Dokument_48.

Aus dem Mikrobiologischen Institut
- Klinische Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Direktor: Prof. Dr. Christian Bogdan
Die Bedeutung der Prostaglandin-E2-Rezeptoren
bei der murinen Lyme-Borreliose
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
der Medizinischen Fakultät
der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
vorgelegt von
Sebastian Kruck
aus
Berlin
Gedruckt mit Erlaubnis
der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Dekan:
Referent:
Koreferent:
Prof. Dr. med. Dr. h. c. J. Schüttler
Prof. Dr. med. Dr. rer. nat. A. Gessner
Prof. Dr. A. Steinkasserer
Tag der mündlichen Prüfung:
06.04.2011
Meinen Eltern gewidmet
Inhaltsverzeichnis
1
1
ZUSAMMENFASSUNG .....................................................................3
2
EINLEITUNG......................................................................................8
3
MATERIAL UND METHODEN ........................................................21
U
U
U
3.1
Mäuse und Zellen ....................................................................................................... 21
U
3.1.1
3.1.2
Mäuse................................................................................................................................................. 21
Zellen ................................................................................................................................................. 21
U
U
3.2
Methoden .................................................................................................................... 22
U
3.2.1
3.2.2
3.2.3
3.2.4
3.2.5
3.2.6
3.2.7
3.2.8
3.2.9
3.2.10
3.2.11
3.2.12
3.2.13
3.2.14
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
U
4
Isolation und in-vitro-Stimulation von Peritonealmakrophagen ........................................................ 22
Präparation von murinen Embryonal-Fibroblasten (MEFs)............................................................... 22
Zytokinmessung in Zellüberständen oder Gelenklysaten................................................................... 22
Mausinfektion mit B. burgdorferi ...................................................................................................... 23
In-vivo-Behandlung mit dem EP-3-Agonisten ONO-AE-248............................................................ 23
In-vivo-Behandlung mit dem EP-4 Antagonisten ONO-AE3-208 ..................................................... 23
Messung der Gelenkschwellung......................................................................................................... 24
Histologische Beurteilung von Gelenken........................................................................................... 24
Bestimmung der Borrelien-Last im Tibiotarsalgelenk durch qPCR................................................... 24
Nachweis von Antikörpern im Serum................................................................................................ 26
RNA-Präparation und cDNA-Synthese ............................................................................................. 26
Qualitative PCR ................................................................................................................................. 26
Quantitative RT-PCR......................................................................................................................... 27
cDNA-Microarray.............................................................................................................................. 28
ERGEBNISSE..................................................................................30
U
4.1
U
4.1.1
U
4.1.2
U
4.1.3
U
4.1.4
U
4.1.5
U
4.1.6
U
4.2
U
4.2.1
U
4.2.2
U
4.2.3
U
4.2.4
U
4.2.5
U
Prostaglandin-E-2, seine Synthetasen und seine Rezeptoren in der
murinen Borreliose..................................................................................................... 30
Expression der mikrosomalen Prostaglandin-E-Synthetasen (mPGES) in verschiedenen ....................
Primärzellen und Zelllinien................................................................................................................ 30
Expression der mikrosomalen Prostaglandin-E-Synthetasen (mPGES) in der .....................................
Lyme-Arthritis. .................................................................................................................................. 31
Expression der PGE-2-Rezeptoren EP-1 bis EP-4 in verschiedenen Primärzellen und .........................
Zelllinien. ........................................................................................................................................... 32
Expression der Zytokine IL-12, TNF und IL-6 in Borrelien-stimulierten PECs aus .............................
C3H/HeJ-Mäusen............................................................................................................................... 33
PGE-2 Sekretion von PECs aus C57BL/6-Mäusen nach der Stimulation mit verschiedenen................
Substanzen. ........................................................................................................................................ 35
mRNA-Expression der Prostaglandin-E-Rezeptoren (EP) in Tibiotarsalgelenken von ........................
C3H/HeJ-Mäusen nach Infektion mit B. burgdorferi......................................................................... 36
Pharmakologische Manipulation der PGE-2-Rezeptoren in vivo.......................... 39
Die Bedeutung des EP-3-Rezeptors für die Entzündung des Tibiotarsalgelenks nach ..........................
Infektion mit B. burgdorferi............................................................................................................... 39
Die Bedeutung des EP-4-Rezeptors für die Entzündung des Tibiotarsalgelenks nach ..........................
Infektion mit B. burgdorferi.............................................................................................................. 40
Histologische Unterschiede der Entzündungsreaktion am Tag 7 p. i. bei Behandlung .........................
mit dem EP-4-Antagonisten. .............................................................................................................. 41
Histologische Unterschiede der Entzündungsreaktion am Tag 14 p. i. bei Behandlung mit .................
dem EP-3-Agonisten bzw. dem EP-4-Antagonisten. ......................................................................... 43
Microarray-Untersuchung der mRNA-Expression in Tibiotarsalgelenken von ....................................
C3H/HeJ-Mäusen nach B. burgdorferi-Infektion............................................................................... 43
Inhaltsverzeichnis
4.3
Die Rolle des CXCL-5 in der murinen Lyme-Borreliose. ...................................... 47
U
4.3.1
4.3.2
U
U
4.3.3
U
4.4
4.4.1
U
4.4.2
5
U
CXCL-5-Analyse in C3H/HeJ-, COX-2-/-- und COX-2+/--Mäusen mittels qPCR.............................. 47
Vergleichende Analyse der Expression von CXCL-5, CXCL-1 und CXCL-2 in der ...........................
Lyme-Arthritis bei C3H/HeJ-Mäusen und in murinen Embryonalfibroblasten (MEFs).................... 48
CXCL-5-Expression in den Zelllinien L929 und b.end.3 sowie in PECs von ......................................
C3H/HeJ-Mäusen............................................................................................................................... 51
Immunreaktion und Borrelienlast nach Infektion mit B. burgdorferi. ................. 53
U
U
2
Immunglobulin-Konzentrationen am Tag 7 und 14 in C3H/HeJ-Mäusen nach Infektion ....................
mit B. burgdorferi. ............................................................................................................................. 53
Borrelienlast in Tibiotarsalgelenken von C3H/HeJ-Mäusen am Tag 7 und 14 p. i............................ 54
DISKUSSION ...................................................................................56
5.1
Regulatorische Rolle von PGE-2 in der Lyme-Arthritis ........................................ 56
5.2
Die Rolle des CXCL-5 in der Lyme-Arthritis ......................................................... 61
U
U
6
LITERATURVERZEICHNIS.............................................................63
7
ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS........................................................71
8
DANKSAGUNG ...............................................................................74
9
LEBENSLAUF .................................................................................75
U
U
U
U
Zusammenfassung
3
1 ZUSAMMENFASSUNG
Hintergrund und Ziele:
Prostaglandine sind wichtige Mediatoren u. a. von Allergien, Tumoren und
Entzündungen und regulieren in vielen Geweben lokal die Zellhomöostase. Sie
werden durch Cyclooxygenasen und spezifische Synthetasen z. B. im ZNS, dem
Gefäßsystem und von Immunzellen hergestellt. Die meisten Prostaglandine binden
an einen einzigen spezifischen G-Protein-gekoppelten Rezeptor. Unter den
Prostaglandinen nimmt PGE-2 eine außergewöhnliche Rolle ein. PGE-2 bindet nicht
nur an 4 verschiedene Rezeptoren (EP-1 bis EP-4), welche zell- und
gewebespezifisch exprimiert werden, sondern kann in Abhängigkeit vom Rezeptor
sowohl pro- als auch anti-inflammatorisch wirken. In vorangegangenen Versuchen
der Arbeitsgruppe von Prof. Gessner haben Prostaglandine sich als wichtige Faktoren
bei der Entzündungsreaktion infolge einer Borrelia burgdorferi-Infektion erwiesen.
Bei pharmakologischer COX-2-Inhibition war die Borrelien-induzierte Arthritis in
Mäusen stark abgeschwächt. Ziel dieser Arbeit war es, die Relevanz des EP-3- und
EP-4-Rezeptors für die Entzündungsgenese im Modell der murinen Borreliose zu
untersuchen. Hierzu wurden C3H/HeJ-Mäuse mit einem hochselektiven Agonisten
des EP-3-Rezeptors (ONO-AE-248) und einem hochselektiven Antagonisten des
EP-4-Rezeptors (ONO-AE3-208) behandelt. Des Weiteren sollte ein etwaiger
Einfluss
der
Substanzen
auf
die
spezifische
Immunantwort
und
die
Erregerelimination geprüft werden.
Methoden:
Der EP-4-Antagonist wurde den Mäusen am Tag der Infektion mit B. burgdorferi
und der EP-3-Agonist ab dem siebten Tag p. i. subkutan injiziert. Der
COX-2-Inhibitor Rofecoxib wurde den Mäusen ab dem Tag der Infektion mit
B. burgdorferi mittels Schlundsonde verabreicht. Durch wiederholtes Messen der
Tibiotarsalgelenke
mit
Hilfe
eines
Außentasters
wurde
anschließend
der
Schwellungs- und Entzündungsverlauf registriert.
Um das Expressionsprofil relevanter Gene im Verlauf einer Borrelieninfektion
mit und ohne Behandlung zu untersuchen, wurde die Gesamt-RNA aus Gelenken
B. burgdorferi-infizierter C3H/HeJ-Mäuse isoliert und nach reverser Transkription
mittels quantitativer PCR analysiert.
Zusammenfassung
Des
Weiteren
4
wurden
histologische
Gefrier-Schnitte
Borrelien-infizierter
Tibiotarsalgelenke angefertigt und mit Hämatoxylin-Eosin gefärbt, um den Einfluss
der Pharmaka auf das Ausmaß der Entzündung zu beurteilen.
Thioglycolat-elizitierte
Peritonealmakrophagen
sowie
Endothel-
und
Fibroblastenzelllinien wurden in vitro unter An- oder Abwesenheit verschiedener
Test-Substanzen mit B. burgdorferi stimuliert. Von den Zellen sezernierte Zytokine
und PGE-2 wurden mit spezifischen ELISAs detektiert.
Um genomweit Genexpressions-Unterschiede feststellen zu können, die sich
durch die Behandlung mit bestimmten Substanzen ergeben, wurde in Kooperation
mit dem HZI Braunschweig eine Analyse der Gesamt-RNA aus kompletten
Tibiotarsalgelenken von C3H/HeJ-Mäusen am Tag 9 p. i. mittels Microarray
durchgeführt.
Ergebnisse und Beobachtungen:
Bei Untersuchungen des Expressionsprofils der 4 EP-Rezeptoren konnten diese in
PMNs, Makrophagen, DCs, Endothelzellen, PECs und auch in Tibiotarsalgelenken
B. burgdorferi-infizierter Mäuse nachgewiesen werden. Durch die Behandlung von
C3H/HeJ-Mäusen
mit
dem
EP-3-Agonisten
ab
Tag
7
p. i.
und
dem
EP-4-Antagonisten ab dem Tag der Infektion konnte eine signifikante Reduktion der
Gelenkschwellung erreicht werden. Histologisch konnte die abgeschwächte
Entzündungsreaktion insofern bestätigt werden, als in den behandelten Gelenken
weniger Zellinfiltrate beobachtet wurden.
In der Microarray-Analyse konnte eine verglichen mit Kontrollmäusen signifikant
verminderte Expression des Chemokins Cxcl-5, das neutrophile Granulozyten
anlockt,
infolge
einer
Behandlung
von
C3H/HeJ-Mäusen
mit
dem
EP-4-Antagonisten und dem COX-2-Inhibitor Rofecoxib festgestellt werden. Die
Regulation dieses Chemokins durch PGE-2 konnte in Experimenten mit
COX-2-defizienten Mäusen bestätigt werden. Als eine wichtige zelluläre Quelle für
die CXCL-5-Produktion wurden Peritonealmakrophagen identifiziert.
In weiteren Versuchen konnte gezeigt werden, dass weder die spezifische
Immunantwort noch die Elimination der Borrelien durch die Behandlung mit dem
EP-4-Antagonisten oder dem COX-2-Inhibitor beeinflusst werden.
Praktische Schlussfolgerung:
Die Schwere der Lyme-Arthritis ließ sich sowohl durch den EP-3-Agonisten als
auch durch den EP-4-Antagonisten reduzieren. Pro-inflammatorische Effekte des bei
Zusammenfassung
5
einer Borrelieninfektion produzierten PGE-2 werden daher offensichtlich über den
EP-4-Rezeptor vermittelt, anti-inflammatorische über den EP-3-Rezeptor, wobei die
unterschiedliche Expressionskinetik der Rezeptoren die dichotome Funktion von
PGE-2 verursacht. Von therapeutischer Bedeutung könnte der EP-3-Agonist sein, da
dieser eine anti-inflammatorische Wirkung auch noch bei Behandlungsbeginn am
Tag 7 p. i., d. h. bei schon manifester Entzündungssymptomatik, entfaltet.
Zusammenfassung
6
Summary
Background and purpose:
Prostaglandins are important mediators of allergies, tumors and inflammations,
and locally regulate cell homeostasis in many tissues. They are produced by
cyclooxygenases (COX) and specific synthetases for example in the CNS, the vessel
system and immune cells. Most prostaglandins bind to only one specific G proteincoupled receptor. PGE-2 plays an exceptional role among prostaglandins. PGE-2 not
only binds to four different receptors (EP-1 to EP-4), whose expressions are cell- and
tissue-specific, but depending on the receptor can act as a pro- or anti-inflammatory
mediator. In previous experiments, Prof. Gessner’s workgroup identified
prostaglandins to be important factors during inflammatory response due to Borrelia
burgdorferi infection. Upon pharmacologic COX-2 inhibition, Borrelia-induced
arthritis was greatly reduced in mice. The purpose of this work was to investigate the
relevance of EP-3 and EP-4 receptors in inflammation during experimental Lyme
arthritis. Hereto, C3H/HeJ mice were treated with a highly selective EP-3 receptor
(ONO-AE-248) agonist and a highly selective EP-4 receptor (ONO-AE3-208)
antagonist. Additionally, the possible influence of these substances on specific
immune responses and on the elimination of pathogens was examined.
Methods:
Mice were injected subcutaneously with the EP-4 antagonist on the day of
infection with B. burgdorferi and with the EP-3 agonist on day 7 p. i.. COX-2
inhibitor Rofecoxib was administered using a gavage from day 1 of infection with
B. burgdorferi. The swelling and the inflammatory process were measured
repeatedly at tibiotarsal joints using an outside caliper.
In order to examine the expression profile of relevant genes in the process of
treated
and
non-treated
Borrelia
infection,
total
RNA
from
joints
of
B. burgdorferi-infected C3H/HeJ mice was isolated and analysed by quantitative
RT-PCR.
Furthermore, histologic frozen sections of Borrelia-infected tibiotarsal joints were
prepared and stained with hematoxylin-eosin in order to evaluate the influence of
pharmaceutical products on the extent of inflammation.
Zusammenfassung
7
Thioglycollate-elicited peritoneal macrophages as well as endothelial und
fibroblast cell lines were stimulated in vitro with B. burgdorferi in the presence or
absence of different test substances. Cytokines and PGE-2 secreted by those cells
were detected using specific ELISAs.
In order to assess genome-wide differences in gene expression resulting from
treatment with certain substances, microarray analysis of the total RNA from entire
tibiotarsal joints from C3H/HeJ mice on day 9 p. i. was carried out in cooperation
with the HZI Braunschweig.
Results and observations:
The four EP-receptors were found to be expressed on PMNs, Mφ, DCs,
endothelial cells, PECs and in tibiotarsal joints of B. burgdorferi-infected mice. A
significant reduction in joint swelling could be observed in C3H/HeJ mice treated
with the EP-3-agonist from day 7 p.i. and with the EP-4 antagonist from day 1 of
infection. The reduced inflammatory response was confirmed histologically where
fewer cell infiltrates were found in joints of treated mice.
Microarray analysis detected a significantly reduced expression of the chemokine
Cxcl-5 in C3H/HeJ mice treated with the EP-4 antagonist and the COX-2 inhibitor
Rofecoxib compared to control mice. The chemokine CXCL-5 is known to attract
granulocytes. Regulation of this chemokine through PGE-2 was confirmed in
experiments with COX-2-deficient mice. Peritoneal macrophages were identified as
important cellular source for CXCL-5 production.
Further experiments revealed that neither the specific immune response nor the
elimination of Borrelia were influenced by treatment with the EP-4 antagonist or
COX-2 inhibitor.
Practical conclusion:
Severe Lyme arthritis could be assuaged by EP-3 agonists as well as
EP-4 antagonists. Pro-inflammatory effects of PGE-2, produced upon Borrelia
infection, were apparently mediated via the EP-4 receptor, anti-inflammatory effects
via the EP-3 receptor. The dichotomous function of PGE-2 is defined by the
receptor’s expression kinetics. The EP-3 agonist could be of therapeutical
importance, as it displays anti-inflammatory effects even if treatment is initiated on
day 7 p. i., when Lyme arthritis is clinically established.
Einleitung
8
2 EINLEITUNG
Die Lyme-Borreliose ist eine Krankheit, die lange Zeit unerkannt blieb. Vor der
Entdeckung des kausalen infektiösen Agens wurden die Beschwerden bei Kindern
der
juvenilen
rheumatoiden
Arthritis
und
bei
Erwachsenen
der
rheumatoiden Arthritis zugeschrieben. Erst 1976 wurde aufgrund einer Häufung von
Arthritisfällen in der Stadt Lyme des Staats Connecticut in den USA der
Zusammenhang zwischen einem Zeckenstich und der darauf folgenden Arthritis
hergestellt. Weitere 6 Jahre dauerte es, bis Willy Burgdorfer und Kollegen ein bisher
nicht beschriebenes, korkenzieherartiges Bakterium in Nymphen der Zeckenspezies
Ixodes (I.) scapularis entdeckten und mit Patienten, die eine frische LymeErkrankung zeigten, in Verbindung brachten, indem sie das gleiche Bakterium in
Kulturen von diesen Patienten nachweisen konnten (86).
Unter der Gruppe Borrelia burgdorferi sensu lato, die insgesamt 14 Mitglieder
zählt,
sind
die
3
wichtigsten
humanpathogenen
Borrelien-Genospezies
zusammengefasst, die über die nördliche Erdhalbkugel verbreitet sind. Während in
den USA ausschließlich Borrelia burgdorferi sensu stricto zu finden ist, sind in
Europa die meisten Erkrankungen auf die Spezies Borrelia afzelii und
Borrelia garinii
zurückzuführen.
Doch
auch
hier
sind
Infektionen
mit
Borrelia burgdorferi sensu stricto beschrieben worden. In den USA findet die
Übertragung hauptsächlich über die Zeckenarten I. scapularis und I. pacificus statt,
in Europa und Asien über die Arten I. ricinus und I. persulcatus (79). In Asien
wiederum werden durch diese Zecken nur die Spezies Borrelia garinii und
Borrelia afzelii übertragen (85).
Borrelien gehören zur Familie der Spirochäten. Borrelia burgdorferi ist ein
gram-negatives, mikroaerophil wachsendes Stäbchen mit einer Länge von 10-20 µm,
einem Durchmesser von 0,33 µm und einer Spanne von ca. 0,5 µm. Seine
korkenzieherartige Form erhält das Bakterium durch Flagellen, die an beiden Enden
des Bakteriums in der zytoplasmatischen Membran verankert sind und sich in der
Mitte überlappen. Die Flagellen befinden sich im periplasmatischen Raum zwischen
innerer und äußerer Membran und sind zusätzlich zur Form auch für die
Beweglichkeit des Bakteriums verantwortlich. Das Genom besteht aus einem
Chromosom von 910 kb, das durch zahlreiche Plasmide ergänzt wird. Einige dieser
Einleitung
9
Plasmide sind für Borrelien unentbehrlich und könnten somit auch als
Mini-Chromosome bezeichnet werden (13, 85, 28, 79).
Das Genom von Borrelia burgdorferi enthält eine große Anzahl von Sequenzen
für Lipoproteine, wie zum Beispiel die outer-surface-proteins (Osps) A bis F (20).
Dabei sticht das sogenannte VlsE-Protein (variable surface antigen E) heraus, da es
einer großen Antigendiversität unterliegt (106). Im Gegensatz dazu finden sich im
Genom nur sehr wenige Gene, die für die Biosynthese benötigt werden, was darauf
schließen lässt, dass die Ernährung von B. burgdorferi durch den Wirt geschehen
muss. Besonders hervorzuheben ist die Tatsache, dass B. burgdorferi zumindest für
das Wachstum in vitro kein Eisen benötigt und so einen Abwehrmechanismus des
Wirts umgehen kann (76). Da das Genom von B. burgdorferi keine bekannten
Toxine kodiert, geht man davon aus, dass die Pathogenität durch Migration im
Gewebe,
Adhäsion
an
Wirtszellen,
proinflammatorisch
wirksame
Bakterienbestandteile und Immunevasion zustande kommt (85).
Die Verbreitung der Borrelien über Zecken beruht auf einer horizontalen
Transmission zwischen den 2 ersten Stadien der Zeckenentwicklung, dem Stadium
der Larve und dem Stadium der Nymphe. Die Larve ernährt sich im Spätsommer
durch das Blut infizierter Nagetiere und die aus der Larve entstehende Nymphe
infiziert kleine Nagetiere und Säuger im nächsten Frühjahr bei ihrer nächsten
Nahrungsaufnahme, wodurch sich der Infektionskreis schließt. Während also die
ersten beiden Entwicklungsstadien der Zecken sich meistens von Nagetieren
ernähren, bevorzugen erwachsene Zecken größere Säugetiere. Den größten Teil des
natürlichen Infektionszyklus verbringen die Borrelien in einem ruheähnlichen
Zustand im Darm der Zecke. Die Infektion mit Borrelien findet dann durch den
Speichel der Zecke statt, mit dem 24-48 Stunden nach Beginn des Blutsaugens
Borrelien beim Prozess der Regurgitation in den neuen Wirt übertragen werden. Die
hauptsächliche Infektionsquelle für den Menschen sind Nymphen, obwohl alle 3
Zeckenstadien den Menschen befallen können. Der Mensch ist allerdings ein
Fehlwirt und trägt nicht zur weiteren Verbreitung der Borrelien bei (85).
Während ihres Ruhezustands im Darm der Zecke exprimieren Borrelien
hauptsächlich das Lipoprotein OspA. Sobald sich die Zecke nach ihrer inaktiven
Winterzeit im Frühjahr oder Sommer ernährt, ändert sich auch die Expression der
Lipoproteine: OspA wird herunterreguliert und dafür OspC hochreguliert (83). OspC
wird unter anderem benötigt, um Säugetiere zu infizieren (72, 30). Zusätzlich binden
Einleitung
10
Borrelien Plasminogen und deren Aktivatoren, um sich leichter ausbreiten zu können
(15).
Die Lyme-Erkrankung beim Menschen spielt sich in 3 Stadien ab. Das erste
Stadium besteht aus einer lokalen Entzündungsreaktion der Haut, die sich von der
Einstichstelle
der
Zecke
langsam
zirkulär
ausbreitet
(Erythema
migrans,
Wanderröte). Das zweite Stadium folgt nach Tagen bis Wochen und spiegelt die
Verbreitung der Borrelien im Körper wieder. Es werden das zentrale Nervensystem
und andere Organe, wie z. B. das Herz, befallen. Nach Monaten bis Jahren kann dann
das dritte Stadium eintreten, das durch eine persistierende Entzündung charakterisiert
ist, die z. B. die Haut oder ein Gelenk betreffen kann. Zwischen den einzelnen
Stadien können Remissionen vorkommen, die in ihrer Zeitspanne unterschiedlich
sind. Auch der Stadienablauf ist variabel, denn nicht jeder, der ein Erythema migrans
hat, entwickelt eine disseminierte Infektion. Andererseits kann ein Patient auch ohne
ersichtliche Hautzeichen spätere Manifestationen der Krankheit, wie zum Beispiel
eine Arthritis, bekommen (85). Neutrophile Granulozyten sind dabei eine wichtige
Zellgruppe, die einen entscheidenden Faktor in der Immunpathologie der
Lyme-Arthritis spielen (8).
Das lokalisierte erste Stadium manifestiert sich nach einer Inkubationszeit von
3-32 Tagen in der Haut und wird Erythema migrans genannt. Es tritt in 70-80% der
Fälle auf und wird in den USA häufig von Grippe-ähnlichen Symptomen begleitet,
während diese Symptome in Europa eher selten auftreten (84, 89). Man geht davon
aus, dass die erste Abwehrreaktion des Körpers an der Einstichstelle durch das
Komplementsystem stattfindet und dadurch die ersten Borrelien lysiert werden (7).
Großen Anteil an der Immunabwehr haben Makrophagen und Plasmazellen (103, 93,
59). Außerdem werden gehäuft Lymphozyten und dendritische Zellen (DCs) im
entzündeten Gewebe angetroffen (63). So nehmen die durch die Lipoproteine der
Spirochäten stimulierten Makrophagen die Spirochäten auf und degradieren sie in
intrazellulären Kompartimenten. Die in das entzündete Gewebe eingewanderten
peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) produzieren IFN (Interferon)-γ und
stimulieren somit zusätzlich Makrophagen, die daraufhin pro-inflammatorische
Zytokine, wie zum Beispiel TNF (Tumornekrosefaktor) und IL (Interleukin)-1-β
ausschütten.
Im zweiten Stadium kommt es zur Disseminierung der Borrelien im ganzen
Körper. Die Borrelien sind dabei sowohl in Flüssigkeiten wie Blut und Liquor, als
Einleitung
11
auch in Geweben wie Myokard, Gehirn, Muskel und Knochen zu finden. Dort kann
die Infektion zu sekundären Manifestationen führen, wie zum Beispiel Meningitis,
Radikuloneuritis oder muskuloskeletalen Schmerzen (17). Um sich auszubreiten,
bindet B. burgdorferi einerseits an Integrine, Proteoglycane oder Glycoproteine von
Wirtszellen. Andererseits trägt auch die Immunevasion der Borrelien zu ihrer
Ausbreitung bei. Man vermutet, dass die Borrelien der Immunabwehr entgehen,
indem sie die Antigenexpression ihrer Oberflächenproteine minimieren oder
permanent ändern. Ein wichtiges Element scheint dabei das VlsE-Protein zu sein,
jenes Lipoprotein, das Antigendiversität durchläuft. Des Weiteren haben Borrelien
eine Reihe unterschiedlich exprimierter Lipoproteine, wie zum Beispiel OspE/F, die
auch zur antigenen Vielfalt beitragen (34). Es wird angenommen, dass B. burgdorferi
als Reaktion auf die Immunantwort seine Oberflächenproteine herrunterreguliert. So
konnte in einem Mausmodell nachgewiesen werden, dass OspC, ein wichtiges
Protein bei der Infektion von Säugetieren, als Reaktion auf die Entwicklung von
Antikörpern herunterreguliert wird. Durch die verringerte Expression der
Oberflächenproteine kann der Erreger häufig vermutlich nicht vollständig eliminiert
werden (50). Zusätzlich können Borrelien bestimmte Abwehrmechanismen
blockieren. So hat B. burgdorferi unter anderem „complement regulator-acquiring
surface
proteins“,
die
die
Komplement-Regulatoren
„factor
H“
und
„factor H-like protein 1“ binden können und damit den Komplement-Faktor C3b
inaktivieren. Dadurch können sich Borrelien vor der vom Wirt induzierten Lyse
durch Komplementfaktoren schützen (45). In Mausmodellen konnte gezeigt werden,
dass sowohl die angeborene als auch die adaptive Immunabwehr für die Elimination
der Borrelien benötigt werden. Die Kombination der beiden Abwehrsysteme führt,
unter anderem durch Antikörperproduktion gegen viele verschiedene Bestandteile
dieser Spirochäten, zur Lyse der Borrelien (85).
Das dritte Stadium wird als das chronische Stadium bezeichnet. Dabei können
Borrelien über Jahre in Nischen des Körpers überleben, die von der Immunabwehr
schlecht erreicht werden oder weil das Immunsystem sie nicht erkennt (26, 55). Trotz
der seltenen Heilungserfolge im chronischen Stadium durch Antibiotika, werden
Patienten mit diesen therapiert. B. burgdorferi scheint dabei die Spezies zu sein, die
am häufigsten zu einer Arthritis, insbesondere einer Gonarthritis führt (88). In einem
Mausmodell wurde dabei den neutrophilen Granulozyten eine entscheidende Rolle in
der Entwicklung der experimentellen Gelenkentzündung beigemessen (8). Aber auch
Einleitung
12
ohne antibiotische Therapie reduziert sich die Zahl der Patienten mit Gonarthritis pro
Jahr um 10-20%, so dass nach 5 Jahren nur noch sehr wenige Patienten unter einer
Arthritis leiden (88). Das spricht dafür, dass das Immunsystem bei den meisten
Patienten letztendlich doch erfolgreich die Borrelien im Gelenk eliminieren kann. B.
afzelii wird hingegen für eine chronische Hautdegeneration verantwortlich gemacht,
die häufig in der Akrodermatitis chronica atrophicans endet, einer Hauterkrankung,
die vorwiegend bei älteren Frauen an sonnenlichtexponierten Stellen der distalen
Extremitäten vorkommt. B. garinii wird hauptsächlich mit einer großen Bandbreite
an neurologischen Erkrankungen in Verbindung gebracht, wie zum Beispiel der
spinalen Meningoradikuloneuritis oder der Polyneuropathie (71).
Es sind Lyme-Arthritiden beschrieben, bei denen die antibiotische Therapie nicht
zu einer Besserung der Beschwerden führte und die deshalb als antibiotikaresistent
gelten. Die normale Therapiedauer einer Borreliose beträgt mit Doxycyclin ein bis 2
Monate und mit Cephtriaxon 2 bis 4 Wochen. In bestimmten Fällen hatten Patienten,
die mit Doxycyclin oder Amoxicillin plus Probenecid für 30 Tage behandelt wurden,
jedoch weiterhin Beschwerden. Trotz Umstellung der Therapie auf Cephtriaxon i. v.
nach anhaltenden Gelenkbeschwerden über 3 Monate hatten 10% der Patienten
weiterhin Symptome, teilweise sogar über Jahre (87). Um dieses Phänomen zu
erklären, sind 4 Hypothesen aufgestellt worden: (I) persistierende Infektion, (II)
zurückgebliebene Spirochätenantigene, (III) durch die Infektion getriggerte
Autoimmunerkrankung
und
(IV)
unspezifische
(Hyper-)Aktivierung
des
Immunsystems (86). Obwohl keine der genannten Hypothesen alleine ausreicht, um
die andauernden Arthritiden der Patienten zu erklären, könnte doch die Kombination
dieser einzelnen Mechanismen die antibiotikaresistente Lyme-Arthritis erklären (86).
Patienten mit chronischer Arthritis werden nach der antibiotischen Therapie zur
Schmerzlinderung mit non-steroidal anti-inflammatory drugs (NSAIDs) und
disease-modifying antirheumatic drugs (DMARDs) behandelt. Obwohl die
DMARDs das Immunsystem unterdrücken, konnte nach DMARD-Therapie mittels
PCR keine erneute Ansammlung von Borrelien in den Gelenken festgestellt werden
(86). Die NSAIDs, die hauptsächlich der Schmerztherapie dienen, inhibieren die
Produktion von Prostaglandinen, welche dafür bekannt sind, bei Entzündungen eine
entscheidende Rolle zu spielen.
Prostaglandine (PGs) gehören zu der Familie der Eikosanoide und regeln im
Körper
viele
verschiedene
Prozesse,
wie
die
Plättchenaggregation,
die
Einleitung
13
Nierenfunktion und Immunantworten (27). Durch Entzündungsreize beginnt die
Herstellung von Prostaglandinen, indem aus der Zellmembran Arachidonsäure mit
Hilfe der Phospholipase A2 herausgelöst wird. Diese Arachidonsäure wird dann
durch die Cyclooxygenasen COX-1 und COX-2 in PGG-2 und danach von denselben
Enzymen weiter zu PGH-2 umgewandelt, welches eine instabile Vorstufe für weitere
Prostaglandine darstellt. Man nimmt an, dass COX-1 ein konstitutives Enzym ist und
in den meisten Körpergeweben vorkommt, während COX-2 ein induzierbares Enzym
ist und hauptsächlich im entzündeten Gewebe vorkommt (94, 61). PGH-2 wird dann
durch spezifische Prostaglandinsynthetasen in PGD-2, PGE-2, PGF-2a und PGI-2
umgewandelt. Diese spezifischen Prostaglandinsynthetasen können ebenso wie die
Cyclooxygenasen durch pro-inflammatorische Reize induziert werden (19). Da
Prostaglandine chemisch oder metabolisch instabil sind, geht man davon aus, dass sie
nur lokal in der Nähe ihres Produktionsortes wirken, indem sie an hochaffine
G-Protein-Rezeptoren vom Rhodopsin-Typ an der Zellmembran binden (68). PGE-2
wird
zusätzlich
durch
die
cytosolischen
Enzyme
15-Ketoprostaglandin-
∆13-Reduktase und 15-Hydroxyprostaglandin-Dehydrogenase abgebaut (92) (Abb.1).
Einleitung
14
Abb.1: Biosynthese von Prostaglandin-E2 (PGE-2), die Interaktionen mit den Rezeptoren EP-1
bis EP-4 und die wichtigsten Wege der pharmakologischen Inhibition.
PGE-2 wird durch Cyclooxygenasen (COX) und Prostaglandin-E-Synthetasen aus Arachidonsäure
hergestellt. PGE-2 bindet und agiert über eine Familie spezifischer E-Prostanoid(EP)-Rezeptoren.
A: Der PGE-2-Syntheseweg mittels COX-1 verläuft über die cytosolische Prostaglandin-E-Synthetase
(cPGES) und alternativ über die mikrosomale Prostaglandin-E-Synthetase-2 (mPGES-2). B: Der
PGE-2-Syntheseweg mittels COX-2 verläuft über mPGES-1 oder mPGES-2. C: PGE-2 wirkt über 4
unterschiedliche Rezeptorsubtypen (EP-1 bis EP-4), welche zu der Familie der 7-Transmembran-GProtein-gekoppelten Rezeptoren gehören. cPLA2: cytosolische Phospholipase A-2; MRP4: multidrug
resistance protein 4; PGH2: Prostaglandin-H2; NSAIDs: non-steroidal anti-inflammatory drugs; AC:
Adenylatcyclase; DAG: Diacylglycerol; PLC: Phospholipase C; IP3: Inositol-1,4,5-Triphosphat;
cAMP: cyklisches Adenosinmonophosphat, PIP2: Phosphatidylinositolbisphosphat.
Entnommen aus: D.F. Legler et al. / The International Journal of Biochemistry & Cell Biology 42
(2010) 198–201 (48).
Einleitung
15
Unter den Prostaglandinen ist PGE-2 (Abb. 2) das am häufigsten im Körper
vorkommende Prostaglandin und das Prostaglandin mit den vielfältigsten Wirkungen
(90). Die spezifischen Prostaglandin-E-Synthetasen (PGES) stellen den letzten
Schritt in der Produktion des PGE-2 dar und werden deshalb als „terminale
Synthetasen“ bezeichnet (107). Bislang sind 3 Prostaglandin-E-Synthetasen bekannt:
2 mikrosomale Prostaglandin-E-Synthetasen (mPGES-1 und mPGES-2) und eine
cytosolische Prostaglandin-E-Synthetase (cPGES) (73). mPGES-1 und cPGES
benötigen Gluthation als Kofaktor, das ihnen zu mehr Stabilität und Aktivität verhilft
(70, 95). Während diese beiden PGES gluthationabhängig sind, wurde 1997 eine
weitere mikrosomale PGES, mPGES-2, gefunden, die hauptsächlich im Herz und im
Gehirn exprimiert wird und gluthationunabhängig ist (100). Interessanterweise
konnte man eine Verbindung der Enzymaktivität zwischen den beiden COXEnzymen COX-1 und COX-2 und den PGES feststellen. So führte eine
Kotransfektion von humanen mPGES-1 und COX-2 in HEK293-Zellen und eine
darauf folgende Stimulation mit A23187 (Calcimycin) oder IL-1-β zu einer deutlich
höheren Produktion von PGE-2 als eine Kotransfektion mit mPGES-1 und COX-1
bei gleichen Stimuli. Man geht davon aus, dass die Aktivität sowohl von mPGES-1
als auch von COX-2 erst durch Stimuli, wie z.B. Infektion, Fieber oder Tumore,
erhöht wird (65) und deshalb eine gekoppelte Regulierung von mPGES-1 und COX2 wahrscheinlich ist. Andererseits scheint cPGES mit COX-1 koreguliert zu sein, da
mit einer Kotransfektion der Gene cPGES und COX-1 in HEK293-Zellen die
höchsten PGE-2-Werte ermittelt wurden (95). Beide Enzyme werden zudem in fast
allen Geweben konstitutiv exprimiert und sind nicht durch inflammatorische Stimuli
induzierbar. Daher nimmt man an, dass cPGES und COX-1 den Grundbedarf an
PGE-2 für die Gewebehomöostase bereitstellen (95). mPGES-2 hingegen produziert
bei chronischen oder akuten Entzündungsreaktionen PGE-2 sowohl in Verbindung
mit COX-1 als auch mit COX-2, wobei es eine leichte Favorisierung für COX-2 zu
geben scheint (64).
Lange Zeit ging man davon aus, dass PGE-2 hauptsächlich eine große Rolle bei
akuten Entzündungsreaktionen spielt, indem es die periphere Durchblutung
beeinflusst und so zu Hyperämie und Schwellung führt. Seit Untersuchungen mit
knockout-Mäusen für jeden spezifischen Rezeptor von Prostaglandinen durchgeführt
worden sind, weiß man jedoch, dass Prostaglandine und im Speziellen auch PGE-2
sowohl pro- als auch anti-inflammatorisch wirken. Dies wird häufig durch
Einleitung
16
unterschiedliche Genexpression in den betroffenen Geweben erreicht, wie z. B. bei
Arthritis-assoziierten
Genen
in
der
Kollagen-induzierten
Arthritis
(90).
Anti-inflammatorische Effekte von Prostaglandinen hat man z. B. bei Allergien
beobachtet (46). Prostaglandine können die Entzündung auf verschiedenen Stufen
beeinflussen und somit sowohl pro- als auch anti-inflammatorische Prozesse
koordinieren (90).
Abb. 2: Strukturformel von Prostaglandin-E2 (PGE-2).
In entzündlichen Geweben, wie auch in der Lyme-Arthritis, werden vermehrt
Prostaglandine gebildet (33). Aufgrund dessen wurden früher COX-Inhibitoren für
die Unterdrückung der Entzündungsreaktion eingesetzt, mit teils gravierenden
Nebenwirkungen, vor allem im Gastrointestinaltrakt (56). Um die konstitutive
Produktion von Prostaglandinen im entzündungsfreien Gewebe nicht zu behindern,
wurden COX-2-Inhibitoren entwickelt, die die Produktion der Prostaglandine vor
allem im entzündeten Gewebe unterdrücken sollten (75). Diese wurden besonders
zur Behandlung nichtinfektiöser entzündlicher Krankheiten wie Osteoarthritis oder
rheumatischer Arthritis eingesetzt Allerdings waren auch diese Medikamente zu
unspezifisch und führten zu z. T. erheblichen Nebenwirkungen. Durch die Inhibition
von Prostacyclin, das eine anti-thrombotische Wirkung hat, wurde das Gleichgewicht
im Gefäßsystem zwischen Prostacyclin und Thromboxan aufgehoben und zugunsten
der Thromboxanwirkung verschoben. Daraus resultierte eine Prädisposition für
Thrombosen, Bluthochdruck und Artherosklerose (21). Als Grund für die erhöhte
Produktion von Prostaglandinen wurde in der Lyme-Borreliose eine vermehrte
Expression von COX-2 festgestellt (1). Durch die Gabe des COX-2-Inhibitors
MF-Tricyclic konnte eine signifikante Reduktion der Arthritis erreicht werden. Um
die Wirkung des in der Entzündung so wichtigen PGE-2 genauer zu untersuchen,
Einleitung
17
sollten in dieser Arbeit Substanzen eingesetzt werden, die direkt auf der Ebene der
PGE-2-Rezeptoren wirken.
PGE-2 kann an 4 verschiedene Rezeptoren binden: EP1, EP2, EP3 und EP4. Die
Homologie der Aminosäuresequenzen der Rezeptoren ist dabei nicht sehr hoch und
beträgt nur etwa 20-30% (57). Alle 4 EP-Rezeptoren sind G-Protein-gekoppelte
Rezeptoren. Unter den EP-Rezeptoren sind EP-3 und EP-4 die am häufigsten
vorkommenden Rezeptoren und in der Maus in fast jedem Gewebe zu finden. Im
Gegensatz dazu ist EP-1 nur in Niere, Lunge und Magen nachgewiesen worden (90).
EP-2 wurde zunächst im Uterus gefunden (90), allerdings konnte es in anderen
Arbeitsgruppen in weitaus mehr Geweben nachgewiesen werden, wie z. B. im
Gefäßsystem (66, 51), in Lungenfibroblasten (69) und im Nierenmark (14).
Die EP-Rezeptoren 2 und 4 binden an G-Protein-S und bewirken somit einen
Anstieg der cAMP-Konzentration. Dadurch werden vermehrt entzündungsassoziierte
Gene in den betroffenen Zellen induziert (57). Man geht davon aus, dass EP-1
Ca++-Kanäle über ein noch nicht bekanntes G-Protein reguliert (91). EP-3 inhibiert
hauptsächlich die Adenylatcyclase über das G-Protein-I. Man darf aber nicht außer
Acht lassen, dass EP-3 häufig an mehr als ein G-Protein bindet und mehr als einen
Signaltransduktionsweg verwendet und somit in unterschiedlicher Art und Weise
wirken kann (90).
Die verschiedenen EP-Rezeptoren haben sehr unterschiedliche Funktionen im
Körper. Zum Beispiel vermittelt EP-1 Stressantworten und erhöht die vom
Capsaicin-Rezeptor erkannte Schmerzempfindlichkeit durch pH- und Hitzestimuli
(62). EP-2 alleine vermittelt unter anderem die Zelldifferenzierung von DCs, die
Rekrutierung von Neutrophilen und zusammen mit EP-4 die Gelenkentzündung in
der Kollagen-induzierten Arthritis. EP-3 wirkt in der Entstehung von Fieber mit,
unterdrückt die Typ I Allergie und ist somit ein Rezeptor, für den sowohl pro- als
auch anti-inflammatorische Effekte nachgewiesen wurden. EP-4 induziert zusätzlich
die Knochenbildung sowie die Langerhanszellmigration und -entwicklung (90).
Makrophagen (Mφ) sind dafür bekannt, nach Stimulation mit LPS große Mengen
an PGE-2 freizusetzen (90, 97). Auch ohne Stimulus wird in residenten
Peritonealmakrophagen und in der Makrophagenzelllinie J774.1 EP-4 exprimiert (37,
41). Während sich bei beiden Makrophagentypen die EP-2 Expression bei
LPS-Stimulation deutlich erhöht, ist in J774.1-Zellen nur eine leichte Erhöhung und
in residenten Peritonealmakrophagen sogar eine Suppression des EP-4-Rezeptors zu
Einleitung
18
erkennen (37). Bei Makrophagen, die durch Thioglycolatbehandlung in das
Peritoneum eingewandert sind, konnte man die Expression sowohl von EP-2 als auch
EP-4 induzieren (74). Durch die Sezernierung von PGE-2 und die gleichzeitige
Expression der EP-Rezeptoren konnte ein selbststimulierender Effekt durch PGE-2
auf Makrophagen nachgewiesen werden (23).
Für jeden der 4 PGE-2-Rezeptoren wurden in den letzten Jahren spezifische
Agonisten und Antagonisten entwickelt, um selektiv die Wirkung dieser Rezeptoren
zu überprüfen und therapeutisch zu modulieren. In dieser Arbeit wurden der
EP-3-Agonist ONO-AE-248, der an den pro- und anti-inflammatorischen Rezeptor
EP-3
bindet,
und
der
EP-4-Antagonist
ONO-AE3-208,
der
an
den
pro-inflammatorischen Rezeptor EP-4 bindet, eingesetzt (Abb. 3).
Abb. 3: Strukturformeln von ONO-AE-248 und ONO-AE3-208.
Für ONO-AE-248 wurde schon in anderen Studien gezeigt, dass es selektiv an
den EP-3-Rezeptor bindet (97) und unter anderem einen letalen Effekt auf
neutrophile Granulozyten (PMNs) hat, denen eine wichtige Rolle in der
Lyme-Arthritis zugeschrieben wird (35, 52). Zum einen wurde gezeigt, dass die
Genexpression derjenigen Chemokine, die PMNs anlocken, durch ONO-AE-248
herunterreguliert wird, und zum anderen wurde nachgewiesen, dass ONO-AE-248
direkt zu einem Zelluntergang von neutrophilen Granulozyten führen kann, der
weder Apoptose noch Nekrose entspricht. Der EP-4-Antagonist ONO-AE3-208 hat
zwar keinen letalen Effekt auf neutrophile Granulozyten, jedoch wurde schon
festgestellt, dass es im Modell der UV-induzierten Hautentzündung unter
ONO-AE3-208-Therapie zu einer Reduktion des Neutrophileninflux in die
entzündeten Gewebe kam (39).
Wie schon erwähnt, sind neutrophile Granulozyten neben Makrophagen
entscheidend an der Immunabwehr der Lyme-Borreliose beteiligt. Außer den
Einleitung
19
Chemokinen CXCL-1 und CXCL-2 ist ein weiterer wichtiger Faktor in der
Rekrutierung von Neutrophilen das CXCL-5, auch bekannt als human neutrophil
chemoattractant chemokine 78 (ENA-78) oder als LPS induced chemokine (LIX) in
der Maus. Im entzündeten Gewebe produzieren Fibroblasten und Makrophagen
größere Mengen CXCL-5 als in nichtentzündetem Gewebe. Makrophagen ihrerseits
verstärken indirekt die Sekretion von CXCL-5, indem sie durch Produktion von TNF
die Sekretion von CXCL-5 durch Fibroblasten stimulieren, wie in in vitro-Versuchen
nachgewiesen wurde (44). Schon 1994 wurde von Koch et al. beschrieben, dass bei
Gabe von anti-CXCL-5-Antikörpern die Chemotaxis von PMNs im Modell der
rheumatoiden Arthritis um ca. 42% reduziert wurde. 2004 wurde von Ruddy et al.
herausgefunden, dass auch IL-17 einen wesentlichen Teil zur Produktion von
CXCL-5 beisteuert und dass durch Kombination von TNF und IL-17, im Vergleich
zu TNF oder IL-17 allein, die höchste Menge an CXCL-5 produziert wird. Somit
konnte eine Verbindung zwischen angeborenem und adaptivem Immunsystem
aufgezeigt werden, die zusammen die Produktion von CXCL-5 steuern (80).
Der Rezeptor der Chemokine CXCL-5 und CXCL-1 heißt CXCR-2. Auch dieser
spielt eine wichtige Rolle in der Immunreaktion der Lyme-Borreliose. So konnte die
Arbeitsgruppe Brown et al. nachweisen, dass die Schwere der Lyme-Arthritis bei
CXCR-2-/--Mäusen des C3H/HeJ-Stammes und des C57BL/6-Stammes signifikant
reduziert war (8). Dies liegt wahrscheinlich daran, dass die PMNs die Blutgefäße
nicht verlassen konnten und daher nicht in das Gewebe eindrangen, was mittels
Immunhistologie gezeigt werden konnte.
Die unterschiedlichen Folgen einer Infektion mit B. burgdorferi bei den
Mausstämmen C57BL/6 und C3H/HeJ scheinen darauf zu beruhen, dass in den
beiden Stämmen verschiedene Gene aktiviert werden. Während C57BL/6-Mäuse
nach
Infektion
mit
Borrelien
keine
Krankheitszeichen,
wie
z.B.
eine
Gelenkschwellung, zeigen, ist bei C3H/HeJ-Mäusen eine starke Gelenkschwellung
des infizierten Hinterlaufs zu sehen. Bei den C3H/HeJ-Mäusen spricht vieles dafür,
dass die Aktivierung von IFN-induzierten Genen zur Entwicklung der schweren
Arthritis führt (58). In dieser Arbeit sollte nun untersucht werden, in welchem Maß
das bei Entzündungen allgemein so wichtige PGE-2 in diesem Prozess eine Rolle
spielt und in wie weit PGE-2 über bestimmte Rezeptoren die Expression von Genen
steuert, die die Arthritis beeinflussen können. Bisher gibt es in der Literatur
Einleitung
20
unterschiedliche Ansichten über diesen Sachverhalt. So beschreiben Anguita et al.,
dass der Schweregrad der Arthritis mit der COX-2-Aktivität korreliert, während
Blaho et al. beobachteten, dass COX-2-Produkte keinen fördernden Effekt auf die
Entwicklung der Lyme-Arthritis haben (1, 5).
Um die funktionelle Rolle bestimmter PGE-2-Rezeptoren (EP-Rezeptoren) in der
Lyme-Arthritis der Maus zu studieren, wurden 2 Medikamente eingesetzt, die jeweils
spezifisch an einen EP-Rezeptor binden. Zum einen wurde ONO-AE-248 als
spezifischer Agonist für den EP-3-Rezeptor, von dem unter bestimmten
Bedingungen anti-inflammatorische Signale ausgehen (46), verwendet und zum
anderen der spezifische Antagonist ONO-AE3-208 für den EP-4-Rezeptor, dessen
pro-inflammatorische Aktivität nachgewiesen ist (36, 40). Diese Medikamente
wurden sowohl in vivo C3H/HeJ-Mäusen injiziert als auch in vitro in verschiedenen
Zellkulturen, unter anderem bei Μφ, untersucht. Damit sollte ein weiterer Baustein
im Modell der Lyme-Arthritis erforscht werden, um den Zusammenhang von
Infektion und Immunantwort zu beleuchten und für die Zukunft eventuelle weitere
Therapiemöglichkeiten bereitzustellen.
Material und Methoden
21
3 MATERIAL UND METHODEN
3.1 Mäuse und Zellen
3.1.1
Mäuse
Die C3H/HeJ-Mäuse wurden bei Janvier und Charles River bestellt und danach unter
spezifisch pathogenfreien Hygienebedingungen gehalten. Zu dem Zeitpunkt der
Infektion waren die Mäuse 4 bis 6 Wochen alt. Davon abgesehen waren Mäuse, die
für Organ- bzw. Zellspenden zwecks in-vitro-Stimulation bestimmt waren, beliebig
alt.
Alle Tierversuche wurden gemäß Tierschutzgesetz durchgeführt und waren von
der Regierung Mittelfranken genehmigt.
3.1.2
Zellen
Für die Stimulation wurden stets eine Million Zellen pro Well in 1 ml Medium
verwendet.
Die Fibroblasten-Zelllinie L929 wurde in Click-RPMI-1640-Medium kultiviert
und passagiert, das mit 2 mM L-Glutamin, 0,05 mM ß-Mercaptoethanol, 165 IU/ml
Penizillin
G,
80
µg/ml
Streptomycin
und
10%
hitzeinaktiviertem
FCS
(Sigma-Aldrich) versetzt war.
Die Endothel-Zelllinie b.End.3 wurde in DMEM-Medium kultiviert und
passagiert, das mit 2 mM L-Glutamin, 10 mM HEPES-Puffer, 0,05 mM
ß-Mercaptoethanol, 165 IU/ml Penizillin G, 80 µg/ml Streptomycin und 10%
hitzeinaktiviertem FCS (Sigma-Aldrich) versetzt war (101, 60).
Die murinen Embryonal-Fibroblasten (MEF) wurden in DMEM-Medium
kultiviert und passagiert, das mit 2mM L-Glutamin, 0,05mM β-Mercaptoethanol,
165 IU/ml Penizillin G, 80 µg/ml Streptomycin, 10% hitzeinaktiviertem FCS
(Sigma-Aldrich) und 1% MEM NEAA (Gibco), versetzt war.
Material und Methoden
22
3.2 Methoden
3.2.1
Isolation und in-vitro-Stimulation von Peritonealmakrophagen
C3H/HeJ-Mäuse wurden mit 2 ml sterilem Thioglykolat-Medium (4% in H2O;
BD
Difco)
intraperitoneal
behandelt.
Nach
4
bis
5
Tagen
wurden
Thioglykolat-elizitierte peritoneale Exsudat-Zellen (PECs) durch Ausspülen des
Peritoneums mit Click-RPMI-1640-Medium gewonnen und zu jeweils 1 x 106/ml in
Zellkulturschalen
ausgesät.
Nicht
adhärente
Zellen
wurden
nach
einer
Inkubationszeit von 2 Stunden bei 37°C durch erneutes Waschen mit Click-RPMI1640-Medium entfernt. Die adhärenten, auf diese Weise hoch angereicherten
Makrophagen wurden danach mit lebenden B. burgdorferi (MOI 10) für 48 Stunden
bei 37°C stimuliert.
3.2.2
Präparation von murinen Embryonal-Fibroblasten (MEFs)
Aus dem Uterus von 12-14 Tage trächtigen Mäusen wurden die Embryonen
isoliert, mechanisch zerkleinert und danach je 1 Embryo mit 1 ml Trypsin (Gibco)
gelöst und für 5 Minuten bei 37°C inkubiert. Danach wurde nach Zugabe von 10 ml
Medium pro Embryo die MEF-haltige Zellsuspension mit einem Zellsieb (BD
Falcon) aufgereinigt. Mit 5 ml 0,01% Gelatine in PBS wurden Zellkulturschalen für
20 Minuten beschichtet. Danach wurde die Restflüssigkeit entfernt und 10 ml
Zellsuspension pro Schale hinzugegeben. Das Medium wurde täglich gewechselt und
die Zellen wurden bei Erreichen der Konfluenz 1:3 geteilt, damit sie weiter
expandieren konnten.
3.2.3
Zytokinmessung in Zellüberständen oder Gelenklysaten
Die Konzentrationen von Chemokinen, Zytokinen, sowie PGE-2 wurden in
Gelenklysaten und zellfreien Mediumüberständen von PEC-Kulturen mittels ELISA
ermittelt.
Aufeinander
abgestimmte
Antikörper-Paare
und
rekombinante
Standardproteine sowie komplette ELISA-Kits wurden von BD Pharmingen
(IL-12p40) oder R & D Systems (IL-6, TNF, PGE-2) für die Messungen erworben.
Den
Empfehlungen
der
Hersteller,
eine
Streptavidin/Biotin-Verstärkung
(Dako Cytomation) mit Tetramethylbenzidin (Sigma-Aldrich) als Substrat für die
Meerrettich-Peroxidase zu verwenden, wurde entsprochen.
Material und Methoden
3.2.4
23
Mausinfektion mit B. burgdorferi
Das mauspathogene N40-Isolat von B. burgdorferi sensu stricto wurde
mikroaerophil
bei
32°C
in
BSK-H-Medium
mit
6%
Kaninchenserum
(Sigma-Aldrich) kultiviert und mindestens einmal, höchstens aber dreimal vor der
Inokulation in Mäuse in vitro passagiert. Die Quantifizierung fand in einer
Zellzählkammer (Kammertiefe 0,02 mm) statt. Danach wurden die Borrelien mit
sterilem BSK-H-Medium auf eine Konzentration von 1 x 107/ml eingestellt. Den
Mäusen wurden daraufhin in die rechte hintere Fußsohle 5 x 105 Borrelien in 50 µl
Medium subkutan injiziert.
3.2.5
Die
In-vivo-Behandlung mit dem EP-3-Agonisten ONO-AE-248
Substanz
ONO-AE-248
(ONO-Pharmaceuticals)
wurde
in
einer
Konzentration von 2,5 µg/ml in PBS 10% Tween 80 vorverdünnt und bei -20°C
aufbewahrt. Unmittelbar vor der Applikation in Mäuse wurde die Substanz mit PBS
1% Tween 80
1:500
weiter
verdünnt.
Der
Beginn
der
Behandlung
der
C3H/HeJ-Mäuse fand gleichzeitig mit der Infektion durch Borrelien statt. Die
Behandlung wurde jeden Tag wiederholt, bis die unbehandelten Kontrollmäuse eine
Spontanremission der Gelenkschwellung zeigten.
Den Mäusen wurde die Substanz in einer Endkonzentration von 10 µg/kg/d in
einem Gesamtvolumen von 100 µl s. c. in den Rücken appliziert. Die Kontrollmäuse
erhielten das Vehikulum PBS 1% Tween 80 täglich auf die gleiche Art und Weise.
3.2.6
Die
In-vivo-Behandlung mit dem EP-4 Antagonisten ONO-AE3-208
Substanz
ONO-AE3-208
(ONO-Pharmaceuticals)
wurde
in
einer
Konzentration von 50 mg/ml in 100% Ethanol vorverdünnt und bei -20°C
aufbewahrt. Vor jeder Behandlung wurde die Substanz in PBS 1:20 weiter verdünnt.
Gleichzeitig mit der Infektion durch Borrelien begann die Behandlung. Diese
erfolgte täglich bis zu dem Zeitpunkt, an dem die Kontrollmäuse eine
Spontanremission der Gelenkschwellung zeigten.
Den Mäusen wurde die Substanz in einer Endkonzentration von 10 mg/kg/d in
einem Gesamtvolumen von 100 µl täglich s. c. in den Rücken appliziert. Die
Kontrollmäuse wurden mit PBS behandelt.
Material und Methoden
3.2.7
24
Messung der Gelenkschwellung
Zur Beurteilung des Schweregrads der Arthritis, der mit der Gelenkschwellung
korreliert, wurden die Durchmesser der Tibiotarsalgelenke durch wiederholtes
Messen mit einem Außentaster (Kroeplin) bestimmt. Die Schwellung wurde durch
Berechnung des Verhältnisses von rechtem, infiziertem Gelenk zu linkem,
uninfiziertem Gelenk quantifiziert. Die somit erhaltenen Werte geben das x-fache
Verhältnis der Schwellung von infiziertem zu uninfiziertem Gelenk wieder. Die
Messung erfolgte mit gestrecktem Gelenk in anterior-posteriorer Orientierung der
Maus.
3.2.8
Histologische Beurteilung von Gelenken
Die Tibiotarsalgelenke wurden mit einer Schere von den Hinterläufen abgetrennt,
in Tissue-Tek O.C.T.-Synthetikmedium (Sakura Finetek) eingebettet, mit flüssigem
Stickstoff schockgefroren und bei -70°C bis zur Weiterverwertung aufbewahrt. Um
die physiologische Morphologie bestmöglich zu erhalten, wurden die Gelenke ohne
vorherige Dekalzifizierung als Ganzes mit einem speziellen Messer aus
Wolframcarbid (16 cm, D-Profil, Microm) bei 25°C an einem HM 500
OM-Kryostaten (Microm) geschnitten. Auf Objektträger, die vorher mit 50 µg/ml
Poly-L-Lysin (Sigma-Aldrich) in 10 mM Tris-HCl (pH 8,0) beschichtet worden
waren, wurden 10 µm dicke Sagittalschnitte des Tibiotarsalgelenks aufgezogen, mit
Aceton bei -20°C für 20 Minuten fixiert, luftgetrocknet und in Hämalaun (Dr. K.
Hollborn & Söhne) für 3 Minuten und in Eosin Y (Sigma-Aldrich) für 5 Minuten
gefärbt.
Die gefärbten Schnitte wurden daraufhin mit einer aufsteigenden Alkoholreihe
und mit Rotihistol (Roth) dehydriert und in DePeX (Serva) eingebettet. Die mit
einem
Axiophot-Mikroskop
(Zeiss)
verbundene
digitale
Videokamera
(Spot RT Color, Diagnostic Instruments) dokumentierte im Zusammenhang mit
MetaVue-Software (Universal Imaging) Fotos der angefertigten Präparate. Für die
weitere Bearbeitung der digitalen Fotos wurde die Photoshop-Software (Adobe)
verwendet.
3.2.9
Bestimmung der Borrelien-Last im Tibiotarsalgelenk durch qPCR
Nach der Infektion der Mäuse mit B. burgdorferi wurde die Gesamt-DNA des
Tibiotarsalgelenks des infizierten Hinterlaufs mit Hilfe des QIAamp DNA Mini-Kits
Material und Methoden
25
(Qiagen) entsprechend der Angaben des Herstellers extrahiert. Das Elutionsvolumen
des AE-Puffers (10 mM Tris-HCl, 0,5 mM EDTA; pH 9,0) betrug 200 µl.
Um die genomische DNA von B. burgdorferi gleichzeitig zu detektieren und zu
quantifizieren, wurde eine quantitative PCR an der isolierten Gesamt-DNA
durchgeführt. Dabei wurden folgende Primer, die von Metabion erworben waren,
verwendet: vorwärts: 5’-TCT TTT CTC TGG TGA GGG AGC T-3’; rückwärts: 5’-TCC
TTC CTG TTG AAC ACC CTC T-3’. Damit wurde ein 70-bp-Fragment des
Flagellin-B-Gens (flaB, chromosomal, Einzelkopie) von B. burgdorferi amplifiziert. Zur
Normalisierung wurde ein 154-bp-Fragment des murinen Nidogen-1-Gens mit folgenden
Primern des gleichen Herstellers amplifiziert: vorwärts: 5’-CCA GCC ACA GAA TAC
CAT CC-3’; rückwärts: 5’-GGA CAT ACT CTG CTG CCA TC-3’. Beide Analysen
wurden in getrennten Ansätzen unter Verwendung des LightCycler fastStart DNA
Master
Plus
SYBR GreenI Kits von Roche durchgeführt. Das Ansetzen des
Master-Mixes wurde laut Protokoll durchgeführt. Das Volumen des PCR-Ansatzes
betrug 10 µl, bestehend aus 5 µl H2O, je 0,5 µl PCR Primer, 2 µl Master-Mix und 2
µl Probe. Die qPCR erfolgte im LightCycler (Roche).
Für die Erstellung einer Standardkurve des Flagellin-B-Gens wurde aus dem
Referenzstamm von B. burgdorferi DNA extrahiert. Die Anzahl der flaB-Kopien in
einer Probe, die die Zahl der Spirochäten reflektiert, wurde auf Basis der Standards
von der LightCycler-Software (Roche) errechnet und auf 106 Nidogen-1-Kopien
normalisiert. Sequenzielle Verdünnungen des pGEM-T easy-Plasmids (Promega) mit
murinem Nidogen-1-Zielfragment wurden als Standard in jeder Nidogen-1-PCR
mitgeführt.
Der Ablauf der qPCR begann initial mit einer 10-minütigen Denaturierung bei
95°C, gefolgt von 50 Amplifikationszyklen. Diese Zyklen bestanden jeweils aus
15-sekündiger Denaturierung bei 95°C, 10-sekündiger Anlagerung bei 61°C (flaB)
bzw.
60°C
(Nidogen-1)
und
10-sekündiger
Elongation
bei
72°C.
Die
Temperaturübertragungsrate betrug 20°C/s und am Ende jeder Extension wurde die
Fluoreszenz gemessen. Um die Spezifität der neu gebildeten PCR-Produkte zu
bestimmen, erfolgte nach Abschluss der PCR eine thermische Auftrennung der
Amplifikate durch Temperaturerhöhung von 65°C auf 95°C mit 0,1°C/s, während
gleichzeitig Fluoreszenzänderungen detektiert wurden (Schmelzpunktanalyse).
Material und Methoden
26
3.2.10 Nachweis von Antikörpern im Serum
Spezifische AK-Isotypen gegen B. burgdorferi wurden durch AK-CaptureELISAs untersucht, nachdem Blut von infizierten Mäusen aus Schwanzvenen am
Tag 7 und Tag 14 p. i. entnommen worden war. Mikrotiterplatten wurden dazu mit
sonifizierten B. burgdorferi in einer Konzentration von 5 µg/ml beschichtet. Das
Mäuseserum wurde entweder 1:100 oder 1:1000 in PBS/10% FCS verdünnt, auf die
Platten gegeben und über Nacht bei 4°C inkubiert. Danach wurden gebundene AK
durch Zugabe von Sekundärantikörpern gegen murines IgG1 oder IgG2a (beide
BD Pharmigen) nachgewiesen. Anti-IgG1-AK und anti-IgG2a-AK waren mit
alkalischer Phosphatase konjugiert und wurden 1:1000 verdünnt. Die Testplatten
wurden abschließend mit 1 mg/ml p-Nitrophenylphosphat (Sigma-Aldrich) inkubiert
und entwickelt.
3.2.11 RNA-Präparation und cDNA-Synthese
Die Gesamt-RNA aus den Tibiotarsalgelenken wurde mit dem RNaqueous Small
Scale
Phenol-Free
Total
RNA
Isolation
Kit
(Ambion)
extrahiert.
Das
Elutionsvolumen betrug 50 µl. Es wurde stets den Anweisungen des Herstellers
Folge geleistet. Um Konzentration und Reinheit zu bestimmen, wurde die
Absorption der gelösten RNA bei 260 nm und 280 nm gemessen. Das Verhältnis von
260 nm zu 280 nm war ≥1,7.
Zur Synthese der cDNA wurden 8 µl Gesamt-RNA (zwischen 500 ng/ml und 5
µg/ml) zusammen mit 500 ng Oligo-(dT)-Primern, 0,5 mM DesoxynukleosidTriphosphat-Mix (beide von Amersham), 4 µl 5-fach First-strand-Puffer, 10 mM
DTT und 50 U SuperScriptII-RT-Polymerase (alle von Invitrogen) für 50 min bei
42°C inkubiert.
Nach der reversen Transkription wurde das Enzym durch 15-minütiges Erhitzen
der Proben auf 70°C inaktiviert.
3.2.12 Qualitative PCR
Für die qualitative PCR wurde 1 µl unverdünnte cDNA als Vorlage in
40-µl-Reaktionen verwendet. Alle PCRs hatten 40 Amplifikationszyklen, die unter
Standardbedingungen abliefen. Die Auftrennung der PCR-Produkte erfolgte in
1,5 - 3% Agarosegelen und die Visualisierung durch Färbung mit Ethidiumbromid.
Primersequenzen und spezifische Anlagerungstemperaturen sind in der folgenden
Tabelle 1 aufgelistet.
Material und Methoden
27
Tab.1: In PCR und RT-PCR angewandte Primer.
Gen
Cox-2
Cxcl-1
Cxcl-2
Cxcl-5
Ep-2
Ep-3
Ep-4
Primer-Sequenz (5’ nach 3’)
vorwärts CAG CAC TTC ACC CAT CAG TT
rückwärts GGC GCA GTT TAT GTT GTC TG
vorwärts TGC ACC CAA ACC GAA GTC AT
rückwärts TTG TCA GAA GCC AGC GTT CAC
vorwärts CGG TCA AAA AGT TTG CCT TG
rückwärts TCC AGG TCA GTT AGC CTT GC
vorwärts CGT AAC TCC AAA AAT TAA TCC CAA A
rückwärts CGA GTG CAT TCC GCT TAG CT
vorwärts TAA AAA CCG AAG AGC TCG GA
rückwärts TTA TGA CCA TCA CCT TCG CC
vorwärts GCC GCT ATT GAT AAT GAT GTT GAA
rückwärts CCT TCT CCT TTC CCA TCT GTG T
vorwärts ATG GTC ATC TTA CTC ATC GCC AC
rückwärts CTT TCA CCA CGT TTG TCT GAT
vorwärts TCT TTT CTC TGG TGA GGG AGC T
rückwärts TCC TTC CTG TTG AAC AAC CTC T
vorwärts TCC AGC GCA AGA AAG AAA AGA TG
Il-12p40
rückwärts AAA AGC CAA CCA AGC AGA AGA CAG
vorwärts AGC ACA CTG CTG GTC ATC AAG ATG TAC
mPges-1
rückwärts CCT GAG AGG ACA ACG AGG AAA TGT ATC
vorwärts CGC GCT GGG GCT GTA CCA CAC C
mPges-2
rückwärts CTG GGC CAC CAA GAT GGG CAC TTT C
vorwärts CCA GCC ACA GAA TAC CAT CC
Nidogen-1
rückwärts GGA CAT ACT CTG CTG CCA TC
vorwärts ATG TCC GGT AAC GGC GGC
Pbgd
rückwärts CAA GGC TTT CAG CAT CGC CAC CA
vorwärts ATG AGC ACA GAA AGC ATG ATC
Tnf
rückwärts TAC AGG CTT GTC ACT CGA ATT
flaB
Amplicon
TA
-Größe
[°C]
[bp]
58
130
56
176
54
178
60
200
56
110
53
83
60
106
61
70
56
294
58
250
59
259
60
154
59
135
51
276
Tab.1: TA: Anlagerungs-Temperatur der Primer. bp: Basenpaare.
3.2.13
Quantitative RT-PCR
Für die Quantifizierung der mRNA-Expressionshöhen verschiedener Gene in
Zelllinien und in Tibiotarsalgelenken von Mäusen zu unterschiedlichen Zeitpunkten
p. i. wurden quantitative RT-PCRs mit dem LightCycler (Roche) unter Verwendung
des LightCycler fastStart DNA Master
Plus
SYBR GreenI (Roche) Kits durchgeführt.
Bei jeder dieser RT-PCRs wurde eine sequenzielle Verdünnung des pGEM-T easyPlasmids (Promega) in 4 Zehnerpotenzen mitgeführt. Pro Molekül enthielt dieses
Plasmid genau eine Kopie der betreffenden Zielsequenz. Dadurch konnte eine
externe Standardkurve geschaffen werden. Diese Standardkurven wurden mit der
Material und Methoden
28
LightCycler-Software erstellt, um damit die Amplifikationseffizienz und die
Expressionshöhe des Zielgens berechnen zu können. Für die Normalisierung der
somit generierten Werte wurde in separaten Läufen der mRNA-Gehalt der
Housekeeping-Gene Pbgd oder Hprt ebenfalls durch eine externe Standardkurve
bestimmt. Die Normalisierung mit dem relativ schwach exprimierten Pbgd erfolgte
bei
Genen
mit
geringer
Expressionshöhe,
um
vergleichbare
Amplifikationsbedingungen zu gewährleisten.
Das PCR-Reaktionsvolumen betrug 10 µl und enthielt 5 µl H2O, je 0,5 µl PCR
Primer, 2 µl Master-Mix und 2 µl der Probe. Der Master-Mix wurde laut Protokoll
hergestellt.
Der Amplifikationsablauf wurde wie in Kap. 3.2.9 beschrieben durchgeführt, mit
Ausnahme der Anlagerungstemperaturen, die wie in Tab.1 beschrieben angepasst
wurden (102, 24, 12).
3.2.14 cDNA-Microarray
In Kooperation mit dem Labor von Dr. Robert Geffers in der Array-Facility der
GBF Braunschweig wurde für eine Analyse der gesamten RNA-Transkriptmengen
und unterschiedlich exprimierter Gene in Tibiotarsalgelenken von C3H/HeJ-Mäusen
9 Tage p. i. ein genomweiter cDNA-Microarray (Affymetrix 430 2.0) durchgeführt.
Dabei wurde die RNA aus Gelenken von Vehiculum-behandelten C3H/HeJ-Mäusen
als Referenz für die Ermittlung der Expressions-Unterschiede gegenüber den
pharmakologisch behandelten Mäusen verwendet. Die Behandlung erfolgte von
Tag 0 bis Tag 9 mit dem COX-2-Inhibitor Rofecoxib oder mit dem
EP-4-Antagonisten ONO-AE3-208. Die isolierte Gesamt-RNA von 3 Mäusen jeder
Behandlungsgruppe wurde gepoolt und danach mit LiCl (2 M final) gefällt und
später in 20 µl Elutionspuffer resuspendiert (RNAqueous-Kit, Ambion). Anschließend
wurden in der GBF-Array-Facility Braunschweig nach Standardprotokollen folgende
Tests durchgeführt: Die Überprüfung der RNA-Integrität im Agilent 2100
Bioanalyzer (Agilent), der DNase-Verdau, die Synthese von cDNA und biotinylierter
cRNA, die Hybridisierung der fragmentierten cRNA (12,5 µg) auf dem Genchip, die
Färbung mit Streptavidin-PE und das Scannen des Genchips. Mit Hilfe der Gene Clip
Operating Software (GCOS) 1.2 und der Data Mining Tool (DMT) 3.1 Software
(Affymetrix) wurde eine erste Datenanalyse durchgeführt. Zur Normalisierung der
Fluoreszenzintensitäten wurden die 3 Microarrays auf eine Zielintensität von 150
angeglichen. Auf den Genchips wurden zwischen 50% und 55% (p<0,05) aller
Material und Methoden
29
analysierten Gene von der Software als exprimiert bewertet („present calls“). Die
Daten wurden zur systematischen Aufarbeitung und für die problemorientierte
Analyse in eine MS Access-Datenbank transferiert und durch gezielt formulierte
Auswahlabfragen, die in der entsprechenden Legende beschrieben sind, ausgewertet.
Es wurden nur Gene bei der Analyse der unterschiedlichen Expression
berücksichtigt, deren Expressionshöhe mehr als 2-fach gegenüber der Referenz
verändert war und die mindestens in einer der beiden verglichenen Bedingungen eine
positive Expressionsbewertung hatten (82, 43, 16).
Ergebnisse
30
4 ERGEBNISSE
4.1 Prostaglandin-E-2,
seine
Synthetasen
und
seine
Rezeptoren in der murinen Borreliose
4.1.1
Expression der mikrosomalen Prostaglandin-E-Synthetasen (mPGES) in
verschiedenen Primärzellen und Zelllinien.
In der Literatur wurden eine Reihe von Zelltypen beschrieben, die PGE-2
produzieren (48, 29, 21, 90). Dabei gelten die Makrophagen als besonders potente
PGE-2-Produzenten. Da PGE-2 durch 2 mikrosomale Prostaglandin-E-Synthetasen
(mPGES-1 und mPGES-2) gebildet werden kann, sollte zunächst untersucht werden,
in welchen Zelltypen diese Enzyme exprimiert werden. Dazu wurde mRNA aus
polymorphkernigen neutrophilen Granulozyten (PMNs) von C3H/HeJ-Mäusen,
unstimulierten und LPS-stimulierten dendritischen Zellen (DCs), Borrelienstimulierten peritonealen Exsudatzellen (PECs) aus C3H/HeJ-Mäusen und Μφ der
Zelllinie J774 sowie Endothelzellen der Zelllinie b.end.3 isoliert und in cDNA
umgeschrieben, um danach mittels konventioneller PCR analysiert zu werden. Es
stellte sich heraus, dass mPGES-1 in PMNs aus C3H/HeJ-Mäusen, unstimulierten
und LPS-stimulierten DCs, Borrelien-stimulierten PECs und der Μφ-Zelllinie J774
exprimiert wurde, während in TNF-stimulierten Endothelzellen mPGES-1 nicht
nachgewiesen werden konnte (Tab. 2).
Tab. 2: mRNA-Expression von Prostaglandin-E-Synthetasen in murinen Zellen.
Perit.-PMN
C3H/HeJ
20h B.b . Stim
Makrophage
J774
48h B.b. Stim
DC
C3H/HeJ
ø Stim.
DC
C3H/HeJ
24h LPS Stim
Endothelzelle
b.End.3
24h TNF Stim
PEC
C3H/HeJ
24h B.b. Stim
mPges-1
+
+
+
+
–
+
mPges-2
–
+
+
+
+
+
Mittels qualitativer PCR wurden stimulierte und unstimulierte murine Zellen auf die Expression der
beiden mikrosomalen Prostaglandin-E-Synthetasen (mPGES-1 und -2) untersucht. Ein nach 40 Zyklen
detektiertes Transkript ist mit „+“ dargestellt, nicht vorhandene Transkription mit „–“.
Die zweite Synthetase, mPGES-2, wurde ebenfalls in unstimulierten und
LPS-stimulierten DCs, Borrelien-stimulierten PECs und in Μφ der Zelllinie J774
Ergebnisse
31
produziert. Zusätzlich wurde mPGES-2 auch in TNF-stimulierten Endothelzellen
exprimiert, während in PMNs von C3H/HeJ-Mäusen kein mPGES-2 nachzuweisen
war (Tab. 2). Daraus zeigt sich, dass beide PGE-Synthetasen in den meisten
Zellarten gleichzeitig exprimiert werden, aber zwischen nicht-hämatopoetischen
Endothelzellen und hämatopoetischen Zellen (PMNs) auch Unterschiede vorhanden
sind.
4.1.2
Expression der mikrosomalen Prostaglandin-E-Synthetasen (mPGES) in
der Lyme-Arthritis.
Als nächstes sollte untersuchen werden, ob auch in den von der Lyme-Arthritis
befallenen Gelenken die Expression von mPGES-1 und mPGES-2 reguliert wird.
Dazu wurden C3H/HeJ-Mäuse mit B. burgdorferi infiziert, die entsprechenden
Tibiotarsalgelenke der Mäuse zu den angegebenen Zeitpunkten präpariert und die
Gesamt-RNA extrahiert, um danach die mRNA mittels reverser Transkriptase in
cDNA umzuschreiben. Die so gewonnene cDNA wurde dann mit Hilfe des
LightCyclers auf mPGES-1 und mPGES-2 analysiert. Der Ausgangswert der
mPGES-Expression am Tag 0 bei einer uninfizierten Maus wurde dabei als „1“
definiert.
Wie in Abbildung 4 zu erkennen, war im Verlauf der Infektion von Tag 0 bis Tag
17 eine deutliche Steigerung der mPGES-1-Produktion zu sehen, während sich die
Expression von mPGES-2 kaum gegenüber dem Ausgangsniveau von Tag 0
veränderte. Dies lässt darauf schließen, dass mPGES-1 eine wesentliche Rolle in der
Entwicklung der Gelenkentzündung spielt. mPGES-2 ist durch die Infektion mit
B. burgdorferi im Gelenk nicht induzierbar, sie scheint also keinen arthritogenen
Einfluss zu haben.
Ergebnisse
32
Abb. 4: mRNA-Expression von Prostaglandin-E-Synthetasen in Tibiotarsalgelenken von
B. burgdorferi-infizierten C3H/HeJ-Mäusen.
Zu den angegebenen Zeitpunkten wurde die gesamte RNA aus Gelenken isoliert und die mRNA mit
Hilfe von Oligo-(dT)-Primern revers transkribiert. Die Expressionshöhen der beiden Gene wurden
mittels quantitativer LightCycler-PCR bestimmt, wobei als Referenz das Housekeeping-Gen Pbgd zur
Normalisierung verwendet wurde. Der mRNA-Gehalt einer uninfizierten Maus wurde mit dem Wert 1
definiert, alle übrigen Expressionshöhen sind als Vielfache dieses Wertes dargestellt.
4.1.3
Expression der PGE-2-Rezeptoren EP-1 bis EP-4 in verschiedenen
Primärzellen und Zelllinien.
Des Weiteren sollte die mRNA-Expression der verschiedenen PGE-2-Rezeptoren
EP-1 bis EP-4 mittels konventioneller PCR in den gleichen Zellarten nachgewiesen
werden, in denen zuvor die Expression der mPGES-1 und der mPGES-2 bestimmt
worden war. Im Unterschied zu den mikrosomalen Prostaglandinsynthetasen
(siehe Tab. 2) zeigte sich eine größere Variabilität in der Expression der Rezeptoren.
EP-1-Rezeptor-mRNA konnte in keiner der untersuchten primären Zellen oder
Zelllinien nachgewiesen werden (Tab. 3).
Weder in PMNs von C3H/HeJ-Mäusen, DCs, Borrelien-stimulierten PECs,
TNF-stimulierten Endothelzellen noch in der Μφ−Zelllinie J774 zeigte sich eine
Expression dieses Rezeptors. Die EP-2-Rezeptor-Transkription war hingegen in
unstimulierten als auch LPS-stimulierten DCs, Borrelien-stimulierten PECs sowie
schwach in der Μφ−Zelllinie nachweisbar, aber nicht in PMNs und TNF-stimulierten
Endothelzellen. Der EP-3-Rezeptor wurde sowohl in unstimulierten als auch in mit
Ergebnisse
33
LPS stimulierten DCs und mit Borrelien stimulierten PECs aus C3H/HeJ-Mäusen
exprimiert, während in PMNs, TNF-stimulierten Endothelzellen und in der
Μφ−Zelllinie kein Rezeptor vom EP-3-Typ nachgewiesen werden konnte. Der
EP-4-Rezeptor stellte sich als der am breitesten exprimierte Rezeptor heraus, da
spezifische
mRNA
in
allen
untersuchten
Zellarten
und
unter
allen
Stimulationsbedingungen zu finden war. Sowohl in PMNs, unstimulierten und
LPS-stimulierten DCs, TNF-stimulierten Endothelzellen, Borrelien-stimulierten
PECs als auch in den J774-Μφ konnte dieser nachgewiesen werden. Dabei hatten die
Endothelzellen die schwächste Bande für den EP-4-Rezeptor. Aufgrund dieser
Ergebnisse stellten sich somit die Rezeptoren EP-2, EP-3 und EP-4 als interessante
Kandidaten für weitere Untersuchungen dar (Tab. 3).
Tab. 3: mRNA-Expression von Prostaglandinrezeptoren in murinen Zellen.
Perit.-PMN
C3H/HeJ
20h B.b. Stim
Makrophage
J774
48h B.b. Stim
DC
C3H/HeJ
ø Stim.
DC
C3H/HeJ
24h LPS Stim
Endothelzelle
b.end.3
24h TNF Stim
PEC
C3H/HeJ
24h B.b. Stim
Ep-1Rezeptor
–
–
–
–
–
–
Ep-2Rezeptor
–
+/-
+
+
–
+
Ep-3Rezeptor
–
–
+
+
–
+
Ep-4Rezeptor
+
+
+
+
+/-
+
Mittels qualitativer PCR wurden stimulierte und unstimulierte murine Zellen auf die Expression der 4
Prostaglandin-E-Rezeptoren (EP-1 – EP-4) untersucht. Ein nach 40 Zyklen detektiertes Transkript ist
mit „+“ dargestellt, nicht vorhandene Transkription mit „–“.
4.1.4
Expression der Zytokine IL-12, TNF und IL-6 in Borrelien-stimulierten
PECs aus C3H/HeJ-Mäusen.
Um den Effekt der beiden Medikamente ONO-AE-248 und ONO-AE3-208, von
exogenem PGE-2 und dem COX-2-Inhibitor Rofecoxib in vitro vergleichend zu
untersuchen, wurden PECs aus C3H/HeJ-Mäusen gewonnen. Diese PECs wurden
dann mit den Substanzen PGE-2, EP-3-Agonist, EP-4-Antagonist oder Rofecoxib
30 Minuten inkubiert, bevor sie mit Borrelien für 48 Stunden stimuliert wurden. Die
Überstände wurden anschließend mittels ELISA auf die Zytokine IL-12, TNF und
IL-6 hin untersucht.
Ergebnisse
34
Abb. 5: Zytokinausschüttung von Peritonealmakrophagen (PECs) 24 h nach B. burgdorferi
Stimulation.
4 Tage nach intraperitonealer Injektion von Thioglykolat in Mäuse wurden PECs mittels
Peritoneallavage gewonnen. Jeweils 1x106 Zellen wurden mit den angegebenen Substanzen behandelt
und eine halbe Stunde später mit B. burgdorferi-Lysaten (MOI: 10) stimuliert. 24 h später wurde die
Konzentration der Zytokine IL-12p40, IL-6 und TNF-α in den Zellüberständen mittels ELISA
gemessen. Um die Versuche vergleichbar zu machen, wurden bei jedem Versuch die Mediumwerte
als 0 festgelegt. Die dargestellten Werte sind Prozentangaben, wobei die Mittelwerte für reine
Borrelienstimulation (ohne zusätzliche Substanzen) als 100% festgelegt wurden. Alle Messwerte sind
Mittelwerte ± SD aus Duplikaten dreier unabhängiger Experimente.
Die Zytokinsekretion infolge reiner Stimulation mit B. burgdorferi wurde im
Diagramm als 100% definiert, alle weiteren gemessenen Werte wurden in Relation
zu diesem Bezugspunkt dargestellt. Bei den Proben, die vorher mit PGE-2 und dem
EP-3-Agonisten ONO-AE-248 inkubiert worden waren, zeigte sich eine signifikante
Reduktion der Produktion aller 3 Zytokine IL-12, TNF und IL-6. Nach
Vorinkubation mit dem EP-4-Antagonisten ONO-AE3-208 zeigte sich nur eine
schwache Reduktion auf ca. 75% der Werte der reinen Borrelienstimulation. Durch
Rofecoxib hingegen wurde die Produktion aller 3 Zytokine über das 1,5-fache hinaus
angehoben. In vitro konnte so ein supprimierender Effekt durch PGE-2 und den EP3-Agonisten nachgewiesen werden, während der EP-4-Antagonist nur einen
minimalen inhibierenden Effekt und der COX-2-Inhibitor Rofecoxib sogar einen
pro-inflammatorischen Effekt hinsichtlich der Produktion der Zytokine IL-12, TNF
und IL-6 zeigte (Abb. 5).
Ergebnisse
4.1.5
35
PGE-2 Sekretion von PECs aus C57BL/6-Mäusen nach der Stimulation
mit verschiedenen Substanzen.
PECs aus C57BL/6-Mäusen wurden mit den Substanzen PGE-2, ONO-AE-248,
ONO-AE3-208, Rofecoxib und NS-398 (beides Inhibitoren der COX-2) für
30 Minuten vorinkubiert, bevor sie für 48 Stunden mit Borrelien stimuliert wurden.
Messwerte von PECs, die ohne weitere Substanzen nur mit B. burgdorferi stimuliert
worden waren, wurden im Diagramm als 100%-Induktion festgelegt. Die beiden
COX-2-Inhibitoren Rofecoxib und NS-398 führten zu einer fast vollständigen
Suppression der PGE-2-Synthese: Die Werte der PGE-2-Sekretion befanden sich im
Bereich der Mediumkontrolle. Interessanterweise konnten selbst durch Zugabe von
PGE-2 vor der B. burgdorferi Stimulation keine höheren Werte erzielt werden, als
mit der alleinigen Stimulation durch B. burgdorferi. Hier war vermutlich das obere
Detektionslimit des ELISAs erreicht. Dagegen zeigte die Inkubation mit dem
EP-3-Agonisten eine Reduktion der PGE-2-Sekretion um fast 50% und die
Inkubation mit dem EP-4-Antagonisten sogar eine Reduktion von über 80%, die fast
das Ausmaß der Reduktion durch die COX-2-Inhibitoren erreichte (Abb. 6).
Abb. 6: PGE-2-Sekretion von Peritonealmakrophagen (PEC´s) 48 h nach Stimulation mit
B. burgdorferi.
Gewinnung der Zellen und Stimulation durch B. burgdorferi wie in Abb. 5 beschrieben.
Nach 48 h wurden die Zellüberstände mittels Prostaglandin-E2 EIA Kit gemessen. Die dargestellten
Werte sind Prozentangaben, wobei der Wert für die Borrelienstimulation (ohne zusätzliche
Substanzen) als 100% festgelegt wurde.
Ergebnisse
36
Daraus kann man schließen, dass die Produktion von PGE-2 in stimulierten Mφ
zum größten Teil durch COX-2 kontrolliert wird, da nach Stimulation der PECs kein
Anstieg der PGE-2-Werte im Vergleich zum Medium zu sehen war, wenn COX-2
durch Inhibitoren blockiert wurde. Der Beitrag von COX-1 zur PGE-2-Synthese ist
hier offensichtlich vernachlässigbar. Der EP-4-Rezeptor scheint über einen
Feedbackmechanismus großen Einfluss auf die PGE-2-Produktion bei PECs zu
haben, da mit dem EP-4-Antagonisten über 80% der Sekretion blockiert werden
konnte (Abb. 6).
4.1.6
mRNA-Expression
der
Tibiotarsalgelenken
von
37B
Prostaglandin-E-Rezeptoren
C3H/HeJ-Mäusen
nach
(EP)
in
Infektion
mit
B. burgdorferi.
Um die Expression der 4 verschiedenen Prostaglandin-E-Rezeptoren (EP-1 bis
EP-4)
auf
mRNA-Ebene
in
den
erkrankten
Tibiotarsalgelenken
von
C3H/HeJ-Mäusen zu untersuchen, wurden C3H/HeJ-Mäuse mit B. burgdorferi
infiziert, die Gelenke zu den angegebenen Zeitpunkten gewonnen und die GesamtRNA aufgereinigt. Die aus der mRNA gewonnene cDNA wurde mit Hilfe der
LightCyler-PCR quantitativ auf Unterschiede in der Expression der verschiedenen
Rezeptoren hin untersucht. Dabei stellte sich heraus, dass die Transkription der
Rezeptoren EP-2 und EP-4 schon 4 Tage nach der Infektion induziert war, wobei
etwa das 1,5-fache des Ausgangswertes einer uninfizierten Maus erreicht wurde
(Abb.7).
Ergebnisse
37
Abb. 7: Expressionskinetik der Prostaglandinrezeptoren EP-1 bis EP-4 in Tibiotarsalgelenken
in B. burgdorferi-infizierten C3H/HeJ-Mäusen.
Zu den angegebenen Zeitpunkten wurde die gesamte RNA aus Gelenken isoliert und die mRNA mit
Hilfe von Oligo-(dT)-Primern revers transkribiert. Die Expressionshöhen der Gene wurden mittels
quantitativer LightCycler-PCR bestimmt, wobei als Referenz das Housekeeping-Gen Pbgd zur
Normalisierung verwendet wurde. Der mRNA-Gehalt einer uninfizierten Maus wurde mit dem Wert 1
definiert, alle übrigen Expressionshöhen sind als Vielfache dieses Wertes dargestellt.
Um den elften Tag p. i. wurde für beide das Maximum mit der fast 3-fach höheren
Rezeptorexpression erreicht. Die Expression von EP-1 und EP-3 war – auf das ganze
Gelenk bezogen – in den ersten 7 Tagen rückläufig, in den Folgetagen bis zum Tag
14 p. i. gab es aber auch hier einen mäßigen Anstieg auf das höchstens 1,5-fache
gegenüber uninfizierten Tieren (Abb.7). Aus diesen Daten ist zu schließen, dass die
Rezeptoren EP-2 und EP-4 eine wichtige Rolle in der murinen Lyme-Borreliose
spielen.
Der
EP-1-Rezeptor
wurde
aufgrund
der
nur
minimalen
Expressionsveränderungen ab der zweiten Woche p. i. als weniger bedeutend für die
murine Lyme-Borreliose eingestuft. Da die Rezeptoren EP-2 und EP-4 denselben
intrazellulären Signalweg aktivieren und somit potenziell ähnliche Effekte
vermitteln, wurden Mäuse exemplarisch mit dem EP-4-Antagonisten ONO-AE3-208
behandelt. Die Behandlung mit dem Agonisten des EP-3-Rezeptors wurde
durchgeführt, da dieser als der einzige anti-inflammatorische Rezeptor gilt und somit
Ergebnisse
38
versucht werden sollte, eine beginnende Entzündungsreaktion – auch bei schon
fortgeschrittener Infektion – zu mildern.
Ergebnisse
39
4.2 Pharmakologische
Manipulation
der
PGE-2-
Rezeptoren in vivo
4.2.1
Die
Bedeutung
des
EP-3-Rezeptors
für
die
Entzündung
des
Tibiotarsalgelenks nach Infektion mit B. burgdorferi.
Um die Bedeutung des EP-3-Rezeptors nach Infektion mit B. burgdorferi in
Mäusen untersuchen zu können, wurde C3H/HeJ-Mäusen eine Dosis von 5 x 105
B. burgdorferi in die Fußsohle injiziert. Im Anschluss daran wurden die Mäuse ab
dem 7. Tag bis zum 26. Tag täglich mit dem EP-3-Agonisten ONO-AE-248 subkutan
(s. c.) behandelt. Gleichzeitig wurde eine Kontrollgruppe nur mit dem Vehiculum
behandelt. In den ersten beiden Wochen nach der Infektion war nur ein minimaler
Unterschied in den Gelenkschwellungen zwischen beiden Gruppen zu erkennen.
1.6
Vehiculum; n = 8
relative Gelenkschwellung
1.5
EP-3 Agonist (ONO-AE-248) ab Tag 7; n =8
10µg/kg/d s.c.
1.4
1.3
1.2
**
*
1.1
1.0
0.9
0
3
6
9
EP-3 Agonist Behandlung
12
15
18
21
24
27
30
Tage nach B. burgdorferi Infektion
Abb. 8: Entwicklung der Gelenkschwellung nach Infektion mit B. burgdorferi bei Behandlung
mit dem EP-3-Agonisten.
Nach der subkutanen Injektion einer Dosis von 5 x 105 B. burgdorferi in die rechte hintere Fußsohle
wurde eine Gruppe von 8 Mäusen einmal täglich ab dem 7. Tag mit dem EP-3-Agonisten ONO-AE248 s.c. behandelt, während die Kontroll-Gruppe allein mit dem Vehiculum PBS s.c. behandelt wurde.
Die Behandlung wurde bis zum Versuchsende durchgeführt. Jeder Datenpunkt stellt den Mittelwert
von 8 infizierten Mäusen dar und jeder Fehlerbalken den SEM. Abgebildet ist eines von 2
Experimenten mit vergleichbaren Ergebnissen. (**: p-Wert < 0,005; *: p-Wert < 0,05 gemäß
zweiseitigem Student’s t-Test, mit dem die beiden Mausgruppen verglichen wurden.)
Erst ab Tag 20 p. i. zeigten sich deutliche Unterschiede: Bei den Mäusen, die mit
dem EP-3-Agonisten behandelt wurden, war eine signifikante Reduktion der
Ergebnisse
40
Gelenkschwellung im Gegensatz zu den Vehiculum-behandelten Mäusen zu
verzeichnen (Abb. 8). Somit konnte eine floride Arthritis durch Gabe des
EP-3-Agonisten vorzeitig abgemildert werden.
4.2.2
Die
Bedeutung
des
EP-4-Rezeptors
für
die
Entzündung
des
Tibiotarsalgelenks nach Infektion mit B. burgdorferi.
Da der EP-4-Rezeptor auf mRNA-Ebene im infizierten Gelenk schon nach 4
Tagen exprimiert war (s. Abb. 7), wurde die tägliche Behandlung mit dem
spezifischen EP-4-Antagonisten ONO-AE3-208 am gleichen Tag begonnen, an dem
die Mäuse mit B. burgdorferi infiziert wurden. Auch hier wurde eine Kontrollgruppe
mitgeführt, die ausschließlich mit dem Vehiculum behandelt wurde. Wie bei der
Behandlung mit dem EP-3-Agonisten war in der Anlaufphase der Infektion nur ein
geringer Unterschied zwischen den beiden Mausgruppen zu sehen. Allerdings kam es
ab Tag 12 p. i. bei den Kontrollmäusen zu einem starken Anstieg der Schwellung der
Tibiotarsalgelenke, während die Schwellung bei der mit dem EP-4-Antagonisten
behandelten Mausgruppe wesentlich schwächer zunahm. Sowohl am Tag 18 p. i. als
auch am Tag 21 p. i. führte die Blockade des EP-4-Rezeptors zu einer im Vergleich
mit unbehandelten Mäusen signifikant milderen Gelenkentzündung. Auch im
weiteren Verlauf bis zum Versuchsende war in den behandelten Mäusen keine
nennenswerte Schwellung mehr zu beobachten (Abb. 9).
Ergebnisse
41
relative Gelenkschwellung
1.2
Vehiculum; n=12
EP-4 Antagonist (ONO-AE3-208); n=7
10 mg/kg/d s.c.
*
**
1.1
12
11
9
1.0
12
12
7
7
7
5
7
EP-4 Antagonist Behandlung
0
3
6
9
12
15
18
21
24
27
30
Tage nach B. burgdorferi Infektion
Abb. 9: Entwicklung der Gelenkschwellung nach Infektion mit B. burgdorferi bei Behandlung
mit dem EP-4-Antagonisten.
Nach subkutaner Injektion einer Dosis von 5 x 105 B. burgdorferi in die rechte hintere Fußsohle
wurde eine Gruppe von 7 Mäusen einmal täglich ab dem Zeitpunkt der Infektion mit dem
EP-4-Antagonisten ONO-AE3-208 s.c. behandelt, während die Kontroll-Gruppe allein mit dem
Vehiculum PBS s.c. behandelt wurde. Die Behandlung wurde abgebrochen, als die Vehiculumbehandelten Mäuse eine Spontanremission der Arthritis zeigten (d 21 p. i.). Abgebildet ist eines von 3
Experimenten mit vergleichbaren Ergebnissen. (**: p-Wert < 0,005; *: p-Wert < 0,05 gemäß
zweiseitigem Student’s t-Test, mit dem die beiden Mausgruppen verglichen wurden.)
4.2.3
Histologische Unterschiede der Entzündungsreaktion am Tag 7 p. i. bei
Behandlung mit dem EP-4-Antagonisten.
Eine
umfassendere
Untersuchung
der
in
vivo-Reaktionen
auf
die
EP-4-Rezeptor-Inhibition sollte durch histologische Darstellung der infizierten
Tibiotarsalgelenke geschehen, die am Tag 7 p. i. untersucht wurden. In Abbildungen
10 A und C sind Gelenkausschnitte einer Vehiculum-behandelten Maus zu sehen,
während in B und D Gelenkausschnitte einer EP-4-Antagonist-behandelten Maus
abgebildet sind. Dabei stellen C und D jeweils 8-fache Ausschnitts-Vergrößerungen
von A und B dar.
Bei der Vehiculum-behandelten Maus (A) ist dabei gut sichtbar, dass viele Zellen
in das gesamte Gewebe des Gelenks eingewandert sind, die aber in dieser
Vergrößerung noch nicht genauer identifiziert werden können. Dies lässt sich durch
die, im Vergleich zu der EP-4-Antagonist-behandelten Maus (B), vermehrt
angehäuften blauen Zellkerne erkennen. In der EP-4-Antagonist-behandelten Maus
sind weniger Zellen eingewandert und die Strukturen des Mausgelenks sind
Ergebnisse
42
deutlicher voneinander abgrenzbar. Gut zu sehen sind Knorpel und Knochen des
Tibiotarsalgelenks im rechten oberen Abschnitt der EP-4-Antagonist-behandelten
Maus. Auf der linken Seite der Abbildungen 10 B sind eine Sehne und eine
Gelenkhöhle markiert.
Abb.
10: Histologie der pathologischen Veränderungen im Tibiotarsalgelenk bei
EP-4-Antagonist-behandelten Mäusen am Tag 7 p. i..
Zur mikroskopischen Beurteilung der Tibiotarsalgelenke und umgebender Gewebe von
EP-4-Antagonist-behandelten und Vehiculum-behandelten Mäusen wurden am Tag 7 p. i. mit einem
Kryotom 10-µm-Gefrierschnitte ohne vorherige Dekalzifizierung angefertigt, mit Aceton fixiert und
danach mit Hämatoxylin und Eosin gefärbt.
A und C: Präparate von Vehiculum-behandelten Mäusen, die eine generelle Infiltration von
Entzündungszellen sowohl in die Gelenkhöhle, als auch in das umliegende Gewebe zeigen. Bei EP-4Antagonist-behandelten Mäusen (B und D) ist deutlich weniger Zellinfiltration zu erkennen. Die
kleinen Pfeile in C markieren repräsentative neutrophile Granulozyten in der Gelenkhöhle, der dicke
Pfeil zeigt auf ein Fibringerinnsel. Originalvergrößerungen: A und B: x 50, C und D: x 400.
(C: Cartilago [Knorpel], GH: Gelenkhöhle, K: Knochen, M: Muskel, S: Sehne, SI: synoviale Intima)
Abbildungen 10 C und D stellen eine 400-fache Vergrößerung eines Bereichs
um die Gelenkhöhle dar. In der Vehiculum-behandelten Maus (C) ist dabei eine
deutliche Infiltration von Entzündungszellen zu sehen, die als neutrophile
Granulozyten identifiziert werden können (kleine Pfeile). Außerdem ist ein großes
Fibringerinnsel im linken Bildabschnitt zu sehen (großer Pfeil). In der
EP-4-Antagonist-behandelten Maus (D) sind zwar auch Entzündungszellen-Infiltrate
zu sehen, diese sind allerdings auf das Gewebe beschränkt und haben nicht die
synoviale Intima (SI) durchbrochen. Deshalb sind kaum Entzündungszellen in der
Synovialflüssigkeit vorhanden. Daraus lässt sich schließen, dass die verminderte
Entzündung in EP-4-Antagonist-behandelten Mäusen unter anderem auf der
Ergebnisse
43
reduzierten Infiltration von Entzündungszellen, insbesondere von neutrophilen
Granulozyten, beruht.
4.2.4
Histologische Unterschiede der Entzündungsreaktion am Tag 14 p. i. bei
Behandlung mit dem EP-3-Agonisten bzw. dem EP-4-Antagonisten.
Am Tag 14 p. i. wurde zusätzlich zu den Vehiculum-behandelten und
EP-4-Antagonist-behandelten Mäusen ein Tibiotarsalgelenk einer EP-3-Agonistbehandelten Maus histologisch untersucht (Abb. 11 A, B, C). Das Gelenk der
Vehiculum-behandelten Maus ist in A, das der EP-3-Agonist-behandelten Maus in B
und das Gelenk der EP-4-Antagonist-behandelten Maus in C zu sehen. In keinem der
3 Abbildungen ist ein deutlicher Unterschied zwischen den Gelenken in Bezug auf
die Infiltration von Entzündungszellen zu sehen. Auch im Gelenk der Vehiculumbehandelten Maus sind relativ wenige Zellkerne zu erkennen, ebenfalls ist die
Schwellung des Gewebes stark zurückgegangen, so dass die Konturen der
verschiedenen Gewebeanteile wieder besser voneinander abgrenzbar sind. Daraus
lässt sich schließen, dass die Auflösung der Entzündung unabhängig von einer
etwaigen PGE-2-Rezeptor-Manipulation 14 Tage nach der Inokulation bereits
eingeleitet ist, da die Zahl der Entzündungszellen schon wieder reduziert und die
Gewebeschwellung rückgängig ist.
Abb. 11: Histologie der pathologischen Veränderungen im Tibiotarsalgelenk bei EP-3-Agonistbzw. EP-4-Antagonist-behandelten Mäusen am Tag 14 p. i..
10-µm-Gefrierschnitte wurden wie in Abb.10 beschrieben angefertigt.
Die in A (Vehiculum-behandelt), B (EP-3-Agonist ab Tag 7 behandelt) und C (EP-4-Antagonist ab
Tag 0 behandelt) dargestellten Gelenke weisen keine erheblichen Unterschiede bezüglich des
Zellinfluxes auf. Die Gelenkhöhlen sind frei von Entzündungszellen. A, B und C: x 50.
(C: Cartilago [Knorpel], GH: Gelenkhöhle, K: Knochen, M: Muskel, S: Sehne)
4.2.5
Microarray-Untersuchung der mRNA-Expression in Tibiotarsalgelenken
von C3H/HeJ-Mäusen nach B. burgdorferi-Infektion.
Um
einen
umfassenden
Überblick
über
die
Auswirkungen
einer
Prostaglandin-/PGE-2-Inhibition auf die Genexpression in Borrelien-infizierten
Mäusen zu gewinnen, wurde am Tag 9 p. i. RNA aus Tibiotarsalgelenken mittels
Ergebnisse
44
genomweitem Microarray analysiert. Dabei war von Interesse, welche Gene im
Vergleich zu Vehiculum-behandelten Mäusen differenziell exprimiert werden, wenn
man die Mäuse ab dem Zeitpunkt der Infektion mit dem COX-2-Inhibitor Rofecoxib
oder
dem
EP-4-Antagonisten
ONO-AE3-208
behandelt.
Von
jeder
Behandlungsgruppe wurden Tibiotarsalgelenke präpariert und die gewonnene
mRNA in cDNA umgeschrieben. Für diesen Versuch wurde die cDNA von jeweils 3
Mäusen gepoolt. Da die EP-3-Rezeptor-mRNA erst im Laufe der zweiten Woche
hochreguliert wird (s. Abb. 7) und der EP-3-Agonist den Mäusen aufgrund der
späten Expression erst ab Tag 7 p. i. injiziert wurde, wurde darauf verzichtet, auch
Gelenke von EP-3-Agonist-behandelten Mäusen mittels Microarray zu untersuchen.
Die Ergebnisse des Microarrays sind in Abb. 12 zu sehen. Die dargestellte
Heatmap zeigt ein hierarchisches Clustering ausschließlich solcher Gene, deren
Expression bei Behandlung mit Rofecoxib und zugleich bei Behandlung mit dem
EP-4-Antagonisten mindestens 2-fach gegenüber der Genexpression Vehiculumbehandelter Mäuse abweicht. Auf den ersten Blick ist zu sehen, dass die
Expressionsveränderungen
der
meisten
aufgeführten
Gene
durch
den
COX-2-Inhibitor Rofecoxib und den EP-4-Antagonisten ONO-AE3-208 ähnlich
stark ausgeprägt sind. Eine Ausnahme stellt DBC-1 (deleted in breast cancer) dar,
das durch Rofecoxib viel stärker herunterreguliert wird als durch ONO-AE3-208
(blaue Umrandung, Abb. 12). DBC-1 gilt als wichtiger Modulator in der
Tumorentstehung und ist bisher nicht mit Entzündungsreaktionen in Verbindung
gebracht worden (42).
Als interessante Gene für das Modell der murinen Lyme-Arthritis stellten sich die
Gene Cxcl-5, Il1rl1 (Interleukin 1 receptor-like 1) und Cxcr-6 heraus
(rote Umrandungen, Abb. 12).
EP-4-Antag.
vs. PBS
45
Rofecoxib
vs. PBS
EP-4-Antag.
vs. Rofecoxib
Ergebnisse
-fache Expressionsänderung
+ 45
–16
1
Abb. 12: Gesamtanalyse der mRNA-Expression in Tibiotarsalgelenken nach B. burgdorferi
Infektion.
Am Tag 9 p. i. wurde die Gesamt-RNA der infizierten Tibiotarsalgelenke isoliert und die
Transkriptionshöhen sämtlicher Gene mittels genomweitem cDNA-Microarray gemessen. Dabei
wurden Vehiculum-behandelte Gelenke von C3H/HeJ-Mäusen als Referenz für die Ermittlung der
Unterschiede zu Gelenken desselben Maustyps mit Behandlung bestimmt. Die Behandlung erfolgte
von Tag 0 bis Tag 9 mit dem Cox-2-Inhibitor Rofecoxib oder mit dem EP-4-Antagonisten
ONO-AE3-208. Die Auswahl zeigt alle Gene, deren Expression sowohl bei Behandlung mit
Rofecoxib als auch mit dem EP-4-Antagonisten mindestens 2-fach gegenüber der
Vehiculum-Behandlung verändert waren.
Ergebnisse
46
CXCL-5, auch als LIX (LPS induced CXC chemokine) oder ENA-78
(epithelial neutrophil-activating peptide-78) bekannt, ist eines der wichtigsten
Chemokine für die Rekrutierung von neutrophilen Granulozyten (78). CXCL-5
wurde schon im Modell der Adjuvans-induzierten Arthritis (AIA) in Ratten
untersucht und dort als bedeutend für die Progression und Aufrechterhaltung der AIA
beschrieben (32). Die Rekrutierung von PMNs kann dadurch erfolgen, dass CXCL-5
über den CXCR-2-Rezeptor an Μφ bindet, diese TNF ausschütten und durch
Induktion von ICAM-1 PMNs ins Gewebe gelangen (99). Jedoch ist umgekehrt auch
eine durch TNF intensivierte CXCL-5-Expression in Osteoblasten beschrieben
worden (80).
IL1RL1, auch ST2 oder IL-33R genannt, ist ein Rezeptor, der durch
pro-inflammatorische Stimuli induziert werden kann und dadurch sowohl die
Entwicklung als auch die Regulierung von Th2-Zellen beeinflusst (96). Erst seit
kurzem ist bekannt, dass IL1RL1 auch eine Rolle in der Rheumatoiden Arthritis
spielt, indem es auf die Migration von PMNs einwirkt. Sowohl in Synovialgewebe,
als auch auf Μφ und aktivierten PMNs konnte IL1RL1 nachgewiesen werden. Sein
Ligand IL-33 bewirkte dabei die Migration der PMNs durch direkte Wirkung auf
PMNs und zusätzlich durch die Aktivierung von Μφ, die Chemokine und Zytokine
produzierten (98).
Der Chemokin-Rezeptor CXCR-6 ist sowohl auf CD8+ T-Zellen und CD4+
Th1-Zellen als auch auf NKT-Zellen basal exprimiert. Sein Ligand ist CXCL-16, das
als Chemokin identifiziert wurde und CD8+ Zellen in entzündetes Gewebe anlockt
(38). In der Rheumatoiden Arthritis konnten Nanki et al. nachweisen, dass der
CXCR-6-Rezeptor in erkrankten Geweben häufiger exprimiert wurde als in gesunden
Geweben (67). Gaida et al. wiesen außerdem 2008 nach, dass bei Patienten mit
Pankreaskarzinom CXCR-6 auch auf PMNs nachgewiesen werden konnte.
Allerdings wurde CXCR-6 bei diesen PMNs erst aufgrund von entzündlichen Reizen
exprimiert und bewirkte so eine Migration von CXCR-6-positiven PMNs in das
entzündete Gewebe (22).
Mit CXCL-5, IL1RL1 und CXCR-6 wurden damit 3 wichtige Modulatoren der
Chemotaxis von PMNs gefunden, deren Expression durch Rofecoxib und den
EP-4-Antagonisten im Borrelien-infizierten Gelenk inhibiert wird.
Ergebnisse
47
4.3 Die Rolle des CXCL-5 in der murinen Lyme-Borreliose.
4.3.1
CXCL-5-Analyse in C3H/HeJ-, COX-2-/-- und COX-2+/--Mäusen mittels
qPCR.
Zur Bestätigung der im Microarray gefundenen Expressionshöhen von CXCL-5
wurde dieselbe cDNA mit Hilfe quantitativer PCR analysiert. Dabei konnte sowohl
bei den Vehiculum-behandelten Mäusen als auch bei den Mäusen, die entweder mit
Rofecoxib oder dem EP-4-Antagonisten behandelt worden waren, eine große
Übereinstimmung zwischen den durch Microarray und qPCR ermittelten
Expressionshöhen von CXCL-5 festgestellt werden (Abb. 13). Nach dieser
Verifizierung wurden nun weitere Untersuchungen zur Relevanz des CXCL-5
durchgeführt.
Abb. 13: mRNA-Expression von Cxcl-5 nach B. burgdorferi Infektion gemessen mittels
Microarray und qPCR.
Cxcl-5-Expression in gepoolten infizierten Tibiotarsalgelenken am Tag 9 p. i. von je 3
C3H/HeJ-Mäusen nach Isolation und reverser Transkription mit Oligo-(dT)-Primern der GesamtmRNA. Die Expressionshöhen von Cxcl-5 wurden zuerst durch einen Microarray analysiert und
danach durch eine quantitative LightCycler-PCR verifiziert. Pbgd diente in der qPCR als Referenz für
die Normalisierung. Der mRNA-Gehalt der Vehiculum-behandelten Mäuse wurde nach
Normalisierung willkürlich als 1 festgelegt. Die weiteren Expressionshöhen sind als Vielfache dieses
Wertes dargestellt.
Um den Einfluss von COX-2-abhängigen Prostaglandinen auf die Cxcl-5Expression aufzudecken, wurden Borrelien-infizierte COX-2-/--und COX-2+/--Mäuse
Ergebnisse
48
auf die Expression von Cxcl-5 am Entzündungsort über einen 2-wöchigen Zeitraum
hin untersucht. Hier konnte ein deutlicher Unterschied in der Expressionshöhe des
Chemokins entdeckt werden (Abb. 14). Während bei den COX-2-/--Mäusen im
Verlauf des kompletten Untersuchungszeitraums nur eine äußerst geringe Erhöhung
der CXCL-5-Transkripte zu messen war, stiegen die Werte der COX-2+/--Mäuse am
Tag 6 p. i. und Tag 8 p. i. auf das 15- bzw. über 40-fache an. Am Tag 13 p. i. war die
CXCL-5 Expression in beiden Mausgruppen wieder auf das Niveau einer
uninfizierten Maus abgesunken. Damit wurde eine wichtige Rolle der durch COX-2
produzierten
Prostaglandine
in
der
Regulation
des
Chemokins
CXCL-5
nachgewiesen. Die Daten weisen besonders gegen Ende der ersten Woche p. i. auf
eine starke Regulierung durch COX-2 hin, deren Produkte dadurch als ein
entscheidender Stimulus für CXCL-5 angesehen werden können.
Abb. 14: mRNA-Expressionskinetik von CXCL-5 in Tibiotarsalgelenken von COX-2-/--und
COX-2+/--Mäusen nach B. burgdorferi Infektion.
Die Gesamt-mRNA wurde zu den angegebenen Zeitpunkten isoliert und mit Hilfe von
Oligo-(dT)-Primern transkribiert. Die Expressionshöhen wurden durch quantitative LightCycler-PCR
bestimmt, wobei als Referenz das Housekeeping-Gen Pbgd zur Normalisierung verwendet wurde. Der
mRNA-Gehalt einer uninfizierten Maus jedes Genotyps wurde mit dem Wert 1 definiert. Alle
weiteren Werte sind als Vielfache dargestellt.
4.3.2
Vergleichende Analyse der Expression von CXCL-5, CXCL-1 und
CXCL-2
in
der
Lyme-Arthritis
bei
C3H/HeJ-Mäusen
und
in
murinen Embryonalfibroblasten (MEFs).
Um die Relevanz der PMN-attrahierenden Chemokine CXCL-1, CXCL-2 und
CXCL-5 einzuschätzen, wurde die mRNA-Expression dieser 3 Chemokine in
Ergebnisse
49
Tibiotarsalgelenken Borrelien-infizierter C3H/HeJ-Mäuse über den Zeitraum von
Tag 0 bis Tag 17 p. i. durch quantitative PCR analysiert. Die erhaltenen Werte von
uninfizierten Mäusen wurden als „1“ definiert und alle weiteren Werte als Vielfache
davon dargestellt.
Alle 3 Chemokine wurden ab Tag 4 p. i. stark hochreguliert. Dabei zeigte CXCL5 die im Vergleich mit den anderen Chemokinen stärkste Induktion in der Arthritis.
Während CXCL-1 auch eine starke Hochregulierung erfuhr, wurden für CXCL-2 nur
leicht erhöhte Werte gemessen. Am Tag 8 p. i. wurden bei allen 3 Chemokinen die
höchsten Werte ermittelt, die bei CXCL-5 sogar bis auf das 200-fache im Vergleich
zu den Werten einer uninfizierten Maus anstiegen. Am Tag 11 p. i. wurde für alle 3
Chemokine ein Rückgang der Expression gemessen, und ab Tag 14 p. i. war die
mRNA-Menge aller 3 Chemokine wieder auf das basale Ausgangsniveau
abgesunken (Abb. 15).
.
Abb. 15: mRNA-Expressionskinetik der Chemokine Cxcl-5, Cxcl-1 und Cxcl-2 in
Tibiotarsalgelenken von C3H/HeJ-Mäusen nach Infektion von B. burgdorferi.
Die Gesamt-RNA wurde zu den angegebenen Zeitpunkten isoliert und die mRNA mit Hilfe von
Oligo-(dT)-Primern transkribiert. Die Expressionshöhen wurden durch quantitative LightCycler-PCR
bestimmt, wobei als Referenz das Housekeeping-Gen Pbgd zur Normalisierung verwendet wurde. Der
mRNA-Gehalt einer uninfizierten Maus wurde mit dem Wert 1 definiert. Alle weiteren Werte sind als
Vielfache dargestellt.
Als zelluläre Quelle von CXCL-5 wurden in der Literatur unter anderem
Fibroblasten beschrieben, die auch im Modell der rheumatoiden Arthritis für eine
Ergebnisse
50
starke Produktion von CXCL-5 verantwortlich sind (44). Aufgrund dieser Befunde
wurden murine Embryonalfibroblasten (MEFs) mit Borrelien stimuliert und
anschließend mittels quantitativer PCR auf die Expression von CXCL-5, aber auch
CXCL-1 und CXCL-2 hin (Abb. 16) untersucht. Von unstimulierten Zellen erhaltene
Werte wurden dabei als „1“ definiert. Die anderen Werte sind als Vielfache davon
wiedergegeben.
Sowohl CXCL-5 als auch CXCL-1 wurden stark hochreguliert, während die
CXCL-2-Induktion weniger stark ausgeprägt war (ca. 10-fach gegenüber
unstimuliert). Allerdings war bei zusätzlicher Behandlung der MEFs mit dem
COX-2-Inhibitor NS-398 eine schwächere Expression von CXCL-5 zu sehen
(Abb. 16). Die Expression von CXCL-2 blieb dagegen durch die NS-398-Zugabe
unverändert und die CXCL-1-Expression zeigte sogar eine leichte Steigerung bei der
Behandlung mit NS-398. Damit konnte gezeigt werden, dass allein CXCL-5 durch
die Inhibition von COX-2 beeinflusst wurde.
Abb. 16: mRNA-Expression der Chemokine Cxcl-1, Cxcl-2 und Cxcl-5 in murinen
Embyonalfibroblasten (MEFs) nach Stimulation mit B. burgdorferi.
Die Gesamt-RNA wurde nach 24 Stunden isoliert und die mRNA mit Hilfe von Oligo-(dT)-Primern
transkribiert. Die Expressionshöhen wurden durch quantitative LightCycler-PCR bestimmt, wobei als
Referenz das Housekeeping-Gen Pbgd zur Normalisierung verwendet wurde. Der mRNA-Gehalt der
unstimulierten Mediumprobe wurde mit dem Wert 1 definiert. Die weiteren Werte sind als Vielfache
dargestellt.
Ergebnisse
4.3.3
51
CXCL-5-Expression in den Zelllinien L929 und b.end.3 und in PECs von
C3H/HeJ-Mäusen.
Da nicht-hämatopoetische Zellen als wesentliche Produzenten von CXCL-5 gelten
(84), wurden vergleichend sowohl die Fibroblasten-Zelllinie L929 und die
Endothel-Zelllinie b.end.3, als auch PECs von C3H/HeJ-Mäusen nach Stimulation
mit Borrelien hinsichtlich ihrer CXCL-5-Expression untersucht. Die Zelllinien
wurden nach vierstündiger Stimulation untersucht, die PECs nach drei- bzw.
sechsstündiger Stimulation.
In Abb. 17 A sieht man die Borrelien-induzierte Steigerung der Expression von
CXCL-5 im Vergleich zum Mediumwert in den beiden Zelllinien. Während L929
schon eine basale Expression von CXCL-5 aufweist, konnte bei b.end.3 in den
Überständen unstimulierter Zellen kein CXCL-5 nachgewiesen werden. Allerdings
war in beiden Zelllinien keine starke Induktion der Expression durch Borrelien
nachzuweisen. Lediglich eine ca. 3-fache Steigerung ließ sich in der Zelllinie L929
nachweisen. Interessanterweise hatten bei der Fibroblasten-Zelllinie sowohl PGE-2
als auch der COX-2-Inhibitor NS-398 einen supprimierenden Effekt auf die
CXCL-5-Produktion, der jedoch beim COX-2-Inhibitor deutlich ausgeprägter war.
Bei der Zelllinie b.end.3 war dagegen ausschließlich durch NS-398 eine Reduktion
der CXCL-5-Expression nachweisbar.
In Abb. 17 B sind die Expressionshöhen von CXCL-5 in PECs nach drei- bzw.
sechsstündiger Stimulation mit Borrelien vergleichend dargestellt. Der Wert
unstimulierter Zellen wurde als „1“ festgelegt und die weiteren Werte sind als
Vielfache davon abgebildet. Im Gegensatz zu den Zelllinien war in diesem Versuch
wieder eine starke Expressionssteigerung des Chemokins CXCL-5 durch die
Borrelienstimulation zu erkennen. Nach dreistündiger Borrelienstimulation von
PECs lag der Expressionswert 250-fach und nach sechsstündiger Stimulation sogar
über 400-fach höher als in ruhenden PECs. Die 3 Substanzen EP-3-Agonist,
EP-4-Antagonist und NS-398 zeigten gleichermaßen einen inhibitorischen Effekt,
indem sie die 3-h- und 6-h-Expressionswerte von CXCL-5 auf weniger als die Hälfte
des Vergleichsniveaus ohne Pharmakabehandlung reduzierten. Allein IL-10 konnte
die Transkription von CXCL-5 fast auf die basale Expressionshöhe verringern.
Somit konnte gezeigt werden, dass weder die Zelllinie L929 noch die Zelllinie
b.end.3 einen ähnlich starken Anstieg der CXCL-5-Expression wie in den
entzündeten Gelenken (s. Abb. 14) simulieren konnten. Allerdings wurde in PECs
Ergebnisse
52
von C3H/HeJ-Mäusen eine sehr starke Hochregulierung nachgewiesen, die auch in
dem Lyme-Arthritis-Modell eine entscheidende Rolle spielen könnte. Die Substanz
NS-398 und der EP-4-Antagonist führten in beiden Versuchsansätzen zu einer
Verminderung der CXCL-5-Expression.
A
B
Abb. 17A/B: mRNA-Expression des Chemokins Cxcl-5 in den Zelllinien L929, b.end.3 und in
PECs nach B. burgdorferi Stimulation.
Die Gesamt-mRNA der Fibroblasten L929 und der Endothelzellen b.end.3 wurde nach 4 Stunden
Stimulation isoliert und mit Hilfe von Oligo-(dT)-Primern transkribiert (A). Die PECs wurden 3 und 6
Stunden stimuliert (B). Die Expressionshöhen wurden durch quantitative LightCycler-PCR bestimmt,
wobei als Referenz das Housekeeping-Gen Pbgd zur Normalisierung verwendet wurde.
Ergebnisse
53
4.4 Immunreaktion und Borrelienlast nach Infektion mit
B. burgdorferi.
4.4.1
Immunglobulin-Konzentrationen in C3H/HeJ-Mäusen am Tag 7 und 14
nach Infektion mit B. burgdorferi.
Um die Sicherheit der verwendeten Pharmaka bei Infektionskrankheiten
abschätzen zu können, sollte untersucht werden, ob die Behandlung mit dem EP-4Antagonisten ONO-AE3-208 oder dem COX-2-Inhibitor Rofecoxib Einfluss auf die
Konzentration von Immunglobulinen in C3H/HeJ-Mäusen hat. Dafür wurde am Tag
7 p. i. und Tag 14 p. i. Serum von B. burgdorferi-infizierten Mäusen gewonnen und
dieses mittels ELISA auf die Konzentration von Borrelien-spezifischem IgG1, IgG2a
und IgM hin untersucht. Es wurden 3 Mausgruppen gebildet. Die erste Gruppe wurde
allein mit dem Vehiculum, die zweite Gruppe mit dem EP-4-Antagonisten und die
dritte Gruppe mit dem COX-2-Inhibitor Rofecoxib behandelt. Die erhaltenen Werte
sind als optische Dichte bei 450 nm abgebildet.
Wie in Abb. 18 zu sehen ist, sind die Konzentrationen der Immunglobuline IgG1
und IgG2a am Tag 14 p. i. deutlich höher als am Tag 7 p. i.. IgM wurde sowohl am
Tag 7 p. i. als auch am Tag 14 p. i. zu etwa gleichen Mengen produziert. Weder der
EP-4-Antagonist noch der COX-2-Inhibitor zeigten dabei eine Beeinflussung der
Immunglobulinproduktion. Daraus kann geschlossen werden, dass keine dieser
beiden Substanzen einen Einfluss auf die Konzentration oder die Art Borrelienspezifischer Immunglobuline nach Infektion von Mäusen mit B. burgdorferi hat.
Ergebnisse
54
Abb. 18: Immunglobulin-Konzentration im Serum von C3H/HeJ-Mäusen 7 und 14 Tage
nach Infektion mit B. burgdorferi.
Die Immunglobuline IgG1, IgG2a und IgM wurden nach 7 und 14 Tagen im Serum von C3H/HeJMäusen mittels ELISA gemessen. Die Mäuse wurden subkutan entweder nur mit dem Vehiculum
behandelt oder mit dem EP-4-Antagonisten ONO-AE3-208 oder dem COX-2-Inhibitor Rofecoxib.
Die relativen Werte sind als optische Dichte (OD) bei 450 nm abgebildet.
4.4.2
Borrelienlast in Tibiotarsalgelenken von C3H/HeJ-Mäusen nach 7 und
14 Tagen p. i.
Um eine Aussage über den Einfluss der verwendeten Pharmaka auf die Borrelienlast
in arthritischen Tibiotarsalgelenken machen zu können, wurde am Tag 7 p. i. und
Tag 14 p. i. genomische DNA sowohl aus Gelenken Vehiculum-behandelter Mäuse,
als auch aus Gelenken EP-4-Antagonist- und Rofecoxib-behandelter Mäuse
gewonnen. Die durch quantitative PCR ermittelte Kopienzahl des Borreliengens
FlaB wurde auf das Mausgen Nid normalisiert.
Die bakterielle Beladung der Gelenke von Kontrollmäusen war am Tag 7 p. i.
tendenziell, jedoch nicht signifikant höher als in EP-4-Antagonist- und
Rofecoxib-behandelten Mäusen (Abb. 19). In allen 3 Mausgruppen sank die
gemessene Zahl der Borrelien nachfolgend bis Tag 14 p. i. stark ab, bei den
Vehiculum-behandelten Mäusen auf fast ein Zehntel des Tag-7-Mittelwertes, so dass
die Borrelienlast bei allen analysierten Mäusen zum Zeitpunkt 2 Wochen nach
Infektion auf gleichem Niveau war. Somit konnte gezeigt werden, dass weder der
Ergebnisse
55
EP-4-Antagonist noch der COX-2-Inhibitor einen Einfluss auf die bakterielle
0.5
0.0
xi
b
ec
o
Ro
fe
co
xib
EP
-4
-A
nt
ag
.
0.0
1.0
of
0.5
1.5
R
1.0
2.0
ag
.
1.5
2.5
nt
2.0
3.0
-A
2.5
B
EP
-4
3.0
3.5
Ve
hi
cu
lu
m
A
Kopien FlaB /Kopie Nidogen
3.5
Ve
hi
cu
lu
m
Kopien FlaB /Kopie Nidogen
Elimination haben.
Abb. 19: Kopienzahl des Borrelien-Gens FlaB in Tibiotarsalgelenken von C3H/HeJ-Mäusen
7 und 14 Tage nach B. burgdorferi Infektion.
Zu den Zeitpunkten 7 (A) und 14 (B) Tage p.i. wurde die genomische DNA aus Gelenken
unbehandelter, mit dem EP-4-Antagonisten behandelter sowie mit dem COX-2-Inhibitor Rofecoxib
behandelter Mäuse isoliert. Die Kopienzahl FlaB wurde auf das Mausgen Nidogen normalisiert und
die Expressionshöhen durch quantitative LightCycler-PCR bestimmt.
Diskussion
56
5 DISKUSSION
5.1 Regulatorische Rolle von PGE-2 in der Lyme-Arthritis
Die Wirkung des Lipidmediators PGE-2 ist bisher nur unzureichend geklärt. In vitro
ist er dafür bekannt, immunsupprimierend, vor allem durch einen inhibitorischen
Effekt auf die Differenzierung von T-Zellen, zu wirken (33). Auch die Sekretion der
Zytokine IL-1β und TNF durch Makrophagen soll durch PGE-2 herunterreguliert
werden (81). Andererseits spricht die Behandlung von Arthritispatienten mit
NSAIDs, die die Prostaglandin-Synthese inhibieren und in der Schmerztherapie
eingesetzt werden, für eine pro-inflammatorische Rolle von Prostaglandinen in vivo.
Diese Diskrepanz zwischen in vitro- und in vivo-Daten konnte bisher nicht detailliert
erklärt werden.
Um die Rolle des PGE-2 in der Entstehung der murinen Borreliose besser zu
verstehen, wurden C3H/HeJ-Mäuse mit einem EP-3-Agonisten und einem
EP-4-Antagonisten behandelt. Die Hypothese war, dass beide Substanzen einen
supprimierenden
Gelenkentzündung
Effekt
auf
haben,
anti-inflammatorischen
und
die
zum
Entstehung
einen
zum
durch
anderen
bzw.
Progression
Stimulation
durch
einer
eines
putativ
Inhibition
eines
pro-inflammatorischen PGE-2-Rezeptors. In den durchgeführten Versuchen konnte
nachgewiesen werden, dass sowohl die Gabe des EP-3-Agonisten, als auch die Gabe
des EP-4-Antagonisten in vivo eine signifikante Reduktion der Gelenkschwellung in
Borrelien-infizierten Mäusen zur Folge hatte. Basierend auf diesen Versuchen wurde
der molekulare Mechanismus, der für die Reduktion der Gelenkschwellung
verantwortlich ist, näher untersucht.
Als PGE-2-assozierte Komponenten des Prostanoid-Systems wurden zunächst die
mikrosomalen Prostaglandin-E-Synthetasen und die 4 verschiedenen EP-Rezeptoren
in solchen Zellarten untersucht, die an der Lyme-Arthritis (mutmaßlich) beteiligt
sind. Die mPGES-1, die üblicherweise nur in aktivierten Zellen nachgewiesen
werden kann (31, 73), wurde hingegen auf mRNA-Ebene auch in nicht-stimulierten
Knochenmarks-DCs von C3H/HeJ-Mäusen detektiert, was höchstwahrscheinlich ein
Effekt der achttägigen Kultivierungsdauer dieser Zellen war. Die dabei viel höheren
Werte der mPGES-1-Expression gegenüber der mPGES-2-Expression wurden so
Diskussion
57
auch schon in der Literatur beschrieben (100). Während die Expression der
EP-Rezeptoren bisher nur in Organen beschrieben wurde (90), konnte in dieser
Arbeit gezeigt werden, dass in Immunzellen wie z. B. PECs, PMNs und DCs sowie
in Endothelzellen das Expressionsmuster der 4 Rezeptoren vergleichbar dem in
mehreren bereits untersuchten Organen ist. Zum Beispiel ist der EP-4-Rezeptor vor
allem in Thymus, Ileum, Uterus und Lunge vertreten, während der EP-3-Rezeptor
besonders in Niere, Uterus und Magen exprimiert wird. Der EP-2-Rezeptor ist
dagegen hauptsächlich im Uterus und der EP-1-Rezeptor vor allem in der Niere
vorzufinden (90).
In Immunzellen konnte der EP-4-Rezeptor als ubiquitär exprimierter Rezeptor mit
dem allgemein höchsten Expressionsniveau identifiziert werden. Während der
EP-1-Rezeptor sehr selektiv exprimiert wird, zeigen die Rezeptoren EP-2 und EP-3
eine größere Expressionsbreite in immunologisch bedeutenden Zelltypen.
Die starke Reduktion der pro-inflammatorischen Zytokine IL-12, TNF und IL-6 in
PECs 48 h nach Stimulation mit B. burgdorferi durch den EP-3-Agonisten, der in
vivo vergleichsweise schwächere Effekte zeigte, war erstaunlich. Allerdings ist von
Liu et al. beschrieben worden, dass der EP-3-Agonist ONO-AE-248 einen letalen
Effekt auf PMNs hat (52). Somit könnte man die sehr stark abgeschwächte
Produktion der Zytokine, die dem Sekretionsniveau nach exogener PGE-2-Gabe
entsprach, auch hier auf einen unspezifischen Zelluntergang zurückführen. Der
COX-2-Inhibitor Rofecoxib konnte die Sekretion von IL-6, IL-12 und TNF
Borrelien-stimulierter PECs sogar noch erhöhen, was als Konsequenz fehlender
Borrelien-induzierter PGE-2-Synthese und damit auch fehlender Suppression durch
PGE-2 erklärt werden kann. Durch Vorinkubation der Zellen mit dem
EP-4-Antagonisten konnte die Zytokinsekretion nicht beeinflusst werden. Die
inhibitorische Funktion von PGE-2 auf die Sekretion pro-inflammatorischer
Zytokine von PECs wird somit offenbar nicht durch den EP-4-Rezeptor vermittelt.
Die PGE-2-Sekretion Borrelien-stimulierter PECs wurde demgegenüber durch
den EP-4-Antagonisten fast auf das Niveau der selektiven COX-2-Inhibition gesenkt.
Hier
scheint
ein
Selbstamplifikations-Mechanismus
der
PGE-2-Produktion
vorzuliegen, an dem der EP-4-Rezeptor entscheidend beteiligt ist.
Die
Infektionsverläufe
der
B.
burgdorferi-infizierten
C3H/HeJ-Mäuse
unterschieden sich in den einzelnen Experimenten hinsichtlich des Beginns und der
maximalen Amplitude der Gelenkschwellung. Diese Heterogenität konnte auch in
Diskussion
58
weiteren Experimenten gefunden werden. Die differierende Ausprägung der
Schwellung zwischen den mit dem EP-3-Agonisten und dem EP-4-Antagonisten
behandelten Mäusen ist durch die verschiedene Kinetik der Rezeptorexpression zu
erklären. Während der EP-3-Rezeptor in Tibiotarsalgelenken erst gegen Ende der
zweiten Woche p. i. verstärkt exprimiert wurde, konnte beim EP-4-Rezeptor schon
eine Hochregulation der mRNA ab Tag 4 p. i. gemessen werden. Durch die spätere
Rezeptorexpression und den deshalb später gewählten Behandlungsbeginn mit dem
EP-3-Agonisten ab Tag 7 p. i., kam es bei den EP-3-Agonist-behandelten Mäusen in
den ersten Tagen der Infektion zu einer ausgeprägten Gelenkschwellung,
vergleichbar mit Vehiculum-behandelten Mäusen, und erst im weiteren Verlauf der
Infektion zu einer Reduktion der Schwellung. Bei den EP-4-Antagonist-behandelten
Mäusen konnte dagegen eine massive Entzündungsreaktion mit Gelenkschwellung
bereits initial unterdrückt werden. Dieser Effekt ist ähnlich dem, wie er schon bei der
Behandlung von Mäusen mit COX-2-Inhibitoren gesehen wurde (1). Somit scheint
der EP-4-Rezeptor eine wichtige Rolle bei der Etablierung der Entzündung der
Tibiotarsalgelenke von Borrelien-infizierten C3H/HeJ-Mäusen zu spielen.
Die
histologische
Aufarbeitung
der
Gelenke
sollte
Einblicke
in
das
Entzündungsgeschehen im Tibiotarsalgelenk bringen. Die Ansammlung von PMNs
in den Synovialspalten, die in histologischen Schnitten am Tag 7 p. i. in den
Kontroll-Mäusen vorhanden waren, könnte für einen Verlust der Barrierefunktion
der Synovialmembran sprechen. Ohne diese Schutzfunktion ist die Gelenkhöhle
einerseits leichter angreifbar für Pathogene, andererseits aber auch für Leukozyten
besser erreichbar. Die massive Präsenz von PMNs in der Synovialflüssigkeit spricht
deshalb für ein Eindringen der Erreger in die Gelenkhöhle. Im Gegensatz dazu
konnten in den EP-4-Antagonist-behandelten Mäusen keine PMNs in den
Gelenkhöhlen nachgewiesen werden, was die protektiven, entzündungshemmenden
Eigenschaften dieser Substanz und die Bedeutung von PGE-2 für die
PMN-Rekrutierung zum Infektionsort verdeutlicht. Dass die Entzündungszellen nicht
allein für die Gelenkschwellung verantwortlich gemacht werden können, zeigt die
Histologie der Tibiotarsalgelenke am Tag 14 p. i.. Hier wurde deutlich, dass zu
diesem Zeitpunkt bezüglich der Infiltration von Entzündungszellen kein Unterschied
zwischen den Pharmaka-behandelten Mäusen und den Kontrollmäusen mehr bestand,
obwohl gleichzeitig die Gelenkschwellungen noch einen erheblichen Unterschied
zeigten. Die Gelenkhöhlen waren zu diesem Zeitpunkt jedoch bei allen Mäusen
Diskussion
59
bereits wieder frei von pathologischen Infiltraten, was für eine Auflösung der
Entzündung auch in den Kontrollmäusen spricht. Es konnte außerdem gezeigt
werden, dass zwar die Schwellung des Tibiotarsalgelenks stark durch PGE-2
reguliert wird, die Erregerelimination aber nicht durch Hemmung der COX-2 oder
des EP-4-Rezeptors beeinträchtigt wird. Dies konnte sowohl durch die Messung von
Borrelien-spezifischen Immunglobulinen, die weder durch Rofecoxib noch durch
ONO-AE3-208 beeinflusst wurden, als auch durch die Messung der Borrelienlast zu
einem späten Zeitpunkt der Infektion bestätigt werden. Bei beiden Analysen konnten
keine signifikanten Unterschiede zwischen den verschiedenen Mausgruppen
gefunden werden.
C3H/HeJ-Mäuse zeigen nach Infektion mit B. burgdorferi eine starke Arthritis,
während sich in C57BL/6-Mäusen nur eine milde Entzündung entwickelt (2, 3, 54).
Zwei unabhängige Studien haben belegt, dass die Anzahl der Borrelien bei beiden
Mausstämmen keinen Einfluss auf das Ausmaß der Arthritis hat (10, 54). Auch
Mäuse beider Stämme mit scid- oder rag-Mutationen zeigten keine großen
Arthritisunterschiede zu Mäusen des jeweiligen Wildtyps. Daraus lässt sich
schließen, dass weder B- noch T-Zellen für die Arthritis benötigt werden und dass sie
auch nicht die Krankheitsausprägung beeinflussen (4, 9). IL-10 scheint ein
bedeutender Faktor für die Limitierung der Lyme-Arthritis zu sein (11, 104). Miller
et al. fanden in Microarray-Untersuchungen von C3H/HeN- und C57BL/6-Mäusen
heraus, dass in diesen Mausstämmen ganz unterschiedliche Gencluster als Reaktion
auf eine Borrelieninfektion aktiviert werden. So wurden in stark entzündeten
C3H/HeN-Gelenken IFN-assoziierte Gene hochreguliert, während in schwach
arthritischen C57BL/6-Gelenken Wundheilungs-Gene und Gene der epidermalen
Differenzierung verstärkt exprimiert wurden (58). Um in Borrelien-infizierten,
COX-2-Inhibitor-
bzw.
EP-4-Antagonist-behandelten
C3H/HeJ-Mäusen
nach
analogen Ursachen für die signifikant abgeschwächte bzw. nahezu ausbleibende
Arthritis zu suchen, wurde mittels Microarray eine genomweite Untersuchung der
Genexpression am Infektionsort durchgeführt. Dabei konnte bei den behandelten
C3H/HeJ-Mäusen allerdings keine signifikant erhöhte Expression von Genen
nachgewiesen werden, die eine Funktion bei der Wundheilung oder der epidermalen
Differenzierung haben. Daraus lässt sich schließen, dass es noch einen weiteren
Mechanismus geben muss, der für die Arthritisentwicklung verantwortlich ist.
Allerdings sind die Ergebnisse der Genexpressionsanalysen aus der Literatur nur
Diskussion
60
begrenzt mit denen aus dieser Arbeit vergleichbar, da sie unter leicht veränderten
experimentellen Bedingungen zustande gekommen sind. Während bei Miller et al.
die Borrelien intradermal in den Rücken der Mäuse injiziert wurden, wurden die
Borrelien im Rahmen dieser Arbeit in die Fußsohle injiziert. Dies könnte auch den
unterschiedlichen Zeitpunkt der maximalen Gelenkschwellung in den beiden
Experimenten erklären, die bei Miller et al. erst nach 4 Wochen eintrat und bei dieser
Arbeit im Verlauf der ersten beiden Wochen nach Infektion beobachtet wurde. Die
auf
den
Zeitpunkt
der
maximalen
Gelenkschwellung
abgestimmten
Microarray-Untersuchungen sind weiterhin dadurch nicht direkt vergleichbar, da sie
zum einen 28 Tage, zum anderen 9 Tage nach Infektion durchgeführt wurden.
Einen ganz anderen Standpunkt vertritt die Arbeitsgruppe um Charles R. Brown.
Dort wurden Untersuchungen an C3H/HeJ-Mäusen unter Therapie von Celecoxib,
einem weiteren COX-2-Inhibitor, durchgeführt. Die Ergebnisse zeigten, dass die
Behandlung mit dem COX-2-Inhibitor keinen lindernden Effekt, sondern sogar einen
prolongierenden Effekt auf die Lyme-Arthritis hatte und deshalb kontraindiziert sei.
Dies wurde dadurch erklärt, dass 15-deoxy-∆12,14-PGJ-2, ein unter bestimmten
Umständen anti-inflammatorisches Produkt der Cyclooxygenase ist (25, 77), dass
ebenso wie die pro-inflammatorischen Prostaglandine durch den COX-2-Inhibitor
gehemmt wird und damit ein möglicherweise entscheidender Faktor für die
Auflösung der Lyme-Arthritis fehlt (5). Da die Gabe des COX-2-Inhibitors
Celecoxib über das Trinkwasser stattfand und nicht über den sicheren Weg der
Injektion, ist ein sicherer Wirkstoffspiegel in der Maus nicht gegeben, so dass hier
ein Grund für die unterschiedlichen Ergebnisse vorliegen könnte. Des Weiteren ist
die Spezifität von Celecoxib gegenüber COX-2 geringer als die von Rofecoxib,
welches in den Experimenten dieser Arbeit verwendet wurde. Schwer erklärbar ist
allerdings, dass bei COX-2-/--Mäusen mit einem genetischen C3H/HeJ-Hintergrund
im Unterschied zu Ergebnissen unserer Arbeitsgruppe eine Arthritis beobachtet
wurde, die der einer Wildtyp-C3H/HeJ-Maus gleicht (5).
In der murinen Lyme-Arthritis konnte der EP-4-Rezeptor somit als ein wichtiger
Faktor für die Entstehung der Gelenkschwellung nachgewiesen werden, indem durch
die Behandlung mit dem EP-4-Antagonisten ONO-AE3-208 eine signifikante
Reduktion der Gelenkschwellung erzielt wurde. Mit dem EP-3-Agonisten
ONO-AE-248 konnte erstmals ein vorzeitiger Rückgang der Gelenkschwellung in
Diskussion
61
der Lyme-Arthritis gezeigt und somit eine potentielle neue Therapieoption
identifiziert werden.
5.2 Die Rolle des CXCL-5 in der Lyme-Arthritis
Als ein entscheidendes Gen, das bei der Behandlung von C3H/HeJ-Mäusen sowohl
durch den COX-2-Inhibitor Rofecoxib als auch durch den EP-4-Antagonisten
ONO-AE3-208 beeinflusst wurde, stellte sich Cxcl-5 dar. Dieses für die
PMN-Wanderung spezifische Chemokin wurde durch beide Substanzen signifikant
schwächer induziert als in den Kontrollmäusen und wurde wegen des schon
bekannten erheblichen Beitrags der PMNs zur Entstehung der Lyme-Arthritis näher
untersucht. Das Hauptaugenmerk galt dabei den Zellen, die für die Produktion des
Chemokins in Frage kommen. Bereits publiziert ist, dass Synovialfibroblasten in
Ko-Kultur mit Endothelzellen entscheidend an der Produktion des CXCL-5 beteiligt
sind
(84).
Die
Befunde
dieser
Arbeit
zeigen,
dass
weder
murine
Embryonalfibroblasten, noch die Fibroblastenlinie L929 oder die Endothelzelllinie
b.end.3, jeweils isoliert kultiviert und mit Borrelien stimuliert, wesentliche
Produzenten von CXCL-5 sind. Im Gegensatz dazu wurden in Borrelien-stimulierten
PECs deutliche Anstiege der CXCL-5-Expression gemessen. Somit konnten
Makrophagen als eine potenzielle zelluläre Quelle von CXCL-5 identifiziert werden.
In weiteren Versuchen stellte sich heraus, dass Borrelien-stimulierte primäre
Synovialfibroblasten sehr hohe Mengen an CXCL-5 sezernieren und deshalb auch in
diesem Modell als wichtigste Zellpopulation in der Produktion von CXCL-5
angesehen werden können (Gläsner, J., unveröffentlicht).
Eine übergeordnete Rolle bei der Rekrutierung von PMNs spielt IL-17 (53). So
beschrieben Lubberts et al., dass Il-17 in der rheumatoiden Arthritis ein wichtiger
Faktor für die Migration von PMNs ist. In dieser Arbeit wurde aber nicht genau
untersucht oder erörtert, welche Chemokine direkt für die Rekrutierung von PMNs
verantwortlich sind. Auch in den Atemwegen wurde beschrieben, dass IL-17 indirekt
PMNs anlockt (18, 47). Bisher ist bekannt, dass PGE-2 über IL-23 und zusätzlich
über den EP-4-Rezeptor die IL-17-Produktion unter anderem in Arthritismodellen
stimulieren kann (105, 6, 81). Zusätzlich konnte in der AIA gezeigt werden, dass
PGE-2 über IL-17 die Migration von PMNs in entzündetes Gewebe durch
Chemokine, wie z. B. CXCL-1 und CXCL-5, steuert (49). Hieraus kann geschlossen
Diskussion
62
werden, dass PGE-2 über IL-23 IL-17 reguliert und dieses über die
Chemokine CXCL-1 und CXCL-5 die Rekrutierung von PMNs bewirkt.
Um eine mögliche Regulation von CXCL-5 durch PGE-2 bzw. durch
Prostaglandine allgemein in der Lyme-Arthritis herauszufinden, wurden Gelenke
Borrelien-infizierter COX-2-defizienter Mäuse auf die Expression dieses Chemokins
hin untersucht. So konnte in COX-2-/--Mäusen nachgewiesen werden, dass CXCL-5
in diesen Mäusen nur äußerst schwach induziert wurde, während es in COX-2+/-Mäusen einen erheblichen Anstieg der CXCL-5-Transkripte um den sechsten und
achten Tag p. i. gab, was die Hypothese stützt, dass bestimmte Prostaglandine eine
entscheidende Rolle in der Produktion von CXCL-5 spielen. Die verstärkte
Expression des Chemokins CXCL-2 fällt in der murinen Borreliose viel geringer aus
als bei CXCL-5 und CXCL-1, woraus man schließen kann, dass CXCL-2 in diesem
Modell wahrscheinlich eine untergeordnete Rolle einnimmt. Im Gegensatz dazu wird
das Chemokin CXCL-1 von Embryonalfibroblasten sogar stärker hochreguliert als
CXCL-5.
Allerdings
konnte
man
durch
COX-2-Inhibition
keine
Expressionsreduktion der CXCL-1-Werte erreichen, so dass dieses Chemokin in der
Lyme-Borreliose zwar eine Rolle spielen könnte, aber nicht durch das
Prostaglandinsystem beeinflusst wird. Deshalb kann man davon ausgehen, dass
CXCL-1 nicht für die Reduktion der Gelenkschwellung, die in dieser Arbeit
beobachtet wurde, verantwortlich ist. Die Erforschung der Regulation von CXCL-1
wäre ein interessanter Ansatz, um die Therapie der Lyme-Borreliose zu optimieren.
CXCL-5 konnte als wichtiges, PMN-rekrutierendes Chemokin in der murinen
Lyme-Arthritis nachgewiesen werden. Als wichtigste Zellpopulation für die
CXCL-5-Produktion
stellten
sich
Synovialfibroblasten
heraus.
Die
CXCL-5-Expression wird dabei maßgeblich durch Produkte der COX-2 reguliert.
Die Modulation der Prostaglandin-induzierten CXCL-5 Expression stellt somit
basierend auf den Ergebnissen meiner Arbeit eine vielversprechende neue
Therapieoption zur Behandlung der Lyme-Arthritis dar.
Literaturverzeichnis
63
6 LITERATURVERZEICHNIS
1.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10.
11.
12.
13.
14.
Anguita, J., Samanta, S., Ananthanarayanan, S. K., Revilla, B., Geba, G. P.,
Barthold, S. W., and Fikrig, E. 2002. Cyclooxygenase 2 activity modulates
the severity of murine Lyme arthritis. FEMS Immunol Med Microbiol 34:187191.
Barthold, S. W., Beck, D. S., Hansen, G. M., Terwilliger, G. A., and Moody,
K. D. 1990. Lyme borreliosis in selected strains and ages of laboratory mice.
J Infect Dis 162:133-138.
Barthold, S. W., Persing, D. H., Armstrong, A. L., and Peeples, R. A. 1991.
Kinetics of Borrelia burgdorferi dissemination and evolution of disease after
intradermal inoculation of mice. Am J Pathol 139:263-273.
Barthold, S. W., Sidman, C. L., and Smith, A. L. 1992. Lyme borreliosis in
genetically resistant and susceptible mice with severe combined
immunodeficiency. Am J Trop Med Hyg 47:605-613.
Blaho, V. A., Mitchell, W. J., and Brown, C. R. 2008. Arthritis develops but
fails to resolve during inhibition of cyclooxygenase 2 in a murine model of
Lyme disease. Arthritis Rheum 58:1485-1495.
Boniface, K., Bak-Jensen, K. S., Li, Y., Blumenschein, W. M., McGeachy,
M. J., McClanahan, T. K., McKenzie, B. S., Kastelein, R. A., Cua, D. J., and
de Waal Malefyt, R. 2009. Prostaglandin E2 regulates Th17 cell
differentiation and function through cyclic AMP and EP2/EP4 receptor
signaling. J Exp Med 206:535-548.
Breitner-Ruddock, S., Wurzner, R., Schulze, J., and Brade, V. 1997.
Heterogeneity in the complement-dependent bacteriolysis within the species
of Borrelia burgdorferi. Med Microbiol Immunol 185:253-260.
Brown, C. R., Blaho, V. A., and Loiacono, C. M. 2003. Susceptibility to
experimental Lyme arthritis correlates with KC and monocyte
chemoattractant protein-1 production in joints and requires neutrophil
recruitment via CXCR2. J Immunol 171:893-901.
Brown, C. R., and Reiner, S. L. 1999. Genetic control of experimental lyme
arthritis in the absence of specific immunity. Infect Immun 67:1967-1973.
Brown, C. R., and Reiner, S. L. 1998. Clearance of Borrelia burgdorferi may
not be required for resistance to experimental lyme arthritis. Infect Immun
66:2065-2071.
Brown, J. P., Zachary, J. F., Teuscher, C., Weis, J. J., and Wooten, R. M.
1999. Dual role of interleukin-10 in murine Lyme disease: regulation of
arthritis severity and host defense. Infect Immun 67:5142-5150.
Bustin, S. A. 2002. Quantification of mRNA using real-time reverse
transcription PCR (RT-PCR): trends and problems. J Mol Endocrinol 29:2339.
Chaconas, G. 2005. Hairpin telomeres and genome plasticity in Borrelia: all
mixed up in the end. Mol Microbiol 58:625-635.
Chen, J., Zhao, M., He, W., Milne, G. L., Howard, J. R., Morrow, J., Hebert,
R. L., Breyer, R. M., Chen, J., and Hao, C. M. 2008. Increased dietary NaCl
induces renal medullary PGE2 production and natriuresis via the EP2
receptor. Am J Physiol Renal Physiol 295:F818-825.
Literaturverzeichnis
15.
16.
17.
18.
19.
20.
21.
22.
23.
24.
25.
26.
27.
28.
29.
64
Coleman, J. L., Gebbia, J. A., Piesman, J., Degen, J. L., Bugge, T. H., and
Benach, J. L. 1997. Plasminogen is required for efficient dissemination of B.
burgdorferi in ticks and for enhancement of spirochetemia in mice. Cell
89:1111-1119.
Draghici, S. 2002. Statistical intelligence: effective analysis of high-density
microarray data. Drug Discov Today 7:S55-63.
Duray, P. H., and Steere, A. C. 1988. Clinical pathologic correlations of
Lyme disease by stage. Ann N Y Acad Sci 539:65-79.
Ferretti, S., Bonneau, O., Dubois, G. R., Jones, C. E., and Trifilieff, A. 2003.
IL-17, produced by lymphocytes and neutrophils, is necessary for
lipopolysaccharide-induced airway neutrophilia: IL-15 as a possible trigger. J
Immunol 170:2106-2112.
Filion, F., Bouchard, N., Goff, A. K., Lussier, J. G., and Sirois, J. 2001.
Molecular cloning and induction of bovine prostaglandin E synthase by
gonadotropins in ovarian follicles prior to ovulation in vivo. J Biol Chem
276:34323-34330.
Fraser, C. M., Casjens, S., Huang, W. M., Sutton, G. G., Clayton, R.,
Lathigra, R., White, O., Ketchum, K. A., Dodson, R., Hickey, E. K., Gwinn,
M., Dougherty, B., Tomb, J. F., Fleischmann, R. D., Richardson, D.,
Peterson, J., Kerlavage, A. R., Quackenbush, J., Salzberg, S., Hanson, M.,
van Vugt, R., Palmer, N., Adams, M. D., Gocayne, J., Weidman, J.,
Utterback, T., Watthey, L., McDonald, L., Artiach, P., Bowman, C., Garland,
S., Fuji, C., Cotton, M. D., Horst, K., Roberts, K., Hatch, B., Smith, H. O.,
and Venter, J. C. 1997. Genomic sequence of a Lyme disease spirochaete,
Borrelia burgdorferi. Nature 390:580-586.
Funk, C. D. 2001. Prostaglandins and leukotrienes: advances in eicosanoid
biology. Science 294:1871-1875.
Gaida, M. M., Gunther, F., Wagner, C., Friess, H., Giese, N. A., Schmidt, J.,
Hansch, G. M., and Wente, M. N. 2008. Expression of the CXCR6 on
polymorphonuclear neutrophils in pancreatic carcinoma and in acute,
localized bacterial infections. Clin Exp Immunol 154:216-223.
Gaillard, T., Mulsch, A., Klein, H., and Decker, K. 1992. Regulation by
prostaglandin E2 of cytokine-elicited nitric oxide synthesis in rat liver
macrophages. Biol Chem Hoppe Seyler 373:897-902.
Gibson, U. E., Heid, C. A., and Williams, P. M. 1996. A novel method for
real time quantitative RT-PCR. Genome Res 6:995-1001.
Gilroy, D. W., Colville-Nash, P. R., Willis, D., Chivers, J., Paul-Clark, M. J.,
and Willoughby, D. A. 1999. Inducible cyclooxygenase may have antiinflammatory properties. Nat Med 5:698-701.
Girschick, H. J., Huppertz, H. I., Russmann, H., Krenn, V., and Karch, H.
1996. Intracellular persistence of Borrelia burgdorferi in human synovial
cells. Rheumatol Int 16:125-132.
Goetzl, E. J., An, S., and Smith, W. L. 1995. Specificity of expression and
effects of eicosanoid mediators in normal physiology and human diseases.
Faseb J 9:1051-1058.
Goldstein, S. F., Buttle, K. F., and Charon, N. W. 1996. Structural analysis of
the Leptospiraceae and Borrelia burgdorferi by high-voltage electron
microscopy. J Bacteriol 178:6539-6545.
Goodwin, J. S., and Ceuppens, J. 1983. Regulation of the immune response
by prostaglandins. J Clin Immunol 3:295-315.
Literaturverzeichnis
30.
31.
32.
33.
34.
35.
36.
37.
38.
39.
40.
41.
42.
43.
65
Grimm, D., Tilly, K., Byram, R., Stewart, P. E., Krum, J. G., Bueschel, D.
M., Schwan, T. G., Policastro, P. F., Elias, A. F., and Rosa, P. A. 2004.
Outer-surface protein C of the Lyme disease spirochete: a protein induced in
ticks for infection of mammals. Proc Natl Acad Sci U S A 101:3142-3147.
Guay, J., Bateman, K., Gordon, R., Mancini, J., and Riendeau, D. 2004.
Carrageenan-induced paw edema in rat elicits a predominant prostaglandin
E2 (PGE2) response in the central nervous system associated with the
induction of microsomal PGE2 synthase-1. J Biol Chem 279:24866-24872.
Halloran, M. M., Woods, J. M., Strieter, R. M., Szekanecz, Z., Volin, M. V.,
Hosaka, S., Haines, G. K., 3rd, Kunkel, S. L., Burdick, M. D., Walz, A., and
Koch, A. E. 1999. The role of an epithelial neutrophil-activating peptide-78like protein in rat adjuvant-induced arthritis. J Immunol 162:7492-7500.
Harris, S. G., Padilla, J., Koumas, L., Ray, D., and Phipps, R. P. 2002.
Prostaglandins as modulators of immunity. Trends Immunol 23:144-150.
Hefty, P. S., Jolliff, S. E., Caimano, M. J., Wikel, S. K., and Akins, D. R.
2002. Changes in temporal and spatial patterns of outer surface lipoprotein
expression generate population heterogeneity and antigenic diversity in the
Lyme disease spirochete, Borrelia burgdorferi. Infect Immun 70:3468-3478.
Honda, T., Matsuoka, T., Ueta, M., Kabashima, K., Miyachi, Y., and
Narumiya, S. 2009. Prostaglandin E(2)-EP(3) signaling suppresses skin
inflammation in murine contact hypersensitivity. J Allergy Clin Immunol
124:809-818 e802.
Honda, T., Segi-Nishida, E., Miyachi, Y., and Narumiya, S. 2006.
Prostacyclin-IP signaling and prostaglandin E2-EP2/EP4 signaling both
mediate joint inflammation in mouse collagen-induced arthritis. J Exp Med
203:325-335.
Ikegami, R., Sugimoto, Y., Segi, E., Katsuyama, M., Karahashi, H., Amano,
F., Maruyama, T., Yamane, H., Tsuchiya, S., and Ichikawa, A. 2001. The
expression of prostaglandin E receptors EP2 and EP4 and their different
regulation by lipopolysaccharide in C3H/HeN peritoneal macrophages. J
Immunol 166:4689-4696.
Jiang, X., Sun, W., Zhu, L., Guo, D., Jiang, H., Ma, D., Jin, J., Zhao, Y., and
Liang, J. Expression of CXCR6 on CD8(+) T cells was up-regulated in
allograft rejection. Transpl Immunol 22:179-183.
Kabashima, K., Nagamachi, M., Honda, T., Nishigori, C., Miyachi, Y.,
Tokura, Y., and Narumiya, S. 2007. Prostaglandin E2 is required for
ultraviolet B-induced skin inflammation via EP2 and EP4 receptors. Lab
Invest 87:49-55.
Kabashima, K., Sakata, D., Nagamachi, M., Miyachi, Y., Inaba, K., and
Narumiya, S. 2003. Prostaglandin E2-EP4 signaling initiates skin immune
responses by promoting migration and maturation of Langerhans cells. Nat
Med 9:744-749.
Katsuyama, M., Ikegami, R., Karahashi, H., Amano, F., Sugimoto, Y., and
Ichikawa, A. 1998. Characterization of the LPS-stimulated expression of EP2
and EP4 prostaglandin E receptors in mouse macrophage-like cell line,
J774.1. Biochem Biophys Res Commun 251:727-731.
Kim, J. E., and Sung, S. Deleted in breast cancer 1 (DBC1) is a dynamically
regulated protein. Neoplasma 57:365-368.
King, H. C., and Sinha, A. A. 2001. Gene expression profile analysis by DNA
microarrays: promise and pitfalls. Jama 286:2280-2288.
Literaturverzeichnis
44.
45.
46.
47.
48.
49.
50.
51.
52.
53.
54.
55.
56.
57.
58.
66
Koch, A. E., Kunkel, S. L., Harlow, L. A., Mazarakis, D. D., Haines, G. K.,
Burdick, M. D., Pope, R. M., Walz, A., and Strieter, R. M. 1994. Epithelial
neutrophil activating peptide-78: a novel chemotactic cytokine for neutrophils
in arthritis. J Clin Invest 94:1012-1018.
Kraiczy, P., Hellwage, J., Skerka, C., Becker, H., Kirschfink, M., Simon, M.
M., Brade, V., Zipfel, P. F., and Wallich, R. 2004. Complement resistance of
Borrelia burgdorferi correlates with the expression of BbCRASP-1, a novel
linear plasmid-encoded surface protein that interacts with human factor H and
FHL-1 and is unrelated to Erp proteins. J Biol Chem 279:2421-2429.
Kunikata, T., Yamane, H., Segi, E., Matsuoka, T., Sugimoto, Y., Tanaka, S.,
Tanaka, H., Nagai, H., Ichikawa, A., and Narumiya, S. 2005. Suppression of
allergic inflammation by the prostaglandin E receptor subtype EP3. Nat
Immunol 6:524-531.
Laan, M., Cui, Z. H., Hoshino, H., Lotvall, J., Sjostrand, M., Gruenert, D. C.,
Skoogh, B. E., and Linden, A. 1999. Neutrophil recruitment by human IL-17
via C-X-C chemokine release in the airways. J Immunol 162:2347-2352.
Legler, D. F., Bruckner, M., Uetz-von Allmen, E., and Krause, P.
Prostaglandin E2 at new glance: novel insights in functional diversity offer
therapeutic chances. Int J Biochem Cell Biol 42:198-201.
Lemos, H. P., Grespan, R., Vieira, S. M., Cunha, T. M., Verri, W. A., Jr.,
Fernandes, K. S., Souto, F. O., McInnes, I. B., Ferreira, S. H., Liew, F. Y.,
and Cunha, F. Q. 2009. Prostaglandin mediates IL-23/IL-17-induced
neutrophil migration in inflammation by inhibiting IL-12 and IFNgamma
production. Proc Natl Acad Sci U S A 106:5954-5959.
Liang, F. T., Jacobs, M. B., Bowers, L. C., and Philipp, M. T. 2002. An
immune evasion mechanism for spirochetal persistence in Lyme borreliosis. J
Exp Med 195:415-422.
Liclican, E. L., Nguyen, V., Sullivan, A. B., and Gronert, K. Selective
Activation of the Prostaglandin E2 Circuit is a Key Component of Chronic
Injury-Induced Pathological Angiogenesis. Invest Ophthalmol Vis Sci.
Liu, J., Akahoshi, T., Jiang, S., Namai, R., Kitasato, H., Endo, H., Kameya,
T., and Kondo, H. 2000. Induction of neutrophil death resembling neither
apoptosis nor necrosis by ONO-AE-248, a selective agonist for PGE2
receptor subtype 3. J Leukoc Biol 68:187-193.
Lubberts, E., Koenders, M. I., and van den Berg, W. B. 2005. The role of Tcell interleukin-17 in conducting destructive arthritis: lessons from animal
models. Arthritis Res Ther 7:29-37.
Ma, Y., Seiler, K. P., Eichwald, E. J., Weis, J. H., Teuscher, C., and Weis, J.
J. 1998. Distinct characteristics of resistance to Borrelia burgdorferi-induced
arthritis in C57BL/6N mice. Infect Immun 66:161-168.
Malawista, S. E. 2000. Resolution of Lyme arthritis, acute or prolonged: a
new look. Inflammation 24:493-504.
Masferrer, J. L., Isakson, P. C., and Seibert, K. 1996. Cyclooxygenase-2
inhibitors: a new class of anti-inflammatory agents that spare the
gastrointestinal tract. Gastroenterol Clin North Am 25:363-372.
Matsuoka, T., and Narumiya, S. 2007. Prostaglandin receptor signaling in
disease. ScientificWorldJournal 7:1329-1347.
Miller, J. C., Ma, Y., Crandall, H., Wang, X., and Weis, J. J. 2008. Gene
expression profiling provides insights into the pathways involved in
inflammatory arthritis development: murine model of Lyme disease. Exp Mol
Pathol 85:20-27.
Literaturverzeichnis
59.
60.
61.
62.
63.
64.
65.
66.
67.
68.
69.
70.
71.
72.
73.
67
Modolell, M., Schaible, U. E., Rittig, M., and Simon, M. M. 1994. Killing of
Borrelia burgdorferi by macrophages is dependent on oxygen radicals and
nitric oxide and can be enhanced by antibodies to outer surface proteins of the
spirochete. Immunol Lett 40:139-146.
Montesano, R., Pepper, M. S., Mohle-Steinlein, U., Risau, W., Wagner, E. F.,
and Orci, L. 1990. Increased proteolytic activity is responsible for the
aberrant morphogenetic behavior of endothelial cells expressing the middle T
oncogene. Cell 62:435-445.
Morita, I. 2002. Distinct functions of COX-1 and COX-2. Prostaglandins
Other Lipid Mediat 68-69:165-175.
Moriyama, T., Higashi, T., Togashi, K., Iida, T., Segi, E., Sugimoto, Y.,
Tominaga, T., Narumiya, S., and Tominaga, M. 2005. Sensitization of
TRPV1 by EP1 and IP reveals peripheral nociceptive mechanism of
prostaglandins. Mol Pain 1:3.
Mullegger, R. R., McHugh, G., Ruthazer, R., Binder, B., Kerl, H., and Steere,
A. C. 2000. Differential expression of cytokine mRNA in skin specimens
from patients with erythema migrans or acrodermatitis chronica atrophicans.
J Invest Dermatol 115:1115-1123.
Murakami, M., Nakashima, K., Kamei, D., Masuda, S., Ishikawa, Y., Ishii,
T., Ohmiya, Y., Watanabe, K., and Kudo, I. 2003. Cellular prostaglandin E2
production by membrane-bound prostaglandin E synthase-2 via both
cyclooxygenases-1 and -2. J Biol Chem 278:37937-37947.
Murakami, M., Naraba, H., Tanioka, T., Semmyo, N., Nakatani, Y., Kojima,
F., Ikeda, T., Fueki, M., Ueno, A., Oh, S., and Kudo, I. 2000. Regulation of
prostaglandin E2 biosynthesis by inducible membrane-associated
prostaglandin E2 synthase that acts in concert with cyclooxygenase-2. J Biol
Chem 275:32783-32792.
Myren, M., Baun, M., Ploug, K. B., Jansen-Olesen, I., Olesen, J., and Gupta,
S. Functional and molecular characterization of prostaglandin E2 dilatory
receptors in the rat craniovascular system in relevance to migraine.
Cephalalgia 30:1110-1122.
Nanki, T., Shimaoka, T., Hayashida, K., Taniguchi, K., Yonehara, S., and
Miyasaka, N. 2005. Pathogenic role of the CXCL16-CXCR6 pathway in
rheumatoid arthritis. Arthritis Rheum 52:3004-3014.
Narumiya, S. 1994. Prostanoid receptors. Structure, function, and
distribution. Ann N Y Acad Sci 744:126-138.
Odaka, T., Kobayashi, K., Takahashi, K., Nakamura, H., and Matsuoka, T.
2009. Effect of prostaglandin E2 on urokinase-type plasminogen activator
production by human lung fibroblasts. Scand J Clin Lab Invest 69:225-233.
Ogino, N., Miyamoto, T., Yamamoto, S., and Hayaishi, O. 1977.
Prostaglandin endoperoxide E isomerase from bovine vesicular gland
microsomes, a glutathione-requiring enzyme. J Biol Chem 252:890-895.
Oschmann, P., Dorndorf, W., Hornig, C., Schafer, C., Wellensiek, H. J., and
Pflughaupt, K. W. 1998. Stages and syndromes of neuroborreliosis. J Neurol
245:262-272.
Pal, U., Yang, X., Chen, M., Bockenstedt, L. K., Anderson, J. F., Flavell, R.
A., Norgard, M. V., and Fikrig, E. 2004. OspC facilitates Borrelia burgdorferi
invasion of Ixodes scapularis salivary glands. J Clin Invest 113:220-230.
Park, J. Y., Pillinger, M. H., and Abramson, S. B. 2006. Prostaglandin E2
synthesis and secretion: the role of PGE2 synthases. Clin Immunol 119:229240.
Literaturverzeichnis
74.
75.
76.
77.
78.
79.
80.
81.
82.
83.
84.
85.
86.
87.
88.
89.
68
Pavlovic, S., Du, B., Sakamoto, K., Khan, K. M., Natarajan, C., Breyer, R.
M., Dannenberg, A. J., and Falcone, D. J. 2006. Targeting prostaglandin E2
receptors as an alternative strategy to block cyclooxygenase-2-dependent
extracellular matrix-induced matrix metalloproteinase-9 expression by
macrophages. J Biol Chem 281:3321-3328.
Penning, T. D., Talley, J. J., Bertenshaw, S. R., Carter, J. S., Collins, P. W.,
Docter, S., Graneto, M. J., Lee, L. F., Malecha, J. W., Miyashiro, J. M.,
Rogers, R. S., Rogier, D. J., Yu, S. S., AndersonGd, Burton, E. G., Cogburn,
J. N., Gregory, S. A., Koboldt, C. M., Perkins, W. E., Seibert, K.,
Veenhuizen, A. W., Zhang, Y. Y., and Isakson, P. C. 1997. Synthesis and
biological evaluation of the 1,5-diarylpyrazole class of cyclooxygenase-2
inhibitors: identification of 4-[5-(4-methylphenyl)-3-(trifluoromethyl)-1Hpyrazol-1-yl]benze nesulfonamide (SC-58635, celecoxib). J Med Chem
40:1347-1365.
Posey, J. E., and Gherardini, F. C. 2000. Lack of a role for iron in the Lyme
disease pathogen. Science 288:1651-1653.
Powell, W. S. 2003. 15-Deoxy-delta12,14-PGJ2: endogenous PPARgamma
ligand or minor eicosanoid degradation product? J Clin Invest 112:828-830.
Rollins, B. J. 1997. Chemokines. Blood 90:909-928.
Rosa, P. A., Tilly, K., and Stewart, P. E. 2005. The burgeoning molecular
genetics of the Lyme disease spirochaete. Nat Rev Microbiol 3:129-143.
Ruddy, M. J., Shen, F., Smith, J. B., Sharma, A., and Gaffen, S. L. 2004.
Interleukin-17 regulates expression of the CXC chemokine LIX/CXCL5 in
osteoblasts: implications for inflammation and neutrophil recruitment. J
Leukoc Biol 76:135-144.
Sakata, D., Yao, C., and Narumiya, S. Prostaglandin E(2), an
immunoactivator. J Pharmacol Sci 112:1-5.
Schena, M., Shalon, D., Davis, R. W., and Brown, P. O. 1995. Quantitative
monitoring of gene expression patterns with a complementary DNA
microarray. Science 270:467-470.
Schwan, T. G., and Piesman, J. 2000. Temporal changes in outer surface
proteins A and C of the lyme disease-associated spirochete, Borrelia
burgdorferi, during the chain of infection in ticks and mice. J Clin Microbiol
38:382-388.
Smith, E., McGettrick, H. M., Stone, M. A., Shaw, J. S., Middleton, J., Nash,
G. B., Buckley, C. D., and Ed Rainger, G. 2008. Duffy antigen receptor for
chemokines and CXCL5 are essential for the recruitment of neutrophils in a
multicellular model of rheumatoid arthritis synovium. Arthritis Rheum
58:1968-1973.
Steere, A. C., Coburn, J., and Glickstein, L. 2004. The emergence of Lyme
disease. J Clin Invest 113:1093-1101.
Steere, A. C., and Glickstein, L. 2004. Elucidation of Lyme arthritis. Nat Rev
Immunol 4:143-152.
Steere, A. C., Levin, R. E., Molloy, P. J., Kalish, R. A., Abraham, J. H., 3rd,
Liu, N. Y., and Schmid, C. H. 1994. Treatment of Lyme arthritis. Arthritis
Rheum 37:878-888.
Steere, A. C., Schoen, R. T., and Taylor, E. 1987. The clinical evolution of
Lyme arthritis. Ann Intern Med 107:725-731.
Strle, F., Nadelman, R. B., Cimperman, J., Nowakowski, J., Picken, R. N.,
Schwartz, I., Maraspin, V., Aguero-Rosenfeld, M. E., Varde, S., LotricFurlan, S., and Wormser, G. P. 1999. Comparison of culture-confirmed
Literaturverzeichnis
90.
91.
92.
93.
94.
95.
96.
97.
98.
99.
100.
101.
102.
103.
69
erythema migrans caused by Borrelia burgdorferi sensu stricto in New York
State and by Borrelia afzelii in Slovenia. Ann Intern Med 130:32-36.
Sugimoto, Y., and Narumiya, S. 2007. Prostaglandin E receptors. J Biol
Chem 282:11613-11617.
Tabata, H., Tanaka, S., Sugimoto, Y., Kanki, H., Kaneko, S., and Ichikawa,
A. 2002. Possible coupling of prostaglandin E receptor EP(1) to TRP5
expressed in Xenopus laevis oocytes. Biochem Biophys Res Commun
298:398-402.
Tai, H. H., Cho, H., Tong, M., and Ding, Y. 2006. NAD+-linked 15hydroxyprostaglandin dehydrogenase: structure and biological functions.
Curr Pharm Des 12:955-962.
Talkington, J., and Nickell, S. P. 2001. Role of Fc gamma receptors in
triggering host cell activation and cytokine release by Borrelia burgdorferi.
Infect Immun 69:413-419.
Tanabe, T., and Tohnai, N. 2002. Cyclooxygenase isozymes and their gene
structures and expression. Prostaglandins Other Lipid Mediat 68-69:95-114.
Tanioka, T., Nakatani, Y., Semmyo, N., Murakami, M., and Kudo, I. 2000.
Molecular identification of cytosolic prostaglandin E2 synthase that is
functionally coupled with cyclooxygenase-1 in immediate prostaglandin E2
biosynthesis. J Biol Chem 275:32775-32782.
Trajkovic, V., Sweet, M. J., and Xu, D. 2004. T1/ST2--an IL-1 receptor-like
modulator of immune responses. Cytokine Growth Factor Rev 15:87-95.
Tsuboi, K., Sugimoto, Y., and Ichikawa, A. 2002. Prostanoid receptor
subtypes. Prostaglandins Other Lipid Mediat 68-69:535-556.
Verri, W. A., Jr., Souto, F. O., Vieira, S. M., Almeida, S. C., Fukada, S. Y.,
Xu, D., Alves-Filho, J. C., Cunha, T. M., Guerrero, A. T., Mattos-Guimaraes,
R. B., Oliveira, F. R., Teixeira, M. M., Silva, J. S., McInnes, I. B., Ferreira, S.
H., Louzada-Junior, P., Liew, F. Y., and Cunha, F. Q. IL-33 induces
neutrophil migration in rheumatoid arthritis and is a target of anti-TNF
therapy. Ann Rheum Dis.
Vieira, S. M., Lemos, H. P., Grespan, R., Napimoga, M. H., Dal-Secco, D.,
Freitas, A., Cunha, T. M., Verri, W. A., Jr., Souza-Junior, D. A., Jamur, M.
C., Fernandes, K. S., Oliver, C., Silva, J. S., Teixeira, M. M., and Cunha, F.
Q. 2009. A crucial role for TNF-alpha in mediating neutrophil influx induced
by endogenously generated or exogenous chemokines, KC/CXCL1 and
LIX/CXCL5. Br J Pharmacol 158:779-789.
Watanabe, K., Kurihara, K., Tokunaga, Y., and Hayaishi, O. 1997. Two types
of microsomal prostaglandin E synthase: glutathione-dependent and independent prostaglandin E synthases. Biochem Biophys Res Commun
235:148-152.
Williams, R. L., Risau, W., Zerwes, H. G., Drexler, H., Aguzzi, A., and
Wagner, E. F. 1989. Endothelioma cells expressing the polyoma middle T
oncogene induce hemangiomas by host cell recruitment. Cell 57:1053-1063.
Wittwer, C. T., Ririe, K. M., Andrew, R. V., David, D. A., Gundry, R. A.,
and Balis, U. J. 1997. The LightCycler: a microvolume multisample
fluorimeter with rapid temperature control. Biotechniques 22:176-181.
Wooten, R. M., Ma, Y., Yoder, R. A., Brown, J. P., Weis, J. H., Zachary, J.
F., Kirschning, C. J., and Weis, J. J. 2002. Toll-like receptor 2 is required for
innate, but not acquired, host defense to Borrelia burgdorferi. J Immunol
168:348-355.
Literaturverzeichnis
104.
105.
106.
107
70
Wooten, R. M., and Weis, J. J. 2001. Host-pathogen interactions promoting
inflammatory Lyme arthritis: use of mouse models for dissection of disease
processes. Curr Opin Microbiol 4:274-279.
Yao, C., Sakata, D., Esaki, Y., Li, Y., Matsuoka, T., Kuroiwa, K., Sugimoto,
Y., and Narumiya, S. 2009. Prostaglandin E2-EP4 signaling promotes
immune inflammation through Th1 cell differentiation and Th17 cell
expansion. Nat Med 15:633-640.
Zhang, J. R., and Norris, S. J. 1998. Genetic variation of the Borrelia
burgdorferi gene vlsE involves cassette-specific, segmental gene conversion.
Infect Immun 66:3698-3704.
Zurier, R.B., Prostaglandins, leukotrienes, and related compounds, in:
Harris Jr., E.D., Budd, R.C., Genovese, M.C., Firestein, G.S. and Sargent
(Eds.), J.S. Kelley’s Textbook of Rheumatology, Elsevier, Philadelphia, PA,
2005, pp. 356– 369.
Abkürzungsverzeichnis
71
7 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS
A23187
Calcimycin
AC
Adenylatcyclase
AIA
Adjuvans-induzierte Arthritis
AK
Antikörper
APC
Antigen-präsentierende Zelle bzw. Allophycocyanin
B. b.
Borrelia burgdorferi
b.end.3
Endothelzelllinie
BSA
bovine serum albumin, Rinderserum-Albumin
BSK-H
Barbour-Stoenner-Kelly-Medium
Ca++
Calcium
cAMP
cyklisches Adenosinmonophosphat
cDNA
complementary DNA, komplementäre DNA
COX
Cyclooxygenase
cPGES
cytosolische Prostglandin-E-Synthetase
cRNA
komplementäre RNA
CXCL
Chemokin-Ligand (mit C-X-C-Motiv)
CXCR
Chemokin-Rezeptor (mit C-X-C-Motiv)
DAG
Diacylglycerol
DNA
deoxyribonucleid acid, Desoxyribonukleinsäure
DBC-1
deleted in breast cancer-1, entfernt bei Brustkrebs-1
DMARD
disease-modifying antirheumatic drug, langwirksames
Antirheumatikum
DMEM
Dulbecco’s modified Eagle’s medium
DMSO
Dimethylsulfoxid
DTT
Dithiothreitol
EC
Endothelzelle
EDTA
Ethylendiamintetraazetat
ELISA
enzyme-linked immunosorbent assay, Enzym-gekoppelter
Immuno-Absorptionstest
ENA-78
epithelial neutrophil-activating peptide-78
EP
E-Prostanoid-Rezeptor
Abkürzungsverzeichnis
72
Fc
crystallizable fragment (Fragment eines Immunglobulins)
FCS
fetal calf serum, fetales Kälberserum
FlaB
Flagellin-B
HBSS
Hank’s balanced salt solution
HEK293
human Embryonic Kidney-293-Zellen
HEPES
N-2-Hydroxyethylpiperazin-N’-2-Ethansulfonsäure
HPRT
Hypoxanthin-Phosphoribosyltransferase
HZI
Helmholtz Zentrum für Infektionsforschung
I.
Ixodes
IFN
Interferon
Ig
Immunglobulin
IL
Interleukin
IP3
Inositol-1,4,5-Triphosphat
LIX
LPS induced CXC Chemokine, LPS induziertes
CXC-Chemokin
LK
Lymphknoten
LPS
Lipopolysaccharid
MEF
murine Embryonalfibroblasten
MOI
multiplicity of infection, Multiplizität der Infektion (Zahl der
Bakterien pro zu infizierender Zelle)
mPGES
mikrosomale Prostaglandin-E-Synthetase
mRNA
messenger RNA, Boten-RNA
MRP-4
multidrug resistance protein 4
NKT-Zellen
natürliche Killer T-Zellen
NSAID
non-steroidal anti-inflammatory drug, nicht-steroidales antiinflammatorisches Medikament
OD
optische Dichte
ONO-AE-248
EP-3-Agonist von ONO-Pharmaceuticals
ONO-AE3-208
EP-4-Antagonist von ONO-Pharmaceuticals
Osp
outer surface protein, Lipoprotein der äußeren Membran von
B. burgdorferi
p. i.
postinoculation, nach der Inokulation
PBGD
Porphobilinogen-Desaminase
Abkürzungsverzeichnis
PBMC
73
peripheral blood mononuclear cells, mononukleäre Zellen des
peripheren Blutes
PBS
phosphate-buffered saline, Phosphat-gepufferte physiologische
NaCl-Lösung
PCR/RT-PCR
polymerase chain reaction/reverse transcription-polymerase
chain reaction, Polymerase-Kettenreaktion/PolymeraseKettenreaktion nach reverser Transkription
PEC
Peritoneal-Exsudat-Zellen
PGE-2
Prostaglandin E-2
PIP2
Phosphatidylinositolbisphosphat
PLC
Phospholipase
PMN
polymorphonuclear leukocytes, polymorphkernige Leukozyten
(hier nur Neutrophile)
qPCR
quantitative Polymerase-Kettenreaktion
rag
recombination activating gene, rekombiniertes
Aktivierungsgen
RNA
ribonucleic acid, Ribonukleinsäure
RT
Raumtemperatur
scid
severe combined immunodeficiency, schwere kombinierte
Immunschwäche
SD
standard deviation, Standardabweichung
SEM
standard error of the mean, Standardfehler des Mittelwertes
Th
T-Helfer-Lymphozyt
TNF
Tumornekrosefaktor
Tris
Tris(hydroxymethyl)-Aminomethan
VlsE
variable surface antigen E, variables Oberflächenantigen E
WT
Wildtyp
ZNS
zentrales Nervensystem
Danksagung
74
8 DANKSAGUNG
An dieser Stelle möchte ich mich bei meinem Doktorvater Prof. Dr. Dr. André
Gessner
bedanken,
der
mir
die
Möglichkeit
gab,
dieses
spannende
Dissertationsthema in seiner Arbeitsgruppe zu bearbeiten und bei dem ich viele
molekularbiologische Arbeitstechniken erlernt habe. Ich danke ihm auch für seine
Geduld, sein exzellentes Fachwissen und seine Ideen, die mich während dieser Zeit
geleitet haben.
Besonders bedanken möchte ich mich bei meinem Betreuer Dr. Joachim Gläsner, der
mich in die Welt der Molekularbiologie eingeführt hat. Durch seine unglaubliche
Geduld und Gewissenhaftigkeit bei den Versuchen hat er mir mit zahlreichen
Hilfestellungen die Arbeit im Labor erst möglich gemacht. Sogar während den
gemeinsamen abendlichen Snacks im Aufenthaltsraum wurde mein immunologisches
Wissen vertieft.
Des Weiteren möchte ich mich bei allen Mitarbeitern der Arbeitsgruppe Gessner
bedanken, mit denen ich im Laufe meiner Dissertation zusammenarbeitete. Viele
schöne Erinnerungen werde ich mitnehmen, die von zahlreichen Tipps im
Laboralltag über das gemeinsame Brezelessen morgens bis hin zu ausgedehnten
Fahrradtouren reichen. Danke: Harald Arnold, Christina Becker, Dagmar Eibl,
Claudia Gießler, Andreas Goldwich, Alexander Holweg, Rimma Junker, Selina
Myrczek, Martha Ölke, Manuel Otte und Gabriel Wetzel.
Herr Prof. Dr. Martin Röllinghoff und seinem Nachfolger Herrn Prof. Dr. Christian
Bogdan danke ich für die ausgezeichneten räumlichen und finanziellen
Rahmenbedingungen
Meiner Freundin Ina Wirries gilt besonderer Dank. Sowohl während der Laborarbeit
als auch während des „Zusammenschreibens“ war sie eine große Stütze, die mir
unermüdlich und jederzeit mit Rat und Tat zur Seite stand. Großer Dank gebührt
auch meinen Eltern und meiner Schwester Bettina, die mir über den ganzen Zeitraum
immer hilfreich zur Seite standen.
Lebenslauf
75
9 LEBENSLAUF
Sebastian Cyrill Kruck
geboren am 24.11.1980 in Berlin
Eltern:
Dr. med. Gerhard Kruck
Dr. med. Irmtraut Kruck
Geschwister:
Bettina Verena Kruck
aktuelle Beschäftigung:
seit 09/2010
Assistenzarzt an der Medizinischen Klinik II Kardiologie und
Pulmologie Campus Benjamin Franklin, Charité Berlin
Hochschulstudium:
05/2010
10/2004 – 05/2010
05/2008 – 03/2010
11/2007 – 10/2008
03/2006
10/2003 – 10/2004
07/2003
10/2001 – 10/2003
2. Teil der ärztlichen Prüfung
Studium der Humanmedizin an der Friedrich-Alexander
Universität
Erlangen-Nürnberg
Mitglied des Leonardo-Kollegs der Friedrich-AlexanderUniversität Erlangen-Nürnberg
Stipendium des IZKF-Doktorandenprogramms unter dem
Leitthema „Genese, Diagnostik und Therapie von
Entzündungsprozessen“.
1. Teil der ärztlichen Vorprüfung, Note: 2
Studium der Humanmedizin an der Medizinischen Hochschule
Hannover
Zwischenprüfung im Fach Violine, Note: 1
Studium an der Musikhochschule Stuttgart mit Hauptfach
Violine
Praktisches Jahr:
09/2009 – 01/2010
06/2009 – 09/2009
02/2009 – 06/2009
3. Tertial
Anästhesiologie bei Dr. med. U. von Hintzenstern
Klinikum Forchheim
. Tertial
Kardiologie bei Prof. Dr. med. W. Daniel
Medizinische Klinik II, Universitätsklinikum Erlangen
1. Tertial
Chirurgie bei Prof. Dr. med. R. Rosso
Ospedale Civico, Lugano (Schweiz)
Lebenslauf
76
Famulaturen:
09/2008
03/2008
09/2007
09/2006
Unfall- und Viszeralchirurgie
bei Prof. Dr. med. F. Hennig und Prof. Dr. med. W.
Hohenberger
Universitätsklinikum Erlangen
Institut für Mikrobiologie, Immunologie und Hygiene
bei Prof. Dr. med. Ch. Bogdan
Universitätsklinikum Erlangen
Hals-Nasen-Ohrenheilkunde
bei Prof. Dr. med. H. Iro
Universitätsklinikum Erlangen
Kardiologische Praxis
bei Dr. med. D. Gast
Internistische Praxis, Berlin
Schulbildung:
2000 – 2001
1999 – 2000
1991 – 1999
1989 – 1991
1987 – 1989
Zivildienst im Klinikum Ludwigsburg
Johann-Wolfgang-von Goethe Gymnasium Ludwigsburg
Abiturnote: 2,6
Friedrich-Schiller-Gymnasium Ludwigsburg
Anton-Bruckner Grundschule Ludwigsburg
Zinnowald Grundschule in Berlin
Lebenslauf
77