Charakterisierung der durch Semliki Forest Virus induzierten
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Aus dem Institut für Molekulare Medizin und Zellforschung der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Charakterisierung der durch Semliki Forest Virus induzierten Apoptosewege mittels Replikonbasierter, rekombinanter Viren INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Medizinischen Doktorgrades der Medizinischen Fakultät der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau Vorgelegt im Jahr 2005 von Sara Maerz geboren in Mainz Dekan : Prof. Dr. med. Ch. Peters Erster Gutachter : Prof. Dr. rer. nat. Ch. Borner Zweiter Gutachter : Prof. Dr. med. O. Opitz Jahr der Promotion : 2007 Meiner Familie 1 Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis ABBILDUNGSVERZEICHNIS ......................................................................................... 4 ABKÜRZUNGSVERZEICHNIS ....................................................................................... 5 1 EINLEITUNG .................................................................................................. 8 1.1 1.1.1 1.1.2 1.1.3 1.1.4 1.1.5 Programmierter Zelltod / Apoptose...........................................................................8 Apoptose und Nekrose ..................................................................................................8 Apoptose und Evolution ................................................................................................9 Caspasen ......................................................................................................................10 Die zwei Hauptwege der Apoptose .............................................................................12 Regulation der Apoptose .............................................................................................14 1.2 1.2.1 1.2.2 Viren ...........................................................................................................................18 Das Alphavirus Semliki Forest Virus (SFV)...............................................................18 Infektion mit SFV induziert Apoptose ........................................................................25 1.3 1.3.1 1.3.2 Das Virusvektorsystem .............................................................................................26 SFV als Vektor und das Replikon-System ..................................................................26 Apoptose durch SFV - Welcher Todesweg, welche Caspasen?..................................30 1.4 Fragestellung dieser Arbeit ......................................................................................31 2 MATERIAL UND METHODEN ..................................................................... 32 2.1 Liste der verwendeten Geräte ..................................................................................32 2.2 Chemikalien und Lösungen......................................................................................33 2.3 2.3.1 2.3.2 2.3.3 2.3.4 2.3.5 2.3.6 Zellkultur ...................................................................................................................34 Zellarten.......................................................................................................................34 Medien.........................................................................................................................34 Konservierung: Einfrieren und Auftauen von Zellen..................................................35 Kulturbedingungen ......................................................................................................35 Zellen trypsinisieren und splitten ................................................................................35 Zellen quantifizieren und ausplattieren .......................................................................36 2.4 2.4.1 2.4.2 2.4.3 Generierung und Gewinnung der Plasmide ...........................................................36 DNA Präparation .........................................................................................................36 Generierung von Plasmiden ........................................................................................37 Transformation in Bakterien mittels Hitzeschock.......................................................39 2.5 2.5.1 SFV Replikon Produktion ........................................................................................39 DNA- Linearisierung und Kontrolle ...........................................................................39 2 Inhaltsverzeichnis 2.5.2 2.5.3 2.5.4 2.5.5 2.5.6 DNA-Purifizierung......................................................................................................40 RNA Transkription......................................................................................................40 RNA Transfektion .......................................................................................................41 Virusernte ....................................................................................................................41 Virusreinigung.............................................................................................................42 2.6 2.6.1 2.6.2 Infektion und FACS-Analyse ...................................................................................42 Infektion ......................................................................................................................42 FACS Analyse und Auswertung .................................................................................43 2.7 2.7.1 Westernblot ................................................................................................................44 Bereitung der Totalextrakte und Bestimmung der Proteinkonzentration mittels BCA .....................................................................................................................................44 SDS, Western-Blot, ECL.............................................................................................44 2.7.2 2.8 Immunfluoreszenz .....................................................................................................46 3 ERGEBNISSE............................................................................................... 48 3.1 3.1.1 3.1.2 3.1.3 3.1.4 3.1.5 Infektion mit rekombinantem Virus........................................................................48 Etablierung der Elektroporationsbedingungen mit eGFP ...........................................48 Erster Nachweis der erfolgreichen Generierung von rekombinantem Virus ..............49 Einsatz steigender Virusmengen .................................................................................50 Infektion mit rekombinantem WT-Virus ist zytotoxisch ............................................52 Die Wirkung der verschiedenen antiapoptotischen Proteine auf rSFV-induzierten Zelltod .........................................................................................................................53 Vergleich der verschiedenen rekombinanten Proteine des intrinsischen und extrinsischen Aktivierungsweges ................................................................................55 Nachweis der rekombinanten Proteine durch WB und IF...........................................57 rSFV Infektion ist caspasenabhängig ..........................................................................59 Apoptose nach Infektion mit nativem WT-SFV besitzt eine caspasenunabhängige Komponente ................................................................................................................60 3.1.6 3.1.7 3.1.8 3.1.9 3.2 3.2.1 3.2.2 Ausweitung der Versuchsreihe auf andere Zelltypen ............................................63 Caspase 9-defiziente MEFs .........................................................................................63 Die Bedeutung von Bax und Bak in SFV-induzierter Apoptose.................................64 4 DISKUSSION................................................................................................ 66 4.1 Etablierung der Bedingungen für effiziente Virusproduktion..............................66 4.2 4.2.1 4.2.2 Interpretation der Ergebnisse ..................................................................................67 Zelltod nach rSFV-Infektion - Beobachtung, Bedingung, Bedeutung........................67 Antiapoptotische Proteine, die mit dem intrinsischen Aktivierungsweg interagieren, schützen vor Apoptose ................................................................................................68 Inhibition der Apoptose durch z-VAD.fmk, Q-VD-OPh und Pefabloc ......................69 Untersuchung der Bax/Bak-KO-MEFs mit rSFV .......................................................70 4.2.3 4.2.4 3 Inhaltsverzeichnis 4.3 4.3.1 4.3.2 4.3.3 4.3.4 Klinischer Ausblick ...................................................................................................72 Probleme und Fortschritt bei der Verwendung viraler Vektoren ................................72 Vorstellung der verschiedenen SFV-Vektorsysteme sowie ihrer Vor- und Nachteile 73 Optionen der therapeutischen Verwendung von SFV-Vektoren.................................74 Schlussfolgerung .........................................................................................................76 5 ZUSAMMENFASSUNG ................................................................................ 77 6 ANHANG ...................................................................................................... 78 6.1 Literaturverzeichnis ..................................................................................................78 6.2 Lebenslauf ..................................................................................................................86 Danksagung...................................................................................................................................87 4 Abbildungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Abb. 1: Apoptose versus Nekrose.................................................................................... 9 Abb. 2: Entstehung einer aktiven Caspase. ................................................................... 11 Abb. 3: Übersicht über den extrinsischen und den intrinsischen Aktivierungsweg der Apoptose .......................................................................................................... 14 Abb. 4: Die Familie der Bcl-2 Proteine. .......................................................................... 15 Abb. 5: Struktur des Semliki Forest Virus....................................................................... 20 Abb. 6: Schematische Darstellung der genomischen Struktur von SFV ........................ 21 Abb. 7: Anordnung der Nichtstrukturproteine nsP1 – nsP4 im SFV-Genom .................. 22 Abb. 8: Anordnung der Nichtstrukturproteine und Strukturproteine im SFV-Genom. ..... 23 Abb. 9: Lebenszyklus des Semliki Forest Virus ............................................................. 23 Abb. 10: Genomische Struktur von SFV und rSFV im Vergleich.................................... 27 Abb. 11: Karte des pSFV2gensubGFP Plasmidvektors ................................................. 28 Abb. 12: Karte des pSFV-Helper2-Plasmids .................................................................. 29 Abb. 13: Übersicht über die Generierung von rekombinantem Virus ............................. 30 Abb. 14: Kontrollgel von in vitro transkribierter RNA ...................................................... 49 Abb. 15: Immunfluoreszenz beweist die Funktionalität des mit den Vektoren pSFV2gensubGFP und pHelper2 generierten rekombinanten Virus ................ 50 Abb. 16: FACS-Ergebnisse einer Probeinfektion mit rSFV/FADD-DN (24 hpi) mit steigenden Virusmengen .................................................................................. 51 Abb. 17: Rekombinanter WT-Virus ist zytotoxisch ......................................................... 53 Abb. 18: Die Wirkung der verschiedenen antiapoptotischen Proteine auf rSFV induzierten Zelltod mittels FACS-Analyse......................................................... 55 Abb. 19: Antiapoptotische Proteine des intrinsischen Aktivierungsweges schützen vor rSFV induziertem Zelltod .................................................................................. 56 Abb. 20: Nachweis der rekombinanten Proteine mittels Westernblot............................. 57 Abb. 21: Immunfluoreszenzanalyse bestätigte eine erfolgreiche rSFV-Infektion und die Exprimierung der rekombinierten Proteine ....................................................... 58 Abb. 22: Infektion mit rekombinantem Semliki Forest Virus vermittelt einen caspasenabhängigen Zelltod (klassische Apoptose)........................................ 59 Abb. 23: Mit z-VAD.fmk und Q-VD-OPh inkubierte Zellen sind vor rSFV-induziertem Zelltod geschützt .............................................................................................. 60 Abb. 24: Durch nativen WT-Virus induzierter Zelltod scheint eine zusätzliche capasenunabhängige Komponente zu besitzen ............................................... 61 Abb. 25: Ergebnisse der quantitativen FACS-Analyse mit dem Serinproteaseinhibitor Pefabloc............................................................................................................ 62 Abb. 26: Fehlen der zellulären Caspase 9 verhindert rSFV-induzierten Zelltod............. 63 Abb. 27: Caspase 9-defiziente 3T9 MEFs sind im Gegensatz zu Wild-Typ 3T9 MEFs vor Apoptose geschützt .......................................................................................... 64 Abb. 28: BAK, nicht aber Bax, wird zum Ablauf von rSFV induzierter Apoptose benötigt ......................................................................................................................... 65 5 Abkürzungsverzeichnis Abkürzungsverzeichnis Abb. Abbildung Apaf-1 Apoptose assoziierter Faktor-1 Bak Bcl-2 assoziierter Antagonist / Killer BH Bcl-2 homologe Domäne Bax Bcl-2 assoziiertes Protein X BHK-21 Baby-Hamster-Nierenzellen BID BH3 interagierender Todesdomänen Antagonist Bcl-2 B-Zell Lymphom-2 CARD Caspasen Rekrutierungs Domäne Caspase Cystenyl Aspartat Spezifische Protease CrmA Cytokin response modifier A DD Death domain / Todesdomäne DED Death effector domain DISC Death inducing signal complex DKO Doppel knock-out DMEM Dulbecco’s Modified Eagles Medium DMSO Dimethylsulfoxid DN Dominant negativ DTT Dithiothreitol EEEV Eastern-Equine-Encephalitis-Virus ER Endoplasmatisches Retikulum EtBr Ethidiumbromid FACS Fluorscence activated cell sorting FADD Fas assoziiertes Protein mit Todesdomäne FAS-L Fas-Ligand FCS Fetales Kälber Serum GFP Green Fluoreszent Protein GOI Gene of interest/ Transgen H Hours Hpi Hours post infection / Stunden nach Infektion IAP Inhibitor der Apoptose 6 Abkürzungsverzeichnis ICE Interleukin Converting Enzym Il-12 Interleukin-12 KD Kilo Dalton LL Lower Left / unterer linker Quadrant LR Lower Right / unterer rechter Quadrant KO Knock-out MCS Multiple cloning site / Klonierungsstelle MLV-Vektor Muriner Leukämie Virus-Vektor min Minute nsP Nichtstrukturprotein OD Optische Dichte OTC-Gen Ornithin-Transcarbamylase-Gen PCR Polymerase Ketten Reaktion PFA Paraformaldehyd PI Propidium Jodid rSFV Rekombinanter Semliki Forest Virus rSFV/WT Rekombinanter Semliki Forest Virus ohne Transgen rSFV/ Bcl-2 Rekombinanter Semliki Forest Virus mit Transgen Q-VD-OPh N-(2Quinolyl)valyl-aspartyl 2,6-difluorophenoxymethylketon rpm Rotation per Minute/ Umdrehung pro Minute RT Raumtemperatur SCID Schwerer kombinierter Immundefekt SDS Sodium-dodecyl-sulfat sek. Sekunde SFV Semliki Forest Virus SIN Sindbis Virus t-BID truncated / geschnittenes BID Trail Tumornekrosefaktor-verbundener Apoptose induzierender Ligand TNF Tumornekrosefaktor UL Upper left / oberer linker Quadrant UR Upper right / oberer rechter Quadrant UV Ultra violett 7 Abkürzungsverzeichnis VEEV Venezuelan-Equine-Enzephalitis-Virus WEEV Western-Equine-Enzephalitis-Virus WT Wildtyp XIAP X-gebundener IAP z-VAD.fmk N-benzocarbonyl-Val-Ala-Asp-fluoromethylketon z.B. zum Beispiel ZNS Zentrales Nervensystem 8 Einleitung 1 Einleitung 1.1 Programmierter Zelltod / Apoptose Jede Zelle eines multizellulären Organismus ist Mitglied einer streng organisierten Gemeinschaft. Die Gesamtanzahl der Zellen dieser Gemeinschaft ist genau reguliert. Zellteilung und Zelltod halten sich in einem adulten Organismus die Waage [Alberts et al. 2002]. Wird eine Zelle im Laufe der Entwicklung nicht mehr benötigt, ist sie defekt, mutiert oder infiziert, so aktiviert sie ein intrazelluläres Todesprogramm und zerstört sich selbst. Dieses Phänomen beobachteten Kerr et al. 1972 zum ersten Mal und prägten den Begriff der Apoptose als eine Form des programmierten Zelltodes [Kerr et al. 1972]. Pathologisch verminderte Apoptose kann durch die Persistenz einzelner mutierter oder überflüssiger Zellen zu Krebs oder Autoimmunerkrankungen führen [Green und Evan 2002; Thompson 1995]. Ungebremster Zelltod wird hingegen als Hauptfaktor bei Infarktleiden, neurodegenerativen oder neuromuskulären Erkrankungen diskutiert [Mattson 2000]. Der stereotype Ablauf der Apoptose führt zum stillen „Verschwinden“ der Zelle nach Durchlaufen charakteristischer morphologischer Veränderungen ohne Beschädigung des umliegenden Gewebes durch adverse Immun- oder Entzündungsreaktionen. 1.1.1 Apoptose und Nekrose Im Gegensatz zu den Formen des programmierten Zelltodes ist die Nekrose ein durch Verletzung, Anoxie oder Mangelversorgung ausgelöster, unphysiologischer und kataboler Prozess. Morphologisches Korrelat der Nekrose ist die Zellschwellung mit anschließendem Verlust der Membranintegrität durch Zerreißen (Alberts et al 2002). Der Zellinhalt läuft in das umliegende Gewebe, wo er eine entzündliche Reaktion hervorruft [Fiers et al. 1999]. Die apoptotische Zelle hingegen schrumpft, es kommt zur Ausstülpung der Zelloberfläche ohne Verlust der Membranintegrität, zur Kernkondensation und zur Fragmentierung der DNA durch Nukleasen. Im weiteren Verlauf bilden sich 9 Einleitung membranumgebene Vesikel (apoptotische Körper), die von Makrophagen phagozytiert werden, wobei keine Entzündung oder Immunreaktion ausgelöst wird. Die Apoptose ist ein genetisch streng regulierter, energieverbrauchender Prozess. Die sterbende Zelle benötigt also eine noch funktionierende ATP-Produktion und zum Teil auch eine aktive Gentranskription und Translation [Antonsson 2001]. In Zellkultur kommt es in einem späten Stadium der Apoptose durch die Abwesenheit von Makrophagen letztlich doch zur Ruptur der Membran. Dieses Phänomen bezeichnet man als sekundäre Nekrose [Depraetere 2000; Savill und Fadok 2000]. Abb. 1: Apoptose versus Nekrose. Veranschaulichung der charakteristischen Veränderungen bei A. nekotischem und B. apoptotischem Zelltod. 1.1.2 Apoptose und Evolution Erste Erkenntnisse über die molekularen Mechanismen und die genetische Kontrolle der Apoptose wurden aus Versuchen mit dem Nematoden (Fadenwurm) Caenorhabditis elegans gewonnen. Einleitung 10 Während der Entwicklung dieses Nematoden sterben genau 131 seiner 1090 somatischen Zellen apoptotisch. Bei Inaktivierung der beiden hauptverantwortlichen Gene ced-3 und ced-4 findet dieser Zelltod nicht statt. Interessanterweise ist eine Entwicklung des Nematoden ohne Apoptose möglich, während bei komplexeren Organismen, wie z.B. der Fruchtfliege Drosophila melanogaster, der Maus und vermutlich auch dem Menschen, die Hemmung der Apoptose zumeist bereits in einem frühen Entwicklungsstadium letal ist [White et al. 1994]. Bei Analyse des von ced-3 codierten Proteins fanden sich starke Ähnlichkeiten mit humanem ICE (Interleukin Converting Enzyme), einer Protease, welche das inflammatorisch wirksame Interleukin-1 aus einem Vorläuferprotein abspaltet [Yuan et al. 1993]. Später wurden 14 weitere humane und murine Mitglieder dieser Proteasenfamilie entdeckt, die zu einem großen Teil während des Ablaufes der Apoptose aktiviert werden [Lamkanfi et al. 2002]. Aufgrund des Cysteinrestes im aktiven Zentrum der Enzyme und der gemeinsamen Eigenschaft, die Substrate nach Aspartatresten zu schneiden, werden diese evolutionär stark konservierten Proteasen als Caspasen bezeichnet (Caspase = Cystein Aspartate Specific Protease) [Alnemri et al. 1996]. 1.1.3 Caspasen Die meisten der typischen morphologischen Veränderungen in der apoptotischen Zelle sind auf eine Aktivierung von Caspasen zurückzuführen. Caspasen sind Cysteinproteasen, die ihre Substrate nach spezifischen Aspartatresten schneiden [Earnshaw et al. 1999]. In der gesunden Zelle liegen sie in inaktiver Form als „Zymogene“ vor. Jede Procaspase besteht aus einer N-terminalen Prodomäne, sowie einer kurzen (p10) und einer langen Untereinheit (p20). Die Aktivierung der Procaspasen erfolgt im Falle der früh in der Apoptose wirksamen Initiatorcaspasen 8, 9, 10 und 2 durch Adapterproteine, die mehrere Kopien von Procaspasen eng zusammenbringen, so dass ein aktives Tetramer mit zwei aktiven Zentren entsteht (siehe Abb. 2). Die jeweils geringe Enzymaktivität wird verstärkt und reicht somit zu einer Autoproteolyse aus [Muzio et al. 1998; Nicholson 1999]. 11 Einleitung Abb. 2: Entstehung einer aktiven Caspase. Proteolytischer Umbau der Procaspase, bestehend aus Nterminaler Prodomäne, p10 sowie p20 Untereinheit, in eine aktive Caspase, einem Tetramer mit zwei aktiven Zentren. Die so aktivierte Initiatorcaspase steht am Anfang einer proteolytischen Kaskade und aktiviert nachfolgend mehrere Effektorcaspasen, die wiederum weitere Initator- und Effektorcaspasen aktivieren können [Nicholson und Thornberry 1997]. So wird das Todessignal in der betroffenen Zelle amplifiziert und der apoptotische Umbau der Zelle irreversibel eingeleitet. Aktivierte Effektorcaspasen schneiden neben weiteren Caspasen vor allem bestimmte Schlüsselproteine der Zelle, die dadurch entweder inaktiviert (z.B. Überlebensproteine) oder aktiviert werden (Todesproteine) und eine Vielzahl der charakteristischen Merkmale einer apoptotischen Zelle bedingen. So ist z.B. das Schneiden gewisser nukleärer Strukturproteine durch Caspasen eine direkte Voraussetzung für die Kernkondensation [Rao et al. 1996]. Der Abbau des Zytoskeletts erfolgt ebenfalls caspasenabhängig durch Degradation der Zytoskelettproteine Fodrin und Gelsolin [Kothakota et al. 1997]. Parallel dazu werden weitere für den Ablauf der Apoptose wichtige Proteine aktiviert, indem Effektorcaspasen negative Regulatordomänen inaktivieren. Dies ist bei dem in 12 Einleitung der Zelle inaktiv vorliegenden Enzym CAD (caspase-aktivierte DNase) der Fall. Aktive Caspase 3 schneidet die hemmende Untereinheit (ICAD) und aktiviert die DNase, welche dann die genomische DNA der apoptotischen Zelle fragmentiert [Enari et al. 1998; Nagata 2000]. Heute sind weit über 100 verschiedene Substrate der aktivierten Effektorcaspasen bekannt, die gemeinsam zum geordneten Absterben der Zelle führen [Earnshaw et al. 1999]. 1.1.4 Die zwei Hauptwege der Apoptose Wie aber wird das irreversible Todesprogramm in der Zelle gestartet, wie kommt es erstmals zur Aktivierung der Initiatorcaspasen? Im Folgenden soll auf die beiden klassischen Triggermechanismen der Apoptose eingegangen werden. Das für die Einleitung der Apoptose verantwortliche Signal führt, entweder von außerhalb der Zelle über „Todesrezeptoren“ auf der Zelloberfläche (extrinsisch) oder durch intrazelluläre Sensoren eingeleitet (intrinsisch), zur Aktivierung von Initiatorcaspasen. Der extrinsische wie auch der intrinsische Aktivierungsweg sind durch Inhibitoren und Aktivatoren feinstufig regulierte Mechanismen, die in einer gemeinsamen Endstrecke Effektorcaspasen schneiden und aktivieren, die dann wiederum mit den jeweiligen Substraten interagieren. 1.1.4.1 Der extrinsische Weg Der rezeptorvermittelte Todesweg ist beispielsweise für die Eliminierung von unerwünschten Zellen während der Ausbildung des Immunsystems verantwortlich. Zytotoxische T-Lymphozyten synthetisieren z.B. ein Protein der TNF Superfamilie (Fas Ligand) welches an den Todesrezeptor der Zielzelle bindet. Die extrazelluläre Bindung der verschiedenen Mitglieder der TNF Superfamilie (FasL, Trail oder TNF) an den Todesrezeptor führt zur Trimerisierung des Rezeptors und über dessen zytoplasmatisch gerichtete „death domain“ (DD) zur Aggregation des Adapterproteins FADD (Fasassociated death domain protein) [Krammer 2000; Locksley et al. 2001]. FADD rekrutiert seinerseits mittels seiner „Death effector domain“ (DED) Moleküle der Procaspase 8 und bildet so einen „death inducing signaling complex (DISC). In diesem Komplex werden Einleitung 13 die Zymogene räumlich so eng aneinander gebracht, dass ihre geringe intrinsische Enzymaktivität für eine Autoproteolyse und die daraus resultierende Freisetzung von aktiver tetramerer Caspase 8 ausreicht [Muzio et al. 1998; Nicholson 1999]. Aktivierte Caspase 8, die Schlüsselinitiatorcaspase des extrinsischen Weges, schneidet direkt Effektorcaspasen oder verknüpft durch Prozessierung des BH3-only-Proteins BID in tBID (t= truncated = geschnitten) den extrinsischen mit dem intrinsischen Todesweg (siehe Abb. 3) [Li et al. 1998; Luo et al. 1998]. 1.1.4.2 Der intrinsische oder mitochondriale Weg Der intrinsische, rezeptorunabhängige Weg zur Einleitung der Apoptose erfolgt vor allem nach intrazellulären Stresssignalen wie Schädigung der Zelle durch Bestrahlung oder Chemotherapeutika, Verlust von Zytokinen oder Wachstumsfaktoren [Borner 2003]. Bei der Aktivierung der Schlüsselinitiatorcaspase (Caspase 9) des intrinsischen Weges spielen Mitochondrien eine entscheidende Rolle [Wang 2001]. Durch Integritätsverlust der äußeren Mitochondrienmembran kommt es zur Freisetzung von Proteinen (z.B. Cytochrom C, einem Protein der Atmungskette) aus dem mitochondrialen Intermembranspalt in das Zytosol, wodurch diese apoptotisch wirksam werden. [Kluck et al. 1997; Patterson et al. 2000]. Eine durch Cytochrom C bedingte Konformationsänderung des Adapterproteins Apaf-1 (apoptotic protease activating factor) ermöglicht die Rekrutierung von Procaspase 9 über die homologe CaspasenRekrutierungs-Domäne (CARD-domain) in eine rosettenartige Struktur (Apoptosom) und bewirkt somit ihre allosterische Verstärkung [Cain et al. 2000; Zou et al. 1999]. Die auf diese Weise prozessierte Caspase 9 schneidet dann die nachfolgenden Effektorcaspasen 3, 6 und 7 der gemeinsamen Endstrecke der extrinsischen und der intrinsischen Aktivierung der Apoptose (siehe Abb. 3) [Rodriguez und Lazebnik 1999]. 14 Einleitung Abb. 3: Übersicht über den extrinsischen und den intrinsischen Aktivierungsweg der Apoptose Der intrinsische Weg ist auf Höhe der Mitochondrien durch pro- und antiapoptotische Mitglieder der Bcl-2 Familie genaustens reguliert [Borner 2003]. 1.1.5 Regulation der Apoptose 1.1.5.1 Die Bcl-2-Familie, Aktivatoren und Inhibitoren Eine der wichtigsten Klassen intrazellulärer Regulatoren der Apoptose ist die Familie der Bcl-2 Proteine. Ihren Namen erhielt diese Gruppe nach der Entdeckung eines überexprimierten Protoonkogens in B-Zell-Lymphomen (Bcl-2) mit einer 14/18Chromosomentranslokation. Als antiapoptotischer Regulator führt überexprimiertes 15 Einleitung Bcl-2 in B-Zell-Lymphomen zu gesteigertem Wachstum und Tumorentstehung [Weiss et al. 1987]. Bis heute sind 15 weitere anti- und proapoptotische Mitglieder der Bcl-2-Familie in Säugetieren identifiziert worden. Die Familie der Bcl-2-Proteine wird aufgrund von Struktur und Funktion in drei Untergruppen untergliedert (siehe Abb. 4) [Adams und Cory 1998; Antonsson und Martinou 2000]. Abb. 4: Die Familie der Bcl-2 Proteine. Die große Gruppe der Bcl-2-Proteine wird in 3 Untergruppen klassifiziert. Die Mitglieder der ersten Gruppe wie z.B. Bcl-2 oder BclxL sind durch 4 BH-Domänen charakterisiert. Sie besitzen allesamt antiapoptotische Eigenschaften. Im Gegensatz dazu haben Mitglieder der zweiten Gruppe wie Bax oder Bak proapoptotische Funktion. Strukturell gleichen sie im Aufbau denen der ersten Gruppe, jedoch fehlt ihnen die N-terminale BH4-Domäne. Die dritte Gruppe fasst die proapoptotischen Proteine zusammen, die mit den vorangegangenen nur die BH3-Domäne gemeinsam haben und somit als BH3-only Proteine bezeichnet werden. Die erste Gruppe fasst alle antiapoptotischen Mitglieder wie z.B. Bcl-2 und BclxL zusammen, deren Struktur durch 4 BH-Domänen (Bcl-2 homologe Domänen) BH1, BH2, BH3, BH4 charakterisiert ist. Sie sind für die antiapoptotische Funktion der Proteine unerlässlich [Borner et al. 1994]. Zusätzlich besitzt diese Klasse einen hydrophoben C-Terminus, der zur Insertion in Mitochondrien- bzw ER-Membranen dient. Durch die Bindung von BH3-only-Proteinen schützen sie vor Apoptose [Borner 2003]. Die proapoptotischen Regulatoren teilen sich in die multimeren Bax–artigen, sowie die monomeren BH3-only-Proteine. Die Bax-artigen proapoptotischen Mitglieder gleichen in ihrem Aufbau stark der ersten antiapoptotischen Gruppe, jedoch fehlt ihnen die vierte BH-Domäne am N-Terminus. Die beiden bekanntesten Mitglieder dieser Aktivatoren der Apoptose sind das zytosolisch vorliegende Bax [Oltvai et al. 1993] und das integrale 16 Einleitung Membranprotein Bak [Chittenden et al. 1995; Kiefer et al. 1995]. Auf einen apoptotischen Stimulus hin reagieren diese Proteine mit einer Konformationsänderung und der Insertion in die äußere Mitochondrienmembran. Dies führt zu einem Integritätsverlust der äußeren Mitochondrienmembran und schlussendlich auf noch ungeklärte Weise zur Freisetzung von Cytochrom C [Wei et al. 2001]. Die dritte Gruppe umfasst bisher acht weitere proapoptotische Proteine, die mit den zuvor genannten multimeren Gruppen nur die BH3-Domäne, bestehend aus 12-16 Aminosäuren, gemeinsam haben [Huang und Strasser 2000]. Die BH3-Domäne ist für die apoptotische Funktion dieser Proteine alleine ausreichend und unerlässlich. Bad, Bid, Bim, Bik, Bmf, Hkr, Noxa und Puma werden deshalb zur Gruppe der monomeren BH3-only-Proteine zusammengefasst. Die BH3-only-Proteine agieren als Sensoren und Mediatoren apoptotischer Stimuli stromaufwärts der Mitochondrien. Werden sie stimuliert, führt dies zu einer Konformationsänderung der proapoptotischen Proteine Bax und Bak und deren Aktivierung im intrinsischen Todesweg. Als wahrscheinlicher Mechanismus wird, neben der direkten Aktivierung von Bax und Bak, die Bindung oder Inaktivierung antiapoptotischer Bcl-2-Mitglieder durch BH3-only-Proteine diskutiert. 1.1.5.2 Die IAPs, CrmA, dominant-negative Mutanten und synthetische Caspaseninhibitoren Im Gegensatz zu den Proteinen der Bcl-2-Familie, die in einer eher indirekten Weise auf Caspasen einwirken, interagieren die IAPs (Inhibitoren der Apoptose) direkt mit den aktiven Effektorenzymen. Zum ersten Mal wurden IAPs in von Baculovirus infizierten Zellen nachgewiesen, in denen sie Apoptose der infizierten Zelle verhinderten [Deveraux et al. 1997]. Im humanen Organismus wurden acht verschiedene IAPs beschrieben, einer unter ihnen XIAP (human X-linked IAP). XIAP hat eine hemmende Wirkung auf die bedeutendste Caspase des intrinsischen Aktivierungsweges Caspase 9, sowie auf deren Effektorcaspasen Caspase 3 und Caspase 7 [Silke et al. 2002]. CrmA (Cytokin response modifier A) ist ein Protein mit einem Molekulargewicht von 38 kD, das in verschiedenen Pockenviren identifiziert wurde. Es hemmt die Aktivität des IL-1ß-konvertierenden Enzymes (ICE) sowie die der für Apoptose unerlässlichen Caspasen 8 ,9 und 1 kompetitiv [Ekert et al. 1999]. Es wird vermutet, dass die virale 17 Einleitung Expression von CrmA die inflammatorische Antwort der infizierten Wirtszelle und vor allem deren Einleitung des apoptotischen Zelltodes unterdrückt, um eine ungestörte virale Vermehrung sicher zu stellen. Für experimentelle Zwecke stehen heute verschiedene kommerzielle, synthetische Caspaseninhibitoren zur Verfügung. Der meistverwendete Vertreter z-VAD.fmk ist ein allgemeiner irreversibler Hemmstoff, bei dem eine caspasenspezifische Sequenz an ein fluoro-chrom-methyl-Keton gebunden ist. Die allgemeine Hemmung aller Caspasen beruht auf dem Fehlen einer caspasenspezifischen Aminosäure. z-VAD.fmk interagiert mit dem katalytischen Zentrum aller Caspasen und hemmt sie durch kovalente Querverbindung von fmk zu dem Cysteinrest im aktiven Zentrum [Nicholson 1999]. Q-VD-OPh ist ein neuartiger synthetischer Hemmstoff der Caspasenaktivität, welcher ähnlich wie z-VAD.fmk funktioniert, jedoch eine noch stärkere Inhibition der Caspasen bewirkt. Eine carboxy-terminale Phenoxy-Gruppe verhindert den Ablauf der Apoptose. Ein anderes Prinzip der Hemmung besitzen die dominant-negativen Mutanten (DN) von Caspase 9 bzw. FADD. Caspase 9-DN besitzt statt des Cysteins ein Serin im aktiven Zentrum und bewirkt so eine Hemmung des intrinsischen Aktivierungsweges. Die vorgenommene Mutation im Adapterprotein FADD-DN erlaubt noch seine Bindung an den Todesrezeptor, aber keine Rekrutierung mehr von Caspase 8. So kann der extrinsische Aktivierungsweg gehemmt werden [Newton et al. 1998]. Einleitung 18 1.2 Viren 1.2.1 Das Alphavirus Semliki Forest Virus (SFV) 1.2.1.1 SFV Taxonomie SFV ist ein einsträngiges RNA-Virus von Plus-Polarität aus der Familie der Togaviren. Der Name der Virusfamilie leitet sich von dem lateinischen Wort Toga (= Mantel, Hülle) ab, da auf den ersten elektronenmikroskopischen Bildern ein Kapsid mit umgebender Membranhülle zu erkennen war. Die Familie der Togaviridae beinhaltet zwei Genera: Die Rubiviren mit dem Erreger der Rötelninfektion als ihrem wichtigsten Vertreter, und die von Arthropoden übertragenen Alphaviren mit 25 bekannten Arten. Semliki Forest Virus (SFV) und Sindbis Virus (SIN) sind die molekularbiologisch am besten charakterisierten Vertreter der Togaviren [Modrow et al. 2003]. Charakteristische Vertreter der Togaviren Rubiviren Wirtsspektrum Rötelnvirus Mensch Alphaviren SIN Sindbisvirus Nagetiere SFV Semliki Forest Virus Nagetiere WEEV Western-Equine-Encephalitis-Virus Pferde, Vögel, (Mensch) EEEV Eastern-Equine-Encephalitis-Virus Pferde, (Mensch) VEEV Venezuelean-Equine-Encephalitis-Virus Pferde, Nagetiere, (Mensch) RRV Ross-River-Virus Beuteltiere Einleitung 19 1.2.1.2 Pathogenese der Alphaviren und Laborsicherheit bei der Arbeit mit Alphaviren Im Gegensatz zur großen humanmedizinischen Bedeutung des Rötelnvirus, führen Alphaviren bei Menschen in den meisten Fällen zu asymptomatischen oder gutartig verlaufenden Infektionen mit Fieber, Exanthem und Gelenkschmerzen. Gelegentlich treten jedoch schwerwiegendere Arthralgien und Polyarthritiden auf. Von humanmedizinischem Interesse sind Infektionen mit dem Eastern-, Western- und Venezuelean-Equine-Enzephalitisvirus (EEEV, WEEV, VEEV). Die Virusinfektion wird durch Vektoren von Pferden auf den Menschen übertragen. Dort verläuft sie häufig inapparent, kann aber auch, vor allem im Falle von EEEV, zu schweren, nicht selten letal endenden Enzephalitiden führen [Meulen 2001]. SFV und SIN führen bei Menschen meist nur zu subklinischen oder leicht febrilen Infektionen wie z.B. 1990 bei einer Gruppe französischer Soldaten in Zentral-Afrika [Mathiot et al. 1990]. Es gab allerdings vermutlich bereits einen Todesfall durch eine SFV-induzierte Laborinfektion [Willems et al. 1979]. Die Arbeit mit SFV und den daraus abgeleiteten Expressionsvektoren wird in der EU als Sicherheitsstufe 2 gehandelt. Der Originalstamm L10 ist neurovirulent in Mäusen und endet letal durch Enzephalitis. In von SFV infizierten Mäusen und Ratten konnten befallene Neurone und Gliazellen sowie eine starke Demyelinisierung im ZNS nachgewiesen werden. Neugeborene Mäuse starben ausnahmslos wenn sie vor ihrem 14. Lebenstag mit SFV infiziert wurden. Es kam zu ubiquitärer Ausbreitung des Virus im ZNS und zu massiver Induktion von Apoptose in den unreifen Neuronen [Oliver et al. 1997].In adulten Mäusen blieb die Infektion von Neuronen und Oligodendrozyten fokal und zeitlich begrenzt [Fazakerley et al. 1993]. Der Schweregrad der Infektion im Tiermodel war abhängig vom Ausreifungsgrad der Zellen sowie vom eingesetzten Virusstamm. Bei einer großen Anzahl von Zelllinien in Kultur führt eine Infektion mit SFV zur Induktion von Apoptose [Allsopp et al. 1998; Glasgow et al. 1997]. Die infizierten Zellen durchlaufen die charakteristischen morphologischen Stadien der Apoptose, bevor sie sich vom Boden der Zellkulturschale ablösen und aufgrund der nicht vorhandenen Makrophagen in sekundäre Nekrose übergehen. Einleitung 20 Die Tatsache, dass sowohl SFV als auch SIN für den Menschen weitgehend ungefährlich sind und sich beide Vertreter leicht in vielfältigen Zellkulturen vermehren lassen, macht sie zu idealen Laborviren. 1.2.1.3 Aufbau und Struktur des Viruspartikels 1.2.1.3.1 Allgemeiner Aufbau Das Semliki Forest Virion besteht aus 3 Grundelementen: Dem einzelsträngigen RNAGenom, dem viruscodierten Kapsid und einer Hülle, die der zellulären Membran der Wirtszelle entstammt. Das ikosaedrische Kapsid aus 240 Molekülen eines Kapsidproteins bildet zusammen mit dem RNA-Genom das Nucleokapsid und hat einen Durchmesser von ca. 40 nm. Nach außen wird es von einer Hüllmembran umgeben, die sich während des „buddings“ (Knospung) von der zellulären Membran ableitet, zusätzlich aber die viral codierten Glykoproteine E1, E2 und E3 enthält. Die trimeren Glykoproteinkomplexe bilden spike-ähnliche Vorsprünge in der Hüllmembran, welche die Adsorption an die Wirtszelle und die Bindung neutralisierender Antikörper vermitteln (siehe Abb. 5). Abb. 5: Struktur des Semliki Forest Virus. A. Darstellung der Oberflächenstruktur von SFV (Rekonstruktion nach Kryoelektromikroskopie) B. Die Farbscala zeigt von blau nach rot den zunehmenden Abstand zum Mittelpunkt. Die Spikes sind in rot dargestellt. C. Anschnitt des Virus, in blau dargestellt das Nukleocapsid, in rot die virale Hüllmembran, in die die Glykoprotein-Spikes inserieren (gelb). 21 Einleitung 1.2.1.3.2 Genomische Struktur Das Genom des Semliki Forest Virus besteht aus einer einsträngigen, 11442 Basenpaare umfassenden RNA in Plusstrangorientierung. Die RNA besitzt am 5’-Ende eine Cap-Struktur und ist am 3’-Ende polyadenyliert. Zwei offene Leserahmen (42S und 26S) mit unterschiedlichen Promotoren unterteilen das Genom in den codierenden Bereich für das Vorläuferpolyprotein der Strukturproteine (E1, E2, E3, 6K und Kapsid (siehe Abb. 8)) sowie den 5’-positionierten größeren Bereich der genetischen Information für die Nichtstrukturproteine (nsP1, nsP2, nsP3, nsP4 (siehe Abb. 7)). Die beiden Teile werden durch einige wenige Nukleotide voneinander getrennt, zudem umfasst das 5’-Ende eine 85 nt und das 3’-Ende eine 264 nt lange, nicht transkribierte Region (NTR) (siehe Abb. 6). Abb. 6: Schematische Darstellung der genomischen Struktur von SFV 1.2.1.3.3 Virale Proteine 1.2.1.3.3.1 Nichtstrukturproteine Das Vorläuferpolyprotein der Nichtstrukturproteine (nsP) wird in die für die virale Replikation und Transkription notwendigen Proteine nsP1 bis nsP4 geschnitten. Sie bilden den RNA-Polymerase-Komplex (siehe Abb. 7). nsP1 wird zur Initiation der Synthese des als Matrize dienenden Minusstranges der viralen RNA benötigt und enthält eine Methyltransferaseaktivität, die für die Bildung der methylierten 5’-Cap-Struktur verantwortlich ist [Cross 1983]. nsP2 besitzt proteolytische Aktivität zur Spaltung des Vorläuferpolyproteins und ist als Helikase während der Genomreplikation aktiv [Gomez de Cedron et al. 1999]. 22 Einleitung nsP3 wirkt während der RNA-Replikation, seine genaue Funktion ist aber noch weitgehend unklar. nsP4 ist die virale RNA-abhängige RNA-Polymerase. Als Schlüsselenzym der viralen RNA-Synthese ist die Konzentration des nsP4-Proteins in der infizierten Zelle durch eine kurze Halbwertszeit und schnelle Degradation streng reguliert. Abb. 7: Anordnung der dem 42S-Promotor nachgeschalteten Nichtstrukturproteine nsP1 – nsP4 im SFV-Genom 1.2.1.3.3.2 Strukturproteine Das Vorläuferpolyprotein der Strukturproteine ist deutlich kleiner als das der Nichtstrukturproteine und wird erst später im Lebenszyklus des Virus von der 26S-RNA translatiert. Das am N-Terminus des Polyproteins gelegene Kapsidprotein spaltet sich autoproteolytisch mit Hilfe einer Chymotrypsin ähnlichen Serinprotease von der Kette ab und bildet durch Interaktion mit viraler RNA und anderen Kapsidmolekülen das Nukleokapsid. Der verbleibende Rest des Polypeptids wandert zum endoplasmatischen Retikulum (ER), wo die Vorläufer E1 und p62 (enthält E2+E3) glykosyliert werden. Nach Heterodimerisierung von P62-E1 kann diese Vorstufe durch den Golgiapparat zur Zellmembran transportiert werden. Nach entgültiger Prozessierung ergänzen die fertigen Glykoproteine E1, E2 und E3 durch Bildung und anschließende Insertion von Spike ähnlichen Strukturen in die zelluläre Membran die virale Hülle. Die kleine 6-kD-Domäne scheint der Virusknospung zu dienen und die Insertion der Glykoproteine in die Membran zu unterstützen. Einleitung 23 Abb. 8: Anordnung der Nichtstrukturproteine und der dem 26S Promotor nachgeschalteten Strukturproteine im SFV-Genom. 1.2.1.4 SFV Lebenszyklus Abb. 9: Lebenszyklus des Semliki Forest Virus (modifiziert von C. Rhême) Wie in Abbildung 9 dargestellt beginnt der Infektionszyklus des Semliki Forest Virus mit der Adsorption des Virions an die Zellmembran der Wirtszelle. Die Glykoproteinkomplexe der viralen Hülle binden an Rezeptoren der Wirtszelle. Über die zellulären Rezeptoren der Alphaviren ist noch sehr wenig bekannt. Ihr weites Wirtsspektrum, sowie die Tatsache, eine große Anzahl verschiedener Zellarten infizieren Einleitung 24 zu können, lässt vermuten, dass Alphaviren an einen evolutionär stark konservierten Rezeptor (z.B. Laminin-Rezeptor) binden oder verschiedene Rezeptoren benutzen können. Die Penetration erfolgt auf dem Wege der rezeptorvermittelten Endozytose, bei der durch Fusion der viralen Hülle mit der endosomalen Membran das Nukleokapsid des Virus durch Abfall des pH-Wertes in das Zytosol der Wirtszelle entlassen wird [Marsh et al. 1984]. Damit die Virusnukleinsäure wirksam werden kann, muß sie aus dem Nukleokapsid freigesetzt werden. Dies geschieht durch Abbau des Kapsidproteins [Strauss und Strauss 1994]. Die sich anschließende Replikation ist ein vollständig zytosolischer Vorgang und beginnt mit der Translation der nichtstrukturalen Proteine (nsP1-nsP4) des RNA-Polymerase-Komplexes. Das freiliegende virale Genom in Plusstrangpolarität wird als Matrize für die Synthese eines komplementären RNAMinusstranges herangezogen, der gleichzeitig als Vorlage für eine vollständige Plusstrang-RNA sowie in einem späteren Zeitpunkt für die subgenomische 26S-mRNA dient. Während der ersten vier Stunden nach Infektion laufen die Synthese des vollständigen Minus- und Plusstranges gleichermaßen ab. Danach nimmt die Synthese des Minusstranges, aufgrund der sich verringernden Proteinbiosynthese, kontinuierlich ab. Während die Transkription der vollständigen Plusstrang-RNA am 3’-Ende des Minusstranges beginnt, wird die vorliegende 26S-mRNA vom subgenomischen 26S-Promotor ausgehend synthetisiert, später gecapt und polyadenyliert. Letztere enthält die Information für die Strukturproteine, die in Form eines Polyproteins (Kapsid, E1, E2, E3, 6K) translatiert werden. Das Kapsidprotein verfügt über eine Serinproteaseaktivität, die das Kapsidprotein von seinem Vorläufer abtrennt. Mit Hilfe des neuen freigewordenen N-Terminus inseriert der verbleibende Rest des Polyproteins in das ER, wo die Glykoproteine E1, E2, E3 prozessiert, glykosyliert und zur Plasmamembran transportiert werden. Die Glykoproteine lagern sich in der Zellmembran zu trimeren „Spikes“ zusammen und bilden gemeinsam eine virale Hüllmembran. Das fertiggestellte Nucleokapsid bindet an diese viral veränderte Zellmembran und löst sich, von ihr umgeben, unter Knospung („budding“) ab. Das reife Virus wird in den Extrazellularraum entlassen und kann von dort aus weitere Zellen des Wirtes infizieren. Einleitung 25 1.2.2 Infektion mit SFV induziert Apoptose Viral induzierter Zelltod ist ein nicht nur bei Alphaviren häufig beobachtetes Phänomen. Wie auch Adenoviren, Retroviren, Para- und Orthomyxoviren, Picornaviren und viele andere Vertreter sind Alphaviren in der Lage, in der infizierten Wirtszelle Apoptose einzuleiten [Levine et al. 1993]. Die morphologischen Kriterien der Apoptose, wie Zellschrumpfung, Kernkondensation oder DNA-Fragmentierung, konnten nach Alphavirusinfektion in vivo [Griffin et al. 1994] und in den meisten Zellkulturlinien nachgewiesen werden. Über die Triggermechanismen der apoptotischen Antwort nach Infektion der Wirtszelle mit SFV und über den „biologischen Sinn“ ist bisher wenig bekannt. Man vermutet in der Apoptose viral infizierter Zellen einen Schutzmechanismus des Wirtes, der auf diese Weise infizierte Zellen eliminieren kann, und somit den Befall weiterer Zellen und Gewebe unterbindet [Vaux und Hacker 1995]. Adeno- und Baculoviren codieren beispielsweise für antiapoptotische Gene, um ein frühzeitiges Absterben ihres Wirtes zu verhindern. Bei Defekt ihrer antiapoptotischen Gene wird der apoptotische Umbau der befallenen Zelle so schnell eingeleitet, dass der virale Replikationszyklus nicht beendet werden kann [Clem und Miller 1993]. Virale Infektion greift auf verschiedenen Ebenen entscheidend in den Metabolismus der Wirtszelle ein. Eine Hemmung der Proteinbiosynthese der Zelle zu Gunsten einer virusspezifischen Produktion führt zur Unterversorgung der Zelle an schnell verbrauchbaren Metaboliten, wobei unklar bleibt, ob es sich bei diesem Phänomen um einen viral induzierten Mechanismus oder eventuell sogar um eine zelluläre Immunreaktion handelt. Des weiteren wird diskutiert, ob und auf welchem Weg die gestörte Wirtsproteinsynthese in den Ablauf des Todesprogrammes eingreift oder ihn sogar auslöst. Eine große Zahl einzelner viraler Produkte wurde bereits auf ihre apoptotische Wirkung hin untersucht, jedoch ist trotz vieler interessanter Ergebnisse noch wenig über die Signaltransduktion und die genauen molekularen Grundlagen des SFV-induzierten Zelltodes bekannt. Ein verbessertes Verständnis dieser molekularen Vorgänge würde die Entwicklung therapeutisch nutzbarer Vektorsysteme erleichtern. 26 Einleitung 1.3 Das Virusvektorsystem Ausgehend von den Alphaviren VEEV, SIN und SFV wurden in den letzten Jahren eine Vielzahl von Expressionsvektoren entwickelt. Eine kurze Generationszeit, das weite Wirtsspektrum, sowie eine effiziente transgenische Expression machen alphavirale Vektoren zu einem wichtigen gentechnischen Werkzeug in der Forschung. Ihr Einsatz in der Krebs- und Gentherapie, sowie die Entwicklung von Impfstoffen ist in Erprobung. 1.3.1 SFV als Vektor und das Replikon-System 1991 entwickelte die Gruppe um P. Liljeström einen auf dem Genom von SFV basierenden, genetisch vollständigen, und darum replikationskompetenten, infektiösen Expressionsvektor [Liljestrom und Garoff 1991]. Aus Sicherheitsgründen und um in vivoEinsätze zu ermöglichen kam es zur Weiterentwicklung dieses Vektors zum Replikonsystem. Das Replikon besteht aus einer selbstreplizierenden Vektor-RNA. Da aber eine MCS zur Einbringung der gewünschten Transgene die viralen Strukturproteine ersetzt, wird ein zweiter Helfervektor für die verlorengegangene Information der Strukturproteine benötigt [Bredenbeek et al. 1993]. Durch co-Transfektion von in vitro transkribierter Replikon-RNA (enthält die Gene für die Nichtstrukturproteine sowie das Transgen) und Helfer-RNA (enthält die genetische Information für die Strukturproteine) in BHK-21-Zellen, entstehen umhüllte SFV-ähnliche Viruspartikel. Die Infektion einer Zelle durch einen so entstandenen umhüllten, dem Alphavirus ähnlichen Partikel, führt zu Replikation, Transkription und Translation des viralen Genoms, sowie des eingeschleusten Transgens und dadurch zu hohen Mengen rekombinanter Proteine. 27 Einleitung Abb. 10: Genomische Struktur von SFV und rSFV im Vergleich. Illustration der Aufteilung des vollständigen Genoms (A) in einen replikationsdefizienten Expressionsvektor pSFV2gensubGFP (B) und den die Strukturgene tragenden Helfervirus pHelper2 (C). 1.3.1.1 Die Plasmidvektoren pSFV und p-Helper Der Expressionsvektor pSFV1 und der eine größere Anzahl Restriktionsschnittstellen enthaltende Vektor pSFV2 enthalten dem SP6-Promotor nachgeschaltet die codierende Region für die Nichtstrukturproteine und dem 26S-Promotor folgend die MCS. Bei dem in dieser Arbeit verwendeten Expressionsvektor pSFV2gensubGFP ist der starke Promotor der subgenomischen 26S-mRNA zweigeteilt, und dient neben der Expression des Transgens auch der Expression des Genes für GFP (green fluorescent protein) (siehe Abb. 10(B) und 11). So kann die Expression des Transgens, sowie das Vorhandensein von rekombinantem Virus in der Wirtszelle einfach und schnell durch die grüne Fluoreszenz nachgewiesen werden (siehe Abb. 15). 28 Einleitung Abb. 11: Karte des pSFV2gensubGFP Plasmidvektors. Das in Abbildung 12 schematisch dargestellte pSFV-Helper2-Plasmid ist die zweite Generation des die Strukturgene tragenden SFV Helfer-Vektors und besitzt, als zusätzliche Sicherheitsstufe, eine Mutation im Spikevorläuferprotein p62. Diese Mutation verhindert die Prozessierung von p62 in die funktionellen Glykoproteine E2 und E3 der viralen Hülle. Die entstehenden SFV-Partikel sind somit nicht infektiös, bis sie an der Virusoberfläche mit α-Chymotrypsin aktiviert werden [Berglund et al. 1993]. Des weiteren fehlt dem pHelper2-Plasmid das Packsignal, so dass nur die Replikon-RNA in die rekombinanten SFV ähnlichen Partikel integriert wird, nicht aber die Information für die Strukturproteine. Die Infektion mit den auf diese Art generierten Viren ist daher nach einem Infektionszyklus selbstlimitierend. 29 Einleitung Abb. 12: Karte des pSFV-Helper2-Plasmids. 1.3.1.2 Generierung und Verwendung der rekombinanten Viren Nach Linearisierung der in vitro RNA-Transkription von pSFV2gensubGFP- und pHelper2-Plasmid-DNA wird die RNA der beiden Plasmide mittels Elektroporation in BHK-Zellen transfiziert. Das Zytoplasma der Zelle ist, wie auch bei physiologischer Infektion, Ort der Virusentstehung. Die Nichtstrukturproteine des Replikon sind für die Replikation und Transkription von Vektor und Helfer-RNA verantwortlich. Das entstehende Virion, welches aufgrund eines fehlenden Packsignals der Helfer-RNA ausschließlich Vektor-RNA mit codierender Sequenz des rekombinanten Proteins enthält, verlässt durch Knospung die Wirtszelle und kann im Überstand der Zellkultur gesammelt werden. Nach Aktivierung durch α-Chymotrypsin sind die SFV-ähnlichen Partikel (rSFV) infektiös. Sie können ein großes Spektrum verschiedener Zellen befallen und in ihrer Eigenschaft als Expressionsvektor hohe Raten eines gewünschten rekombinanten Proteins exprimieren (siehe Abb. 13). Einleitung 30 Abb. 13: Übersicht über die Generierung von rekombinantem Virus. Nach Linearisierung und in vitro RNA-Transkription der beiden Plasmide wird die RNA in BHK-21-Zellen co-elektroporiert. Im Zytoplasma werden Viruspartikel produziert, die ausschließlich Replikon-RNA enthalten. Nach Knospung (budding) des rSFV kann dieser im Überstand der Zellkultur gesammelt werden. αChymotrypsin aktiviert den Virus und ermöglicht die Infektion verschiedener Zelllinien, in diesem Fall MEFs. Auf diese Weise können mit Hilfe des Virus-Vektor-Systems verschiedene rekominante Proteine in Zielzellen eingebracht werden und auf deren Wirkung auf den Vorgang der Apoptose hin untersucht werden. 1.3.2 Apoptose durch SFV - Welcher Todesweg, welche Caspasen? Ist der zytotoxische Effekt von Alphaviren bei der Verwendung der viralen Vektoren zur transgenen Exprimierung sonst eher ein limitierender Faktor, so ist er bei Untersuchung von alphaviral induziertem Zelltod von großem Vorteil. Das Replikonsystem dient als physiologischer Todesstimulus und erlaubt parallel die transgene Exprimierung verschiedener antiapoptotischer Proteine (Bcl-2, CrmA, XIAP) oder dominant-negativer Mutanten (FADD-DN, Caspase 9-DN), ohne die Notwendigkeit stabil transfizierte Zelllinien zu generieren. Die Wirkung der verschiedenen eingeschleusten antiapoptotischen Proteine lässt einen Rückschluss auf den aktivierten Todesweg und die von ihm benötigten Komponenten zu. 31 Einleitung 1.4 Fragestellung dieser Arbeit In der vorliegenden Arbeit sollte der durch den zytotoxischen Alphavirus SFV ausgelöste Todesweg untersucht werden. Mit Hilfe der Expression von antiapoptotischen Proteinen (Bcl-2, CrmA, XIAP) sowie dominant-negativen Mutanten (FADD-DN, Caspase 9-DN) des extrinsischen und intrinsischen Aktivierungsweges der Apoptose sollte die Frage geklärt werden, welcher der beiden Aktivierungswege, welche Caspasen und welche anti- und proapoptotischen Proteine bei SFV-induzierter Apoptose aktiviert werden. Wir vermuteten, dass jedes rekombinant exprimierte antiapoptotische Protein, welches den zytotoxischen Effekt von SFV verhindert oder zumindest verringert, direkt in den molekularen Signalweg der SFV-induzierten Apoptose eingreift. Neben Wildtyp Mausembryofibroblasten (MEFs), in denen mit Hilfe von rekombinantem Virus die erwähnten antiapoptotischen rekombinanten Proteine exprimiert werden konnten, wurden zur weiteren Untersuchung dieser Fragestellung Knock-Out-MEFs proapoptotischer Proteine infiziert: Caspase 9-KO, Bax-KO, Bak-KO,.Bax/Bak-DKO. In diesem Versuchsansatz untersuchten wir die Frage, welche der genannten proapoptotischen Proteine für die SFV-induzierte Apoptose notwendig sind. Das Fehlen wichtiger, für die Apoptose notwendiger zellulärer Komponenten, sollte unserer Überlegung nach ein Überleben oder zumindest ein vermindertes Absterben des entsprechenden Zelltyps nach Infektion mit SFV nach sich ziehen. 32 Material und Methoden 2 Material und Methoden 2.1 Liste der verwendeten Geräte Blotting-Maschine Trans-Blot Semi-Dry Transfer Cell, Bio-Rad, München Brutschrank Heraeus Instruments, Stuttgart Eismaschine Scotsman AF-10, Mailand, Italien Elektroporator (gene pulser x cell) Bio-Rad, München Filmentwicklermaschine Curix 60 AGFA-Geveart, Leverkusen Geltrockner 583 Bio-Rad, München Heizblock, Thermomixer 5436 Eppendorf, Hamburg Kühlschränke -80°C Thermo Forma, Marietta, OH, USA -20°C Siemens, München +4°C Liebherr, Biberach a. d. Riß Licht-Mikroskop (Zellkultur) Nikon TMS, Düsseldorf FACS Calibur Beckton Dickinson Fluoreszenzmikroskop Axiovert Zeiss, Jena Digitalkamera Contax 167 MT Magnetrührer K-550 GE Scientific Industries inc. Bohemia, NY, USA Mikrowellenherd DMR-703 Mio-Star, Migros, Zürich, Schweiz Photospectrometer (UV/ Vis) Beckman Coulter, Fullerton, CA, USA Pipettboy Acu Classic Integra Bioscience , Fernwald Pipetten Gilson, Frankreich Sterilbank HB-2448 K Heraeus, Hanau Stickstofftank Messer Griesheim, Krefeld Spannungsgeräte Power Pac2000 Bio-Rad, München Thermocycler PCR MI Research Biozym, Hess. Oldendorf Transilluminator Bio-Doc-Analyze, Biometra, Göttingen TM Vortex Genie Bender und Hobein, Zürich, Schweiz Waage LP6200S Sartorius, Göttingen Wasserbad Eigenproduktion 33 Material und Methoden Kühlzentrifuge Megafuge 30R Heraeus, Hanau Ultrazentrifuge Optima TL Beckman, Coulter, CA, USA SW41 Ti Rotor Beckman, Coulter, CA, USA Z1 Coulter Particle Counter Beckman Coulter, CA, USA 2.2 Chemikalien und Lösungen Aceton Merck, Darmstadt Agar Gibco,Invitrogen,Karlsruhe Agarose Biozym, Oldendorf Betamercaptoethanol Sigma, Deisenhofen Chloroform Merck, Darmstadt Calf intestinal phosphatase (CIP) NEB/Bioconcept, Schweiz Ciprobay Bayer, Leverkusen EDTA Fluka, Buchs, Schweiz Eisessig Merck, Darmstadt Ethanol Baker, Deventer, Niederlande Ethidiumbromid Merck, Darmstadt FCS (Fetales Kälber Serum) Invitrogen, Karlsruhe Glycerol, Roth, Karlsruhe Isopropanol Merck, Darmstadt Natriumacetat (NaAC) Fluka, Buchs, Schweiz Penicillin Seromed, Berlin Sucrose Calbiochem, La Jolla, USA Saponin Fluka, Buchs, Schweiz SDS Roth, Karlsruhe Streptomycin Calbiochem, La Jolla, USA Trypsin 2,5% Gibco, Invitrogen, Karlsruhe Tween 20 Merck, Darmstadt 34 Material und Methoden Lösungen: H8-Puffer 20mMTris,2mM EDTA, 2mM EGTA 6mM Betamercaptoethanol PBS 14,7 mM KH2PO4, 79,7 mM Na2HPO4, 26,8 mM KCL,1,4 NaCL PBS-Tween 0,5 ml Tween 20 pro Liter PBS PBA 1% PBS und 1 % BSA TAE x 50 2M Tris base, 1M Eisessig SOC-Medium 1M KCL, 1 M NaCL, 2M Mg2+, 2M D(+)-Glukose LB-Amp.-Medium LB-Medium mit Ampicillin 75 µg/ml Sucroselösung PBS mit 20% Sukrose 2.3 Zellkultur 2.3.1 Zellarten Wild-Typ 3T9 Mausembryofibroblasten (MEFs) Caspase 9-defiziente 3T9 MEFs (Caspase 9-KO-MEFs) Bax-defiziente 3T9 MEFs (Bax-KO-MEFs) Bak-defiziente 3T9 MEFs (Bak-KO-MEFs) Bax/Bak-defiziente (DKO-MEFs ) 3T9 MEFs BHK-21 Zellen (adhärente Baby Hamster Nieren Zellen) 2.3.2 Medien Für alle verwendeten Zelllinien wurde hochglukosehaltiges Medium (4,5 g/l) DMEM (Dulbecco’s Modified Eagles Medium, Invitrogen) mit 10% FCS (fetal calf serum) und Pen/Strep (60 µg/ml Penizillin und 100 µg/ml Streptomycin) verwendet. 35 Material und Methoden 2.3.3 Konservierung: Einfrieren und Auftauen von Zellen Material: Medium, 15 ml Falkon-Röhrchen, 60 mm Kulturplatte. Einfrieren: Die zum Einfrieren vorbereiteten Zellen wurden in 20% FCS enthaltendem Gefriermedium resuspendiert und in spezielle Gerfrierröhrchen pipettiert. Nach Zugabe von 10% DMSO konnten sie bei –80°C eingefroren werd en und anschließend zur Langzeitkonservierung in –160°C überführt werden. Auftauen: Die gefrorenen Zellen wurden schnellst möglich im Wasserbad aufgetaut und in ein vorbereitetes 5 ml Medium enthaltendes 15 ml Falkon-Röhrchen überführt. Nach Zentrifugation bei 700 x g über 5 min wurde das Medium gewechselt und erneut 3 min bei 800 x g zentrifugiert. Die so von DMSO befreiten Zellen wurden in frischem Medium mit 10% FCS resuspendiert, in 60 mm Kulturschalen ausplattiert und bei 37°C inkubiert. 2.3.4 Kulturbedingungen Alle Zelllinien wurden in Inkubatoren mit H2O gesättigter Atmosphäre bei 37°C und 5 Vol % CO2 kultiviert. Bei positiver Mykoplasmenkontrolle wurden die Zellen während der Dauer eines Monats mit 200 µg/ml Ciprobay® (Bayer) enthaltendem Medium behandelt und erneut kontrolliert. 2.3.5 Zellen trypsinisieren und splitten Material: Trypsinlösung (0,375%): für 250 ml werden 25 ml 10x PBS, 37,5 ml Trypsin, 185,5 ml H2O und 500 µl 0,5 M EDTA gemischt und steril filtriert. Methode: Bei einer Zelldichte von über 70% wurden die Zellen gesplittet und neu ausplattiert. Adherente Zellen wurden mit 1x PBS gewaschen und anschließend mit 0,53 ml Trypsin beträufelt. Nach einer 3 minütigen Inkubation bei 37°C wurden die Zellen in frischem Medium mit 10% FCS resuspendiert und entsprechend verdünnt wieder ausplattiert. 36 Material und Methoden 2.3.6 Zellen quantifizieren und ausplattieren Material: Zählbecher, Isotonpuffer, Z1 Coulter Particle Counter Methode: Die resuspendierten Zellen wurden 1/100 in 10 ml Isoton verdünnt und mit Hilfe des Zellzählers gemessen. Die Anzahl der im Grössenbereich von 8-30 µm gezählten Zellen wurden als Zellen pro Milliliter angegeben. 2.4 Generierung und Gewinnung der Plasmide 2.4.1 DNA Präparation 2.4.1.1 MINIpräp Material: LB-Medium mit Antibiotika, Minipräparations-Kit (Promega) Methode: Die Plasmide enthaltenden Bakterien wurden entweder am Tag nach der Transformation als Kolonien gepickt, oder als gefrorene Proben gekratzt, und in einem mit 5 ml LB-Medium gefülltes Bakterienröhrchen zwischen 18 und 24 Stunden bei 37°C und 200 rpm schüttelnd inkubiert. Die am folgenden Tag eingetrübte Bakterienkultur wurde bei 3.500 rpm für 5 Minuten zentrifugiert und das so entstandene Pellet wie im Protokoll des Kits beschrieben weiterverarbeitet. 2.4.1.2 MIDIpräp Material: LB-Medium mit Antibiotika, Midi-Präparationskit (Jet-Star) Methode: Die Inkubation der Bakterien erfolgte, um die Ausbeute zu erhöhen, in mehreren kleinen, mit 5 ml LB Medium gefüllten Bakterienröhrchen, statt in den im Protokoll vorgeschlagenen 50 ml Erlenmeyerkolben wie bei der Minipräparation. Ansonsten wurde genau wie im Jet-Star-Protokoll angegeben verfahren. Material und Methoden 37 2.4.1.3 Kontrollagarosegel Material: Agarose, 1x TAE-Puffer, Ethidiumbromid Methode: Zur Herstellung eines 0,8 % Agarosegeles wurden in einem Erlenmeyerkolben 0,4 g Agarose mit 50 ml TAE-Puffer vermischt und vorsichtig in der Mikrowelle erwärmt. Nach Abkühlung der Mischung konnten unter dem Abzug 5 µl Ethidiumbromid zugegeben werden und die flüssige Masse in die Schälchen der Gelapparatur eingefüllt werden. War das Gel erstarrt wurde es mit TAE begossen und die Proben geladen. Die Elektrophorese wurde mit einer Spannung von 40 bis 50 Volt laufen gelassen. 2.4.1.4 Photometrische Messung Methode: Die photometrische Messung zur Ermittlung der Konzentration und Reinheit der gewonnenen Plasmid-DNA erfolgte mittels Spektrometer in einer Verdünnung von 1/100 bei einer Wellenlänge von 260 nm gegen steriles H2O. Bei einem Quotient der Extinktionswerte der OD 260 (DNA) / OD 280 (Proteine) zwischen 1,8 und 2 wurde die DNA als rein bewertet. 2.4.2 Generierung von Plasmiden 2.4.2.1 Subclonieren mittels PCR Material: Taq Polymerase, 10x Puffer + MgCl2, Primer, steriles H2O, Gelextraktionskits (Qiagen), PCR-Purifikationskits (Qiagen) Methode: Zur Subklonierung des Transgens in den verwendeten Expressionsvektor pSFV2gensubGFP musste zuerst das entsprechende Gen aus dem Originalvektor durch PCR isoliert werden. Die speziellen Primer zur Isolierung des Transgens wurden so modelliert, dass im Vorwärtsprimer 4 Nukleotide der Restriktionsstelle und diese wiederum der Kozak-Sequenz (GCCACC) und einem ATG vorgeschaltet sind. Der Vorwärtsprimer enthielt zudem eine 4 Nukleotide umfassende Sequenz in direkter Nachbarschaft der Restriktionsstelle um eine problemlose Bindung der 38 Material und Methoden Restriktionsenzyme zu garantieren. Im Rückwärtsprimer liegen 4 Nukleotide der Restriktionsstelle vorgeschaltet, gefolgt wird sie von einem Stopcodon. Die PCR wurde unter den folgenden Bedingungen durchgeführt: PCR-Ansatz: 100 ng DNA (des Transgens im Originalvektor), dNTP 200 µM, Taq Polymerase, 10x Puffer + MgCl2, Vorwärts- und Rückwärtsprimer, steriles H2O PCR-Programm: PCR-Block auf 95°C vorheizen, Denatur ierung 1x 2 min bei 94°C, 30 Zyklen: Denaturierung 30 sek, Primerhybridisierung 30 sek bei 54 °C, Elongation 1 min bei 72°C, Abschluss der Elongation 1x 5 min b ei 72°C, Abkühlung auf 10°C. Die erhaltene Hybrid-DNA wurde nach Protokoll des PCR-Purifikationskits von (Qiagen) gereinigt, in 30 µl sterilem H2O eluiert und anschließend, zur Herstellung der für die Ligation in den Vektor benötigten Schnittstellen, mit den Restriktionsenzyme NotI und XhoI in einem Gesamtvolumen von 60 µl über Nacht bei 37°C verdaut. Die über Nacht verdaute Insert-DNA wurde vollständig auf ein 1 % iges Agarosegel geladen und nach Abschluss der Elektrophorese unter UV-Licht mit einem Skalpell aus dem Gel herausgetrennt und in ein Eppendorf-Tube überführt. Die Gelextraktion erfolgte unter Befolgung des Protokolls des Gelextraktionskits (Qiagen) 2.4.2.2 Ligation von Vektor und Transgen Material: Je 500 ng Vektor-DNA und Insert-DNA, PEG 8000 (15%), EtBr, Ligase, Ligase-Puffer, ATP, NotI, XhoI (New England Biolabs), calf intestinal phosphatase (CIP) Methode: In einem weiteren Schritt konnte das mit den Restriktionsendonukleasen verdaute und purifizierte Insert in den ebenso enzymatisch mit NotI, XhoI verdauten Vektor ligiert werden. Eine sich anschließende Dephosphorylierung der Vektor-DNA mit CIP vermied die Rezirkulation des Vektors. In dem Reaktionsansatz lag das Verhältnis zwischen Vektor und Insert bei 1:3. Inkubation des Reaktionsansatzes erfolgte über Nacht bei 4°C. Am darauffolgenden Tag konnten 2 µl des Ligationsansatzes zur Transformation von Bakterien verwendet werden. 39 Material und Methoden 2.4.3 Transformation in Bakterien mittels Hitzeschock Material: Bakterienröhrchen, SOC-Medium, XL-1 blue superkompetente Bakterien (Stratagene), β-Mercaptoethanol 1,42 M (Stratagene) Methode: Zur Transformation des legierten Plasmids in XL-1-Blue-Zellen wurden 100 µl der Zellen mit 1,7 µl β-Mercaptoethanol für 10 min. auf Eis inkubiert und alle zwei min leicht geschüttelt. Der Zugabe von Plasmid-DNA folgte eine 30 minütige Inkubation auf Eis bevor die Proben für 50 sek in ein auf 42°C vor geheiztes Wasserbad eingetaucht wurden. Nach weiteren zwei Minuten auf Eis wurden die Proben mit je 900 µl vorgewärmtem SOC-Medium versetzt 1 Stunde bei 37°C und 220 rpm in einem Schüttler inkubiert. Der Ansatzes wurden anschließend in einem Volumen von 150 µl unter Verwendung einer gebogenen Glaspipette auf Agarplatten mit Ampizillin aufgetragen und zum Wachstum einzelner Kolonien über Nacht bei 37°C inkubiert. 2.4.3.1 Sequenzierung und Kontrolle: Methode: Die Kontrolle der rekombinanten Plasmid-DNA erfolgte außer durch richtungsweisende Gelelektrophoresen auch mit Hilfe der, extern bei der Firma Mikrosynth, durchgeführten DNA-Sequenzierung. 2.5 SFV Replikon Produktion 2.5.1 DNA- Linearisierung und Kontrolle Material: Restriktionsenzyme NruI, SpeI (New England Biolabs) und Puffer Methode: Für eine Virusproduktion wurden 3 µg der rekombinanten Plasmid DNA von pSFV2gensubGFP und pHelper2 mit den Restriktionsenzymen NruI bzw. SpeI (New England Biolabs) über Nacht verdaut. Die Kontrolle der auf diese Weise linearisierten DNA erfolgte mit Hilfe eines 0,8% Agarosegels mit TAE bei 40-50 Volt. Bei Detektierung korrekt abgebildeter Banden konnte zum Schritt der Purifizierung übergegangen werden. Material und Methoden 40 2.5.2 DNA-Purifizierung Material: Phenol-Chloroform, Natrium-Acetat 3M, 95% Ethanol, nukleasefreies Wasser. Methode: Purifizierung und Konzentrierung der linearisierten DNA erfolgte über Säulen nach Befolgung des Protokolles des QIAquick PCR-Purifikations Kit (Qiagen) oder durch eine Phenol-Chloroform-Extraktion. Hierzu wurden die vorhandenen Volumina linearisierter DNA bestimmt und auf ein Volumen von 100 µl erhöht. Nach Zugabe einer equivalenten Menge Phenol-Chloroform und 10 sek vortexen wurde jede Probe 60 sek mit 10.000 rpm bei Raumtemperatur, zur klaren Trennung der zwei Phasen zentrifugiert. Die obere DNA Phase wurde vorsichtig abpippitiert und in ein neues Eppendorf-Tube überführt. Das DNA-Volumen wurde erneut bestimmt und mit einem 1/10 Volumen 3M Na-Acetat sowie 2,5 Volumen 95%-igem Ethanol (–20°C ) versetzt. Nach 1 h bei –80°C wurden die Proben 15 min bei 13.000 rpm zentrifugiert, der Überstand verworfen und die Pellets bei 37°C kurz von Ethanol getrocknet. D ie anschließend in nukleasefreiem Wasser aufgenommene DNA wurde erneut im Agarosegel kontrolliert und per Spektrometermessung quantifiziert. 2.5.3 RNA Transkription Material: Nuklease freies Wasser Transkriptionsmischung: Transkriptionspuffer (Promega), DTT, Cap-Analog (Biolabs), rNTP mix (Promega), RNase Inhibitor (Promega) und SP6 RNAPolymerase (Promega) RNA- Pipettenspitzen (Molecular Bioproducts, San Diego, USA) Safe-lock Tubes (Eppendorf, Hamburg) Linearisierte und purifizierte Ausgangs-DNA Methode: Für die in vitro RNA-Transkription wurden jeweils 2 µg linearisierter und purifizierter DNA mit nukleasefreiem Wasser zu eien Volumen von 24 µl aufgefüllt und 41 Material und Methoden zu einer 26 µl enthaltenden Transkriptionmischung gegeben. Der insgesamt 50 µl umfassende Ansatz von 5 µl 10x Transkriptionspuffer (Promega), 5 µl 50 mM DTT, 5 µl 10mMm7 G(5’)ppp(5’)G Cap-Analog (Biolabs), 5 µl rNTP mix (Promega), 2 µl 50 U RNase Inhibitor (Promega) und 4 µl 100 U SP6 RNA-Polymerase (Promega) wurde 90 min bei 37°C inkubiert. Während der sich a nschließenden Kontrolle der in vitro transkribierten RNA auf 0,8% Agarosegel, konnten die für die Elektroporation benötigten BHK-21 Zellen vorbereitet werden um eine möglichst schnelle Verarbeitung der RNA zu garantieren. Alle Arbeitsschritte mit RNA wurden sorgfältig mit speziellen RNase-freien RNA-Pipettenspitzen und auf Eis durchgeführt. 2.5.4 RNA Transfektion Material: 0,2 cm gap Elektroporationskuvette (Bio-Rad) auf Eis gekühlt, Replikon-RNA und Helfer-RNA, DMEM mit 10% FCS Methode: Die RNA der beiden Plasmidvektoren pSFV2gensubGFP und pHelper2 wurde mittels Elektroporation in BHK-21 Zellen eingebracht. Die am Vortag in Kulturflaschen ausplattierten adhärenten BHK-21 Zellen wurden mit Trypsin abgelöst, nach zweifachem Waschen in PBS in isotoner Lösung gezählt und anschließend zu 1x107 Zellen pro ml in sterilem PBS resuspendiert. Je 500 µl der resuspendierten Zellen wurde in eine 0,2 cm gap Kuvette transferiert und mit 50 µl der Replikon-RNA und 30 µl Helfer-RNA gut vermischt. Die Elektroporation erfolgte mit einem Impuls von 700 V und 50 µF. Nach dem Impuls folgte eine Resuspendierung der elektroporierten Zellen in glukosehaltigem DMEM mit 10% FCS und das Ausplattieren in 10 cm Kulturschalen. Die Zellen wurden bei 37°C und 5% CO 2 zwischen 30 und 40 Stunden inkubiert. 2.5.5 Virusernte Material: α-Chymotrypsin (Sigma), Aprotinin (Alexis), Virusaliquots Methode: Nach Ablauf der Inkubationszeit wurde der Überstand aus den Kulturschalen gesammelt und durch einen 0,22 µm Filter von Zelldetritus gereinigt. Der rekombinanten Virus enthaltende Überstand wurde bei Raumtemperatur mit 20 µg/ml α-Chymotrypsin 42 Material und Methoden (Sigma) über 30 min aktiviert, und zur Beendigung der Reaktion weitere 30 min mit 10 µg/ml Aprotinin (Alexis) gestoppt. Zur Kontrolle der Effizienz der Elektroporation wurden die adherenten BHK-21-Zellen, welche der Virusproduktion gedient hatten, wie unter Punkt 2.6.2 beschrieben für eine FACS-Analyse vorbereitet. 2.5.6 Virusreinigung Material: 20% Sucroselösung in PBS, Ultrazentrifuge SW 41 Ti Rotor (Beckman Coulter) Methode: Zur Purifizierung des gewonnenen rekombinanten Virus wurde die aktivierte Viruslösung auf eine 20% Sucroseschicht gegeben und bei 160.000 x g für 90 min ultrazentrifugiert. Die Ultrazentrifugation erfolgt bei 4°C in einem SW41 Ti Rotor (Beckman Coulter). Nach Abpipettieren der Flüssigkeit wurde das unsichtbare Viruspellet am Boden des Röhrchens in 1 ml Infektionsmedium mit 0,5% FCS resuspendiert und in Form von Aliquots bei – 80°C e ingefroren. 2.6 Infektion und FACS-Analyse 2.6.1 Infektion Material: DMEM 0,5% FCS, 10% FCS, Aliquots rekombinanter Viren Methode: Um möglichst geringe Mengen des produzierten rekombinanten Virus zu verbrauchen wurde die Infektion an am Vortag ausplattierten MEF-3T9 Zellen in 12 Lochplatten durchgeführt. Um eine Konfluenz von ca. 70% zum Zeitpunkt der Infektion zu erreichen wurden 105 Zellen pro Milliliter und Loch verwendet. Vor Zugabe des rekombinanten Virus erfolgten zwei Waschvorgänge der Zellen mit PBS und ein Austausch des Wachstumsmediums mit 10% FCS gegen solches mit nur 0,5% FCS. Je nach Determinierung der Konzentration des rekombinanten Virus wurden zwischen 30 und 60 µl aufgetautes Virus verwendet. Die Infektion erfolgte über eine Stunde bei 37°C und 5% CO2 auf einem Schüttler im Inkubator. Die Infektion wurde durch Zugabe von 1 ml DMEM mit 10 % FCS beendet und in diesem Zustand über den gewünschten Zeitraum inkubiert. Material und Methoden 43 2.6.2 FACS Analyse und Auswertung Material: 15 ml Falkon-Röhrchen (Beckton Dickinson, USA), FACS-Röhrchen (Beckton Dickinson), Propidium-Jodid, 1x PBS. Methode: Dank des verwendeten GFP-enthaltenden Expressionsvektors pSFV2gensubGFP konnte die Anzahl infizierter Zellen mittels FACS–Analyse bestimmt werden. Hierzu wurde der Überstand der viral infizierten Lochplatten, zusammen mit den durch Trypsinbehandlung abgelösten Zellen, in je ein 15 ml Falcon-Röhrchen pipettiert. Während der 3 minütigen Zentrifugation bei 800 g in Raumtemperatur bildete sich am Boden des Falkon-Röhrchens ein Zellpellet, welches in 5 ml PBS resuspendiert wurde. Die erneute Zentrifugation, die dem Waschen der Zellen diente, erfolgte unter gleichen Bedingungen. Als Gegenstaining zu dem bereits im Virus vorhandenen GFP wurden die Zellen in 300 µl einer 5 µg/ml Propidiumjodid enthaltenden Lösung aufgenommen. Die Proben wurden in FACS-Röhrchen überführt und in diesen gemessen. Auswertung: Mit Hilfe des apoptotischen FACS Assays kann die Anzahl infizierter und toter Zellen in Relation gesetzt werden. Zur Analyse der Ergebnisse wurde ein Dotplot erstellt, in dem grüne Fluoreszenz (GFP exprimiert vom Virusgenom) gegen rote Fluoreszenz (PI) aufgetragen wurde. Das zur Markierung toter Zellen verwendete rot fluoreszierende Propidium-Jodid (PI) ist ein nicht zellpermeabeler DNA-Farbstoff und kann auf Grund dessen ausschließlich nekrotische Zellen mit bereits durchlässiger Membran anfärben. Folglich zeigten die anhand der Negativkontrolle (alle Zellen im unteren linken Quadranten (LL)) festgelegten Quadranten im unteren rechten Quadranten die Population der GFP-positiven bzw. infizierten Zellen, und in den beiden oberen Quadranten (UR+UL) die PI-positiven, toten Zellen. Das Vorhandensein zweier identischer Promotoren in einem Replikonvektor, welche die zeitgleiche Expression des Transgenes sowie des gfp-Markergenes regulieren, erlaubt zu einem frühen Infektionszeitpunkt (z.B. 24 hpi) bei Analyse der Prozentzahl GFP positiver und PI negativer Zellen (LR Quadrant) den direkten Rückschluss auf die Effizienz der Infektion als auch auf die erfolgreiche Expression des Transgens in der infizierten Zelle. Zur Evaluation der antiapoptotischen Wirkung der verschiedenen in der Material und Methoden 44 Zelle exprimierten Transgene wurde der Prozentsatz toter Zellen nach 24, 48, 72 etc. Stunden verglichen und in Diagrammen dargestellt. 2.7 Westernblot Material: Bio-Rad Ausrüstung, H8-Puffer, 1x Lämmli-Puffer, Filterpapier, PVDF Membran, 10% SDS, Lauf-Puffer, Transfer-Puffer, BCA-Kit (Pierce), PBS-Tween, Milchpulver, ECL, Photopapier, Audioradiographiekassette Antikörper: 1. Antikörper Anti-mBcl-2 10C4 (Zymed), (1:1000) Anti-Flag M5 (Sigma) (1:2000) 2. Antikörper anti-Maus TexasRed (DAKO) (1:5000) . 2.7.1 Bereitung der Totalextrakte und Bestimmung der Proteinkonzentration mittels BCA Material: BCA-Protein-Assey-Kit (Pierce, Bonn) Methode: Die am Vortag in 6 Loch-Platten mit rekombinantem Virus infizierten Zellen wurden nach 24 hpi trypsinisiert, in einem Falkon gesammelt, und nach zweifachem Waschen mit PBS bei 1200 rpm zentrifugiert. Das Zellpellet wurde anschließend in 50 µl auf 95°C vorgewärmtem H8-Puffer mit 1% SDS für 15 m in unter Schütteln bei 95°C gekocht. Das visköse Extrakt wurde mehrere Male mit der Pipette aufgezogen, bis es eine homogene Konsistenz aufwies. Im Anschluß konnte der BCA-Essay zur Bestimmung der Proteinkonzentration wie im Herstellerprotokoll beschrieben durchgeführt werden. 2.7.2 SDS, Western-Blot, ECL Vorbereitung des SDS-Geles: Die zum Gießen des Geles verwendete Bio-Rad Ausrüstung wurde bis zur Markierung mit der vorbereiteten 12% Trenngellösung gefüllt und zur Glättung der Geloberkante mit 45 Material und Methoden Isobutanol beschichtet. Nach Aushärtung konnte das 4% Sammelgel unter vorsichtiger Platzierung eines Kammes darüber eingefüllt werden. Bevor schließlich das polimerisierte Gel in den mit Laufpuffer gefüllten Bio-Rad Container gesetzt wurden, musste der die Taschen bildende Kamm entfernt werden und alles mit H2O gereinigt werden. Laden der Proben und Laufenlassen des Geles: Die mit BCA-Assay gemessenen Proben wurden 4 min bei 95°C in 1x Lämmli-Puffer denaturiert und anschließend 30 µg Proteine in einem Volumen von 15 µl auf das Gel geladen. Je eine Tasche pro Gel wurde mit Marker, die nicht verwendeten mit 1x Lämmli-Puffer gefüllt. Die Elektrophorese erfolgte bei 20 mA pro Gel bis das Ende des Geles erreicht wurde. Elektroblotting: Pro Gel wurden sieben Filterpapiere und eine zuvor über 1 min in Methanol aktivierte PVDF Membran 15 Minuten in 1x Transferpuffer eingeweicht. Das Gel wurde vorsichtig von der Glasplatte auf die Membran transferiert, auf drei Filterpapiere platziert und mit den übrigen vier überdeckt. Das Gel wurde 90 min bei 40 mA transferiert. Anschließend wurde die Membran für eine Stunde bei Raumtemperatur (RT) in 5% Milchlösung in PBS-Tween geschüttelt, um unspezifische Proteinbindung zu verhindern. Labelling: Das geblockte Gel wurde mindestens 3 x 5 min in PBS-Tween auf einem Schüttler gewaschen und anschließend über Nacht bei 4°C mit d em ersten Antikörper in 3% Milch inkubiert. Am folgenden Tag wurde die Membran, nach erneutem dreifachem Waschen in PBS-Tween, 90 min lichtgeschützt bei RT mit dem zweiten Antikörper in 3% Milch inkubiert und anschließend erneut gewaschen. 46 Material und Methoden Entwicklung: Nach einminütiger Aktivierung in der vorbereiteten ECL-Lösung wurde die Membran in Seranfolie eingewickelt in einer Audioradiographiekassette in die Dunkelkammer transportiert und mit verschiedenen Belichtungszeiten auf Photofilm entwickelt. 2.8 Immunfluoreszenz Material: Pinzetten, Deckgläschen rund, ∅12mm, Darmstadt, Objektträger Langenbrinck, Emmendingen, PBS, auf –20°C vorgekühltes Aceton, 4% PFA (4% in Pipes 0,1 M pH 6,8), Saponin 0,05% (in Pipes 0,1 M pH 6,8), Antikörper in PBA (PBS + 10% BSA), niedere Plastikschalen, kleines Gefäß, mit PBS gefüllt, Hoechst 33342: 1 µl Stammlösung (2 mg/ml) auf 1 ml 4% PFA, Slow Fade Antifade Kit ® (Molecular Probes), lichtundurchlässige Objektträgerkästchen Erstantikörper: Anti- Maus-Bcl-2 (10C4), Zymed, San Francisco (1:50) Anti-Flag (M2) Sigma, USA (1:100) Zweitantikörper: Anti-Maus Texasred Dianova, Hamburg (1:200) Methode: Zellvorbereitung: Die mit Ethanol ausgeflammten Deckgläschen wurden in eine Zellkulturschale gelegt und nach Zugabe der Zellsuspension leicht am Boden angedrückt, um ein Anwachsen von Zellen auf der Unterseite zu vermeiden. Fixierung: Die über Nacht auf dem Deckgläschen angewachsenen Zellen konnten am nächsten Tag infiziert und am darauf folgenden Tag weiter verarbeitet werden. Hierzu wurden die Deckgläschen mit Hilfe einer Pinzette mit der bewachsenen Seite nach oben auf ein mit Parafilm überzogenes Schälchen gelegt und sofort für 10 min mit 65 µl PFALösung fixiert. Danach wurden die Deckgläschen 2x in PBS gewaschen und anschließend in eine flache mit PBS gefüllte Schale gelegt. 47 Material und Methoden Permeabilisierung: Wieder auf dem Parafilm, wurde für exakt 5 min 65 µl 0,05% Saponinlösung aufpipettiert und erneut 2x in PBS gewaschen. Anschließend wurden die Deckgläschen für 10 min bei –20°C in Aceton inkubie rt und wiederum 2x in PBS gewaschen und die Deckgläschen auf dem Parafilm aufgereiht. Antikörper: Die jeweiligen Verdünnungen der Antikörper wurden je nach Protokoll in 1% PBA vorbereitet und 65 µl der vorbereiteten Erstantikörperlösung für 90 Minuten einwirken lassen. Ebenso wurde nach erneutem Waschen mit dem zweiten Antikörper verfahren, wobei dieser streng vor Licht geschützt werden musste. DNA-Färbung: Die DNA der Zellen wurde 15 Minuten mit einer 1:1000-Verdünnung von 2 µg/ml Hoechst 33342 (1:1000) gefärbt und wiederum 2x in PBS gewaschen. Slow Fade Behandlung: Auf jedes Deckgläschen wurden für ca. 10 min zwei Tropfen Equilibration Buffer gegeben. Währenddessen wurden 5 µl Slow-Fade Reagenz auf die Objektträger getropft, und die Deckgläschen mit der Zellseite nach unten in die SlowFade Lösung des Objektträgers abgelegt. Die Objektträger wurden in einer lichtdichten Kunststoffbox mit feuchtem Tuch bei 4°C aufbewahrt, bevor sie unter dem Fluoreszenzmikroskop betrachtet und fotografiert werden konnten. Ergebnisse 48 3 Ergebnisse 3.1 Infektion mit rekombinantem Virus 3.1.1 Etablierung der Elektroporationsbedingungen mit eGFP Ein kritischer Schritt bei der Herstellung rekombinanter Viren war die geringe Ausbeute nach Transfektion der RNA der beiden Vektoren pSFV2gensubGFP und pHelper2 in BHK-21-Zellen. In einem ersten Verfahren wurden deshalb die Elektroporationsbedingungen durch einfache eGFP-DNA-Transfektionen und Auswertungen mittels FACS-Analyse etabliert. Eine Elektroporation galt als umso effizienter, je mehr GFPpositive Zellen im rechten unteren Quadranten (LR) gezählt wurden und je geringer die Todesrate der elektroporierten Zellen ausfiel (obere Quadranten, PI-Färbung (rot)). Es wurden verschiedene Elektroporationsmedien (PBS, DMEM, HEPES) und DNAKonzentrationen zwischen 10 und 40 µg kombiniert, die Zelldichte der zu transfizierenden BHK-Zellen von 60-80% variiert, sowie die Einflüsse unterschiedlicher elektrischer Spannungen bzw. Kapazitäten und einfacher bzw. doppelter elektrischer Impulse getestet. Als beste Bedingungen erwiesen sich ein einfacher Impuls mit 700 Volt und 50 µF und eine DNA-Konzentration von 20 µg bei einer Zelldichte von ca. 60% und einem Kuvettenvolumen von 400 µl. Im Folgenden konnte die so optimierte Elektroporation zur Transfektion der BHK-Zellen pSFV2gensubGFP und pHelper2 verwendet werden. mit den RNA-Vektoren Ergebnisse 49 3.1.2 Erster Nachweis der erfolgreichen Generierung von rekombinantem Virus Die linearisierte und purifizierte Plasmid-DNA wurde, wie ausführlich in Kapitel 2.5 beschrieben, unter Verwendung von SP6-RNA-Polymerase zur in vitro RNATranskription verwendet. Die RNA-Synthese wurde, wie auch vorher die Linearisierung der Matrizen-DNA, mittels Gelelektrophorese kontrolliert (siehe Abb. 14). Abb. 14: Kontrollgel von in vitro transkribierter RNA. Zu erkennen sind die linearisierte DNA-Matrize im oberen Bereich des Gels sowie die RNA der verschiedenen Konstrukte als dicke Banden im unteren Teil. Die generierte RNA wurde nach Fertigstellung auf Eis gestellt und direkt weiter verwendet, um mögliche Degradationsprozesse vor dem Einbringen in die zur Virusproduktion verwendeten BHK-21-Zellen zu verhindern. Die Funktionalität des Replikonsystems wurde durch Infektion von WT-MEFs getestet. Das mit den Vektoren pSFV2gensubGFP und pHelper2 generierte rekombinante Virus (siehe Kapitel 2.5) konnte mittels FACS-Analyse und Immunfluoreszenz (siehe Abb. 15) der infizierten Zellen, unabhängig nachgewiesen werden. von dem beschriebenen zytotoxischen Effekt des Virus, 50 Ergebnisse Abb. 15: Immunfluoreszenz beweist die Funktionalität des mit den Vektoren pSFV2gensubGFP und pHelper2 generierten rekombinanten Virus. Nach Infektion von WT-MEFs stellen sich pSFVgensubGFP-positive Zellen grün dar. Zellkerne erscheinen nach Färbung mit Hoechst 33342 blau 3.1.3 Einsatz steigender Virusmengen Zur Verbesserung der Infektionsraten wurden steigende Mengen von 1 µl bis 200 µl der verschiedenen rekombinanten Viren zur Infektion von WT-MEFs getestet und miteinander verglichen. Die Ergebnisse zeigen eine Sättigung des Dosis-WirkungsVerhältnisses. Aufgrund der zeit- und materialaufwändigen Produktion musste, je nach Konzentration des produzierten Virus, anhand von Probeinfektionen, wie hier am Beispiel des rekombinanten FADD-DN/pSFV2gensuGFP-Virus demonstriert, das optimale Dosis-Wirkungs-Verhältnis ermittelt werden (siehe Abb. 16). Das jeweilige Aliquot wurde bei allen folgenden Infektionen in dem minimal möglichen Volumen mit gleichzeitig größtmöglicher Wirkung, welches zumeist zwischen 30 und 50 µl lag, verwendet. Auf diese Weise konnte, bei minimalem Einsatz von rekombinantem Virus, ein maximaler Prozentsatz von Zellen infiziert werden. 51 Ergebnisse Abb. 16 a) rSFV/FADD-DN 1µl Abb. 16 b) rSFV/FADD-DN 10µl Abb. 16 c) rSFV/FADD-DN 50µl Abb. 16 d) rSFV/FADD-DN 150µl Abb. 16: FACS-Ergebnisse einer Probeinfektion mit rSFV/FADD-DN (24 hpi) mit steigenden Virusmengen (von 1µl-150µl). Anhand des Prozentsatzes erfolgreich infizierter Zellen (LR= GFP positiv), wurde das optimale Dosis-Wirkungsverhältnis ermittelt. 52 Ergebnisse 3.1.4 Infektion mit rekombinantem WT-Virus ist zytotoxisch Die Infektion mit dem nativen Alphavirus SFV ist nach Ablauf einer Infektionszeit von ca. 24 hpi in MEFs stark zytotoxisch. Um die zytotoxische Wirkung von rekombinantem WT-SFV zu quantifizieren, wurden die unter gleichen Bedingungen infizierten Zellen nach Ablauf unterschiedlich langer Infektionszeiten ausgewertet. Die hierzu nach FACS-Analyse erstellten Dottplots wurden anhand der Negativkontrolle (nicht infizierte Zellen) in vier Quadranten unterteilt, die in den beiden oberen die PI positiven – also sekundär nekrotischen – Zellen, im unteren linken die lebenden nicht infizierten und im unteren rechten die infizierten (GFP positiven), nicht-nekrotischen Zellen zusammenfassen (siehe Abb. 17). Da die viral infizierten Zellen bei Übergang von Apoptose in sekundäre Nekrose aufgrund der verletzten Membranintegrität GFP verlieren, waren die infizierten toten Zellen nicht wie erwartet doppelt positiv (wanderten also nicht von dem unteren rechten in den oberen rechten Quadranten), sondern erschienen in beiden oberen Quadranten (UR+UL). Zur Quantifizierung von Zelltod wurde deshalb die Gesamtanzahl PI-positiver Zellen verglichen (UR+UL). 24 Stunden nach Infektion mit rekombinantem Virus ohne Transgen konnte, im Gegensatz zu der von nativen Alphaviren bekannten Todeskinetik, zunächst nur ein minimaler Beginn des virusinduzierten Zelltodes beobachtet werden, der aber nach ca. 48h schließlich bis zu 60% der initial infizierten Zellen getötet hatte. Wegen der etwas trägeren Kinetik der rekombinanten Viren wurden zur Analyse von rSFV induzierter Apoptose die Werte PI positiver Zellen (UR+UL) nach 24 hpi und 48 hpi ausgewertet, wobei der 24 h Wert hauptsächlich eine Aussage über die Effizienz der Infektion (LR = GFP positive Zellen) machte. Die Ergebnisse der Infektionen mit rekombinantem WTVirus zeigen deutlich den physiologischen zytotoxischen Effekt des Virus nach 48 hpi und bestätigen erneut die Funktionalität des Vektorsytems. 53 Ergebnisse Abb. 17: Rekombinanter WT-Virus ist zytotoxisch. FACS-Analyse nach 24 bzw. 48 Stunden. Die nach 24 hpi erfolgreich infizierten Zellen (LR) sind zu einem großen Teil nach 48 hpi PI positiv (UL+UR). 3.1.5 Die Wirkung der verschiedenen antiapoptotischen Proteine auf rSFV-induzierten Zelltod Zur Beantwortung der zentralen Fragestellung, welcher Todesweg und welche Caspasen bei SFV-induziertem Zelltod aktiviert werden, wurden WT-MEFs mit rekombinantem, folgende Transgene enthaltenden Virus infiziert: Humanes FADDdominant-negativ (DN), humane Caspase 9-DN, CrmA, Maus-Bcl-2, und XIAP. Die erfolgreiche Expression der Transgene konnte mit FACS-Analyse indirekt über GFP nachgewiesen werden (siehe Abb. 18). Da sowohl dem Transgen als auch dem Gen für GFP der gleiche zweigeteilte 26S Promotor vorgeschaltet ist, bestätigt die grüne Fluoreszenz gleichzeitig die erfolgreiche Expression des heterologen Gens. Zusätzliche Beweise lieferten die durchgeführten Immunfluoreszenzen und Westernblots. Wie bereits an früherer Stelle erwähnt, zeigten die Infektionen mit den verschiedenen antiapoptotischen Transgenen nach 24 hpi kaum Zelltod. Lediglich auf die Effizienz der Infektion kann anhand der ausgezählten Anzahl fluoreszierender Zellen geschlossen werden. Erst nach Ablauf weiterer 24 h zeichneten sich, abhängig von der Wirkung des mit Hilfe des Vektors rekombinant exprimierten Proteins, drastische Unterschiede hinsichtlich des Ergebnisse 54 Zelltodes ab. Mit rSFV/FADD-DN infizierte Zellen starben beispielsweise zu über 65% nach Ablauf von 48 hpi. Sie zeigten eine ähnliche Kinetik wie mit rSFV/WT infizierte Zellen. Die mit rSFV/XIAP infizierten Zellen zeigten hingegen 48 Stunden nach Infektion weiterhin über 70% infizierte gesunde Zellen und weniger als 10% PI-positive Zellen (siehe Abb. 18 und 19). Die auch nach 48 hpi weiterhin stabile Population GFP-positiver Zellen nach Infektion mit den Transgenen XIAP bzw. Bcl-2 deutet des weiteren darauf hin, dass der antiapoptotische Schutz nicht auf einer Hemmung der Virusreplikation beruht, da das Replikon immer noch repliziert und gleichzeitig GFP produziert wird, sondern dass die im Folgenden beschriebenen Transgene mit den Komponenten des durch rSFV aktivierten Todesweges interagieren und ihn inhibieren. Abb. 18 a) rSFV/WT 24 hpi Abb. 18 b) rSFV/WT 48 hpi Abb. 18 c) rSFV/FADD-DN 24 hpi Abb. 18 d) rSFV/FADD-DN 48 hpi 55 Ergebnisse Abb. 18 e) rSFV/Bcl2 24 hpi Abb. 18 f) rSFV/Bcl2 48 hpi Abb. 18 g) rSFV/XIAP 24 hpi Abb. 18 h) rSFV/XIAP 48 hpi Abb. 18: Die Wirkung der verschiedenen antiapoptotischen Proteine auf rSFV induzierten Zelltod konnte mittels FACS-Analyse verglichen werden. Während die verschiedenen FACS Ergebnisse nach 24 hpi noch sehr ähnlich sind, sind nach Ablauf von 48 hpi klare Unterschiede zu erkennen. Die hier beispielhaft abgebildeten FACS-Daten wurden anschließend unter Fokussierung auf den jeweiligen Anteil PI-positiver Zellen (UR+UL) quantitativ ausgewertet. 3.1.6 Vergleich der verschiedenen rekombinanten Proteine des intrinsischen und extrinsischen Aktivierungsweges Bei quantitativem Vergleich der antiapoptotischen Wirkung der verschiedenen Transgene untereinander und im Bezug auf die Infektion mit rSFV/WT (rekombinanter Virus ohne Transgen) stellte sich transgen exprimiertes XIAP als potentester Inhibitor heraus. Während nach Ablauf von 48 Stunden nach Infektion bei mit rSFV/WT infizierten Zellen 56,4% (±9,7%) der Zellen in der FACS-Analyse in die oberen Quadranten wanderten, also PI positiv (nekrotisch) waren, zeigten mit rSFV/XIAP infizierte Zellen Ergebnisse 56 eine Todesrate von 10,3% (±3,7%). Ähnlichen Schutz vor SFV induzierter Apoptose boten, wenn auch zu einem etwas geringeren Ausmaß, transgen exprimierte Caspase 9, CrmA sowie Bcl-2. Mit rSFV/FADD-DN infizierte Zellen hingegen starben vergleichbar wie die ohne Transgen infizierten Zellen (siehe Abb. 19). Diese Ergebnisse unterstreichen die entscheidende Rolle des intrinsischen (mitochondrialen) Todesweges und schließen gleichzeitig eine wesentliche Beteiligung des extrinsischen Aktivierungsweges nach SFV Infektion aus. 100 80 24 hpi 48 hpi 60 40 20 A rS FV /X IA P rm C rS FV / Bc l2 -D N rS FV /m e 9D rS FV /F A pa s as rS FV /C DD T rS FV /W m N 0 oc k Prozent toter Zellen (UR + UL) Infektion von MEF-3T9-Zellen mit rekombinantem Virus Virus-Rekombinanten Abb. 19: Antiapoptotische Proteine des intrinsischen Aktivierungsweges schützen vor rSFV induziertem Zelltod. Quantitative FACS-Auswertung rSFV induzierter Apoptose nach 24 und 48 hpi. Beim Vergleich der verschiedenen antiapoptotischen Proteine wird deutlich, dass die Konstrukte rSFV/Caspase 9-DN, mBcl2, CrmA sowie XIAP die Zellen vor Apoptose schützen, während sich rSFV/FADD-DN infizierte Zellen wie rSFV/WT infizierte Zellen verhalten. Ausgewertet wurden Infektionen bei denen über 70% der Ausgangszellen nach 24hpi erfolgreich infiziert waren. 57 Ergebnisse 3.1.7 Nachweis der rekombinanten Proteine durch WB und IF Zur Expressionskontrolle der mit dem Replikon in die Zielzellen eingeschleusten rekombinanten Proteine wurden Westernblots (siehe Abb. 20) und Immunfluoreszenzen (siehe Abb. 21) durchgeführt. Der verwendete monoklonale Flag-M5-Antikörper konnte durch Bindung an die Flag-Fusionsproteine (Flag-FADD-DN, Flag-XIAP, Flag-CrmA, Flag-Caspase 9-DN) alle in dieser Arbeit verwendeten rekombinanten Proteine markieren. Im Falle von mBcl-2 wurde mit einem spezifischen anti-mBcl-2-Antikörper gearbeitet. Die selben Antikörper wurden, in anderer Konzentration, zur Durchführung einer Immunfluoreszenz verwendet. Abb. 20: Nachweis der rekombinanten Proteine mittels Westernblot. Während zum Nachweis von mBcl-2 ein spezifischer anti-mBcl-2 Antikörper verwendet wurde, musste zum Nachweis der anderen rekombinanten Proteine, aufgrund des Fehlens von spezifischen Antikörpern, ein antiFlag-Antikörper verwendet werden. Bei Bcl-2 wurde neben der spezifischen Bande eine zusätzliche, wahrscheinlich durch Degradation hervorgerufene Bande detektiert. Für die Positivkontrolle wurden Bcl-2 überexprimierende Hela2-Zellen verwendet. 58 Abb. Ergebnisse 21: Immunfluoreszenzanalyse bestätigte eine erfolgreiche rSFV-Infektion und die Exprimierung der rekombinierten Proteine. Die mit rekombinantem pSFV2gensubGFP infizierten Zellen erscheinen grün, die rekombinant exprimierten Proteine sind mit anti-Flag und anti-Maus-Texasred rot markiert, die Zellkerne wurden mit Hoechst 33342 blau angefärbt. rSFV/WT wurde ebenfalls mit anti-Flag behandelt und dient als Negativkontrolle. Bei mBcl-2 wurde der spezifische Antikörper anti-mBcl-2 und anti-Maus-Texasred verwendet. Ergebnisse 59 3.1.8 rSFV Infektion ist caspasenabhängig Um die Bedeutung der Caspasen für den viral induzierten Zelltod zu bestätigen bzw. um eine eventuelle caspasenunabhängige Komponente zu untersuchen, wurden Versuche mit dem unspezifischen Caspaseninhibitor z-VAD.fmk durchgeführt. Die Zellen wurden eine halbe Stunde mit z-VAD.fmk vorinkubiert, infiziert und Zelltod anschließend per FACS quantifiziert. Die Ergebnisse zeigen, dass rSFV induzierter Zelltod mit Hilfe von Caspaseninhibitoren verhindert werden kann, also strikt caspasenabhängig ist (siehe Abb. 22). 100 80 60 - z-VAD.fmk 48 hpi + z-VAD.fmk 48 hpi 40 20 rS FV /C rS FV /W as T pa se rS 9FV D N /F AD D -D N rS FV /C rm A rS FV /X IA P 0 m oc k Prozent toter Zellen (UL + UR) z-VAD.fmk mit rekombinantem Virus 48 hpi Abb. 22: Infektion mit rekombinantem Semliki Forest Virus vermittelt einen caspasenabhängigen Zelltod (klassische Apoptose) in WT-MEFs, die durch z-VAD.fmk verhindert werden kann. rSFV-induzierter Zelltod nach 48 hpi mit und ohne den Caspaseninhibitor z-VAD.fmk. Auch nach 72 hpi findet bei Infektion mit den verschiedenen rekombinanten SFV-Viren unter den Caspaseninhibitoren z-VAD.fmk sowie Q-VD-OPh praktisch kein Zelltod statt. Im direkten Vergleich zeigt Q-VD-OPh eine minimal bessere Hemmung des 60 Ergebnisse caspasenvermittelten Zelltodes (siehe Abb.23). An der Negativkontrolle ist zu sehen, dass die Inhibitoren selbst keine zytotoxische Wirkung haben. 100 80 - z-VAD.fmk 60 + z-VAD.fmk 40 + Q-VD-Oph 20 oc k rS rS FV FV /C /W as T pa se rS 9FV D N /F AD D -D N rS FV /C rm A rS FV /X IA P 0 m Prozent tote Zellen (UR + UL) z-VAD.fmk/Q-VD-OPh 72 hpi Virus-Rekombinanten Abb. 23: Mit z-VAD.fmk und Q-VD-OPh inkubierte Zellen sind vor rSFV-induziertem Zelltod auch nach 72 hpi geschützt. Quantitative Auswertung der FACS-Analysen von parallel infizierten Wild-Typ-3T9-Mausembryofibroblasten (MEFs) mit z-VAD.fmk, Q-VD-OPh oder ohne Zugabe von Caspaseninhibitoren. 3.1.9 Apoptose nach Infektion mit nativem WT-SFV besitzt eine caspasenunabhängige Komponente In einem weiteren Versuch wurden Infektionen mit nativem WT-Virus durchgeführt. Die Inkubation mit Caspaseninhibitoren konnte in diesem Fall die infizierten Zellen zwar bis zu einem gewissen Punkt vor viral induziertem Zelltod schützen, ihn aber nicht in ähnlichem Ausmaß wie bei dem Virusvektorsystem verhindern. Diese Resultate weisen auf eine mögliche zusätzliche caspasenunabhängige Aktivierung der Apoptose bei nativer Virusinfektion hin (siehe Abb. 24). Ergebnisse 61 100 80 60 - z-VAD.fmk + z-VAD.fmk 40 20 i ru s W TV rS FV /W T 0 m oc k Prozent toter Zellen (UR + UL) Wildtypvirus - rekombinanter Virus Infektion 48hpi mit z-VAD.fmk Abb. 24: Während z-VAD.fmk vollständig vor rSFV induziertem Zelltod schützen kann, scheint der durch nativen WT-Virus induzierte Zelltod eine zusätzliche capasenunabhängige Komponente zu besitzen. Infektion von Wild-Typ 3T9 Mausembryofibroblasten (MEFs) mit rekombinantem WT-Virus und nativem WT-Virus. Im Vergleich der durch FACS-Analyse ermittelte Prozentsatz toter Zellen 48 hpi mit und ohne den Caspaseninhibitor z-VAD.fmk. Zur weiteren Untersuchung einer eventuellen caspasenunabhängigen Komponente wurden Infektionen unter vorangegangener Inkubation mit dem Serinproteaseinhibitor Pefabloc durchgeführt. Erstaunlicherweise konnten bei anschließender FACS- Auswertung keine GFP positiven Zellen nachgewiesen werden (siehe Abb.25). Verschiedene Erklärungen zu diesen Ergebnissen werden an späterer Stelle eingehend diskutiert. 62 Ergebnisse Abb. 25 a) rSFV/WT Abb. 25 b) rSFV/WT + Pefabloc Abb. 25 c) rSFV/CrmA Abb. 25 d) rSFV/CrmA + Pefabloc Abb. 25: Ergebnisse der quantitativen FACS-Analyse nach 30 hpi mit und ohne vorherige Inkubation der zu infizierenden Wild-Typ 3T9 Mausembryofibroblasten (MEFs) mit dem Serinproteaseinhibitor Pefabloc. Bei Verwendung von Pefabloc konnten keine GFP positiven Zellen nachgewiesen werden. Hier beispielhaft an rSFV/WT und rSFV/CrmA Infektion verdeutlicht. Ergebnisse 63 3.2 Ausweitung der Versuchsreihe auf andere Zelltypen 3.2.1 Caspase 9-defiziente MEFs In den nun folgenden Experimenten wurden Caspase 9 defiziente Maus-EmbryoFibroblasten (MEFs) mit rekombinantem Virus infiziert und eine Verlaufskurve der Todeskinetik zwischen 24 und 120 hpi gezeichnet. Die zentrale Rolle von Caspase 9 im SFV-induzierten intrinsischen Aktivierungsweg begründet die bei allen verwendeten rekombinanten Viruskonstrukten beobachtete, ausbleibende Einleitung der Apoptose. Noch nach 120 hpi zeigten die mit rSFV verschiedener Konstrukte infizierten Caspase 9KO-MEFs, eine stabile GFP-Expression und kaum Zelltod (siehe Abb. 26). Caspase 9, die zentrale Caspase des intrinsischen Weges, welche zusammen mit dem Adapterprotein Apaf1 und dem aus Mitochondrien freigesetzten Cytochrom C das Apoptosom bildet, wird demnach zum Ablauf des programmierten Zelltodes nach SFVInfektion unbedingt benötigt (siehe Abb. 26 und 27). Todeskinetik von Caspase 9-defizienten 3T9-MEFs Prozent tote Zellen (UL+UR) 100 80 mock rSFV/WT rSFV/Caspase 9-DN rSFV/FADD-DN rSFV/CrmA rSFV/XIAP 60 40 20 0 24 hpi 48 hpi 72 hpi 96 hpi 120 hpi Abb. 26: Fehlen der zellulären Caspase 9 verhindert rSFV-induzierten Zelltod. Todeskinetik von Caspase 9-defizienten 3T9 MEFs. Die quantitative Auswertung der FACS-Ergebnisse zwischen 24 und 120 hpi zeigt, dass zu allen Zeitpunkten weniger als 20% Zelltod stattfindet. Ergebnisse 64 3T9-WT-Zellen im Vergleich mit Caspase-9-KO- Zellen nach 48hpi 100 Prozent tote Zellen (UR + UL) 80 WT-MEF-3T9-Zellen 60 Caspase-9-KO-MEF3T9-Zellen 40 20 XI AP rS FV / rS FV / Cr m A N DD FA D rS FV / Ca sp as e 9D N W T rS FV / rS FV / m oc k 0 Virus-Rekombinanten Abb. 27: Caspase 9-defiziente 3T9 MEFs sind im Gegensatz zu Wild-Typ 3T9 MEFs vor Apoptose geschützt. Im Vergleich die durch FACS-Analysen ermittelten Anteile PI-positiver Zellen nach 48 hpi in Prozent. 3.2.2 Die Bedeutung von Bax und Bak in SFV-induzierter Apoptose In einem weiteren Experiment sollten die stromaufwärts der Mitochondrien agierenden proapoptotischen Bcl-2 Familienmitglieder Bax und Bak auf ihre Bedeutung in Bezug auf SFV-induzierten Zelltod untersucht werden. Hierzu wurden single-KO-Zelllinien für Bax und Bak, sowie eine Doppel-KO-Zelllinie (Bax/Bak-DKO) mit dem generierten rekombinanten Virus infiziert und mit parallel infizierten Wild-Typ-3T9-MEFs verglichen. Wie bereits beschrieben, sterben Wild-Typ-3T9-Mefs nach Infektion mit rSFV/WT. Nach einer Infektionszeit von 48 hpi sind ca. 55% der infizierten Zellen PI positiv. Unter den gleichen Bedingungen starben auch die Bax-KO-Zellen in vergleichbarem Maße. Nach 48 hpi hatten 60% der Bax-KO-Zellen aufgrund des Übergangs in sekundäre Nekrose ihre Membranintegrität eingebüßt und wurden PI positiv (siehe Abb. 28). Ergebnisse 65 Ein erstaunliches Ergebnis lieferte allerdings das Fehlen des integralen mitochondrialen Membranproteins Bak. Seine Abwesenheit bot Schutz vor viral induzierter Apoptose. Nach Ablauf von 48 hpi waren nur ca. 20% der infizierten Zellen PI positiv. Auch nach Ablauf von 72 hpi konnte dieses Ergebnis bestätigt werden. Ähnlich wie die BAK singelKO-Zellen verhielten sich auch die DKO Zellen. Der apoptotische Signalweg benötigt demnach spezifisch Bak, nicht aber Bax, um die apoptotische Information weiterzuleiten. Prozent tote Zellen (UR + UL) 100 80 60 mock rSFV/WT rSFV/XIAP 40 20 EF s W TM s Ba xKO -M EF s Ba kKO -M EF Ba x/ Ba kD KO -M EF s 0 Zellarten Abb. 28: BAK, nicht aber Bax, wird zum Ablauf von rSFV induzierter Apoptose benötigt. Auswertung der FACS-Ergebnisse der Infektion von Bax-KO, Bak-KO (singel-KO) und Bax/Bakdefizienten (DKO) MEFs im Vergleich zu WT-MEFs nach 48 hpi. Diskussion 66 4 Diskussion 4.1 Etablierung der Bedingungen für effiziente Virusproduktion Während der ersten erfolgreichen Versuche zur Herstellung von rekombinantem Virus zeigte sich zunehmend, dass sowohl die Ausbeute des Virus als auch die damit erzielten Infektionsraten für unsere Zwecke unzureichend waren. Um Aussagen über viral induzierten Zelltod und die Wirkung verschiedener rekombinanter Proteine auf diesen Vorgang machen zu können, legten wir Infektionsraten von mindestens 70% als Einschlusskriterium fest. Nur wenn zu Beginn der Infektionszeit über 70% der Zielzellen infiziert und gesund waren (rechter unterer Quadrant, LR) konnte von der Gesamtzahl PI-positiver Zellen nach 48 oder 72 hpi ein Rückschluss auf die antiapoptotische Wirkung des jeweiligen rekombinant exprimierten Proteins zugelassen werden. Um dieses Ziel zu erreichen, wurden nach und nach eine große Zahl verschiedener kritischer Schritte getestet und optimiert. Bereits die DNA-Produktion der viralen Vektoren pSFV2gensubGFP und pHelper2 und die Aufreinigung der Plasmid-DNA mit MIDI-Präp in Bakterien führte zu einem Problem. Die Ausbeute war viel zu gering und die Qualität der produzierten DNA mangelhaft. Zur Optimierung des Bakterienwachstums wurden diese in LB-Medium, TB-Medium und mit 8% Sucrose angereichertem LB-Medium bei 30° und 37° C über Nacht inkubiert. Als beste Kombination erwies sich LB-Medium bei 37°C, d ie Produktion blieb aber weiterhin unzureichend, vermutlich aufgrund eines während der Bakterienvermehrung stattfindenden Degradationsprozesses der viralen DNA. Das Problem konnte durch die Wahl eines geringeren Wachstumsvolumen (10 x 5 ml anstatt 50 ml) teilweise überwunden werden. Dennoch blieben die Erträge relativ gering was die Virusproduktion erheblich erschwerte. Auch war es nicht möglich gefrorene Bakterienstocks zu verwenden. Vor jeder viralen DNA-Produktion mussten die Plasmide frisch mittels Transformation in Bakterien eingebracht werden und am darauffolgenden Tag direkt von der Agarplatte gepickt und verwendet werden. Eine mögliche Erklärung dieser Schwierigkeiten liegt in dem Stressfaktor, den das Einschleusen viraler DNA für die Bakterien bedeutet. 67 Diskussion 4.2 Interpretation der Ergebnisse 4.2.1 Zelltod nach rSFV-Infektion - Beobachtung, Bedingung, Bedeutung Lange Zeit sah man den Grund des Zelltodes nach alphaviraler Infektion allein in der Hemmung der synthetischen und metabolischen Prozesse der Zelle begründet. Heute weiß man, dass SFV-induzierter Zelltod, wie auch bei einer Vielzahl anderer Viren auf Induktion von programmiertem Zelltod zurückzuführen ist [Glasgow et al. 1997; Razvi und Welsh 1995]. Die Ergebnisse dieser Arbeit bestätigen dies deutlich. Bei den durchgeführten FACS-Analysen migrierten die sterbenden Zellen allerdings nicht, wie zu Beginn erwartet, senkrecht vom unteren rechten (GFP positiv) zum oberen rechten Quadranten (GFP und PI positiv). Die Population PI positiver Zellen erschien vielmehr zwischen dem oberen Linken und oberen Rechten Quadranten. Bei Infektionsraten zwischen 70 und 100% (GFP positive Zellen nach 24 hpi) konnte der hohe Anteil der sich nach 48 hpi bei WT-Infektion in die beiden oberen Quadranten abbildenden Zellen nur von ursprünglich infizierten Zellen stammen. Desweiteren stimmte die Abnahme der GFP positiven, lebenden Zellen zwischen 24 und 48 hpi genau mit der Zunahme der Rate toter Zellen überein. Die Abnahme an GFP liegt vermutlich darin begründet, dass die Zellen nach der Apoptose relativ schnell in die sekundäre Nekrose übergehen, die Plasmamembran poröser wird und dadurch zytosolisches GFP aus der Zelle ausfließt. Eine andere Möglichkeit wäre, dass das GFP in der sterbenden Zelle proteolytisch abgebaut wird. Die stabile GFP Expression nach Transfektion mit eGFP und die auch nach 72 Stunden sichtbare grüne Fluoreszenz bei mit rSFV und wirksamen antiapoptotischen Proteinen infizierten Zellen lassen darauf schließen, dass weder die Halbwertszeit von GFP, noch die Hemmung der Virusreplikation eine Erklärung für den GFP-Verlust liefern kann. Zusammenfassend konnten wir aus der Interpretation der vorliegenden Ergebnisse schlussfolgern, dass MEFs effektiv durch rSFV-Infektion getötet werden und die sterbenden Zellen in diesem Zusammenhang GFP verlieren. Diskussion 68 4.2.2 Antiapoptotische Proteine, die mit dem intrinsischen Aktivierungsweg interagieren, schützen vor Apoptose Von zentralem Interesse in der vorliegenden Arbeit war die Untersuchung der molekularen Mechanismen rSFV- oder SFV induzierter Apoptose. Anhand der gewonnenen Ergebnisse konnten wir zeigen, dass heterolog exprimierte Proteine mit hemmender Wirkung auf den intrinsischen Aktivierungsweg (XIAP, Bcl-2, CrmA, Caspase 9-DN) vor rSFV-induzierter Apoptose schützen (siehe Abb. 19). Da die beobachtete, auch nach 72 Stunden stabile, GFP-Expression direkt mit der viralen RNAReplikation korreliert, konnte eine Hemmung der Virusreplikation als Grund für das Ausbleiben der Apoptose ausgeschlossen werden. Die getesteten antiapoptotischen Proteine konnten also nur durch ihre Interaktion mit dem intrinsischen Aktivierungsweg schützen. Aufgrund seiner hemmenden Wirkung auf die zentrale Caspase des intrinsischen Aktivierungsweges, Caspase 9, sowie auf Caspase 3 der gemeinsamen Endstrecke ist es nicht überraschend, dass XIAP sich als potentester Inhibitor erwies. Die Ergebnisse der Infektionen von rSFV mit dominant negativer Caspase 9 als Transgen, sowie die Infektionen von Caspase 9-KO-MEFs unterstreichen die zentrale Bedeutung von Caspase 9 bei SFV induziertem Zelltod. Die beobachtete antiapoptotische Wirkung von CrmA, einem viralen serpinähnlichen Proteinaseinhibitor mit hemmender Wirkung auf Caspase 1, Caspase 9, Caspase 8 sowie von Serinproteasen ist mit großer Wahrscheinlichkeit auf die Inaktivierung von Caspase 9 zurückzuführen. Die Hemmung von Caspase 8 des extrinsischen Weges kann, wie anhand der Ergebnisse mit rSFV/FADD-DN demonstriert, keine antiapoptotische Wirkung haben, da der extrinsische Weg nicht beteiligt ist. Caspase 1 hingegen könnte in SFV induzierter Apoptose involviert sein, was aber bislang noch nicht untersucht wurde. Heterolog exprimiertes Bcl-2 schützte ebenfalls effektiv vor viral induzierter Apoptose, auch wenn sich vor allem zu Beginn einige Schwierigkeiten in Bezug auf die Infektionsraten ergaben. Während bei Infektion mit den übrigen Transgenen fast alle Infektionsraten nach 24 hpi über 70% lagen, also verwertbar waren, lagen die Raten bei Infektion mit rSFV/Bcl-2 oft nur zwischen 40 und 60%. Eine mögliche Erklärung liegt in der für die Zelle toxischen Wirkung einer Bcl-2-Überexprimierung oder eventuell in einer Diskussion 69 Verlangsamung des Zellzyklus begründet [Borner 1996]. Auch eine Hemmung der viralen Replikation durch Bcl-2 könnte die schlechten Infektionsraten erklären [Hardwick und Bellows 2003]. Die Infektion mit rSFV/FADD-DN konnte den zytotoxischen Effekt der viralen Infektion nicht vermindern, was eine Beteiligung des extrinsischen, Todesrezeptor vermittelten Aktivierungsweges ausschließt [Krammer 2000]. 4.2.3 Inhibition der Apoptose durch z-VAD.fmk, Q-VD-OPh und Pefabloc Da unser viraler Vektor bereits GFP enthielt, war bei FACS-Analyse der Nachweis apoptotischen Zelltodes mittels GFP-Annexin-V Markierung nicht möglich. Außerdem erwies sich eine Analyse mit dem rot fluoreszierend markierten PE-Annexin-V als zu wenig sensitiv. So konnten unter PI Färbung ausschließlich sekundär nekrotische Zellen quantifiziert werden. Dies führte zu einer Unterschätzung der sich in Apoptose befindenden Zellen, da nur die Zellen markiert wurden, welche in einer späten Phase des Zelltodes mit bereits beginnender Membraninstabilität waren. Dadurch fehlte zunächst ein wichtiger Beweiß dafür, dass die Zellen wirklich apoptotisch mit anschließender sekundärer Nekrose und nicht, wie theoretisch auch vorstellbar, direkt nekrotisch starben. Zusätzliche Versuche zeigten, dass z-VAD.fmk rSFV-induzierten Zelltod verhindern kann. Somit ist dieser Vorgang strikt caspasenabhängig, das heißt apoptotisch. Morphologische Veränderungen nach rSFV Infektion wie Zellschrumpfung, Blebbing und Kern-fragmentierung bestätigten zusätzlich, dass dieser Zelltod eine Apoptosephase durchläuft. Ein interessantes Ergebnis zeigte die parallel durchgeführte Infektion mit dem nativen WT-Virus. Hier konnten weder z-VAD.fmk noch Q-VD-OPh den einsetzenden Zelltod vollständig verhindern. Der nur partielle Schutz lässt auf eine weitere caspasenunabhängige Komponente des Zelltodes nach Infektion mit nativem WT-Virus schließen. Da im Unterschied zum nativen WT-Virus die rekombinanten SFV-Viren keine Strukturproteine bilden, könnte es sein, dass der caspasenunabhängige Zelltod durch die Expression dieser Proteine zustand kommt. Diese Strukturproteine werden in großen Mengen im Lumen des ER produziert und verursachen dadurch einen Stress des ER, welcher einen solchen caspaseunabhängigen Todesweg auslösen könnte. Diskussion 70 Künftige Experimente mit einer Kombination von ER-Stress und rSFV Infektion werden zeigen, ob dabei der rSFV induzierte Zelltod eine caspasenunabhängige Komponente aufweist. Unser Labor konnte kürzlich zeigen, dass ER-Stress induzierte, caspasenunabhängige Apoptose durch Serinproteasen vermittelt wird [Egger et al. 2003]. Sich anschließende Versuche mit dem Serinproteaseinhibitor Pefabloc sollten klären, ob es sich bei der caspasenunabhängigen Komponente nach Infektion mit nativem WT-Virus auch um eine Serinprotease handeln könnte und welche Rolle diese Protease bei Infektion mit dem viralen Vektorsystem spielte. Die hierzu mit rekombinantem Virus infizierten Zellen zeigten aber weder nach 24 noch nach 48 hpi GFP positive Zellen. Daraus lässt sich ableiten, dass entweder keine Replikation des rekombinanten Virus stattfand oder die mit dem Serinproteaseinhibitor vorbehandelten Zellen gar nicht infiziert werden konnten. Der WT-Virus kodiert selbst für eine Serinprotease (Kapsid), die das Strukturpolyprotein schneidet. Diese Serinprotease fehlt dem rSFV, weil Kapsid so wie auch Strukturproteine gar nicht genomisch exprimiert werden. Folglich sollte die Replikation von rSFV nicht von einer Serinprotease abhängen. Da aber, wie durch das Fehlen GFP positiver Zellen bestätigt, keine virale Replikation stattfand, könnte eine Serinprotease in der viralen Replikation eine entscheidende Rolle spielen, oder dieser sogar vorgeschaltet sein. Weitere Versuche werden zeigen, ob die Wirtszelle mit einer Serinprotease zur Replikation des Virus beiträgt, oder ob Pefabloc unspezifisch die Cysteinprotease-Aktivität von nsp2 hemmen könnte. 4.2.4 Untersuchung der Bax/Bak-KO-MEFs mit rSFV 4.2.4.1 Bak, nicht aber Bax wird zur viral induzierten Apoptose benötigt Über die genauen Wirkmechanismen der multimeren proapoptotischen Mitglieder der Bcl-2 Familie Bax und Bak wird noch immer viel diskutiert. Einer weitverbreiteten Meinung nach triggern beide Proteine den mitochondrialen Todesweg durch Perforation der äußeren mitochondrialen Membran, was zur Freilassung der im Intermembranspalt befindlichen Proteine, wie z.B. Cytochrom C, ins Zytosol führt. Auf welche Art und Weise jene durchlässigen Bereiche entstehen wird kontrovers diskutiert. Bax, das vorwiegend Diskussion 71 als zytosolisches Monomer vorliegt und erst nach Aktivierung oligomerisiert und mit der mitochondrialen Membran interagiert, formt entweder selbst Poren oder bildet diese mit bereits in der Membran vorhandenen spannungsabhängigen Anionenkanälen (VDAC). Desweiteren wird eine Matrixschwellung mit anschließender Ruptur der Membran diskutiert [Antonsson 2001]. Mindestens eines der beiden proapoptotischen Proteine Bax und Bak ist für den Ablauf des intrinsischen Todesweges der Apoptose unbedingt nötig. Während Bax- als auch Bak-KO-Mäuse lebensfähig sind, ist bei Doppel-KO-Mäusen der Phänotyp durch mangelnde Apoptose während der Embryonalentwicklung (interdigitale Häute, unperforierter Vaginalkanal oder Überangebot an hämatopoetischen Zellen) gezeichnet und die Tiere sterben kurz nach ihrer Geburt [Lindsten et al. 2000]. Desweiteren sind Zellen dieser Mäuse vollständig vor UV-, Staurosporin-, oder Etoposid-induziertem Zelltod geschützt [Wei et al. 2001]. Diese Ergebnisse lassen vermuten, dass wenigstens eines dieser proapototischen Bcl-2 Familien Mitglieder benötigt wird, um auf verschiedene Todessignale zu reagieren, und dass ausschließlich die Abwesenheit beider Proteine den Ablauf der Apoptose verhindern kann. Die von uns erzielten Ergebnisse zeigen aber klar, dass SFV-induzierter Zelltod rein Bak-, nicht aber Bax-abhängig ist. Das Fehlen von Bak zeigte in den von uns mit dem rekombinanten Virus durchgeführten Versuchen an KO-Zelllinien einen ebenso deutlichen Schutz vor Apoptose wie das Fehlen beider Proteine. Die Bax-KO-MEFs verhielten sich hingegen wie die parallel infizierten WT-MEFs. Diese Ergebnisse zeigen zum ersten Mal, dass bei der Wirkung von Bax und Bak keine vollständige Überschneidung vorliegt, sondern eine SFV-Infektion spezifisch das Membranprotein Bak aktiviert, welches dadurch, nach einer Konformationsänderung, zur Permeabilisierung der äußeren Mitochondrienmembran führt und über Cytochrom CFreisetzung und Bildung des Apoptosoms die Apoptose einleitet. Diskussion 72 4.3 Klinischer Ausblick 4.3.1 Probleme und Fortschritt bei der Verwendung viraler Vektoren Die turbulente Geschichte der Gentherapie ist seit ihrem Beginn von großen Hoffnungen und ebenso großen Enttäuschungen geprägt. Die revolutionäre neue Technologie die eine Heilung fast aller Krankheiten versprach, enttäuschte den vorschnellen Enthusiasmus. 1999 starb ein 18-jähriger Patient an den Folgen einer adversen Immunreaktion gegen den adenoviralen Vektor, welcher ihm das partiell fehlende OTCGen (Ornithin Transcarbamylase-Gen) liefern sollte.[Anonymous 2002; Marshall 1999] Das Hauptproblem stellten die in diesem Zusammenhang verwendeten viralen Vektoren und deren Interaktion mit dem humanen Immunsystem dar. Als eine mögliche Ursache des fulminanten Verlaufes wurde später eine eventuell vorbestandene Exposition mit dem WT-Virus diskutiert, die das Immunsystem dieses Patienten für den Vektor sensibilisiert hatte [Bostanci 2002]. Bereits ein Jahr später konnten erste durchschlagende Erfolge in der Heilung von Kinder verzeichnet werden, die unter schwerer kombinierter Immundefizienz („SCID“) litten. Nach Reinfusion von ex vivo, mittels MLV-Vektor transduzierten hämatopoetischen Stammzellen entwickelten die Kinder ein funktionelles Immunsystem [Cavazzana-Calvo et al. 2000]. In 2 der 11 Fälle kam es aber nachfolgend zu einer leukämieähnlichen Erkrankung [Hacein-Bey-Abina et al. 2003]. Es wird vermutet, dass der Grund der aufgetretenen Entartung in der Integration des Retrovirus in die Promotorregion eines leukämischen Onkogens (LMO) mit einer darauffolgenden Expression und Aktivierung dieses Onkogens lag [Check 2002; Kaiser 2003]. Die hier aufgeführten Beispiele zeigen deutlich, wie wichtig ein fundiertes Verständnis der molekularen Abläufe in der infizierten Zelle ist und welche Gefahren von einem an Sicherheit mangelnden Vektorsystem ausgehen. In den letzten Jahren wurden deshalb eine große Zahl von potentiellen Vektoren basierend auf verschiedenen Viren für den Einsatz in der Gentherapie untersucht. Neue Erkenntnisse in diesem Bereich ermöglichten so die Entwicklung spezifischerer, Diskussion 73 sichererer und effizienterer Vektoren. Im Folgenden soll auf die verschiedenen Arten von alphaviralen Vektoren, deren Sicherheitsmerkmale und ihre möglichen Einsatzgebiete eingegangen werden. 4.3.2 Vorstellung der verschiedenen SFV-Vektorsysteme sowie ihrer Vor- und Nachteile Ein genereller Vorteil in der Verwendung alphaviraler Vektoren liegt im milden Verlauf der Infektion des Menschen mit dem WT-Virus sowie der geringen Durchseuchungsrate der Bevölkerung [Strauss und Strauss 1994]. Alphaviren integrieren sich zudem nicht in das Genom der Zielzelle (im Gegensatz zu Retroviren), und die viralen Proteine werden nur über kurze Zeit exprimiert. Dadurch lassen sich künstlich herbeigeführte Infektionen leichter steuern. Zur Herstellung des Expressionsvektors verwendeter attenuierter Virus wurde mit zusätzlichen Sicherheitsstufen versehen, um Rekombination und unkontrollierte Virusvermehrung zu vermeiden. Der in der vorliegenden Arbeit verwendete Plasmid-Vektor ist der am häufigsten experimentell verwendete Vektortyp. Wie bereits beschrieben wird bei dieser Art eines Vektors nur die Replikon-RNA, nicht aber die Helfer-RNA als Genom in die rSFVPartikel verpackt. Diese Eigenschaft macht den generierten Virus proliferationsdefizient, so dass die virale Infektion selbstlimitierend und daher wenig gefährlich ist [Berglund et al. 1993]. Replikationskompetente Vektoren, bei denen das gesamte Genom verpackt wird, bieten, auf Kosten eines erhöhten Sicherheitsrisikos, den Vorteil nach einer ersten Infektion auch Nachbarzellen infizieren zu können. Eine weitere Möglichkeit stellt die Verwendung von DNA-basierten Vektoren dar. Anstelle der teuer in vitro transkribierten SFV-RNA wird eine virale cDNA unter Verwendung eines eukaryotischen RNA-Polymerase2-Promotors (wie z.B. der CMVPromotor) in die Zielzelle transfiziert. Die zelluläre RNA-Polymerase2 übernimmt anschließend die Transkription des SFV-Replikon-Vektors. Die hohe Sicherheit dieses Systems ist in der vollständigen Abwesenheit von Helfer-RNA bzw. Strukturproteinen begründet, und wird deshalb bei in vivo-Einsätzen favorisiert. 74 Diskussion Um die Wahrscheinlichkeit homologer Rekombination, die zu replikationsfähigem Virus führen könnte, stärker zu senken, wurde ein Zwei-Helfer-System entwickelt, bei dem Kapsid- und Hüllproteine auf zwei unterschiedlichen Helfer-Vektoren platziert wurden [Smerdou und Liljestrom 1999]. Ein anderer Ansatz ist die Entwicklung spezieller Zelllinien zur Verpackung und kontrollierten Produktion von Alphaviren [Polo et al. 1999]. Neben der stetigen Verbesserung der Sicherheit der viralen Vektor-Systeme arbeitet man zur Zeit auch an der Entwicklung eines weniger zytotoxischen Vektorsystems. Punktmutationen im nsP2-Gen reduzierten signifikant die Zytotoxizität und erweiterten so entscheidend das Einsatzgebiet der rekombinanten viralen Vektoren [Lundstrom et al. 2003]. 4.3.3 Optionen der therapeutischen Verwendung von SFV-Vektoren Wichtige therapeutische Ziele sind die Verwendung von SFV- oder SIN-Vektoren in der Gentherapie und als Vakzine. 4.3.3.1 Anwendung in der Gentherapie Die starke zytotoxische Wirkung von nativem WT-SFV und rekombinantem SFV machen den Vektor zu einem vielversprechenden Werkzeug in der Tumortherapie. Intratumorale Injektion von SFV in SFV-sensitive humane Prostatatumore führte im Tiermodell zu eindrucksvollem Substanzverlust des bestehenden Tumors und in einigen Fällen sogar zu vollständiger Remission [Loimas et al. 2001]. Eine Verstärkung der zytotoxischen Wirkung von SFV durch heterologe Expression des proapoptotischen Proteins Bax konnte das Wachstum von Bcl-2 überexprimierenden AT3 Tumoren in immunsupprimierten Mäusen verhindern [Murphy et al. 2001]. In einer weiteren Studie wurde ein die murinen IL-12 Untereinheiten p40 und p35 exprimierender Vektor in Maus-B16 Melanome injiziert, was durch Hemmung der Blutgefäßbildung einer Weiterentwicklung des Tumors entgegenwirkte. Die Effizienz der Behandlung konnte durch wiederholte Injektionen verbessert werden, ohne dass eine Immunreaktion ausgelöst wurde [Asselin-Paturel et al. 1999]. Diskussion 75 In einem ähnlichen Therapieansatz führte die antiangiogenische Wirkung von heterologem mittels rSFV exprimiertem Endostatin in Gehirntumoren durch Verminderung der Tumorvaskularisierung zur Reduktion der Tumormasse [Yamanaka et al. 2001]. 4.3.3.2 Anwendung bei Impfung und Immunisierung Während man sich in der Gentherapie den zytotoxischen Effekt von SFV und rSFV auf die Zielzelle, z.B. zur Bekämpfung von Tumoren zu Nutzen macht, so ist er bei Generierung neuer Vakzine mittels viralen SFV-Vektoren eher ein limitierender Faktor. Zumeist benötigt man an solcher Stelle eine verminderte Zytotoxizität um eine verlängerte transgenische Expression des Antigens und ein verlängertes Überleben der infizierten Zelle zu garantieren. Hierzu sind neue weniger zytotoxische SFV-Vektoren in Erprobung. Eine weitere Möglichkeit bietet, wie auch in der vorliegenden Arbeit beschrieben, die Verwendung von Vektorsystemen, die neben dem Antigen eine antiapoptotische Sequenz wie z.B. XIAP oder Bcl-2 enthalten [Kim et al. 2004]. Generell eignen sich alphavirale Vektoren sehr gut zur Generierung von Impfstoffen. Vor allem die bereits vorgestellte Gruppe der DNA-basierten Vektoren bietet eine Reihe wichtiger Vorzüge. Im Gegensatz zu den sonst verwendeten Adeno- bzw. PockenvirenVektoren findet sich in der Bevölkerung keine vorbestehende Immunität gegen SFV. Das Fehlen von Strukturproteinen verhindert zusätzlich eine Immunantwort gegen den verwendeten Vektor was eine Mehrfachverwendung des Impfstoffes ermöglicht. Trotz intensiver Studien konnte die hohe Effektivität dieses Systems bisher nicht abschließend geklärt werden. Die Auswirkungen des von Virus induzierten apoptotischen Umbaus der Wirtszelle wird kontrovers diskutiert. Die eine Seite sieht einen Vorteil in der antiviralen Antwort der Wirtszelle sowie in der Aktivierung proapoptotischer Faktoren, da auf diese Weise die Aktivität von antigenpräsentierenden Zellen und generell die Immunantwort gestärkt wird [Leitner et al. 2003]. Die andere Seite sieht vielmehr einen Vorteil in der Einschleusung antiapoptotischer Faktoren um ein längeres Überleben der antigenpräsentierenden Zelle zu ermöglichen [Kim et al. 2004]. 76 Diskussion 4.3.4 Schlussfolgerung Ein besseres Verständnis der in der infizierten Zelle ablaufenden molekularen Mechanismen ist die Voraussetzung für eine Anpassung des SFV basierten Vektorsystems an neue experimentelle und eventuell bald auch therapeutische Verwendungszwecke. Je besser die durch diesen Vektor induzierten Signalwege verstanden werden, desto größer wird deren Nutzen, desto kleiner die Nebenwirkungen und kalkulierbarer die Gefahren sein. Die bisher häufig als nachteilig angesehene Zytotoxizität könnte sich in Zukunft als äußerst nützliches Instrument erweisen und die Einsatzmöglichkeiten der SFV basierten Vektorsysteme weiter ausdehnen. 77 Zusammenfassung 5 Zusammenfassung Programmierter Zelltod (Apoptose) wird vorwiegend über zwei Signalwege reguliert, einen von Todesrezeptoren vermittelten, extrinsischen und einen über Mitochondrien laufenden, intrinsischen Weg. Der Alphavirus SFV, ein plusstrang-RNA Virus, induziert in Zellkultur Apoptose. Die zu Grunde liegenden molekularen Mechanismen sowie der genaue Aktivierungsweg des Virus sind jedoch noch unklar. Zu deren Untersuchung wurde ein auf SFV basierendes Vektorsystem verwendet, in dem der Vektor als physiologischer Todesstimulus und gleichzeitig als Expressionsvektor zur Einbringung heterologer Proteine dient. Mit diesem System wurden heterologe Proteine mit antiapoptotischer Funktion (XIAP, Bcl-2, CrmA) und dominant interferierender Mutanten (FADD-DN, Caspase 9-DN) in Zielzellen (MEFs) eingeschleust, funktionell exprimiert und ihre Wirkung auf SFV induzierte Apoptose untersucht. Es konnte gezeigt werden, dass diejenigen Proteine vor Apoptose schützen, welche durch Interaktionen den intrinsischen Aktivierungsweg hemmen. Als potentester Inhibitor der mittels SFV-Vektor induzierten Apoptose zeigte sich XIAP, ein Protein mit inhibitorischer Wirkung auf die Schlüsselcaspase des intrinsischen Weges, Caspase 9, sowie auf Caspase 3. Heterologe Exprimierung des Adapterproteins FADD-DN des extrinsischen Aktivierungsweges hingegen bot keinerlei Schutz vor Apoptose. Zusätzliche Versuche mit Caspase 9-KO-Zelllinien bestätigten die Bedeutung des intrinsischen Aktivierungsweges für SFV induzierte Apoptose. Abschließend sollte die Frage geklärt werden welche der durch SFV-Infektion angeworfenen Signalwege stromaufwärts der Mitochondrien eine Rolle spielen. Hierzu wurden KO-Zelllinien der proapoptotischen multimeren Proteine Bax und Bak, sowie Doppel-KO-Zellen mit rekombinantem SFV infiziert. Es konnte gezeigt werden, dass Bak, nicht jedoch Bax zur Einleitung der viral induzierten Apoptose benötigt wird. Mit den vorliegenden Resultaten lässt sich ein Aktivierungsschema konstruieren, bei dem SFV über das integrale Membranprotein Bak durch Cytochrom C-Freisetzung zu einer Aktivierung des intrinsischen Weges mit der Schlüsselcaspase des Apoptosoms, Caspase 9, führt und im Folgenden über die Caspase 3 der gemeinsamen Endstrecke Apoptose induziert. 78 Anhang 6 Anhang 6.1 Literaturverzeichnis Adams, Jerry A. und Cory, Suzanne (1998). The Bcl-2 protein family: arbiters of cell survival. Science 281: S. 1322-1326. Alberts, B., Johnson, A., Lewis, J., Raff, M., Roberts, K. und Walter, P. (2002). 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Zou, H., Li, Y., Liu, X. und Wang, X. (1999). An APAF-1.cytochrome c multimeric complex is a functional apoptosome that activates procaspase-9. J Biol Chem 274(17): S. 11549-56. Anhang 86 6.2 Lebenslauf Name Sara Maerz Anschrift Sandmühlweg 8 55124 Mainz Studienanschrift Langackerweg 7 79115 Freiburg Geboren am 30.10.1979 in Mainz Schulbildung 1986- 1990 Maler-Becker-Grundschule, Mainz-Gonsenheim 1990- 1999 Gymnasium Mainz-Gonsenheim 1999 Abitur in der „section bilingue“ Studium Seit Wintersemester 1999/2000 Studium der Humanmedizin an der Albert-LudwigsUniversität Freiburg im Breisgau SS 2001 Aufnahme als Stipendiatin in das Ev. Studienwerk e.V., Villigst WS 2002/2003 bis SS 2003 Studium mit einem Erasmus-Stipendium an der Medizinischen Fakultät der Universidad de Salamanca, Spanien Seit März 2004 Experimentelle Doktorarbeit am Institut für Molekulare Medizin, Freiburg Famulaturen 2002 Hospital San Juan de Dios (Santiago de Chile) 2003 Hospital Universitario (Salamanca) 2004 Centre Hospitalier Universitaire (Fort-de-France) Anhang 87 Danksagung Mein herzlicher Dank gilt Prof. Dr. C. Borner für die Überlassung des interessanten Themas, für viele hilfreiche Impulse während des Experimentierens, für seine Begeisterungsfähigkeit und seinen Optimismus, und vor allem für die gute Betreuung beim Schreiben der Arbeit. Danken möchte ich PD Dr. O. Opitz für die spontane und unkomplizierte Übernahme des Zweitgutachtens. Ein ganz besonderer Dank geht an meine Betreuerin Dr. Céline Rhême für die gute Einarbeitung, die umfassende Betreuung im Labor, für die kompetente Beratung bei den Experimenten und für die Zeit und Geduld bei der Beantwortung all meiner Fragen. Un grand merci pour tout! Vielen Dank, thank you, merci beaucoup, muchas gracias und gesamte Arbeitsgruppe Borner: an die Dr. Lotti Egger für Ratschläge und Hilfe bei der IF und für die Schweizer Schokolade. Anand Manoharan für die tatkräftige Unterstützung beim Westernblot und die kulinarischen Höhepunkte beim Weinseminar. Dr. David Grubb, für die Rettung bei diversen Computerproblemen. Goretti Saumell i Puig und Irina Pleines, für ihre immerwährende gute Laune und die nette Zeit in und außerhalb des Labors. Karin Neubert, der guten Seele des Labors, fürs Zuhören und die gute Gesellschaft. Bärbel Schätzle nicht nur für die spannende Stadtführung. Kristine Faulhaber für die geduldige Einweisung in die DNA-Präparation. Irene Bayer, Aneta Kovacs, Christin Urban, Karen Schrader und Dorothée Walter Wolfgang Sevenich möchte ich für sein Verständnis für entnervte Doktorandinnen und ihre Computerprobleme und für seinen selbstlosen, stundenlangen Beistand bei Formatierungen, Probedrucken und Bildbearbeitungen ganz besonders danken. Nicht zuletzt danke ich von ganzem Herzen meiner Familie, meinem Freund Felix, meinen Mitbewohnern und meinen Freunden, auf die ich immer zählen kann.
