Fluoreszenzmikroskopie - Uni

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Fluoreszenzmikroskopie
Fluoreszenz
Emission eines Photons beim Übergang eines
Elektrons von einem höheren in ein tieferes
Energieniveau eines Moleküls nach Absorption
von Licht kurzer Wellenlänge (innerhalb von
wenigen Nanosekunden)
Prinzipien der Fluoreszenz
1. Absorption von kurzwelligem Licht
2. Emission von Licht größerer Wellenlänge
Differenz zwischen Wellenlängen:
Stokes- Differenz
1. Absorption
•
•
Erregung (Excitation)
Elektronen der fluoreszierenden Moleküle absorbieren
Photonen (durch Anregungslicht) und gelangen auf höheres
Energieniveau
Elektron erreicht höheres Orbital, befindet sich in „excited
state“
2. Emission
•
•
•
Ausstrahlung
Elektronen können sich nicht lange auf
Energieniveau halten
Fallen auf ursprüngliches Energieniveau zurück
Energie wird freigesetzt Æ Emission
Fluoreszenzlicht
Fluoreszenz
Einzelne Stadien: S0, S1, S2 Æ unterschiedliche Spins
Molekül in Singulettzustand
Phosphoreszenz: Elektronen in metastabilem
Energieniveau Æ gleiche Spins
Molekül in Triplettzustand
Verweildauer: Millisekunden bis Stunden
• Energie wird nicht nur als Licht freigesetzt
Æ Energieverlust
• Emittiertes Licht energieärmer als Anregungslicht
Energieärmer Lichtstrahlung besitzt größere
Wellenlänge
Andere Lichtfarbe als energiereiche
Lichtstrahlung
Emittiertes Licht besitzt
20-50nm größere Wellenlängen als Anregungslicht
Stokes- Differenz
Mit Filtern kann das helle Anregungslicht und das
schwache Fluoreszenzlicht im Strahlengang des
Mikroskops getrennt werden:
Nur die fluoreszierenden Objekte werden noch betrachtet
Fluoreszenzmikroskop
• Licht aus Xenon- oder
Quecksilberdampflampe
• Anregungsfilter
• Dichromischer Spiegel
• Emissionsfilter
Anregungsfilter
• Filtert die für die
Anregung des
Fluorochroms
geeignete Wellenlänge heraus
Dichromatischer Spiegel
•
•
Reflektiert Licht auf Präparat
Besitzt kritische Wellenlänge:
1.
Licht mit geringer Wellenlänge
wird reflektiert
Licht mit großer Wellenlänge
wird durchgelassen
2.
kurzwelliges Licht gelangt zum Präparat
langwelliges Licht gelangt zum Auge
starkes Beleuchtungslicht kann von
Fluoreszenzlicht getrennt werden
Emissionsfilter
• Transmittiert das
Fluoreszenzlicht
Bleaching
•
•
•
•
•
•
•
•
Genereller Begriff für alle Prozesse, die Abnahme von
Fluoreszenzsignal fördern
Möglichkeit zu fluoreszieren wird inaktiviert/heruntergesetzt
Fluoreszenzsignal ist nicht so hell wie erwartet (erhofft)
Übergang in den Triplett-Zustand
Triplett-Zustand kann unter Phosphoreszenz verlassen werden
Dies dauert lange, in der Zwischenzeit können Triplett-Triplett
Übergänge erfolgen
In dieser Zeit findet keine Licht-Emission statt
Photochemische Reaktionen können zu Phototoxizität führen
Vermeidung Bleaching:
•
•
Nicht mehr Licht als absolut notwendig benutzen
Fluoreszenzien bei Nichtgebrauch in Dunkelheit aufbewahren
Fluoreszierende Moleküle
• Aromatische Ringsysteme mit delokalisierten Elektronen
in bindenden π Orbitalen
Immunfluoresszenz
GFP
Zurzeit am gebräuchlichsten
bei der Proteinmarkierung
GFP
G F
reen
P
luorescent
•
Aequorea victoria
– bereits 1962 isoliert
– 1992 erste Klonierung
– 1994 Einsatz als Reporter-Gen
•
wandelt das blaue Licht der
Aequoporine (Chemolumineszenz) in
grün fluoreszierendes Licht um
(Biolumineszenz)
rotein
Struktur
•
25-30kDa Polypeptid
•
Absorption: 396nm und 475nm (ΔE!)
– Anregung durch blaues Licht
•
Emissionsmaximum bei 508nm
•
Eigentliches Fluorophor bildet
Tripeptidsequenz Ser65-Tyr66-Gly67
Æeingekapselt in der sog. „β-Can“
(auch wichtig für Fluoreszenz)
Im Gegensatz zu anderen natürlichen fluoreszierenden
Proteinen benötigt GFP keine Cofaktoren, da das
Chromophor obligater Bestandteil ist!
Chromophor: Farbgebender, fluoreszierender
Teil des Proteins mit anregbaren Elektronen
Mechanismus der
Chromophorbildung
1.
Nucleophiler Angriff der Amidgruppe
(R-C=O-NH-R) von Glycin (67) auf die
Carbonylgruppe (RR-C=O) der AS an
Position 65
ÆZyklisierung
2.
Es folgt eine Kondensation (-H2O)
3.
Deprotonierung unter aeroben
Bedingungen.
Mgl. Entsteht H2O2 was als starkes Zellgift wirkt
Æzu hohe Expression von GFP tödlich
4.
Oxidation zu einem Imidazolion
(aromat. Organ. Verbindung mit zwei
Stickstoffatomen)
GFP mit Emission bei 510nm
► Direktes chemisches Markieren von Fusionsproteinen
mit „small molecules“
o Eine „small-molecule“ Markierung besteht aus einem sehr kompakten
Liganden, der an einen Rezeptor bindet
o Ligand bindet spezifisch und fest an den Rezeptor
o darf nicht die Funktion des Zielproteins stören
o Targetprotein bindet an
- Rezeptorprotein
- Proteindomäne
- Peptidsequenz
► Die meisten Ansätze verwenden eine spezifische, hochaffine nicht
kovalente oder kovalente Interaktion, zwischen einem synthetischen Liganden
und seinem korrespondierenden Rezeptor.
Interaktionspaar aus biarsenischem
Liganden und Tetracystein
o Affinität zwischen einem kurzen Tetracysteinpeptid (CCXXCC) und
FlaSH
o Bei der Anwendung wird das zu untersuchende Zielprotein in Form
dieses Tetracysteinmotivs exprimiert
o EDT sorgt dafür, dass andere endogene Proteine mit eng gelagerten
Cysteinpaaren verdrängt werden und folglich unspezifische Bindungen
verhindert werden
Deconvolution
Konfokales Fluoreszenzmikroskop
Konventionelles Fluoreszenzmikroskop
konfokales Fluoreszenzmikroskop
Laser-Scanning Mikroskop
Konfokales Fluoreszenzmikroskop
Medulla
konventionelles
konfokales
Fluoreszenzmikroskop
Muskel
Getreidekorn
Prinzip der Zwei-Photonen
Mikroskopie
- Erregung der Moleküle mit 2 Photonen
halber Energie
- Summierung der Energie der Photonen
nur bei gleichzeitiger Absorption
(innerhalb von 10^-15s)
Ædiese ist nur bei hohen Intensitäten
gegeben (Titan-Saphir-Laser)
- Aufnahme der Photonen durch das
Molekül
- Abgabe eines Photons mit doppelter
Energie
(Laserstrahl muss dafür gepulst werden)
Vergleich CLSM & TPLSM
- Anregungslicht wird von einem Laser erzeugt
- fokussierter Laserstrahl scannt in der Brennebene
- bei TPLSM Anregung der Fluorochrome nur im
Brennpunkt
- keine Fluoreszenz außerhalb des Brennpunktes
Æ keine konfokalen Blenden, die nur Licht aus
Brennebenen durchlassen
Maus-Niere
TIRF
total internal reflection fluorescence microscopy
Measure
Measure the
the
•• topography
topography of
of cell-substrate
cell-substrate contacts
contacts
•• Membrane
Membrane proximal
proximal ion
ion fluxes
fluxes
•• Endocytosis
Endocytosis and
and Exocytosis
Exocytosis
•• Membrane-associated
Membrane-associated
photosensitizers
photosensitizers
Evanescent field
•
•
•
penetration depths between 70 to 300 nm
→ fluorophores located within or close to the plasma membrane
are detected selectively
variations in the angle of incidence changes the penetration depth
decreased fluorophore bleeching
Transport, capture and exocytosis of single synaptic vesicles at active zones
D. ZENISEK, J. A. STEYER & W. ALMERS, Nature 406, 849 - 854 (24 August 2000)
Protein-Protein Wechselwirkungen:
FRET
(Förster/Fluorescence resonance energy transfer )
•
Angeregtes Donor-Fluorophor
•
Dipol-Dipol Wechselwirkung mit
Akzeptor-Fluorophor
•
Energieübertragung ohne
Photonenemission (strahlungslos) des
Donors
Calciummessung durch FRET zwischen CFP und YFP:
Nach Ca-Bindung wird Energy vom CFP aufs
YFP übertragen und man erhält grüne Fluoreszenz
Stathmin reduziert die Konzentration freier Tubulin-Dimere
Fluoreszenz
FRET-Analyse
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