Nachweis Enzymaktivität, Enzymhemmung
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Nachweis der Enzymaktivität und Enzymhemmung Chemikalien: Harnstofflösung (10% w/v) Phenolphtalein-Lösung Urease rohe Kartoffel Wasserstoffperoxid-Lösung (30 % w/v) Bäckerhefe verdünnte Lösung von Methylenblau in Wasser Amylase rauchende Salzsäure 0.1 M Kupfersulfat-Lösung 2 %-ige Stärke-Lösung Lugolsche Lösung (Iod/Kaliumiodid-lösung) Material: Reagenzgläser 3 150 ml-Bechergläser als Wasserbäder Thermometer 2 ml-Plastikpipetten Parafilm Zerfall von Harnstoff unter dem Einfluss von Urease - 2 ml Harnstofflösung werden in ein Reagenzglas gegeben. - Dazu fügt man drei Tropfen Phenolphtalein-Lösung bei. - Schliesslich wird noch eine winzige Spatelspitze Urease zugegeben. - Man verschliesst mit Parafilm und schüttelt kräftig. - Welche Beobachtung kann gemacht werden? Aufgabe: 1. Formulieren Sie die Reaktionsgleichung für die durch Urease katalysierte Reaktion und erklären Sie die Beobachtung. Wirkung von Katalase zur Zell-Entgiftung Katalase aus Kartoffeln - Eine rohe Kartoffel wird halbiert. Auf die frische Schnittfläche tropft man drei Tropfen Wasserstoffperoxid-Lösung (Vorsicht, stark ätzend!) - Welche Beobachtung kann gemacht werden? Katalase aus Bäckerhefe - Ein erbsengrosses Stück Bäckerhefe wird in ein sauberes Reagenzglas gegeben und mit etwa 3 ml Wasser versetzt. Das Reagenzglas wird mit Parafilm verschlossen und umgeschüttelt. - Zu dieser Suspension setzt man ebenfalls drei Tropfen Wasserstoffperoxid-Lösung zu. - Welche Beobachtung kann gemacht werden? Aufgaben: 1. Formulieren Sie die Reaktionsgleichung für die Zersetzung von Wasserstoffperoxid durch Katalase. 2. Wieso ist Wasserstoffperoxid ein starkes Zellgift? Wasserstoffübertragung durch ein Coenzym Prinzip: NAD+ ist das Coenzym zweier Enzyme, der Alkoholdehydrogenase und der etwas unspezifischeren Dehydrogenase. In der ersten von der Alkoholdehydrogenase katalysierten Reaktion wird Ethanol zu Ethanal + + oxidiert und NAD zu NADH und H reduziert. In der zweiten, von der unspezifischen Dehydrogenase katalysierten Reaktion wird der Wasserstoff vom Coenzym auf das Methylenblau übertragen. NADH wird zu NAD+ oxidiert, Methylenblau zu Leukomethylenblau reduziert. Arbeitsanleitung: - 0.2 g Bäckerhefe werden abgewogen und in einem Reagenzglas mit 10 ml Wasser versetzt. Man verschliesst mit Parafilm und schüttelt um. Die Suspension wird auf zwei Reagenzgläser verteilt. - In beide Reagenzgläser gibt man 10 Tropfen sehr verdünnte, hellblaue Lösung von Methylenblau in Wasser. - In ein Reagenzglas gibt man zusätzlich noch zwei Tropfen Ethanol hinzu. - Beide Reagenzgläser werden in ein Wasserbad von 40°C gestellt (warmes Wasser in 150 ml-Becherglas) und dort 15 Minuten belassen. Nach Ablauf dieser Zeit nimmt man sie wieder heraus. - Welche Beobachtung kann gemacht werden? Aufgaben: 1. Formulieren Sie die ablaufenden Reaktionen durch Reaktionsgleichungen. 2. Welche an der Reaktion beteiligten Stoffe werden von der Bäckerhefe beigesteuert? 3. Erklären Sie in einem kurzen Satz, welche Funktion dem NAD+ zukommt. Hemmung der Enzym-Wirkung von Amylase - Man stellt fünf saubere und trockene Reagenzgläser bereit und nummeriert sie von 1 - 5. - In jedes der Gläser gibt man etwa 1 ml Amylase-Lösung (100 mg Amylase in 10 ml Wasser) oder Mundspeichel derselben Person. - Glas 1 bleibt als Referenz vorerst unverändert. In Glas 2 fügt man nun drei Tropfen rauchende Salzsäure (Vorsicht ätzend) zu. In Glas 3 fügt man vier Tropfen 0.1 M Kupfersulfat-Lösung zu. - Die drei Gläser 1, 2 und 3 werden nun mit je 5 ml Stärke-Lösung versetzt und fünf Minuten ins Wasserbad mit 40° C gestellt. - Glas 4 wird in ein mit siedendem Wasser gefülltes Becherglas gestellt, Glas 5 in ein Becherglas, das eine Eis/Wasser-Mischung enthält. Nach zwei Minuten werden beide Reagenzgläser mit 5 ml Stärke-Lösung versetzt. - Jedes der Reagenzgläser wird fünf Minuten mit Stärke inkubiert und danach aus dem jeweiligen Bad genommen. Danach setzt man allen Gläsern drei Tropfen Lugolsche Lösung zu. Bei Vorhandensein von Stärke bildet sich ein blauer IodStärke-Komplex. - Notieren Sie die Beobachtungen in den einzelnen Gläsern. Aufgaben: 1. Welche Reaktion wird durch die Amylase katalysiert? 2. Durch welche Faktoren wird die Amylase gehemmt? Versuchen Sie die hemmende Wirkung zu erklären. 3. Überlegen Sie, welche der Enzymhemmungen reversibel, welche irreversibel sind. Lösungsblatt zur Übertragung von Wasserstoff durch ein Coenzym. Arbeitsanleitung: Herstellung der Proteinlösung - Ein rohes Ei wird aufgeschlagen. Das Eiweiss wird vom Eigelb getrennt. Das Eiweiss wird in das 150 ml-Becherglas gegeben, das Eigelb verworfen. - Nun gibt man 25 ml dest. Wasser zu und rührt mit einem Glasstab kräftig um. Dann lässt man das Becherglas etwa eine Minute stehen. - Die obere Phase wird vorsichtig in ein frisches 100 ml-Becherglas abdekantiert. Tritt keine sichtbare Phasentrennung ein, so wird das ganze Gemisch weiterverwendet. Xanthoprotein-Reaktion - In eine Reagenzglas wird etwa 2 cm hoch Protein-Lösung gegossen. - Dazu setzt man fnf Tropfen konzentrierte Salpetersäure (Vorsicht, ätzend!) zu. Notieren Sie die Beobachtung. Nun wird sehr vorsichtig über dem Bunsenbrenner erhitzt. Notieren Sie die Beobachtung. Biuret-Probe - In eine Reagenzglas wird etwa 2 cm hoch Protein-Lösung gegossen. - Dazu gibt man halb so viel 1 M Natronlauge und schüttelt vorsichtig um. - Zum Schluss tropft man noch 10 Tropfen 0.1 M Kupfersulfat-Lösung zu. Dann schüttelt man um. Ist nichts zu beobachten, erhitzt man vorsichtig über dem Bunsenbrenner. Notieren Sie die Beobachtungen. Denaturierung eines Proteins - Fünf Reagenzgläser werden von 1 bis 5 nummeriert und mit etwa 2 cm hoch Proteinlösung beschickt. - Glas 1 wird vorsichtig über dem Bunsenbrenner erhitzt. - Zu Glas 2 gibt man drei Tropfen rauchende Salzsäure. Zu Glas 3 gibt man eine Plastikpipette voll Ethanol. Zu Glas 4 gibt man eine Plastikpipette voll 1 M Kupfersulfat-Lösung. Zu Glas 5 gibt man eine Plastikpipette voll Eisen(III)-chloridLösung. - Notieren Sie alle Beobachtungen. Aufgaben: 1. Welche Aminosäuren muss ein Protein enthalten, damit die Xanthoprotein-Reaktion möglich ist? 2. Bei der Biuret-Pobe werden Natronlauge und Cu2+-Ionen zugegeben. Was bewirkt die Natronlauge? Welcher Unterschied besteht zwischen dem violetten Komplex bei Proteinen und dem blauen Komplex bei Aminosäuren? 3. Was geschieht mit einem Protein bei der Denaturierung? Erklären Sie die denaturierende Wirkung von Salzsäure, Ethanol, Kupfersulfat- und Eisen(III)-chlorid-Lösung. Argumentieren Sie mit den Bindungen, die durch diese Reagenzien gelöst werden. Stieger, Gymnasium Solothurn
