute weiß man, dass es an die Rekombinase (RAD51) bindet und bei der Rekombinationsreparatur von Doppelstrangbrüchen direkt beteiligt ist. Neben den ererbten Mutationen in Genen von Reparaturproteinen findet man natürlich auch in Tumoren neue somatische Mutationen, die im Laufe der Tumorentwicklung erworben wurden und die die Evolution des Tumors beschleunigen (siehe Seminarthema Krebs). Grundlegende Literatur: Löffler, Basiswissen Biochemie, 7. Auflage S. 229-233 Löffler Petrides Heinrich, Biochemie & Pathobiochemie, 8. Auflage S. 236-241 Rassow Hauser Netzker Deutzmann, Biochemie, 3. Auflage S. 492-500 Themen, die im Vortrag angesprochen werden sollten: Schäden an der DNA und ihre Folgen • Depurinierungen und Depyrimidierungen • Desaminierungen von Cytosin und Adenin • Methylierungen durch S-Adenosylmethionin • Oxidationsschäden • Schäden durch UV-Licht • Anlagerung von Benzpyren Folgen von Mutationen Reparaturmechanismen • Basenexzisionsreparatur • Nukleotidexzisionsreparatur • Mismatch-Reparatur • Rekombinationsreparatur • NHEJ Zusammenhang DNA-Reparatur - Krebs 9
