Biochemische Untersuchungen zur Interaktion der aeroben sn
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Biochemische Untersuchungen zur Interaktion der aeroben sn-Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenase aus Escherichia coli mit der cytoplasmatischen Membran Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Naturwissenschaften Universität Konstanz Fachbereich Biologie Antje-Christine Walz Konstanz, 2002 Dissertation der Universität Konstanz Referenten: Prof. Dr. Rupert Mutzel Prof. Dr. Winfried Boos Datum der mündlichen Prüfung: 12. Februar 2002 Prüfer: Prof. Dr. Hans-Jürgen Apell HD Dr. Michael Dahl Prof. Dr. Gottfried Seebaß „Eine Tasse faßt nur eine Tasse Wasser, und wenn ich Liter in sie gösse.“ Ludwig Wittgenstein Teile dieser Arbeit wurden veröffentlicht: Walz, A.-C., R.A. Demel, B. de Kruijff, und R. Mutzel, Aerobic sn-glycerol-3-phosphate dehydrogenase from Escherichia coli binds to the cytoplasmic membrane through an amphipathic α-Helix. Biochem. J. (im Druck) Zusammenfassung Diese Arbeit beschreibt den molekularen Mechanismus der Bindung der löslichen snGlycerin-3-Phosphat-Dehydrogenase (GlpD) aus Escherichia coli an die cytoplasmatische Membran. Zunächst wurde der spezifische Bindungsmechanismus zwischen GlpD und eukaryontischem Ca2+/Calmodulin (Ca2+/CaM) durch Kompetitionsstudien analysiert. Von den eingesetzten chemisch unterschiedlichen Calmodulin-Antagonisten wurde die GlpD-Calmodulin-Bindung lediglich durch anionische Liposomen und durch Melittin gehemmt, einem kleinen Peptid, dessen Sekundärstruktur durch eine basisch amphiphile α-Helix charakterisiert ist. In einem weiteren Schritt wurde die Ca2+/CaM-Bindedomäne von GlpD auf den Bereich der Aminosäuren 355-370 eingegrenzt. Sowohl das GlpD-Fragment CBRIII, das C-terminal um 190 Aminosäuren verkürzt ist, als auch die GlpD-Mutante GlpD∆(351-72), die eine Deletion im Bereich der Aminosäuren 351-372 aufweist, konnten nicht mehr an Ca2+/CaM binden. Sekundärstrukturvorhersagen ermittelten eine basisch amphiphile α-Helix für diesen Bereich. Durch gerichtete Mutagenese wurden Mutanten (R359E, K360E, AH362/4DE) erzeugt, die im α-helicalen Bereich negativ geladen waren, während Wildtyp-GlpD in diesem Bereich positiv geladen war. Die beiden Mutanten R359E und K360E präsentieren einen Überschuss an negativer Ladung im hydrophilen Teil der Helix und konnten nicht mehr an Ca2+/CaM binden. Dagegen konnte die Mutante AH362/4DE, deren hydrophile Seite der Helix neutral war, noch an Ca2+/CaM binden. Die Vermutung, dass dieselben molekulare Mechanismen bei der GlpD-Calmodulin- und der GlpD-Lipid-Bindung vorherrschen, konnte durch Experimente mit Lipid-Monolayern bestätigt werden. GlpD induzierte eine Druckänderung in Monolayern, die aus GesamtPhospholipidextrakt von E. coli (TLE) bestanden, indem es in den hydrophoben Bereich der Lipidschicht eindrang. Die Membraninsertion von GlpD war abhängig von der Lipidzusammensetzung. In anionischen Monolayern war die penetrative Kraft von GlpD deutlich höher als bei zwitterionischen Monolayern. In Experimenten mit gemischten Phospholipiden wurde eine positive Korrelation zwischen dem Gehalt an negativ geladenen Phospholipiden und der induzierten Druckänderung beobachtet. Die Punktmutanten, die nicht mehr an Ca2+/CaM banden, konnten bei physiologisch relevanten Drücken nicht mehr in I TLE-Monolayer inserieren. Die AH362/4DE-Mutante war dagegen im Vergleich zum Wildtyp in ihrer Insertionskraft nur geringfügig eingeschränkt. Versuche mit anionischen und zwitterionischen Phospholipiden zeigten, dass die penetrative Kraft der Punktmutanten nur in anionischen Monolayern nicht jedoch in zwitterionischen Lipidschichten reduziert war. Experimente mit Lipid-Bilayern bestätigten, dass eine direkte GlpD-Lipid-Bindung besteht. In Bindungsstudien mit GlpD und TLE-Vesikeln wurde gezeigt, dass GlpD an TLE-Liposomen bindet. Die Lipidspezifität dieser Bindung unterschied sich deutlich von der des MonolayerSystems. Die Affinität von GlpD war gegenüber zwitterionischen Phospholipiden höher als gegenüber anionischen Phospholipiden. Die Tatsache, dass dieser Effekt auch mit den Punktmutanten erzielt wurde, zeigt, dass im Lipid-Bilayer-System ein weiterer Mechanismus der GlpD-Lipid-Interaktion beobachtet wurde. Die Enzymaktivität von GlpD war abhängig von der Phospholipid-Zusammensetzung. Es konnte ausgeschlossen werden, dass die geringere Stimulation durch PG- gegenüber PEVesikeln ausschließlich auf Ladungs- bzw. auf pH-Effekten beruht. Die mittels Liposomenbindungstests beobachtete spezifische Bindung von GlpD an PE wirkt sich offensichtlich begünstigend auf die PE-vermittelte Aktivierung aus, möglicherweise indem dies GlpD in seiner enzymatisch aktiven Konformation stabilisiert. II Abkürzungsverzeichnis CaM CDP CL Calmodulin Cytosindiphosphat Cardiolipin NTA OD PAGE DMSO dNTP DHAP DOPC DOPE Dimethylsulfoxid Desoxyribonukleotide Dihydroxyaceton-Phosphat Dioleoylphosphatidylcholin Dioleoylphosphatidylethanolamin Dioleoylphosphatidylglycerin Dipalmitoylglycerin Dithiothreitol “enhanced chemiluminescence” PC PE PG PGP PS Ethylenglycol-O-O´-bis(2aminoethyl)-N,N,N´,N´-tetraacetat Flavin-Adenin-Dinukleotid Glycerin-3-Phosphat Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenase “glycerol utilization” RT “nuclear magnetic resonance spectroscopy” Nitriloessigsäure optische Dichte Polyacrylamid Gelelektrophorese Phosphatidylcholin Phosphatidylethanolamin Phosphatidylglycerin Phosphatidylglycerinphosphat Phosphatidylserin Calmidazolium Polymerase Kettenreaktion Phenazin Methosulfat “regulator of G protein signaling” Raumtemperatur SDS SRP SUVs TBS Natriumdodecylsulfat Signalerkennungspartikel small unilamellar vesicles Tris buffered saline TCA TFP Tm TLE Trichloressigsäure Trifluoperazin Schmelztemperatur Gesamtphospholipid Extrakt aus Escherichia coli Tris-(hydroxymethyl)aminomethan N-(6-Aminohexyl)-5-chlor-1naphthalinsulfonamidhydrochlorid ATP DOPG DPG DTT ECL EGTA FAD G3P GlpD GUT Adenosin-3´ Monophosphat IPTG kb kDa LUVETs Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid Kilobasen Kilodalton “large unilamellar vesicles prepared by extrusion technique” MARCKS myristoylierte Alanin-reiche Proteinkinase C-Substrate MTT 3-(4,5-dimethylthiazolyl-2)-2,5diphenyltetrazolium Bromid NADH NMR R24571 PCR PMS RGS Tris W7 reduziertes Nicotinamid-AdeninDinucleotidphosphat III Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis Einleitung ............................................................................................................................. 1 ..................................................................................... 1 ...................................................................... 1 .................................................................. 3 Zentrale Rolle von G3P Membranaufbau von E. coli Phospholipidsynthese Charakteristika der Phospholipide ............................................... 5 Nicht-Bilayer Lipids ...................................................... 5 Anionische Phospholipide ............................................ 6 .................................................... 7 ........................................................................... 9 Glycerintransport und -metabolismus Das glp-Regulon Regulation des Glycerinmetabolismus ........................................ Die sn-Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenasen ........... Die anaerobe Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenase 10 11 .... 11 Die aerobe Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenase ......... 12 Klassifizierung peripherer Membranproteine .............. 13 Eukaryontisches Calmodulin und bakterielle ............................................ 14 Calmodulin-Bindeproteine Ziel dieser Arbeit ................................................................................................... 14 ................................................................................ 16 Verwendete Materialien und deren Bezugsquellen ................................... 16 .................................................... 16 ................................................................................ 17 .................................................................. 17 Material und Methoden Chemikalien und sonstige Materialien Oligonukleotidprimer Verwendete Bakterienstämme IV Inhaltsverzeichnis ................................................................................ 18 Verwendete Kulturmedien ......................................................................... 18 Mikrobiologische Methoden .............................................................................. 18 .................................................... 18 ........................................................................... 19 Bestimmung der Zelldichte in Flüssigkulturen ........................................ 19 .................................................................... 19 ..................................................................................... 19 ...................................................................... 19 .......................................... 20 ...................................................................... 21 .................................................................................. 21 ..................................................................................... 22 .................................................... 22 Coomassie Blue-Färbung von SDS-PAA-Gelen ........................................ 22 Western Blot und Immunfärbung von Proteinen ................................... 22 Protein-Präzipitation mit 10% Trichloressigsäure ................................. 23 Proteinbestimmung ..................................................................................... 23 Enzymaktivitätstest ..................................................................................... 24 Reinigung von rekombinantem GlpD über ............................................... 25 Verwendete Plasmide Aufbewahrung von Bakterienstämmen Wachstumsbedingungen Molekularbiologische Methoden Standardmethoden Polymerase-Kettenreaktion Gerichtete Mutagenese mittels Fusions-PCR Konstruktion der Vektoren TSS-Transformation Biochemische Methoden SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese Chitinaffinitätschromatographie Reinigung der Wildtyp-, CBRIII-, GlpDD(351-372), .............................. 25 R349E-, K360E, AH362/4DE-Fusionsproteine über Ni2+/NTA-Affinitätschromatographie Bindungsstudien von Wildtyp- und mutagenisiertem GlpD .................. 27 an Calmodulin-Sepharose 4B Präparation von SUVs (Small Unilamellar Vesicles) .............................. V 27 Inhaltsverzeichnis Präparation LUVETs (Large Unilamellar Vesicles ................................. 28 prepared by Extrusion Technique) Lipid Extraktion nach Bligh and Dyer ...................................................... 28 Phosphor Bestimmung nach Fiske Subbarow .......................................... 29 Isolierung und Reinigung des gesamten Phospholid- .............................. 29 Extrakts aus E. coli (TLE) Monolayer-Experimente ........................................................................... 30 Vesikel-Bindungsstudien ........................................................................... 32 ............................................................................................................................... 33 ................................................. 33 Klonierung, Überexpression und Reinigung von GlpD .......................... 33 ........................................................... 34 Inhibitionsstudien zur Bindung von GlpD an CaM ................................. 35 .................. 36 Lokalisation der CaM-Bindedomänen ...................................................... 37 ....................... 38 Charakterisierung der GlpD-Lipid-Bindung ............................................... 42 Direkte Protein-Lipid-Interaktion ............................................................. 42 Ergebnisse Spezifität der Bindung von GlpD an CaM Calcium-abhängige CaM-Bindung Bindung von GlpD an saure und hydrophobe Oberflächen Basisch amphiphile Helix: CaM-Bindemotiv von GlpD? Lipidspezifität der Insertion von GlpD ........................................ 43 Insertion von GlpD in gemischte Phospholipid-Monolayer ......... 45 Insertion von GlpD und Punktmutanten in TLE-Monolayer ....... 46 Insertion von wt-GlpD und Punktmutanten ................................. 47 in PG- bzw. PE-Monolayer GlpD-Bindung an TLE-Bilayer .................................................................. Liposomen-Bindungsspezifität von GlpD 48 ................................... 48 Einfluss von Liposomen auf die GlpD-Aktivität ........................................ 50 VI Inhaltsverzeichnis ............................................... 50 ......... 51 Enzymaktivität nach Vorinkubation mit LUVETs ................................. 52 Liposomen-stimulierte GlpD-Aktivität bei hohen ................................... 54 Stärkste Stimulation mit neutralen SUVs Dosis-Abhängigkeit der Liposomen-stimulierten GlpD Aktivität Salzkonzentrationen ........... 55 ................................................................................................................................. 57 Direkte GlpD-Lipid-Interaktion ...................................................................... 57 .................................................................... 57 Insertion erfolgt durch basisch amphiphile α-Helix ..................... 58 ............................ 60 ............................................................. 62 Lokalisierung an Mikrodomänen? .................................................................. 63 α-Helix: generelles Membranbindemotiv bei ............................................... 65 pH-Abhängigkeit der Liposomen-stimulierten Enzymaktivität Diskussion Membraninsertion von GlpD Spezifische Bindung an PE-enthaltende Membranen Lipid-stimulierte Enzymaktivität Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenasen? ..................................... 67 Ausblick: Identifikation von Membranbindemotiven ......................... 68 Identität von CaM- und Membranbindedomäne durch CaM Bindetests Literaturverzeichnis .......................................................................................................... VII 71 Einleitung Einleitung Escherichia coli gehört der Familie der Enterobacteriaceae an, einer Gruppe Gram-negativer Bakterien, deren natürliches Habitat der Darm warmblütiger Organismen ist (Sanderson, 1976). In seiner natürlichen Umgebung sind Fettsäuren, Triacylglyceride und Phospholipide häufig vorkommende Substanzen. Zentraler Bestandteil von Triacylglyceriden und Phospholipiden ist Glycerin-3-Phosphat (G3P), das von E. coli entweder für den Membranaufbau oder zur Energiegewinnung genutzt werden kann. Zentrale Rolle von G3P Im Metabolismus von E. coli spielt das wasserlösliche G3P eine zentrale Rolle. Einerseits wird es für die Lipidbiosynthese als Grundbaustein von Phospholipiden und als Vorläufermolekül der polaren Kopfgruppe des Phosphatidylglycerins benötigt (Raetz, 1986). Andererseits kann es als Energiequelle in Form von Glycerin, G3P und Glycerophosphatdiester genutzt werden (Lin, 1976). Ist kein externes G3P vorhanden, so wird es von E. coli durch eine NADH-abhängige Reduktion von Glycerinaldehyd-3-Phosphat synthetisiert (Yun et al., 2000). Die Tatsache, dass G3P als Substrat zweier unterschiedlicher Reaktionswege genutzt werden kann, ermöglicht den Bakterien, flexibel und schnell auf die jeweilige Umweltsituation zu reagieren und stellt sie gleichzeitig vor regulatorische Herausforderungen. Wird die Expression der Strukturgene des Glycerin-Metabolismus nicht mehr reguliert, z.B. durch Mutationen im Glp-Repressor, der die Expression dieser Strukturgene negativ kontrolliert, so führt dies zu einem verstärktem G3P-Abbau, so dass nicht mehr genügend G3P für den Aufbau von Phospholipiden vorhanden ist, was letztendlich die Lebensfähigkeit der Bakterien einschränkt (Holtman et al., 2001b). In E. coli müssen Glycerintransport und –metabolismus folglich auf verschiedenen Ebenen reguliert werden. Membranaufbau von E. coli Bakterielle Membranen stellen eine Permeationsbarriere für viele Substrate dar. Die Zellhülle Gram-negativer Bakterien besteht aus drei Kompartimenten: der cytoplasmatischen Membran, dem Periplasma und der Außenmembran (Abb. 1). Alle von Gram-negativen Bakterien aufgenommenen Substanzen müssen daher zwei Membranen passieren. Die äußere 1 Einleitung Membran ist durch einen asymetrischen Aufbau gekennzeichnet, der ungewöhnlich für biologische Membranen ist. Während die äußere Schicht aus Lipopolysacchariden (LPS) besteht, sind in der zum Periplasma gerichteten Schicht Glycerophospholipide enthalten (Raetz und Dowhan, 1990). Die äußere Membran stellt eine Permeationsbarriere dar und bietet der Zelle Schutz vor antimikrobiellen Agenzien. Sie enthält nur wenige Porine, die die äußere Membran gegenüber hydrophilen Substanzen, die kleiner als 600 Da sind, durchlässig machen (Nikaido und Vaara, 1985). Eine Peptidoglykanschicht trennt die innere von der äußeren Membran und bietet der Zelle mechanischen Schutz (Cooper, 1991). Die Aufnahme von Substraten durch die äußere Membran erfolgt durch passive Diffusion, weswegen die Nährstoffkonzentration im Periplasma niedriger als im Extrazellulärraum gehalten werden muss. Da Mikroorganismen meist unter limitiertem Substratangebot leben, kann dies nur erfüllt werden, wenn die Substanzen durch aktiven und spezifischen Transport über die cytoplasmatische Membran schnell entfernt werden. Die cytoplasmatische Membran, bestehend aus einem Glycerophospholipidbilayer mit darin eingelagerten Proteinen, entspricht dem typischen Aufbau von Plasmamembranen. Abbildung 1: Zellhülle von E. coli (Raetz und Dowhan, 1990) 2 Einleitung Die integralen Membranproteine übernehmen verschiedene Funktionen, wie Energieerzeugung, Transport und Austausch von Nährstoffen und Metaboliten und sind die Vebindungsglieder zwischen Umweltbedingungen und physiologischer Antwort. Die wichtigsten Glycerophospholipide von E. coli sind Phosphatidylethanolamin (PE), Phosphatidylglycerin (PG) und Cardiolipin (CL) (Abb2B). Circa 75% des gesamten cytoplasmatischen Phospholipidgehalts besteht aus PE (Raetz, 1978). Die relativen Anteile von CL und PG hängen vom Wachstumsstadium der Zellen ab. In der logarithmischen Wachstumsphase wird vermehrt PG gebildet, in der stationären Phase wird ein erhöhter Anteil von CL beobachtet (Ames, 1968; Cronan, 1968; Raetz, 1986). Phospholipidsynthese Die Biosynthese von PE, PG und CL läuft in mehreren Stufen ab (Abbildung 2A). Vorläufer von Fettsäuren und polaren Kopfgruppen werden im Cytoplasma synthetisiert (Raetz, 1986). Die Endprodukte der Fettsäuresynthese werden zu den an der cytoplasmatischen Membran lokalisierten G3P-Molekülen transferiert. Dort werden sie zu den verschiedenen Phospholipidkopfgruppen synthetisiert. Die Synthese der Phospholipide beginnt mit der Acetylierung zu 1-Acyl-Glycerin-3-Phosphat, katalysiert von der G3P-Acyltransferase PlsB (Larson et al., 1984; Raetz, 1986). 1-Acyl-G3P wird durch eine zweite Acyltransferase (Rajasekharan et al., 1988) zu Diacylglycerin-3-Phosphat, auch Phosphatidat genannt, umgewandelt. Aus Phosphatidat wird Cytosidindiphosphat (CDP)-Diacylglycerin, das gemeinsame Vorläufermolekül von PE, PG und CL. Die von pssA kodierte Phosphatidylserin-Synthase und die von psd kodierte Phosphatidylserin (PS)-Decarboxylase wandeln CDP-Diacylglycerin zu PE um. Diese Reaktion läuft so schnell ab, dass in E. coli kaum PS nachgewiesen werden kann. Die Synthese von PG erfolgt aus CDP-Diacylglycerin über das Zwischenprodukt Phosphatidylglycerinphosphat (PGP). Die zweistufige Reaktion wird von der pgs-kodierten PGPhosphatsynthase und der von pgp kodierten PGP-Phosphatase katalysiert. Aus der Kondensation von zwei PG-Molekülen entsteht durch die von dem cls-Gen kodierte CL-Synthase ein CL-Molekül. 3 Einleitung sn -glycero-3-phosphate A fatty acyl-ACP ACP phosphatic acid CTP PPi CDP-diacylglycerol L-serine sn -glycerol-3-P CMP CMP phosphatidylserine (PS) phosphatidylglycerol-P psd CO2 pgp phosphatidylethanolamine (PE) Pi phosphatidylglycerol (PG) PG glycerol cls cardiolipin (CL) B O R C O CH2 R' C O CH H2C O Phosphatidylethanolamine O O O P O CH2 CH2 NH3+ _ O R C O CH2 R' C O CH O H2C Phosphatidylglycerol O O H P O O CH2 _ C CH2 OH OH O O R C O CH2 R' C O CH O H2C Cardiolipin H O O P O O _ CH2 C OH O CH2 O O P O H2C O C R HC O C R' CH2 O _ Abbildung 2: A: Syntheseweg der Glycerophospholipide nach Raetz (1986) und B: chemische Struktur von PE, PG und Cl. R und R´ bezeichnen Fettsäurereste. 4 Einleitung Charakteristika der Phospholipide Glycerophospholipide bestehen aus dem Rückgrat-bildenden Glycerin, zwei Fettsäureketten, die den hydrophoben Teil darstellen und einem phosphorylierten Alkohol als Kopfgruppe. Nicht-Bilayer Lipids Aufgrund seiner kleinen Kopfgruppe ist PE (Abb. 2B) im Gegensatz zu PG und CL nicht in der Lage, sich spontan zu einem Lipidbilayer zusammenzuschließen. Obwohl biologische Membranen Bilayer sind, enthält die Membran von E. coli einen hohen Anteil an NichtBilayer-Lipiden. Diese Lipide bilden eine invertierte hexagonale Phase (Abb. 3B), die jedoch in Biomembranen nicht vorkommt. In Biomembranen induzieren Nicht-Bilayer-Lipide eine kubische Phase (Abb. 3C). Nicht-Bilayer-Lipide sind in E. coli essentiell, wie die Arbeiten mit dem Stamm AD93 zeigen, der aufgrund einer Mutation im pssA-Gen kein PS synthetisiert und folglich auch kein PE mehr bilden kann (Dechavigny et al., 1991a und 1991b). Unter normalen Wachstumsbedingungen ist diese Mutation lethal. AD93-Zellen können nur durch Zusatz divalenter Kationen wie Calcium, Magnesium und Strontium wachsen (Dechavigny et al., 1991a). Durch NMR-Analyse wurde gezeigt, dass unter diesen Bedingungen der Übergang von Bilayer- zu Nicht-Bilayer-Strukturen bei Lipiden des AD93-Stammes in einem ähnlichen Temperaturbereich erfolgt wie bei Lipiden des parentalen Stammes W3899 (Rietveld et al., 1993). Rietveld und Mitarbeiter folgern, dass CL zusammen mit Kationen die für die Membranfunktion essentielle Struktur von PE einnehmen kann. Elektronenmikroskopische Untersuchungen zeigen, dass bei AD93-Zellen Calcium-Ionen auf der periplasmatischen Seite wirken und die Bilayer-Struktur der Membran durch die cytosolische Membranhälfte stabilisiert werden (Rietveld et al., 1997). Die funktionelle Bedeutung von PE besteht folglich darin, dass sich Biomembranen in einem Zustand befinden, der nahe des Bilayer-Nichtbilayer Übergangs ist. Dieser Zustand ist in E. coli von zentraler Bedeutung, da dies eine Neuanordnung der Lipide gemäß ihrer jeweiligen Aufgabe ermöglicht (De Kruijff, 1997b) und ist folglich in E. coli strikt reguliert (Morein et al., 1996; Rietveld et al., 1993). In AD93-Zellen sind der Einbau und die Funktion wichtiger Transportproteine wie beispielsweise die Lac-Permease deutlich geschwächt (Bogdanov et al., 1996) und die Protein-Translokation deutlich reduziert (Rietveld et al., 1995). Abbildung 3E und 3G verdeutlichen, wie PE die Packungsdichte von Lipiden in der Membran erhöht und damit die 5 Einleitung Faltung integraler Proteine beeinflusst (Cantor, 1999; Curran et al., 1999; De Kruijff, 1997a). Dies erklärt die Beobachtung, dass eine Membran mit steigender Anzahl an funktionellen Aufgaben einen steigenden Anteil an Nicht-Bilayer-Lipiden aufweist. Zudem stimulieren die kleinen Kopfgruppen von Nicht-Bilayer-Lipiden die partielle Insertion von Proteinen in die Kopfgruppenregion der Membran (Van Den Brink-Van Der Laan et al., 2001; Van Klompenburg et al., 1998). Abbildung 3: Organisation von Nicht-Bilayerlipiden. A: Die Assemblierung des Nicht-Bilayer Lipids PE zu einer konkaver Struktur führt zur Bildung von B: einer hexagonalen Phase oder C: einer kubischen Phase. D: Nicht-Bilayer-Lipide, die in einem planaren Lipid-Bilayer zusamengefasst sind, erzeugen einen höheren lateralen Druck im Inneren der Membran und einen niedrigeren Druck im Bereich der Kopfgruppen. E: Dieses Druckprofil stabilisiert transmembrane Proteine. F: Bilayer-Lipide, wie Phosphatidylcholin haben eine zylindrische Form und führen deshalb zu einer gleichmäßigen Packungsdichte in Bilayern. G: Der laterale Druck in PC-Bilayern ist geringer und führt zu einer relaxierten Orientierung von transmembranen Proteinen (De Kruijff, 1997b). Anionische Phospholipide Bei physiologischem pH (7.4) ist PE neutral, PG und CL sind dagegen negativ geladen. Während die Mutanten noch überlebensfähig sind, die aufgrund eines Defekts im cls-Gen zwar noch PG jedoch kein CL mehr produzieren können, sind Mutationen im pgsA-Gen lethal (Heacock und Dowhan, 1987). Durch die Konstruktion einer Mutante, deren pgsA-Expression durch ein lac-Operon gesteuert ist, wurde der minimale Gehalt an PG für die Überlebensfähigkeit mit 3% bestimmt. Kikuchi und Mitarbeiter zeigten, dass die pgsA-Mutante 6 Einleitung überlebensfähig ist, wenn gleichzeitig die Synthese von Lipoprotein gehemmt ist. Die Autoren folgern, dass PG und CL für elementare Prozesse nicht essentiell sind, da ihre Rolle von Phosphatidsäure übernommen werden kann (Kikuchi et al., 2000). Anionische Lipide spielen bei der Proteintranslokation (De Kruijff, 1994; De Vrije et al., 1988; Kusters et al., 1991; Kusters et al., 1994) und DNA Replikation (Garner et al., 1998) eine zentrale Rolle. So wurde gezeigt, dass das periphere Membranprotein DnaA, das die Initiation der DNA-Replikation katalysiert, anionische Phospholipide mit einer ein kDa großen Domäne penetriert (Garner und Crooke, 1996; Garner et al., 1998). Die HelicalWheel-Projektion dieser 18 Aminosäuren zeigt, dass das Fragment eine amphiphile Helix formieren kann. Die Aktivität von SecA, einer cytoplasmatischen Komponente des ProteinTranslokationskomplexes, wird durch saure Phospholipide stimuliert (Lill et al., 1990). Es wurde gezeigt, dass SecA in Phospholipid-Monolayer inseriert (Breukink et al., 1992). FtsY, eine GTPase mit Homologie zur α-Untereinheit des eukaryontischen Signalerkennungspartikel(SRP)-Rezeptors, ist ein cytosolisches Protein, das bei der Proteintranslokation das Preprotein an die Membran transloziert (Luirink et al., 1994). FtsY ist ein cytoplasmatisches Protein, das durch anionische Phospholipide stimuliert wird und durch Insertion in anionische Lipide an die Membran bindet (De Leeuw et al., 2000). Eine weitere wichtige Funktion anionischer Phospholipide besteht darin, die korrekte Orientierung und Topologie transmembraner Proteine zu kontrollieren (Van Klompenburg et al., 1997; Van Klompenburg und De Kruijff, 1998). Glycerintransport und -metabolismus E. coli nutzt unterschiedliche G3P-Quellen. Zum einen das durch Phosphorylierung von Glycerin gewonnene und zum anderen das aus dem Phospholipidabbau stammende G3P. Transport und Katabolismus von Glycerin, G3P und Glycerophosphatdiester durch die Genprodukte des glp-Regulons sind in Abbildung 4 dargestellt. Das metabolische System dient im wesentlichen dazu, das aus dem Abbau von Phospholipiden und Triacylgylcerin stammenden Glycerin zu verstoffwechseln. Glycerophosphatdiester, die deacetylierten Abbauprodukte der Phospholipide (Lin, 1987), werden im Periplasma von der dort lokalisierten Phosphodiesterase GlpQ zu Alkohol und G3P hydrolysiert (Larson et al., 1983). G3P wird durch die Permease GlpT (Eiglmeier et al., 1987; Larson et al., 1982) im Austausch gegen anorganisches Phosphat ins Zellinnere transportiert (Auer et al., 2001; Elvin et al., 1985). Die für den Transport benötigte Energie wird 7 Einleitung durch diesen Antiport bereitgestellt und gleichzeitig wird eine Akkumulation des toxisch wirkenden Phosphats verhindert (Xavier et al., 1995). Wird Glycerin aus dem Nährmedium aufgenommen, so gelangt es durch erleichterte Diffusion ins Zellinnere. Dies wird von dem Glycerinfascilitator GlpF katalysiert (Borgnia und Agre, 2001; Heller et al., 1980), der einen substratspezifischen Kanal mit einer Porengröße von 0.4 nm bildet (Heller et al., 1980). Cytoplasmatisches Glycerin wird sofort von der ATP-abhängigen Glycerinkinase K phosphoryliert, die in ihrer enzymatisch aktiven Form mit dem GlpF-Fascilitator assoziiert vorliegt (Voegele et al., 1993). Extracellular Medium Glycerol Periplasma Glycerol Cytoplasma Facilitator Glycerol (glpF) Enzyme IIIGle Feedback Inhibition Fructose-1,6-P2 Kinase (glpK) +ATP Aerobic dehydrogenase (glpD) G3P Anaerobic dehydrogenase Permease G3P (glpT) DHAP Glyceraldehyde-3-P (glpACB) ROH G3P Oxidoreductase gpsA P-diesterase (glpQ) Phosphatidic acid G3P-OR phosphatidylgycerol-3-P PE PG Cardiolipin Abb. 4: Glycerintransport und –metabolismus Im Cytosol wird G3P entweder als Ausgangsstoff für die Lipidsynthese oder für die Dissimilation verwendet. Zur Energiegewinnung wird G3P von zwei FAD-abhängigen Dehydrogenasen zu Dihydroxyaceton-Phosphat (DHAP) oxidiert. DHAP kann als Intermediat in die Glykolyse eingehen. Im aeroben Milieu wird diese Oxidation von der aeroben Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenase (GlpD) katalysiert, im anaeroben Milieu dagegen von der anaeroben G3P Dehydrogenase (GlpABC). Die bei dieser Oxidationsreaktion frei werdenden Reduktionsäquivalente werden von den beiden Flavoenzymen auf einen membranassoziierten Cytochromkomplex übertragen, an dessen Ende ein terminaler 8 Einleitung Elektronenakzeptor sitzt. Im Fall der aeroben Oxidation ist dies molekularer Sauerstoff bzw. Nitrat, unter anaeroben Bedingungen dagegen Fumarat oder Nitrat (Lin, 1987). Während die Elektronen durch den Cytochromkomplex geschleust werden, wird die frei werdende Energie dazu genutzt, Protonen durch die Membran von der cytoplasmatischen auf die periplasmatische Seite zu pumpen. Mit dem an der Membran erzeugten Protonengradienten ändert sich sowohl das elektrische als auch das chemische Potential, womit die membrangebundene ATPase angetrieben wird und dadurch ATP erzeugen kann. Das glp-Regulon Die Expression der Enzyme, die am Glycerintransport und –metabolismus beteiligt sind, wird strikt reguliert. Dies wird durch die strukturelle Organisation der glp-Gene ermöglicht. Das Glycerophosphatregulon (glp) besteht aus fünf Operons, die an drei verschiedenen Genorten auf dem E. coli-Chromosom liegen (Cozzarelli et al., 1968). Alle Gene des glp-Systems stehen unter der Kontrolle des GlpR-Repressors (Schweizer und Larson, 1987). Der Genlocus von glpR liegt bei 75 min und wird im Gegenuhrzeigersinn transkribiert (Lin, 1987). Der Repressor bildet im aktiven Zustand ein Tetramer aus identischen Untereinheiten von 30 kDa (Larson et al., 1987) und bindet spezifisch an die Kontrollregionen des glp-Regulons. Sekundärstrukturanalysen zeigen, dass die spezifische DNA-Bindung des Repressors durch ein Helix-Schleife-Helix-Motiv in der Nähe des N-Terminus möglich ist (Zeng et al., 1996). Diese DNA-Bindung kann durch den Induktor G3P aufgelöst werden (Larson et al., 1987). Durch Versuche mit einer Mutante mit einer inaktiven Glycerinkinase wurde gezeigt, dass für eine Induktion der glp-Gene die Phosphorylierung von Glycerin notwendig ist. Folglich ist G3P der alleinige Induktor (Hayashi und Lin, 1965; Lin, 1976). Als Anti-Induktor wurde DGalaktose-1-Phosphat identifiziert (Sundarajan, 1963). Bei 88 min findet man das Operon glpFKX (Cozzarelli und Lin, 1966; Weissenborn et al., 1992), das für den Glycerinfascilitator GlpF und die Glycerinkinase GlpK und eine Fructose-1,6-Bisphosphatase GlpX (Donahue et al., 2000) kodiert. In dem bei 49 min kartierten Operon sind die Gene glpT (G3P-Transporter) und glpQ (periplasmatische Glycerinphosphodiesterase) zusammengefasst, die im Gegenuhrzeigersinn transkribiert werden. Gegenläufig dazu ist das glpABC-Operon angeordnet, dessen Gene für die drei Untereinheiten der anaeroben heterotrimeren sn-Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenase kodieren (Cole et al., 1988; Ehrmann et al., 1987; Kistler und Lin, 1971; Miki et al., 1979). Bei 75 min auf dem Chromosom liegt das glpDEG-Operon. Während die physiologische 9 Einleitung Funktion von glpG noch unbekannt ist (Zeng et al., 1996), wurden GlpE als Schwefeltransferase und GlpD als aerobe Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenase (Cozzarelli et al., 1968) identifiziert. Die vom glpE-Gen kodierte saure, cytoplasmatische Rhodanese besteht lediglich aus 108 Aminosäuren mit einem Molekulargewicht von 12 kDa und katalysiert als Dimer die Übertragung von Schwefel auf den Schwefelakzeptor Thioredoxin 1. Welche physiologische Rolle GlpE spielt, ist noch unklar (Ray et al., 2000). Das offene Leseraster des glpD-Gens besteht aus 501 Codons und die translatierte Sequenz kodiert ein Protein mit einem Molekulargewicht von 57 kDa (Austin und Larson, 1991). Das glpG-Genprodukt ist ein basisches, cytoplasmatisches oder membranassoziiertes Protein mit einem Molekulargewicht von 28 kDa (Zeng et al., 1996). Regulation des Glycerinmetabolismus E. coli verfügt über ein breitgefächertes kataboles Repertoire. Dabei wird immer diejenige Kohlenstoffquelle bevorzugt, die ein schnelleres Wachstum ermöglicht. Produktion und Konzentration von Syntheseprodukten werden sowohl auf metabolischer Ebene mittels Änderungen von Enzymaktivitäten als auch durch eine regulierte Transkription der jeweiligen Enzyme gesteuert. Auf genetischer Ebene wird die Expression der glp-Gene negativ durch den Repressor GlpR kontrolliert, der mit unterschiedlichen Affinitäten an die Operatorsequenzen bindet. So zeigt der GlpR-Repressor eine deutlich höhere Affinität zu dem glpD-Operator als zu denen der anderen glp-Operatoren (Lin, 1987). Bei Glycerinmangel resultiert daraus eine niedrige Basalexpression von GlpD. Mutationen in GlpR, die zu einer konstitutiven Expression von GlpD führen, beeinträchtigen die Phospholipidbiosynthese und bewirken ein Ungleichgewicht in der Membranzusammensetzung (Flower, 2001), das letztendlich die Lebensfähigkeit der Bakterien dramatisch einschränkt. Neben der negativen Regulation durch GlpR unterliegen alle glp-Gene der Katabolitrepression durch den cAMP-CAP (cAMP catabolite gene activator protein)-Komplex (Cozzarelli et al., 1968; Fraser und Yamazaki, 1980). Stehen der Zelle neben Glycerin andere, energiereichere Kohlenstoffquellen zur Verfügung wie beispielsweise die dem PTS (Phosphoenolpyruvat-abhängigen Phosphotransferase)-System angehörigen Zucker (Glucose, Mannitol und Mannose), so wird durch Katabolitrepression die Transkription der glp-Gene verhindert (Übersicht in Postma et al., 1993). Das Schlüsselenzym im Glycerinmetabolismus ist die Glycerinkinase GlpK, die den 10 Einleitung geschwindigkeitsbestimmenden Schritt katalysiert (Zwaig et al., 1970). Sie ist ein wichtiger Regulator zwischen der Genexpression des glp-Systems und dem Angebot an Kohlenstoffquellen. Die Inhibition durch das nichtphosphorylierte Enzym EIIAGlc des PTS-Systems, auch ‘Inducer Exclusion’ bezeichnet, erfolgt durch spezifische Bindung von EIIAGlc an GlpK, womit eine reduzierte Synthese des Induktors G3P bewirkt wird. Dies ist außergewöhnlich, denn in der Regel bindet EIIAGlc an Transportproteine. In diesem Fall bindet es jedoch nicht an den Fascilitator GlpF, sondern an das metabole Enzym GlpK (De Boer et al., 1986; Novotny et al., 1985). Ferner wird die Enzymaktivität von GlpK allosterisch durch Fructose1,6-Bisphosphat gehemmt (Holtman et al., 2001a). Während die Kinase bereits bei gering induziertem Zustand durch EIIAGlc reguliert wird, tritt die ‘Feedback Inhibition’ durch Fructose-1,6-Bisphosphat erst in voll induzierten Zellen ein (Liu et al., 1994). Durch diese strikte Kontrolle der Glycerinkinase wird verhindert, dass G3P akkumuliert, denn eine intrazelluläre Konzentration von 20 mM G3P wirkt sich bakteriostatisch aus (Cozzarelli et al., 1965). Die sn-Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenasen Die anaerobe und die aerobe Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenase befinden sich an zentraler Position zwischen dem Energiestoffwechsel und dem Metabolismus von Membranlipiden (siehe Abb. 4). Beide katalysieren die Oxidation von G3P zu DHAP, übertragen jedoch die bei der Oxidation frei werdenden Reduktionsäquivalente auf unterschiedliche Cytochromoxidasen. Im Fall der aeroben Oxidation überträgt GlpD die Reduktionsäquivalente auf das bei hohem O2-Gehalt synthetisierte und vom cyo-Operon exprimierte Cytochrom O. Bei der anaeroben Oxidation von G3P wird die Übertragung durch GlpABC auf das bei niedrigem O2-Gehalt synthetisierte und vom cyd-Operon exprimierte Cytochrom D übermittelt (Kistler und Lin, 1972; Spiro und Guest, 1987). Die Expression der beiden Cytochromoxidasen steht unter der respiratorischen Kontrolle der ArcA und ArcB Produkte, die ein ZweikomponentenRegulationssystem bilden. Der ‘response-regulator’ ArcA wird bei geringer Sauerstoffkonzentration von dem Sensor ArcB, einer Histidinkinase, phosphoryliert und reprimiert die GlpD-Expression (Iuchi et al., 1990). Die anaerobe Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenase Die anaerobe Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenase (GlpABC) ist ein heterotrimeres Enzym, das aus drei unterschiedlichen Untereinheiten zusammengesetzt ist (Kuritzkes et al., 11 Einleitung 1984; Schryvers und Weiner, 1981; Schryvers und Weiner, 1982). Dieser Komplex besteht aus dem Polypeptid GlpA (62 kDa) mit dem nicht-kovalent gebundenen Kofaktor FAD, ferner GlpB (43 kDa), das vermutlich FMN-assoziiert vorliegt, und dem Membrananker GlpC (44 kDa), dessen Aminosäuresequenz auf zwei Eisen-Schwefel-Zentren schließen lässt (Cole et al., 1988). Die Expression von GlpABC ist das Resultat zweier Einflüsse: einer Fumarat und Nitrat Reduktase (FNR)-abhängigen Regulation (Kuritzkes et al., 1984) und eines weiteren Mechanismus, der über den Redoxstatus der Zelle kontrolliert wird (Iuchi et al., 1990). Die aerobe Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenase Die aerobe Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenase (GlpD) liegt im nativen Zustand als homodimeres Enzym vor (Schryvers et al., 1978). Sie ist aus zwei identischen Untereinheiten von 58 kDa zusammengesetzt (Schweizer und Larson, 1987) mit FAD als nichtkovalentem Kofaktor (Robinson und Weiner, 1980). Das periphere Membranprotein GlpD katalysiert die aerobe Oxidation von G3P zu DHAP unter Verwendung von molekularem Sauerstoff bzw. Nitrat als Elektronenakzeptor (Kuritzkes et al., 1984). Die Transkription von GlpD ist strikt reguliert. Es wurden insgesamt vier Repressorbindestellen identifiziert, zwei davon außerhalb und zwei innerhalb des offenen Leseraster von glpD (Yang und Larson, 1996). Die Bindung von GlpR an die internen Repressorbindestellen führt zu einer fünf- bis siebenfach stärkeren Kontrolle des glpD-Operons im Vergleich zum glpFKX-Operon (Yang und Larson, 1996). Zellen in der stationären Wachstumsphase zeigen eine erhöhte GlpD-Expression (Weichart et al., 1993). Die Autoren diskutieren, dass dies mit der verstärkten Bildung des Induktors G3P als Nebenprodukt der erhöhten Cardiolipinsynthese zusammenhängt. Neben der Regulation auf Transkriptionsebene wird die Aktivität von GlpD über die Lokalisation geregelt. In vivo ist enzymatisch aktives GlpD mit der Membran assoziiert (Weiner, 1974). In vitro ist das lösliche GlpD vollständig aktiv, wenn Phospholipide oder Detergenzien zugesetzt werden (Robinson und Weiner, 1980; Schryvers et al., 1978). Der Bindungsmechanismus von GlpD an die Membran konnte bislang noch nicht aufgeklärt werden. Es kann lediglich ausgeschlossen werden, dass transmembrane Helices das Protein an der Membran verankern. Denn die einzige mögliche transmembrane Helix, die durch Sekundärstrukturvorhersage ermittelt wurde, befindet sich im Bereich der FAD-Bindedomäne (Austin und Larson, 1991). 12 Einleitung Möglicherweise ist GlpD in die Lipid A-Biosynthese involviert. Milla und Raetz (Milla und Raetz, 1996) reinigten die Disaccharid-Synthase LpxB, ein Enzym des Lipid ASyntheseweges, als 8xHis-LpxB-Fusionsprotein, um Interationen mit anderen E. coli Proteinen untersuchen zu können. GlpD konnte selbst bei geringer Expressionsinduktion des 8xHis-LpxB-Fusionsproteins kogereinigt werden. Die Autoren diskutieren, dass eine Interaktion zwischen GlpD und LpxB in vivo möglicherweise ein regulatorisches Bindeglied zwischen dem Katabolismus von Glycerophospholipiden und der Lipid A-Biosynthese darstellt. Außerdem wurde eine spezifische Interaktion zwischen GlpD und eukaryontischem Calmodulin beobachtet (Hellstern, 1997), deren physiologische Bedeutung noch ungeklärt ist. Klassifizierung peripherer Membranproteine Aufgrund der Beobachtung, dass die Reinigung von GlpD aus E. coli den Einsatz von Detergenzien und hohen Salzkonzentrationen erfordert, wurde GlpD als peripheres Membranprotein klassifiziert (Weiner und Heppel, 1972). Die Gemeinsamkeit der so bezeichneten Proteine besteht darin, dass sie sich in ihrem aktiven Zustand an die Membran anheften. Die jeweils zugrunde liegenden molekularen Mechanismen können sehr verschieden sein. Die Bindung an die Membran kann entweder durch Protein-Protein-Wechselwirkungen mit einem integralen Membranprotein dem sogenannten Membrananker, oder durch direkte ProteinLipid-Interaktion vermittelt werden, die entweder durch Bindung an Phospholipide oder durch Penetration der cytoplasmatischen Schicht des Lipid-Bilayers erfolgt. Die intermolekularen Kräfte, die die Proteine an der Membran verankern, können auf hydrophoben oder elektrostatischen Wechselwirkungen beruhen. Im Fall von hauptsächlich elektrostatischen Kräften wird eine elektropositive Protein-Oberfläche präsentiert, die mit den elektronegativen Lipid-Kopfgruppen interagiert (Lloyd et al., 1999; Stams et al., 1998). Im Fall von hydrophoben und elektrostatischen Wechselwirkungen kann das periphere Membranprotein eine unpolare α-Helix ausbilden, die eine Lipidschicht des Bilayers penetriert (Picot et al., 1994). Häufiger wird jedoch die Bildung unpolarer Schleifen beobachtet, die den hydrophoben Bereich der Membran penetrieren (Macedo-Ribeiro et al., 1999). In beiden Fällen interagieren polare Aminosäuren mit den Phospholipid-Kopfgruppen. 13 Einleitung Eukaryontisches Calmodulin und bakterielle Calmodulin-Bindeproteine Zwar kommt Calmodulin in Prokaryonten nicht vor, dennoch wurden einige Proteine identifiziert, die in vitro spezifisch mit Calmodulin interagieren. Die Adenylatcyclase aus den drei Spezies Anabaena species (Bianchini et al., 1990), Bordetella pertussis (Gordon et al., 1989; Wolff et al., 1980) und Bacillus anthracis (Gordon et al., 1989; Leppla, 1982) wird von Calcium-gebundenem Calmodulin aktiviert. In E. coli wurden spezifische Interaktionen zwischen Calmodulin und GlpD, GlpC, TraC bzw. SecA beobachtet (Hellstern, 1997). Die physiologische Bedeutung dieser Eigenschaft ist jedoch noch unklar. Calmodulin ist ein eukaryontisches, hochkonserviertes hitzestabiles Protein mit vier Calcium-Bindestellen, das in Eukaryonten an einer Vielzahl Ca2+-abhängiger Signaltransduktionswege beteiligt ist (Cohen, 1988; Hinrichsen, 1993). Ob Calciumabhängige Signaltransduktion in Prokaryonten ebenfalls eine Rolle spielen, bleibt spekulativ (Norris et al., 1996). Die vier Calciumbindestellen des 17 kDa großen Calmodulin liegen paarweise in Helix-Schleife-Helix-Motiven (auch „EF-Hand“ genannt) an beiden Enden des Moleküls (Babu et al., 1988; Kretsinger et al., 1991). Die Bindung von Calcium-Ionen verursacht eine Konformationsänderung, so dass hydrophobe Bereiche präsentiert werden, die von elektronegativen Aminosäuren flankiert sind (James et al., 1995). Damit kann Calmodulin an die jeweiligen Zielproteine binden. Es wurde gezeigt, dass Calmodulin positiv geladene Peptide bindet, die eine basisch amphipathische α-Helix ausbilden. Zudem wird beobachtet, dass die Calmodulin-Bindedomänen der Zielproteine trotz geringer Sequenzhomologie basisch amphipathische α-Helices aufweisen (O'Neil und Degrado, 1990). Sequenzvergleiche zeigten, dass einige hydrophobe Reste konserviert sind. Aufgrund dieser Homologien können die Helices in drei Bindungsmotivtypen unterschieden werden (Rhoads und Friedberg, 1997). Ziel dieser Arbeit Während in Eukaryonten physiologische Prozesse in Organellen kompartimentiert ablaufen, ist die prokaryontische Cytoplasma-Membran zentraler Dreh- und Angelpunkt vieler Reaktionen. Neben der Regulation auf Transkriptions- und Translationsebene ist die Translokation von Proteinen zu ihrem Wirkort eine weitere Regulationsebene. 14 Einleitung Die aerobe sn-Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenase (GlpD) aus E. coli ist ein lösliches Enzym, das aktiv ist, sobald es an die Membran bindet. Der molekulare Mechanismus dieser Anheftung wurde in der vorliegenden Arbeit untersucht. Zunächst wurde die spezifische Interaktion zwischen GlpD und Calmodulin biochemisch charakterisiert. Da in vivo die identifizierten Calmodulin-Bindeproteine aus E. coli mit der cytoplasmatischen Membran assoziiert sind, können diese Untersuchungen Aufschluss über die Art der GlpD-MembranAnheftung geben. Die Frage, ob GlpD direkt an die cytoplasmatische Membran bindet, wurde durch Monolayer-Experimente und Vesikelbindungsstudien beantwortet. Mit Hilfe der Monolayer-Technik wurde untersucht, ob GlpD Phospholipid-Monolayer penetrieren kann und welche Phospholipide diese Membraninsertion begünstigen. Mit Vesikelbindungsstudien wurde die Bindung zwischen GlpD und den verschiedenen Lipidtypen quantifiziert. Um den Einfluss von Lipiden auf die biologische Aktivität charakterisieren zu können, wurde die Enzymaktivität von GlpD in Anwesenheit von Liposomen gemessen. 15 Material und Methoden Material und Methoden Verwendete Materialien und deren Bezugsquellen Chemikalien und sonstige Materialien Agar Agarose Alkalische Phosphatase Ammoniummolybdat Bactotrypton CaM-Sepharose 4B Calmidazolium (R24571) Cardiolipin aus Rinderherz Chitin Beads Chlorpromazin Compound 48/80 Coomassie Brilliant Blue Coomassie Protein Assay Reagent Dialysemembran (Spectra/Por 6, MWCO 3500 Da) D,L-sn-Glycerin-3-Phosphat Dithiothreitol 1,2-Dioleoyl-sn-Glycerol-3-Phosphatidylcholin 1,2-Dioleoyl-sn-Glycerol-3-Phosphatidylethanolamin 1,2-Dioleoyl-sn-Glycerol-3-Phosphatidylglycerin DMSO EGTA ExpandTM-Polymerase FAD Fendilin IPTG Luminol 2-Mercaptoethanol Magermilchpulver (Frema Reform) Melittin (Bienengift) Molekulargewichtsstandard, LMW Molecular-Weight-Marker (SDS-PAGE) MTT Naphthalinsulfonamid (W7) Ni2+-NTA Agarose Nitrozellulosemembran (BA 85, 0.45 µm) Nucleoside Nonidet P-40 NZ-Amine A (Caseinhydrolysat) PMS p-Coumarsäure Restriktionsenzyme inkl. Puffer Röntgenfilme Fuji-RX Rotiblock SAWADY Pwo-DNA-Polymerase Sepharose 4B Natriumdisulfit Natriumsulfit Trifluoperazin Tween20 GibcoBRL, Eggenstein GibcoBRL Eggenstein Boehringer Mannheim Merck, Darmstadt GibcoBRL Eggenstein Pharmacia, Freiburg Sigma, Deisendorf Avanti Polar Lipids, Alabaster (USA) New England Biolabs Sigma, Deisendorf Sigma, Deisendorf Serva, Heidelberg Pierce, Rockford (USA) Spectrum Medical Industries (L.A., USA) Sigma, Deisendorf Serva, Heidelberg Avanti Polar Lipids, Alabaster (USA) Avanti Polar Lipids, Alabaster (USA) Avanti Polar Lipids, Alabaster (USA) Sigma Chemical Co, St. Louis (USA) Fluka, Neu-Ulm Boehringer Mannheim Sigma, Deisendorf Sigma, Deisendorf BTS (BioTech Trade & Service GmbH) Fluka, Neu-Ulm Fluka, Neu-Ulm Fink GmbH, Herrenberg Merck, Darmstadt Pharmacia, Freiburg Sigma, Deisendorf Sigma, Deisendorf Fluka, Neu-Ulm Qiagen GmbH, Hilden Schleicher & Schuell, Dassel Sigma Chemical Co, St. Louis (USA) ICN, Eschwege Interorgana, Köln Sigma, Deisendorf Fluka, Neu-Ulm Boehringer Mannheim, Gibco, BRL, New England Biolabs, Pharmacia, MBI, USB Allmedt, Essen Roth, Karlsruhe pEQLab, Erlangen Pharmacia, Freiburg Merck, Darmstadt Merck, Darmstadt Sigma, Deisendorf Sigma, Deisendorf 16 Material und Methoden Oligonukleotidprimer Alle aufgelisteten Oligonukleotide wurden von der Firma MWG-Biotech (Ebersberg) synthetisiert. pQE30-glpD.fwd 5´-cgcggatccgaaaccaaagatctgattgtg-3´ pQE30-glpD.rev 5´-gcgcctaggctttggtttctagactaacac-3´ PTYB11-glpD.fwd 5´-ggtggttgctctaccatggaaaccaaagatctgattgtg-3´ pQE30-glpD.rev 5´-ggtggtctgcagtcacgacgccagcgataacc-3´ pQE30-CBRIII.fwd 5´-cgcggatccgaaaccaaagatctgattgtg-3´ pQE30-CBRIII.rev 5´-gggttcgaacccgccttaactgctttttaaagtgc-3´ pQE30-glpD∆(351-372).fwd 5´-cggggtaccccgtattatcagggtattggcccggcatgg-3´ pQE30-glpD∆(351-372).rev 5´-cggggtaccccggccgaataccgacagcagcggtgctttgcc-3´ pQE30-glpD-R359E.fwd 5´-cggtaagctgaccacctacgaaaaactggcggaacatgcg-3´ pQE30-glpD-R359E.rev 5´-cgcatgttccgccagtttttcgtaggtggtcagcttacc-3´ pQE30-glpD-K360E.fwd 5´-ctgaccacctaccgagaactggcggaacatgcg-3´ pQE30-glpD-K360E.rev 5´-cgcatgttccgccagttctcggtaggtggtcag-3´ pQE30-glpD-AH362/4DE.fwd 5´-cctaccgaaaactggacgaagatgcgctggaaaaactaacgc-3´, pQE30-glpD-AH362/4DE.rev 5´-gcgtaagtttttccagcgcatcttcctccagttttcggtagg-3´ Verwendete Bakterienstämme Stammname relevanter Genotyp MC4100 F-araD139 ∆ (argF-lac)U169 rpsL 150 (Strr) relA1 flb5301 deoC1 (Casadaban, 1976) ptsF25 rbsR F´::Tn10 proA+B+laclq ∆(lacZ)M15/recA1 endA1 gyrA96 (Nalr) (Bullock et al., 1987) thi hsdR17(rk- mk+) supE44 relA1 lac F- lac- ara- gal-- mtl- recA+ uvr+ NalS StrS rifS (Villarejo und Zabin, 1974) F+ nadB7 supE (Dechavigny et al., 1991a) F- λ- fhuA2 [lon] ompT lacZ::T7 gene1 gal sulA11 ∆(mcrC- New England Biolabs mrr)114::IS10 R (mcr-73::miniTn10-TetS) R(zgb-210::Tn10) (TetS) endA1 [dcm] XL1-Blue M15[pREP4] W3899 ER2566 Referenz/Quelle 17 Material und Methoden Verwendete Plasmide Plasmid Beschreibung/Genotyp/ r Referenz/Quelle pQE 30 pDS56/RBSII Amp Stüber et al.,1990 pTYB11 N-terminaler Intein-Fusionsvektor New England Biolabs pAW4 pQE30-glpD diese Arbeit pAW7 pTYB11-glpD diese Arbeit PAW9 pQE30-glpD∆(351-372) diese Arbeit pAW13 pQE30-CBRIII diese Arbeit pAW16 pQE30-glpD-K359E diese Arbeit pAW17 pQE30-glpD-K360E diese Arbeit pAW18 pQE30-glpD-AH362/4DE diese Arbeit Verwendete Kulturmedien Die Medien wurden nach Miller (Miller, 1972) hergestellt. Sie wurden 20 Minuten bei 120° C und einem Druck von 1 bar autoklaviert, auf 50-60° C abgekühlt und anschließend je nach Bedarf mit hitzelabilen Medienzusätzen versetzt. LB-Medium 1% Bactotrypton (w/v), 0.5% Hefeextrakt (w/v), 0.5% NaCl(w/v) NZA-Medium 1% NZ-Amine-A (w/v), 0.5% Hefeextrakt (w/v), 0.5% NaCl(w/v) SOC-Medium 2% Bactotrypton (w/v), 0.5% Hefeextrakt (w/v), 10mM NaCl, 2.5 mMKCl, 10 mM MgCl2, 10 mM MgSO4, 20 mM Glucose 2xTSS-Medium 1% Bactotrypton (w/v), 0.5% Hefeextrakt (w/v), 0.5% NaCl(w/v), 20% (w/v) PEG-6000, 10% (v/v) DMSO, 100 mM MgSO4 Für Agarplatten wurden je Liter Medium 20g Select-Agar zugegeben. Nachdem die Medien auf 50-60° C abgekühlt waren, wurden je nach Bedarf Antibiotika zugesetzt. Mikrobiologische Methoden Aufbewahrung von Bakterienstämmen Die verwendeten Bakterienstämme wurden als DMSO-Kulturen bei –70°C aufbewahrt. Hierzu wurde eine Übernachtkultur mit DMSO [10% Endkonzentration (v/v)] gemischt und als Suspension eingefroren. 18 Material und Methoden Wachstumsbedingungen Flüssigkulturen wurden in Gefäßen, die eine ausreichende Belüftung zuließen, in Reagenzglasrollständern oder in thermostatisierten Schütteltruhen bei 37°C bzw. 28°C inkubiert. Bestimmung der Zelldichte in Flüssigkulturen Die Zellzahl von Flüssigkulturen wurde bestimmt, indem die optische Dichte der Kultur bei einer Wellenlänge von λ = 578 nm (OD578) photometrisch gemessen wurde. Nach Miller entspricht eine optische Dichte OD578 von 1 etwa 107 µg/ml Protein und einer Zellzahl von 109 Zellen pro ml (Miller, 1972). Molekularbiologische Methoden Standardmethoden Die routinemäßigen molekularbiologischen Arbeiten wie DNA-Restriktion, Ligation, Ethanolfällung, Dephosphorylierung mit alkalischer Phosphatase, Analyse von Restriktionsfragmenten durch Agarose- bzw. PAA-Gelelektrophorese, Isolation von Plasmid DNA aus E. coli-Zellen mittels Cäsiumchlorid-Dichtegradienten-Zentrifugation, Transformation durch Elektroporation und Plasmid-Minipräparation (Concert Rapid Plasmid Miniprep Kit, Gibco Karlsruhe) wurden nach Standardprotokollen (Sambrook et al., 1989) bzw. nach Angaben der Hersteller durchgeführt. Polymerase-Kettenreaktion Die Polymeraskettenreaktion (PCR) wurde durchgeführt, um glpD bzw. glpD-Fragmente in die Überexpressionsvektoren pQE30 bzw. ptYB11 zu klonieren. Der Reaktionsansatz setzte sich standardmäßig aus 0.5 µg chromosomaler DNA von E. coli [MC4100] bzw. 10 ng Plasmid-DNA, jeweils 100 pmol Vorwärts- bzw. RückwärtsOligonukleotidprimer (Primer), jeweils 4 µM Nukleotide, PCR-Puffer (nach Angaben des Herstellers) und 2.6 Units Polymerase (SAWADY Pwo-DNA-Polymerase). Die Polymerasekettenreaktion wurde in einem Thermocycler (Perkin Elmer GeneAmp PCR System 2400) durchgeführt. Nach einer initialen Denaturierung bei 95°C für 5 min erfolgten 30 Zyklen, zusammengesetzt aus jeweils einem Denaturierungsschritt, bei dem die DNA-Stränge 19 Material und Methoden voneinander getrennt werden (30 s bei 95°C), einem Annealingschritt, um die Primer mit dem Template (chromosomale DNA) zu hybridisieren (45 s, Tm , s.u.) und einem abschließenden Elongationsschritt, bei dem die Primer komplementär zur Template-DNA von der Polymerase verlängert werden (90 s 72°C). Die Schmelztemperatur Tm wurde nach folgender Formel bestimmt: Tm = 69.3°C + 0.41 x (GC-Gehalt in %) – 650/Oligonukleotidlänge – 2°C Die amplifizierten DNA-Fragmente wurden mit dem Concert Rapid PCR Purification System (Gibco, Karlsruhe) gereinigt. Gerichtete Mutagenese mittels Fusions-PCR Punktmutationen sowie Deletionen wurden gerichtet in die kodierenden Sequenzen eingefügt, nach der von Ho und Mitarbeitern etablierten Methode (Ho et al., 1989). Hierfür wurden flankierende Primer, die das 5´-Ende bzw. das 3´-Ende beinhalten, sowie Mutationsprimer eingesetzt, die in der Mitte die gewünschte Mutation tragen und komplementär zueinander sind. Mit je einem mutierten und einem der flankierenden Primer wurde die vordere bzw. die hintere Hälfte der Sequenz durch PCR amplifiziert. Die beiden PCR-Produkte tragen die Punktmutationen und wurden in einer dritten PCR fusioniert. Da die PCR-Produkte im mutagenisierten Bereich überlappen, hybridisieren sie miteinander und wurden durch die PCR verlängert. Die Ausbeute der Fusions-PCR wurde durch Zusatz der flankierenden Primer gesteigert. Deletionen wurden ebenfalls durch Fusions-PCR hergestellt. Hierzu wurden Primer upstream bzw. downstream der Deletionsstelle ausgewählt. Da die Primer zusätzlich eine Schnittstelle trugen und in der Restriktionsschnittstelle komplementär zu einander waren, überlappten die PCR-Fragmente und konnten so wie oben beschrieben in einer dritten PCR verlängert werden. Die PCR-Produkte wurden durch elelektrophoretische Auftrennung, gefolgt von Elution aus einem Agarose-Gel mittels Qiaquick Gelextraction Kit (Qiagen) gereinigt. 20 Material und Methoden Konstruktion der Vektoren Zur Herstellung des Polyhistidin-GlpD-Fusionsprotein kodierenden Plasmids pAW4 wurde das offene Leseraster glpD aus chromosomaler E. coli DNA [MC4100] ohne das Startcodon ATG amplifiziert. Dabei wurden als Vorwärtsprimer pQE30-glpD.fwd und als Rückwärtsprimer pQE30-glpD.rev eingesetzt. Das PCR-Produkt sowie der Überexpressionsvektor pQE30 wurden mit den Restriktionsenzymen BamHI und HindIII geschnitten. Das geschnittene PCR-Produkt wurde mit dem geschnittenen und dephosphorylierten Vektor ligiert. Das C-terminal um 190 Aminosäuren verkürzte, GlpD kodierende Plasmid pAW13 wurde wie oben beschrieben mit den Primern CBRIII-glpD.fwd und CBRIII-glpD.rev erzeugt. Die GlpD∆(351-372)- GlpD-R359E, GlpD-K360E bzw. AH362/4DE kodierenden Plasmide pAW9, pAW16, pAW17 bzw. pAW18 wurden mittels PCR amplifiziert und gerichtet in pQE30-Vektoren kloniert. Durch gerichtete Klonierung von glpD in den Überexpressionsvektor ptYB11 entstand das Plasmid pAW7, das für ein Intein-GlpD-Fusionsprotein kodiert. Aus chromosomaler E. coli-DNA wurde glpD mit den Primern glpD-pTYB11.fwd und glpD-pTYB11.rev amplifiziert. Vektor und PCR-Produkt wurden mit den Restriktionsenzymen PstI und SapI geschnitten und ligiert. Alle klonierten Konstrukte wurde von der Firma GATC (Konstanz) kontrollsequenziert. TSS-Transformation Die TSS Transformation nach Chung und Mitarbeitern ist ein schnelle und zuverlässige Methode, E. coli-Zellen mit Plasmid-DNA zu transformieren (Chung et al., 1989). Einer Übernachtkultur der zu transformierenden Zellen wurde 1:100 mit LB-Medium verdünnt. Die bei 37°C wachsenden Zellen wurden in der logarithmischen Phase aliquotiert (50 µl) und auf Eis mit demselben Volumen von kaltem 2xTSS-Medium versetzt. 10 ng Plasmid-DNA wurde zu den kompetenten Zellen gegeben und 20 min auf Eis inkubiert. Der Transformationsansatz wurde in 1 ml SOC-Medium überführt und bei 37°C im Roller inkubiert. Anschließend wurden die Zellen auf Selektionsplatten ausplattiert. Da diese Methode keine hohe Transformationseffizienz ermöglicht, wurden zur Transformation von Ligationsansätzen eine Transformation durch Elektroschock durchgeführt (Sambrook et al., 1989). 21 Material und Methoden Biochemische Methoden SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese SDS-PAGE wurde nach der Methode von Laemmli durchgeführt (Lämmli, 1970). Zur Auftrennung von rekombinanten GlpD-Proteinen wurden 10% Polyacrylamid (PAA)-Gele verwendet, die 0.1% SDS enthielten. Die Auftrennung des verkürzten CBRII-GlpDFragments erfolgte in 15% PAA-Gelen. Die aufzutrennenden Proben wurden 1:1 (v/v) mit SDS-Probenpuffer (10 mM Tris-HCl pH 8.0. 2.5% SDS, 5% β-Mercaptoethanol, 0.05% Bromphenolblau) versetzt, 5 min bei 95° C erhitzt und einer SDS-PAGE unterzogen. Zur Bestimmung des apparenten Molekulargewichts wurden die Molekulargewichtsstandards SDS 7B (Sigma) und LMW-Marker (Pharmacia) verwendet. Coomassie Blue-Färbung von SDS-PAA-Gelen Nach der gelelektrophoretischen Auftrennung wurden die Proteinbanden mit 0.05% Coomassie Brilliant Blue R250 in 25% Isopropanol, 10% Essigsäure für mindestens eine Stunde angefärbt. Proteinbanden wurden durch Entfärben in 20% Methanol und 10% Essigsäure sichtbar gemacht. Western Blot und Immunfärbung von Proteinen Für einen spezifischen Nachweis wurden die mittels SDS-PAGE aufgetrennten Proteine nach der Semi-dry-Methode 1 h bei einem konstanten Stromfluss von 0.8 mA/cm2 auf eine Nitrozellulosemembran transferiert (Kyhse-Andersen, 1984). Die Membran wurde zweimal jeweils 5 min mit TBSI-Puffer (10 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.05% Nonidet P-40) gewaschen. Zur Absättigung der Protein-Bindestellen wurde die Membran mindestens eine Stunde in einer Blocklösung (Rotiblock, Roth) inkubiert. Nach zweimaligem Waschen (5 min) mit TBSI-Puffer erfolgte die Inkubation mit dem primären anti-GlpD-Antikörper (gelöst in TBSI, 3% BSA, 0.02% NaN3). Dann wurde die Membran 3 x 3 min mit TBSI gewaschen und eine Stunde mit sekundärem Peroxidasegekoppelten anti-Kaninchen-Antikörper inkubiert. Nach 3 x 3-minütigem Waschen wurde der Blot mit 2 ml ECL-Detektionsreagenz für 1 min inkubiert. Die Chemilumineszenz des sekundären Antikörpers wurde auf einem Röntgenfilm nachgewiesen. 22 Material und Methoden Das ECL-Reagenz wurde wie folgt hergestellt: ECL-Lösung I: 100 mM Tris-HCl (pH 8.5, V = 500 ml) wurde unter ständigem Rühren entgast (Zugabe einiger Tropfen flüssigen Stickstoffs zur Verdrängung von O2). Tropfenweise wurden unter ständigem Rühren 2.5 ml einer 0.18 M p-Cumarsäure (in DMSO gelöst) und 1.2 ml einer 0.5 M Luminol-Lösung (3-Aminophtalhydrazid, unter N2-Begasung in DMSO gelöst) zugegeben. Die Lösung wurde sterilfiltriert und in einer braunen Flasche bei RT aufbewahrt. Luminol-Aliquots wurden bei -20°C gelagert. ECL II besteht aus einer 18%igen H2O2-Lösung, die dunkel und kühl gelagert wurde. Die gebrauchsfertige Lösung wurde unmittelbar vor der Anwendung gemischt, wobei 2 ml ECL-Lösung I mit 10 µl ECL II gemischt wurden. Protein-Präzipitation mit 10% Trichloressigsäure Durch Trichloressigsäure-Fällung wurden Detergenzien und Lipide aus den Proteinproben entfernt. Hierzu wurde die wässrige Probe mit demselben Volumen an eisgekühlter 10% Trichloressigsäure gemischt (vortexen) und 20 min auf Eis inkubiert. Nach 15 min Zentrifugation (10.000xg, 4°C) wurde der Überstand dekantiert. Trichloressigsäure im Proteinpellet wurde durch mehrmaliges Waschen mit eisgekühltem 80% Aceton und H2O entfernt. Für SDS-PAGE wurden denaturierte Proteinproben mit SDS-Probenpuffer versetzt bzw. zur BCA-Proteinbestimmung in 0.1% SDS gelöst. Proteinbestimmung Proteinkonzentrationen wurden mit dem Coomassie Protein Assay Reagent (Pierce) nach der Methode von Bradford (Bradford, 1976) bestimmt. Proben, die Detergenzien oder Lipide enthielten, wurden mit 10% TCA präzipitiert. Die Proteinkonzentration wurde mit dem BCA Detection Kit (Pierce) nach der Methode von Smith (Smith et al., 1985) bestimmt. Die Konzentration homogener Proteinlösungen mit bekannter Aminosäurezusammensetzung wurden ferner durch UV-Absorption bei 280 nm nach Lambert Beer mit folgender Formel bestimmt : c = A280 ⋅ MW (ε ⋅ d ) 23 Material und Methoden Wobei c = Proteinkonzentration (g/l), A = Absorption, M W = Molekulargewicht, d = Schichtdicke (cm), der Extinktionskoeffizient ε wurde wie folgt berechnet: ε = (nTryptophan ⋅ 5546 + nTyro sin ⋅ 1340 + n Phenylalanin ⋅ 10 + nCystein ⋅ 30)mol −1cm −1 Enzymaktivitätstest Die Enzymaktivität der aeroben Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenase wurde 10 min lang photometrisch bei Raumtemperatur mittels der PMS-gekoppelten Reduktion von MTT bei einer Wellenlänge von 570 nm gemessen (Kistler und Lin, 1972). Proteinmenge [μg] Der Testansatz (V=250 µl) enthielt 50 mM Tris-HCl, pH 7.4, 75 mM NaCl, 0.5 mM MTT, 0.2 mM PMS, 10 µM FAD, 75 ng gereinigtes GlpD. Die Reaktion wurde mit 20 mM D,L-Glycerin-3-Phosphat gestartet. Die spezifische Aktivität wurde angegeben in [nmol] reduziertes MTT pro [µg] GlpD und Minute. Sie wurde nach folgender Formel berechnet: spez. Aktivität GlpD = 1 Gesamtvolumen ∆A 1 ⋅ ⋅ ⋅ min ε 570 0.5cm Pr oteinmenge[ µg ] Der Extinktionskoeffizient ε des reduzierten MTTs beträgt 17 mM-1cm-1 (Kistler und Lin, 1972), ∆ A bezeichnet die Absorbtionsänderung. 24 Material und Methoden Reinigung von rekombinantem GlpD über Chitinaffinitätschromatographie Rekombinantes GlpD wurde als Intein-Fusionsprotein überexprimiert und über ChitinAffinitätschromatographie mit anschließender Abspaltung des Inteinrestes gereinigt. Das GlpD-Intein-Fusionsprotein (MW = 113 kDa) kodierende Plasmid pAW7 wurde in den Überexpressionsstamm ER2566 transformiert. Für die Reinigung wurde eine Übernachtkultur des GlpD-Expressionsstamms 1:100 mit NZA-Medium (100 µg/ml Ampicillin, V = 2 Liter) verdünnt. Nachdem die bei 37°C wachsenden Zellen die logarithmische Wachstumsphase (OD600 = 0.5-0.7) erreicht hatten, wurde die Proteinexpression mit 0.5 mM IPTG induziert. Vor Erreichen der stationären Phase (OD600 = 1.0) wurden die Zellen durch Zentrifugation (8000xg, 30 min, 4°C) geerntet. Alle nun folgenden Schritte wurden bei 4–8°C durchgeführt. Die Zellen wurden 20fach konzentriert in Lysepuffer (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 1% Tween20) resuspendiert und mittels einer zweifache Passage durch eine French-Pressure Cell Press (12000 p.s.i., 4°C, American Instrument Co, Silver Spring, MD, USA) lysiert. Der Überstand des abzentrifugierten (12000xg, 4°C) Lysats wurde auf eine mit Lysepuffer äquilibrierte Chitinsäule (V = 2 ml, Durchmesser 1 cm) bei einer konstanten Flussrate von 0.25 ml/min aufgetragen. Unspezifisch gebundene Proteine wurden mit 100 ml Waschpuffer (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 1 M NaCl, 1 mM EDTA, 0.1% Tween20) bei einer Flussrate von 1 ml/min entfernt. Die Chitinmatrix wurde anschließend 20 h bei 23°C in einem “Cleavagepuffer“ (20 mM Tris-HCl pH 8.0, 500 mM NaCl, 100 mM DTT, 0.1% Tween20) inkubiert. In Anwesenheit des Thiols DTT erfolgte die Abspaltung (“Splicing“) des rekombinanten GlpD von seinem N-terminalen Inteinrest (MW = 55 kDa), der an die Chitinbeads gebunden hat. Das Protein wurde mit Elutionspuffer (20 mM Tris-HCl pH 7.4, 500 mM NaCl, 1 mM EDTA, 0.1% Tween20) von der Säule eluiert. Eluatfraktionen, die gereinigtes und abgespaltenes Protein enthielten, wurden dreimal gegen Dialysepuffer (1000faches Volumen, 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.1% Tween20) dialysiert. ∆(351-372), R349E-, K360E, Reinigung der Wildtyp-, CBRIII-, GlpD∆ AH362/4DE-Fusionsproteine über Ni2+/NTA-Affinitätschromatographie Rekombinantes GlpD-Wildtyp-Protein sowie das verkürzte CBRIII Fragment, die Deletionsmutante GlpD∆(351-372) und die mutierten Isoformen R349E-, K360E, AH362/4DE wurden als N-terminale 6xHistidin-Fusionsproteine in einer einstufigen Affinitätschromatographie gereinigt. 25 Material und Methoden Die klonierten Plasmide, die anstelle des ersten Methionins sechs Histidine kodieren, wurden zur Expression in den Stamm M15 transformiert. Wegen einer beobachteten PlasmidInstabilität wurde vor jeder Reinigungsprozedur das jeweilige Plasmid frisch transformiert. Die Expression unterlag der Kontrolle des Lactose-Operons und konnte durch IPTG induziert werden. Um zu vermeiden, dass die Zellen vor der logarithmischen Wachstumsphase rekombinantes Protein exprimieren (“ground leakage“), wurde Lactose-freies Medium verwendet. Für die Reinigung wurde eine Übernachtkultur des GlpD-Expressionsstamms 1:100 mit NZA-Medium (V = 4 Liter) verdünnt. Nachdem die bei 28°C wachsenden Zellen die logarithmische Phase erreicht hatten (OD600 = 0.5 - 0.7), wurden sie mit 1 mM IPTG induziert. Drei Stunden nach der Induktion wurden die Zellen durch Zentrifugation (8000xg, 30 min, 4°C) geerntet. Das Zellpellet wurde in flüssigem Stickstoff eingefroren und 15 min auf Eis aufgetaut. Alle nachfolgenden Schritte wurden bei 4-8°C durchgeführt. Die aufgetauten Zellen wurden in Lysepuffer (50 mM NaPO4 pH 8.0, 300 mM NaCl, 1% Tween20, 10 mM β-Mercaptoethanol, 10 mM Imidazol) 20fach konzentriert resuspendiert und mittels zweimaliger Passage durch eine French-Pressure Cell Press (12000 p.s.i., 4°C) lysiert. Nach Zentrifugation (40.000xg, 30 min, 4°C) wurde der Überstand auf eine mit Lysepuffer äquilibrierte Ni2+-NTA-Agarose-Säule (Qiagen, V = 1ml) bei einer konstanten Flussrate von 5 ml/min aufgetragen. Unspezifisch gebundene Proteine wurden durch Waschen mit Waschpuffer I (50 mM NaPO4 pH 7.0, 10 mM Imidazol, 300 mM NaCl, 1% Tween20, 10 mM β-Mercaptoethanol) sowie Waschpuffer II (50 mM NaPO4 pH 7.0, 30 mM Imidazol, 300 mM NaCl, 1% Tween20, 10 mM β-Mercaptoethanol) entfernt. Die Polyhistidin-Fusionsproteine wurden mit Elutionspuffer (50 mM NaPO4 pH 7.4, 250 mM Imidazol, 300 mM NaCl, 1% Tween20, 10 mM β-Mercaptoethanol) bei einer Flussrate von 0.5 ml/min eluiert. Eluatfraktionen, die gereinigtes Protein enthielten, wurden dreimal gegen Dialysepuffer (1000faches Volumen, 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 0.1% Tween20) dialysiert. Für Liposomen-stimulierte Enzymaktivitätsmessungen sowie Monolayer-Experimente und LUVET-Bindungsstudien wurde die Reinigungsprozedur mit folgenden Modifikationen durchgeführt: Die Puffer enthielten weder Tween20 noch andere Detergenzien. Im Lysepuffer waren 500 mM NaCl, im Waschpuffer II 1 M NaCl und im Elutionspuffer 250 mM NaCl und 10% Glycerin enthalten. Gereinigtes Protein wurde dreimal gegen Dialysepuffer (1000faches Volumen, 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 75 mM NaCl und 10% Glycerin) dialysiert. 26 Material und Methoden Bindungsstudien von Wildtyp- und mutagenisiertem GlpD an CalmodulinSepharose 4B Die Bindungsstudien wurden in einem sogenannten „Batchverfahren“ durchgeführt. Alle Schritte wurden bei 8°C durchgeführt, und von jedem Schritt wurde ein Aliquot abgenommen, das anschließend mittels SDS-PAGE und Immunoblotting analysiert wurde. Um die Bindung von GlpD an Calmodulin (CaM) zu charakterisieren, wurde, falls nicht anders angegeben, 1 µg GlpD in einem Testansatz von 250 µl mit 15 µl CaM-Sepharose 4B in Anwesenheit von Ca2+/CaM-Bindepuffer (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 0.1% Tween20) auf einem Roller für 1 h bei 8°C inkubiert. In den Kontrollansätzen wurde Ca2+/CaM-Bindepuffer, der 10 mM EGTA (anstelle von 2 mM CaCl2) enthielt, verwendet bzw. statt der CaM-gekoppelten Sepharose wurde nur Sepharose 4B eingesetzt. Bei Kompetitionsstudien wurden CaM-Antagonisten (50 µg/ml Compound 48/80, 150 µM TFP, 20 mM R24571, 60 µM Melittin, 150 µM Fendilin, 100 µM Chlorpromazin) in die Reaktionsansätze gegeben. Die Proben wurden bei 8°C 1 h auf dem Roller inkubiert. Der Überstand wurde nach kurzer Zentrifugation des Testansatzes abgenommen und das Sepharose-Sediment wurde in einem Gesamtvolumen von 1 ml CaM-Bindepuffer resuspendiert. Dieser Waschschritt wurde zunächst dreimal mit Ca2+/CaM-Bindepuffer und dreimal mit Waschpuffer (50 mM TrisHCl pH 7.4, 500 mM NaCl, 2 mM CaCl2, 0.1% Tween20) wiederholt, um unspezifisch gebundenes Protein zu entfernen. Um spezifisch gebundenes Protein zu eluieren, wurde das Sediment in 250 µl Elutionspuffer (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 150 mM NaCl, 10 mM EGTA, 0.1% Tween20) resuspendiert. Nach einer 30-minütigen Inkubation auf dem Roller bei 8°C wurde nach kurzer Zentrifugation der Überstand abgenommen. Nach zwei weiteren Waschschritten mit Elutionspuffer (V = 1 ml) wurde das Pellet mit SDS-Probenpuffer (in einem Gesamtvolumen von 250 µl) versetzt. Bei Kompetitionsstudien mit kleinen Liposomen (SUVs) wurde der Bindungstest wie oben beschrieben jedoch ohne Tween20 durchgeführt. Präparation von SUVs (Small Unilamellar Vesicles) Zur Herstellung von Lipidlösungen (10-20 mg Lipid/ml) wurden organische Lösungsmittel eingesetzt: 100% Chloroform bei zwitterionischen Phospholipiden bzw. ein Chloroform:Methanol-Gemisch (75/25 (v/v)) bei anionischen Phospholipiden. Es wurden ausschließlich Glasgefäße verwendet. Sollten Liposomen mit unterschiedlicher LipidZusammensetzung hergestellt werden, so wurden die Lipide in organischem Lösungsmittel 27 Material und Methoden gemischt. Dann wurde ein Lipidfilm hergestellt, indem das organische Lösungsmittel unter Stickstoff-Begasung verdampft wurde. Der Lipidfilm wurde im Exsikkator getrocknet. Mehrschichtige große Liposomen (multilamellar vesicles, MLV) bilden sich spontan, wenn der Lipidfilm in wässriger Lösung (50 mM Tris-HCl pH 7.4, 75 mM NaCl) vollständig hydratisiert wurde, z.B. durch vortexen unter Zuhilfenahme von Glaskügelchen. Kleine, einschichtige Liposomen (mit einem Durchmesser von 25-50 nm) wurden durch Ultraschallbehandlung hergestellt. Dazu wurde die MLVs enthaltende Lipidsuspension auf Eis unter Stickstoff-Begasung 10mal 30s bei 50 W sonifiziert, wobei nach jedem „Burst“ eine 30s Pause erfolgte. Bildeten sich SUVs, so wurde die Suspension klarer, die Lösung war „leicht neblig transparent“. Größere multilamellare Strukturen wurden durch Zentrifugation (30 min, 37.000xg) sedimentiert, die SUVs waren im Überstand enthalten. Präparation LUVETs (Large Unilamellar Vesicles prepared by Extrusion Technique) Große, einschichtige Liposomen (Durchmesser 100-400 nm) wurden aus MLVs hergestellt, die nach 10 Einfrier-Auftau-Zyklen in einem Ethanol/Trockeneisbad (-80°C) 10mal durch einen Polycarbonatfilter (200 nm Porengröße) gepresst wurden (Extrusion). Aufgrund ihrer Form sind LUVETs geeignet, Biomembranen zu modellieren. Lipid Extraktion nach Bligh und Dyer Phospholipide wurden aus wässrigen Lösungen nach der Methode von Bligh und Dyer isoliert (Bligh und Dyer, 1959). Wurden Phospholipide aus kleinen Volumina (1-5 ml) zur quantitativen Analyse gereinigt, so wurden in einem ersten Schritt 0.8 Volumeneinheiten der zu untersuchenden Probe (enthält 0.1 M HCl) mit 2 Volumeneinheiten Methanol und 1 Volumeneinheit Chloroform durch vortexen gemischt. Zu diesem Ein-Phasen-Gemisch wurde eine Volumeneinheit 0.1 M HCl und eine Volumeneinheit Chloroform gegeben und gemischt. Es bildet sich ein zwei Phasen-Gemisch, wobei sich Chloroform mit den gelösten Lipiden in der unteren Phase befindet. Die Chloroformschicht wurde quantitativ in ein Glasröhrchen überführt. Die wässrige Phase wurde zweimal mit 1.2 Volumeneinheiten Chloroform gewaschen. 28 Material und Methoden Phosphor Bestimmung nach Fiske Subbarow Die Menge an Phospholipiden wurde durch eine Phosphorbestimmung nach der Methode von Fiske-Subbarow bestimmt (Fiske und Subbarow, 1925). Die zu analysierenden Proben wurden in phosphorfreie Glasröhrchen überführt und im Trockenofen (200°C) eingeengt. Zu den getrockneten Proben wurde jeweils 0.3 ml 70% Perchlorsäure gegeben. Das mit einer Glasmurmel abgedichtete Röhrchen wurde 3 h bei 180°C inkubiert, um die Phospholipide zu zerstören. Zu den abgekühlten Proben wurden jeweils 3 ml Ammoniummolybdatlösung und 120 µl Fiske-Subbarow Reagenz gegeben. Die gevortexten Proben wurden 15 min in einem Wasserbad gekocht und nach Abkühlung photometrisch bei 830 nm gemessen. Eine Eichgerade wurde aus Proben mit 0 – 125 nmol anorganischem Phosphat (0.5 mM KH2PO4) erstellt. Dazu wurden folgende Reagenzien hergestellt: Ammoniummolybdat-Lösung: 2.2 g NH4-Molybdat wurde in 20 ml 98% H2SO4 gelöst (= 90 mM (NH4)6 MO7O24x4H2O). Nach 15 min Rühren wurde die Lösung mit H2O 20fach verdünnt. Fiske-Subbarow Reagenz: In 200 ml H2O wurden 27.36 g Natriumdisulfit (= 720 mM Na2S2O5) und 1 g Natriumsulfit (= 40 mM Na2SO3) gelöst. Dann wurden 0.5 g 1-Amino-2-Naphtalen-4-Sulfonsäure zugegeben und unter ständigem Rühren bei 40°C gelöst und über Nacht stehen gelassen. Das filtrierte Reagenz wurde in einer lichtundurchlässigen Flasche aufbewahrt. Isolierung und Reinigung des gesamten Phospholid-Extrakts aus E. coli (TLE) W3899-Zellen (V= 5 Liter) wurden in der späten logarithmischen Phase (OD600 = 0.8) geerntet (30 min, 8000xg, 4°C) und mit physiologischer Salzlösung (PSS, 0.9% w/v NaCl) gewaschen. Das Nassgewicht der Zellpellets wurde bestimmt. 12 g Zellpellet wurden in 300 400 ml PSS resuspendiert. Die Extraktion aller Phospholipide aus E. coli erfolgte nach der Methode von Bligh und Dyer unter Verwendung von Glasgefäßen. Eine Volumeneinheit Zellsuspension (= 300 400 ml) wurde mit einer Volumeneinheit Chloroform und 2.2 Volumeneinheiten Methanol in einem Scheidetrichter gemischt. Das Gemisch wurde nun im Scheidetrichter mindestens 5 29 Material und Methoden min geschwenkt (hin und wieder wurde Chloroform durch einen Hahn entweichen gelassen), bis sich ein Ein-Phasensystem eingestellt hatte. Ein optimales Einphasengemisch erkennt man an vielen rasch entweichenden Luftblasen. Dann wurde jeweils eine Volumeneinheit Chloroform und PSS zugegeben und das Gemisch erneut für mindestens 5 min geschwenkt. Sobald eine Phasentrennung auftrat, wurde die Chloroformphase (unterste Phase: enthält Phospholipide, neutrale Lipide und Fettsäuren) abgelassen und gesammelt. Die wässrige Phase wurde erneut mit einer Volumeneinheit Chloroform unter Schwenken gewaschen und nachdem sich das Gemisch in zwei Phasen aufgetrennt hatte, wurde die Chloroformphase abgelassen und gesammelt. Dies wurde noch ein weiteres Mal wiederholt. Das gesammelte Lipid-Chloroform-Gemisch wurde in einem Rotationsevaporator eingedampft. Da der rohe Lipidextrakt noch viel Protein enthält, wurde die Prozedur erneut wiederholt. Um neutrale Lipide, Fettsäuren und andere Kontaminationen aus dem Lipidextrakt zu entfernen, wurde der rohe Lipidextrakt in einem kleinen Volumen (1-10 ml) auf eine Silicagel-Säule (Baker 60 mm Partikel, Durchmesser 2 cm, Länge 25 cm) geladen. Die Säule wurde mit 500 ml Chloroform gewaschen, dabei eluierten alle neutralen Lipide und andere Kontaminationen. Phospholipide wurden durch 500 ml Chloroform:Methanol (1:1, v/v) eluiert. Die Reinheit des Extraktes wurde durch Dünnschicht-Chromatographie bestimmt (Fine und Sprecher, 1982). Monolayer-Experimente Lipid-Moleküle orientieren sich an einer Pufferoberfläche spontan zu einem Lipid-Monolayer. Die polaren Kopfgruppen sind in Kontakt mit der wässrigen Phase, die hydrophoben Kohlenwasserstoffketten ragen heraus. Mit der Wilhelmy Plate Methode (Demel, 1994) wurde der Druck von Lipidmonolayern gemessen. Lagert sich ein Peptid zwischen die Kohlenwasserstoffketten der Lipide ein, so bewirkt dies eine messbare Änderung der Oberflächenspannung. Da die Oberflächenspannung der Pufferlösung bekannt ist, entspricht die Differenz zwischen der gemessenen Spannung und der Pufferoberflächenspannung dem Druck des Lipidlayers. Informationen über einen aufgesprühten Lipidmonolayer erhält man durch die Messung des Drucks an der Oberfläche. Ein dünnes Platinplättchen (1.96 cm breit, 1 cm lang) mit einer rauen Oberfläche wurde in eine wässrige Lösung getaucht. Das Gewicht des Plättchens wurde durch eine Waage (Cahn 2000 Microbalance) bestimmt und diente als Maß für den Oberflächendruck. Der Druck an der Oberfläche π wird definiert als die Differenz 30 Material und Methoden zwischen der Oberflächenspannung der wässrigen Phase (γPuffer = 72 mN/m) und der Oberflächenspannung des die Oberfläche bedeckenden Lipidfilms: π = γ Puffer − γ Monolayer Die Wilhelmy Plate Methode misst den Druck nicht direkt, sondern die jeweilige Oberflächenspannung. Somit sind Messungen kleinster Druckänderung mit einer Genauigkeit von 0.01 mN/m möglich. Mit dem teilweise eingetauchten Plättchen wird die Spannungsänderung gemessen. Auf das Platinplättchen wirken verschiedene Kräfte. Einerseits wirkt das Gewicht P und die Oberflächenspannung nach unten, anderereits die Archimedes Auftriebskraft A nach oben. Die Netto-Kraft, die nach unten wirkt, wird folgendermaßen berechnet: F = P + 2 ⋅ ( w + t ) ⋅ γ ⋅ cosθ − A Wobei w die Breite, t die Dicke des Plättchens ist (da t <<w, kann t vernachlässigt werden). θ ist der Kontaktwinkel zwischen der flüssigen und festen Phase. Ist das Plättchen vollständig benetzt (begünstigt durch raue Oberfläche), so ist der Kontaktwinkel θ = 0, cos θ = 1 , so dass gilt: F = P + 2 ⋅ w ⋅γ − A Wird ein Monolayer auf die Oberfläche gesprüht , so gilt: ∆F = −( P + 2 ⋅ w ⋅ γ − A) Puffer − ( P + 2 ⋅ w ⋅ γ − A) Monolayer da P und A konstant bleiben, kann man folgendermaßen vereinfachen: ∆F = −2 ⋅ w ⋅ (γ Puffer − γ Monolayer ) Da der Druck an der Oberfläche der Differenz zwischen der Oberflächenspannung des Puffers und des Lipidfilms entspricht, gilt: 31 Material und Methoden ∆F = − 2 ⋅ w ⋅ π daraus folgt: π =− ∆F 2⋅w Für Monolayer-Experimente wurde der Druck einer Oberfläche bei 28+1°C und kontinuierlichem Rühren gemessen. Filtrierter und entgaster Subphasenpuffer (50 mM Tris-HCl, 75 mM NaCl pH 7.4) wurde in ein Teflongefäß gefüllt (5 ml Volumen, 8.81 cm2 Oberfläche). Die Lipide wurden aus einer Chloroform- bzw. Chloroform:Methanol-(1:1 v/v) Stammlösung auf die Pufferoberfläche gesprüht. Bei den Messungen wurden Monolayer mit einem Oberflächendruck zwischen 25 und 35 mN/m verwendet. Experimente mit geringeren Anfangsdrücken wurden nicht durchgeführt, da die durch GlpD induzierte Oberflächenspannung bei 24 mN/m lag. In allen Experimenten wurden sättigende Mengen an gereinigten Proteinen (3 µg/ml) durch ein Loch am Rande des Teflongefäßes in die Subphase injiziert. Druckänderungen wurden verfolgt, bis der Anstieg ein Gleichgewicht erreicht hatte (gewöhnlich nach 40-50 min). Nach jeder Messung wurde das Teflongefäß mechanisch mit nichtionischer Seife (Zeep) gesäubert und unter kontinuierlichem Rühren mit Methanol/Essigsäure (10:1, v/v) für 20 h gereinigt. Die Messungen erfolgten unter N2-Atmosphäre. Vesikel-Bindungsstudien Vesikel-Bindungsstudien wurden mit LUVETs aus TLE, DOPE:PC (6:4 molares Verhältnis) bzw. DOPG und gereinigtem wt-GlpD bzw. den R359E- K360E- und AH362DE-Mutanten durchgeführt. LUVETs wurden mit gereinigtem Protein in 400 µl 50 mM Tris-HCl pH 7.4, 75 mM NaCl zwei Stunden bei Raumtemperatur inkubiert. Durch einstündige Zentrifugation (436.000xg, 4°C) sedimentierten die Vesikel vollständig. In einem Kontrollexperiment wurden Vesikel ohne Protein sedimentiert und der Phospholipidgehalt von Überstand und Pellet bestimmt. Es zeigte sich, dass mindestens 95% der Vesikel sedimentierten. Die Proteine wurden dagegen in Abwesenheit von Vesikeln zu 99% im Überstand nachgewiesen. Eine qualitative Analyse von kosedimentiertem GlpD erfolgte durch SDS-PAGE und anschließendem Immunoblotting. Im Überstand und Pellet der LUVET-Protein-Ansätze wurde die Proteinkonzentration nach Fällung von Aliquots des Überstands und des resupendierten Pellets mit 10% Trichloressigsäure mit dem Pierce BCA Detection Kit bestimmt. 32 Ergebnisse Ergebnisse Spezifität der Bindung von GlpD an CaM Klonierung, Überexpression und Reinigung von GlpD Die Isolierung von rekombinantem GlpD wurde auf zwei unterschiedlichen Wegen erzielt. Einerseits wurde GlpD als Fusionsprotein mit 6 N-terminalen Histidinen (vom Plasmid pAW4) exprimiert und über eine einstufige Affinitätschromatographie an einer Ni2+/NTASäule gereinigt (Abb. 5A) und andererseits als Intein-Fusionsprotein (vom Plasmid pAW7) exprimiert und über eine Chitin-Affinitätschromatographie nach Abspaltung des fusionierten Inteins gereinigt (Abb. 5B). In beiden Fällen lag das rekombinante, überexprimierte Protein in löslicher Form vor, so dass unter nativen Bedingungen gereinigt werden konnte. Abbildung 5: Reinigung von rekombinantem GlpD. GlpD wurde als A: N-terminales poly-Histidin-Fusionsprotein überexprimiert und über Ni2+/NTA-Affinitätschromatographie gereinigt bzw. B: als N-terminales InteinFusionsprotein überexprimiert und über eine Chitin-Affinitätschromatographie mit Intein-Abspaltung gereinigt. Die Proben wurden durch 10% SDS-PAGE aufgetrennt und mit Coomassie Blue Färbung sichtbar gemacht. Folgende Fraktionen sind gezeigt: n.i.: Zellextrakt von nicht induzierten Zellen RE: Zellextrakt induzierter Zellen FP-S: Überstand des abzentrifugierten French-Press-Zelllysats FP-P: Pellet des abzentrifugierten FrenchPress-Lysats E: GlpD-Eluatfraktion. 33 Ergebnisse Photometrisch wurde die Aktivität beider GlpD-Proteine durch einen PMS-gekoppelten MTT-Enzymaktivitätstest bestimmt. Die spezifische Enzymaktivität des von pAW4 exprimierten GlpD-6xHistidin-Fusionsproteins bzw. des von Plasmid pAW7 exprimierten GlpD-Proteins wurde in mindestens drei Experimenten ermittelt. Der mittlere Wert und die Standardabweichung wurde mit 1.24 + 0.14 [nmol/(µg x min)] bzw. 1.133 + 0.22 [nmol/(µg x min)] bestimmt. Die Aktivität beider Proteine wird durch das nichtionische Detergenz Tween20 ca. 3-fach stimuliert (Daten nicht gezeigt). Beide rekombinanten Proteine sind enzymatisch aktiv und verhalten sich bezüglich ihrer Aktivität wie Wildtyp-GlpD (Weiner und Heppel, 1972). Calcium-abhängige CaM-Bindung Um die Bindungseigenschaften von GlpD an CaM zu untersuchen, wurde gereinigtes GlpD mit immobilisiertem Rinder-CaM inkubiert. In einem sogenannten „Batchverfahren“ wurde gereinigtes 6-Histidin-GlpD Fusionsprotein (95%ige Reinheit) mit CaM-Sepharose 4B in Anwesenheit von 2 mM Calcium bzw. 10 mM EGTA inkubiert. Das Gel wurde mit 500 mM NaCl gewaschen und anschließend mit EGTA inkubiert, um gebundenes GlpD zu eluieren. Der in Abbildung 6 gezeigte Western Blot dokumentiert die spezifische Bindung von GlpD an CaM. Im Kontrollansatz, der nur Sepharose-Matrix enthielt, ist kein gebundenes GlpD vorhanden. GlpD bindet in Anwesenheit von 2 mM Calcium nahezu vollständig an CaM und wird durch 10 mM EGTA eluiert. Im Ansatz mit 10 mM EGTA bindet dagegen sehr wenig GlpD. Nach EGTA-Elution wurden die CaM-Sepharose-Pellets mit SDS-Probenpuffer versetzt und über SDS-PAGE und anschließendem Immunoblot analysiert (Daten nicht gezeigt). Es konnte keine Bindung von GlpD an die Trägermatrix festgestellt werden. Dagegen wurden Spuren von GlpD bei einer Analyse der CaM-Pellets nach Elution sowohl im Ansatz mit Calcium als auch im Ansatz mit EGTA nachgewiesen (Daten nicht gezeigt). GlpD bindet offensichtlich an Bindungsstellen, die sowohl in der Calcium-gebundenen als auch der Calcium-freien Konformation präsent sind. Diese spezifische Wechselwirkung wurde ebenfalls mit GlpD beobachtet, das aus mit pAW7 transformierten ER2566-Zellen isoliert wurde (Daten nicht gezeigt). Folglich kann ausgeschlossenen werden, dass der N-terminale Histidinrest die CaM-Bindung beeinflusst. 34 Ergebnisse Abbildung 6: Bindungsstudien von GlpD an immobilisiertes Rinder-CaM. Im Batch-Verfahren wurden in einem Testansatz von 250 µl 35 nM GlpD mit 30 µl CaM-Sepharose 4B in Anwesenheit von 2mM Calcium (Calcium-CaM) bzw. von 10 mM EGTA (EGTA-CaM) bei 8°C 1 h inkubiert. Als Kontrolle wurden 35 nM GlpD mit 30 µl Trägermatrix Sepharose 4B inkubiert (Control). Nach dreimaligem Waschen mit 500 mM NaCl wurde nach einer 30 minütigen Inkubation mit 10 mM EGTA gebundenes GlpD eluiert. Von jedem Schritt wurden Aliquots abgenommen, durch 10% SDS-PAGE aufgetrennt, auf Nitrozellulose transferiert und mit 1:50.000 verdünntem anti-GlpD Antikörper immunmarkiert. D: Überstand mit nicht gebundenem GlpD; W1: erster NaCl-Waschschritt; E1: erste Eluatfraktion; E2: zweite Eluatfraktion. Inhibitionsstudien zur Bindung von GlpD an CaM Die Bindungsspezifität wurde durch Kompetitionsstudien mit CaM-Antagonisten näher charakterisiert. Es wurde geprüft, welche der chemisch unterschiedlichen CaM-Antagonisten die spezifische Bindung zwischen GlpD und CaM hemmen (Abb. 7). Folgende CaM-Antagonisten konnten die GlpD-CaM-Bindung nicht hemmen: die aus einer Familie von homologen hydrophoben Polykationen bestehende Substanz Compound 48/80 (Gietzen, 1983), Trifluoperazin, der Mikonazol-Abkömmling R24571 (Gietzen et al., 1981), Chlorpromazin, Fendilin sowie das Naphthalinsulfonamid W7. Lediglich das Bienengift Melittin konnte die Bindung wirksam inhibieren. Melittin ist ein kleines Peptid, das eine basisch amphiphile Helix ausbilden kann. In Anwesenheit von Ca2+/CaM wird die Bildung α-helicaler Strukturen von 5% auf 72% erhöht (Maulet und Cox, 1983). Aufgrund der spezifischen Kompetition zwischen GlpD und Melitittin kann gefolgert werden, dass GlpD in Anwesenheit von Ca2+/CaM ebenfalls eine basisch amphiphile αhelicale Domäne exponiert und an CaM bindet. 35 Ergebnisse Abbildung 7: Kompetitionsstudien zur Charakterisierung der GlpD-CaM Bindung. Je 35 nM GlpD wurden mit 15 µl Ca2+/CaM-Sepharose 4B in Anwesenheit von 50µg/ml Compound 48/80, 150 µM Trifluoperazin (TFP), 20 mM R24571, 60 µM Melittin, 150 µM Fendilin bzw. 100 µM Chlorpromazin in einem Gesamtvolumen von 250 µl 2 h bei 8°C inkubiert. Der Kontrollansatz enthielt nur Ca2+/CaM-Sepharose und GlpD. Durch dreimaliges Waschen mit 500 mM NaCl wurde unspezifisch gebundenes GlpD entfernt. Nach einer 30 minütigen Inkubation in 10 mM EGTA wurde gebundenes Protein eluiert. Nach jedem Zentrifugationsschritt wurde jeweils ein Aliquot abgenommen, durch 10 %ige SDS-PAGE aufgetrennt und nach Transfer auf Nitrozellulose mit anti-GlpD-Antikörper imunmarkiert. D: Überstand mit nicht gebundenem GlpD; W1: erster NaClWaschschritt; W3: letzter Waschschritt; E1: erste Eluatfraktion; E2: zweite Eluatfraktion. Bindung von GlpD an saure und hydrophobe Oberflächen Ca2+/CaM präsentiert eine saure und hydrophobe Oberfläche (James et al., 1995). Durch Komplexierung von Calcium mit EGTA wird eine Konformationsänderung bewirkt, in deren Folge weniger saure und hydrophobe Aminosäuren auf der Proteinoberfläche präsentiert werden. Die Beobachtung, dass GlpD bevorzugt an Ca2+/CaM bindet und dass GlpD mit Melittin um die CaM-Bindestellen kompetiert, deutet darauf hin, dass GlpD in Anwesenheit von Ca2+/CaM durch hydrophobe und elektrostatische Wechselwirkungen an Ca2+/CaM bindet. Um dies zu testen, wurde GlpD mit CaM in Anwesenheit von unterschiedlichen hydrophoben Substanzen inkubiert. Abbildung 8 dokumentiert, dass die GlpD-CaM-Bindung lediglich durch kleine Liposomen aus negativ geladenen Phospholipiden (DOPG-SUVs) gehemmt wird. Neutrale Liposomen, die aus jeweils 50% DOPE und DOPC gebildet wurden, 36 Ergebnisse beeinträchtigen die GlpD-Ca2+/CaM-Interaktion nicht. Die Zugabe von Dipalmitoylglycerin (DPG)-Mizellen, einer neutralen Fettsäure, hatte ebenfalls keinen Effekt. Folglich beruht die spezifische Interaktion zwischen GlpD und CaM auf hydrophoben und elektrostatischen Wechselwirkungen. Abbildung 8: Hemmung der GlpD-CaM Bindung. Dargestellt sind Bindungsstudien von GlpD an CaM, die in Anwesenheit von 70 mM DOPG-SUVs, 70 mM DOPE/PC-SUVs bzw. 5 mM DPG-Mizellen durchgeführt wurden. Der Bindungstest enthielt in einem Ansatz (V=250 µl) 35 nM GlpD und 15 µl Ca2+/CaM-Sepharose 4B. Im Kontrollansatz wurde nur GlpD mit CaM-Sepharose inkubiert. Nach 30 min Inkubation wurde das CaMPellet dreimal mit 500 mM NaCl gewaschen und anschließend für 30 min in 10 mM EGTA inkubiert, um gebundenes GlpD zu eluieren. Es wurden jeweils Aliquots zur 10 % SDS-PAGE abgenommen. Mittels Immunoblotting wurde GlpD in den einzelnen Fraktionen nachgewiesen. D: Überstand mit nicht gebundenem GlpD; W3: letzter NaCl-Waschschritt; E1: erste Eluatfraktion. Lokalisation der CaM-Bindedomänen Um die CaM-Bindedomäne von GlpD zu identifizieren, wurden glpD-Fragmente kloniert, die für C-terminal verkürzte Proteine kodieren. Diese Proteine wurden überexprimiert und gereinigt. Anschließend wurden sie bezüglich ihrer Fähigkeit getestet, spezifisch an Ca2+/CaM-Sepharose 4B zu binden. Abbildung 9A dokumentiert die Reinigung des um 190 Aminosäuren verkürzten CBRIII-Fragments. Die apparente Größe des gereinigten Fragments betrug 30 kDa. Wie Abbildung 9B zeigt, bindet das CBRIII-Fragment nicht an die Ca2+/CaM-Sepharose 4B, da 37 Ergebnisse es nur im Überstand nachgewiesen werden kann. Bereits eine C-terminale Deletion von 190 Aminosäuren verhindert folglich eine Bindung an Ca2+/CaM. Abbildung 9: Reinigung und CaM-Bindungstest des C-terminal verkürzten GlpD-Fragments CBRIII. A: Überexpression und Reinigung des C-terminal um 190 Aminosäuren verkürzten GlpD-Fragments als Nterminales poly-Histidin-Fragment. Die Proben wurden durch 15% SDS-PAGE aufgetrennt und mit Coomassie Blue Färbung sichtbar gemacht. Die Abbildung zeigt folgende Fraktionen: 1: Zellextrakt uninduzierter Zellen 2: Zellextrakt induzierter Zellen 3: Überstand des abzentrifugierten French-Press-Zelllysats 4: Eluatfraktion des gereinigten CBRIII-Fragments B: Der Bindungstest enthielt in einem Ansatz (V=250 µl) 35 nM CBRIII und 15 µl Ca2+/CaM-Sepharose 4B. Nach 30 min Inkubation wurde das CaM-Pellet dreimal mit 500 mM NaCl gewaschen und anschließend für 30 min in 10 mM EGTA inkubiert, um gebundenes CBRIII zu eluieren. Es wurden jeweils Aliquots zur 15 % SDS-PAGE abgenommen. Mittels Immunoblotting wurde CBRIII in den einzelnen Fraktionen nachgewiesen. D: Überstand mit nicht gebundenem CBRIII; W3: letzter NaClWaschschritt; E1 und E2: Eluatfraktionen. Basisch amphiphile Helix: CaM-Bindemotiv von GlpD? Sekundärstrukturvorhersageprogramme wie PHD (Rost et al., 1994), SOPM (Geourjon und Deleage, 1994), PREDATOR (Frishman und Argos, 1996) und GOR3 (Gibrat et al., 1987) ermittelten für GlpD im Bereich von Aminosäuren 355-70 eine basische α-Helix mit amphiphiler Ausprägung (Eisenberg et al., 1984). Um zu überprüfen, ob dieser Bereich für die CaM-Bindung notwendig ist, wurde durch FusionsPCR die Deletionsmutante GlpD∆(351-372) kloniert, überexprimiert und gereinigt. CaM-Bindungsstudien zeigen, dass GlpD ohne die basisch amphiphile Helix nicht mehr an CaM binden kann (Abb. 10). 38 Ergebnisse ∆(351-372) und immobilisiertem Rinder-CaM. Abbildung 10: Bindungsstudien mit gereinigtem GlpD∆ In einem Testansatz von 250 µl wurden 35 nM GlpD∆(351-372) mit 15 µl Ca2+/CaM-Sepharose 4B inkubiert (delta351-72). Als Kontrolle wurden 35 nM GlpD mit 15 µl Ca2+/CaM-Sepharose 4B inkubiert (wt-GlpD). Nach dreimaligem Waschen mit 500 mM NaCl wurde 30 min mit 10 mM EGTA inkubiert, um gebundenes GlpD zu eluieren. Von jedem Schritt wurden Aliquots abgenommen, durch 10% SDS-PAGE aufgetrennt, auf Nitrozellulose transferiert und mit 1:50000 verdünntem anti-GlpD Antikörper immunmarkiert. Spur 1 zeigt durch 10% SDS-PAGE aufgetrenntes und Coomassie Blue gefärbtes Wildtyp-GlpD sowie GlpD∆(351-372). D: Überstand mit nicht gebundenem GlpD; W3: letzter NaCl-Waschschritt; E1: erste Eluatfraktion; E2: zweite Eluatfraktion. Welche Rolle spielen die positiv geladenen Reste im α-helicalen Bereich von GlpD für die Bindung an CaM? Werden die Aminosäuren 355-70 in einer Helix-Projektion dargestellt, wird die basisch amphiphile Struktur deutlich (Abbildung 11). Die eine Hälfte der Helix hat einen hydrophoben, die andere Seite einen hydrophilen Charakter, der zudem positiv geladen ist. Die Nettoladung der α-Helix beträgt unter physiologischen Bedingungen +1. Es stellt sich nun die Frage, ob die positive Ladung der Helix für die CaM-Bindung notwendig ist. Mittels gerichteter Mutagenese wurden drei Punktmutanten hergestellt, die durch eine elektronegative anstelle einer elektropositiven Helix charakterisiert sind. Es wurden zwei Mutanten (R359E, K360E) erzeugt, bei denen jeweils eine basische Aminosäure (Arginin359 bzw. Lysin360) gegen die saure Aminosäure Glutamat ausgetauscht wurden. Bei der Doppelmutante wurden zwei Aminosäuren, nämlich Alanin362 gegen Glutamat, sowie Histidin364 gegen Aspartat ausgetauscht. Alle drei Mutanten haben im Bereich der α-Helix eine negative Nettoladung von –1. Das jeweils gezielt mutagenisierte offene Leseraster von glpD wurde in einen pQE30-Vektor kloniert. Die Punktmutanten wurden überexprimiert und über Ni2+/NTA-Affinitätschromatographie gereinigt (Abb. 12A). 39 Ergebnisse Wildtyp -L355 T T Y R359 K360 L A362 E H364 A L E K L T370 R359E L355 T K360E L355 T AH362/4DE L355 T T T T Y Y Y E359 K L R E360 L R K L A E A E D362 E H A H A E364 A L L L E E E K K K L L L T370 T370 T370 M,I,L,V F,Y,W G,A,P D,E 359 K,H,R 363 R 370 366 S,T 355 L L E T 356 T E 367 A K 362 369 Y 358 360 L H A K 365 L 368 364 T 357 361 Abbildung 11: Aminosäuresequenz und Helical-Wheel-Projektion vonGlpD im Bereich der Aminosäuren 355-370. Wildtyp-Sequenz der vorhergesagten α-Helix im Bereich der Aminosäuren 355-370. Die Strategien für die Punktmutation sind darunter dargestellt. In der Helical-Wheel Projektion der Wildtyp-Sequenz entsprechen die Graustufen dem Hydrophobizitätsgrad der Aminosäuren, wobei Reste mit größter Hydrophobizität schwarz dargestellt sind. Die mutierten GlpD-Proteine wurden als 6xHistidin-Fusionsproteine überexprimiert und gereinigt (Abb. 12a). CaM-Bindungsstudien mit den gereinigten Proteinen zeigten, dass die Doppelmutante ebenso wie der Wildtyp an CaM bindet (Abb. 12B). Keine Bindung wurde bei den Punktmutanten K360E und R359E beobachtet. 40 Ergebnisse Abbildung 12:Reinigung von GlpD-Punktmutanten und Bindungsstudien mit immobilisiertem RinderCaM. wt-GlpD, R359E- , K360E- und AH362/4DE-Mutanten wurden als N-terminale poly-HistidinFusionsproteine überexprimiert und über Ni2+/NTA Affinitätschromatographie gereinigt. A: Die gereinigten und dialysierten Proteine wurden durch 10% SDS-PAGE aufgetrennt und durch Coomassie Blue Färbung sichtbar gemacht. B: Bindungstest von wt-GlpD und Punktmutanten mit immobilisiertem CaM. In einem Testansatz von 250 µl wurden jeweils 35 nM wt-GlpD, AH362/4DE, R359E bzw. K360E mit 15 µl Ca2+/CaM-Sepharose 4B inkubiert. Als Kontrolle wurden 35 nM GlpD mit 15 µl Ca2+/CaM-Sepharose 4B inkubiert (wt-GlpD). Nach dreimaligem Waschen mit 500 mM NaCl wurden die Ansätze für 30 min in 10 mM EGTA inkubiert, um gebundenes GlpD zu eluieren. Von jedem Schritt wurden Aliquots abgenommen, durch 10% SDS-PAGE aufgetrennt, auf Nitrozellulose transferiert und mit 1:50000 verdünntem anti-GlpD Antikörper immunmarkiert. D Überstand mit nicht gebundenem GlpD; W3: letzter NaCl-Waschschritt; E1: erste Eluatfraktion; E2: zweite Eluatfraktion. 41 Ergebnisse Zusammenfassend wird aus den hier präsentierten Ergebnissen gefolgert, dass GlpD eine basische amphiphile α-Helix ausbildet, die mit der sauren und hydrophoben Oberfläche von CaM interagiert. Es stellt sich nun die Frage, welche physiologische Bedeutung der in vitro beobachtete Befund hat. Aufgrund dieser biochemischen Charakterisierung wird postuliert, dass die in vitro beobachtete Protein-Protein-Wechselwirkung die Assoziation von GlpD an die innere Plasma-Membran widerspiegelt. Die Hypothese einer direkten LipidProtein-Interaktion zwischen GlpD und der Cytoplasma-Membran wurde sowohl in LipidMonolayer- als auch in Lipid-Bilayer-Systemen überprüft. Charakterisierung der GlpD-Lipid-Bindung Eine biochemische Charakterisierung von Lipid-Protein-Wechselwirkungen kann nur unter Detergenz-freien Bedingungen erfolgen. Deshalb wurden sowohl Wildtyp-GlpD als auch die mutierten GlpD-Isoformen ohne Verwendung von Detergenz gereinigt. Hohe Salzkonzentrationen im Waschpuffer verhinderten eine Verunreinigung mit Lipiden in der Präparation. Der Lipidgehalt der gereinigten Proteine wurde bestimmt, indem Aliquots einer LipidExtraktion nach der Methode von Bligh und Dyer (1959) unterzogen wurden. Anschließend wurde der Phosphorgehalt des Extrakts nach der Methode von Fiske-Subbarrow (1925) bestimmt. Es konnte keine Verunreinigung mit Lipiden nachgewiesen werden (Daten nicht gezeigt). Direkte Protein-Lipid-Interaktion Mit der Wilhelmy Plate Methode wurde die Insertion von GlpD zwischen die Kohlenwasserstoffketten von Lipiden gemessen. Gereinigtes GlpD wurde bei einem Anfangsdruck von 27 mN/m unter einen Lipid-Monolayer injiziert, der aus einem Phospholipid-Extrakt von E. coli (TLE) bestand. Der zeitliche Verlauf der Druckänderung wurde bis zum Erreichen eines konstanten Endwertes protokolliert (Abb. 13). 40 Minuten nach der Injektion von GlpD wurde eine Druckänderung von 5 mN/m gemessen. Eine signifikante Druckänderung wird nur bei Substanzen beobachtet, die zwischen den polaren Kopfgruppen bis in die Kohlenwasserstoffkettenregion der Lipide eindringen (Demel, 1994). Eine bloße Bindung an die polaren Kopfgruppen der Lipide bewirkt dagegen keine signifikante Druckänderung (Mayer et al., 1983). Dieses Ergebnis kann folglich als effiziente Insertion von GlpD in Lipidschichten interpretiert werden. Ferner zeigt dieses Experiment, dass eine direkte Protein42 Ergebnisse Lipid-Interaktion zwischen GlpD und E. coli Phospholipiden stattfindet. s u rfa ce p re s s u re (m N /m ) 33 32 31 TL E 30 29 28 27 0 10 20 30 40 tim e (m in ) Abbildung 13: Interaktion zwischen GlpD und TLE-Monolayer. Nach Injektion von 3 µg GlpD unter einen TLE-Monolayer mit einem initialen Oberflächendruck von 27 mN/m wurde die Druckänderung über die Zeit verfolgt. Lipidspezifität der Insertion von GlpD Experimente mit reinen Phospholipid-Monolayern geben Aufschluss darüber, ob die Insertion von GlpD von bestimmten Lipidtypen abhängt. Um den Einfluss verschiedener LipidKopfgruppen zu testen, wurden artifizielle Phospholipide mit derselben Fettsäurezusammensetzung und unterschiedlichen Kopfgruppen eingesetzt. s u rfa ce p re s s u re (m N /m ) 39 37 CL 35 D OPG 33 31 PE 29 27 0 10 20 30 40 tim e (m in ) Abbildung 14: Vergleich von Insertionsprofilen bei unterschiedlichen Monolayern. Es wurden Monolayer aus reinem DOPE, DOPG bzw. Rinderherz-Cardiolipin (CL) auf eine Pufferoberfläche mit einem Oberflächendruck von 27 mN/m aufgesprüht. Die durch GlpD induzierte Druckänderung wurde aufgezeichnet. 43 Ergebnisse Abbildung 14 zeigt, dass GlpD eine dreifach höhere Druckänderung in CL-Monolayern und eine 2.2-fach höhere Druckänderung in DOPG-Monolayern als in DOPE-Monolayern bewirkt. Folglich inserierten mehr GlpD-Moleküle in anionische Phospholipide als in zwitterionische. Um die penetrative Kraft von GlpD zu untersuchen, wurde in Abhängigkeit des Anfangsdrucks die Insertion von GlpD in DOPE-, DOPC-, DOPG- und CL-Monolayern gemessen. Ein höherer Anfangsdruck korreliert mit einer dichteren Packung der Lipide und einer reduzierten Insertion von Proteinen (Demel, 1994). 12 s urfac e pres s ure increas e (m N/m ) Cardiolipin DOP G 10 DOP E DOP C 8 6 4 2 0 24 26 28 30 32 34 36 38 initial surface press ure (m N/m ) Abbildung 15: Penetrative Kraft von GlpD bei unterschiedlichen Monolayern. Die Druckänderung nach Injektion von GlpD wurde als Funktion des Anfangsdruckes gemessen. Monolayer aus DOPC (offene Raute), DOPE (offenes Dreieck), DOPG (gefüllter Kreis) und Cardiolipin aus Rinderherz (gefülltes Quadrat) wurden eingesetzt. Abbildung 15 zeigt, dass bei allen vier Lipiden eine deutliche Druckänderung bewirkt wird. Unabhängig vom Anfangsdruck induzierte GlpD bei negativ geladenen Monolayern aus DOPG bzw. Cardiolipin eine deutlich höhere Druckänderung als bei den ungeladenen Monolayern aus DOPC bzw. DOPE (Abb. 15). Folglich inseriert GlpD in anionische Lipide stärker als in ungeladene. Ein Maß für die penetrative Kraft eines Proteins ist der maximale Initialdruck πmax, nämlich der höchstmögliche Anfangsdruck, bei dem das Protein eine Druckänderung bewirkt. Der maximale Anfangsdruck für CL wurde mit 38.5 mN/m, für DOPG mit 37 mN/m, für DOPE mit 33.5 mN/m und für DOPC mit 30 mN/m extrapoliert. Obwohl sowohl DOPE als auch DOPC zwitterionische Lipide sind, ist die penetrative Kraft 44 Ergebnisse von GlpD bei DOPE-Monolayern deutlich stärker als bei DOPC-Monolayern. Da PC in Bakterien nicht vorkommt, PE dagegen 70% der Phospholipide ausmacht, könnte die beobachtete Diskrepanz auf der Lipidspezifität von GlpD beruhen. Monolayer-Experimente, die bei hohen Anfangsdrücken durchgeführt werden, sind ein verlässliches Modellsystem, um Proteininsertion zu untersuchen (Übersicht in Demel, 1994). Für biologische Membranen liegt der Druck zwischen 31-35 mN/m (Demel et al., 1975). Werden in vitro in diesem physiologisch relevanten Bereich Druckänderungen durch ein Protein induziert, so lässt dies darauf schließen, dass es auch in vivo die jeweiligen Lipidschichten penetriert. Insertion von GlpD in gemischte Phospholipid-Monolayer Um zu testen, ob anionische Lipide die Membraninsertion von GlpD begünstigen, wurden Experimente mit gemischten Phospholipiden durchgeführt. Bei einem konstanten Anfangsdruck von 30 mN/m wurde die induzierte Druckänderung von GlpD in DOPE-Monolayern mit unterschiedlichem DOPG-Gehalt gemessen. Abbildung 16 demonstriert eine lineare Abhängigkeit zwischen dem DOPG-Gehalt und der Druckdifferenz. Je größer der Anteil an anionischen DOPG war, desto stärkere Druckänderungen wurden gemessen. Insertion von GlpD findet folglich verstärkt in Anwesenheit s urfa ce p res s u re in cre a s e (m N /m ) von anionischen Lipiden statt. 6 5 4 3 2 1 0 0 20 40 60 80 1 00 m ole % D OPG Abbildung 16: Insertion von GlpD als Funktion des prozentualen DOPG-Anteils in einem DOPEMonolayer. GlpD wurde unter gemischte Monolayer aus DOPE und DOPG bei einem Anfangsdruck von 30 mN/m injiziert. 45 Ergebnisse Insertion von GlpD und Punktmutanten in TLE-Monolayer Apolipoproteine binden Phospholipide, indem sie eine basisch amphiphile α-Helix exponieren (Segrest et al., 1992; Segrest et al., 1998). Die Helical-Wheel-Projektion der Aminosäuren 355-70 ähnelt den helicalen Strukturen von Apolipoprotein A Klasse IMolekülen. Bei beiden Helices taucht an den Übergängen zwischen hydrophober und hydrophiler Hälfte jeweils eine negativ geladene Aminosäure auf (Abb. 11). Um zu testen, ob die α-Helix, die an die CaM-Oberfläche bindet, an der Membraninsertion beteiligt ist, wurden die Punktmutanten unter TLE-Monolayer injiziert. Die jeweils induzierte Druckänderung wurde mit der des Wildtyps verglichen. Abbildung 17A vergleicht den zeitlichen Verlauf der Druckänderung, nachdem Wildtyp- bzw. mutiertes GlpD injiziert wurde. Sowohl die Kinetik als auch die maximale Druckänderung unterscheiden sich deutlich. Betrachtet man die Druckänderung in Abhängigkeit des Anfangsdrucks (Abb. 17B) wird klar, dass unabhängig vom Anfangsdruck die Insertionskraft der Punktmutanten deutlich geringer ist als die des Wildtyps. Die geringste Penetrationskraft wurde bei den Punktmutanten R359E (πi= 31.3 mN/m) und K360E (πi=30.2) beobachtet. Die Doppelmutante AH362/4DE ist im Vergleich zum Wildtyp bezüglich ihrer Fähigkeit, Lipide zu penetrieren, dagegen nur geringfügig geschwächt (πi=33.0). Diese Experimente bestätigen die These, dass die basisch amphiphile α-Helix für die Protein-Lipid-Bindung entscheidend ist. s urfac e pres sure (m N/m ) w t -GlpD 32 AH 3 62 /4 D E 31 K3 60 E 30 29 R 3 5 9E 28 27 0 10 20 30 tim e (m in) 40 s urfac e pres sure inc rease (m N/m ) A 33 B 6 w t-Glp D AH 3 62 /4 D E 5 K3 60 E R 3 5 9E 4 3 2 1 0 25 2 7,5 30 3 2,5 35 initial s urfa ce p res s u re (m N /m ) Abbildung 17: Insertion von Wildtyp- und mutiertem GlpD in TLE-Monolayer A: Zeitverlauf der Insertion von Wildtyp- und mutierten GlpD-Proteinen in TLE-Monolayer mit einem Oberflächendruck von 27 mN/m. B: Insertion von Wildtyp und mutierten Proteinen in TLE-Monolayer als Funktion des initialen Oberflächendruck. 46 Ergebnisse Insertion von wt-GlpD und Punktmutanten in PG- bzw. PE-Monolayer Aufgrund der bisherigen Datenlage wird vermutet, dass die basisch amphiphile α-Helix von GlpD anionische Phospholipide penetriert. Diese These wurde mit folgenden Experimenten geprüft. DOPG- bzw. DOPE-Monolayer wurden mit unterschiedlichem Anfangsdruck auf die Pufferoberfläche gesprüht. Nach Injektion von Wildtyp-GlpD bzw. Punktmutanten-GlpD wurde die induzierte Druckänderung gemessen und verglichen. Abbildung 18 stellt die gemessenen Druckdifferenzen als Funktion des Anfangsdrucks dar. Im Vergleich zum Wildtyp ist die penetrative Kraft der Punktmutanten in DOPG-Monolayer deutlich geringer (Abb. 18A). Dagegen ergaben Messungen mit DOPE-Monolayern keine signifikanten Unterschiede zwischen Wildtyp und den Mutanten (Abb. 18B). Dies beweist, dass die α-Helix an der Insertion in anionische Phospholipide beteiligt ist. Vergleicht man die maximalen Initialdrucke πmax der einzelnen Mutanten, so zeigt die Doppelmutante AH362/4DE (πmax=35.5 mN/m) das größte Potential, in DOPG-Monolayer zu inserieren. Die beiden Mutanten R359E und K360E sind bei einem Anfangsdruck von 31.5 mN/m nicht mehr fähig, eine Druckänderung zu bewirken. Folglich ist bei der Insertion in Lipide weniger die Nettoladung der Helix als vielmehr die Ladungsverteilung in diesem Bereich ausschlaggebend. B 9 w t-GlpD A H362/4DE R359E 8 7 6 K360E 5 4 3 2 1 0 25 2 7,5 30 3 2,5 35 initial s urfa ce p res s u re in cre a s e (m N /m ) s urfa ce p res s u re in cre a s e (m N /m ) s urfa ce p res s u re in cre a s e (m N /m ) A 6 w t-GlpD A H362/4DE 5 R359E 4 K360E 3 2 1 0 25 2 7,5 30 3 2,5 35 initial s urfa ce p res s u re (m N /m ) Abbildung 18: Lipidspezifische Insertion von wt-GlpD und Punktmutanten. Die Änderung des Oberflächendrucks nach Injektion von Wildtyp- (offene Raute), AH362/4DE (gefülltes Quadrat), R359E (gefülltes Dreieck) und K360E (gefüllter Kreis) unter A: DOPG-Monolayer bzw. B: DOPE-Monolayern ist als Funktion des initialen Oberflächendrucks dargestellt. 47 Ergebnisse GlpD-Bindung an TLE-Bilayer Nachdem im Monolayer-System eine direkte GlpD-Lipid Interaktion gezeigt und charakterisiert wurde, wurde diese Interaktion im Bilayer-System weiter analysiert. In Vesikelbindungsexperimenten wurde gereinigtes GlpD mit LUVETs („Large unilamellar vesicles prepared by Extrusion“) aus TLE für zwei Stunden vorinkubiert. Anschließend wurden die Liposomen durch Ultrazentrifugation abzentrifugiert. In Abwesenheit von Liposomen wurde GlpD quantitativ im Überstand nachgewiesen (Abb.19, Spuren 1+2). In einem weiteren Kontrollexperiment wurden TLE-Liposomen ohne GlpD abzentrifugiert. Die Bestimmung des Lipidgehalts von Überstand und Pellet ergab, dass die Liposomen unter diesen Bedingungen quantitativ sedimentierten (Daten nicht gezeigt). Wurde dagegen GlpD nach Vorinkubation mit TLE-Liposomen abzentrifugiert, so sedimentierte ein beträchtlicher Teil von GlpD mit den Liposomen (Abb. 19, Spur 4), was auf eine Bindung von GlpD an die Membranen schließen lässt. Abbildung 19: Liposomenbindungsstudien mit gereinigtem GlpD und TLE-Liposomen. Proben mit gereinigtem GlpD (250 ng) wurden ohne (Spur1+2) und mit 500 nmol LUVETs (Spur 3+4) nach zweistündiger Vorinkubation abzentrifugiert. Die Überstände (Spuren 1+3) und die Pellets (Spuren 2+4) der abzentrifugierten Ansätze wurden durch 10 % SDS-PAGE und Western Blot mit anschließender Immunfärbung mit anti-GlpD Antikörper analysiert. Liposomen-Bindungsspezifität von GlpD Um die Lipidspezifität der GlpD-Assoziation an Membranen zu untersuchen, wurde gereinigtes GlpD einerseits mit neutralen LUVETs, die 60% PE und 40% PC enthielten und andererseits mit negativ geladenen LUVETs, die aus 100% PG bestanden, inkubiert. Da PE ein Nicht-Bilayer-Lipid ist, konnten keine reinen PE-Liposomen hergestellt werden. Der Phospholipidgehalt der eingesetzten Liposomen lag bei 200 nmol, die Proteinmenge variierte 48 Ergebnisse zwischen 1.9 µg und 60 µg (Abb. 20A). Nach zweistündiger Inkubation wurde nach anschließender Ultrazentrifugation der Proteingehalt im Überstand und Pellet bestimmt. In Ansätzen, die nur GlpD enthielten, wurde kein sedimentiertes Protein nachgewiesen. Mittels Phosphorbestimmung der sedimentierten und löslichen Fraktion wurde gezeigt, dass die Liposomen zu 98% sedimentierten. Wie Abbildung 20A zeigt, sedimentierte bei geringen GlpD-Konzentrationen mehr Protein mit PE/PC-Liposomen als mit PG-Liposomen. Die höhere Affinität gegenüber PE zeigt, dass GlpD spezifisch mit PE interagiert, was zu einer Bindung an die Membranoberfläche führt, die zwar im Bilayer-System, nicht jedoch im Monolayer-System beobachtet wurde. Die Mutanten zeigten ähnliche Bindungseigenschaften wie der Wildtyp (Abb. 20B), folglich wird der hier beobachtete Bindungstyp durch die Punktmutationen nicht beeinflusst. A 14 p ro te in b o u nd (µg) 12 10 8 6 PE/PC 4 PG 2 0 0 10 20 30 40 50 60 p ro te in a d d ed (µg) B 14 p ro te in b o u nd (µg) 12 10 8 6 4 2 PE/PC PG R359E PE/PC PG K3 6 0E PE/PC PG AH 3 6 2/4 D E 0 0 10 20 30 40 p ro te in a d d ed (µg) Abbildung 20: Liposomenbindungsstudien mit Wildtyp- und mutierten GlpD Proteinen. A: Lipidspezifität von Wildtyp-GlpD bezüglich der Bindung an DOPE/PC- (6:4 molares Verhältnis, offene Dreiecke) und DOPG-Liposomen (gefüllte Kreise). B: Lipidspezifität von R359E- (Dreieck), K360E- (Quadrat) und AH362/4DE-Proteinen (Kreise) an DOPE/PC- (6:4 molares Verhältnis, offene Symbole) und DOPGLiposomen (gefüllte Symbole). Gezeigt sind Mittelwerte und Standardabweichungen von jeweils mindestens zwei unabhängigen Experimenten. Die Werte wurde dreifach bestimmt. 49 Ergebnisse Einfluss von Liposomen auf die GlpD-Aktivität Stärkste Stimulation mit neutralen SUVs Von SecA (Lill et al., 1990) und DnaA (Garner und Crooke, 1996) ist bekannt, dass sie mit anionischen Lipiden interagieren und dadurch enzymatisch aktiviert werden. Stimuliert die Insertion von GlpD in anionische Lipide ebenfalls die Enzymaktivität? Experimentell wurde diese Frage mittels PMS-gekoppelten Enzymaktivitätstests geklärt. Hierzu wurde gereinigtes GlpD mit einschichtigen Liposomen inkubiert und die Enzymaktivität bestimmt. Es wurden SUVs aus reinem DOPC, DOPG und gemischte SUVs aus DOPE:PG (molares Verhältnis 7:3) bzw. DOPG:PE (molares Verhältnis 7:3) eingesetzt. In Übereinstimmung mit Schryvers und Mitarbeitern (Schryvers et al., 1978) stimulierten alle Lipide die Enzymaktivität (Abb. 21). Überraschenderweise wurde die stärkste Stimulation mit dem nichtionischen Detergenz Tween20 und DOPE/PC-Liposomen (molares Verhältnis 6:4) beobachtet. Je höher der Anteil an DOPG in den Liposomen, desto geringere Stimulationen wurden beobachtet. Die niedrigste Aktivierung wurde bei Liposomen gemessen, die 70% bzw. 100% DOPG enthielten. s p ecific a ctivity [nm o l/(m in *µg)] 4 3 2 1 0 con tro l D OPC D OPG 7 :3 PE:PG 7 :3 PG:PE Tw e e n2 0 Abbildung 21: Stimulation der GlpD-Enzymaktivität durch SUVs. Die Enzymaktivität von GlpD wurde photometrisch in einem PMS-gekoppelten MTT-Enzymaktivitätstest gemessen. In einem Volumen von jeweils 250 µl wurde 0.75 µg GlpD mit 200 µM DOPC-, DOPG-, DOPE/PG- (7:3 molares Verhältnis), DOPG/PE- (7:3 molares Verhältnis) SUVs bzw. 0.05% Tween20 eingesetzt. Im Kontrollansatz war weder Detergenz, noch Liposomen enthalten. Die spezifische Aktivität gibt die Menge an reduziertem MTT pro Minute und pro µg Protein an. Gezeigt sind Mittelwerte und Standarabweichungen von jeweils drei unabhängigen Experimenten. Die Werte wurden jeweils doppelt bestimmt. 50 Ergebnisse Dosis-Abhängigkeit der Liposomen-stimulierten GlpD Aktivität Die durch Ultraschall hergestellten Liposomen sind sehr klein (25 - 50 nm Durchmesser) und nehmen eine kugelförmige Gestalt an. Ihre konvexe Oberfläche ist sehr stark gekrümmt, so dass in der äußeren Lipidschicht die Abstände zwischen den Kopfgruppen deutlich größer sind als in größeren Liposomen (Keller et al., 1993). LUVETs sind größere Liposomen (200 nm Durchmesser) mit einer deutlich schwächer gekrümmten Oberfläche, die die Form der inneren Cytoplasma-Membran somit besser widerspiegeln als SUVs. Möglicherweise resultiert der im vorherigen Experiment beobachtete Effekt aus der spezifischen Oberflächenstruktur PE-enthaltender SUVs. Im Gegensatz zu großen Liposomen ist die Oberflächenkrümmung bei PE-enthaltenden SUVs stärker ausgeprägt, als bei PG-enthaltenden SUVs. Nicht nur die Kopfgruppen, sondern auch die Oberflächenstruktur der Membran können die Enzymaktivität beeinflussen: Je stärker die Krümmung von Lipidvesikeln ausgeprägt ist, desto höher ist die Aktivierung der Proteinkinase C (Slater et al., 1994). Um Krümmungsunterschiede als mögliche Ursache für unterschiedliche Aktivitäten ausschließen zu können, wurden große Liposomen verwendet. Abbildung 22 zeigt eine DosisWirkungskurve der GlpD-Aktivierung durch große Liposomen. Es wurden neutrale Liposomen wie DOPC-LUVETs (100% PC), DOPE:PC-LUVETs (molares Verhältnis 1:1), sowie anionische Liposomen, wie reine DOPG-LUVETs (100% DOPG) und DOPE:PE/PCLUVETs mit unterschiedlichen molaren Verhältnissen (10% PG/ 45% PC/ 45%PE; 30% PG/ 35% PE/ 35% PC; 90% PG/ 5% PE/ 5% PC). Eine maximale Stimulation bei allen eingesetzten LUVETs wurde bei einer Konzentration von 100 µM beobachtet. DOPE/PC-LUVETs stimulierten die Enzymaktivität am stärksten. Je höher der Anteil an DOPG, desto geringere Enzymaktivitäten wurden gemessen. Sowohl Messungen mit SUVs als auch mit LUVETs ergaben eine deutlich stärkere Stimulation der GlpD-Enzymaktivität durch neutrale als durch anionische Phospholipide. Sowohl bei SUVs als auch bei LUVETs wurde eine stärkere Aktivierung der GlpD-Aktivität durch PE/PC als durch PG-Liposomen beobachtet. Deshalb kann gefolgert werden, dass Interaktionen zwischen den neutralen Kopfgruppen und GlpD einen Einfluss auf die GlpDAktivität haben. 51 s pe cific a ctivity (nm o l/(µg xm in)) Ergebnisse 4 3 PC PE:PC 2 PE/PC :PG 9:1 PE/PC :PG 7:3 1 PG:PE/PC 7:3 PG 0 0 50 1 00 1 50 2 00 L U VET-C on cen tra tio n (µM) Abbildung 22: Dosisabhängige Stimulation der GlpD-Enzymaktivität durch LUVETs. Die Enzymaktivität von GlpD wurde photometrisch in einem PMS-gekoppelten MTT-Enzymaktivitätstest gemessen. In einem Volumen von jeweils 250 µl wurde 0.75 µg GlpD mit DOPE/PC- (1:1 molares Verhältnis), DOPC-, DOPE/PC:PG- (9:1 molares Verhältnis), DOPE/PC:PG- (7:3 molares Verhältnis), DOPE/PC:PG- (7:3 molares Verhältnis) und DOPG LUVETs eingesetzt. Im Kontrollansatz waren keine LUVETs enthalten. Die spezifische Aktivität gibt die Menge an reduziertem MTT pro Minute und pro µg Protein an. Gezeigt sind Mittelwerte und Standarabweichungen von jeweils drei unabhängigen Experimenten. Die Werte wurden jeweils doppelt bestimmt. Enzymaktivität nach Vorinkubation mit LUVETs Möglicherweise ist die beobachtete negative Korrelation zwischen DOPG-Gehalt und Enzymaktivität auf Ladungseffekte anionischer Lipide zurückzuführen. Die starke negative Ladung könnte eine teilweise Entfaltung und folglich eine Inaktivierung von GlpD bewirken. Um dies zu untersuchen, wurde GlpD 5 bzw. 30 Minuten mit den Liposomen vorinkubiert. Ausgehend von der Überlegung, dass eine starke negative Ladung die Enzymaktivität beeinträchtigt, würde man eine reduzierte Aktivität nach längerer Inkubationszeit erwarten. Diese Erwartung wurde jedoch nicht bestätigt, wie Abbildung 23 illustriert. LUVETs, die DOPG enthielten, stimulierten die GlpD-Aktivität nach 30 Minuten im gleichen Maß wie nach 5 Minuten. Somit kann ausgeschlossen werden, dass ein Überschuss an negativer Ladung GlpD inaktiviert. Aus dem Vergleich der PE:PC-stimulierten Aktivität von GlpD nach 5 Minuten mit der nach 30 Minuten geht hervor, dass die Aktivität nach 30 längerer Vorinkubation signifikant höher ist (das Signifikanzniveau wurde nach dem Student´schen tTest mit p<0.05 berechnet). Folglich wird vermutet, dass die Konformation von GlpD durch Bindung an DOPE verändert wird und dies die Enzymaktivität stimuliert. 52 Ergebnisse s p ecific a ctivity [nm o l/(µg *m in)] 8 5 m in 7 3 0 m in 6 5 4 3 2 1 0 C o n trol PC PE:PC 1 :1 PC /PE:PG PC /PE:PG PG:PE/PC 9 :1 7 :3 7 :3 PG Abbildung 23: LUVETs induzierte Stimulation der GlpD-Enzymaktivität nach 5 und 30 min. Die Enzymaktivität von GlpD wurde photometrisch in einem PMS-gekoppelten MTT-Enzymaktivitätstest nach 5- bzw. 30 minütiger Vorinkubation gemessen. In einem Volumen von jeweils 250 µl wurde 0.75 µg GlpD mit 200 µM DOPC-, DOPE/PC- (1:1 molares Verhältnis), DOPE/PC:PG- (9:1 molares Verhältnis), DOPE/PC:PG- (7:3 molares Verhältnis), DOPE/PC:PG- (3:7 molares Verhältnis) und DOPG LUVETs eingesetzt. Der Kontrollansatz enthielt keine LUVETs. Die spezifische Aktivität gibt die Menge an reduziertem MTT pro Minute und pro µg Protein an. Die Daten repräsentieren Mittelwerte und die ermittelten Standarabweichungen von jeweils drei unabhängigen Experimenten. Die Werte wurden jeweils doppelt bestimmt. s pe cific a ctivity [n m o l/(µg xm in )] 7 6 5 4 PE:PC 3 TLE 2 PE:PG 7:3 1 PG PC 0 0 50 1 00 1 50 2 00 L U VET (µM) Abbildung 24: Dosisabhängige Stimulation der GlpD-Enzymaktivität durch LUVETs nach 2 h Vorinkubation. Die Enzymaktivität von GlpD wurde photometrisch in einem PMS-gekoppelten MTT-Enzymaktivitätstest gemessen. Nach 2 h Vorinkubation des Testansatzes, der in einem Volumen von jeweils 250 µl 0.75 µg GlpD mit DOPE/PC- (6:4 molares Verhältnis), DOPC-, TLE-, DOPE:PG- (7:3 molares Verhältnis) und DOPG-LUVETs enthielt, wurde die spezifische GlpD- Enzymaktivität als reduziertes MTT pro Minute und pro µg Protein gemessen. Im Kontrollansatz wurden keine LUVETs eingesetzt. Gezeigt sind Mittelwerte und Standarabweichungen von jeweils drei unabhängigen Experimenten. Die Werte wurden jeweils doppelt bestimmt. Die Dosis-Wirkungsbeziehung nach zweistündiger Vorinkubation (Abbildung 24) bestätigt, dass unabhängig von der jeweiligen LUVET-Konzentration die durch neutrale Phospholipide stimulierte Enzymaktivität deutlich höher ist als die durch negativ geladene Phospholipide 53 Ergebnisse stimulierte. Liposomen aus TLE, die 76% PE, 14% PG and 10% CL enthielten (Rietveld et al., 1995), aktivieren GlpD im selben Ausmaß wie DOPE/PG (7:3 molares Verhältnis). Liposomen-stimulierte GlpD-Aktivität bei hohen Salzkonzentrationen Da das eingesetzte Substrat G3P ein kleines Molekül mit einer negativen Ladung ist, könnte eine Substratabstoßung durch negativ geladene Phospholipide die Ursache für die niedrigere PG-Stimulation sein. Die GlpD-Aktivität wäre somit mangels Substrat geringer. Um dies zu überprüfen, wurden Enzymaktivitäten nach 30-minütiger Vorinkubation bei hohen Salzkonzentrationen (400 mM NaCl) gemessen. Mit hohen Salzkonzentrationen kann die negative Ladung der PG-Liposomen abgeschirmt und damit eine Substratabstoßung verhindert werden. Abbildung 25 vergleicht die Liposomen-stimulierte spezifische Aktivität von GlpD bei niedrigen (75 mM) und hohen (400 mM) Salzkonzentrationen. Die Aktivierung durch DOPE:DOPC (6:4) ist bei 75 mM NaCl um den Faktor 1.47 höher als durch DOPG. Bei höheren Salzkonzentrationen (400 mM NaCl) wird dieser Unterschied sogar noch größer: Die DOPE-stimulierte Aktivität ist um den Faktor 1.78 höher als die durch DOPG stimulierte Aktivität. Demnach wird Substratabstoßung als Ursache für die geringere DOPGStimulierung ausgeschlossen. s pec ific ac tivity [nm ol/(µg*m in)] 9 75 m M NaCl 8 400 m M NaCl 7 6 5 4 3 2 1 0 C o n trol D OPC PC :PE 6 :4 PE:PG 1 :1 PE:PG 3 :7 D OPG Abbildung 25: Einfluss der Ionenstärke auf die LUVET-stimulierte GlpD-Aktivität. Die Enzymaktivität von GlpD wurde photometrisch in einem PMS-gekoppelten MTT-Enzymaktivitätstest unter niedrigen (75 mM NaCl) bzw. hohen (400 mM NaCl) Salzbedingungen nach 30 min Vorinkubation gemessen. Die spezifische Aktivität wurde in einem Volumen von jeweils 250 µl gemessen, das 0.75 µg GlpD mit 200 µM DOPC-, DOPE/PC- (6:4 molares Verhältnis), DOPE:PG- (1:1 molares Verhältnis), DOPE:PG- (3:7 molares Verhältnis) und DOPG-LUVETs enthielt. Im Kontrollansatz wurden keine LUVETs eingesetzt. Die Daten repräsentieren Mittelwerte und die ermittelten Standarabweichungen von jeweils drei unabhängigen Experimenten. Die Werte wurden jeweils doppelt bestimmt. 54 Ergebnisse pH-Abhängigkeit der Liposomen-stimulierten Enzymaktivität Aufgrund der negativen Ladung der DOPG-Liposomen ist der pH an der Membranoberfläche lokal erniedrigt. Ob die geringere Stimulation durch DOPG-LUVETs ein Resultat des lokal erniedrigten pH ist, wurde untersucht. Hierzu wurden Enzymaktivitätstests im basischen Milieu (pH 8.5) durchgeführt und mit den Ergebnissen unter den Standardbedingungen (pH s p ecific a ctivity [nm o l/(m in xµg)] 7.4) verglichen. 7 p H 7 .4 p H 8 .5 6 5 4 3 2 1 0 C o n trol TL E PC PE:PC 6 :4 PG:PC 1 :1 PG PE:PG 7 :3 Abbildung 26: Einfluss des pH-Milieus auf die LUVET-stimulierte GlpD-Aktivität. Die Enzymaktivität von GlpD wurde photometrisch in einem PMS-gekoppelten MTT-Enzymaktivitätstest bei pH 7.4 bzw. pH 8.5 nach 30 min Vorinkubation gemessen. Die spezifische Aktivität wurde in einem Volumen von jeweils 250 µl gemessen, das 0.75 µg GlpD mit 200 µM TLE-, DOPC-, DOPE/PC- (6:4 molares Verhältnis), DOPG:PC- (1:1 molares Verhältnis), DOPG- und DOPE:PG- (7:3 molares Verhältnis) LUVETs enthielt. Im Kontrollansatz wurden keine LUVETs eingesetzt. Die Daten repräsentieren Mittelwerte und die ermittelten Standardabweichungen von jeweils drei unabhängigen Experimenten. Die Werte wurden jeweils doppelt bestimmt. Abbildung 26 zeigt, dass sowohl bei pH 7.4 als auch pH 8.5 die stärkste Stimulation mit neutralen Liposomen erreicht wurde. Die bei pH 8.5 gemessenen Enzymaktivitäten waren insgesamt höher als die bei pH 7.4 beobachteten. PE/PC-Liposomen stimulierten die Enzymaktivität signifikant stärker als DOPG-Liposomen. Im Vergleich zu pH 7.4 fielen die Unterschiede jedoch geringer aus. Bei pH 7.4 wurde eine ca. 5.8-fach stärkere Stimulation mit DOPE/PC-Liposomen und eine 3.8-fach höhere Stimulation mit DOPG-Liposomen im Vergleich zur Kontrolle gemessen. Bei pH 8.5 wurden mit DOPE/PC-Vesikeln eine 3.2-fach höhere und mit DOPG eine 2.7-fach höhere Aktivität als ohne Liposomen beobachtet. Folglich beeinträchtigt der lokal niedrigere pH von anionischen Liposomen die GlpDAktivität. Da jedoch selbst bei höheren pH-Werten die PE/PC-induzierte Aktivitäten signifikant höher waren als die PG-induzierten (das Signifikanzniveau wurde nach dem Student´schen t-Test mit p<0.05 bestimmt), ist der pH-Effekt offensichtlich nicht die einzige 55 Ergebnisse Ursache für den beobachteten Unterschied. Es wird vermutet, dass dies Folge einer spezifischen Interaktion zwischen GlpD und der Kopfgruppe von PE ist, wie sie auch in Vesikelbindungsstudien beobachtet wurde (Abb. 20A). 56 Diskussion Diskussion Direkte GlpD-Lipid-Interaktion In der vorliegenden Arbeit wurde untersucht, wie das periphere Membranprotein GlpD mit Phospholipiden interagiert. Direkte GlpD-Lipid Interaktion wurde dabei auf zwei unterschiedlichen Wegen demonstriert. Mithilfe der Monolayer-Technik wurde die penetrative Kraft von GlpD gegenüber unterschiedlich zusammengesetzten Phospholipid-Monolayern gemessen. Unter Verwendung von Phospholipid-Bilayern wurde in einem zweiten Ansatz eine Bindung an die Oberfläche von Liposomen nachgewiesen. Die Ergebnisse zeigen, dass eine direkte GlpD-Lipid-Interaktion auf zwei unterschiedlichen Wegen geschieht. Membraninsertion von GlpD Die Ergebnisse der Monolayer-Experimente zeigen, dass GlpD Domänen ausbildet, die sich zwischen die Phospholipide einlagern. Monolayer, die bei hohen Initialdrücken eingesetzt werden, sind ein verlässliches Instrument, die partielle Insertion von Proteinen zu analysieren, da die Packungsdichte der Phospholipide, wie sie in der Erythrozyten-Membran ermittelt wurden, einem Initialdruck von 31 bis 35 mN/m im Monolayer-System entspricht (Demel et al., 1975). Der maximale Initialdruck πmax bei dem eine Insertion des Proteins stattfindet, ist ein Maß für die Penetrationskraft eines Proteins. Der Befund, dass GlpD selbst bei Initialdrücken im physiologisch interessanten Bereich in TLE-Monolayer (πmax = 34,2 mN/m) inseriert, deutet an, dass GlpD in vivo die cytoplasmatische Membran penetriert. Um zu untersuchen, welche Phospholipide das Eintauchen von GlpD in Lipid-Monolayern begünstigen, wurden Experimente mit Monolayern durchgeführt, die aus artifiziellen Phospholipiden bestanden (DOPE, DOPC, DOPG). Da sich diese Lipide lediglich bezüglich ihrer Kopfgruppe und nicht bezüglich ihrer Fettsäurezusammensetzung unterscheiden, wurde somit der Einfluss der polaren Kopfgruppe auf die Insertion untersucht. Es zeigte sich, dass GlpD bevorzugt in negativ geladene Phospholipide inseriert. Die Maximaldrücke für anionische Lipide wie DOPG bzw. CL lagen deutlich über den Maximaldrücken für zwitterionischer Phospholipide wie DOPE und DOPC. Die Beobachtung, dass die durch GlpD induzierte Druckänderung mit dem Gehalt an negativ 57 Diskussion geladenen Phospholipiden bei gemischten Monolayern positiv korreliert (Abbildung 16), unterstreicht den fördernden Einfluss negativ geladener Lipide auf die Penetrationskraft von GlpD. Die beobachtete Diskrepanz zwischen Insertion in DOPE und in DOPC lässt auf die Spezifität der GlpD-PE-Interaktion schließen. Möglicherweise sind nicht nur elektrostatische Wechselwirkungen, sondern auch eine spezifische Interaktion aufgrund ihrer physikalischchemischen Eigenschaften zwischen den PE-Kopfgruppen und GlpD für die Penetration in Monolayer entscheidend. Denn erstens kann PE, das im Gegensatz zu PC ein ionisierbares Amin aufweist, Wasserstoffbrücken ausbilden (Dowhan, 1997). Der zweite wichtige Unterschied zwischen PE und PC besteht darin, dass PE zu der Gruppe der Nicht-Bilayer-Lipide gehört und dies entscheidend für die Beschaffenheit der Membranstruktur ist. PE-enthaltende Membranen weisen aufgrund der kleinen PE-Kopfgruppe im Membran-Cytoplasma-Grenzbereich eine geringere Packungsdichte auf als im Inneren der Membran (vgl. Abb. 3). NichtBilayer-Lipide tendieren folglich dazu, Aggregate mit einer konkaven Oberflächenstruktur zu bilden (Abb. 27A). Werden diese Lipide in eine Bilayerstruktur „gezwängt“, dann werden die hydrophoben Lipidschwänze zusammengedrückt, so dass die Kopfgruppen voneinander getrennt werden (Abb. 27B). Dieser Zustand wird als „frustrated bilayer“ bezeichnet (De Kruijff, 1997a; Gruner, 1985). Die dadurch entstehenden Lücken zwischen den Kopfgruppen ermöglichen eine partielle Penetration von Proteinen (Van Den Brink-Van Der Laan et al., 2001). Abbildung 27: A: PE-Monolayer; B: PE in „frustrated bilayer“-Struktur (Van Voorst und De Kruijff, 2000) Insertion erfolgt durch basisch amphiphile α-Helix Mit welchen Domänen dringt GlpD in die Lipid-Monolayer ein? Im Gegensatz zu integralen Membranproteinen bilden periphere Membranproteine keine transmembranen Domänen aus. 58 Diskussion Einige sind dennoch in der Lage, entweder durch α-helicale Domänen oder durch Schleifen die cytoplasmatische Seite der Doppelmembran zu penetrieren. In jüngster Zeit wurden einige Proteine beschrieben, die über α-helicale Domänen an die cytoplasmatische Membran binden, darunter das bei der Chromosomen-Replikation in E. coli beteiligte Enzym DnaA (Garner und Crooke, 1996), das in der Katabolitrepression beteiligte E. coli Enzym IIAGlc (Wang et al., 2000), sowie RGS4 (Regulator of G protein signaling), ein die G-Proteinaktivität regulierendes Säugerenzym (Bernstein et al., 2000). Mit Hilfe von Sekundärstrukturvorhersagen konnte eine basisch amphiphile α-Helix im Bereich der Aminosäuren 355-370 ermittelt werden. Biophysikalische Studien zeigen, dass von allen Aminosäuren Tryptophan und Tyrosin die höchste Affinität für die sogenannte Interface-Region haben, also den Übergangsbereich zwischen polarer und unpolarer Umgebung (Wimley und White, 1996). Da ein Tyrosinrest in der vorhergesagten Struktur liegt, gilt eine Orientierung der helicalen Struktur im Membran-Cytoplasma-Grenzbereich als wahrscheinlich. Mutationen in GlpD, welche die ursprünglich positive Nettoladung der Helix in eine negative Ladung umwandelten, führten zu einer verminderten Penetrationsfähigkeit von GlpD in TLE-Monolayer. Elektrostatische Wechselwirkungen sind also für die Membraninsertion essentiell. Obwohl die Nettoladung der Helix bei allen Mutanten unter physiologischen Bedingungen –1 betrug, wurden deutliche Unterschiede in ihrer Penetrationskraft festgestellt. Während die Mutanten R359E und K360E unter physiologisch relevanten Drücken nicht mehr in der Lage waren, TLE-Monolayer zu penetrieren, inserierte die AH362/4DE-Mutante unter physiologischen Druckbedingungen und verhielt sich damit eher wie Wildtyp-GlpD. Vergleicht man das Insertionspotential der Mutanten in anionische Lipidmonolayer, so wird der Unterschied noch deutlicher. Die Insertionskraft der Doppelmutante ist im Gegensatz zur penetrativen Kraft des Wildtyp-GlpD deutlich reduziert, liegt aber im Gegensatz zu den R359E- bzw. K360E-Mutanten immer noch deutlich im physiologisch relevanten Bereich. Keine Unterschiede zwischen Wildtyp-GlpD und den Mutanten wurden dagegen bei der Insertion in zwitterionische Lipidmonolayer beobachtet. Folglich ist die α-helicale Struktur in ihrer basisch-amphiphilen Ausprägung für die Insertion in anionische Lipidschichten essentiell. Diese Schlussfolgerung wird durch eine experimentelle und theoretische Analyse der Assoziation basischer Peptide mit Membranen, die negative Phospholipide enthalten, gestützt (Ben-Tal et al., 1996; Ben-Tal et al., 1997). Die Autoren postulieren, dass pro basischem Rest 59 Diskussion 1 kcal/mol Energie für die Membranassoziation zur Verfügung steht. Folglich ist die Anzahl der basischen Reste für eine energetisch günstige Insertion entscheidend. Damit kann allerdings nur erklärt werden, dass eliminierte basische Reste im helicalen Bereich dazu führen, dass die Penetrationskraft der Mutanten geringer ist als die des Wildtyps. Was ist jedoch die Ursache für die unterschiedliche Penetrationseffizienz der einzelnen Mutanten? Zwar ist die Nettoladung im α-helicalen Bereich unter physiologischen Bedingungen bei allen Mutanten gleich, allerdings unterscheiden sich die Mutanten in der Anordnung elektronegativer Reste. Während die hydrophile Seite der α-Helix bei der Doppelmutante statt des ursprünglich positiven Ladungsüberschusses neutral ist, präsentieren die R359E- bzw. K360E-Mutanten eine elektronegativ geladene hydrophile Seite. Dies führt zu folgendem Modell: Gelangt Wildtyp-GlpD in die Nähe von anionischen Phospholipiden, so wird die elektropositiv geladene Helix exponiert. Positive Ladungen im hydrophilien Bereich interagieren dabei mit den elektronegativen Lipid-Kopfgruppen. Bei der AH362/4DE-Mutante begünstigt vermutlich das Dipol-Moment der Membran die Präsentation der amphiphilen Helix. Die elektrostatische Anziehung ist zwar deutlich geringer, jedoch offensichtlich immer noch ausreichend, um eine Adsorption zu ermöglichen. Da die negativen Reste im hydrophoben Bereich lokalisiert sind, kommen sie möglicherweise nicht mit den polaren Kopfgruppen direkt in Kontakt. Lediglich hydrophobe Wechselwirkungen begünstigen das Eintauchen der Helix in die Membran. Dagegen überwiegt bei den R359E- und K360E Mutanten die elektrostatische Abstoßung zwischen den negativen Resten auf der hydrophilen Seite und den anionischen Lipid-Kopfgruppen, so dass keine Adsorption im Grenzbereich stattfinden kann. Folglich kann die amphiphile Helix nicht in den hydrophoben Bereich der Membran eindringen. Spezifische Bindung an PE-enthaltende Membranen Die Monolayer-Experimente ermöglichen es, den Mechanismus der Membraninsertion von GlpD umfassend zu analysieren. Mittels radioaktiv markiertem GlpD könnten in MonolayerExperimenten neben der Proteininsertion (über die Messung der Druckänderung) auch die oberflächliche Protein-Lipid-Bindung (über die Messung der Radioaktivität im Monolayer bzw. im Puffer) quantifiziert werden. Eine oberflächliche Bindung von Proteinen an Membranen kann jedoch auch im Lipid-Bilayersystem untersucht werden. Die Hypothese, dass GlpD direkt mit der cytoplasmatischen Membran interagiert, wurde im Lipid-Bilayersystem experimentell bestätigt. Die Beobachtung, dass nach zweistündiger Inkubation von 60 Diskussion gereinigtem GlpD mit TLE-Liposomen und anschließender Ultrazentrifugation das lösliche GlpD mit den Liposomen sedimentierte, kann als effektive Bindung von GlpD an Liposomen interpretiert werden. Um die Lipidspezifität zu untersuchen, wurden GlpD-Bindungstests mit einerseits neutralen Phospholipid-Vesikeln, die 60% PE enthielten, und andererseits negativ geladenen Phospholipid-Vesikeln durchgeführt. Unter der Annahme, dass die GlpD-LipidInteraktion lediglich auf Membraninsertion beruht, würde man erwarten, dass GlpD bevorzugt an negativ geladene Phospholipide bindet. Diese Erwartung konnte nicht bestätigt werden. Im Gegenteil, es wurde sogar eine höhere Affinität von GlpD für die PE-enthaltenden Liposomen beobachtet. Die maximale Menge an gebundenem Protein war bei beiden LUVET-Typen gleich. Wenn Ladungseffekte ausschließlich für die unterschiedliche Bindungseffekte verantwortlich wären, dann würde man ähnliche Affinitäten für reine PC-Liposomen wie für PE/PC-Liposomen erwarten. In Experimenten mit reinen PC-Liposomen band bei Zugabe von 15 bzw. 30 µg GlpD deutlich weniger Protein als an PE/PC-Liposomen (Daten nicht gezeigt). Folglich resultiert die höhere Affinität gegenüber PE/PC-Liposomen aus spezifischen Wechselwirkungen zwischen PE und GlpD. In Ergänzung zu der Beobachtung, dass die Penetrationskraft von GlpD gegenüber PE-Monolayern deutlich höher ist als gegenüber PCMonolayern, wird in diesem Zusammenhang die zentrale Bedeutung des „frustrated bilayer“Effekts deutlich. Die Packungsdichte im Membran-Cytoplasma-Grenzbereich ist geringer als im Inneren der Membran, dadurch können sich Peptide bzw. Proteindomänen zwischen die PE-Kopfgruppen einlagern. Die Ergebnisse von Liposomen-Bindungstests mit den Mutanten unterschieden sich kaum von den Resultaten, die mit Wildtyp-GlpD erzielt wurden. Liposomen-Bindungsstudien mit den Mutanten zeigten, dass die Mutanten in der Lage sind, direkt mit den Membranen zu interagieren. Es wurde ebenfalls eine höhere Affinität gegenüber PE-enthaltenden LUVETs beobachtet im Vergleich zu LUVETs, die PG enthielten. Demzufolge ist die α-helicale Struktur für diese Art der Anheftung nicht entscheidend ganz im Gegensatz zur Membraninsertion. Zwar konnte bei den durchgeführten Liposomen-Bindungstests nicht direkt differenziert werden, ob die beobachtete Anheftung durch Insertion und/oder oberflächliche Bindung zustande kommt, dennoch wird durch folgende Beobachtungen deutlich, dass zwei unterschiedliche Wege der direkten GlpD-Lipid-Interaktion existieren: 1.) Die Lipidspezifität im Bilayersystem unterscheidet sich deutlich von der des Monolayersystems. 2.) Mutationen im α-helicalen Bereich beeinträchtigten die Insertion in Monolayer, hatten jedoch keinen Effekt 61 Diskussion auf die beobachtete Anheftung im Bilayersystem. Lipid-stimulierte Enzymaktivität Welche Konsequenzen hat die direkte Lipid-Interaktion auf die Enzymaktivität in vitro? Mittels Enzymaktivitätsmessungen wurde gezeigt, dass Liposomen unabhängig von ihrer Größe, Form und Zusammensetzung die Aktivität von GlpD - im Vergleich zur Aktivität ohne Liposomen - deutlich stimulieren. Während DnaA (Garner und Crooke, 1996) und D-LactatDehydrogenase (Dym et al., 2000) über anionische Phospholipide an die cytoplasmatische Membran binden und dadurch maximal aktiviert werden, wurde eine maximale Aktivierung von GlpD durch PE-enthaltende Liposomen beobachtet. Durch Experimente mit unterschiedlich langen Vorinkubationszeiten konnte ausgeschlossen werden, dass die geringere Stimulation durch PG- gegenüber PE/PC-Liposomen auf Ladungseffekten von PG beruht, die eine teilweise Entfaltung von GlpD und eine damit einhergehende Inaktivierung bewirken könnten. Ferner wurde mit Versuchen unter Hochsalzbedingungen gezeigt, dass die Ursache für die geringere Aktivierung von GlpD durch anionische Phospholipide nicht aus einer ladungsbedingten Abstoßungsreaktion des Substrats resultiert. Möglicherweise beeinflusst der an der Oberfläche anionischer Liposomen lokal verringerte pH (Leenhouts et al., 1995) die GlpD-Enzymaktivität negativ. Enzymaktivitätsmessungen, die im basischen Milieu durchgeführt wurden, zeigten eine deutlich höhere Stimulation von GlpD als im neutralen Milieu. Die Unterschiede waren bei Liposomen, die anionische Phospholipide enthielten, deutlich größer als bei neutralen Liposomen. Allerdings wurde auch im basischen Milieu die größte Stimulation mit PE-enthaltenden Liposomen beobachtet. Vermutlich resultiert dies aus einer spezifischen Interaktion zwischen GlpD und PE, die stimulierend auf die Enzymaktivität wirkt. Es wurde nämlich gezeigt, dass die PEinduzierte Stimulation nach 30-minütiger Inkubation höher ist als nach 5-minütiger Inkubation. Folglich findet eine Wechselwirkung zwischen GlpD und PE statt, die nach Erreichen des Gleichgewichtszustands eine maximale Aktivierung bewirkt. Dieser Gleichgewichtszustand ist nach 30 Minuten erreicht, da eine Verlängerung der Inkubationszeit auf zwei Stunden die Aktivität nicht weiter erhöhte (Abb. 22). Ferner wird zwar eine negative Korrelation zwischen dem Gehalt anionischer Lipide und der stimulierten Aktivierung beobachtet, dennoch ist der Ladungseffekt nicht die einzige Ursache, für die erhöhte Stimulation mit PE/PC-Liposomen. Denn im Vergleich zu reinen PC-Liposomen wird die GlpD-Aktivität durch neutrale Liposomen, die PE enthalten, deutlich stärker stimuliert (Abb. 62 Diskussion 24). Daraus kann geschlossen werden, dass eine spezifische Wechselwirkung zwischen PE und GlpD entweder durch Ausbildung von Wasserstoffbrücken und/oder durch partielle Insertion zwischen die PE-Kopfgruppen eine Konformation stabilisiert, die förderlich für die PMS-vermittelte Reduktion von MTT ist. Aus der Beobachtung, dass ein breites Spektrum unterschiedlicher Detergenzien die GlpD-Aktivität stimuliert (Robinson und Weiner, 1980), wird geschlossen, dass sich die Hydrophobizität von GlpD in Anwesenheit von Phospholipiden bzw. Detergenzien erhöht und damit die Enzymaktivität signifikant steigert. Offensichtlich ist eine lockere Bindung an Membranoberflächen bzw. der lockere Kontakt mit Mizellen ausreichend, um eine für die Enzymaktivität günstige Proteinstruktur zu induzieren. Enzymaktivitätsmessungen mit den mutierten GlpD-Proteinen konnten nicht durchgeführt werden, da die Punktmutationen zu einer stark reduzierten Aktivität führten. Bei der AH362/4DE-Mutante wurden lediglich 2% und bei der R359E bzw. K360E-Mutante 1.5% der ursprünglichen Aktivität gemessen. Ein Homologievergleich von Glycerin-PhosphatDehydrogenasen aus verschiedenen Organismen ergab, dass die Aminosäuren R359, K360 und A362 aus E. coli in verschiedenen prokaryontischen Organsimen, wie Pseudomonas aeruginosa, Pseudomonas tolaasii und Bacillus subtilis konserviert sind. Die Aminosäuren R359 und A362 sind sogar in eukaryontischen Organsimen (Hefe, Maus und Mensch) konserviert. Es wird vermutet, dass diese Aminosäuren an der G3P-Substratbindung beteiligt sind (Austin und Larson, 1991). Der Austausch dieser konservierten Aminosäuren könnte zu einem Verlust der Substratbindefähigkeit führen. Dies würde die niedrige Aktivität der Punktmutanten erklären. Eine ähnliche Überschneidung von Substrat- und Lipidbindestelle wurde auch für DLactat-Dehydrogenase ermittelt (Dym et al., 2000). Der Vorteil einer solchen Überlappung besteht darin, dass die Membranbindedomäne das Protein an der Membran stabil verankert und damit eine günstige Orientierung des aktiven Zentrums zur Membranseite hin ermöglicht. Das räumliche Zusammenbringen von aktivem Zentrum und Quinon-Molekül scheint für den Elektronentransport optimal zu sein (Dym et al., 2000). Lokalisierung an Mikrodomänen? Die Beobachtung, dass GlpD aus E. coli-Zellen unter Verwendung von Detergenzien und hohen Salzkonzentrationen aus Zellen gereinigt wird, spricht für eine starke Membrananheftung (Weiner und Heppel, 1972). Ein oberflächlicher Kontakt zwischen GlpD und der 63 Diskussion Membran ist für diese stabile Verankerung nicht ausreichend, das Eintauchen von Proteindomänen in die cytoplasmatische Membran bewirkt dagegen eine stabile GlpD-MembranAnheftung. Aufgrund der enormen Penetrationskraft von GlpD in anionische Monolayer wird vermutet, dass in vivo die Membraninsertion für die Lokalisation an der cytoplasmatischen Membran eine zentrale Rolle spielt. Einige Befunde sprechen dafür, dass GlpD in vivo über Insertion in PG oder CL an die Membran verankert ist: Es wurde gezeigt, dass es nur eine begrenzte Zahl an GlpD-Bindestellen an der Membran gibt (Kung und Henning, 1972). Aus der Beobachtung, dass GlpD mit der an anionische Lipide bindenden D-LactatDehydrogenase um dieselben Bindungsstellen kompetiert (Dym et al., 2000; Kung und Henning, 1972), wird gefolgert, dass die Membrananheftung von GlpD in vivo an Membrandomänen mit anionischen Lipiden erfolgt. Auf Grundlage der hier präsentierten Daten wird postuliert, dass lösliches GlpD zufällig an die Membran bindet und in Anwesenheit von anionischen Phospholipiden eine basisch amphiphile α-Helix ausbildet. Diese α-Helix ist in der Lage, mit den polaren Kopfgruppen anionischer Lipide zu interagieren und zwischen die Kohlenwasserstoffketten der Phospholipide zu inserieren. Das tiefe Eintauchen der helicalen Domäne von GlpD sorgt für eine stabile Verankerung des Proteins an Membranbereiche, die einen hohen Anteil negativ geladener Phospholipide aufweisen. Norris und Fishov postulieren, dass in E. coli Mikrodomänen ausgebildet werden, die zentrale Vorgänge, wie die bakterielle Zellteilung, regulieren (Norris und Fishov, 2001). Mikrodomänen, die mit anionischen Lipiden angereichert sind und Proteincluster enthalten, wurden in E. coli beobachtet (Fishov und Woldringh, 1999; Mileykovskaya und Dowhan, 2000). Um in vivo Lipide in der Zellmembran sichtbar machen zu können, markierten Fishov und Woldringh E. coli-Zellen mit einem lipophilen Fluoreszenzfarbstoff. Sie beobachteten eine inhomogene Fluoreszenzmarkierung der cytoplasmatischen Membran: Zu Beginn der Zellteilung fluoreszieren die beiden Zellpole stark, während die Teilungsregion im Zellmittelpunkt nicht fluoresziert (1999). Vermutlich ist das Anfärbung der Phospholipide in dieser Region aufgrund von Protein-Clusterbildung nicht möglich. Mileykovskaya und Dowhan markierten E. coli-Zellen mit eine Cardiolipin-spezifischen Fluoreszenzfarbstoff. Sie beobachteten Cardiolipin-angereicherte Domänen in der Teilungsregion und an den Zellpolen (2000). Die zentrale Bedeutung der Membraninhomogenität wird zudem durch die Ergebnisse von Experimenten mit der pss-Mutante, die keine Phosphatidylethanolamin mehr bilden kann, gestützt. Diese Mutation ist lethal, in Anwesenheit von Kationen sind die Zellen jedoch überlebensfähig. Mileykovskaya und Mitarbeiter beobachteten, dass die Zellen nicht mehr 64 Diskussion teilungsfähig sind (1998). Zwar bindet FtsZ noch an die Zellteilungregion, allerdings ist keine korrekte Assemblierung von FtsZ, dem Schlüsselprotein der Zellteilung, möglich, so dass kein Septum gebildet werden kann (Mileykovskaya et al., 1998). Einige physiologische Prozesse in Bakterien wie z.B. Proteintranslokation und Chromosomenreplikation werden durch Membran-assoziierte Enzyme gesteuert, die bevorzugt mit anionischen Phospholipiden interagieren, wie SecA (Breukink et al., 1992; Miller et al., 1998), FtsY (De Leeuw et al., 2000) und DnaA (Garner et al., 1998). Möglicherweise finden diese energieverbrauchenden Prozesse ebenfalls an Mikrodomänen, die mit anionischen Lipiden angereichert sind, statt. Eine gezielte Lokalisation von GlpD an diese Mikrodomänen könnte dem Zweck dienen, die dort assoziierten Enzyme mit Energie zu versorgen. α-Helix: generelles Membranbindemotiv bei Glycerin-3- Phosphat-Dehydrogenasen? Die anaerobe Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenase (GlpABC) aus E. coli bindet über den Membrananker GlpC auf bislang unbekannte Weise an die Membran. Mittels Sekundärstrukturvorhersagen können keine transmembranen Strukturen identifiziert werden, jedoch werden im Bereich der Aminosäuren 261-279 amphiphile α-Helices vorhergesagt (Cole et al., 1988; Eisenberg, 1984). Abbildung 28 zeigt, dass die Aminosäuresequenz von GlpC im Bereich von Aminosäuren 274-288 zu 42.9% identisch mit der Membraninsertionsdomäne von GlpD ist. Da die für die Insertion essentiellen Aminosäuren R359 und K360 in GlpC konserviert sind, kann die Voraussage gemacht werden, dass sie bei der Membrananheftung von GlpC ebenfalls eine Rolle spielen. GlpD(357-69) YRKLAEHALEKLTP GlpC(275-288) WRKLDEGKTLPLKP :*** * * * Abb. 28: Homologievergleich der Aminosäuresequenzen vonGlpC mit der GlpD-Membran-Insertionsdomäne. Als Kriterien für die Ähnlichkeit wurden folgende Eigenschaften der Aminosäuren zugrunde gelegt: negativ geladen, positiv geladen, unpolar oder polar ungeladen (* = identische Aminosäure; : =homologer Austausch, unterstrichen = α-helicale Membranbindestelle). 65 Diskussion Zwischen GlpD und der FAD-abhängigen Glycerin-3-Phosphat-Dehydrogenase (GUT2) aus Saccharomyces cerevisiae besteht eine 31%ige Identität der Aminosäuresequenzen. GUT2 katalysiert die Oxidation von Glycerin (Larsson et al., 1993; Sprague und Cronan, 1977) und ist zwischen der inneren und der äußeren Mitochondrien-Membran lokalisiert, wobei der Mechanismus der Membranverankerung noch nicht geklärt ist. GUT2 ist eine Komponente des Glycerin-3-Phosphat-Shuttle und überträgt die Reduktionsequivalente von cytosolischem NADH über die Membran zur mitochondrialen Atmungskette (Larsson et al., 1998; Overkamp et al., 2000). Aufgrund der Beobachtung, dass GUT2 durch Carbonat (Na2CO3)Extraktion, nicht jedoch durch 1 M NaCl von der inneren mitochondrialen Membran isoliert werden kann, wird vermutet, dass GUT2 ein peripheres Membranprotein ist, das hauptsächlich durch hydrophobe und weniger durch elektrostatische Wechselwirkungen mit der Membran interagiert (unveröffentliche Daten, Marjolein Janssen). Zudem wurde eine spezifische Interaktion zwischen GUT2 und PC beobachtet, wobei PC möglicherweise die Aktivität stimuliert (persönliche Mitteilung, Marjolein Janssen). Da eine hohe Übereinstimmung von GUT2 mit der α-helicalen Membraninsertionsdomäne von GlpD besteht, kann spekuliert werden, dass GUT2 ebenfalls über eine α-helicale Domäne in Membranen inseriert (Abb. 29). Sekundärstrukturvorhersageprogramme wie PHD (Rost et al., 1994) und Predator (Frishman und Argos, 1996) ermittelten für GUT2 im Bereich von Aminosäure 463-479 eine amphiphile (Eisenberg et al., 1984) α-Helix. Somit stimmen GlpD und GUT2 in dem Membran-Bindemotiv überein. Während die GlpD-Helix elektropositiv ist und damit bevorzugt in anionische Phospholipide inseriert, ist die GUT2-Helix neutral. Dies stützt die experimentelle Beobachtung, dass GUT2 über hydrophobe Wechselwirkungen mit der Membran und insbesondere mit PC interagiert. GlpD(353-379) GGKLTTYRKLAEHALEKL Gut2(461-477) GGKWTTYRQMAEETVDKV *** **** :** ::*: Abb. 29: Homologievergleich der Aminosäuresequenzen vonGut2 mit der GlpD-Membran-Insertionsdomäne. Als Kriterien für die Ähnlichkeit wurden folgende Eigenschaften der Aminosäuren zugrunde gelegt: negativ geladen, positiv geladen, unpolar oder polar ungeladen (* = identische Aminosäure; : =homologer Austausch, unterstrichen = α-helicale Membranbindestelle). 66 Diskussion Identität von CaM- und Membranbindedomäne Der spezifische Bindungsmechanismus zwischen GlpD und eukaryontischem CaM wurde durch Kompetitionsstudien untersucht. Von den eingesetzten chemisch unterschiedlichen CaM-Antagonisten wurde die GlpD-CaM-Bindung lediglich durch anionische Liposomen und durch Melittin gehemmt, einem kleinen Peptid, dessen Sekundärstruktur durch eine basisch amphiphile α-Helix charakterisiert ist. Neutrale Liposomen hatten keinen Einfluss auf die Bindung. Mittels C-terminal verkürzter GlpD-Fragmente und mittels in-vitro-Mutagenese wurde die CaM-Bindedomäne von GlpD auf den Bereich von Aminosäure 355-370 eingegrenzt. Diese Domäne wurde von unterschiedlichen Sekundärstrukturvorhersageprogrammen als basisch amphiphile α-Helix prognostiziert. Punktmutationen in diesem Bereich, die elektropositive Aminosäuren gegen elektronegative im hydrophilen Teil der Helix austauschen, beeinträchtigten die CaM-Bindung. Mutationen, die eine neutrale hydrophile Seite der αHelix bewirkten, hatten keinen Einfluss auf die GlpD-CaM-Bindung. Auf Grundlage dieser biochemischen Charakterisierung wurde postuliert, dass diese in vitro beobachtete Protein-Protein-Wechselwirkung die Assoziation von GlpD an Membranen widerspiegelt. Die Ergebnisse der Monolayer-Untersuchungen bestätigen diese Hypothese. GlpD-Mutanten, die nicht mehr an CaM binden konnten, zeigten geringe Penetrationskraft bezüglich anionischer Phospholipid-Monolayer. Im vorliegenden Fall war CaM also ein geeignetes Modell, Protein-Lipid-Interaktionen zu prognostizieren. Einige Argumente sprechen dafür, dass Protein-CaM-Bindungen als Testsystem für Protein-Lipid-Interaktionen betrachtet werden können. Ca2+/CaM präsentiert eine hydrophobe und saure Oberfläche, so dass die molekularen Kräfte für die Bindung anderer Proteine im wesentlichen auf hydrophoben und elektrostatischen Wechselwirkungen beruhen. Solche Wechselwirkungen spielen auch eine wichtige Rolle bei der Interaktion zwischen peripheren Membranproteinen und der cytoplasmatischen Membran. Neben GlpD gibt es noch andere Proteine, die mit demselben molekularen Mechanismus sowohl CaM als auch anionische Lipide bzw. anionische amphiphile Substanzen binden. Neben GlpD zählen hierzu sowohl die endotheliale als auch die neuronale Stickoxid Synthase (Venema et al., 1995; Venema et al., 1996; Watanabe et al., 1998) sowie MARCKS, die myristoylierten Alanin-reichen Proteinkinase C-Substrate (Vergeres und Ramsden, 2000). Ferner wurde gezeigt, dass Calcineurin aus Dictyostelium discoideum sowohl von Ca2+/CaM als auch von negativ geladenen ungesättigten Fettsäuren wie der 67 Diskussion Arachidonsäure aktiviert werden können (Kessen et al., 1999). Die Autoren diskutieren, dass dies vermutlich über denselben Bindungsmechanismus erfolgt. Die hier angeführten Beispiele zeigen, dass aufgrund der Identität von CaM- und Membranbindedomäne in vivo eine Fülle von Quervernetzungen zwischen verschiedenen Reaktionswegen möglich ist. In vitro kann dies dazu genutzt werden, über CaM-Bindungsstudien nach potentiellen Lipidbindemotiven zu suchen. Durch biochemische Charakterisierung der CaM-Bindedomäne wird zwar die Frage, welche funktionelle Bedeutung die identifizierten CaM-Bindedomänen in vivo haben, nicht hinreichend geklärt, allerdings können sich daraus notwendige Hinweise auf eine mögliche Funktion in vivo ergeben. Ausblick: Identifikation von Membranbindemotiven durch CaM Bindetests Insbesondere in Organismen, die kein CaM haben, eröffnet sich aufgrund der strukturellen Identität von GlpD- und CaM- Bindemotiven eine neue experimentelle Strategie, um nach prokaryontischen Membranbindeproteinen zu suchen und diese näher zu charakterisieren. Im Fall von GlpD wurde dies bereits erfolgreich demonstriert und kann auch bei anderen prokaryontischen CaM-Bindeproteinen angewandt werden. So ist z.B. ein Bereich des CaM-Bindeproteins GlpC hoch konserviert mit der GlpD-Membran-Insertionsdomäne (Abb.27). Durch Sekundärstrukturvorhersageprogramme wie PHD (Rost et al., 1994) und Predator (Rost et al., 1994) wurde für die Aminosäuren in diesem homologen Bereich von GlpC eine basische α-Helix mit amphiphilen Eigenschaften (Eisenberg et al., 1984) ermittelt (Abb30). Ferner wurde gezeigt, dass das CaM-Bindeprotein SecA in anionische Phospholipide inseriert (Breukink et al., 1992) und dass hierfür 70 Aminosäuren des CTerminus von SecA essentiell sind (Breukink et al., 1995). Über Sekundärstrukturvorhersageprogramme wie PHD und Predator wurde eine basisch amphiphile α-Helix im Bereich von Aminosäure 622-635 ermittelt, die mit CaM interagieren und in anionische Phospholipide inserieren könnte. Sekundärstrukturvorhersagen für das CaM-Bindeprotein TraC ermittelten eine basisch amphiphile Helix im Bereich von Aminosäuren 421-434 (Abb. 30). 68 Diskussion A L I L K H W R T GlpC F Q L L G A K TraC V W L Q E R A V R E A M,I,L,V F,Y,W A V K W G,A,P D,E N,Q K V N I SecA K,H,R S,T Q K E R T A Abb. 30: Basisch amphiphile Helices von GlpC, TraC und SecA als potentielle CaM- und Membranbindedomänen. Die Graustufen entsprechen dem Hydrophobizitätsgrad der Aminosäuren, wobei die Aminosäuren mit größerer Hydrophobizität dunkler und hydrophilere Reste heller dargestellt sind. Ob diese Helices für die CaM-Bindung essentiell sind, könnte durch CaM-Bindetests geprüft werden. CaM-Bindetests haben in experimenteller Hinsicht einige Vorteile gegenüber Monolayer- oder Liposomenbindungstests. Der erste Vorteil betrifft die experimentellen Voraussetzungen. So muss die Reinigung peripherer Membranproteine für CaM-Bindetests im Gegesatz zu Lipidmonolayer- bzw. Liposomenbindungstests nicht ohne den Einsatz von Detergenzien durchgeführt werden. Folglich erhält man für CaM-Bindetests eine höhere Ausbeute an Protein. Zweitens sind CaM-Bindetests experimentell einfacher durchzuführen, da keine speziellen Geräte (z.B. Mikro-Cahn-Waage) benötigt werden und sie nicht so sensitiv gegenüber externen Störungen (elektromagnetische Anziehung, Luftdruck etc.) sind wie Monolayer-Experimente. Drittens sind CaM-Bindetests nicht so zeitaufwendig, denn CaM-Sepharose wird industriell hergestellt und ist somit direkt einsetzbar. Für LiposomenBindungstests muss man dagegen die Liposomen erst herstellen. CaM-Bindetests vereinfachen also die Suche nach peripheren Membranbindeproteinen bzw. -domänen und können als Screeningsystem in E. coli angewandt werden. Die Suche wird dabei auf Proteine beschränkt, die hauptsächlich über elektrostatische Wechselwirkungen mit anionischen Phospholipiden interagieren. Insbesondere bei der 69 Diskussion Identifizierung von Proteinen, die möglicherweise an Mikrodomänen lokalisiert sind, können CaM-Bindetests effizient eingesetzt werden. 70 Literaturverzeichnis Literaturverzeichnis Ames, G. F. (1968), Lipids of Salmonella typhimurium and Escherichia coli: structure and metabolism. J. Bacteriol. 95: 833-843. Auer, M., M. J. Kim, M. J. Lemieux, A. Villa, J. Song, X. D. Li und D. N. Wang (2001), High-yield expression and functional analysis of Escherichia coli glycerol-3-phosphate transporter. Biochemistry 40: 6628-6635. Austin, D. und T. J. Larson (1991), Nucleotide sequence of the glpD gene encoding aerobic sn-glycerol 3- phosphate dehydrogenase of Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 173: 101-107. Babu, Y. S., C. E. Bugg und W. J. Cook (1988), Structure of calmodulin refined at 2.2 A resolution. J. Mol. Biol. 204: 191-204. Ben-Tal, N., B. Honig, R. M. Peitzsch, G. Denisov und S. 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White (1996), Experimentally determined hydrophobicity scale for proteins at membrane interfaces. Nat. Struct. Biol. 3: 842-848. 81 Literaturverzeichnis Wolff, J., G. H. Cook, A. R. Goldhammer und S. A. Berkowitz (1980), Calmodulin activates prokaryotic adenylate cyclase. Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 77: 3841-3844. Xavier, K. B., M. Kossmann, H. Santos und W. Boos (1995), Kinetic analysis by in vivo 31P nuclear magnetic resonance of internal Pi during the uptake of sn-glycerol-3-phosphate by the pho regulon-dependent Ugp system and the glp regulon-dependent GlpT system. J. Bacteriol. 177: 699-704. Yang, B. und T. J. Larson (1996), Action at a distance for negative control of transcription of the glpD gene encoding sn-glycerol 3-phosphate dehydrogenase of Escherichia coli K-12. J. Bacteriol. 178: 7090-7098. Yun, M., C. G. Park, J. Y. Kim und H. W. 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Prof. Dr. Winfried Boos danke ich für die Bereitschaft, diese Arbeit zu begutachten, Prof. Dr. Michael Ehrmann hat mir manch guten Tipp gegeben. I'm very grateful for the opportunity to carry on my research at the Center for Biomembranes and Lipid Enzymology (CBLE) in Utrecht: "The Mecca of biochemistry of lipids". I would like to thank Prof. Dr. Ben de Kruijff for the invitation, the encouraging discussions and the fruitful suggestions. Special thanks to Dr. Rudy Demel for his interest in the GlpD-lipid-story and for the solutions to numerous problems with the monolayer experiments. I appreciated the unique ambience at the CBLE and I would like to thank all the colleagues for their hospitality. I am glad I met Marjolein Janssen not only because of the beneficial discussions about GUT2 and GlpD but also for her straightforward solutions to my day-to-day problems. Herrn Prof. Dr. Dieter Malchow danke ich für die freundliche Aufnahme in die Arbeitsgruppe und den Kolleginnen und Kollegen für die nette Arbeitsatmosphäre. Mein besonderer Dank gilt Ralph Schaloske für die vielen fruchtbaren Diskussionen, die zahlreichen Literaturhinweise und die Hilfestellung an der Calcium-Elektrode. Durch die unermüdliche Korrekturbereitschaft und die vielen guten Verbesserungsvorschlägen von Ralph Schaloske und Ina Schlatterer konnte die Dissertation wesentlich verbessert werden. Ursula Kessen hat mich immer wieder moralisch unterstützt, vielen Dank also nicht nur für das Calmodulin aus Dictyostelium. Für die zuverlässige Unterstützung und den Beistand in schwierigen Zeiten möchte ich mich bei Annette Bäuerle bedanken. Christian Seibel war bei den Proteinreinigungen eine echte Hilfe. Gerd Knoll möchte ich herzlich danken. Er hat mich in allen „IT“-Fragen bestens beraten und mich ermutigt, nach Utrecht zu gehen. Die Friedrich-Ebert-Stiftung hat meine Arbeit an diesem Projekt finanziell und ideell gefördert. Dafür gilt ihr besonderer Dank. Meinen Eltern danke ich nicht nur für die liebevolle Pflege der Antikörperhasen, sondern auch dafür, dass sie mir diesen Weg ermöglich haben. Für das Layout dieser Arbeit danke ich Christoph Petersen. Er hat in den vergangenen Jahren alle Höhen und Tiefen des Promotionsprojektes mit mir durchlebt und mir den Rücken freigehalten. Seiner Liebe und Geduld gilt mein größter Dank. 83
