FLUORESZENZSPEKTROSKOPIE
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FLUORESZENZSPEKTROSKOPIE Biophysik Vorlesung 05.02.2015. Gábor Talián ENTWURF • Lumineszenz • Fluoreszenzvorgang • Fluorimeter • Charakterisierung der Fluoreszenz • Fluorophore, Biolumineszenz Lumineszenz Elektronenanregung Energieüberfluß Der wird nicht konserviert: Energieabgabe z.B. Photonenemission = LUMINESZENZ ihr Grund ist nicht die hohe Temperatur des Körpers („kalte Emission” Temperaturstrahlung) S3 S3 interner Übergang/ innere Umwandlung S2 strahlungslos S2 Schwingungsrelaxation S1 S1 S0 S0 e- + hν1 → e-* → e- + hν2 ν1 = ν2 Fluoreszenz ∙ FLUORESZENZVORGANG 1.) Das Elektron eines Moleküls in S0 Grundzustand wird mit ∙ angeregt. S3 2.) Es gelangt in S1 Zustand (selten in S2 [Sn]). Umwandlungsdauer : ~ 10-15 s 3.) Die Photonenabsorption verändert den Spinzustand nicht. 4.) Das System strebt nach dem Grundzustand. 5.) Das angeregte Elektron wird vom Sn Zustand auf S1 relaxier durch strahlunslosen internen Übergang / innere Umwandlung. Die freigesetzte Energie wird als Vibration verteilt. ② S2 ① S1 ⑤ ⑥ ⑦ 6.) Das Elektron gelangt immer auf das niedrigste Vibrationsniveau des ersten angeregten Zustands (S1): Kasha-Regel. Die freigesetzte Energie wird mit der Umgebung als Wärme getauscht: Vibrations- oder termische Relaxation. Umwandlungsdauer von Schritten 5-6 : ~ 10-14 – 10-11 s 7.) Das Elektron von dem ersten angeregten Zustand (S1) kehrt in den Grundzustand (S0) zurück durch radiative Relaxation, d. h., Photonenemission: Lumineszenz Umwandlungsdauer : ~ 10-9 – 10-7 s S0 Michael Kasha, USA, 1920-2013 Anregunsweise Typ der Lumineszenz Photonenabsorption Chemische Reaktion Wärme Ladungszufuhr Hochenergetisierte Teilchenstrahlung Reibung Schallwelle Photolumineszenz Chemilumineszenz, Biolumineszenz Termolumineszenz Elektrolumineszenz Radiolumineszenz Tribolumineszenz Sonolumineszenz Angeregter Zustand Radiative Relaxation Erster angeregter Singlett Fluoreszenz, verspätete Fluoreszenz Niedrigster Triplett Phosphoreszenz Übergang in S0 A.) FLUORESZENZ: in einem Schritt Umwandlungsdauer : ~ 10-9 – 10-7 s B.) PHOSPHORESZENZ: strahlungloser Übergang in den Triplettzustand (T1) – Intersystem crossing Umwandlungsdauer : ~ 10-10 – 10-8 s Das angeregte Elektron von T1 kehrt in den Grundzustand (S0) zurück durch radiative Relaxation, d. h., Photonenemission: Lumineszenz Sehr kleine Wahrscheinlichkeit wegen der „verbotenen” Spinumwandlung Umwandlungsdauer : ~ 10-6 – 103 s S2 C.) VERSPÄTETE FLUORESZENZ: Das Elektron von T1 gelangt in den ersten angeregten Zustand (S1) durch termische Anregung S1 C A S0 T1 gleicher Spinzustand B entgegengesetzter Spinzustand Messung der Fluoreszenz: Der Fluorimeter Die Küvette • • • • • • • Durchschaulich Nichtfluoreszierender Stoff Glas im sichtbaren Bereich Spezialglas für λ < 300 nm Quarz für Absorption (polarisierend!) Spezialquarz für Fluoreszenz Durchflußküvette • Vorteile der Verwendung von Fluoreszenz: – Lässt sich gut detektieren meßbar auch bei kleinen Konzentrationen – Empfindlich auf die Umgebung und Wechselvirkungen • Parameter der Lumineszenzstoffe – Absorptions(Anregungs)- und Emmissionsspektrum – Quantenausbeute – Lebensdauer des angeregten Zustands – Polarisation/Anisotropie Emissonsspektrum ∆JE / ∆λ (λ) SPEKTRA ANREGUNG Bei einer festgestellten Emissionswellenlänge (höchste Intensität) Intensität als Funktion der Anregungswellenlänge Übergänge vom Grundzustand FLUORESZENZ Bei einer festgestellten Absorptionswellenlänge (höchste Intensität) Intensität als Funktion der Emissionswellenlänge Übergänge vom niedrigsten Schwingungsniveau des ersten angeregten Zustands S1 S0 PHOSPHORESZENZ Bei einer festgestellten Absorptionswellenlänge (höchste Intensität) Intensität als Funktion der Emissionswellenlänge Übergänge vom niedrigsten Schwingungsniveau des ersten Triplettzustands T 1 S0 S0 SN Stokes-shift (Verschiebung) George Gabriel Stokes, ENG, 1819-1903 Spiegelsymmetrie Anregung ≠ AbsorpSon ! QUANTENAUSBEUTE Φ= <1 FLUORESZENZLEBENSDAUER Intensität ∙ ∙ = ∙ Lebensdauer Anregungsimpuls Fluoreszenz Φ = ∙ Zeit FLUORESZENZFARBSTOFFE Spezifische Markierungen an Molekülen Kromophor - chemische Substanz geeignet zur Lumineszenz Fluorophor - chemische Substanz geeignet zur Fluoreszenz Native/Innere/Intrinsic Fluorophore - aromatische Aminosäuren kein Bedarf das Protein zu verändern Äußere/Extrinsic Fluorophore IAEDANS IAF FITC Fluoreszein Toxine Makrophag-Markierung Aktin: Phalloidin-Alexa 568 (rot) Zellkerne: DAPI (lila) Streptococcus aureus (grün) Falloidin B-Skorpionentoxin A-Bungarotoxin Antikörper Oder fluoreszierende Markierung Maus, embryonelle Fibroblastzelle, Interphase Tubulin: polyklonale Antikörper-Markierung (grün) DNS : blau BIOLUMINESZENZ Leuchtkäfer (Lampyris noctiluca) Siphonophora; Praya dubia Luciferin + ATP → Luciferil-adenilat + PPi Luciferil-adenilat + O2 → Peroxiluciferin + AMP Peroxiluciferin → Oxiluciferin + hν Ctenophora; Bathocyroë Green fluorescent protein (GFP) Shimomura, Johnson, Saiga (1962) Nobel-Preis in 2008 Aequorea victoria Aequorin (22 kDa) Green fluorescent protein (27 kDa) relative Fluoreszenz GFP Derivate (ECFP,YFP,..) relative Fluoreszenz Wellenlänge (nm) Wellenlänge (nm) ZUSAMMENFASSUNG • Lumineszenz - Lichtausstrahlung nach nicht-termischer Anregung • Übergänge zwischen Elektronenenergieniveaus; Kasha-Regel • Fluoreszenz und Phosphoreszenz; Singulett- und Triplettzustände • Fluorimeter • Anregungs- und Emissions(Fluoreszenz-)spektra; Stokes-shift • Quantenausbeute • Lebensdauer, Fluoreszenzabklang • Fluorophore, Biolumineszenz, Verwendungen Danke für Ihre Aufmerksamkeit!
