FLUORESZENZSPEKTROSKOPIE

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FLUORESZENZSPEKTROSKOPIE
Biophysik Vorlesung
05.02.2015.
Gábor Talián
ENTWURF
• Lumineszenz
• Fluoreszenzvorgang
• Fluorimeter
• Charakterisierung der Fluoreszenz
• Fluorophore, Biolumineszenz
Lumineszenz
Elektronenanregung
Energieüberfluß
Der wird nicht konserviert: Energieabgabe
z.B. Photonenemission = LUMINESZENZ
ihr Grund ist nicht die hohe Temperatur des Körpers
(„kalte Emission”
Temperaturstrahlung)
S3
S3
interner Übergang/
innere Umwandlung
S2
strahlungslos
S2
Schwingungsrelaxation
S1
S1
S0
S0
e- + hν1 → e-* → e- + hν2
ν1 = ν2
Fluoreszenz
∙
FLUORESZENZVORGANG
1.) Das Elektron eines Moleküls in S0 Grundzustand wird mit ∙ angeregt.
S3
2.) Es gelangt in S1 Zustand (selten in S2 [Sn]). Umwandlungsdauer : ~ 10-15
s
3.) Die Photonenabsorption verändert den Spinzustand nicht.
4.) Das System strebt nach dem Grundzustand.
5.) Das angeregte Elektron wird vom Sn Zustand auf S1 relaxier durch
strahlunslosen internen Übergang / innere Umwandlung.
Die freigesetzte Energie wird als Vibration verteilt.
②
S2
①
S1
⑤
⑥
⑦
6.) Das Elektron gelangt immer auf das niedrigste Vibrationsniveau des
ersten angeregten Zustands (S1): Kasha-Regel.
Die freigesetzte Energie wird mit der Umgebung als Wärme getauscht:
Vibrations- oder termische Relaxation.
Umwandlungsdauer von Schritten 5-6 : ~ 10-14 – 10-11 s
7.) Das Elektron von dem ersten angeregten Zustand (S1) kehrt
in den Grundzustand (S0) zurück durch radiative Relaxation,
d. h., Photonenemission: Lumineszenz
Umwandlungsdauer : ~ 10-9 – 10-7 s
S0
Michael Kasha, USA, 1920-2013
Anregunsweise
Typ der Lumineszenz
Photonenabsorption
Chemische Reaktion
Wärme
Ladungszufuhr
Hochenergetisierte Teilchenstrahlung
Reibung
Schallwelle
Photolumineszenz
Chemilumineszenz, Biolumineszenz
Termolumineszenz
Elektrolumineszenz
Radiolumineszenz
Tribolumineszenz
Sonolumineszenz
Angeregter Zustand
Radiative Relaxation
Erster angeregter Singlett
Fluoreszenz, verspätete Fluoreszenz
Niedrigster Triplett
Phosphoreszenz
Übergang in S0
A.) FLUORESZENZ: in einem Schritt
Umwandlungsdauer : ~ 10-9 – 10-7 s
B.) PHOSPHORESZENZ: strahlungloser Übergang in
den Triplettzustand (T1) – Intersystem crossing
Umwandlungsdauer : ~ 10-10 – 10-8 s
Das angeregte Elektron von T1 kehrt in den
Grundzustand (S0) zurück durch radiative Relaxation,
d. h., Photonenemission: Lumineszenz
Sehr kleine Wahrscheinlichkeit wegen der
„verbotenen” Spinumwandlung
Umwandlungsdauer : ~ 10-6 – 103 s
S2
C.) VERSPÄTETE FLUORESZENZ: Das Elektron von T1
gelangt in den ersten angeregten Zustand (S1)
durch termische Anregung
S1
C
A
S0
T1
gleicher Spinzustand
B
entgegengesetzter
Spinzustand
Messung der
Fluoreszenz:
Der Fluorimeter
Die Küvette
•
•
•
•
•
•
•
Durchschaulich
Nichtfluoreszierender Stoff
Glas im sichtbaren Bereich
Spezialglas für λ < 300 nm
Quarz für Absorption
(polarisierend!)
Spezialquarz für Fluoreszenz
Durchflußküvette
• Vorteile der Verwendung von Fluoreszenz:
– Lässt sich gut detektieren meßbar auch bei kleinen Konzentrationen
– Empfindlich auf die Umgebung und Wechselvirkungen
• Parameter der Lumineszenzstoffe
– Absorptions(Anregungs)- und Emmissionsspektrum
– Quantenausbeute
– Lebensdauer des angeregten Zustands
– Polarisation/Anisotropie
Emissonsspektrum
∆JE / ∆λ (λ)
SPEKTRA
ANREGUNG
Bei einer festgestellten
Emissionswellenlänge
(höchste Intensität)
Intensität als Funktion der
Anregungswellenlänge
Übergänge vom Grundzustand
FLUORESZENZ
Bei einer festgestellten
Absorptionswellenlänge
(höchste Intensität)
Intensität als Funktion der
Emissionswellenlänge
Übergänge vom niedrigsten
Schwingungsniveau des ersten
angeregten Zustands
S1 S0
PHOSPHORESZENZ
Bei einer festgestellten
Absorptionswellenlänge
(höchste Intensität)
Intensität als Funktion der
Emissionswellenlänge
Übergänge vom niedrigsten
Schwingungsniveau des ersten
Triplettzustands
T 1 S0
S0 SN
Stokes-shift (Verschiebung)
George Gabriel Stokes,
ENG, 1819-1903
Spiegelsymmetrie
Anregung ≠ AbsorpSon !
QUANTENAUSBEUTE
Φ=
<1
FLUORESZENZLEBENSDAUER
Intensität
∙ ∙ = ∙ Lebensdauer
Anregungsimpuls
Fluoreszenz
Φ = ∙ Zeit
FLUORESZENZFARBSTOFFE
Spezifische Markierungen an Molekülen
Kromophor - chemische Substanz geeignet zur Lumineszenz
Fluorophor - chemische Substanz geeignet zur Fluoreszenz
Native/Innere/Intrinsic Fluorophore - aromatische Aminosäuren
kein Bedarf das Protein zu verändern
Äußere/Extrinsic Fluorophore
IAEDANS
IAF
FITC
Fluoreszein
Toxine
Makrophag-Markierung
Aktin: Phalloidin-Alexa 568 (rot)
Zellkerne: DAPI (lila)
Streptococcus aureus (grün)
Falloidin
B-Skorpionentoxin
A-Bungarotoxin
Antikörper
Oder fluoreszierende Markierung
Maus, embryonelle Fibroblastzelle, Interphase
Tubulin: polyklonale Antikörper-Markierung (grün)
DNS : blau
BIOLUMINESZENZ
Leuchtkäfer (Lampyris noctiluca)
Siphonophora; Praya dubia
Luciferin + ATP → Luciferil-adenilat + PPi
Luciferil-adenilat + O2 → Peroxiluciferin + AMP
Peroxiluciferin → Oxiluciferin + hν
Ctenophora; Bathocyroë
Green fluorescent protein (GFP)
Shimomura, Johnson, Saiga (1962)
Nobel-Preis in 2008
Aequorea victoria
Aequorin (22 kDa)
Green fluorescent protein (27 kDa)
relative
Fluoreszenz
GFP Derivate
(ECFP,YFP,..)
relative
Fluoreszenz
Wellenlänge (nm)
Wellenlänge (nm)
ZUSAMMENFASSUNG
• Lumineszenz - Lichtausstrahlung nach nicht-termischer Anregung
• Übergänge zwischen Elektronenenergieniveaus; Kasha-Regel
• Fluoreszenz und Phosphoreszenz; Singulett- und Triplettzustände
• Fluorimeter
• Anregungs- und Emissions(Fluoreszenz-)spektra; Stokes-shift
• Quantenausbeute
• Lebensdauer, Fluoreszenzabklang
• Fluorophore, Biolumineszenz, Verwendungen
Danke für Ihre Aufmerksamkeit!
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