Tierärztliche Hochschule Hannover

Tierärztliche Hochschule Hannover
Erprobung einer Kombinationstherapie aus dem
Histondeacetylaseinhibitor Valproat und dem mTORInhibitor Temsirolimus für das fortgeschrittene
Prostatakarzinom in vitro und am Nacktmausmodell.
INAUGURAL – DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae ( Dr. med. vet. )
vorgelegt von
Lisa Krahn
Bremen
Hannover 2012
Wissenschaftliche Betreuung:
1. Prof. Dr. Ralph Brehm
Anatomisches Institut
Tierärztliche Hochschule Hannover
2. PD Dr. Paul Thelen
Urologische Klinik und Poliklinik
Universitätsmedizin Göttingen
1. Gutachter:
- Prof. Dr. Ralph Brehm
2. Gutachter:
- Prof. Dr. Bernd Schröder
Tag der mündlichen Prüfung:
24.05.2012
Meiner Familie
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis ............................................................ XI
Abbildungsverzeichnis ............................................................ XIV
Tabellenverzeichnis ................................................................. XV
1 Einleitung ..............................................................................1
2 Literaturübersicht ..................................................................3
2.1 Das Prostatakarzinom ..................................................................... 3
2.1.1 Epidemiologie ........................................................................................... 3
2.1.2 Ätiologie .................................................................................................... 4
2.1.3 Klinik ......................................................................................................... 4
2.1.4 Früherkennung ......................................................................................... 5
2.1.5 Das Prostataspezifische Antigen .............................................................. 6
2.1.6 Stadieneinteilung ...................................................................................... 8
2.1.7 Therapie ................................................................................................... 8
2.2 Der Androgenrezeptor und das kastrationsresistente .................... 10
Prostatakarzinom .................................................................................. 10
2.3 Das IGF-System............................................................................ 14
2.3.1 IGF-1 ...................................................................................................... 14
2.3.2 IGF-2 ...................................................................................................... 15
2.3.4 IGF-Rezeptoren ...................................................................................... 15
2.3.5 IGF-Bindungsproteine (IGF-BP) ............................................................. 16
2.3.6 IGF-BP Proteasen .................................................................................. 17
2.3.7 Das IGF-System und Tumorentstehung ................................................. 17
V
2.4 Histone und Epigenetik ................................................................. 19
2.4.1 Aufbau der Chromosomen ..................................................................... 19
2.4.2 Epigenetik ............................................................................................... 20
2.5 Histondeacetylasen und Valproat .................................................. 21
2.5.1 Histonacetyltransferasen und Histondeacetylasen ................................. 21
2.5.2 Histondeacetylasen im Prostatakarzinom ............................................... 22
2.5.3 Histondeacetylaseinhibitoren .................................................................. 23
2.5.3.1 Valproat ........................................................................................... 23
2.6 Mammalian target of rapamycin (mTOR) ...................................... 25
2.6.1 mTOR-Inhibitoren und Temsirolimus ...................................................... 27
2.7 Zelllinien ........................................................................................ 28
2.8 Mausmodell ................................................................................... 28
3 Material und Methoden .......................................................30
3.1 Geräte ........................................................................................... 30
3.2 Gebrauchsmaterialien ................................................................... 31
3.3 Molekularbiologische Agenzien ..................................................... 31
3.4 Lösungen/Fixantien ....................................................................... 33
3.5 Primer ........................................................................................... 34
3.6 Zellkultur ....................................................................................... 35
3.6.1 Zelllinie ................................................................................................... 35
3.6.2 Kultivierung der Zelllinie ......................................................................... 35
3.6.3 Passagieren der Zellkultur ...................................................................... 35
3.6.4 Behandlung der LNCaP-Zellen mit Valproat und Temsirolimus .............. 36
3.6.5 Vitalitätstest ............................................................................................ 37
VI
3.6.5.1 Prinzip des Alamar Blue Assays ........................................................ 37
3.6.5.2 Protokoll des Alamar Blue Assays ..................................................... 38
3.6.6 Proliferationstest ..................................................................................... 38
3.6.6.1 Prinzip des BrdU-ELISA ..................................................................... 38
3.6.6.2 Protokoll des BrdU-ELISA .................................................................. 39
3.6.7 RNA-Extraktion aus der Zellkultur .......................................................... 40
3.6.7.1 Allgemeines Arbeiten mit RNA ........................................................... 40
3.6.7.2 Prinzip der RNA-Extraktion aus der Zellkultur .................................... 40
3.6.7.3 Protokoll zur RNA-Extraktion aus der Zellkultur ................................. 41
3.7 Tierversuch ................................................................................... 42
3.7.1 Versuchstiere.......................................................................................... 42
3.7.2 Vorbereiten der LNCaP-Zellen zur Injektion ........................................... 42
3.7.3 Medikation der Versuchstiere ................................................................. 42
3.7.4 Erfassung der Ergebnisse ...................................................................... 43
3.7.5 Aufbereitung der Tumorgewebeproben .................................................. 44
3.7.5.1 Fixierung und Einbettung des Tumorgewebes ................................... 44
3.7.5.2 Herstellung der Paraffinschnitte ......................................................... 44
3.7.5.3 HE-Färbung ....................................................................................... 44
3.7.5.3.1 Protokoll der HE-Färbung ............................................................ 45
3.7.5.4 Ki-67 Immunhistochemie ................................................................... 45
3.7.5.4.1 Prinzip der Ki-67 Färbung............................................................ 46
3.7.5.4.2 Protokoll der Ki-67 Immunhistochemie ........................................ 46
3.7.5.5 Berechnung des Proliferationsindex .................................................. 47
3.7.6 PSA-Messung......................................................................................... 48
3.7.6.1 Prinzip der PSA-Messung .................................................................. 48
3.7.6.2 Protokoll zur PSA- Messung .............................................................. 47
3.7.7 RNA-Extraktion aus Tumorgewebe ........................................................ 50
3.7.7.1 Prinzip der RNA-Extraktion aus Tumorgewebe.................................. 50
3.7.7.2 Protokoll zur RNA-Extraktion aus Tumorgewebe ............................... 50
VII
3.8 RNA-Quantifizierung mittels Agilent 2100 Bioanalyzer .................. 51
3.8.1 Prinzip der RNA-Quantifizierung............................................................. 51
3.8.2 Protokoll der RNA-Quantifizierung.......................................................... 52
3.8.3 Auswertung der Messungen ................................................................... 53
3.9 cDNA-Synthese............................................................................. 54
3.9.1 Prinzip der cDNA-Synthese .................................................................... 54
3.9.2 Protokoll der cDNA-Synthese ................................................................. 55
3.10 Polymerase-Kettenreaktion (PCR) .............................................. 57
3.10.1 Prinzip der PCR .................................................................................... 57
3.10.2 Real Time RT-PCR............................................................................... 58
3.10.2.1 Real Time RT-PCR Amplifikationsdiagramm ................................... 59
3.10.2.2 Protokoll zur SYBR Green PCR ....................................................... 60
3.10.2.3 iCycler Programm ............................................................................ 62
3.10.2.4 Auswertung der Messungen ............................................................ 62
3.11 Statistik ....................................................................................... 63
4 Ergebnisse ..........................................................................64
4.1 Ergebnisse der Zellversuche ......................................................... 64
4.1.1 Ergebnisse der RNA-Quantifizierung...................................................... 64
4.1.2 Ergebnisse des Vitalitätstests ................................................................. 67
4.1.3 Ergebnisse des Proliferationtests ........................................................... 68
4.1.4
Veränderung der Genexpression nach Behandlung mit Valproat,
Temsirolimus oder einer Kombination der beiden Medikamente ....................... 69
4.1.4.1 Expression von KLK3: ........................................................................ 70
4.1.4.2 Expression von IGF-1: ....................................................................... 71
4.1.4.3 Expression von IGF-1-R: ................................................................... 72
4.1.4.4 Expression von IGF-BP-3: ................................................................. 73
VIII
4.2 Ergebnisse des Tierversuchs ........................................................ 74
4.2.1 Verwendete und ausgewertete Mäuse ................................................... 74
4.2.2 Das Tumorwachstum.............................................................................. 75
4.2.3 Der Proliferationsindex ........................................................................... 82
4.2.4 PSA-Sekretion ........................................................................................ 92
4.2.5
Veränderung der Genexpression nach Behandlung mit Valproat,
Temsirolimus oder einer Kombination der beiden Medikamente ....................... 94
4.2.5.1 Expression von KLK3: ........................................................................ 95
4.2.5.2 Expression von IGF-1: ....................................................................... 96
4.2.5.3 Expression von IGF-1-R: ................................................................... 97
4.2.5.4. Expression von IGF-BP-3: ................................................................ 98
5 Diskussion ...........................................................................99
5.1 Ergebnisse der Zellversuche ......................................................... 99
5.1.1 Vitalität und Proliferation der Zellen ........................................................ 99
5.1.2 Veränderung der Genexpression von KLK3, IGF-1, IGF-1-R und IGF-BP-3
........................................................................................................................ 101
5.2 Ergebnisse des Tierversuchs ...................................................... 107
5.2.1 Anwachsen der Tumoren ..................................................................... 107
5.2.2 Wachstum der Tumoren ....................................................................... 108
5.2.3 PSA im Serum der Mäuse .................................................................... 112
5.2.4 Veränderung der Genexpression von KLK3, IGF-1, IGF-1-R und IGF-BP-3
........................................................................................................................ 113
6 Schlussfolgerung ..............................................................115
7 Zusammenfassung ...........................................................116
8 Abstract .............................................................................118
IX
9 Literaturverzeichnis ...........................................................120
X
Abkürzungsverzeichnis
%
Prozent
°C
Grad Celsius
µl
Mikroliter
µMol
Mikromolarität
ADP
Adenosindiphosphat
ARP
Acidic ribosomal phosphoprotein
bp
Basenpaare
BPH
Benigne Prostatahyperplasie
BrdU
Bromodeoxyuridine
BSA
Bovines Serum Albumin
ca.
circa
cdk
Cyclin dependent kinase
cDNA
Complementary deoxyribonucleic acid
CRPC
Castration-Resistant Prostate Cancer
Ct
Threshold-Cycle
d
Day
dest.
destilliert
DNA
Deoxyribonucleic acid
dNTPs
Desoxyribonukleosidtriphosphate
e. V.
eingetragener Verein
EDTA
Ethylendiamintetraacetat
EGF
Epidermal growth factor
ELISA
Enzyme-linked immunosorbent assay
EMEA
European Medicine Agency
FCS
Fetal calf serum
FDA
Food and Drug Administation
F-Primer
Forward-Primer
FSH
Follikelstimulierendes Hormon
FU
Fluoreszenz
GH
Growth hormon
H
Histon
XI
HAT
Histonacetyltransferasen
HDAC
Histondeacetylasen
HDACi
Histondeacetylaseinhibitoren
HE-Färbung
Hämatoxylin-Eosin-Färbung
i. v.
Intra venös
IGF
Insulin like growth factor
IGF-1-R
Insulin like growth factor 1 receptor
IGF-BP
Insulin like growth factor binding protein
kg
Kilogramm
Ki-67
Kiel-67
KLK3
Kallikrein 3
L
Liter
LNCaP
Lymph node cacinoma of the prostate
M6P
Mannose-6-Phosphat
ml
Milliliter
mm
Millimeter
mMol
Millimolarität
mRNA
messenger Ribonucleic acid
mTOR
mammalian target of rapamycin
mTORC
mammalian target of rapamycin complex
NaCL
Natriumchlorid
ng
Nanogramm
nm
Nanometer
NMRI nu/nu
Naval Medical Research Institute nude/nude
Nr.
Nummer
PBGD
Porphobilinogen-deaminase
PBS
Phosphate buffered saline
PC
Prostate Cancer
PI3K
Phosphoinositid-3-Kinase
PIN
prostatische intraepitheliale Neoplasie
PSA
Prostata spezifisches Antigen
PTEN
Phosphatase und tensin homolog
RFU
Relative fluorescence units
RKI
Robert Koch Institut
XII
RPMI
Roswell Park Memorial Institute
R-Primer
Reverse-Primer
rRNA
Ribosomal Ribonucleic acid
RT-PCR
reverse transkriptase Polymerase-Kettenreaktion
s
Sekunde
S
Svedberg
SIR
Silent Information Regulator
TBS
Tris buffered Saline
Tem
Temsirolimus
TIMP
tissue inhibitor of metalloproteinase
TNM
Tumor Lymphknoten Metastasen
tRNA
Transfer Ribonucleic acid
TSA
Trichostatin A
u. a.
unter anderem
u.
Und
UICC
Union internationale contre le cancer
UPM
Umdrehungen pro Minute
USA
United States of America
VEGFRs
Vascular endothelial growth factor receptors
VPA
Valproat
z.B.
zum Beispiel
XIII
Abbildungsverzeichnis
Abbildung
1:
Möglichkeiten
der
Entwicklung
des
kastrationsresistenten
Prostatakarzinoms durch Reaktivierung des Androgenrezeptors ............................. 13
Abbildung 2: Schematische Darstellung der Zusammenhänge des IGF-Systems mit
dem Androgenrezeptor und PSA .............................................................................. 19
Abbildung 3: Amplifikationsdigramm einer Real Time RT-PCR ................................ 60
Abbildung 4: Repräsentatives Elektropherogramm der isolierten RNA ................... 65
Abbildung 5: Repräsentative Darstellung der Elektrophorese ................................. 66
Abbildung 6: Darstellung der Vitalität der behandelten Zellen. ................................. 67
Abbildung 7: Proliferationsaktivität der behandelten Zellen ...................................... 68
Abbildung 8: Expression von KLK3 .......................................................................... 70
Abbildung 9: Expression von IGF-1 .......................................................................... 71
Abbildung 10: Expression von IGF-1-R .................................................................... 72
Abbildung 11: Expression von IGF-BP-3 .................................................................. 73
Abbildung 12: Durchschnittliches Wachstum der Tumoren ...................................... 76
Abbildung 13 A-D: Wachstum der Tumoren der Mäuse. .......................................... 80
Abbildung 14 A-B: Tumorgewebe der Gruppe 0 ....................................................... 83
Abbildung 15 A-D: Tumorgewebe der Gruppen 0-3 ................................................. 88
Abbildung 16 A,B: Tumorgewebe der Gruppe 3 ....................................................... 90
Abbildung 17 A-B: Tumorgewebe der Gruppe 0 ....................................................... 92
Abbildung 18: PSA Menge gemessen im Serum der Mäuse .................................... 93
Abbildung 19: PSA-Sekretion der Tumoren .............................................................. 94
Abbildung 20: Expression von KLK3 im Tumorgewebe der Mäuse .......................... 95
Abbildung 21: Expression von IGF-1 im Tumorgewebe der Mäuse.......................... 96
Abbildung 22: Expression von IGF-1-R im Tumorgewebe der Mäuse ...................... 97
Abbildung 23: Expression von IGF-BP-3 im Tumorgewebe der Mäuse.................... 98
Abbildung 24: Schematische Darstellung der möglichen Effekte von IGF-1 und IGF1-R auf den Androgenrezeptor und mTOR ............................................................. 103
Abbildung 25: Schematische Darstellung der möglichen Effekte von IGF-1 und IGF1-R auf den Androgenrezeptor sowie mTOR und eines möglichen Feedback
XIV
Mechanismus von mTOR-Inhibitoren. .................................................................... 105
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Verwendete Primerpaare, Schmelzpunkte und Fragmentgrößen. ........... 34
Tabelle 2: Schema der Behandlung der LNCaP-Zellen ............................................ 37
Tabelle 3: Schema der Behandlung der Mäuse........................................................ 43
Tabelle 4: RNA-Konzentrationen der behandelten LNCaP-Zellen ............................ 66
Tabelle 5: Übersicht über die Anzahl der injizierten Mäuse, die Anzahl der Mäuse mit
Tumorwachstum und die Anzahl der auswertbaren Mäuse. ..................................... 75
Tabelle 6: Anzahl der Tiere pro Gruppe mit starkem, mäßigem oder geringem
Tumorwachstum. ...................................................................................................... 81
Tabelle 7: Durchschnittlicher Proliferationsindex ..................................................... 84
XV
1
Einleitung
Das Prostatakarzinom ist die häufigste Krebserkrankung des Mannes in westlichen
Gesellschaften. Zwei Drittel der Karzinome sind bei Diagnosestellung auf die
Prostata beschränkt und können erfolgreich behandelt werden (BÖRGERMANN et
al., 2009). Das letzte Drittel kann jedoch auf Grund der Ausbreitung des Karzinoms
nicht mehr erfolgreich operiert werden. Die Therapie der Wahl für diese Patienten ist
der vollkommene Androgenentzug. Im Anschluss an die Remission von 2-4 Jahren,
erfolgt jedoch die Entwicklung des kastrationsresistenten Prostatakarzinoms. Dieses
kann nur noch palliativ behandelt werden. Die verwendeten Medikamente verringern
die Schmerzen und erhöhen die Lebensqualität, verlängern das Leben aber nur um
ein paar Monate (TANNOCK et al., 2004). Aus diesem Grund werden neue
Medikamente benötigt, die auf karzinomspezifische Signalwege abzielen.
Das
Ziel
dieser
Arbeit
ist,
zu
untersuchen,
ob
die
Behandlung
von
Prostatakarzinomzellen (LNCaP, Lymph node cacinoma of the prostate) und
Prostatakarzinomzelltumoren mit dem Histondeacetylaseinhibitor Valproat und dem
mTOR-Inhibitor Temsirolimus einen synergistischen Effekt auf die Proliferation der
Tumorzellen zeigt und in wie weit das IGF-System dabei eine Rolle spielt.
Zu diesem Zweck wurden zum einen in einem Zellversuch LNCaP-Zellen mit
Valproat, Temsirolimus oder einer Kombination aus beiden Stoffen behandelt.
Anschließend wurden die Vitalität der Zellen mit einem Alamar Blue Assay und die
Proliferationsaktivität mit einem BrdU-ELISA gemessen. Die mRNA der Zellen wurde
extrahiert und die Expression verschiedener Gene mittels Real Time RT-PCR
bestimmt.
Zum anderen wurden LNCaP-Zellen in immunsupprimierte Nacktmäuse (NMRInu/nu)
implantiert. Die Mäuse wurden mit Valproat per os, Temsirolimus intravenös oder der
Kombination aus beiden Medikamenten behandelt. Eine Gruppe blieb unbehandelt
und diente als Kontrolle. Das Wachstum der entstehenden Tumoren wurde zweimal
die Woche vermessen. Nach sieben Wochen oder sobald es aus Tierschutzgründen
1
notwendig war, wurden die Mäuse getötet. Die mRNA aus einem Teil des Tumors
wurde extrahiert und ebenfalls die Expression verschiedener Gene mittels Real Time
RT-PCR bestimmt. Ein weiterer Teil des Tumors wurde histologisch aufbereitet und
eine HE-Färbung sowie eine Immunhistochemie gegen den Proliferationsmarker Ki67 angefertigt.
2
2
Literaturübersicht
2.1 Das Prostatakarzinom
2.1.1 Epidemiologie
Das
Prostatakarzinom
ist
die
häufigste
Krebserkrankung
des
Mannes
in
Deutschland. Die Zahl der jährlichen Neuerkrankungen lag 2002 bei ca. 48650.
Damit handelt es sich bei knapp einem Viertel (22,3%) aller Krebsneuerkrankungen
des Mannes um Prostatakrebs (Quelle: Gesellschaft der epidemiologischen
Krebsregister in Deutschland e.V. und das RKI, 2006).
Das mittlere Erkrankungsalter liegt bei 69 Jahren. Etwa 90 % aller Erkrankten sind
älter als 60 Jahre. Bei unter 50-Jährigen werden kaum Prostatakarzinome
beobachtet.
Die
Anzahl
der
Neuerkrankungen
stieg
seit
1980
kontinuierlich
an.
Die
altersstandardisierten Erkrankungsraten haben zwischen 1980 und 2004 um ca. 150
% zugenommen. Dies liegt zum einen an der demografischen Entwicklung und der
damit ständig steigenden Lebenserwartung, zum anderen an einer verbesserten
Früherkennung (ROHDE et al., 2007).
Die Sterberate ist seit 1970 fast unverändert. Wohingegen die Überlebensaussichten
für Erkrankte sich seit 1980 verbessert haben. Anfang der 1980er-Jahre betrug die 5Jahres-Überlebensrate ca. 70% (SCHÖN et al., 1999). Seit 1990 liegt die 5-JahresÜberlebensrate bei über 80% (ROHDE et al., 2007).
Als Ursache für die verbesserten Überlebensaussichten spielen zum einen eine
Verbesserungen
der
Therapiemöglichkeiten
sowie
eine
Verbesserung
der
Heilungschancen durch häufigere Entdeckung von Tumoren in früheren Stadien mit
frühzeitigerem Behandlungsbeginn eine Rolle. Zum anderen führt die frühere
Entdeckung durch verbesserte Früherkennung rein rechnerisch zu verbesserten
Überlebensaussichten, selbst wenn der Sterbezeitpunkt unbeeinflusst bliebe.
3
2.1.2 Ätiologie
Es werden verschiedene Risikofaktoren diskutiert, jedoch ist die genaue Ätiologie
des Prostatakarzinoms nicht bekannt.
Das Alter des Patienten ist der wichtigste Risikofaktor. Etwa 90% der Erkrankten sind
älter als 60 Jahre.
Zudem scheinen genetische Faktoren eine Rolle zu spielen. Dies stützt sich auf die
Tatsache, dass das Risiko, an Prostatakrebs zu erkranken, deutlich steigt, wenn ein
Verwandter erkrankt ist. So verdoppelt sich das Risiko, wenn ein Verwandter ersten
Grades (Bruder, Vater) erkrankt ist und erhöht sich um das fünf- bis elffache wenn
zwei oder mehr Verwandte ersten Grades oder zwei Verwandte vor dem 55.
Lebensjahr erkrankt sind (ROHDE et al., 2007).
Ebenfalls eine Rolle spielen hormonelle Faktoren. So erkranken Eunuchen nach
einer Kastration vor der Pubertät nicht am Prostatakarzinom (historisch, z.B.
italienische Sänger im 17. und 18. Jahrhundert). Im Tierversuch konnte man
Prostatakarzinome durch chronische Östrogen- und Androgengaben induzieren. Es
ist jedoch nicht bekannt, ob Androgene auch beim Menschen eine Induktion oder
Promotion auslösen (HAUTMANN u. HULAND, 2006).
Auch
die
Ernährung
und
Lebensweise
können
die
Entstehung
von
Prostatakarzinomen beeinflussen. Dies wird aus der Beobachtung gefolgert, dass die
Inzidenz für Prostatakrebs in Asien deutlich geringer ist als in Europa oder
Nordamerika. Asiaten, die in die USA ausgewandert sind, haben jedoch ab der 2.
Generation das gleiche Risiko an Prostatakrebs zu erkranken wie andere
Amerikaner. Dies wird auf die Änderung der Lebens- und Ernährungsweise
zurückgeführt. Es wird diskutiert ob tierische Fette und Eiweiße dabei eine
Bedeutung haben (WHITTEMORE et al., 1995).
2.1.3 Klinik
Die frühen Stadien des Prostatakarzinoms verlaufen oft völlig asymptomatisch. Etwa
90% der Karzinome haben ihren Ursprung in der peripheren Zone der Prostata und
liegen somit entfernt von der Harnröhre. Diese Karzinome werden meist als
4
Zufallsbefund nach einer Operation der gutartigen Prostatahyperplasie oder während
einer Autopsie gefunden.
Erst im fortgeschrittenen Stadium kann es zu Obstruktionssymptomen und
Hämaturie kommen.
In manchen Fällen zeigen sich klinische Symptome auch erst wenn das Karzinom
bereits gestreut hat. Der bevorzugte Ort für eine hämatogene Metastasierung ist das
Skelettsystem.
Am
Oberschenkelknochen
häufigsten
und
betroffen
das
sind
Becken.
die
Lendenwirbelkörper,
Patienten
können
über
der
tiefe
Rückenschmerzen, Ischiasbeschwerden und ziehende Schmerzen im Rücken klagen
(HAUTMANN u. HULAND, 2006).
2.1.4 Früherkennung
Die Früherkennung mit guten Heilungschancen des Prostatakarzinoms ist mit einigen
Schwierigkeiten verbunden. Einerseits ist eine kurative Therapie nur möglich solange
das Karzinom auf die Prostata beschränkt ist und sich noch nicht extrakapsulär
ausgebreitet hat. Das Karzinom muss also so früh wie möglich entdeckt werden. Von
den 40 % der Männer in den westlichen Industrieländern, die das Risiko tragen im
Laufe ihres Lebens ein Prostatakarzinom zu entwickeln, werden jedoch nur 10 %
symptomatisch und nur 3 % versterben an diesem Karzinom (SCARDINO et al.,
1992). Durch verbesserte Früherkennung besteht also auch immer die Gefahr der
Überbehandlung.
Dies zeigt sich auch daran, dass bei Autopsien von über 80-Jährigen Männern in
mehr als 60% der Fälle ein vorher nicht bekanntes Prostatakarzinom gefunden wird,
an welchem diese Männer aber nicht verstorben sind. Durch das vermehrte
Screening nach einem Prostatakarzinom im Rahmen der Vorsorge steigt auch das
Risiko, dass Männer behandelt werden, die bis zu ihrem Lebensende nichts von
ihrem Krebs erfahren hätten (SÖKELAND et al., 2007).
Im Rahmen des gesetzlichen Krebsfrüherkennungsprogramms haben gesetzlich
versicherte Männer ab dem 45. Lebensjahr ein Anrecht auf eine jährliche
5
Vorsorgeuntersuchung. Diese beinhaltet eine Untersuchung der Genitalorgane und
eine digital-rektale Tastuntersuchung der Prostata.
Im
Jahr
2004
beteiligten
sich
Krebsfrüherkennungsuntersuchungen
18,3%
der
(Quelle:
Männer
ab
45
Jahren
BUNDESMINISTERIUM
an
FÜR
GESUNDHEIT UND SOZIALE SICHERUNG, 2005). 2-5% der Prostatakarzinome
werden durch die jährliche Vorsorgeuntersuchung entdeckt (ITO et al., 2001). Die
Deutsche Gesellschaft für Urologie vertritt in einer aktuellen Leitlinie jedoch die
Meinung, dass die alleinige digital-rektale Untersuchung der Prostata ohne
Bestimmung
des
Prostataspezifischen
Antigens
(PSA)
als
Früherkennungsuntersuchung nicht ausreichend ist (WIRTH et al., 2009).
Mit der Tastuntersuchung können nur oberflächliche Tumoren erkannt werden, die
schon eine gewisse Größe erreicht haben. Die Treffsicherheit sinkt weiter, wenn der
Tumor auf der dem Darm abgewandten Seite der Prostata liegt. Außerdem ist das
Untersuchungsergebnis stark von der Erfahrung und den Fähigkeiten des
Untersuchers abhängig.
Laut der Leitlinie soll eine PSA-Bestimmung nur Männern empfohlen werden, die den
Wunsch nach Früherkennung haben, da es derzeit noch keinen Nachweis gibt, dass
eine PSA-Screeninguntersuchung zu einer Verlängerung des krankheitsspezifischen
Überlebens führt (WEINMANN et al, 2005; ANDRIOLE et al., 2009; SCHRÖDER et
al., 2009; WIRTH et al., 2009). Die betroffenen Männer müssen von ihrem
behandelnden
Arzt
über
die
Risiken
von
möglichen
diagnostischen
und
therapeutischen Behandlungen und über die Folgen von falsch-positiven und falschnegativen Ergebnissen aufgeklärt werden.
Das zukünftige Ziel von Vorsorgeuntersuchungen muss daher sein, behandlungsbedürftige Prostatakarzinome zu finden und die Gefahr der Überbehandlung zu
minimieren.
2.1.5 Das Prostataspezifische Antigen
Das PSA ist ein Glykoprotein, welches durch das Gen KLK3 codiert wird. PSA wird
ausschließlich in den Ausführungsgängen der Prostata gebildet und trägt zur
6
Verflüssigung des Ejakulats bei. In geringen Mengen tritt PSA auch ins Blut über und
kann im Serum nachgewiesen werden. Ein Prostatakarzinom kann zu einer
Erhöhung des PSA-Wertes führen, jedoch zeigen 20% aller entdeckten Karzinome
einen normalen PSA-Wert (HAUTMANN u. HULAND, 2006). Andererseits gibt es
auch
viele
andere
patientenabhängige
Einflussgrößen,
die
den
PSA-Wert
unabhängig von einer Karzinomerkrankung erhöhen können. So spielen neben Alter,
Prostatagröße und Ethnie auch therapeutische und diagnostische Eingriffe am
unteren
Harntrakt,
Leberfunktionsstörungen
sowie
Prostatitis
und
benigne
Prostatahyperplasie eine Rolle (LEIN, 2002; STROHMAIER, 2002).
Im Allgemeinen werden Werte im Serum unter 4 ng/ml als Normalwert angegeben
(CATALONA et al., 1994).
Um
die
Aussagekraft
des
PSA-Tests
zu
erhöhen,
kann
die
PSA-
Anstiegsgeschwindigkeit gemessen werden. Durch ein Prostatakarzinom steigt die
PSA-Serumkonzentration jährlich deutlich stärker als bei Patienten mit gutartigen
Prostataerkrankungen. Der Grenzwert liegt bei 0,75 ng/ml/Jahr (CARTER et al.,
1992).
Zusätzlich kann noch die PSA-Dichte gemessen werden. Dabei wird der PSA-Wert in
Relation zum Prostatavolumen gestellt, da mit zunehmender Größe der Prostata
durch benigne Prostatahyperplasie der PSA-Wert ebenfalls steigt. Eine PSA-Dichte
über 0,15 gilt als verdächtig (HAUTMANN u. HULAND, 2006).
Laut der Leitlinie der Deutschen Gesellschaft für Urologie soll im Rahmen einer
Vorsorgeuntersuchung eine Prostatabiopsie empfohlen werden, wenn einer der
folgenden Punkte zutrifft:
1. Kontrollierter PSA-Wert > 4 ng/ml
2. Karzinomverdacht bei digital-rektaler Untersuchung
3. Auffälliger PSA-Anstieg
(WIRTH et al., 2009).
7
2.1.6 Stadieneinteilung
Prostatakarzinome
können
durch
verschiedene
Bewertungssysteme
in
Entwicklungsstadien eingeteilt werden. Bei der TNM-Klassifikation der UICC (Union
internationale contre le cancer) wird das Karzinom anhand der Ausdehnung des
Primärtumors, der betroffenen regionalen Lymphknoten und der vorhandenen
Fernmetastasen beurteilt (SOBIN et al., 2009).
Weltweite Anwendung findet die Einteilung nach Gleason. Dieses System wurde
zwischen 1960 und 1975 von dem Pathologen Donald F. Gleason entwickelt und
basiert auf der histologischen Beurteilung von HE (Hämatoxylin Eosin) gefärbten
Prostatakarzinompräparaten. Dabei wird der Differenzierungsgrad der am häufigsten
und am zweithäufigsten vorkommenden Zellpopulation beurteilt und mit 1 bis 5
bewertet. Beide Werte werden addiert und bilden den so genannten Gleason-Score.
Dabei beschreibt z.B. der Score 2 die am besten differenzierten Tumoren, Score 10
die am wenigsten differenzierten Tumoren (GLEASON, 1966; MELLINGER et al.,
1967).
2.1.7 Therapie
Bei der Wahl der richtigen Therapie spielen Tumorstadium, Differenzierungsgrad,
Allgemeinzustand und biologisches Alter des Patienten eine Rolle (SÖKELAND et
al., 2007).
Ist ein Tumor weder zu tasten noch im bildgebenden Verfahren darstellbar und
wurde er nur zufällig z.B. im Rahmen einer Behandlung der benignen
Prostatahyperplasie histologisch diagnostiziert, kann abgewartet werden. In solchen
Fällen wird der Patient regelmäßig untersucht und der PSA-Wert bestimmt. Nach 10
Jahren haben 15-20% der betroffenen Männer mit einem behandlungsbedürftigen
Tumor zu rechnen.
Bei lokalisierten Karzinomen, die nur auf die Prostata beschränkt sind, ist die radikale
Prostatektomie die Therapie der Wahl. In diesen Fällen kann die Therapie kurativ,
dass heißt heilend, sein. Allerdings sollten die Patienten noch eine mittlere
Lebenserwartung von mehr als 10 Jahren haben. Die Lebenserwartung ist zu
8
berücksichtigen, weil durch das langsame Wachstum des Tumors ein 70-jähriger ein
Risiko von 10% hat in den nächsten 10 Jahren an dem Karzinom zu sterben aber ein
50%iges Risiko durch eine andere Ursache zu versterben.
Die wichtigsten Risiken der Operation sind Impotenz mit bis zu 100%, Inkontinenz
(5%) oder Harnröhrenstriktur (5%) (HAUTMANN u. HULAND, 2006).
Eine Alternative stellt die Strahlentherapie dar. Bei dieser Therapie wird entweder
von außen bestrahlt oder durch das Einbringen von strahlendem Material
(Brachytherapie) von innen. Die Brachytherapie hat den Vorteil, dass eine höhere
Strahlendosis genutzt werden kann, ohne benachbarte Gewebe zu schädigen.
Die wichtigste Nebenwirkung ist auch bei der Bestrahlung die Impotenz (ROHDE et
al., 2007).
Im Falle eines fortgeschrittenen Prostatakarzinoms, bei dem der Tumor bereits
extrakapsulär
ausgebreitet
ist
und
Metastasen
vorhanden
sind,
steht
die
antiandrogene Therapie im Vordergrund. Diese beruht auf der Tatsache, dass 80%
der Karzinome hormonsensitiv sind. Bei diesen Patienten wird mit einer Remission,
dass heißt einem Rückgang des Tumors, innerhalb von 2-4 Jahren gerechnet. Die
Therapie ist aber niemals heilend sondern nur palliativ. Auf die Remission folgt ein
erneutes Wachstum von kastrationsresistenten Karzinomzellen.
20% der Patienten mit fortgeschrittenem Prostatakarzinom zeigen kein Ansprechen
auf
eine
Hormontherapie.
Bei
Ihnen
handelt
es
sich
ebenfalls
um
ein
kastrationsresistentes Prostatakarzinom (HAUTMANN u. HULAND, 2006).
Bei der Therapie des kastrationsresistenten Prostatakarzinoms handelt es sich um
eine symptomatische Therapie, die zum Ziel hat, die Lebensqualität der Patienten zu
erhalten oder zu verbessern. Als Therapieoptionen stehen Chemotherapie und
Schmerztherapie zur Verfügung. Bei asymptomatischen Patienten besteht auch die
Möglichkeit des Abwartens, da ein Überlebensvorteil bei frühzeitig begonnener
Chemotherapie im Vergleich zum Beginn bei Symptomen nicht erwiesen ist (WIRTH
et al., 2009).
Patienten mit einer symptomatischen, fortschreitenden Erkrankung, die sich in einem
guten Allgemeinzustand befinden, sollte eine Therapie mit dem Zytostatikum
Docetaxel
in
Kombination
mit
Prednisolon
9
empfohlen
werden.
Für
diese
Medikamentenkombination ist eine Verbesserung der Schmerzen und Lebensqualität
erwiesen.
Außerdem
wurde
eine
Verlängerung
des
Gesamtüberlebens
nachgewiesen. Diese beträgt allerdings nur wenige Monate (TANNOCK et al., 2004).
2.2 Der Androgenrezeptor und das kastrationsresistente
Prostatakarzinom
Der Androgenrezeptor gehört zur Familie der nuklearen Steroidrezeptoren und
vermittelt die Wirkung der männlichen Sexualhormone. Solange diese den Rezeptor
noch nicht erreicht haben, befindet er sich diffus verteilt im Zytoplasma (TYAGI, et
al., 2000). Dort ist er inaktiv und zur Stabilisierung an sog. Chaperone (u.a.
Hitzeschock-Proteine) gebunden (CENTENERA et al., 2008).
Der
Ligand
des
Androgenrezeptors
in
gesunden
Prostatazellen
und
Prostatakarzinomzellen ist Dihydrotestosteron, welches durch die 5α-Reduktase aus
Testosteron gebildet wird. Testosteron besitzt ebenfalls die Fähigkeit, an den
Androgenrezeptor zu binden. Seine Affinität ist jedoch geringer, als die des
Dihydrotestosterons (PENNING et al., 2008).
Erreicht
der
Ligand
den
Androgenrezeptor
kommt
es
zu
einer
Konformationsänderung: Die Hitzeschock-Proteine lösen sich vom Androgenrezeptor
ab und dieser wandert in den Zellkern (CENTENERA et al., 2008). Dort bindet der
Androgenrezeptor
zusammen
mit
Coaktivatoren
als
Transkriptionsfaktor
an
spezifische DNA-Sequenzen und bewirkt die Expression von verschiedenen Genen,
welche u. a. eine Rolle für das Zellwachstum und das Überleben der Zellen spielen
(KNUDSEN u. PENNING, 2010). Außerdem gehört zu ihnen das KLK3, welches für
das PSA-Protein codiert. Durch die Messung des PSA im Serum besteht also indirekt
die Möglichkeit, die Aktivität des prostataspezifischen Androgenrezeptors zu
bestimmen (YOUNG et al., 1991; LUKE u. COFFEY, 1994).
In gesunden Prostatazellen besteht ein Gleichgewicht zwischen Zellwachstum und
Zelltod. In der Karzinomzelle ist dieses Gleichgewicht jedoch gestört. Durch
10
Veränderungen im Signalweg des Androgenrezeptors wirken die Androgene nicht
mehr über einen parakrinen Signalweg, der zu einer Wachstumshemmung führt,
sondern erhalten die Fähigkeit, autokrin zu wirken. Über diesen autokrinen
Signalweg bewirken die Androgene eine Stimulation der Proliferation, was zu
unkontrolliertem Wachstum und letztendlich zur Tumorentstehung führt.
(GAO et
al., 2001). Deshalb ist die Therapie der Wahl bei einem fortgeschrittenen
Prostatakarzinom die antiandrogene Therapie. Das Antiandrogen verdrängt das
Dihydrotestosteron vom Androgenrezeptor, so dass. dieser nicht mehr in den
Zellkern eindringen kann und somit seine Wirkung ausbleibt. Bei erfolgreicher
Behandlung geht der Tumor in Regression (HAUTMANN u. HULAND, 2006). Leider
bewirken die Antiandrogene aber keine dauerhafte Regression des Tumors und
damit Heilung. Fast alle Tumoren beginnen nach 2-4 Jahren wieder zu wachsen. Ab
diesem Zeitpunkt spricht man von einem kastrationsresistenten Karzinom, da der
Tumor trotzt chemischer oder organischer Kastration weiter wächst. Dabei steigt das
PSA im Blut wieder an, was u. a. darauf hindeutet, dass der Androgenrezeptor
wieder als Transkriptionsfaktor arbeitet.
Es existieren verschiedene Wege durch die der Androgenrezeptor reaktiviert werden
kann (Abbildung 1).
1. Veränderungen am Androgenrezeptor
a) Durch Überexpression des Androgenrezeptorgens kommt es zu einem Überschuss von Androgenrezeptor–Molekülen in der Zelle (LINJA et al., 2001). Es
wird vermutet, dass dadurch zum einen die Wirkung von antiandrogenen
Medikamenten, die den Androgenrezeptor blockieren sollen (z.B. Bicalutamid),
geschwächt wird, da mehr Androgenrezeptoren vorhanden sind, die blockiert
werden müssen. Zum anderen erhöht sich die Wahrscheinlichkeit, dass Spuren
von Testosteron, welche trotz chemischer oder chirurgischer Kastration
zurückbleiben, einen Androgenrezeptor finden, den sie aktivieren können.
b) Mutationen des Androgenrezeptorgens können dazu führen, dass das Spektrum
der möglichen Liganden erhöht wird.
So können dann auch andere
Steroidhormone, wie z.B. Progesteron oder Cortisol, den Androgenrezeptor
11
aktivieren (BERREVOETS et al., 1993). Eine solche Mutation besitzt auch die in
dieser
Arbeit
verwendete
Prostatakarzinomzelllinie
LNCaP.
Durch
eine
Punktmutation am Androgenrezeptorgen kommt es zu einem Wechsel der
Aminosäure
Threonin
zu
Alanin
in
der
Ligandenbindungsdomäne
des
Androgenrezeptors. Dadurch können nicht nur Androgene sondern auch
Östrogen
und
Anti-Androgene
den
Androgenrezeptor
der
LNCaP-Zelle
stimulieren (VELDSCHOLTE et al., 1990).
c) Durch alternatives Spleißen der prä-mRNA des Androgenrezeptors verändert
sich die Struktur des Rezeptors. Seine Liganden-bindende Region geht verloren
und er erhält die Fähigkeit, auch ohne Liganden dauerhaft aktiv zu sein (DEHM
et al., 2008; GUO et al., 2009).
d) Veränderungen der Phosphorylierung am Androgenrezeptorprotein können die
Rezeptor-Aktivität erhöhen. Ponguta et al. wiesen nach, dass eine Deregulierung
des epidermalen Wachstumsfaktors (EGF) zu einer Phosphorylierung des
Androgenrezeptors am Serine-578 führen kann. Dies führte zu einer erneutem
Aktivität des Androgenrezeptors und damit zu Zellproliferation (PONGUTA et al.,
2008).
2. Veränderungen der Androgenrezeptor-Cofaktoren
Es wird vermutet, dass eine Deregulierung von Co-Aktivatoren oder ein vermindertes
Vorhandensein von Co-Repressoren die Aktivität des Androgenrezeptors erhöht
(KNUDSEN u. PENNING, 2010). So konnte gezeigt werden, dass eine verminderte
Expression des Co-Repressors Prohibitin die Aktivität des Androgenrezeptors erhöht
(DAI et al., 2008; DART et al., 2009).
3. Tumoreigene Liganden Synthese
Als Anpassung an eine antiandrogene Therapie kann das kastrationsresistente
Prostatakarzinom mit einer tumoreigenen Androgensynthese reagieren. Diese führt
zu einer erhöhten Androgenrezeptor-Aktivität (LOCKE et al., 2008; MONTGOMERY
et al., 2008 A).
12
(modifiziert nach KNUDSEN u. PENNING, 2010)
Abbildung 1: Möglichkeiten der Entwicklung des kastrationsresistenten Prostatakarzinoms durch
Reaktivierung
des
Androgenrezeptors.
(ii)
Reaktivierung
des
Androgenrezeptors
durch
Androgenrezeptorgen-Amplifikation und -Überexpression, Mutationen am Androgenrezeptorgen,
Veränderungen der Phosphorylierung am Androgenrezeptor, alternatives spleißen, Deregulation von
Co-Aktivatoren oder ein vermindertes Vorhandensein von Co-Repressoren und tumoreigene
Liganden Synthese. (iii) Wachstum des kastrationsresistenten Tumors mit steigendem PSA Wert. AC:
Acetylierung, AR: Androgen Rezeptor, CoAct: Co-Aktivatoren, CoR: Co-Repressoren, CRPC:
Kastrationsresistentes Prostatakarzinom, GF: Growth Factor, P: Phosphorylierung, Src: Sarcoma,
Sumo: Sumoylierung.
13
2.3 Das IGF-System
Das Insulin-like growth factor System (IGF-System) ist ein komplexes System. Es
besteht aus zwei Wachstumsfaktoren (IGF-1 und IGF-2), zwei IGF-Rezeptoren (IGF1-R und IGF-2-R), sechs IGF-Bindungsproteinen (IGF-BP-1 bis 6) und IGF-BP
spaltenden Proteasen.
IGF sind Mediatoren des Wachstumshormons (Growth Hormone, GH) und
stimulieren ähnlich wie Insulin die Glukoseaufnahme in Fett- und Muskelzellen
(GANTEN u. RUCKPAUL, 2006). Darüber hinaus spielen sie eine wichtige Rolle in
der Zellproliferation, -differenzierung, -apoptose und -transformation (MOSCHOS u.
MANTZOROS, 2002).
2.3.1 IGF-1
IGF-1 ist ein Peptidhormon bestehend aus 70 Aminosäuren. Er kann in nahezu allen
Körperzellen gebildet werden, seine Hauptbildungsstelle ist jedoch die Leber. Dort
wird die Produktion vor allem von GH beeinflusst (SCHWANDER et al.,1983). Die
Serumkonzentration von IGF-1 ist jedoch von vielen Faktoren abhängig und kann u.
a. auch von Sexualhormonen (MURPHY u. FRIESEN, 1988) und durch mangelnde
Kalorienzufuhr (EMLER u. SCHALCH, 1987) beeinflusst werden. Wie wichtig IGF-I
für das Wachstum und die Organentwicklung ist, wurde anhand von IGF-1 knock-out
Mäusen gezeigt. Diese Mäuse wogen zum Zeitpunkt ihrer Geburt nur 60% des
Gewichts von gleichalten Wildtyp Mäusen. Außerdem zeigten sie eine hohe
perinatale Sterblichkeit, unterentwickelte Muskeln und Lungen, sowie Unfruchtbarkeit
(BAKER et al., 1993; LIU et al., 1993, POWELL-BRAXTON et al., 1993). Obwohl die
Leber der Hauptbildungsort von IGF-1 ist, scheint für Wachstum und Entwicklung
auch die Bildung in allen anderen Körperzellen eine große Rolle zu spielen. Mäuse
bei denen nur die leberspezifische Produktion von IGF-1 ausgeschaltet wurde,
zeigten keine signifikanten Unterschiede im Wachstum (SJOGREN et al., 1999).
14
2.3.2 IGF-2
IGF-2 besteht aus 67 Aminosäuren und kann genauso wie IGF-1 in fast allen
Körperzellen gebildet werden. Die Serumkonzentration von IGF-2 ist höher, als die
von IGF-1 und wird nicht von GH reguliert (MOSCHOS u. MANTZOROS, 2002). IGF1 und IGF-2 werden beide über den IGF-1-R vermittelt und haben beide eine
proliferative und antiapoptotische Wirkung. IGF-2 kann darüber hinaus noch an den
IGF-2-Rezeptor binden (O'DELL u. DAY, 1998). IGF-2 spielt eine wichtige Rolle in
der embryonalen und fetalen Entwicklung. In der postnatalen Phase ist er jedoch
weniger wichtig, da er dort von IGF-1 ersetzt werden kann (BAKER et al., 1993).
2.3.4 IGF-Rezeptoren
Der IGF-1-R ist ein Glykoprotein welches sich auf der Oberfläche fast jeder Zelle
befindet. Er gehört zu der Superfamilie der Tyrosinkinase-Rezeptoren und bindet
IGF-1, IGF-2 und Insulin mit abnehmender Affinität (MOSCHOS u. MANTZOROS,
2002; STEELE-PERKINS et al., 1988).
IGF-1-R ist verbunden mit verschiedenen intrazellulären "second messenger"
Systemen und ist über diese an der Proliferation und Differenzierung von normalen
Zellen, aber auch an der Entwicklung von Krebszellen beteiligt (SELL et al., 1993;
SELL et al., 1994). Eine Aktivierung von IGF-1-R führt zu einem Fortschreiten des
Zellzyklus, DNA Synthese und vermehrter Translation (WERNER u. LE ROITH,
1997).
Die Expression von IGF-1-R wird von vielen Tumorsuppressoren wie z.B. p53
(WERNER et al., 1996; PRISCO et al., 1997) vermindert, wohingegen die meisten
Wachstumsfaktoren (ROSENTHAL et al., 1991; RUBINI et al., 1994), Steroide
(Östrogene, Kortikosteroide) (DAWS et al., 1996; CLARKE et al., 1997) und
hypophysäre Hormone (GH, FSH,) seine Expression erhöhen (HERNANDEZ, 1995).
Der IGF-2/Mannose-6-Phosphat-Rezeptor (M6P) ist ein Bindungsprotein, das
ebenfalls auf der Zelloberfläche vieler Zellen vorkommt. Er bindet M6P tragende
lysosomale Enzyme und IGF-2. Der IGF-2-R beeinflusst den Transport von
15
lysosomalen Enzymen von ihrem Ort der Synthese, dem Golgi-Apparat, zu den
Lysosomen (CHEN et al., 1997) sowie die extrazelluläre Konzentration von IGF-2
indem er die Endozytose und Proteolyse von IGF-2 in den Lysosomen vermittelt
(OKA et al., 1985; KIESS et al., 1987).
Außerdem wird vermutet, dass es sich bei dem IGF-2-R um einen Tumorsuppressor
handelt, da er in verschiedenen Tumoren vermindert exprimiert wird (HANKINS et
al., 1996).
2.3.5 IGF-Bindungsproteine (IGF-BP)
Zu dem IGF-System gehören weiterhin 6 IGF-Bindungsproteine, die die biologische
Wirkung der IGF positiv wie negativ beeinflussen können und auch IGF-unabhängige
Wirkungen zeigen (DE MELLOW u. BAXTER, 1988; BLAT et al., 1989; MCCUSKER
et al., 1990; FRANKLIN et al., 2003; HAN et al., 2011).
IGF-BP spielen eine große Rolle für die IGF-Bioverfügbarkeit. Durch die Bindung von
IGF-1 und IGF-2 an IGF-BP erhöht sich die biologische Halbwertszeit der IGF
erheblich. Freier IGF im Serum hat eine Halbwertszeit von ca. 10 Minuten,
wohingegen an IGF-BP gebundener IGF eine Halbwertszeit von 20-30 Minuten
besitzt (GULER et al., 1989). 99% der zirkulierenden IGF ist an IGF-BP gebunden,
davon liegen 75 bis 90% gebunden an IGF-BP-3 vor. IGF-BP-3 und -5 assoziieren
nach der Bindung von IGF noch mit einer säurelabilen Untereinheit und haben dann
eine Halbwertszeit von 12-15 Stunden (BAXTER, 1988; GULER et al., 1989; JOGIEBRAHIM et al., 2009).
IGF-BP besitzen neben IGF- abhängigen auch IGF-unabhängige Wirkungen. So
kann IGF-BP-3 über einen IGF-unabhängigen Weg Apoptose induzieren (HAN et al.,
2011; FRANKLIN et al., 2003). Außerdem wurde gezeigt, dass durch den
Tumorsuppressor p53 die Expression von IGF-BP-3 erhöht wird (GRIMBERG et al.,
2005).
16
2.3.6 IGF-BP Proteasen
Die IGF-BP Proteasen sind eine heterogene Gruppe von Molekülen, die alle die
Fähigkeit haben, IGF-BP zu spalten. Zu ihnen gehören z.B. Kallikreine und
Matrixmetalloproteine (FOWLKES et al., 1994), Cathepsine und das PSA (COHEN et
al., 1992; KOISTINEN et al., 2002). Durch die Proteolyse der IGF-BP entstehen
Fragmente mit einer geringeren Affinität für IGF (RAJAH et al., 1995). Die IGF
dissoziieren von den IGF-BP und stehen dem IGF-1-R als Reaktionspartner zur
Verfügung. Die Rolle des PSA als IGF-BP Protease könnte für die zukünftige
Behandlung von Prostatakarzinomen wichtig sein. Das PSA spaltet die IGF-BP-3 und
-5 und erhöht damit die Verfügbarkeit von IGF für den IGF-1-R, welcher seine
proliferative und antiapoptotische Wirkung vermehrt entfalten kann (MOSCHOS u.
MANTZOROS, 2002).
2.3.7 Das IGF-System und Tumorentstehung
Welche Rolle das IGF-System bei der Entstehung von verschiedenen Tumoren
spielt, ist Gegenstand intensiver Forschung. Es existieren Hinweise, dass ein enger
Zusammenhang zwischen dem IGF-System und dem Wachstum von Prostatakrebs
besteht. IGF-1 und IGF-1-R werden von gesunden Prostatazellen ebenso exprimiert
wie
von
Zellen
der
benignen
Prostatahyperplasie
und
von
den
meisten
Prostatakarzinom-Zelllinien (COHEN et al., 1991; IWAMURA et al., 1993; KIMURA et
al., 1996). IGF hat einen proliferativen Effekt auf normale und transformierte
Prostataepithelzellen (COHEN et al., 1991; IWAMURA et al., 1993). Eine Inhibition
von IGF-1 und des IGF-1-R reduzieren die Proliferation, sowie die Migration und das
invasive Verhalten von Prostatakrebszellen (BURFEIND et al., 1996; MARELLI et al.,
1999; MARELLI et al., 2007). Es wurde gezeigt, dass IGF-BP-3 das Wachstum von
LNCaP-Zellen inhibiert (BOYLE et al., 2001).
In in vivo Versuchen zeigte sich eine Zunahme der Expression von IGF-1 und IGF-1R
bei
der
Entwicklung
von
androgenabhängigen
Prostatatumoren
hin
zu
androgenunabhängigeren und damit maligneren Tumoren (NICKERSON et al.,
2001). Mäuse, die durch eine Mutation eine verringerte IGF-1 Produktion aufwiesen,
17
zeigten ein verringertes Wachstum von LNCaP-Tumoren (TAKAHARA et al., 2011).
In mehreren epidemiologischen Studien wurde versucht, zu ermitteln, in wie weit ein
Zusammenhang zwischen IGF-1 Konzentration und Tumorrisiko besteht. Dabei
wurde gezeigt, dass hohe IGF-1 Konzentrationen im Serum und/oder niedrige IGFBP-3 Konzentrationen mit einem erhöhten Risiko für verschiedene Tumoren
assoziiert sind, darunter auch Prostatakrebs. Diese Ergebnisse weisen auf eine
schützende Funktion des IGF-BP-3 hin, einerseits über die Verringerung der
Verfügbarkeit von freiem IGF und andererseits über IGF-unabhängige Mechanismen
(CHAN et al., 1998; STATTIN et al., 2000; ALLEN et al., 2005). Jedoch gibt es auch
Studien mit gegenteiligen Ergebnissen, die einen entgegengesetzten oder keinen
Zusammenhang zwischen IGF-1 und IGF-BP-3 Konzentration und Tumorrisiko
zeigen (SEVERI et al., 2006).
Kürzlich wurden verschiedene Interaktionen zwischen dem Androgenrezeptor und
IGF-1 nachgewiesen. So erhöht eine androgene Stimulierung die Expression von
IGF-1-R in Prostataepithelzellen. Außerdem konnte gezeigt werden, dass IGF-1 den
Androgenrezeptor dabei unterstützt, in Abwesenheit von Androgenen in den Zellkern
zu gelangen. Dieser Effekt konnte durch einen IGF-1-R inhibierenden Antikörper
wieder aufgehoben werden (WU et al., 2006).
Abbildung
2
fasst
die
Wechselwirkungen
Androgenrezeptor sowie PSA zusammen:
18
des
IGF-Systems
mit
dem
Abbildung 2: Schematische Darstellung der Zusammenhänge des IGF-Systems mit dem
Androgenrezeptor und PSA. IGF-1 aktiviert den IGF-1-R und führt damit zu Proliferation von Zellen.
Zusätzlich unterstützt IGF-1 den Androgenrezeptor dabei in Abwesenheit von Androgenen in den
Zellkern zu gelangen, wo dieser die Expression von PSA stimuliert. PSA spaltet IGF-BP, welche
dadurch mehr IGF-1 zur Verfügung stellen.
AR: Androgenrezeptor,
: spaltet,
: führt zu,
: vermehrte Expression.
Zusammengefasst zeigen diese Ergebnisse, dass das IGF-System eine wichtige
Rolle im Prostatakarzinom spielt und dass ein Zusammenhang zwischen dem IGFSystem und dem Androgenrezeptor besteht. Damit stellt das IGF-System ein
mögliches Therapieziel des Prostatakarzinoms und des kastrationsresistenten
Prostatakarzinoms dar.
2.4 Histone und Epigenetik
2.4.1 Aufbau der Chromosomen
Die DNA im Zellkern bildet zusammen mit den Histonen Untereinheiten des
Chromatins, die sog. Nukleosomen. Ein Nukleosom besteht aus ca. 146
Basenpaaren der DNA, die um ein Histon-Oktamer gewunden ist. Jedes HistonOktamer besteht aus je zwei Kopien der vier Proteine H2A, H2B, H3 und H4
19
(KORNBERG, 1977; MARKS et al., 2001; GRAW, 2010). Diese Proteine sind
evolutionär hoch konserviert und besitzen je einen lysinreichen N-Terminus. Ein
weiteres Histon, H1, wird als „linker-Histon“ bezeichnet und lagert sich den
Nukleosomen an. Es verbindet die Nukleosomen untereinander bis zur maximal
kondensierten Form der DNA, den Chromosomen (MARKS et al., 2001; GRAW,
2010).
2.4.2 Epigenetik
Unter Epigenetik versteht man vererbbare Änderungen, die nicht auf einer Änderung
der Erbsubtanz beruhen (WATSON et al., 2010).
Pluripotente, embryonale Stammzellen besitzen die Fähigkeit, sich zu verschiedenen
Zelltypen zu differenzieren und ihre spezifischen Funktionen auch beizubehalten.
Damit z.B. aus der gleichen Erbinformation eine Leber- oder Nierenzelle entsteht, ist
es wichtig, dass entsprechende Gene in der richtigen Zelle zur richtigen Zeit
abgelesen werden. Mechanismen, die diese Transkription regulieren, werden unter
dem Sammelbegriff Epigenetik zusammengefasst (WAGNER u. JUNG, 2010).
Ein wichtiges Element der epigenetischen Genregulation ist die Modifikation von
Histonen. Diese Modifikation findet überwiegend an den N-Termini der vier Histone
H2A, H2B, H3 und H4 statt und betrifft vor allem die basischen Aminosäuren Lysin
und Arginin (WU u. GRUNSTEIN, 2000). Dabei sind die angeknüpften oder
abgespaltenen Gruppen sehr vielfältig. Es handelt sich um Acetyl-, Methyl- und
Phosphatgruppen sowie um größere Moleküle wie Ubiquitin und ADP-Ribose (BIEL
et al., 2005). Durch die verschieden modifizierten Histone entsteht ein Code, der von
Proteinen
und
Multiproteinkomplexen
abgelesen
werden
kann
und
so zu
Genaktivierung und/oder –inaktivierung führt (STRAHL u. ALLIS, 2000; MARKS et
al., 2001).
20
2.5 Histondeacetylasen und Valproat
2.5.1 Histonacetyltransferasen und Histondeacetylasen
Eine Form der epigenetischen Veränderung ist die Acetylierung. Sie wird beeinflusst
durch die Histonacetyltransferasen (HAT) und die Histondeacetylasen (HDAC).
Diese Enzyme katalysieren die Acetylierung und Deacetylierung an der Aminosäure
Lysin am N-Terminus der Histone (XU et al., 2007).
Durch die Acetylierung kommt es zu einer Abnahme der positiven Ladung am Histon
und dadurch zu einer schwächeren Bindung mit der negativ geladenen DNA. Die
Chromatinstruktur wird gelockert und dadurch die Transkriptionsaktivität erhöht.
Folglich führt eine Acetylierung zu einer erhöhten Genexpression. Die HDAC
bewirken somit durch die Deacetylierung eine Festigung der Chromatinstruktur und
ein Ruhen der Transkriptionsaktvität (XU et al., 2007).
Neben den Histonen wurden mehr als 50 andere Proteine als Reaktionspartner der
HDAC identifiziert. Zu ihnen gehören Proteine mit regulatorischen Funktionen bei
Zellproliferation, Zellmigration und Zelltod (DOKMANOVIC et al., 2007), wie z.B. das
Tumorsuppressorprotein p53 (JUAN et al., 2000), das Hitzeschockprotein 90 (BALI
et al., 2005) und α-Tubulin (HUBBERT et al., 2002). Die Reaktion der HDAC mit
diesen Proteinen kann zu einer Veränderung der Proteinstabilität führen oder die
Interaktion zwischen diesen Proteinen und anderen beeinflussen (MARKS u. XU,
2009).
Im menschlichen Organismus wurden bislang 18 HDAC identifiziert und klassifiziert.
Sie werden in vier Klassen eingeteilt. Klasse I beinhaltet HDAC1, HDAC2, HDAC 3
und HDAC8 (RUNDLETT et al., 1996; TAUNTON et al., 1996). Klasse II ist aufgeteilt
in die Klassen IIa (HDAC 4, HDAC5 und HDAC7) und IIb (HDAC6 und HDAC10) (XU
et al., 2007). Zu der Gruppe III gehören sieben Enzyme. (BLANDER u. GUARENTE,
2004). Zur Klasse IV gehört nur HDAC11 (GAO et al., 2002).
Die wichtige Rolle der HDAC in der Entwicklung, konnte anhand von Knock-outMäusen gezeigt werden. Tiere, denen die HDAC 1, HDAC 3 oder HDAC 7 fehlten,
21
starben bereits während der frühen embryonalen Entwicklung (LAGGER et al., 2002;
CHANG et al., 2006; MONTGOMERY et al., 2008 B).
Waren HDAC 2 oder HDAC 4 ausgeschaltet, wurden die Tiere nur wenige Tage alt
(VEGA et al., 2004; MONTGOMERY et al., 2007). Nur Tiere, denen HDAC 5, HDAC
6 oder HDAC 9 fehlten, überlebten (CHANG et al., 2004; ZHANG et al., 2008).
2.5.2 Histondeacetylasen im Prostatakarzinom
Verschiedene Studien setzten sich bereits mit der Rolle der HDAC im
Prostatakarzinom auseinander. In diesen Arbeiten konnte gezeigt werden, dass
verschiedene HDAC in Prostatakrebszellen höher exprimiert werden als im
gesunden Prostatagewebe (HALKIDOU et al., 2004; WEICHERT et al., 2008; WANG
et al., 2009).
Wang et al. untersuchten Gewebeproben von 98 Männern. Sie verglichen die
Expression von verschiedenen HDAC in Primärtumoren, rezidiven Tumoren und
Metastasen im Vergleich zu gesundem Prostatagewebe. Dabei zeigte sich eine
Überexpression von verschiedenen HDAC im malignen Gewebe (WANG et al.,
2009).
Außerdem
korreliert
in
einer
anderen
Studie,
durchgeführt
an
192
Tumorgewebeproben, eine hohe HDAC-Expression mit Tumordedifferenzierung und
verstärkter Proliferation (WEICHERT et al., 2008).
Das Gewebe der benignen Prostatahyperplasie (BPH) unterschied sich in einer
weiteren Studie in der Expression der HDAC1 nicht von gesundem Prostatagewebe
(HALKIDOU et al., 2004). Allerdings wurde in drei von fünf untersuchten Proben der
BPH eine „low grade PIN“ (Prostatische Intraepitheliale Neoplasie) gefunden. Diese
PIN Läsion gilt als Vorläufer des Prostatakarzinoms und zeigte ein vollkommen
anderes Expressionsprofil mit erhöhter Expression von HDAC1. Diese Ergebnisse
weisen darauf hin, dass die Expression von HDAC1 mit der Entwicklung des
malignen Phänotyps verbunden ist. In den Primärtumoren dieser Studie und noch
stärker in den kastrationsresistenten Prostatakarzinomen konnte ebenfalls eine
deutliche Hochregulierung der HDAC1 gefunden werden (HALKIDOU et al., 2004).
22
Durch die vermehrte HDAC-Expression und der damit verbundenen verminderten
Histonacetylierung kommt es zu einer Verfestigung der Chromatinstruktur. Die
dadurch verringerte Transkriptionsaktivität führt zu einer veränderten Expression
verschiedener Gene, die für die Differenzierung und geregelte Proliferation von
gesunden Zellen wichtig sind. So wird z.B. das antiproliferativ wirkende p21-Gen in
Tumoren mit erhöhter Expression von HDAC vermindert gebildet und erst eine
Behandlung mit Histondeacetylaseinhibitoren (HDACi) führt wieder zu einer erhöhten
Expression von p21 (SAMBUCETTI et al., 1999; RICHON et al., 2000).
2.5.3 Histondeacetylaseinhibitoren
HDACi hemmen die Wirkung der HDAC und führen über eine vermehrte Acetylierung
an den Histonen zu einer erhöhten Transkriptionsaktivität. HDACi werden nach ihrer
chemischen Struktur in mehrere Gruppen eingeteilt. Dazu gehören (DOKMANOVIC
et al., 2007):
Hydroxamsäuren (z.B. Trichostatin A, Vorinostat)
Zyklische Peptide (z.B. Apicidin)
Kurzkettige Fettsäuren (z.B. Valproat)
Benzoamide (z.B. MS-275).
2.5.3.1 Valproat
Eines der Medikamente, dessen Wirkung auf das fortgeschrittene Prostatakarzinom
in dieser Arbeit untersucht worden ist, ist das Valproat.
Valproat wird seit den 60er Jahren des 20. Jahrhunderts in der Epilepsietherapie als
Antikonvulsivum eingesetzt. Es ist das Mittel der Wahl bei primär generalisierter
sowie unklassifizierbarer Epilepsie und wird auch zur Migränetherapie eingesetzt
(WAGNER et al., 2010).
Göttlicher et al. konnten zeigen, dass es sich bei Valproat außerdem um einen
HDACi handelt. Sie wiesen nach, dass Valproat die Aktivität von HDAC hemmt und
23
zu einer Hyperacetylierung an den Histonen führt (GÖTTLICHER et al., 2001).
Die Aktivität von Valproat liegt im millimolaren Bereich und es zählt damit zu den
schwach wirksamen HDACi. Jedoch stehen diesem Nachteil für die klinische
Anwendung einige Vorteile gegenüber. Durch die langjährige Erfahrung mit der
Substanz ist das Nebenwirkungsprofil gut bekannt und es bestehen wenig Bedenken
hinsichtlich der Sicherheit. Außerdem ist Valproat oral zu nahezu 100% verfügbar
(KUENDGEN u. GATTERMANN, 2007; WAGNER et al., 2010).
Die Wirkung von Valproat auf Krebszellen ist Gegenstand intensiver Forschung. An
verschiedenen Krebszelllinien wurden die tumorhemmenden Eigenschaften von
Valproat nachgewiesen. Brustkrebszellen (MT-450) reagieren auf eine Behandlung
mit Valproat mit der Initiation von Apoptose. An einem in vivo Modell dieser Zelllinie
führte die Applikation von Valproat zu einem verringerten Tumorwachstum
(GÖTTLICHER et al., 2001). Neuroblastomzellen (SH-SY5Y) reagieren auf eine
Applikation von Valproat mit der Induktion von Zelldifferenzierung (YUAN et al.,
2001). Prostatakrebszellen (LNCaP, DU-145 und PC-3) werden von Valproat in
ihrem Wachstum gehemmt (ABDUL u. HOOSEIN, 2001). Diese Inhibition der
Proliferation kann dadurch erklärt werden, dass Valproat zu einer veränderten
Expression von verschiedenen Genen führt, die Proliferation oder Apoptose
beeinflussen. So führte die Behandlung der Prostatakrebszelllinie LNCaP mit
Valproat zu einer erhöhten Expression des Metalloproteinase inhibitors 3 (TIMP-3)
und IGF-BP-3 (THELEN et al., 2004). TIMP-3 ist in verschiedenen Krebszellen
beteiligt an der Induktion von Apoptose (BAKER et al., 1999; BOND et al., 2002).
IGF-BP-3 wirkt dem proliferativ wirkendem IGF entgegen und hat selber
proapototische Eigenschaften (COHEN et al., 1991; IWAMURA et al., 1993; BOYLE
et al., 2001). PSA wurde durch die Behandlung von LNCaP-Zellen mit Valproat
vermindert exprimiert (THELEN et al., 2004). PSA spaltet IGF-BP-3 und erhöht damit
die Verfügbarkeit von IGF für den IGF-1-R. Deshalb wirkt auch eine verringerte
Expression von PSA dem proliferativ wirkenden IGF entgegen. Es wurde gezeigt,
dass Valproat zu einer erhöhten Expression des Östrogenrezeptors ß führt und auf
diesem Wege die aufgezeigten Expressionsveränderungen entstehen können
(STETTNER et al., 2007).
24
Valproat führt weiterhin zu einer Apoptoseinduktion in LNCaP-Zellen. An diesem
Vorgang beteiligt ist die erhöhte Expression des Apoptose-induzierenden Rezeptors
Fas und seines Liganden (ANGELUCCI et al., 2006).
Xia et al., konnten in einem in vitro Experiment zeigen, dass eine Behandlung der
Prostatakarzinomzelllinie LNCaP mit Valproat die Acetylierung am Histon H3 erhöht.
Außerdem wurde die Expression des Tumorsuppressors p21 erhöht und die
Proliferation der Zellen
reduziert.
In einem
in
vivo
Versuch
wurde
das
Tumorwachstum von LNCaP-Zellen in immunsupprimierten Nacktmäusen gehemmt.
(XIA et al., 2006).
Desweiteren führt Valproat zu einer Hemmung des Zellzyklus von LNCaP-Zellen und
verringert die Expression der Cyclin abhängigen Kinase (Cdk1), was zu einer
Abnahme des Androgenrezeptors auf DNA- und Proteinebene führt (CHEN et al.,
2006; WEDEL et al., 2011).
2.6 Mammalian target of rapamycin (mTOR)
Neben Valproat wurde die Wirkung eines weiteren Medikaments auf das
fortgeschrittene Prostatakarzinom in dieser Arbeit untersucht. Dabei handelt es sich
um den mTOR-Inhibitor Temsirolimus.
mTOR ist der Name einer Serin/Threonine Kinase, die in allen Säugetierzellen
vorkommt (SHAW u. CANTLEY, 2006). Seinen Namen erhielt das Protein, weil es
als Zielstruktur des Immunsuppressivums Rapamycin im Säugetier erkannt wurde.
Über verschiedene Signalkaskaden beeinflusst mTOR das Überleben, das
Wachstum und den Metabolismus von Zellen (GANTEN u. RUCKPAUL, 2008).
Dabei stellt mTOR ein Schlüsselprotein dar, welches evolutionär hoch konserviert
vorliegt (BJORNSTI u. HOUGHTON, 2004). Bei fehlerhafter Ausbildung des Proteins
durch embryonale Mutationen kommt es zum Tod des Organismus (HENTGES et al.,
2001). mTOR wirkt als Sensor für zellulären Stress, der zum Beispiel durch
Nährstoff- oder Wachstumsfaktormangel entsteht und das Zellwachstum bezüglich
der Verfügbarkeit von Energie und Nährstoffen koordiniert. Kommt es zu einer
25
Mangelsituation hemmen mTOR und seine nachgeschalteten Signalwege die
Proteinbiosynthese der Ribosomen, verringern die Zellgröße und führen im
Extremfall zum Zelltod durch Autophagie und Apoptose, gleichzeitig stimulieren sie
die
Zellproliferation
bei
günstigen
Wachstumsbedingungen
(GANTEN
u.
RUCKPAUL, 2008; YUAN et al., 2009).
mTOR liegt, gebunden an andere Proteine, als Komplex vor. Dabei kann man zwei
verschiedene Komplexe unterscheiden (LOEWITH et al., 2002). mTOR complex 1
(mTORC1) wird durch das Immunsuppressivum Rapamycin und seine Analoga
gehemmt und fördert die Proteintranslation. mTOR complex 2 (mTORC2) wird nicht
durch Rapamycin und seine Analoga beeinflusst und reguliert das Zytoskelett, die
Zellmotilität und aktiviert den AKT-Signalweg (Proteinkinase B) (RUSSELL et al.,
2011). Der AKT-Signalweg vermittelt die Proliferation von Zellen (GANTEN u.
RUCKPAUL, 2008).
Die Aktivität von mTOR wird durch verschiedene positive und negative Signale
reguliert. Positiv wirken Wachstumsfaktoren wie IGF-1 und sein Rezeptor IGF-1-R,
HER (human epidermal growth factor receptor) mit Liganden und VEGFRs (vascular
endothelial growth factor receptors) mit Liganden. Diese positive Wirkung wird durch
den PI3K-AKT Signalweg vermittelt. PI3K (Phosphoinositid-3-Kinase) vermittelt
aktivierende Signale von Zelloberflächenrezeptoren an nachgeschaltete Signalwege
im Inneren der Zelle (YUAN et al., 2009).
Negativer Regulator vom PI3K-AKT Signalweg und damit auch von mTOR ist PTEN
(Phosphatase und Tensin Homolog; WU et al., 1998; RAMASWAMY et al., 1999).
PTEN ist ein Tumorsuppressor, der im aktivierten Zustand den Zelltod durch
Einleitung der Apoptose verursacht (SALMENA et al., 2008). Mutationen an diesem
Enzym begünstigen die unkontrollierte Zellvermehrung und sind bei vielen Tumoren
zu finden (LI et al., 1997; STECK et al., 1997). Auch im Prostatakarzinom konnte
nachgewiesen werden, das PTEN in Karzinomzellen, im Gegensatz zu normalem
Prostatagewebe, vermindert exprimiert wird (KREMER et al., 2006).
26
2.6.1 mTOR-Inhibitoren und Temsirolimus
mTOR spielt somit bei der Entstehung von verschiedenen Tumoren eine wichtige
Rolle. Aus diesem Grund wurden und werden mTOR-Inhibitoren intensiv erforscht,
mit dem Ziel, neue Medikamente in der Tumortherapie zu entwickeln.
Die Substanz Rapamycin (Sirolimus) wurde 1975 auf der Insel Rapa Nui aus dem
Bakterium Streptomyces hygroscopicus isoliert (VÉZINA et al., 1975). Anfangs war
nur
ihre
immunsuppressive
Wirkung
bekannt.
Sirolimus
wird
in
der
Transplantationsmedizin zur Vorbeugung von Abstoßungsreaktionen eingesetzt
(PASCUAL, 2006). 1981 wurde erstmals die antitumoröse Wirkung von Sirolimus
beschrieben (DOUROS u. SUFFNESS, 1981). Durch die Entwicklung von Sirolimusähnlichen Substanzen konnten die pharmakologischen Eigenschaften der mTORInhibitoren verbessert werden, so dass heute mehrere mTOR-Inhibitoren in der
Tumortherapie eingesetzt werden (YUAN et al., 2009).
Bei dem Medikament Temsirolimus handelt es sich um einen Ester des Rapamycins.
Es wurde als ein intravenös zu applizierender mTOR-Inhibitor entwickelt (YU et al.,
2001).
Temsirolimus wurde 2007 von der US Food and Drug Administation (FDA) und der
European Medicine Agency (EMEA) für die Behandlung des fortgeschrittenen
Nierenzellkarzinoms zugelassen. Zuvor hatte eine Phase III Studie an 626 Patienten
mit fortgeschrittenem Nierenzellkarzinom gezeigt, dass Temsirolimus das Überleben
der Patienten verlängert (HUDES et al., 2007).
In der Prostatakrebsforschung bewirkten mTOR-Inhibitoren wie Temsirolimus und
RAD001 (Everolimus) in in vitro Versuchen einen antiproliferativen Effekt. LNCaPZellen, die mit Temsirolimus behandelt wurden, zeigen einen Rückgang von
Proliferation und eine Hemmung des Zellzyklus (FUNG et al., 2009). Dies konnte
ebenfalls für RAD001 nachgewiesen werden (WEDEL et al., 2011).
Widersprüchliche Ergebnisse existieren dagegen zur Wirkung von mTOR-Inhibitoren
in in vivo Versuchen. Die Behandlung von induzierten Prostatakarzinomen mit dem
mTOR-Inhibitor Rapamycin zeigte einen Rückgang des Tumorwachstums (ZHANG
et al., 2009). LNCaP-Tumoren reagierten dagegen nicht auf eine Behandlung mit
27
RAD001 (SCHAYOWITZ et al., 2010).
2.7 Zelllinien
Verschiedene Zelllinien sind verfügbar, um das Prostatakarzinom zu untersuchen.
DU-145 wurde aus einer Gehirnmetastase isoliert. Diese Zelllinie
wächst
androgenunabhängig, exprimiert keinen Androgenrezeptor und kein PSA (STONE et
al., 1978; MITCHELL et al., 2000).
PC-3
wurde
aus
einer
Knochenmetastase
isoliert
und
wächst
ebenfalls
androgenunabhängig, exprimiert keinen Androgenrezeptor und kein PSA (KAIGHN
et al., 1979; MITCHELL et al., 2000).
VCaP (vertebral-cancer of the prostate) wurde aus einer Knochenmetastase eines
Wirbelkörpers isoliert und wächst androgenabhängig. Sie exprimiert PSA und den
„wildtypischen“ Androgenrezeptor (KORENCHUK et al., 2001).
LNCaP wurde aus einer humanen Lymphknotenmetastase isoliert. Sie wächst
androgenabhängig, exprimiert den Androgenrezeptor und PSA (HOROSZEWICZ et
al., 1980; HOROSZEWICZ et al., 1983). Die LNCaP-Zellen besitzen eine
Punktmutation in der Ligandenbindungsstelle des Androgenrezeptors. Diese
ermöglicht die Stimulation des Androgenrezeptors nicht nur durch Androgene
sondern auch durch Östrogene und Antiandrogene (VELDSCHOLTE et al., 1990).
Eine solche Mutation stellt für Karzinomzellen eine Möglichkeit dar, eine
antiandrogene Therapie zu umgehen und sich somit zu kastrationsresistenten
Karzinomzellen zu entwickeln. Aus diesem Grund wurde für die vorliegende Studie
die LNCaP-Zelllinie als Modell eines kastrationsresistenten Prostatakarzinoms
gewählt.
2.8 Mausmodell
Zur Untersuchung des Prostatakarzinoms in vivo können zwei verschiedene Formen
von
Mausmodellen
unterschieden
werden.
28
Zum
einen
die
Gruppe
der
Xenotransplantationen.
Dabei
werden
Prostatakarzinomzellen
subkutan
in
immunsupprimierte Nacktmäuse implantiert. An der Implantationsstelle wächst dann
in der Regel ein subkutaner Tumor. Alle oben genannten Zelllinien können für
Xenotransplantationen verwendet werden (DU-145 (MICKEY et al., 1980), PC-3
(WARE et al., 1982), VCaP (KORENCHUK et al., 2001), LNCaP (HOROSZEWICZ et
al., 1983).
Desweiteren wird das sogenannte Tramp (transgenic adenocarcinoma of the mouse
prostate) Modell zur Untersuchung von Prostatakarzinomen verwendet. Dabei
handelt es sich um eine transgene Mauslinie, die Karzinome in ihrer eigenen
Prostata entwickelt (GREENBERG et al., 1995).
Das Ziel dieser Arbeit war, die additive Wirkung von Valproat und Temsirolimus auf
LNCaP-Zellen als Modell für ein kastrationsresistentes Prostatakarzinom zu
untersuchen. Um eine gute Vergleichbarkeit zwischen in vitro und in vivo Versuchen
zu gewährleisten, wurde das Modell der Xenotransplantation von LNCaP-Zellen
gewählt.
29
3
Material und Methoden
3.1 Geräte
Gerät
Hersteller
Agilent Bioanalyzer 2100
Agilent Technologies, Waldbronn (D)
CO2- Auto-Zero
Heraeus, Hanau (D)
Gefrierschrank (-20°C)
Liebherr, Biberach, (D)
Gefrierschrank (-80°C)
GFL, Burgwedel (D)
GenAmp PCR System 2400
PerkinElmer, Rodgau-Jügesheim (D)
Homogenisator Ultra-Turrax
IKA Labortechnik, Staufen (D)
iCycler
BioRad, München (D)
Kühlschrank, Silkafrost comfort
Siemens, München (D)
Kulturbank, Hera Safe
Heraeus, Düsseldorf (D)
Labofuge 400 R
Heraeus, Hanau (D)
LabofugeGL
Heraeus, Hanau (D)
Leica TP1020
Leica, Wetzlar (D)
Linear Stainer II
Sakura, Staufen (D)
Mikroskop ID 03
Zeiss, Jena (D)
Mozaic Färbeautomat
Zymed
Laboratories,
San
Francisco
(USA)
MS1 Minishaker
IKA, Staufen (D)
Omnifuge 2.0 RS
Heraeus, Hanau (D)
Pipetus
Hirschmann Laborgeräte, Eberstadt (D)
Schlittenmikrotom Hn 40
Reichert & Jung, Heidelberg (D)
Tissue Block Dispender PAG 12
Medite, Burgdorf (D)
Tissue-Tek Film Eindeckautomat
Sakura, Staufen (D)
Vortexer
IKA, Staufen (D)
30
3.2 Gebrauchsmaterialien
Gebrauchsmaterialien
Hersteller
6-well-Platten (Cellstar)
Greiner bio-one, Frickenhausen (D)
96-well Mikrotiterplatte (Cellstar)
Greiner bio-one, Frickenhausen (D)
Auslaufpipette (10ml)
Sarstedt, Nümbrecht (D)
Deckgläser
Menzel-Gläser, Braunschweig (D)
Falcon-Tubes, 15 und 50 ml
Sarstedt, Nümbrecht (D)
I-Cycler IQ Optical Quality Sealing
BioRad, München, (D)
tape
Kanüle, 26 G
Braun, Melsungen (D)
Objektträger
Roth, Karlsruhe (D)
PCR-Multiplates
BioRad, München (D)
Pipetten (0,1-2,5 µl, 0,5-10 µl, 10-100 µl, Eppendorf, Hamburg (D)
100-1000 µl)
Pipettenspitzen (2,5 µl, 10 µl, 100 µl, Sarstedt, Nümbrecht (D)
1000 µl)
Tissue-Tek Film
Sakura, Staufen (D)
Zählkammer Neubauer
Brand, Wertheim (D)
Zellkulturflaschen (25 cm2, 75 cm2)
Sarstedt, Nümbrecht (D)
3.3 Molekularbiologische Agenzien
Molekularbiologische Agenzien
Hersteller
Agilent RNA 6000 Nano LabChip Kit
Agilent, Technologies, Waldbronn (D)
Alamar Blue Assay
Serotec, Düsseldorf (D)
Amino Acid Solution
Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)
Antiköper Ki-67 (Clone K-2)
Zytomed Systems, Berlin (D)
Aqua dest.
Universitätsmedizin, Göttingen (D)
Bovines Serum Albumin
Paesel & Lorei, Hanau (D)
31
Cell Proliferation ELISA, BrdU
Roche, Mannheim (D)
Citronensäure-Monohydrat
Merck, Darmstadt (D)
Dako REAL Detection System, Alkaline Dako, Glostrup (Dänemark)
Phosphatase/RED, Rabbit/Mouse
Eosinlösung
Merck, Darmstadt (D)
Ethanol
Chemie Vertrieb, Hannover (D)
Fetales Kälberserum
Paa Laboratories, Linz (Österreich)
Formaldehyd 37%
Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)
Hämatoxylin
Merck, Darmstadt (D)
L-Glutamin
Biochrom, Berlin (D)
Matrigel
BD Biosiences, Heidelberg (D)
Natriumcitrat
Merck, Darmstadt (D)
Natriumchlorid
Merck, Darmstadt (D)
Omniscript RT Kit
Qiagen, Hilden (D)
Orfiril Saft
Desitin Arzneimittel, Hamburg (D)
Paraffin
Süsse Labortechnik, Gudensberg (D)
PBS-Puffer
Biochrom, Berlin (D)
PCR-Primer
IBA, Göttingen (D)
peqGOLD TriFast
peqlab, Erlangen (D)
PSA Enzyme Immunoassay Test Kit
Genway, San Diego (USA)
RNAlater
Qiagen, Hilden (D)
RPMI 1640
Invitrogen, Karlsruhe (D)
Salzsäure (3,5 Mol)
Merck, Darmstadt (D)
SYBR-Green
Eurogentec, Köln (D)
Torisel (Temsirolimus)
Wyeth, Berlin (D)
TRIS
Merck, Darmstadt (D)
Trypsin EDTA
Lonza, Verviers (Belgien)
Valproat
Sigma-Aldrich, St. Louis (USA)
VE-Wasser
Merck, Darmstadt (D)
Xylol
J. T. Baker, Deventer, Niederlande
Zymo Research Mini RNA Isolation II Kit
Zymo Research, Freiburg (D)
32
3.4 Lösungen/Fixantien
Hergestellte Lösungen
BSA 2%
2g BSA in 100ml PBS-Puffer
Citratpuffer
Lösung A: Citronensäure 4,2g auf 200ml
VE-Wasser.
Lösung B: Natriumcitrat 29,4g auf 1L VEWasser.
18ml Lösung A + 82ml Lösung B mit VEWasser auf 1L auffüllen.
PH-Wert auf 6,0 einstellen.
Formalin 4%
39,75 ml PBS-Puffer
5,25 ml Formaldehyd (37%)
RPMI-Medium
10 % Fetales Kälberserum
2 % Amino Acid Solution
1% L-Glutamin
TBS-Puffer
TRIS 60,6g
NaCl 87,6g
Mit 800ml VE-Wasser mischen.
120ml Salzsäure hinzugeben und auf 1L
mit VE-Wasser auffüllen.
PH-Wert auf 7,35 einstellen.
100ml dieser Lösung mit 900ml VEWasser mischen.
PH-Wert auf 7,4 einstellen.
33
3.5 Primer
Die verwendeten Primer wurden mit Hilfe des „primer3 online primer design
programs“ (http://primer3.sourceforge.net) entworfen.
Gen
F-Primer
R-Primer
Schmelzpunkt
Fragmentgröße
ARP
PBGD
KLK3
IGF-1
IGF-1-R
IGF-BP-3
5‘-CGACCTGGAA
5‘-ATCTGCTGCA
GTCCAACTAC-3‘
TCTGCTTG-3‘
5‘-TGTCTGGTAACGG
5‘-TCAATGTTGCCACC
CAATGCGGCTGCAAC-3‘
ACACTGTCCGTCT-3‘
5‘-TGAACCAGAG
5‘-CCCCAGAATC
GAGTTCTTGAC-3‘
ACCCGAGCAG-3‘
5‘-TGGATGCTC
5‘-AGGGGTGCGC
TTCAGTTCGTG-3‘
AATACATCT-3‘
5‘-CCGAAGGT
5‘-AATGGCGGAT
CTGTGAGGAAGA-3‘
CTTCACGTAG-3‘
5‘-GAACTTCTC
5‘-CTGGGACTCA
CTCCGAGTCCAA-3‘
GCACATTGAG-3‘
60 °C
119bp
72 °C
126bp
61 °C
164bp
60 °C
217bp
61 °C
160bp
62 °C
115bp
Tabelle 1: Verwendete Primerpaare, Schmelzpunkte und Fragmentgrößen.
Spezifische Primersequenz, verwendete Annealingtemperatur und Fragmentgröße.
F: forward, R: reverse.
34
3.6 Zellkultur
3.6.1 Zelllinie
Für die Zellkultur wurde folgende Zelllinie verwendet:
LNCaP-Prostatakarzinomzelllinie (THELEN et al., 2004).
3.6.2 Kultivierung der Zelllinie
Alle Arbeiten wurden unter einer Sterilbank durchgeführt. Die Zellkulturen lagerten in
einem Brutschrank bei 37°C und einem CO2-Gehalt von 5%. Alle 3 Tage wurde das
Medium der Zellen erneuert. Dafür musste zunächst das alte RPMI-Medium bis auf
einen kleinen Rest abgesaugt werden. Dieser Rest war für die Kontinuität der
Zellkultur nötig. Dann wurden 3ml frisches RPMI-Medium vorsichtig auf die Zellen
gegeben. Generell wurde beim Umgang mit der Zellkultur auf vorsichtiges und
erschütterungsfreies Arbeiten geachtet, um die Zelladhärenz nicht zu beeinflussen.
3.6.3 Passagieren der Zellkultur
Je nach Wachstum und Zelldichte der Zellen in der Kulturflasche mussten die Zellen
passagiert werden. Dies geschah in Abhängigkeit von der eingesetzten Zellmenge
ca. alle 7 Tage. Hierfür wurde zunächst das verbrauchte RPMI-Medium abgesaugt
und durch 2ml Trypsin-EDTA ersetzt. Nun mussten die Zellen 5-10 Minuten im
Brutschrank inkubieren. Durch das Trypsin-EDTA wurden die Zellen schonend vom
Boden der Kulturflasche gelöst. Nach der Inkubationszeit wurde die Zellsuspension
in ein Reagenzröhrchen überführt und 2ml RPMI-Medium dazu gegeben. Das
Medium stoppte die Wirkung des Trypsins und schützte dadurch die Zellen.
Das Reagenzröhrchen wurde dann bei 10000 Umdrehungen pro Minute (UPM) für
10 Minuten zentrifugiert. Auf dem Boden des Röhrchens befand sich dann ein
Zellpellet. Der Überstand wurde abgesaugt und das Pellet in 2ml frischem RPMI35
Medium suspendiert. Von dieser Zellsuspension nahm man 0,5ml ab und überführte
sie in eine frische Kulturflasche, welche mit 3ml RPMI-Medium aufgefüllt wurde.
Anschließend wurde die Kulturflasche unter den oben genannten Bedingungen
kultiviert.
3.6.4 Behandlung der LNCaP-Zellen mit Valproat und Temsirolimus
Die LNCaP-Zellen wurden in verschiedenen Kombinationen mit Temsirolimus und
Valproat behandelt. Temsirolimus (Tem) wurde in einer Konzentration von 1µMol/L
verwendet, Valproat (VPA) in einer Konzentration von 1mMol/L.
Bei der Wahl der Konzentrationen und der Zeiten wurde sich an der Arbeit von
Wedel et al., orientiert. Die genannten Konzentrationen von Valproat und dem
mTOR-Inhibitor RAD001 bewirkten in der vorgenannten Arbeit einen synergistischen
Effekt in LNCaP-Zellen auf das Tumorzellwachstum und die Inhibition des Zellzyklus
(WEDEL et al., 2011). Ein durchgeführter Vorversuch hatte zudem gezeigt, dass eine
erneute Behandlung der Zellen mit Valproat nach 48 Stunden notwendig war, um die
in dieser Studie beschriebenen Effekte zu beobachten.
Temsirolimus der Firma Wyeth wurde nach Packungsbeilage mit dem beiliegenden
Verdünnungsmittel vermischt, dann mit NaCl verdünnt, um eine Zielkonzentration
von 1µMol/L zu erreichen. Valproat wurde mit RPMI-Medium vermischt, um eine
Konzentration von 1mMol/L zu erreichen.
Zur Vorbereitung der Behandlung wurden die Zellen wie in Punkt 3.6.3 beschrieben
vorbereitet. Während normalerweise die gewonnene Zellsuspension wieder zurück in
die Kulturflasche gefüllt wurde, entnahm man zunächst mit einer Pipette eine kleine
Menge der Suspension und gab sie auf eine Neubauer-Zählkammer, um die Zellzahl
zu bestimmen. Anhand der errechneten Zellzahl ermittelte man, wie viel Suspension
man pro Well einer Sechs-Well-Platte braucht, um eine Zellzahl von 100000 Zellen
pro Well zu erreichen. Vier Wells wurde dann mit RPMI-Medium auf 2ml Inhalt
aufgefüllt. Die Sechs-Well-Platte wurden dann für 24h zurück in den Brutschrank
gegeben, damit die Zellen anwachsen konnten.
36
Nach dieser Zeit begann die Behandlung nach folgendem Schema:
Stunde
Well Nr.1
Well Nr.2
Well Nr.3
0
Medium
1mMol/L VPA
1mMol/L VPA
1mMol/L VPA
1mMol/L VPA +
Well Nr.4
24
48
1µMol/L Tem
1µMol/L Tem
72
96
RNA-Extraktion
RNA-Extraktion
RNA-Extraktion
RNA-Extraktion
Tabelle 2: Schema der Behandlung der LNCaP-Zellen mit Valproat (VPA), Temsirolimus (Tem) und
der Kombination aus beiden Medikamenten.
Well Nr. 1 diente als Kontrolle. In diesem wurde nur das alte RPMI-Medium gegen
frisches ausgetauscht. Well Nr. 2 wurde Valproat in der oben genannten
Konzentration zugegeben, dieses wurde nach 48h wiederholt. Well Nr. 3 wurde
ebenfalls Valproat zugegeben, nach 48h wurde das Valpoat wiederholt und
zusätzlich Temsirolimus auf die Zellen gegeben. Well Nr. 4 erhielt zu Beginn frisches
RPMI-Medium und nach 48h wurde mit Temsirolimus behandelt. 96h nach der ersten
Behandlung wurden die Überstände abgenommen. Die zurückbleibenden Zellen
waren nun bereit zur RNA-Extraktion (siehe Punkt 3.6.7), (n = 3).
3.6.5 Vitalitätstest
3.6.5.1 Prinzip des Alamar Blue Assays
Es wurde ein Alamar Blue Assay durchgeführt, um zu klären, ob die Behandlung mit
den verschiedenen Medikamenten die Zellen nachhaltig in ihrer Vitalität geschädigt
hat. Der Assay beinhaltet einen Redoxindikator, das Resazurin. Unbehandelte Zellen
erzeugen ein reduzierendes Milieu in dem das Resazurin zu dem fluoreszierenden
Resorufin reduziert wird. Zytotoxische Substanzen hemmen oder verlangsamen
37
diese Reduktion, so dass von einem Rückgang der Fluoreszenz auf einen Rückgang
der Vitalität der Zellen geschlossen werden kann.
3.6.5.2 Protokoll des Alamar Blue Assays
Behandlung der Zellen
Die Zellen wurden wie in Punkt 3.6.3 beschrieben passagiert. Bevor sie jedoch in
eine frische Kulturflasche gegeben wurden, wurde die Zellzahl mit Hilfe einer
Neubauer-Zählkammer bestimmt. In einer 96-Well Platte wurden 5000 Zellen in
100µl RPMI-Medium aufgenommen und, wie in Tabelle 2 aufgeführt, behandelt. Pro
Behandlungsgruppe wurden 6 Wells verwendet (n = 6).
Hinzufügen des Alamar Blue Reagenz
10µl des Alamar Blue Reagenz wurden auf jedes Well pipettiert und die Zellen für 4
Stunden im Brutschrank inkubiert.
Photometrische Messung
Die anschließende photometrische Messung erfolgte bei 570 und 600nm.
3.6.6 Proliferationstest
3.6.6.1 Prinzip des BrdU-ELISA
Es wurde ein BrdU (5-bromo-2‘-deoxyuridine) ELISA durchgeführt, um Aussagen
bezüglich der Proliferationsaktivität der behandelten Zellen treffen zu können.
Bei BrdU handelt es sich um ein Pyrimidin Analog welches in die DNA
proliferierender Zellen eingebaut wird und das natürliche Thymidin ersetzt. Nach
einer entsprechenden Inkubationszeit wird die DNA der Zellen denaturiert. Nun
bindet ein Anti-BrdU Antikörper, der wiederrum mit einer Peroxidase verbunden ist,
an das BrdU in der neu synthetisierten DNA. Die Peroxidase führt zu einem
Farbumschlag
des
zugegebenen
Substrats.
photometrisch gemessen.
38
Dieser
Farbumschlag
wird
3.6.6.2 Protokoll des BrdU-ELISA
Behandlung der Zellen
Die Zellen wurden, wie in Punkt 3.6.3 beschrieben, passagiert. Bevor sie jedoch in
eine frische Kulturflasche gegeben wurden, wurde die Zellzahl mit Hilfe einer
Neubauer-Zählkammer bestimmt. In einer 96-Well Platte wurden 5000 Zellen in
100µl RPMI-Medium aufgenommen und, wie in Tabelle 2 aufgeführt, behandelt. Pro
Behandlungsgruppe wurden 6 Wells verwendet (n = 6).
Hinzufügen des BrdU-labeling Reagenz
10µl des BrdU-labeling Reagenz wurden auf jedes Well pipettiert und die Zellen für
weitere 2 Stunden im Brutschrank inkubiert.
Hinzufügen des FixDenat Reagenz
Die vorhandene Flüssigkeit wurde vorsichtig von den einzelnen Wells abgesaugt und
je 200µl FixDenat Reagenz hinzugefügt. Es folgte eine Inkubationszeit von 30
Minuten bei Raumtemperatur.
Hinzufügen von Anti-BrdU-Peroxidase
Das FixDenat Reagenz wurde vorsichtig entfernt und durch 100µl Anti-BrdUPeroxidase ersetzt. Die Platte wurde bei Raumtemperatur für 90 Minuten stehen
gelassen.
Hinzufügen der Substratlösung
Das Reagenz wurde von der Platte entfernt und jedes Well dreimal mit Waschlösung
gewaschen. Dann wurden 100µl Substratlösung pro Well hinzugefügt.
Photometrische Messung
Sobald der Farbumschlag erfolgte, wurde die photometrische Messung bei einer
Wellenlänge von 370nm durchgeführt.
39
3.6.7 RNA-Extraktion aus der Zellkultur
3.6.7.1 Allgemeines Arbeiten mit RNA
RNA ist u. a. gefährdet durch RNasen. Diese Enzyme sind sehr beständig, weit
verbreitet und bereits kleinste Mengen können RNA zerstören. Deshalb muss beim
Arbeiten auf eine RNase freie Umgebung geachtet werden.
Während des Arbeitens wurden deshalb Latexhandschuhe getragen. Es wurden
ausschließlich autoklavierte oder RNase-freie Materialien verwendet. Gefäße
mussten,
wann
immer
möglich,
geschlossen
werden
und
waren
kühl
zwischenzulagern. Die RNA-Extraktion wurde bei Raumtemperatur durchgeführt. Zur
weiteren sofortigen Verwendung konnte die RNA auf Eis zwischengelagert werden.
Eine mittelfristige Lagerung erfolgte bei -20°C im Gefrierschrank.
3.6.7.2 Prinzip der RNA-Extraktion aus der Zellkultur
Die RNA-Extraktion wurde mit Hilfe des Zymo Research Mini RNA Isolation II Kit
durchgeführt. Durch das RNA-Extraktionsverfahren kann RNA aus Zellen gewonnen
werden. Dabei werden die selektiven Bindungseigenschaften einer mit Silikangel
geschichteten Membran mit der Microspin-Technologie kombiniert. Es ist möglich,
100µg RNA mit einer Größe von mehr als 200 Basenpaaren an die Membran zu
binden. Kleinere RNA insbesondere 5.8S rRNA, 5S rRNA und tRNA werden
zusammen mit Proteinen und Zelllysat abgetrennt.
Beim Verfahren des Zymo Research Mini RNA Isolation II Kit werden die Zellen
zunächst
lysiert
und
homogenisiert,
anschließend
werden
sie
mit
Guanidinisothiocyanat-Puffer behandelt. Auf diese Weise wird die Denaturierung
erreicht und gleichzeitig alle RNasen inaktiviert, wodurch eine Isolation intakter RNA
gewährleistet wird. In einem weiteren Schritt wird Ethanol verwendet, um optimale
Bindungsvoraussetzungen für die Membran zu schaffen. Dann wird die Probe auf
eine Zymo-Spin Column mit Collection Tube gegeben. An diese wird die RNA
gebunden und restliche Zellbestandteile werden ausgewaschen. Die extrahierte RNA
wird mit 30µl RNase-freiem Wasser eluiert.
40
3.6.7.3 Protokoll zur RNA-Extraktion aus der Zellkultur
Ernten der Zellen
Das Medium inklusive der zugesetzten Medikamente wurde entfernt. Damit waren
die Zellen optimal vorbereitet für die Lyse. Aus jedem behandelten Well wurde
einmal der RNA-Pool isoliert (n = 1).
Lyse
600µl des ZR-RNA-Puffers wurde pro Well auf die Zellen gegeben. Daduch lösten
sich die Zellen vom Boden des Wells, die Plasmamembran und die Organellen der
Zelle wurden lysiert und die in den Zellen befindliche RNA freigesetzt.
Zentrifugation
Die 600µl Probe pro Well wurde jeweils auf eine Zymo-Spin Column pipettiert und
diese dann auf eine 2ml Eppendorf Gefäß gesetzt. Dann wurde 1 Minute bei 10000
Umdrehungen pro Minute (UPM) zentrifugiert. Der Durchfluss wurde verworfen.
Zugabe des RNA Waschpuffers
350µl RNA Waschpuffer wurde auf jede Säule gegeben. Dadurch wurden
Zellbestandteile ausgewaschen ohne die Bindung der RNA zu gefährden. Die Säule
wurde erneut 1 Minute bei 10000 UPM zentrifugiert. Dieser Schritt wurde nochmal
wiederholt.
Elution
Die Zymo-Spin Column wurde auf ein frisches 1,5ml Eppendorf Gefäß überführt und
30µl RNase-freies Wasser auf die Membran pipettiert. Dann wurde wieder 1 Minute
bei 10000 UPM zentrifugiert. Das Eluat konnte, auf Eis gelagert, sofort weiter
verwendet werden oder bei -20°C zur mittelfristigen Verwendung aufbewahrt werden.
41
3.7 Tierversuch
3.7.1 Versuchstiere
Es wurden 80 Versuchstiere verwendet. Dabei handelte es sich um männliche,
immunsupprimierte Nacktmäuse des Stammes NMRInu/nu der Firma
Laboratory,
Le Genest St Isle, Frankreich.
Der Tierversuch
Janvier
wurde
vom
Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit
genehmigt (Aktennr. 33.12-42502-04.10/0111). Die Tiere wurden in der zentralen
tierexperimentellen Einrichtung der Universitätsmedizin Göttingen gehalten. Die Tiere
waren zum Zeitpunkt der Lieferung ca. 8 Wochen alt und wurden zunächst zur
Eingewöhnung an die neue Umgebung 2 Wochen ohne weitere Manipulation
gehalten. Zu Versuchsbeginn waren die Mäuse somit ca. 10 Wochen alt.
3.7.2 Vorbereiten der LNCaP-Zellen zur Injektion
Die LNCaP-Zellen wurden wie in Punkt 3.6.3 beschrieben behandelt. Statt die
Zellsuspension in eine frische Kulturflasche zu überführen, wurden die Zellen in einer
Neubauer-Zählkammer ausgezählt. Pro Maus wurden 1 Million Zellen in 100µl PBS
(2-8°C) benötigt. Die benötigte Menge an Zellsuspension wurde für 10 Minuten bei
10000 UPM zentrifugiert. Anschließend wurde der Überstand abgesaugt und das
vorhandene Zellpellet in der berechneten Menge PBS resuspendiert. Von der auf Eis
gelagerten Zellsuspension wurden 100µl zu 100µl Matrigel hinzugefügt und beides
zusammen in eine eisgekühlte Injektionsspritze aufgezogen. Die gefüllten Spritzen
wurden auf Eis gelagert und den fixierten Mäusen zügig subkutan zwischen die
Schulterblätter injiziert.
3.7.3 Medikation der Versuchstiere
Die Behandlung der Mäuse begann, sobald der Tumor ein Volumen von 120 mm³
erreicht hatte. Die Tumoren wurden zweimal wöchentlich mit Hilfe einer Schieblehre
42
vermessen
und
ihr
Volumen
nach
folgender
Formel
berechnet:
größerer
Durchmesser x (kleinerer Durchmesser)² x 0,5 (IGAWA et al., 2002).
Die Mäuse wurden in vier Gruppen zu je 20 Tieren aufgeteilt und nach folgendem
Schema über 7 Wochen behandelt bzw. nicht behandelt:
Gruppe 0 (n=20)
Gruppe 1 (n=20)
Gruppe 2 (n=20)
Keine Behandlung
Valproat über das
Valproat über das
Trinkwasser
Trinkwasser
800mg/kg/d
800mg/kg/d
Temsirolimus
Gruppe 3 (n=20)
1x Temsirolimus
wöchentlich i.v.
wöchentlich i.v.
0,3mg/kg
0,3mg/kg
1x
Tabelle 3: Schema der Behandlung der Mäuse mit Valproat, Temsirolimus und der Kombination der
beiden Medikamente.
Gruppe 0 = keine Behandlung, Gruppe 1 = Behandlung mit Valproat, Gruppe 2 = Behandlung mit
Temsirolimus, Gruppe 3 = Behandlung mit Valproat und Temsirolimus.
Die verwendete Dosierung des Valproat (0,8%ig) wurde gewählt, da sie ausreichend
ist um eine Blutkonzentration zu erreichen, die äquivalent der beim Menschen
gewünschten Konzentration ist (SHABBEER et al., 2007). Die Dosierung von
Temsirolimus entspricht der Empfehlung des Herstellers für den durchgeführten
Tierversuch.
Konnte die Applikation von Temsirolimus intravenös nicht erfolgreich durchgeführt
werden, erfolgte alternativ die Injektion des Medikaments retrobulbär.
3.7.4 Erfassung der Ergebnisse
Zweimal wöchentlich wurde das Tumorvolumen der Mäuse mit einer Schieblehre
gemessen. Nach Ablauf der 7 Wochen oder wenn das Tumorvolumen ein
Weiterleben der Mäuse aus Tierschutzgründen verbot, wurden die Mäuse durch eine
CO2 Überdosierung getötet. Anschließend wurde durch Herzpunktion Blut von den
43
Mäusen entnommen. Dieses wurde bei 5000 UPM für 8 Minuten zentrifugiert und
das entstandene Serum in ein frisches Eppendorf Gefäß überführt. Für spätere
Untersuchungen wurde das Serum bei -20°C gelagert.
Der Tumor wurde unter sterilen Bedingungen entnommen, makroskopisch beurteilt
und in drei Stücke zerteilt. Ein Teilstück mit mind. 0,5mm Kantenlänge wurde in die
fünffache Menge RNAlater aufgenommen. Ein weiteres Stück wurde in Formalin 4%
fixiert. Das dritte Teilstück des Tumors wurde in einem Röhrchen in flüssigem
Stickstoff gekühlt und bei -80°C aufbewahrt.
3.7.5 Aufbereitung der Tumorgewebeproben
Die Aufbereitung und Färbung der Tumorgewebeproben erfolgte in Kooperation mit
der Abteilung Pathologie der Universitätsmedizin Göttingen.
3.7.5.1 Fixierung und Einbettung des Tumorgewebes
Das entnommene Tumorgewebe wurde in Formalin 4% für mind. 72 Stunden fixiert.
Die Entwässerung und Einbettung des Gewebes erfolgt im Leica TP1020. Der Tumor
wurde über eine Isopropanolverdünnung aufsteigender Konzentration (3h 75%, 3h
96%, 3h 100%, 3h Xylol) entwässert und schließlich in Paraffin eingebettet. Die
Fertigung der zu schneidenden Blöcke erfolgte an der Ausgießstation (Tissue Block
Dispender PAG 12, Medite).
3.7.5.2 Herstellung der Paraffinschnitte
Von
den
eingebetteten
Tumorgewebeproben
wurden
mit
Hilfe
eines
Schlittenmikrotoms Hn 40 1-2µm dicke Paraffinschnitte hergestellt.
3.7.5.3 HE-Färbung
Die HE-Färbung erfolgte in der Färbestraße Linear Stainer II. Jedes Eintauchen der
Schnitte erfolgte für 2 Minuten mit einer anschließenden Abtropfzeit von 30
Sekunden.
44
3.7.5.3.1 Protokoll der HE-Färbung
Entparaffinieren und Rehydrieren
Die Schnitte wurden in Kuvetten gesteckt und 4 mal in Xylol eingetaucht,
anschließend erfolgte die Rehydierung durch Eintauchen der Schnitte in eine
absteigende Ethanolreihe (2x 100%, 1x 96%, 1x 75%).
Waschen der Schnitte durch Eintauchen in Aqua dest (1x).
Anfärben der Schnitte durch Eintauchen in Hämatoxylin nach Mayer (3x).
Waschen der Schnitte durch Eintauchen in Leitungswasser (1x).
Anfärben der Schnitte durch Eintauchen in Eosinlösung (2x).
Waschen der Schnitte durch Eintauchen in Aqua dest.(1x).
Dehydrieren
Die Schnitte wurden durch Eintauchen in eine aufsteigende Ethanolreihe dehydriert
(2x 96%, 2x 100%).
Klären der Schnitte durch Eintauchen in Xylol (3x).
Eindecken der Präparate mit Tissue-Tek Film im Tissue-Tek Film Eindeckautomat.
3.7.5.4 Ki-67 Immunhistochemie
Ki-67 ist ein Proliferationsmarker. Während der aktiven Phasen des Zellzyklus (G1,
S, G2, M) befindet sich das Protein auf der Oberfläche der Chromosomen und kann
mittels Antikörper nachgewiesen werden. Befindet sich die Zelle dagegen in der
Ruhephase (G0) fehlt das Ki-67 Protein. Diese Tatsache ermöglicht es, mittels Ki-67
Immunhistochemie die so genannte Wachstumsfraktion bzw. den Proliferationsindex
der untersuchten Zellpopulation zu bestimmen (GERDES et al., 1984; SCHOLZEN u.
45
GERDES, 2000).
3.7.5.4.1 Prinzip der Ki-67 Färbung
Der Nachweis des Ki-67 Proteins erfolgte mit der sogenannten indirekten 2-Schritt
Methode mit Hilfe eines Dako Kits (Dako REAL Detection Systems, Alkaline
Phosphatase/RED,
Rabbit/Mouse).
Dabei
wurde
das
Ki-67
mit
einem
Primärantikörper markiert. Gegen diesen ist dann ein biotinylierter Zweitantikörper
gerichtet. An dieses Biotin kann dann in einem weiteren Schritt Streptavidin binden
an welches eine Alkalische Phosphatase konjugiert ist. Diese Phosphatase
katalysiert dann die Farbreaktion des Chromogens Fast Red. Die Färbung erfolgte in
dem Färbeautomaten Mozaic (Zymed Laboratories). Die Farbreaktion war rot.
3.7.5.4.2 Protokoll der Ki-67 Immunhistochemie
Entparaffinieren und Rehydrieren
Die Schnitte wurden 3mal in Xylol für je 5 Minuten eingelegt, anschließend erfolgte
die Rehydierung durch Einlegen in eine absteigende Ethanolreihe (30 Sekunden
100%, 30 Sekunden 96%, 30 Sekunden 75%).
Waschen der Schnitte für 30 Sekunden in demineralisiertem Wasser.
Kochen der Schnitte in Citratpuffer mit pH 6 für 40 Minuten.
Abkühlen der Schnitte in Eiswasser für 10 Minuten.
Aufbringen von 2%igem BSA für 5 Minuten.
Aufbringen des Primärantikörpers 5µg/ml (Ki-67, Clone K-2, Zytomed Systems) für
30 Minuten.
Waschen der Schnitte mit TBS-Puffer 3 Minuten.
46
Aufbringen des Zweitantikörpers für 20 Minuten (Dako REAL™ Link, biotinylierter
Zweitantikörper (AB2).
Waschen der Schnitte mit TBS-Puffer für 5 Minuten.
Aufbringen der Streptavidin Alkalischen Phosphatase für 20 Minuten.
Waschen der Schnitte mit TBS-Puffer für 5 Minuten.
Aufbringen des Chromogens Fast Red für 20 Minuten.
Wässern der Schnitte in deionisiertem Wasser für 2 Minuten.
Anfärben der Schnitte mit Hämatoxylin nach Mayer für 45 Sekunden.
Waschen der Schnitte in warmem Wasser.
So lange spülen bis das Spülwasser klar bleibt.
Dehydrieren
Die Schnitte wurden durch Einlegen in eine aufsteigende Ethanolreihe dehydriert (30
Sekunden 75%, 30 Sekunden 96%, 30 Sekunden 100%).
Klären der Schnitte in Xylol 3mal für 30 Sekunden.
Eindecken der Schnitte mit Tissue-Tek Film im Tissue-Tek Film Eindeckautomat.
3.7.5.5 Berechnung des Proliferationsindex
Zur Berechnung des Proliferationsindex wurden die Präparate, in denen Ki-67
angefärbt war, bei 400facher Vergrößerung unter dem Mikroskop betrachtet und die
Tumorzellen in 10 Sichtfeldern ausgezählt. Das Zentrum der Tumoren bestand
überwiegend
aus
nekrotischem
Gewebe.
47
Aus
diesem
Grund
wurden
die
Randbereiche der Präparate gewählt, in denen sich intaktes Tumorgewebe befand.
In den Gruppen 0, 1 und 3 wurden 6 Mäuse ausgewertet, in Gruppe 2 7 Mäuse
(Gruppe 0 = keine Behandlung, Gruppe 1 = Behandlung mit Valproat, Gruppe 2 =
Behandlung mit Temsirolimus, Gruppe 3 = Behandlung mit Valproat und
Temsirolimus). Pro Maus wurde ein Schnitt ausgezählt.
Der Proliferationsindex bezeichnet den prozentualen Anteil der positiv markierten
Tumorzellen und errechnet sich nach folgender Formel:
positiv markierte Tumorzellen
Proliferationsindex =
total gezählte Tumorzellen
3.7.6 PSA-Messung
3.7.6.1 Prinzip der PSA-Messung
Um die PSA-Konzentration im Serum der Mäuse zu bestimmen wurde das PSA
Enzyme Immunoassay Test Kit verwendet. Das PSA in der Probe bindet an ein antiPSA Antikörper, der sich auf einer Microtiter Platte befindet. Anschließend wird die
Platte gewaschen und damit überschüssiges Antigen entfernt. Ein anti-PSA
Antikörper, der mit einer Peroxidase verbunden ist, bindet an das PSA der Probe.
Abhängig von der Menge der gebundenen Peroxidase wird dann ein Farbstoff
gebildet. Dieser wird im Spektrometer bei 450nm gemessen und ist direkt
proportional zu der Konzentration des PSA.
Die PSA-Konzentration im Serum jeder auswertbaren Maus wurde dreimal
gemessen (siehe 4.2.1).
48
3.7.6.2 Protokoll zur PSA- Messung
Vorbereiten der Reagenzien
Alle Reagenzien wurden auf Raumtemperatur gebracht.
Standard und Proben auftragen
Jeweils 50µl der Standardkonzentration und Proben wurden in ein Well des Test Kits
gegeben.
Zero Puffer hinzufügen
50µl Zero Buffer wurden in jedes Well pipettiert und die Platte für 30 Sekunden
geschwenkt. Nun folgte eine Inkubationszeit von 60 Minuten bei Raumtemperatur.
Waschen
Der Inhalt der Platte wurde ausgeschlagen und jedes Well 5x mit 100µl destilliertem
Wasser gewaschen.
Enzym konjugiertes Reagenz hinzufügen
100µl Enzym konjugiertes Reagenz wurden in jedes Well pipettiert und die Platte 10
Sekunden geschwenkt. Anschließend erfolgte wieder eine Inkubationszeit von 60
Minuten bei Raumtemperatur.
Waschen
Der Inhalt der Platte wurde erneut ausgeschlagen und jedes Well 5x mit 100µl
destilliertem Wasser gewaschen.
TMB Reagenz hinzufügen
100µl TMB Reagenz wurden auf jedes Well gegeben, die Platte für 10 Sekunden
geschwenkt und anschließend 20 Minuten stehen gelassen.
Stoppen der Reaktion
100µl Stopp Reagenz wurden zu jedem Well hinzugefügt. Es erfolgte ein
49
Farbumschlag von blau nach gelb. Die Platte wurde für 30 Sekunden geschwenkt.
PSA-Messung
Die Absorption der Proben wurde in einem Photometer bei 450nm gemessen und
war direkt proportional zu der PSA Konzentration.
3.7.7 RNA-Extraktion aus Tumorgewebe
3.7.7.1 Prinzip der RNA-Extraktion aus Tumorgewebe
Die RNA-Extraktion wurde mit Hilfe des peqGOLD TriFast Systems durchgeführt.
PeqGOLD TriFast enthält Phenol und Guanidinisothiocyanat und basiert auf einer
Einschritt-Flüssigphasen-Separation. Durch das Guanidinisothiocyanat wird das
Gewebe
denaturiert.
Nach
Zugabe
von
Chloroform
und
anschließender
Zentrifugation erhält man drei Phasen. In der unteren, organischen Phase befinden
sich die Proteine, die DNA sammelt sich in der organischen und der Interphase und
die RNA ist nur in der wässrigen, oberen Phase gelöst. Die RNA wird aus der
wässrigen Phase ausgefällt und zweimal mit Ethanol gewaschen. Anschließend wird
die RNA in RNase-freiem Wasser gelöst. Sie kann sofort weiter verwendet werden
oder bei -20°C zur Zwischenlagerung aufbewahrt werden.
3.7.7.2 Protokoll zur RNA-Extraktion aus Tumorgewebe
Homogenisieren des Tumorgewebes
Zu 50-100 mg des Gewebes wurde 1ml peqGOLD Trifast gegeben. Anschließend
wurde die Probe in einem elektrischen Homogenisator zerkleinert und 5 Minuten bei
Raumtemperatur stehen gelassen.
Phasentrennung
0,2ml Chloroform wurde zugegeben und die Probe für 15 Sekunden kräftig
geschüttelt. Dann wurde die Probe 3-10 Minuten bei Raumtemperatur stehen
gelassen. Nun wurde die Probe 5 Minuten bei 13000 UPM zentrifugiert. Die Probe
50
trennte sich auf in drei Phasen, wobei sich die RNA nur in der oberen, wässrigen
Phase befand.
RNA-Präzipitation
Die wässrige Phase wurde in ein neues Röhrchen überführt und 0,5ml Isopropanol
zugegeben. Die Probe wurde gemischt und für 10 Minuten bei Raumtemperatur
gelagert. Dann erfolgte eine Zentrifugation bei 13000 UPM und 4°C für 10 Minuten.
Waschen der RNA
Der Überstand wurde vorsichtig abpipettiert und 1ml 75% Ethanol zu dem
zurückbleibenden Pellet zugefügt. Die Probe wurde auf einem Schüttelgerät
gemischt und erneut 10 Minuten bei 13000 UPM und 4°C zentrifugiert. Dieser Schritt
wurde ein weiteres Mal wiederholt.
Lösen der RNA
Das Ethanol wurde vorsichtig entfernt und das RNA-Pellet kurz an der Luft
getrocknet. Dann wurde das Pellet in 50µl RNase-freiem Wasser gelöst. Die RNA
konnte, auf Eis gelagert, sofort weiter verwendet werden oder bei -20°C zur
mittelfristigen Verwendung aufbewahrt werden.
3.8 RNA-Quantifizierung mittels Agilent 2100 Bioanalyzer
3.8.1 Prinzip der RNA-Quantifizierung
Zur Untersuchung der Quantität und Integrität der RNA wurde der Agilent 2100
Bioanalyzer mit dem RNA 6000 Nano LabChip Kit verwendet. Mit Hilfe dieses
Systems können geringe Mengen RNA (5ng) bei einem kleinen Probeneinsatz von
1µl innerhalb von 30 min hinsichtlich Qualität und Konzentration untersucht werden.
Der
Agilent
2100
Bioanalyzer
bewertet
51
die
RNA-Proben
anhand
eines
Fluoreszenzassays. Die Technologie des LabChips basiert auf dem Prinzip der
Mikrofluidik. Das Innere des Chips besteht aus Systemen winziger geschlossener
Kanäle. Durch Druck und elektrokinetische Kräfte strömen die Proben kontrolliert
durch die vorgegebenen Mikrokanäle. Die Nukleinsäuren werden hinsichtlich ihrer
Größe sortiert und nach dem Prinzip der Elektrophorese aufgetrennt. Der
Bioanalyzer misst die Fluoreszenz der RNA-Proben über die Zeit und zeichnet einen
Graphen auf, das Elektropherogramm. Zu jeden Ansatz erstellt die Software ein vom
Elektropherogramm abgeleitetes Gel-Bild, das den Graphen ergänzt. Außerdem
berechnet das System automatisch das Verhältnis der ribosomalen Banden der
RNA.
3.8.2 Protokoll der RNA-Quantifizierung
Alle benötigten Reagenzien wurden gekühlt bei 4°C gelagert. Der Gel-Dye-Mix,
welcher den Fluoreszenzfarbstoff enthält, musste vor Licht geschützt aufbewahrt
werden, um ihn vor Zerfall zu schützen.
Dekontamination der Elektroden
Um die Elektroden vor Verunreinigungen mit RNA zu schützen wurde ein
Elektrodenreinigungschip verwendet. Dieser Chip wurde mit 350µl RNase-ZAP
gefüllt und für eine Minute im Agilent 2100 Bioanalyzer platziert. Danach wurde ein
zweiter Reinigungschip mit 350µl RNase-freiem Wasser befüllt und ebenfalls für eine
Minute in dem Gerät belassen. Anschließend lies man das Wasser auf den
Elektroden kurz verdampfen.
Vorbereiten des Gel-Dye-Mixes
Der Gel-Dye-Mix wurde bei 4°C lichtgeschützt gelagert. Vor dem Gebrauch musste
er auf Raumtemperatur erwärmt werden. 400µl RNA-Gel Matrix wurde in den SpinFilter gegeben und bei 4000 UPM für 10 min zentrifugiert. 130µl der filtrierten RNAGel Matrix wurden in einem 1,5ml Zentrifugenröhrchen mit 2µl RNA-Dye-Konzentrat
52
ergänzt. Anschließend wurde der Gel-Dye-Mix mit Hilfe eines Schüttelgeräts
gemischt. Den Mix konnte man 1 Woche lagern, das gefilterte Gel musste innerhalb
eines Monats verbraucht werden.
Vorbereiten des RNA-Nano-Chips
Ein RNA-Nano-Chip wurde in die sohenannte Priming Station eingelegt. 9µl des GelDye-Mixes wurden in die auf dem Chip markierte Vertiefung pipettiert. Um den RNAChip zu laden, wurde mit Hilfe des Tauchkolbens der Priming Station für 30
Sekunden ein definierter Druck auf den Chip ausgeübt. Dann wurden 9µl Dye-Mix in
die anderen beiden gekennzeichneten Probenöffnungen verteilt.
Nun wurden je 5µl des RNA-Nano-Markers in die dafür vorgesehenen Öffnungen
gegeben. Anschließend wurde 1µl RNA-6000-ladder in die mit der Leiter markierte
Vertiefung gegeben.
Einfüllen der Proben
Nun wurde jeweils 1µl je Probe in die dafür vorgesehenen Vertiefungen pipettiert.
Jede isolierte RNA-Probe wurde einmal gemessen (n = 1). Wurden nicht alle der
zwölf Vertiefungen benötigt, mussten diese mit 1µl RNA-6000-Nano-Marker befüllt
werden. Anschließend wurde der Chip auf ein Schüttelgerät gelegt und bei 2400
UPM für 2 Minuten geschüttelt.
Messung des Chips im Agilent 2100 Bioanalyzer
3.8.3 Auswertung der Messungen
Anhand eines Elektropherogramms konnte beurteilt werden, ob die Durchführung
erfolgreich war. Es sollten zwei ribosomale Peaks (18S und 28S rRNA) und ein
Markerpeak dargestellt werden. Außerdem sollte zwischen den ribosomalen Peaks
nur eine geringe Hintergrundfluoreszenz vorhanden sein.
Die Qualität der RNA konnte zusätzlich noch anhand eines Gel-Bildes beurteilt
werden. Die 18S rRNA und die 28S rRNA sollten als zwei getrennte, scharfe Banden
erscheinen. Dabei sollte die 28S rRNA Bande doppelt so stark erscheinen, wie die
53
18S rRNA Bande. Unscharfe Banden wären ein Zeichen von RNA Degradation.
Durch das 18S/28S-rRNA Verhältnis konnte ebenfalls die Qualität der RNA beurteilt
werden. Werte > 1,7 weisen auf eine hochwertige RNA hin.
Anhand der ermittelten RNA-Konzentrationen wurde die nachfolgende cDNASynthese durchgeführt.
3.9 cDNA-Synthese
3.9.1 Prinzip der cDNA-Synthese
Die zuvor isolierte und quantifizierte RNA wurde mit Hilfe des Omniscript RT Kits von
QIAGEN in cDNA umgeschrieben. Dies ist nötig, um mRNA mit Hilfe von Real Time
RT-PCR quantifizieren zu können. Das Omniscript RT Kit ermöglicht es 50ng bis 2µg
RNA pro Reaktion in cDNA umzuwandeln.
Es wird ein Zufallsprimer (Random Primer) verwendet, der die komplette RNA,
inklusive rRNA, mRNA und tRNA umschreibt. Die cDNA-Synthese erfolgt in 3
Schritten:
1. Primeranlagerung
Die verwendeten Random Primer sind kurze Fragmente einsträngiger DNA
(Oligonukleotide), die nur aus 6 bis 8 Nukleotiden bestehen. Sie sind nicht spezifisch
für
einen
bestimmten
RNA-Abschnitt
sondern
sollen
mit
möglichst
vielen
Basenkombinationen übereinstimmen, um die komplette RNA umzuschreiben.
Deshalb lagern Sie sich auch an mehreren Stellen eines RNA-Stangs an und führen
so zu relativ kurzen cDNA-Molekülen.
2. Reverse Transkription (RNA-abhängige DNA-Polymerase)
Nach dem Prinzip der komplementären Basenpaarung kann die RNA-abhängige
DNA-Polymerase nun aus der RNA die komplementäre cDNA herstellen.
54
3. RNA-Degradation
Die Omniscript Reverse Transkriptase enthält eine Ribonuklease (RNase H). Diese
zerlegt die RNA, die an die cDNA gebunden ist. Ungebundene RNA wird nicht
beeinflusst. So entsteht ein einsträngiger cDNA-Strang.
3.9.2 Protokoll der cDNA-Synthese
Jede zuvor isolierte und quantifizierte RNA wurde einmal in cDNA umgeschrieben (n
= 1). Alle Arbeiten wurden mit Handschuhen und unter ausschließlicher Verwendung
von RNase-freien Materialien durchgeführt. Die Proben und Chemikalien wurden auf
Eis gelagert.
Der Gesamtansatz betrug 20µl pro Well. Davon bestanden 5,8µl aus einem Master
Mix (Zusammensetzung siehe unten) und 14,2µl aus der einzusetzenden RNA und
Wasser.
Es wurden 500ng RNA eingesetzt. Die entsprechenden Volumina wurden anhand
der Daten aus der RNA Quantifizierung mittels Agilent 2100 Bioanalyzer berechnet.
Rechenbeispiel:
Die Probe enthielt 377ng/µl.
500ng sollten eingesetzt werden:
500ng/377ng/µl = 1,3µl
Die benötigte Menge Wasser berechnete sich aus der Differenz der einzusetzenden
Menge Wasser (14,2µl) und der einzusetzenden RNA (in diesem Fall 1,3µl).
14,2µl-1,3µl=12,9µl
Es mussten also 12,9µl Wasser verwendet werden.
Der einfache Ansatz des Master Mixes zur Transkription einer Probe setzte sich
55
folgendermaßen zusammen:
2µl RT-Puffer
2µl 5mM dNTPs
1µl RT
0,3µl RNAase-Inhibitor (30U/µl)
0,5µl Random Primer (0,1µg/l)
= 5,8µl Master Mix
Vorbereiten der RNA
Die benötigte Menge RNA pro Probe wurde wie oben beschrieben berechnet. Die
RNA wurde auf Eis aufgetaut und kurz mit Hilfe eines Schüttelgeräts gemischt. Nun
wurde die berechnete Menge RNA in ein 0,2ml Eppendorf Gefäß pipettiert und mit
der entsprechenden Menge Wasser ergänzt. Die Proben wurden in einen
Thermocycler (iCycler) gegeben, wo sie bei 65°C für 5 Minuten denaturierten und
dann auf 4°C gekühlt wurden.
Master Mix
Die Omniscript RT Kit Bestandteile wurden auf Eis aufgetaut und mit einem
Schüttelgerät gemischt. Entsprechend der Probenanzahl wurde ein Vielfaches des
Master Mixes angesetzt. Dieser wurde noch einmal mit einem Schüttelgerät
gemischt.
Supplementierung der RNA mit Master Mix
Je 5,8µl Master Mix wurden zu jeder Probe hinzu gefügt und anschließend mit einem
Schüttelgerät gemischt.
cDNA-Synthese
Die Proben wurden in den Thermocycler gestellt. Nun lief die cDNA-Synthese ab.
Das Programm umfasste folgende Schritte:
10 Minuten bei 25°C
56
60 Minuten bei 37°C
5 Minuten bei 93°C
4°C dauerhaft bis zum Öffnen des Thermocyclers
Verdünnung
Die fertige cDNA wurde 1:5 verdünnt. Zu dem Ansatz von 20µl wurden also 80µl
Wasser hinzu pipettiert. Damit erhielt man 100µl cDNA.
Lagerung
Die cDNA wurde bis zur weiteren Verwendung bei -20°C gelagert.
3.10 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
3.10.1 Prinzip der PCR
Bei
der
PCR
handelt
es
sich
um
eine
Methode
bei
der
definierte
Nukleinsäurebereiche aus einem Nukleinsäuregemisch gezielt vermehrt werden
können. Dafür benötigt man die Sequenzinformation des gewünschten Fragments,
um passende Oligonukleotidprimer auswählen zu können. Mit Hilfe einer
thermostabilen DNA-Polymerase, die sich an die Primer anlagert, können DNAEinzelstränge zu Doppelsträngen polymerisiert werden.
Für die Durchführung einer PCR benötigt man u. a. die Matrizen-DNA und die DNAPolymerase, die entsprechenden Primer (aus Tabelle 1) und vier Desoxynukleotide
(dNTPs). Die PCR verläuft in drei Schritten:
1. Denaturierung
Auftrennen der Matrizen-DNA (Template) bei 95°C. Die Template-DNA liegt nun als
Einzelstrang vor.
2. Anlagerung
Anlagerung
(Annealing)
der
Oligonukleotidprimer
57
an
die
entsprechende
(komplementäre) Sequenz der Template-DNA.
Dafür wird die Temperatur bis zum spezifischen Schmelzpunkt des Primers gesenkt.
3. Polymerisation
Die hitzestabile DNA-Polymerase lagert sich an die Primer an und erzeugt
ausgehend vom 3´-OH-Ende des Primers einen komplementären DNA Strang zur
Matrize (in 5’ – 3’ Richtung).
Diese drei Schritte werden als PCR-Zyklus bezeichnet und in der vorliegenden
Studie bei der Real Time RT-PCR 60 mal wiederholt. Dabei wird der im vorherigen
Schritt erzeugte DNA-Strang zusätzlich als Template verwendet, was dazu führt,
dass die DNA-Menge des gewünschten Fragments exponentiell ansteigt (KÜCK,
2005).
3.10.2 Real Time RT-PCR
Das in dieser Arbeit verwendete PCR Verfahren unterscheidet sich von dem oben
beschriebenen dadurch, dass bei einer Real Time RT-PCR die DNA Amplifikation in
Echtzeit verfolgt werden kann. Dafür wird ein Fluoreszenzfarbstoff, in dieser Arbeit
SYBR Green, verwendet. Dieser Farbstoff besitzt in Lösung wenig Fluoreszenz.
Bindet er jedoch an doppelsträngige DNA, emittiert er ein starkes Fluoreszenzsignal,
das detektiert werden kann. Je stärker die Konzentration der doppelsträngigen DNA
zunimmt, umso stärker steigt also auch die gemessene Fluoreszenz.
Der Schwellenzyklus (Threshold-Cycle, Ct) beschreibt den Punkt der Amplifikation,
bei
dem
die
gemessene
Fluoreszenz
erstmalig
deutlich
über
die
Hintergrundfluoreszenz ansteigt. Je eher dieser Schwellenzyklus überschritten wird,
desto höher war die Ausgangskonzentration des gesuchten Fragments (WILHELM et
al., 2000).
Bei der Real Time RT-PCR wurde jeweils ein (durch den Vorwärts- und RückwärtsPrimer (Tabelle 1) definiertes) Fragment einer mRNA amplifiziert und somit
quantifiziert. Dadurch lässt sich mit dieser Methode eine Aussage über die
58
Genexpression der analysierten Gene treffen.
3.10.2.1 Real Time RT-PCR Amplifikationsdiagramm
Die Ergebnisse der Real Time RT-PCR können in einem Amplifikationsdiagramm
dargestellt werden (Abbildung 3). Dabei wird die Intensität der Fluoreszenz gegen die
Zykluszahl aufgetragen. Es entsteht eine sigmoidale Kurve bei der vier verschiedene
Phasen unterschieden werden können.
1. Lineare Grundphase
Die Fluoreszenz befindet sich noch auf dem Niveau der Hintergrundfluoreszenz.
Diese wird als Baseline bezeichnet. Die Grundphase umfasst ca. die ersten 20
Zyklen.
2. Frühe exponentielle Phase
Die Fluoreszenz steigt an und schneidet den Schwellenwert. Dieser Schwellenwert
entspricht dem zehnfachen Wert der Baseline. Der Zyklus in dem der Schwellenwert
geschnitten wird, wird als Schwellenzyklus (Threshold-Cycle) bezeichnet.
3. Exponentielle Phase
Die Amplifikation durchläuft ihr Optimum. Bei idealen Versuchsbedingungen
verdoppelt sich das PCR Produkt nun nach jedem Zyklus.
4. Plateau-Phase
Die Reaktionskomponenten stehen nur noch begrenzt zur Verfügung (WONG u.
MEDRANO, 2005).
59
Abbildung 3: Amplifikationsdigramm einer Real Time RT-PCR. 1. Lineare Grundphase, 2. Frühe
exponentielle Phase, 3. Exponentielle Phase, 4. Plateau Phase, A: Threshold-Cycle.
x-Achse: Anzahl der durchgeführten PCR-Zyklen.
y-Achse: Relative Fluoreszenz Einheit (RFU: relative fluorescence units).
3.10.2.2 Protokoll zur SYBR Green PCR
Um eine Kontamination der zu untersuchenden cDNA mit PCR Produkten aus
vorhergegangenen Studien zu vermeiden, wurden alle erforderlichen Pipettierschritte
in einem Laborbereich vorgenommen, in dem keine PCR-Produktanalysen
durchgeführt wurden. Für jede cDNA-Probe wurden drei Ansätze angefertigt (n = 3).
Ein Ansatz SYBR Green Supermix enthält:
10 µl SYBR Green Supermix
0,2 µl F-Primer
0,2 µl R-Primer
4,6 µl Nuklease-freies Wasser
60
Vorbereitung
Alle benötigten Materialien wurden aus dem Gefrierschrank (-20°C) genommen und
auf Eis aufgetaut. Anschließend wurden die Substanzen mit Hilfe eines
Schüttelgeräts gemischt.
Komplementierung des SYBR Green Supermix
Je nach Probenanzahl wurde ein Vielfaches des oben beschriebenen Ansatzes
SYBR Green Supermix benötigt. Die errechneten Mengen wurden in einem
Eppendorfgefäß zusammengefügt und mit Hilfe eines Schüttelgeräts gemischt.
Supplementierung der cDNA
15 µl des kompletten Supermixes wurden in jedes Probengefäß gegeben. Dann
wurde pro Probe 5 µl cDNA hinzugefügt. Alle Gefäße wurden mit einer
thermosensiblen und lichtdurchlässigen Folie verschlossen.
Negativkontrolle
Um Verunreinigungen des Supermixes ausschließen zu können, wurde eine
zusätzliche Probe mit 5 µl Wasser statt cDNA supplementiert. Auch diese wurde mit
Folie verschlossen.
Zentrifugieren
Die Probengefäße wurden 5 Minuten bei 1500 UPM zentrifugiert.
Positionierung im Thermocycler (iCycler)
Alle Proben wurden in den Thermocycler gestellt.
61
3.10.2.3 iCycler Programm
Im iCycler laufen folgende Schritte ab:
Zyklus 1 (1x):
95 °C für 30 Sekunden
Vordenaturierung
Zyklus 2 (60x):
95 °C für 10 Sekunden
Denaturierung
60 °C - 72 °C für 30 Sekunden
Anlagerung und Polymerisation
(Temperatur je nach spezifischem
Schmelzpunkt des verwendeten Primers
(Tabelle 1))
Im Anschluss erfolgt eine Schmelzkurvenanalyse:
Zyklus 3 (71x):
60 °C-95 °C für 10 Sekunden
Schmelzkurvenanalyse
Dabei erfolgte eine Temperaturerhöhung von 0,5 °C alle 10 Sekunden.
3.10.2.4 Auswertung der Messungen
Die Auswertung der Proben erfolgt nach der ∆∆Ct-Methode (LIVAK et al., 2001).
Dabei werden nach der Formal 2-∆∆CT die ermittelten Ct-Werte der unbehandelten
Gruppe von denen der behandelten Gruppe abgezogen und in Bezug zu konstant
exprimierten Referenzgenen gesetzt. Als Referenzgene wurden in der vorliegenden
Arbeit zur Auswertung der Zellversuche ARP (acidic ribosomal protein) und PBGD
(porphobilinogen deaminase) verwendet, da diese aufgrund der bisherigen
Erfahrungen der Arbeitsgruppe von LNCaP-Zellen konstant exprimiert werden. Zur
Auswertung der Tumorgewebeproben des Tierversuchs wurde das Referenzgen
ARP verwendet. Ein zweites konstant exprimiertes Referenzgen konnte nicht
62
gefunden werden.
3.11 Statistik
Die statistische Auswertung der Ergebnisse erfolgte mit Unterstützung der Abteilung
Medizinische Statistik der Universitätsmedizin Göttingen.
Alle Zellversuche wurden dreimal unabhängig voneinander durchgeführt. Die RNAExtraktion und –Quantifizierung erfolgte einmal für jeden Ansatz. Ebenso wurde jeder
Ansatz einmal in cDNA umgeschrieben. Die Real Time RT-PCR Untersuchungen
wurden
für
jeden
Ansatz
in
Triplikaten
gemessen.
Die
Vitalitäts-
und
Proliferationstests wurden sechsmal unabhängig voneinander durchgeführt.
Der Tierversuch wurde einmal durchgeführt. Für die Erfassung des Tumorwachstums
wurden in den Gruppen 0, 1 und 2 je 7 Mäuse ausgewertet, in Gruppe 3 wurden 6
Mäuse ausgewertet (siehe 4.2.1). HE-Färbungen und Ki-67-immunhistochemische
Färbungen wurden in den Gruppen 0, 1 und 3 von je 6 Mäusen angefertigt, in
Gruppe 2 von 7 Mäusen (Gruppe 0 = keine Behandlung, Gruppe 1 = Behandlung mit
Valproat, Gruppe 2 = Behandlung mit Temsirolimus, Gruppe 3 = Behandlung mit
Valproat und Temsirolimus). Dabei wurden eine HE-Färbung und eine Ki-67immunhistochemische Färbung pro Maus angefertigt und ausgewertet.
Alle Real Time RT-PCR- und Proliferationsuntersuchungen wurden mit Hilfe von der
GraphPad Prism 5 Software ausgewertet. Die Errechnung der p-Werte erfolgte mit
dem ein-Stichproben t-Test bei einem hypothetischen Wert von 1,0 mit Hilfe der
Software. Als signifikant gelten Werte mit p < 0.05. Die Auswertung des
Tumorwachstums erfolgte mit der Software STATISTICA.
63
4
Ergebnisse
4.1 Ergebnisse der Zellversuche
Um zu untersuchen, ob die Behandlung mit dem HDACi Valproat und dem mTORInhibitor Temsirolimus einen additiven Effekt zeigt, wurden LNCaP-Zellen mit je
einem und der Kombination aus beiden Stoffen behandelt. Die Konzentration von
Valproat betrug 1mMol/L, die von Temsirolimus 1µMol/L. Eine unbehandelte
Zellkultur diente als Kontrolle.
4.1.1 Ergebnisse der RNA-Quantifizierung
Am Ende des Zellversuches wurde die RNA aus den Zellen extrahiert und die
Quantität und Integrität der RNA mit Hilfe des Agilent 2100 Bioanalyzer bestimmt.
Dabei wurde für jede Probe ein Elektropherogramm (Abbildung 4) erstellt. Dieses
wies zwei ribosomale Peaks (18S und 28S rRNA) und einen Markerpeak auf. Eine
degradierte RNA würde zu zusätzlichen Peaks führen. Es war demnach von einer
guten RNA Qualität auszugehen.
64
Abbildung
4:
Repräsentatives
Elektropherogramm
der
isolierten
RNA
aus
einem
Behandlungsversuch. LNCaP-Zellen wurden mit Valproat wie unter Punkt 3.6.4 beschrieben
behandelt.
1. Marker-Peak, 2. 18S-ribosomaler-Peak, 3. 28S-ribosomaler Peak, x-Achse: Sekunden (s), y-Achse:
Fluoreszenz (FU: Fluorescence Unit).
Zusätzlich wurde vom Agilent 2100 Bioanalyzer ein Gel-Bild durch kapillarelektrophoretische Auftrennung der RNA erzeugt (Abbildung 5). Dabei erschien die
28S rRNA Bande doppelt so stark, wie die 18S rRNA Bande, was für die Reinheit der
RNA sprach. Unscharfe Banden wären ein Zeichen von RNA Degradation gewesen.
65
Abbildung 5: Repräsentative Darstellung der Elektrophorese der isolierten RNA aus einem
Behandlungsversuch. Die LNCaP-Zellen wurden wie unter Punkt 3.6.4 beschrieben behandelt.
L: Leiter (Banden von unten: 200bp, 500bp 1kbp, 2kbp, 4kbp, 6kbp), 1. LNCaP-Kontrolle, 2. LNCaPBehandlung mit VPA, 3. LNCaP-Behandlung mit Tem, 4. LNCaP-Behandlung mit VPA und Tem.
In der folgenden Tabelle sind exemplarisch die RNA-Konzentrationen und das RNAVerhältnis (18S/28S) einer durchgeführten LNCaP Behandlung dargestellt. Die
LNCaP-Zellen wurden wie unter Punkt 3.6.4 beschrieben behandelt. Das RNAVerhältnis von mindestens 2 sprach für eine gute RNA-Integrität.
LNCaP stimuliert mit:
RNA Konzentration (ng/µl) RNA-Verhältnis
Medium
354
2,1
Valproat
292
2,1
Temsirolimus
281
2
Valproat/Temsirolimus 167
2,3
Tabelle 4: RNA-Konzentrationen der behandelten LNCaP-Zellen. Die Zellen wurden wie unter Punkt
3.6.4 beschrieben behandelt. Die Messung erfolgte mit dem Agilent 2100 Bioanalyzer.
66
4.1.2 Ergebnisse des Vitalitätstests
Um Rückschlüsse auf die Vitalität der Zellen ziehen zu können, wurde der Alamar
Blue Assay durchgeführt. Dieser zeigt durch eine Verringerung des entstehenden
Fluoreszenzfarbstoffs eine Reduktion der Vitalität von Zellen an (Abbildung 6).
% Vitalität
150
100
50
em
VP
A
/T
Te
m
VP
A
M
ED
0
Abbildung 6: Darstellung der Vitalität der behandelten Zellen. Quantifiziert mit einem Alamar Blue
Assay (n = 6). Die Mediumkontrolle wurde auf 100% gesetzt.
x-Achse: MED = Medium, VPA = Valproat, Tem = Temsirolimus, VPA/Tem = Valproat und
Temsirolimus; y-Achse: % Vitalität.
Die behandelten Zellen zeigten im Vergleich zur Mediumkontrolle keine signifikanten
Veränderungen der Fluoreszenz. Dies bedeutet, dass die Vitalität der Zellen durch
die durchgeführte Behandlung nicht beeinträchtigt wurde.
67
4.1.3 Ergebnisse des Proliferationtests
Um Rückschlüsse auf die Proliferationsaktivität der Zellen ziehen zu können, wurde
der BrdU Test durchgeführt (Abbildung 7).
% Proliferation
150
100
50
em
VP
A
/T
Te
m
VP
A
M
ED
0
Abbildung 7: Proliferationsaktivität der behandelten Zellen. Quantifiziert mittels BrdU-Test (n = 6). Die
Mediumkontrolle wurde auf 100% gesetzt.
x-Achse: MED = Medium, VPA = Valproat, Tem = Temsirolimus, VPA/Tem = Valproat und
Temsirolimus; y-Achse: % Proliferation.
Die Behandlung der Zellen mit Valproat führte verglichen mit der Mediumkontrolle zu
einem Rückgang der Proliferation von 64,6% (p<0,05). Eine Behandlung mit
Temsirolimus verringerte die Proliferation um 23,9% (p<0,05). Die Behandlung der
Zellen mit beiden Medikamenten führte zu einer Proliferationsreduktion von 81,8%
(p<0,05). Im Verhältnis zu den Zellen, die nur mit Valproat behandelt wurden, sank
die Proliferation bei den Zellen, die mit beiden Medikamenten behandelt wurden
nochmal um 48,5% (p<0,05).
68
4.1.4
Veränderung der Genexpression nach Behandlung mit
Valproat,
Temsirolimus
oder
einer
Kombination
der
beiden
Medikamente
Die aus den unterschiedlich behandelten Zellen isolierte RNA wurde in cDNA
umgewandelt, um die Expression von KLK3, IGF-1, IGF-1-R und IGF-BP-3 mit Hilfe
der Real Time RT-PCR zu untersuchen.
Zur korrekten Berechnung der Expressionsunterschiede und zur Kontrolle der
endogenen Funktionen der Zellen wurden die Gene ARP (acidic ribosomal
phosphoprotein) und PBGD (porphobilinogen deaminase) als Referenzgene
verwendet. Diese zeigten keine signifikanten Veränderungen in ihrer Expression
zwischen Kontrolle und stimulierten Zellen. Geringe Schwankungen der Expression
wurden durch die Verwendung der ∆∆Ct-Methode (LIVAK et al., 2001) zur
Auswertung bei der Interpretation der Ergebnisse berücksichtigt.
69
4.1.4.1 Expression von KLK3:
Die Expression von KLK3 reduzierte sich durch die Behandlung mit Valproat um 40%
(p<0,05)
im
Vergleich
zur
unbehandelten
Kontrolle.
Die
Behandlung
mit
Temsirolimus oder die Behandlung mit der Kombination aus beiden Medikamenten
bewirkte keine signifikante Änderung der Expression (Abbildung 8).
Expression
1.5
1.0
0.5
em
A
/T
VP
Te
m
VP
A
M
ED
0.0
Abbildung 8: Expression von KLK3 nach Stimulation der LNCaP-Zellen (n = 3). Die Expression von
KLK3 in der Mediumkontrolle wurde auf 1 gesetzt.
x-Achse: MED = Medium, VPA = Valproat, Tem = Temsirolimus, VPA/Tem = Valproat und
Temsirolimus; y-Achse: Expression von KLK3.
70
4.1.4.2 Expression von IGF-1:
Die Behandlung mit Valproat führte zu einem Rückgang der Expression von IGF-1
um 49% (p<0,05). Die anderen beiden Behandlungsmöglichkeiten bewirkten keine
signifikante Veränderung der Expression (Abbildung 9).
Expression
2.0
1.5
1.0
0.5
A
/T
em
VP
Te
m
VP
A
M
ED
0.0
Abbildung 9: Expression von IGF-1 nach Stimulation der LNCaP-Zellen (n = 3). Die Expression von
IGF-1 in der Mediumkontrolle wurde auf 1 gesetzt.
x-Achse: MED = Medium, VPA = Valproat, Tem = Temsirolimus, VPA/Tem = Valproat und
Temsirolimus; y-Achse: Expression von IGF-1.
71
4.1.4.3 Expression von IGF-1-R:
Die Behandlung mit Valproat führte zu einer Abnahme der Expression um 36%
(p<0,05). Die Behandlung mit Temsirolimus und der Kombination aus beiden
Medikamenten bewirkte keine signifikante Änderung der Expression (Abbildung 10).
Expression
1.5
1.0
0.5
em
VP
A
/T
Te
m
VP
A
M
ED
0.0
Abbildung 10: Expression von IGF-1-R nach Stimulation der LNCaP-Zellen (n = 3). Die Expression
von IGF-1-R in der Mediumkontrolle wurde auf 1 gesetzt.
x-Achse: MED = Medium, VPA = Valproat, Tem = Temsirolimus, VPA/Tem = Valproat und
Temsirolimus; y-Achse: Expression von IGF-1-R.
72
4.1.4.4 Expression von IGF-BP-3:
Durch die Behandlung mit Valproat wurde die Expression von IGF-BP-3 um den
Faktor 7,5 erhöht. Eine Behandlung der Zellen mit Temsirolimus alleine zeigte keine
signifikante Änderung. Jedoch führte die kombinierte Therapie zu einer Steigerung
der Expression von IGF-BP-3 um den Faktor 53 (Abbildung 11).
Expression
60
40
20
em
A
/T
VP
Te
m
VP
A
M
ED
0
Abbildung 11: Expression von IGF-BP-3 nach Stimulation der LNCaP-Zellen (n = 3). Die Expression
von IGF-BP-3 in der Mediumkontrolle wurde auf 1 gesetzt.
x-Achse: MED = Medium, VPA = Valproat, Tem = Temsirolimus, VPA/Tem = Valproat und
Temsirolimus; y-Achse: Expression von IGF-BP-3.
73
4.2 Ergebnisse des Tierversuchs
Um die Auswirkung von Valproat und Temsirolimus auf das Tumorwachstum von
induzierten LNCaP Tumoren in vivo zu untersuchen, wurde ein Tierversuch
durchgeführt. Dazu wurden LNCaP Zellen immunsupprimierten Nacktmäusen
implantiert. Ab einem festgelegten Tumorvolumen (120mm³) wurden die Mäuse mit
Valproat (800mg/kg/d per os), Temsirolimus (0,3mg/kg intra venös) oder der
Kombination aus beiden Stoffen behandelt. Eine weitere Gruppe von Mäusen diente
als unbehandelte Kontrolle. Die Dosierung des Valproat wurde ausgewählt, weil
bekannt ist, dass sie ausreichend ist, um eine Blutkonzentration zu erreichen, die
äquivalent der beim Menschen gewünschten Konzentration ist (SHABBEER et al.,
2007).
4.2.1 Verwendete und ausgewertete Mäuse
Von den 80 verwendeten Mäusen entwickelten 31 Mäuse Tumoren. Dies entsprach
einem prozentualen Anteil von 38,8%. 4 Mäuse konnten nicht ausgewertet werden,
weil sie innerhalb kurzer Zeit nach Versuchsbeginn (3 bis 14 Tage) ein schlechtes
Allgemeinbefinden zeigten und aus tierschutzrechtlichen Gründen getötet werden
mussten.
Folgende Tabelle zeigt die Anzahl der injizierten Mäuse, die Anzahl der Mäuse mit
Tumorwachstum und die Anzahl der auswertbaren Mäuse pro Behandlungsgruppe:
74
Gruppe
0
1
2
3
Anzahl der
20
20
20
20
7
7
9
7
7
6
injizierten Mäuse
Anzahl der Mäuse 8
mit Tumoren
Auswertbare
7
Mäuse
Tabelle 5: Übersicht über die Anzahl der injizierten Mäuse, die Anzahl der Mäuse mit Tumorwachstum
und die Anzahl der auswertbaren Mäuse.
Gruppe 0 = keine Behandlung, Gruppe 1 = Behandlung mit Valproat, Gruppe 2 = Behandlung mit
Temsirolimus, Gruppe 3 = Behandlung mit Valproat und Temsirolimus.
4.2.2 Das Tumorwachstum
Das Wachstum der Tumoren wurde zweimal wöchentlich mit Hilfe einer Schieblehre
gemessen und nach folgender Formel berechnet: größerer Durchmesser x (kleinerer
Durchmesser)² x 0,5 (IGAWA et al., 2002). Nach der Entnahme der Tumoren wurde
diese zerteilt und makroskopisch beurteilt. Dabei wurde deutlich, dass die Tumoren
ein makroskopisch uneinheitliches Bild zeigten. Manche Tumoren bestanden aus
solidem Gewebe, andere waren mit nekrotischem Gewebe und Flüssigkeit gefüllt.
Bei diesen konnte Gewebe für die histologische Untersuchung nur aus dem soliden
Randbereich entnommen werden.
Das Wachstum der Tumoren zeigte zwischen den verschiedenen Gruppen während
und nach Abschluss der Behandlung keine signifikanten Unterschiede (Abbildung
12).
75
Abbildung 12: Durchschnittliches Wachstum der Tumoren der Mäuse der Gruppen 0-3.
Zwischen dem Tumorwachstum der verschiedenen Gruppen sind statistisch keine Unterschiede zu
ermitteln.
Gruppe 0 = keine Behandlung, Gruppe 1 = Behandlung mit Valproat, Gruppe 2 = Behandlung mit
Temsirolimus, Gruppe 3 = Behandlung mit Valproat und Temsirolimus.
x-Achse: Tage; y-Achse: Tumorvolumen (mm³).
Die Variation des Wachstums war allerdings innerhalb jeder Gruppe groß. Allein
Gruppe 2 (Tiere mit Behandlung von Temsirolimus, Abbildung 13 C) zeigte, bis auf
eine Ausnahme, ein relativ einheitliches Wachstum (Abbildung 13 A-D).
76
77
78
79
Abbildung 13 A-D: Wachstum der Tumoren der Mäuse.
A: Gruppe 0 (ohne Behandlung), B: Gruppe 1 (Valproat), C: Gruppe 2 (Temsirolimus), D: Gruppe 3
(Valproat und Temsirolimus).
x-Achse: Tage; y-Achse: Tumorvolumen (mm³)
80
Das Tumorwachstum konnte in stark (>1500mm³ bis Tag 20), mäßig (>1500mm³
zwischen Tag 25 und 40) und gering (<1000mm³ bis Tag 45) eingeteilt werden.
Damit ergab sich folgende Verteilung (Tabelle 6):
Tumorwachstum
stark
(>1500mm³
bis Tag 20)
mäßig
gering
(>1500mm³
(<1000mm³
bis
zwischen Tag 25 Tag 45)
und 40)
Gruppe 0
3
1
3
Gruppe 1
2
2
3
Gruppe 2
0
6
1
Gruppe 3
0
4
2
Tabelle 6: Anzahl der Tiere pro Gruppe mit starkem, mäßigem oder geringem Tumorwachstum.
Gruppe 0 = keine Behandlung, Gruppe 1 = Behandlung mit Valproat, Gruppe 2 = Behandlung mit
Temsirolimus, Gruppe 3 = Behandlung mit Valproat und Temsirolimus
81
4.2.3 Der Proliferationsindex
Um die Wachstumsfraktion der Tumorzellen anhand der angefertigten histologischen
Präparate
zu
bestimmen,
wurde
in diesen
der Proliferationsmarker Ki-67
immunhistochemisch angefärbt und der Proliferationsindex bestimmt. In den
untersuchten Tumorproben zeigten sich zudem verschiedene histomorphologische
Malignitätskriterien wie Polymorphie, atypische Mitosen, große Zellkerne mit
prominenten Nucleoli und eine veränderte Kern/Plasma Relation zugunsten des
Kerns (Abbildung 14 A,B).
82
Abbildung 14 A-B: Tumorgewebe der Gruppe 0 (keine Behandlung), 400fache Vergrößerung, Scale
bar: 20µm.
A: Repräsentative HE-Färbung, B: Repräsentative Ki-67 Färbung.
A: Als Malignitätskriterien sind zu erkennen: Polymorphie, atypische Mitosen, große Zellkerne mit
prominenten Nucleoli und eine veränderte Kern/Plasma Relation. B: Die Ki-67 positiven Zellen zeigen
eine rote Farbreaktion.
83
Die kombinierte Behandlung der Mäuse mit Valproat und Temsirolimus (Gruppe 3)
führte im Vergleich zu den Mäusen die kein Medikament (Gruppe 0, 80%), nur
Valproat (Gruppe 1, 81%) oder nur Temsirolimus (Gruppe 2, 77%) erhielten zu einer
signifikanten Abnahme des Proliferationsindex (49%) (Tabelle 7; Abbildung 15 A-D).
Gruppe 0
Maus 1
Gruppe 1
Gruppe 2
Gruppe 3
83%
86%
44%
Maus 2
75%
92%
58%
52%
Maus 3
75%
83%
74%
49%
Maus 4
86%
85%
48%
Maus 5
89%
79%
76%
46%
Maus 6
74%
79%
77%
52%
Maus 7
78%
72%
83%
Durchschnitt
80%
81%
77%
49%
Tabelle 7: Durchschnittlicher Proliferationsindex pro Maus und Behandlungsgruppe nach Auszählung
der Tumorzellen in 10 Sichtfeldern bei 400facher Vergrößerung. Es wurde ein Schnitt pro Maus
ausgewertet.
Gruppe 0 = keine Behandlung, Gruppe 1 = Behandlung mit Valproat, Gruppe 2 = Behandlung mit
Temsirolimus, Gruppe 3 = Behandlung mit Valproat und Temsirolimus
84
85
86
87
Abbildung 15 A-D: Tumorgewebe der Gruppen 0-3, Repräsentative Ki-67 Färbungen, 100fache
Vergrößerung, Scale bar: 100µm, A: Gruppe 0, B: Gruppe 1, C: Gruppe 2, D: Gruppe 3.
Gruppe 0 = keine Behandlung, Gruppe 1 = Behandlung mit Valproat, Gruppe 2 = Behandlung mit
Temsirolimus, Gruppe 3 = Behandlung mit Valproat und Temsirolimus.
Der Anteil der Ki-67 positiven Zellen ist in dem Tumorgewebe der Gruppe 3 geringer als in den
Tumorgeweben der Gruppen 0-2.
Dabei ergab sich bei Mäusen aus Gruppe 3 (Valproat und Temsirolimus, Abbildung
13D) ein geringerer Proliferationsindex, obwohl sie, gemessen am Tumorvolumen,
ein stärkeres Wachstum zeigten als z.B. Mäuse der Gruppe 0 (keine Behandlung,
Abbildung 13A) (Abbildung 16,17 A,B)).
88
89
Abbildung 16 A,B: Tumorgewebe der Gruppe 3 (Valproat und Temsirolimus), Repräsentative Ki-67
Färbungen, 100fache Vergrößerung, Scale bar: 100µm.
A: Maus 1 in Abbildung 13 D, B: Maus 6 in Abbildung 13 D.
Der Anteil der Ki-67 positiven Zellen ist geringer als bei Mäusen der Gruppe 0 (Abbildung 17), obwohl
die Mäuse der Gruppe 3, gemessen am Tumorvolumen, ein stärkeres Wachstum zeigten (Abbildung
13 D).
90
91
Abbildung 17 A-B: Tumorgewebe der Gruppe 0 (keine Behandlung), Repräsentative Ki-67
Färbungen, 100fache Vergrößerung, Scale bar: 100µm.
A: Maus 3 in Abbildung 13 A, B: Maus 6 in Abbildung 13 A.
Der Anteil der Ki-67 positiven Zellen ist höher als bei Mäusen der Gruppe 3 (Abbildung 16), obwohl
die Mäuse der Gruppe 0, gemessen am Tumorvolumen, ein geringeres Wachstum zeigten (Abbildung
13 A).
4.2.4 PSA-Sekretion
Die LNCaP-Zellen des Tumors produzierten humanes PSA, welches im Serum der
Mäuse gemessen werden konnte. Die Mäuse selber produzierten kein PSA. Die
Menge an gemessenem PSA ermöglicht es, Rückschlüsse auf die Aktivität des
Androgenrezeptors in den LNCaP-Zellen der jeweiligen Mäuse zu ziehen. Dies ist
möglich, weil der Androgenrezeptor als Transkriptionsfaktor für das KLK3-Gen dient,
das für das PSA-Protein codiert (YOUNG et al., 1991; LUKE u. COFFEY, 1994).
92
Die Menge des PSA im Serum der Mäuse unterschied sich zwischen den
verschiedenen Gruppen nicht signifikant (Abbildung 18).
PSA (ng/ml)
3000
2000
1000
3
e
2
pp
e
ru
G
G
ru
pp
pp
ru
G
G
ru
pp
e
e
1
0
0
Abbildung 18: PSA Menge gemessen im Serum der Mäuse (n = 3).
x-Achse: Gruppe 0 = keine Behandlung, Gruppe 1 = Behandlung mit Valproat, Gruppe 2 =
Behandlung mit Temsirolimus, Gruppe 3 = Behandlung mit Valproat und Temsirolimus; y-Achse: PSA
(ng/ml).
Da die Mäuse zum Zeitpunkt ihres Todes keine exakt gleich großen Tumoren
aufwiesen und die PSA-Sekretion von der Anzahl der vorhandenen LNCaP-Zellen
abhängig ist, wurde die gemessene PSA Menge auf das Tumorvolumen bezogen
(Abbildung 19).
93
PSA (ng/ml/mm³)
3
2
1
3
ru
pp
e
2
G
ru
pp
e
G
ru
pp
e
G
G
ru
pp
e
0
1
0
Abbildung 19: PSA-Sekretion der Tumoren bezogen auf das jeweilige Tumorvolumen (n = 3).
x-Achse: Gruppe 0 = keine Behandlung, Gruppe 1 = Behandlung mit Valproat, Gruppe 2 =
Behandlung mit Temsirolimus, Gruppe 3 = Behandlung mit Valproat und Temsirolimus; y-Achse: PSA
(ng/ml/mm³).
Auch im Verhältnis zum Tumorvolumen zeigte die PSA-Sekretion der verschiedenen
Gruppen keine signifikanten Unterschiede.
4.2.5
Veränderung der Genexpression nach Behandlung mit
Valproat,
Temsirolimus
oder
einer
Kombination
der
beiden
Medikamente
Aus dem Tumorgewebe der getöteten Mäuse wurde die RNA isoliert und in cDNA
umgewandelt. Anschließend wurde mittels Real Time RT-PCR die Expression von
KLK3, IGF-1, IGF-1-R und IGF-BP-3 untersucht.
94
Als Referenzgen wurde bei der Untersuchung des Tumorgewebes das ARP gewählt
und die Auswertung erfolgte mit der ∆∆Ct-Methode (LIVAK et al., 2001).
4.2.5.1 Expression von KLK3:
Die Behandlung der Mäuse mit Valproat hatte keinen Einfluss auf die KLK3 mRNAExpression der Tumorzellen. Temsirolimus erhöhte die Expression von KLK3 um
53% (p<0,05), die Kombination aus beiden Medikamenten führte zu einer
durchschnittlichen Erhöhung um 93% (p<0,05) (Abbildung 20).
2.5
Expression
2.0
1.5
1.0
0.5
3
G
ru
pp
e
2
pp
e
ru
G
ru
G
G
ru
pp
e
pp
e
0
1
0.0
Abbildung 20: Expression von KLK3 im Tumorgewebe der Mäuse (n = 3). Die Expression von KLK3
in der Gruppe 0 wurde auf 1 gesetzt.
x-Achse: Gruppe 0 = keine Behandlung, Gruppe 1 = Behandlung mit Valproat, Gruppe 2 =
Behandlung mit Temsirolimus, Gruppe 3 = Behandlung mit Valproat und Temsirolimus; y-Achse:
Expression von KLK3.
95
4.2.5.2 Expression von IGF-1:
Valproat führte zu einer Verringerung der IGF-1 Expression um 21% (p<0,05).
Temsirolimus senkte die IGF-1 Expression um 45% (p<0,05). Die Kombination der
beiden Medikamente zeigte keinen signifikanten Einfluss (Abbildung 21).
Expression
1.5
1.0
0.5
3
G
ru
pp
e
2
pp
e
ru
G
ru
G
G
ru
pp
e
pp
e
0
1
0.0
Abbildung 21: Expression von IGF-1 im Tumorgewebe der Mäuse (n = 3). Die Expression von IGF-1
in der Gruppe 0 wurde auf 1 gesetzt.
x-Achse: Gruppe 0 = keine Behandlung, Gruppe 1 = Behandlung mit Valproat, Gruppe 2 =
Behandlung mit Temsirolimus, Gruppe 3 = Behandlung mit Valproat und Temsirolimus; y-Achse:
Expression von IGF-1.
96
4.2.5.3 Expression von IGF-1-R:
Temsirolimus erhöhte die Expression von IGF-1-R um den Faktor 2,7. Die
Behandlung mit Valproat oder der Kombination von Valproat und Temsirolimus
bewirkten keine signifikante Veränderung der Expression (Abbildung 22).
Expression
4
3
2
1
3
ru
pp
e
2
G
G
ru
pp
e
pp
e
ru
G
G
ru
pp
e
0
1
0
Abbildung 22: Expression von IGF-1-R im Tumorgewebe der Mäuse (n = 3). Die Expression von IGF1-R in der Gruppe 0 wurde auf 1 gesetzt.
x-Achse: Gruppe 0 = keine Behandlung, Gruppe 1 = Behandlung mit Valproat, Gruppe 2 =
Behandlung mit Temsirolimus, Gruppe 3 = Behandlung mit Valproat und Temsirolimus; y-Achse:
Expression von IGF-1-R.
97
4.2.5.4. Expression von IGF-BP-3:
Die Kombination aus Valproat und Temsirolimus senkte die Expression von IGF-BP3 um 77%. Die Behandlung der Mäuse mit nur einem Medikament führte zu keiner
signifikanten Änderung (Abbildung 23).
Expression
1.5
1.0
0.5
3
ru
pp
e
2
G
G
ru
pp
e
pp
e
ru
G
G
ru
pp
e
0
1
0.0
Abbildung 23: Expression von IGF-BP-3 im Tumorgewebe der Mäuse (n = 3). Die Expression von
IGF-BP-3 in der Gruppe 0 wurde auf 1 gesetzt.
x-Achse: Gruppe 0 = keine Behandlung, Gruppe 1 = Behandlung mit Valproat, Gruppe 2 =
Behandlung mit Temsirolimus, Gruppe 3 = Behandlung mit Valproat und Temsirolimus; y-Achse:
Expression von IGF-BP-3.
98
5
Diskussion
5.1 Ergebnisse der Zellversuche
Das Ziel der Zellversuche war, zu untersuchen, ob ein additiver Effekt bei der
Behandlung der Prostatakrebszelllinie LNCaP mit dem HDACi Valproat und dem
mTOR-Inhibitor Temsirolimus besteht. Zu diesem Zweck wurden LNCaP-Zellen mit
Valproat (1mMol/L) und Temsirolimus (1µMol/L) stimuliert und die RNA der Zellen
extrahiert.
5.1.1 Vitalität und Proliferation der Zellen
Um auszuschließen, dass die beobachteten Effekte auf eine toxische Wirkung der
Medikamente zurückzuführen sind, wurde zunächst mittels Alamar Blue Assay die
Vitalität der Zellen nach der Stimulation untersucht. Dieser ergab, dass bei keinem
der Stimulationsversuche eine signifikante Reduktion der Vitalität aufgetreten ist.
Dies bedeutet, dass die Zellen durch die Behandlung mit Valproat bzw. Temsirolimus
in ihrer Lebensfähigkeit nicht beeinträchtigt wurden.
Die verwendeten Konzentrationen der Wirkstoffe betrugen in den durchgeführten
Experimenten 1mMol/L für Valproat und 1µMol/L für Temsirolimus. Bei der Wahl der
Konzentrationen wurde sich an der Studie von Wedel et al., orientiert. In dieser Arbeit
wurden LNCaP- (und PC-3-) Zellen mit Valproat und dem mTOR-Inhibitor RAD001 in
den genannten Konzentrationen behandelt. Es zeigte sich ein synergistischer Effekt
auf das Tumorzellwachstum und eine Inhibition des Zellzyklus (WEDEL et al., 2011).
Thelen et al. zeigten weiterhin, dass die Vitalität von LNCaP-Zellen durch Stimulation
mit Valproat erst durch hohe Konzentrationen (25mmol/L) signifikant sinkt, so dass
für die in dieser Arbeit gewählte Konzentration (1 mmol/L) keine Beeinflussung der
Vitalität zu erwarten war. Diese Daten stimmen mit unseren Ergebnissen aus dem
Alamar Blue Assay überein (THELEN et al., 2004).
Die Proliferationsaktivität der Zellen wurde anhand eines BrdU Tests untersucht.
99
Dabei führte die Stimulation mit Temsirolimus im Verhältnis zur unbehandelten
Kontrolle zu einem Rückgang der Proliferation von 23,9%. Die Behandlung mit
Valproat reduzierte die Proliferation um 64,6%, die Kombination aus beiden
Wirkstoffen um 81,8%. Ein Rückgang der Proliferation aufgrund einer allgemeinen
Zellschädigung kann ausgeschlossen werden, da eine konstante Zellvitalität
(gemessen durch den Alamar Blue Assay) nachgewiesen wurde.
Valproat besitzt tumorhemmende Eigenschaften, u. a. durch eine Reduktion des
Tumorzellwachstums und durch die Induktion von Zelldifferenzierung. Dies wurde an
verschiedensten
Zellarten,
u.a.
an
Neuroblastomzellen
(SH-SY5Y)
und
Brustkrebszellen (MT-450), nachgewiesen (GÖTTLICHER et al., 2001; YUAN et al.,
2001).
Eine mögliche Erklärung für den Rückgang der Proliferation von LNCaP-Zellen durch
Valproat wurde bereits von Thelen et al. aufgezeigt. Die Gruppe konnte zeigen, dass
Valproat die HDAC-Aktivität in LNCaP-Zellen hemmt und die Expression von
verschiedenen Genen beeinflusst, die für Proliferation oder Apoptose wichtig sind
(THELEN et al., 2004). So wurde die Expression von TIMP-3 und IGF-BP-3 durch die
Behandlung der LNCaP-Zellen mit Valproat erhöht (THELEN et al., 2004). TIMP-3
beteiligt sich an der Induktion von Apoptose (BOND et al., 2002). IGF-BP-3 wirkt als
Bestandteil des IGF-Systems dem proliferativ wirkendem IGF entgegen und hat
selber proapoptotische Eigenschaften (COHEN et al., 1991; IWAMURA et al., 1993;
BOYLE et al., 2001). Die Expression von PSA wurde durch die Behandlung der
LNCaP-Zellen mit Valproat vermindert (THELEN et al., 2004). IGF-BP-3 wird von
PSA gespalten, wodurch sich die Verfügbarkeit von IGF für den IGF-1-R erhöht. Aus
diesem Grund wirkt auch eine verringerte Expression von PSA dem proliferativ
wirkendem IGF entgegen. Die Veränderung der Expression von IGF-BP-3 und PSA
durch die Behandlung mit Valproat wurde in dieser Arbeit ebenfalls untersucht und
die Ergebnisse von Thelen et al. konnten bestätigt werden.
Zusätzlich ist bekannt, dass Valproat einen hemmenden Effekt auf den Zellzyklus
ausübt. Valproatbehandlung erhöhte den Anteil von Prostatakarzinomzellen in der
G0/G1 Phase im Vergleich zu unbehandelten Zellen und verringerte die Expression
der Cyclin-abhängige Kinase 1 (Cdk1 ) (WEDEL et. al., 2011). Eine Hemmung von
100
Cdk1 wiederum führt zu einer Abnahme des Androgenrezeptors auf mRNA- und
Proteinebene (CHEN et al., 2006).
Auch der antiproliferative Effekt von verschiedenen mTOR-Inhibitoren konnte bereits
in in vitro und in vivo Versuchen nachgewiesen werden (AZIM et al., 2010). So führte
die Applikation von Rapamycin zu einem signifikanten Rückgang des Wachstums
von induzierten Prostatakarzinomen im Mausmodell (ZHANG et al., 2009).
Weiterhin zeigten Fung et al. einen Rückgang der Proliferation von LNCaP-Zellen
durch Temsirolimus, eine Abnahme in der S Phase befindlicher Zellen und eine
Zunahme der Zellen in der G1 Phase des Zellzyklus (FUNG et al., 2009). Diese
Ergebnisse stimmen mit den Untersuchungen des mTOR-Inhibitors RAD001 überein
(WEDEL et al., 2011).
Bezüglich der Fragestellung dieser Arbeit, ob ein synergistischer Effekt bei der
Behandlung von LNCaP-Zellen mit Valproat und Temsirolimus besteht, ist der von
uns beobachtete stärkere Rückgang der Proliferation der LNCaP-Zellen, die mit einer
Kombination aus Valproat und Temsirolimus behandelt wurden ein wichtiges und
neues Ergebnis. Eine mögliche Erklärung für diesen Effekt könnte die Hemmung des
Zellzyklus sein. Wedel et al. konnten in einer Studie mit einem anderen mTORInhibitor (RAD001) einen additiven Effekt von Valproat und RAD001 auf die
Hemmung des Zellzyklus nachweisen (WEDEL et al., 2011). Einen weiteren Grund
könnte die von uns nachgewiesene Beeinflussung des IGF-Systems durch Valproat
und Temsirolimus darstellen.
5.1.2
Veränderung der Genexpression von KLK3, IGF-1, IGF-1-R
und IGF-BP-3
Das
IGF-System
spielt
eine
wichtige
Rolle
für
die
Zellproliferation,
-
Zelldifferenzierung, Zelltransformation und Apoptose (MOSCHOS u. MANTZOROS,
2002).
IGF-1 bindet an den IGF-1-R und wird in seiner Aktivität vom IGF-BP-3 und PSA
101
beeinflusst. IGF-BP-3 bindet IGF-1 und senkt damit die Verfügbarkeit für den IGF-1R, wohingegen PSA IGF-BP-3 spaltet und damit die Bioverfügbarkeit des IGF-1
erhöht (COHEN et al., 1992; RAJAH et al., 1995; KOISTINEN et al., 2002)
(Abbildung 2).
Eine Behandlung der LNCaP-Zellen mit Valproat führte in unserer Studie zu einem
Rückgang der Expression des KLK3-Gens (= PSA mRNA) um 40%.
Durch
die
Aktivierung
des
Androgenrezeptors
und
seiner
Wirkung
als
Transkriptionsfaktor wird von der LNCaP-Zelle PSA gebildet. Thelen et al. konnten
zeigen, dass die Behandlung von LNCaP-Zellen mit Valproat zu einer geringeren
Expression von PDEF (Prostate-Derived Ets Factor) und PSA führt (THELEN et al.,
2004). PDEF ist ein Co-Aktivator des Androgenrezeptors und unterstützt diesen bei
der Expression von PSA (OETTGEN et al., 2000).
Die Behandlung der LNCaP-Zellen mit Temsirolimus und der Kombination aus
beiden Wirkstoffen führte in der vorliegenden Arbeit zu keinem signifikanten
Rückgang des PSA. Daraus lässt sich folgern, dass wahrscheinlich kein
Zusammenhang zwischen den mTOR nachgeschalteten Signalkaskaden und einer
Aktivierung des Androgenrezeptors besteht. Die Beantwortung der Frage, warum
Temsirolimus die Wirkung von VPA auf die PSA Expression aufhebt, bedarf weiterer
Forschung.
Die IGF-1-Expression wurde in der vorliegenden Arbeit durch die Behandlung der
LNCaP-Zellen mit Valproat in seiner Expression um 49% reduziert, die Expression
des IGF-1-R um 36%. Diese Ergebnisse können wie folgt interpretiert werden:
IGF-1 und sein Rezeptor fördern die Entwicklung von metastatischen Fähigkeiten
von Prostatakrebszellen. Es wurde gezeigt, dass IGF-1 über den IGF-1-R u.a. die
Migration von Prostatakarzinomzellen vorantreibt (MARELLI et al., 2006). Außerdem
konnte durch die Hemmung von IGF-1 (durch einen spezifischen Antikörper) das
Wachstum von menschlichen Prostatakrebszellen in Knochen sowie die Entstehung
von neuen Metastasen im Tierversuch unterdrückt werden (GOYA et al., 2004).
IGF-1 unterstützt den Androgenrezeptor in Abwesenheit von Androgenen dabei, in
102
den Zellkern zu gelangen und spielt damit eine wichtige Rolle in der Pathogenese
des kastrationsresistenten Prostatakarzinoms. Dies geschieht, indem IGF-1 über den
IGF-1-R PI3K und AKT aktiviert (MYERS et al., 1994; DUDEK et al., 1997; KULIK et
al.,
1997).
PI3K
und
Prostatakrebsentwicklung
AKT
und
spielen
dem
eine
wichtige
Voranschreiten
der
Rolle
bei
der
Erkrankung
zum
kastrationsresistenten Karzinom (MURILLO et al., 2001 und GRAFF, 2002).
Weiterhin ist bekannt, dass PI3K und AKT über ihren Signalweg den Eintritt des
Androgenrezeptors in den Zellkern in Abwesenheit von Androgenen fördern und dort
seine Transkriptionsaktivität erhöhen können (WEN et al., 2000 und MANIN et al.,
2002).
Neben seiner unterstützenden Wirkung auf den Androgenrezeptor führt eine
Aktivierung von AKT zu einer vermehrten mTOR-Aktivität (SEKULIĆ et al., 2000;
AOKI et al., 2001) (Abbildung 24).
Abbildung 24: Schematische Darstellung der möglichen Effekte von IGF-1 und IGF-1-R auf den
Androgenrezeptor und mTOR. AR: Androgen Rezeptor,
: aktiviert,
: führt zu,
: vermehrte Expression.
Die in der vorliegenden Arbeit erreichte Reduktion von IGF-1 und IGF-1-R durch die
Valproat-Behandlung lässt aufgrund der Ergebnisse aus der Literatur erstens eine
Reduktion der Malignität der LNCaP-Zellen sowie zweitens in Kombination mit
Temsirolimus einen synergistischen Effekt auf die Hemmung von mTOR erwarten.
Die Behandlung mit Temsirolimus und die Kombination der beiden Medikamente
zeigte jedoch in der vorliegenden Studie keine Auswirkung auf die Expression von
103
IGF-1 und IGF-1-R.
Über die Gründe der Kompensation des Effektes von Valproat auf IGF-1 und IGF-1R durch Temsirolimus kann bei dem derzeitigen Erkenntnissstand nur spekuliert
werden:
So ist aber bekannt, dass mTOR über verschiedene Signalkaskaden das Überleben,
das Wachstum und den Metabolismus von Zellen beeinflusst. Einer der negativen
Regulatoren von mTOR ist PTEN. PTEN wiederum reguliert AKT negativ (WU et al.,
1998; RAMASWAMY et al., 1999). Im Prostatakarzinom wird PTEN herunter
reguliert, weshalb AKT vermehrt wirken kann. Gleichzeitig ist die Aktivität von mTOR
in Prostatakrebszellen höher als im gesunden Prostatagewebe (KREMER et al.,
2006). Dai et al. unterstützten diese Ergebnisse und zeigten, dass die Expression
von AKT und mTOR mit dem Gleacon Score korreliert und in Prostatakrebszellen
höher ist als in gesunden Prostatazellen (DAI et al., 2009)
Folgerichtig ist eine Inhibition von mTOR in Prostatakrebszellen mit verringerter
Invasion, Migration, Proliferation und vermehrter Apoptose verbunden (WANG et al.,
2010).
Jedoch ist eine erfolgreiche Krebsbehandlung mit einem mTOR-Inhibitor durch die
Entstehung von Resistenzen und Kompensationsmechanismen nur eingeschränkt
möglich. Viele verschiedene Krebsarten entwickeln, auch wenn sie anfänglich
sensibel
für
mTOR-Inhibitoren
waren,
Resistenzmechanismen
gegen
die
entsprechenden Medikamente. Es sind verschiedene Strategien beschrieben, wie die
Zelle den mTOR-Inhibitoren entgegen wirken kann. Unter anderem existiert ein
Feedback Mechanismus, der die Wirkung von mTOR-Inhibitoren aufhebt. So konnten
O`Reilly et al. zeigen, dass mTOR-Inhibitoren über diesen Mechanismus zu einer
vermehrten Expression z.B. von Insulin Rezeptor Substrat 1 (IRS1) führen. IRS1
vermittelt die Aktivierung des IGF-1-R und führt damit zu einer vermehrten
Aktivierung von AKT (Abbildung 26). Dies wurde u. a. für Prostatakrebszellen (DU145) gezeigt (O`REILLY et al., 2006).
Eine anderer möglicher Feedback Mechanismus von mTOR-Inhibitoren suggeriert
der IGF/IGF-1-R-Signalweg: Eine Blockade des IGF-1-R verhinderte den Feedback
104
Mechanismus. Es konnte jedoch an den verwendeten Rhabdomyosarkom-zellen
keine Beteiligung von IRS1 nachgewiesen werden (WAN et al., 2007).
Abbildung 25: Schematische Darstellung der möglichen Effekte von IGF-1 und IGF-1-R auf den
Androgenrezeptor sowie mTOR und eines möglichen Feedback Mechanismus von mTOR-Inhibitoren.
AR: Androgen Rezeptor,
: aktiviert,
: führt zu,
: hemmt.
Warum letztendlich Temsirolimus den Effekt von Valproat auf die Expression von
IGF-1 und IGF-1-R aufzuheben scheint, kann somit nicht abschließend beantwortet
werden. In weiterführenden Studien sollte z.B. die Rolle von PTEN bei der
Behandlung von Prostatakarzinomzellen mit Valproat und Temsirolimus untersucht
werden.
Die Expression von IGF-BP-3 wurde in unserer Studie durch die Behandlung mit
Valproat um den Faktor 7,5 erhöht. Die Kombination mit Temsirolimus erhöhte die
Expression sogar um den Faktor 53. Die alleinige Behandlung mit Temsirolimus
zeigte dagegen keinen Effekt.
Dies ist ein neues und wichtiges Ergebnis und eine mögliche Erklärung für den
synergistischen Effekt der beiden Medikamente auf den Rückgang der Proliferation
der LNCaP-Zellen (Abbildung 7).IGF-BP-3 besitzt IGF-abhängige und –unabhängige
antiproliferative und proapoptotische Eigenschaften (DE MELLOW u. BAXTER,
1988; BLAT et al., 1989; MCCUSKER et al., 1990; FRANKLIN et al., 2003; HAN et
al., 2011).
105
75-90% des im Serum zirkulierenden IGF-1 ist an IGF-BP-3 gebunden. IGF-BP-3 ist
somit die größte Fraktion unter den zirkulierenden IGF-BP (JOGIE-BRAHIM et al.,
2009). IGF-1, welches an IGF-BP-3 gebunden ist, steht dem IGF-1-R nicht als
Reaktionspartner zu Verfügung. Durch die Menge des IGF-BP-3 wird demnach die
Bioverfügbarkeit von IGF-1 reguliert (JOGIE-BRAHIM et al., 2009). Aufgrund dieses
Zusammenhangs beeinflusst IGF-BP-3 über IGF-abhängige Mechanismen das
Zellwachstum.
Zusätzlich besitzt IGF-BP-3 auch IGF-unabhängige Wirkungen. So konnte gezeigt
werden, dass IGF-BP-3 in Prostatakrebszellen über einen IGF-unabhängigen Weg
Apoptose induziert (HAN et al., 2011). IGF-BP-3 konnte außerdem die durch VEGF
(vascular endothelial-derived growth factor) vermittelte Proliferation von
HUVEC-
Zellen (human macrovascular umbilical vein endothelial cells) hemmen (FRANKLIN
et al., 2003).
In wie weit eine erhöhte Serumkonzentration von IGF-BP-3 mit einem erhöhten
Prostatakrebsrisiko
in
Zusammenhang
steht
wurde
in
verschiedenen
epidemiologischen Studien untersucht: Die Ergebnisse dieser Untersuchungen sind
kontrovers. Manche Studien zeigten ein erhöhtes Risiko einer Erkrankung (STATTIN
et al., 2000; SEVERI et al., 2006), manche keinen (CHAN et al., 1998) und manche
eine nicht signifikante Erhöhung des Risikos (CHEN et al., 2005).
Die Stimulation der LNCaP-Zellen mit Valproat und der Kombination von Valproat
und Temsirolimus führt in der vorliegenden Arbeit zu einer signifikant erhöhten
Expression von IGF-BP-3. Die Kombination beider Medikamente zeigte dabei eine
deutlich stärkere Wirkung als die einzelne Gabe von Valproat. Dieses neue Ergebnis
weist darauf hin, dass die Kombination von Valproat und Temsirolimus über die
antiproliferativen und proapoptotischen Eigenschaften von IGF-BP-3 die Malignität
der Tumorzellen senken kann und stellt einen möglichen Weg, für die additive
Wirkung von Valproat und Temsirolimus auf den Rückgang der Proliferation der
LNCaP-Zellen dar (Abbildung 7). Es bleiben die Fragen zu klären, warum erstens die
alleinige Stimulation mit Temsirolimus keinen Effekt zeigt und zweitens durch welche
Signalwege Valproat und die Kombination von Valproat und Temsirolimus wirken.
Durch
den
Zusammenhang
zwischen
106
dem
IGF-System
und
dem
kastrationsresistenten
möglicherweise
einen
Prostatakarzinom
neuen
stellt
Therapieansatz
die
für
gewählte
das
Behandlung
kastrationsresistente
Prostatakarzinom dar.
In künftigen Studien sollte daher IGF-BP-3 auf Proteinebene untersucht werden, um
die Ergebnisse auf RNA-Ebene zu ergänzen. Weiterhin wäre interessant, Apoptose
zu untersuchen und nachzuweisen, ob und wo der Androgenrezeptor vergleichend
exprimiert wird (Zytoplasma oder Zellkern).
5.2 Ergebnisse des Tierversuchs
Ziel des Tierversuchs war es, zu untersuchen, ob die Behandlung mit Valproat,
Temsirolimus oder einer Kombination der beiden Medikamente eine Auswirkung auf
das Tumorwachstum von humanen Prostatakrebszellen in vivo hat.
Zu
diesem
Zweck
wurden
LNCaP-Zellen
subkutan
in
immunsupprimierte
Nacktmäuse injiziert. Daraufhin entwickelte sich an dieser Stelle ein Tumor aus den
LNCaP-Zellen. Sobald ein festgelegtes Tumorvolumen erreicht war, wurden die
Mäuse in Gruppen unterteilt und mit Valproat (per os), Temsirolimus (intravenös)
oder der Kombination aus beiden Stoffen behandelt.
5.2.1 Anwachsen der Tumoren
Von den verwendeten 80 Mäusen entwickelten nur 31 Mäuse einen palpierbaren
Tumor. Dies entsprach einem Anteil von 38,8% der Tiere. Abgeleitet aus einem
vorangegangenen Versuch hätte ein Anteil von ca. 70% erwartet werden können.
Damals entwickelten 11 von 16 Mäusen einen Tumor, was einem Anteil von 69%
entsprach (THELEN et al., 2005) Dabei wurden die gleiche Mauslinie und die
gleichen Zellen verwendet.
In
vielen
wissenschaftlichen
Veröffentlichungen,
in
denen
ebenfalls
Xenotransplantationen in immunsupprimierte Mäuse durchgeführt wurden, wird die
Anzahl injizierter Tiere nicht erwähnt (KORTENHORST et al., 2009; SHABBEER et
al., 2007; YIN et al., 2007). Aus diesem Grund ist es schwierig zu beurteilen, ob die
von uns erreichte Quote erfolgreich injizierter Tiere den Erwartungen entsprach.
107
Obwohl die von uns verwendeten Mäuse des Stammes NMRInu/nu ein etabliertes
Modell
für
Xenotransplantationen
sind,
existieren
keine
wissenschaftlichen
Veröffentlichungen darüber, wie hoch die Anwachsrate von LNCaP-Tumoren in
diesen Mäusen ist.
Es gibt vielfältige Gründe für ein unterschiedliches Anwachsen der Zellen: Die
verwendeten LNCaP-Zellen wurden in den Injektionsspritzen mit Matrigel vermischt
und bis zur Verwendung für ca. 15 Minuten auf Eis gelagert. Dann wurden die Mäuse
nacheinander behandelt. Eventuell haben sich die Zellen und das Matrigel in diesem
Zeitraum unterschiedlich stark entmischt und konnten deshalb nicht gleich gut
anwachsen.
Die Injektion der Zellen erfolgte subkutan zwischen die Schulterblätter. Es wurde auf
eine einheitliche Technik geachtet, jedoch könnte die Injektionstiefe zwischen den
einzelnen Mäusen variiert und dies zusammen mit dem individuellen Gefäßverlauf
der Mäuse einen Einfluss auf das Anwachsen der Zellen gehabt haben.
Obwohl die Mäuse alle durch ein Fehlen des Thymus immunsupprimiert waren,
könnten auch individuelle Unterschiede der Tiere das Wachstum der injizierten
Zellen beeinflussen haben.
5.2.2 Wachstum der Tumoren
Das Wachstum der Tumoren zeigte während und nach Abschluss der Therapie
zwischen den verschiedenen Behandlungsgruppen keine signifikanten Unterschiede.
Jedoch war die Varianz des Wachstums innerhalb jeder Gruppe sehr groß.
So zeigten alleine drei Mäuse der Gruppe 0 (keine Medikation) ein sehr starkes
Wachstum mit einem Tumorvolumen von >1500mm³ bis Tag 20, eine Maus ein
mäßiges Wachstum mit einem Tumorvolumen von etwa 1000mm³ an Tag 25 und
drei Mäuse ein geringes Wachstum mit einem Volumen <1000mm³ bis Tag 45. Auch
die Gruppen 1 (Valproat) und 3 (Valproat plus Temsirolimus) zeigten eine ähnliche
Varianz, wobei Gruppe 3 keine Mäuse mit starkem Tumorwachstum beinhaltete.
Nur die alleinige Behandlung mit Temsirolimus (Gruppe 2) führte zu einem relativ
einheitlichen Wachstum. Sechs Mäuse zeigten ein mäßiges und eine ein geringes
108
Wachstum.
Auch das makroskopische Bild des Tumorgewebes zeigte eine große Varianz. Einige
Tumoren bestanden aus solidem Tumorgewebe. Andere waren mit nekrotischem
Gewebe und Flüsssigkeit gefüllt, so dass bei diesen die histologischen Präparate nur
aus dem festen Randbereich des Tumors angefertigt werden konnten.
Wie auch schon für das Anwachsen der Tumoren können für die große Varianz des
Wachstums
und
das
unterschiedliche
makroskopische
Bild
der
Tumoren
verschiedene Gründe vermutet und kritisch hinterfragt werden.
So könnte sich durch eine individuelle Vaskularisierung die Durchblutung der
Tumoren unterschieden haben. Diese unterschiedliche Durchblutung könnte eine
Rolle gespielt haben für die Wirkstoffkonzentration im Tumor. Für die von uns
verwendete Dosierung von Valproat (0,8%ig) ist nachgewiesen, dass diese
Konzentration ausreicht, eine gewünschte Blutkonzentration zu erreichen, die
äquivalent der beim Menschen gewünschten Konzentration ist (SHABBEER et al.,
2007). Durch eine unterschiedlich starke Durchblutung der Tumoren könnte
allerdings die Wirkstoffkonzentration, die die Tumorzellen tatsächlich erreichte,
variiert haben.
Temsirolimus wurde direkt i.v. appliziert und sollte aus diesem Grund zu 100% im
Blut verfügbar gewesen sein. Jedoch wurde bei nicht durchführbarer i.v. Applikation
Temsirolimus auch retrobulbär injiziert. Ob dies einen Unterschied auf die
Bioverfügbarkeit, Abbaurate und Halbwertszeit von Temsirolimus hatte, ist nicht
bekannt. Dies sollte zusätzlich zu der Frage, wie hoch die Wirkstoffkonzentration
direkt im Tumor war, in weiteren Studien beobachtet und untersucht werden.
Die Behandlung der Mäuse mit Valproat, Temsirolimus oder der Kombination aus
beiden Stoffen führte zu keiner signifikanten Beeinflussung der Volumina der
Tumoren (mm³).
An verschiedenen Zellarten (Neuroblastomzellen SH-SY5Y und Brustkrebszellen
MT-450) konnte für Valproat nachgewiesen werden, dass es zu einer Reduktion von
Tumorwachstum und zur Induktion von Zelldifferenzierung führt (GÖTTLICHER et
109
al., 2001; YUAN et al., 2001). In Zellkulturexperimenten an LNCaP-Zellen führte
Valproat zu einem Rückgang der Proliferation und beeinflusste die Expression von
verschiedenen Genen, die bei der Proliferation oder Apoptose eine Rolle spielen
(THELEN et al., 2004). Diese tumorhemmenden Eigenschaften von Valproat konnten
in unseren Zellversuchen ebenfalls nachgewiesen werden (Abbildung 7-11).
Außerdem konnte bewiesen werden, dass Valproat bei Prostatakrebszellen, darunter
auch LNCaP-Zellen, einen hemmenden Effekt auf den Zellzyklus ausübt (WEDEL et.
al., 2011).
Im Tierversuch konnte Valproat humane Magenkrebszellen in ihrem Wachstum
hemmen:
Immunsupprimierten
Nacktmäusen
(BALB/cnu/nu)
wurden
humane
Magenkrebszellen implantiert. Die Mäuse wurden mit Valproat in einer Dosierung
von 10mg/Maus fünfmal pro Woche intraperitoneal behandelt. Valproat bewirkte
einen signifikanten Rückgang des Tumorwachstums um 36,4% und eine gesteigerte
Apoptose in den behandelten Tumoren (YAGI et al., 2010). Auch für humane
Leberkrebszellen (HuH7), die BALB/c Mäusen implantiert wurden, konnte ein
signifikant reduziertes Wachstum durch die Behandlung mit Valproat per os
nachgewiesen werden (MACHADO et al., 2011).
Dagegen konnte in unserem Tierversuch keine signifikante Veränderung des
Tumorwachstums durch Valproat nachgewiesen werden.
Auch die Behandlung mit Temsirolimus führte zu keiner signifikanten Änderung des
Tumorwachstums.
Temsirolimus bewirkte im Zellversuch einen Rückgang der Proliferation von LNCaPZellen sowie eine Hemmung des Zellzyklus (FUNG et al., 2009). Diese
Eigenschaften
konnten
auch
für
einen
weiteren
mTOR-Inhibitor,
RAD001,
nachgewiesen werden (WEDEL et al., 2011). Auch in unseren Zellversuchen war ein
Rückgang der Proliferation von LNCaP-Zellen durch Temsirolimus festzustellen. Dies
wurde durch die Kombination von Temsirolimus und Valproat verstärkt.
Bezüglich der Wirkung von mTOR-Inhibitoren in in vivo Versuchen existieren
widersprüchliche Ergebnisse. Zhang et al. verwendeten Mäuse, die durch eine
Genmutation ein spontanes Wachstum von Tumoren in ihrer Prostata zeigten. Die
110
Behandlung mit dem mTOR-Inhibitor Rapamycin zeigte einen signifikanten
Rückgang des Tumorwachstums im Vergleich zur unbehandelten Gruppe. Eine
Kombination von Rapamycin mit einem Antiandrogen verstärkte diesen Effekt auf
das Wachstum weiter (ZHANG et al., 2009). In einem weiteren Versuch wurde SCID
Mäusen Prostatakrebszellen in die Tibia injiziert, die dort einen Tumor bildeten. Die
Behandlung der Tiere mit dem mTOR-Inhibitor RAD001 führte zu einem
Tumorrückgang und einer Reduktion des Serum-PSA der Mäuse im Vergleich zur
unbehandelten Kontrolle (MORGAN et al., 2008).
Bei der Behandlung von LNCaP-Tumoren in SCID Mäusen führte RAD001 dagegen
nicht zu einer Veränderung des Wachstums der Tumoren. (SCHAYOWITZ et al.,
2010). Die Behandlung von LNCaP-Tumoren in Nacktmäusen mit Temsirolimus,
welches intraperitoneal appliziert wurde, zeigte keinen Erfolg (FUNG et al., 2009).
In unseren Versuchen zeigte Temsirolimus ebenfalls keinen Einfluss auf das
Wachstum der LNCaP-Tumoren.
In der vorliegenden Arbeit führte zwar die Kombination von Valproat und
Temsirolimus zu keinem messbaren Rückgang der Volumina der Tumoren (mm³),
allerdings zeigten die histologischen Präparate eine deutliche Abnahme der
Wachstumsfraktion der Zellen in diesen Tumoren. Dafür könnte eine additive
Wirkung der Medikamente auf die Hemmung des Zellzyklus verantwortlich sein. Für
Valproat und den mTOR-Inhibitor RAD001 ist eine solche Wirkung im Zellversuch mit
LNCaP-Zellen beschrieben worden (WEDEL et al., 2011). Warum dies nicht zu
einem reduzierten Tumorwachstum führte, kann nur vermutet werden. Eine
Möglichkeit wäre, dass die Hemmung des Zellzyklus erst gegen Ende der sieben
wöchigen Behandlungsdauer einsetzte und dies deshalb im histologischen Präparat
nicht nachgewiesen werden konnte, die Behandlungsdauer aber nicht ausreichte um
eine Auswirkung auf das Tumorvolumen sehen zu können. Eine andere Möglichkeit
wäre, dass die Varianz im makroskopischen Aufbau der Tumoren die Auswertbarkeit
des Tumorwachstums (mm³) beeinflusst hat. So könnte ein flüssigkeitsgefüllter
Tumor eine geringe Proliferationsrate im Bereich des soliden Gewebes zeigen, die
Menge an Flüssigkeit aber eine stärkere Volumenzunahme vortäuschen. In weiteren
111
Studien sollte bei der Beurteilung der Volumenzunahme von Tumoren das
makroskopische Bild des Tumorgewebes berücksichtigt werden.
Zudem hatte der applizierte Wirkstoff im Zellversuch direkt Kontakt mit der Zellwand
jeder einzelnen Zelle. Dieser Zugang des Wirkstoffes wurde im Tierversuch
erschwert. Die Applikation von Valproat erfolgte über das Trinkwasser. Dabei hatten
die Mäuse keine andere Wahl, als das mit dem Wirkstoff versetzte Wasser zu
trinken. Allerdings wurde bei der Berechnung der Dosierung davon aus gegangen,
dass alle Mäuse gleich viel trinken. Variationen in der Trinkmenge könnten die
Wirkstoffkonzentration im Blut beeinflusst haben. In weiteren Studien müssten die
Bioverfügbarkeit und die Wirkstoffkonzentration von Valproat und Temsirolimus im
Inneren der Tumoren bestimmt werden. Außerdem sollte versucht werden, ein
Verfahren zu finden, welches ein einheitlicheres Wachstum von LNCaP-Tumoren
garantiert.
5.2.3 PSA im Serum der Mäuse
Durch die Aktivierung und nachfolgende Bindung des Androgenrezeptors an
spezifische DNA Sequenzen, bewirkt dieser die Expression von verschiedenen
Genen. Zu diesen gehört auch das KLK3, welches für das PSA Protein kodiert
(YOUNG et al., 1991; LUKE u. COFFEY, 1994). Aus diesem Grund ist es möglich
von der Menge des gebildeten PSA Rückschlüsse auf die Aktivität des
Androgenrezeptors zu ziehen.
Das humane PSA, welches im Serum der Mäuse gemessen werden konnte, wurde
ausschließlich von den LNCaP-Tumoren produziert. Die Mäuse produzieren kein
eigenes PSA.
Die PSA Messung im Serum der Mäuse ergab keinen signifikanten Unterschied
zwischen den verschiedenen Behandlungsgruppen. Auch die PSA Menge bezogen
auf das Tumorvolumen der jeweiligen Maus zeigte keine signifikanten Unterschiede.
Aus diesen Ergebnissen lässt sich schlussfolgern, dass die Aktivität des
Androgenrezeptors durch die jeweiligen Medikamente scheinbar nicht beeinflusst
112
wurde.
Dagegen verringerte Valproat die Expression der PSA mRNA in unserem
Zellversuch um den Faktor 2,9. Temsirolimus und die Kombination von Valproat und
Temsirolimus zeigten keine Effekte.
Ob der Effekt von Valproat nicht ausreichte, um zu einer PSA Senkung im Serum der
behandelten Mäuse zu führen oder ob die Valproat-Konzentration, die den Tumor
erreichte, zu gering war, um die Zellen zu beeinflussen, müssen weitere Studien
zeigen.
5.2.4
Veränderung der Genexpression von KLK3, IGF-1, IGF-1-R
und IGF-BP-3
Aus dem Tumorgewebe der getöteten Mäuse wurde RNA isoliert und die Expression
der oben genannten Gene mittels Real Time RT-PCR untersucht.
Die Ergebnisse aus den Untersuchungen der Gene KLK3, IGF-1, IGF-1-R und IGFBP-3 stehen hierbei im Widerspruch zu den Ergebnissen aus den Zellversuchen:
Die Expression von KLK3 wurde durch die Behandlung der Mäuse mit Temsirolimus
um 53% erhöht. Die Kombination der beiden verwendeten Medikamente führte sogar
zu einer Erhöhung um 93%. Diese erhöhte KLK3 Expression lies sich jedoch nicht
auf Proteinebene im Serum der Mäuse feststellen. Ein Grund dafür könnte sein, dass
die Erhöhung der KLK3 Expression zu gering war, um eine Veränderung des PSA im
Serum der Mäuse zu bewirken. Ein anderer Grund könnte sein, dass die PSA-mRNA
zudem post-transkriptionell reguliert wurde.
Im Widerspruch dazu führte in unseren Zellversuchen nur Valproat zu einem
Rückgang der KLK3 Expression. Die Erhöhung der KLK3 Expression lässt auf eine
gesteigerte Aktivität des Androgenrezeptors schließen. Bislang ist jedoch kein
Zusammenhang zwischen den mTOR nachgeschalteten Signalwegen und der
Aktivität des Androgenrezeptors bekannt.
113
Die Expression von IGF-1 wurde durch die Behandlung mit Valproat um 21%
gesenkt. Temsirolimus verringerte die Expression um 45%. Auch im Zellversuch
konnte für Valproat die Fähigkeit nachgewiesen werden, die IGF-1 Expression zu
senken, allerdings zeigte Temsirolimus keinen Effekt.
Weiterhin erhöhte Temsirolimus die Expression von IGF-1-R um den Faktor 2,7.
Dieses Ergebnis ist konträr zu den Zellversuchen. Dort hatte Temsirolimus keinen
signifikanten Effekt. Stattdessen führte Valproat zu einer verringerten Expression von
IGF-1-R.
Der deutlichste Unterschied zu den Ergebnissen des Zellversuchs zeigte die
Expression von IGF-BP-3. Im Tierversuch führte die Behandlung mit Temsirolimus
und Valproat zu einer Verringerung der Expression um 77%, wohingegen die
Expression von IGF-BP-3 im Zellversuch um den Faktor 53 zunahm.
Wodurch die widersprüchlichen Ergebnisse des Tierversuchs im Vergleich zum
Zellversuch entstanden sind, lässt sich nicht abschließend beantworten. Allerdings
reichten
die
Expressionsunterschiede
Tumorwachstum
signifikant
zu
im
Tierversuch
beeinflussen.
Ob
der
nicht
aus,
Einfluss
um
der
das
beiden
Medikamente auf das Zellwachstum im Tumor zu gering war, um einen Effekt
sichtbar zu machen oder ob der Zeitraum der Behandlung zu kurz war muss weiter
untersucht werden.
114
6
Schlussfolgerung
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die kombinierte Behandlung von LNCaPZellen in vitro und in vivo mit dem HDACi Valproat und dem mTOR-Inhibitor
Temsirolimus einen synergistischen Effekt auf die Inhibition der Zellproliferation zeigt.
Ebenfalls konnte ein synergistischer Effekt der beiden Medikamente auf das IGFSystem in vitro nachgewiesen werden. Dadurch könnte die Kombination aus Valproat
und
Temsirolimus
die
Fähigkeit
besitzen,
den
Krankheitsverlauf
des
kastrationsresistenten Prostatakarzinoms positiv zu beeinflussen. Jedoch zeigen die
vorliegenden Ergebnisse auch, dass weitere Untersuchungen nötig sind, um
einerseits den genauen Wirkmechanismus der kombinierten Therapie zu verstehen
und andererseits die optimale Dosierung und Applikationsdauer der Medikamente in
vivo zu finden. In weiteren Studien sollte u.a. die Rolle von PTEN, die Expression
des Androgenrezeptors sowie Apoptose untersucht werden.
115
7
Zusammenfassung
Lisa Krahn (2012)
Erprobung einer Kombinationstherapie aus dem Histondeacetylaseinhibitor Valproat
und dem mTOR-Inhibitor Temsirolimus für das fortgeschrittene Prostatakarzinom in
vitro und am Nacktmausmodell.
Das Prostatakarzinom ist die häufigste Krebserkrankung des Mannes in westlichen
Gesellschaften. Zwei Drittel der Karzinome sind bei Diagnosestellung auf die
Prostata beschränkt und können erfolgreich behandelt werden. Das letzte Drittel
jedoch kann auf Grund der Ausbreitung des Karzinoms nicht mehr erfolgreich
operiert werden. Die Therapie der Wahl für diese Patienten ist der vollkommene
Androgenentzug. Im Anschluss an die Remission von 2-4 Jahren, erfolgt jedoch die
Entwicklung des kastrationsresistenten Prostatakarzinoms und kann nur noch
palliativ behandelt werden. Die verwendeten Medikamente verringern die Schmerzen
und erhöhen die Lebensqualität, verlängern das Leben aber nur um ein paar Monate.
Aus diesem Grund werden neue Medikamente benötigt, die auf karzinomspezifische
Signalwege abzielen.
Das
Ziel
dieser
Arbeit
Prostatakarzinomzellen
ist,
(LNCaP)
zu
untersuchen,
und
ob
die
Behandlung
Prostatakarzinomzelltumoren
mit
von
dem
Histondeacetylaseinhibitor Valproat und dem mTOR-Inhibitor Temsirolimus einen
synergistischen Effekt auf das Tumorwachstum zeigt.
In einem Zellversuch wurden LNCaP-Zellen mit Valproat, Temsirolimus oder einer
Kombination aus beiden Stoffen behandelt. Anschließend wurde die Proliferation der
Zellen und die Expression verschiedener Gene analysiert.
Die Behandlung der LNCaP-Zellen mit Valproat oder Temsirolimus führte zu einem
signifikanten Rückgang der Zellproliferation. Dabei zeigte sich ein synergistischer
Effekt bei der Applikation beider Medikamente. Außerdem führte die kombinierte
Behandlung zu einer deutlich erhöhten Expression (x53) von IGF-BP-3, welches
116
antiproliferative
und
proapoptotische
Eigenschaften
besitzt.
Über
diese
synergistische Beeinflussung des IGF-Systems könnte die Kombination aus Valproat
und
Temsirolimus
die
Fähigkeit
besitzen,
den
Krankheitsverlauf
des
kastrationsresistenten Prostatakarzinoms positiv zu beeinflussen.
Um die Medikamente auch in vivo zu untersuchen, wurden LNCaP-Zellen in
immunsupprimierte Nacktmäuse (NMRInu/nu) implantiert. Der entstehende Tumor
wurde zweimal die Woche vermessen und die Mäuse ebenfalls mit Valproat per os,
Temsirolimus intra venös oder der Kombination aus beiden Medikamenten
behandelt. Die vierte Gruppe blieb unbehandelt und diente als Kontrolle. Nach
sieben Wochen oder sobald es aus Tierschutzgründen notwendig war, wurden die
Mäuse getötet.
Im Tierversuch zeigte sich ein sehr individuelles Wachstum der Tumoren und es
konnten keine signifikanten Unterschiede im Wachstum zwischen den verschiedenen
Behandlungsgruppen nachgewiesen werden. Die Untersuchung der Tumoren mittels
Ki-67-Immunhistochemie zeigte allerdings einen verringerten Proliferationsindex in
den Tumoren, die mit beiden Medikamenten behandelt wurden. Die Ergebnisse der
Genexpressionsanalyse mittels Real Time PCR waren widersprüchlicher Natur. So
führte die kombinierte Behandlung mit Valproat und Temsirolimus zu einer Abnahme
der Expression des IGF-BP-3 um 77%, wohingegen die Expression von IGF-1-R
durch Temsirolimus, nicht aber durch die Kombination, um den Faktor 2,7 erhöht
wurde.
Die Ergebnisse des Tierversuchs unterstützen die in vitro Ergebnisse daher nur
teilweise. Ob z.B. der Einfluss der beiden Medikamente auf das Zellwachstum im
Tumorgewebe im Tierversuch zu gering war, um einen Effekt sichtbar zu machen
oder ob der Zeitraum der Behandlung zu kurz war, müssen weitere Untersuchungen
zeigen.
117
8
Abstract
Lisa Krahn (2012)
The effect of a combinational therapy of the histondeacetylaseinhibitor Valproate and
the mTOR-inhibitor Temsirolimus on advanced prostate carcinoma in vitro and a
nude mice model.
In Western societies, prostate cancer is the most common malignancy in men.
Currently, two third of prostate carcinomas are restricted locally at diagnosis and can
be successfully treated. However, there is no option for the last third. The therapy of
choice for an advanced prostate carcinoma is a complete withdrawal of androgens.
This results in a remission of 2-4 years, followed by the development of a so called
castration-resistant prostate carcinoma.
The subsequent therapy palliates the pain and improves quality of life for the patients
but it extends the life span only for a couple of months. Thus, new drug treatments
are needed to manipulate androgen signaling in order to restrict tumour growth.
The aim of this study is to elucidate whether the treatment of a prostate carcinoma
cell line (LNCaP) or LNCaP derived tumours with the Histone deacetylase inhibitor
valproat in combination with the mTOR-inhibitor Temsirolimus results in synergistic
effects on cell proliferation and tumour growth.
In a cell culture experiment, LNCaP cells were treated with Valproat, Temsirolimus or
a combination of both. Subsequently, the proliferation rate and the gene-expression
of diverse tumour markers were analyzed.
The incubation of LNCaP cells with the combination of Valproat and Temsirolimus
resulted in a decrease of cell proliferation with an additive effect of both drugs in
comparison to the single treatment. Moreover, the combined application of Valproat
and Temsirolimus also led to a significant upregulation (x53) of IGF-BP-3, which
mediates apoptosis and inhibits proliferation.
Therefore the combined application of Valproat and Temsirolimus might inhibit the
118
progression of the castration-resistant prostate carcinoma via this synergistic effect
on the IGF-system.
In a second, in vivo experiment, LNCaP cells were implanted into immunesuppressed nude mice (NMRInu/nu), resulting in the formation of a subcutaneous
prostate carcinoma. The mice were subdivided into four groups and again treated
with Valproat per os, Temsirolimus intravenous or a combination of both. The last
group was untreated and served as control. Tumour volume was measured and
calculated twice a week over a period of seven weeks or until tumour size exceeded
animal welfare considerations.
In the mouse model, the distinct tumours grew rather heterogeneously. We found no
significant differences in size between the different groups. However, staining against
the proliferation marker Ki-67 in histological sections of the tumours showed a
remarkable reduction in the proliferation potential when the mice were treated with
the combination of Valproat and Temsirolimus. However, the results of quantitative
PCR to estimate RNA levels of key markers from tumour samples were contradicting.
For instance, the combined application of Valproat and Temsirolimus reduced the
expression of IGF-BP-3 to some extent (77%), whereas the expression of IGF-1-R
was increased upon treatment of Temsirolimus alone (x 2,7) but not after treatment
with both drugs.
Therefore, our data derived from the in vivo experiment. do not unequivocally support
our results from cell culture experiments. Whether e.g. the effects observed in
LNCaP cells are not sufficient to inhibit tumour growth in vivo or whether the period of
medication was too short to see effects needs to be investigated in further studies.
119
9
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