Aus der Abteilung Fischkrankheiten und Fischhaltung des Zentrums

Aus der Abteilung Fischkrankheiten und Fischhaltung
des Zentrums für Infektionsmedizin
der Tierärztlichen Hochschule Hannover
Interaktion von Aeromonas hydrophila
mit der Intestinalmukosa des Karpfens (Cyprinus carpio)
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer
DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
Vorgelegt von
Verena Schroers
aus Krefeld
Hannover 2007
Wissenschaftliche Betreuung:
Apl. Prof. Dr. Dieter Steinhagen
Abteilung Fischkrankheiten und Fischhaltung
Zentrum für Infektionsmedizin
Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover
1. Gutachter:
Prof. Dr. Dieter Steinhagen
2. Gutachter:
Prof. Dr. Hans-Joachim Schuberth
Tag der mündlichen Prüfung:
22.05.2007
Diese Arbeit wurde von der Deutschen Forschungsgemeinschaft (DFG) gefördert.
MEINER FAMILIE GEWIDMET
Inhaltsverzeichnis
1
EINLEITUNG ................................................................................................... 15
2
LITERATURÜBERSICHT.............................................................................. 17
2.1
Der Gastrointestinaltrakt des Karpfens (Cyprinus carpio) ........................... 17
2.1.1
Anatomischer Aufbau ......................................................................................... 17
2.1.2
Histologischer Aufbau des Rumpfdarms ............................................................ 17
2.1.3
Intestinaler Mukus............................................................................................... 19
2.1.3.1
Aufbau und Funktion der intestinalen Mukusschicht ......................................... 19
2.1.3.2
Muzine................................................................................................................. 22
2.1.4
Intestinale Mikroflora der Fische ........................................................................ 27
2.2
Bakterielle Infektionen bei Fischen ................................................................. 30
2.2.1
Allgemeines......................................................................................................... 30
2.2.2
Aeromonaden ...................................................................................................... 31
2.2.2.1
Aeromonas hydrophila ........................................................................................ 31
2.2.2.2
Aeromonas salmonicida ...................................................................................... 33
2.2.3
Infektionserreger aus der Gruppe der Enterobacteriaceae .................................. 36
2.2.3.1
Edwardsiella tarda.............................................................................................. 36
2.2.3.2
Yersinia ruckeri ................................................................................................... 37
2.3
Interaktionen zwischen Bakterien und mukosalen Oberflächen.................. 39
2.3.1
Interaktionen zwischen Probiotika und mukosalen Oberflächen ........................ 42
2.3.2
Interaktionen zwischen Pathogenen und mukosalen Oberflächen ...................... 43
3
MATERIAL UND METHODEN .................................................................... 48
3.1
Bakterienstämme............................................................................................... 48
3.1.1
Aeromonas hydrophila ........................................................................................ 48
3.1.2
Aeromonas salmonicida, Edwardsiella tarda, Yersinia ruckeri ......................... 48
3.1.3
Vermehrung und Aufbewahrung der Bakterien .................................................. 49
3.1.3.1
Vermehrung und Einstellung der Konzentration ................................................ 49
3.1.3.2
Aufbewahrung..................................................................................................... 50
3.1.4
Charakterisierung der Bakterienstämme ............................................................. 50
3.1.4.1
Biochemische Untersuchung............................................................................... 50
3.1.4.2
Hämagglutinationstest......................................................................................... 51
3.1.4.3
CAMP-Test ......................................................................................................... 52
3.1.4.4
Zytotoxizität in vitro............................................................................................ 53
3.2
Infektion von Karpfen mit A. hydrophila ........................................................ 55
3.2.1
Versuchstiere....................................................................................................... 55
3.2.2
Applikation der Bakterien ................................................................................... 55
3.2.2.1
Versuche zur Virulenzprüfung ............................................................................ 55
3.2.2.1.1
Bakterienapplikation ........................................................................................... 55
3.2.2.1.1.1
Intraperitoneale Applikation ............................................................................... 56
3.2.2.1.1.2
Orale Applikation................................................................................................ 56
3.2.2.2
Orale Applikation von A. hydrophila.................................................................. 57
3.2.2.2.1
Bakterienapplikation ........................................................................................... 57
3.2.3
Klinische Untersuchung und Sektion der Versuchstiere..................................... 58
3.2.4
Entnahme und Bearbeitung mikrobiologischer Proben ...................................... 58
3.2.5
Mukusgewinnung ................................................................................................ 58
3.3
Mukusanalyse .................................................................................................... 59
3.3.1
Konzentrierung des Mukus ................................................................................. 59
3.3.2
Gelchromatographie ............................................................................................ 59
3.3.2.1
Vorbereitung der Chromatographiesäule ............................................................ 60
3.3.2.2
Kalibrierung der Chromatographiesäule ............................................................. 60
3.3.2.3
Auftrennung der Mukusproben ........................................................................... 61
3.3.3
Photometrische Muzinquantifizierung ................................................................ 61
3.3.3.1
PAS-Reaktion zur Bestimmung des Kohlenhydratgehaltes................................ 62
3.3.3.2
Bradford-Reaktion zur Bestimmung des Proteingehaltes ................................... 62
3.3.3.3
Darstellung der Ergebnisse der Muzinanalyse .................................................... 62
3.3.3.4
Bestimmung des Muzingehalts ........................................................................... 63
3.3.4
Bestimmung der terminalen Glykosilierung an Glykokonjugaten in
Mukusproben....................................................................................................... 63
3.3.5
Bestimmung des adsorbierten Lysozymgehaltes an Glykokonjugaten............... 65
3.4
Bakterienadhäsion an Mukusproben .............................................................. 65
3.4.1
Validierung der Methode .................................................................................... 65
3.4.1.1
Markierung der Bakterien ................................................................................... 65
3.4.1.1.1
Vergleich verschiedener Konzentrationen des Fluoreszenzfarbstoffs ................ 65
3.4.1.1.2
Ermittlung der Stabilität der Fluoreszenzfärbung ............................................... 66
3.4.1.1.3
Vergleich der Bakterienkonzentration ................................................................ 66
3.4.1.1.4
Vergleich der Fluoreszenzintensitäten verschiedener ............................................
Bakterienstämme................................................................................................. 66
3.4.1.2
Messung der Fluoreszenzintensität ..................................................................... 67
3.4.1.2.1
Vergleich von Filtern im Fluoreszenzphotometer............................................... 67
3.4.1.3
Adhäsion von Bakterien an Schleim ................................................................... 67
3.4.1.3.1
Adhäsionsversuch an Objektträger...................................................................... 67
3.4.1.3.2
Adhäsionversuch in Mikrotiterplatten................................................................. 68
3.4.2
Adhäsion an intestinalen Mukus unbehandelter Karpfen ................................... 69
3.4.3
Adhäsion an Mukus von Karpfen nach oraler Bakterienapplikation .................. 70
3.4.4
Adhäsion an intestinalen Mukus von Karpfen nach singulärer oraler ...................
LPS-Applikation.................................................................................................. 70
3.4.5
Untersuchung möglicher Bindungsstellen bei der Adhäsion von ..........................
Bakterien an intestinalen Mukus ......................................................................... 70
3.4.5.1
Vorinkubation der Mukusproben mit Enzymen.................................................. 70
3.4.5.2
Vorinkubation der Bakterien mit Oligosacchariden............................................ 71
3.5
Statistische Auswertung.................................................................................... 72
4
ERGEBNISSE ................................................................................................... 73
4.1
Charakterisierung der eingesetzten A. hydrophila Stämme .......................... 73
4.1.1
Biochemische Reaktionen ................................................................................... 73
4.1.2
Hämagglutinationstest......................................................................................... 73
4.1.3
CAMP-Test ......................................................................................................... 74
4.1.4
Zytotoxizität in vitro............................................................................................ 75
4.2
Infektion von Karpfen mit A. hydrophila ........................................................ 77
4.2.1
Prüfung der Virulenz........................................................................................... 77
4.2.1.1
Intraperitoneale Applikation ............................................................................... 77
4.2.1.2
Orale Applikation................................................................................................ 77
4.2.2
Orale Applikation von A. hydrophila.................................................................. 78
4.2.2.1
Klinische Untersuchung und Sektion.................................................................. 78
4.2.2.2
Mikrobiologische Untersuchung ......................................................................... 80
4.3
Mukusanalyse .................................................................................................... 82
4.3.1
Kalibrierung der Chromatographiesäule ............................................................. 82
4.3.2
Untersuchung des Mukus unbehandelter Karpfen .............................................. 83
4.3.2.1
Kohlenhydrat- und Proteingehalte ...................................................................... 83
4.3.3
Untersuchung des Mukus von Karpfen nach Natriumchloridapplikation........... 85
4.3.3.1
Kohlenhydratgehalt im Darmmukus von Karpfen nach
Natriumchloridapplikation .................................................................................. 86
4.3.3.2
Proteingehalt im Darmmukus von Karpfen nach ...................................................
Natriumchloridapplikation .................................................................................. 89
4.3.4
Untersuchung des Mukus von Karpfen nach Applikation von ..............................
A. hydrophila 38 und A. hydrophila 60.............................................................. 92
4.3.4.1.1
Kohlenhydratgehalt im Darmmukus von Karpfen nach Bakterienapplikation ... 93
4.3.4.1.2
Proteingehalt im Darmmukus von Karpfen ........................................................ 98
4.3.4.2
Terminale Glykosilierung von Glykoproteinen des intestinalen Mukus .......... 103
4.3.4.3
Lysozymbestimmung im nach Molekülgrößen aufgetrennten Mukus.............. 109
4.4
Bakterienadhäsion........................................................................................... 110
4.4.1
Validierung der Methode .................................................................................. 110
4.4.1.1
Markierung ........................................................................................................ 110
4.4.1.1.1
Vergleich von Konzentrationen des Fluoreszenzfarbstoffs .............................. 111
4.4.1.1.2
Ermittlung der Stabilität der Fluoreszenzfärbung ............................................. 112
4.4.1.1.3
Vergleich verschiedener Bakterienkonzentrationen.......................................... 112
4.4.1.1.4
Vergleich der Fluoreszenzintensitäten verschiedener Bakterien ...................... 113
4.4.1.2
Fluoreszenzintensitätsmessung ......................................................................... 114
4.4.1.2.1
Vergleich von Filtern im Fluoreszenzphotometer............................................. 114
4.4.1.3
Adhäsion von Bakterien an intestinalen Mukus des Karpfens.......................... 115
4.4.1.3.1
Adhäsion von Bakterien an mit Mukus beschichteten Objektträgern............... 115
4.4.1.4
Adhäsion von Bakterien an mit Mukus beschichteten Mikrotiterplatten.......... 116
4.4.1.4.1
Vergleich von Mikrotiterplatten........................................................................ 116
4.4.1.4.2
Vergleich verschiedener Inkubationszeiten ...................................................... 117
4.4.2
Adhäsion von Bakterien an den intestinalen Mukus unbehandelter .....................
Karpfen.............................................................................................................. 117
4.4.2.1
Versuchsfische .................................................................................................. 117
4.4.2.2
Adhäsion unterschiedlich virulenter A. hydrophila Stämme an den.......................
intestinalen Mukus ........................................................................................... 118
4.4.2.3
Adhäsion weiterer fischpathogener Keime an den intestinalen Mukus ............ 120
4.4.3
In vitro Adhäsion von A. hydrophila an den intestinalen Mukus von ....................
Karpfen nach oraler Bakterienapplikation ....................................................... 122
4.4.4
Adhäsion von Bakterien an intestinalen Mukus von Karpfen nach oraler ............
LPS-Applikation................................................................................................ 129
4.4.5
Ermittlung möglicher Bindungsstellen von Bakterien an den intestinalen ............
Mukus................................................................................................................ 131
4.4.5.1
Adhäsion von Bakterien an den mit Glykosidasen vorbehandelten .......................
intestinalen Mukus ........................................................................................... 131
4.4.5.2
Adhäsion von mit verschiedenen Oligosacchariden vorbehandelten .....................
Bakterien an den intestinalen Mukus ................................................................ 133
5
DISKUSSION .................................................................................................. 135
5.1
Virulenz und Pathogenität der eingesetzten Bakterien ............................... 136
5.2
Klinische und mikrobiologische Befunde nach Bakterienapplikation ....... 140
5.3
Mukusanalyse .................................................................................................. 143
5.4
Adhäsion von Bakterien an Mukus ............................................................... 155
5.5
Schlussbetrachtung ......................................................................................... 167
6
ZUSAMMENFASSUNG ................................................................................ 168
7
SUMMARY...................................................................................................... 170
8
LITERATURVERZEICHNIS ....................................................................... 172
9
ANHANG ......................................................................................................... 200
9.1
Verwendete Chemikalien / Reagentien ......................................................... 200
9.2
Lösungen .......................................................................................................... 203
9.2.1
Lösungen für die Bakterienvermehrung, Lagerung und Charakterisierung...... 203
9.2.2
Lösungen zur Gewinnung, Auftrennung und Analyse des Mukus ................... 204
9.2.3
Lösungen für den Lektin-ELISA....................................................................... 206
9.2.4
Lösungen für die Untersuchung der Adhäsion von Bakterien an Mukus ......... 207
10
DANKSAGUNG .............................................................................................. 208
Abkürzungsverzeichnis
%
Prozent
°C
Grad Celsius
Abb.
Abbildung
A. hydrophila
Aeromonas hydrophila
A. salmonicida
Aeromonas salmonicida
Aqua dest.
Destilliertes Wasser
BSA
Bovines Serumalbumin
bzw.
beziehungsweise
ca.
circa
cm
Zentimeter
ConA
Concanavalia ensiformes-Agglutinin
Da
Dalton
DBA
Dolchios biflorus-Agglutinin
ELISA
enzyme-linked immunosorbent assay
(Enzymgekoppelter Immunadsorptionstest)
EPC
Epithelioma papulosum cells
(Epithelioma papulosum-Zellen)
et al.
et alii (und andere)
E. tarda
Edwardsiella tarda
Fa.
Firma
Fu
Fukose
g
Gramm
g
Erdbeschleunigung
Gal
Galaktose
GalNAc
N-Acetyl-Galaktosamin
GlcNAc
N-Acetyl-Glucosamin (N-Acetyl-Glukosamin)
HA
Hämagglutinationstest
HAE
Hämagglutinierende Einheit(en)
HEp-2-Zellen
Humane Larynx-Epithelioma-2- Zellen
IgM
Immunglobulin M
KbE
Koloniebildende Einheit(en)
KDN
3-Desoxy-D-Glukero-D-Galakto-2-Nonulonsäure
kDa
Kilodalton
lat.
lateinisch
l
Liter
LPS
Lipopolysaccharid
M
Mol
Man
Mannose
min
Minute(n)
ml
Milliliter
mM
Millimol
m-RNA
messenger-ribonucleic-acid
(messenger-Ribonukleinsäure)
NeuNAc
N-Acetyl-Neuraminsäure
nm
Nanometer
µl
Mikroliter
OD
optische Dichte
OPD
Ortho-Phenyl-Diamin
OT
Objektträger
PAS-Reaction
Periodicacid-Schiff-Reaction
(Perjodsäure-Schiff-Reaktion)
p.appl.
post applicationem
PBS
phosphate buffered saline (Phosphatpuffer)
PTS-Region
Prolin-Threonin-Serin-Region
Q1
Quartil 1
Q3
Quartil 3
RCA
Ricinus communis-Agglutinin
rel.
relativ(e)
s
Standardabweichung
s.
siehe
SNA
Sambucus nigra-Agglutinin
SMM
Schweinemagenmuzin
sp.
Spezies
ssp.
Subspezies
Tab.
Tabelle
u.
und
U
Unit(s) (Einheit(en))
UEA 1
Ulex europaeus-Agglutinin 1
unbeh.
unbehandelt
UV
Ultraviolett
WGA
Wheat Germ-Agglutinin
X
Mittelwert
Y. ruckeri
Yersinia ruckeri
Einleitung
1
15
Einleitung
Bakterielle Infektionen, die lokal in Form von Hautveränderungen oder septikämisch
verlaufen können, treten bei Fischen in Aquakulturen oder Aquarien regelmäßig auf.
Verursacht werden diese Erkrankungen durch obligat- oder fakultativ-pathogene Bakterien,
die sich im Wasser befinden, aber auch über das Futter aufgenommen werden können
(INGLIS et al. 1993). Es ist nicht für alle bakteriellen Infektionserreger abschließend geklärt,
welche Eintrittspforten in den Organismus genutzt werden. Ein regelmäßig aus dem Wasser
isoliertes Bakterium ist Aeromonas hydrophila, welches als fakultativ-pathogen gilt (INGLIS
et al. 1993) und sowohl bei Zier- als auch bei Nutzfischen häufig im Zusammenhang mit
Erkrankungen isoliert werden kann (CIPRIANO 2001). Infektionen mit A. hydrophila können
teils zu hohen Mortalitätsraten führen (INGLIS et al. 1993); in konditionsstarken, gesunden
Fischen verursacht das Bakterium in der Regel jedoch keine Krankheitssymptome (GEIGER
2001). Offensichtlich existieren verschiedene Faktoren, die einen Krankheitsausbruch durch
bakterielle Infektionserreger begünstigen. Umweltbedingungen, wie physikalisch-chemische
Wasserparameter, Fütterung und Bakterienbelastungen des Haltungssystems sowie zusätzlich
Infektionen mit Parasiten oder Viren, spielen eine wichtige Rolle in der Pathogenese
bakterieller Erkrankungen (INGLIS et al. 1993). In der Literatur werden jedoch auch
unterschiedlich virulente Stämme von A. hydrophila beschrieben (HAZEN et al. 1982).
Fraglich ist, welche Faktoren bei einer Infektion entscheidend sind. Experimentell ist eine
manifeste Infektion, sowohl durch A. hydrophila, als auch durch andere Bakterien, bei
Fischen schwer zu erzielen. Bei experimentellen Studien wurden den Fischen die Bakterien in
den meisten Fällen intraperitoneal injiziert, um Krankheitszustände zu erzielen (DALE et al.
1997). Bei dieser Art der Inokulation handelt es sich um ein artifizielles System;
natürlicherweise manifestieren Infektionen sich vornehmlich über eine andere Eintrittspforte.
Für eine erfolgreiche Infektion müssen Bakterien die dermale oder intestinale Schleimschicht
der Fische als erste Barriere passieren (DONNENBERG 2000). Diese Schleimschicht dient
dem Schutz des unter ihr gelegenen Gewebes und enthält zudem Faktoren der unspezifischen
sowie der spezifischen Immunabwehr (ALEXANDER u. INGRAM 1992). Bakterien sind in
der Lage, über bestimmte molekulare Strukturen an Komponenten der Schleimschicht zu
binden. Die Adhäsion der Infektionserreger an den Schleim ist häufig der erste Schritt im
Einleitung
16
Verlauf einer Infektion (BEACHEY 1981; TSE u. CHADEE 1991; RINKINEN et al. 2000).
Der Organismus reagiert auf das Vorhandensein der Bakterien mit einer Modulation der
Sekretion des Schleims. Beispielsweise veränderte sich infolge einer oralen Applikation von
Lipopolysaccharid (LPS) die Zusammensetzung des Darmschleims von Karpfen (Cyprinus
carpio) (NEUHAUS 2005). Eine Kontamination des Hälterungswassers mit A. hydrophila
führte ebenfalls zu einer Modulation der dermalen Schleimsekretion bei Karpfen
(BEHRENDT 2005). Nach der Adhäsion an die Schleimschicht kann es zu einer Invasion von
Bakterien in Epithelzellen kommen, wobei Bakterien unterschiedliche Strategien nutzen
(SANSONETTI 2004).
In dieser Arbeit soll untersucht werden, ob eine Modulation der Schleimsekretion durch
verschieden virulente Stämme A. hydrophila in Abhängigkeit von der Virulenz in
unterschiedlicher
Weise
erfolgt.
Dazu
werden
Karpfen
(Cyprinus
carpio)
einer
experimentellen oralen Infektion mit verschieden virulenten Stämmen von A. hydrophila
unterzogen. Der sezernierte Schleim soll sowohl im Hinblick auf seinen Gesamtprotein- und
Gesamtkohlenhydratgehalt als auch auf die genauere Zusammensetzung der Kohlenhydrate
untersucht werden.
Zusätzlich soll für verschieden virulente A. hydrophila Stämme sowie für die obligatpathogenen Bakterien Aeromonas salmonicida, Edwardsiella tarda und Yersinia ruckeri
geklärt werden, ob und in welchem Maße sie an den intestinalen Mukus unbehandelter Fische
adhärieren. Die Adhäsionsfähigkeit soll ebenfalls an dem Schleim der Fische untersucht
werden, die der Bakterienapplikation unterzogen wurden, um Variationen im Verlauf der
experimentellen Infektion zu ermitteln. Im Anschluss sollen Strukturen ermittelt werden, die
die Bakterien für die Anheftung am intestinalen Schleim nutzen können.
Das Ziel dieser Studie ist es, Aufschlüsse über die Rolle von mukosalen Oberflächen von
Fischen als ersten Infektionsschutz bei Interaktionen mit Bakterien zu geben.
Literaturübersicht
2
2.1
2.1.1
17
Literaturübersicht
Der Gastrointestinaltrakt des Karpfens (Cyprinus carpio)
Anatomischer Aufbau
Der Gastrointestinaltrakt des Karpfens (Cyprinus carpio) lässt sich in Kopf-, Vorder-, Mittelund Enddarm gliedern (HARDER 1975). Der Kopfdarm umfasst die Mundhöhle und den
Pharynx. An den Kopfdarm schließt sich der Vorderdarm in Form des Ösophagus an. Viele
Autoren fassen Kopf- und Vorderdarm zusammen und bezeichnen den gesamten Bereich als
Vorderdarm. Anschließend an den Ösophagus findet sich bei Karpfen eine magenähnliche
Erweiterung (Pseudogaster); ein Magen im eigentlichen Sinne ist nicht ausgebildet
(ROBERTS 1989). Die magenähnliche Erweiterung geht über in den Mitteldarm, der
anatomisch nicht vom sich anschließendem Enddarm zu differenzieren ist. Beide weisen den
gleichen Durchmesser auf, und da die Darmschlingen nicht konstant verlaufen, ist keine
eindeutige Bezeichnung einzelner Abschnitte – wie bei Säugetieren üblich – möglich.
Aufgrund dessen werden Mittel- und Enddarm häufig als Rumpfdarm zusammengefasst. Der
kurze Enddarm mündet im Anus.
Die Untersuchungen dieser Studie befassen sich ausschließlich mit dem Rumpfdarm.
2.1.2
Histologischer Aufbau des Rumpfdarms
Der Rumpfdarm des Karpfens ist histologisch aufgebaut aus einer Tunica mucosa, einer
Tunica muscularis und einer Tunica serosa (s. Abb. 2.1). Die Tunica mucosa wird durch die
Tela submucosa von der Tunica muscularis getrennt. Die Tela subserosa wiederum stellt die
Trennung zwischen Tunica muscularis und Tunica serosa dar.
Die Tunica mucosa besteht aus einer zum Lumen gelegenen Lamina epithelialis mucosae,
einer Lamina propria mucosae sowie einer Lamina muscularis mucosae. Die Lamina
epithelialis mucosae ist aus einem einschichtigen Zylinderepithel aufgebaut. Die einzelnen
Epithelzellen sind hochprismatisch und besitzen einen in der Zellmitte oder basal
18
Literaturübersicht
befindlichen, ovalen Nukleus. Sie weisen sowohl bei Säugern (OBERTI 1961; SCHMIDT
1961) als auch bei Fischen (JENDRYSEK 1993) eine große Anzahl langer Mikrovilli auf,
deren Vorhandensein zu einer Oberflächenvergrößerung der Zellen führt. An diesen
Strukturen finden bei Säugern Pinozytosevorgänge statt, die der Nährstoffaufnahme dienen
(OBERTI 1961; SCHMIDT 1961). Diese Funktion scheint bei Fischen ebenfalls vorhanden
zu sein. Lateral sind die Epithelzellen miteinander durch so genannte „tight junctions“
verbunden. Zwischen den Epithelzellen eingestreut liegen zahlreiche exokrine Zellen, die
Becherzellen, die Schleim zum Schutz des Epithels produzieren. Die Regenerationsrate der
Epithelzellen bei Fischen wird in unterschiedlichen Studien beschrieben und ist nicht
eindeutig geklärt. Während die Regeneration der Enterozyten bei einer Wassertemperatur von
20°C bei Grasskarpfen (Ctenopharyngodon idella) 15 bis 20 Tage dauerte (STROBAND u.
DEBETS 1978), wurde in einer späteren Studie beobachtet, dass die Epithelzellen von
Karpfen, die bei einer Wassertemperatur von 20°C gehalten wurden, eine Regenerationsrate
von drei Tagen aufwiesen (HEMMER 1995). Dieser Wert entspricht der Regenerationsrate
von Säugerenterozyten. Der Lamina epithelialis mucosae schließt sich – abgegrenzt durch
eine Basalmembran - die Lamina propria mucosae an, die aus lockerem Bindegewebe mit
eingelagerten Kapillaren aufgebaut ist. Spezielle Schleimhautdrüsen, die bei Säugern
regelmäßig ausgebildet sind, fehlen in der Lamina propria mucosae der Karpfen. Die Lamina
muscularis mucosae ist im Rumpfdarm der Karpfen nicht vorhanden.
Die aus glatter Muskulatur gebildete Tunica muscularis umschließt, getrennt durch die
bindegewebige Tela submucosa, die Tunica mucosa. Die Tela submucosa besteht aus einem
luminal liegenden Stratum compactum mit dicht gepackten kollagenen Faserbündeln und
einem der Tunica muscularis zugewandten Stratum granulosum (AMLACHER 1992). Sie
enthält außerdem ein lockeres Geflecht von Nervenfasern (HARDER 1975). Die Tunica
muscularis selber ist zweischichtig aufgebaut und besteht aus einem zum Lumen gelegenen
Stratum longitudinale (Längsmuskelschicht) und einem weiter außen gelegenen Stratum
circulare (Ringmuskelschicht). Die beiden Lagen sind durch eine Bindegewebsschicht
getrennt, in der ein Nervenplexus gelegen ist. Die Ringmuskelschicht ist stärker angelegt als
die Längsmuskelschicht und in viele Segmente gegliedert, die sich bei Kontraktion ineinander
schieben und somit, zusätzlich durch die bei Kontraktion eintretende Verengung des
Literaturübersicht
19
Darmlumens, zu einer Weiterbeförderung des Darminhalts führen. Die schwächer
ausgebildete Längsmuskelschicht dient lediglich zur Anheftung der Ringmuskelschicht.
Die Tunica serosa wird gebildet aus einem einschichtigen Plattenepithel, welches der Lamina
propria serosae und der Tela subserosa, einer lockeren Bindegewebsschicht, aufliegt. In der
Lamina propria serosae ist ein Nervengeflecht, der Plexus subserosus zu finden.
Abbildung 2.1: Histologischer Aufbau des Rumpfdarms des Karpfens
Mukusschicht
Tunica mucosa
Tunica muscularis
Tunica serosa
2.1.3
2.1.3.1
Intestinaler Mukus
Aufbau und Funktion der intestinalen Mukusschicht
Die Epithelzellen des Darms stehen durch aufgenommene Nahrungspartikel in direktem
Kontakt mit der Umwelt und sind zusätzlich den Verdauungsfermenten im Darmlumen
ausgesetzt. Die der Tunica mucosa aufliegende Schleimschicht (Schleim lat.: mucus) wird
von Becherzellen gebildet (FORSTNER et al. 1973) und befindet sich im intakten Darm
zwischen dem Nahrungsbrei und dem Epithel. Sie dient dem Schutz der Epithelzellen vor
chemischen und mechanischen Einflüssen. Die Konzentration der Verdauungsfermente ist an
der Basis der Schleimschicht extrem gering und nimmt Richtung Darmlumen zu. Um dieses
Konzentrationsgefälle aufrecht zu erhalten, muss ständig Schleim produziert werden. Im
gesunden Organismus besteht eine dynamische Balance zwischen dem Abbau und der
20
Literaturübersicht
Sekretion von Mukus (ALLEN et al. 1988). Die Mukusschicht schützt das Epithel außerdem
vor Austrocknung und unterstützt den Transport des Nahrungsbreis. Sie dient als
semipermeable Barriere zwischen den Epithelzellen und den im Darm befindlichen Stoffen,
wobei sie permeabel für Ionen und kleinere Moleküle und impermeable für große Moleküle,
wie Pepsine, ist (ALLEN u. CARROLL 1985). Allerdings ist die mukosale Barriere
gegenüber biologisch aktiven Proteinen nicht vollständig. Diese Eigenschaft kann zur
Applikation pharmazeutischer Stoffe ausgenutzt werden (MCLEAN u. DONALDSON 1990).
Die Mukusschicht fungiert als Bestandteil der unspezifischen Immunabwehr und schützt vor
eindringenden Infektionserregern. Sie enthält zusätzlich Komponenten des spezifischen
Immunsystems in Form von Immunglobulinen.
Mukus ist ein komplexes Gemisch aus Wasser, großen Glykoproteinen (Muzinen), zellulären
Makromolekülen, Elektrolyten, Mikroorganismen und abgestorbenen Zellen (FAURE et al.
2003). Der Wassergehalt im intestinalen Mukus beträgt mindestens 95%. Die Muzine bilden
einen Anteil von 2-5%. Als Bestandteile der Immunabwehr im Mukus von Fischen sind
Enzyminhibitoren, Hydrolasen, Proteinasen, Agglutinine sowie IgM nachgewiesen worden
(ALEXANDER u. INGRAM 1992). Die Viskosität des Mukus wird über das Verhältnis von
Wasser zu Glykoproteinen reguliert. Mukus stellt im Gegensatz zu Wasser oder Öl keine
Newtonsche Flüssigkeit dar. Deutlich wird dies bei Reibung zweier mit Mukus bedeckter
Oberflächen in entgegengesetzter Richtung. An den Kontaktstellen der beiden zueinander
weisenden Mukusschichten nimmt der Mukus eine wasserähnliche Konsistenz an, während
der den Oberflächen zugewandte Mukus gelartig bleibt und an diesen haftet. Die beiden
Schichten können nun leicht aneinander vorbeigleiten. Dadurch wirkt Mukus wie eine Art
Schmiermittel und setzt die Reibungskräfte herab. Der an den Oberflächen verbleibende
Mukus spielt eine entscheidende Rolle für die selektive Permeabilität der Mukusschicht, die
so erhalten bleibt (CONE 1999). Die Mukusschicht lässt sich auch im Organismus in
Bereiche unterteilen. Man unterscheidet den adhärenten vom nicht-adhärenten Mukus
(ALLEN u. CARROLL 1985; HERRMANN et al. 1999; ATUMA et al. 2001). Zudem
kommt zellulärer und löslicher Mukus vor.
In den Becherzellen ist zellulärer Mukus zu finden. Er liegt in Vesikeln vor und wird
entweder kontinuierlich sezerniert oder auf einen Stimulus hin freigegeben.
Literaturübersicht
21
Der adhärente, membrangebundene Mukus steht fest mit dem Epithel in Verbindung. Er
nimmt vermutlich eine Mittlerrolle zwischen Epithel und membranassoziiertem Mukus ein.
Dem membranassoziiertem Mukus werden physiologische Funktionen im Zusammenhang mit
Zellwachstum, Zelldifferenzierung, Schutz des Epithels sowie Adhäsion und Eindringen von
Bakterien in die Epithelzellen zugeschrieben. In vitro konnte nachgewiesen werden, dass
membrangebundener Mukus von Ratten auch in löslicher Form vorkommen, und somit zu
membranassoziiertem Mukus werden kann (WANG et al. 2002).
Der nicht adhärente, membranassoziierte Mukus stellt die eigentliche Schutzschicht des
Epithels dar. Der Mukus dieses Bereiches weist eine gelartige Beschaffenheit auf, wodurch er
an der Unterlage haftet und durch wässrige Bestandteile des Darminhalts nicht abgewaschen
werden kann (PEREZ-VILAR u. HILL 1999). Dieser Anteil des Mukus bedingt die
herabgesetzten Reibungs- und Scherkräfte.
Der lösliche Mukus, der im Darmlumen vorliegt, besteht aus gelöstem, membranassoziiertem
Mukus. Der Übergang von membranassoziiertem zu löslichem Mukus geschieht durch
bakterielle Einwirkung oder durch enzymatische Vorgänge. Die Darmperistaltik wirkt
unterstützend auf diese Faktoren. Dieser Teil des Mukus mischt sich mit weiteren
Bestandteilen des Darminhalts und abgeschilferten Epithelzellen. Er erfüllt keine schützenden
Aufgaben mehr.
Abbildung 2.2: Schematische Darstellung der Schichten des intestinalen Mukus
löslicher Mukus
membranassoziierter Mukus
membrangebundener Mukus
zellulärer Mukus
Becherzelle
Epithelzelle
Literaturübersicht
22
2.1.3.2
Muzine
Ausführliche Studien zum dermalen Mukus und der Muzine der Fische wurden durchgeführt
(SHEPHERD 1994), während der intestinale Mukus seltener beschrieben wurde.
Verschiedene Studien geben allerdings Hinweise darauf, dass die Muzine unterschiedlicher
Organe und Spezies eine ähnliche Grundstruktur aufweisen (ALEXANDER u. INGRAM
1992; BANSIL et al. 1995).
Muzine sind hochmolekulare Glykoproteinmonomere, die in der Regel einen Anteil von 2-5%
des Mukus ausmachen. Im Gastrointestinaltrakt formen die einzelnen Glykoproteinmonomere
ein Polymergemisch, dem die entscheidende Rolle bei der Ausbildung der gelartigen
Beschaffenheit des Mukus zukommt. Durch die Bindung von Wasser an den
Kohlenhydratanteil des Moleküls wird dieses verfestigt (BANSIL et al. 1995).
Muzine sind aufgebaut aus einem zentralen Kernprotein, dem Apomuzin, und daran
gebundener Kohlenhydratseitenketten. Ein einzelnes Muzinmolekül zeigt einen mit einer
Flaschenbürste
vergleichbaren
Aufbau.
Verschiedene
Studien
geben
den
Anteil
Kohlenhydrate an der Molekülmasse mit 75% (BANSIL et al. 1995) bis 90% (PEREZVILAR u. HILL 1999) an.
Der Proteinanteil, das Apomuzin, ist ein lineares Polypeptid, welches ein Molekulargewicht
zwischen 100 und 250kDa besitzt (BANSIL et al. 1995). Die Anzahl der Aminosäuren wird
in der Literatur für menschliche Muzine mit Werten zwischen 1.500 bis 4.500 Aminosäuren
(FORSTNER u. FORSTNER 1994) bis hin zu 5.000 bis über 13.000 Aminosäuren pro
Muzinmonomer (ROUSSEL u. DELMOTTE 2004) angegeben. Das Protein besteht aus einem
Mittelstück sowie zwei Endstücken. Im Bereich des Mittelstücks machen Serin und Threonin
etwa ein Drittel aller Aminosäuren aus. Das Mittelstück besteht aus sich wiederholenden
Aminosäuresequenzen, den so genannten „tandem repeats“, die bei Menschen sechs bis 169
Aminosäuren enthalten. Diese „tandem repeats“ wiederholen sich bis zu einhundert mal
(BANSIL et al. 1995). Jedes „tandem repeat“ enthält mindestens einen Prolinrest, so dass
auch diese Aminosäure immer im Bereich des Mittelstücks zu finden ist (CARLSTEDT et al.
1995; GUM 1995; CONE 1999), weswegen diese Region auch als PTS-Region (Prolin,
Threonin, Serin-Region) bezeichnet wird. In einem Muzinmonomer treten eine bis mehrere
Literaturübersicht
23
PTS-Regionen auf. Die genannten Aminosäuren machen dort 20 bis 55% des Proteinanteils
aus (CONE 1999). Weitere häufig vertretene Aminosäuren sind Glycin und Alanin
(WOODWARD et al. 1982; STROUS u. DEKKER 1992). Das Mittelstück ist stark
glykosiliert, wobei die Kohlenhydratseitenketten vornehmlich O-glykosidisch an Serin oder
Threonin gebunden sind. Die Glykosilierung führt aufgrund sterischer Behinderung dazu,
dass Proteasen diesen Bereich nicht abbauen können. Die Endstücke des Apomuzins enthalten
keine „tandem repeats“ und deutlich weniger Serin und Threonin. Stattdessen sind in diesen
Bereichen
viele
Cysteinreste
zu
finden.
Die
wenigen
dort
vorhandenen
Kohlenhydratseitenketten, die lediglich 2-3% des Gesamtkohlenhydratgehalts des Moleküls
ausmachen (CONE 1999), sind an den Endstücken hauptsächlich N-glykosidisch gebunden.
Die Endstücke ähneln im Hinblick auf Aminosäurenzusammensetzung und Struktur typischen
globulären Proteinen (BANSIL et al. 1995). Das Molekül wird an den Endstücken durch die
Ausbildung von Disulfidbrücken stabilisiert (STROUS u. DEKKER 1992). Etwa 90% der im
Muzin
vorkommenden
Schwefelwasserstoffgruppen
sind
an
der
Bildung
dieser
Disulfidbrücken beteiligt (MANTLE et al. 1990; GUM 1995). Im dermalen Mukus der
Regenbogenforelle (Oncorhynchus mykiss) konnten in einer Studie je Endstück über zehn
Cysteinreste ermittelt werden, die Disulfidbrücken bildeten (SUMI et al. 1997).
Der Kohlenhydratanteil der Muzine besteht aus den überwiegend im Bereich des Mittelstücks
des Muzinmonomers zu findenden O-glykosidisch gebundenen Seitenketten sowie aus den
wenigen, an den Endstücken N-glykosidisch gebundenen Seitenketten. Die einzelnen
Kohlenhydratseitenketten sind aus zwei bis 20 Monosacchariden aufgebaut und können linear
oder verzweigt sein (VERDUGO 1990). Im Säugermukus sind vier bis fünf verschiedene
Kohlenhydrate, die im Bereich des Mittelstücks auftreten, beschrieben. Es handelt sich bei
diesen Kohlenhydraten um Galaktose (Gal), N-Acetyl-Galaktosamin (GalNAc), N-AcetylGlukosamin (GlcNAc) und Fukose (Fu) (DEPLANCKE u. GASKINS 2001), in einigen
Studien wird auch N-Acetyl-Neuraminsäure (NeuNAc) beschrieben (WOODWARD et al.
1982; STROUS u. DEKKER 1992). O-glykosidisch gebundene Mannose kommt am
Mittelstück nicht vor (STROUS u. DEKKER 1992). In isoliertem Kolonmukus des Menschen
konnten in einer Studie 21 verschiedene Oligosaccharide nachgewiesen werden, die sich aus
den beschriebenen Kohlenhydraten zusammensetzten. Unter diesen 21 Oligosacchariden
befanden sich zehn sauer und elf neutral geladene Verbindungen (PODOLSKY 1985). Im
Literaturübersicht
24
Hautmukus einiger Fischarten, zum Beispiel bei Schmerlen (Misgurnus anguillicaudatus),
konnte
erstmals
3-Desoxy-D-Glukero-D-Galakto-2-Nonulonsäure
(KDN),
eine
Neuraminsäureverbindung, isoliert werden. Andere Neuraminsäureverbindungen konnten
dagegen nicht nachgewiesen werden (KIMURA et al. 1994). Bei der Analyse des dermalen
Mukus von Regenbogenforellen dagegen konnte kein KDN isoliert werden. Die
Zusammensetzung des Mukus bestand bei Regenbogenforellen aus 30,1% NeuNAc, 26%
GalNAc, 5% Gal und 26% Aminosäuren (SUMI et al. 1997).
Die Kohlenhydratseitenketten weisen Unterschiede in ihrer Verknüpfung an den Proteinanteil
auf, die mit der Spezies, dem Organ und dem Gesundheitszustand des untersuchten
Individuums variieren. Im Mittelstück des Muzinmonomers unterscheidet man eine
Kernregion
von
einer
Hauptregion.
Während
im
Bereich
der
Kernregion
die
Kohlenhydratseitenketten vorwiegend über die Hydroxylgruppen von Serin und Threonin
vermittelt über N-Acetyl-Galaktosamin (CARLSTEDT et al. 1995) an das Apomuzin
gebunden werden, liegen im Bereich der Hauptregion ausschließlich β-1,4 oder β-1,3glykosidische Bindungen vor. Diese Bindungen werden ebenfalls durch N-AcetylGalaktosamin vermittelt. Die Kohlenhydratstruktur der N-glykosidisch gebundenen
Oligosacchariden im Bereich der Endstücke ist der im Mittelstück ähnlich. Allerdings
befinden sich hier auch N-glykosidisch gebundene Mannosereste (STROUS u. DEKKER
1992). Die Bindung der Kohlenhydratseitenketten ist in diesem Bereich α-glykosidisch. Die
gebundenen Neuraminsäurereste verleihen dem Mukusmolekül eine negative Ladung. Dazu
trägt die Sulfatierung an den Endstücken des Moleküls bei.
Abbildung 2.3: Schematische Darstellung eines Muzinmoleküls
Apomuzin
O-glykosidisch gebundene
Kohlenhydratseitenketten
N-glykosidisch gebundene
Kohlenhydratseitenketten
Literaturübersicht
25
Die Synthese der Muzine in den Becherzellen beginnt mit dem Aufbau des Proteinanteils, der
auf MUC-Genen kodiert ist. Durch Translation der m-RNA im zytoplasmatischen Teil des
rauen Endoplasmatischen Retikulums wird das Protein synthetisiert. Von dort wird das fertig
gestellte Protein, vermittelt durch eine N-terminale Signalsequenz (STROUS u. DEKKER
1992), in das Lumen des rauen Endoplasmatischen Retikulums transportiert (FORSTNER
1995). Dort werden Disulfidbrücken ausgebildet, die zu einer N-glykosidischen Bindung von
Kohlenhydratseitenketten
führen.
Es
werden
bereits
synthetisierte,
mannosehaltige
Kohlenhydratketten an das Molekül gebunden. Nach Abschluss der N-Glykosilierung wird
das Muzin, in Vesikeln verpackt, zum Golgiapparat transportiert. Während der Passage durch
den Golgiapparat erhält es seine endgültige Glykosilierung. Die N-glykosidisch gebundenen
Ketten werden umgebaut, indem einzelne Mannose- und Glukosereste abgespalten werden.
Beteiligt an diesen Vorgängen sind Glykosidasen und α-Mannosidasen. Die meisten Oglykosidischen Bindungen von Kohlenhydraten an den Proteinkern über N-AcetylGlukosamin und die Verlängerung der Seitenketten findet anschließend statt (FORSTNER
1995).
Dabei
werden
Monosaccharide
durch
spezifische,
membrangebundene
Glykosyltransferasen in den Golgiapparat transportiert und dort an das Muzin angeheftet.
Sulfat wird mittels einer Sulfotransferase des Golgiapparates an periphere Oligosaccharide
gebunden (DEPLANCKE u. GASKINS 2001). Die Zusammensetzung der Seitenketten ist
abhängig vom Vorhandensein zellspezifischer Glykosyltransferasen, vom Verzweigungsgrad
der Oligosaccharide, von sterischen Behinderungen und vom physiologischen Status der
Zelle. Sie kann krankheitsbedingt verändert sein (DELL u. MORRIS 2001). Zum Beispiel
nahm bei Ratten mit ulzerativer Kolitis die Bildung der Muzine ab, wobei sich besonders der
Gehalt an Threonin und Serin verringerte (FAURE et al. 2003). Nach einer Applikation von
Prostaglandin E2 nahm der Gehalt an Kohlenhydratseitenketten im Mukus von Ratten
deutlich zu (ENSS et al. 1995).
Die Sekretion der Muzine, die in Vesikeln in den Becherzellen gespeichert sind, erfolgt
kontinuierlich (basale Sekretion) oder als Reaktion auf einen bestimmten Reiz (stimulierte
Sekretion) (FORSTNER 1995). In beiden Fällen werden die Muzine durch Exozytose
ausgeschleust. Es handelt sich um eine merokrine Sekretion (CARLSTEDT et al. 1985). Die
basale Sekretion geschieht kontinuierlich zum Schutz des Epithels, wobei jeweils nur ein
Vesikel durch Exozytose entleert wird. Die Vesikel werden vom Golgiapparat in Richtung
Literaturübersicht
26
apikaler Plasmamembran transportiert und bei Kontakt mit dieser entleert. Es wird kein
weiteres Signal für diesen Vorgang benötigt. Die Zeit zwischen der Fertigstellung der Muzine
im Golgiapparat und der Ausschleusung beträgt etwa sechs Stunden, wobei der Transport der
Muzine bis in die apikal gelegenen Bereiche der Becherzelle bereits vier Stunden in Anspruch
nimmt (VERDUGO 1990). Bei der stimulierten Sekretion liegen die Vesikel in der Nähe der
Plasmamembran. Die Muzine werden in den Vesikeln über einen längeren Zeitraum
gespeichert und liegen gestapelt in diesen vor. Es sind unterschiedliche Stoffe bekannt, die zu
einer Freisetzung der Muzine aus den Vesikeln führen. In Studien konnte diese Freisetzung
durch
Phospholipase-C-Aktivatoren,
Senföl,
Chymotrypsin,
Elastase,
Choleratoxin,
Prostaglandine (FORSTNER 1995), Carbachol (EPPLE et al. 1997) sowie Lipopolysaccharid
(ENSS et al. 1996a; ENSS et al. 1996b; URLAUB 1998; NEUHAUS 2005) nachgewiesen
werden. Beteiligt an der Freigabe sind zweifach positiv geladene Calciumionen, die neben
den negativ geladenen Muzinen in den Becherzellen vorliegen. Durch den Ausstrom der
Calciumionen findet ein Wassereintritt in die Zellen statt. Dadurch nehmen die Muzine in der
Zelle Wasser auf, schwellen an und werden aus der Zelle ausgeschleust (VERDUGO 1990).
Bis die Becherzelle erneut mit Muzinen gefüllt ist, vergehen nach der Exozytose bei
Menschen ein bis zwei Stunden (FORSTNER 1995).
Der Abbau der Muzine im Darmlumen erfolgt durch bakterielle Enzyme, wobei der
Proteinanteil durch die angehefteten Kohlenhydratseitenketten zunächst weitgehend geschützt
ist. Im Darm befindliche Bakterien, sowohl die zur normalen Darmflora gehörenden, als auch
pathogene
Erreger,
produzieren
Endoglykosidasen,
die
die
terminal
gebundenen
Monosaccharide der Kohlenhydratseitenketten abspalten. Die Glykosidasen besitzen eine
große Spezifität, die bestimmt wird durch das jeweilige Monosaccharid, das abgespalten
werden soll, seine anomerische Konfiguration und die Lokalisation der Glykosidbindung.
Zunächst werden die terminalen, α-glykosidisch gebundenen Zuckerreste entfernt, gefolgt von
den β-glykosidisch gebundenen. Die Bakterien können die abgespaltenen Zuckerreste als
Nahrungsquelle nutzen (HOSKINS 1981). Ruminococcus- und Bifidobacterium-Stämme sind
Bakterienspezies, die erwiesenermaßen in großem Ausmaß am Abbau der Muzine beteiligt
sind. Diese Bakterien bilden sowohl α- wie auch β-Glykosidasen und Neuraminidasen
(HOSKINS
et
al.
1985).
Neuraminidasen
benötigen
zur
Abspaltung
von
Neuraminsäureverbindungen teils bakterielle O-Acetyl-Esterasen, die die im Molekül
Literaturübersicht
27
befindliche O-Acetyl-Ester zunächst abspalten, damit die Neuraminidasen ihre Funktion
erfüllen können (CORFIELD et al. 1993). Der nun freigelegte Proteinanteil der Muzine kann
durch wirtseigene Pankreasenzyme abgebaut werden (VARIYAM u. HOSKINS 1983). Im
gesunden Organismus besteht ein Gleichgewicht zwischen dem Abbau und der Neubildung
der Muzine (CORFIELD et al. 1993; FORSTNER 1995; DEPLANCKE u. GASKINS 2001).
2.1.4
Intestinale Mikroflora der Fische
Der Magen-Darm-Trakt ist physiologischerweise von Bakterien besiedelt, die apathogen oder
symbiontisch sind, wobei diese Übergänge als fließend beschrieben werden. Das
ausgewogene Gleichgewicht dieser Mikroflora wird als Eubiose bezeichnet (HAENEL 1982).
Die intestinale Mikroflora der Fische setzt sich zusammen aus aeroben sowie vielen
fakultativ- und wenigen obligat-anaeroben Bakterien. Man unterscheidet eine autochthone
von einer allochthonen Mikroflora. Die autochthone Mikroflora ist die Population von
Bakterien, die sowohl bei frei lebenden als auch bei gehälterten Fischen zu finden ist (TRUST
u. SPARROW 1974). Sie ist gekennzeichnet durch ihr Vorhandensein in gesunden
Individuen, durch eine frühe Kolonisation und eine lebenslange Persistenz, und durch die
Fähigkeit, sich unter anaeroben Bedingungen zu vermehren und mit der epithelialen
Schleimhaut in Magen oder Darm zu assoziieren (RINGO u. BIRKBECK 1999). Bakterien
der allochthonen Mikroflora befinden sich nur vorübergehend im Intestinaltrakt der Fische
und können aus dem Futter, dem Wasser oder von anderen bakterienbesiedelten Oberflächen
des Fisches stammen.
Die von der Schleimhaut des Darms isolierten Bakterien differieren bei Fischen je nach Alter,
Ernährungszustand und Umweltbedingungen (RINGO et al. 2003), so dass auch innerhalb
derselben Fischspezies, beispielsweise bei Regenbogenforellen, Unterschiede in der
Zusammensetzung der intestinalen Mikroflora vorhanden sein können (HUBER et al. 2004).
Die Besiedlung des Darms mit Bakterien ist abhängig von der Darmperistaltik, den
Verdauungsenzymen und immunologischen Reaktionen (RINGO et al. 2003). Der Salzgehalt
und die Bakterienbelastung des Wassers beeinflussen ebenfalls die intestinale Mikroflora
(CAHILL 1990). Es besteht ein Zusammenhang zwischen der Keimzusammensetzung des
Literaturübersicht
28
Wassers und der des Intestinaltraktes der Fische; beispielsweise erhöhte sich der Gehalt an
Vibrio und Aeromonas ssp. im Wasser nach Zusatz von Karpfen und erniedrigte sich nach
Entfernen der Fische (SUGITA et al. 1985). Bei Fischen mit gering differenziertem Darm,
wie Feilenfischen (Pevagor sp.), konnte eine Bakterienflora, die größtenteils der des
aufgenommenen Futters entsprach, isoliert werden, während sich bei Fischen mit stärkerer
Differenzierung des Intestinaltraktes, wie Seebrassen (Pagrus major), die Keimpopulation im
Darm von der des Futters unterschied (CAHILL 1990). In unterschiedlichen Darmabschnitten
sind andere Bakterienpopulationen vorhanden. So konnte gezeigt werden, dass der Gehalt an
aeroben Bakterien in caudaler Richtung konstant abnimmt (CAHILL 1990). Ebenfalls wurde
nachgewiesen, dass im selben Darmabschnitt einzelne Enterozyten mehr oder weniger stark
mit Bakterien besetzt sein können, was vermutlich durch das Alter der Zellen bedingt ist
(RINGO et al. 2001). Die Anzahl der intestinalen Keime wird in adulten Fischen mit Werten
zwischen 102 bis 105 in Königslachsen (Oncorhynchus tchawytscha) (MOFFITT u. MOBIN
2006), 103 in Lachsen (Salmo salar) (RINGO et al. 2000; RINGO et al. 2003) bis hin zu 106
bis 1015 pro Gramm Darm in Salmoniden (TRUST u. SPARROW 1974) angegeben. Die
Bakterien, die mit dem Darmgewebe assoziiert sind, überwiegen gegenüber denen im
Darminhalt (TRUST u. SPARROW 1974). Insgesamt ist die Bakterienanzahl im
Gastrointestinaltrakt von Fischen niedriger als in warmblütigen Tieren (RINGO et al. 2001).
Erklärt werden kann dies durch die Nutzung unzureichender Medien zum Nachweis der
Bakterien,
antibakterielle
Wirkung
der
intestinalen
Sekrete
und
des
Mukus,
Temperatureffekte oder die relativ schnelle Darmpassage. Unterschiede in der Quantität der
intestinalen Mikroflora zwischen verschiedenen Arten konnten für Bachforellen (Salmo
trutta) und Regenbogenforellen nachgewiesen werden, wobei Bachforellen eine deutlich
höhere Anzahl an Bakterien im Darm aufwiesen als Regenbogenforellen (GONZALEZ et al.
1999).
Die Kolonisation des Intestinaltraktes mit Bakterien beginnt in der Regel nach dem Schlupf
der Jungfische. Der Darm der frisch geschlüpften Fische enthält sehr wenige Bakterien, wird
aber während der ersten Tage relativ schnell besiedelt. Die sich entwickelnde intestinale
Mikroflora setzt sich zusammen aus der Bakterienpopulation des Eies, des aufgenommenen
Lebendfutters und des umgebenden Wassers (HANSEN u. OLAFSEN 1989; RINGO u.
BIRKBECK 1999). Die Eioberflächen werden bereits wenige Stunden nach der Befruchtung
Literaturübersicht
29
mit Bakterien besiedelt (HANSEN u. OLAFSEN 1999). Von Eioberflächen von Dorschen
(Gadus morhua) und Heilbutt (Hippoglossus hippoglossus) wurden unter anderem Bakterien
aus den Gattungen Pseudomonas, Aeromonas, Alteromonas und Flavobacterium isoliert
(HANSEN u. OLAFSEN 1989). Bei Goldfischen (Carassius auratus) wurden kurz nach dem
Schlupf bereits Aeromonas hydrophila, Pseudomonas ssp., Bacteroidaceae sowie Clostridium
ssp. im Darm nachgewiesen (SUGITA et al. 1988). Eine intakte intestinale Mikroflora scheint
erst Wochen bis Monate nach der ersten Fütterung vorhanden zu sein (HANSEN u.
OLAFSEN 1999). Bei Goldfischen konnte nach 67 Tagen eine Stabilisierung der intestinalen
Mikroflora nachgewiesen werden (SUGITA et al. 1988).
Die am häufigsten isolierten Keime aus dem Intestinaltrakt von Süßwasserfischen sind
gramnegative Stäbchen, insbesondere Enterobacter ssp. (TRUST u. SPARROW 1974;
CAHILL 1990), Aeromonas ssp. (TRUST u. SPARROW 1974; CAHILL 1990; GONZALEZ
et al. 1999; HUBER et al. 2004), Acinetobacter ssp. (TRUST u. SPARROW 1974; CAHILL
1990; HUBER et al. 2004), Pseudomonas ssp. (RINGO u. BIRKBECK 1999; HUBER et al.
2004) und Flavobacterium ssp. (RINGO u. BIRKBECK 1999; HUBER et al. 2004). Weitere
gramnegative Keime wie Proteus ssp., Shewanella ssp. (HUBER et al. 2004) Enterococcus
ssp. und Escherichia coli (TRUST u. SPARROW 1974) wurden ebenfalls wiederholt isoliert.
Im Darm von Bachforellen, Hechten (Esox lucius) und Regenbogenforellen wurden Bacillus
ssp. und coryneforme Bakterien gefunden, dagegen jedoch keine Enterobacteriaceae
(GONZALEZ et al. 1999). Grampositive Keime gehören ebenfalls zur normalen Flora des
Gastrointestinaltraktes adulter Fische. Zu diesen zählen verschiedene Spezies von
Milchsäurebakterien, wie Lactobacillus ssp. und Carnobacterium ssp. (RINGO u.
BIRKBECK 1999). Auch Lactococcus ssp., Pediococcus ssp. und Enterococcus ssp. konnten
im Intestinaltrakt von Karpfen nachgewiesen werden (CAI et al. 1999). Vereinzelt konnten
auch andere grampositive Keime, wie Staphylococcus ssp., im Darm von Regenbogenforellen
nachgewiesen werden (HUBER et al. 2004).
Die intestinale Mikroflora ist beteiligt an Verdauungsprozessen und dient als Schutz vor
pathogenen Bakterien. Die Produktion von Amylase konnte in verschiedenen Fischarten für
Aeromonas ssp. und Pseudomonas ssp., als Bestandteil der intestinalen Mikroflora,
nachgewiesen werden. Amylase besitzt für Süßwasserfische eine bedeutende Funktion bei der
Literaturübersicht
30
Verdauung von Stärke (SUGITA et al. 1997). Die Bakterien der intestinalen Mikroflora
produzieren Substanzen, die das Wachstum pathogener Keime im Darmtrakt unterdrücken. So
konnte gezeigt werden, dass Produkte von Carnobacterium Stamm K1 das Wachstum von
Aeromonas salmonicida und Listonella anguillarum (früher: Vibrio anguillarum) hemmen
(JÖBORN et al. 1997). Verschiedene Bakterien, die zur intestinalen Mikroflora von Steinbutt
(Scophthalmus maximus) und Kliesche (Limanda aspera) gehören, waren in der Lage, sich
stärker an den intestinalen Mukus zu binden als pathogene Bakterien (OLSSON et al. 1992).
Zusätzlich besetzen Bakterien der intestinalen Mikroflora Bindungsstellen, die so nicht mehr
von pathogenen Bakterien genutzt werden können (RINGO u. BIRKBECK 1999).
2.2
2.2.1
Bakterielle Infektionen bei Fischen
Allgemeines
Fische sind über das Wasser, in dem sie leben, kontinuierlich einer mehr oder weniger großen
Zahl Bakterien ausgesetzt. Besonders Bakterien der Gattungen Aeromonas und Pseudomonas
sind im Süßwasser weit verbreitet und gelten als fakultativ-pathogen. Bakterielle Infektionen
sind vermutlich in den meisten Fällen multifaktoriell bedingt. Sowohl suboptimale
Wasserparameter, weitere Erkrankungen, zum Beispiel durch Parasiten, und auch Stress
können zum Entstehen einer klinisch manifesten Infektion führen (INGLIS et al. 1993). Die
Bakterien interagieren dabei mit der Schleimhaut der Fische, die sowohl die äußere Haut
bedeckt, als auch den Gastrointestinaltrakt auskleidet.
In dieser Studie werden drei Stämme des fakultativ-pathogenen Bakteriums Aeromonas
hydrophila eingesetzt. Zusätzlich werden die obligat-pathogenen Bakterien Aeromonas
salmonicida, Edwardsiella tarda und Yersinia ruckeri verwendet. Diese Erreger werden im
Folgenden näher beschrieben.
Literaturübersicht
2.2.2
31
Aeromonaden
Der Gattung Aeromonas werden die motilen Arten Aeromonas hydrophila, Aeromonas caviae
sowie Aeromonas sobria zugeordnet. Die in älterer Literatur zu findenden Arten Aeromonas
liquefaciens, Aeromonas punctata und Aeromonas formicans werden inzwischen als
Synonyme für Aeromonas hydrophila aufgefasst. Als einzige unbewegliche Art ist
Aeromonas salmonicida vertreten.
2.2.2.1
Aeromonas hydrophila
Bei Aeromonas hydrophila handelt es sich um ein gramnegatives, fakultativ-anaerobes, nicht
sporenbildendes, stäbchen- bis kokkenförmiges Bakterium. Es ist mit einer polaren Geißel
ausgestattet, die es zu aktiven Bewegungen befähigt. A. hydrophila ist weltweit verbreitet und
in aquatischen Ökosystemen ubiquitär und häufig in großer Zahl zu finden – bevorzugt in
organisch stark belasteten Gewässern (INGLIS et al. 1993). In intensiv bewirtschafteten
Fischteichen können über eintausend Keime pro Milliliter Wasser vorkommen (SCHUBERT
1967). Erkrankungen treten insbesondere bei Warmwasserfischen auf, Kaltwasserfische
können aber auch betroffen sein (CIPRIANO 2001). Zudem sind Erkrankungen bei
Seewasserfischen, zum Beispiel bei Seebrassen, beschrieben (DOUKAS et al. 1998), wobei
A. hydrophila in der Regel nicht in Gewässern mit sehr hohen Salzgehalten vorkommt.
A. hydrophila kann Bestandteil der mikrobiellen Flora aquatischer Organismen sein (TRUST
u. SPARROW 1974). Daher wird diskutiert, ob das Bakterium als primäres Pathogen für
Fische angesehen werden sollte, oder ob es nur als Sekundärerreger zu Krankheiten führt
(AUSTIN u. AUSTIN 1987; INGLIS et al. 1993). Die Umwelt, der Immunstatus des Tieres
sowie mögliche primäre Erkrankungen spielen offensichtlich für die Infektion eine Rolle
(INGLIS et al. 1993). Auch wird die unterschiedliche Virulenz verschiedener A. hydrophila
Stämme diskutiert. Nicht nur bei Fischen, sondern auch bei Amphibien und Säugern,
einschließlich des Menschen, kann A. hydrophila Erkrankungen verursachen. Infektionen bei
Menschen entstehen über kontaminiertes Wasser (ARDI 2005) oder Lebensmittel
(CIPRIANO 2001). Bei Menschen äußert sich eine Infektion in Gastroenteritis, Septikämie,
Wund- und Augeninfektionen (ARDI 2005), Meningitis, Endokarditis und Peritonitis
Literaturübersicht
32
(DELAMARE et al. 2002). Besonders der obere Gastrointestinaltrakt ist betroffen (CHANG
et al. 1997). Bei Fröschen führt eine Infektion mit A. hydrophila zum typischen Bild der „Red
Leg Disease“ (CIPRIANO 2001).
Eine Infektion mit A. hydrophila verläuft bei Fischen perakut bis chronisch, wobei auch
latente Infektionen vorkommen (CIPRIANO 2001). Im perakuten Fall zeigen die Tiere in der
Regel keine klinischen Symptome. Ulzerative Hautläsionen, Nekrosen der Flossen und
Septikämie treten im akuten Fall auf. Große, lange bestehende Ulzerationen sowie
abdominale Ödeme können bei der chronischen Verlaufsform beobachtet werden (INGLIS et
al. 1993; CIPRIANO 2001). Ödeme in den Schuppentaschen, Abszesse, Hämorrhagien in den
Kiemen und Exophthalmus treten regelmäßig auf. Histologisch ist oft eine Nekrose der
intestinalen Mukosa mit Ablösung des Epithels zu erkennen. Die Mortalität kann in einer
Population sehr hoch sein (CIPRIANO 2001).
Fische infizieren sich über das Wasser. Besonders bei steigenden Wassertemperaturen im
Frühjahr und im Sommer treten Erkrankungen auf (CIPRIANO 2001). Experimentell ergab
sich die höchste Mortalitätsrate für Goldfische bei Wassertemperaturen zwischen 17°C und
25°C (RAHMAN et al. 2001a). Eine Ausnahme bildet das Ergebnis einer Studie aus Kroatien;
dort wurden keine Krankheitsausbrüche in den Sommermonaten festgestellt (POPOVIC et al.
2000).
Verschiedene Virulenzfaktoren für A. hydrophila sind beschrieben. Es konnten Exotoxine wie
Enterotoxin, Hämolysin, Lipasen und Proteasen identifiziert werden (ARDI 2005). Ein
dermonekrotischer
Faktor
Bebrütungstemperaturen
verursachte
zwischen
Hämolyse
auf
Blutagarplatten
bei
zehn und 30°C. Ein Zusammenhang zwischen
Hämolysinproduktion und Virulenz schien denkbar, konnte aber nicht belegt werden
(AUSTIN u. AUSTIN 1987; INGLIS et al. 1993; ALAVANDI u. ANANTHAN 2003).
Stämme, die aus Wasser isoliert wurden, waren beispielsweise häufiger hämolysierend als
Stämme aus erkrankten Organismen (ALAVANDI u. ANANTHAN 2003). Unterschiedliche
Hämolysingenotypen scheinen für die Zytotoxizität mitverantwortlich zu sein (WANG et al.
2003). Auch die Produktion von Proteasen korrelierte nicht mit der Virulenz (INGLIS et al.
1993), ebenso wenig wie die Fähigkeit bestimmter A. hydrophila Stämme, an Erythrozyten zu
adhärieren. Dagegen konnte ein Zusammenhang zwischen der Elastasebildung und der
Literaturübersicht
33
Virulenz nachgewiesen werden (AUSTIN u. AUSTIN 1987). Die regelmäßig vorkommende
Ausbildung eines S-Layers (DOOLEY et al. 1988; DOOLEY u. TRUST 1988) war in
Laborexperimenten positiv mit der Virulenz korreliert (MURRAY et al. 1988). Ein
Zusammenhang bestand auch zwischen hitzestabilen Antigenen und der Virulenz für Fische
(LEBLANC et al. 1981). Die Anzüchtungszeit der Bakterien hatte einen Einfluss auf die
Virulenz, wobei Bakterien, die nur einen Tag bebrütet wurden, für Goldfische am
virulentesten waren (RAHMAN et al. 2001b). Ein zytotoxisches Exotoxin konnte in 88% von
25 untersuchten A. hydrophila Stämmen gefunden werden (RALL et al. 1998). Aus infizierten
Fischen konnten mehr Stämme, die Zytotoxin produzierten, isoliert werden, als solche, die
kein Zytotoxin bildeten (YADAV et al. 1992). Bei Verabreichung eines Adhäsins von
A. hydrophila konnte die Invasion des Bakteriums in EPC-Zellen verhindert werden (FANG
et al. 2000). Durch eine Impfung von Karpfen gegen A. hydrophila in Form einer
Badebehandlung in einer Bakterienimmersion, konnte eine lokale mukosale Aktivität nach
zweimalige Behandlung im Abstand von drei Monaten erreicht werden (LAMERS et al.
1985). Zusammengefasst scheinen eine Reihe von Faktoren, darunter Endo- und Exotoxine,
die Virulenz eines A. hydrophila Stammes zu bedingen.
2.2.2.2
Aeromonas salmonicida
Aeromonas salmonicida ist ein gramnegatives, nicht sporenbildendes, fakultativ-anaerobes,
stäbchenförmiges Bakterium. Im Unterschied zu anderen Aeromonaden ist es unbeweglich
und bildet ein braunes Pigment. Charakteristisch ist, dass viele Stämme nicht bei
Temperaturen über 35°C angezüchtet werden können. Es handelt sich um ein für Fische
obligat-pathogenes Bakterium, wobei bei verschiedenen Fischspezies unterschiedliche
Krankheitsbilder hervorgerufen werden. Krankheitsausbrüche sind stressassoziiert und
können zu hohen Verlustraten führen (INGLIS et al. 1993). Erstmals beschrieben wurde
A. salmonicida 1894 nach einem Krankheitsausbruch bei Forellen in Deutschland
(EMMERICH u. WEIBEL 1894). Das Bakterium ist auch bei Karpfen fast weltweit
verbreitet, wie Berichte aus Israel (MAURICE u. TINMAN 2000), Finnland (RINTAMÄKI
u. VALTONEN 1991) und Japan (KAKU et al. 1999) zeigen. Es verursacht bei Süß-, Brackund Seewasserfischen Erkrankungen.
34
Literaturübersicht
Die Taxonomie von A. salmonicida ist umstritten. Generell werden die Bakterien eingeteilt in
typische und atypische Stämme. In „Bergey´s Manual of Systematik Bacteriology“ wurde
1984 eine Aufteilung der A. salmonicida Stämme in drei Subspezies beschrieben. Aufgrund
ihrer unterschiedlichen biochemischen Reaktionen wurden Stämme von A. salmonicida in die
Subspezies salmonicida, achromogenes und masoucida eingeteilt. Eine andere Einteilung
erfolgte aufgrund epizootiologischer Kriterien (MCCARTHY u. ROBERTS 1980). Hierbei
handelt es sich um die Subspezies salmonicida, achromogenes und nova. A. salmonicida ssp.
salmonicida ist dabei der Erreger der Furunkulose der Salmoniden; bei A. salmonicida ssp.
achromogenes handelt es sich um Stämme, die ebenfalls pathogen für Salmoniden sind, aber
nicht die typischen Symptome der Furunkulose auslösen; A. salmonicida ssp. nova ist für
Nicht-Salmoniden pathogen (MCCARTHY u. ROBERTS 1980; INGLIS et al. 1993). Die
epizootiologische Auftrennung wurde von einigen Wissenschaftlern nicht anerkannt
(WIKLUND u. DALSGAARD 1998) und weitere, neu beschriebene Subspezies wurden
aufgrund biochemischer Reaktionen eingeteilt, beispielsweise die Subspezies smithia (HOLT
et al. 1994). Zusätzlich existieren Stämme einer noch nicht benannten Subspezies, deren
Charakteristikum eine Wachstumsfähigkeit bei 37°C ist (CIPRIANO u. BULLOCK 2001)
sowie Subspezies pectinolytica (PAVAN et al. 2000). Generell gilt die Subspezies
salmonicida als typischer Stamm, während alle anderen Subspezies den atypischen Stämmen
zugerechnet werden (INGLIS et al. 1993; WIKLUND u. DALSGAARD 1998; CIPRIANO u.
BULLOCK 2001).
Die typische Erkrankung durch A. salmonicida ssp. salmonicida bei Salmoniden ist die
Furunkulose. Salmoniden jeden Alters können betroffen sein, wobei sehr junge Fische
seltener erkranken (INGLIS et al. 1993). Die Erkrankung kann perakut bis chronisch
verlaufen. Im perakuten Fall, der meistens Jungfische betrifft, sind in der Regel kaum klinisch
erkennbare Symptome vorhanden. Akute Infektionen treten bei Jungfischen sowie adulten
Fischen auf und sind gekennzeichnet durch eine Dunkelfärbung der Haut und Hämorrhagien
im Maul oder an den Flossen. Typische Furunkel der Haut treten nur bei chronisch infizierten,
meist älteren Tieren auf. Die Bakterien lösen, bedingt durch eine Septikämie, Läsionen aus,
die in der Muskulatur entstehen und nach außen durchbrechen können. Eine andere
Verlaufsform bei Salmoniden wird als „Trout Ulcer Disease“ bezeichnet und wird durch eine
atypische, achromogene A. salmonicida Subspezies verursacht. Die Symptome dieser
Literaturübersicht
35
Verlaufsform äußern sich in Hautgeschwüren, die sich bis in die Muskulatur erstrecken
können. Erkrankungen bei anderen Fischarten führen zu unterschiedlichen klinischen Bildern.
Bei Goldfischen sind Infektionen mit atypischen A. salmonicida ssp. bekannt, die zu
Nekrosen und Ulzerationen der Haut sowie zur Degeneration der Muskulatur führen
(CIPRIANO u. BULLOCK 2001). Bei Karpfen mit dem Krankheitsbild „Erythrodermatitis“
konnte häufig eine atypische Subspezies von A. salmonicida nachgewiesen werden (INGLIS
et al. 1993; WIKLUND u. DALSGAARD 1998; CIPRIANO u. BULLOCK 2001). In
Untersuchungen waren 76,9% der A. salmonicida Stämme pathogen für Karpfen
(KOZINSKA et al. 2002). Die Erythrodermatitis verläuft subakut bis chronisch und tritt bei
Wassertemperaturen zwischen vier und 30°C auf. Klinische Symptome sind Exophthalmus,
Hämorrhagien in den Kiemen und Anämie (CIPRIANO u. BULLOCK 2001). Bei der
Blutuntersuchung fiel bei infizierten Karpfen ein Anstieg des Serumprotein- und des
Immunglobulingehaltes auf (EVENBERG et al. 1986). A. salmonicida scheint das
Immunsystem der Karpfen schwächen zu können (POURREAU et al. 1986). Dabei sind
unterschiedliche Karpfenstämme verschieden anfällig für eine Infektion (SOEVENYI et al.
1988; HOUGHTON et al. 1991). Jüngere Karpfen sind empfindlicher gegenüber einer
Infektion mit A. salmonicida als ältere Tiere (WIEGERTJES et al. 1993). Eine
Immunisierung der Karpfen durch Verabreichung von A. salmonicida-Antigenen ist möglich
(IRIE et al. 2005). Auch bei weiteren Fischspezies, wie Schleien (Tinca tinca) (BERNOTH u.
KÖRTING
1992),
Dorschen,
Heilbutt,
Steinbutt
(DALMO
et
al.
1998)
und
Schwarzspitzenriffhai (Carcharhinus melanopterus) (BRIONES et al. 1998), konnten
Infektionen mit A. salmonicida beobachtet werden.
Infektionen finden über das Wasser statt. A. salmonicida kann dabei in Süßwasser etwa 17
Tage infektiös bleiben (MCCARTHY 1977). Virulenzfaktoren des Bakteriums sind
Leukozidin, welches zur Leukopenie führt, sowie Proteasen. In verschiedenen Stämmen von
A. salmonicida konnte die Produktion mehrer Exotoxine und Exoproteasen nachgewiesen
werden (GUDMUNDSDOTTIR et al. 2003).
Literaturübersicht
36
2.2.3
Infektionserreger aus der Gruppe der Enterobacteriaceae
2.2.3.1
Edwardsiella tarda
Edwardsiella tarda ist ein gramnegatives, stäbchenförmiges Bakterium aus der Gruppen der
Enterobacteriaceae, welches erstmals 1965 beschrieben wurde (EWIG et al. 1965). Das
Bakterium besitzt peritriche Flagellen und ist fakultativ-anaerob. Außer Fischen zählen
Amphibien, Reptilien, Vögel und Säugetiere, einschließlich des Menschen, zu den möglichen
Wirten des Bakteriums (BULLOCK u. MCCRAREN 1989). Es existieren vier Serotypen (A,
B, C, und D), wobei 72% der Isolate, die aus Fischen isoliert werden konnten, dem Serotyp A
angehörten.
Dies
deutet
darauf
hin,
dass
dieser
Serotyp
hauptsächlich
an
Krankheitsausbrüchen beteiligt ist. In Infektionsversuchen mit Aalen (Anguilla sp.) und
Tilapien (Oreochromis sp.) konnte dies bestätigt werden (AUSTIN u. AUSTIN 1987;
INGLIS et al. 1993). Es bestehen Zweifel darüber, ob E. tarda als Primär- oder
Sekundärerreger angesehen werden sollte, da das Bakterium zumindest bei Welsen (Silurus
ganis) Bestandteil der normalen Mikroflora der Haut zu sein scheint (AUSTIN u. AUSTIN
1987). E. tarda ist in erster Linie ein Krankheitserreger von Warmwasserfischen,
insbesondere Welsen und Aalen, wurde aber auch bei vielen anderen Süßwasserfischen, unter
anderem bei Karpfen (SAE-OUI et al. 1984), aber auch bei Meerwasserfischen, nach
Krankheitsausbrüchen isoliert. Probleme verursachen Infektionen mit E. tarda weltweit,
besonders in den USA und in Japan (AUSTIN u. AUSTIN 1987; INGLIS et al. 1993). Ab
10°C Wassertemperatur treten Erkrankungen auf, insbesondere aber bei hohen Temperaturen
um 30°C. Experimente mit Flundern (Platichthys flesus) ergaben eine Korrelation zwischen
der Pathogenität von E. tarda und der Wassertemperatur. Die Pathogenität der Bakterien war
bei Wassertemperaturen zwischen 20°C und 25°C am höchsten, wobei höhere
Haltungstemperaturen nicht untersucht wurden (ZHENG et al. 2004). Eine starke organische
Belastung des Wassers (MEYER u. BULLOCK 1973) und hohe Kupferkonzentrationen
(AUSTIN u. AUSTIN 1987) scheinen zusätzlich eine Rolle für die Pathogenität zu spielen.
Die Symptome einer Erkrankung reichen bei Welsen je nach Krankheitsstadium von kleinen
Hautläsionen bis zu Abszessen und Nekrosen der Haut. Erkrankte Fische sind lethargisch,
stehen an der Oberfläche und zeigen spiralige Schwimmbewegungen (BULLOCK u.
MCCRAREN 1989). Aus den lateral gelegenen Hautläsionen entstehen große Abszesse in der
Literaturübersicht
37
Muskulatur oder am Schwanzflossenansatz. Die Abszesse können mit Gas und nekrotischem
Gewebe angefüllt sein und einen üblen Geruch absondern (MEYER u. BULLOCK 1973).
Verantwortlich dafür scheinen Exotoxine zu sein, von denen bereits zwei isoliert werden
konnten. Endotoxine werden dagegen nicht gebildet (INGLIS et al. 1993). Karpfen zeigen
Hämorrhagien an Körper und Flossen. In einer Untersuchung betrug die Mortalitätsrate bei
Welsen in einer Population bis zu 50%, wobei auffällig war, dass nur größere Fische ab einem
Gewicht von 450g betroffen waren (MEYER u. BULLOCK 1973). Andere Studien berichten
auch von Krankheitsausbrüchen bei Fischbrut und Jungfischen (HERMAN u. BULLOCK
1986; DARWISH et al. 2000). Eine letale Dosis von 109 Bakterien pro Milliliter PBS-Puffer
wurde für den Bloch (Anabas testudineus) bestimmt (SAHOO et al. 2000). Fische infizieren
sich durch Bakterien aus der Umwelt, die im Teichwasser 76 Tage infektiös bleiben
(BULLOCK u. MCCRAREN 1989).
In Infektionsversuchen mit Mäusen konnte eine Mortalitätsrate von 50% bei einzelnen
Stämmen von E. tarda beobachtet werden, wobei keine Korrelation zwischen dem
Vorhandensein von Plasmiden, der chemotaktischen Aktivität, der Serumresistenz oder der
Enzymaktivität
bestand
(JANDA
et
al.
1991a).
Über
das
Futter
verabreichte
Immunmodulatoren, wie Glucan, Levamisol oder Vitamin E, führten zu einer erniedrigten
Mortalitätsrate (SAHOO u. MUKHERJEE 2002).
2.2.3.2
Yersinia ruckeri
Yersinia ruckeri ist ein gramnegatives, stäbchen- bis kokkenförmiges Bakterium aus der
Gruppe der Enterobacteriaceae. Die meisten Stämme sind motil durch peritriche Flagellen,
unbewegliche Stämme kommen aber regelmäßig vor. Y. ruckeri ist für Fische ein wichtiger
Primärerreger bakterieller Erkrankungen. Erstmals isoliert wurde das Bakterium in den
1950er Jahren in den USA. In den 1980er Jahren nahm die Zahl der Erkrankungen durch eine
Infektion mit Y. ruckeri in Deutschland stark zu (INGLIS et al. 1993). Inzwischen konnte
Y. ruckeri bereits aus Wasser, aquatischen Invertebraten, verschiedenen Nutz- und
Wildfischen (AUSTIN u. AUSTIN 1987) sowie Bisamratten (STEVENSON u. DALY 1982)
isoliert werden. Auch aus klinisch gesunden Karpfen konnte Y. ruckeri isoliert werden
Literaturübersicht
38
(FUHRMANN et al. 1984). Experimentelle Infektionen von Karpfensetzlingen durch
intraperitoneale Applikation führten zum Tod der meisten Tiere. Die überlebenden Fische
zeigten deutliche Symptome einer bakteriellen Infektion (BERC et al. 1999). Experimentelle
Infektionen von Platies (Xiphophorus maculatus) über das Wasser (106-108 Bakterien pro
Milliliter Wasser) führten noch vor dem Auftreten von Symptomen zum Tod der Tiere
(KAWULA et al. 1996).
Hauptwirte des Erregers sind Regenbogenforellen. Andere Salmoniden und Fische weiterer
Arten werden nur selten infiziert. Erkrankungen durch Y. ruckeri bei Salmoniden werden als
Rotmaulseuche
bezeichnet.
Symptome
sind
Septikämien
und
Hämorrhagien
auf
Körperoberflächen, Flossen und in Organen (INGLIS et al. 1993). Am Kopf, besonders im
Maulbereich, sind in vielen Fällen auffällige Rötungen zu beobachten, diese müssen jedoch
nicht bei allen Tieren des Bestandes vorkommen; Exophthalmus kann auftreten
(FUHRMANN et al. 1984). Im chronischen Fall erscheinen die Fische dunkel verfärbt und
lethargisch, können sich aber auch in einem asymptomatischen Carrierstatus befinden. Die
Verluste sind bei chronischen Verlaufsformen gering, können jedoch durch suboptimale
Wasserqualität oder Stress dramatisch steigen (INGLIS et al. 1993). Fische infizieren sich in
der Regel über das Wasser. Da Y. ruckeri auch aus Vogelkot isoliert werden konnte, kann ein
Eintrag des Erregers durch Vögel nicht ausgeschlossen werden (WILLUMSEN 1989).
Y. ruckeri ist in der Lage, gut an raue Oberflächen im Wasser zu binden und kommt assoziiert
mit Algen und Sediment von Teichen vor. Der dadurch entstehende Biofilm in
Hälterungsanlagen kann zu Infektionen der Fische führen (COQUET et al. 2002a; COQUET
et al. 2002b).
Literaturübersicht
2.3
39
Interaktionen zwischen Bakterien und mukosalen Oberflächen
Mikroorganismen
verschiedener
taxonomischer
Gruppen
assoziieren
sich
mit
Epitheloberflächen zahlreicher Spezies, wobei die meisten der auf den Schleimhäuten
angesiedelten Keime nicht pathogen für den Wirt zu sein scheinen (SAVAGE 1984;
SAVAGE 1987). So ist auch für die Aufrechterhaltung der mikrobiellen Flora im
Gastrointestinaltrakt eine enge Bindung zwischen Bakterien und Schleimhaut notwendig.
Allerdings entstehen bakterielle Infektionen bei Menschen und Tieren ebenfalls überwiegend
durch
Ansiedlung
von
Bakterien
auf
Schleimhäuten.
Die
Fähigkeit
bakterieller
Infektionserreger, mit der Mukosa zu interagieren, ist unter anderem abhängig von der
Beweglichkeit der Bakterien, ihrer Fähigkeit auf chemotaktische Reize zu reagieren und der
Nutzung vorhandener Nährstoffe (SAVAGE 1984).
Der erste Schritt in der Pathogenese der meisten Infektionserkrankungen scheint die Adhäsion
der Krankheiterreger an mukosale Oberflächen zu sein (BEACHEY 1981; TSE u. CHADEE
1991; RINKINEN et al. 2000). Dabei binden Bakterien entweder an die Epithelzellen oder
den Mukus. In vielen Studien wurde gezeigt, dass Bakterien spezialisierte Organellen, so
genannte Adhäsine, besitzen, die diese Bindungen ermöglichen. Im Mukus und auf den
Enterozyten sind Rezeptoren vorhanden, die Adhäsine erkennen (TSE u. CHADEE 1991;
GUSILS et al. 2004). Es besteht ein Gewebstropismus durch die Lokalisation der spezifischen
Rezeptoren in unterschiedlichen Geweben (NIEMANN et al. 2004). Viele bewegliche
Bakterien
nutzen
chemotaktische
Faktoren
oder
besitzen
Proteinase-
oder
Glykosidaseaktivitäten, die ihnen ein Durchdringen der Mukusschicht ermöglichen (TSE u.
CHADEE 1991). Virulenzfaktoren, die eine Bindung an Zellen oder eine Produktion von
Enterotoxinen ermöglichen, können auf Plasmiden der Bakterien kodiert sein (TORANZO et
al. 1983).
Es sind drei Hauptbindungsmöglichkeiten zwischen Schleimhaut und Bakterien beschrieben.
Die Adhäsion findet vermutlich in den meisten Fällen lektinvermittelt statt, wobei das Lektin
sich entweder auf der Oberfläche des Bakteriums oder auf der der Epithelzelle befinden kann.
Die Lektine binden an Kohlenhydrate und können in Form von Fimbrien, Kapseln oder als
Bestandteil der Membran gramnegativer Bakterien vorliegen (ABRAHAM et al. 1999). Sind
Literaturübersicht
40
die
Lektine
auf
der
Oberfläche
der
Bakterien
ausgebildet,
können
die
Kohlenhydratseitenketten der Muzine (TSE u. CHADEE 1991) oder Kohlenhydratanteile auf
der Zellmembran der Epithelzellen (BAVINGTON u. PAGE 2005) als Bindungspartner
genutzt werden. Am Beispiel der Adhäsion von Pseudomonas aeruginosa an pulmonalen
Mukus des Menschen wurde ermittelt, dass eine Bindung an Fukose, Galaktose, N-AcetylGalaktosamin und N-Acetyl-Glukosamin stattfand. Das Bakterium konnte nicht an
Neuraminsäure binden (NELSON et al. 1990). Die Bindung von Yersinia enterocolitica an
Kaninchenmukus konnte an N-Acetyl-Glukosamin und Galaktose nachgewiesen werden
(MANTLE u. HUSAR 1994). Fukose als Bestandteil von Schweinemagenmuzin hatte eine
chemotaktische Wirkung auf Campylobacter jejuni (HUGDAHL et al. 1988). Durch Zugabe
von Kohlenhydraten konnte die Bindung von Pseudomonas aeruginosa (NELSON et al.
1990) und weiterer respiratorischer Pathogene (THOMAS u. BROOKS 2004) verhindert
werden. Die Bindung von Yersinia enterocolitica an Mukus von Mensch und Kaninchen
konnte durch Zugabe von Galaktose, N-Acetyl-Galaktosamin und Laktose reduziert werden
(MANTLE u. HUSAR 1993). Fukose verhinderte die Bindung von Vibrio cholerae, wobei
keine chemotaktische Wirkung von Fukose auf das Bakterium festgestellt werden konnte
(FRETER u. O´BRIAN 1981). Einige Bakterien sind in der Lage, spezielle Enzyme, wie
Neuraminidase, zu bilden, wodurch Kohlenhydratseitenketten vom Mukus oder der
Epithelzelle abgespalten werden und so eine Bindung an zuvor nicht zugängliche Bereiche
ermöglicht wird (TONG et al. 2002).
Als zweite, ebenfalls häufige Bindungsmöglichkeit, kommt eine Protein-Protein-Bindung
zwischen Bakterien und mukosalen Oberflächen vor (ABRAHAM et al. 1999), wobei auch
Bindungen an den Proteinanteil der Muzine bestehen (MANTLE u. HUSAR 1994). Hierbei
können auch Integrine als Bindungspartner fungieren (ISBERG u. LEONG 1990). Auf der
Zellmembran von Staphylococcus ssp. scheinen muzinbindende Rezeptoren vorhanden zu
sein, die aus Proteinkomponenten bestehen (SANFORD et al. 1989). Diskutiert wird, ob
Protein-Protein-Bindungen tatsächlich an der Adhäsion beteiligt sind oder ob sie in erster
Linie für die Gewebeinvasion verantwortlich sind (MAKIHIRA et al. 2002).
Die dritte Bindungsmöglichkeit, die seltener beschrieben wird, ist eine Bindung zwischen
Lipiden und hydrophoben Bereichen, wobei sich die Lipide wiederum entweder auf den
Literaturübersicht
41
Bakterien oder auf den Epithelzellen befinden können (ABRAHAM et al. 1999). Der
Zusammenhang
zwischen
hydrophoben
Eigenschaften
der
Bakterien
und
ihrer
Bindungsfähigkeit ist noch umstritten; in Versuchen mit Bifidobacterium ssp. konnte keine
direkte Korrelation festgestellt werden (GUEIMONDE et al. 2005).
Weitere Substanzen, unter anderem Eisen, spielen offenbar zusätzlich eine Rolle bei
bakteriellen Interaktionen (GRAM et al. 1999). Unterschiedliche Stämme eines Bakteriums
interagieren nicht in gleicher Weise mit Wirtszellen, wie für Vibrio Stämme nachgewiesen
werden konnte (WANG et al. 1998). Generell ist die Affinität zwischen Rezeptoren und
Liganden bei der Adhäsion von Bakterien an mukosale Oberflächen gering (PIETERS 2004).
Dieser Umstand scheint durch die Vielzahl der Bindungsmöglichkeiten und die Quantität der
Liganden und Rezeptoren ausgeglichen zu werden.
Um eine Infektion auszulösen, sind nach der Adhäsion weitere Schritte notwendig.
Beispielsweise spielt die Adhäsion eine bedeutende Rolle in der nachfolgenden Translokation
von Bakterien (KATAYAMA et al. 1997).
Es sind zahlreiche Abwehrmechanismen der mukosalen Oberflächen bekannt. Zum einen
dient die viskoelastische Konsistenz des Mukus, durch die die Beweglichkeit vieler Bakterien
herabgesetzt wird, der Abwehr (CONE 1999). Zusätzlich schützen mukoziliare Aktivitäten
und anti-adhäsive Substanzen im Mukus vor einer Infektion. So konnten im Hautmukus von
Dorschen antimikrobielle Substanzen, die sowohl gegen grampositive, wie auch gegen
gramnegative Bakterien wirkten, isoliert werden. Es handelte sich bei diesen Substanzen um
kationische Proteine, von denen drei ribosomaler Herkunft waren (BERGSSON et al. 2005).
Lektine, die auf Fischzellen vorhanden sind, scheinen ebenfalls eine antibakterielle und
antifungale Funktion zu besitzen (ALEXANDER u. INGRAM 1992). Fraglich ist allerdings,
ob Fische, wie Säuger, Rezeptoren besitzen, die eine Endotoxinerkennung ermöglichen.
Dagegen spricht die Resistenz von Fischen gegen Endotoxinschocks (ILIEV et al. 2005).
Die Verhinderung der Adhäsion kann zur Prophylaxe und Therapie von Erkrankungen
eingesetzt werden (ACORD et al. 2005). Beispielsweise können Vakzinen auf diesem Prinzip
beruhen. Passive Impfungen durch die Gabe von Antikörpern gegen die bakteriellen
Adhäsionsmoleküle
wurden
bereits
entwickelt.
Auch
soll
eine
niedrig
dosierte
42
Literaturübersicht
Antibiotikatherapie eine bakterielle Bindung verhindern; gegen diese Maßnahme spricht die
Gefahr der Entwicklung von Antibiotikaresistenzen der Bakterien (BAVINGTON u. PAGE
2005). Auch zu Therapiezwecken kann die Adhäsion bestimmter Substanzen an den Mukus
genutzt werden, indem Pharmaka mit dieser Fähigkeit verabreicht werden. Durch die Bindung
an Schleimhäute kann so eine langsame, kontrollierte Abgabe des Wirkstoffs erfolgen
(EDSMAN u. HÄGERSTRÖM 2005).
Es existieren viele Studien, die die Interaktion von probiotischen Bakterien mit mukosalen
Oberflächen untersuchen, da diese für die Auswahl der Probiotika essentiell ist. Andere
Studien befassen sich mit den Beziehungen zwischen pathogenen Bakterien und
Schleimhäuten. Im Folgenden werden diese beiden Aspekte gesondert dargestellt.
2.3.1
Interaktionen zwischen Probiotika und mukosalen Oberflächen
Probiotika sind lebensfähige Mikroorganismen, die einen gesundheitsfördernden Einfluss auf
den Wirt haben. Die Bindungsfähigkeit von Probiotika an den intestinalen Mukus ist
essentiell für die gewünschte Wirkung und wird zur Auswahl geeigneter Substanzen genutzt.
Adhäsive Probiotika wirken stärker antagonistisch auf die Bindung pathogener Bakterien als
nicht-adhäsive (VESTERLUND et al. 2005a). Probiotika produzieren Metabolite, die
antimikrobiell wirken, und zu einer Reduktion der Adhäsion pathogener Bakterien an den
intestinalen Mukus führen (VINE et al. 2004a; VINE et al. 2004b). Eine Bindung an und
Wachstum in Fischmukus konnte bei Carnobacterium Stamm K1 nachgewiesen werden
(JÖBORN et al. 1997). Bakterien der intestinalen Mikroflora vom Atlantischen Lachs (Salmo
salar) waren zu 6% in der Lage, antagonistische Wirkung gegen A. salmonicida zu entfalten.
Unter diesen intestinalen Bakterien befand sich je ein Stamm A. hydrophila, Vibrio fluvialis
sowie Carnobacterium ssp. (IRIANTO u. AUSTIN 2002). Eine Temperaturabhängigkeit bei
der Bindung verschiedener Probiotika an den intestinalen Mukus besteht (IBRAHIM et al.
2004). Entgegen der früher vertretenen Meinung, dass Probiotika aus demselben Wirt isoliert
werden müssen, in dem sie eingesetzt werden sollen, ist inzwischen erwiesen, dass keine
wirtsspezifische Bindung an den Mukus besteht. Zwischen der Adhäsion von Probiotika an
den Mukus unterschiedlicher Fischarten scheint kein deutlicher Unterschied zu bestehen
Literaturübersicht
43
(CHABRILLON et al. 2005). Auch zeigten Bakterien, die aus dem Darm von Pferden isoliert
wurden, die stärkste Bindung an menschlichen Mukus (LAUKOVA et al. 2004). Probiotika,
die eigentlich im humanen Bereich eingesetzt werden, zeigten an den intestinalen Mukus von
Fischen eine gute Adhäsionsfähigkeit. Einige dieser Bakterien waren auch in der Lage, in den
Mukus einzudringen (NIKOSKELAINEN et al. 2001). Auch an den intestinalen Mukus von
Hunden adhärierten Probiotika, die in der menschlichen Ernährung eingesetzt werden, gut
(RINKINEN et al. 2000). Es scheinen demnach ähnliche Rezeptoren im Mukus verschiedener
Wirte ausgebildet zu sein, weswegen die Adhäsionsfähigkeit stärker vom Bakterienstamm als
vom Wirtsmukus abzuhängen scheint (CHABRILLON et al. 2005). Für Enterococcus ssp.
konnten inzwischen zwei Oberflächenproteine isoliert werden, die an der Adhäsion beteiligt
sind (LAUKOVA et al. 2004).
Es konnte gezeigt werden, dass die Verabreichung von Probiotika an Regenbogenforellen
deren Immunparameter positiv beeinflusste. Dabei wurden verstärkte „respiratory burst“Aktivitäten der Blutzellen, verstärktes Serum-vermitteltes Abtöten von Escherichia coli sowie
erhöhte Immunglobulingehalte im Blutserum festgestellt (NIKOSKELAINEN et al. 2003).
Pseudomonas fluorescens bewirkte als Probiotikum in Zusammenhang mit einer Infektion mit
Listonella anguillarum einen Rückgang der Mortalität von Regenbogenforellen von 50% auf
bis zu 35% (GRAM et al. 1999).
Probiotika besitzen allerdings keine antagonistische Wirkung gegen alle pathogenen
Bakterien. So beeinflusste Lactobacillus rhamnosus die Adhäsion von Salmonella enteritica
serovar typhimurium nicht; die Bindung des Probiotikums wurde durch das Pathogen sogar
herabgesetzt (VESTERLUND et al. 2005a).
2.3.2
Interaktionen zwischen Pathogenen und mukosalen Oberflächen
Pathogene Bakterien sind in der Lage, sich auf Zellen auszubreiten oder in Zellen
einzudringen und so zu einer Zerstörung der Mukosa zu führen. Listonella anguillarum und
Vibrio alginolyticus zeigten eine deutliche Adhäsion an intestinalen Mukus von Seebrassen,
der zusätzlich chemotaktisch auf diese Bakterien wirkte (BORDAS et al. 1998). Eine
Literaturübersicht
44
chemotaktische Wirkung des Mukus von Regenbogenforellen auf Listonella anguillarum
(O'TOOLE et al. 1999) und Wachstum des Bakteriums im Mukus von Lachsen (GARCIA et
al. 1997) konnte auch in anderen Studien nachgewiesen werden. Zumindest für einige
pathogene Keime scheint eine Wirtsspezifität vorzuliegen. Beispielsweise binden Neisseria
gonorrheae Stämme nur an die Schleimhaut von Menschen, nicht aber an die von Kaninchen,
Schweinen und Rindern (STEPHENS et al. 1982). Unterschiedliche Sekretionssysteme, die
zur Ausschleusung toxischer Substanzen ausgebildet sind, kommen auf Bakterienmembranen
vor (DONNENBERG 2000). Die Toxine können in den periplasmatischen Spalt freigesetzt
werden, so zum Beispiel bei Bacteroides fragilis und Clostridium difficile, die an den Zellen
adhärieren (SANSONETTI 2004). Durch Endozytose werden die mikrobiellen Produkte in
die Zellen aufgenommen. Andere Bakterien schleusen mittels eines Sekretionssystems Toxine
direkt in die Wirtszelle ein. Zum Beispiel injizieren enteropathogene Bakterien der Gattungen
Escherichia coli und Helicobacter pylori Effektor-Moleküle in Zellen, Salmonellen und
Shigellen dringen komplett in Zellen ein (SANSONETTI 2004). Einige Bakterien nutzen so
genannte Invasine, die es ihnen ermöglichen, in die Zellen aufgenommen zu werden. Nach
der Aufnahme durch Phagozytose sind diese Bakterien in der Lage, die Immunmechanismen
des Organismus zu umgehen und sich zu vermehren. Für Listeria monocytogenes sind bereits
zwei Invasine bekannt und auch bei anderen Bakterien konnten Invasine nachgewiesen
werden. Invasine befinden sich auf der äußeren Membran gramnegativer Bakterien bzw. in
der Zellwand grampositiver Bakterien (NIEMANN et al. 2004). Alle Mechanismen
resultieren
in
der
Aktivierung
einer
Signalkaskade,
die
zur
Transkription
proinflammatorischer Gene führt (SANSONETTI 2004). Die Motilität der Bakterien spielt
eine entscheidende Rolle bei der Invasion der Zellen. Unbewegliche Mutanten von Listonella
anguillarum zeigten im Vergleich zu beweglichen Bakterien eine deutlich niedrigere
Invasionsrate in Zellen (ORMONDE et al. 2000). Ähnliche Ergebnisse ergaben sich bei
Versuchen mit unbeweglichen Mutanten von Vibrio cholerae bei der Bindung an
Kaninchenmukus (FRETER u. O´BRIAN 1981). Ein Zusammenhang zwischen der
Adhäsionsfähigkeit pathogener Bakterien und deren Invasionsfähigkeit in Zellen scheint zu
bestehen. So zeigten invasive Listonella anguillarum Stämme eine höhere Bindungsfähigkeit
an Zellen als nichtinvasive Stämme (WANG u. LEUNG 2000). Listonella anguillarum besitzt
Flagellen, die eine Bindung an Mukus ermöglichen, Fimbrien scheinen dagegen nicht
Literaturübersicht
45
ausgebildet zu sein. Eine Vorbehandlung von Mukusproben von Seebrassen mit Listonella
anguillarum führte zu einer verminderten Adhäsion anderer Bakterien (CHABRILLON et al.
2004).
Bakterienadhäsion scheint mit der Lokalisation im Darm zu variieren. An den Mukus des
Mitteldarms von Regenbogenforellen zeigte Listonella anguillarum in vitro eine stärkere
Adhäsion als an den des Enddarms. Dieser Umstand konnte in vivo nicht nachvollzogen
werden. Eine Endozytose der Bakterien fand ebenfalls im Mitteldarm statt (RINGO et al.
2001). Stämme von Yersinia enterocolitica mit und ohne Virulenzplasmid zeigten ein
deutliches Wachstum in Kaninchenmukus, wobei nur die Stämme mit Virulenzplasmid
Muzine abbauen konnten. Das Wachstum im Mukus ermöglicht offensichtlich die
Kolonisation der mukosalen Oberfläche, während die Produktion von mukusabbauenden
Enzymen den Stämme mit Virulenzplasmid ermöglicht, die Mukusschicht zu durchdringen
(MANTLE u. ROMBOUGH 1993).
Auch Interaktionen zwischen mukosalen Oberflächen und den Bakterien, die in dieser Studie
verwendet wurden, sind beschrieben und sollen im Folgenden dargestellt werden.
In Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass A. hydrophila-Isolate unterschiedlicher
Quellen nicht in gleicher Weise vom dermalen Mukus von Forellenbarschen (Micropterus
salmoides) chemotaktisch beeinflusst wurden. Einige zeigten keine, andere eine starke
chemotaktische Aktivität. A. hydrophila-Isolate, die aus Hautläsionen gewonnen wurden,
wiesen dabei eine stärkere chemotaktische Aktivität auf, als Isolate aus dem Wasser. Wurden
die Fische gestresst, so produzierten sie keinen chemotaktisch attraktiveren Mukus (HAZEN
et al. 1982). Die Bindung von A. hydrophila, A. caviae und A. sobria an Muzine erkrankter
Fische ergab eine signifikant höhere Adhäsionsfähigkeit von A. hydrophila im Vergleich zu
den anderen Aeromonas Spezies. Auf der Oberfläche von A. hydrophila konnten drei Proteine
gefunden werden, die aktiv an Muzine binden und deren Größe zwischen 22 und 150kDa lag.
Es konnte nachgewiesen werden, dass in vitro die Geißeln der Aeromonaden als Adhäsine,
die eine Bindung an Enterozyten des Menschen ermöglichen, wirken können (KIROV et al.
2004). Die Adhäsionsfähigkeit von Aeromonas ssp. an HEp-2-Zellen korrelierte mit ihrer
Enteropathogenität. Bei der Bindung spielten filamentöse Adhäsine eine Rolle (KIROV et al.
46
Literaturübersicht
1995). Die Adhäsine von A. hydrophila banden experimentell selektiv an D-Mannose und LFukose auf Zelloberflächen (AUSTIN u. AUSTIN 1987).
Die Anzucht der Bakterien führte zu Unterschieden in deren Bindungsfähigkeit. Während
Aeromonaden, die in sehr nährstoffreichen Medien angezüchtet wurden, eine geringe
Adhäsion an den Mukus aufwiesen, zeigten Bakterien dieser Art aus weniger nährstoffreichen
Medien eine stärkere Adhäsion an den Mukus. Der Mukus kann in diesem Fall die
Kohlenstoff- und Stickstoffquelle der Bakterien darstellen (ASCENCIO et al. 1998).
Viele virulente A. hydrophila Stämme sind in der Lage, in Fischepithelzellen einzudringen.
Alle in einer Studie untersuchten virulenten Stämme konnten sich außerdem in EPC-Zellen
vermehren, jedoch keiner der avirulenten Stämme. Zytopathogene Effekte wurden von
einigen virulenten Stämmen bereits nach 30minütiger Inkubation ausgelöst, während
avirulente Stämme nicht zytopathogen waren (LEUNG et al. 1996). Verantwortlich für die
Invasion in Zellen scheinen zwei verschiedene Gruppen von Molekülen mit unterschiedlichen
Molekulargewichten zu sein (LEE et al. 1997). Das größere Molekül kann vermutlich als
Vakzine gegen Infektionen mit A. hydrophila eingesetzt werden (FANG et al. 1998). Die
Untersuchung unterschiedlich virulenter A. hydrophila Stämme ergab, dass alle Stämme den
gleichen Mechanismus zur Aufnahme in Zellen nutzen (TAN et al. 1998). In den Zellen
kommt es zu einer Neuordnung der Aktinfilamente, an der möglicherweise Mikrofilamente
beteiligt sind (LOW et al. 1998). Experimentell konnte die Beteiligung von Mikrofilamenten
an der Invasion von A. hydrophila in Zellen bestätigt werden (CHU u. LU 2005). Die
morphologischen Veränderungen in Fischzellen nach der Invasion von A. hydrophila ließen
sich in drei Phasen aufteilen. Zunächst lösten die Zellen sich voneinander und bildeten dann
durch zytoplasmatische Ausstülpungen Verbindungen zwischen einander aus. In der dritten
Phase waren in jeder Zelle bakterienhaltige Vakuolen zu erkennen, die zur Lyse der Zellen
führen konnten. Verschiedene Pili-Typen schienen mehr oder weniger an der intestinalen
Kolonisation von A. hydrophila beteiligt zu sein (KIROV et al. 2000).
E. tarda Stämme, sowohl virulente als auch avirulente, sind in der Lage, an EPC-Zellen zu
adhärieren und in diese (LING et al. 2000) sowie in HEp-2-Zellen (JANDA et al. 1991a)
einzudringen. Bei der Untersuchung von 22 Stämmen waren 92% invasiv (JANDA et al.
1991b), wobei 85% dieser Stämme Hämolysin produzierten (JANDA et al. 1991a; JANDA et
Literaturübersicht
47
al. 1991b). Virulente Stämme schienen zusätzlich über weitere Virulenzfaktoren zu verfügen,
die zu einer Erkrankung führten (LING et al. 2000). Inzwischen wurde auch ein Typ III
Sekretions-System in E. tarda gefunden, durch das Toxine in die Wirtszelle eingeschleust
werden können, die die normale Zellfunktionen stören (TAN et al. 2005). Eine Verminderung
der Infektionsrate von Grasskarpfen und Tilapien konnte durch die Verabreichung
verschiedener Polysaccharide an die Fische erreicht werden (WANG u. WANG 1997).
Viele untersuchte Y. ruckeri Stämme zeigten eine moderate Adhäsion und Invasion in eine
Salmonidenzelllinie. Eine toxische Wirkung durch die Produktion extrazellulärer Produkte,
wie Hämolysin, konnte nachgewiesen werden (ROMALDE u. TORANZO 1993). Im
Gegensatz zu Fischzellen, konnte Y. ruckeri in menschliche Zelllinien nicht eindringen
(KAWULA et al. 1996).
Material und Methoden
48
3
3.1
Material und Methoden
Bakterienstämme
Es wurden insgesamt sechs Bakterienstämme eingesetzt. Es kamen drei Stämme Aeromonas
hydrophila sowie je ein Stamm Aeromonas salmonicida, Edwardsiella tarda und Yersinia
ruckeri zum Einsatz.
3.1.1
Aeromonas hydrophila
Die A. hydrophila Stämme 42 und 60 wurden vom Institut für Veterinärmikrobiologie,
Frederiksberg, Dänemark, zur Verfügung gestellt. Die biochemischen Eigenschaften der
beiden Stämme sind der Tabelle 3.1 zu entnehmen. Stamm 38 wurde vom Friedrich-LöfflerInstitut, Insel Riems, zur Verfügung gestellt. Über die biochemischen Eigenschaften dieses
Stammes war nichts bekannt.
3.1.2
Aeromonas salmonicida, Edwardsiella tarda, Yersinia ruckeri
Bei A. salmonicida, E. tarda und Y. ruckeri handelt es sich um Feldisolate, die im
Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit aus
eingesandtem Probenmaterial isoliert und für die Versuche zur Verfügung gestellt wurden.
Über die biochemischen Eigenschaften dieser Bakterien war nichts bekannt.
Material und Methoden
49
Tabelle 3.1: Biochemische Eigenschaften von A. hydrophila 42 und 60 (Nielsen 2005,
persönliche Mitteilung)
Biochemische Reaktion
Gramfärbung
Beweglichkeit
Hämolyse
Oxidase
Katalase
Hugh & Leifson
Decarboxylase: Arginin
Decarboxylase: Lysin
Decarboxylase: Ornithin
Urea
Triple Sugar Iron
Simmon´s Citrat
Indol
Voges-Proskauer
Äskulin
Gasbildung aus Glukose
Säure aus Arabinose
Säure aus Zellobiose
Säure aus Sukrose
Säure aus Salicin
O-Serotyp
LPS-banding pattern (I-V)
A. hydrophila 42
+
+
+
+
fermentativ
+
gelb/gelb/keinGas/kein H2S
+
+
+
+
+
+
+
+
O9
III
3.1.3
Vermehrung und Aufbewahrung der Bakterien
3.1.3.1
Vermehrung und Einstellung der Konzentration
A. hydrophila 60
+
+
+
+
fermentativ
+
gelb/gelb/Gas/kein H2S
+
+
+
+
+
+
+
+
O 97
II
Zur Vermehrung der Bakterien wurden Blutagarplatten (s. 9.2.1 a) genutzt. Die
Bakterienstämme wurden mittels einer Platinum-Iridiumdrahtöse (Fa. Neolab, Heidelberg)
auf den Platten ausgestrichen. Alle Bakterien wurden bei 25°C im Brutschrank bebrütet,
wobei A. hydrophila, E. tarda und Y. ruckeri bereits nach 24 Stunden ein deutliches
Material und Methoden
50
Keimwachstum zeigten. A. salmonicida benötigte eine Bebrütungszeit von zwei bis drei
Tagen, bis Kolonien zu erkennen waren. Die Kolonien wurden von der Agarplatte gelöst,
indem auf jede Platte eine geringe Menge Kalbsboullion (Veal-Infusion-Broth, Fa. Otto Nord
Wald GmbH, Hamburg, s. auch 9.2.1 b) mittels Pasteurpipette aufgebracht wurde und die
Kolonien durch Verstreichen mit einem Drigalskispatel (Fa. Roth, Karlsruhe) in dem Medium
suspendiert wurden. Das mit Bakterien angereicherte Medium wurde je Blutagarplatte in zehn
Milliliter Kalbsboullion überführt. Zur Bestimmung der Bakterienkonzentration wurden
Verdünnungsreihen angelegt. Dabei wurden die Bakteriensuspensionen mit einem
Verdünnungsmedium (s. 9.2.1 c) versetzt. Nach dem Ausstreichen auf Blutagarplatten und
der Bebrütung für die entsprechende Zeit wurde die Anzahl der koloniebildenden Einheiten
pro Milliliter ermittelt. Zusätzlich wurde die Lichtabsorption der Bakteriensuspensionen bei
620nm im Spektrophotometer (FluoStar Optima, Fa. BMG Labotech, Offenburg)
photometrisch bestimmt. Die Bakteriensuspensionen wurden mittels Kalbsboullion auf eine
Konzentration von 109 KbE pro Milliliter eingestellt und zu Aliquots von je einem Milliliter
in Reaktionsgefäße (Fa. Eppendorf, Hamburg) abgefüllt.
3.1.3.2
Aufbewahrung
Die Lagerung der Bakteriensuspensionen fand bei -80°C zu Aliquots von je einem Milliliter
in Kalbsboullion statt. Nach dem Auftauen wurden die Bakteriensuspensionen sofort
verwendet und nicht erneut eingefroren. Mögliche Reste wurden verworfen.
3.1.4
3.1.4.1
Charakterisierung der Bakterienstämme
Biochemische Untersuchung
Die Bestimmung der biochemischen Eigenschaften der drei eingesetzten A. hydrophila
Stämme wurde mittels des gebrauchsfertigen Testsystems Api® 20 NE (Fa. Bio Merieux,
Frankreich) durchgeführt. Das Testsystem wurde mit einen Tag alten Kolonien beimpft. Die
Material und Methoden
51
Inkubation fand bei 30°C im Brutschrank statt. Die Auswertung erfolgte nach 24 und
nochmals nach 48 Stunden mittels der vom Testhersteller bereitgestellten Codierlisten.
3.1.4.2
Hämagglutinationstest
Einige Bakterien haben die Eigenschaft, an Erythrozyten zu adsorbieren, was zu einer
Vernetzung der Erythrozyten (Hämagglutination) führt, wodurch deren Sedimentation am
Boden des Reaktionsgefäßes verhindert wird (s. Abb. 3.1). Diese Eigenschaft wird als
Pathogenitätsmerkmal von Bakterien angesehen. Durch das Anlegen einer Verdünnungsreihe
der Bakteriensuspensionen lässt sich das Ausmaß der Fähigkeit der Bakterien zur Adsorption
an Erythrozyten leicht abschätzen.
Zur Bestimmung hämagglutinierender Eigenschaften der eingesetzten Bakterienstämme
wurde Blut von parasiten- und virusfrei aufgezogenen Karpfen, die ein durchschnittliches
Gewicht von 100 Gramm aufwiesen, entnommen. Jedes Tier wurde in einer Konzentration
von 0,15 Gramm Tricain (MS 222, Fa. Sigma, München) pro Liter Wasser sediert. Jedem
Fisch wurde etwa ein Milliliter Blut mittels einer Spritze entnommen, die einen Milliliter
Alzeversche Lösung (s. 9.2.1 d) enthielt. Das Blut wurde bei 755 g in einer Zentrifuge
(Megafuge 1.0 R, Fa. Heraeus, Hanau) für zehn Minuten bei 4°C zentrifugiert. Das Plasma
sowie die Leukozytenschicht wurden verworfen. Die Erythrozyten wurden in Alzeverscher
Lösung resuspendiert und nach zweimaliger Wiederholung dieses Waschvorgangs in
Alzeverscher Lösung mit 10% Erythrozyten bei 4°C für maximal drei Tage gelagert. Für den
Hämagglutinationstest wurde eine 1%ige Suspension verwendet, die jeweils frisch angesetzt
wurde.
In eine Mikrotiterplatte mit 96 U-förmigen Vertiefungen (Fa. Greiner Labortechnik, Solingen)
wurden jeweils in die erste Vertiefung einer Längsreihe 100µl der entsprechenden
Bakteriensuspensionen (109 KbE/ml) gegeben. In die weiteren Vertiefungen der
entsprechenden Reihen wurden je 50µl PBS-Puffer (Fa. PAA, Pasching) vorgelegt.
Ausgehend von der ersten Vertiefung wurde die Bakteriensuspension durch Überführen von
jeweils 50µl in die folgenden Vertiefungen verdünnt. Aus der letzten Vertiefung wurden 50µl
verworfen. Als Kontrolle diente PBS-Puffer, der anstelle der Bakterien in drei Vertiefungen
Material und Methoden
52
gegeben wurde. Anschließend wurde in jede Vertiefung eine Menge von 50µl der 1%igen
Erythrozytensuspension pipettiert und die Mikrotiterplatte eine Stunde bei 4°C inkubiert. Die
Auswertung der Hämagglutination fand im Anschluss statt. Die agglutinierten Proben ließen
sich an der Ausbildung eines gleichmäßigen Niederschlags erkennen. Wenn keine
Agglutination stattgefunden hatte, rollten die Erythrozyten in Form eines Punktes in der Mitte
des Bodens der Vertiefung zusammen. Die Erythrozyten, die zusammen mit PBS-Puffer in
die Vertiefungen gegeben wurden, dienten als Kontrolle und sollten keine Hämagglutination
erkennen lassen. Durch das Auszählen der Verdünnungsstufe, die noch zu einer
Hämagglutination
führte,
ließ
sich
der
Titer
der
Ausgangssuspension
in
Hämagglutinationseinheiten (HAE) ausdrücken. Eine HAE ist definiert als Antigenmenge, die
50% der Erythrozyten in einer Vertiefung agglutinieren kann. Der reziproke Wert der
Verdünnung, die gerade noch agglutinierend wirkt, wird als HA-Titer angegeben
(BURKHARDT 1992; QUINN et al. 1994).
Abbildung 3.1: Prinzip des HA-Testes
Erythrozyten
3.1.4.3
Bakterien
Hämagglutination
CAMP-Test
Manche Bakterien, darunter auch einige A. hydrophila Stämme, sind in der Lage die partielle
Hämolysezone eines β-hämolysierenden Staphylokokkenstammes (Staphylococcus aureus) zu
verstärken. Diese Bakterien bilden eine thermolabile Substanz, die zusammen mit dem βHämolysin der Staphylokokken eine typische, keilförmige Aufhellung der Blutagarplatte
Material und Methoden
53
durch Lysis der Erythrozyten ergibt. Dieses Phänomen wird nach den Entdeckern Christi,
Aktins, Munch und Peterson (CHRISTIE et al. 1944) als CAMP-Test bezeichnet.
Ein β-hämolysierender Staphylokokkenstamm wurde in einem breiten Impfstrich quer auf
einer Blutagarplatte ausgestrichen. Die zu testenden Bakterien, in diesem Fall die
A. hydrophila Stämme, wurden im rechten Winkel von der Peripherie her so auf der
Agarplatte inokuliert, dass deren Impfstriche knapp vor dem des Staphylokokkenstammes
endeten. Der Test war positiv, wenn eine vollständige, keilförmige Hämolyse im Bereich, an
dem beide Bakterienstämme aufeinander trafen, entstand. Das Testergebnis war negativ, wenn
keine Hämolyse oder eine Hämolyse ohne die typische Keilbildung entstand (s. Abb. 3.2).
Die Auswertung erfolgte nach einer Bebrütungszeit von 24 Stunden bei 37°C im Brutschrank
(BURKHARDT 1992; QUINN et al. 1994).
Abbildung 3.2: Prinzip des CAMP-Testes
Staphylococcus aureus
(unvollständige
Hämolyse)
Teststämme
positive CAMP-Reaktion
negative CAMPReaktion
3.1.4.4
Zytotoxizität in vitro
Für die Untersuchung der Interaktion von Bakterien mit Zellen wurden Epithelioma
papulosum cyprini-Zellen (EPC-Zellen) eingesetzt (FIJAN et al. 1983). Die Zelllinie stammt
von einem durch Herpesviren induzierten Papillom der Haut von Karpfen. Die Zellen wurden
als adhärente Kultur in Zellkulturflaschen (Fa. Nunc, Wiesbaden) in Zellkulturmedium nach
Earl (s. 9.2.1 e) bei 25°C gehalten. Sie wurden im Abstand von zwei bis drei Tagen vermehrt,
54
Material und Methoden
indem sie durch Einwirkung von Trypsin (s. 9.2.1 f) von ihrer Unterlage gelöst wurden und
im Verhältnis von 1:4 in neue Zellkulturflaschen umgesetzt wurden. Nach etwa zwei Tagen
bildeten die Zellen einen geschlossenen Zellrasen, einen Monolayer. Dieser wurde entweder
zur weiteren Vermehrung genutzt oder für Zellversuche herangezogen.
Für die Versuche wurden EPC-Zellen in Gewebekulturplatten mit 24 Vertiefungen (Fa. Nunc,
Wiesbaden) ausgesät. Hierfür wurden die Zellen mittels Trypsin vom Boden der Zellflasche
gelöst und in Zellkulturmedium aufgenommen. Die Suspension wurde bei 115 g und 25°C für
zehn Minuten in einer Zentrifuge (Megafuge, 1.0 RS, Fa. Heraeus, Hanau) zentrifugiert und
in zehn Millilitern Zellkulturmedium resuspendiert. Die Zellzahl wurde in einer Zählkammer
nach Neubauer (Fa. Omnilab, Bremen) bestimmt und auf eine Konzentration von 300.000
Zellen pro Milliliter mittels Zellkulturmedium eingestellt. In jede der Vertiefungen der
Gewebekulturplatte wurde ein Milliliter der Zellsuspension gegeben. Nach ein- bis
zweitägiger Inkubation im Brutschrank bei 25°C und einem Zusatz von 5%CO2 waren
geschlossene Zellrasen zu erkennen, die weiterverwendet werden konnten.
Alle eingesetzten Bakterien wurden in vitro auf ihre Toxizität für Zellen untersucht. Nach
Entfernung des Zellkulturmediums wurde in jede Vertiefung der Gewebekulturplatte ein
Milliliter der entsprechenden Bakteriensuspension in Konzentrationen von 105 (nur
A. hydrophila) bis 107 KbE pro Milliliter (alle Bakterien) gegeben. Die Zellen wurden zwei,
sechs und 24 Stunden nach Zugabe der Bakterien mikroskopisch (Mikroskop, Fa. Zeiss,
Oberkochen) untersucht und fotografiert.
Material und Methoden
3.2
55
Infektion von Karpfen mit A. hydrophila
3.2.1
Versuchstiere
Für die Gewinnung von unbehandeltem Darmmukus sowie für die Infektionsversuche wurden
parasiten- und virusfrei aufgezogene Geschwistertiere des Karpfenstammes R8F8 x R3F8
(Cyprinus carpio) genutzt. Diese wurden im September 2002 als befruchtete Eier von der
Universität
Wageningen,
Niederlande,
bezogen
und
waren
zum
Zeitpunkt
der
Untersuchungen drei bis vier Jahre alt. Die Fische wurden in der Abteilung Fischkrankheiten
und Fischhaltung der Tierärztlichen Hochschule Hannover unter Laborbedingungen
aufgezogen. Die Haltung fand in der eigenen Rezirkulationsanlage statt. Zur Fütterung der
Karpfen wurde handelsübliches Karpfenfutter (Fa. Milkivit, Burgheim) verwendet, welches
einmal täglich in einer Menge von 1% des Körpergewichts der Tiere verfüttert wurde. Zum
Zeitpunkt der Probennahme wiesen die Tiere ein Körpergewicht von ca. 100 Gramm auf.
Die Versuchstiere wurden in 80 Litern fassenden Glas- oder Kunststoffbecken gehältert. Zur
Akklimatisierung wurden die Fische drei Tage vor Versuchsbeginn aus der parasiten- und
virusfreien Haltungsanlage in die Becken eingesetzt. Die Wassertemperatur betrug je nach
Versuchsansatz 17 bis 25°C. Es fand ein täglicher Teilwasserwechsel von 50% statt, welcher
mit Leitungswasser der entsprechenden Hälterungstemperatur durchgeführt wurde. Zur
Reinigung des Wassers war an jedem Becken ein Außenfilter (Fa. Eheim, Deizisau)
angeschlossen.
Eine
Belüftung
erfolgte
zusätzlich
über
Sprudelsteine,
die
an
Membranpumpen angeschlossen waren.
3.2.2
3.2.2.1
3.2.2.1.1
Applikation der Bakterien
Versuche zur Virulenzprüfung
Bakterienapplikation
Zur Festlegung der zu verabreichenden Bakterienkonzentrationen wurden verschiedene
Versuchsansätze durchgeführt (s. Tab. 3.2).
Material und Methoden
56
3.2.2.1.1.1
Intraperitoneale Applikation
Je sechs Karpfen wurde A. hydrophila 42 oder A. hydrophila 60 intraperitoneal appliziert. Je
zwei Fischen wurde eine Bakterienkonzentration von 106, 107 und 108 KbE des jeweiligem
Bakterienstammes appliziert. Die Bakteriensuspensionen wurden nach dem Auftauen
abzentrifugiert und in 0,9%iger Natriumchloridlösung resuspendiert. Anschließend wurden
die
benötigten
Konzentrationen
eingestellt.
Jedem
Tier
wurden
100µl
der
Bakteriensuspension in der entsprechenden Konzentration mittels einer Kanüle intraperitoneal
verabreicht. Die Tiere wurden über zwei Monate beobachtet.
3.2.2.1.1.2
Orale Applikation
In einem ersten Ansatz wurden zwölf Karpfen eingesetzt, die bei einer Wassertemperatur von
17°C gehältert wurden. Jeweils sechs Tieren wurde A. hydrophila 42 bzw. A. hydrophila 60
appliziert. Je Gruppe wurde zwei Fischen eine Konzentration von 106, 107 und 108 KbE
appliziert. Insgesamt wurde jedem Karpfen 200µl der Bakteriensuspension in entsprechender
Konzentration verabreicht. 100µl der Bakteriensuspension wurde mittels einer Knopfkanüle
in den Enddarm appliziert, während die restlichen 100µl ebenfalls mittels einer Knopfkanüle
oral in den Pseudogaster verabreicht wurden. Die Fische wurden über zwölf Tage beobachtet,
insbesondere im Hinblick auf Krankheitssymptome.
Der Versuch wurde in einem zweiten Ansatz analog bei einer Hälterungstemperatur von 25°C
wiederholt (s. Tab. 3.2).
In einem dritten Ansatz wurden vier Karpfen eingesetzt, von denen je zwei Tieren
A. hydrophila 38 bzw. A. hydrophila 60 in einer Konzentration von 108 KbE oral mittels einer
Knopfkanüle in den Pseudogaster appliziert wurde. Nach einer Woche bzw. nach dem Tod
der Tiere wurden Organproben für eine mikrobiologische Untersuchung gewonnen. Diese
wurden auf Blutagarplatten ausgestrichen und 24 Stunden bei 25°C bebrütet.
Material und Methoden
57
Tabelle 3.2: Übersicht über die Versuche zur Virulenzprüfung (Konz. = Konzentration)
Versuchsbedingungen
applizierter
Konz.
Bakterienstamm:
(KbE/ml):
108
A. hydrophila 38
107
106
108
A. hydrophila 42
107
106
108
A. hydrophila 60
107
106
Wassertemperatur (°C)
Versuchsdauer (Tage)
Anzahl Tiere
3.2.2.2
3.2.2.2.1
Applikationsart
i.p.
oral/anal
oral/anal
oral
2
2
2
2
2
2
20
60
12
2
2
2
2
2
2
17
12
12
2
2
2
2
2
2
25
12
12
2
2
20
7
4
Orale Applikation von A. hydrophila
Bakterienapplikation
Zum Einsatz kamen 96 Karpfen, die bei einer Wassertemperatur von 20°C gehältert wurden.
Je 32 dieser Fische wurde eine 0,9%igen Natriumchloridlösung, A. hydrophila 38 oder
A. hydrophila 60 oral mittels Knopfkanüle in den Pseudogaster appliziert. Die
Bakteriensuspensionen, die in einer Konzentration von 109 KbE pro Milliliter bei -80°C
gelagert wurden, wurden nach dem Auftauen in 0,9%iger Natriumchloridlösung
resuspendiert. Die Konzentration der Bakteriensuspensionen wurde so eingestellt, dass jedes
Tier 107 KbE erhielt. Die applizierte Flüssigkeitsmenge wurde pro Tier auf 300µl festgelegt.
Nach der Applikation wurden die Tiere bei 20°C Wassertemperatur gehältert. An Tag eins,
drei, sechs und zehn nach der Applikation wurden aus jeder Gruppe acht Fische euthanasiert
und den weiteren Analysen unterzogen.
Material und Methoden
58
3.2.3
Klinische Untersuchung und Sektion der Versuchstiere
Vor der Probennahme wurden die Tiere einzeln nacheinander in einem ein Liter Wasser
fassenden Plastikaquarium mit 0,5 Gramm Tricain (MS 222, Fa. Sigma, München) pro Liter
Wasser euthanasiert. Anschließend fanden eine adspektorische Untersuchung der Fische
sowie die Bestimmung von Gewicht und Länge statt. Nach Eröffnung der Leibeshöhle
wurden die Organe adspektorisch beurteilt.
3.2.4
Entnahme und Bearbeitung mikrobiologischer Proben
Mittels einer sterilen Öse (Fa. Neolab, Heidelberg) wurden Proben von Niere, Milz und Leber
entnommen und getrennt auf Blutagarplatten ausgestrichen. Die Platten wurden im
Brutschrank bei 25°C unter aeroben Bedingungen bebrütet. Nach 24 bis 48 Stunden war ein
Bakterienwachstum zu erkennen. Die Anzahl der koloniebildenden Einheiten wurde
semiquantitativ ausgewertet und eine eventuelle Hämolysebildung wurde bestimmt. Die
Differenzierung der Keime aufgrund ihrer biochemischen Eigenschaften erfolgte mit Hilfe
des gebrauchsfertigen Testsystems Api® 20 NE (Fa. Bio Merieux, Frankreich). Die
Inkubationszeit betrug 24 bis 48 Stunden. Die Auswertung der Reaktionsergebnisse erfolgte
mittels der vom Testhersteller bereitgestellten Codierlisten (s. auch 3.1.4.1).
3.2.5
Mukusgewinnung
Für die Mukusanalyse sowie die Bakterienadhäsionsversuche wurde der intestinale Mukus
von acht unbehandelten, parasiten- und virusfrei aufgezogenen Karpfen gewonnen. Ebenfalls
wurde der intestinale Mukus der Fische, denen A. hydrophila appliziert worden war,
gewonnen.
Der komplette Darm der Fische wurde im Rahmen der Sektion entnommen und kühl gelagert.
Jeder Darm wurde gewogen und längs eröffnet. Der gesamte Darm wurde in Stücke von ca.
zwei Millimetern zerteilt, die in Isolationsmedium (s. 9.2.2 a) gegeben wurden. Im Wasserbad
(Fa. GFL, Großburgwedel) fand bei 37°C eine Inkubation über 20 Minuten statt.
Material und Methoden
59
Währenddessen wurden die Proben alle fünf Minuten kräftig geschüttelt und anschließend
über ein Teesieb abgegossen. Der an den Darmstücken haftende Mukus wurde mittels PBSPuffer (s. 9.2.2 b) abgespült. Die Darmstücke wurden daraufhin verworfen. Das nun
mukushaltige Medium wurde in einer Ultrazentrifuge (Fa. Beckmann, München) 30 Minuten
bei 13.500 g und 4°C zentrifugiert, um Zellbestandteile und Blut zu entfernen. Der
muzinhaltige Überstand wurde bis zur weiteren Verarbeitung in Glasflaschen gefüllt und bei
-20°C gelagert.
3.3
Mukusanalyse
3.3.1
Konzentrierung des Mukus
Für eine weitergehende Analyse wurden die Mukusproben zunächst mittels Ultrafiltration
konzentriert. Hierfür wurden die Proben in eine 200 Milliliter fassende Ultrafiltrationszelle
(Fa. Amicon, Schwalbach) mit einer Membran mit einem molekularen Ausschlussgewicht
von 30.000 Dalton (Fa. Millipore, Schwalbach) gegeben. Durch die Verwendung einer
Druckpumpe wurde ein Überdruck von 2,7 bar aufgebaut, wodurch die Probe durch die
Membran gepresst wurde, um das Lösungsmittel zu entfernen. Die Glykoproteine des Mukus
selber besitzen ein Molekulargewicht von mehreren Millionen Dalton, so dass sie von der
Membran zurückgehalten wurden. Nach etwa drei Stunden waren die Proben auf eine Menge
von
zwei
Millilitern
konzentriert
und
konnten
mittels
einer
Spritze
aus
der
Ultrafiltrationszelle entfernt werden. Um möglichst die gesamte Mukusmenge zu gewinnen,
wurde die Zelle mit einer geringen Menge PBS-Puffer (s. 9.2.2 c) nachgespült. Die
Flüssigkeit wurde ebenfalls in die Spritze aufgenommen, wobei darauf geachtet wurde, dass
die Menge von zwei Millilitern nicht überschritten wurde.
3.3.2
Zur
Gelchromatographie
Auftrennung
der
Glykoproteine
des
Mukus
nach
Molekülgröße
dienten
Gelchromatographiesäulen mit Sepharose-CL-4B®-Gel (Fa. Pharmacia Biotech, Uppsala,
60
Material und Methoden
Schweden und Fa. GE Healthcare, München). Die verwendeten Säulen wiesen einen
Innendurchmesser von 16 Millimetern und eine Länge von 35 bzw. 40 Zentimetern auf.
Durch unterschiedlich große Poren des Gels wurden kleinere Moleküle länger als größere in
der Säule zurückgehalten und konnten erst nach längerer Zeit aufgefangen werden, wodurch
eine Auftrennung der Moleküle erfolgte.
3.3.2.1
Vorbereitung der Chromatographiesäule
Das Sepharosegel (Fa. Sigma, München) wurde vorgequollen in 20%igem Ethanol geliefert.
Nach Abwiegen der benötigten Menge von 60 Gramm wurde das Gel mehrmals mit
0,01molarem Phosphatpuffer (s. 9.2.2 c) gewaschen, um Ethanolreste zu entfernen. Durch
Unterdruck wurde das Gel über mehrere Stunden entgast, damit keine störenden gasgefüllten
Hohlräume in der Säule entstehen konnten. Das Sepharosegel wurde im Verhältnis von 3:1
mit dem Phosphatpuffer gemischt und in die Säule gefüllt. Mittels einer Peristaltikpumpe (Fa.
Pharmacia Biotech, Uppsala, Schweden) wurde die Säule bei einer Fließgeschwindigkeit von
13 Millilitern Phosphatpuffer (s. 9.2.2 c) pro Stunde über 18 Stunden fest gepackt. Das
errechnete Gelbettvolumen betrug 44,8 Milliliter.
3.3.2.2
Kalibrierung der Chromatographiesäule
Um den Mukusfraktionen des intestinalen Schleims der Karpfen, die nach der
Gelchromatographie aufgesammelt werden konnten, ein Molekulargewicht zuordnen zu
können, wurden zur Kalibrierung der Gelchromatographiesäule drei Markersubstanzen mit
bekannter Molekülgröße verwendet. Als Marker dienten Bovines Serumalbumin (Fa. Roth,
Karlsruhe), Thyroglobulin (Fa. Sigma, München) sowie Schweinemagenmuzin (Fa. Sigma,
München). Die Marker wurden in den in Tabelle 3.3 angegebenen Mengen in PBS-Puffer
gelöst und in Mengen von je zwei Millilitern auf die Chromatographiesäule gegeben. Mittels
der angeschlossenen Peristaltikpumpe wurde die Säule mit Phosphatpuffer eluiert. Zur
Detektion der Marker diente im Falle von Bovinem Serumalbumin und Thyroglobulin die
Bradford-Reaktion zur Bestimmung des Proteingehaltes der gewonnenen Fraktionen, da bei
Material und Methoden
61
diesen Substanzen der Proteinanteil überwiegt. Das Schweinemagenmuzin wurde aufgrund
seines
hohen
Kohlenhydratgehaltes
mittels
der
PAS-Reaktion
(Nachweis
des
Kohlenhydratgehaltes) bestimmt.
Tabelle 3.3: Molekulargewichte und eingesetzte Mengen der Markersubstanzen
Marker
Molekülgröße (kDa)
Schweinemagenmuzin
Thyroglobulin
Bovines Serumalbumin
3.3.2.3
>2000
670
69
Eingesetzte Menge pro ml
Phosphatpuffer (pH 8)
2,5mg
1,5mg
0,5mg
Auftrennung der Mukusproben
Die Proben wurden einzeln nacheinander auf die Sepharosesäule aufgetragen. Mittels der an
die Säule angeschlossenen Peristaltikpumpe wurden 5,2 Milliliter eines 0,01molaren
Phosphatpuffers (s.9.2.2 c) in der Stunde durch die Säule geleitet. Die Auftrennung dauerte
für jede Probe etwa zehn Stunden. Ein der Säule nachgeschalteter Fraktionssammler (Fa.
BioRad, München) erstellte während dieser Zeit alle 15 Minuten eine neue Fraktion, so dass
jede Probe in 40 Fraktionen zu je 1,3 Millilitern aufgetrennt werden konnte.
3.3.3
Photometrische Muzinquantifizierung
Für die photometrische Mukusanalyse mittels PAS- und Bradford-Reaktion wurden pro
Fraktion und Reaktion drei Aliquots in Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Fa. Nunc,
Wiesbaden) pipettiert. Das Restvolumen der Fraktionen wurde bis zum weiteren Gebrauch bei
-20°C gelagert.
62
3.3.3.1
Material und Methoden
PAS-Reaktion zur Bestimmung des Kohlenhydratgehaltes
Der Gehalt einer Lösung an Zuckerresten auf Glykokonjugaten kann mittels der PASReaktion nachgewiesen werden (MANTLE u. ALLEN 1978). Durch eine Perjodatoxidation
entstehen freie Aldehydgruppen, welche nach Zugabe von Schiff-Reagenz einen roten
Farbstoffkomplex bilden. Zu 150µl jeder Fraktion wurden 50µl Perjodessigsäure (s. 9.2.2 d)
in eine Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen (Fa. Nunc, Wiesbaden) gegeben. Als
Positivkontrolle diente Schweinemagenmuzin in einer Konzentration von 0,2 Milligramm pro
Milliliter, als Negativkontrolle 0,01molarer Phosphatpuffer. Die Platte wurde 30 Minuten bei
37°C im Brutschrank inkubiert. Dann erfolgte die Zugabe von 50µl Schiff´schen Reagenz
(Fa. Sigma, München) und eine Inkubation bei Zimmertemperatur im Dunkeln für weitere 30
Minuten. Die Extinktion wurde im Spektrophotometer (FluoStar Optima, Fa. BMG Labtech,
Offenburg) bei einer Wellenlänge von 560nm gemessen.
3.3.3.2
Bradford-Reaktion zur Bestimmung des Proteingehaltes
Der Proteingehalt der einzelnen Fraktionen wurde mittels Bradford-Reaktion (BRADFORD
1976) ermittelt. Aus jeder Fraktion wurden 50µl mit 200µl Bradford-Gebrauchslösung (s.
9.2.2 e) in eine Mikrotiterplatte gegeben. Als Positivkontrolle diente Bovines Serumalbumin
in einer Konzentration von 0,2 Milligramm pro Milliliter, als Negativkontrolle 0,01molarer
Phosphatpuffer. Die Platte wurde für zehn Minuten bei Raumtemperatur im Dunkeln
inkubiert. Anschließend wurde die Extinktion im Spektrophotometer (FluoStar Optima, Fa.
BMG Labtech, Offenburg) bei einer Wellenlänge von 580nm ermittelt.
3.3.3.3
Darstellung der Ergebnisse der Muzinanalyse
Die graphischen Darstellungen der für die einzelnen Fraktionen ermittelten Extinktionswerte
ergaben sowohl für die PAS- wie auch für die Bradford-Reaktion Elutionsprofile, die zwei
deutliche Gipfel (Peaks) aufwiesen. Anhand dieser Elutionsprofile wurden Fraktionen für
weitere Untersuchungen zu drei Fraktionspools zusammengefasst, wobei der erste Pool aus
den Fraktionen, in denen der erste Peak zu finden war, gebildet wurde, der zweite Pool
Material und Methoden
63
beinhaltete die Fraktionen des Bereiches zwischen den beiden Peaks (Schulterbereich) und
der dritte Pool die Fraktionen des zweiten Peaks.
3.3.3.4
Der
Bestimmung des Muzingehalts
Muzingehalt
der
Proben
wurde
errechnet
aus
den
Extinktionswerten
der
Kohlenhydratfärbung. Zur Berechnung wurde der bekannte Extinktionswert einer fünf
Milligramm enthaltenen Schweinemagemuzin-Lösung verwendet. Der Muzingehalt wurde in
Milligramm pro Milliliter angegeben.
3.3.4
Bestimmung der terminalen Glykosilierung an Glykokonjugaten in
Mukusproben
Um Aufschluss über die Kohlenhydratseitenketten von Glykokonjugaten in den
Schleimproben zu erhalten, wurde die Bindung von Lektinen an Glykokonjugate in den
Mukusproben mittels eines ELISA-Verfahrens ermittelt (s. Abb. 3.3). Die Durchführung
erfolgte anlehnend an eine frühere Studie (ENSS et al. 1995). Die Lektine, die zum Einsatz
kamen (DBA, RCA, SNA, UEA: Fa. Vector Laboratories, Burlingame/USA; ConA: Fa.
Sigma, München) und ihre Kohlenhydratspezifität sind Tabelle 3.4 zu entnehmen.
Tabelle 3.4: Eingesetzte Lektine und deren Kohlenhydratspezifität
Lektin (biotinyliert)
Concanavalia ensiformes-Agglutinin
Dolchios biflorus-Agglutinin
Ricinus communis-Agglutinin
Abkürzung
ConA
DBA
RCA
Sambucus nigra-Agglutinin
SNA
Ulex europaeus-Agglutinin 1
UEA 1
Spezifisches Kohlenhydrat
α-D-Mannose, α-D-Glukose
N-Acetyl-α-D-Galaktosamin
N-Acetyl-b-D-Galaktose
N-Acetyl-Neuraminsäure-α-2-6Galaktose
α-L-Fukose
64
Material und Methoden
Die feste Phase des ELISA bildeten Mikrotiterplatten mit 96 Vertiefungen (Fa. Nunc,
Wiesbaden), an die über Nacht in Coating Puffer (s. 9.2.3 a) gelöste Schleimmoleküle der
beiden Peaks sowie des Schulterbereiches gebunden wurden. Von jedem Pool wurden drei
Aliquots eingesetzt. Nach dreimaligem Waschen der Mikrotiterplatte mittels Waschpuffer (s.
9.2.3 b) wurden unspezifische Bindungsstellen durch eine einstündige Inkubation der Platte
mit 0,5%iger BSA-Lösung abgesättigt. Nach erneutem Waschen wurden die entsprechenden
Lektine in einer 1:1000 Verdünnung in Verdünnungspuffer (s. 9.2.3 c) in die Vertiefungen der
Platte gegeben und eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert. Anschließend an weitere drei
Waschschritte folgte die Inkubation mit einem Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase-Komplex
(Fa. Dako, Hamburg, Konjugatlösung, s. auch 9.2.3 d) für 30 Minuten. Nach dem Waschen
wurden die Platten mit der Substratlösung (s. 9.2.3 e), die Ortho-Phenyl-Diamin (OPD; OPDTabletten, Dako, Hamburg) und Wasserstoffperoxid (Fa. AppliChem, Darmstadt) enthielt, für
weitere 15 Minuten inkubiert. Die Reaktion wurde nach dieser Zeit durch Zugabe von
0,5molarer Schwefelsäure (Fa. Merck, Darmstadt) gestoppt und die Extinktionswerte im
Spektrophotometer (FluoStar Optima, Fa. BMG Labtech, Offenburg) bei einer Wellenlänge
von 492nm ermittelt.
Abbildung 3.3: Prinzip des Lektin-ELISA
Farbkomplex
Streptavidin-Meerrettich-PeroxidaseKomplex
Lektin (biotinyliert)
Mukus-Glykoprotein
Mikrotiterplatte
Material und Methoden
3.3.5
65
Bestimmung des adsorbierten Lysozymgehaltes an Glykokonjugaten
Lysozym (Synonym: Muramidase) ist ein Enzym, welches die Muraminschicht bakterieller
Infektionserreger zerstört und so als Bestandteil der unspezifischen Immunabwehr fungiert.
Lysozym besitzt ein Molekulargewicht von ca. 14.300 Dalton.
Zur Bestimmung von an Schleimproben absorbiertem Lysozym wurden 25µl jedes
Fraktionspools mit 175µl einer Suspension aus zwei Milligramm des Bakteriums
Micrococcus luteus (Fa. Sigma, München) in 0,05molarem Natriumphosphatpuffer (s. 9.2.2 f)
versetzt. Dreißig Sekunden bis zehn Minuten nach Zugabe der Mukusproben wurde die
optische Dichte der Lösung alle dreißig Sekunden im Photometer (Fa. Barloword Scientific
T/As Jenway, Essex/England) bestimmt. Eine Abnahme der OD-Werte – bedingt durch den
lysozymalen Abbau der Bakterien – wurde als Kennzeichen für eine Lysozymaktivität
gewertet. Als Negativkontrolle diente 0,01molarer PBS-Puffer, als Positivkontrolle eine
Lösung aus 480 Units Hühnereiweiß-Lysozym („Henn Egg White Lysozyme“, Fa. Sigma,
München) pro Milliliter. Zur Kontrolle der Versuchsanordnung wurde eine Verdünnungsreihe
des Hühnereiweiß-Lysozyms angesetzt. Die Messung der OD-Werte erfolgte mit
Konzentrationen von 48 bis 4800 Units Hühnereiweiß-Lysozym pro Milliliter.
3.4
Bakterienadhäsion an Mukusproben
3.4.1
3.4.1.1
3.4.1.1.1
Validierung der Methode
Markierung der Bakterien
Vergleich verschiedener Konzentrationen des Fluoreszenzfarbstoffs
Für die Markierung der Bakterien wurde der Fluoreszenzfarbstoff Syto® 9 (Fa. MoBiTec,
Göttingen) eingesetzt. Er wurde in Konzentrationen zwischen 1µmol/l und 100µmol/l geprüft,
um zu gewährleisten, dass eine optimale Markierung der Bakterien bei möglichst geringer
Farbstoffkonzentration gegeben war.
Material und Methoden
66
Die Bakteriensuspensionen wurden aufgetaut und bei 17.000 g in einer Zentrifuge (Biofuge
A, Fa. Heraeus, Hanau) für zehn Minuten abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen
und die Bakterien wurden in einem Milliliter 0,9%iger Natriumchloridlösung resuspendiert.
Für die Versuche wurde letztlich eine Vorverdünnung des Fluoreszenzfarbstoffs Syto® 9
hergestellt, indem in 100µl 0,9%ige Natriumchloridlösung 1µl Syto® 9 gegeben wurde. Ein
Milliliter der resuspendierten Bakteriensuspensionen wurde mit 100µl der Farblösung
versetzt. Die markierten Bakteriensuspensionen wurden in eine Mikrotiterplatte mit 96
Vertiefungen gegeben und die Fluoreszenzintensität wurde in einem Spektrophotometer
(FluoStar Optima, Fa. BMG Labtech, Offenburg) bestimmt.
3.4.1.1.2
Ermittlung der Stabilität der Fluoreszenzfärbung
Um abzuklären, ob die Fluoreszenz der markierten Bakterien stabil war, wurden diese mit
dem Fluoreszenzfarbstoff Syto® 9 markiert und dunkel gelagert. Die Fluoreszenzaktivität
wurde an Tag eins, drei, sechs und zwölf nach Markierung bestimmt.
3.4.1.1.3
Vergleich der Bakterienkonzentration
Eine Verdünnungsreihe der Bakteriensuspensionen wurde angelegt, um Unterschiede in der
Fluoreszenzaktivität
bei
der
Bakterienbindung
1
zu
ermitteln.
Es
wurden
9
Bakterienkonzentrationen zwischen 10 und 10 KbE pro Milliliter verglichen.
3.4.1.1.4
Vergleich der Fluoreszenzintensitäten verschiedener Bakterienstämme
Um zu überprüfen, ob die eingesetzten, unterschiedlichen Bakterienstämme nach Markierung
mittels des Fluoreszenzfarbstoffs eine vergleichbare Fluoreszenzintensität aufweisen, wurden
alle verwendeten Stämme (A. hydrophila Stamm 38, 42 und 60; A. salmonicida; E. tarda;
Y. ruckeri)
in
einer
Konzentration
von
109
KbE
pro
Milliliter
mittels
des
Fluoreszenzfarbstoffs Syto® 9 (10µmol/l) markiert. Jeweils 50µl dieser markierten
Bakteriensuspensionen wurden in einem dreifachen Ansatz in eine Mikrotiterplatte gegeben.
Material und Methoden
67
Die Fluoreszenzaktivität wurde im Fluoreszenzphotometer (FluoStar Optima, Fa. BMG
Labtech, Offenburg) bei Wellenlängen von 470nm für die Extinktion und 520nm für die
Emission bestimmt. Für jede Platte wurde der Leerwert mitbestimmt.
3.4.1.2
Messung der Fluoreszenzintensität
3.4.1.2.1
Zur
Vergleich von Filtern im Fluoreszenzphotometer
Messung
der
Fluoreszenzintensität
wurden
Filter
mit
unterschiedlichen
Wellenlängenbereichen eingesetzt und verglichen. Für die Anregung kamen Filter mit
Wellenlängenbereichen von 450nm und 470nm zum Einsatz. Als Emissionsfilter wurden
Wellenlängen von 520nm und 590nm verglichen.
3.4.1.3
3.4.1.3.1
Adhäsion von Bakterien an Schleim
Adhäsionsversuch an Objektträger
Um abzuklären, ob die eingesetzten Bakterien an den intestinalen Mukus adhärieren, wurden
Schleimproben an beschichtete Objektträger (Super Frost®, Fa. Roth, Karlsruhe) gebunden
und die mittels Syto® 9 markierten Bakterien zugegeben. Nach Ablauf einer Inkubationszeit
von zehn bis 30 Minuten erfolgte die semiquantitative Auswertung unter dem
Fluoreszenzmikroskop (Fa. Zeiss, Oberkochen). Die Versuchsansätze sind in den Tabellen 3.5
und 3.6 dargestellt.
Versuch 1:
Auf jeweils zwei Objektträger wurden 50µl der Mukusproben gegeben und getrocknet; auf
weitere zwei Objektträger wurde der Mukus kurz vor Zugabe der Bakterien gegeben. Jeweils
50µl A. hydrophila 42 bzw. A. hydrophila 60 wurden dem Mukus zugegeben und eine Stunde
im Dunkeln inkubiert.
Material und Methoden
68
Tabelle 3.5: Ansatz Adhäsion an Objektträger (OT), Versuchsansatz 1
Bakterienstamm
A. hydrophila 42
A. hydrophila 60
Mukus frisch
2 OT
2 OT
Mukus getrocknet
2 OT
2 OT
Versuch 2:
Der Mukus wurde kurz vor Zugabe der Bakterien auf die Objektträger gegeben. Jeweils 50µl
A. hydrophila 42 bzw. A. hydrophila 60 wurden auf den gebundenen Mukus pipettiert und
zehn, 20 und 30 Minuten im Dunkeln inkubiert.
Tabelle 3.6: Ansatz Adhäsion an Objektträger (OT), Versuchsansatz 2
Bakterienstamm
A. hydrophila 42
A. hydrophila 60
3.4.1.3.2
Inkubationszeit (min)
10
2 OT
2 OT
20
2 OT
2 OT
30
2 OT
2 OT
Adhäsionsversuch in Mikrotiterplatten
Für die Adhäsion von Bakterien an in Mikrotiterplatten gebundenen Mukus wurden zwei
unterschiedliche schwarz gefärbte Platten verglichen. Zum Einsatz kamen Mikrotiterplatten
mit Maxisorp®- (Fa. Nunc, Wiesbaden) und Nunclon®-Beschichtung (Fa. Nunc, Wiesbaden).
Maxisorp®-Platten werden für immunologische Untersuchungen verwendet, während
Nunclon®-Platten bei der Arbeit mit Zellkulturen eingesetzt werden.
Inkubationszeiten:
Inkubationszeiten für die Adhäsion der Bakterien an den Mukus zwischen zehn Minuten und
zwei Stunden wurden verglichen.
Material und Methoden
69
Schleimkonzentration:
Eine Verdünnungsreihe der Mukusproben wurde angelegt, um die Unterschiede in der
Fluoreszenzaktivität bei der Bakterienbindung zu ermitteln. Es kamen Mengen von 0,1µl bis
100µl Mukuslösung in PBS-Puffer (Gesamtvolumen: 100µl) pro Vertiefung zum Einsatz.
3.4.2
Adhäsion an intestinalen Mukus unbehandelter Karpfen
Mittels Coating Puffer (s. 9.2.3) wurden 25µl der Mukusproben über Nacht in einer feuchten
Kammer an die Mikrotiterplatten gebunden. Als Kontrollen dienten Bovines Serumalbumin
(BSA) in einer Konzentration von einem Milligramm pro Milliliter, an welches die Bakterien
stark adhärieren, sowie Schweinemagenmuzin (SMM) in einer Konzentration von fünf
Milligramm pro Milliliter, welches zu einer schwächeren Adhäsion führt.
Nach dreimaligem Waschen der Mikrotiterplatten mit Waschpuffer wurden in jede Vertiefung
der Platte 25µl der markierten Bakteriensuspension zugegeben und bis zu einer
Geschwindigkeit von 163 g in einer Zentrifuge (Megafuge 1.0 R, Fa. Heraeus, Hanau)
zentrifugiert. Die Platte wurde daraufhin eine halbe Stunde bei Raumtemperatur im Dunkeln
inkubiert. Anschließend wurde die Platte mit 0,9%iger Natriumchloridlösung gewaschen. Um
alle nicht am Mukus anhaftenden Bakterien zu entfernen, wurde die Platte umgedreht bis zu
einer Geschwindigkeit von 163 g zentrifugiert. Die Vertiefungen wurden mit 50µl 0,9%iger
Natriumchloridlösung aufgefüllt und die Platte erneut bis zu einer Geschwindigkeit von 163 g
zentrifugiert, um eine eventuelle Bildung von Luftblasen, die sich störend auf die Messung
auswirken
könnten,
auszuschließen.
Die
Fluoreszenzaktivität
wurde
im
Fluoreszenzphotometer (FluoStar Optima, Fa. BMG Labtech, Offenburg) bei Wellenlängen
von 470nm für die Extinktion und 520nm für die Emission bestimmt. Für jede Platte wurde
der Leerwert mitbestimmt.
Material und Methoden
70
3.4.3
Adhäsion an Mukus von Karpfen nach oraler Bakterienapplikation
An den intestinalen Mukus der einer Bakterienapplikation unterzogenen Karpfen wurde
analog zu 3.4.2 die Bindung von A. hydrophila 38 und 60 ermittelt.
3.4.4
Adhäsion an intestinalen Mukus von Karpfen nach singulärer oraler LPSApplikation
Im Rahmen einer anderen Studie (NEUHAUS 2005) wurden Karpfen einer singulären, oralen
LPS-Applikation unterzogen. Den Tieren wurden 150µg pro Gramm Körpergewicht LPS
(Lipopolysaccharid von Escherichia coli, Fa. Sigma, München) verabreicht. Am ersten,
zweiten, dritten, fünften und achten Tag nach Applikation wurde, wie in 3.2.5 bis 3.3.2
beschrieben, der intestinale Mukus gewonnen, konzentriert und nach Molekülgrößen
aufgetrennt. Anschließend wurde wie in 3.3.3 beschrieben der Kohlenhydrat- sowie der
Proteingehalt mittels der PAS- und der Bradford-Reaktion bestimmt. Die erhaltenen
Elutionsprofile wiesen zwei Peaks und einen dazwischen liegenden Schulterbereich auf. Die
Fraktionen, in denen der erste Peak lag, die des Schulterbereichs und die des zweiten Peaks
wurden jeweils gepoolt. Zur Untersuchung der Adhäsionsfähigkeit von Bakterien an den
intestinalen Mukus aus dem Darm der mit LPS vorbehandelten Fische wurden die drei
Fraktionspools verwendet. Untersucht wurden Fraktionspools von vier Fischen je Versuchstag
und die entsprechenden Mukusproben der Kontrolltiere wie in 3.4.2 beschrieben.
3.4.5
Untersuchung möglicher Bindungsstellen bei der Adhäsion von Bakterien
an intestinalen Mukus
3.4.5.1
Vorinkubation der Mukusproben mit Enzymen
Zur Abspaltung bestimmter Kohlenhydratseitenketten wurden die Mukusproben mit
unterschiedlichen Glykosidasen vorinkubiert. Die Glykosidasen wurden jeweils 30 Minuten
bei
der
entsprechenden
Reaktionstemperatur
zugesetzt.
Anschließend
wurde
die
Glykosidasewirkung bei einer höheren Temperatur gestoppt. Die Glykosidasen (Fa. Sigma,
Material und Methoden
71
München) sowie die Reaktionsbedingungen sind Tabelle 3.7 zu entnehmen. Nach der
Einwirkung der Glykosidasen wurden die Mukusproben analog wie in 3.4.2 beschrieben,
verwendet, um die Adhäsionsfähigkeit verschiedener Bakterien an die so behandelten
Mukusproben zu prüfen. Als Kontrolle dienten in diesem Fall die nur mit dem entsprechenden
Puffer ohne Zusatz von Glykosidasen versetzten Schleimproben. Die Zusammensetzung der
Verdünnungspuffer ist dem Anhang (9.2.4 a und b) zu entnehmen.
Tabelle 3.7: Eingesetzte Glykosidasen: Reaktionsbedingungen
Units/ml
Mukus
Glykosidase
Acetyl-Glukosaminidase
0,25
β-Galaktosidase
0,25
Mannosidase
Neuraminidase
0,05
0,2
3.4.5.2
Verdünnungspuffer
PBS-Puffer
(Fa. PAA, Pasching)
PBS-Puffer
(Fa. PAA, Pasching)
Natriumacetatpuffer
Natriumacetatpuffer
pH- Reaktions- ReaktionsstopWert temperatur Temperatur
7,3
25°C
37°C
7,3
37°C
45°C
4,5
5,0
25°C
37°C
37°C
45°C
Vorinkubation der Bakterien mit Oligosacchariden
Um mögliche Bindungsstellen der Bakterien für Kohlenhydrate abzusättigen, wurden die
Bakterien mit verschiedenen Oligosacchariden eine Stunde bei Raumtemperatur inkubiert
(THOMAS u. BROOKS 2004). Anschließend wurden die Bakteriensuspensionen durch
Zentrifugation bei 17.000 g in einer Zentrifuge (Biofuge A, Fa. Heraeus, Hanau) für zehn
Minuten aufgereinigt. Die verwendeten Oligosaccharide (Fa. Sigma, München) sowie die
Reaktionsbedingungen sind Tabelle 3.8 zu entnehmen. Nach der Inkubation der Bakterien mit
den Oligosacchariden wurden die Bakteriensuspensionen analog wie in 3.4.2 beschrieben,
verwendet, um die Adhäsionsfähigkeit an den Mukus zu überprüfen. Als Kontrolle dienten in
diesem Fall die nur mit Natriumphosphatpuffer ohne Zusatz von Oligosacchariden versetzten
Bakteriensuspensionen.
Material und Methoden
72
Tabelle 3.8: Eingesetzte Oligosaccharide: Reaktionsbedingungen
Oligosaccharid
N-Acetyl-Galaktosamin
N-Acetyl-Neuraminosyl-D-LA
2-Fukosyl-D-laktose
4-OB-D-Galaktopyranosyl
Mannose
3.5
Menge in mM/ml Mukus
1,5
0,05
0,15
1,5
140
Verdünnungspuffer
Natriumphosphatpuffer
Natriumphosphatpuffer
Natriumphosphatpuffer
Natriumphosphatpuffer
Natriumphosphatpuffer
Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung erfolgte mit dem Programm Sigmastat® der Firma SPSS Science,
Chicago, Version 2.02.0 (©1992-1997 SPSS Inc.). Zunächst wurde ein t-Test durchgeführt,
um zu belegen, dass die Karpfen aus derselben Grundgesamtheit stammten.
Zur Bestimmung signifikanter Unterschiede der Mukusanalyse wurden alle biochemischen
Messwerte dem Kruskal-Wallis-Test für nicht normalverteilte Messergebnisse unterzogen.
Unterschiede zwischen den Versuchsgruppen wurden bei einem p-Wert unter 0,05 als
signifikant und bei einem p-Wert unter 0,001 als hochsignifikant bewertet.
Die Ergebnisse der teminalen Glykosilierung und die Adhäsionsfähigkeiten der Bakterien
wurden auf die gleiche Weise geprüft.
Ergebnisse
4
4.1
4.1.1
73
Ergebnisse
Charakterisierung der eingesetzten A. hydrophila Stämme
Biochemische Reaktionen
Die Auswertung der Reaktionsergebnisse des Api® 20 NE Systems ergab für A. hydrophila 42
und 60 eine Wahrscheinlichkeit von 97,9%, dass es sich tatsächlich um A. hydrophila
handelte. Für A. hydrophila 38 lag diese Wahrscheinlichkeit bei 99,8%. Die beiden Stämme
42 und 60 unterschieden sich in keiner ermittelten Reaktion voneinander, während der Stamm
38, im Gegensatz zu Stamm 42 und 60, zur Fermentation von Glukose befähigt war, dagegen
aber nicht zur Assimilation von Citrat. Die durchgeführten Reaktionen sowie die Ergebnisse
sind Tabelle 4.2 zu entnehmen.
4.1.2
Hämagglutinationstest
Die eingesetzten Bakterienstämme verfügten über sehr unterschiedliche hämagglutinierende
Eigenschaften (Tabelle 4.1). Stamm 38 wies pro Milliliter Ausgangsbakteriensuspension (109
KbE/ml) 40 HAE auf, während A. hydrophila 42 eine Anzahl von 320 HAE, A. hydrophila 60
eine Anzahl von 640 HAE aufwies.
Tabelle 4.1: Hämagglutinierende Einheiten von A. hydrophila Stamm 38, 42 und 60. Die
Tabelle ist repräsentativ für drei unabhängige Versuchswiederholungen.
Bakterienstamm
A. hydrophila 38
A. hydrophila 42
A. hydrophila 60
Verdünnung, die noch zu
einer HA führt
1:4
1:32
1:64
HAE / 1000 µl
40
320
640
Ergebnisse
74
Tabelle 4.2: Biochemische Charakterisierung der eingesetzten A. hydrophila Stämme 38, 42
und 60 mittels des Api® 20 NE Systems.
Test
Reaktionen
KNO3
Tryptophan
Glukose
Arginin
Harnstoff
Äskulin
Gelatine + Tusche
p-Nitro-Phenyl-ß-DGalaktopyranosid
Glukose
Arabinose
Mannose
Mannit
N-Acetyl-Glukosamin
Maltose
Glukonat
Caprat
Adipat
Malat
Citrat
Phenylacetat
Tetramethyl-p-Phenylen-Diamin
4.1.3
Nitratreduktion zu Nitrit
Indolnachweis
Fermentation
Arginindihydrolase
Urease
Hydrolyse (β-Glucosidase)
Hydrolyse (Protease)
A.hydrophila Stamm
38
42
60
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
ß-Galactosidase
+
+
+
Assimilation
Assimilation
Assimilation
Assimilation
Assimilation
Assimilation
Assimilation
Assimilation
Assimilation
Assimilation
Assimilation
Assimilation
Cytochromoxidase
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
+
CAMP-Test
Die verwendeten A. hydrophila Stämme 38, 42 und 60 zeigten, ebenso wie die als Standard
verwendeten β-hämolysierenden Staphylokokken, eine partielle Hämolyse. Keiner der
A. hydrophila Stämme war in der Lage, die partielle Hämolyse der β-hämolysierenden
Staphylokokken zu verstärken. Aufgrund dessen wurde der CAMP Test für die drei
A. hydrophila Stämme als negativ bewertet.
Ergebnisse
4.1.4
75
Zytotoxizität in vitro
Die Zytotoxizität wurde in vitro durch Co-Kultur von Bakterien mit einem 24 Stunden alten
Zellrasen von EPC-Zellen geprüft. Alle A. hydrophila Stämme wurden in Konzentrationen
von 105 und 107 KbE pro Milliliter eingesetzt, A. salmonicida, E. tarda und Y. ruckeri in einer
Konzentration von 107 KbE pro Milliliter.
Bakterienkonzentration 105 KbE pro Milliliter:
EPC-Zellen, die mit A. hydrophila 42 und 60 inkubiert wurden, zeigten nach zwei Stunden
keine Abweichungen in der Morphologie, während nach sechs und nach 24 Stunden
vereinzelt abgekugelte Zellen auftraten. Nach Inkubation der Zellen mit 0,9%iger
Natriumchloridlösung
ergaben
sich
vergleichbare
morphologische
Veränderungen.
A. hydrophila 38 führte bereits nach zwei Stunden zur Abkugelung einzelner Zellen, nach
sechs Stunden war die Abkugelung verstärkt. Die Zellgrenzen konnten nach einer
Inkubationsdauer von 24 Stunden in weiten Bereichen nicht mehr erkannt werden (s. Abb.
4.1). Die wenigen noch intakten Zellen bildeten Ausläufer zu benachbarten Zellen.
Kontrolle
A. hydrophila 38
Abbildung
4.1:
EPC-Zellen
nach
24-stündiger
Inkubation
mit
0,9%iger
Natriumchloridlösung (Kontrolle) und A. hydrophila 38 in einer Konzentration von 105 KbE.
240fache Vergrößerung. Nach Inkubation mit Natriumchloridlösung ist ein intakter Zellrasen
mit darüber liegenden Zellen zu erkennen, nach Inkubation mit A. hydrophila 38 sind nur
noch vereinzelte intakte Zellen zu erkennen, ein intakter Zellrasen ist nicht mehr vorhanden.
Intakte Zellen sind mittels Pfeilen dargestellt. Die Abbildung ist repräsentativ für drei
unabhängige Versuchsdurchführungen.
Ergebnisse
76
Bakterienkonzentration 107 KbE pro Milliliter:
Die Inkubation von EPC-Zellen mit unterschiedlich pathogenen Bakterien in einer
Konzentration von 107 koloniebildenden Einheiten pro Milliliter ergab deutlichere
Veränderungen
in
der
Zellmorphologie
als
die
Inkubation
mit
niedrigerer
Bakterienkonzentration. Die mit 0,9%iger Natriumchloridlösung und A. salmonicida
inkubierten Zellen waren nach 24 Stunden vereinzelt abgekugelt. Eine Inkubation der Zellen
mit A. hydrophila 42 und 60 führte nach 24 Stunden zu vereinzelten abgestorbenen Zellen, die
in Form von Lücken im Zellrasen zu erkennen waren. Zellen, die mit A. hydrophila 38,
E. tarda und Y. ruckeri inkubiert wurden, lösten sich bereits nach sechs Stunden vereinzelt
von der Unterlage. Die noch intakten Zellen bildeten Ausläufer zu Nachbarzellen. Nach 24
Stunden waren alle Zellen in mehreren Zellverbünden komplett von der Unterlage abgelöst (s.
Abb. 4.2).
Kontrolle
A. hydrophila 38
Abbildung
4.2:
EPC-Zellen
nach
24-stündiger
Inkubation
mit
0,9%iger
Natriumchloridlösung (Kontrolle) und A. hydrophila 38 in einer Konzentration von 107 KbE.
100fache Vergrößerung. Nach Inkubation mit Natriumchloridlösung ist ein intakter Zellrasen
zu erkennen, nach Inkubation mit A. hydrophila 38 sind alle Zellen in mehreren Verbünden
abgelöst, es sind keine intakten Zellen zu erkennen. Intakte Zellen sind mittels Pfeilen
dargestellt. Die Abbildung ist repräsentativ für drei unabhängige Versuchsdurchführungen.
Ergebnisse
4.2
4.2.1
77
Infektion von Karpfen mit A. hydrophila
Prüfung der Virulenz
Eine Übersicht über die Versuche zur Virulenzprüfung ist Tabelle 3.2 zu entnehmen.
4.2.1.1
Intraperitoneale Applikation
Zwölf Karpfen wurde A. hydrophila 42 bzw. 60 in Konzentrationen zwischen 106 und 108
KbE intraperitoneal verabreicht. Einer der Fische, dem A. hydrophila 60 in einer
Konzentration von 108 KbE appliziert worden war, verstarb zwei Tage nach
Bakterienapplikation. Eine Sektion erbrachte aufgrund der bereits fortgeschrittenen Autolyse
keine Ergebnisse. Alle anderen Karpfen zeigten keine Krankheitssymptome.
4.2.1.2
Orale Applikation
Zwölf Karpfen, die zunächst bei Wassertemperaturen von 17°C und anschließend bei 25°C
gehalten wurden, wurde A. hydrophila 42 bzw. 60 in Konzentrationen zwischen 106 und 108
KbE oral verabreicht (s. Tab. 3.2). Bei keinem der Fische konnten während des
Versuchszeitraums Störungen des Allgemeinbefindens oder anderweitige Auffälligkeiten
ausgemacht werden. Einen Tag nach oraler Applikation von A. hydrophila 38 verstarben
beide Fische, die mit einer Konzentration von 108 KbE behandelt wurden. Aus den
untersuchten Organen der beiden Fische konnte A. hydrophila mit hochgradigem Keimgehalt
isoliert werden. Die Fische, denen A. hydrophila 60 verabreicht wurde, zeigten weder
Störungen des Allgemeinbefindens noch konnten in der Sektion abweichenden Befunde
ermittelt werden. Nur bei einem der Fische konnte ein geringgradiger Gehalt an A. hydrophila
in der Leber festgestellt werden (s. Tab. 4.3.).
Ergebnisse
78
Tabelle 4.3: Ergebnisse der mikrobiologischen Untersuchung der Organe von jeweils zwei
Karpfen nach oraler Applikation von A. hydrophila 38 und 60 in einer Konzentration von 108
KbE.
Nachgewiesener Bakteriengehalt in Organen
Applizierter
Fisch
Bakterienstamm Nr.
A. hydrophila 38
1
2
1
A. hydrophila 60
2
4.2.2
Milz
Leber
Niere
hgr. A. hydrophila
hgr. A. hydrophila
keine Bakterien
nachweisbar
keine Bakterien
nachweisbar
hgr. A. hydrophila
hgr. A. hydrophila
hgr. A. hydrophila
hgr. A. hydrophila
keine Bakterien
nachweisbar
keine Bakterien
nachweisbar
ggr. A. hydrophila
keine Bakterien
nachweisbar
Orale Applikation von A. hydrophila
Aufgrund der unterschiedlichen Pathogenität für Karpfen nach oraler Applikation sowie der
ermittelten Unterschiede in der Zytotoxizität in vitro wurden die Bakterienstämme
A. hydrophila 38 und 60 ausgewählt, um jeweils 32 Karpfen appliziert zu werden. Als
Kontrolle dienten 32 Karpfen, denen 0,9%ige Natriumchloridlösung verabreicht wurde.
4.2.2.1
Klinische Untersuchung und Sektion
Insgesamt traten in der Gruppe der Fische, denen A. hydrophila 38 appliziert worden war, bei
14 Karpfen Auffälligkeiten auf. Acht Fische, denen A. hydrophila 60 verabreicht wurde, und
vier Fische innerhalb der Kontrollgruppe zeigten ebenfalls Anzeichen einer Erkrankung. Zu
erkennen
waren
Hyperämien
der
Flossen
und
verstärkt
injizierte
oberflächliche
Hautblutgefäße. Die Mehrzahl der Tiere wies demnach aber keine klinischen Symptome einer
Erkrankung auf und das Allgemeinbefinden der Fische erschien nicht beeinträchtigt. Keiner
der untersuchten Fische verstarb während des Versuches. Eine Übersicht über die klinischen
Befunde ist in Tabelle 4.4 dargestellt.
Ergebnisse
79
Tabelle 4.4: Pathologische Veränderungen bei Karpfen (n=8 je Gruppe und Tag) nach oraler
Applikation von Natriumchloridlösung, A. hydrophila 60 und 38
Pathologische Veränderungen bei Probennahme nach Applikation von
0,9%iger NaCl-Lösung
A. hydrophila 60
A. hydrophila 38
Tag 1
Fisch 1
Fisch 2
Fisch 3
Fisch 4
Fisch 5
Fisch 6
Fisch 7
Fisch 8
Tag 3
Fisch 1
Fisch 2
generalisierte Rötung
-
-
hgr. Gefäßinjizierung
-
-
-
Fisch 3
Fisch 4
-
-
Fisch 5
-
-
Fisch 6
Fisch 7
Fisch 8
-
ggr. Flossenrötung
ggr. Flossenrötung
ggr. Flossenrötung
ggr. Flossenrötung, mgr.
Gefäßinjizierung
ggr. Flossenrötung
ggr. Flossenrötung, mgr.
Gefäßinjizierung
ggr. Flossenrötung, mgr.
Gefäßinjizierung
ggr. Gefäßinjizierung
ggr. Flossenrötung
ggr. Flossenrötung
ggr. Flossenrötung
ggr. Flossenrötung
-
ggr. Hautrötung
-
ggr. Hautrötung
-
-
ggr. Flossenrötung
ggr. Flossenrötung
ggr. Flossenrötung
ggr. Flossenrötung
-
ggr. Flossenrötung
ggr. Flossenrötung
ggr.-mgr. Flossenrötung
ggr. Flossenrötung
ggr. Flossenrötung
ggr. Flossenrötung
-
Tag 6
Fisch 1
Fisch 2
Fisch 3
Fisch 4
Fisch 5
Fisch 6
Fisch 7
Fisch 8
Tag 10
Fisch 1
Fisch 2
Fisch 3
Fisch 4
Fisch 5
Fisch 6
Fisch 7
Fisch 8
Ergebnisse
80
4.2.2.2
Mikrobiologische Untersuchung
Die mikrobiologischen Befunde sind in Tabelle 4.5 dargestellt. Aus den Organen der meisten
Fische konnten keine Bakterien isoliert werden. Nur einige Tiere jeder Gruppe wiesen
Bakterien in den Organen auf. Bei den isolierten Bakterien handelte es sich um Arten, die im
Wasser oder als Bestandteil der physiologischen Darmflora weit verbreitet sind. A. hydrophila
konnte – mit einer Ausnahme – nicht aus den Organen der Karpfen isoliert werden. Teilweise
wurden Bakterien isoliert, die mit den zur Verfügung stehenden diagnostischen Methoden
nicht identifiziert werden konnten.
In der Kontrollgruppe ließen sich aus den Organen von zwei Fischen Bakterien isolieren. Ein
Fisch aus der Kontrollgruppe wies einen Tag nach Applikation der Salzlösung hochgradige
Keimgehalte in allen untersuchten Organen auf. Es handelte sich nicht um A. hydrophila,
jedoch war die Bakteriengattung nicht näher zu bestimmen. An Tag sechs nach Applikation
der Salzlösung konnte aus der Leber eines Kontrolltieres Pseudomonas putida isoliert werden.
Drei Fischen, denen A. hydrophila 60 appliziert worden war, wiesen gering- bis mittelgradige
Gehalte an Pseudomonas putida oder Staphylococcus aureus in den Organen auf (s. Tab. 4.5).
Bei zwei Tieren konnten am sechsten Tag nach Applikation diese Bakterien isoliert werden,
bei einem Tier am zehnten Tag nach Applikation.
An allen Versuchstagen konnten nach Applikation von A. hydrophila 38 aus den Organen
einiger Karpfen Bakterien isoliert werden, wobei es sich um Pseudomonas putida, Gaffkya
tetragena, Acinetobacter lwoffii, Staphylococcus ssp., Shewanella putrefaciens und in einem
Fall um A. hydrophila handelte. Auch in dieser Gruppe überwog allerdings die Anzahl der
Fische, die keinen Bakteriengehalt in den Organen aufwiesen (s. Tab. 4.5).
Ergebnisse
81
Tabelle 4.5: Aus Organen von Karpfen (n=8 je Gruppe und Tag) isolierte Bakterien nach
Applikation von NaCl-Lösung, A. hydrophila 60 und A. hydrophila 38
Aus Organen isolierte Bakterien bei Probennahme nach Applikation von
0,9%iger NaCl-Lösung
A. hydrophila 60
A. hydrophila 38
Tag 1
Fisch 1
Fisch 2
Fisch 3
Fisch 4
Fisch 5
Fisch 6
Fisch 7
Fisch 8
Tag 3
Fisch 1
Fisch 2
Fisch 3
Fisch 4
Fisch 5
Fisch 6
Fisch 7
Fisch 8
Tag 6
Fisch 1
Fisch 2
Fisch 3
Fisch 4
Fisch 5
Fisch 6
Fisch 7
Fisch 8
Tag 10
Fisch 1
Fisch 2
Fisch 3
Fisch 4
Fisch 5
Fisch 6
Fisch 7
Fisch 8
ggr. Pseudomonas putida
hgr. nicht bestimmbar
mgr. Gaffkya tetragena
mgr. Acinetobacter lwoffii
ggr. Staphylococcus ssp.
ggr. nicht bestimmbar
mgr. Pseudomonas putida
ggr. Pseudomonas putida
ggr. Pseudomonas putida
ggr. Aeromonas hydrophila
mgr. Staphylococcus
aureus
ggr. Shewanella putrefaciens
mgr. Gaffkya tetragena
ggr. nicht bestimmbar
Ergebnisse
82
4.3
4.3.1
Zur
Mukusanalyse
Kalibrierung der Chromatographiesäule
Kalibrierung
wurden
Schweinemagenmuzin,
-
wie
Bovines
unter
Material
Serumalbumin
und
und
Methoden
beschrieben
Thyroglobulin
auf
die
Chromatographiesäule aufgetragen und eluiert. Nach dem Bestimmen des Protein- und
Kohlenhydratgehaltes aufgefangener Fraktionen mittels PAS- und Bradford-Reaktion ergaben
sich die in Abbildung 4.3 dargestellten Elutionsprofile. Zu erkennen war, dass bei der
verwendeten Säule Moleküle mit einer Größe von über 2.000kDa (Schweinemagenmuzin)
vorwiegend in Fraktion 14 zu finden waren. Die Fraktion 23 enthielt vorwiegend Moleküle
mit einer Größe von 670kDa (Thyroglobulin) und Moleküle mit einer Größe von 69kDa
(Bovines Serumalbumin) waren vorwiegend in Fraktion 27 enthalten. Anhand dieser
Kalibrierung war es für die nachfolgenden Versuche möglich, eine ungefähre molekulare
Größenzuordnung der isolierten Moleküle anzugeben.
Thyroglobulin
Bovines Serumalbumin
Schweinemagenmuzin
optische Dichte
0,8
0,6
0,4
0,2
0,0
1
4
7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40
Fraktionen
Abbildung 4.3: Gemeinsames Elutionsprofil von mittels PAS-Reaktion gefärbtem
Schweinemagenmuzin sowie mittels Bradford-Reaktion gefärbtem Thyroglobulin und
Bovinem Serumalbumin, Fraktionsvolumen 1,3 ml, Gelbettvolumen 44,8ml. Die Abbildung
ist repräsentativ für drei unabhängige Messungen.
Ergebnisse
4.3.2
83
Untersuchung des Mukus unbehandelter Karpfen
Die zur Mukusgewinnung verwendeten acht Karpfen wiesen ein Körpergewicht zwischen
70,5 und 101,1 Gramm und ein Darmgewicht zwischen 0,75 und 1,59 Gramm auf (s. Tab.
4.6). Die Daten waren normalverteilt. Die Tiere zeigten zum Zeitpunkt der Probennahme
keine Anzeichen einer Erkrankung. Während der Sektion wurden bei keinem der untersuchten
Karpfen adspektorisch Veränderungen an den Organen, insbesondere dem Darm, festgestellt.
Tabelle 4.6: Körpergewicht und Darmgewicht der zur Gewinnung von unbehandeltem
interstinalen Mukus verwendeten Karpfen. X: Mittelwert, s: Standardabweichung
Anzahl der Tiere
unbehandelte Karpfen
4.3.2.1
8
Körpergewicht (g)
X
s
87,09
9,99
Darmgewicht (g)
X
s
1,39
0,33
Kohlenhydrat- und Proteingehalte
Nach separater Auftrennung des isolierten Darmschleims der acht Karpfen mittels eines
Sepharose-CL-4B®-Gels wurden der Kohlenhydrat- und der Proteingehalt in 40
aufgefangenen Fraktionen mittels PAS- und Bradford-Färbung bestimmt. Die Elutionsprofile
zeigten zwei Peaks in den Fraktionen fünf bis zehn sowie 14 bis 25 mit einem dazwischen
liegenden Schulterbereich (Fraktionen elf bis 13). Die beiden Kurven verliefen analog. In der
Abbildung 4.4 ist das Elutionsprofil der gemittelten Werte der acht Karpfen dargestellt. Der
gemittelte Gesamtextinktionswert des Kohlenhydratanteils (PAS-Reaktion, Fraktionen 1-40)
lag bei 7,17, während der gemittelte Gesamtproteingehalt mit 6,65 im Verhältnis 1:0,93
niedriger
lag.
Der
gemittelte
Gesamtglykoproteingehalt
konnte
anhand
der
für
Schweinemagenmuzin in der PAS-Färbung gemessenen Extinktionswerte (5 Milligramm =
23,57 OD) errechnet werden. Er lag bei 1,52 Milligramm Glykoprotein pro Gramm
Darmgewicht (s. Tab. 4.7).
Ergebnisse
optische Dichte
84
0,8
0,7
0,6
0,5
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
P1
1
4
Kohlenhydrat
S
P2
Protein
7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40
Fraktionen
Abbildung 4.4: Elutionsprofil der gemittelten optischen Dichten vom Darmschleim
unbehandelter Karpfen (n=8) nach Auftrennung auf einem Sepharose-CL-4B®-Gel. Die
Kohlenhydratkonzentration wurde mittels PAS-, die Proteinkonzentration mittels BradfordReaktion bestimmt und auf ein Gramm Darmgewicht normiert. Die beiden Peaks (P1, P2)
sowie der Schulterbereich (S) sind durch die Rechtecke gekennzeichnet. Fraktionsvolumen
1,3 ml, Gelbettvolumen 44,8 ml. Die Abbildung ist repräsentativ für drei unabhängige
Messungen je Mukusprobe.
Mittels der PAS- und der Bradford-Reaktion ließen sich die hochmolekularen Glykoproteine
des Darmschleims nachweisen. Die Glykoproteine mit hohem Molekulargewicht (>2.000kDa)
fanden sich in Peak 1 (Fraktionen 5-10) bei einem hohen Gesamtkohlenhydrat- und einem
niedrigen Gesamtproteingehalt. Der gemittelte Kohlenhydratgehalt lag mit 1,75 optischer
Dichte bei der PAS-Reaktion über dem des gemittelten Proteingehalts mit 0,75 optischer
Dichte
in
der
Bradford-Reaktion
(Verhältnis
1:0,43).
Bezogen
auf
die
Glykoproteingesamtmenge wies der untersuchte erste Peak einen gemittelten Anteil von 0,37
Milligramm
des
Kohlenhydratgehaltes
auf.
Dieser
Wert
entsprach
24,3%
des
Gesamtkohlenhydratgehaltes. Im Bereich der Schulter des Elutionsprofils (Fraktionen 11-13)
traten Glykoproteine mit einer Größe von etwa 2.000kDa auf. Die kleineren Glykoproteine
des Peaks 2 (Fraktionen 14-25) wiesen Größen zwischen 2.000 bis weniger als 670kDa und
einen hohen Gesamtproteinanteil bei geringerem Kohlenhydratanteil auf. Der gemittelte
Gehalt an Proteinen war im Verhältnis von 1:0,78 höher als der Kohlenhydratgehalt. Auf die
Glykoproteingesamtmenge bezogen wies der untersuchte zweite Peak einen gemittelten
Anteil von 0,69 Milligramm des Kohlenhydratgehaltes auf, was 45,4% des gemittelten
Gesamtkohlenhydratgehaltes entspricht.
Ergebnisse
85
Tabelle 4.7: Biochemische Analyse des intestinalen Mukus des Karpfens (n=8). Gemittelte
Summe der Extinktionsmittelwerte nach PAS- und Bradford-Reaktion. Umrechnung der
Extinktionssummen der PAS-Reaktion in Milligramm Glykoprotein mittels der
Extinktionswerte der Eichsubstanz SMM. X: Mittelwert, s: Standardabweichung. Die Tabelle
ist repräsentativ für drei unabhängige Messungen je Mukusprobe.
Intestinales Glykoprotein je Gramm Darmgewicht
Gesamtgehalt
(Fraktion 1-40)
Peak 1
(Fraktionen 5-10)
Schulterbereich
(Fraktionen 11-13)
Peak 2
(Fraktionen 14-25)
4.3.3
Extinktion (OD)
kalkulierter Muzingehalt (mg)
Extinktion (OD)
kalkulierter Muzingehalt (mg)
Extinktion (OD)
kalkulierter Muzingehalt (mg)
Extinktion (OD)
kalkulierter Muzingehalt (mg)
Kohlenhydrat
s
X
Protein
X
s
7,17
1,52
2,34
6,65
2,26
1,75
0,38
0,75
0,30
0,60
0,45
0,19
1,77
4,17
1,16
0,37
0,84
0,18
3,25
0,69
Untersuchung des Mukus von Karpfen nach Natriumchloridapplikation
Zunächst wurden die Reaktionen der intestinalen Mukosa auf einen Flüssigkeitsreiz
untersucht. Dafür wurde 32 Karpfen eine 0,9%ige Natriumchloridlösung oral verabreicht. Der
intestinale Mukus wurde am ersten, dritten, sechsten und zehnten Tag nach Applikation von
jeweils acht Karpfen gewonnen. Nach Auftrennung des intestinalen Mukus auf einem
Sepharose-CL-4B®-Gel wurde der Kohlenhydrat- und Proteingehalt mittels der PAS- und der
Bradford-Reaktion bestimmt. Die Werte der optischen Dichtemessung der acht Karpfen
wurden gemittelt. Eine Änderung des gemittelten Kohlenhydrat- wie auch des gemittelten
Proteinanteils intestinaler Glykoproteine fiel auf.
Ergebnisse
86
4.3.3.1
Kohlenhydratgehalt
im
Darmmukus
von
Karpfen
nach
Natriumchloridapplikation
Nach
der
Applikation
der
Natriumchloridlösung
konnte
eine
Zunahme
des
Gesamtkohlenhydratgehaltes der intestinalen Glykoproteine an den Tagen eins bis sechs nach
Applikation
ermittelt
werden,
während
am
zehnten
Tag
eine
Reduktion
des
Gesamtkohlenhydratgehaltes beobachtet werden konnte (s. Abb. 4.5). Die Zunahme des
Kohlenhydratgehaltes war an den Tagen eins und sechs statistisch hochsignifikant (p<0,001)
im Vergleich zu den Gehalten des Mukus unbehandelter Karpfen (s. Tab. 4.8). Am ersten Tag
nach Applikation fiel eine Zunahme besonders von Molekülen mittlerer und kleiner Größe
auf, während der Gehalt an großen Molekülen nicht deutlich verändert war. Der Anteil großer
Moleküle nahm am dritten Tag nach Applikation zu, während der Anteil kleiner Moleküle
abnahm. Am sechsten Tag nach Applikation erhöhte sich der Gehalt an kleinen Molekülen
statistisch hochsignifikant (p<0,001) im Vergleich zum Mukus unbehandelter Fische. Eine
deutliche Reduktion des Kohlenhydratgehaltes, die im Schulterbereich statistisch signifikant
und im zweiten Peak statistisch hochsignifikant (Schulter: p<0,05, Peak 2: p<0,001) war, fiel
am zehnten Tag nach Applikation auf.
Ergebnisse
Tag 1 p.appl.
1,0
optische Dichte
0,8
0,8
0,6
0,4
0,4
0,2
0,2
0,0
0,0
4
7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40
Tag 6 p.appl.
1,0
0,8
unbehandelt
NaCl-Gabe
Tag 3 p.appl.
1,0
0,6
1
optische Dichte
unbehandelt
NaCl-Gabe
87
1
4
0,8
0,6
0,6
0,4
0,4
0,2
0,2
7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40
Tag 10 p.appl.
1,0
unbehandelt
NaCl-Gabe
unbehandelt
NaCl-Gabe
0,0
0,0
1
4
7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40
Fraktionen
1
4
7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40
Fraktionen
Abbildung 4.5: Elutionsprofil intestinaler Glykoproteine des Karpfens nach Applikation von
0,9%iger Natriumchloridlösung pro Gramm Darmgewicht isoliert auf einer Sepharose-CL4B®-Säule. Gemittelter Kohlenhydratgehalt (unbehandelt: n=8, NaCl-Gabe: Tag 1: n=8, Tag
3: n=6, Tag 6: n=6, Tag 10: n=7) gemessen anhand der PAS-Reaktion. Fraktionsvolumen 1,3
ml, Gelbettvolumen 44,8 ml. Die Abbildung ist repräsentativ für drei unabhängige Messungen
je Mukusprobe.
Ergebnisse
88
Tabelle 4.8: Gehalt intestinaler Glykoproteine im Darmschleim von Karpfen nach
Applikation von Natriumchloridlösung nach PAS-Färbung; angegeben sind die gemittelten
Summen und berechneten relativen Werte, Umrechnung in Milligramm kalkulierter
Glykoproteingehalt. Statistisch signifikante Veränderungen sind im Vergleich zum Mukus
unbehandelter Karpfen mit * dargestellt. X: Mittelwert, s: Standardabweichung. Die Tabelle
ist repräsentativ für drei unabhängige Messungen je Mukusprobe.
Glykoprotein je
Gramm
Darmgewicht
Anzahl der Tiere
Gesamtgehalt
(Fraktion 1-40)
Extinktion (OD)
rel. Extinktion (%)
kalkulierter
Muzingehalt (mg)
Peak 1
(Fraktion 5-10)
Extinktion (OD)
rel. Extinktion (%)
kalkulierter
Muzingehalt (mg)
Schulterbereich
(Fraktion 11-13)
Extinktion (OD)
rel. Extinktion (%)
kalkulierter
Muzingehalt (mg)
Peak 2
(Fraktion 14-25)
Extinktion (OD)
rel. Extinktion (%)
kalkulierter
Muzingehalt (mg)
unbehandelt
8
7,17
100
8
2,34
1,52
1,75
100
0,38
0,69
3,95
2,08
119
0,60
1,27
151
0,94
3,74
115
0,79
2,01
2,73
156
0,44
1,29
154
0,94
3,01
93
0,64
2,41
3,07
175
0,39
1,25
149
2,75
4,87*
150
1,03
0,63
1,46
83
0,42
0,31
0,61
0,27
0,85
4,81
67
1,02
0,65
0,27
1,68
12,48
174
7
2,65
0,58
0,27
1,77
9,04
126
6
1,92
0,44
0,18
3,25
100
9,68*
135
6
2,05
0,37
0,84
100
Applikation von 0,9% NaCl, Tage p.appl.
Tag 1
Tag 3
Tag 6
Tag 10
X
s
X
s
X
s
X
s
0,33*
39
0,10
0,07
2,75
1,36*
42
0,29
0,31
Ergebnisse
4.3.3.2
89
Proteingehalt im Darmmukus von Karpfen nach Natriumchloridapplikation
Der Proteingehalt der intestinalen Glykoproteine reduzierte sich nach Applikation von
Natriumchloridlösung im Vergleich zum Mukus unbehandelter Karpfen über den gesamten
Versuchszeitraum (s. Abb. 4.6). Am zehnten Tag nach Applikation war die Reduktion
statistisch hochsignifikant (p<0,001). Am ersten Tag nach Applikation fiel die Abnahme der
großen Moleküle auf; der erste Peak war nicht mehr deutlich ausgebildet. Die Anzahl kleiner
Moleküle mit einem Molekulargewicht von unter 670kDa erhöhte sich dagegen. Drei Tage
nach der Applikation waren wieder vermehrt große Moleküle im intestinalen Mukus
nachzuweisen, das Niveau des Mukus unbehandelter Fische konnte aber nicht erreicht
werden. Eine erneute Zunahme des Gehaltes kleiner Moleküle konnte an Tag sechs nach
Applikation ermittelt werden, während am zehnten Tag sowohl die kleinen als auch die
großen Moleküle vermindert waren. Weder der erste noch der zweite Peak war am zehnten
Tag nach Applikation deutlich ausgeprägt. Die Abnahme des Gehaltes an kleinen Molekülen
war im Mukus an den Tagen drei und zehn nach der Applikation von 0,9%iger
Natriumchloridlösung statistisch hochsignifikant (p<0,001) im Vergleich zum Mukus
unbehandelter Karpfen (s. Tab. 4.9).
Ergebnisse
90
Tag 1 p.appl.
optische Dichte
0,8
0,6
0,4
0,4
0,2
0,2
0,0
0,0
4
7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40
Tag 6 p.appl.
0,8
0,6
unbehandelt
NaCl-Gabe
1
4
0,6
0,4
0,2
0,2
unbehandelt
NaCl-Gabe
7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40
Tag 10 p.appl.
0,8
0,4
0,0
Tag 3 p.appl.
0,8
0,6
1
optische Dichte
unbehandelt
NaCl-Gabe
unbehandelt
NaCl-Gabe
0,0
1
4
7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40
Fraktionen
1
4
7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40
Fraktionen
Abbildung 4.6: Elutionsprofil intestinaler Glykoproteine des Karpfens nach Applikation von
0,9%iger Natriumchloridlösung pro Gramm Darmgewicht isoliert auf einer Sepharose-CL4B®-Säule. Gemittelter Proteingehalt (unbehandelt: n=8, NaCl-Gabe: Tag 1: n=8, Tag 3: n=6,
Tag 6: n=6, Tag 10: n=7) gemessen anhand der Bradford-Reaktion. Fraktionsvolumen 1,3 ml,
Gelbettvolumen 44,8 ml. Die Abbildung ist repräsentativ für drei unabhängige Messungen je
Mukusprobe.
Ergebnisse
91
Tabelle 4.9: Gehalt intestinaler Glykoproteine im Darmschleim von Karpfen nach
Applikation von Natriumchloridlösung nach Bradford-Färbung; angegeben sind die
gemittelten Summen und berechneten relativen Werte. Statistisch signifikante Veränderungen
sind im Vergleich zum Mukus unbehandelter Karpfen mit * dargestellt. X: Mittelwert, s:
Standardabweichung. Die Tabelle ist repräsentativ für drei unabhängige Messungen je
Mukusprobe.
Glykoprotein je
Gramm
Darmgewicht
Anzahl der Tiere
Gesamtgehalt
(Fraktion 1-40)
Extinktion (OD)
rel. Extinktion (%)
Peak 1
(Fraktion 5-10)
Extinktion (OD)
rel. Extinktion (%)
Schulterbereich
(Fraktion 11-13)
Extinktion (OD)
rel. Extinktion (%)
Peak 2
(Fraktion 14-25)
Extinktion (OD)
rel. Extinktion (%)
unbehandelt
8
Applikation von 0,9% NaCl, Tage p.appl.
Tag 1
Tag 3
Tag 6
Tag 10
X
s
X
s
X
s
X
s
8
6
6
7
6,65
100
2,26
5,97
90
1,39
3,71
56
1,34
6,04
91
1,07
2,91*
44
0,56
0,75
100
0,30
0,41
55
0,32
0,55
73
0,41
0,58
77
0,27
0,56
75
0,51
0,45
100
0,19
0,26
58
0,15
0,28
62
0,17
0,33
73
0,18
0,19
42
0,05
4,17
100
1,16
2,73
65
1,20
2,05*
49
0,68
2,93
70
0,92
1,23*
29
0,45
Ergebnisse
92
4.3.4
Untersuchung des Mukus von Karpfen nach Applikation von A. hydrophila
38 und A. hydrophila 60
Jeweils 32 Karpfen wurde eine Suspension aus A. hydrophila 38 bzw. A. hydrophila 60 oral
verabreicht. Der intestinale Mukus wurde am ersten, dritten, sechsten und zehnten Tag nach
Applikation von jeweils acht Karpfen je Gruppe gewonnen. Nach Auftrennung des
intestinalen Mukus auf einem Sepharose-CL-4B®-Gel wurde der Kohlenhydrat- und
Proteingehalt mittels der PAS- und der Bradford-Reaktion bestimmt. Die Werte der optischen
Dichtemessung der Mukusfraktionen der Karpfen wurden gemittelt. Da Veränderungen des
Kohlenhydrat- und des Proteinanteils der intestinalen Glykoproteine als Reaktion auf einen
Flüssigkeitsreiz beobachtet werden konnten, wurden die ermittelten Ergebnissen der
Mukusanalyse nach Applikation der Bakterien mit den Ergebnissen der Mukusanalyse nach
Applikation
der
Natriumchloridlösung
verglichen.
Die
Fischgruppe,
der
die
Natriumchloridlösung appliziert worden war, wird im Folgenden als Kontrollgruppe
bezeichnet.
Ergebnisse
4.3.4.1.1
93
Kohlenhydratgehalt im Darmmukus von Karpfen nach Bakterienapplikation
Bezogen auf den gesamten Versuchszeitraum kam es nach Applikation von A. hydrophila 60
zu einer Zunahme des Kohlenhydratgehaltes des intestinalen Mukus, während im Mukus der
Karpfen nach Applikation von A. hydrophila 38 eine Abnahme des Kohlenhydratgehaltes im
Vergleich zur Kontrollgruppe ermittelt werden konnte (s. Abb. 4.7).
Tag 1 p.appl.
1,0
optische Dichte
0,8
NaCl-Gabe
A. hydrophila 60
A. hydrophila 38
0,6
0,4
0,4
0,2
0,2
0,0
1
4
7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40
Tag 6 p.appl.
1,0
optische Dichte
0,8
0,6
0,0
Tag 3 p.appl.
1,0
1
0,8
0,6
0,6
0,4
0,4
0,2
0,2
0,0
7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40
Tag 10 p.appl.
1,0
0,8
4
0,0
1
4
7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40
Fraktionen
1
4
7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40
Fraktionen
Abbildung 4.7: Elutionsprofil intestinaler Glykoproteine des Karpfens nach Applikation von
0,9%iger Natriumchloridlösung, A. hydrophila 60 und 38 pro Gramm Darmgewicht isoliert
auf einer Sepharose-CL-4B®-Säule. Gemittelter Kohlenhydratgehalt (NaCl-Gabe: Tag 1: n=8,
Tag 3: n=6, Tag 6: n=6, Tag 10: n=7; A. hydrophila 60: Tag 1: n=8, Tag 3: n=6, Tag 6: n=5,
Tag 10: n=7; A. hydrophila 38: Tag 1: n=7, Tag 3: n=5, Tag 6: n=6, Tag 10: n=6) gemessen
anhand der PAS-Reaktion. Fraktionsvolumen 1,3 ml, Gelbettvolumen 44,8 ml. Die Abbildung
ist repräsentativ für drei unabhängige Messungen je Mukusprobe.
94
Ergebnisse
An Tag eins nach Applikation der Bakteriensuspensionen kam es zu einer statistisch
hochsignifikanten Abnahme (p<0,001) des Gesamtkohlenhydratgehaltes im Darmmukus der
Fische, denen A. hydrophila 38 verabreicht worden war, im Vergleich zur Kontrollgruppe (s.
Tab. 4.10). Im Mukus dieser Fische war besonders der Kohlenhydratgehalt im Bereich der
Schulter sowie im zweiten Peak erniedrigt. Diese Abnahme war im Bereich der Schulter
statistisch signifikant (p<0,05) und im zweiten Peak statistisch hochsignifikant (p<0,001) im
Vergleich zur Kontrollgruppe. Der zweite Peak war im Elutionsprofil nicht deutlich
ausgebildet. Nach Applikation von A. hydrophila 60 traten keine Unterschiede im Vergleich
zur Kontrollgruppe auf.
Tab. 4.10: Gehalt intestinaler Glykoproteine im Darmschleim von Karpfen einen Tag nach
Applikation von A. hydrophila nach PAS-Färbung; angegeben sind die gemittelten Summen
und berechneten relativen Werte, Umrechnung in Milligramm kalkulierter
Glykoproteingehalt. Statistisch signifikante Veränderungen sind im Vergleich zum Mukus der
Kontrollgruppe mit * dargestellt. X: Mittelwert, s: Standardabweichung. Die Tabelle ist
repräsentativ für drei unabhängige Messungen je Mukusprobe.
Glykoprotein je Gramm
Darmgewicht
Anzahl der Tiere
Gesamtgehalt (Fraktion 1-40)
Extinktion (OD)
relative Extinktion (%)
kalkulierter Muzingehalt (mg)
Peak 1 (Fraktionen 5-10)
Extinktion (OD)
relative Extinktion (%)
kalkulierter Muzingehalt (mg)
Schulterbereich (Fraktionen 11-13)
Extinktion (OD)
relative Extinktion (%)
kalkulierter Muzingehalt (mg)
Peak 2 (Fraktionen 14-25)
Extinktion (OD)
relative Extinktion (%)
kalkulierter Muzingehalt (mg)
0,9% NaCl
X
s
8
Applikation von
A. hydrophila 60 A. hydrophila 38
X
s
X
s
8
7
9,68
100
2,05
3,95
9,37
97
2,03
3,18
5,64*
58
1,20
2,45
2,08
100
0,44
0,94
1,91
92
0,41
1,07
1,38
66
0,29
0,42
1,27
100
0,27
0,44
1,22
96
0,26
0,63
0,63*
50
0,13
0,39
3,74
100
0,79
1,68
3,73
100
0,79
1,45
1,85*
49
0,39
0,95
Ergebnisse
95
An Tag drei nach Applikation der Bakterien nahm die Kohlenhydratgesamtmenge im
Darmmukus nach Applikation von A. hydrophila 60 im Vergleich zu Tag eins zu, während sie
im Mukus der Karpfen nach Applikation von A. hydrophila 38 weiter abnahm. Im Vergleich
zum Mukus der Kontrollgruppe war die Zunahme sowohl des Gesamtkohlenhydratgehaltes
als auch des Kohlenhydratgehaltes im Schulterbereich und im ersten Peak der Elutionsprofile
im Mukus nach Gabe von A. hydrophila 60 statistisch hochsignifikant (p<0,001) (s. Tab.
4.11). Eine hochsignifikante Abnahme (p<0,001) des intestinalen Kohlenhydratgehaltes
konnte im Mukus nach A. hydrophila 38 Applikation im Vergleich zur Kontrollgruppe
festgestellt werden. Das Elutionsprofil wies weder einen ersten noch einen zweiten Peak auf.
Tab. 4.11: Gehalt intestinaler Glykoproteine im Darmschleim von Karpfen drei Tage nach
Applikation von A. hydrophila nach PAS-Färbung; angegeben sind die gemittelten Summen
und berechneten relativen Werte, Umrechnung in Milligramm kalkulierter
Glykoproteingehalt. Statistisch signifikante Veränderungen sind im Vergleich zum Mukus der
Kontrollgruppe mit * dargestellt. X: Mittelwert, s: Standardabweichung. Die Tabelle ist
repräsentativ für drei unabhängige Messungen je Mukusprobe.
Glykoprotein je Gramm
Darmgewicht
Anzahl der Tiere
Gesamtgehalt (Fraktion 1-40)
Extinktion (OD)
relative Extinktion (%)
kalkulierter Muzingehalt (mg)
Peak 1 (Fraktionen 5-10)
Extinktion (OD)
relative Extinktion (%)
kalkulierter Muzingehalt (mg)
Schulterbereich (Fraktionen 11-13)
Extinktion (OD)
relative Extinktion (%)
kalkulierter Muzingehalt (mg)
Peak 2 (Fraktionen 14-25)
Extinktion (OD)
relative Extinktion (%)
kalkulierter Muzingehalt (mg)
0,9% NaCl
X
s
6
Applikation von
A. hydrophila 60 A. hydrophila 38
X
s
X
s
6
5
9,04
100
1,92
2,01
13,98*
155
2,97
3,62
5,93
66
1,26
1,39
2,73
100
0,58
0,94
3,48
127
0,73
1,87
1,16
42
0,25
0,36
1,29
100
0,27
0,39
1,80*
140
0,38
0,53
0,51*
40
0,12
0,28
3,01
100
0,64
0,85
5,17*
172
1,10
1,44
1,82*
60
0,39
0,84
96
Ergebnisse
An Tag sechs nach Applikation der Bakterien kam es zu einer geringen Zunahme des
Gesamtkohlenhydratgehaltes des Mukus der Karpfen nach Applikation von A. hydrophila 38
im Vergleich zu Tag drei. Der Gesamtgehalt sowie der Kohlenhydratgehalt im
Schulterbereich und im zweiten Peak des Elutionsprofils lag aber noch immer statistisch
signifikant (p<0,05) unter dem der Kontrollgruppe (s. Tab 4.12). Während im
Gesamtkohlenhydratgehalt kein Unterschied zwischen der Kontrollgruppe und dem Mukus
der Fische, die A. hydrophila 60 erhalten hatten, zu erkennen war, fiel im zweiten Peak des
Elutionsprofils eine hochsignifikante Zunahme des Kohlenhydratanteils (p<0,001) im
Vergleich zur Kontrollgruppe auf. Im Vergleich zu Tag drei nahm der Kohlenhydratgehalt im
Darmmukus von Karpfen nach Applikation von A. hydrophila 60 allerdings gering ab.
Tab. 4.12: Gehalt intestinaler Glykoproteine im Darmschleim von Karpfen sechs Tage nach
Applikation von A. hydrophila nach PAS-Färbung; angegeben sind die gemittelten Summen
und berechneten relativen Werte, Umrechnung in Milligramm kalkulierter
Glykoproteingehalt. Statistisch signifikante Veränderungen sind im Vergleich zum Mukus der
Kontrollgruppe mit * dargestellt. X: Mittelwert, s: Standardabweichung. Die Tabelle ist
repräsentativ für drei unabhängige Messungen je Mukusprobe.
Glykoprotein je Gramm
Darmgewicht
Anzahl der Tiere
Gesamtgehalt (Fraktion 1-40)
Extinktion (OD)
relative Extinktion (%)
kalkulierter Muzingehalt (mg)
Peak 1 (Fraktionen 5-10)
Extinktion (OD)
relative Extinktion (%)
kalkulierter Muzingehalt (mg)
Schulterbereich (Fraktionen 11-13)
Extinktion (OD)
relative Extinktion (%)
kalkulierter Muzingehalt (mg)
Peak 2 (Fraktionen 14-25)
Extinktion (OD)
relative Extinktion (%)
kalkulierter Muzingehalt (mg)
0,9% NaCl
X
s
6
Applikation von
A. hydrophila 60 A. hydrophila 38
X
s
X
s
5
6
12,48
100
2,65
2,41
12,30
99
2,61
5,19
6,34*
51
1,34
1,82
3,07
100
0,65
2,75
3,43
112
0,73
1,98
1,19
39
0,25
0,55
1,25
100
0,27
0,61
1,30
104
0,28
0,88
0,82*
66
0,17
0,25
4,87
100
1,03
2,75
3,74*
77
0,79
1,67
2,46*
51
0,52
0,70
Ergebnisse
An
Tag
zehn
nach
Applikation
der
97
Bakterien
ließ
sich
eine
Abnahme
der
Kohlenhydratkonzentration im Darmmukus von Karpfen, denen A. hydrophila 60 appliziert
worden war, im Vergleich zu Tag sechs erkennen. Der Gesamtgehalt und der
Kohlenhydratgehalt im zweiten Peak des Elutionsprofils war dennoch statistisch
hochsignifikant (p<0,001) und im Schulterbereich des Elutionsprofils statistisch signifikant
(p<0,05) höher im Vergleich zum Mukus der Kontrollgruppe. Im Mukus der Fische, denen
A. hydrophila 38 appliziert worden war, war keine deutliche Veränderung des
Kohlenhydratgehaltes im Vergleich zu Tag sechs vorhanden. Der Gehalt an Kohlenhydraten
in dieser Gruppe war allerdings statistisch hochsignifikant höher (p<0,001) im Vergleich zur
Kontrollgruppe (s. Tab 4.13).
Tab. 4.13: Gehalt intestinaler Glykoproteine im Darmschleim von Karpfen zehn Tage nach
Applikation von A. hydrophila nach PAS-Färbung; angegeben sind die gemittelten Summen
und berechneten relativen Werte, Umrechnung in Milligramm kalkulierter
Glykoproteingehalt. Statistisch signifikante Veränderungen sind im Vergleich zum Mukus der
Kontrollgruppe mit * dargestellt. X: Mittelwert, s: Standardabweichung. Die Tabelle ist
repräsentativ für drei unabhängige Messungen je Mukusprobe.
Glykoprotein je Gramm
Darmgewicht
Anzahl der Tiere
Gesamtgehalt (Fraktion 1-40)
Extinktion (OD)
relative Extinktion (%)
kalkulierter Muzingehalt (mg)
Peak 1 (Fraktionen 5-10)
Extinktion (OD)
relative Extinktion (%)
kalkulierter Muzingehalt (mg)
Schulterbereich (Fraktionen 11-13)
Extinktion (OD)
relative Extinktion (%)
kalkulierter Muzingehalt (mg)
Peak 2 (Fraktionen 14-25)
Extinktion (OD)
relative Extinktion (%)
kalkulierter Muzingehalt (mg)
0,9% NaCl
X
s
7
Applikation von
A. hydrophila 60 A. hydrophila 38
X
s
X
s
7
6
4,81
100
1,02
0,63
9,57*
199
2,03
3,85
6,27*
130
1,33
2,23
1,46
100
0,31
0,42
2,41
165
0,51
0,93
1,17
80
0,25
0,79
0,33
100
0,07
0,10
1,25*
378
0,27
0,81
0,65
196
0,14
0,41
1,36
100
0,29
0,31
3,14*
231
0,67
0,60
1,82
134
0,39
0,88
Ergebnisse
98
4.3.4.1.2
Proteingehalt im Darmmukus von Karpfen
Über den gesamten Versuchszeitraum lag der Proteingehalt im Darmmukus der Karpfen,
denen A. hydrophila 38 appliziert worden war, unter dem des Mukus der Kontrollgruppe,
während der Proteingehalt im Mukus der Karpfen, die A. hydrophila 60 erhalten hatten, über
dem der Kontrollgruppe lag (s. Abb. 4.8).
Tag 1 p.appl.
optische Dichte
0,6
NaCl-Gabe
A. hydrophila 60
A. hydrophila 38
0,4
0,4
0,2
0,2
0,0
0,0
1
4
7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40
Tag 6 p.appl.
0,6
optische Dichte
Tag 3 p.appl.
0,6
1
0,4
0,2
0,2
0,0
0,0
1
4
7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40
Fraktionen
7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40
Tag 10 p.appl.
0,6
0,4
4
1
4
7 10 13 16 19 22 25 28 31 34 37 40
Fraktionen
Abbildung 4.8: Elutionsprofil intestinaler Glykoproteine des Karpfens nach Applikation von
0,9%iger Natriumchloridlösung, A. hydrophila 38 und 60 pro Gramm Darmgewicht isoliert
auf einer Sepharose-CL-4B®-Säule. Gemittelter Proteingehalt (NaCl-Gabe: Tag 1: n=8, Tag
3: n=6, Tag 6: n=6, Tag 10: n=7; A. hydrophila 60: Tag 1: n=8, Tag 3: n=6, Tag 6: n=5, Tag
10: n=7; A. hydrophila 38: Tag 1: n=7, Tag 3: n=5, Tag 6: n=6, Tag 10: n=6) gemessen
anhand der Bradford-Reaktion. Fraktionsvolumen 1,3 ml, Gelbettvolumen 44,8 ml. Die
Abbildung ist repräsentativ für drei unabhängige Messungen je Mukusprobe.
Ergebnisse
99
An Tag eins nach Applikation nahm der Anteil großer und kleiner Moleküle im Darmmukus
von Karpfen, denen A. hydrophila 60 verabreicht worden war, im Vergleich zur
Kontrollgruppe zu, während er im Mukus der Karpfen nach Applikation von A. hydrophila 38
abnahm. Die Reduktion des Proteingehaltes nach Applikation von A. hydrophila 38 war im
Vergleich zur Kontrollgruppe statistisch hochsignifikant (p<0,001). Das Elutionsprofil zeigte
keine typischen Peaks. Im Schulterbereich des Elutionsprofils war die Zunahme des
Proteinanteils des Mukus nach Applikation von A. hydrophila 60 vergleichend zur
Kontrollgruppe statistisch signifikant (p<0,05) (s. Tab 4.14).
Tab. 4.14: Gehalt intestinaler Glykoproteine im Darmschleim von Karpfen einen Tag nach
Applikation von A. hydrophila nach Bradford-Färbung; angegeben sind die gemittelten
Summen und berechneten relativen Werte. Statistisch signifikante Veränderungen sind im
Vergleich zum Mukus der Kontrollgruppe mit * dargestellt. X: Mittelwert, s:
Standardabweichung. Die Tabelle ist repräsentativ für drei unabhängige Messungen je
Mukusprobe.
Glykoprotein je Gramm
Darmgewicht
Anzahl der Tiere
Gesamtgehalt (Fraktion 1-40)
Extinktion (OD)
relative Extinktion (%)
Peak 1 (Fraktionen 5-10)
Extinktion (OD)
relative Extinktion (%)
Schulterbereich (Fraktionen 11-13)
Extinktion (OD)
relative Extinktion (%)
Peak 2 (Fraktionen 14-25)
Extinktion (OD)
relative Extinktion (%)
0,9% NaCl
X
s
8
Applikation von
A. hydrophila 60 A. hydrophila 38
X
s
X
s
8
7
5,97
100
1,39
8,06
135
2,25
3,47*
58
2,56
0,41
100
0,32
0,60
146
0,30
0,30
73
0,34
0,26
100
0,15
0,57*
219
0,27
0,17
65
0,17
2,73
100
1,20
4,16
152
1,77
1,59
58
1,19
100
Ergebnisse
Auch am dritten Tag nach Applikation war der Proteingehalt im intestinalen Mukus der
Karpfen, denen A. hydrophila 38 verabreicht worden war, niedriger, als der im Mukus der
Kontrollgruppe. Nach Applikation von A. hydrophila 60 war der Gesamtproteingehalt im
Vergleich zur Kontrollgruppe statistisch signifikant (p<0,05) erhöht und der Proteingehalt im
zweiten Peak des Elutionsprofils statistisch hochsignifikant (p<0,001) erhöht (s. Tab 4.15).
Allerdings nahm der Proteingehalt nach Applikation von A. hydrophila 60 im Vergleich zu
Tag eins geringgradig ab. Es war keine Veränderung des Gesamtproteingehaltes nach
Applikation von A. hydrophila 38 festzustellen. Im Elutionsprofil vom Mukus der Karpfen,
denen A. hydrophila 38 verabreicht worden war, waren keine deutlichen Peaks ausgebildet.
Tab. 4.15: Gehalt intestinaler Glykoproteine im Darmschleim von Karpfen drei Tage nach
Applikation von A. hydrophila nach Bradford-Färbung; angegeben sind die gemittelten
Summen und berechneten relativen Werte. Statistisch signifikante Veränderungen sind im
Vergleich zum Mukus der Kontrollgruppe mit * dargestellt. X: Mittelwert, s:
Standardabweichung. Die Tabelle ist repräsentativ für drei unabhängige Messungen je
Mukusprobe.
Glykoprotein je Gramm
Darmgewicht
Anzahl der Tiere
Gesamtgehalt (Fraktion 1-40)
Extinktion (OD)
relative Extinktion (%)
Peak 1 (Fraktionen 5-10)
Extinktion (OD)
relative Extinktion (%)
Schulterbereich (Fraktionen 11-13)
Extinktion (OD)
relative Extinktion (%)
Peak 2 (Fraktionen 14-25)
Extinktion (OD)
relative Extinktion (%)
0,9% NaCl
X
s
6
Applikation von
A. hydrophila 60 A. hydrophila 38
X
s
X
s
6
5
3,71
100
1,34
7,14*
192
1,41
3,46
93
0,73
0,55
100
0,41
0,73
133
0,46
0,37
67
0,30
0,28
100
0,17
0,54
193
0,24
0,24
86
0,20
2,05
100
0,68
4,07*
199
1,05
1,18
58
0,37
Ergebnisse
101
An Tag sechs nach Applikation der Bakterien nahm der Proteingehalt im Mukus der Fische
nach Applikation von A. hydrophila 60 im Vergleich zu Tag drei ab, während er nach
Applikation von A. hydrophila 38 annähernd auf dem gleichen Niveau blieb. Der zweite Peak
des Elutionsprofils des Mukus der Karpfen, denen A. hydrophila 38 verabreicht worden war,
war deutlicher ausgebildet als an den vorangegangenen Tagen. Der Proteingehalt der
intestinalen Glykoproteine war sowohl insgesamt als auch im zweiten Peak des
Elutionsprofils nach Applikation von A. hydrophila 38 im Vergleich zum Mukus der
Kontrollgruppe statistisch hochsignifikant erniedrigt (p<0,001), im Bereich der Schulter
statistisch signifikant erniedrigt (p<0,05) (s. Tab 4.16).
Tab. 4.16: Gehalt intestinaler Glykoproteine im Darmschleim von Karpfen sechs Tage nach
Applikation von A. hydrophila nach Bradford-Färbung; angegeben sind die gemittelten
Summen und berechneten relativen Werte. Statistisch signifikante Veränderungen sind im
Vergleich zum Mukus der Kontrollgruppe mit * dargestellt. X: Mittelwert, s:
Standardabweichung. Die Tabelle ist repräsentativ für drei unabhängige Messungen je
Mukusprobe.
Glykoprotein je Gramm
Darmgewicht
Anzahl der Tiere
Gesamtgehalt (Fraktion 1-40)
Extinktion (OD)
relative Extinktion (%)
Peak 1 (Fraktionen 5-10)
Extinktion (OD)
relative Extinktion (%)
Schulterbereich (Fraktionen 11-13)
Extinktion (OD)
relative Extinktion (%)
Peak 2 (Fraktionen 14-25)
Extinktion (OD)
relative Extinktion (%)
0,9% NaCl
X
s
6
Applikation von
A. hydrophila 60 A. hydrophila 38
X
s
X
s
5
6
6,04
100
1,07
4,53
75
2,59
2,69*
45
0,98
0,58
100
0,27
0,55
95
0,41
0,17
29
0,23
0,33
100
0,18
0,42
127
0,25
0,09*
27
0,11
2,93
100
0,92
2,38
81
1,60
1,18*
40
0,25
102
Ergebnisse
Am Tag zehn nach Applikation waren in allen untersuchten Mukusproben nur geringe
Proteingehalte messbar. Eine deutliche Ausbildung der beiden Peaks sowie des
Schulterbereiches war in den Elutionsprofilen nicht zu erkennen. Der Proteingehalt blieb nach
Applikation von A. hydrophila 60 im Vergleich zu Tag sechs annähernd gleich, während es zu
einer Proteinzunahme im Mukus der Karpfen nach Applikation von A. hydrophila 38 kam.
Nach Applikation von A. hydrophila 60 war der Proteingehalt insgesamt hochsignifikant
höher (p<0,001) als in der Kontrollgruppe (s. Tab. 4.17).
Tab. 4.17: Gehalt intestinaler Glykoproteine im Darmschleim von Karpfen zehn Tage nach
Applikation von A. hydrophila nach Bradford-Färbung; angegeben sind die gemittelten
Summen und berechneten relativen Werte. Statistisch signifikante Veränderungen sind im
Vergleich zum Mukus der Kontrollgruppe mit * dargestellt. X: Mittelwert, s:
Standardabweichung. Die Tabelle ist repräsentativ für drei unabhängige Messungen je
Mukusprobe.
Glykoprotein je Gramm
Darmgewicht
Anzahl der Tiere
Gesamtgehalt (Fraktion 1-40)
Extinktion (OD)
relative Extinktion (%)
Peak 1 (Fraktionen 5-10)
Extinktion (OD)
relative Extinktion (%)
Schulterbereich (Fraktionen 11-13)
Extinktion (OD)
relative Extinktion (%)
Peak 2 (Fraktionen 14-25)
Extinktion (OD)
relative Extinktion (%)
0,9% NaCl
X
s
7
Applikation von
A. hydrophila 60 A. hydrophila 38
X
s
X
s
7
6
2,91
100
0,56
4,93*
169
2,03
3,94
135
2,01
0,56
100
0,51
0,73
130
0,41
0,76
136
0,40
0,19
100
0,05
0,46
242
0,25
0,38
200
0,33
1,23
100
0,45
1,57
128
0,46
1,23
100
0,81
Ergebnisse
4.3.4.2
103
Terminale Glykosilierung von Glykoproteinen des intestinalen Mukus
Um Veränderungen in der terminalen Glykosilierung von hochmolekularen Glykoproteinen
aus dem intestinalen Mukus nach Applikation von Bakterien zu ermitteln, wurde das
Glykosilierungsmuster
der
Glykoproteine
nach
Gabe
von
Natriumchloridlösung,
A. hydrophila 38 und A. hydrophila 60 in einem lektinbindenden Verfahren (Lektin-ELISA)
bestimmt.
Bereits bei der Analyse des Gesamtgemisches der Glykoproteine aus dem Darmmukus
(Summe aus Peak 1, Schulter und Peak 2, s. Abb. 4.4) ließ sich eine Modulation der
Glykosilierung durch die Bakterienapplikation erkennen (s. Abb. 4.9). Deutliche
Veränderungen waren an den Tagen sechs und zehn nach Applikation zu beobachten. An
diesen Tagen stiegen die Gehalte der einzelnen untersuchten Zucker durchschnittlich an. Die
höchsten Gehalte konnten für α-Galaktosamin, β-Galaktosamin und Mannose ermittelt
werden, während Fukose und Neuraminsäure nur in sehr geringen Gehalten auftraten. Bei
Betrachtung der einzelnen Fischgruppen fiel auf, dass der Mukus der Karpfen, denen
A. hydrophila 60 appliziert worden war, durchschnittlich den geringsten Gehalt der
untersuchten Zucker aufwies, der Mukus der Karpfen denen A. hydrophila 38 appliziert
worden war, dagegen durchschnittlich den höchsten. Im Gesamtgemisch konnte eine
statistisch signifikante (p<0,05) Zunahme des Gehaltes an Fukose einen Tag nach Applikation
von A. hydrophila 60 im Vergleich zur Kontrollgruppe festgestellt werden. Nach Applikation
von A. hydrophila 38 lag der Fukosegehalt an Tag drei und Tag zehn, der βGalaktosamingehalt an Tag eins und Tag zehn sowie der Neuraminsäuregehalt an Tag drei
und Tag zehn statistisch signifikant (p<0,05) über dem der Kontrollgruppe.
Die Glykosilierung der beiden Peaks sowie der Schulter wurde ebenfalls für die drei Gruppen
(NaCl, A. hydrophila 60 und 38) bestimmt und ist in den Abbildungen 4.10 bis 4.13
dargestellt. Es ließen sich keine klaren Tendenzen und keine statistisch signifikanten
Unterschiede (p>0,05) in den einzelnen Fraktionspools erkennen. Mannose war vorwiegend
in den Glykoproteinen des zweiten Peaks vorhanden, die Verteilung der anderen Zucker
variierte.
Ergebnisse
104
6
5
optische Dichte
70
Fukose (UEA)
NaCl
A. hydrophila 60
A. hydrophila 38
4
*
50
40
*
3
*
30
2
20
1
10
0
0
Tag 1
70
optische Dichte
60
50
40
Tag 3
Tag 6
Tag 10
60
*
50
30
20
20
10
10
6
5
4
3
Tag 3
Tag 6
Tag 10
Mannose (ConA)
NaCl
A. hydrophila 60
A. hydrophila 38
40
30
0
Tag 1
.
Tag 1
70
beta-Galaktosamin(RCA)
NaCl
A. hydrophila 60
A. hydrophila 38
*
0
optische Dichte
60
alpha-Galaktosamin (DBA)
NaCl
A. hydrophila 60
A. hydrophila 38
Tag 3
Tag 6
Neuraminsäure (SNA)
NaCl
A. hydrophila 60
A. hydrophila 38
*
Tag 10
Tag 1
Tag 3
Tag 6
Tag 10
*
2
1
0
Tag 1
Tag 3
Tag 6
Tage nach Applikation
Tag 10
Abbildung 4.9: Glykosilierung des intestinalen Mukus an Tag eins, drei, sechs und zehn nach
Applikation von Natriumchloridlösung, A. hydrophila 60 und 38. Dargestellt ist jeweils der
Median und die 25 und 75 Perzentile der Summe der ermittelten Glykosilierung der
Mukusmoleküle des Peak 1, der Schulter und des Peak 2 bezogen auf ein Gramm
Darmgewicht und die ermittelten Kohlenhydratgehalte (PAS-Färbung) (NaCl-Gabe: Tag 1:
n=8, Tag 3: n=6, Tag 6: n=6, Tag 10: n=7; A. hydrophila 60: Tag 1: n=8, Tag 3: n=6, Tag 6:
n=5, Tag 10: n=7; A. hydrophila 38: Tag 1: n=7, Tag 3: n=5, Tag 6: n=6, Tag 10: n=6). Im
Vergleich zur Kontrollgruppe (NaCl) statistisch signifikante Unterschiede (p<0,05) sind für
den jeweiligen Tag mittels * dargestellt. Skalierung der y-Achse nicht einheitlich. Die
Abbildung ist repräsentativ für drei unabhängige Messungen je Mukusprobe.
Ergebnisse
105
An Tag eins nach Applikation fiel die allgemeine Zunahme der terminalen Glykosilierung der
Glykoproteinen mit allen untersuchten Monosacchariden nach Applikation von A. hydrophila
38 sowie die Abnahme der terminalen Glykosilierung nach Applikation von A. hydrophila 60
im Vergleich zur Kontrollgruppe auf. Besonders die Gehalte an Mannose und β-Galaktosamin
waren nach Gabe von A. hydrophila 38 erhöht. Fukose konnte nach Applikation beider
Bakterienstämme nachgewiesen werden, jedoch nicht im Mukus der Kontrollgruppe (s. Abb.
4.10).
optische Dichte
30
25
20
30
NaCl Gabe
Peak 1
Schulterbereich
Peak 2
25
20
15
15
10
10
5
5
0
0
optische Dichte
Fu
α-Gal
30
A. hydrophila 38
25
Peak 1
Schulterbereich
Peak 2
20
A. hydrophila 60
Peak 1
Schulterbereich
Peak 2
ß-Gal
Man
Neu
ß-Gal
Man
Kohlenhydrate
Neu
Fu
α-Gal
ß-Gal
Man
Neu
15
10
5
0
Fu
α-Gal
Abbildung 4.10: Glykosilierung des Mukus an Tag eins nach Applikation. Dargestellt sind
die Mediane sowie die 25 und 75 Perzentile der Peaks 1 und 2 und der Schulter bezogen auf
ein Gramm Darmgewicht und die ermittelten Kohlenhydratgehalte (PAS-Färbung) (NaClGabe: n=8; A. hydrophila 60: n=8; A. hydrophila 38: n=7). Untersuchte Kohlenhydrate:
Fukose (Fu), α-Galaktosamin (α-Gal), β-Galaktosamin (β-Gal), Mannose (Man),
Neuraminsäure (Neu). Die Abbildung ist repräsentativ für drei unabhängige Messungen je
Mukusprobe.
Ergebnisse
106
An Tag drei nach Applikation nahm der Gehalt an Mannose in Glykoproteinen aus dem
Mukus von Karpfen nach Verabreichung von A. hydrophila 60 im Vergleich zu Tag eins zu,
nach Verabreichung von A. hydrophila 38 dagegen ab. Im Vergleich zu Tag eins nahm αGalaktosamin in der Kontrollgruppe ab, blieb nach Bakterienapplikation aber auf dem
gleichen Niveau. Es war weniger β-Galaktosamin im Mukus der Fische nach Applikation von
A. hydrophila 38 nachweisbar, als am ersten Tag. Die Gehalte an Neuraminsäure und Fukose
waren in der Gruppe, die A. hydrophila 38 erhalten hatte, am höchsten (s. Abb. 4.11).
optische Dichte
30
25
20
NaCl Gabe
Peak 1
Schulterbereich
Peak 2
30
25
20
15
15
10
10
5
5
Fu
optische Dichte
Peak 1
Schulterbereich
Peak 2
0
0
α-Gal
30
A. hydrophila 38
25
Peak 1
Schulterbereich
Peak 2
20
A. hydrophila 60
ß-Gal
Man
Neu
ß-Gal
Man
Kohlenhydrate
Neu
Fu
α-Gal
ß-Gal
Man
Neu
15
10
5
0
Fu
α-Gal
Abbildung 4.11: Glykosilierung des Mukus an Tag drei nach Applikation. Dargestellt sind
die Mediane sowie die 25 und 75 Perzentile der Peaks 1 und 2 und der Schulter bezogen auf
ein Gramm Darmgewicht und die ermittelten Kohlenhydratgehalte (PAS-Färbung) (NaClGabe: n=6; A. hydrophila 60: n=6; A. hydrophila 38: n=5). Untersuchte Kohlenhydrate:
Fukose (Fu), α-Galaktosamin (α-Gal), β-Galaktosamin (β-Gal), Mannose (Man),
Neuraminsäure (Neu). Die Abbildung ist repräsentativ für drei unabhängige Messungen je
Mukusprobe.
Ergebnisse
107
An Tag sechs nach Applikation fiel eine deutliche Zunahme von Mannose und βGalaktosamin im Mukus der Fische der Kontrollgruppe im Vergleich zu Tag drei auf. αGalaktosamin nahm dagegen innerhalb dieser Gruppe deutlich ab. Im Mukus der Fische,
denen A. hydrophila 60 appliziert wurde, nahm der Gehalt an α- und β-Galaktosamin und
Mannose im Vergleich zu Tag drei zu. Die Gehalte an Fukose und Neuraminsäure
erniedrigten sich im Mukus der Fische nach Applikation von A. hydrophila 38, und lagen nun
auf dem Niveau aus dem Darm von Karpfen aus den beiden Vergleichsgruppen (s. Abb.
4.12).
optische Dichte
30
25
20
NaCl Gabe
Peak 1
Schulterbereich
Peak 2
A. hydrophila 60
25
Peak 1
Schulterbereich
Peak 2
20
15
15
10
10
5
5
0
0
Fu
30
optische Dichte
30
25
20
α-Gal
ß-Gal
Man
Neu
ß-Gal
Man
Kohlenhydrate
Neu
Fu
α-Gal
ß-Gal
Man
Neu
A. hydrophila 38
Peak 1
Schulterbereich
Peak 2
15
10
5
0
Fu
α-Gal
Abbildung 4.12: Glykosilierung des Mukus an Tag sechs nach Applikation. Dargestellt sind
die Mediane sowie die 25 und 75 Perzentile der Peaks 1 und 2 und der Schulter bezogen auf
ein Gramm Darmgewicht und die ermittelten Kohlenhydratgehalte (PAS-Färbung) (NaClGabe: n=6; A. hydrophila 60: n=5; A. hydrophila 38: n=6). Untersuchte Kohlenhydrate:
Fukose (Fu), α-Galaktosamin (α-Gal), β-Galaktosamin (β-Gal), Mannose (Man),
Neuraminsäure (Neu). Die Abbildung ist repräsentativ für drei unabhängige Messungen je
Mukusprobe.
Ergebnisse
108
An Tag zehn kam es innerhalb der Kontrollgruppe wieder zu einer Erniedrigung der Gehalte
an Mannose und β-Galaktosamin im Vergleich zu Tag sechs, dafür zu einem Anstieg von αGalaktosamin. Nach Applikation von A. hydrophila 60 sanken die Gehalte von Mannose, αund β-Galaktosamin. Es erhöhte sich der Gehalt an Mannose, Fukose und Neuraminsäure in
der Gruppe der Fische, denen A. hydrophila 38 verabreicht worden war (s. Abb. 4.13).
optische Dichte
30
25
20
15
NaCl Gabe
Peak 1
Schulterbereich
Peak 2
30
A. hydrophila 60
25
Peak 1
Schulterbereich
Peak 2
20
15
10
10
5
5
0
0
Fu
optische Dichte
30
25
20
α-Gal
ß-Gal
Man
Neu
Fu
α-Gal
ß-Gal
Man
Neu
A. hydrophila 38
Peak 1
Schulterbereich
Peak 2
15
10
5
0
Fu
α-Gal
ß-Gal
Man
Kohlenhydrate
Neu
Abbildung 4.13: Glykosilierung des Mukus an Tag zehn nach Applikation. Dargestellt sind
die Mediane sowie die 25 und 75 Perzentile der Peaks 1 und 2 und der Schulter bezogen auf
ein Gramm Darmgewicht und die ermittelten Kohlenhydratgehalte (PAS-Färbung) (NaClGabe: n=7; A. hydrophila 60: n=7; A. hydrophila 38: n=6). Untersuchte Kohlenhydrate:
Fukose (Fu), α-Galaktosamin (α-Gal), β-Galaktosamin (β-Gal), Mannose (Man),
Neuraminsäure (Neu). Die Abbildung ist repräsentativ für drei unabhängige Messungen je
Mukusprobe.
Ergebnisse
4.3.4.3
109
Lysozymbestimmung im nach Molekülgrößen aufgetrennten Mukus
Zu keinem Zeitpunkt war in den Glykoproteinlösungen, die nach Applikation der
Natriumchloridlösung bzw. der Bakteriensuspensionen durch Gelfiltration gewonnen wurden,
eine Lysozymaktivität messbar. Die Kontrollsubstanz Hühnereiweiß-Lysozym („Henn Egg
White Lysozyme“) führte zu einem Abbau der im Test verwendeten Bakterien der Gattung
Micrococcus luteus, der durch die stetige Abnahme der optischen Dichte der Lösung
nachgewiesen werden konnte. Im Gegensatz dazu nahm die Trübung der Bakteriensuspension
durch die Zugabe der Mukusproben nicht ab (s. Abb. 4.14).
Henn Egg White Lysozyme
Mukus nach NaCl Gabe
Mukus nach Gabe von A. hydrophila 60
Mukus nach Gabe von A. hydrophila 38
optische Dichte
0,4
0,3
0,2
0,1
0,0
0,5
2
3,5
5
6,5
Minuten nach Zugabe von M. luteus
8
9,5
Abbildung 4.14: Lysozymbestimmung in Glykoproteinlösungen nach Gelfiltration nach
Applikation von Natriumchloridlösung, A. hydrophila 60 und A. hydrophila 38. Die
Abbildung ist repräsentativ für drei unabhängige Messungen je Mukusprobe.
Ergebnisse
110
4.4
Bakterienadhäsion
Die Adhäsion von Bakterien an intestinalen Mukus wurde mittels fluoreszenzmarkierten
Bakterien durchgeführt. Hierfür war es erforderlich, eine geeignete Methode zu entwickeln.
4.4.1
Validierung der Methode
4.4.1.1
Markierung
Zur Markierung wurde jeweils eine Menge von 100µl Bakteriensuspension je Vertiefung
einer Mikrotiterplatte mit 96 Vertiefungen eingesetzt, mittels des Fluoreszenzfarbstoffs Syto®
9
markiert
und
die
Fluoreszenzintensität
im
Fluoreszenzphotometer
bestimmt.
Fluoreszenzmarkierte Bakterien sind in Abbildung 4.15 dargestellt.
Abbildung 4.15: Markierung von Bakterien aus dem Stamm A. hydrophila 38 mittels Syto® 9
in einer Konzentration von 10µmol/l. 640fache Vergrößerung. Ermittlung der Stabilität der
Fluoreszenzfärbung. Die Abbildung ist repräsentativ für drei unabhängige Färbungen.
Ergebnisse
4.4.1.1.1
111
Vergleich von Konzentrationen des Fluoreszenzfarbstoffs
Die Markierung von Bakterien aus dem Stamm A. hydrophila 42 in einer Konzentration von
109 KbE pro Milliliter mittels des Fluoreszenzfarbstoffs Syto® 9 in Konzentrationen zwischen
einem und 100µmol/l ergab einen deutlichen Abfall der Fluoreszenzintensität bei niedrigeren
Farbstoffkonzentrationen. Die als Kontrolle mit dem Farbstoff gemischte 0,9%ige
Natriumchloridlösung führte in einer Konzentration von 100µmol/l zu einer sehr hohen
Fluoreszenzintensität
von
über
3000
Einheiten.
Bei
Einsatz
niedrigerer
Farbstoffkonzentrationen nahm diese unspezifische Fluoreszenz ab und wies bei
Konzentrationen zwischen 1 und 10µmol/l keinen deutlichen Unterschied mehr zueinander
auf (s. Abb. 4.16). Nach Berücksichtigung dieser Ergebnisse wurde für die weiteren
Messungen die Farbstoffkonzentration auf 10µmol/l festgelegt.
Fluoreszenzintensität
100000
A. hydrophila 42
Kontrolle
10000
1000
100
10
1
100
10
Syto 9 (µmol/l)
1
Abbildung 4.16: Markierung von Bakterien aus dem Stamm A. hydrophila 42 mit Syto® 9 in
Konzentrationen zwischen 1µmol/l und 100µmol/l. Als Kontrolle diente mit dem Farbstoff
versetzte Natriumchloridlösung. Angegeben sind die Mittelwerte und Standardabweichungen
von drei Versuchsdurchführungen. Die Abbildung ist repräsentativ für drei unabhängige
Messungen.
Ergebnisse
112
4.4.1.1.2
Ermittlung der Stabilität der Fluoreszenzfärbung
Eine Messung der Fluoreszenzintensität von mit Syto® 9 gefärbten A. hydrophila 42 ergab
keinen deutlichen Rückgang der Fluoreszenz im Verlauf von zwölf Tagen (s. Abb. 4.17).
Fluoreszenzintensität
A. hydrophila 42
Kontrolle
1000
1
Tag 1
Tag 3
Tag 6
Tage nach Markierung
Tag 12
Abbildung 4.17: Messung der Fluoreszenzintensität von mittels Syto® 9 markierten
Bakterien (A. hydrophila 42) über einen Zeitraum von zwölf Tagen. Vergleich verschiedener
Bakterienkonzentration. Die Abbildung ist repräsentativ für drei unabhängige Messungen.
4.4.1.1.3
Vergleich verschiedener Bakterienkonzentrationen
Die im Fluoreszenzphotometer ermittelten Daten bei der Messung von A. hydrophila 42 in
Konzentrationen zwischen 106 und 109 KbE pro Milliliter ergab einen Abfall der
Fluoreszenzintensität mit sinkender Konzentration (s. Abb. 4.18).
Fluoreszenzintensität
1000000
A. hydrophila 42
Kontrolle
1000
1
9
10
8
7
6
10
10
10
Bakterienkonzentration (KbE/ml)
Abbildung 4.18: Messung der Fluoreszenzintensität nach Markierung von verschieden
konzentrierten Suspensionen von A. hydrophila 42 mittels Syto® 9. Die Abbildung ist
repräsentativ für drei unabhängige Messungen.
Ergebnisse
4.4.1.1.4
113
Vergleich der Fluoreszenzintensitäten verschiedener Bakterien
Die Messung der Fluoreszenzintensitäten der eingesetzten Bakterienstämme (A. hydrophila
Stamm 38, 42 und 60; A. salmonicida; E. tarda; Y. ruckeri) ergab nur geringe Schwankungen
der Intensitäten zwischen den Stämmen (s. Abb. 4.19). Die Fluoreszenzintensitäten reichten
von 7350 bis 8375 bei einer Standardabweichung von 256. Aufgrund dieses Ergebnisses
wurde die Markierung der Bakterienstämme als annähernd gleich eingestuft.
A. hydrophila 38
A. hydrophila 42
A. hydrophila 60
A. salmonicida
E. tarda
Y. ruckeri
1
10
100
1000
Fluoreszenzintensität
10000
Abbildung 4.19: Messung der Fluoreszenzintensität nach Markierung der verwendeten
Bakterienstämme (A. hydrophila Stamm 38, 42 und 60, A. salmonicida, Y. ruckeri und
E. tarda) in einer Konzentration von 109 KbE pro Milliliter mittels des Fluoreszenzfarbstoffs
Syto® 9 (10µmol/l). Angegeben sind die Mittelwerte und Standardabweichungen von drei
unabhängigen Messungen.
Ergebnisse
114
4.4.1.2
4.4.1.2.1
Fluoreszenzintensitätsmessung
Vergleich von Filtern im Fluoreszenzphotometer
Die Messung der Fluoreszenzintensität bei Einsatz unterschiedlicher Emissions- und
Absorptionsfilter ergab die höchste Messgenauigkeit bei Verwendung eines Absorptionsfilters
für eine Wellenlänge von 470nm und eines Emissionsfilters für eine Wellenlänge von 520nm
(s. Abb. 4.20). Die Messgenauigkeit wurde zum einen festgemacht an der Höhe der
Fluoreszenzintensität und zum anderen an der größtmöglichen Differenz zwischen der
Fluoreszenz der Bakteriensuspension und der Natriumchloridlösung, die als Kontrolle diente.
Die Kombination der Filter, die die höchste Messgenauigkeit aufwiesen (Extinktion 470nm,
Emission 520nm), wurde für die nachfolgenden Messungen verwendet.
A. hydrophila 42
Kontrolle
Fluoreszenzintensität
30000
25000
20000
15000
10000
5000
0
470-520
450-520
470-590
Extinktionsfilter / Emissionsfilter
Abbildung 4.20: Messung der Fluoreszenzintensität mittels verschiedener Filter nach
Markierung von A. hydrophila 42 mittels Syto® 9. Die Abbildung ist repräsentativ für drei
unabhängige Messungen.
Ergebnisse
4.4.1.3
4.4.1.3.1
115
Adhäsion von Bakterien an intestinalen Mukus des Karpfens
Adhäsion von Bakterien an mit Mukus beschichteten Objektträgern
Versuch 1:
Eine große Anzahl Bakterien des Stammes A. hydrophila 42 hatte sowohl an über Nacht an
Super-Frost®-Objektträger gebundenen Mukus als auch an frisch auf den Objektträger
aufgetragenen Mukus gebunden, während bei Einsatz von A. hydrophila 60 bei beiden
Ansätzen nur vereinzelt Bakterien zu erkennen waren (s. Tab. 4.18). Die Anzahl der an den
Mukus gebundenen Bakterien wurde geschätzt und eingeteilt in „keine Bakterien“ (-),
„vereinzelt“ (+/-), „geringgradig“ (+), „mittelgradig“ (++) und „hochgradig“ (+++).
Tabelle 4.18.: Adhäsion von Bakterien an Mukus auf Super-Frost®-Objektträgern, Versuch 1,
Inkubationszeit 60 Minuten. Die Tabelle ist repräsentativ für drei unabhängige
Versuchsdurchführungen.
Bakterienstamm
A. hydrophila 42
A. hydrophila 60
Mukus frisch
+++
+
Mukus getrocknet
+++
+
Versuch 2:
Bei Einsatz von A. hydrophila 42 waren nach Inkubationszeiten zwischen zehn und 30
Minuten mehr gebundene Bakterien zu erkennen, als bei Einsatz von A. hydrophila 60. Je
länger die Inkubationszeit gewählt war, desto mehr Bakterien waren vorhanden (s. Tab. 4.19).
Tabelle 4.19.: Adhäsion von Bakterien an Mukus auf Super-Frost®-Objektträgern, Versuch 2.
Die Tabelle ist repräsentativ für drei unabhängige Versuchsdurchführungen.
Bakterienstamm
A. hydrophila 42
A. hydrophila 60
10
++
+/-
Inkubationszeit (min)
20
+++
+/-
30
+++
+
Ergebnisse
116
4.4.1.4
Adhäsion von Bakterien an mit Mukus beschichteten Mikrotiterplatten
4.4.1.4.1
Vergleich von Mikrotiterplatten
Nach halbstündiger Inkubation von Schweinemagenmuzin in Konzentrationen von 1,0, 0,5
und 0,1 Milligramm pro Milliliter und Natriumchloridlösung mit mittels Syto® 9 markierten
Bakterien (A. hydrophila 42) in verschieden beschichteten Mikrotiterplatten, ergaben sich
Unterschiede in der Fluoreszenzintensität. Während bei Verwendung von Mikrotiterplatten
mit Nunclon®-Beschichtung bei allen Konzentrationen des Schweinemagenmuzins die
Fluoreszenzintensität annähernd konstant blieb, nahm die Fluoreszenzintensität bei
Verwendung von Platten mit Maxisorp®-Beschichtung mit sinkender Konzentration ab und
erreichte bei einer Konzentration von 0,1 Milligramm pro Milliliter annährend das Niveau der
Kontrolle (s. Abb. 4.21). Obwohl die Fluoreszenzintensitäten bei Verwendung der
Maxisorp®-Platte generell niedriger waren, als die bei Verwendung der Nunclon®-Platte,
wurden für die weiteren Versuche aufgrund der spezifischeren Messergebnisse Maxisorp®-
160
140
120
100
80
60
40
20
0
Nunclon
A. hydrophila 42
Kontrolle
5mg/ml
1mg/ml
0,5mg/ml
Konzentration Schweinemagenmuzin
Fluoreszenzintensität
Fluoreszenzintensität
Platten eingesetzt.
160
140
120
100
80
60
40
20
0
Maxisorp
A. hydrophila 42
Kontrolle
5mg/ml
1mg/ml
0,5mg/ml
Konzentration Schweinemagenmuzin
Abbildung 4.21: Messung der Fluoreszenzintensität von mittels Syto® 9 markierten
Bakterien der Gattung A. hydrophila 42 in Mikrotiterplatten mit Nunclon®- und Maxisorp®Beschichtung. Die Abbildung ist repräsentativ für drei unabhängige Messungen.
Ergebnisse
4.4.1.4.2
117
Vergleich verschiedener Inkubationszeiten
Die benötigte Inkubationszeit von fluoreszenzmarkierten A. hydrophila 42 an den intestinalen
Mukus unbehandelter Karpfen wurde untersucht. Die Fluoreszenzintensität stieg bei
Inkubationszeiten zwischen zehn und 30 Minuten kontinuierlich an, blieb zwischen 30 und 60
Minuten etwa auf dem gleichen Niveau und war nach 120 Minuten deutlich erniedrigt (s.
Fluoreszenzintensität
Abb. 4.22). Für die weiteren Versuche wurde eine Inkubationszeit von 30 Minuten gewählt.
500
A. hydrophila 42
400
300
200
100
0
10
20
30
60
120
Minuten Minuten Minuten Minuten Minuten
Inkubationszeit
Abbildung 4.22: Vergleich unterschiedlicher Inkubationszeiten bei der Messung von mittels
Syto® 9 markierten Bakterien der Gattung A. hydrophila Stamm 42 an intestinalen Mukus von
Karpfen. Die Abbildung ist repräsentativ für drei unabhängige Messungen.
4.4.2
Adhäsion von Bakterien an den intestinalen Mukus unbehandelter
Karpfen
4.4.2.1
Versuchsfische
Die für die Adhäsionsversuche verwendeten acht Karpfen wiesen ein Körpergewicht
zwischen 81,5 und 106,4 Gramm und ein Darmgewicht zwischen 0,75 und 1,59 Gramm auf
(s. Tab. 4.20). Diese Daten waren normalverteilt.
Ergebnisse
118
Tabelle 4.20: Körpergewicht und Darmgewicht der für die Adhäsionsversuche verwendeten
Karpfen. X: Mittelwert, s: Standardabweichung.
Anzahl der Tiere
unbehandelte Karpfen
4.4.2.2
8
Körpergewicht (g)
X
s
96,24
12,35
Darmgewicht (g)
X
s
1,20
0,30
Adhäsion unterschiedlich virulenter A. hydrophila Stämme an den intestinalen
Mukus
Zunächst wurde die Adhäsionsfähigkeit der Bakterien an Glykoproteine bestimmt, die nach
Auftrennung des intestinalen Mukus auf einer Sepharose-CL-4B®- Säule in den Peaks 1 und 2
sowie dem Schulterbereichs der Elutionsprofile unbehandelter Karpfen aufgefangen wurden.
Die erhaltenen Werte wurden mittels der bekannten Kohlenhydratgehalte der Fraktionspools
korrigiert.
Angegeben
werden
jeweils
die
gemittelten
Werte
der
Fluoreszenzintensitätsmessungen von sechs Karpfen. Die stärkste Fluoreszenzintensität trat
bei Adhäsion von A. hydrophila 42 an die Moleküle aus dem Bereich der Schulter des
Elutionsprofils mit einem gemittelten Wert von 245,1 Fluoreszenzeinheiten auf. Die
Bindungsfähigkeit der Bakterien an die Moleküle aus Peak 1 des Elutionsprofils war mit einer
gemittelten Fluoreszenzintensität von 97,0 höher als an die Moleküle aus Peak 2 mit einem
gemittelten Wert von 70,2 (s. Tab. 4.21).
Tabelle 4.21: Ermittelte Fluoreszenzintensität bei Bindung von A. hydrophila Stamm 42 an
die drei Fraktionspools des intestinalem Mukus von sechs Karpfen. Die Tabelle ist
repräsentativ für drei unabhängige Messungen je Mukusprobe.
A. hydrophila 42
Gesamte Fraktionen
Peak 1
Schulterbereich
Peak 2
Fluoreszenzintensität rel. Fluoreszenzintensität (%)
412,2
100
97,0
24
245,1
59
70,2
17
Ergebnisse
119
Im Vergleich der A. hydrophila Stämme untereinander ergab sich ein Unterschied in der
Adhäsionsfähigkeit zwischen den Stämmen. Bezogen auf die Moleküle des Peak 1 wies
A. hydrophila 60 die niedrigste, A. hydrophila 38 die höchste Adhäsionsfähigkeit auf.
Bei der Analyse aller drei Fraktionspools ergab sich ein vergleichbares Bild (s. Abb. 4.23).
Die Adhäsion war bei allen drei Stämmen an die Moleküle aus dem Schulterbereich des
Elutionsprofils am stärksten. Insgesamt wies A. hydrophila 38 in jedem der drei
Fraktionspools die höchste Fluoreszenzintensität auf.
Fluoreszenzintensität
500
400
*
*
*
*
*
*
300
A. hydrophila 38
A. hydrophila 42
A. hydrophila 60
*
*
*
200
100
0
Peak 1
Schulter
Peak 2
Abbildung 4.23: Semiquantitative Analyse der Adhäsionsfähigkeit von mittels Syto® 9
markierten A. hydrophila 38, 42 und 60 an die Glykoproteine, die nach Auftrennung des
intestinalen Mukus aus Karpfen auf einer Sepharose-CL-4B®-Säule in Peak 1, der Schulter
und Peak 2 erhalten wurden. Gezeigt werden Mittelwert und Standardabweichungen
photometrischer Messungen von sechs Karpfen. Statistisch signifikante Unterschiede
(p<0,05) bei der Bindung der unterschiedlichen Bakterienstämme sind bezogen auf den
jeweiligen Fraktionspool mittels * dargestellt. Die Abbildung ist repräsentativ für drei
unabhängige Messungen je Mukusprobe.
Im Verhältnis war die Adhäsionsfähigkeit von A. hydrophila Stamm 42 sechsmal höher als
die von Stamm 60. A. hydrophila Stamm 38 adhärierte dreizehnmal stärker an den Mukus der
Karpfen als A. hydrophila 60. Diese Unterschiede waren statistisch hochsignifikant (p<0,001).
Die prozentuale Verteilung der Bindungsfähigkeit an die Moleküle der drei Fraktionspools
des Elutionsprofils war bei allen Stämmen vergleichbar.
Ergebnisse
120
4.4.2.3
Adhäsion weiterer fischpathogener Keime an den intestinalen Mukus
Zum Vergleich der Adhäsionsfähigkeit von obligat- sowie fakultativ-pathogenen bakteriellen
Infektionserregern wurde die Bindungsfähigkeit von A. salmonicida, E. tarda sowie
Y. ruckeri an intestinalen Mukus des Karpfens ermittelt. Auch die für Fische obligatpathogenen Bakterien wiesen die höchste Fluoreszenzintensität an Moleküle des
Schulterbereichs des Elutionsprofils auf. Zudem war die Adhäsion der Bakterien an die
Moleküle des ersten Peaks höher, als an die des zweiten Peaks (s. Abb. 4.24). Die
Adhäsionsfähigkeit der obligat-pathogenen bakteriellen Infektionserreger war dabei mit
Ausnahme von A. salmonicida stärker als die der geprüften Stämme des fakultativpathogenen Bakteriums A. hydrophila. Während die Adhäsionsfähigkeit bei der Bindung von
Y. ruckeri nur geringgradig höher war, als die der A. hydrophila Stämme und vergleichbar mit
der des A. hydrophila Stammes 38, adhärierte E. tarda am stärksten an den isolierten Mukus
(s. Abb. 4.25). Unter den obligat-pathogenen Bakterien wies Y. ruckeri eine dreimal stärkere
Bindung und E. tarda eine dreizehnmal stärkere Bindung an den Mukus von Karpfen auf, als
A. salmonicida. Es ergaben sich zwischen allen obligat-pathogenen Bakterien statistisch
hochsignifikante Unterschiede (p<0,001) in der Bindungsfähigkeit an den intestinalen Mukus
des Karpfens.
Ergebnisse
3000
Fluoreszenzintensität
2500
E. tarda
Y. ruckeri
A. salmonicida
*
121
*
*
2000
1500
*
*
1000
*
*
*
*
500
0
Peak 1
Schulter
Peak 2
Abbildung 4.24: Semiquantitative Analyse der Adhäsionsfähigkeit von mittels Syto® 9
markierten E. tarda, Y. ruckeri und A. salmonicida an die Glykoproteine, die nach
Auftrennung des intestinalen Mukus aus Karpfen auf einer Sepharose-CL-4B®-Säule in Peak
1, der Schulter und Peak 2 erhalten wurden. Gezeigt werden Mittelwert und
Standardabweichungen photometrischer Messungen von sechs Karpfen. Statistisch
signifikante Unterschiede (p<0,05) bei der Bindung der unterschiedlichen Bakterienstämme
sind bezogen auf den jeweiligen Fraktionspool mittels * dargestellt. Die Abbildung ist
repräsentativ für drei unabhängige Messungen je Mukusprobe.
A. hydrophila 60
*
A. hydrophila 42
A. hydrophila 38
*
**
* *
* *
A. salmonicida
*
* *
*
*
Y. ruckeri
E. tarda
0
1000
2000 3000 4000
Fluoreszenzintensität
5000
*
6000
Abbildung 4.25: Vergleichende Darstellung der Adhäsionsfähigkeit von fischpathogenen
Bakterien (A. hydrophila, A. salmonicida, E. tarda und Y. ruckeri) an intestinalen Mukus von
Karpfen. Dargestellt sind Mittelwert und Standardabweichungen fluoreszenzphotometrischer
Messungen der Bindung von Syto® 9 markierten Bakterien an Glykoproteine aus dem
Darmmukus von sechs Karpfen. Statistisch signifikante Unterschiede (p<0,05) sind mittels *
dargestellt. Die Abbildung ist repräsentativ für drei unabhängige Messungen je Mukusprobe.
Ergebnisse
122
4.4.3
In vitro Adhäsion von A. hydrophila an den intestinalen Mukus von Karpfen
nach oraler Bakterienapplikation
Um Veränderungen in der Adhäsionsfähigkeit von Bakterien an den intestinalen Mukus nach
bakterieller Applikation zu ermitteln, wurden die Mukusproben von Karpfen, die
Natriumchloridlösung, A. hydrophila 38 und A. hydrophila 60 erhalten hatten, untersucht. Die
Adhäsionsfähigkeit von A. hydrophila 38 und 60 wurde an diesem Mukus in vitro überprüft.
Statistisch signifikante Änderungen der Adhäsionsfähigkeiten wurden für die beiden mit
Bakterien behandelten Karpfengruppen vergleichend zur Kontrollgruppe (NaCl) ermittelt.
Zusammenfassend ließ sich beobachten, dass A. hydrophila 38 an allen Tagen nach
Applikation deutlich stärker an den intestinalen Mukus aller untersuchter Karpfen adhärierte
als A. hydrophila 60 (s. Abb. 4.26). Wurde Karpfen Natriumchloridlösung appliziert, war die
Bindungsfähigkeit von A. hydrophila 38 an intestinale Glykoproteine, die drei oder sechs
Tage nach Applikation isoliert wurden, gegenüber Mukus unbehandelter Karpfen verringert.
Eine Applikation von A. hydrophila 60 in den Darm von Karpfen resultierte an den Tagen
eins bis sechs in Mukus, an den A. hydrophila 38 eine deutlich gesteigerte Adhäsionsfähigkeit
zeigte. Bei Applikation von A. hydrophila 38 in den Darm von Karpfen vermochte
A. hydrophila 38 einen Tag nach der Applikation schlechter an den Mukus zu binden; an den
folgenden Tagen entsprach die Adhäsion von A. hydrophila 38 etwa dem Niveau, das bei
Kontrollkarpfen gemessen wurde. A. hydrophila 60 band deutlich besser an Glykoproteine,
die sechs bis zehn Tage nach oraler Applikation isoliert wurden, wobei keine Unterschiede
zwischen den verabreichten Bakterienstämmen und der Natriumchloridlösung als Kontrolle
zu beobachten waren (s. Abb. 4.26).
Ergebnisse
Fluoreszenzintensität
3000
2500
123
Applikation von NaCl
A. hydrophila 38
A. hydrophila 60
2000
1500
*
*
1000
*
*
500
0
unbehandelt
Tag 1
Tag 3
Tag 6
Tag 10
Tage nach Applikation
Fluoreszenzintensität
3000
2500
2000
Applikation von A. hydrophila 60
A. hydrophila 38
A. hydrophila 60 *
*
*
1500
1000
*
500
*
*
0
unbehandelt
Tag 1
Tag 3
Tag 6
Tag 10
Tage nach Applikation
Fluoreszenzintensität
3000
2500
2000
1500
1000
Applikation von A. hydrophila 38
A. hydrophila 38
A. hydrophila 60
*
*
*
*
500
0
unbehandelt
Tag 1
Tag 3
Tag 6
Tag 10
Tage nach Applikation
Abbildung 4.26: Adhäsion von A. hydrophila 38 und 60 an Mukus von Karpfen in vitro an
Tag eins, drei, sechs und zehn nach Applikation von Natriumchloridlösung, A. hydrophila 60
und A. hydrophila 38. Gezeigt werden die Mittelwerte und Standardabweichungen der
Summe des Peak 1, der Schulter und des Peak 2 photometrischer Messungen (unbehandelt:
n=8; NaCl-Gabe: Tag 1: n=8, Tag 3: n=6, Tag 6: n=6, Tag 10: n=7; A. hydrophila 60: Tag 1:
n=8, Tag 3: n=6, Tag 6: n=5, Tag 10: n=7; A. hydrophila 38: Tag 1: n=7, Tag 3: n=5, Tag 6:
n=6, Tag 10: n=6). Statistisch signifikante Unterschiede (p<0,05) sind im Vergleich zu
unbehandeltem Mukus mittels * dargestellt. Die Abbildung ist repräsentativ für drei
unabhängige Messungen je Mukusprobe.
Ergebnisse
124
Bei der Analyse von Glykoproteine aus dem Mukus, der einen Tag nach Applikation der
Natriumchloridlösung gewonnen wurde, banden A. hydrophila 38 und 60 am stärksten an die
Moleküle des zweiten Peaks des Elutionsprofils, am schwächsten an die des Schulterbereichs
(s. Abb. 4.27). Insgesamt waren jedoch keine großen Unterschiede zwischen den
Fraktionspools zu erkennen. Im Vergleich dazu wiesen die Bakterien an den Mukus der
Fische, die mit A. hydrophila 60 behandelt waren, eine deutlich verstärkte Bindungsfähigkeit
auf. Die Adhäsion von A. hydrophila 38 war innerhalb dieser Gruppe an die intestinalen
Glykoproteine des Peak 2 des Elutionsprofils, also an kleinere Moleküle, am stärksten, am
schwächsten an die großen Moleküle des ersten Peaks. Die niedrigste Bindungsfähigkeit
zeigten beide Bakterienstämme an den intestinalen Mukus der Fische, die mit A. hydrophila
38 behandelt waren, wobei auch innerhalb dieser Gruppe die Bindung der Bakterien an die
Moleküle
aus
dem
zweiten
Peak
des
Elutionsprofils
am
stärksten
war.
Die
Bindungsfähigkeiten der Bakterien an die Mukusproben sind in Abbildung 4.26 dargestellt.
Ein statistisch signifikante (p<0,05) Zunahme der Adhäsionsfähigkeit bestand bei der
Bindung von A. hydrophila 38 an den Mukus der Fische nach Applikation von A. hydrophila
60 im Vergleich zur Kontrollgruppe.
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
Applikation von NaCl
A. hydrophila 38
A. hydrophila 60
Fluoreszenzintensität.
Peak 1
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
Schulter
Fluoreszenzintensität.
Fluoreszenzintensität.
Ergebnisse
Peak 2
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
125
Applikation von A. hydrophila 60
A. hydrophila 38
A. hydrophila 60
Peak 1
Schulter
Peak 2
Applikation von A. hydrophila 38
A. hydrophila 38
A. hydrophila 60
Peak 1
Schulter
Peak 2
Abbildung 4.27: Adhäsion von A. hydrophila 38 und 60 an Mukus von Karpfen in vitro
einen Tag nach Applikation von Natriumchloridlösung (n=8), A. hydrophila 60 (n=8) und
A. hydrophila 38 (n=7). Gezeigt werden Mittelwert und Standardabweichungen
photometrischer Messungen. Die Abbildung ist repräsentativ für drei unabhängige Messungen
je Mukusprobe.
Ergebnisse
126
Am dritten Tag nach Applikation konnte eine deutliche Abnahme der Bindung beider
A. hydrophila Stämme an den Mukus von Karpfen nach Natriumchlorid-Gabe ermittelt
werden (s. Abb. 4.28). An intestinale Glykoproteine aus Karpfen, denen A. hydrophila 38
verabreicht worden war, erhöhte sich die Bindung beider Bakterienstämme. An die
Glykoproteine aus dem Mukus dieser Karpfen vermochte auch A. hydrophila 60 in deutlich
gesteigertem Maße zu binden. An den Mukus von Karpfen, denen A. hydrophila 60 appliziert
worden war, war keine deutliche Änderung zu Tag eins nach Applikation messbar. Beide
Bakterienstämme, A. hydrophila 38 auch 60, adhärierten statistisch signifikant stärker
(p<0,05) an den Mukus aus Karpfen, denen zuvor oral Bakterien appliziert worden waren, als
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
Applikation von NaCl
Fluoreszenzintensität
Peak 1
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
A. hydrophila 38
A. hydrophila 60
Fluoreszenzintensität
Fluoreszenzintensität
an Mukus aus dem Darm von Kontrollfischen.
Schulter
Peak 2
Applikation von A. hydrophila 60
A. hydrophila 38
A. hydrophila 60
Peak 1
Schulter
Peak 2
Applikation von A. hydrophila 38
A. hydrophila 38
A. hydrophila 60
Peak 1
Schulter
Peak 2
Abbildung 4.28: Adhäsion von A. hydrophila 38 und 60 an Mukus von Karpfen in vitro drei
Tage nach Applikation von Natriumchloridlösung (n=6), A. hydrophila 60 (n=6) und
A. hydrophila 38 (n=5). Gezeigt werden Mittelwert und Standardabweichungen
photometrischer Messungen. Die Abbildung ist repräsentativ für drei unabhängige Messungen
je Mukusprobe.
Ergebnisse
127
Sechs Tage nach Applikation war die Bindungsfähigkeit von A. hydrophila 60 im Vergleich
zu den vorherigen Versuchstagen deutlich gesteigert (s. Abb. 4.29). A. hydrophila 38 und 60
adhärierten
stärker
an
Mukus
aus
Karpfen
nach
vorheriger
Applikation
von
Natriumchloridlösung und A. hydrophila 60 als am Tag drei nach Applikation. Im Vergleich
zu Tag drei zeigte A. hydrophila 38 eine verstärkte Adhäsion an die Moleküle des
Schulterbereichs der Elutionsprofile. An den Mukus aus dem Darm von mit A. hydrophila 38
behandelten Karpfen adhärierten Bakterien besser, als an den intestinalen Mukus aus Karpfen
der Kontrollgruppe, wobei gegenüber dem dritten Tag die Adhäsionsfähigkeit von
A. hydrophila 60 gesteigert erschien. A. hydrophila 38 adhärierte signifikant stärker (p<0,05)
an Glykoproteine aus dem intestinalen Mukus von mit A. hydrophila 38 und 60 behandelten
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
Applikation von NaCl
A. hydrophila 38
A. hydrophila 60
Fluoreszenzintensität
Peak 1
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
Schulter
Fluoreszenzintensität
Fluoreszenzintensität
Karpfen als an den Mukus von Karpfen aus der Kontrollgruppe.
Peak 2
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
Applikation von A. hydrophila 60
A. hydrophila 38
A. hydrophila 60
Peak 1
Schulter
Peak 2
Applikation von A. hydrophila 38
A. hydrophila 38
A. hydrophila 60
Peak 1
Schulter
Peak 2
Abbildung 4.29: Adhäsion von A. hydrophila 38 und 60 an Mukus von Karpfen in vitro
sechs Tage nach Applikation von Natriumchloridlösung (n=6), A. hydrophila 60 (n=6) und
A. hydrophila 38 (n=5). Gezeigt werden Mittelwert und Standardabweichungen
photometrischer Messungen. Die Abbildung ist repräsentativ für drei unabhängige Messungen
je Mukusprobe.
Ergebnisse
128
Zehn Tage nach Applikation band A. hydrophila 60 im Vergleich zu den Vortagen in
verstärktem Maße an Glykoproteine aus allen drei Versuchsgruppen (s. Abb. 4.30).
A. hydrophila 38 adhärierte besser als A. hydrophila 60 an Glykoproteine aus allen drei
Versuchsgruppen, die Adhäsion an Glykoproteine aus Karpfen nach A. hydrophila 60
Applikation war jedoch deutlich geringer als an den Vortagen. Es wurde keine
unterschiedliche Adhäsion von A. hydrophila 60 oder A. hydrophila 38 an Mukus aus mit
Bakterien behandelten Karpfen und dem der Kontrollgruppe beobachtet. Dieses beruhte vor
allem auf einer gesteigerten Adhäsion von Bakterien an Glykoproteine aus der
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
Applikation von NaCl
A. hydrophila 38
A. hydrophila 60
Fluoreszenzintensität
Peak 1
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
Fluoreszenzintensität
Fluoreszenzintensität
Kontrollgruppe.
Schulter
Peak 2
1000
900
800
700
600
500
400
300
200
100
0
Applikation von A. hydrophila 60
A. hydrophila 38
A. hydrophila 60
Peak 1
Schulter
Peak 2
Applikation von A. hydrophila 38
A. hydrophila 38
A. hydrophila 60
Peak 1
Schulter
Peak 2
Abbildung 4.30: Adhäsion von A. hydrophila 38 und 60 an Mukus von Karpfen in vitro zehn
Tage nach Applikation von Natriumchloridlösung (n=6), A. hydrophila 60 (n=5) und
A. hydrophila 38 (n=6). Gezeigt werden Mittelwert und Standardabweichungen
photometrischer Messungen. Die Abbildung ist repräsentativ für drei unabhängige Messungen
je Mukusprobe.
Ergebnisse
4.4.4
129
Adhäsion von Bakterien an intestinalen Mukus von Karpfen nach oraler
LPS-Applikation
Die Adhäsion von Bakterien an intestinale Glykoproteine von Karpfen nach Applikation von
LPS wurde mit den Bakterienstämmen A. hydrophila 42 und 60 überprüft. A. hydrophila 42
zeigte generell eine stärkere Bindung an den Mukus als A. hydrophila 60. Bakterien aus
beiden Stämmen adhärierten verstärkt an Glykoproteine, die zwei und drei Tage nach
Applikation des LPS isoliert wurden. Am zweiten Tag nach Applikation von LPS war die
Adhäsion von A. hydrophila 42 und 60 statistisch signifikant (p<0,05) verstärkt im Vergleich
zur Kontrollgruppe. Die Adhäsion von A. hydrophila 42 an Glykoproteine aus Mukus fünf
oder acht Tage nach LPS-Applikation entsprach dem Niveau, wie es bei unbehandelten
Karpfen beobachtet wurde. A. hydrophila 60 zeigte am zehnten Tag nach Applikation von
LPS eine statistisch signifikante (p<0,05) Zunahme der Bindungsfähigkeit im Vergleich zum
Mukus unbehandelter Fische (s. Abb. 4.31).
*
Fluoreszenzintensität
1000
*
A. hydrophila 42
A. hydrophila 60
*
800
600
400
200
0
Kontrolle
Tag 1
Tag 2
Tag 3
Tag 5
Tag 8
Tage nach Applikation
Abbildung 4.31: Adhäsion von A. hydrophila 42 und 60 an Mukus von Karpfen nach
Applikation von LPS (n=4). Gezeigt werden die Mittelwerte der Summe des Peak 1, der
Schulter und des Peak 2 photometrischer Messungen. Statistisch signifikante Unterschiede
zur Kontrollgruppe (Kontrolle) sind mittels * dargestellt. Die Abbildung ist repräsentativ für
drei unabhängige Messungen je Mukusprobe.
Ergebnisse
130
Wurden
gelchromatographisch
aufgetrennte
intestinale
Mukusglykoproteine
auf
Bakterienadhäsion geprüft, ließ sich eine vermehrte Anheftung von A. hydrophila 42 an
Moleküle aus dem ersten Peak und dem Schulterbereich des Elutionsprofils (s. Abb. 4.4)
erkennen (s. Abb. 4.32). Die Adhäsion war in Proben, die einen und zwei Tage nach LPS
Applikation gewonnen wurden, bis auf das Doppelte des Niveaus der Kontrollgruppe erhöht.
An Mukusproben, die ab dem dritten Tag nach der Applikation von LPS gewonnen wurden,
nahm die Adhäsion von A. hydrophila 42 ab und lag auf dem Niveau der Kontrollfische. Die
Adhäsion von A. hydrophila 60 an den Mukus von Karpfen war nach Applikation von LPS
nicht verändert.
A. hydrophila 42
Peak 1
Schulter
Peak 2
400
300
200
100
500
Fluoreszenzintensität
Fluoreszenzintensität
500
A. hydrophila 60
Peak 1
Schulter
Peak 2
400
300
200
100
0
0
Tag 1
Tag 2
Tag 3
Tag 5
Tage nach Applikation
Tag 8
Tag 1
Tag 2
Tag 3
Tag 5
Tage nach Applikation
Tag 8
Abbildung 4.32: Adhäsion von A. hydrophila 42 und 60 an Mukus von Karpfen in vitro nach
Applikation von LPS (n=4). Gezeigt werden die Mittelwerte und Standardabweichungen des
Peak 1, der Schulter und des Peak 2 photometrischer Messungen. Die Abbildung ist
repräsentativ für drei unabhängige Messungen je Mukusprobe.
Ergebnisse
4.4.5
131
Ermittlung möglicher Bindungsstellen von Bakterien an den intestinalen
Mukus
Um näher zu bestimmen, wie die Adhäsion von Bakterien an die Glykoproteine aus dem
intestinalen Mukus von Karpfen vermittelt wird, wurden zum einen durch Glykosidasen
Oligosaccharide von Glykoproteinen aus dem Mukus abgespalten, zum anderen
Bindungsstellen der Bakterien durch Vorinkubation mit Oligosacchariden abgesättigt.
Anschließend wurde die Adhäsion von Bakterien der Gattung A. hydrophila 42 an intestinale
Glykoproteine bestimmt.
4.4.5.1
Adhäsion von Bakterien an den mit Glykosidasen vorbehandelten intestinalen
Mukus
Nach Abspaltung von Mannose von Glykoproteinen aus dem Mukus von Karpfen konnte eine
statistisch signifikante (p<0,05) Verstärkung der Bindungsfähigkeit von A. hydrophila 42
beobachtet werden (s. Abb. 4.33). Der Einsatz weiterer Glykosidasen führte nicht zu
statistisch signifikanten (p>0,05) Änderungen der Bakterienadhäsion. Ein Verdau mit
Neuraminidase führte zu einer geringgradig höheren Bindungsfähigkeit der Bakterien,
während durch die Aktivität von Galaktosidase eine geringgradig schwächere Bindung der
Bakterien an intestinale Glykoproteine beobachtet wurde. Ein Verdau mit AcetylGlukosaminidase hatte keinen deutlichen Einfluss auf die Adhäsionsfähigkeit.
Ergebnisse
132
1000
Acetylglukosaminidase
unbehandelt
Acetylglukosaminidase
1200
Fluoreszenzintensität
Fluoreszenzintensität
1200
800
600
400
200
0
800
Mannosidase
unbehandelt
Mannosidase
*
Schulter
600
400
200
Peak 2
Peak 1
1200
*
*
600
400
200
Fluoreszenzintensität
Fluoreszenzintensität
1000
800
0
Peak 1
1200
1000
Galaktosidase
unbehandelt
Galaktosidase
1000
Schulter
Peak 2
Schulter
Peak 2
Neuraminidase
unbehandelt
Neuraminidase
800
600
400
200
0
0
Peak 1
Schulter
Peak 2
Peak 1
Abbildung 4.33: Adhäsion von A. hydrophila 42 an Glykoproteine aus dem intestinalen
Mukus des Karpfens nach Verdau mit Glykosidasen. Eingesetzt wurden Glykoproteine aus
dem Mukus nach Gelfiltration über eine Sepharose-CL-4B®-Säule. Verwendet wurden
Proteine des Peak 1, der Schulter sowie des Peak 2 des Elutionsprofils unbehandelter Karpfen
(n=6). Gezeigt werden die Mittelwerte und Standardabweichungen photometrischer
Messungen. Statistisch signifikante Unterschiede zur Kontrollgruppe sind mittels *
dargestellt. Die Abbildung ist repräsentativ für drei unabhängige Messungen je Mukusprobe.
Ergebnisse
4.4.5.2
133
Adhäsion von mit verschiedenen Oligosacchariden vorbehandelten Bakterien an
den intestinalen Mukus
Nach Vorinkubation der Bakterien mit Oligosacchariden war die Adhäsionsfähigkeit von
A. hydrophila 42 größtenteils herabgesetzt (s. Abb. 4.34). Nur vereinzelt konnte an die
intestinalen Glykoproteine des Peak 1 des Elutionsprofils eine gering verstärkte
Bindungsfähigkeit beobachtet werden. Keine der Veränderungen ließ sich jedoch statistisch
absichern (p>0,05). Die Absättigung von Bakterien mit N-Acetyl-Laktosamin, Mannose
sowie mit 2-Fukosyl-D-Laktose führte zu einer verringerten Adhäsion. Kein deutlicher
Unterschied zur Kontrollgruppe war nach Vorinkubation der Bakterien mit N-AcetylNeuraminosyl-D-LA und 4-OB-D-Galaktopyranosyl zu beobachten. Eine geringgradig
erhöhte Bakterienadhäsion war nach Inkubation mit diesen Oligosacchariden an die
Glykoproteine des Peak 1 aus dem Elutionsprofil zu erkennen (s. Abb. 4.35).
N-Acetyllaktosamin
2-Fukosyl-D-Lactose
Mannose
323,54
4-OB-D-Galaktopyranosyl
N-Acetylneuraminosyl-DLA
PBS-Puffer
0
500
1000
1500
Fluoreszenzintensität
Abbildung 4.34: Adhäsion von A. hydrophila 42 nach Vorbehandlung mit unterschiedlichen
Oligosacchariden an die Summe des Peak 1, der Schulter sowie des Peak 2 des Mukus
unbehandelter Karpfen (n=6). Gezeigt werden die Mittelwerte und Standardabweichungen
photometrischer Messungen. Die Abbildung ist repräsentativ für drei unabhängige Messungen
je Mukusprobe.
Ergebnisse
134
800
N-Acetyllaktosamin
PBS-Puffer
N-Acetyllactosamin
1000
Fluoreszenzintensität
Fluoreszenzintensität
1000
600
400
200
0
Schulter
2-Fukosyl-D-Lactose
2-Fucosyl-D-Lactose
400
200
0
Fluoreszenzintensität
Peak 1
Schulter
Peak 2
800
PBS-Puffer
4-OB-D-Galactopyranosyl
600
400
200
0
Peak 1
800
200
1000 4-OB-D-Galaktopyranosyl
PBS-Puffer
600
1000
400
Peak 2
Fluoreszenzintensität
Fluoreszenzintensität
800
600
0
Peak 1
1000
800
N-Acetylneuraminosyl-D-LA
PBS-Puffer
N-Acetylneuraminosyl-D-LA
Schulter
Peak 2
Schulter
Peak 2
Peak 1
Schulter
Peak 2
Mannose
PBS-Puffer
Mannose
600
400
200
0
Peak 1
Abbildung 4.35: Adhäsion von A. hydrophila 42 nach Inkubation mit Oligosacchariden an
den Peak 1, den Schulterbereich und den Peak 2 des intestinalen Mukus unbehandelter
Karpfen (n=6). Gezeigt werden Mittelwerte und Standardabweichungen photometrischer
Messungen. Die Abbildung ist repräsentativ für drei unabhängige Messungen je Mukusprobe.
Diskussion
5
135
Diskussion
Fische in Aquakulturanlagen und in Aquarien sind häufig einer hohen Anzahl von
Mikroorganismen ausgesetzt, die sich im Hälterungswasser befinden oder über Futtermittel
eingetragen werden. Aeromonas hydrophila ist ein im Wasser weit verbreitetes Bakterium,
mit dem sich das Immunsystem von Fischen in Hälterungsanlagen und in der Natur
regelmäßig auseinandersetzten muss. Das Bakterium wird häufig im Zusammenhang mit
Flossenerosionen und Hautgeschwüren isoliert (INGLIS et al. 1993). Da A. hydrophila
allerdings in konditionsstarken, gesunden Fischen meist keine Infektion auslöst (GEIGER
2001), gilt dieser Keim als fakultativ-pathogen. Das Auftreten unterschiedlich virulenter
Stämme von A. hydrophila wird vermutet (HAZEN et al. 1982). Um eine Infektion auslösen
zu können, muss das Bakterium die dermale oder intestinale Mukusschicht des Fisches
überwinden, die die erste Barriere gegen eindringende Pathogene darstellt. Die Mukusschicht
reagiert auf Pathogene durch eine Modulation der Sekretion des Schleims. Beispielsweise
konnte eine Zunahme des sezernierten Mukus der Haut von Karpfen infolge einer Belastung
des Wassers mit A. hydrophila beobachtet werden (BEHRENDT 2005). Es kann davon
ausgegangen werden, dass auch die intestinale Mukussekretion durch eine Applikation von
A. hydrophila beeinflusst wird. Dass Zusammensetzung und Menge des sezernierten
intestinalen Mukus durch bakterielle Noxen moduliert wird, konnte in anderen Studien bereits
belegt werden. Dabei wurde meistens Lipopolysaccharid (LPS) als Bestandteil gramnegativer
Bakterien als Stimulus eingesetzt. In Ratten (ENSS et al. 1996a) und in Mäusen (URLAUB
1998) veränderte sich die Sekretion der intestinalen Glykoproteine nach oraler Applikation
von LPS. Auch in Fischen konnte eine Änderung der Zusammensetzung des intestinalen
Mukus als Folge einer oralen LPS-Applikation nachgewiesen werden (NEUHAUS 2005).
Unklar war jedoch, ob die Applikation lebender Bakterien die Mukussekretion ebenfalls
beeinflusst. In dieser Studie sollte daher untersucht werden, in welcher Weise die Sekretion
des intestinalen Mukus nach Applikation verschieden virulenter Stämme von A. hydrophila
moduliert wird. Besondere Berücksichtigung fand dabei die Zusammensetzung des nach der
Bakterienapplikation gewonnenen Mukus im Hinblick auf seinen Kohlenhydrat- und
Proteingehalt. Die Adhäsion bakterieller Infektionserreger an Mukus oder auch an Zellen wird
als erster Schritt in der Pathogenese der meisten Infektionserkrankungen angesehen
Diskussion
136
(BEACHEY 1981; TSE u. CHADEE 1991; RINKINEN et al. 2000). Fraglich ist, ob
unterschiedlich virulente Stämme eines Bakteriums sich in ihrer Adhäsionsfähigkeit
unterscheiden. Die Adhäsionsfähigkeit an intestinalen Mukus von drei Stämmen
A. hydrophila
sowie
von
verschiedenen
anderen
für
Fische
obligat-pathogenen
Infektionserregern (A. salmonicida, E. tarda, Y. ruckeri) wurde aus diesem Grund untersucht.
Nachdem Daten über die Adhäsionsfähigkeit der Bakterien an den intestinalen Mukus
unbehandelter Fische vorlagen, wurde in einem zweiten Schritt die Bindung verschiedener
A. hydrophila Stämme an den Mukus von Fischen, denen Bakterien zuvor oral appliziert
worden waren, untersucht. Ziel war, mögliche Änderungen der Adhäsionsfähigkeit von
A. hydrophila an Mukus, der durch eine bakterielle Applikation moduliert worden war, zu
ermitteln. Änderungen der Adhäsionsfähigkeit sind möglicherweise beteiligt am Verlauf einer
bakteriellen Infektion.
5.1
Virulenz und Pathogenität der eingesetzten Bakterien
Karpfen sollten unterschiedlich virulente A. hydrophila Stämme oral appliziert werden, um
Änderungen der intestinalen Mukussekretion infolge der Bakterienapplikation ermitteln zu
können. Für die Untersuchungen standen drei A. hydrophila Stämme zur Verfügung, die als
Stamm 38, 42 und 60 bezeichnet wurden. Über die Stämme 42 und 60 lagen Ergebnisse einer
biochemischen Untersuchung vor. Weitere Daten bezüglich der Unterschiede dieser Stämme
waren nicht bekannt. A. hydrophila 38 war nicht näher charakterisiert worden. Daher war es
notwendig, weitere Untersuchungen zur Charakterisierung durchzuführen. Insbesondere
sollten mögliche Virulenzunterschiede der Stämme ermittelt werden.
Eine biochemische Untersuchung mittels einer kommerziellen bunten Reihe zeigte keine
Unterschiede zwischen den Stämmen 42 und 60 und nur sehr geringe Unterschiede zu Stamm
38. Diese Ergebnisse erlaubten keine Rückschlüsse auf die Virulenz der Bakterienstämme.
A. hydrophila 60 führte im Hämagglutinationstest in höheren Verdünnungen als die beiden
anderen A. hydrophila Stämme noch zu einer Hämagglutination der verwendeten
Diskussion
137
Fischerythrozyten. Fasst man die Fähigkeit zur Hämagglutination als Virulenzmerkmal auf,
wäre A. hydrophila 60 virulenter als die anderen Stämme einzustufen.
Mit Hilfe des CAMP-Tests (CHRISTIE et al. 1944) wurden bereits in früheren Studien
verschiedene Subspezies der Gattung Aeromonas untersucht (GUBASH 1997), wobei teils
Korrelationen zwischen positiven Testergebnissen und der Enterotoxizität sowie der
Zytotoxizität der Bakterien festgestellt wurden (RAHIM et al. 2004). Der Test fiel bei den
drei untersuchten Stämmen negativ aus. Setzt man eine Korrelation zwischen der
Enterotoxizität und einer positiven CAMP-Reaktion voraus, so sind alle eingesetzten
A. hydrophila Stämme als nicht enterotoxisch einzustufen.
Die Versuche zur Zytotoxizität in vitro wurden an EPC-Zellen, einer Zelllinie des Karpfens,
durchgeführt. Diese Zelllinie wurde in verschiedenen Studien bereits genutzt, um
Interaktionen von Zellen mit fischpathogenen Bakterien, so zum Beispiel mit A. hydrophila
(LEUNG et al. 1996; LEE et al. 1997; FANG et al. 1998; LOW et al. 1998; TAN et al. 1998;
CHU u. LU 2005), E. tarda (LING et al. 2000) und Vibrio ssp. (WANG et al. 1998) zu
untersuchen. Die Zelllinie wurde ausgewählt, da der Zelltyp demjenigen entspricht, mit dem
Pathogene im Zuge einer Infektion vermutlich als erstes in Kontakt kommen. In früheren
Untersuchungen wurden die Zellen mit Bakteriensuspensionen zwischen 105 (LEUNG et al.
1996; LOW et al. 1998) und 106 (CHU u. LU 2005) KbE für 30 Minuten inkubiert. In der
eigenen Studie wurden Konzentrationen von 105 und 107 KbE gewählt und die
Inkubationszeit wurde auf bis zu 24 Stunden verlängert. Auf diese Weise war es möglich,
Änderungen der Zellmorphologie über einen längeren Zeitraum zu beobachten. Da die
Auswertung mikroskopisch erfolgte, konnte nur semiquantitativ bestimmt werden, in
welchem Ausmaß die Zellen nach der jeweiligen Inkubationszeit beeinträchtigt waren. Die
Zytotoxizität der untersuchten A. hydrophila Stämme war in vitro abhängig von der
Inkubationszeit sowie der Bakterienkonzentration. Während bei einer Konzentration von 105
KbE pro Milliliter nur A. hydrophila 38 eine zytotoxische Wirkung auf EPC-Zellen zeigte,
konnte diese bei Einsatz von 107 KbE pro Milliliter ebenfalls für A. hydrophila 42 festgestellt
werden. A. hydrophila 60 zeigte in keiner eingesetzten Konzentration eine zytotoxische
Wirkung. In früheren Studien konnte gezeigt werden, dass die Fähigkeit zur Adhäsion von
A. hydrophila an Zellen mit der Enteropathogenität dieser Bakterien korrelierte (KIROV et al.
138
Diskussion
1995). In Versuchen mit A. hydrophila und EPC-Zellen konnte nur bei Inkubation der Zellen
mit virulenten Stämmen, nicht aber mit avirulenten Stämmen, zytopathogene Befunde
erhoben werden (LEUNG et al. 1996). Es kann daher vermutet werden, dass Stamm 38 und in
gewissem Maße Stamm 42 für Fische virulent sind, Stamm 60 dagegen avirulent. Die durch
die Bakterien verursachten morphologischen Veränderungen der Zellen wurden vermutlich
durch Umstrukturierungen des Zytoskeletts als Folge des Eindringens der Erreger in die
Zellen hervorgerufen (LEUNG et al. 1996). In vielen Studien wurden zudem Exotoxine von
A. hydrophila, wie Hämolysin und Enterotoxine, beschrieben, die zytotoxisch auf Fischzellen
wirkten (LEUNG et al. 1996; LOW et al. 1998). Dabei scheint es unterschiedliche
Hämolysingene bei einzelnen A. hydrophila Stämmen zu geben, wobei ihre Kombination die
Zytotoxizität der Stämme bestimmt (WANG et al. 2003). Die Toxine scheinen aber nicht
allein für die zytotoxischen Wirkungen der Bakterien verantwortlich zu sein, da sie keine so
deutlichen Veränderungen der Zellmorphologie auslösen konnten, wie komplette Bakterien
(LOW et al. 1998). Da auch avirulente Stämme über die Toxine verfügen, können diese nicht
als Kennzeichen der Virulenz angesehen werden. Das Wachstum und metabolische
Aktivitäten der Bakterien scheinen hierfür eine bedeutendere Rolle zu spielen als die
Produktion von Exotoxinen (LOW et al. 1998).
In unterschiedlichen Studien wurde die Fähigkeit von A. hydrophila, in Zellen einzudringen,
untersucht. Während einige Autoren dies nicht nachweisen konnten (KAWULA et al. 1996),
gehen andere von einer Invasionsfähigkeit virulenter, nicht jedoch avirulenter Stämme aus
(LEUNG et al. 1996). Wahrscheinlich ist ein Eindringen der virulenten Stämme in Zellen, die
auf diese Weise in der Lage wären, das Immunsystem des Fisches zu umgehen, um eine
Krankheit auszulösen. Das Eindringen von Bakterien in Zellen wird dabei als
Selektionskriterium gewertet, welches pathogene und virulente Bakterien von anderen
unterscheidet (LEUNG et al. 1996).
Die Zytotoxizität der als obligat-pathogen eingeschätzten bakteriellen Infektionserreger
E. tarda und Y. ruckeri war vergleichbar mit der von A. hydrophila 38. Dass die Änderungen
in der Zellmorphologie nach Inkubation von EPC-Zellen mit Y. ruckeri, einem Pathogen von
Salmoniden, nach sechs Stunden noch nicht in dem Maße ausgebildet waren, wie bei
A. hydrophila 38 und E. tarda, könnte darauf beruhen, dass in dieser Studie eine
Diskussion
139
Karpfenzelllinie verwendet wurde. In einer anderen Studien wurde eine Abhängigkeit der
Adhäsionsfähigkeit von Y. ruckeri an Zellen von der verwendeten Zelllinie beobachtet
(ROMALDE u. TORANZO 1993). Auch die nicht beobachtete Zytotoxizität von
A. salmonicida, ebenfalls einem Pathogen, welches in erster Linie bei Salmoniden zu
Erkrankungen führt, könnte durch die verwendete Karpfenzelllinie erklärt werden. Zusätzlich
könnte die Unbeweglichkeit von A. salmonicida ein Grund dafür sein, dass die Zellen auch
nach einer Inkubationszeit von 24 Stunden mit diesen Bakterien keine morphologischen
Änderungen aufwiesen. E. tarda führte auch in früheren Studien zu einer Veränderung von
EPC-Zellen, wobei nachgewiesen werden konnte, dass die Bakterien sowohl an die Zellen
adhärierten als auch in diese eindrangen (LING et al. 2000).
Ob die in dieser Studie verwendeten Bakterienstämme in der Lage sind, in EPC-Zellen
einzudringen, konnte durch die mikroskopischen Untersuchungen nicht geklärt werden. Da
sich der A. hydrophila Stamm 38 aber bei einer Inkubation mit EPC-Zellen ebenso verhielt,
wie die obligat-pathogenen Bakterien E. tarda und Y. ruckeri, kann vermutet werden, dass
dieser Stamm ebenfalls für Fische virulent ist. A. hydrophila 60, welches keine zytotoxische
Wirkung zeigte, scheint dagegen avirulent zu sein. Die Virulenz von A. hydrophila 42 liegt
offenbar zwischen der der beiden anderen Stämme, ist aber nicht eindeutig zu beurteilen.
Bei den durchgeführten in vivo Untersuchungen zur Ermittlung der Virulenz der
A. hydrophila Stämme, erwies es sich als schwierig, Krankheitssymptome bei den
verwendeten Karpfen auszulösen. Die Beobachtung, dass manifeste Infektionen unter
Laborbedingungen nur sehr schwer zu erzielen sind, konnte auch in anderen Studien bereits
gemacht werden (KAWULA et al. 1996). Die Fische verstarben entweder perakut oder
zeigten keine Anzeichen einer Erkrankung (KAWULA et al. 1996). In dieser Studie verstarb
nach der intraperitonealen Injektion von A. hydrophila 60 ein Karpfen. Der Todesfall wurde
auf die Applikationsart zurückgeführt, da eine große Gefahr der Verletzung innerer Organe
durch eine intraperitoneale Gabe besteht. Nach oraler Applikation von A. hydrophila 38
verstarben zwei Karpfen, während A. hydrophila 42 und 60 keine Symptome bei den Tieren
hervorriefen. Aus den Organen der verstorbenen Karpfen, denen A. hydrophila 38 appliziert
worden war, konnten hochgradige Gehalte an A. hydrophila isoliert werden. Nach
Applikation von A. hydrophila 60 wurde nur aus der Leber eines Fisches A. hydrophila
Diskussion
140
isoliert. Ähnliche Ergebnisse konnten nach Infektion von Platies (Xiphophorus sp. maculatus)
mit A. hydrophila ermittelt werden. Nur aus Organen von Tieren, die an der Infektion
verstorben waren, konnten Bakterien isoliert werden, nicht aber aus Organen der
überlebenden Fische (KAWULA et al. 1996).
Aufgrund der in vitro Untersuchungen zur Zytotoxizität und der in vivo Versuche wurde für
alle weiteren Untersuchungen die Hypothese zugrunde gelegt, dass A. hydrophila 38 virulent,
A. hydrophila 60 dagegen avirulent ist. Das Ergebnis des Hämagglutinationstests wurde dabei
als weniger aussagekräftig angesehen.
5.2
Klinische und mikrobiologische Befunde nach Bakterienapplikation
A. hydrophila 38 und 60 wurden Karpfen oral appliziert. Der intestinale Mukus dieser Tiere
sollte nach der Applikation an verschiedenen Tagen gewonnen und untersucht werden.
Vor der Applikation der Bakterien wurden die Fische über einen Zeitraum von drei Tagen
nicht gefüttert. Auf diese Weise sollte erreicht werden, dass der intestinale Mukus ohne
Verunreinigungen durch Nahrungsbestandteile gewonnen werden konnte, da anderenfalls die
Gefahr bestanden hätte, keine aussagekräftigen Daten bei der Analyse des Mukus zu erhalten
(GUY 2002). Hungerphasen sind für Fische physiologisch und treten beispielsweise im
Winter auf. Es ist bekannt, dass längere Hungerphasen bei Fischen zu einer Veränderung der
histologischen Struktur im Darm in Form einer Proliferation der Becherzellen und einer
Infiltration von Leukozyten in die Lamina propria führen. Diese Symptome konnten bei
Karpfen nach vierwöchigem Fasten beobachtet werden (BOZIC et al. 2001). In
amerikanischen Flundern (Pseudopleuronectes americanus) wurde nachgewiesen, dass die
Proliferation der Epithelzellen des Darms vom Fütterungsstatus der Fische abhängt (TRIER u.
MOXEY 1980). Da die Karpfen im Rahmen der eigenen Studie nur für sehr kurze Zeit kein
Futter erhielten und zwischen den einzelnen Gruppen keine Unterschiede bezüglich der
Fütterung bestanden, kann davon ausgegangen werden, dass lediglich geringe Abweichungen
zum physiologischen Status vorhanden waren, die bei allen Fischen ähnlich ausgeprägt sein
Diskussion
141
dürften. Aus diesem Grund wurden eventuelle Änderungen des histologischen Aufbaus der
Darmmukosa in den Ergebnissen nicht berücksichtigt.
Die Karpfen wurden bei einer Wassertemperatur von 20°C gehältert. Diese Temperatur
entspricht derjenigen, bei der bei Goldfischen die höchsten Mortalitätsraten nach Infektionen
mit A. hydrophila beobachtet wurden (RAHMAN et al. 2001a). Die Gruppengröße wurde
nach Abwägung der statistischen Aussagekraft und Tierschutzaspekten auf acht Fische je
Probennahmetag festgelegt. Da in einer vorangegangenen Arbeit die Reaktionen der
intestinalen Mukosa des Karpfen acht Tage nach oraler LPS-Applikation noch nicht
abgeschlossen waren (NEUHAUS 2005), wurde in dieser Studie ein Versuchszeitraum von
zehn Tagen gewählt.
In verschiedenen Studien wurden Fischen bakterielle Infektionserreger oder deren
Bestandteile in Form von LPS verabreicht. Die Applikationswege reichten dabei über eine
Zugabe der Bakterien ins Hälterungswasser der Fische in Konzentrationen von 1010 KbE pro
200 Liter (BEHRENDT 2005) bis 108 KbE pro Milliliter, intramuskuläre Injektionen von
Bakteriensuspensionen in Konzentrationen von 107 bis 105 KbE (FANG et al. 2000),
intraperitoneale Gaben von Bakterien in Konzentrationen zwischen 105 und 107 KbE (DALE
et al. 1997) bis hin zu oraler Verabreichung von LPS (NEUHAUS 2005). Da sich natürliche
Infektionen aller Wahrscheinlichkeit nach über das Wasser oder durch orale Aufnahme
manifestieren, wurde in dieser Studie die orale Applikation gewählt. Die Konzentration wurde
durch Ergebnisse näher gehender Versuche festgelegt. Da nicht ausgeschlossen werden
konnte, dass Änderungen der Muzinsekretion allein durch eine Flüssigkeitsapplikation
entstanden, wurde den Fischen der Kontrollgruppe die gleiche Flüssigkeitsmenge in Form von
Natriumchloridlösung
verabreicht,
die
die
anderen
Karpfen
in
Form
einer
Bakteriensuspension erhielten.
Es konnten nach Applikation der Bakterien während des gesamten Versuchzeitraums keine
gravierenden pathologischen Veränderungen an den Karpfen festgestellt werden. Allerdings
war auffällig, dass besonders die Fische, denen A. hydrophila 38 appliziert worden war,
vermehrt Rötungen der Flossen sowie lokal begrenzter Hautbezirke aufwiesen. Wenige
Fische, denen Natriumchloridlösung und A. hydrophila 60 appliziert worden war, wiesen
ebenfalls die geschilderten Symptome auf. Es ist bekannt, dass A. hydrophila in
Diskussion
142
Stresssituationen zu Krankheitsausbrüchen führen kann (LEUNG et al. 1995). Möglich ist ein
Auftreten dieser Rötungen bedingt durch den Stress, den das Umsetzten in ein anderes
Hälterungsbecken, das Fasten und nicht zuletzt die Manipulation durch die Applikation
verursacht haben. Dennoch erschien das vermehrte Auftreten von Symptomen bei Fischen,
denen A. hydrophila 38 appliziert worden war, eine Bestätigung zu sein, dass dieser Stamm
virulent sein könnte. Verwunderlich ist in diesem Zusammenhang nicht, dass keine
schwerwiegenden Symptome auftraten. So zeigten in anderen Studien mit A. hydrophila nur
Platies, die aufgrund der Infektion verstarben, Krankheitssymptome, während überlebende
Fische klinisch gesund erschienen (KAWULA et al. 1996).
Die Vermutung, dass es sich bei A. hydrophila 38 um einen virulenten Stamm handeln
könnte, wurde zusätzlich durch die Ergebnisse der mikrobiologischen Untersuchung
untermauert. Auch hier konnten insbesondere aus Organen der Karpfen Bakterien isoliert
werden, denen A. hydrophila 38 verabreicht wurde. Zwar konnte nur in einem der Fälle
A. hydrophila isoliert werden, doch sprach die vermehrte Anzahl der nachgewiesenen
Bakterien für eine Störung der Darmbarriere. Ein Zusammenbruch der intestinalen Barriere
konnte bereits in anderen Studien bei einer Zunahme von mit der Schleimhaut assoziierten
Bakterien festgestellt werden (KATAYAMA et al. 1997). Offenbar konnten Bakterien, die
aller Wahrscheinlichkeit nach bereits zuvor als Bestandteil der intestinalen Mikroflora im
Darm vorlagen, das Epithel durchdringen und sich im Organismus verbreiten. In
Infektionsversuchen von Platies mit A. hydrophila war die Reisolierung des eingesetzten
Bakteriums ebenfalls nur aus Organen der Fische möglich, die aufgrund der Infektion
verstarben, nicht jedoch aus den Organen überlebender Fische (KAWULA et al. 1996).
Die Ergebnisse bekräftigen die Hypothese, dass A. hydrophila 38 virulent, A. hydrophila 60
weniger virulent ist. Das Auftreten von Krankheitssymptomen war abhängig von der
Applikationsart
und
Gegebenheiten
spielen
der
applizierten
zusätzlich
Bakterienkonzentration.
Umweltparameter,
wie
Unter
natürlichen
physikalisch-chemische
Wasserwerte sowie weitere Erkrankungen der Fische bei der Ausbildung einer manifesten
Infektion eine Rolle (INGLIS et al. 1993). Unter Laborbedingungen werden dagegen diese
Einflüsse ausgeschlossen.
Diskussion
5.3
143
Mukusanalyse
Aufgrund des Befalls innerer Organe mit bakteriellen Infektionserregern konnte vermutet
werden, dass die intestinale Infektionsbarriere bei diesen Fischen durchbrochen wurde. Eine
wichtige Rolle in der Infektionsabwehr kommt der dem Epithel aufliegenden Mukusschicht
zu. Daher wurde untersucht, ob nach einer oralen Applikation von A. hydrophila Stämmen
Sekretion und Zusammensetzung des Mukus im Darm von Karpfen moduliert wird. Anhand
der pathologischen und der mikrobiologischen Untersuchung ließ sich erkennen, dass die
beiden eingesetzten A. hydrophila Stämme einen unterschiedlichen Einfluss auf den
Intestinaltrakt der Karpfen hatten.
Die Gewinnung des intestinalen Mukus wurde in früheren Studien auf verschiedene Weise
durchgeführt.
Dabei
kam
unter
anderem
die
Gewinnung
durch
zweimalige
Ethanolpräzipitation zum Einsatz (SANFORD et al. 1989; RINKINEN et al. 2000). Häufiger
wurde der Mukus mittels eines Gummispatels von der Darmschleimhaut separiert (GARCIA
et al. 1997; CHABRILLON et al. 2004; LAUKOVA et al. 2004; GUEIMONDE et al. 2005).
Dieses Verfahren führt zwangsläufig zu einer mechanischen Beeinflussung der intestinalen
Mukosa. Durch die Beschädigung der Zellen kann es zu einer verstärkten Degeneration der
Muzine kommen (KHATRI et al. 1998). Möglicherweise spiegelt der so gewonnene Mukus
nicht mehr die physiologischen Gegebenheiten wider. Aus diesem Grund wurde ein anderes
Verfahren angewendet, welches bereits mehrfach zur schonenden Isolierung des intestinalen
Mukus von Ratten (ENSS et al. 1995; ENSS et al. 1996a; ENSS et al. 1996b), Mäusen
(URLAUB 1998) und auch Karpfen (NEUHAUS 2005) eingesetzt wurde. Hierbei wurde der
Mukus durch ein Spülmedium von der Schleimhaut gelöst, wodurch eine mechanische
Beeinflussung soweit wie möglich vermieden wurde.
Um aussagekräftige Ergebnisse zu erhalten, wurde in den erwähnten Studien ein Gramm
Darm für die Mukusisolierung verwendet (ENSS et al. 1996a; URLAUB 1998). Da der
gesamte Darm der eingesetzten Karpfen etwa ein Gewicht von einem Gramm aufwies,
wurden die kompletten Därme genutzt. Die erhaltenen Ergebnisse wurden auf das jeweilige
Darmgewicht der Karpfen bezogen, so dass Fehler aufgrund unterschiedlicher Darmgewichte
minimiert werden konnten.
144
Diskussion
Ziel war, den gesamten intestinalen Mukus eines jeden Fisches zu gewinnen. Zur Isolierung
des Mukus war es notwendig, die mukushaltigen Lösungen in mehrere unterschiedliche
Gefäße, so zum Beispiel zur Konzentrierung in die Ultrafiltrationszelle, zu überführen.
Obwohl jedes zur Isolierung und zur weiteren Auftrennung verwendete Behältnis nach der
Umfüllung des Mukus sorgfältig mit Puffer nachgespült wurde, um möglichst alle Mukusreste
überführen zu können, kann ein geringer Verlust an Mukus durch diese Vorgänge nicht
ausgeschlossen werden. Da die Mukusverluste in jeder Probe ähnlich sein dürften, wurde
dieser Fehler bei der weiteren Analyse des Mukus vernachlässigt.
Um einen Abbau der Muzine durch Proteasen und Bakterien zu vermeiden, wurden die
Därme während der Mukusgewinnung kontinuierlich gekühlt. Nach der Gewinnung sowie
nach der Konzentrierung in der Ultrafiltrationszelle wurden die Proben bei einer Temperatur
von -20°C gelagert. Die Auftrennung nach Molekülgröße mittels Gelfiltration fand bei 10°C
statt. Eine Beeinflussung des Mukus durch bakterielle Einwirkung kann trotz dieser
Maßnahmen nicht vollständig ausgeschlossen werden, da die intestinale Mikroflora von
Fischen aus Bakterien besteht, die sich größtenteils bei niedrigen Temperaturen, auch unter
10°C, vermehren können. Auf diese Weise war ein geringer Einfluss durch bakteriellen
Abbau der Muzine möglich. Auf das bei der Gewinnung und Lagerung von Mukus mittels des
oben beschriebenen Verfahrens in anderen Studien eingesetzte Gemisch aus verschiedenen
Antibiotika wurde bewusst verzichtet. Da der aufgetrennte Mukus anschließend für
Untersuchungen der bakteriellen Adhäsionsfähigkeit an intestinale Glykoproteine dienen
sollte, war es notwendig, keine antimikrobiell wirkenden Substanzen einzusetzen. Da der
mögliche bakterielle Abbau des Mukus für jede Probe gleich sein müsste, wurde er in den
weiteren Untersuchungen vernachlässigt.
Der isolierte Mukus wurde im Hinblick auf seinen Kohlenhydrat- und Proteingehalt mittels
der PAS- (MANTLE u. ALLEN 1978) und der Bradford-Reaktion (BRADFORD 1976)
untersucht. Beide Reaktionen geben einen Überblick über die Gesamtgehalte an
Kohlenhydraten und Proteinen in einer Lösung, lassen allerdings keine Rückschlüsse auf die
nähere Zusammensetzung zu. Im Intestinaltrakt liegt der Mukus zusammen mit anderen
Substanzen, wie abgeschilferten Zellen, Zelltrümmern und weiteren Sekreten, die
Kohlenhydrate und Proteine als Bestandteile enthalten, vor (ALLEN u. CARROLL 1985).
Diskussion
145
Um die spezifischen Kohlenhydrat- und Proteingehalte der Mukusglykoproteine zu ermitteln,
wurden diese Substanzen durch mehrfache Zentrifugationsschritte sowie durch Ultrafiltration
bei einer Porengröße von 30.000Da entfernt.
Die Glykoproteine des Mukus, die Muzine, bestehen aus einem zentral liegenden Kernprotein
mit daran anhaftenden Kohlenhydratseitenketten (STROUS u. DEKKER 1992; CONE 1999).
Muzine sind gekennzeichnet durch das Auftreten von Regionen die reich an Prolin, Threonin
und Serin (PTS-Regionen) sind. Diese sich wiederholenden Aminosäuresequenzen werden als
„tandem repeats“ bezeichnet (STROUS u. DEKKER 1992; CONE 1999). Da es sich
vermutlich bei den intestinalen Glykoproteinen mit kleinem Molekulargewicht, die in dieser
Studie gewonnen wurden, nicht um fertig ausgebildete Muzine im Sinne dieser Definition
handelt, werden die aus dem Darm von Karpfen gewonnenen Mukusglykoproteine im
Folgenden als Glykoproteine bezeichnet.
Der Kohlenhydratanteil der Glykoproteine ist aufgrund seiner Lage leichter zugänglich, als
der Proteinanteil. Es muss daher davon ausgegangen werden, dass der Proteinanteil nur im
Bereich der schwach glykosilierten Endstücke der Glykoproteine mittels üblicher
Nachweismethoden detektiert werden kann (VARIYAM u. HOSKINS 1983). Daher scheint
die PAS-Reaktion die sensitiveren Ergebnisse über den Aufbau der intestinalen Glykoproteine
zu liefern. Aus diesem Grund wurden auch die Ergebnisse dieser Reaktion genutzt, um den
quantitativen Gehalt an Glykoproteinen im Mukus abzuschätzen. In degradierten intestinalen
Glykoproteinen, in denen der Proteinanteil überwiegt und deutlich weniger Kohlenhydrate
vorhanden sind, kämen für eine Umrechnung ebenfalls die Daten der Proteinbestimmung in
Betracht. Für die Umrechnung der ermittelten optischen Dichten der PAS-Reaktion in Gramm
intestinales Glykoprotein wurden die optischen Dichten nach PAS-Reaktion der Eichsubstanz
Schweinemagenmuzin in einer bekannten Konzentration verwendet. Da es sich hierbei um
standardisierte Muzine eines Säugetieres handelt, die aus dem Magen gewonnen wurden,
kann der Glykoproteingehalt des intestinalen Mukus der Karpfen nur geschätzt werden. Die
Zusammensetzung der Glykoproteine des Mukus von Fischen und Säugern variiert durch das
Vorhandensein unterschiedlicher Kohlenhydratseitenketten (KIMURA et al. 1994).
Außerdem bestehen Unterschiede bezüglich des Aufbaus der Muzine in Magen und Darm.
Die Muzine des Magens besitzen eine kleinere Molekülgröße und weisen eine weniger starke
Diskussion
146
Glykosilierung auf, als die des Darms. Da kein standardisiertes Mukusglykoprotein aus dem
Fischdarm erhältlich ist, war die in dieser Studie angegebene Umrechnung die einzige
Möglichkeit, den Gehalt an intestinalem Glykoprotein im Mukus annähernd abzuschätzen.
Eine exakte Quantifizierung der isolierten Glykoproteinmenge würde zusätzlich Kenntnisse
über die genaue Zusammensetzung der Kohlenhydratseitenketten voraussetzen, da die
Anfärbbarkeit durch die PAS-Reaktion bei hohen N-Acetyl-Galaktosamin-Gehalten gut ist,
wohingegen bei hohen Fukose-Gehalten eine schlechte Anfärbbarkeit zu beobachten ist
(DUBOIS et al. 1956).
Es konnte anhand der Elutionsprofile nach Gelfiltration gezeigt werden, dass die Applikation
unterschiedlicher A. hydrophila Stämme zu Veränderungen in der Menge und der
molekularen Zusammensetzung des Mukus führte. Die erhaltenen Elutionsprofile wiesen zwei
Peaks und einem dazwischen gelegenen Schulterbereich auf. Im ersten Peak waren reife, nicht
degradierte Muzine einer Größe von mehr als 2.000kDa enthalten, im zweiten Peak kleinere
Moleküle einer Größe bis unter 670kDa, die degradiert oder noch nicht ausgereift waren. Im
dazwischen gelegenen Schulterbereich waren Moleküle mit einer Größe zwischen 2.000kDa
und 670kDa in geringerer Menge enthalten.
Als Kontrolle dienten Mukusproben von Fischen, denen 0,9%ige Natriumchloridlösung
verabreicht
worden
war.
Vergleicht
man
die
Elutionsprofile
des
Mukus
nach
Natriumchloridapplikation mit denen von unbehandeltem Mukus, so fällt sowohl im
Kohlenhydrat- als auch im Proteingehalt eine Zunahme kleinerer Moleküle auf. Diese
Ergebnisse belegen eine Änderung der intestinalen Glykoproteine allein durch Applikation
einer Flüssigkeit. Als Reaktion auf die Applikation wurden vermehrt Glykoproteine aus den
Becherzellen ausgeschleust, wobei an Tag sechs nach Applikation der Anteil der kleineren
Moleküle signifikant erhöht war. Nach dieser Freisetzung lagen an Tag zehn im Lumen des
Darms signifikant weniger Glykoproteine vor. Dieses Ergebnis spricht dafür, dass die
Becherzellen zwischen dem dritten und zehnten Tag nach Applikation massiv entleert
wurden, und innerhalb dieses kurzen Zeitraums eine Neusynthese von Mukus nicht möglich
war,
so
dass
die
Mukusgesamtmenge
im
Darmlumen
stark
abnahm.
Eine
Natriumchloridkonzentration von 0,9% kann Fischen appliziert werden, da diese eine
ähnliche Zusammensetzung des Blutes aufweisen wie Säugetiere (ROBERTS 1989). Die
Diskussion
147
verwendete Natriumchloridkonzentration liegt demnach im physiologischen Bereich, so dass
eine Reaktion der intestinalen Mukosa infolge dieser Salzkonzentration nicht wahrscheinlich
ist. Eine Reizung kann allerdings durch die Ausdehnung der Darmwand aufgrund der
Flüssigkeitsapplikation möglich sein. Aufgrund dieser Befunde wurden die Ergebnisse der
Mukusanalyse der Fische, denen A. hydrophila 38 und 60 verabreicht worden war, nicht mit
den Elutionsprofilen der unbehandelten Fische, sondern mit denen der Fische aus der
Kontrollgruppe verglichen.
Betrachtet man im Vergleich zum Mukus der Kontrollgruppe denjenigen der Fische, denen
A. hydrophila 60 verabreicht wurde, so fällt eine Zunahme der Mukusgesamtmenge sowie ein
höherer Gehalt an kleineren Molekülen bereits am Tag drei nach Applikation auf. Dies spricht
für eine Ausschleusung von Mukus aus den Becherzellen, wobei auch noch nicht ausgereifte
Moleküle ins Darmlumen entlassen wurden. Am sechsten Tag nach Applikation reduzierte
sich die Mukusgesamtmenge im Darmlumen wieder, um an Tag zehn nach Applikation in
etwa auf die Menge, die am ersten Tag zu messen war, zu sinken. Vergleichend zur
Kontrollgruppe schien nach Applikation von A. hydrophila 60 sowohl die Ausschleusung des
Mukus als auch die Normalisierung der Sekretion schneller abzulaufen. Eine Zunahme der
Proteinmenge fiel an Tag eins und drei nach Applikation auf. An beiden Tagen war ebenfalls
insbesondere der Gehalt an kleineren Molekülen stark erhöht. Da diese kleinen Moleküle in
der Regel noch nicht vollständig glykosiliert sind, haben die Bradford-Farbmoleküle bei
diesen Molekülen einen leichteren Zugang zum Proteinanteil, so dass dieser besser
nachgewiesen werden kann (VARIYAM u. HOSKINS 1983). Eine Sekretion unvollständig
synthetisierter Glykoproteine als Antwort auf eine Noxe wird von anderen Autoren ebenfalls
diskutiert. Dabei soll eine unvollständige Glykosilierung in Form von fehlenden
Neuraminsäuren vorliegen (TSE u. CHADEE 1991). Es wird vermutet, dass nicht-pathogene
Bakterien bei Menschen eine Zunahme der sezernierten Mukusmenge auslösen (LEIPER et
al. 2001). Die vermehrte Mukussekretion führt im Darm dann zu einem abspülenden Effekt,
wodurch Infektionserreger zusammen mit dem Mukus aus dem Körper ausgeschleust werden.
Dieser Effekt konnte bei oraler Gabe von LPS an Karpfen ebenfalls beobachtet werden
(NEUHAUS 2005). Der Vorgang der verstärkten Muzinsekretion kann daher als
Abwehrmechanismus des Organismus angesehen werden (SMIRNOVA et al. 2003). Die
148
Diskussion
Ausbildung manifester Infektionen kann auf diese Weise wahrscheinlich in vielen Fällen
verhindert werden.
Interessant ist die Veränderung der sezernierten Mukusmenge im Darm der Kontrollfische
und der Fische, die A. hydrophila 38 erhalten hatten. Bereits am ersten Tag nach Applikation
von A. hydrophila 38 konnte eine signifikante Abnahme der Gesamtmukusmenge beobachtet
werden. An Tag drei war so gut wie kein Mukus mehr im Darmlumen vorhanden. Erst an Tag
sechs und Tag zehn nach Applikation konnte eine geringe Zunahme der Mukusmenge
beobachtet werden, die allerdings zu Versuchende noch nicht das Ausgangsniveau erreicht
hatte. Die Proteinkonzentration war ebenfalls an Tag eins und drei nach Applikation stark
erniedrigt, erhöhte sich aber an Tag sechs. Da die intestinalen Glykoproteine im ersten Peak
des Elutionsprofils massiv vermindert waren, kann davon ausgegangen werden, dass das
Darmepithel nicht ausreichend vor Noxen aus dem Darmlumen geschützt war. Nur diese
hochmolekularen Glykoproteine sind in der Lage, die Viskosität des Mukus aufrecht zu
erhalten und somit das Epithel vor eindringenden Erregern zu schützen (BANSIL et al. 1995;
PEREZ-VILAR u. HILL 1999). Die Applikation von A. hydrophila 38 führte offenbar zu
einem massiven Verlust der Mukusmenge im Darmlumen. Hierbei ist nicht eindeutig zu
klären, ob die Becherzellen bereits innerhalb des ersten Tages nach Applikation massiv
entleert wurden und somit keine weitere Ausschleusung von Glykoproteinen möglich war,
oder ob die Bakterien eine Freisetzung der Glykoproteine aus den Becherzellen verhindern
konnten. Für unterschiedliche Stämme von Yersinia enterocolitica konnte nachgewiesen
werden, dass virulente Stämme im Gegensatz zu nicht-virulenten Stämmen in der Lage
waren, intestinale Glykoproteine in kleinere Moleküle zu degradieren (MANTLE u.
ROMBOUGH 1993). Die Vermutung liegt nah, dass auch A. hydrophila 38 in der Lage ist,
eine Degradation der im Darmlumen befindlichen Glykoproteine zu verursachen und so die
Mukusschicht zu zerstören. Da verschiedene Bakterien, unter anderem A. hydrophila
(ASCENCIO et al. 1998), den intestinalen Mukus als Kohlenhydrat- und Stickstoffquelle
nutzen können (MANTLE u. ROMBOUGH 1993), ist es möglich, dass A. hydrophila 38
ebenfalls dazu in der Lage ist. Dadurch könnten die Bakterien im Darmlumen überleben und
sich vermehren. Für Yersinia enterocolitica wird die Produktion von Exoglykosidasen und
proteolytische Enzyme vermutet (MANTLE u. ROMBOUGH 1993). Auch wird vermutet,
dass durch bakterielle Abspaltung der Kohlenhydratseitenketten ein proteolytischer Abbau
Diskussion
149
des Proteinanteils, der dann ungeschützt vorliegt, durch Verdauungsenzyme stattfindet
(VARIYAM u. HOSKINS 1983). Demnach ist denkbar, dass A. hydrophila 38
Kohlenhydratanteile
der
Glykoproteine
abspaltet
und
der
Proteinanteil
durch
Verdauungsenzyme abgebaut wird. In jedem Fall könnten sowohl A. hydrophila selbst wie
auch weitere Pathogene, sollten sie auf die ungeschützte Mukosa des Darms treffen, leichter
Infektionen auslösen als bei einer intakten intestinalen Mukusschicht.
Die Ergebnisse der Mukusanalyse nach vorheriger Applikation von A. hydrophila 60 sind mit
denen früherer Untersuchungen vergleichbar. In Studien an Ratten, denen LPS als Bestandteil
gramnegativer Bakterien verabreicht wurde, konnte eine Zunahme der Mukussekretion bereits
am ersten bis zum fünften Tag nach Applikation nachgewiesen werden. Diese Hypersekretion
des Mukus wurde als Entzündungsreaktion interpretiert (ENSS et al. 1996a). Veränderungen
der Glykoproteingesamtmenge konnten ebenfalls nach oraler Applikation von LPS an
Karpfen festgestellt werden. Hierbei kam es zu einer Abnahme der intestinalen
Glykoproteinmenge insbesondere an Tag zwei und drei nach Applikation durch eine massive
Entleerung der Becherzellen. Die Vermutung lag nahe, dass aufgrund dieser Entleerung der
Becherzellen sezernierungsfähige Glykoproteine aus den Stapelvesikeln fehlten (NEUHAUS
2005). Bei Versuchen zur Enterotoxizität, bei denen A. hydrophila in den Dünndarm von
Kaninchen verbracht wurde, konnte ebenfalls eine Freisetzung des Mukus aus den
Becherzellen beobachtet werden (ANNAPURNA u. SANYAL 1977). Auch bei einer
Infektion von Ratten mit dem Nematoden Nippostrongylus brasiliensis konnte eine
Hyperplasie der Becherzellen in der Mukosa nachgewiesen werden (ISHIKAWA et al. 1993).
Die eigenen Daten belegen, dass ein Stimulus in Form von Bakterien die Zusammensetzung
des intestinalen Mukus verändern kann. Die Reaktionszeit der intestinalen Glykoproteine
betrug dabei mindestens zehn Tage. Besonders nach Gabe von A. hydrophila 38 war nach
diesem Zeitraum die Neusynthese von Glykoproteinen noch nicht abgeschlossen. Aufgrund
der höheren Körpertemperatur bei homoiothermen Säugetieren lassen sich mukosale
Reaktionen in einem Zeitraum von ein bis zwei Tagen bestimmen (ENSS et al. 1996a;
URLAUB 1998). Bei poikilothermen Fischen hängt ein solcher Zeitraum eng mit der
Hälterungstemperatur zusammen. Aufgrund der Ergebnisse der oralen LPS-Gabe an Karpfen
wurde vorgeschlagen, den Versuchszeitraum bei Fischen von dort eingesetzten acht Tagen auf
150
Diskussion
die Dauer von zehn Tagen zu erhöhen (NEUHAUS 2005). Im Rahmen der eigenen Studie
zeigte sich jedoch, dass die verwendeten Bakterienstämme zusätzlich zum Temperaturfaktor
eine bedeutende Rolle bei der Zeitspanne mukosaler Reaktionen spielten. Aus diesem Grund
scheint es ratsam, bei bakteriellen Applikationen einen längeren Versuchszeitraum als zehn
Tage zu wählen.
Da intestinale Glykoproteine als Reaktion auf die Bakterienapplikation verstärkt sezerniert
wurden, waren die Speichervesikel in den Becherzellen schnell entleert und eine Neusynthese
von Mukusglykoproteinen war erforderlich. Diese Neusynthese in Form kleinerer Moleküle
konnte nach Verabreichung von A. hydrophila 60 insbesondere ab Tag sechs nach
Applikation beobachtet werden, Ansätze waren bereits am dritten Tag nach Applikation zu
erkennen. Nach Applikation von A. hydrophila 38 konnte die Neusynthese ebenfalls an Tag
sechs nach Applikation festgestellt werden.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Applikation von verschiedenen Stämmen von
A. hydrophila die Sekretion der intestinalen Glykoproteine in unterschiedlicher Weise
moduliert. Während A. hydrophila 60 offenbar schnell aus dem Intestinaltrakt entfernt werden
kann, scheint A. hydrophila 38 die intestinale Mukusschicht zu zerstören und infolgedessen
Infektionen auslösen zu können. Da auch LPS innerhalb kurzer Zeit aus dem Darm des
Karpfen eliminiert werden konnte (NEUHAUS 2005), scheint die Enteropathogenität von
Bakterien nicht allein von diesem Endotoxin, welches als Bestandteil der Zellwand in
gramnegativen Bakterien auftritt, abzuhängen. Die Reaktion der Intestinalmukosa der Fische
war nach Applikation von A. hydrophila 60 und LPS ähnlich ausgeprägt. Es kann daher
vermutet werden, dass LPS, welches sich auch in der Zellwand von A. hydrophila 60 befindet,
die Reaktion der intestinalen Mukosa beeinflusst. A. hydrophila 38 dagegen scheint zusätzlich
zu LPS in der Zellwand über weitere Strukturen oder Eigenschaften zu verfügen, die eine
Ausschleusung des Bakteriums verhindert. Hier könnte ein Zusammenhang zwischen der
Adhäsionsfähigkeit der beiden Bakterienstämme und der Beeinflussung des intestinalen
Mukus bestehen.
Im Anschluss an die Mukusanalyse mittels der PAS- und der Bradford-Reaktion fand die
Bestimmung der terminalen Glykosilierung der Mukusproben statt. Diese Untersuchung sollte
Aufschluss darüber geben, ob infolge der Applikation von Bakterien eine Sekretion nicht
Diskussion
ausgereifter
Mukusglykoproteine
stattfindet.
Da
151
die
Kohlenhydratseitenketten
der
Mukusglykoproteine im physiologischen Zustand den enzymatischen Abbau der Moleküle
verhindern, kann eine modulierte Sekretion möglicherweise diese Funktion beeinträchtigen.
Als Konsequenz könnte der Mukus abgebaut werden und die Schutzfunktion für die
Darmmukosa entfallen. Das durchgeführte lektinbindende Verfahren wurde zur Untersuchung
der Glykosilierung des intestinalen Mukus von Ratten entwickelt (ENSS et al. 1995). Es
wurden fünf Lektine eingesetzt, die an spezifische, im Mukus von Fischen regelmäßig
vorkommende Oligosaccharide binden. Für diese Analyse wurden zunächst die Mukusproben
in einer Gelfiltration nach Molekülgröße aufgetrennt. Anschließend wurden die Fraktionen
entsprechend der Abbildung 4.4. vereinigt, so dass im ersten Fraktionspool (Peak 1) Moleküle
mit einem Molekulargewicht von mehr als 2.000kDa enthalten waren, in einem zweiten
Fraktionspools Moleküle von ca. 670 bis 2.000kDa (Schulter) und in einem dritten Pool
Moleküle einer Größe von weniger als 670kDa (Peak 2) enthalten waren. Glykoproteine aus
diesen drei Fraktionspools wurden zusammen mit Lektinen inkubiert, und die Lektinbindung
kolorimetrisch (photometrisch) bestimmt. Die erhaltenen Werte wurden auf das jeweilige
Darmgewicht der Karpfen sowie auf den Kohlenhydratgehalt des jeweiligen Fraktionspools
bezogen.
Die Kohlenhydrate, die durch das lektinbindende Verfahren (Lektin-ELISA) nachgewiesen
werden konnten, waren Mannose, die an Mukusglykoproteinen N-glykosidisch gebunden
vorliegt, sowie N-Acetyl-Galaktosamin, Galaktose, Fukose und Neuraminsäure, die Oglykosidisch gebunden vorliegen (ENSS et al. 1995). In der Literatur sind infolge von
Infektionen mit Endotoxinen (BEHRENDT 2005; NEUHAUS 2005) und Parasiten
(ISHIKAWA et al. 1993) Änderungen der Zusammensetzung des Kohlenhydratanteils der
Glykoproteine des Mukus beschrieben.
Insgesamt fiel auf, dass am ersten und besonders am dritten Tag nach Applikation von
A. hydrophila 60 die Gehalte an Kohlenhydraten im Mukus der Fische deutlich absanken, und
im weiteren Verlauf wieder anstiegen. Dies lässt vermuten, dass alle in den Becherzellen
gespeicherten Mukusglykoproteine, auch wenn deren Synthese noch nicht vollständig
abgeschlossen war, in das Darmlumen ausgeschleust wurden, um die bakteriellen Erreger
durch den erwähnten abspülenden Effekt zu beseitigen. Im Mukus der Fische, denen
Diskussion
152
A. hydrophila 38 verabreicht worden war, kam es teils ebenfalls am dritten Tag und teils erst
am sechsten Tag nach Applikation zu einer Verminderung der Menge der untersuchten
Kohlenhydrate. Abnahmen des Kohlenhydratgehaltes in den Glykoproteinen wurden auch bei
Menschen
mit
entzündlichen
Darmerkrankungen
in
Form
verkürzter
Kohlenhydratseitenketten und vermehrter Bildung von Galaktose, Acetyl-Galaktosamin und
Neuraminsäureverbindungen festgestellt (RHODES 1997).
Mannose macht in den hochmolekularen intestinalen Glykoproteinen nur einen geringen
Anteil der Kohlenhydrate aus, tritt aber vermehrt in den niedermolekularen Glykoproteine auf
(SZENTKUTI u. ENSS 1998). Im ersten Peak der Elutionsprofile konnte daher, wie erwartet,
in allen drei Fischgruppen weniger Mannose nachgewiesen werden, als im zweiten Peak. Da
Mannose als typischer Bestandteil N-gebundener Oligosaccharide auftritt (STROUS u.
DEKKER 1992), und diese bereits früh in der Synthese an den Proteinkern gebunden werden
(FORSTNER 1995), spricht die Zunahme des Mannosegehaltes besonders an Tag eins nach
Applikation im Mukus von Fischen, denen A. hydrophila 38 appliziert worden war, für ein
vermehrtes Auftreten unausgereifter Mukusglykoproteine.
Ein großer Anteil des Grundgerüstes der Kohlenhydratketten wird durch α-Galaktosamin
gebildet (URLAUB 1998). Aus diesem Grund spricht ein hoher Gehalt dieses Zuckers für
lange Kohlenhydratseitenketten. Im ersten Peak sowie im Schulterbereich der Elutionsprofile
konnte daher auch durchschnittlich mehr α-Galaktosamin nachgewiesen werden, als im
zweiten Peak. Der Gehalt an α-Galaktosamin im Mukus der Fische nach Applikation von
A. hydrophila 38 nahm zunächst ab und stieg erst am zehnten Tag nach Applikation an.
Dieses Ergebnis spricht für einen abnehmenden Gehalt an langen Kohlenhydratseitenketten,
wodurch die Theorie des bakteriellen Abbaus der Mukusglykoproteine unterstützt wird. Im
Mukus nach Applikation von A. hydrophila 60 konnte am dritten Tag eine Abnahme des
Gehaltes an α-Galaktosamin ermittelt werden, am sechsten Tag eine deutliche Zunahme. Dies
deutet auf einen höheren Gehalt an unfertigen Molekülen an Tag drei hin, an Tag sechs
scheinen die Moleküle bereits längere Seitenketten zu besitzen.
Vorwiegend in unreifen Mukusglykoproteinen tritt β-Galaktosamin auf. Besonders an Tag
sechs nach Applikation waren die Gehalte an β-Galaktosamin im Mukus der Fische jeder
Gruppe hoch. Die höchsten Gehalte traten im Bereich der Schulter des Elutionsprofils auf,
Diskussion
153
was die Vermutung zulässt, dass vermehrt unreife Mukusglykoproteine mittlerer
Molekülgröße sezerniert worden waren. Im Vergleich der Gruppen untereinander wies
besonders der Mukus der Fische, denen A. hydrophila 38 verabreicht worden war, die
höchsten Gehalte an β-Galaktosamin auf. Dies könnte für eine Freisetzung unreifer Moleküle
sprechen, die zum Ausgleich zu den durch die Bakterien degradierten ausgereiften Molekülen
sezerniert wurden.
Unter physiologischen Bedingungen ist neben Fukose und N-Acetyl-Galaktosamin auch
Neuraminsäure terminal an die Kohlenhydratseitenketten der Glykoproteine des Mukus
gebunden (ENSS et al. 1995). Diese dient als Schutz der zentralen Zucker vor Glykosidasen.
Eine Zunahme des Gehaltes an Neuraminsäure kann im sezernierten Mukus nach einer
Reizung der Mukosa (ENSS et al. 1992) und im Mukus von Patienten mit entzündlicher
Darmerkrankung (RHODES 1997) beobachtet werden. In dieser Studie konnten generell nur
niedrige Gehalte an Neuraminsäure im Mukus ermittelt werden. Eine Zunahme des
Neuraminsäuregehaltes an Tag sechs und zehn nach Applikation konnte im Mukus der
Kontrollgruppe festgestellt werden. Die Applikation der Natriumchloridlösung schien
demnach
bereits
einen
ausreichend
starken
Reiz
für
eine
Modulation
der
Kohlenhydratzusammensetzung darzustellen. Nach Applikation von A. hydrophila 60 waren
im Mukus geringfügig höhere Gehalte an Neuraminsäure im Vergleich zur Kontrollgruppe
messbar. A. hydrophila 38 führte im Mukus zu einer deutlich stärkeren Glykosilierung mit
Neuraminsäure, die in besonders hohen Gehalten drei Tage nach Applikation nachgewiesen
werden konnte. Demnach schien die Reizung der Mukosa durch A. hydrophila 38 besonders
ausgeprägt zu sein.
Auch Fukose konnte, wenn überhaupt, nur in sehr geringen Mengen durch Lektinbindung
nachgewiesen werden. An Tag eins nach Applikation konnte Fukose nur im Mukus der
Fische, denen Bakterien appliziert worden waren, gefunden werden, nicht aber in dem der
Kontrollgruppe. Vergleichbare Ergebnisse liegen aus anderen Studien vor (NEUHAUS 2005).
Fukose scheint demnach im intestinalen Mukus unbehandelter Karpfen nicht von Bedeutung
zu sein. Die durchschnittlich höchsten Fukosegehalte waren nach Applikation von
A. hydrophila 38 messbar. Fukose wird als Chemoattraktans beschrieben, das bakterielle
Infektionserreger, wie Listonella anguillarum (O'TOOLE et al. 1999) und Campylobacter
Diskussion
154
jejuni (HUGDAHL et al. 1988) anlockt. Auf diese Weise könnte die vermehrte Bildung von
Fukose als Reaktion auf eine Bakterienapplikation als Abwehrmechanismus interpretiert
werden. Die durch Lektinbindung nachgewiesenen Fukosegehalte können wahrscheinlich nur
Tendenzen aufzeigen, da Schwierigkeiten beim Nachweis von Fukose mittels Lektinen
beschrieben sind. Durch Bindung anderer Saccharide an Fukose ist diese möglicherweise für
das Lektin schwer zugänglich. Nachweise von Fukose im Mukus gelangen dagegen durch
gaschromatographische Untersuchungen (SZENTKUTI u. ENSS 1998).
Aufgrund
beträchtlicher
individueller
Variationen
waren
die
Ergebnisse
der
Lektinbindungsstudien schwer zu beurteilen. Zusammengefasst kann vermutet werden, dass
der Anteil unausgereifter Muzine infolge der Bakterienapplikation erhöht war, insbesondere
im Mukus der Fische, die A. hydrophila 38 erhalten hatten.
Zur Bestimmung des Lysozymgehaltes im isolierten Mukus kam ein für Fische entwickeltes
Verfahren zum Einsatz (ELLIS 1990). Lysozym kommt in hohen Konzentrationen im Serum
und im Mukus von Fischen vor (ELLIS 1990). Besonders hohe Gehalte finden sich in
Geweben, die reich an Leukozyten sind (ELLIS 1990). Da Lysozym antimikrobielle
Funktionen besitzt, sollte sein Vorhandensein im aufgetrennten Mukus vor der Durchführung
der Adhäsionsversuche mit unterschiedlichen Bakterien ermittelt werden. Zwar konnte
ausgeschlossen werden, dass sich freies Lysozym in den aufgetrennten Mukusproben befand,
da dieses aufgrund seiner Molekülgröße von 14.300Da durch die Konzentrierung des Mukus
in der Ultrafiltrationszelle ausgespült worden war, es war jedoch nicht auszuschließen, dass
Lysozym an Strukturen des Mukus gebunden vorlag. Im Serum von Klieschen (Limanda
limanda) konnte eine signifikante Abnahme des Lysozymgehaltes nach Lagerung bei -26°C
für drei Tage bis drei Wochen beobachtet werden (HUTCHINSON u. MANNING 1996). Da
die Mukusproben vor der Bestimmung des Lysozymgehaltes ebenfalls bei -20°C gelagert
wurde, ist auch in diesem Fall nicht auszuschließen, dass der Gehalt an Lysozym während
dieser Zeit abnahm. Da angenommen werden kann, dass diese Abnahme für alle untersuchten
Proben aufgrund der gleichen Lagerbedingungen vergleichbar war, wurde dieser Aspekt bei
der Auswertung der Ergebnisse vernachlässigt.
Diskussion
155
In keiner der aufgetrennten Mukusproben konnte Lysozym nachgewiesen werden, so dass die
Proben für die Versuche zur Ermittlung der Adhäsionsfähigkeit von Bakterien an Mukus
eingesetzt werden konnten.
5.4
Adhäsion von Bakterien an Mukus
Die Adhäsion von Bakterien an Mukus sowie an Zellen scheint der erste Schritt in der
Pathogenese vieler Infektionserkrankungen zu sein (BEACHEY 1981; TSE u. CHADEE
1991; RINKINEN et al. 2000). Im Rahmen dieser Studie wurde die Adhäsionsfähigkeit von
A. hydrophila, einem fakultativ-pathogenen Krankheitserreger von Fischen, an intestinalen
Mukus von Karpfen untersucht. Mögliche Unterschiede in der Bindungsfähigkeit
verschiedener Stämme dieses Bakteriums sollten ermittelt werden. Es kamen sowohl die
beiden Stämme 38 und 60, die für die Infektionsversuche genutzt wurden, zum Einsatz, sowie
ein weiterer Stamm (A. hydrophila 42).
Die Adhäsion verschiedener Bakterien an den Mukus von Menschen, Säugetieren und auch
Fischen wurde in bisherigen Studien mittels unterschiedlicher Methoden untersucht. Es
wurden
radioaktiv
markierte
Bakterien
(VESTERLUND
et
al.
2005b)
sowie
antikörpervermittelte photometrische Verfahren (OFEK et al. 1986) eingesetzt. Der Vergleich
verschiedener Methoden zur Ermittlung der Adhäsion von Bakterien an Zellen ergab die beste
Reproduzierbarkeit und Sensitivität nach radioaktiver Markierung (VESTERLUND et al.
2005b). Der große Nachteil der Methode besteht zweifelsohne in der Gefahr, die von der
Radioaktivität
ausgeht.
Die
Markierung
bakterieller
Infektionserreger
mittels
Fluoreszenzfarbstoffen erwies sich ebenfalls als gut reproduzierbar, wies allerdings keine
große Sensitivität bei der Untersuchung schlecht adhärierender Bakterien auf. Aufgrund der
geringen Gesundheitsrisiken, schien diese Methode trotzdem am besten geeignet für die
Untersuchung von Bakterienadhäsionen zu sein (VESTERLUND et al. 2005b). Die
Markierung von Bakterien mittels Fluoreszenzfarbstoffen zur Untersuchung der Adhäsion an
den intestinalen Mukus von Karpfen wurde bisher nicht beschrieben.
Diskussion
156
In dieser Studie wurden alle verwendeten Bakterienstämme mittels des Fluoreszenzfarbstoffes
Syto® 9 markiert. Die verwendete Konzentration der Bakterien wurde zum einen anhand
früherer Studien (VESTERLUND et al. 2005b), zum anderen anhand der eigenen Ergebnisse
in Vorversuchen festgelegt. In bisherigen Studien zur Adhäsion von Bakterien wurden diese
in Form von Suspensionen, die Konzentrationen zwischen 107 (MANTLE u. ROMBOUGH
1993; O'TOOLE et al. 1999) und 1010 (MANTLE u. HUSAR 1993, 1994) KbE pro Milliliter
enthielten, eingesetzt. Die Menge der eingesetzten Bakterien wurde daraufhin auf 25µl je
Vertiefung einer Mikrotiterplatte einer 109 KbE pro Milliliter enthaltenden Suspension
festgelegt. Durch das Abzentrifugieren bereits markierter Bakterien und das Resuspendieren
in Natriumchloridlösung ohne Farbstoff, konnte eine unspezifische Fluoreszenz des
verwendeten Lösungsmittels durch überschüssigen Farbstoff ausgeschlossen werden. Es
konnte ein Fluoreszenzfarbstoff eingesetzt werden, da in jedem Adhäsionsansatz nur ein
einzelner Bakterienstamm untersucht wurde. Sollten mehrere Stämme in einem Ansatz
untersucht werden, könnte keine Differenzierung der Stämme stattfinden und die Methode
wäre nicht verwendbar. In einem solchen Fall sollten genetisch modifizierte, fluoreszierende
Bakterien eingesetzt werden (VESTERLUND et al. 2005b). Möglich wäre ebenfalls der
Einsatz
unterschiedlicher
Fluoreszenzfarbstoffe,
die
bei
derselben
Anregung
in
unterschiedlicher Weise das Licht emittieren.
Durch zahlreiche Vorversuche wurde die Methode so festgelegt, dass eine möglichst
spezifische Bindung der Bakterien an den Mukus ermittelt werden konnte. Eine geringe
unspezifische Bindung der Bakterien an den Kunststoff der Mikrotiterplatten konnte nicht
vollständig ausgeschlossen werden. Beispielsweise konnte in einer Studie mit Yersinia
enterocolitica eine Bindung der Bakterien an Polystyrol durch hydrophobe Interaktionen
nachgewiesen werden (MANTLE u. HUSAR 1993). Da keine Unterschiede diesbezüglich
zwischen den eingesetzten Bakterienstämmen ermittelt werden konnten und der Fehler bei
jeder Messung auftrat, wurde er vernachlässigt. Da nicht bekannt war, ob Mukus die
eingesetzten Bakterienstämme chemotaktisch anzieht, wurden diese, um einen zunächst losen
Kontakt zum Mukus herzustellen, zusammen mit dem Mukus in der Mikrotiterplatte kurz
abzentrifugiert. In anderen Studien wurde für verschiedene A. hydrophila Isolate eine
chemotaktische Wirkung des Mukus beobachtet. Dabei war auffällig, dass verdünnter Mukus
eine stärkere Anziehungskraft auf diese Bakterien aufwies, als unverdünnter Mukus. Erklärt
Diskussion
157
werden konnte dieses Phänomen aufgrund der herabgesetzten Viskosität der Mukuslösung,
die zu einer verbesserten Beweglichkeit der Bakterien führt (HAZEN et al. 1982). Da der in
dieser Studie eingesetzte Mukus durch die Auftrennung in der Gelchromatographiesäule, bei
der den Proben kontinuierlich Puffer zugemischt wurde, verdünnt vorlag, kann eine
chemotaktische Anziehungskraft auf die Bakterien durchaus vorhanden sein. Die
Inkubationszeit wurde auf eine halbe Stunde festgelegt. Sie sollte nicht zu lange sein, da bei
fischpathogenen Bakterien die Möglichkeit besteht, dass diese sich bei Raumtemperatur
vermehren (INGLIS et al. 1993) und so zu Verfälschungen der Messergebnisse führen
können. Dieses war in dem kurzen Zeitraum von einer halben Stunde nicht zu befürchten. Im
Anschluss an Inkubation und Waschen wurde die Mikrotiterplatte mit der Öffnung nach unten
auf Zellstoff liegend nochmals kurz abzentrifugiert. Durch diesen Schritt sollte erreicht
werden, dass Bakterien, die dem Mukus auflagen, aber nicht an diesen gebunden hatten, aus
der Platte entfernt wurden. Eine vergleichbare Methode war verwendet worden, um die
Adhäsion von Bakterien an Zellen zu untersuchen (ACORD et al. 2005).
Zunächst wurde die Adhäsion der Bakterien an Mukus unbehandelter Karpfen untersucht. Ein
signifikanter Unterschied zwischen der Adhäsion der drei A. hydrophila Stämme an den
unbehandelten intestinalen Mukus des Karpfens konnte beobachtet werden. Dabei fiel auf,
dass Stamm 60 am schwächsten, Stamm 38 am stärksten an den Mukus adhärierte. Die
Bindungsfähigkeit des Stammes 42 lag zwischen denen der beiden anderen Stämme.
Besonders ausgeprägt war die Bindung der Bakterien an Moleküle mit einem
Molekülargwicht
zwischen
670
und
2.000kDa.
An
kleinere
Moleküle
fiel
die
Adhäsionsfähigkeit schwächer aus. Es ist bekannt, dass die Adhäsion von verschiedenen
Stämmen Yersinia enterocolitica an Mukus mit der Virulenz der Bakterien korreliert
(MANTLE u. HUSAR 1993, 1994). Auch bei der Untersuchung der Adhäsion verschiedener
Stämme von Pseudomonas cepacia an menschlichen intestinalen Mukus war die Bindung der
Stämme, die von Patienten isoliert wurden, die an der Infektion verstarben, höher, als die
derjenigen, die nicht zum Tode führten (SAJJAN et al. 1992). Für A. hydrophila kann eine
ähnliche Korrelation angenommen werden. Dafür sprechen ebenfalls die Ergebnisse der
pathologischen und mikrobiologische Untersuchung sowie der Mukusanalyse nach
Applikation der Bakterien. Die Adhäsion an sich führt nicht zu einer Infektion. Auch
Probiotika, die dem Wirt nutzen, werden nach ihrer Adhäsionsfähigkeit an intestinalen Mukus
158
Diskussion
ausgewählt (VESTERLUND et al. 2005a). Ein Bakterienstamm, der an den Mukus adhäriert,
muss, um eine Infektion des Wirtes auszulösen, über weitere Eigenschaften verfügen. Wie
bereits erwähnt, besitzt die intestinale Mukusschicht eine Abwehrfunktion, die unter anderem
durch die Bindung von Infektionserregern und deren anschließende Elimination aus dem
Organismus im Zuge der Darmmotilität erfolgt. Adhäriert ein Bakterium gut an den
intestinalen Mukus, muss es sich im Folgenden zusätzlich schnell vermehren können und in
der Lage sein, die Mukusschicht zu durchdringen, um die darunter liegenden Epithelzellen zu
erreichen. Die Vermehrungsrate der Bakterien muss demnach höher sein, als die
Erneuerungsrate des intestinalen Mukus (MANTLE u. HUSAR 1993).
Um die Adhäsionsfähigkeiten der drei A. hydrophila Stämme einordnen zu können, wurden
zusätzlich die obligat-pathogenen Bakterien A. salmonicida, E. tarda sowie Y. ruckeri auf ihre
Bindungsfähigkeit an den intestinalen Mukus untersucht. Geht man von einer Korrelation
zwischen Pathogenität und Adhäsionsfähigkeit aus, so sollten beim Einsatz dieser Bakterien
stärkere Bindungsfähigkeiten gemessen werden. Dies war aber nur teilweise der Fall.
Während E. tarda eine deutlich stärkere Adhäsionsfähigkeit und Y. ruckeri eine gering
erhöhte Bindung aufwies, als die A. hydrophila Stämme, konnte für A. salmonicida lediglich
eine Bindungsfähigkeit, die zwischen der der beiden A. hydrophila Stämmen 42 und 60 lag,
nachgewiesen werden. Die Notwendigkeit der Motilität von Bakterien zur Adhäsion an
Mukus oder Zellen und zur Invasion in Zellen wird in der Literatur diskutiert. Während einige
Autoren der Meinung sind, dass Motilität notwendig ist, um in den Wirt einzudringen
(ORMONDE et al. 2000), beschreiben andere, dass für eine Adhäsion an den Mukus diese
Fähigkeit nicht gegeben sein muss (NELSON et al. 1990). A. salmonicida ist unbeweglich, so
dass in Erwägung gezogen werden kann, dass die nur geringe Adhäsionsfähigkeit auf die
fehlende Motilität zurückzuführen sein könnte. Eine weitere mögliche Erklärung der geringen
Adhäsion ist der Umstand, dass es sich insbesondere bei A. salmonicida und Y. ruckeri um
bakterielle Infektionserreger bei Salmoniden handelt. Möglicherweise findet aus diesem
Grund keine optimale Bindung an den Mukus von Karpfen statt. Für einige pathogene
Bakterien konnte eine Wirtsspezifität nachgewiesen werden, zum Beispiel für Neisseria ssp.
(STEPHENS et al. 1982). E. tarda besitzt kein so eingeschränktes Wirtsspektrum wie
A. salmonicida, so dass in diesem Fall eine Reaktion mit cyprinidem Mukus denkbar wäre.
Diskussion
159
Eine Korrelation zwischen der Pathogenität bzw. der Virulenz bakterieller Infektionserreger
kann aufgrund dieser Ergebnisse nur vermutet werden.
Die Adhäsionsfähigkeit der beiden A. hydrophila Stämme 38 und 60 an Mukus, der aus dem
Darm von Karpfen nach oraler Applikation von Natriumchloridlösung, A. hydrophila 38 oder
A. hydrophila 60 isoliert wurde, variierte sehr stark. Über den gesamten Versuchsverlauf
betrachtet, nahm die Adhäsionsfähigkeit von A. hydrophila 60 an den Mukus der Fische aus
allen drei Gruppen kontinuierlich zu. Die verstärkte Adhäsion der Bakterien an die sich durch
Abspülen von Glykoproteinen permanent erneuernde Oberfläche des Mukusfilms kann als
Abwehrmechanismus des Körpers angesehen werden, da so vermutlich eine Bindung und
nachfolgende Elimination der Infektionserreger erreicht wurde. Es handelt sich demnach um
eine Reaktion des Organismus auf einen nicht-virulenten Erreger. Auch in anderen Studien
wird eine Schutzfunktion durch Adhäsion beschrieben, beispielsweise um Pseudomonas
aeruginosa durch die mukoziliäre Clearence aus der menschlichen Lunge zu entfernen
(NELSON et al. 1990). Die Bindungsfähigkeit von A. hydrophila 38 an Glykoproteine aus
den drei Versuchsgruppen zeigte deutliche Schwankungen. Die starke Zunahme der
Adhäsionsfähigkeit an den Mukus der Fische, denen A. hydrophila 60 verabreicht worden
war,
spricht
für
eine
Modulation
der
Glykoproteine
des
Mukus
infolge
der
Bakterienapplikation. Weiteren bakteriellen Infektionserregern wird ermöglicht, besser an die
Glykoproteine zu binden und so effektiver aus dem Intestinaltrakt entfernt zu werden. Der
Rückgang der Bindungsfähigkeit am zehnten Tag nach Applikation kann als Hinweis auf eine
erfolgreiche Elimination der Bakterien aufgefasst werden. Im Gegensatz dazu scheint die
Abnahme der Adhäsionsfähigkeit von A. hydrophila 38 an den Mukus der Karpfen, denen
dieser Bakterienstamm in vivo appliziert worden war, auf eine herabgesetzte Fähigkeit des
Organismus zur Elimination des Pathogens hinzudeuten. Möglicherweise sind die Bakterien
in der Lage, die nur noch gering ausgebildeten Mukusschicht zu umgehen und so direkt die
Epithelzellen der Mukosa zu erreichen. Die Mukosa scheint nach Applikation von
A. hydrophila 38 ungeschützter zu sein. Die erneute Zunahme der Adhäsion ab dem dritten
Tag nach Applikation der Bakterien kann als verspätete Reaktion der intestinalen
Mukusschicht auf den bakteriellen Reiz angesehen werden. Dadurch, dass die
Bindungsfähigkeit nicht deutlich über die an Mukus unbehandelter Fische ansteigt, scheint
eine effektive Abwehr einer Infektion nicht gegeben zu sein. Versuche zur Ermittlung der
160
Diskussion
chemotaktischen Anziehungskraft von Mukus auf A. hydrophila ergaben eine deutlich
herabgesetzte chemotaktische Aktivität von dermalem Mukus der Fische, die klinische
Symptome in Form von Hyperämien und nekrotischen Veränderungen der Haut aufwiesen
(HAZEN et al. 1982). Vermutlich wird die Adhäsionsfähigkeit an Mukus, der durch
Bakterien moduliert wurde, ähnlich beeinflusst. Die Abnahme der Adhäsion von
A. hydrophila 38 an den Mukus der Fische der Kontrollgruppe an Tag drei nach Applikation
deutet auf eine Reaktion der Mukosa auf den durch die Natriumchloridlösung gesetzten Reiz
hin. Möglicherweise kann eine Applikation der Natriumchloridlösung zu einer Beeinflussung
der Schleimhaut führen, die ein Eindringen von Infektionserregen erleichtert. Das verspätete
Einsetzten sowie das relativ geringe Ausmaß der Reaktion spricht für eine nicht optimale
Abwehr der Mukosa auf den Reiz.
Im Vergleich zum Mukus von Fischen, denen Bakterien oral appliziert worden waren, wurde
ebenfalls die Adhäsion von Bakterien an den Mukus nach oraler Gabe von LPS überprüft. Die
hierbei auffällige Zunahme der Bindungsfähigkeit von A. hydrophila 42 und 60 am ersten und
zweiten Tag nach Applikation war vergleichbar mit der Adhäsionsfähigkeit von Bakterien
nach A. hydrophila 60 Gabe. Besonders ausgeprägt war diese Reaktion beim vermutlich
virulenteren Stamm 42. Fraglich ist, ob der virulentere Stamm in der Lage ist, eine Infektion
auszulösen. Auch in diesem Fall ist es wahrscheinlicher, dass eine gesteigerte Elimination
durch Ausschleusung des Endotoxins gebunden an den Mukus stattfindet. LPS scheint sich
demnach auf die Darmmukosa des Karpfens ähnlich wie nicht-virulente A. hydrophila Stamm
zu verhalten.
Auffällig war, dass Bakterien in höchst unterschiedlicher Weise an Glykoproteine mit hoher,
mittlerer und kleiner Molekülmasse im Mukus der Karpfen nach Bakterienapplikation
banden. Während einen und drei Tage nach Applikation der Bakterien A. hydrophila
bevorzugt an Moleküle einer Größe von unter 670kDa band, adhärierten die Bakterien ab dem
sechsten Tag nach der Applikation ebenfalls stark an Moleküle bis 2.000kDa. Diese
Beobachtung konnte sowohl für A. hydrophila 38 als auch für A. hydrophila 60 gemacht
werden. Nach Applikation von LPS dagegen fand, genau wie an den Mukus unbehandelter
Karpfen, an allen Tagen nach Applikation eine Bindung besonders an Moleküle einer Größe
zwischen 670 und 2.000kDa statt. Es stellt sich hierbei die Frage, an welche Strukturen der
Diskussion
161
intestinalen Glykoproteine Bakterien adhärieren und wie durch eine Modulation der
Zusammensetzung des Mukus Adhäsionsfähigkeiten verstärkt oder vermindert werden
können.
In diesem Zusammenhang werden in der Literatur insbesondere Bindungen an den
Kohlenhydratanteil der intestinalen Glykoproteine beschrieben (ASCENCIO et al. 1998).
Zum Beispiel konnte gezeigt werden, dass Yersinia enterocolitica hauptsächlich an die
Kohlenhydratseitenketten der Glykoproteine adhäriert, wobei Hydroxylgruppen der
Saccharide vermutlich keine Rolle spielen (MANTLE u. HUSAR 1994). Für einige
Infektionserreger, zum Beispiel für den Protozoen Entamoeba histolytica (SEGUIN et al.
1995), sowie verschiedene Bakterien (ABRAHAM et al. 1999), sind Lektine beschrieben, die
sich auf der Oberfläche des Erregers befinden und spezifisch an Kohlenhydratstrukturen des
Mukus binden können. Auch bei A. hydrophila werden solche Strukturen vermutet
(ASCENCIO et al. 1998), so dass sie auch bei den in dieser Studie eingesetzten Stämmen
denkbar sind.
In den eigenen Untersuchungen konnten verschiedene Kohlenhydrate, die Bestandteil der
intestinalen Glykoproteine sind, als Bindungspartner für A. hydrophila 42 ermittelt werden.
So deutet die verringerte Bindungsfähigkeit von A. hydrophila 42 an den Mukus nach
enzymatischer
Abspaltung
von
Acetyl-Glukosamin
auf
eine
Bedeutung
dieses
Oligosaccharids als Bindungspartner hin. Auch am Beispiel der Adhäsion von Pseudomonas
cepacia an den Mukus von Menschen (SAJJAN et al. 1992), sowie von Yersinia
enterocolitica an den Mukus von Ratten und Kaninchen (MANTLE u. HUSAR 1993, 1994)
konnte eine Bindung an Acetyl-Galaktosamin nachgewiesen werden. Die Reduzierung der
Adhäsion durch Vorinkubation der Bakterien mit Acetyl-Laktosamin spricht ebenfalls für
eine Beteiligung dieses Zuckers an der bakteriellen Adhäsion.
Die Rolle, die die Fukoseseitenketten des intestinalen Mukus bei der Interaktion mit
Bakterien spielen, ist nicht eindeutig geklärt. Zwar scheint Fukose ein wichtiger Faktor bei
der chemotaktischen Anziehung von Bakterien zu sein (HUGDAHL et al. 1988), Fukosereste
am intestinalen Mukus dienen Bakterien aber wahrscheinlich nicht als Bindungspartner
(MANTLE u. HUSAR 1994). Die Zugabe von Fukose zu intestinalem Mukus des Frettchens
162
Diskussion
verringerte allerdings die Adhäsion verschiedener Staphylococcus Spezies (SANFORD et al.
1989). Da auch in der eigenen Studie ein Rückgang der Adhäsion von A. hydrophila 42 nach
Vorinkubation mit Fukose an den Mukus nachgewiesen werden konnte, scheint dieser Zucker
zumindest für A. hydrophila 42 eine Bedeutung als Bindungspartner zu besitzen.
Während in Studien am Mukus von Frettchen die Adhäsion von Staphylokokken nach Zugabe
von Galaktose zunahm (SANFORD et al. 1989), konnte in den eigenen Versuchen mit
A. hydrophila 42 keine deutliche Veränderung der Adhäsionsfähigkeit beobachtet werden. Da
jedoch die Abspaltung von Galaktose vom Mukus zu einer Erniedrigung der Adhäsion der
Bakterien führte, kann dieser Zucker als Bindungspartner nicht ausgeschlossen werden. Auch
andere Studien belegen, dass Galaktose an der Adhäsion von Bakterien an Mukus (MANTLE
u. HUSAR 1993, 1994) sowie an Zellen (THOMAS u. BROOKS 2004) beteiligt sein kann.
Für einige Bakterien scheint Mannose einen wichtigen Rezeptor darzustellen (MANTLE u.
HUSAR 1994). Eine geringe Abnahme der Adhäsion von Staphylokokken an den Mukus von
Frettchen (SANFORD et al. 1989) und eine Reduzierung der Adhäsion von verschiedenen
pathogenen Bakterien an Zellen nach Zugabe von Mannose (THOMAS u. BROOKS 2004)
konnte nachgewiesen werden. In der eigenen Studie wurde eine Adhäsionsabnahme von
A. hydrophila 42 an den Mukus von Karpfen nach Vorinkubation mit Mannose beobachtet,
wodurch diese Theorie unterstützt wird. Da allerdings nach enzymatischer Abspaltung von
Mannose eine deutliche Zunahme der Adhäsion von A. hydrophila 42 zu beobachten war,
scheint es sich bei diesem Zucker nicht um den Hauptbindungspartner zu handeln. Vielmehr
sind offenbar nach der Abspaltung freigelegte Strukturen in größerem Ausmaß an der
Adhäsion beteiligt. Auch handelt es sich bei Mannose um ein großes Molekül (STROUS u.
DEKKER 1992), dessen Vorhandensein eine sterische Behinderung bei der Bindung der
Bakterien darstellen kann. Nach Abspaltung liegt diese Behinderung nicht mehr vor und die
Adhäsion verstärkt sich.
Ob Neuraminsäurereste der intestinalen Glykoproteine als Bindungspartner von Bakterien
fungieren, geht aus der Literatur nicht eindeutig hervor. Während im tracheobronchialem
Mukus des Menschen eine Bindung von Pseudomonas aeruginosa an Neuraminsäure
stattfindet (SANFORD et al. 1989), spielt dieser Zucker bei der Adhäsion von Yersinia
enterocolitica an Mukus von Kaninchen wahrscheinlich keine Rolle als Bindungspartner
Diskussion
163
(MANTLE u. HUSAR 1994). Die negative Ladung der Neuraminsäure und die Größe des
Moleküls scheinen vielmehr die Adhäsion von Bakterien zu behindern. Dafür spricht auch die
in der eigenen Untersuchung mit A. hydrophila 42 nachgewiesene Erhöhung der
Bindungsfähigkeit nach Abspaltung von Neuraminsäure von intestinalen Glykoproteinen.
Weiterhin war keine deutliche Änderung der Adhäsionsfähigkeit nach Vorinkubation von
A. hydrophila
42
mit
einer
Neuraminsäureverbindung
festzustellen.
Da
die
Adhäsionszunahme nach Abspaltung von Neuraminsäure jedoch weder in dieser noch in
anderen Studien signifikant war, vermuten einige Autoren, dass sterische Behinderungen,
aufgrund der filamentösen Struktur der Muzine, eine bedeutendere Rolle in der Verhinderung
der Adhäsion spielen als die Ladung der Neuraminsäurereste (VAN KLINKEN et al. 1995).
Die verstärkte Bindungsfähigkeit von A. hydrophila 42 an große Glykoproteine aus dem
ersten
Peak
des
Elutionsprofils
des
Mukus
nach
Vorinkubation
mit
einem
Neuraminsäureoligosaccharid, kann allerdings durch die negative Ladung der Neuraminsäure
erklärt werden. Die Bakterienladung wird vermutlich durch den Zusatz dieses
Oligosaccharids so verändert, dass eine verstärkte Adhäsion an den Mukus möglich ist.
Eine Zunahme der Adhäsionsfähigkeit von Bakterien an intestinalen Mukus nach Abspaltung
von Kohlenhydratseitenketten wurde in anderen Studien auf eine Bindung der Bakterien an
zentraler gelegene Kohlenhydratstrukturen, die durch die Entfernung von terminalen
Zuckerresten zugänglich sind, zurückgeführt (MANTLE u. HUSAR 1994). Dabei wurde eine
Bindung von Pseudomonas cepacia im menschlichen Mukus sowohl an zentral gelegene NAcetyl-Glukosamin- und N-Acetyl-Galaktosamin-haltige Ketten festgestellt (SAJJAN et al.
1992), während Yersinia enterocolitica im Mukus von Ratten und Kaninchen zwar an NAcetyl-Galaktosamin und Galaktose (MANTLE u. HUSAR 1993, 1994), nicht aber an NAcetyl-Glukosamin adhärierte (MANTLE u. HUSAR 1994).
Aus den eigenen Untersuchungen geht hervor, dass die Kohlenhydratseitenketten der
intestinalen Glykoproteine, insbesondere Reste von Acetyl-Glukosamin, Acetyl-Laktosamin,
Fukose und Galaktose, eine Bedeutung bei der Adhäsion von Bakterien haben, dass eine
Bindung aber nicht ausschließlich an einen spezifischen Zuckerrest stattfindet. Auch scheinen
weitere,
nicht-kohlenhydrathaltige
beizutragen.
Strukturen
zusätzlich
zur
bakteriellen
Adhäsion
Diskussion
164
In diesem Zusammenhang wird eine mögliche Bindung von Bakterien an Bestandteile des
Proteingerüstes
der
intestinalen
Glykoproteine
diskutiert.
Durch
Abspaltung
von
Kohlenhydratseitenketten können diese freigelegt werden, und so zu einer verbesserten
Adhäsion der Bakterien an die Glykoproteine führen. Da der Proteinanteil der Muzine hohe
Gehalte hydrophober Aminosäuren aufweist, scheint eine Interaktion zwischen diesen und
den Bakterien möglich (MANTLE u. HUSAR 1994). Studien mit A. hydrophila dagegen
berichten von einer Abnahme der Adhäsion der Bakterien nach Abspaltung sämtlicher
Kohlenhydratseitenketten von intestinalen Glykoproteinen (ASCENCIO et al. 1998). Anhand
der eigenen Ergebnisse ist diese Fragestellung nicht abschließend zu klären.
Wahrscheinlich ist, dass die Adhäsion von Bakterien sowohl an bestimmte Zuckerseitenketten
wie auch an den Proteinanteil der Glykoproteine des Mukus erfolgt. Vermutlich findet die
Bindung zwar in erster Linie an terminale und zentrale Kohlenhydrate statt, zusätzliche
Bindungsmöglichkeiten an den Proteinanteil der Muzine können aber nach Abspaltung der
Zucker freigelegt werden und so zu einer verstärkten Adhäsion führen (MANTLE u. HUSAR
1994).
Durch die Bindung von Bakterien an kohlenhydrathaltige Strukturen des Mukus wirkt dieser
bis zu einem gewissen Grad antibakteriell, da durch die Ausscheidung des Mukus die
anhaftenden Erreger eliminiert werden können. Das Gleichgewicht zwischen Adhäsion von
Erregern und schützender Wirkung des Mukus scheint allerdings sehr empfindlich zu sein
(VAN KLINKEN et al. 1995). Daher bestehen offenbar Unterschiede in der Interaktion
zwischen verschieden virulenten bakteriellen Infektionserregern und dem intestinalen Mukus.
Die Applikation vermutlich nicht virulenter Bakterien, wie A. hydrophila 60, führt zu einer
verstärkten Sekretion von Mukus, an den neu in den Darm gelangte Bakterien besser binden
können. Auf diese Weise werden die Infektionserreger ausgeschieden. Interessant ist dabei,
dass offenbar die zuerst in den Intestinaltrakt gelangten Bakterien den weiteren Verlauf
bestimmen, da auch virulente Bakterien, die im Folgenden in den Darm gelangen, wie in
dieser Studie mit A. hydrophila 38 in vitro simuliert, eliminiert werden können. Durch den
ersten Reiz reagiert die Schleimhaut auf alle später eindringenden Bakterien in gleicher
Weise. Binden dagegen zuerst virulente Bakterien, wie A. hydrophila 38, an die
Mukusschicht, so kann diese innerhalb weniger Stunden bereits derartig geschädigt werden,
Diskussion
165
dass sie bei nachfolgend in den Darm gelangenden Bakterien keinen Schutz für die Mukosa
mehr darstellt und eine Infektion leichter ausgelöst werden kann.
Die Tatsache, dass Bakterien an Kohlenhydratstrukturen im Mukus binden, bietet
verschiedene therapeutisch nutzbare Möglichkeiten. Ein Ansatz ist, bakterielle Infektionen
durch die Verabreichung der spezifischen Zucker oder Enzyme, die diese Zucker von
bakteriellen Infektionserregern abspalten, zu unterdrücken. An Mäusen wurden bereits in den
1970er Jahren erfolgreich Studien in diesem Zusammenhang durchgeführt (ARONSON et al.
1979). Auch in der Prophylaxe von bakteriellen Infektionen bei Fischen könnte diese
Methode angewendet werden. Da eine Therapie mit Antibiotika besonders bei Fischen häufig
nicht zum Erfolg führt, da inzwischen eine Vielzahl von Bakterien, die Resistenzen gegen
einen Großteil dieser Medikamente aufweisen, an Krankheitsgeschehen beteiligt sind
(INGLIS et al. 1993), könnte eine erfolgreiche Verabreichung von Zuckern oder Enzymen
eine sinnvolle Alternative sein. Die Gefahr der Ausbildung resistenter Stämme gegen die
Saccharide wird als gering eingeschätzt, da die Verhinderung der Adhäsion wahrscheinlich
keinen Selektionsdruck darstellt, da diese für die Bakterien nicht letal ist und eine Vielzahl
von Adhäsionsmechanismen bestehen (BAVINGTON u. PAGE 2005). Da viele
Infektionserreger multiple Bindungsstellen für Saccharide aufweisen, wäre vermutlich die
Gabe eines Zuckergemisches erforderlich, um Infektionen zu verhindern (ABRAHAM et al.
1999). Versuche mit Tilapien und Grasskarpfen ergaben, dass die Gabe von Polysacchariden
die Überlebensrate der Fische nach experimenteller Infektion mit A. hydrophila signifikant
erhöhte (WANG u. WANG 1997). Forschungsbedarf besteht auf diesem Gebiet insbesondere
bei der Wahl der Darreichungsform der Saccharide. Der Versuch, eine A. hydrophila
Infektion bei Karpfen zu verhindern, scheiterte bei oraler Verabreichung sowie bei Zusatz des
Therapeutikums zum Wasser. Nur eine intraperitoneale Infektion brachte zufrieden stellende
Ergebnisse (SELVARAJ et al. 2005). Da diese Methode sehr zeitaufwendig und mit einem
enormen Stress für die Tiere verbunden ist, sollte im Sinne der Durchführbarkeit und im
Interesse des Tierschutzes weiter an Möglichkeiten einer einfachen und schonenden
Applikation geforscht werden.
Eine weitere Möglichkeit, Adhäsionen von Bakterien zu verhindern, ist die Verabreichung
bakterieller Bestandteile, wie am Mukus von Seebrassen und Listonella anguillarum in vitro
166
Diskussion
bereits gezeigt wurde (CHABRILLON et al. 2004). Durch Aktivierung des Immunsystems
der Fische kann eine protektive Immunität erreicht werden, die eine Adhäsion der Erreger im
Folgenden verhindert. Eine Vakzinierung von Karpfen mittels A. hydrophila-Antigen über das
Wasser konnte ebenfalls bereits erfolgreich durchgeführt werden, jedoch war die Dauer der
Immunität auf wenige Monate beschränkt (LAMERS et al. 1985). Eine Injektionsvakzine
gegen A. hydrophila, die ein Antigen des Bakteriums enthielt, schützte blaue Fadenfische
(Trichogaster trichopterus) auch gegen A. hydrophila Stämme, gegen die die Fische nicht
geimpft waren (FANG et al. 2000). Dies bietet die Möglichkeit, mit einem weniger virulenten
Stamm zu vakzinieren und somit Infektionen durch virulente Stämme zu verhindern.
Ein anderer Ansatz ist die Nutzung der Adhäsion für therapeutische Zwecke (EDSMAN u.
HÄGERSTRÖM 2005). Auch diese Möglichkeit sollte bei der Therapie von Fischen nicht
unbeachtet bleiben. Durch die Gabe eines, beispielsweise an ein Lektin gekoppeltes
Therapeutikum, könnte eine gute Aufnahme in den Körper, eine langsame Freisetzung des
Wirkstoffs sowie die Möglichkeit einer lokalen anstelle einer systemischen Behandlung
erreicht werden. Auch auf diesem Gebiet könnten sich im Verlaufe der nächsten Jahre neue
Erkenntnisse ergeben.
Diskussion
5.5
167
Schlussbetrachtung
Die Ergebnisse der eigenen Untersuchungen zeigen erstmals, dass die orale Applikation von
A. hydrophila die Synthese und Sekretion der intestinalen Glykoproteine beim Karpfen
moduliert, wobei unterschiedlich virulente Stämme des Bakteriums in verschiedener Weise
auf die Darmmukosa wirken. Die Adhäsion von Bakterien an Mukus kann dabei als Virulenzoder Pathogenitätsmerkmal aufgefasst werden. Der avirulente Stamm (A. hydrophila 60)
führte zu einer massiven Freisetzung von Mukus aus den Becherzellen, an den weitere
Bakterien verstärkt adhärieren konnten. Eine Elimination der Infektionserreger durch
Ausschleusung zusammen mit dem Mukus scheint somit wahrscheinlich. Dieser abspülende
Effekt scheint nach Applikation eines virulenten Stammes (A. hydrophila 38) nicht möglich
zu sein. Der intestinale Mukus scheint durch diese Bakterien degradiert zu werden, wodurch
die Darmmukosa keinen ausreichenden Schutz vor neu eindringenden Bakterien mehr bietet.
Es ist somit wahrscheinlich, dass nicht nur LPS als Bestandteil der Bakterien an der
veränderten Mukussekretion beteiligt ist, sondern zusätzlich andere Faktoren zu den
ermittelten Reaktionen der Intestinalmukosa führen. Dies scheinen Faktoren zu sein, die sich
zwischen verschiedenen Stämmen einer Bakteriengattung unterscheiden.
Es konnte zusätzlich zur Änderung der sezernierten Mukusmenge als Reaktion auf den
bakteriellen Reiz eine veränderte Zusammensetzung des Kohlenhydratanteils der intestinalen
Glykoproteine ermittelt werden. Auch konnten Hinweise gefunden werden, die darauf
hindeuten, dass Bakterien unter anderem Bestandteile der Kohlenhydratseitenketten der
Glykoproteine als Adhäsionspartner nutzen. Aus diesem Grund veränderte sich die
Adhäsionsfähigkeit weiterer Bakterien an den intestinalen Mukus von Fischen nach einer
Bakterienapplikation.
Zusammenfassung
168
6
Zusammenfassung
Verena Schroers (2007):
Interaktion von Aeromonas hydrophila mit der Intestinalmukosa des Karpfens (Cyprinus
carpio)
Die intestinale Mukusschicht des Karpfens schützt das darunter liegende Epithel vor einer
Vielzahl von Noxen und stellt eine Barriere für eindringende Pathogene dar. Der erste Schritt
in der Pathogenese der meisten Infektionskrankheiten besteht in der Adhäsion der Erreger an
diese mukosalen Oberflächen. Der Organismus reagiert auf das Vorhandensein von
Pathogenen, wie Bakterien, mit einer Modulation der Sekretion des Mukus. Ein häufig in
Zusammenhang mit Krankheitsausbrüchen bei Fischen isoliertes Bakterium ist Aeromonas
hydrophila, das allerdings in konditionsstarken Fischen keine Krankheitssymptome auslöst
und daher als fakultativ-pathogen angesehen wird. Es existieren unterschiedlich virulente
Stämme des Bakteriums. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Reaktion der intestinalen
Mukusschicht von Karpfen auf eine orale Applikation von zwei unterschiedlich virulenten
Stämmen von A. hydrophila, den virulenten Stamm 38 und den avirulenten Stamm 60,
untersucht. Dazu wurden Menge, Molekülgröße und terminale Glykosilierung sezernierter
Glykoproteine nach Bakterienapplikation bestimmt. Außerdem wurde untersucht, ob die
eingesetzten Bakterien und weitere für Fische pathogene Keime an den intestinalen Mukus
adhärieren können und diese Adhäsion nach vorheriger oraler Applikation von Bakterien
verändert ist. Des Weiteren wurde geprüft, welche Strukturen der intestinalen Glykoproteine
an der Adhäsion beteiligt sind.
Bereits die Applikation von Natriumchloridlösung führte bei Karpfen zu einer veränderten
Mukussekretion. Nach der Applikation wurden in Mukusproben im Vergleich zu
unbehandelten Tieren ein erhöhter Kohlenhydrat- und ein erniedrigter Proteingehalt
gemessen, der auf eine verstärkte Glykosilierung der Glykoproteine hindeutete. Nach
Applikation von A. hydrophila 60 erhöhte sich der Gehalt an Glykoproteinen signifikant,
während er nach Applikation von A. hydrophila 38 signifikant abnahm. Nach der Applikation
der Bakterien fiel allgemein eine Zunahme kleiner Moleküle in Mukus auf. Dieses Ergebnis
weist auf eine Neusynthese von Glykoproteinen hin. Die intestinalen Glykoproteine scheinen
Zusammenfassung
169
nach Applikation von A. hydrophila 38 einen geringeren Gehalt an β-Galaktosamin, Fukose,
Mannose und Neuraminsäure aufzuweisen, als die intestinalen Glykoproteine der Fische,
denen A. hydrophila 60 verabreicht worden war. An Mukus unbehandelter Karpfen zeigte der
virulente A. hydrophila Stamm 38 eine signifikant höhere Bindungsfähigkeit, als der
avirulente Stamm 60. Andere fischpathogene Bakterien, wie Yersinia ruckeri und
Edwardsiella tarda adhärierten – anders als Aeromonas salmonicida - stärker an den
intestinalen Mukus, als die A. hydrophila Stämme. An Mukus aus dem Darm von mit
A. hydrophila behandelten Karpfen vermochten die untersuchten Bakterienstämme in sehr
unterschiedlicher Weise zu adhärieren. A. hydrophila 38 adhärierte an Mukus nach
Applikation von A. hydrophila 38 signifikant schwächer und an Mukus aus dem Darm von
Karpfen nach Applikation von A. hydrophila 60 signifikant stärker als an Mukus aus
Kontrollkarpfen. Die Adhäsionsfähigkeit an Mukus des avirulenten A. hydrophila Stammes
60 verstärkte sich nach vorheriger Applikation von Bakterien. Auch an den Mukus von
Fischen, denen oral LPS appliziert worden war, verstärkte sich die Adhäsionsfähigkeit des
virulenten A. hydrophila Stammes. Die Behandlung von intestinalen Glykoproteinen mit
unterschiedlichen Glykosidasen zeigte, dass verschiedene terminale Oligosaccharide des
Mukus von den Bakterien als Bindungspartner genutzt werden.
Die Daten dieser Studie zeigen erstmals, dass verschiedene A. hydrophila Stämme die
Mukussekretion im Darm von Karpfen in unterschiedlicher Weise zu modulieren vermögen.
Es ergaben sich Hinweise, dass die Modulation von der Virulenz der applizierten
A. hydrophila Stämme abhängt. Während die Applikation eines nicht virulenten Stammes zu
einer verstärkten Mukussekretion und somit wahrscheinlich zu einer Ausschleusung des
Erregers führt, wird durch die Applikation eines virulenten Stammes die Mukusschicht
zerstört, so dass die intestinale Mukosa vor weiteren Pathogenen nicht ausreichend geschützt
ist. Eine Korrelation zwischen der Bindungsfähigkeit bakterielle Infektionserreger an den
intestinalen Mukus von Karpfen und deren Pathogenität scheint zu bestehen.
Summary
170
7
Summary
Verena Schroers (2007):
Interactions of Aeromonas hydrophila with the intestinal mucosa of common carp
(Cyprinus carpio).
The intestinal mucus gel of carp protects the underlying epithelium against a wide range of
noxes and is a barrier for penetrating pathogens. In most infectional diseases the first stage of
the pathogenesis is the adherence of the pathogen to those mucosal surfaces. Often the
organism reacts to the presence of the bacteria with a modulated mucus secretion. A bacteria
that can commonly be isolated during disease outbreaks is Aeromonas hydrophila. This
bacteria is considered to be a facultative pathogen, since it does not lead to disease symptoms
in conditionally fit fish. Virulence of the bacteria depends on the bacterial strain. In this study,
the reaction of the intestinal mucus gel to oral application of two strains of A. hydrophila
which differ in virulence (virulent strain 38 and avirulent strain 60) was studied. Therefore
quantity, molecular size and terminal glycosylation of mucus after bacteria application were
determined. Furthermore it was studied if these and other fish pathogenic bacteria can adhere
to intestinal mucus and if this adhesion changes after oral administration of bacteria. It was
also studied which structures of intestinal glycoproteins are involved in adhesion.
The administration of a sodium chloride solution to carp already induced an altered mucus
secretion. The application leads to an increased carbohydrate content and a decreased protein
content, compared to untreated animals. This indicates a increased glycosylation of the
glycoproteins. After administration of A. hydrophila 60 the content of intestinal glycoproteins
increased significantly, as where after administration of A. hydrophila 38 it significantly
decreased. After administration of bacteria an increase in small molecules was observed for
both strains. This indicates an increased synthesis of glycoproteins. The intestinal
glycoproteins appear to have a lower content of β-galactosamine, fucose, mannose and
neuraminic acid after application of A. hydrophila 38, as the intestinal glycoproteins of the
fish to which A. hydrophila 60 was administered.
Summary
171
The virulent A. hydrophila strain 38 had a significantly higher adherence to mucus of
untreated carp, as the avirulent strain 60. In contrast to Aeromonas salmonicida, other fish
pathogens such as Yersinia ruckeri and Edwardsiella tarda adhered more strongly to the
intestinal mucus as the A. hydrophila strains. The ability of the studied bacterial strains to
adhere to gut mucus of A. hydrophila treated carp was different. A. hydrophila 38 adhered
significantly weaker to mucus after application of A. hydrophila 38 and to gut mucus of carp
treated with A. hydrophila 60 significantly stronger as to mucus from control carp.
A. hydrophilia 60 showed a stronger binding to mucus after administration of bacteria. The
virulent A. hydrophila also had an increased ability of strain to bind mucus of fish, to which
LPS was orally administered. Treatment of intestinal glycoproteins with an array of
glycosidases showed that bacteria can use several different terminal oligosaccharides of
mucus as a binding site.
This study shows that different A. hydrophila strains can modulate mucus secretion in the gut
of carp in a different way. There are indications that modulation depends on the virulence of
the applied A. hydrophila strain. Application of a non-virulent strain leads to an increased
mucus secretion and therefore probably to a flushing out of the bacteria, whereas the
application of a virulent strain destroys the mucus layer, leaving the intestinal mucosa
insufficiently protected for further pathogens. A correlation between the binding ability of
infectious bacteria to intestinal mucus of carp and their pathogenicity appears to exist.
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Anhang
200
9
9.1
Anhang
Verwendete Chemikalien / Reagentien
Albumin Fraktion V (Bovines Serumalbumin), Fa. Roth, Karlsruhe
A-Mannosidase from Jack Beans, Fa. Sigma, München
Amphotericin B, Fa. PAA, Pasching
B-Galactosidase Grade VIII from Escherichia coli, Fa. Sigma, München
B-N-Acetyl-Glucosaminidase from Jack Beans, Fa. Sigma, München
Calciumchlorid, CaCl2, Fa. Merck, Darmstadt
Citronensäure, C6H8O2*2H2O, Fa. AppliChem, Darmstadt
Columbia-Agar-Basis, Fa. Oxoid, Wesel
Concanavalia-ensiformes Agglutinin (ConA), Fa. Sigma, München
Coomassie Brilliant Blue G, Fa. Fluka, Buchs/Schweiz
D-Glucose, C6H12O6, Fa. Merck, Darmstadt
D(+)-Mannose from Wood, Fa. Sigma, München
Di-Natriumhydrogenphosphat, Na2HPO4, Fa. AppliChem, Darmstadt
Dithiothreitol, Fa. Sigma, München
Dolchios biflorus Agglutinin (DBA), Fa. Vector Laboratories, Burlingame/USA
Dulbecco´s PBS-Puffer ohne Calcium und Magnesium, Fa. PAA, Pasching
Essigsäure, C2H4O2, Fa. AppliChem, Darmstadt
Ethanol 70%, C2H5OH, Fa. Merck, Darmstadt
Anhang
201
Fetales Kälberserum, Fa. Biochrom AG, Berlin
2-Fucosyl-D-Lactose, Fa. Sigma, München
Henn Egg White Lysozyme (Hühnereiweiß-Lysozym), Fa. Sigma, München
Hepeslösung, Fa. Serva, Heidelberg
Kalbsboullion (Veal Infusion Broth), Fa. Oxoid, Wesel
Kaliumchlorid, KCl, Fa. Merck, Darmstadt
Kaliumdihydrogenphosphat, KH2PO4, Fa. Merck, Darmstadt
Minimal Essential Medium nach Earl´s (MEM Earl´s), Fa. PAA, Pasching
Minimal Essential Medium / Non Essential Aminoacids (MEM NEAA, 100x), Fa. PAA,
Pasching
Micrococcus luteus, Fa. Sigma, München
N-Acetyl-Lactosamin synthetic, Fa. Sigma, München
N-Acetyl-Neuraminosyl-D-Lactose, Fa. Sigma, München
Natriumacetat, CH3COONa*3 H2O, Fa. Merck, Darmstadt
Natriumchlorid, NaCl, Fa. AppliChem, Darmstadt
Natriumcarbonat, Na2CO3, Fa. Merck, Darmstadt
Natriumcitrat-2-hydrat, C6H5Na3O7*2H2O, Fa. Merck, Darmstadt
Natriumdihydrogenphosphat-1-hydrat, NaH2PO4*H2O, Fa. Merck, Darmstadt
Natriumhydrogencarbonat, NaHCO3, Fa. Merck, Darmstadt
Natriumpyruvat, Fa. Sigma, München
202
Anhang
Neuraminidase Type VI from Clostridium perfringens, Fa. Sigma, München
4-OB-D-Galactopyranosyl-D-Galactopyran, Fa. Sigma, München
OPD-Tabletten, Fa. DakoCytomation, Glostrup / Dänemark
Penicillin (10.000IE/ml) / Streptomycin (10mg/ml), Fa. PAA, Pasching
Perjodsäure, H5IO6, Fa. Sigma, München
Phosphorsäure 85%, Fa. Roth, Karlsruhe
Ricinus communis Agglutinin (RCA), Fa. Vector Laboratories, Burlingame/USA
Sambucus nigra Agglutinin (SNA), Fa. Vector Laboratories, Burlingame/USA
Schafblut, Fa. Oxoid, Wesel
Schiff´sches Reagenz, Fa. Sigma, München
Schwefelsäure, Fa. Merck, Darmstadt
Schweinemagenmuzin, Fa. Sigma, München
Sepharose-CL-4B®-Gel, Fa. Sigma, München
Streptavidin-Meerrettich-Peroxidase-Komplex, Fa. DakoCytomation, Glostrup/Dänemark
Syto® 9, Fa. MoBiTec, Göttingen
Trypsin (0,5%) / EDTA (0,2%), Fa. PAA, Pasching
Tween 20®, Fa. Serva, Heidelberg
Tyroglobulin, Fa. Sigma, München
Ulex europaeus Agglutinin 1 (UEA), Fa. Vector Laboratories, Burlingame/USA
Wasserstoffperoxid, H2O2, Fa. AppliChem, Darmstadt
Anhang
9.2
203
Lösungen
9.2.1
Lösungen für die Bakterienvermehrung, Lagerung und Charakterisierung
a) Blutagar
Chemikalien
Columbia Agar Basis
Aqua dest.
15 Minuten bei 121°C autoklavieren
Schafblut
vorsichtig mischen und Platten gießen
Mengen
39000mg
1000ml
70ml
b) Kalbsboullion (Veal Infusion Broth)
Chemikalien
Mengen
Kalbsboullion (Veal Infusion Broth)
25000mg
Aqua dest.
1000ml
eine Minute bis zur Lösung des Pulvers kochen, bei 121°C 25 Minuten autoklavieren
c) Verdünnungsmedium für Bakterien
Chemikalien
Aqua dest.
Natriumchlorid
Kaliumchlorid
Calciumchlorid
Natriumhydrogencarbonat
pH
Mengen
1000ml
2250mg
105mg
120mg
50mg
7
d) Alzeversche Lösung
Chemikalien
Aqua dest.
Natriumchlorid
Natriumcitrat
Citronensäure
D-Glucose
Mengen
1000ml
4200mg
8000mg
550mg
20500mg
Anhang
204
e) Medium für Zellkulturen
Chemikalien
MEM Earl´s
Fetales Kälberserum
MEM NEAA
Penicillin / Streptomycin
Mengen
500ml
50ml
5ml (=7,96g/l)
10ml
f) Trypsin für Zellkulturen
Chemikalien
Dulbecco´s PBS
Trypsin
9.2.2
Mengen
500ml
25ml
Lösungen zur Gewinnung, Auftrennung und Analyse des Mukus
a) Isolationsmedium
Chemikalien
PBS-Puffer ohne Calcium und Magnesium
Dithiotreitol
Amphotericin B
Natriumpyruvat
Hepeslösung, 1N
Mengen
500ml
100mg
0,03mg
1mg
12ml
b) PBS-Puffer, einfach
Chemikalien
Aqua dest.
Natriumchlorid
Kaliumchlorid
Kaliumdehydrogenphosphat
Di-Natriumhydrogenphosphat
Mengen
1000ml
8000mg
200mg
200mg
2900mg
Anhang
205
c) PBS-Puffer, 0,01M
Stammlösung:
Gebrauchslösung:
Chemikalien
Aqua dest.
Di-Natriumhydrogenphosphat
Amphotericin B
Aqua dest.
Stammlösung
pH
Menge
500ml
7100mg
1250mg
450ml
50ml
8
d) Perjodessigsäure
Chemikalien
Essigsäure 7%
Perjodsäure
Mengen
100ml
100ml
e) Bradford-Lösung
Chemikalien
Coomassie Brilliant Blue G
Ethanol 70%
Phosphorsäure 85%
Gebrauchslösung: Aqua dest.
Stammlösung
Gebrauchslösung immer frisch ansetzen
Stammlösung:
Menge
100mg
50ml
100ml
17ml
3ml
f) Natriumphosphatpuffer 0,05 M
Chemikalien
Aqua dest.
Natriumdihydrogenphosphat
pH
Mengen
500ml
6,9mg
6,2
Anhang
206
9.2.3
Lösungen für den Lektin-ELISA
a) Coating Puffer
Chemikalien
Aqua dest.
Natriumhydrogencarbonat
Natriumcarbonat
pH
Mengen
500ml
8400mg
10600mg
9,6
b) Waschpuffer (0,15M)
Chemikalien
Aqua dest.
Di-Natriumhydrogenphosphat
Kaliumdihydrogenphosphat
Natriumchlorid
Kaliumchlorid
Gebrauchslösung: Aqua dest.
Stammlösung
Tween 20®
Stammlösung:
Menge
500ml
14500mg
1000mg
4000mg
1000mg
500ml
50ml
0,5ml
c) Verdünnungspuffer
Chemikalien
Aqua dest.
Di-Natriumhydrogenphosphat
Kaliumdihydrogenphosphat
Gebrauchslösung: Aqua dest.
Stammlösung
Stammlösung:
Menge
500ml
14500mg
1000mg
500ml
50ml
d) Konjugatlösung
Chemikalien
PBS-Puffer
Streptavidin-Meerettich-Peroxidase Komplex
Mengen
12ml
0,006ml
Anhang
207
e) Substratlösung
Chemikalien
Aqua dest.
OPD-Tabletten
Wasserstoffperoxid 30%
9.2.4
Mengen
12ml
4 Stück
0,005ml
Lösungen für die Untersuchung der Adhäsion von Bakterien an Mukus
a) Natriumacetatpuffer pH 4,5
Chemikalien
Essigsäure 0,2M
Natriumacetatlösung 0,2M
Mengen
114ml
86ml
b) Natriumacetatpuffer pH 5
Chemikalien
Essigsäure 0,2M
Natriumacetatlösung 0,2M
Mengen
141ml
59ml
208
Danksagung
10 Danksagung
Herrn Prof. Dr. Dieter Steinhagen danke ich für die Überlassung des Themas und die
außerordentlich kompetente Betreuung. Seine geduldige Unterstützung hat maßgeblich zum
Gelingen dieser Arbeit beigetragen.
Herrn Prof. Dr. Wolfgang Körting danke ich für die Bereitstellung der Arbeitsmöglichkeiten
in der Abteilung Fischkrankheiten.
Für die Bereitstellung der Bakterienstämme danke ich Frau Dr. Braune vom
Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit, Herrn
Günter Kotterba vom Friedrich-Löffler-Institut sowie dem Institut für Veterinärmikrobiologie
in Fredriksberg, Dänemark.
Den Mitarbeitern der Klinik für Geflügel der Tierärztlichen Hochschule Hannover danke ich
für die stets freundliche Hilfe bei den mikrobiologischen Laborarbeiten.
Dem Institut für physiologische Chemie der Tierärztlichen Hochschule Hannover, besonders
Dr. Markus Keiser, danke ich für die freundliche Hilfe bei mikroskopischen Untersuchungen.
Bei Frau Prof. Dr. Marie-Luise Enss möchte ich mich für die methodischen Anregungen zur
Durchführung dieser Arbeit bedanken.
Ich möchte mich bei allen Mitarbeitern, Doktoranden und Praktikanten der Abteilung
Fischkrankheiten, besonders bei Kirsten Meyer und Uta Reimers, für das stets freundliche
Arbeitsumfeld bedanken. Henner Neuhaus, Marian van der Marel, Birgit Luckhardt, Sven
Grzybek, Lyke Ahrens, Dirk Lange und Patricia Lowels danke ich zusätzlich sehr für die
theoretische und praktische Hilfe bei der Durchführung dieser Arbeit.
Ganz besonders danke ich meiner Familie, insbesondere meinen Eltern, für ihre ständige
Hilfsbereitschaft und Unterstützung in jeglicher Hinsicht.
Nicht nur für die kritischen Anmerkungen zu dieser Arbeit, sondern besonders für seine
Geduld und seine ständige Unterstützung danke ich besonders meinem Freund Arne Jung.