Apoptose als Ursache des durch das Rötelnvirus induzierten

Apoptose als Ursache des durch das Rötelnvirus induzierten
zytopathischen Effektes
M.W. Pletz1, J. Hofmann2, U.G.Liebert 2
1Pneumologie I (Infektiologie und Immunologie), Zentralklinik E.v.Behring / Lungenklnik Heckeshorn, Berlin; 2 Institut für Virologie, Universität Leipzig
Einleitung
A
Das Rötelnvirus (RV) verursacht die gleichnamige, häufig mit
einem Exanthem einhergehende Kinderkrankheit.
Die klinische Relevanz des RV beruht jedoch vor allem auf seiner
Teratogenität (Kongenitales Rötelnsyndrom), deren Pathomechanismus bis heute weitgehend ungeklärt ist. In den infizierten
fetalen Organe findet sich eine deutlich reduzierte Zellzahl.
Neben einer bislang diskutierten, viral induzierten Wachstumshemmung kommt eine Dysregulation der Organogenese durch
Apoptose oder Nekrose in Betracht.
Ziel der vorliegenden Arbeit war es, den durch das Rötelnvirus
verursachten Zelltod in vitro zu untersuchen und beteiligte
Faktoren zu identifizieren.
M
m
RV
B
Abb . 2
DNA-Gelelektrophorese
M
A: Mock infizierte (m) und RV infizierte
Verozellkultur (RV).
B: Zellen aus Zellrasen (RVl) und abgelöste Zellen aus dem Überstand (RVs)
einer RV infiziertenVerozellkultur.
(M) 100bp Marker.
A
RVs
RVl
B
Abb. 3
Annexin V Färbung
(A) Phasenkontrast (Vergrößerung 40fach)
und (B) fluoreszenzmikroskopische Darstellung einer apoptotischen Zelle nach
AnnexinV-FITC Markierung
Ergebnisse
Apoptose von akut RV infizierten Zellen
Verozellen, die mit verschiedenen RV-Stämmen infiziert wurden
(multiplicity of infection =1), zeigen 48 bis 72 h post infectionem
(p.i.) einen charakteristischen zytopathischen Effekt (CPE). Die
Zellen runden sich ab und lösen sich nach Volumenreduktion aus
dem Zellrasen (Abb.1).
A
2. dpi
4. dpi
Zellentyp
Apoptose
6. dpi
ECV 304
HFF
U 937
Hep 2
61%
58%
24%
23%
6. dpi
Abb. 1 CPE
Abb. 4 Flowzytometrische Quantifizierung apoptotischer Zellen
Mock - (A) und RV
infizierte Vero Zellen
(B) am 6. Tag p.i.
Anteil apoptotischer Zellen (SubG1) in infizierten Verozellen am 2., 4. und 6. Tag p.i. und Anteil
apoptotischer Zellen inverschiedenen infizierten humanen Zellinien am 6. Tag p.i. (Tabelle)
B
Parallel zu diesen, für Apoptose typischen, morphologischen
Veränderungen konnte durch Propidiumjodidfärbung die
Chromatinkondensation und mittels TUNEL-Test und DNAGelelektrophorese (Abb. 2A) die Fragmentierung der zellulären
DNA nachgewiesen werden (apoptotic laddering). Die separate
Analyse von Zellrasen und Überstand infizierter Kulturen zeigte,
daß es sich bei den apoptotischen Zellen um die oben
beschriebenen abgelösten Zellen handelt (Abb. 2B). Ein früher
Marker
der
Apoptose,
die
Externalisierung
von
Phosphatidyserin, das sich bei vitalen Zellen nur auf der
Innenseite der Zellmembran findet, wurde mit FITC-markierten
Annexin V (Abb. 3) detektiert.
Die quantitative Erfassung der apoptotischen Zellen erfolgte
flowzytometrisch. Hier fand sich ein im zeitlichen Verlauf der
Infektion ansteigender Anteil der apoptischen SubG1 Population
( Abb. 4) bis 58 % am 6. Tag p.i.
Diese Ergebnisse ließen sich an akut infizierten humanen diploiden Zellen (Hep2, ECV 304, U 937, humane Vorhautfibroblasten) in unterschiedlichem Ausmaß reproduzieren (Abb. 4)
Zusammenhang zwischen Apoptose und Viruslast
Die Abhängigkeit der Apoptose vom Virustiter wurde in dafür
etablierten, persistent infizierten Verozellen untersucht. Diese
Zellen wurden nach akuter Infektion einmal wöchentlich
passagiert und die Viruskonzentration im Überstand über ein
Jahr verfolgt. Das Absinken der Viruskonzentration im
Überstand ging mit einer Abnahme der Anzahl apoptotischer
Zellen einher.
Einfluß der viralen Strukturproteine
Verozellen wurden stabil mit der subgenomischen 24S RV RNA
transfiziert. Trotz einer nachgewiesenen Expression der
Strukturproteine C, E1 und E2 in > 90% der Zellen, wurde keine
erhöhte Apoptoserate gemessen.
Untersuchungen zum Mechanismus
Adhäsionsprozeß: Weder UV-inaktivierte Viren noch Rubella like
Particles (Viruspartikel ohne RNA), die zur Adhäsion befähigt sind,
jedoch nicht replizieren, konnten in Zellkulturen Apoptose induzieren.
Parakrine Faktoren: Aus dem Überstand infizierter Zellkulturen wurden
durch Ultrafiltration (Ausschlußgröße 50 kD) RV depletiert. Zytokine
(Molekulargewicht bis 30 kD) wurden bei dieser Prozedur nicht entfernt.
Das Ultrafiltrat induzierte in naiven Zellkulturen keine Apoptose.
Apoptoseregulierende Proteine: Zwischen mock, akut und chronisch
infizierten sowie 24S transfizierten Zellen zeigten sich für p53, Bax, Bcl2 und Bcl-XL im Westernblot keine Unterschiede im Expressionsniveau.
Zusamenfassung
•Unsere Untersuchungen zeigen, daß dem durch das Rötelnvirus
verursachten zytopathische Effekt eine Apoptoseinduktion zugrunde liegt,
die im zeitlichen Verlauf der Infektion zunimmt und von der Viruslast
abhängt.
•Wir fanden keinen Hinweis auf eine direkte Beteiligung viraler
Strukturproteine oder parakriner Faktoren. Da weder inaktivierte Viren
noch Rubella like Particles in der Lage sind Apoptose zu induzieren, muß
die aktive Virusreplikation essentielle Vorraussetzung sein.
•Eine Beeinflussung der Expression von p53, Bax, Bcl-2 und Bcl-XL
durch das Rötelnvirus konnte nicht nachgewiesen werden.
•Diese Ergebnisse sind nicht nur auf Verozellen beschränkt, sondern
ließen sich in allen untersuchten humanen Zellen reproduzieren.
Da Apoptose ein wichtiger Prozeß der Organogenese ist, kann eine
Bedeutung der in vitro beobachteten viralen Apoptoseinduktion für
die Pathogenese des Kongenitalen Rötelnsyndroms nicht
ausgeschlossen werden.