Functional Genomics in Biotechnologie, Land- und Forstwirtschaft Zeitaufgelöste UV-Vis, Fluoreszenz und CirculardichroismusSpektroskopie Christian Obinger Molekülspektroskopie 10- -3 Zeitaufgelöste UV-Vis, Fluoreszenz und Circulardichroismus-Spektroskopie PiStar-180 UV-Vis, Fluoreszenz und CD Multi-mixing Stopped-flow Spektrometer von Applied Photophysics Zeitauflösung: Stopped-flow Spektroskopie Konventionelle Stopped-flow Technik: A+BC Detektion ab 1,5 ms: Sample-handling unit UV-Vis (Monochromator, Dioden-Array) Fluoreszenz Circulardichroismus Zeitauflösung: Stopped-flow Spektroskopie Sequentielle Stopped-flow Technik (Multi-mixing) A + B C (ageing: ms - s) D+E Detektion ab 1,5 ms: UV-Vis (Monochromator, Dioden-Array) Fluoreszenz Circulardichroismus Circulardichroismus-Spektroskopie Unter Circulardichroismus versteht man den Unterschied in der Lichtabsorption von rechtsund links- polarisiertem Licht. Die meisten Biomoleküle zeigen Circulardichroismus! Elliptizität 180 250 Circulardichroismus-Spektroskopie 180 – 250 nm Sekundärstruktur von Peptiden und Proteinen 250 – 340 nm Aussagen zur Tertiärstruktur von Proteinen CD-Signale von aromatischen Aminosäuren (Phe, Tyr, Trp) und Disulfidbindungen (Cystin) 180 – 320 nm Aussagen zu Struktur von DNA und RNA CD-Signale von den Purin- und Pyrimidin-Basen Circulardichroismus-Spektroskopie CD-Spektren verschiedener β-Proteine + Mo - Mo CD-Spektren des Mo-sensing protein aus E. coli. Circulardichroismus-Spektroskopie 350 – 800 nm Strukturelle Information über aktives Zentrum von Proteinen bzw. Enzymen CD-Signale von prosthetischen Gruppen (z.B. Häm oder Flavin oder Metall), Cofaktoren (z.B. NAD(P)H) oder Liganden. CD-Spektrum eines Flavocytochroms Fette Linie: Intaktes Flavocytochrom Strichlierte Linie: Stöchiometrische Mischung aus getrennt exprimiertem Cytochromund Flavoprotein Zeitaufgelöste UV-Vis, Fluoreszenz und Circulardichroismus-Spektroskopie ANWENDUNGEN Beispiele: n Aufklärung von Enzymmechanismen Identifizierung von Enzymintermediaten Bestimmung von Geschwindigkeitsskonstanten Bestimmung thermodynamischer Größen (Aktivierungsenergie, Enthalpie, Entropie, Freie Enthalpie, Gleichgewichtskonstanten, Reduktionspotentiale usw.) Zeitaufgelöste UV-Vis, Fluoreszenz und Circulardichroismus-Spektroskopie ANWENDUNGEN Beispiele: o Aufklärung der Wechselwirkung Ligand mit Protein/Enzym bzw. DNA/RNA Beispiele: Ligand-Rezeptorwechselwirkung Ligand-Prosthetische Gruppe Ligand-DNA p Aufklärung der Wechselwirkung Protein-DNA Zeitaufgelöste UV-Vis, Fluoreszenz und Circulardichroismus-Spektroskopie ANWENDUNGEN Beispiele: q Strukturinformation von Peptiden/Proteinen bzw. DNA/RNA Rekombinante Proteine Proteinengineering Membranproteine Kinetik der Proteinfaltung (Faltungsintermediate) Qualitätskontrolle von Biomolekülen (thermodyn. Parameter)