fluoreszenzspektroskopie

FLUORESZENZSPEKTROSKOPIE
Biophysik Vorlesung
Gábor Talián
ENTWURF
• Lumineszenz
• Fluoreszenzvorgang
• Fluorimeter
• Charakterisierung der Fluoreszenz
• Fluorophore, Biolumineszenz
Lumineszenz
Elektronenanregung
Energieüberfluß
Der wird nicht konserviert: Energieabgabe
z.B. Photonenemission = LUMINESZENZ
ihr Grund ist nicht die hohe Temperatur des Körpers
(„kalte Emission”
Temperaturstrahlung)
Anregunsweise
Typ der Lumineszenz
Photonenabsorption
Chemische Reaktion
Wärme
Ladungszufuhr
Hochenergetisierte Teilchenstrahlung
Reibung
Schallwelle
Photolumineszenz
Chemilumineszenz, Biolumineszenz
Termolumineszenz
Elektrolumineszenz
Radiolumineszenz
Tribolumineszenz
Sonolumineszenz
Angeregter Zustand
Radiative Relaxation
Erster angeregter Singlett
Fluoreszenz, verspätete Fluoreszenz
Niedrigster Triplett
Phosphoreszenz
S3
S3
interner Übergang/
innere Umwandlung
S2
strahlungslos
S2
Schwingungsrelaxation
S1
S1
S0
S0
e- + hν1 → e-* → e- + hν2
ν1 = ν2
Fluoreszenz
∙
FLUORESZENZVORGANG
1.) Das Elektron eines Moleküls in S0 Grundzustand wird mit ∙ angeregt.
S3
2.) Es gelangt in S1 Zustand (selten in S2 [Sn]). Umwandlungsdauer : ~ 10-15 s
Die Photonenabsorption verändert den Spinzustand nicht.
Das System strebt nach dem Grundzustand.
3.) Das angeregte Elektron wird vom Sn Zustand auf S1 relaxier durch
strahlunslosen internen Übergang / innere Umwandlung.
Die freigesetzte Energie wird als Vibration verteilt.
②
S2
①
S1
③
④
⑤
S0
4.) Das Elektron gelangt immer auf das niedrigste Vibrationsniveau des
ersten angeregten Zustands (S1): Kasha-Regel.
Die freigesetzte Energie wird mit der Umgebung als Wärme getauscht:
Vibrations- oder termische Relaxation.
Umwandlungsdauer von Schritten 3-4 : ~ 10-14 – 10-11 s
5.) Das Elektron von dem ersten angeregten Zustand (S1) kehrt
in den Grundzustand (S0) zurück durch radiative Relaxation,
d. h., Photonenemission: Lumineszenz
Umwandlungsdauer : ~ 10-9 – 10-7 s
Michael Kasha, USA, 1920-2013
Übergang in S0
A.) FLUORESZENZ: in einem Schritt
Umwandlungsdauer : ~ 10-9 – 10-7 s
B.) PHOSPHORESZENZ: strahlungloser Übergang in
den Triplettzustand (T1) – Intersystem crossing
Umwandlungsdauer : ~ 10-10 – 10-8 s
Das angeregte Elektron von T1 kehrt in den
Grundzustand (S0) zurück durch radiative Relaxation,
d. h., Photonenemission: Lumineszenz
Sehr kleine Wahrscheinlichkeit wegen der
„verbotenen” Spinumwandlung
Umwandlungsdauer : ~ 10-6 – 103 s
S2
C.) VERSPÄTETE FLUORESZENZ: Das Elektron von T1
gelangt in den ersten angeregten Zustand (S1)
durch termische Anregung
S1
C
A
S0
T1
gleicher Spinzustand
B
entgegengesetzter
Spinzustand
Messung der
Fluoreszenz:
Der Fluorimeter
Die Küvette
•
•
•
•
•
•
•
Durchschaulich
Nichtfluoreszierender Stoff
Glas im sichtbaren Bereich
Spezialglas für λ < 300 nm
Quarz für Absorption
(polarisierend!)
Spezialquarz für Fluoreszenz
Durchflußküvette
• Vorteile der Verwendung von Fluoreszenz:
– Lässt sich gut detektieren meßbar auch bei kleinen Konzentrationen
– Empfindlich auf die Umgebung und Wechselvirkungen
• Parameter der Lumineszenzstoffe
– Anregungs- und Emmissionsspektrum
– Quantenausbeute
– Lebensdauer des angeregten Zustands
– Polarisation/Anisotropie
Emissonsspektrum
∆JE / ∆λ (λ)
SPEKTRA
ANREGUNG
Bei einer festgestellten
Emissionswellenlänge
(höchste Intensität)
Intensität als Funktion der
Anregungswellenlänge
Übergänge vom Grundzustand
FLUORESZENZ
Bei einer festgestellten
Absorptionswellenlänge
(höchste Intensität)
Intensität als Funktion der
Emissionswellenlänge
Übergänge vom niedrigsten
Schwingungsniveau des ersten
angeregten Zustands
S1 S0
PHOSPHORESZENZ
Bei einer festgestellten
Absorptionswellenlänge
(höchste Intensität)
Intensität als Funktion der
Emissionswellenlänge
Übergänge vom niedrigsten
Schwingungsniveau des ersten
Triplettzustands
T 1 S0
S0 SN
Stokes-shift (Verschiebung)
George Gabriel Stokes,
ENG, 1819-1903
Spiegelsymmetrie
Anregung ≠ AbsorpSon !
QUANTENAUSBEUTE
Φ=
<1
Intensität
FLUORESZENZLEBENSDAUER
Lebensdauer
Anregungsimpuls
Fluoreszenz
Zeit
∙ ∙
= ∙ FLUORESZENZFARBSTOFFE
Spezifische Markierungen an Molekülen
Kromophor - chemische Substanz geeignet zur Lumineszenz
Fluorophor - chemische Substanz geeignet zur Fluoreszenz
Native/Innere/Intrinsic Fluorophore - aromatische Aminosäuren
kein Bedarf das Protein zu verändern
Äußere/Extrinsic Fluorophore
IAEDANS
IAF
FITC
Fluoreszein
Toxine
Makrophag-Markierung
Aktin: Phalloidin-Alexa 568 (rot)
Zellkerne: DAPI (lila)
Streptococcus aureus (grün)
Falloidin
B-Skorpionentoxin
A-Bungarotoxin
Antikörper
Oder fluoreszierende Markierung
Maus, embryonelle Fibroblastzelle, Interphase
Tubulin: polyklonale Antikörper-Markierung (grün)
DNS : blau
BIOLUMINESZENZ
Leuchtkäfer (Lampyris noctiluca)
Siphonophora; Praya dubia
Luciferin + ATP → Luciferil-adenilat + PPi
Luciferil-adenilat + O2 → Peroxiluciferin + AMP
Peroxiluciferin → Oxiluciferin + hν
Ctenophora; Bathocyroë
Green fluorescent protein (GFP)
Shimomura, Johnson, Saiga (1962)
Nobel-Preis in 2008
Aequorea victoria
Aequorin (22 kDa)
Green fluorescent protein (27 kDa)
relative
Fluoreszenz
GFP Derivate
(ECFP,YFP,..)
relative
Fluoreszenz
Wellenlänge (nm)
Wellenlänge (nm)
ZUSAMMENFASSUNG
• Lumineszenz - Lichtausstrahlung nach nicht-termischer Anregung
• Fluoreszenz und Phosphoreszenz (Übergänge zwischen Elektronenenergieniveaus, Kasha-Regel, Singulett- und Triplettzustände)
• Fluorimeter
• Anregungs- und Emissions(Fluoreszenz-)spektra; Stokes-shift
• Quantenausbeute, Lebensdauer, Fluoreszenzabklang
• Fluorophore, Biolumineszenz, Verwendungen
Danke für Ihre Aufmerksamkeit!
Rot fluoreszierende Anemone bei Tageslicht
Seeigel
Anemonen
1955 wurde das später „Green Fluorescent Protein“ (GFP) getaufte
Pigment erstmals beschrieben und als Protein erkannt.
1962 wurde es erstmals aus der Qualle „Aequorea victoria“ isoliert.
2008 wurde Osamu Shimomura, Martin Chalfie und Roger Tsien
gemeinsam der Nobelpreis für Chemie verliehen „für die Entdeckung und
Entwicklung des Green Fluorescent Protein, GFP“
Green Fluorescent Protein (GFP)
Drsophila with GFP
Transmission of a GFP transgene directed by actin
promoter from a transgenic mother to one of her 3 pups.
Fluoreszende Biomoleküle (Sonden)
Anwendungsbeispiele :
1. Aromatische Aminosäuren: Tryptophan, Tyrosin, Phenyl-alanin
2. Proteinen mit aromatische Aminosäuren (Absorption 280 nm, Emission 330-350 nm )
3. GFP (YFP, RFP…) Mit geeigneten mikroskopischen Verfahren, wie z. B. der konfokalen
Fluoreszenzmikroskopie, lassen sich damit biologische Vorgänge innerhalb der Zellen
sichtbar machen.
4. Porphyrinen (Häm and Chlorophyll) Stoffwechselerkrankungen, Photosynteseaktivitat
5. Vitamin A (Carotinoide)
6. Einige Steroide
7. Künstliche Fluorophore
- Ethidiumbromid (Bindung an DNA)
- Extrinsische Fluorophore
Polarlicht ist auch Fluoreszenz
bei dem die Anregung der Luftmoleküle in erster Linie durch die Teilchen des
Sonnenwindes erfolgt, bei dem infolge der Wechselwirkung mit dem Sonnenwind
Moleküle Licht ausstrahlen.
Green light … the northern lights in Canada. Photograph: Daniel J Cox/Corbis
a geomagnetic storm caused Northern Lights to be visible in Europe at unusually low
latitudes.
a photo taken from the International Space Station