Vorlesung (21.1.2013)

Vorlesung "Molekülphysik/Festkörperphysik"
Wintersemester 2012/2013
Prof. Dr. F. Kremer
Übersicht der Vorlesung am 21.01.2013
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Fluoreszenz
Phosphoreszenz
Interkombinationsübergang
FRET (Fluoreszenz-Resonanz EnergieTransfer)
Konfokalmikroskopie
Einzelmolekülspektroskopie
STED (Stimulated Emission Depletion)
FCS (Fluoreszenz-Correlations-Spektroskopie)
Ablauf der Fluoreszenz
Alexander Jablonski (1898–1980)
• Lichtabsorption regt Elektron an zu einem höheren Vibrationszustand auf den
Energieniveaus S1 oder S2.
• Bis auf wenige Ausnahmen relaxieren die Elektronen in kondensierter Materie
(angekoppeltes Wärmebad) in den niedrigsten Vibrationszustand des S1 Niveaus. Die
geschieht gewöhnlich in weniger als 10-12s.
• Nach einer Abklingdauer von ca. 10-8s kehrt das Elektron wieder in das S0 Niveau zurück,
dabei kann (-> Quantenausbeute) es Licht (gewöhnlich mit größerer Wellenlänge)
emittieren.
Fluoreszenz
• Fluoreszenz ist die kurzzeitige, spontane Emission von Licht beim Übergang eines
elektronisch angeregten Systems in einen Zustand niedrigerer Energie.
• Im Gegensatz zur Phosphoreszenz sind Fluoreszenzübergänge spinerlaubt, d. h. sie
gehorchen der Auswahlregel ΔS = 0, erfolgen also zwischen Zuständen gleichen Spins.
Phosphoreszenz
• Es kommt nach etwa 10-8 Sekunden zu einem weiteren Quantensprung der Elektronen in
ein metastabiles Energieniveau. Es ändert sich hierbei der Spin der Elektronen, wodurch
das Molekül unter Änderung der Multiplizität von einem Singulett- in einen Triplettzustand
übergeht (Interkombinationsübergang - Intersystem Crossing).
• Die Verweildauer in diesem Zustand beträgt Millisekunden bis hin zu Stunden.
• Das Molekül ist in diesem angeregten Zustand „gefangen“, da eine Abgabe der Energie an
die Umgebung nicht möglich ist (Spinumkehr nicht möglich).
• Ausnahme: erneuter Interkombinationsübergang. Durch ihn kann eine schwache Strahlung
emittiert werden.
Interkombinationsübergang
• Elektrische Dipolübergänge erfolgen besonders
gut, wenn die Multiplizität erhalten bleibt (z. B.
Fluoreszenz). Prozesse, bei denen sich die
Multiplizität ändert (Interkombination), sind verboten
(Interkombinationsverbot), d. h. sie finden meist nur
in geringem Ausmaß bzw. statistisch selten statt.
(~langsam)
• Wenn jedoch die Kernladungszahl Z stark zunimmt
tritt jj-Kopplung auf. Dabei ist die
Wechselwirkungsenergie zwischen dem
magnetischen Bahnmoment und dem magnetischen
Spinmoment groß gegen die Kopplungsenergien
zwischen den magnetischen Bahnmomenten und
zwischen den Spinmomenten. ->
Interkombinationsverbot gilt nicht mehr (streng), da
keine Unterscheidung der Atomterme in S, P, D –
Terme und in Singulett, Dubletts und Tripletts.
Übergang von LS- zu jj-Kopplung
leichte Atome
schwere Atome
LS
Gesamtbahndrehimpuls:
Gesamtspin:
Gesamtdrehimpuls:
jj
G
G
L = ∑ li
i
G
G
S = ∑ si
i
G G G
J =L+S
Gesamtbahndrehimpuls:
nicht definiert
Gesamtspin:
nicht definiert
Gesamtdrehimpuls:
G
G
J = ∑ ji
i
mit
G G G
ji = li + si
Fluoreszenzlöschung
Es existiert eine Reihe von Effekten, die zur Fluoreszenzlöschung
führen können, beispielsweise:
•
•
•
Komplex-Bildung
interne Konversion
Energie-Übertragung auf andere Moleküle, sogenannte Quencher
Zu den Quenching-Effekten gehören alle Vorgänge, die entweder den
angeregten Zustand des Fluorophors strahlungslos in den
Grundzustand überführen oder aber verhindern, dass der Fluorophor
in den angeregten Zustand übergehen kann.
Dynamisches Quenching: Energie des angeregten Fluorophores wird
durch den Zusammenstoß mit einem Quenchermolekül auf dieses
Quenchermolekül übertragen, wobei die Energie letztlich in Wärme
übergeht.
Statisches Quenching: Fluorophor und Quenchermolekül bilden einen
Komplex, dessen Fluoreszenz verringert ist oder ganz ausbleibt.
Resonanz-Energie-Transfer
Beim Resonanz-Energie-Transfer wird die Energie des angeregten
Zustandes des Fluorphors D (Donor) strahlungslos durch
Resonanzeffekte auf ein zweites Molekül A (Akzeptor) übertragen.
FRET (Fluoreszenz-Resonanzenergietransfer)
kT: Transferrate
τD: Lebensdauer Donor
r: Abstand Donor Akzeptor
R0: Försterradius
Förster-Resonanzenergietransfer kann zwischen zwei
Farbstoffen, die als Moleküle, Komplexe oder Nanopartikel
vorliegen, beobachtet werden.
Dabei wird die Energie eines angeregten Donorfarbstoffs
nicht in Form eines Photons abgegeben, sondern
strahlungslos über Dipol-Dipol-Wechselwirkungen auf
einen Akzeptorfarbstoff übertragen.
Der Energietransfer folgt dabei dem Coulombschen Gesetz.
Demnach induziert der angeregte Donor D* eine Oszillation
im Akzeptor A.
Charakteristisch für den Förster-Resonanzenergietransfer
ist auch, dass die quantenmechanische Eigenschaft des
Spins von Donor- und Akzeptorfarbstoff erhalten bleibt.
Daher tritt der Förster-Resonanzenergietransfer in der
Regel als sogenannter Singulett-Singulett-Transfer auf.
Photolumineszenz
Bsp.: Fluoreszierende Minerale
Photolumineszenz
oben: Nilrot bei Tageslicht (obere Reihe) und UV-Licht (366
nm, untere Reihe) in verschiedenen Lösungsmitteln. V.l.n.r.:
1. Wasser, 2. Methanol, 3. Ethanol, 4. Acetonitril, 5.
Dimethylformamid,
6.
Aceton,
7.
Ethylacetat,
8.
Dichlormethan, 9. n-Hexan, 10. tert-Butylmethylether, 11.
Cyclohexan, 12. Toluol.
links: Uranglas unter Tages- und UV-Licht
Anwendungsbeispiele
Niederdruck-Gasentladungslampe, die Ultraviolettstrahlung wird
von der Leuchtstoff-Beschichtung in sichtbares Licht umgewandelt.
Mit Ethidiumbromid gefärbtes Agarose-Gel
Phosphoreszierende Leuchtziffern
(ggf. mit Tritium Anregung)
Querschnitt durch eine "weiße" LED
(blaue LED + gelber Fluoreszenzfarbstoff)
konfocal
"normal"
Konfokalmikroskopie
Konfokalmikroskope erlauben durch ihre
hohe axiale Auflösung die Aufnahme von
vielen Bildern in verschiedenen
Schärfeebenen und somit die Erstellung
eines scharfen, dreidimensionalen Bilds.
a,d: menschliches Knochenmark
b,e: Muskelzelle
c,f: Pollen einer Sonnenblume
Konfokalmikroskopie
• Lichtmikroskop
• nicht das gesamte Präparat beleuchtet
• ein beugungsbegrenzter Lichtfleck
• Besonderheit besteht darin, dass im Strahlengang des detektierten
Lichts eine Lochblende angebracht ist, die Licht, welches von
außerhalb der Schärfeebene kommt, blockieren kann.
Einzelmolekülspektroskopie
• Ein abbildendes Fluoreszenzmikroskop; hier werden mit Hilfe einer
sehr rauscharmen und empfindlichen CCD-Kamera Bilder
aufgenommen, die Signale der einzelnen Emitter enthalten.
• Ein konfokales Mikroskop mit einem mehrkanaligen Detektorsystem,
das einzelne Photonen mit sehr hoher Zeitauflösung registrieren
kann.
Einzelmolekülspektroskopie
• Ein abbildendes Fluoreszenzmikroskop; hier werden mit Hilfe einer
sehr rauscharmen und empfindlichen CCD-Kamera Bilder
aufgenommen, die Signale der einzelnen Emitter enthalten.
• Ein konfokales Mikroskop mit einem mehrkanaligen Detektorsystem,
das einzelne Photonen mit sehr hoher Zeitauflösung registrieren
kann.
Einzelmolekülspektroskopie
Einzelmolekülspektroskopie
Einzelmolekülspektroskopie
Surface-tethered DNA in shear flow – observation of dynamic cyclic motion
Q-dot
DNA
End-specific DNA-immobilisation
Experimental set-up
Time- & flow-dependent coordinates
Manipulation of doubly-tethered DNA
by molecular motors & hydrodynamic flow
DNA-protein interaction
1 H * ≈ 0.2
1 H * > 0.3
Motor-induced DNA stretching
Response of doubly-tethered DNA to shear flow
Complexation of two DNA fragments
by a genetically modified TetR protein
(with W. Hillen, Erlangen)
TU Dresden / AG Mertig
Einzelmolekülspektroskopie
The experiment: semiflexible actin filaments in parabolic microflow
actin in microchannels:
10µm
10µm
pressure flow – parabolic flow
profile
length L ~ 8µm
persistence length
LP ~ 13µm
“stretched”
“tumbling”
“U-form”
Dagmar Steinhauser and Thomas Pfohl
STED (Stimulated Emission Depletion)
• bietet aber bessere Auflösung als in einem
herkömmlichen Laser-Raster-Mikroskop möglich,
da der Bereich, aus dem die Fluoreszenz emittiert
wird, bedeutend verkleinert wird, als der Bereich,
der von dem Laserstrahl beleuchtet wird.
• Dies wird durch gezieltes Ausschalten der
Farbstoffmoleküle im Außenbereich des Fokus
erreicht.
STED (Stimulated Emission Depletion)
•Konfokalmikroskop, das nach dem RESOLFT-Prinzip
(REversible Saturable OpticaL (Flurorescence)
Transitions) arbeitet
•baut auf Fluoreszenz-Laser-Raster-Mikroskopen auf
FCS (Fluoreszenz-Correlations-Spektroskopie)
Die
Fluoreszenz-Korrelations-Spektroskopie
(fluorescence
correlation
spectroscopy, FCS) ist eine höchstempfindliche optische Messmethode, die aus
Fluktuationen in der Fluoreszenzintensität Informationen gewinnt. Mit FCS werden
in der Regel Diffusionskonstanten, Konzentrationen und Bindungen zwischen
verschiedenen diffundierenden Spezies gemessen. Die Methode wurde in den
1970er Jahren von W. W. Webb, et al. entwickelt.
FCS (Fluoreszenz-Correlations-Spektroskopie)
Die Theorie der FCS beruht auf der Poisson-Statiastik:
N n −N
P(n, N ) =
e
n!
P(n,N) ist die Wahrscheinlichkeit, dass n Fluorophore in dem
Beobachtungsvolumen vorhanden sind, wenn die mittlere Zahl der Moleküle
in dem Volumen N ist.
Beispiel: Wenn N=0,6 so ist die Wahrscheinlichkeit
55%, dass das Beobachtungsvolumen kein Fluorophor enthält
33%, dass es einen Fluorophor und
10%, dass es Fluorophore enthält.
Es ist evident, dass die Diffusionsrate der Fluorophore eine wichtige Rolle
spielen muss. Darum wird die Intensität zu einer Zeit t verglichen mit der zu
einer Zeit t+τ.
(1)
FCS (Fluoreszenz-Correlations-Spektroskopie)
Korrelationsfunktion K(s)
K (τ ) = ⟨ F (t ) F (t + τ )⟩
T
1
= ∫ F (t ) F (t + τ ) dt
T 0
(2)
Von Interesse sind die Fluktuationen von F (t ) um einen mittleren Wert
δ F ( t ) = ⟨ F ⟩ − F (t )
(3)
Normalisierung der Autokorrelationsfunktion für die Fluoreszensintensität
liefert
G (τ ) =
⟨ F (t ) F (t + τ )⟩
⟨F⟩ ⋅ ⟨F⟩
G (τ ) = 1 +
⟨δ F (0)δ F (τ )⟩
⟨F⟩2
(4)
(5)
FCS (Fluoreszenz-Correlations-Spektroskopie)
Beweis: Einsetzen von (3) in (5) liefert
1+
⟨ F ⟩ ⋅ ⟨ F ⟩ + ⟨( ⟨ F ⟩ − F (t ) )( ⟨ F ⟩ − F (t + τ ) )⟩
⟨F ⟩2
⟨ F ⟩ 2 + ⟨ F ⟩ 2 − ⟨ F ⟩⟨( ⟨ F (t + τ )⟩ + ⟨ F (t )⟩ ) + ⟨ F (t ) ⋅ F (t + τ )⟩
=
⟨F ⟩2
2⟨ F ⟩ 2 − 2⟨ F ⟩ 2 ⋅ ⟨ F ⟩ + ⟨ F (t ) ⋅ F (t + τ )⟩
=
⟨F ⟩2
(6)
Die Hauptanwendung der FCS sind Diffusionsmessungen. Die Theorie
der Diffusion in drei Dimensionen liefert für die Korrelationsfunktion
2
⎡
⎤
r
r
'
−
2
⟨δ c (r , 0)δ c(r ',τ )⟩ = c (4π Dτ ) exp ⎢ −
4 Dτ ⎥⎥
⎢⎣
⎦
3
wobei D der Diffusionskoeffizient ist.
(7)
FCS (Fluoreszenz-Correlations-Spektroskopie)
Vergleich mit der FCS-Messung unter Berücksichtigung eines
Gauss'schen Strahlprofils liefert
−1
⎛ 4 Dτ ⎞ ⎛ 4 Dτ ⎞
G (τ ) = G (0) ⎜1 + 2 ⎟ ⋅ ⎜1 + 2 ⎟
s ⎠ ⎝
n ⎠
⎝
= G (0) G (τ )
−1
2
(8)
Dabei sind s und n die Parameter des Strahlprofils.
Für die Diffusionszeit τD gilt
s2
τD =
4D
wobei D der Diffusionskoeffizient ist.
(9)
FCS (Fluoreszenz-Correlations-Spektroskopie)
Fluktuation in Anzahl an Flourophoren im Beobachtungsvolumen
FCS (Fluoreszenz-Correlations-Spektroskopie)
Poisson-Verteilung in einem ellipsoidalen
Beobachtungsvolumen für verschiedene
Fluorophore
Simulierte Autokorrelationsfunktion für
Diffusion in 3-Dimensionen von einer
Mischung aus zwei diffundierenden Spezien
FCS (Fluoreszenz-Correlations-Spektroskopie)
Anwendung: Diffusionsanalyse in Abhängigkeit vom Molekulargewicht
Pack CG, Nishimura G, Tamura M, Aoki K, Taguchi H, Yoshida M, Kinjo M. 1999. Analysis of interaction between chaperonin GroEL
and its substrate using fluorescence correlation spectroscopy. Cytometry 36:247–253.
FCS (Fluoreszenz-Correlations-Spektroskopie)
Anwendung: laterale Diffusion in Membranen
Korlach J, Schwille P, Webb WW, Feigenson GW. 1999. Characterization of lipid bilayer phases by confocal microscopy and fluorescence
correlation spectroscopy. Proc Natl Acad Sci USA 96:8461–8466.
FCS (Fluoreszenz-Correlations-Spektroskopie)
Anwendung: Bestimmung molekularer Wechselwirkungen (gebundene Liganden
sind langsamer) Schwille P,
FCS (Fluoreszenz-Correlations-Spektroskopie)
Anwendung: Konformationsänderung von
Polyelektrolyten führt zu unterschiedlichen
Diffusionsgeschwindigkeiten Schwille P,
FCS (Fluoreszenz-Correlations-Spektroskopie)
Anwendung: Protein-Bindung
Pack CG, Nishimura G, Tamura M, Aoki K, Taguchi H, Yoshida M, Kinjo M. 1999. Analysis of interaction between chaperonin GroEL
and its substrate using fluorescence correlation spectroscopy. Cytometry 36:247–253.
FCS (Fluoreszenz-Correlations-Spektroskopie)
Anwendung: 2D-FCS in Membranen
Schwille P, Haupts U, Maiti S, Webb WW. 1999. Molecular dynamics in living cells observed by fluorescence correlation spectroscopy
with one- and two- photon excitation. Biophys J, 77:2251–2265.
Kontrollfragen zur Vorlesung am 21.1.2013
124. Was besagt ein Jablonski-Diagramm
125. Was ist der Unterschied zwischen Fluoreszenz und Phosphoreszenz?
126. Durch welche Mechanismen kann die Fluoreszenz unterdrückt werden?
127. Was ist das Prinzip der konfokalen Mikroskopie?
128. Welche Auflösung lässt sich mit einem konfokalen Mikroskop realisieren?
129. Was ist das Prinzip der Stimulated Emission Depletion (STED) Mikroskopie.
Welche laterale Auflösung kann damit erreicht werden?
130. Was ist eine Correlationsfunktion? Welche Eigenschaften hat sie?
131. Was ist das Prinzip der Fluoreszenz- Correlations- Spektroskopie (FCS)?
Jablonski Diagramm
Alexander Jablonski (1898–1980)
• Fluoreszenz ist die kurzzeitige, spontane Emission von Licht beim Übergang eines
elektronisch angeregten Systems in einen Zustand niedrigerer Energie.
• Im Gegensatz zur Phosphoreszenz sind Fluoreszenzübergänge spinerlaubt, d. h. sie
gehorchen der Auswahlregel ΔS = 0, erfolgen also zwischen Zuständen gleichen Spins.
Fluoreszenzlöschung
Dynamisches Quenching
Für die dynamische Fluoreszenzlöschung gilt folgendes Verhältnis:
F0 τ 0
= = 1 + K d ⋅ [Q ]
F τ
Für die gleiche Konzentration des Quenchers wird bei der dynamischen
Fluoreszenzlöschung bei steigender Temperatur der Wert für die Kd= KSV prinzipiell
größer, d. h. der Quencher löscht bei höherer Temperatur stärker als bei niedrigerer
Temperatur: die Diffusionsgeschwindigkeit des Quenchers - und damit auch der
bimolekulare Ratenkoeffizient k0 - nimmt bei steigender Temperatur zu, wodurch die
Anzahl der Stöße mit dem Fluorophor, und damit die Anzahl der Löschvorgänge,
ebenfalls zunimmt.
K d = τ 0 kq
1 ⎛1 1 ⎞
⋅⎜ − ⎟
kq =
[Q ] ⎝ τ τ 0 ⎠
Dabei ist kq die bimolekulare Quenchingkonstante und τ0 die Lebensdauer des
angeregten Zustandes des Fluorophors in Abwesenheit des Quenchers.
Die bimolekulare Quenchingkonstante kq kann aus der Lebenszeit τ0 des ungestörten
Fluorophors ([Q]=0), und der Lebenszeit τ des Fluorophors für die
Quencherkonzentration [Q]
Dynamisches Quenching
Herleitung
Das Fluorophor F geht durch die Absorption eines Photons in den
angeregten Zustand F* über:
ka
F + hν Absorption → F*
Dabei ist ka die Geschwindigkeitskonstante der Absorption, mit der das Fluorophor vom
Grundzustand in den angeregten Zustand wechselt.
Aus diesem angeregten Zustand kann das Fluorophor über verschiedenen Wege in den
Grundzustand zurückkehren:
kf
(A) F → F + hν Emission
*
kW
(B) F → F + Wärme
*
kq
(C) F +Q → F + Q'
*
In (A) geht das Fluorophor durch die Emission eines Photons in den Grundszustand
über (Fluoreszenz), in (B) geht die Energie des angeregten Zustandes durch andere
Prozesse strahlungslos in Wärme über und in (C) wird der angeregte Zustand durch
den Quencher Q strahlungslos in den Grundzustand überführt. Dabei nimmt der
Quencher die Energie des angeregten Zustandes des Fluorophors auf, symbolisiert
durch Q'. Die drei Reaktionswege (A), (B) und (C) besitzen die jeweiligen
Geschwindigkeitskonstanten kf, kw und kq.
Dynamisches Quenching
Herleitung
Die Fluoreszenz-Quantenausbeute ist definiert als:
Φ=
Ie
Ia
Dabei ist Ie die Anzahl der durch Fluoreszenz emittierten Photonen pro Zeiteinheit und
Ia ist die Anzahl der vom Fluorophor absorbierten Photonen pro Zeiteinheit.
Die Anzahl der emittierten Photonen pro Zeiteinheit bestimmt sich mit (A) aus der
Konzentration an angeregten Fluorophor [F * ] und kf :
I e = k f ⋅ [F* ]
Die Anzahl der absorbierten Photonen lässt sich, analog zu Ie, aus der Konzentration
[F] des Fluorophors F und der Geschwindigkeitskonstante ka bestimmen. Da die
angeregten Fluorophore F* durch die oben genannten Prozesse (A), (B) und (C) wieder
in den Grundzustand zurückkehren, sind die beiden Prozesse Absorption und Verlust
der Anregungsenergie durch die drei Prozesse (A), (B) und (C) im
Gleichgewichtszustand gleich groß:
I a = ka ⋅ [F] = k f ⋅ [F* ] + kW ⋅ [F* ] + kq ⋅ [ Q ] ⋅ [F* ]
Dynamisches Quenching
Herleitung
Durch Ersetzen von Ie und Ia wird die Quantenausbeute der Fluoreszenz nach Kürzung
um [F * ] zu:
k
Φ=
f
k f + kW + kq ⋅ [ Q ]
In der Abwesenheit des Quenchers - d.h. [Q] = 0 - ist die Quantenausbeute gleich:
kf
Φ0 =
k f + kW
Das Verhältnis (Φ0 / Φ) ist gleich:
kq ⋅ [ Q ]
Φ 0 k f + kW + kq ⋅ [ Q ]
=
=1+
Φ
k f + kW
kf + k
Die Fluoreszenzlebensdauer τ des angeregten Zustandes in Abwesenheit des Quencher
ist die inverse Summe der beiden Reaktionsgeschwindigkeiten:
τ=
1
k f + kW + kq ⋅ [ Q ]
Dynamisches Quenching
Herleitung
In der Abwesenheit des Quenchers - d.h. [Q] = 0 - ist die Fluoreszenzlebensdauer gleich:
1
τ0 =
k f + kW
Wird in das Verhältnis (Φ0/Φ) die Fluoreszenzlebenszeit τ0 eingesetzt, so sich ergibt
nach Umstellung die Gleichung:
Φ0
= 1 + τ 0 kq ⋅ [ Q ]
Φ
Wird dagegen τ und τ0 in das Verhältnis (Φ0/Φ) eingesetzt so ergibt sich:
Φ0 τ 0
=
Φ τ
Wegen der direkten Proportionalität der Quantenausbeute Φ der Fluoreszenz zur
Intensität F der Fluoreszenz folgt:
Φ 0 F0
= = 1 + τ 0 kq ⋅ [ Q ]
Φ F
und
F0 τ 0
=
F τ
Fluoreszenzlöschung
Statisches Quenching
Bei der statischen Fluoreszenzlöschung bildet sich aus dem Fluorophor F und dem
Quencher Q ein Komplex FQ, der selbst nicht fluoresziert. Dies lässt sich anhand einer
chemischen Gleichung beschreiben:
F+Q U FQ
Das chemisches Gleichgewicht Ks zwischen dem Fluorophor, dem Quencher und dem
Komplex aus Fluororphor und Quencher, wird nach dem Massenwirkungsgesetz
gebildet und ist gleich der Stern-Volmer-Konstante KSV:
K SV = K S
FQ ]
[
=
[ F][Q]
Dabei ist [FQ] die Konzentration des Komplexes aus Fluorophor und Quencher, [F] die
Konzentration des ungebundenen Fluorophors und [Q] die Konzentration des
ungebundenen Quenchers. Bei der statischen Fluoreszenzlöschung ist das Verhältnis
aus τ0 und τ, im Gegensatz zur dynamischen Fluoreszenzlöschung, gleich eins, da bei
der statischen Fluoreszenzlöschung lediglich die Anzahl der anregbaren Fluorophore
reduziert wird.
τ0
=1
τ
Statisches Quenching
Herleitung
Die Assoziationskonstante Ks lautet:
KS
FQ ]
[
=
[ F][Q]
Die Gesamtkonzentration [F]0 des Fluorophors setzt sich additiv aus der
Konzentration des ungebundenen Fluorophors [F] und der Konzentration des mit
dem Quencher gebundenen Fluorophors [FQ] zusammen:
[ F] = [ F] + [ FQ]
0
Wird diese Gleichung nach [FQ] umgestellt und dann in die Gleichung der
Assoziationskonstante Ks eingesetzt, ergibt sich:
F]
[
1
=
−
[ F][Q] [Q]
0
KS
Diese Gleichung wird nun nach
([F]0 / [F]) umgestellt:
[ F]
[ F]
= 1 + K S ⋅ [Q]
[ ]
[ F]
=
0
Wegen der direkten Proportionalität der Fluoreszenzintensität F des Fluorophors zu
seiner Konzentration [F] folgt:
F
0
F0
= 1 + K S ⋅ [Q]
F
Franck-Condon-Prinzip
• Das Franck-Condon-Prinzip beruht auf der Tatsache,
dass der Wechsel von Elektronen zwischen
verschiedenen Zuständen in ca. 10−15 Sekunden
stattfindet, so dass sich der Kernabstand während der
Anregung nicht ändert (Kernschwingungsperiode ca.
10−13 s).
• Die hohe Geschwindigkeit des elektronischen
Übergangs gegenüber der Kernbewegung wird durch
die geringe Masse der Elektronen ermöglicht (analog
zur Born-Oppenheimer-Näherung).
• Wenn ein Molekül nun von einem elektronischen
Zustand in einen anderen übergeht, so ist dieser
Übergang umso wahrscheinlicher, je mehr die
Vibrations-Wellenfunktionen der beiden Zustände
zueinander kompatibel sind.