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Funktionelle und strukturelle
Charakterisierung von Varianten des
respiratorischen Komplex I
INAUGURALDISSERTATION
zur Erlangung des Doktorgrades
der Fakultät für Chemie und Pharmazie
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg
vorgelegt von
Diplom-Chemikerin
Klaudia Morina
aus Freiburg
Freiburg im Breisgau, 2014
Vorsitzender des Promotionsausschusses:
Prof. Dr. Thorsten Koslowski
Referent:
Prof. Dr. Thorsten Friedrich
Korreferent:
Datum der mündlichen Prüfung:
Prof. Dr. Oliver Einsle
02.04.2014
Teile der in dieser Arbeit vorgestellten Ergebnisse wurden in folgenden Artikeln
veröffentlicht:
Morina, K., Schulte, M., Hubrich, F., Dörner, K., Steimle, S., Stolpe, S., und Friedrich, T.
(2011). Engineering the Respiratory Complex I to Energy-converting NADPH:Ubiquinone
Oxidoreductase. J. Biol. Chem. 286, 34627–34634.
Birrell, J.A., Morina, K., Bridges, H.R., Friedrich, T., und Hirst, J. (2013). Investigating the
function of [2Fe-2S] cluster N1a, the off-pathway cluster in complex I, by manipulating its
reduction potential. Biochem. J. 456, 139–146.
per Nurijen dhe Salihin
Inhaltsverzeichnis
1
Zusammenfassung ........................................................................................ 1
2
Einleitung ...................................................................................................... 4
3
2.1
Die aerobe Atmungskette von Escherichia coli ....................................................... 4
2.2
Die NADH:Ubichinon Oxidoreduktase ................................................................... 6
2.3
Elektronentransfer im Komplex I .......................................................................... 10
2.4
Die Fe/S-Zentren N1a und N7 ................................................................................ 13
2.5
Die NADH-Bindestelle des Komplex I ................................................................... 18
2.6
λ-Red vermittelte Rekombination .......................................................................... 23
2.7
Ziel der Arbeit .......................................................................................................... 26
Material und Methoden ............................................................................. 28
3.1
Chemikalien ............................................................................................................. 28
3.2
Stämme ..................................................................................................................... 31
3.2
Verwendete Vektoren .............................................................................................. 31
3.3
DNA-Oligonukleotide .............................................................................................. 35
3.4
Medien, Lösungen und DNA-modifizierende Enzyme ......................................... 38
3.4.1
Nährmedien ........................................................................................................ 38
3.4.2
Antibiotika-Lösungen ......................................................................................... 40
3.4.3
Lösungen und Puffer für die Molekularbiologie ................................................ 40
3.4.4
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Western Blot ................................ 40
3.4.5
Puffer und Lösungen für die Proteinbiochemie ................................................. 42
3.4.6
DNA-modifizierende Enzyme ............................................................................ 44
3.5
Mikrobiologische Methoden ................................................................................... 45
3.5.1
Bestimmung der optischen Dichte ..................................................................... 45
3.5.2
Vorkulturen ........................................................................................................ 45
3.5.3
Glycerin-Dauerkulturen ..................................................................................... 45
3.5.4
Herstellung elektrokompetenter Zellen .............................................................. 45
3.5.5
Bakterienanzucht ................................................................................................ 46
3.5.6
Überproduktion des E. coli Komplex I .............................................................. 46
3.5.7
Expressionstests ................................................................................................. 47
3.5.8
Überproduktion des A. aeolicus NuoEFHis ......................................................... 47
3.6
3.6.1
Plasmidpräparation ............................................................................................. 48
3.6.2
Reinigung von DNA........................................................................................... 49
3.6.3
DNA-Konzentrationsbestimmung ...................................................................... 49
3.6.4
Restriktionsanalysen und DpnI-Verdau ............................................................. 49
3.6.5
Polymerasekettenreaktion .................................................................................. 49
3.6.6
Agarose-Gelelektrophorese ................................................................................ 51
3.6.7
Klonierung .......................................................................................................... 52
3.6.8
Transformation durch Elektroporation ............................................................... 52
3.6.9
Sequenzierung von Plasmiden ........................................................................... 53
3.7
Proteinchemische Methoden ................................................................................... 53
3.7.1
Isolierung der E. coli Cytoplasmamembranen ................................................... 53
3.7.2
Isolierung des E. coli Komplex I ........................................................................ 53
3.7.3
Isolierung des A. aeolicus NuoEFHis .................................................................. 54
3.7.4
Bestimmung der Proteinkonzentration ............................................................... 56
3.7.5
Aktivitätsmessungen .......................................................................................... 57
3.7.6
SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese ............................................................. 59
3.7.7
Western Blot-Analyse ........................................................................................ 60
3.7.8
Saccharosedichtegradienten-Zentrifugation ....................................................... 61
3.8
Kristallographische Methoden ............................................................................... 61
3.8.1
Kristallisation der A. aeolicus NuoEFHis-Varianten ........................................... 61
3.8.2
Herstellung von Keimkristallen ......................................................................... 62
3.9
4
Molekularbiologische Methoden ............................................................................ 48
EPR-Spektroskopie ................................................................................................. 62
Ergebnisse ................................................................................................... 64
4.1
Substratunterscheidung am Komplex I ................................................................. 64
4.1.1
Darstellung der Mutanten pBADnuo nuoFhis E183A/D/G/H/N und Q.............. 65
4.1.2
Komplex I-vermittelte Aktivitäten der Cytoplasmamembranen ........................ 67
4.1.3
Präparation des Komplex I und der Varianten E183A/D/G/H/N und QF .......... 69
4.1.4
4.2
Charakterisierung der Varianten E183A/D/G/H/N und QF ................................ 72
Strukturelle Untersuchung der Substratdiskriminierung ................................... 79
4.2.1
Optimierung der heterologen Expression von A. aeolicus nuoEF in E. coli...... 79
4.2.2
Darstellung der E185F-Varianten des A. aeolicus Subkomplexes NuoEF ......... 83
4.2.3
Kristallisation der Varianten E185XF................................................................. 86
4.2.4
Strukturen der Varianten E185DF und E185HF.................................................. 89
4.2.5
Struktur der Variante E185DF mit gebundenem NAD+ ..................................... 93
4.3
Die Position Tyr178F im E. coli Komplex I ........................................................... 98
4.3.1
Darstellung der Komplex I-Varianten Y178A/C/F und LF ................................ 99
4.3.2
Charakterisierung der Komplex I-Varianten Y178A/C/F und LF ...................... 99
4.4
Die Beteiligung von Trp221G am Elektronentransfer ........................................ 101
4.4.1
Darstellung der Doppelmutanten...................................................................... 103
4.4.2
Komplex I-vermittelte Aktivitäten der Cytoplasmamembranen ...................... 104
4.5
Der E. coli Stamm BW25113nptI Δnuo Δndh/pBADnuo nuoFhis ...................... 107
4.5.1
Oxidaseaktivitäten der Membranen.................................................................. 107
4.5.2
Überproduktion des E. coli Komplex I ............................................................ 111
4.6
Modulation des Mittenpunktspotentials von N1a............................................... 112
4.6.1
Darstellung von pBADnuo nuoFhis nuoE V96P, N142M und V96P/N142M.. 113
4.6.2
Präparation der Varianten V96PE, N142ME und V96P/N142ME .................... 114
4.7
Redox-induzierte Konformationsänderung des Glu95 auf NuoF ..................... 119
4.7.1
Darstellung der A. aeolicus NuoEFHis-Varianten G129DE und G129SE .......... 120
4.7.2
Strukturen der NuoEFHis-Varianten G129DE und G129SE .............................. 122
4.7.3
Darstellung der Komplex I-Varianten G135DE und G135SE ........................... 126
4.8
Die Oberflächen-Salzbrücke in NuoG ................................................................. 132
4.8.1
Darstellung der Mutante pBADnuo nuoFhis nuoG E617A............................... 132
4.8.2
Die Stabilität der Variante E617AG.................................................................. 133
4.9
Zuordnung des EPR-Signals N4 ........................................................................... 136
4.9.1
Darstellung der N4- und N5-Mutanten ............................................................ 138
4.9.2
Charakterisierung der N4- und N5-Varianten .................................................. 140
4.10 Mutationen der NADH-Bindestelle des A. aeolicus NuoEFHis ........................... 144
4.10.1 Darstellung der Mutanten ................................................................................. 145
5
Diskussion .................................................................................................. 146
5.1
Die durch Glu183F vermittelten Substratselektivität ......................................... 146
5.2
Die Position Tyr178F im E. coli Komplex I ......................................................... 148
5.3
Die Beteiligung von Trp221G am Elektronentransfer ........................................ 149
5.4
Überproduktion des E. coli Komplex I und des A. aeolicus NuoEFHis ............. 150
5.5
Modulation des Mittenpunktspotentials von N1a............................................... 152
5.6
Redox-induzierte Konformationsänderung des Glu95 auf NuoF ..................... 153
5.7
Oberflächen-Salzbrücke in NuoG ........................................................................ 156
5.8
Zuordnung des EPR-Signals N4 ........................................................................... 156
6
Literaturverzeichnis ................................................................................. 158
7
Anhang....................................................................................................... 173
7.1
H-Brücken Netzwerk um NAD+/NADH und FMN im A. aeolicus NuoEFHis... 173
7.2
Kristallisations-screens .......................................................................................... 178
7.3
Kristallographische Statistiken ............................................................................ 179
Zusammenfassung
1 Zusammenfassung
Reaktive Sauerstoffspezies (reactive oxygen species; ROS) stehen im Verdacht an der
Entstehung neurodegenerativer Erkrankungen, wie Morbus Parkinson und Morbus Alzheimer
beteiligt zu sein. Zusätzlich wird ROS eine wesentliche Rolle beim Alterungsprozess
zugeschrieben. Die NADH:Ubichinon Oxidoreduktase, auch respiratorischer Komplex I
genannt, gilt als die bedeutendste Quelle von ROS im Mitochondrium. Der Enzymkomplex
koppelt den Elektronentransfer von NADH auf Ubichinon mit der Translokation von Protonen
über die Membran. Aufgrund seines einfacheren Aufbaus wird der bakterielle Komplex I als
Modellsystem für den eukaryotischen Komplex angesehen. Der Escherichia coli Komplex I
besteht aus 13 Untereinheiten, die mit NuoA bis NuoN bezeichnet werden und trägt neun
Eisen-Schwefel (Fe/S)-Zentren sowie ein Flavinmononukleotid (FMN) als Kofaktoren. In
dieser Arbeit wurden spezifische Fragen zum Mechanismus des Komplex I durch
Charakterisierung ortsgerichteter Mutanten geklärt. Auswirkungen der Mutationen auf die
enzymatische Aktivität wurden mit dem E. coli Komplex I untersucht. Die strukturellen
Änderungen der Mutationen wurden, falls möglich, mit dem löslichen Subkomplex aus den
Untereinheiten NuoE und F des Aquifex aeolicus Komplex I charakterisiert.
NADPH ist ein schlechtes Substrat für den Komplex I, da der Rest Glu183F vermutlich die
Bindung blockiert. Durch Mutagenese des Glu183F im E. coli Komplex I zu Ala, Asn, Asp,
Gln, Gly und His wurde eine NADPH:Ubichinon Oxidoreduktase konstruiert. Dies wurde
durch eine hohe katalytische Aktivität bei einer geringen ROS-Produktion gezeigt. Die
katalytische Effizienz der Reaktion mit NADPH war bis zu 2400-fach erhöht, während die
ROS-Produktion um mehr als 90% verringert wurde. Auch die Aktivität mit NADH war
verbessert, allerdings auf Kosten einer erhöhten ROS-Produktion. Die Struktur der
homologen NuoEF-Variante E185DF mit gebundenem NAD+ wurde bei einer Auflösung von
1.80 Å gelöst. Die Struktur zeigte eine veränderte Bindung des NAD+, wobei die AdenosinRibose um etwa 160° verkippt vorliegt, um sich an die neue Bindestelle anzupassen. Die
veränderte Bindung erklärt sowohl die hohe Aktivität als auch die gesteigerte ROSProduktion bei der Umsetzung von NADH.
Die Mutation des konservierten Tyr204 zu Cys der Untereinheit NDUFV1 wurde im Genom
eines am Leigh-like-Syndrom erkrankten Patienten nachgewiesen. Dieses Tyrosin bildet eine
H-Brücke mit einem Glutamat-Rest in der NADH-Bindetasche aus und stabilisiert damit die
Bindung des NADHs. Die Auswirkung dieser Mutation auf den E. coli Komplex I wurde
durch Mutagenese des homologen Tyr178F zu Ala, Cys, Leu und Phe untersucht. Die
1
Zusammenfassung
katalytische Effizienz der Varianten war bis zu 80% verringert und die ROS-Produktion bis
zu 13-fach erhöht. Der Verlust der H-Brücke verringert offensichtlich die Effizienz der
Elektronenübertragung auf FMN. Zusätzlich erleichtert der geringe sterische Anspruch der
eingeführten Aminosäuren die Diffusion von Sauerstoff in das aktive Zentrum. Beide Effekte
führen zu einer erhöhten ROS-Produktion.
Aufgrund des großen Abstands zwischen zwei Fe/S-Zentren wurde vermutet, dass das
Trp221G am Elektronentransfer im Komplex I über einen hopping-Mechanismus beteiligt ist.
Der Austausch von Trp221G gegen Leu verringerte die Komplex I-Aktivität in der Membran
um etwa ein Drittel. Allerdings können strukturelle Ursachen für die geringe Aktivität nicht
ausgeschlossen werden. Daher wurden in dieser Arbeit aliphatische Aminosäuren mit
ähnlichen Abständen zu den Fe/S-Zentren wie das Leu221G gegen Trp ausgetauscht, mit der
Absicht, Doppelmutanten mit erhöhter Aktivität zu erzeugen. Jedoch wurde für keine der
sechs dargestellten Doppelmutanten eine erhöhte Komplex I-Aktivität gemessen.
In dieser Arbeit wurde der E. coli Stamm BW25113nptI Δnuo Δndh/pBADnuo nuoFhis als
Überproduktionsstamm für den Komplex I etabliert. In diesem Stamm sind die Gene, die für
den Komplex I und die alternative NADH Dehydrogenase kodieren, deletiert. Daher kann bei
Verwendung dieses Stamms zur Bestimmung der Komplex I-Aktivität in der Membran auf
den Einsatz des kostspieligen Substrats d-NADH verzichtet werden.
Um die heterologe Überproduktion des A. aeolicus Subkomplexes NuoEFHis zu erhöhen,
wurde in dieser Arbeit der Vektor pETBlue-1nuoEFhis ohne nuoG kloniert. Da NuoG nur in
Form von Einschlusskörpern produziert wurde, sollte der Stress der Zellen bei der Expression
und Produktion vermindert werden. Mit Hilfe von Expressionstests wurde die Proteinausbeute
mit diesem Plasmid etwa sechseinhalbfach erhöht.
Das Fe/S-Zentrum N1a des bakteriellen Komplex I hat ein ungewöhnlich hohes
Mittenpunktspotential im Vergleich zu seinem mitochondrialen Homolog. In einem
Kooperations-Projekt mit der Gruppe von Dr. Judy Hirst (MRC, Cambridge) wurde das
Mittenpunktspotential dieses Zentrums durch ortsgerichtete Mutagenese um bis zu 100 mV
abgesenkt. Aufgrund dieses negativeren Potentials konnte das Zentrum N1a in der Variante
V96P/N142ME nicht mit NADH reduziert werden. Dies hatte eine um 60% erhöhte H2O2Produktion zur Folge, was die funktionelle Bedeutung dieses Zentrums als Schutz vor einer
erhöhten ROS-Produktion zeigt.
Die Strukturen des NuoEFHis mit gebundenem NAD+ und NADH zeigten eine
Konformationsänderung der Peptidbindung von Glu95F. In dem reduzierten NuoEFHis zeigt
die Carbonyl-Gruppe des Glu95F vom FMN weg und erlaubt so die Bindung von NADH. Im
2
Zusammenfassung
oxidierten NuoEFHis zeigt diese Carbonyl-Gruppe zum FMN hin und verdrängt dadurch das
NAD+. Dieser mögliche „Produkt-Auswurf-Mechanismus“ wurde durch die Mutation des
Gly129E zu Ser und Asp untersucht. Die neu eingeführten Reste sollten die Carbonyl-Gruppe
des Glu95F durch H-Brücken in die Konformation des reduzierten Proteins zwingen. Die
Struktur der Varianten G129DE und G129SE wurden bei 1.85 Å bzw. 2.44 Å Auflösung
erhalten. Die Carbonyl-Gruppe war nur in der Variante G129DE in der Konformation des
reduzierten Proteins fixiert. Die Auswirkungen der Mutationen auf die Aktivität des
Komplex I wurde anhand der homologen Varianten G135DE und G135SE bestimmt. Die
Komplex I-vermittelten Aktivitäten der Variante G135SE waren nur leicht verringert. Die
NADH:Decyl-Ubichinon Oxidoreduktaseaktivität der Variante G135DE nahm während der
Messung stetig ab, vermutlich weil das Produkt NAD+ nicht mehr effektiv aus der
Bindetasche entfernt wird, was wiederum die Hypothese des „Auswurf-Mechanismus“
unterstützt.
Die katalytische Untereinheit NarG der Nitratreduktase A ist sequenz- und strukturhomolog
zur C-terminalen Domäne von NuoG. Die Deletion einer Salzbrücke an der Oberfläche von
NarG führte zum Verlust der Kofaktoren dieser Untereinheit. NuoG besitzt ebenfalls eine
Salzbrücke an der Proteinoberfläche in der Nähe eines Fe/S-Zentrums, das wichtig für die
Stabilität des Komplex I ist. Der Austausch von Glu617G, einem Teil der Salzbrücke, gegen
Ala hatte den Zerfall des Komplexes zur Folge, was vermutlich an dem Verlust des Fe/SZentrums liegt. Diese Daten unterstreichen die evolutionäre Verwandtschaft dieser Proteine.
In den letzten Jahren wird die „klassische“ Zuordnung der EPR-Signale der Fe/S-Zentren des
Komplex I zu den strukturellen definierten Fe/S-Zentren in Frage gestellt. Es wird vermutet,
dass die EPR-Signale N4 und N5 den falschen strukturell definierten Fe/S-Zentren zugeordnet
wurden. Um dies zu untersuchen, wurden die Aminosäuren, die die Zentren N4 und N5
koordinieren jeweils gegen Alanine ausgetauscht. Die meisten Mutanten zeigten keine
Komplex I-vermittelte Aktivität in den Membranen, was auf den Verlust eines Zentrums
hindeutet. Drei der Varianten mit einer Mutation im Motiv von N4 und eine mit einer
Mutation um N5 konnten präpariert und EPR-spektroskopisch charakterisiert werden. Alle
Präparationen zeigten das Signal, das dem Zentrum N4 zugeordnet wird. Es ist somit
unwahrscheinlich, dass das EPR-Signal N4 von den strukturell definierten Fe/S-Zentren N4
oder N5 stammt.
3
Einleitung
2 Einleitung
2.1 Die aerobe Atmungskette von Escherichia coli
Die bei katabolen Prozessen wie der Glykolyse, dem Citratzyklus und der β-Oxidation in
Formen von reduziertem Nikotinamidadenindinukleotid (NADH) und Flavinen (FADH2 und
FMNH2) anfallenden Reduktionsäquivalente werden in der aeroben Atmungskette genutzt,
um Sauerstoff zu H2O zu reduzieren. Die Oxidoreduktasen der Atmungskette translozieren
dabei Protonen über die innere Mitochondrienmembran der Eukaryoten bzw. über die
Cytoplasmamembran der Prokaryoten. Der so erzeugte Protonengradient stellt die sogenannte
protonenmotorische Kraft dar, die von der ATP-Synthase zur ATP-Produktion aus ADP und
anorganischem Phosphat genutzt wird (Mitchell und Moyle, 1967). Dieser Prozess wird als
Oxidative Phosphorylierung bezeichnet.
Das gramnegative, fakultativ anaerobe Darmbakterium Escherichia coli besitzt mindestens 15
primäre Dehydrogenasen und zehn terminale Oxidasen oder Reduktasen (Unden und
Bongaerts, 1997). Die aerobe Atmungskette von E. coli wird im Wesentlichen von der
Succinat
Dehydrogenase,
der
protonenpumpenden
Typ
I
sowie
der
nicht
energieumwandelnden Typ II NADH:Ubichinon Oxidoreduktase und den drei terminalen
Ubichinol:O2 Oxidoreduktasen, der bd-I und -II sowie der bo3 Oxidase gebildet (Anraku und
Gennis, 1987; Borisov et al., 2011a; Sousa et al., 2011). Abbildung 2.1 zeigt die schematische
Darstellung der aeroben Atmungskette von E. coli.
(d)-NADH
(d)-NAD+
Succinat
Fumarat
NADH NAD+
Cytosol
2 H+/e−
2 H+/e−
Q
QH2
Q
QH2
Q
QH2
1 H+/e−
½O2
H2 O
QH2
Q
Periplasma
Abbildung 2.1: Schematische Darstellung der aeroben Atmungskette von E. coli. Die Typ I
NADH:Ubichinon Oxidoreduktase ist cyan (PDB-Eintrag: 4HEA; Baradaran et al., 2013), die Typ II
NADH:Ubichinon Oxidoreduktase hellgrün (PDB-Eintrag: 4G6H; Feng et al., 2012), die Succinat
Dehydrogenase grün (PDB-Eintrag: 1NEK; Yankovskaya et al., 2003) und die bo3 Oxidase blau (PDB-Eintrag:
1FFT; Abramson et al., 2000) dargestellt. Die Strukturen der beiden bd Oxidasen sind nicht bekannt, daher wird
stellvertretend nur eine in violetten Blöcken dargestellt. Die katalysierten Reaktionen der einzelnen Enzyme sind
durch Substrate und Produkte angedeutet. Die roten Pfeile zeigen die Protonentranslokationsreaktionen mit den
jeweiligen Stöchiometrien.
4
Einleitung
Die Typ I NADH:Ubichinon Oxidoreduktase (NDH-I) koppelt den Transfer von zwei
Elektronen von NADH auf Ubichinon (Q) mit der Translokation von vier Protonen über die
Membran (Friedrich, 1998, 2001; Yagi und Matsuno-Yagi, 2003). Prokaryoten und einfach
aufgebaute
Eukaryoten
besitzen
eine
oder
mehrere
alternative
NADH:Ubichinon
Oxidoreduktasen (NDH-II) (Matsushita et al., 1987; Melo et al., 2004; Sousa et al., 2011).
Die E. coli NDH-II trägt ein nicht kovalent gebundenes Flavinadenindinukleotid (FAD) und
besteht aus einem einzelnen 47.2 kDa großen Peptid, das vom Gen ndh kodiert wird
(Jaworowski et al., 1981). Es wurde gezeigt, dass die NDH-II als Dimer über jeweils eine
C-terminale, amphipatische Helix an die cytoplasmatische Membran assoziiert ist (Villegas et
al., 2011; Feng et al., 2012). Die NDH-I kann im Gegensatz zur NDH-II neben NADH auch
das Derivat Desamino-(d-)NADH umsetzen (Matsushita et al., 1987). Die Succinat
Dehydrogenase (Komplex II) ist in die Membran integriert und verbindet den Citratzyklus mit
der Atmungskette. Der Enzymkomplex besteht aus vier Untereinheiten und trägt ein FAD,
drei Eisen-Schwefel (Fe/S)-Zentren und ein Häm b als Kofaktoren. Komplex II überträgt zwei
Elektronen von Succinat auf Ubichinon, transloziert dabei jedoch keine Protonen (Cecchini et
al., 2002; Yankovskaya et al., 2003). Die zur Familie der Häm-Kupfer Oxidasen gehörende
bo3 Oxidase besteht aus vier Untereinheiten und koppelt die Reduktion von molekularem
Sauerstoff zu H2O mit der Translokation von Protonen über die Membran (Abramson et al.,
2000; Anraku und Gennis, 1987). Alle Kofaktoren, ein Häm b, ein Häm o3 und ein CuB sind
in der Untereinheit I gebunden (Abramson et al., 2000). Die bd-I und -II Oxidasen bestehen
jeweils aus zwei Untereinheiten und tragen über eine skalare Reaktion zum Aufbau des
Protonengradienten bei (Puustinen et al., 1991; Borisov et al., 2011a). Die Oxidasen sind
homolog zueinander und tragen jeweils zwei Häm b und ein Häm d in der großen
Untereinheit (Dassa et al., 1991; Borisov et al., 2011b).
NAD+ ist essentiell für katabole Prozesse, da es das Hauptoxidationsmittel der Zelle darstellt.
Eine wichtige Funktion der Atmungskette ist die Regeneration von NAD+. Unter aeroben
Bedingungen nutzt E. coli dafür hauptsächlich die NDH-II und die bo3 Oxidase. Hierbei
werden pro regeneriertem NAD+ insgesamt zwei H+ transloziert. Unter mikroaeroben
Bedingungen werden vermehrt die NDH-I und die bd-I Oxidase produziert, was einer
Gesamtausbeute von fünf translozierten H+ pro oxidiertem NADH entspricht (Calhoun et al.,
1993; Unden und Bongaerts, 1997). Obwohl die ATP-Ausbeute pro oxidiertem NAD+ über
NDH-I und bd-I Oxidase höher ist, steht unter aeroben Bedingungen die NAD+-Regeneration
im Vordergrund (Melo et al., 2004).
5
Einleitung
2.2 Die NADH:Ubichinon Oxidoreduktase
Die Typ I NADH:Ubichinon Oxidoreduktase (EC 1.6.5.3), auch bekannt als respiratorischer
Komplex I, stellt bei Eukaryoten und den meisten Prokaryoten das erste und größte Enzym
der Atmungskette dar (Weiss et al., 1991; Leif et al., 1995; Friedrich, 1998; Yagi und
Matsuno-Yagi, 2003). Folgende Gleichung gibt die von Komplex I katalysierte Reaktion
wieder.
(2.1)
Der etwa 1 MDa schwere mitochondriale Komplex I besteht aus 44 Untereinheiten und trägt
acht Fe/S-Zentren und ein Flavinmononukleotid (FMN) (Carroll et al., 2006; Balsa et al.,
2012). Er gilt als die Hauptquelle für reaktive Sauerstoffspezies (reactive oxygene species;
ROS) im Mitochondrium (Walker, 1992; Murphy, 2009). Bei ROS handelt es sich um freie
Radikale, wie z. B. O2•−, OH• sowie um reaktive sauerstoffhaltige Moleküle, wie H2O2 und
O3. Diese Spezies sind einerseits ein essentielles Nebenprodukt des Sauerstoffmetabolismus,
stellen andererseits als oxidativer Stress einen wichtigen pathophysiologischen Faktor dar
(Devasagayam et al., 2004). Mutationen im Komplex I und die daraus möglicherweise
resultierenden Dysfunktionen können zu einer erhöhten ROS-Produktion oder zu einer
erniedrigten katalytischen Aktivität führen. Dies wiederum kann schwerwiegende
neurodegenerative Störungen wie z. B. die Parkinson- und die Alzheimer-Krankheit zur Folge
haben (Schapira, 1998; Dawson und Dawson, 2003; Lin und Beal, 2006; Pagniez-Mammeri et
al., 2012). Die ROS-Produktion in Mitochondrien wird weiterhin mit dem Alterungsprozess
in Zusammenhang gebracht (Balaban et al., 2005).
Der bakterielle Komplex besteht in der Regel aus 14 Untereinheiten mit einer molekularen
Masse von etwa 550 kDa (Friedrich, 1998). Er trägt bis zu zehn Fe/S-Zentren und ein FMN
(Friedrich und Böttcher, 2004). Die Untereinheiten des bakteriellen Komplexes sind essentiell
für die Katalyse und werden daher als Kernuntereinheiten bezeichnet. Homologe sämtlicher
dieser Untereinheiten werden im mitochondrialen Komplex I gefunden. Darüber hinaus
besitzt der bakterielle Komplex die gleichen Substratbindestellen, katalysiert die gleiche
Reaktion und wird durch die selben Hemmstoffe blockiert wie der mitochondriale (Friedrich
et al., 1994; Degli Esposti, 1998). Daher wird der bakterielle Komplex I als Modell für die
eukaryotischen NADH:Ubichinon Oxidoreduktase angesehen (Friedrich und Scheide, 2000).
6
Einleitung
In E. coli sind die nuo-Gene (NADH:Ubichinon Oxidoreduktase) in dem 15 kbp großen nuoOperon organisiert, wobei nuoC und nuoD fusioniert vorliegen. Der 535 kDa schwere
Komplex wird entsprechend aus 13 Untereinheiten aufgebaut, die mit NuoA – N bezeichnet
werden (Weidner et al., 1993, Braun et al., 1998; Friedrich, 1998).
Erst 2013 wurde eine Kristallstruktur des Komplex I aus Thermus thermophilus bei einer
Auflösung von 3.3 Å veröffentlicht (Baradaran et al., 2013). Dieser besteht aus 16
Untereinheiten Nqo1 – 16 (NADH:quinone oxidoreductase), die zusammen einen 536 kDa
schweren Komplex bilden (Abb. 2.2). In dieser Arbeit wird der Übersicht wegen
ausschließlich die E. coli Nomenklatur für die 14 Kernuntereinheiten verwendet. Der
Komplex
weist
eine
L-förmige
Struktur
auf,
was
schon
vorher
durch
elektronenmikroskopische Aufnahmen des E. coli und Bos taurus Komplex I gezeigt wurde
(Guénebaut et al., 1998; Grigorieff, 1999). Er besteht aus einen peripheren Arm, der in die
wässrige Phase ragt und einem Membranarm, der in die Lipiddoppelschicht eingebettet ist.
NADH
NAD+
140 Å
Cytosol
Q
30 Å
QH2
Periplasma
180 Å
Abbildung 2.2: Struktur des T. thermophilus Komplex I bei 3.3 Å Auflösung (PDB-Eintrag: 4HEA;
Baradaran et al., 2013). Die Orientierung des Komplexes in der Membran ist gezeigt. Die Substratbindestellen
sind durch schwarze Pfeile angedeutet. Der periphere Arm trägt neun Fe/S-Zentren und ein FMN, hier als
Kalotten-Modelle dargestellt. Der Membranarm trägt keine Kofaktoren und ist für die Protonentranslokation
verantwortlich. Die Dimensionen des Komplexes und der Membran sind angegeben.
Der aus den Untereinheiten NuoB, NuoE – G, NuoI und den zwei löslichen Proteinen Nqo15
und
Nqo16
bestehende
periphere
Arm
trägt
alle
bekannten
Kofaktoren
des
Elektronentransfers: ein FMN und neun Fe/S-Zentren. NuoE trägt das zweikernige Fe/SZentrum N1a, NuoF enthält die NADH-Bindestelle mit dem nicht-kovalent gebundenen FMN
7
Einleitung
und das vierkernige Zentrum N3. Die größte Untereinheit NuoG trägt das zweikernige Fe/SZentrum N1b und die vierkernigen Zentren N4, N5 und N7 (Uhlmann und Friedrich, 2005).
NuoI beherbergt die zwei vierkernigen Fe/S-Zentren N6a und N6b. Das distale vierkernige
Zentrum N2 befindet sich auf NuoB. In der Literatur wird diskutiert, ob die Zuordnung der
EPR-spektroskopisch detektierten Signale zu den strukturell definierten Zentren stimmig ist
(Roessler et al., 2010). Es ist strittig, ob das EPR-Signal „N4“ nicht von den strukturell
definierten Fe/S-Zentren N5 oder N6a erzeugt wird (Yakovlev et al., 2007; Nakamaru-Ogiso
et al., 2008; Sinha et al., 2012). Der Übersicht wegen wird in dieser Arbeit die Nomenklatur
nach Tomoko Ohnishi verwendet (Ohnishi, 1998; Sazanov und Hinchliffe, 2006). Die
Untereinheiten Nqo15 und 16 sind nur in der Gattungen Thermus und Deinococcus
konserviert, wobei Nqo16 keinen Einfluss auf die Aktivität hat, aber essentiell für die
Kristallisation des gesamten Komplexes ist. Es wird daher davon ausgegangen, dass es sich
um einen Assemblierungsfaktor handelt (Baradaran et al., 2013). Die Deletion des Gens, des
zu Nqo15, das ein Mitglied der Frataxin-Proteinfamilie ist, homologen Proteins CyaY, hatte
weder Einfluss auf die Assemblierung noch auf die Aktivität des E. coli Komplex I (Pohl et
al., 2007a).
Der Elektronentransfer findet im peripheren Arm statt. Die von NADH an FMN übertragenen
Elektronen gelangen über die Kette aus Fe/S-Zentren zum Ubichinon, das zwischen beiden
Armen gebunden wird. Die 30 Å lange, enge Ubichinon-Bindestelle wird von NuoB, NuoD
und NuoH gebildet und ist vollständig vom Solvens abgeschirmt. Der schmale Eingang zur
Bindestelle wird von hydrophoben Seitenketten gebildet, wobei geladene Reste das Innere des
Bindungskanals auskleiden. Die Kopfgruppe des Ubichinons wird 15 Å oberhalb der
Membran und in etwa 12 Å Abstand von N2 gebunden. Der periphere Arm wird
hauptsächlich über hydrophobe Wechselwirkungen an den Membranarm gebunden. Die
Kavität der Ubichinon-Bindestelle bildet dabei eine Ausnahme. Hier wechselwirken NuoB
und NuoH über geladene Reste mit einander (Baradaran et al., 2013).
Der Membranarm besteht aus den Untereinheiten NuoA, NuoH, NuoJ – N. Die Untereinheiten
NuoL, NuoM sowie NuoN sind zueinander und zu Na+/H+-Antiportern homolog und bilden
drei der vier Protonenkänale des Komplexes (Friedrich und Weiss, 1997). NuoL, NuoM und
NuoN besitzen jeweils 14 transmembrane Helices (TM), von denen wiederum jeweils vier
zwei zentrale Helix-Bündel bilden, die von den restlichen Helices flankiert werden. Jedes
dieser Helix-Bündel bildet einen Halbkanal: einem N-terminalen aus TM4–8 und einem
C-terminalen aus TM9 – 13. Die Halbkanäle TM4 – 8 sind im oxidierten Zustand der
Präparation zum Cytoplasma hin geöffnet und enthalten ein zentrales Lysin auf TM7
(LysTM7) sowie ein Glutamat auf TM5. Die zum Periplasma geöffneten Halbkanäle TM9 –13
8
Einleitung
enthalten ein zentrales Lysin (NuoL und NuoN) oder Glutamat (NuoM) auf TM12. Die zwei
Halbkanäle sind über geladene Reste miteinander verbunden. NuoH trägt ebenfalls geladene
Reste an analogen Positionen wie die Untereinheiten NuoL, M und N. Zusammen mit NuoJ
und NuoK bildet NuoH den vierten Protonenkanal. Die zentralen geladenen Reste bilden eine
Achse, die sich durch den gesamten Membranarm zieht (Abb. 2.3). Zusätzlich besitzt NuoL
eine C-terminale, amphipatische Helix (HL), welche die Protonenkanäle miteinander
verbindet. HL ist durch zwei transmembrane Helices in der Membran verankert, wobei die
C-terminale Helix mit NuoJ, K und N über polare Reste interagiert (Efremov und Sazanov,
2011). Zudem besitzen die Protonenkanäle auf der periplasmatischen Seite jeweils zwei
antiparallel ausgerichtete β-Stränge.
Abbildung 2.3: Vorgeschlagener Kopplungsmechanismus des Komplex I. Der periphere Arm (grau, nicht
maßstabsgetreu dargestellt) mit NADH (blau), FMN (orange) und den Fe/S-Zentren (orange) sowie der
Membranarm mit den Protonenkanälen in verschiedenen Farben sind schematisch dargestellt. Die durch die
Reduktion des Q initiierte Kaskade an konformativen Änderungen ist mit roten und die durch Reduktion von N2
hervorgerufenen Verschiebungen mit blauen Pfeilen dargestellt. Die zentrale Achse aus geladenen Resten ist
durch rote bzw. blaue Punkte und die H+-Translokation durch schwarze Pfeilen gekennzeichnet. Die
unterstützende Funktion der Helix HL und der β-Stränge ist mit Rechtecken und Pfeilen angedeutet (Baradaran
et al., 2013).
Folgender
Redox-getriebener
Kopplungsmechanismus
von
Elektronentransfer
und
Protonentranslokation wurde für Komplex I vorgeschlagen (Abb. 2.3; Baradaran et al., 2013):
Nachdem ein Elektron von N2 auf Ubichinon übertragen wurde, initiiert das negativ geladene
Q•− eine Kaskade an konformativen Änderungen, die über die geladene zentrale Achse an alle
Protonenkanäle weitergeleitet werden. Die LysTM7 auf den zum Cytosol hin geöffneten
9
Einleitung
Halbkanälen werden protoniert. Sobald das Q•− zu QH2 reduziert wird, schließen sich die
Halbkanäle auf der cytosolischen Seite und die LysTM7 übertragen die Protonen auf die
zentralen geladenen Reste der zum Periplasma hin geöffneten Halbkanäle. Diese geben die
Protonen ins Periplasma ab und der Komplex I geht wieder in den oxidierten Zustand über.
Die konformativen Änderungen werden durch die Helix HL auf der cytosolischen und die
β-Stränge auf der periplasmatischen Seite unterstützt. Auch die Redoxreaktion von N2
verschiebt Helices in NuoB und NuoD und trägt damit zu den konformativen Änderungen im
gesamten Komplex bei (Baradaran et al., 2013).
2.3 Elektronentransfer im Komplex I
Der Elektronentransfer in biologischen Systemen wird generell durch einen Tunnel-Prozess
beschrieben (Page et al., 1999). Nach Veröffentlichung der ersten Kristallstruktur des
peripheren Arms des T. thermophilus Komplex I bei 3.3 Å waren die Abstände zwischen den
Kofaktoren bekannt (Sazanov und Hinchliffe, 2006). Mit Hilfe der Mittenpunktspotentiale
(Em, 7) wurde ein möglicher Elektronenweg ausformuliert (Moser et al., 2006; Abb. 2.4).
NADH (Em, 7 = −340 mV) wird von NuoF gebunden und überträgt ein Hydridion und ein
Proton auf das tief in der Substratbindetasche liegende FMN (Em, 7 = −320 mV;
et
al., 2008; Leif et al., 1995). Die Elektronen werden einzeln auf N3 (Em, 7 = −270 mV), das den
Eintrittspunkt der Elektronentransferkette darstellt, über die isopotenziellen Fe/S-Zentren
N1b, N4, N5, N6a, N6b (Em, 7 = −250 mV) auf N2 (Em, 7 = −220 mV) und schließlich auf
Ubichinon (Em, 7 = +110 mV) übertragen (Leif et al., 1995; Ohnishi, 1998; Yano et al., 2003).
Das Fe/S-Zentrum N7 ist über 20 Å von dem nächstgelegenen Zentrum N4 entfernt. Dies
überschreitet die maximale Distanz von 14 Å für einen physiologisch relevanten
Elektronentransfer (Page et al., 1999). Es wurde EPR-spektroskopisch gezeigt, dass N7 nicht
mit NADH, aber chemisch mit Dithionit reduziert werden kann (Pohl et al., 2007b). Der
durch Mutagenese des Bindemotivs bedingte Verlust des Zentrums hatte keinen Einfluss auf
die Aktivität, sondern verminderte die Stabilität des Komplex I (Pohl et al., 2007b).
Das zweikernige Fe/S-Zentrum N1a ist etwa 20 Å von N3, aber nur 12.3 Å vom FMN
entfernt. Da N1a im Gegensatz zu N7 konserviert ist, ist es wahrscheinlich von funktioneller
Bedeutung. Es wird angenommen, dass der Großteil der von Komplex I produzierten ROS am
reduzierten FMN gebildet wird (Kussmaul und Hirst, 2006; Hirst et al., 2008). Es wird
weiterhin vermutet, dass das gut vom Solvens abgeschirmte N1a als Zwischenspeicher für das
10
Einleitung
zweite vom Flavosemichinonradikal übertragene Elektron dient, um die Lebensdauer des
solvensexponierten Radikals so gering wie möglich zu halten (Sazanov, 2007). Aufgrund
seines niedrigen Mittenpunktspotentials (Em, 7 = −330 mV; Leif et al., 1995) kann N1a erst
von dem entstehenden Flavosemichinonradikal (E m, 7 = −390 mV; Sled et al., 1994) reduziert
werden (Sazanov, 2007). Während des katalytischen turnovers bleiben einige Fe/S-Zentren
der Elektronentransferkette teilweise und nur N2 vollständig reduziert (Krishnamoorthy und
Hinkle, 1988; Kotlyar et al., 1990; Bridges et al., 2012). Erst wenn das distale Fe/S-Zentrum
N2 durch Ubichinon oxidiert wird, rücken die anderen Elektronen nach und das Elektron von
N1a kann über FMN und N3 in die Elektronentransferkette eingespeist werden (Sazanov,
2007).
N7
N1b
10.9 (7.6)
14.2
(11.0)
24.2 (20.5)
13.0
(10.7)
N4
16.2 (13.8)
N3
13.5
(12.3)
12.2 (8.5)
N5
N2
22.3 (19.4)
N6a
N1a
N6b
16.9 (14.0)
14.0 (10.5)
12.2 (9.0)
Abbildung 2.4: Anordnung der Kofaktoren im T. thermophilus Komplex I (PDB-Eintrag: 3IAM;
Berrisford und Sazanov, 2009). FMN und NADH sind als Stabmodelle in Elementfarben und die neun Fe/SZentren sind als Kalotten-Modelle mit Eisen in Rot und Schwefel in Gelb dargestellt. Die blauen Pfeile
markieren den möglichen Elektronenweg. Der grüne Pfeil deutet die mögliche reversible Elektronenübertragung
auf N1a an. Alle Abstände sind in Ångström angegeben. Die Zahlen vor den Klammern geben die
Mittelpunktsabstände und die Zahlen in den Klammern die Kante-zu-Kante Abstände zwischen den Kofaktoren
wieder.
Anhand der bekannten Abstände der Kofaktoren wurden die Elektronentransferraten durch
den Komplex I berechnet (Moser et al., 2006). Hierfür wurde ein von der Marcus-Theorie
abgeleitetes phänomenologisches Modell benutzt, bei dem nur die Abstände zwischen den
einzelnen Kofaktoren berücksichtigt werden und das Protein als einheitliche Tunnelbarriere
betrachtet wird (Page et al., 1999). Für alle Transferschritte, bis auf den zwischen N5 und
N6a, wurden Elektronentransferraten (kET) von 106 – 107 s−1 berechnet. Der Kante-zu-Kante
11
Einleitung
Abstand zwischen N5 und N6a beträgt 14 Å (Sazanov und Hinchliffe, 2006), was genau der
Grenze des physiologisch relevanten Elektronentransfers entspricht (Page et al., 1999). Für
diesen Schritt betrug die berechnete Transferrate 104 s−1. Obwohl der errechnete Wert die
experimentellen Werte von 50 – 180 s−1 (Ragan und Racker, 1973; Stolpe und Friedrich,
2004; Sharpley et al., 2006) bei weitem überschreitet, wird er als Flaschenhals für die
Gesamttransferrate von Komplex I angesehen (Moser et al., 2006).
Die Gruppe von Prof. Thorsten Koslowski, Instititut für Physikalische Chemie der Universität
Freiburg, veröffentlichte eine alternative Berechnung auf atomarer Ebene (Wittekindt et al.,
2009). Bei dieser Beschreibung werden nicht nur die Abstände, sondern auch die chemische
Umgebung der Redoxpartner berücksichtigt, was zu genaueren Werten führt. Es wurden vier
mögliche
Transfer-Mechanismen
berücksichtigt:
Tunneln
(through
space),
E ek r nenüber ragung über σ-Bindungen des Proteins (through bond), indirekte Beteiligung
e π-Systems der aromatischen Aminosäuren oder der Amidbindungen durch Erhöhung der
elektronischen
Amin
Kopplung
(superexchange)
und
direkte
Beteiligung
aromatischer
uren, in em a zu über ragen e E ek r n in erme i r auf em π-System lokalisiert
ist (hopping) (Wittekindt et al., 2009). Nur für den hopping-Mechanismus wurden Werte
berechnet, die mit der physiologischen Transferrate von kET = 50 – 180 s−1 übereinstimmen
(Wittekindt et al., 2009). Sequenzvergleiche zeigten, dass die von Wittekind et al.
identifizierten aromatischen Aminosäuren entweder konserviert oder durch andere
aromatische Aminosäuren ersetzt sind. Abbildung 2.5 gibt die Lage der aromatischen
Seitenketten zwischen den Fe/S-Zentren wieder. In vorangegangenen Arbeiten unserer
Gruppe wurden die in Abbildung 2.5 gezeigten aromatischen Aminosäuren gegen anderen
aromatische Aminosäuren und Leucin ausgetauscht. Die Mutation der aromatischen
Aminosäuren zu Leucin, die sich zwischen den Fe/S-Zentren N1b und N4 bzw. N6b und N2
befinden hatten keinen oder nur geringen Einfluss auf die Aktivität. Dies ist verständlich, da
die Mutationen die Elektronentransferraten theoretisch nur unwesentlich beeinflussen sollten
und dieser geringe Effekt mit den verwendeten Methoden nicht erfasst werden kann. Der
Austausch von Phe515CD und Trp221G gegen Leucin, die beide zwischen N5 und N6a liegen,
bedingte eine Abnahme der d-NADH-Oxidaseaktivität der E. coli Cytoplasmamembranen um
mehr als 30% (Dörner, 2010). Obwohl Leucin von allen aliphatischen Aminosäuren die
größte Seitenkette besitzt, müssen auch strukturelle Gründe für die erniedrigte Aktivität in
Betracht gezogen werden.
12
Einleitung
N1b
3
G
F33 (F35 )
3
G
W247 (W221 )
N2
N4
N5
4
F328
CD
(F515 )
N6b
4
H327
CD
(H514 )
N6a
9
I
F100 (F101 )
Abbildung 2.5: Position der am Elektronentransfer beteiligten aromatischen Aminosäuren in Komplex I
nach Wittekind et al. 2009 (PDB-Eintrag: 3IAM; Berrisford und Sazanov, 2009). Die T. thermophilus und
die E. coli Nomenklatur (in Klammern) der möglicherweise am Elektronentransfer beteiligten aromatischen
Aminosäuren sind angegeben. Die Fe/S-Zentren sind als Kalotten-Modelle mit Eisen in Rot und Schwefel in
Gelb dargestellt. Die berechneten hopping-Pfade sind mit blauen, gestrichelten und die through space-Pfade mit
schwarzen, gestrichelten Linien angedeutet.
2.4 Die Fe/S-Zentren N1a und N7
Das Fe/S-Zentrum N1a wird von der Thioredoxin-ähnlichen Domäne von NuoE gebunden
und fungiert vermutlich als Antioxidans (Sazanov und Hinchliffe, 2006). In vorangegangenen
Arbeiten wurde gezeigt, dass N1a essentiell für die Stabilität des Komplex I ist (Dörner,
2010). Die N1a-koordinierenden Cysteine wurden gegen Alanin oder Serin ausgetauscht.
Durch die Bestimmung der NADH-Oxidaseaktivität der Cytoplasmamembranen der Mutanten
wurde gezeigt, dass die Varianten in verringertem Maß vorhanden sind. Zudem wurde durch
Saccharosedichtegradienten-Zentrifugation gezeigt, dass einige der Varianten nach der
Extraktion aus der Membran zerfielen. Die Varianten, die nicht zerfielen, zeigten eine
deutlich verringerte NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität (Dörner, 2010). N1a kann
nach Reduktion durch NADH EPR-spektroskopisch im E. coli Komplex I nachgewiesen
werden (Leif et al., 1995; Uhlmann und Friedrich, 2005). Für den mitochondrialen Komplex I
wurde das mit Dithionit reduzierte N1a nur in der einzeln produzierten Untereinheit NuoE
oder in einem Subkomplex bestehend aus NuoE, NuoF und einer 10 kDa Untereinheit
detektiert (Ragan et al., 1982; Barker et al., 2007). Im intakten mitochondrialen Komplex I ist
N1a aufgrund seines niedrigen Mittenpunktspotentials von etwa −450 mV nicht mit NADH
13
Einleitung
reduzierbar (Ohnishi et al., 1981). In Proben die mit dem sehr starken Reduktionsmittel Eu2+
behandelt wurden, war N1a EPR-spektroskopisch nicht nachweisbar. Daraus wurde
geschlossen, dass das Potential von N1a niedriger als −1 V sein sollte (Reda et al., 2008).
Allerdings kann es auch mechanistische Gründe geben, warum das Zentrum nicht reduziert
wird. Anhand von Mutagenese-Studien an NuoE aus E. coli hat die Gruppe von Dr. Judy
Hirst am MRC Cambridge, UK, versucht Reste zu identifizieren, die in der Lage sind das
Mittenpunktspotential von N1a zu modulieren. In der zweiten Koordinationssphäre von N1a
in Prokaryoten befinden sich die nicht konservierten Reste, Val96E und Asn142E. Im
mitochondrialen Komplex I sind an diesen Positionen ein Prolin (Pos. 96) und ein Methionin
(Pos. 142) konserviert (Abb. 2.6). Abbildung 2.7 gibt die Positionen der Aminosäuren in
T. thermophilus NuoE wieder.
96
E. coli
T. thermophilus
A. aeolicus
B. taurus
Y. lipolytica
VIRYCDSVVC
HLQVCATLSC
RIRVCVSIVC
HIQVCTTTPC
HLQICTTTPC
142
HINGYQGIQA
KLAGAEELWD
HLMGTNKLLK
MLRNSDSILE
QLCGSDGIME
-----------
DKGPNMMIDE
HTAPVIQVND
SEAPVFMVND
VNAPMVQIND
VNAPMMAIND
Abbildung 2.6: Ausschnitt des Sequenzvergleichs von NuoE. Die Aminosäuren Pro96 und Met142 sind in
Eukaryoten konserviert, wie hier am Beispiel von Yarrowia lipolytica und Bos taurus NuoE gezeigt. Die E. coli
Nummerierung ist angegeben.
S96
V142
Abbildung 2.7: Die Thioredoxin-ähnliche Domäne von NuoE aus T. thermophilus (PDB-Eintrag: 3IAM;
Berrisford und Sazanov, 2009). Die zu Val96E und Asn142E homologen Positionen sind gezeigt. Es wurde die
Nummerierung nach E. coli verwendet. N1a ist als Stabmodell mit den koordinierenden Cysteinen dargestellt.
14
Einleitung
Der
Austausch
Val96E
gegen
Pro
und
Asn142E
gegen
Met
verschob
das
Mittenpunktspotential des Zentrums in der einzeln produzierten Untereinheit NuoE jeweils
um etwa −60 mV. In der Variante mit beiden Mutationen wurde das Mittenpunktspotential
sogar um −100 mV verschoben (J. Hirst, persönliche Mitteilung). Erschwerend kommt hinzu,
dass das Mittenpunktspotential von N1a von der chemischen Umgebung, genauer vom pH
und der Ionenstärke abhängt. Daher bleibt zu untersuchen ob dieser an der einzelnen
Untereinheit beobachtete Effekt der Mutationen auch bei dem Gesamtkomplex zu messen ist.
Sequenzanalysen haben gezeigt, dass die N-terminale Domäne von NuoG, die N1b, N4 und
N5
bindet,
Ähnlichkeit
zu
Untereinheiten
der
[Fe/Fe]-Hydrogenasen
und
den
NAD+-reduzierenden [Ni/Fe]-Hydrogenasen aufweist (Fearnley und Walker, 1992; Rothery et
al., 2008). Die C-terminale Domäne, die das Zentrum N7 bindet, zeigt Struktur- und
Sequenzähnlichkeit zu Enzymen der Molybdo-bis(Molybdopterin-Guanin-Dinukleotid)
([Mo(MGD)2])-Familie (Chow et al., 1991; Finel, 1998; Rothery et al., 2008). Da N7 nur im
Komplex I einiger Bakterien wie z. B. E. coli, T. thermophilus und Aquifex aeolicus
vorkommt, ist davon auszugehen, dass es sich bei diesem Zentrum um ein evolutionäres
Relikt handelt. Es wird vermutet, dass der Vorläufer von NuoG ebenfalls einen [Mo(MGD)2]Kofaktor und ein weiteres Fe/S-Zentrum besaß, die im Laufe der Evolution verloren gingen.
NuoG im A. aeolicus Komplex I besitzt ein weiteres Fe/S-Zentrum N8, das N7 mit der
Elektronentransferkette verbinden könnte (Peng et al., 2010). Dies deutet darauf hin, dass der
NuoG-Vorläufer als Elektroneneintritts-Modul für ein anderes Substrat als NADH fungierte.
Im Genom von A. aeolicus, einem der evolutionär ältesten Eubakterien, sind die nuo-Gene
nicht wie in anderen Bakterien in einem Operon organisiert, sondern sind auf drei
verschiedenen Loci verteilt (Scheide et al., 2002). Die Tatsache, dass nuoEF und nuoG auf
verschiedenen Loci organisiert sind, verstärkt die Vermutung der evolutionär späten
Entstehung des NADH-Dehydrogenase-Moduls NuoEFG (Friedrich und Scheide, 2000).
Ein typischer Vertreter der [Mo(MGD)2]-Familie ist die Chinol:Nitrat Oxidoreduktase (EC
1.7.5.1), die auch als Nitratreduktase A oder NarGHI bekannt ist. Unter anaeroben
Bedingungen und in Anwesenheit von Nitrat nutzt E. coli NarGHI, um mit Hilfe von
Menachinol (MQH2) Nitrat zu Nitrit zu reduzieren (Forget, 1974). NarGHI bildet mit der
Formiat Dehydrogenase N (FdnGHI) eine anaerobe Atmungskette, die Elektronen von
Formiat im Periplasma auf Nitrat im Cytosol transferiert. Beide Redoxreaktionen sind über
den Menachinon (MQ)-Pool in der Membran gekoppelt (Abb. 2.8). Dabei werden Protonen
über eine Redox-Schleife vom Cytosol ins Periplasma transloziert (Bertero et al., 2003).
15
Einleitung
FdnGHI gehört auch zur [Mo(MGD)2]-Familie. Die Untereinheit FdnG hat ebenfalls Strukturund Sequenz-Ähnlichkeit zur C-terminalen Domäne von NuoG (Rothery et al., 2008).
Periplasma
Cytosol
Abbildung 2.8: Schematische Darstellung der Nitratatmung in E. coli (Bertero et al., 2003). Der von
FdnGHI und NarGHI katalysierte Elektronentransfer von Formiat (Periplasma) zu Nitrat (Cytosol) und der
redox-gekoppelten Protonentransport über MQ/MQH2 in der Membran ist dargestellt. FS bezeichnen Fe/SZentren und bD und bP entsprechen Häm-Gruppen.
Die Untereinheiten NarG, H und I bilden den 224 kDa schweren NarGHI-Komplex. Die Gene
narGHJI sind in einem Operon organisiert. Das Gen narJ kodiert für das Chaperon NarJ, das
essentiell für die Assemblierung des gesamten Enzyms und für die Reifung sowie Insertion
der Kofaktoren ist (Blasco et al., 1998; Lanciano et al., 2007). Der Komplex trägt insgesamt
acht Kofaktoren: ein [Mo(MGD)2], vier vierkernige und ein dreikerniges Fe/S-Zentrum sowie
zwei Häm-Gruppen. Der Komplex ist über NarI, das die Häm-Gruppen bP und bD trägt, in der
Membran verankert. NarH trägt das dreikernige Fe/S-Zentrum FS4 sowie die vierkernigen
Zentren FS3, FS2 und FS1 und verbindet den Elektronentransfer von NarI zu NarG. Die zur
C-terminalen Domäne von NuoG homologe, katalytische Untereinheit NarG trägt den
[Mo(MGD)2]-Kofaktor und das vierkernige Zentrum FS0, das wie N5 in NuoG von drei Cys
und einem His koordiniert wird. Abbildung 2.9 zeigt die Struktur des NarGHI-Komplexes bei
einer Auflösung von 1.6 Å (Bertero et al., 2003).
16
Einleitung
B)
A)
NarG
NarH
Cytosol
NarI
Periplasma
Abbildung 2.9: Struktur des NarGHI Komplexes aus E. coli (PDB-Eintrag: 1Q16; Bertero et al., 2003). A)
zeigt die Organisation der Untereinheiten und die Anordnung der Kofaktoren, die als Kalotten-Modelle
dargestellt sind. B) zeigt die Koordination des Mo (cyan) und des Fe/S-Zentrums FS0 in NarG. Die zwei MGD
(nach Elementfarben eingefärbt) und das FS0 (Fe in Rot, S in Gelb) sind als Stabmodelle abgebildet.
In der Gruppe von Prof. Axel Magalon Universität Marseilles, Frankreich, wurde gezeigt,
dass das Chaperon NarJ den [Mo(MGD)2]-Kofaktor und das FS0 in eine offene Form des
löslichen NarGH-Intermediats einsetzt (Lanciano et al., 2007). NarG untergeht eine
konformative Änderung und die geschlossene Form wird durch eine an der Oberfläche von
NarG befindlichen Salzbrücke aus den Resten Arg107 und Glu793 stabilisiert. Es wurde
gezeigt, dass nach Mutation einer der beiden Aminosäuren zu einem Alanin das Enzym noch
produziert wird, aber weder den [Mo(MGD)2]-Kofaktor noch das Fe/S-Zentrum FS0 trägt.
Diese Salzbrücke ist in der katalytischen Untereinheit von Enzymen der [Mo(MGD)2]Familie konserviert (Prof. Axel Magalon, persönliche Mitteilung).
In NuoG ist diese Oberflächen-Salzbrücke ebenfalls vorhanden und wird im E. coli
Komplex I von Arg280 und Glu617 gebildet. N7 in NuoG und FS0 in NarG sind in ähnlicher
Position zu der jeweiligen Salzbrücke angeordnet (Abb. 2.10). Die Mutation der N7koordinierenden Cysteine bedingte den Zerfall des Komplex I (Pohl et al., 2007b). Die
Auswirkung der Deletion der Salzbrücke auf die Assemblierung von Komplex I ist zu
untersuchen.
17
Einleitung
B)
A)
FS0
N7
Abbildung 2.10: Oberflächen-Salzbrücke in NarG A) und NuoG B). Die Strukturen sind nach ihren
Sekundärstrukturelementen eingefärbt. A) zeigt NarG mit dem [Mo(MGD)2]-Kofaktor (rot) und dem Zentrum
FS0 (PDB-Eintrag: 1Q16; Bertero et al., 2003). B) zeigt NuoG mit dem Zentrum N7 (PDB-Eintrag: 3IAM;
Berrisford und Sazanov, 2009). Die Aminosäuren, die die Oberflächen-Salzbrücke bilden, sind farblich
hervorgehoben.
2.5 Die NADH-Bindestelle des Komplex I
In unserem Arbeitskreis wurden die Untereinheiten NuoE und NuoF des Komplex I aus dem
hyperthermophilen Bakterium A. aeolicus als Subkomplex NuoEF in E. coli überproduziert,
isoliert und kristallisiert
et al., 2008). NuoF ist aus einer N-terminalen Domäne,
die die glycinreiche Schleife trägt, einer ungewöhnlichen Rossmann-Faltung mit nur vier statt
fünf β-Strängen, die von zwei α-Helices flankiert werden, einer Ubiquitin-ähnlichen und einer
C-terminalen Domäne aus einem Bündel von vier α-Helices aufgebaut. Diese Helices
enthalten die Cysteine 347F, 350F, 353F und 393F, die das vierkernige N3 tetraedrisch
koordinieren. NuoE ist aus einer N-terminalen Domäne, die aus einem Bündel von vier αHelices besteht und mit NuoF wechselwirkt und einer Thioredoxin-ähnlichen Domäne, die
das zweikernige N1a bindet, aufgebaut (Kohlstädt, 2009). N1a wird von den Cysteinen 86E,
91E, 127E und 131E quadratisch planar koordiniert. Abbildung 2.11 gibt die Quartärstruktur
des Subkomplexes wieder.
18
Einleitung
Abbildung 2.11: Struktur des A. aeolicus Subkomplexes NuoEF bei 2.0 Å. Das FMN ist in Elementfarben als
Stabmodell dargestellt. Die Fe/S-Zentren N1a und N3 sind als Kalotten-Modelle mit Eisen in Rot und Schwefel
in Gelb dargestellt. Die N-terminale (blau), die ungewöhnliche Rossmann-Faltung (grün), die Ubiquitin-ähnliche
(beige) und die N3 koordinierende C-terminale Domäne (rot) von NuoF sind gezeigt. Die an NuoF bindende
Domäne von NuoE ist in Grau und die N1a koordinierende Thioredoxin-ähnliche Domäne in Türkis dargestellt
(Kohlstädt, 2009).
Der Subkomplex wurde zudem mit NAD+ im oxidierten und NADH im reduzierten Zustand
kristallisiert. Die Strukturen wurden jeweils bei 1.8 Å gelöst. Bei Anbindung des Nukleotids
öffnet sich die Bindetasche, indem sich die glycinreiche Schleife in der Struktur des
oxidierten Proteins um 0.4 bis 0.8 Å und in der des reduzierten Proteins um 0.6 bis 1.1 Å
Struktur bewegt. Das Adenin des NAD+/H wird durch π-Wechselwirkungen mit Phe71F und
Tyr205F stabilisiert. In beiden Strukturen bildet Lys76F Wasserstoff (H)-Brücken zum O3' der
Adenosin-Ribose und O2P des FMNs aus. Das Glu185F bildet in beiden Strukturen mit seiner
Seitenkette H-Brücken mit den Hydroxyl-Gruppen der Adenosin-Ribose und mit seinem
Peptid-Stickstoff eine H-Brücke zum O2' des FMN aus. In der Struktur der NADPHabhängigen Glutathion Reduktase aus E. coli wechselwirken zwei Arginin-Reste und ein
Lysin-Rest mit der zusätzlichen Phosphat-Gruppe des NADPHs (Scrutton et al., 1990; Mittl
et al., 1994). Die Arginin-Reste befinden sich in ähnlicher Position wie Glu185F und Lys76F
im Komplex I. Zudem bietet die NADH-Bindetasche etwas, aber nicht ausreichend Raum für
die zusätzliche Phosphat-Gruppe des NADPH. Es ist zu vermuten, dass das Glu185F durch
eine sterische Hinderung und/oder eine elektrostatische Abstoßung mit der zusätzlichen
Phosphat-Gruppe die Anbindung des NADPHs erschwert, was die geringe Aktivität des
Komplexes mit NADPH erklären würde (Stolpe, 2007). In der Struktur des reduzierten
19
Einleitung
Proteins mit gebundenem NADH bildet die Seitenkette des Lys202F eine H-Brücke mit der
Seitenkette von Glu184F und den Carbonyl-Gruppen von Arg200F und Ile392F. In der
Struktur des oxidierten Proteins ist die Seitenkette des Lys202F verdreht. Dadurch verliert es
die H-Brücken zu den Carbonyl-Gruppen und bildet eine neue mit der Seitenkette des
Glu185F aus, was wiederum dessen H-Brücken zur Adenosin-Ribose schwächt (Abb. 2.12 A).
Im Gegensatz dazu wurde für die Struktur des T. thermophilus Komplex I beschrieben, dass
das Lys202F im reduzierten Zustand eine H-Brücke zum Pyrophosphat des NADHs ausbildet
(Berrisford und Sazanov, 2009).
A)
B)
E97
Y180
E97
Y180
F71
E184
E185
F71
K76
E185
K76
E184
F79
K202
Y205
F79
K202
Y205
Abbildung 2.12: Wechselwirkungen der Seitenketten von NuoF mit NAD+/H im Subkomplex NuoEF im
oxidierten A) bzw. reduzierten B) Zustand. Oxidiertes NuoF (grau) mit gebundenem NAD + (grün) und
reduziertes NuoF (hellblau) mit gebundenem NADH (magenta) sind dargestellt. Mit NAD + bzw. NADH
wechselwirkenden Seitenketten sowie deren Nomenklatur sind gezeigt. H-Brücken wurden mit dem Programm
UCSF Chimera nach Mills und Dean bestimmt (Mills und Dean, 1996; Pettersen et al., 2004) und sind durch
gestrichelte Linien angedeutet. Das FMN ist in Gelb dargestellt.
Ein sehr wichtiger Unterschied zwischen der Struktur des Proteins im oxidierten und im
reduzierten Zustand ist die Umorientierung der Peptidbindung des Glu95F (Abb. 2.13). In der
Struktur des reduzierten Proteins zeigt die Peptidbindung vom FMN weg. Dabei verdrängt
sein Carbonyl-Sauerstoff ein H2O, das in der Struktur des oxidierten Proteins die gesamte
Schleife über H-Brücken stabilisiert. In dieser Konformation ist genügend Platz für die
Anbindung des NADH. In der Struktur des oxidierten Proteins zeigt die Carbonyl-Gruppe der
Peptidbindung zum FMN hin. Aufgrund des sterischen Anspruchs der Carbonyl-Gruppe wird
das NAD+ bei dieser Umorientierung aus der Bindetasche geschoben (Abb. 2.13).
20
Einleitung
A)
B)
E95
E95
D94
Abbildung 2.13: Peptidrückgrate der NADH-Bindestelle. A) zeigt die überlagerten Strukturen des A. aeolicus
NuoEF im oxidierten Zustand (grau) mit NAD+ (grün) und im reduzierten Zustand (hellblau) mit NADH
(magenta). Das Rückgrat von Glu95F ist jeweils in der gleichen Farbe wie das gebundene Nukleotid dargestellt.
Das in der reduzierten Struktur verdrängte H2O ist grün markiert. B) zeigt die überlagerten Strukturen des
T. thermophilus (beige) und A. aeolicus (hellblau) NuoF jeweils im reduzierten Zustand mit gebundenem NADH
(T. thermophilus: orange, A. aeolicus: magenta). Die Orientierung des Rückgrats an den Positionen Asp94F und
Glu95F (Farbgebung der Nukleotide entsprechend) ist gezeigt.
Die Umorientierung der Carbonyl-Gruppe scheint eine Art „Auswurf-Mechanismus“ für das
Produkt NAD+ darzustellen. Aus der Struktur geht nicht hervor, ob die Änderung des RedoxZustands des FMN oder des N1a der Schalter für die Umorientierung des Rückgrats von
Glu95F ist. Die Anbindung des Nukleotids kann als Schalter ausgeschlossen werden, da die
Peptidbindung in der Struktur des oxidierten und reduzierten Proteins ohne gebundenes
Nukleotid jeweils die entsprechende Orientierung einnimmt. In der Struktur des
T. thermophilus Komplex I mit gebundenem NADH zeigt die Carbonyl-Gruppe des Glu95F
ebenfalls vom FMN weg, jedoch weist die Peptidbindung des Asp94F eine andere
Orientierung auf (Abb. 2.13 B, Berrisford und Sazanov, 2009). Aufgrund der geringen
Auflösung von 3.1 Å ist es jedoch schwierig, die genaue Orientierung des Rückgrats in dieser
Struktur anzugeben. In der A. aeolicus NuoEF Struktur ist die Seitenkette des Glu95F über
H-Brücken mit den Amid-Stickstoffen von Arg103F und Asp104F und mit der Seitenkette des
Tyr138F im oxidierten und reduzierten Zustand fest verankert. In der Struktur des reduzierten
Proteins ist die Seitenkette des Glu95F zusätzlich über ein H2O-Molekül mit dem NN7 des
NADH verbunden (Abb. 2.14). In beiden Strukturen ist der Amid-Stickstoff des Glu95F über
ein H2O-Molekül mit dem N3 des FMNs verbrückt. Sehr wichtig scheint das von FMN,
Asp94F und Tyr180F koordinierte Wasser zu sein (Abb. 2.14). In der Struktur des oxidierten
Proteins bildet es zusätzlich eine H-Brücke zu der zum FMN hin orientierten CarbonylGruppe des Glu95F. In der Struktur des reduzierten Proteins bildet es zusätzlich zur H-Brücke
21
Einleitung
zum O4- noch eine zum N5-Atom des FMNs (Abb. 2.14 B). In beiden Strukturen ist das
Glu97F über ein H2O-Molekül mit dem O2' der Nikotinamid-Ribose verbrückt (Abb. 2.14).
Das Glu97F verdreht sich in der Struktur des reduzierten Proteins, um mit Tyr180F eine HBrücke zu bilden. Mit seinem Amid-Stickstoff bildet es zusätzlich eine H-Brücke zum NO7
des Nikotinamids aus. Es wird vermutet, dass die H-Brücke zu Tyr180F die Anbindung des
Nikotinamids in 3.0 Å Abstand zum Isoalloxazinring des FMNs stabilisiert, um den
Hydridtransfer zu unterstützen. Die Mutation des Glu97F im E. coli Komplex I (Glu95F) zu
Glutamin führte zu einer um etwa ein Drittel verminderten Aktivitäten (Euro et al., 2009). Die
Mutation des Tyr180F zu Cys ist bei einem Patienten mit dem Leigh-like Syndrom verknüpft
(Bénit et al., 2001; Pagniez-Mammeri et al., 2012). Zudem wird vermutet, dass das Tyr unter
Ausbildung eines Tyrosyl-Radikals an der ROS-Produktion im Komplex I beteiligt sein
könnte.
A)
B)
E97
E97
E95
E95
Y180
Y180
D94
D94
Abbildung 2.14: H-Brücken-Netzwerk am aktiven Zentrum im oxidierten A) und reduzierten B)
Subkomplex NuoEF. A) zeigt den oxidierten Subkomplex (grau) mit gebundenem NAD+ (grün) und B) den
reduzierten (hellblau) mit gebundenem NADH (magenta). Die verbrückenden H2O sind dunkelblau markiert.
H-Brücken sind durch gestrichelte Linien dargestellt.
Eine komplette Auflistung aller von NAD+/NADH und FMN zu NuoF gebildeten H-Brücken
in erster und zweiter Koordinationssphäre sind im Anhang 7.1 (Tab. 7.1 – 7.4) aufgeführt.
22
Einleitung
2.6 λ-Red vermittelte Rekombination
Unter homologer Rekombination versteht man den Austausch von DNA-Abschnitten, die
über homologe DNA-Sequenzen verfügen. Eukaryoten und Prokaryoten benutzen ihr
Rekombinase-System als Reparaturmechanismus, um beschädigte chromosomale DNA über
einen Austauschmechanismus zu reparieren. Das E. coli Rekombinase-System besteht
hauptsächlich aus RecA und RecBCD (Clark und Sandler, 1994). Die Exonuklease-Aktivität
des RecBCD-Komplexes erzeugt 3'-Überhänge, an die RecA bindet und die Rekombination
vermittelt (Anderson und Kowalczykowski, 1997). Zur gezielten in vitro Manipulation von
DNA ist das E. coli Rekombinations-System nicht geeignet, da es für den Austausch etwa
1 kbp lange, homologe Bereiche benötigt. Zudem verhindert die Exonuklease-Aktivität von
RecBCD den Einbau linearer DNA. Das Rekombinase-System des λ-Phagen bietet die
Möglichkeit, Gene durch lineare Einzelstrang (ss) und Doppelstrang (ds) DNA in einem
E. coli-Wirt gezielt zu modifizieren (Murphy, 1998; Ellis et al., 2001). Das -Red System
(recombinant defective) besteht aus den Proteinen Gam, Exo und Beta und benötigt für eine
effiziente Rekombination etwa 36 – 50 nt lange homologe Bereiche (Datsenko und Wanner,
2000). λ-Gam inhibiert den RecBCD-Komplex des Wirts (Murphy, 1991). Die 5'-3'
Exonuklease λ-Exo baut einen Strang des dsDNA-Fragments ab und lässt einen intakten
ssDNA Strang zurück (Mosberg et al., 2010). λ-Beta bindet an die ssDNA, verhindert so den
Abbau durch Nukleasen und vermittelt die Anlagerung an die komplementären Stränge (Court
et al., 2002). Die lineare ssDNA wird hauptsächlich als Okazaki-Fragment an der
Replikationsgabel auf dem Folgestrang eingebaut, wobei auch der Einbau am Leitstrang
beobachtet wird (Mosberg et al., 2010). Die -Red vermittelte Rekombination kann
unabhängig von der Größe der zu manipulierenden DNA eingesetzt werden und hat sich zu
einer bewährten Methode zur Modifikation chromosomaler und episomaler DNA entwickelt
(Jeong et al., 2013; Pohl et al., 2007b).
Das in unserem Arbeitskreis zur Expression der E. coli nuo-Gene verwendete Plasmid
pBADnuo nuoFhis ist aufgrund seiner Größe einer ortsgerichteten Mutagenese nicht
zugänglich. Um Punktmutationen in einzelne Gene einzufügen muss zuerst eine ortsgerichtete
Mutagenese und dann eine -Red vermittelte Rekombination angewendet werden (Abb. 2.15).
Um die Effizienz der -Red vermittelten Rekombination zu steigern, wurde in dieser Arbeit
das Suizid-System nptI-sacB verwendet (Ried und Collmer, 1987).
23
Einleitung
3. Ortsgerichte
Mutagenese
Subklon
nuo
pVO1100
5 – 7 kBp
5 – 7 kBp
1. PCR
4. PCR
nptI-sacB-Kassette
mit homologen
Bereichen zum Zielgen
mutiertes
nuo-Zielgen
2. λ-Red vermittelte
Rekombination und
Selektion auf Kanamycin
pBADnuo
nuoFhis
Subklon
nuo
pBADnuo
nuoFhis::nptIsacB
21 kBp
zur Darstellung des
Expressionsvektor mit nptIsacB-Kassette im Zielgen
25 kBp
5. λ-Red vermittelte
Rekombination und
Selektion auf Saccharose
pBADnuo
nuoFhis
21 kBp
Expressionsvektor mit
Punktmutation im Zielgen
Abbildung
2.15:
Schematische
Darstellung
der
Strategie
zur
Mutagenese
des
Komplex I-
Expressionsplasmids. Zur Insertion der Selektions-Kassette in den Expressionsvektor pBADnuo nuoFhis wird
zunächst mittels PCR die nptI-sacB-Kassette aus der Vorlage pVO1100 mit Oligonukleotiden, welche die für die
Rekombination notwendigen homologen Bereiche tragen, amplifiziert. Im zweiten Schritt wird mittels λ-Red
vermittelter Rekombination die nptI-sacB-Kassette in der Verktor insertiert und positive Klone auf kanamycinhaltigen Medium selektiert. Zur Insertion von Punktmutationen in den Expressionsvektor wird zunächst durch
Ortsgerichtete Mutagenese an einem Subklon, der das Zielgen enthält, die gewünschte Mutation eingebracht. Im
nächsten Schritt wird das mutierten Gen mittels PCR amplifiziert. Im letzten Schritt wird das mutierte Gen mit
Hilfe der λ-Red vermittelten Rekombination in den Vektor pBADnuo nuoFhis eingebracht. Die homologen
Bereiche sind grün und das Zielgen blau dargestellt.
24
Einleitung
Zur Kontrolle wird die durch sacB vermittelte Empfindlichkeit gramnegativer Bakterien
gegen Saccharose genutzt (Gay et al., 1985). Die durch nptI vermittelte Kanamycin-Resistenz
wird zur Selektion auf den Einbau der Kassette verwendet.
Zunächst wird die nptI-sacB-Kassette mittels Polymerasekettenreaktion (polymerase chain
reaction, PCR) amplifiziert und durch -Red vermittelte Rekombination in das Zielgen
insertiert. Die für die Rekombination benötigten homologen Bereiche werden durch die
Oligonukleotide in die Sequenzen eingeführt. Zur Selektion positiver Klone wird die durch
nptI vermittelte Kanamycin-Resistenz genutzt. Die gewünschten Punktmutationen werden
durch ortsgerichtete Mutagenese in einen Subklon, der das Zielgen enthält, eingefügt. Es
werden lineare Fragmente, welche die gewünschten Mutationen tragen, mittels PCR
amplifiziert und durch -Red vermittelte Rekombination gegen die Selektions-Kassette im
Plasmid pBABnuo nuoFhis::nptI-sacB ausgetauscht. Zur Selektion auf die gewünschten Klone
wird die durch sacB vermittelte Empfindlichkeit gegen Saccharose genutzt.
Um die Rekombination des PCR-Produkts mit genomischer DNA zu verhindern, wurde in
dieser Arbeit der E. coli Stamm DH5αΔnuo/pKD46 verwendet (Pohl et al., 2007b). Der
Vektor pKD46 trägt das red-Operon unter der Kontrolle eines ara-Promotors und ein
Temperatur-sensitives Replikon, das die Replikation bei 37 °C verhindert.
25
Einleitung
2.7 Ziel der Arbeit
NADPH wird von Komplex I nur sehr langsam umgesetzt. Strukturanalysen der NADHBindetasche haben gezeigt, dass vermutlich Glu183F aufgrund von sterischen und
elektrostatischen Abstoßungen für die Substratspezifität von Komplex I verantwortlich ist.
Um diese Annahme zu überprüfen, sollte Glu183F im E. coli Komplex I jeweils gegen Ala,
Asn, Asp, Gln und Gly ausgetauscht werden. Zudem sollte, um eine elektrostatische
Anziehung an diese Position einzubringen, das Glu gegen His ausgetauscht werden. Die
strukturellen Effekte der Mutationen sollten durch die homologen Varianten des A. aeolicus
NuoEFHis-Subkomplexes untersucht werden. Diese sollten präpariert und falls möglich
kristallisiert werden.
Auf dem Genom eines am Leigh-like-Syndrom erkrankten Patienten wurde die Mutation
Tyr204Cys auf der Untereinheit NDUFV1 (homolog zu E. coli Tyr178CysF) nachgewiesen.
Die Auswirkung der Mutation auf die Aktivität des Komplex I sollte durch Mutation der
homologen Position im E. coli Komplex I gegen Phe, Leu, Ala und Cys untersucht werden.
Die Varianten sollten produziert, präpariert und charakterisiert werden.
Quantenmechanische Rechnungen deuten auf eine Beteiligung aromatischer Aminosäuren am
Elektronentransfer im Komplex I hin. In vorangegangen Arbeiten wurde gezeigt, dass die
Variante W221LG, mit der Mutation zwischen N5 und N6a, gegenüber dem Ausgangsstamm
eine um 30% verminderte d-NADH-Oxidaseaktivität aufweist. Um strukturelle Gründe für die
verminderte Aktivität ausschließen zu können, sollte versucht werden Doppelmutanten von
der Mutante Trp221LeuG zu generieren, die die ursprüngliche Aktivität aufweisen. Hierfür
sollten Aliphatische Aminosäuren an ähnlicher Position zwischen N5 und N6a gegen Trp
ausgetauscht und die Aktivität der Doppelmutanten bestimmt werden.
E. coli besitzt neben Komplex I noch die alternative NADH:Ubichinon Oxidoreduktase. Um
die Komplex I-vermittelte NADH-Oxidaseaktivität in den Cytoplasmamembranen zu
bestimmen, muss das kostspielige spezifische Substrat d-NADH verwendet werden. Um dies
zu umgehen, sollte in dieser Arbeit der E. coli Stamm BW25113nptI Δnuo Δndh als
Überproduzent für den E. coli Komplex I etabliert werden.
In Kooperation mit Dr. Judy Hirst sollte untersucht werden, ob die Mutationen Val96ProE und
Asn142MetE die in der einzeln produzierten Untereinheit NuoE das Mittenpunktspotential des
Fe/S-Zentrums N1a drastisch erniedrigen, den gleichen Effekt im gesamten E. coli Komplex I
haben. Die Varianten sollten dargestellt und die physiologischen Auswirkungen der
Mutationen untersucht werden.
26
Einleitung
Der Redox-induzierte Konformationswechsel der Peptidbindung von Glu95F wird als
„Auswurf-Mechanismus“ für das Produkt NAD+ diskutiert. In dieser Arbeit sollte versucht
werden, durch Mutationen H-Brücken einzubringen, die die Peptidbindung des Glu95F in
einer Konformation fixieren. Zum strukturellen Nachweis der Fixierung sollte Gly129E in
A. aeolicus NuoEF jeweils gegen Ser und Asp ausgetauscht werden. Die Varianten sollten
präpariert und kristallisiert werden. Zur funktionellen Charakterisierung sollte die homologe
Position Gly135E im E. coli Komplex I mutiert werden.
In der katalytischen Untereinheit NarG der Nitratreduktase A führte die Deletion einer
Oberflächen-Salzbrücke zum mangelnden Einbau oder zum Verlust der Kofaktoren. Die das
Zentrum N7 bindende C-terminale Domäne von NuoG ist homolog zu NarG und weist eine
Oberflächen-Salzbrücke zwischen Arg280G und Glu617G auf. In dieser Arbeit sollte Glu617G
gegen Ala im E. coli Komplex I ausgetauscht und die Auswirkung auf die Stabilität des
Komplexes untersucht werden.
Die EPR-Signale des Komplex I wurden anhand biochemischer Charakterisierung den
einzelnen
Fe/S-Zentren
zugeordnet.
Allerdings
wird
diese
Zuordnung
seit
der
Veröffentlichung der Struktur des peripheren Arms scharf diskutiert. Es ist strittig, ob das
EPR-Signal N4 von den strukturell definierten Fe/S-Zentren N4, N5 oder N6a generiert wird.
In dieser Arbeit sollten die Liganden der strukturell definierten Zentren N4 und N5 jeweils
gegen Alanine ausgetauscht werden. Anhand der Aktivitäten und der EPR-Spektren sollte
versucht werden, die EPR-Signale den strukturell definierten Zentren zuzuordnen.
In Zusammenarbeit mit Karoline Aierstock und Dr. Lothar Kussmaul, Boehringer Ingelheim,
Biberach, sollten für enzymkinetische und strukturelle Untersuchungen sowie zur
Bestimmung der ROS-Produktion die Positionen Glu95F, Glu97F und Tyr180F des A. aeolicus
Subkomplexes NuoEFHis gegen verschiedene Aminosäuren ausgetauscht werden.
27
Material und Methoden
3 Material und Methoden
3.1 Chemikalien
Tabelle 3.1 gibt alle in dieser Arbeit verwendeten Chemikalien und deren Hersteller wieder.
Tabelle 3.1: Verwendete Chemikalien.
Chemikalie
Acrylamid-Bisacrylamid-Lösung (29:1, w/w)
Hersteller
Gerbu
Adenosin-5'-diphosphoribose (ADP-Ribose)
Sigma Aldrich
Agar
Agarose low EEO
9-Amino-3-chlor-7-methoxyacridin (ACMA)
Ammoniumchlorid (NH4Cl)
Applichem
Applichem
Sigma Aldrich
Roth
Ammoniumperoxodisulfat (APS)
Merck
Ammoniumsulfat ((NH4)2SO4)
Grüssing
Ampicillin, Natriumsalz
Roth
Amplex Red
Antifoam 204
L-(+)-Arabinose
Biobeads SM-2
1,3-Bis(tris(hydroxymethyl)-methylaminopropan) (BisTris)
Borsäure
Bromphenolblau
Invitrogen
Sigma Aldrich
Roth
BioRad
Roth
Applichem
Sigma Aldrich
Calciumchlorid (CaCl2)
Fluka
Carbonylcyanid-3-chlorphenylhydrazon (CCCP)
Sigma
Casein (säurehydrolysiert)
Chloramphenicol
Cobaltchlorid (CoCl2)
Coomassie Brilliant Blue R-250 (CBB R-250)
L-Cystein
3,3'-Diaminobenzidin
5-(Diethoxyphosphoryl)-5-methyl-1-pyrrolin-N-oxid
(DEPMPO)
2,3-Dimethoxy-5-methyl-6-decyl-1,4-benzochinon (DecylUbichinon)
Dithiothreitol (DTT)
DNase I
n-Dodecyl-β-D-maltopyranosid (DDM)
Roth
Roth
Merck
Applichem
Applichem
Sigma
28
Enzo
Sigma
Gerbu
Applichem
Applichem
Material und Methoden
Tabelle 3.1; Fortsetzung.
E. coli polare Lipide (E. coli polar lipid extract)
Eisen-Ammonium-Citrat (14.5 – 16% (w/w) Eisen)
Essigsäure
Ethanol abs.
Ethidiumbromid-Lösung (1%ig)
Ethylendiamintetraessigsäure, di-Natriumsalz (EDTA)
Fenazaquin
Glucose
Glycerin (~86%)
Glycin
Hefeextrakt
2-(4-(2-Hydroxyethyl)-1-piperazinyl)-ethansulfonsäure,
Natriumsalz (HEPES)
Imidazol
Isopropanol
Isopropyl-β-D-thio-galactopyranosid (IPTG)
Kaliumacetat
Kaliumchlorid (KCl)
Kaliumcyanid (KCN)
Kaliumdihydrogenphosphat (KH2PO4)
Kaliumhexacyanoferrat(III) (K3[Fe(CN)6])
di-Kaliumhydrogenphosphat (K2HPO4)
Kaliumiodid (KI)
Kalium-Natrium- Tartrat (Seignettesalz)
Kanamycinsulfat
Kupfersulfat Pentahydrat (CuSO4·5 H2O)
Magnesiumchlorid (MgCl2)
Magnesiumsulfat (MgSO4)
Malonat
D-Mannitol
Meerrettichperoxidase (HRP)
2-Mercaptoethanol
Methanol
2-Methylbutan
Methylcyclohexan
2-N-Morpholino-ethansulfonsäure (MES)
3-N-Morpholino-propansulfonsäure (MOPS)
Tri-Natriumcitrat
Natriumchlorid (NaCl)
Natriumdithionit (Na2S2O4)
Avanti Polar Lipids
Sigma
VWR
VWR
Roth
Sigma Aldrich
Sigma
Grüssing
Roth
Applichem
Ohly
Gerbu
Applichem
Sigma Aldrich
Gerbu
Roth
Merck
Merck
Roth
Applichem
Merck
Merck
Grüssing
Roth
Grüssing
VWR
Grüssing
Institutsbestände
Applichem
MP Biomedicals
Roth
Institutsbestände
Merck
Merck
Applichem
Applichem
Roth
VWR
Merck
29
Material und Methoden
Tabelle 3.1; Fortsetzung.
Natriumdodecylsulfat (SDS)
di-Natriumhydrogenphosphat (Na2HPO4)
Natriumhydroxid (NaOH)
tri-Natriumphosphat (Na3PO4)
Natriumsulfat (Na2SO4)
Nickelsulfat (NiSO4)
Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid, di-Natriumsalz, oxidierte
Form (NAD+)
Nicotinamid-Adenin-Dinukleotid, di-Natriumsalz, reduzierte
Form (NADH)
Nicotinamidadenin-Dinukleotid-2'-phosphat, Tetra-Natriumsalz
Hydrat, reduzierte Form (NADPH)
Nicotinamid-Hypoxanthin-Dinukleotid, Natriumsalz, reduzierte
Form (d-NADH)
desoxy-Nukleosidtriphosphatemix
Pepton aus Casein (pankreatischer Verdau)
Phenylmethylsulfonylfluorid (PMSF)
Phosphorsäure (85%; w/w)
Piericidin A
Polyethylenglycol (PEG) 3350
Riboflavin
Rinderserum Albumin (BSA)
RNase A
D-(+)-Saccharose
Salzsäure (HCl)
Succinat
Superoxiddismutase (Rinderleber)
N,N,N',N'-Tetramethyldiamin (TEMED)
Thiaminhydrochlorid
Trichloressigsäure (TCA)
Tris-(hydroxymethyl)-aminomethan (Tris)
N-[Tri(hydroxymethyl)-methyl]-glycin (Tricin)
L-Tryptophan
Tween 20
Valinomycin
Wasserstoffperoxyd (H2O2)
30
Serva
VWR
VWR
Grüssing
Roth
Aldrich
Sigma Aldrich/ Roth
Roth
Sigma Aldrich
Sigma Aldrich
Thermo Scientific
Applichem
Applichem
Merck
Aus Institutsbeständen
Sigma Aldrich
Applichem
Applichem
Applichem
Roth
VWR
Serva
Sigma Aldrich
Serva
Merck
Merck
Applichem
Roth
Merck
Acros
Sigma Aldrich
Sigma Aldrich
Material und Methoden
3.2
Stämme
Die in dieser Arbeit verwendeten Bakterienstämme sind in Tabelle 3.2 aufgeführt.
Tabelle 3.2: Verwendete E. coli Stämme.
E. coli Stamm
DH5α
DH5nuo
BW25113
BW25113nuo
BW25113ndh::nptI
BW25113nptI nuo
ndh
Rosetta(DE3)
Genotyp
F- Φ80lacZ∆M15 Δ(lacZYAargF)U169 recA1 endA1 hsdR17
(rK- mK+) phoA supE44 λ- thi-1
gyrA96 relA1
DH5Δnuo
lacIq rrnBT14 lacZWJ16 hsdR514
araBADAH33 rhaBADLD78
BW25113 nuo
BW25113 ndh::FRTnptIFRT
BW25113 nuo ndh; nptI
F- ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm
pRARE (camR)
Referenz
Invitrogen
(Pohl, 2008)
(Datsenko & Wanner, 2000)
(Macedo Vranas, 2013)
(Baba et al., 2006)
T. Lenn (persönliche
Mitteilung)
Novagen
3.2 Verwendete Vektoren
Die in dieser Arbeit verwendeten und dargestellten Vektoren sind in Tabelle 3.3 aufgeführt.
Tabelle 3.3: Verwendete Vektoren.
Vektor
pCA24NnuoCD
Genotyp
pCA24NnuoCD T504W
pCA24NnuoCD S519W
pCA24NnuoE
pCA24NnuoCD, nuoCD T504W
pCA24NnuoCD, nuoCD S519W
camR, ColE1 origin, lacI-PT5-lac
his6-nuoE
pCA24NnuoE V96P
pCA24NnuoE V96P/N142M
pCA24NnuoE G135D
pCA24NnuoE G135S
pCA24NnuoE N142M
pCA24NnuoI
pCA24NnuoE, nuoE V96P
pCA24NnuoE, nuoE V96P/N142M
pCA24NnuoE, nuoE G135D
pCA24NnuoE, nuoE G135S
pCA24NnuoE, nuoE N142M
camR, ColE1 origin, lacI-PT5-lac
his6-nuoI
pCA24NnuoI L65W
pCA24NnuoI, nuoI L65W
camR, ColE1 origin, lacI-PT5-lac
his6-nuoCDgfp
Referenz
(Kitagawa et al.,
2005)
(Dek vić, 2012)
(Dek vić, 2012)
(Kitagawa et al.,
2005)
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
(Kitagawa et al.,
2005)
(Dek vić, 2012)
31
Material und Methoden
Tabelle 3.3; Fortsetzung.
pCA24NnuoF
camR, ColE1 origin, lacI-PT5-lac
his6-nuoF
pCA24NnuoF E183A
pCA24NnuoF E183D
pCA24NnuoF E183G
pCA24NnuoF E183H
pCA24NnuoF E183N
pCA24NnuoF E183Q
pUC25nuoE´–G
pCA24NnuoF, nuoF E183A
pCA24NnuoF, nuoF E183D
pCA24NnuoF, nuoF E183G
pCA24NnuoF, nuoF E183H
pCA24NnuoF, nuoF E183N
pCA24NnuoF, nuoF E183Q
ampR, pUC origin, lacZ´, ´nuoE-G
nuoFcstrep-tagII
pUC25nuoE´–G, nuoF Y178A
pUC25nuoE´–G, nuoF Y178F
pUC25nuoE´–G, nuoF Y178L
pUC25nuoE´–G, nuoF Y178C
pUC25nuoE´–G, nuoG H101A
pUC25nuoE´–G, nuoG C105A
pUC25nuoE´–G, nuoG V107W
pUC25nuoE´–G, nuoG C108A
pUC25nuoE´–G, nuoG C114A
pUC25nuoE´–G, nuoG C153A
pUC25nuoE´–G, nuoG C156A
pUC25nuoE´–G, nuoG C159A
pUC25nuoE´–G, nuoG C203A
pUC25nuoE´–G , nuoG R219L
pUC25nuoE´–G, nuoG
R219W/W221L
pUC25nuoE´–G nuoF Y178A
pUC25nuoE´–G nuoF Y178F
pUC25nuoE´–G nuoF Y178L
pUC25nuoE´–G nuoF Y178C
pUC25nuoE´–G H101A
pUC25nuoE´–G C105A
pUC25nuoE´–G V107W
pUC25nuoE´–G C108A
pUC25nuoE´–G C114A
pUC25nuoE´–G C153A
pUC25nuoE´–G C156A
pUC25nuoE´–G C159A
pUC25nuoE´–G C203A
pUC25nuoE´–G R219L
pUC25nuoE´–G
R219W/W221L
pUC25nuoE´–G
R219W/W221R
pUC25nuoE´–G W221L
pUC25nuoE´–G E617A
pBADnuo nuoFhis
(Kitagawa et al.,
2005)
diese Arbeit
diese Arbeit
(Hubrich, 2010)
(Hubrich, 2010)
(Hubrich, 2010)
(Hubrich, 2010)
(Kohlstädt, 2009)
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
(Burschel, 2013)
(Burschel, 2013)
(Dek vić, 2012)
(Burschel, 2013)
(Burschel, 2013)
diese Arbeit
diese Arbeit
(Burschel, 2013)
diese Arbeit
(Dek vić, 2012)
(Schäuble, 2013)
pUC25nuoE´–G, nuoG
R219W/W221R
(Schäuble, 2013)
pUC25nuoE´–G, nuoG W221L
pUC25nuoE´–G, nuoG E617A
camR, p15a origin, araC-ParaBAD
nuoA-N, his6-nuoF
pBADnuo nuoFhis, nuoCD::
nptI-sacR sacB, nuoG W221L
(Dörner, 2010)
diese Arbeit
(Pohl et al., 2007c)
pBADnuo nuoFhis nuoCD
T504W nuoG W221L
pBADnuo nuoFhis, nuoCD T504W,
nuoG W221L
(Dek vić, 2012)
pBADnuo nuoFhis nuoCD
S519W nuoG W221L
pBADnuo nuoFhis, nuoCD S519W,
nuoG W221L
(Dek vić, 2012)
pBADnuo nuoFhis nuoE::nptIsacB
pBADnuo nuoFhis, nuoE::nptI-sacR
sacB
(Dörner, 2010)
pBADnuo nuoFhis nuoE V96P
pBADnuo nuoFhis, nuoE V96P
diese Arbeit
pBADnuo nuoFhis nuoE
V96P/N142M
pBADnuo nuoFhis, nuoE
V96P/N142M
diese Arbeit
pBADnuo nuoFhis
nuoCD::nptI-sacB
nuoG W221L
32
(Dek vić, 2012)
Material und Methoden
Tabelle 3.3; Fortsetzung.
pBADnuo nuoFhis, nuoE G135D
diese Arbeit
pBADnuo nuoFhis, nuoE G135S
pBADnuo nuoFhis, nuoE N142M
diese Arbeit
diese Arbeit
(Hubrich, 2010)
pBADnuo nuoFhis Y178A
pBADnuo nuoFhis Y178C
pBADnuo nuoFhis Y178F
pBADnuo nuoFhis Y178L
pBADnuo nuoFhis E183A
pBADnuo nuoFhis E183D
pBADnuo nuoFhis E183H
pBADnuo nuoFhis E183G
pBADnuo nuoFhis E183N
pBADnuo nuoFhis E183Q
pBADnuo nuoFhis, hisnuoF::nptIsacR sacB
pBADnuo nuoFhis, hisnuoF Y178A
pBADnuo nuoFhis, hisnuoF Y178C
pBADnuo nuoFhis, hisnuoF Y178F
pBADnuo nuoFhis, hisnuoF Y178L
pBADnuo nuoFhis, hisnuoF E183A
pBADnuo nuoFhis, hisnuoF E183D
pBADnuo nuoFhis, hisnuoF E183H
pBADnuo nuoFhis, hisnuoF E183G
pBADnuo nuoFhis, hisnuoF E183N
pBADnuo nuoFhis, hisnuoF E183Q
pBADnuo nuoFhis nuoGc::nptIsacB
pBADnuo nuoFhis, nuoGcomplete::
nptI-sacR sacB
(Dek vić, 2012)
pBADnuo nuoFhis nuoG
H101A
pBADnuo nuoFhis, nuoG H101A
(Burschel, 2013)
pBADnuo nuoFhis nuoG
C105A
pBADnuo nuoFhis nuoG
V107W W221L
pBADnuo nuoFhis nuoG
C108A
pBADnuo nuoFhis nuoG
C114A
pBADnuo nuoFhis nuoG
C153A
pBADnuo nuoFhis nuoG
C156A
pBADnuo nuoFhis nuoG
C159A
pBADnuo nuoFhis nuoG
C203A
pBADnuo nuoFhis, nuoG C105A
(Burschel, 2013)
pBADnuo nuoFhis, nuoG V107W
W221L
(Dek vić, 2012)
pBADnuo nuoFhis, nuoG C108A
(Burschel, 2013)
pBADnuo nuoFhis, nuoG C114A
(Burschel, 2013)
pBADnuo nuoFhis, nuoG C153A
diese Arbeit
pBADnuo nuoFhis, nuoG C156A
diese Arbeit
pBADnuo nuoFhis, nuoG C159A
(Burschel, 2013)
pBADnuo nuoFhis, nuoG C203A
diese Arbeit
pBADnuo nuoFhis nuoE
G135D
pBADnuo nuoFhis nuoE G135S
pBADnuo nuoFhis nuoE
N142M
pBADnuo nuoFhis::nptI-sacB
(Gnandt, 2012)
(Gnandt, 2012)
diese Arbeit
(Gnandt, 2012)
diese Arbeit
diese Arbeit
(Hubrich, 2010)
diese Arbeit
diese Arbeit
(Hubrich, 2010)
pBADnuo nuoFhis nuoG
R219L
pBADnuo nuoFhis nuoG
R219W/W221L
pBADnuo nuoFhis, nuoG R219L
(Dek vić, 2012)
pBADnuo nuoFhis, nuoG
R219W/W221L
(Schäuble, 2013)
pBADnuo nuoFhis nuoG
R219W/W221R
pBADnuo nuoFhis, nuoG
R219W/W221R
(Schäuble, 2013)
33
Material und Methoden
Tabelle 3.3; Fortsetzung.
pBADnuo nuoFhis nuoG
W221L
pBADnuo nuoFhis nuoG
E617A
pBADnuo nuoFhis nuoG
W221L nuoI2::nptI-sacB
pVO1100
pBADnuo nuoFhis, nuoG W221L
(Dörner, 2010)
pBADnuo nuoFhis, nuoG E617A
diese Arbeit
pBADnuo nuoFhis, nuoG W221L,
nuoI2:: nptI-sacR sacB
(Dek vić, 2012)
ampR, kanR, nptI-sacRsacB
pKD46
ampR, R101 origin, araCParaBAD, exo, bet, gam
pETBlue-1nuoEFhisG
ampR, pUC origin, PT7lac, lacZ´,
nuoEFaxa-his6 nuoG
ampR, pUC origin, PT7lac, lacZ´,
nuoEFaxa-his6
pETBlue-1nuoEFhis, nuoE G129D
V. Spehr (persönliche
Mitteilung)
(Datsenko und
Wanner, 2000)
(Kohlstädt, 2009)
pETBlue-1nuoEFhis
pETBlue-1nuoEFhis nuoE
G129D
pETBlue-1nuoEFhis nuoE
G129D
pETBlue-1nuoEFhis E95D
pETBlue-1nuoEFhis E95N
pETBlue-1nuoEFhis E95Q
pETBlue-1nuoEFhis E97D
pETBlue-1nuoEFhis E97N
pETBlue-1nuoEFhis E97Q
pETBlue-1nuoEFhisY180A
pETBlue-1nuoEFhisY180F
pETBlue-1nuoEFhisY180L
pETBlue-1nuoEFhisY180C
pETBlue-1nuoEFhis E185A
pETBlue-1nuoEFhis E185D
pETBlue-1nuoEFhis E185G
pETBlue-1nuoEFhis E185H
pETBlue-1nuoEFhis E185N
pETBlue-1nuoEFhis E185Q
34
diese Arbeit
diese Arbeit
pETBlue-1nuoEFhis, nuoE G129D
diese Arbeit
pETBlue-1nuoEFhis, nuoFhis E95D
pETBlue-1nuoEFhis, nuoFhis E95N
pETBlue-1nuoEFhis, nuoFhis E95Q
pETBlue-1nuoEFhis, nuoFhis E97D
pETBlue-1nuoEFhis, nuoFhis E97N
pETBlue-1nuoEFhis, nuoFhis E97Q
pETBlue-1nuoEFhis, nuoFhis Y180A
pETBlue-1nuoEFhis, nuoFhis Y180F
pETBlue-1nuoEFhis, nuoFhis Y180L
pETBlue-1nuoEFhis, nuoFhis Y180C
pETBlue-1 nuoEFhis, nuoFhis
E185A
pETBlue-1 nuoEFhis, nuoFhis
E185D
pETBlue-1 nuoEFhis, nuoFhis
E185G
pETBlue-1 nuoEFhis, nuoFhis
E185H
pETBlue-1 nuoEFhis, nuoFhis
E185N
pETBlue-1 nuoEFhis, nuoFhis
E185Q
(Engel, 2010)
(Engel, 2010)
(Engel, 2010)
(Engel, 2010)
(Engel, 2010)
(Engel, 2010)
(Engel, 2010)
(Engel, 2010)
(Engel, 2010)
diese Arbeit
(Burschel, 2011)
diese Arbeit
(Burschel, 2011)
diese Arbeit
diese Arbeit
diese Arbeit
Material und Methoden
3.3 DNA-Oligonukleotide
Die in dieser Arbeit verwendeten DNA-Oligonukleotide sind in den Tabellen 3.4 bis 3.6
aufgeführt.
Tabelle 3.4: Sequenzen der DNA-Oligonukleotide für die ortsgerichtete Mutagenese an den nuo-Genen
von E. coli und A. aeolicus. Die für die Mutagenese der A. aeolicus nuo-Gene verwendete Oligonukleotide sind
mit axa im Subskript gekennzeichnet. Die neu generierten Codons sind fett, die ausgetauschten Basen kursiv
hervorgehoben. Zum Nachweis der Mutation wurde eine neue Restriktionsschnittstelle eingefügt. Diese ist durch
Unterstrich gekennzeichnet und die ausgetauschten Basen kursiv hervorgehoben. Ausgetauschte Basen zur
Vermeidung von Haarnadelstrukturen sind grün markiert. Die Sequenzen der für die ortsgerichtete Mutagenese
notwendigen revers komplementären Oligonukleotide sind nicht aufgeführt. Sie werden im Text mit dem
g eic en Namen un er En ung „rev“ erw n . Deletierte Schnittstellen sind mit * markiert.
Oligonukleotid
nuoCD T504W_fwd
nuoCD S519W_fwd
nuoE V96P_fwd
nuoE G135S_fwd
nuoE G135D_fwd
nuoE N142M_fwd
nuoF Y178A_fwd
nuoF Y178C_fwd
nuoF Y178F_fwd
nuoF Y178L_fwd
nuoF E183A_fwd
nuoF E183D_fwd
nuoF E183G_fwd
nuoF E183H_fwd
nuoF E183N_fwd
nuoF E183Q_fwd
Sequenz
5'-CCGAAAGAGCGCTGGCTGCAGCATATCG
AAAC-3'
5'-CTTCCTGCAAGTGTGGTGGGGCCCGGTGA
TGCC-3'
5'-GTGACAGCGTGCCGTGCCATATTAATGGT
TATCAGG-3'
5'-CAACTTGCTGCTTAAGTAACTGTGATAAA
G-3'
5'-CTTGCTGCCTGGACAACTGTGATAAAGGG
CCCAACATGATGATC-3'
5'-GTGATAAAGGGCCCATGATGATGATCGA
TG-3'
5'-GCAGGGCGCGCCATATGCGGGGAAG-3'
5'-GCAGGGCGCTGCATATGCGGGGAAG-3'
5'-GCAGGGCGCTTCATATGCGGGGAAG-3'
5'-GGGCAGGGCGATTAATCTGCGGGGAAG-3'
5'-CATCTGCGGGGAAGCGACAGCATTAATC
AACTCC-3'
5'-CTGCGGGGAAGATACAGCATTAATCAACT
CCCTGG-3'
5'-CATCTGCGGGGAAGGCACAGCATTAATC
AACTCC-3'
5'-CTGCGGGGAACACACAGCATTAATCAACT
CCCTGG-3'
5'-CTGCGGGGAAAACACAGCATTAATCAACT
CCCTGG-3'
5'-CTGCGGGGAACAGACAGCATTAATCAACT
CCCTGG-3'
Schnittstelle
PstI
BanII
VspI
AflII
ApaI
BanII
NdeI
NdeI
NdeI
VspI
VspI
VspI
VspI
VspI
VspI
VspI
35
Material und Methoden
Tabelle 3.4; Fortsetzung.
nuoG H101A_fwd
nuoG C105A_fwd
nuoG V107W_fwd
nuoG C108A_fwd
nuoG C114A_fwd
nuoG C153A_fwd
nuoG C156A_fwd
nuoG C159A_fwd
nuoG C203A_fwd
nuoG R219L_fwd
nuoG R219W
W221L_fwd
nuoG R219W
W221R_fwd
nuoG E617A_fwd
nuoI L65W_fwd
nuoEaxaG129D_fwd
nuoEaxaG129S_fwd
nuoFaxa E95D_fwd
nuoFaxa E95N_fwd
nuoFaxa E95Q_fwd
nuoFaxa E97D_fwd
nuoFaxa E97N_fwd
nuoFaxa E97Q_fwd
nuoFaxa Y180A_fwd
36
5'-GTTGATGACCAACGCGCCGCACGACTG-3'
5'-CACCCGCACGACGCACCGGTATGTG-3'
5'-GCACGACTGTCCATGGTGTGAAGAGGG
C-3'
5'-CACGACTGTCCAGTAGCTGAAGAGGGC-3'
5'-GAGGGCGGTAACGCGCATCTGCAGGATA
TGAC-3'
5'-CTCTCACGAGATGAACCGCGCCATCGCCT
GC-3'
5'-CTCTCACGAGATGAACCGCTGCATCGCCG
CCTACCGCTG-3'
5'-CTGCTACCGCGCTGTGCGTTATTATAAAG
ATTACG-3'
5'-CTGGTCGAAATTGCGCCAACCGGCGTATT
TAC-3'
5'-CTCCGAGCGTTATAACCTGAAATGGGATA
TGC-3'
5'-CTCCGAGCGTTATAACTGGAAACTGGATA
TGCAGTTTGC-3'
5'-CTCCGAGCGTTATAACTGGAAACGTGATA
TGCAGTTTGC-3'
5'-CTGCCAGCTTTGCTGCTAGCGACGGTACG
GTGATC-3'
5'-CGTTGCGTAGCATGCAATTGGTGCGCGGT
AGCC-3'
5'-CGTTCAGTGTCTGGATGCCTGCAGTGAAG
CTCCCGTG-3'
5'-CGTTCAGTGTCTGAGCGCCTGCAGTGAAG
CTCCCGTG-3'
5'-GCAACGCGGACGACTCAGAACCGGGTAC
CTTTAAGGAC-3'
5'-GCAACGCGGACAACTCAGAACCGGGTAC
CTTTAAGGAC-3'
5'-GCAACGCGGACCAGTCAGAACCGGGTAC
CTTTAAGGAC-3'
5'-GGACGAGTCAGACCCGGGAACCTTTAAG
G-3'
5'-GGACGAGTCAAACCCGGGAACCTTTAAG
G-3'
5'-GGACGAGTCACAACCCGGGACCTTTAAG
G-3'
5'-GGGGTGCGGGCGCCGCTATATGCGGTGA
G-3'
AgeI
StyI
CaiI
PstI
BauI
BauI
PsiI
PsiI
PsiI
PsiI
NheI
PaeI
PstI
PstI
KpnI
KpnI
KpnI
SmaI
SmaI
SmaI
EheI
Material und Methoden
Tabelle 3.4; Fortsetzung.
nuoFaxa Y180C_fwd
nuoFaxa Y180F_fwd
nuoFaxa Y180L_fwd
nuoFaxa E185A_fwd
nuoFaxa E185D_fwd
nuoFaxa E185G_fwd
nuoFaxa E185H_fwd
nuoFaxa E185N_fwd
nuoFaxa E185Q_fwd
5'-GCGGGTGCCTGTATATGCGGTGAG-3'
5'-GGGGTGCGGGCGCCTTTATATTGCGGTGA
G-3'
5'-GGGGTGCGGGGGCCCTCATATGCGGTGA
G-3'
5'-GGTGCCTACATCTGTGGTGAGGCGACCG
CTCTGATAG-3'
5'-GTGCCTACATCTGTGGTGAGGACACCGCT
CTGATAG-3'
5'-GGTGCCTACATCTGTGGTGAGGGTACCGC
TCTGATAG-3'
5'-GGTGCCTACATCTGTGGTGAGCATACCGC
TCTGATAG-3'
5'-GTGCCTACATCTGTGGTGAGAACACCGCT
CTGATAG-3'
5'-GTGCCTACATCTGTGGTGAGCAAACCGCT
CTGATAG-3'
NdeI*
EheI
ApaI
NdeI*
NdeI*
NdeI*
NdeI*
NdeI*
NdeI*
Tabelle 3.5: Sequenzen der Oligonukleotide zur Amplifikation der nptI-sacB Selektionskassette. Die für die
-Red vermittelte Rekombination notwendigen und zu den nuo-Genen homologen Bereiche sind fett gedruckt
und die homologen Bereiche zur sacB-Kassette unterstrichen.
Oligonukleotid
Sequenz
nuoD::nptI-sacB_fwd
5'-TCACCCGCTGACCACGCCGCCGCCGAAAGAGCGC
ACGCTGCACGTTGTGTCTCAAAATCTCTGATG-3'
nuoD::nptI-sacB_rev
5'-CTTTGGTCGCCTCAATCATCTGGAAAGATTCATTG
GCAGGCATCACCGAATTCCCCGGGGGATCCG-3'
nuoF::nptI-sacB_fwd
5'-CCGCTGACCTGGCGTCTGCGCGATGACAAACAGC
CAGTGTGGCTGGACGGTACCGGATCCGTCGACCTG-3'
nuoF::nptI-sacB_rev
5'-GCCAGGCTTTAAATTTCAGACCATCACGCATACCA
CCGGCGTAATCTTCGGAATTCCCCGGGGGATCCG-3'
nuoGbeg::nptI-sacB_fwd 5'-GAATACGAGGTCAACGGAGCGGACAACCTGCTGG
AAGCTTCACGTTGTGTCTCAAAATCTCTGATG-3'
nuoGend::npt-sacB_rev
5'-TCAACCGGCAGCGTGACCGTGTTGCCATCGTAAC
TAAAGGAGACGCGGAATTCCCCGGGGGATCCG-3'
nuoI2::nptI-sacB_fwd
5'-ACGCGAAACGCGAATGTACCCGGAAGAGCCGGTC
TATCTGCACGTTGTGTCTCAAAATCTCTGATG-3'
nuoI::nptI-sacB_rev
5'-GTATTCCCCCATTTCGAAATCCGGGGTTAACTGAA
TCGCCGTGGTCGGAATTCCCCGGGGGATCCG-3'
37
Material und Methoden
Tabelle 3.6: Sequenzen der DNA-Oligonukleotide zur Amplifikation linearer DNA-Fragmente. Die zur
Amplifikation der A. aeolicus nuo-Gene verwendeten Oligonukleotide sind mit axa gekennzeichnet. Eingeführte
Restriktionsschnittstellen sind mit Unterstrich hervorgehoben.
Oligonukleotid
nuoD_fwd
nuoD_rev
nuoE_fwd
nuoE_rev
nuoI_fwd
nuoI_rev
nuoF_fwd
nuoF_rev
nuoGbeg_fwd
nuoGrec_rev
axa_nuoE_fwd
axa_nuoFhis_rev
Sequenz
5'-TGGGTGGTGGCGTTTCTGAC-3'
5'-ATCGCCGCCGGAATTTGCTG-3'
5'-CACGAGAATCAACAACCACAAACCG-3'
5'-TTTATACCGCTCCAGCAGTTCAGG-3'
5'-TCTGGATGATCGGCCTGCAC-3'
5'-TCGCCCTTATCTTTGCCGTC-3'
5'-AACATTATCCGTACTCCCGAAACG-3'
5'-CAGCGCTCTTTCAGCAGGTTCG-3'
5'-CGATTAACGCTCAGTCTC-3'
5'-GTGCCTCCTTGAGATCCTC-3'
5'-TACCAGAATTCTAAGAAGGAGATATAGAT
TATGTTTAAAACG-3'
5'-AGTTCGCTCAGCTTAATGATGATGATGATG
ATGTCCGG-3'
Schnittstelle
EcoRI
BlpI
3.4 Medien, Lösungen und DNA-modifizierende Enzyme
3.4.1 Nährmedien
In Tabelle 3.7 sind alle verwendeten Nährmedien und deren Zusammensetzung aufgeführt.
Tabelle 3.7: Zusammensetzung der Medien.
Medium
LB-Medium
Zusammensetzung
Pepton
NaCl
Hefeextrakt
Konzentration
1% (w/v)
1% (w/v)
0.5% (w/v)
SOC-Medium
Pepton
Hefeextrakt
NaCl
KCl
MgSO4
MgCl2
Glucose
2% (w/v)
0.5% (w/v)
10 mM
2.5 mM
10 mM
10 mM
20 mM
38
Material und Methoden
Tabelle 3.7; Fortsetzung.
LB-Agar
LB-Medium mit
Agar
2% (w/v)
YP/SUC-Agar
Pepton
Hefeextrakt
Saccharose
Agar
1% (w/v)
0.5% (w/v)
10% (w/v)
2% (w/v)
Autoinduktionsmedium
Pepton
Hefe
Na2HPO4
KH2PO4
NH4Cl
Na2SO4
MgSO4
Riboflavin
Eisenammonium-Citrat
L-Cystein
Mannitol
Arabinose
Glucose
1% (w/v)
0.5% (w/v)
25 mM
25 mM
50 mM
5 mM
2 mM
50 mg/L
30 mg/L
0.5 mM
0.5% (w/v)
0.2% (w/v)
0.05% (w/v)
M9-Minimalmedium
Na2HPO4
KH2PO4
NaCl
NH4Cl
CaCl2
MgSO4
Casein (säurehydrolysiert)
L-Tryptophan
Glycerin
Thiaminhydrochlorid
25 mM
22 mM
8.5 mM
18.7 mM
0.1 mM
1 mM
0.1% (w/v)
5‰ (w/v)
25 mM
100 µg/mL
NuoEFaxa-Medium
Pepton
NaCl
Hefeextrakt
Glucose
Riboflavin
Eisenammonium-Citrat
L-Cystein
1% (w/v)
1% (w/v)
0.5% (w/v)
1% (w/v)
50 mg/L
30 mg/L
0.5 mM
39
Material und Methoden
3.4.2 Antibiotika-Lösungen
In Tabelle 3.8 sind alle in dieser Arbeit verwendeten Antibiotika und die verwendeten
Konzentrationen aufgeführt.
Tabelle 3.8: Verwendete Antibiotika.
Antibiotikum
Ampicillin
Stammlösung
50 mg/mL, in H2O
Endkonzentration
100 μg/mL
Chloramphenicol
34 mg/mL, in Ethanol
34 oder 170 μg/mL in f ü igen Me ien
20 μg/mL in fe en Me ien
Kanamycin
50 mg/mL, in H2O
50 μg/mL
3.4.3 Lösungen und Puffer für die Molekularbiologie
In Tabelle 3.9 sind die Zusammensetzungen der in dieser Arbeit verwendeten Puffer und
Lösungen für die Plasmidpräparationen im analytischen Maßstab und für die AgaroseGelelektrophorese aufgeführt.
Tabelle 3.9: Zusammensetzung der Puffer und Lösungen für die Molekularbiologie.
Puffer
P1
Zusammensetzung
Tris/HCl, pH 8.0
EDTA
RNase A
Konzentration
50 mM
10 mM
100 µg/mL
P2
NaOH
SDS
200 mM
1% (w/v)
P3
Kaliumacetat/Essigsäure, pH 5.5
3M
TBE-Puffer
Tris/Borsäure, pH 8.3
EDTA
89 mM
1 mM
3.4.4 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese und Western Blot
Die für die SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese (SDS-PAGE) und Western Blot-Analyse
verwendeten Puffer und Lösungen sowie deren Zusammensetzung sind in den Tabellen 3.10
bis 3.12 aufgeführt.
40
Material und Methoden
Tabelle 3.10: Zusammensetzung der Puffer und Gele für die SDS-PAGE nach Schägger und von Jagow,
1987.
Puffer
Zusammensetzung
Konzentration
Probenpuffer
Tris/Acetat, pH 6.8
SDS
Glycerin
2-Mercaptoethanol
Bromphenolblau
0.2 M
16% (w/v)
48% (v/v)
8% (v/v)
0.04% (w/v)
Anodenpuffer
Tris/HCl, pH 8.9
0.2 M
Kathodenpuffer
Tris/HCl, pH 8.25
Tricine
SDS
0.1 M
0.1 M
0.1% (w/v)
Schägger-Gelpuffer
Tris/HCl, pH 8.45
SDS
3M
0.3% (w/v)
Färbelösung
CBB R-250
Ethanol
Essigsäure
0.5% (w/v)
50% (v/v)
10% (v/v)
Entfärbelösung
Ethanol
Essigsäure
30% (v/v)
10% (v/v)
Trenngel
Acrylamid-Bisacrylamid-Lösung
Schägger-Gelpuffer
Glycerin
TEMED
APS
34% (v/v)
34% (v/v)
11% (v/v)
0.1% (v/v)
0.1% (w/v)
Sammelgel
Acrylamid-Bisacrylamid-Lösung
Schägger-Gelpuffer
TEMED
APS
13% (v/v)
23% (v/v)
0.2% (v/v)
0.1% (w/v)
Tabelle 3.11: Zusammensetzung der Puffer und Gele für die SDS-PAGE nach Laemmli, 1970.
Puffer
Probenpuffer
Laufpuffer
Zusammensetzung
Tris/HCl, pH 6.8
SDS
Glycerin
Bromphenolblau
EDTA
DTT
Tris/HCl, pH 8.3
Glycin
SDS
Konzentration
0.4 M
4% (w/v)
12% (w/v)
1% (w/v)
2.5 mM
3.5 mM
50 mM
390 mM
0.1% (w/v)
41
Material und Methoden
Tabelle 3.11; Fortsetzung.
Sammelgelpuffer
Tris/Essigsäure, pH 6.8
1M
Trenngelpuffer
Tris/Essigsäure, pH 8.8
3M
Sammelgel
Acrylamid-Bisacrylamid-Lösung
Sammelgelpuffer
TEMED
APS
SDS
Acrylamid-Bisacrylamid-Lösung
Trenngelpuffer
TEMED
APS
SDS
19% (v/v)
14% (v/v)
0.1% (v/v)
0.1% (w/v)
0.1% (w/v)
50% (v/v)
13% (v/v)
0.1% (v/v)
0.1% (w/v)
0.1% (w/v)
Trenngel
Tabelle 3.12: Puffer und Lösungen für den Western Blot nach Towbin et al., 1979.
Puffer
Blotpuffer
Zusammensetzung
Tris/HCl, pH 7.5
Glycin
Methanol
SDS
Konzentration
25 mM
191 mM
20% (v/v)
0.05% (w/v)
phoshate-buffered saline
(PBS), pH 7.4
KH2PO4
Na2HPO4
NaCl
KCl
1.5 mM
6.5 mM
137 mM
2.7 mM
PBS-T
PBS
TWEEN 20
0.01% (v/v)
Blockpuffer
Magermilchpulver in PBS-T
3% (w/v)
Na2HPO4-Lösung
Na2HPO4, pH 7.4
25 mM
Entwickler
Na2HPO4, pH 7.4
NiSO4
CoCl2
3,3'-Diaminobenzidin
H2O2
25 mM
1.1 mM
2.3 mM
2.8 mM
0.06% (v/v)
3.4.5 Puffer und Lösungen für die Proteinbiochemie
In Tabelle 3.13 sind die Puffer und Lösungen für die Präparation von E. coli
Cytoplasmamembranen, des Komplex I, die Saccharosedichtegradienten-Zentrifugation und
die Aktivitätsbestimmungen sowie deren Zusammensetzung aufgeführt.
42
Material und Methoden
Tabelle 3.13: Zusammensetzung der Puffer für die E. coli Cytoplasmamembran- und Komplex IPräparation, die Saccharosedichtegradienten-Zentrifugation und Aktivitätsbestimmungen.
Puffer
A-Puffer
Zusammensetzung
MES/NaOH, pH 6.0
NaCl
Konzentration
50 mM
50 mM
A*-Puffer
MES/NaOH, pH 6.0
NaCl
MgCl2
50 mM
50 mM
5 mM
ADDM*-Puffer
MES/NaOH, pH 6.0
NaCl
MgCl2
DDM
MES/NaOH, pH 6.0
NaCl
MgCl2
DDM
MES/NaOH, pH 6.3
NaCl
Imidazol
MgCl2
DDM
50 mM
50 mM
5 mM
0.1% (w/v)
50 mM
350 mM
5 mM
0.1% (w/v)
50 mM
500 mM
20 mM
5 mM
0.1% (w/v)
Elutionspuffer
MES/NaOH, pH 6.3
NaCl
Imidazol
MgCl2
DDM
50 mM
500 mM
500 mM
5 mM
0.1% (w/v)
Saccharoselösung 5%
Saccharose in A*-Puffer
DDM
5% (w/v)
0.1% (w/v)
Saccharoselösung 30%
Saccharose in A*-Puffer
DDM
30% (w/v)
0.1% (w/v)
Biuret-Lösung
NaOH
Seignettesalz
KI
CuSO4
200 mM
0.5% (w/v)
0.5% (w/v)
0.3% (w/v)
Rekonstitutionspuffer
MES/NaOH, pH 6.0
NaCl
DDM
5 mM
50 mM
0.1% (w/v)
Lipidpuffer
MES/NaOH, pH 6.0
NaCl
DDM
5 mM
50 mM
2% (w/v)
BDDM*-Puffer
Bindepuffer
43
Material und Methoden
Tabelle 3.13; Fortsetzung.
ACMA-Messpuffer
MES/NaOH, pH 6.0
KCl
MgCl2
Valinomycin
5 mM
50 mM
2 mM
1 µM
In Tabelle 3.14 sind die Zusammensetzungen der Puffer und Lösungen für die A. aeolicus
NuoEFHis-Präparation aufgeführt.
Tabelle 3.14: Zusammensetzung der Puffer für die A. aeolicus NuoEFHis-Präparation.
Puffer
Bindepuffer
Zusammensetzung
MOPS/NaOH, pH 7.0
NaCl
Imidazol
Konzentration
50 mM
200 mM
20 mM
Elutionspuffer
MOPS/NaOH, pH 7.0
NaCl
Imidazol
50 mM
200 mM
500 mM
A-Puffer
MOPS/NaOH, pH 7.0
NaCl
50 mM
50 mM
B-Puffer
MOPS/NaOH, pH 7.0
NaCl
50 mM
350 mM
3.4.6 DNA-modifizierende Enzyme
Alle in dieser Arbeit verwendeten Enzyme sind in den Tabellen 3.15 und 3.16 aufgeführt.
Tabelle 3.15: Verwendete Restriktionsenzyme.
Restriktionsenzyme
Konzentration
AflII, AgeI, ApaI, BamHI, BanII,
BauI, BlpI, CaiI, DpnI, EcoRI, EheI,
10 U/µL
KpnI, NdeI, NheI, PaeI, PsiI, PstI,
SacI, SmaI, StyI, VspI
Hersteller
Thermo Scientific
Tabelle 3.16: Verwendete DNA-Polymerasen und Ligasen.
Polymerase
Pfu-DNA-Polymerase
Phusion-DNA-Polymerase
Long PCR Enzyme Mix
T4-DNA-Ligase
44
Konzentration
2.5 U/µL
2 U/µL
5 U/µL
5 U/µL
Hersteller
Thermo Scientific
Finnzymes
Thermo Scientific
Thermo Scientific
Material und Methoden
3.5 Mikrobiologische Methoden
3.5.1 Bestimmung der optischen Dichte
Das Zellwachstum wurde anhand der optischen Dichte der Kulturen bei 600 nm (OD600)
verfolgt (Ultrospec 1000 pro, UV/Visible Spectrophotometer, Amersham Pharmacia Biotech).
Als Referenz diente das verwendete Medium. Es wurden Küvetten mit einem Lichtweg von
1 cm (Plastibrand 1.5 mL Halbmikro, Brand) verwendet. Ab einer OD600 von 0.4 wurde die
Zellsuspension mit dem verwendeten Medium verdünnt.
3.5.2 Vorkulturen
Für die Herstellung von Vorkulturen wurden 4, 50 bzw. 400 mL LB-Medium mit den
entsprechenden Antibiotika versetzt und aus einer anderen Vorkultur oder aus einer GlycerinDauerkultur 1:1000 bis 1:5000 (v/v) angeimpft. Um Einzelkolonien zu kultivieren, wurden
diese mit einem sterilen Zahnstocher von einer Platte gepickt und in LB-Medium überführt.
Die Vorkulturen wurden unter Schütteln bei 30 bzw. 37 °C 16 – 18 h angezogen.
3.5.3 Glycerin-Dauerkulturen
Zur Herstellung von Glycerin-Dauerkulturen wurden 150 µL 80%iges (v/v) steriles Glycerin
in einem Eppendorfgefäß vorgelegt, mit 250 µL Vorkultur versetzt und sofort in flüssigem
Stickstoff schockgefroren. Die Glycerin-Dauerkulturen wurden bei −80 °C gelagert.
3.5.4 Herstellung elektrokompetenter Zellen
Zellen für die Elektroporation: Zur Herstellung elektrokompetenter Zellen für die
Elektroporation wurde LB-Medium im Verhältnis 1:100 (v/v) mit einer E. coli Vorkultur
angeimpft und unter Schütteln bei 37 °C inkubiert. Bei einer OD600 von 0.5 – 0.7 wurde die
Zellsuspension 15 min auf Eis inkubiert. Die Zellen wurden zentrifugiert (4500×g, 10 min,
4 °C, Rotor A-4-44, Eppendorf Zentrifuge 5804 R) und der Überstand verworfen. Das
Sediment wurde in dem Ausgangsvolumen sterilem, eiskaltem ddH2O resuspendiert, erneut
45
Material und Methoden
zentrifugiert und der Überstand verworfen. Dieser Schritt wurde zweimal wiederholt. Das
Sediment wurde im 1.5-fachen Volumen eiskaltem 15%igem (v/v) Glycerin gelöst. Die Zellen
wurden bis zur Transformation auf Eis gestellt oder in 50 µL Aliquots in flüssigem Stickstoff
schockgefroren und bei −80 °C gelagert.
Ze en für ie λ-Red vermittelte Rekombination: Für ie λ-Red vermittelte Rekombination
wurden 100 mL LB-Medium mit Ampicillin versetzt und im Verhältnis 1:100 (v/v) mit einer
E. coli DH5αΔnuo/pKD46 Vorkultur angeimpft und bei 30 °C und 180 Upm (Certomat R, B.
Braun Biotech International) inkubiert. Bei einer OD600 von 0.25 – 0.3 wurde die Expression
des red-Operons durch Zugabe von 0.2% (w/v) L-(+)-Arabinose induziert. Nach exakt 20 min
wurden die Zellen für 15 min auf Eis gestellt, zentrifugiert (4500×g, 10 min, 4 °C, Rotor A-444, Eppendorf Zentrifuge 5804 R) und der Überstand verworfen. Das Sediment wurde im
Ausgangsvolumen sterilem eiskaltem 10%igem (v/v) Glycerin oder ddH2O resuspendiert,
erneut zentrifugiert und der Überstand verworfen. Dieser Schritt wurde zweimal wiederholt.
Anschließend
wurde
die OD600
der Zellsuspension
auf 30 – 45
eingestellt.
Die
elektrokompetenten DH5αΔnuo/pKD46 Zellen wurden bis zu ihrer Verwendung auf Eis
gelagert.
3.5.5 Bakterienanzucht
Für die Anzucht von E. coli Stämmen ohne Plasmide wurde LB-Medium verwendet. 400 mL
Medium wurden falls benötigt mit Antibiotika versetzt und 1:100 (v/v) aus einer 50 mL
Vorkultur angeimpft. Die Kulturen wurden unter Schütteln bei 37 °C inkubiert. Beim
Erreichen der stationären Phase wurde das Wachstum durch Inkubation auf Eis gestoppt und
die Zellen durch Zentrifugation geerntet (11´900×g, 10 min, 4 °C, Rotor JLA 10´500, Avanti
J-26 XP, Beckman Coulter). Das Zellsediment wurde in flüssigem Stickstoff schockgefroren
und bei −80 °C gelagert.
3.5.6 Überproduktion des E. coli Komplex I
400 mL Maßstab: 400 mL Autoinduktionsmedium ohne Antibiotikum wurden 1:50 oder 1:25
(v/v) aus einer 100 oder 400 mL E. coli Vorkultur angeimpft. Die Kulturen wurden unter
Schütteln bei 37 °C inkubiert. Kurz vor oder bei Erreichen der stationären Phase wurden die
Zellen durch Zentrifugation geerntet (11´900×g, 10 min, 4 °C, Rotor JLA 10´500, Avanti J-26
46
Material und Methoden
XP, Beckman Coulter). Das Zellsediment wurde in flüssigem Stickstoff schockgefroren und
bei −80 °C gelagert.
10 L Maßstab: In einem Fermenter wurden 10 L Autoinduktionsmedium 1:25 (v/v) mit einer
400 mL E. coli Vorkultur angeimpft und bei 37 °C im Druckluftstrom aerob kultiviert. Die
Zellsuspension wurde mit Hilfe eines KPG-Rührers durchmischt. Kurz vor oder bei Erreichen
der stationären Phase wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet (11´900×g, 10 min,
4 °C, Rotor JLA 10´500, Avanti J-26 XP, Beckman Coulter). Das Zellsediment wurde in
flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei −80 °C gelagert.
3.5.7 Expressionstests
Die Expressionsleistung einzelner Klone für die Überexpression von A. aeolicus nuoEFhis
variiert stark. Geeignete Klone wurden über Expressionstests selektiert. Dafür wurden 50 mL
LB-Medium wurden mit Chloramphenicol und Ampicillin versetzt und 1:50 (v/v) aus einer
4 mL Vorkultur angeimpft. Die Zellen wurden unter Schütteln bei 37 °C kultiviert. Bei einer
OD600 von 0.6 – 0.7 wurde die Genexpression durch Zugabe von 0.7 – 1.0 mM Isopropyl-β-Dthio-galactopyranosid (IPTG) induziert. Nach 3 h Wachstum wurden die Zellen durch
Zentrifugation geerntet (4500×g, 10 min, 4 °C, Rotor A-4-44, Eppendorf Zentrifuge 5804 R).
Die Proteinproduktion der verschiedenen Stämme wurde optisch anhand der Färbung der
Zellsedimente verglichen. Der dunkelste Klon wurde für die Zellzucht verwendet.
3.5.8 Überproduktion des A. aeolicus NuoEFHis
400 mL-Maßstab: 400 mL NuoEFaxa-Medium ohne Antibiotikum wurden 1:25 – 1:100 (v/v)
aus einer 100 oder 400 mL E. coli Vorkultur angeimpft. Die Kulturen wurden unter Schütteln
bei 37 °C inkubiert. Bei einer OD600 von 0.6 – 0.7 wurde durch Zugabe von 0.7 – 1.0 mM
IPTG die Expression von nuoEFhis induziert. Beim Erreichen der stationären Phase oder
spätestens 4 h nach Induktion wurden die Zellen durch Zentrifugation geerntet (11´900×g,
10 min, 4 °C, Rotor JLA 10´500, Avanti J-26 XP, Beckman Coulter). Das Zellsediment wurde
in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei −80 °C gelagert.
47
Material und Methoden
10 L-Maßstab: In einem Fermenter wurden 10 L NuoEFaxa-Medium 1:25 (v/v) mit einer
400 mL E. coli Vorkultur angeimpft und bei 37 °C im Druckluftstrom aerob kultiviert. Die
Zellsuspension wurde mit Hilfe eines KPG-Rührers gerührt. Bei einer OD600 von 0.6 – 1.0
wurde die Expression von nuoEFhis durch Zugabe von 0.7 – 1.0 mM IPTG induziert. Beim
Erreichen der stationären Phase oder spätestens 4 h nach Induktion wurden die Zellen durch
Zentrifugation geerntet (11´900×g, 10 min, 4 °C, Rotor JLA 10´500, Avanti J-26 XP,
Beckman Coulter). Das Zellsediment wurde in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bei
−80 °C gelagert.
3.6 Molekularbiologische Methoden
3.6.1 Plasmidpräparation
Analytischer Maßstab: Für Plasmidpräparationen im analytischen Maßstab wurden 1.5 – 2 mL
einer Vorkultur zentrifugiert (2´300×g, 4 min, Raumtemperatur, Rotor F-45-36-8, Eppendorf
5415 D). Das Sediment wurde in 250 µL kaltem Puffer P1 suspendiert. Durch die Zugabe von
250 µL Puffer P2 wurden die Zellen lysiert. Nach exakt 4 min Inkubation bei
Raumtemperatur wurde die Suspension mit 250 µL Puffer P3 (4 °C) neutralisiert, 15 min auf
Eis inkubiert und anschließend zentrifugiert (20´800×g, 15 min, 4 °C, Rotor F45-30-11,
Eppendorf 5417R). Der Überstand wurde vorsichtig in ein neues Eppendorfgefäß überführt
un mi 750 µL I pr pan
ver e z , 20 min bei −20 °C inkubiert und erneut zentrifugiert
(20´800×g, 15 min, 4 °C, Rotor F45-30-11, Eppendorf 5417R). Die gefällte Plasmid-DNA
wurde 1 – 2 h bei 37°C getrocknet und anschließend in 30 µL ddH2O (55 °C, 20 min,
700 Upm, Eppendorf Thermomixer compact) gelöst.
Präparativer Maßstab: Bei Plasmidpräparationen im präparativen Maßstab wurde das Wizard
Plus SV Minipreps DNA Purification System Kit (Promega) nach Herstellerangaben
verwendet. Vor der Elution der gereinigten DNA wurde das Säulenmaterial 2 min bei 55 °C
mit 50 µL ddH2O inkubiert.
48
Material und Methoden
3.6.2 Reinigung von DNA
Zur Reinigung linearer DNA-Fragmente aus Lösungen oder aus einem Agarosegel wurde das
Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega) nach Angaben des Herstellers
verwendet. Vor der Elution der gereinigten DNA wurde das Säulenmaterial 2 min bei 55 °C
mit 25 – 50 µL ddH2O inkubiert.
3.6.3 DNA-Konzentrationsbestimmung
Die Konzentration von DNA-Lösungen wurde in zehnfacher Verdünnung mit dem Quant-iT
dsDNA-Assay am Qubit Fluorometer (Invitrogen) nach Angaben des Herstellers bestimmt.
3.6.4 Restriktionsanalysen und DpnI-Verdau
Das Volumen der Restriktionsansätze betrug 20 µL. 0.1 – 1 µg DNA wurden mit 0.2 – 10 U
Restriktionsenzym und 2 µL des entsprechenden Puffers versetzt. Die Lösung wurde 1 – 3 h
bei 37 °C inkubiert. Für Restriktionsanalysen mit zwei Enzymen wurden die Protokolle von
Thermo Scientific verwendet. Die Restriktions-Fragmente wurden durch Agarosegelelektrophorese aufgetrennt.
Um nach der PCR die methylierte Templat-DNA abzubauen, wurde der gereinigte PCRAnsatz mit DpnI verdaut. Hierfür wurde das Volumen des Ansatzes bestimmt und mit der
benötigten Menge Tango-Puffer und 10 U DpnI versetzt. Der Ansatz wurde 2 h bei 37 °C
inkubiert und erneut gereinigt.
3.6.5 Polymerasekettenreaktion
Die PCR wurde in 50 µL Ansätzen in 0.2 mL PCR-Gefäßen (Biozyme) in dem vom Hersteller
mitgelieferten Puffer durchgeführt. Der Reaktionsansatz wurde vor Zugabe der Polymerase
und bis zum Erreichen der initialen Denaturierungstemperatur auf Eis gekühlt. Die PCRProdukte wurden im Thermocycler (PTC-200, MJ Research) mit unterschiedlichen
Temperaturprogrammen amplifiziert. Um den Erfolg der PCR zu überprüfen, wurden 2 –
10 µL des Ansatzes entnommen und mittels Agarose-Gelelektrophorese untersucht. Der
restliche Ansatz wurde mit dem Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)
49
Material und Methoden
gereinigt und mit DpnI verdaut. Zur Kontrolle wurden 2 – 4 µL der gereinigten Probe auf ein
Agarosegel aufgetragen.
Ortsgerichtete Mutagenese: Für die ortsgerichtete Mutagenese wurde die QuikChangeMethode (Stratagene) verwendet. Ein Ansatz enthielt 40 – 45 ng Vorlage-DNA, je 240 nM
DNA-Oligonukleotide, 0.2 mM dNTP-Mix, 1×Pfu-Puffer + MgSO4 und 2.5 U Pfu-DNAPolymerase (Thermo Scientific). Tabelle 3.17 gibt das verwendete Temperaturprogramm
wieder.
Tabelle 3.17: Temperaturprogramm der PCR für die ortsgerichtete Mutagenese nach der QuikChangeMethode.
Temperatur [°C]
Zeit [s]
Zyklen
Initiale Denaturierung
95
120
1
Denaturierung
95
60
Anlagerung der Oligonukleotide
50 – 60
30 – 60
Elongation
72
60 – 120 pro 1 kbp
18
Amplifikation der nptI-sacB-Kassette: Um die nptI-sacB-Kassette durch -Red vermittelte
Rekombination in das gewünschte nuo-Gen einzubringen, musste diese von homologen
Bereichen des jeweiligen nuo-Gens flankiert sein. Es wurden Oligonukleotide verwendet, die
über einen Bereich von etwa 36 – 47 bp homolog zu den jeweiligen nuo-Genen sind und
19 – 26 bp lange, homologe Bereiche zur nptI-sacB-Kassette enthalten (Tab. 3.5).
Zur Amplifikation der Selektionskassette wurde eine kommerziell erhältliche Mischung aus
Taq und einer anderen thermostabilen DNA-Polymerase mit Korrekturlesefunktion (Long
PCR Enzym Mix, Thermo Scientific) verwendet. Der Ansatz enthielt 20 – 30 ng VorlageDNA, je 0.5 µM DNA-Oligonukleotide, 0.2 mM dNTP-Mix, 1×Long PCR Enzym MixPuffer + MgCl2 und 2.5 U Long PCR Enzym Mix (5 U/µL). Tabelle 3.18 zeigt das
verwendete Temperaturprogramm.
50
Material und Methoden
Tabelle 3.18: Temperaturprogramm zur Amplifikation der Selektionskassette.
Temperatur [°C]
Zeit [s]
Zyklen
Initiale Denaturierung
95
180
1
Denaturierung
95
30
Anlagerung der Oligonukleotide
58
30
Elongation
68
90 pro 1 kbp
Abschließende Elongation
68
600
25
1
Amplifikation linearer DNA-Fragmente: Um lineare DNA-Fragmente zu amplifizieren, wurde
folgender Ansatz verwendet: 20 – 40 ng Vorlage-DNA, je 2 µM DNA-Oligonukleotide, 200
µM dNTP-Mix, 1× Phusion HF-Puffer + MgCl2 (Finnzymes) und 1 U Phusion DNA
Polymerase (2 U/µL, Finnzymes). Tabelle 3.19 gibt die Parameter des verwendeten
Temperaturprogramms wieder.
Tabelle 3.19: Temperaturprogramm zur Amplifikation linearer DNA-Fragmente.
Temperatur [°C]
Zeit [s]
Zyklen
Initiale Denaturierung
95
120
1
Denaturierung
95
20
Anlagerung der Oligonukleotide
55 – 60
30
Elongation
72
20 s pro 1 kbp
Abschließende Elongation
72
300
25
1
3.6.6 Agarose-Gelelektrophorese
In dieser Arbeit wurden ausschließlich 0.8%ige (w/v) Agarosegele in TBE-Puffer verwendet.
Proben mit einem kleineren Volumen als 10 µL wurden mit ddH2O auf 10 µL aufgefüllt. Die
Proben wurden mit 6×Probenauftragspuffer (Thermo Scientific) versetzt. Zur Bestimmung
der Fragmentlängen wurden 500 ng λ-DNA/Eco130I (StyI) Marker 16 (Thermo Scientific)
oder GeneRuler 1 kb DNA Ladder (Thermo Scientific) aufgetragen. Die Ansätze wurden
elektrophoretisch bei 10 V/cm getrennt. Zur Visualisierung der DNA-Banden wurde den
Gelen 200 ng/mL Ethidiumbromid zugesetzt. Auf einem Leuchtschirm wurde die Fluoreszenz
des DNA/Ethidiumbromid-Komplexes bei 312 nm angeregt und fotografisch dokumentiert.
51
Material und Methoden
3.6.7 Klonierung
Zu klonierende Gene wurde durch PCR amplifiziert. Das PCR-Produkt und das Plasmid, in
welches das Gen eingebracht werden sollte, wurden mit zwei Restriktionsenzymen
geschnitten und über ein Agarosegel gereinigt. Für die Ligation wurden linearisiertes Plasmid
und Insert im molaren Verhältnis von 1:5 gemischt und mit ddH2O auf 17.5 µL aufgefüllt.
Um Fehlanlagerungen der Überhänge zu minimieren wurde der Ansatz 5 min bei 45 °C und
anschließend 5 min auf Eis inkubiert. Es wurden 2 µL T4-DNA Ligase-Puffer und 0.5 µL
T4-DNA-Ligase (2.5 U) zugegeben und 45 min bei 16 °C inkubiert. Der gesamte
Ligationsansatz wurde mit dem Wizard SV Gel and PCR Clean-Up System (Promega)
gereinigt. E. coli DH5α Ze en wur en mi 1 µL des gereinigten Produkts transformiert und
auf LB-Agar-Platten mit dem benötigten Antibiotikum ausgestrichen.
3.6.8 Transformation durch Elektroporation
Für die Transformation von E. coli wurden 50 µL frisch hergestellte oder auf Eis aufgetaute
elektrokompetente Zellen mit 10 – 500 ng DNA versetzt. Die Suspension wurde in einer zuvor
auf Eis gekühlten Elektroporationsküvette (d = 0.1 cm, Eppendorf) für 5.0 – 6.0 ms einem
Spannungspuls von 1700 V (Electroporator 2510, Eppendorf) ausgesetzt. Der Ansatz wurde
sofort in 1 mL kaltem SOC-Medium aufgenommen, in ein 2.0 mL Eppendorfgefäß überführt
und bei 37 °C (1 h, 750 Upm, Thermomixer compact, Eppendorf) inkubiert. Abhängig von
der
eingesetzten
Menge
an
DNA
wurde
der
gesamte
oder
100 – 200 µL
des
Transformationsansatzes auf LB-Agar-Platten, die mit dem für die Selektion benötigten
Antibiotikum versetzt waren, ausgestrichen. Die LB-Agar-Platten wurden für 16 h bei 37 °C
oder für 20 – 24 h bei 30 °C inkubiert.
Für die -Red vermittelte Rekombination wurden die elektrokompetenten Zellen frisch
hergestellt. 50 µL der elektrokompetenten Zellen wurden in einem eiskaltem 1.5 mL
Eppendorfgefäß vorgelegt und mit 50 ng Plasmid und 100 – 500 ng linearer DNA versetzt.
Um die Transformationseffizienz zu erhöhen, wurde SOC-Medium bei Raumtemperatur
verwendet. Wenn die nptI-sacB-Kassette eingefügt werden sollte, wurde der Ansatz auf
LB-Agar-Platten mit Kanamycin ausgestrichen. Wenn die nptI-sacB-Kassette gegen lineare
DNA mit eingefügten Mutationen ausgetauscht werden sollte, wurden die Zellen auf
YP/SUC-Agar-Platten mit Chloramphenicol ausgestrichen. Die Agar-Platten wurden für 20 –
24 h bei 30 °C inkubiert.
52
Material und Methoden
3.6.9 Sequenzierung von Plasmiden
Für die Sequenzierung wurden 20 µL DNA-Lösung (≥ 20 ng/µL) zur Firma GATC Biotech
AG (Konstanz) geschickt. Um die Qualität der Sequenzierung von Plasmiden einer Länge von
mehr als 21 kbp zu erhöhen, wurde eine höher konzentrierte Lösung (50 – 100 ng/µL)
eingesendet.
3.7 Proteinchemische Methoden
3.7.1 Isolierung der E. coli Cytoplasmamembranen
Alle Schritte wurden bei 4 °C oder auf Eis durchgeführt. Zwei bis fünf g Zellen
(Feuchtgewicht) wurden im 6-fachen Volumen A-Puffer resuspendiert, mit 0.1 mM PMSF
(0.1 M Stammlösung in Isopropanol) und einer Spatelspitze DNase I versetzt und in einem
Teflon-in-Glas-Homogenisator homogenisiert. Die Zellen wurden in zwei Durchgänge mit
einer French-Press Zelle (110 MPa, 17´000 psi, French Pressure Cell, SLM-Aminco)
aufgeschlossen. Der Aufschluss wurde zentrifugiert (9500×g, 20 min, 4 °C, Rotor A8.24,
RC-5, Sorvall Instruments) und das Sediment aus Zelltrümmern und nicht aufgeschlossenen
Zellen verworfen. Zur Sedimentation der Membranen wurde der Überstand erneut
zentrifugiert (252´000×g, 70 min, 4 °C, Rotor 70.1 Ti, L8-M Ultrafuge, Beckman). Die
Membranen wurden mit A*-Puffer (1:1; w/v) und 0.1 mM PMSF versetzt und in einem
Teflon-in-Glas-Homogenisator
homogenisiert.
Die
NADH-Oxidaseaktivität,
die
NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität und der Proteingehalt der Suspension wurden
bestimmt. Die Membranen wurden in flüssigem Stickstoff schockgefroren und bis zur
Verwendung bei −80 °C gelagert.
3.7.2 Isolierung des E. coli Komplex I
Alle Schritte wurden bei 4 °C oder auf Eis durchgeführt. 22 – 45 g E. coli Zellen
(Feuchtgewicht) wurden im 6-fachen Volumen A-Puffer resuspendiert, mit 0.1 mM PMSF
(0.1 M Stammlösung in Isopropanol) sowie einer Spatelspitze DNase I versetzt und in einem
Labormixer (2 – 5 min, Einstellung: II; Braun MX 32) zerkleinert. Entstandener Schaum
wurde durch Zugabe von wenig Antifoam 204 entfernt. Die Cytoplasmamembranen wurden
53
Material und Methoden
wie beschrieben isoliert. Die Membransuspension wurde mit einer 20%igen (w/v) DDMStammlösung auf eine Endkonzentration von 3% (w/v) eingestellt. Der Ansatz wurde 15 min
auf Eis inkubiert und alle 1 – 3 min mit einem Teflon-in-Glas-Homogenisator durchmischt.
Der Detergenzextrakt wurde mit A*-Puffer auf ein Volumen von 32 – 96 mL verdünnt. Zur
Abtrennung von nicht gelösten Bestandteilen wurde der Extrakt zentrifugiert (257´000×g,
4 °C,
15 min, Rotor 60 Ti,
L8-M
Ultrafuge, Beckman).
Die
NADH/Ferricyanid
Oxidoreduktaseaktivität und der Proteingehalt des Überstands wurden bestimmt. Der
Überstand wurde mit einer Flussgeschwindigkeit von 6 mL/min auf eine zuvor in A*DDMPuffer äquilibrierten 50 mL Anionenaustausch-Chromatographiesäule (26×95 mm, Fractogel
EMD TMAE Hicap (M), Merck) aufgetragen (ÄKTA prime plus, Amersham Biosciences).
Die Säule wurde mit 150 mM NaCl (33% B*DDM-Puffer) bei derselben Flussgeschwindigkeit
gewaschen und gebundene Proteine in einem linearen Gradienten von 150 – 350 mM NaCl
(33 – 100% B*DDM-Puffer) eluiert. Das Eluat wurde in 4 mL Fraktionen gesammelt und deren
NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseativität bestimmt. Die Gipfelfraktionen der Aktivität
wurden vereinigt und deren NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität und Proteingehalt
bestimmt. Das Eluat wurde mit Elutionspuffer auf eine Imidazolkonzentration von 20 mM
eingestellt. Die vereinigten Fraktionen der Anionenaustausch-Chromatographie wurden mit
einer Flussgeschwindigkeit von 1 mL/min auf eine in Bindepuffer äquilibrierte 10 mL
Affinitäts-Chromatographiesäule (16×50 mm, Ni2+-IDA, ProBond Resin, Invitrogen)
aufgetragen (ÄKTA prime plus, Amersham Biosciences). Die Säule wurde mit Bindepuffer
bei derselben Flussgeschwindigkeit gewaschen und gebundene Proteine in einem
Stufengradienten von 140, 260, 380 und 500 mM Imidazol im Elutionspuffer eluiert. Das
Eluat wurde in 2 mL Fraktionen gesammelt. Fraktionen, die signifikante NADH/Ferricyanid
Oxidoreduktaseaktivität zeigten, wurden vereinigt und durch Ultrafiltration auf ein Volumen
von 100 – 500 µL eingeengt (Amicon Ultra-15, MWCO: 100 kDa, Millipore, 3800×g, 4 °C,
Rotor A-4-44, Eppendorf Centrifuge 5804 R). Das Konzentrat wurde auf A*-Puffer
umgepuffert, indem es dreimal mit dem zehnfachen Volumen A*-Puffer verdünnt und wieder
konzentriert wurde. Danach wurde die NADH/Ferricyanid sowie die NADH:Decyl-Ubichinon
Oxidoreduktaseaktivität und der Proteingehalt bestimmt. Die Proteinlösung wurde aliquotiert,
in f ü igem S ick
ff c ckgefr ren un bei −80 °C gelagert.
3.7.3 Isolierung des A. aeolicus NuoEFHis
Alle Schritte wurden bei 4 °C oder auf Eis durchgeführt. 5 – 10 g Zellen (Feuchtgewicht)
wurden mit 4 – 6-fachen Volumen Bindepuffer, 0.1 mM PMSF (0.1 M in Isopropanol) und
54
Material und Methoden
einer Spatelspitze DNase I versetzt und mit einem Teflon-in-Glas Homogenisator
homogenisiert. Die Zellen wurden in zwei Durchgängen mit einer French-Press Zelle
(110 MPa, 17´000 psi, French Pressure Cell, SLM-Aminco) aufgeschlossen. Durch
Ultrazentrifugation (252´000×g, 4 °C, 70 min, Rotor 60 Ti, L8-M Ultrafuge, Beckman) wurde
das Cytosol von nicht aufgeschlossenen Zellen, Membranen und Zelltrümmern abgetrennt.
Von der cytosolischen Fraktion wurde die NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität sowie
der Proteingehalt bestimmt. Das restliche Cytosol wurde mit einer Laufgeschwindigkeit von
1 – 1.5 mL/min auf eine in Bindepuffer äquilibrierte 10 mL Affinitäts-Chromatographiesäule
(16×50 mm, Ni2+-IDA, ProBondTM Resin, Invitrogen) aufgetragen (ÄKTA prime plus,
Amersham Biosciences). Es wurde mit Bindepuffer gewaschen bis die gemessene Absorbanz
bei 280 nm wieder das Grundniveau erreicht hatte. Durch einen Waschschritt mit
68 – 116 mM Imidazol im Elutionspuffer (10 – 20% Elutionspuffer), wurden unspezifisch
gebundene Proteine eluiert. NuoEFhis wurde durch einen 40 mL linearen Gradienten von 68
bzw. 116 mM auf 500 mM Imidazol im Elutionspuffer (10 bzw. 20 – 100% Elutionspuffer)
eluiert und in 1.5 mL Fraktionen gesammelt. Die NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität
der einzelnen Fraktionen wurde gemessen und Fraktionen mit signifikanter Aktivität
vereinigt. Es wurde eine Probe zur Bestimmung der Gesamtaktiviät, der Proteinkonzentration
und für die SDS-PAGE entnommen. Die vereinigten Fraktionen wurden durch Ultrafiltration
(Amicon-Ultra 15, MWCO; 30 kDa, Millipore, 3800×g, 4 °C, Rotor A-4-44, Eppendorf
Centrifuge 5804 R) auf weniger als 500 µL eingeengt und mit einer Flussgeschwindigkeit von
1 – 2 mL/min
auf
eine
in
A-Puffer
äquilibrierte
120 mL
Größenausschluss-
Chromatographiesäule (Superdex 200 16/60) aufgetragen (ÄKTA prime plus, Amersham
Biosciences). Das Eluat wurde in 2 mL Fraktionen gesammelt. Das Elutionsprofil zeigte zwei
Absorptionsmaxima zwischen 70 – 74 mL und bei 80 mL Elutionsvolumen. Das erste
Maximum entspricht der aktiven Form des Enzyms, was durch die Bestimmung der
NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität überprüft wurde. Das zweite Maximum
entspricht vermutlich einer falsch gefalteten Form, die eine deutlich geringere Aktivität
aufweist. Für die folgenden Reinigungsschritte wurden die Fraktionen des ersten Gipfels
verwendet. Fraktionen mit signifikanter Aktivität wurden vereinigt und eine Probe zur
Bestimmung der Gesamtaktiviät, der Proteinkonzentration und für die SDS-PAGE
entnommen. Die restliche Lösung wurde mit einer Flussgeschwindigkeit von 1.5 mL/min auf
eine in A-Puffer äquilibrierte 5 mL Anionentausch-Chromatographiesäule (16×25 mm,
Source 15Q, Amersham Pharmacia) aufgetragen (ÄKTA prime plus, Amersham Biosciences).
Nach dem Auftrag wurde die Säule mit A-Puffer gewaschen bis die Absorbanz bei 280 nm
wieder das Grundniveau erreicht hatte. Gebundene Proteine wurden mit einem 25 mL linearen
55
Material und Methoden
Gradienten von 50 – 350 mM NaCl im Elutionspuffer (0 – 100% B-Puffer) eluiert. Es wurden
1 mL Fraktionen gesammelt und deren NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität bestimmt.
Fraktionen mit signifikanter Aktivität wurden vereinigt und es wurde eine Probe zur
Bestimmung der Gesamtaktiviät, der Proteinkonzentration und für die SDS-PAGE
entnommen. Die vereinigten Fraktionen wurden durch Ultrafiltration auf weniger als 500 µL
konzentriert. Die Probe wurde mit einer Flussgeschwindigkeit von 1.0 – 2.0 mL/min auf eine
mit A-Puffer äquilibrierte 120 mL Größenausschluss-Chromatographiesäule (Superdex 200
16/60) aufgetragen (ÄKTA prime plus, Amersham Biosciences) und das Eluat in 2 mL
Fraktionen
gesammelt.
Fraktionen
mit
signifikanter
NADH/Ferricyanid
Oxidoreduktaseaktivität wurden vereinigt. Das gereinigte Protein wurde auf eine
Konzentration von 10 – 12 mg/mL eingestellt, zu je 65 µL aliquotiert, in flüssigem Stickstoff
c ckgefr ren un bei −80 °C gelagert.
3.7.4 Bestimmung der Proteinkonzentration
Biuret-Methode: Der Gesamtproteingehalt der Membranen und der Eluate der einzelnen
Reinigungsschritte der Komplex I-Präparationen wurde nach der Biuret-Methode bestimmt.
Hierfür wurden 10 – 20 µL Membransuspension, 10 – 20 µL Detergenzextrakt oder 20 – 40 µL
Eluat der Anionenaustausch-Chromatographie mit 1 mL 6% (w/v) Trichloressigsäure versetzt,
invertiert und anschließend zentrifugiert (16´100×g, 1 min, RT, Rotor F45-24-11, Eppendorf
Zentrifuge 5415 D). Der Überstand wurde verworfen, das Sediment mit 1 mL Biuret-Reagenz
versetzt und durch Schütteln bei 37 °C (1400 Upm, 30 min, Eppendorf Thermomixer
compact) gelöst. Die Absorbanz bei 546 nm wurde gemessen (Halbmikro-Küvetten, d = 1 cm,
Greiner, Ultraspec 1100 pro, Pharmacia Biotech). Durch Zugabe von wenigen Körnchen
KCN wurden die Proben entfärbt und die Absorbanz bei 546 nm erneut bestimmt. Diese
Absorbanz wurde als Hintergrundstreuung durch Lipide und Aggregate, abgezogen. Aus der
Differenz wurde über den Vergleich mit einer mittels Rinderserumalbumin (BSA) erstellten
Kalibrationsgeraden (0.1 – 1.0 mg BSA) die Proteinkonzentration der Probe bestimmt. Die
Konzentration jeder Probe wurde dreifach bestimmt.
Bradford-Methode: Der Proteingehalt der bei der Reinigung von NuoEFHis anfallenden
Proben und der Präparation wurde nach der Bradford-Methode bestimmt. Dabei wurde 1 µL
der jeweiligen Proteinlösung mit 19 µL ddH2O sowie 1 mL 1×Roti-Quant (Roth) Lösung
versetzt, invertiert und 5 min bei Raumtemperatur inkubiert. Es wurde die Absorbanz bei
56
Material und Methoden
595 nm gemessen (Halbmikro-Küvetten, d = 1 cm, Greiner, Ultraspec 1100 pro, Pharmacia
Biotech). Die Proteinkonzentration wurde mittels einer mit 1 – 7 µg BSA erstellten
Kalibrationsgeraden bestimmt. Es wurden jeweils Doppelbestimmungen durchgeführt.
UV-spektroskopische Methode: Die Konzentration des gereinigten Komplex I wurde
spektroskopisch bestimmt (UV-Küvette micro, d = 1 cm, Plastibrand; TIDAS II, J&M). Die
Absorbanz der Proteinlösung bei 280 nm wurde bestimmt und gegen den Wert des Puffers bei
gleicher Wellenlänge korrigiert. Zur Korrektur der Lichtstreuung wurde von diesem Wert die
korrigierte Absorbanz bei 310 nm abgezogen. Mit Hilfe des Lambert-Beerschen Gesetzes
wurde die Proteinkonzentration bestimmt. Hierfür wurde der aus der Aminosäuresequenz
abgeleitete Extinktionskoeffizient von ε280 = 763 mM−1 cm−1 (Gill und von Hippel, 1989) bei
einer angenommenen molekularen Masse von Mr = 535 kDa verwendet. Die Konzentration
des gereinigten Subkomplexes NuoEFHis wurde ebenfalls spektroskopisch bestimmt. Hierfür
wurde
der
aus
der
Aminosäuresequenz
abgeleitete
Extinktionskoeffizient
von
ε280 = 80.7 mM−1 cm−1 (Gill und von Hippel, 1989) bei einer angenommenen molekularen
Masse von Mr = 66 kDa verwendet.
3.7.5 Aktivitätsmessungen
(d)-NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität: Die NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität wurde durch die zeitliche Abnahme der K3[Fe(CN)6]-Konzentration bei 410 nm
spektroskopisch verfolgt. Zur Messung wurden 1 mL K3[Fe(CN)6]-Lösung (1 mM in
A-Puffer) und 20 µL (d)-NADH (10 mM) in einer Küvette vorgelegt. Es wurden 1 – 5 µL
Probe zugegeben, der Ansatz vermischt und die zeitliche Änderung der Absorbanz gemessen
(Ultrospec
1000
UV/Visible
Spectrophotometer,
Pharmacia
Biotech).
Für
die
Aktivitätsberechnung mit Hilfe des Lambert-Beerschen-Gesetzes wurde ein molarer
Ex ink i n k effizien v n ε410(K3[Fe(CN)6]) = 1 mM−1 cm−1 verwendet (Friedrich et al.,
1989).
(d)-NAD(P)H-Oxidaseaktivität: Zur Bestimmung der (d)-NAD(P)H-Oxidaseaktivität wurde
die Abnahme der Sauerstoff-Konzentration mit Hilfe einer Clark-Sauerstoffelektrode (RE K11, Oxytec) gemessen. Zur Kalibrierung der Elektrode wurden 2 mL A-Puffer bei 30 °C mit
einer Spatelspitze Natriumdithionit reduziert und das Signal aufgenommen. Zur Berechnung
der Aktivität wurde von einer Sauerstoffkonzentration von 237 µM (Weiss, 1970) im Puffer
57
Material und Methoden
ausgegangen. Für die Messung wurden 2 mL A-Puffer bei 30 °C vorgelegt und mit 5 µL
Membransuspension versetzt. Die Reaktion wurde durch Zugabe von 5 µL 0.5 M
(d)-NAD(P)H (Endkonzentration 1.25 mM) gestartet. Die Komplex I-vermittelte Aktivität der
Probe wurde durch die Zugabe von 5 µL der spezifischen Hemmstoffe Piericidin A (10 mM
in EtOH, Endkonzentration 25 µM) oder Fenazaquin (10 mM in Ethanol, Endkonzentration
50 µM) blockiert.
Succinat-Oxidaseaktivität:
Die
Succinat-Oxidaseaktivität
wurde
ebenfalls
als
Sauerstoffverbrauch an einer Clark-Sauerstoffelektrode (RE K1-1, Oxytec) gemessen. Zur
Kalibrierung wurden 2 mL PBS-Puffer mit einer Spatelspitze Natriumdithionit reduziert. Der
gemessene Spannungsabfall entspricht einer Sauerstoffkonzentration von 237 µM (Weiss,
1970). Für die Messung wurden 2 mL PBS-Puffer bei 30 °C vorgelegt und mit 5 µL
Membransuspension versetzt. Der Ansatz wurde 10 min unter Rühren inkubiert um eventuell
gebundenes Oxalacetat aus dem aktiven Zentrum zu verdrängen (Maklashina und Cecchini,
1999). Die Reaktion wurde durch Zugabe von 5 µL 0.5 M Succinat (Endkonzentration
1.25 mM) gestartet. Die Succinat Dehydrogenase vermittelte Aktivität der Probe wurde durch
die Zugabe von 20 µL des Hemmstoffes Malonat (1 M in ddH2O, Endkonzentration 10 mM)
inhibiert. Um den Einfluss der Komplex I-spezifischen Inhibitoren Piericidin A und
Fenzaquin auf die Aktivität der der restlichen Atmungskette in den verwendeten E. coli
Membranen zu überprüfen, wurden der Reaktion jeweils 5 µL Piericidin A (10 mM in EtOH,
Endkonzentration 25 µM) oder 10 µL Fenazaquin (10 mM in Ethanol, Endkonzentration
50 µM) zugesetzt.
NADH:Decyl-Ubichinon Oxidoreduktaseaktivität: Zur Bestimmung der physiologischen
Komplex I Aktivität wurde der Elektronentransfer von NAD(P)H auf das UbichinonAnalogon 2,3-Dimethoxy-5-methyl-6-decyl-1,4-benzochinon (Decyl-Ubichinon) verfolgt. Die
Aktivität wurde über die zeitliche Abnahme der NAD(P)H-Konzentration bei 340 nm
bestimmt. 5 µg Komplex I wurden 1:1 (w/w) mit E. coli polaren Lipiden (10 mg/mL) versetzt
und für 30 min auf Eis inkubiert. Für die Messung wurden 981 µL A-Puffer vorgelegt und mit
10 µg der Komplex I/Lipid-Mischung und anschließend mit 3 µL Decyl-Ubichinon (20 mM
in Ethanol, Endkonzentration 60 µM) versetzt. Es wurde 1 min bei Raumtemperatur inkubiert
und die Messung durch Zugabe von 15 µL NADH (10 mM in H2O, Endkonzentration
150 µM) gestartet. Zur Berechnung der physiologischen Aktivität mittels des Lambert-
58
Material und Methoden
Beerschen-Ge e ze
wur e
ein
m arer
Ex ink i n k effizien
v n
ε340(NADH) =
6.178 mM−1 cm−1 verwendet.
Protonentranslokationsaktivität: Um die Protonentranslokation zu messen, wurde Komplex I
zunächst in Liposomen rekonstituiert. Hierfür wurden 200 µg Enzym (5 mg/mL) in
ADDM-Puffer mit 60 µL E. coli polaren Lipiden (20 mg/mL in Lipidpuffer) 1:6 (w/w)
vermischt und mit 80 µL Rekonstitutionspuffer verdünnt. BioBeads SM-2 (Biorad) wurden
mit Methanol und anschließend mit ddH2O aktiviert. Die Enzym/Lipid-Lösung wurde zum
etwa 8-fachen Überschuss an BioBeads, bezogen auf die Detergenzbindekapazität von etwa
105 mg DDM/g BioBeads (Rigaud et al., 1998), gegeben und 3 h unter Rühren auf Eis
inkubiert (Stolpe und Friedrich, 2004). Zur Abschätzung der in der Probe befindlichen DDMGesamtmenge, wurde die DDM-Konzentration in den Puffern und der Komplex I-Lösung
berechnet (Böttcher et al., 2002). Die Proteoliposomen wurden vorsichtig mit einer Pipette
von den BioBeads abgetrennt und zur Messung der Protonentranslokationsaktivität mittels
Fluoreszenzlöschung von 9-amino-6-chlor-2-methoxyacridin (ACMA) eingesetzt. Alle
Messungen wurden im Arbeitskreis von Prof. P. Gräber im Institut für Physikalische Chemie
(Albert-Ludwigs-Universität, Freiburg) durchgeführt. 967 µL ACMA-Messpuffer wurden mit
5.1 µL Proteoliposomen (6.5 µg Komplex I), 5 µL Decyl-Ubichinon (10 mM in Ethanol,
Endkonzentration 50 µM) und 8 µL ACMA-Lösung (25 µM in Ethanol, Endkonzentration
0.2 µM) versetzt und unter Rühren inkubiert bis die Fluoreszenzemission bei 480 nm
(d = 1 cm, Makro-Küvetten Spezial PS, Ratiolab; LS 45 Luminescence Spectrometer, Perkin
Elmer, Anregungswellenlänge 430 nm, Spaltbreite 10 nm) konstant blieb. Durch die Zugabe
von 15 µL NAD(P)H (10 mM in ddH2O, Endkonzentration 150 µM) wurde die Reaktion
gestartet. Die zeitliche Änderung der Fluoreszenzemission bei 480 nm wurde mit Hilfe eines
des Programms FL WinLab (Perkin Elmer) aufgezeichnet. Zur Kontrolle wurde der durch die
Reaktion aufgebaute Protonengradient durch die Zugabe von 10 µL CCCP (10 mM in
Ethanol, Endkonzentration 100 μM) abgebaut oder die Reaktion durch die Zugabe von 5 µL
Piericidin A (10 mM in Ethanol, Endkonzentration 50 µM) gestoppt.
3.7.6 SDS-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Nach Schägger und von Jagow (1987): Um die Reinheit und Zusammensetzung von
Cytoplasmamembranen und der Präparation des E. coli Komplex I zu untersuchen, wurde
eine SDS-PAGE nach Schägger und von Jagow (1987) verwendet. Für die Auftrennung der
59
Material und Methoden
Polypeptide wurde ein diskontinuierliches Gelsystem mit 3.9%igem Sammelgel und
10%igem Trenngel verwendet. Zur Probenvorbereitung wurden 70 – 300 µg gelöstes Protein
oder Membranensuspension mit Schägger-Probenpuffer versetzt, für 30 min bei 37 °C unter
Schütteln (750 Upm, Eppendorf Thermomixer compact) denaturiert und auf das Gel
aufgetragen. Die Polypeptide wurden bei konstanten 45 mA (EPS 600, Pharmacia Biotech)
aufgetrennt, bis die Farbstoffbande die untere Gelkante erreicht hatte. Die Proteinbanden
wurden mit heißer Färbelösung gefärbt und durch anschließende Entfärbung des Hintergrunds
mit Entfärbelösung sichtbar gemacht. Wenn Gele für den Western Blot verwendet wurden,
wurden diese bis zum Transfer in Blotpuffer aufbewahrt.
Nach Laemmli (1970): Um die Reinheit von A. aeolicus NuoEFHis-Proben zu untersuchen,
wurde ein diskontinuierliches Gelsystem nach Laemmli (1970) aus einem 5%igem
Sammelgel und einem 15%igem Trenngel verwendet. Es wurden 10 µg Protein mit ddH2O
auf 10 µL aufgefüllt, mit 4 μL Pr benpuffer ver e z un bei 65 °C denaturiert (750 Upm,
10 min, Thermomixer compact, Eppendorf). Die Polypeptide wurden bei konstanten 35 mA
(EPS 600, Pharmacia Biotech) für etwa eine Stunde elektrophoretisch aufgetrennt. Die
Proteinbanden wurden wie oben beschrieben sichtbar gemacht.
3.7.7 Western Blot-Analyse
Zur Untersuchung der Produktion einzelner E. coli Komplex I-Varianten wurden die durch
SDS-PAGE aufgetrennten Proteinuntereinheiten auf eine zuvor in Methanol aktivierte PVDFMembran (Westran S, Whatman) transferiert. Es wurde eine mit Blotpuffer gefüllte Nass-Blot
Apparatur bei 4 °C und ein über einen Zeitraum von 135 min konstanter Strom von 400 mA
verwendet (Towbin et al., 1979). Um eine unspezifische Anbindung der primären Antikörper
zu verhindern, wurde die Membran bei Raumtemperatur 1 h in Blockpuffer inkubiert. Danach
wurde die Membran für 1 h oder über Nacht bei 4 °C mit dem primären Antikörper (Mouse
Anti-His4, Qiagen, in PBS) inkubiert. Die Membran wurde zweimal mit PBS-T gewaschen
(50 mL, 5 min) und 1 h mit dem sekundären Antikörper (Goat anti mouse IgG, HRP
conjugated, Qiagen, in PBS) inkubiert. Die Membran wurde erneut zweimal mit PBS-T
(50 mL, 5 min) und zweimal mit Na2HPO4-Lösung (50 mL, 5 min) gewaschen. Danach wurde
die frisch angesetzte Färbelösung hinzugegeben. Sobald die Banden sichtbar waren, wurde die
Membran in ein Wasserbad (RT) überführt, um die Färbereaktion zu stoppen.
60
Material und Methoden
3.7.8 Saccharosedichtegradienten-Zentrifugation
Alle
Arbeitsschritte
wurden
bei
4 °C
oder
auf
Eis
durchgeführt.
E. coli
Cytoplasmamembranen wurden isoliert, 1:1 (w/v) in A*-Puffer resuspendiert und 1:1000
(v/v) mit PMSF (0.1 M in Isopropanol) versetzt. 1.5 mL der Membranensuspension wurden
mit 263 µL DDM-Stammlösung (20% (w/v), Endkonzentration 3%) versetzt und für 15 min
auf Eis inkubiert. Alle 3 – 4 min wurde mit einem Teflon-in-Glas-Homogenisator
durchmischt. Der Extrakt wurde zentrifugiert (150´000×g, 4 °C, 30 psi, 25 min, Rotor A-100,
Airfuge, Beckmann). 400 µL des Extrakts wurden auf einen 12 mL Saccharosegradienten von
5 – 30% (w/v) Saccharose in A*DDM-Puffer mit 50 µM PMSF aufgetragen und zentrifugiert
(222´000×g, 17 h, 4 °C, Rotor SW 41 Ti, Coulter-Optima LE-80K Ultracentrifuge, Beckman).
Die
Gradienten
wurden
zu
600 µL
fraktioniert
und
die
NADH/Ferricyanid
Oxidoreduktaseaktivität der einzelnen Fraktionen bestimmt.
3.8 Kristallographische Methoden
3.8.1 Kristallisation der A. aeolicus NuoEFHis-Varianten
Für Kristallisationsexperimente wurden die hanging drop und die sitting drop Methode in
24-Well-Kristallisationsplatten angewendet. Es wurden jeweils 2.5 µL Proteinlösung mit
5 –12 mg/mL
mit
2.5 µL
Reservoirlösung
versetzt.
Das
Volumenverhältnis
von
Reservoirlösung zu Tropfengröße betrug immer 1:100. Die Kristallisationsansätze wurden bei
16 – 20 °C unter Lichtausschluss gelagert. Das Kristallwachstum wurde in regelmäßigen
Abständen
beobachtet,
bevor
die
bis
dahin
gewachsenen
Kristalle
für
röntgendiffraktometrische Messungen weiter präpariert wurden. Die Zusammensetzungen der
einzelnen Reservoirs sind in der Tabelle 3.20 aufgeführt. Für die Visualisierung von
Proteinstrukturen wurde das Programm UCSF Chimera verwendet (Petterson et al., 2004).
61
Material und Methoden
Tabelle 3.20: Zusammensetzung der Reservoirs für die Kristallisation. Der pH-Wert für 0.1 M Tris/HCl ist
angegeben. Alle Reservoirlösungen enthielten zusätzlich 0.2 M NaCl.
1
2
3
4
5
6
A
pH 6.8,
0.6 M
Na3Citrat
pH 6.8,
0.7 M
Na3Citrat
pH 6.8,
0.8 M
Na3Citrat
pH 6.8,
0.9 M
Na3Citrat
pH 6.8,
1.0 M
Na3Citrat
pH 6.8,
1.05 M
Na3Citrat
B
pH 6.9,
0.6 M
Na3Citrat
pH 6.9,
0.7 M
Na3Citrat
pH 6.9,
0.8 M
Na3Citrat
pH 6.9,
0.9 M
Na3Citrat
pH 6.9,
1.0 M
Na3Citrat
pH 6.9,
1.05 M
Na3Citrat
C
pH 7.0,
0.6 M
Na3Citrat
pH 7.0,
0.7 M
Na3Citrat
pH 7.0,
0.8 M
Na3Citrat
pH 7.0,
0.9 M
Na3Citrat
pH 7.0,
1.0 M
Na3Citrat
pH 7.0,
1.05 M
Na3Citrat
D
pH 7.1,
0.6 M
Na3Citrat
pH 7.1,
0.7 M
Na3Citrat
pH 7.1,
0.8 M
Na3Citrat
pH 7.1,
0.9 M
Na3Citrat
pH 7.1,
1.0 M
Na3Citrat
pH 7.1,
1.05 M
Na3Citrat
3.8.2 Herstellung von Keimkristallen
Um
das
Kristallwachstum
zu
initiieren
oder
hochwertigere
Kristalle
für
die
Röntgendiffraktometrie zu erhalten, wurden Keimkristalle (seeds) verwendet. Zu deren
Darstellung
wurden
verwachsene
Kristalle
oder
Kristallfragmente
aus
einem
Kristallisationstropfen entnommen und in 10 µL Reservoirlösung mit einer Pipettenspitze
grob zerkleinert. Diese wurden in einem 1.5 mL Reaktionsgefäß mit 50 µL eiskalter
Reservoirlösung verdünnt. Seed-beads (Hampton Research) wurden zugegeben und durch
zweiminütiges Rühren (Vortex-GENIE, Scientific Industries) die noch zu großen Kristalle zu
Mikrokristallen zerkleinert. Um eine zu starke Erwärmung und damit ein Auflösen der
Mikrokristalle zu vermeiden, wurde das Reaktionsgefäß alle 30 s auf Eis gestellt. Es wurden
jeweils 10 µL der Lösung aliquotiert und Verdünnungen von 1:1000 und 1:10´000 hergestellt.
Alle seed-Lö ungen wur en bei −80 °C gelagert. Bei der Kristallisation wurden 1.9 µL
Reservoirlösung und 0.6 µL der 1:1000 oder 1:10´000 verdünnten seedstock Lösung mit
2.5 µL Proteinlösung in einem Tropfen vermischt. Anschließend wurde wie oben beschrieben
weiterverfahren.
3.9 EPR-Spektroskopie
Alle EPR-spektroskopischen Untersuchungen wurden in Zusammenarbeit mit Herrn Prof.
Thorsten Friedrich oder Frau Dr. Katerina Dörner am Institut für Biochemie (Albert-Ludwigs62
Material und Methoden
Universität, Freiburg) durchgeführt. Die EPR-Spektren wurden mit einem EMX 6/1 EPRSpektrometer (Bruker) ausgestattet mit einem ESR-9 Helium-Kryostaten (Oxford
Instruments) aufgenommen.
Zum Nachweis einzelner Fe/S-Zentren wurden 0.5 – 1.5 mg des isolierten Komplex I in
300 µL A-Puffer mit 1 – 3 µL NAD(P)H (1 M) und/oder mit einigen Körnchen Dithionit
reduziert. Die Probe wurde durchmischt, luftblasenfrei in ein EPR-Röhrchen überführt und in
einer Kältemischung (2-Methylbutan/Methylcyclohexan 5:1, v/v) bei ca. −120 °C eingefroren.
Die Proben wurden in flüssigem Stickstoff gelagert.
Während der NAD(P)H-Umsetzung durch Komplex I entstehende ROS wurden EPRspektroskopisch mit Hilfe des Radikalfängers DEPMPO bei Raumtemperatur detektiert
(Vasquez-Vivar et al., 2000). Der 1 mL Reaktionsansatz (A-Puffer) enthielt 45 µg Komplex I
rekonstituiert in E. coli polaren Lipiden, 1 mM NAD(P)H und 0.5 µL DEPMPO
(Endkonzentration 100 mM). Die Reaktion wurde durch die Zugabe von 100 µM DecylUbichinon gestartet. Der Ansatz wurde 1 min bei Raumtemperatur inkubiert bevor 20 µL in
einem
Quarzröhrchen
entnommen
wurden.
Zur
Kontrolle
wurden
100 U/mL
Superoxiddismutase (SOD) bzw. 20 µM Piericidin A zugegeben, oder es wurde auf die
Zugabe von Decyl-Ubichinon verzichtet.
63
Ergebnisse
4 Ergebnisse
4.1 Substratunterscheidung am Komplex I
NADH und NADPH werden in verschiedenen metabolischen Prozessen verwendet. NADH
wird bevorzugt in katabolen, NADPH hingegen in anabolen Prozessen genutzt. Die Struktur
der NADH-Bindestelle des Komplex I zeigt, dass Glu183F Wasserstoffbrücken zu dem O2'
und dem O3' der Adenosin-Ribose ausbildet. Sequenzanalysen von Dinukleotid-abhängigen
Dehydrogenasen haben gezeigt, dass an der homologen Position ein Asp bei NAD- bzw. ein
Asn oder ein Gly bei NADP-abhängigen Dehydrogenasen vorliegt (Lesk, 1995). Um zu
untersuchen, ob das Glu183F für die Unterscheidung zwischen NADH und NADPH als
Substrat verantwortlich ist, wurde es jeweils gegen Ala, Asp, Asn, Gln, Gly und His
ausgetauscht. Florian Hubrich wurde im Rahmen seiner Zulassungsarbeit zu den Arbeiten zu
Teilen dieses Kapitels angeleitet (Hubrich, 2010). Teile der hier gezeigten Ergebnisse wurden
bereits veröffentlicht (Morina et al., 2011). Zur gleichen Zeit veröffentlichte die Gruppe von
Isabelle Meynial-Salles an der Université de Toulouse, Frankreich, ähnliche Ergebnisse mit
einem anderen methodischen Ansatz (Auriol et al., 2011). Hierbei wurde untersucht, wie sich
E. coli an eine erhöhte intrazelluläre NADPH-Konzentration anpasst. Durch Inaktivierung des
zweiten Enzyms der Glykolyse und des ersten des Entner-Doudoroff-Wegs war diese E. coli
Mutante gezwungen Glucose über den Pentosephosphatweg, die Hauptproduktionsstätte von
NADPH, zu verstoffwechseln. Nach bereits 20 Generationen wurden erhöhte Wachstumsraten
beobachtet. Analysen der genomischen DNA zeigten eine einzelne Punktmutation;
Glu183AlaF. Um die NADPH-Konzentration weiter zu erhöhen wurden die Gene der
Phosphofruktokinase 1 und 2 inaktiviert, um anaplerotische Reaktionen der Glykolyse zu
unterbinden. Nach mehreren Generationen wurden nur acht Klone erhalten, von denen fünf
ebenfalls die Mutation Glu183AlaF und drei die Mutation Glu183GlyF trugen (Auriol et al.,
2011).
Zur Überproduktion der Glu183F-Varianten wurde hier der E. coli Stamm BW25113Δnuo und
das
Expressionsplasmid
pBADnuo nuoFhis
verwendet.
Da
das
Expressionsplasmid
pBADnuo nuoFhis mit etwa 21 kbp zu groß für eine ortsgerichtete Mutagenese ist, wurden
Punktmutationen mit Hilfe der λ-Red vermittelten Rekombination eingeführt. Um die
Effizienz der Rekombination zu erhöhen wurde das Gen nuoF auf pBADnuo nuoFhis durch
Insertion der nptI-sacB-Selektionskassette inaktiviert. Die gewünschten Punktmutationen
wurden mittels ortsgerichteter Mutagenese in den Subklon pCA24nuoF, der nur das Gen
64
Ergebnisse
nuoF enthält, eingebracht. Von dem Subklon wurde ein lineares Fragment amplifiziert, das
die gewünschte Mutation trug. Mit Hilfe der λ-Red vermittelten Rekombination wurde die
Selektionskassette in dem Vektor pBADnuo nuoFhis::nptI-sacB gegen das mutierte lineare
Fragment
ausgetauscht.
Die
so
dargestellten
Mutanten
wurden
angezogen,
die
Komplex I-Varianten isoliert und biochemisch charakterisiert.
4.1.1 Darstellung der Mutanten pBADnuo nuoFhis E183A/D/G/H/N und Q
Die nptI-sacB-Kassette wurde von dem Vektor pVO1100 mit den Oligonukleotiden
nuoF::nptI-sacB_fwd und nuoF::nptI-sacB_rev (Tab. 3.5) amplifiziert. Die Oligonukleotide
trugen die für die λ-Red vermittelte Rekombination benötigten homologen Bereiche zu nuoF.
E ek r k mpe en e
DH5αΔnuo/pKD46
wurden
frisch
hergestellt
und
mit
50 ng
pBADnuo nuoFhis und 350 ng des PCR-Produkts nuoF::nptI-sacB kotransformiert. Der
Ansatz wurde auf LB-Platten mit Kanamycin ausgestrichen und etwa 22 h bei 30 °C
inkubiert. Es wurden einzelne Klone kultiviert, deren Plasmide isoliert und mittels Restriktion
analysiert (Abb. 4.1).
Länge [bp]
1
2
19´329→
7743→
4254→
3472→
2690→
Abbildung 4.1: Restriktionsanalyse des Vektors pBADnuo nuoFhis::nptI-sacB mit VspI. Spur 1 zeigt das
Bandenmuster des λ-DNA/Eco130I(StyI) Marker16. Spur 2 zeigt das erwartete Bandenmuster mit Längen von
7238, 5907, 4545, 3508 und 3147 bp.
Um die einzelnen Punktmutationen in den Expressionsvektor pBADnuo nuoFhis einzufügen,
mussten diese zunächst durch ortsgerichtete Mutagenese in den Subklon pCA24nuoF
eingebracht werden. Hierfür wurden die Oligonukleotid-Paare nuoF E183A_fwd/rev,
nuoF E183D_fwd/rev, nuoF E183G_fwd/rev, nuoF E183H_fwd/rev, nuoF E183N_fwd/rev
und nuoF E183Q_fwd/rev verwendet (Tab. 3.4). Die Oligonukleotide trugen neben den
65
Ergebnisse
gewünschten Mutationen, auch stille Mutationen um eine neue Schnittstelle für VspI zu
generieren. Für die PCR wurden 40 – 50 ng pCA24NnuoF als Vorlage und eine
Anlagerungstemperatur von 60 °C für 60 s verwendet. Der Erfolg der PCR wurde durch
Agarosegelelektrophorese überprüft. Das gereinigte PCR-Produkt wurde mit DpnI verdaut.
50 µL elektrokompetente E. coli DH5α wur en mi
1 µL des gereinigten Produktes
transformiert und der gesamte Ansatz auf chloramphenicolhaltigen LB-Agar-Platten
ausgestrichen. Es wurden einzelne Kolonien angezogen, die Plasmide der Kulturen isoliert
und mittels Restriktion analysiert (Abb. 4.2). Der Erfolg der ortsgerichteten Mutagenese
wurde durch Sequenzierung bestätigt.
Länge [bp]
1
2
19´329→
7743→
4254→
3472→
1489→
925→
421→
Abbildung 4.2: Restriktionsanalyse des Vektors pCA24NnuoF E183A mit VspI. Die Agarosegele der
anderen Mutanten sehen identisch aus und werden daher nicht gezeigt. Spur 1 zeigt das Bandenmuster des
λ-DNA/Eco130I(StyI) Marker16. Spur 2 zeigt das erwartete Bandenmuster mit Längen von 3999, 1055 und
742 bp. Die erwartete Bande bei 59 bp ist nicht mehr im Agarosegel enthalten.
Die Subklone pCA24NnuoF E183A/D/G/H/N und Q tragen genau wie der Expressionsvektor
pBADnuo nuoFhis das Gen für die Chloramphenicol-Acetyltransferase, welche die
Chloramphenicol-Resistenz vermittelt. Um die Effizienz der Rekombination zu erhöhen,
wurden die Subklone zunächst mit CaiI geschnitten, das Fragment mit dem mutierten nuoF
aus dem Agarosegel isoliert und als Vorlage zur Amplifikation der für die λ-Red vermittelte
Rekombination benötigten linearen Fragmente verwendet. Für die PCR wurden die
Oligonukleotide nuoF_fwd und nuoF_rev (Tab. 3.6) bei einer Anlagerungstemperatur von
60 °C verwendet. Der Erfolg der PCR wurde durch Agarose-Gelelektrophorese überprüft. Die
Ansätze wurden gereinigt, mit DpnI verdaut und erneut gereinigt. Elektrokompetente
DH5αΔnuo/pKD46 wurden frisch hergestellt und mit 50 ng pBADnuo nuoFhis::nptI-sacB und
300 – 400 ng der linearen Fragmente kotransformiert, auf YP/SUC-Agar-Platten mit
66
Ergebnisse
Chloramphenicol ausgestrichen und 20 – 24 h bei 30 °C inkubiert. Es wurden einzelne
Kolonien angezogen, die Plasmide der Klone isoliert und durch Restriktion analysiert (Abb.
4.3). Der Erfolg der λ-Red vermittelten Rekombination wurde durch Sequenzierung bestätigt.
Länge [bp]
1
2
19´329→
7743→
6223→
4254→
3472→
2690→
925→
421→
Abbildung 4.3: Restriktionsanalyse des Vektors pBADnuo nuoFhis E183A mit VspI. Die Agarosegele der
anderen Mutanten sehen identisch aus und werden daher nicht gezeigt. Spur 1) zeigt das Bandenmuster des
λ-DNA/Eco130I(StyI) Marker16. Spur 2) zeigt das erwartete Bandenmuster mit Längen von 7238, 5654, 4545,
3147 und 742 bp.
4.1.2 Komplex I-vermittelte Aktivitäten der Cytoplasmamembranen
Für die Überproduktion der Komplex I Varianten wurde der E. coli Stamm BW25113Δnuo
verwendet. Zellen dieses Stamms wurden mit den dargestellten Plasmiden transformiert. Zur
Kontrolle wurden die Plasmide vor der Zellzucht aus dem Expressionsstamm isoliert und
erneut über eine Restriktionsanalyse mit VspI charakterisiert (Daten nicht gezeigt). Die
Mutanten BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFhis E183A/D/G/H/N und Q wurden im 10 LMaßstab in Autoinduktionsmedium angezogen. Um den Einfluss der Mutationen auf das
Zellwachstum zu untersuchen, wurde der Ausgangsstamm BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFhis
ebenfalls angezogen. Abbildung 4.4 zeigt die Wachstumskurven der einzelnen Mutanten und
des Ausgangsstamms. Die Mutationen von E183F zu D, H, N und Q hatten keinen Einfluss
auf das Zellwachstum, da alle Stämme eine OD600 von etwa 5.5 erreichten. Die
entsprechenden Mutationen zu Ala und Gly beeinträchtigten das Wachstum stark. Die
Stämme BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFhis E183G und E183A erreichten etwa 2 h vor dem
Ausgangsstamm die stationäre Phase bei einer OD600 von 2.5 bzw. 2.8, was weniger als der
Hälfte der OD600 des Ausgangsstamms entspricht.
67
Ergebnisse
A)
B)
Abbildung 4.4: Wachstumskurven der Stämme BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFhis E183X. A) zeigt die
Wachstumskurven der Stämme BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFhis E183D (grün), E183H (rot), E183N (blau),
E183Q (violett), und des Ausgangsstamms (schwarz). B) stellt die Wachstumskurven der Stämme
BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFhis E183A (rot), E183G (blau) und des Ausgangsstamms (schwarz) dar. Die
Zellen wurden im 10 L-Maßstab in Autoinduktionsmedium angezogen.
Die Cytoplasmamembranen der Mutanten sowie des Ausgangsstamms wurden präpariert und
deren NAD(P)H-Oxidaseaktivitäten als auch NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivitäten
bestimmt. Die Membranen des Ausgangsstamms dienten als Referenz. Tabelle 4.1 gibt die
Aktivitäten wieder.
Tabelle 4.1: NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivitäten und NAD(P)H-Oxidaseaktivitäten der
Cytoplasmamembranen
des
Ausgangsstamms
und
der
Glu183F-Mutanten.
Für
eine
bessere
Vergleichbarkeit wurden die Aktivitäten auf die des Ausgangsstamms normiert, wobei diese gleich 1.0 gesetzt
wurde.
BW25113Δnuo/
pBADnuo nuoFhis
NADH/Ferricyanid
Oxidoredukatseaktivität
NADHOxidaseaktivität
NADPHOxidaseaktivität
Normierte Oxidaseaktivitäten
NADH
NADPH
[µmol·min−1·mg−1]
68
unverändert
7.0
0.8
0.2
1.0
1.0
E183A
7.5
1.5
0.5
1.9
2.5
E183D
15.4
1.8
1.1
2.3
5.5
E183G
6.6
0.8
0.4
1.0
2.0
E183H
11.2
1.1
0.5
1.4
2.5
E183N
15.4
1.1
0.5
1.4
2.5
E183Q
7.9
0.8
0.5
1.0
2.5
Ergebnisse
Die Werte sind höher als bei anderen Messungen (vgl. 4.4.2, 4.5.1 und 4.6.1). Untereinander
sind die Werte vergleichbar, da die Membranen zeitgleich und unter identischen Bedingungen
vermessen wurden. Der Grund für die erhöhte Aktivität ist nicht verstanden. Die Membranen
der Mutanten weisen im Vergleich zum Ausgangsstamm eine deutlich erhöhte NADPHOxidaseaktivität auf. Die NADPH-Oxidaseaktivität der Cytoplasmamembranen der Mutante
BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFhis E183G
ist
doppelt
so
hoch,
die
der
Mutanten
BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFhis E183A/H/N und Q zweieinhalbmal und die der Mutante
BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFhis E183D sogar mehr als fünfmal so hoch wie die des
Ausgangsstamms.
Die
NADH-Oxidaseaktivitäten
der
Membranen
der
Mutanten
BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFhis E183G und Q sind im Vergleich zum Ausgangsstamm
unverändert. Die der Mutanten BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFhis E183H und N sind
anderthalbfach erhöht und die Mutanten BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFhis E183A und D
zeigen eine doppelt so hohe Aktivität. Die NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivitäten der
Mutanten
BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFhis E183A/G
und
Q
ähneln
der
des
Ausgangsstamms. Bei den Mutanten BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFhis E183D/H und N sind
diese deutlich erhöht. Die Aktivitäten der Membranen geben einen Hinweis darauf, dass die
eingeführten Mutationen die Umsetzung von NADPH begünstigen.
4.1.3 Präparation des Komplex I und der Varianten E183A/D/G/H/N und QF
Um den Einfluss der Mutationen auf die Affinität zu NADH und NADPH zu untersuchen,
wurden die Varianten nach etabliertem Protokoll isoliert. Da alle Varianten auf dieselbe Weise
präpariert wurden, wird im diesem Kapitel die Reinigung der Variante E183DF exemplarisch
gezeigt. Die übrigen Präparationen verliefen ähnlich.
31 g Zellen des E. coli S amm BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFhis E183D wurden mit Hilfe
einer Druckentspannungsanlage aufgeschlossen. Die Cytoplasmamembranen wurden
präpariert und die Membranproteine mit 3% (w/v) DDM extrahiert. Die Variante wurde durch
Anionenaustausch- und Affinitäts-Chromatographie gereinigt. Abbildung 4.5 A gibt das
Elutionsprofil der Anionenaustausch-Chromatographie wieder. Die gebundenen Proteine
wurden mit einem Gradienten von 150 bis 350 mM NaCl eluiert. Fraktionen mit
NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität über 20 U/mL wurden vereinigt und über eine
Ni2+-Affinitäts-Chromatographie weiter gereinigt. Gebundene Proteine wurden mit einem
Stufengradienten von 140, 260, 380 und 500 mM Imidazol eluiert (Abb. 4.5 B). Die Variante
69
Ergebnisse
eluierte bei 260 mM Imidazol. Fraktionen mit NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität
über 15 U/mL wurden vereinigt.
A)
B)
Abbildung 4.5: Elutionsprofile der Anionenaustausch-Chromatographie an Fractogel EMD TMAE A)
und Affinitäts-Chromatographie an ProBond Ni2+-IDA B) der Präparation der Variante E183DF. Die
Absorbanz bei 280 nm ist in Blau, die NaCl- bzw. die Imidazol-Konzentration in Grün und die artifizielle
NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität in Rot dargestellt.
Tabelle 4.2 gibt den Verlauf der Reinigung der Variante E183DF als Beispiel wieder. Die
Ausbeuten der Präparationen aller Varianten und des ursprünglichen Komplex I sind in
Tabelle 4.3 zusammengefasst.
Tabelle 4.2: Präparation der Variante E183DF aus 31 g Zellen des Stamms BW25113Δnuo/pBADnuo
nuoFhis E183D.
Protein
[mL]
[mg]
[µmol·min-1]
[µmol·min-1·mg-1]
[%]
Membranen
18.0
1168
4722
4.0
100
Detergenzextrakt
60
786
3935
5.0
83
Fractogel EMD
44
119
1571
13.2
33
0.5
6.3
882
139.8
19
Präparationsschritt
2+
ProBond Ni -IDA
70
NADH/Ferricyanid
Oxidoreduktaseaktivität
total
spezifisch
Volumen
Ausbeute
Ergebnisse
Tabelle 4.3: Ausbeute der Präparationen der Varianten E183A/D/G/H/N/QF und des ursprünglichen
Komplex I.
Variante
Eingesetzte
Zellen
Protein
NADH/Ferricyanid
Oxidoreduktaseaktivität
Ausbeute aus
Gesamtaktivität
Komplex I
[g]
30.0
[mg]
6.0
[µmol·min−1·mg−1]
83.0
[%]
13
E183AF
31.0
2.1
80.0
8
F
E183D
31.0
6.3
139.8
19
E183GF
25.0
4.5
64.8
9
F
20.0
6.1
66.2
26
F
23.0
2.0
60.0
5
F
22.0
2.9
81.3
7
E183H
E183N
E183Q
Alle Varianten konnten in ausreichender Menge isoliert werden. Die Präparationstabelle der
Variante E183DF zeigt, dass die spezifische NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität mit
jedem Reinigungsschritt stieg. Diese lag für die meisten Präparationen zwischen 60 und
80 µmol·min−1·mg−1. Für die Variante E183DF betrug die Aktivität 140 µmol·min−1·mg−1 und
lag damit über der des Komplex I mit 83 µmol·min−1·mg−1. Die Präparationen wurden mittels
SDS-PAGE analysiert (Abb. 4.6). Das Acrylamidgel zeigt alle Banden der NuoUntereinheiten in den Präparationen.
M
1
2
3
4
5
6
7
app. Mr [kDa]
85 →
70 →
50 →
40 →
30 →
25 →
20 →
15 →
← Nu G
← Nu CD
← Nu F
← NuoL/N
← NuoM
← NuoH
← NuoB
} NuoI/J/E
← NuoA
← NuoK
Abbildung 4.6: Polyacrylamidgel der Präparationen. Spur M zeigt die Banden des Proteinstandards
PageRuler Unstained Protein Ladder (Thermo Scientific), Spur 1 die der Variante E183H F, Spur 2 die der
Variante E183QF, Spur 3 die der Variante E183AF, Spur 4 die der Variante E183DF, Spur 5 die der Variante
E183NF, Spur 6 die der Variante E183GF und Spur 7 die des unveränderten Komplex I. Es wurden jeweils
60 – 70 µg Protein auf das Gel aufgetragen. Die hydrophoben Untereinheiten NuoH, L, M und N werden nur
schwach angefärbt. Die Banden sind den einzelnen Komplex I-Untereinheiten zugeordnet.
71
Ergebnisse
4.1.4 Charakterisierung der Varianten E183A/D/G/H/N und QF
Um den Einfluss der eingeführten Mutation auf die Substratspezifität zu untersuchen, wurde
die NAD(P)H:Decyl-Ubichinon Oxidoreduktaseaktivität der in polare Lipide rekonstituierten
Varianten in Abhängigkeit von der Substratkonzentration bestimmt. Die Aktivitäten wurden
für 5 – 200 µM NADH bzw. 5 – 1500 µM NADPH bei einer Decyl-Ubichinon-Konzentration
von 60 µM
bestimmt. Die Aktivitäten wurden nach Hanes
(1932)
gegen die
Substratkonzentration aufgetragen. Nach linearer Regression wurde anhand der Steigung der
Geraden und dem Schnittpunkt mit der Ordinate die Michaelis-Konstante Km und die
maximale Umsatzgeschwindigkeit vmax bestimmt. Aus vmax wurde die Wechselzahl kcat
berechnet und mit dieser wiederum die katalytische Effizienz (kcat/Km) bestimmt. In Tabelle
4.4 sind die kinetischen Parameter des Komplex I und der Varianten aufgeführt. Die
kinetischen Parameter wurden in Zusammenarbeit mit Herrn Dipl.-Chem. Marius Schulte
bestimmt.
Tabelle 4.4: Kinetische Parameter des Komplex I und der Varianten E183A/D/G/H/N und QF mit NADH
und NADPH als Substrat.
Variante
Km
vmax
kcat
kcat/Km
[µM]
[µmol·min−1·mg−1]
[s−1]
[s−1·µM−1]
NADH
NADPH
NADH
NADPH
NADH
NADPH
NADH
NADPH
Komplex I
13 ± 1
1870 ± 30
2.9 ± 0.2
0.37 ± 0.1
26 ± 2
3.0 ± 1
2.0 ± 0.3
0.0018 ± 0.001
E183AF
12 ± 1
8±1
3.9 ± 0.1
3.9 ± 0.2
35 ± 1
35 ± 2
2.9 ± 0.2
4.35 ± 0.005
E183DF
5.8 ± 1
390 ± 30
4.2 ± 0.2
3.8 ± 0.2
37 ± 2
34 ± 2
6.4 ± 0.4
0.09 ± 0.006
E183GF
11 ± 1
33 ± 2
2.1 ± 0.1
2.4 ± 0.1
19 ± 1
21 ± 1
1.7 ± 0.2
0.65 ± 0.004
E183HF
5.7 ± 1
25 ± 2
4.1 ± 0.2
1.1 ± 0.1
37 ± 2
10 ± 1
6.5 ± 0.3
0.40 ± 0.003
E183NF
14 ± 1
480 ± 50
1.2 ± 0.2
1.2 ± 0.3
11 ± 2
11 ± 3
0.8 ± 0.1
0.022 ± 0.006
E183QF
12 ± 2
45 ± 4
3.1 ± 0.2
1.6 ± 0.1
28 ± 2
14 ± 1
2.3 ± 0.5
0.32 ± 0.003
Die kinetischen Parameter der Variante E183QF mit NADH als Substrat sind im Vergleich
zum Komplex I unverändert. Im Gegensatz dazu steigt die Affinität der Variante zu NADPH
um das 40-fache und der vmax um das Vierfache. Die Affinität von E183NF zu NADH ist
ebenfalls unverändert, aber vmax ist halbiert. Die Varianten E183DF und E183HF besitzen eine
doppelt so hohe Affinität zu NADH; zudem ist vmax um etwa ein Drittel gesteigert. Alle
Varianten zeigen eine deutlich erhöhte Reaktivität mit NADPH im Vergleich zum Komplex I.
72
Ergebnisse
Die Affinität der Variante E183HF zu NADPH ist um das 75-fache, der vmax dreifach erhöht.
Obwohl die Affinität der Variante E183DF zu NADPH nur fünffach erhöht ist, setzt diese
NADPH 10-mal schneller um als der ursprüngliche Komplex I. Die Umsatzrate überschreitet
sogar die des unveränderten Enzyms mit NADH als Substrat. Die Affinität von E183NF zu
NADPH und der vmax sind im Vergleich zu Komplex I vierfach erhöht, wobei die Variante
NADH und NADPH gleich schnell umsetzt. Da die katalytische Effizienz von Km und vmax
abhängt, ist sie ein sinnvoller Parameter, um die Varianten untereinander zu vergleichen. Die
katalytische Effizienz der Varianten E183DF und E183HF sind im Vergleich zu Komplex I
mit NADH als Substrat dreifach erhöht. Die der Variante E183QF ist unverändert und die von
E183NF ist mehr als halbiert. Die katalytische Effizienz aller Varianten mit NADPH als
Substrat ist deutlich erhöht. Die der Variante E183HF ist 220-fach, die der Variante E183QF
180-fach, die der Variante E183DF 50-fach und die der Variante E183NF 12-fach erhöht.
Die auch durch eine gerichtete Evolution erhaltenen Varianten E183AF und E183GF (Auriol
et al., 2011) hatten den größten Effekt auf die Umsetzung von NADPH. Die Variante E183G F
hat im Vergleich zu Komplex I eine unveränderte Affinität zu NADH, wobei vmax um ein
Drittel erniedrigt ist. Mit NADPH als Substrat zeigt die Variante eine 6.5-fach erhöhte
Umsatzgeschwindigkeit im Vergleich zum ursprünglichen Komplex. Die katalytische
Effizienz mit NADH als Substrat ist etwas erniedrigt. Wegen der stark erhöhten Affinität
dieser Variante zu NADPH ist die katalytische Effizienz 360-fach erhöht. Die kinetischen
Parameter der Variante E183AF sind bemerkenswert. Diese Variante zeigt die gleiche
Affinität zu NADH aber eine um ein Drittel erhöhte Umsatzgeschwindigkeit im Vergleich
zum unveränderten Komplex I. Daraus ergibt sich eine anderthalbfach höhere katalytische
Effizienz. Der Km der Variante zu NADPH ist sogar niedriger als zu NADH, wobei beide
Substrate gleich schnell umsetzt werden. Die katalytische Effizienz für die Umsetzung von
NADPH ist im Vergleich zu Komplex I 2400-fach gesteigert, wobei nur die Variante E183AF
eine höhere katalytische Effizienz für Umsetzung von NADPH als für die Umsetzung von
NADH aufweist.
Um zu untersuchen, ob alle Fe/S-Zentren durch die Zugabe von NADPH reduziert werden,
wurde die Variante E183HF EPR-spektroskopisch untersucht. 1.5 mg der Variante wurden mit
1.5 µL NADPH (1 M) reduziert und eingefroren. Es wurden Spektren bei 40 und 13 K
aufgenommen. Die Proben wurden von Prof. Thorsten Friedrich vermessen. Abbildung 4.7
zeigt die EPR-Spektren des Komplex I und der Variante E183HF.
73
Ergebnisse
A)
B)
a
a
b
b
c
c
Magnetische Flussdichte [mT]
Abbildung 4.7: EPR-Spektren des Komplex I und der Variante E183HF. Die Spektren in A) wurden bei
40 K und 2 mW, die in B) bei 13 K und 5 mW aufgenommen. a zeigt die Spektren des mit NADH und b des mit
NADPH reduzierten unveränderten Komplex I. c zeigt die Spektren der mit NADPH reduzierten Variante
E183HF. Die Mikrowellenfrequenz betrug 9.462 GHz, die Modulationsamplitude 0.6 mT, die Zeitkonstante
0.164 s und die Aufnahmegeschwindigkeit 17.9 mT/min (Morina et al., 2011).
In den EPR-Spektren der mit NADPH-reduzierten Variante E183HF sind die Signale aller
Fe/S-Zentren enthalten. Im Vergleich zu den Spektren des mit NADH reduzierten Komplex I
wurden alle Fe/S-Zentren der Variante E183HF in gleichem Maß von NADPH reduziert.
Es wurde untersucht, ob die NAD(P)H:Decyl-Ubichinon Oxidoreduktaseaktivität der Variante
E183HF mit der Translokation von Protonen gekoppelt ist. Die Variante wurde in Liposomen
rekonstituiert und der durch die Redoxreaktion erzeugte pH-Gradient anhand der
Fluoreszenzlöschung des pH-sensitiven Fluoreszenzfarbstoffs ACMA detektiert. Um zu
überprüfen, ob die gemessene Fluoreszenzlöschung durch den von Komplex I aufgebauten
Protonengradient erfolgte, wurde den Ansätzen jeweils der Komplex I-spezifische Inhibitor
Piericidin A oder der Protonengradient-Entkoppler CCCP zugegeben. Alle Reaktionen
wurden durch die Zugabe von 150 µM NAD(P)H gestartet (Abb. 4.8). Die Messungen
wurden in Zusammenarbeit mit Herrn Dipl.-Chem. Stefan Steimle durchgeführt.
74
Ergebnisse
A)
B)
C)
D)
Abbildung 4.8: Aufbau der Protonengradienten durch den Komplex I und die Variante E183HF. Die
Proteine wurden in Liposomen rekonstituiert. Die pH-abhängige Fluoreszenslöschung von ACMA (ΔF) über die
Zeit wurde detektiert. Die durch die Reaktion von Komplex I A) und der Variante E183HF C) mit NADH
(schwarz) und NADPH (rot) aufgebauten Protonengradienten sind abgebildet. Zur Kontrolle wurden Komplex I
B) und die Variante E183HF D), bevor die Reaktion mit NADH bzw. NAD(P)H gestartet wurde, mit Piericidin A
(PicA) oder CCCP inkubiert (Morina et al., 2011).
Die Reaktion von Komplex I mit NADH erzeugte einen Protonengradienten. Der Aufbau des
Gradienten wurde durch die Zugabe des Inhibitors Piericidin A und durch die Zugabe von
CCCP komplett unterbunden. Die Zugabe von NADPH zu Komplex I-Proteoliposomen
erzeugte keinen Protonengradient, was vermutlich an der langsamen Umsetzung des NADPH
durch Komplex I liegt (Tab. 4.4). Der Protonenrückstrom über die Membran lag vermutlich in
der gleichen Größenordnung wie die Translokation durch Komplex I. Die Variante E183HF
erzeugte durch die Umsetzung von NADH ebenfalls einen Protonengradienten. Im Gegensatz
zum ursprünglichen Komplex I ist die Reaktion der Variante mit NADPH mit einer
nachweisbaren Protonentranslokation gekoppelt. Die Inkubation mit Piericidin A und CCCP
verhinderte die Ausbildung eines Protonengradienten. Der durch die Redoxreaktion der
Variante mit NADH erzeugte Protonengradient nimmt schneller ab als der von dem
ursprünglichen Komplex I erzeugte. Dies könnte durch eine unterschiedliche Qualität der
Liposomen oder durch die schnellere Reaktion von E183HF mit NADH bedingt sein.
Unterschiede in der durch NADH und NADPH induzierten Fluoreszenzlöschung könnten auf
75
Ergebnisse
den unterschiedlichen Umsatzgeschwindigkeiten von E183HF mit den Substraten basieren
(vgl. Tab. 4.4).
Untersuchungen an Mitochondrien haben gezeigt, dass die Lipidperoxidation durch die
Komplex I-vermittelte ROS-Produktion in Anwesenheit von NADPH erhöht ist (Glinn et al.,
1997). Es wurde untersucht, ob die ROS-Produktion des bakteriellen Komplex I und der
Variante E183HF mit NADPH ebenfalls erhöht ist. Für den qualitativen ROS-Nachweis
wurde der Radikalfänger DEPMPO verwendet. Die mit Superoxid- und Hydroxyl-Radikalen
gebildeten Addukte DEPMPO-OOH und DEPMPO-OH erzeugen charakteristische, EPRspektroskopisch detektierbare Signale (Vasquez-Vivar et al., 2000). Der Komplex I und die
Variante E183HF wurden in E. coli polare Lipide rekonstituiert und mit DEPMPO (100 mM)
und NAD(P)H (1 mM) versetzt. Die Reaktion wurde durch die Zugabe von Decyl-Ubichinon
gestartet. SOD (100 U/mL) bzw. Piericidin A (20 µM) wurden zur Kontrolle zugegeben oder
es wurde auf die Zugabe von Decyl-Ubichinon verzichtet. Die EPR-spektroskopischen
Messungen wurden in Zusammenarbeit mit Frau Dr. Katerina Dörner durchgeführt.
Abbildung 4.9 gibt die gemessenen Spektren wieder.
Proben, die ausschließlich mit DEPMPO und dem zum Protein 1000-fachen molaren
Überschuss Decyl-Ubichinon inkubiert wurden, erzeugten keine Signale. Die Zugabe von
NADH zu der Komplex I-Probe lieferten kaum Signale, während bei der Variante kleine, aber
deutlich sichtbare Signale nachweisbar waren. Die mit NADPH inkubierten Proben erzeugten
beide das charakteristische EPR-Signal des DEPMPO-OOH Addukts, wobei das Signal mit
der Komplex I-Probe deutlich intensiver war als mit der Variante E183HF. Die Signale
wurden durch Zugabe von Piericidin A nicht, durch die Zugabe von SOD aber vollständig
unterdrückt. Ohne Decyl-Ubichinon erzeugten beide Proben deutlich geringere Signale.
76
Ergebnisse
A) a
B) a
b
b
c
c
d
d
e
e
f
f
Magnetische Flussdichte [mT]
Magnetische Flussdichte [mT]
Abbildung 4.9: EPR-spektroskopischer Nachweis der Superoxid-Produktion von Komplex I A) und der
Variante E183HF B). Die Enzyme wurden in E. coli polare Lipide rekonstituiert, mit 100 mM DEPMPO und
100 µM Decyl-Ubichinon (a) sowie mit 1 mM NADH (b), mit 1 mM NADPH (c), mit 1 mM NADPH und
100 U/mL SOD (d), mit 1 mM NADPH ohne Decyl-Ubichinon (e) oder mit 1 mM NADPH und 20 µM
Piericidin A (f) inkubiert. Die Spektren wurden bei Raumtemperatur aufgenommen. Die Mikrowellenfrequenz
betrug
9.65
GHz,
die
Modulationsamplitude
0.1
mT,
die
Zeitkonstante
0.164
s
und
die
Aufnahmegeschwindigkeit 5.4 mT/min (Morina et al., 2011).
Um die ROS-Produktion von Komplex I und seinen Varianten zu quantifizieren, wurde ein
von Herrn Dipl.-Chem. Marius Schulte (Schulte, 2014) für den E. coli Komplex I etablierter
Amplex Red Assay verwendet. Amplex Red wird von der Meerrettich Peroxidase (HRP) in
Anwesenheit von H2O2 zu Resorufin oxidiert. Die Bildung von Resorufin kann photometrisch
bei 557 – 571 nm verfolgt werden. 5 µg Komplex I wurde in polaren Lipiden rekonstituiert
und mit 60 µM Decyl-Ubichinon, 2 U/mL HRP sowie 10 µM Amplex Red inkubiert. Die
Reaktion wurde durch Zugabe von 30 µM NAD(P)H gestartet. Die Abnahme der NADHKonzentration und die Zunahme der Resorufin-Konzentration wurden gleichzeitig
aufgenommen. Somit konnte die prozentuale Zunahme von Resorufin und dadurch die
Entstehung von H2O2 pro umgesetztem NADH berechnet werden (Tab. 4.5) Die Messungen
wurden in Zusammenarbeit mit Herrn Dipl.-Chem. Marius Schulte durchgeführt.
77
Ergebnisse
Tabelle 4.5: Prozentuale H2O2-Produktion pro umgesetztem NAD(P)H des Komplex I und der E183XFVarianten. Zur Bestimmung der H2O2-Produktion wurde das Amplex Red Assay verwendet.
H2O2-Produktion pro umgesetztem NAD(P)H [%]
Variante
Komplex I
+ NADH
+ NADPH
− NAD(P)H
0.8 ± 0.08
14.1 ± 0.4
0
F
E183D
9.5 ± 0.9
24.4 ± 1.7
0
E183QF
2.1 ± 0.2
4.9 ± 0.3
0
F
2.2 ± 0.2
4.1 ± 0.2
0
F
E183H
2.1 ± 0.2
3.6 ± 0.2
0
E183AF
1.6 ± 0.1
1.2 ± 0.1
0
E183GF
1.6 ± 0.1
1.3 ± 0.1
0
E183N
Ohne die Zugabe von NAD(P)H konnte keine H2O2-Produktion beobachtet werden. Weniger
als 1% der von NADH auf den Komplex I übertragenen Elektronen führen zur Produktion
von ROS. Die ROS-Produktion pro umgesetztem NADPH ist 18-fach erhöht. Das ist
wahrscheinlich durch die schlechte Bindung von NADPH bedingt, die zu einer sehr
langsamen Umsetzung von 0.37 µmol·min−1·mg−1 führt. Alle Varianten zeigen mit NADH als
Substrat mindestens eine doppelt so hohe ROS-Produktion; die der Variante E183DF ist sogar
12-fach erhöht. Die ROS-Produktion der Varianten, die durch gerichtete Evolution
entstanden, ist nur in geringem Maß erhöht, beträgt aber dennoch das Doppelte der von
Komplex I. Alle Varianten außer E183DF produzieren bei der Umsetzung von NADPH
deutlich weniger ROS als der unveränderte Komplex I. Die ROS-Produktion der in dieser
Arbeit erstmals beschriebenen Varianten beträgt mit NADPH als Substrat etwa ein Drittel von
der des ursprünglichen Komplex I. Jedoch sind die Werte höher als bei der Umsetzung von
NADH. Bei den von Auriol et al. (2011) beschriebenen Varianten E183AF und E183GF ist die
ROS-Produktion bei der Umsetzung von NADPH im Vergleich zum ursprünglichen
Komplex I um über 90% niedriger und ist sogar niedriger als der Wert mit NADH als
Substrat.
Die hohen ROS-Produktionsraten der Varianten mit NADPH als Substrat sind wahrscheinlich
durch die hohen Km-Werte bedingt. Die Variante E183DF produziert aufgrund des hohen vmax
von 3.8 µmol·min−1·mg−1 mit NADPH sehr viel mehr ROS als der ursprüngliche Komplex I
mit NADH bei einem vmax von 2.9 µmol·min−1·mg−1. Das könnte durch die geringe Affinität
zu NADPH (Km = 390 µM) erklärt werden. Da aber der Km der Variante E183NF mit 480 µM
ungefähr in der gleichen Größenordnung liegt, die ROS-Produktion aber der von
E183Q und HF ähnlich ist, kann die geringe Affinität zu NADPH nicht der einzige Grund für
78
Ergebnisse
die erhöhte ROS-Produktion sein. Sehr interessant ist die Tatsache, dass alle Varianten trotz
gleichem oder niedrigerem Km-Wert mit NADH eine deutlich erhöhte ROS-Produktion
haben. Dies kann allein durch die kinetischen Daten nicht erklärt werden und erfordert daher
weitergehende strukturelle Untersuchungen.
4.2 Strukturelle Untersuchung der Substratdiskriminierung
In dieser Arbeit wurde mit enzymkinetischen Methoden gezeigt, dass das konservierte
Glutamat 183 auf NuoF des E. coli Komplex I eine Schlüsselposition für die Unterscheidung
zwischen NADH und NADPH als Substrat darstellt. Es wurden sechs Komplex I-Varianten
dargestellt, die alle deutlich erhöhte Aktivitäten mit NADPH und teilweise auch mit NADH
aufwiesen. Die Umsetzung von NADH war bei allen Varianten mit einer erhöhten ROSProduktion gekoppelt. Um die strukturellen Gründe für die veränderten Umsatzraten und die
erhöhte ROS-Produktion der Varianten zu untersuchen, wurden die homologen Varianten des
A. aeolicus Subkomplexes NuoEFHis erzeugt, produziert und kristallisiert. Sabrina Burschel
wurde im Rahmen ihrer Bachlorarbeit und Sascha Jurkovic im Rahmen seiner Diplomarbeit
zu Teilen der Arbeiten in diesem Kapitel angeleitet (Burschel, 2011; Jurkovic, 2013).
Zunächst sollte die heterologe Expression der A. aeolicus Gene nuoEF in E. coli optimiert
werden. In vorangegangen Arbeiten wurde für die Produktion von NuoEFHis der
Expressionsvektor pETBlue-1nuoEFhisG verwendet
, 200
et al., 2008).
Bei der Präparation wurden die Untereinheiten NuoE und NuoF als löslicher Komplex NuoEF
erhalten. NuoG lag in Form von Einschlusskörpern vor. Um den durch die Überproduktion
möglicherweise bedingten Zellstress zu minimieren, sollte der Vektor pETBlue-1nuoEFhis
ohne das Gen nuoG kloniert werden.
4.2.1 Optimierung der heterologen Expression von A. aeolicus nuoEF in E. coli
Um die Expression der A. aeolicus Gene nuoEF zu optimieren, wurde der Vektor
pETBlue-1nuoEFhis hergestellt. Dafür wurden die Gene nuoEFhis mit den Oligonukleotiden
axa_nuoE_fwd und axa_nuoFhis_rev (Tab. 3.6) von dem Vektor pETBlue-1nuoEFhisG mittels
PCR amplifiziert. Die Anlagerungstemperatur betrug 60 °C. Das Amplikon und der Vektor
79
Ergebnisse
pETBlue-1 wurden mit BlpI und EcoRI geschnitten und ligiert. Die korrekte Insertion wurde
durch Sequenzierung der Übergänge von Vektor zu Insert bestätigt. Der E. coli Stamm
Rosetta(DE3) wurde mit dem Vektor pETBlue-1nuoEFhis transformiert und auf LB-AgarPlatten mit Chloramphenicol und Ampicillin ausgestrichen. Der Stamm wurde im 10 LMaßstab in NuoEFaxa-Medium angezogen (Abb. 4.10 A) und das Protein nach etabliertem
Protokoll isoliert. Die erste NuoEFHis-Präparation aus 28 g Zellen dieses Stamms ergab 1 mg
Protein. Dies entspricht 0.04 mg Protein pro g Zellen. Diese Ausbeute war deutlich geringer
als die in vorangegangen Arbeiten beschrieben von 0.42 mg pro g Zellen (Ko
et al.,
2008). Bei einer weiteren Zellzucht aus derselben Glycerindauerkultur wurden sehr helle
Zellen erhalten. Nach dem ersten chromatographischen Reinigungsschritt an Ni2+-IDA wurde
in den entsprechenden Fraktionen nur eine farblose Lösung erhalten (Daten nicht gezeigt). Als
Konsequenz daraus wurden Zellen des E. coli Stamms Rosetta(DE3) erneut mit dem Vektor
pETBlue-1nuoEFhis transformiert. Es wurden zehn einzelne Kolonien im 4 mL-Maßstab
angezogen. Je 50 mL LB-Medium wurden mit Chloramphenicol und Ampicillin versetzt und
1:50 (v/v) aus den 4 mL-Vorkulturen angeimpft. Die Expression der Gene wurde durch die
Zugabe von 1 mM IPTG bei OD600 0.7 induziert. Die Zellen wurden für weitere 3 h
angezogen und durch Zentrifugation geerntet. Nur vier der zehn Zellsedimente wiesen die für
die Überproduktion von NuoEFHis charakteristische Braunfärbung auf. Der dunkelste Klon
wurde für die Zellzucht ausgewählt und wieder im 10 L-Maßstab in NuoEFaxa-Medium
kultiviert. Abbildung 4.10 B gibt die Wachstumskurve wieder.
A)
B)
Abbildung 4.10: Wachstumskurven des Stamms Rosetta(DE3)/pETBlue-1nuoEFhis. A) zeigt die
Wachstumskurve ohne vorangegangenen Expressionstest. B) zeigt die Wachstumskurve des Klons mit der nach
optischen Kriterien, höchsten Expressionsleistung. Der Zeitpunkt der Induktion mit 1 mM IPTG ist mit einem
Pfeil markiert. Es wurde im 10 L-Maßstab in NuoEFaxa-Medium angezogen.
80
Ergebnisse
Der Klon, der durch Expressionstests ausgewählt worden war, zeigte nach der Induktion ein
deutlich langsameres Wachstum und eine geringere Enddichte (OD600 = 2.7) als der nicht
getestete Klon (OD600 = 6.2). Nach Induktion wurde kein exponentielles Wachstum des
ausgewählten Klons beobachtet, was vermutlich auf den durch die erhöhte Expression und
Produktion bedingten Stress zurückzuführen ist. Aus 10 L NuoEFaxa-Medium wurden 22 g
Zellen erhalten, was einem Drittel der ersten Zellzucht entspricht. Da die Zellen eine sehr
dunkle, braune Färbung aufwiesen, wurden nur 5 g für die Proteinpräparation verwendet. Die
Zellen wurden in zwei Durchläufen mit Hilfe einer Druckentspannungsanlage aufgeschlossen.
Das Cytosol wurde durch Ultrazentrifugation von unlöslichen Bestandteilen befreit. Das
Protein wurde durch vier chromatographische Schritte gereinigt. Zuerst wurde das Cytosol auf
eine Ni2+-Affinitäts-Chromatographiesäule aufgetragen. Gebundene Proteine wurden mit
einem linearen Gradienten von 116 – 500 mM Imidazol eluiert. Fraktionen mit einer
NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität von über 20 U/mL wurden vereinigt, durch
Ultrafiltration
auf
Chromatographiesäule
unter
500 µL
(Superdex
eingeengt
200
16/60)
und
auf
eine
aufgetragen.
GrößenausschlussEs
wurden
zwei
Absorptionsmaxima erhalten, wobei nur das erste bei etwa 72 mL Elutionsvolumen Aktivität
aufwies. Der zweite Gipfel bei etwa 80 mL Elutionsvolumen wurde verworfen. Die
Fraktionen des ersten Gipfels mit NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivitäten über
40 U/mL wurden vereinigt und auf eine Ionenaustausch-Chromatographiesäule (Source 15Q)
aufgetragen. Gebundene Proteine wurden mit einem linearen Gradienten von 50 – 350 mM
NaCl eluiert. Erneut wurden die Fraktionen mit signifikanter Aktivität (≥ 30 U/mL) vereinigt,
durch Ultrafiltration auf unter 500 µL eingeengt und auf eine GrößenausschlussChromatographiesäule aufgetragen. Es wurde nur ein Gipfel bei 72 mL Elutionsvolumen
erhalten. Abbildung 4.11 gibt die Elutionsprofile der chromatographischen Reinigungsschritte
wieder. Die Reinheit und die Zusammensetzung der Proben der einzelnen Reinigungsschritte
wurde durch SDS-PAGE analysiert (Abb. 4.12).
Das Polyacrylamidgel zeigt in jeder Spur NuoFHis bei etwa 50 kDa und NuoE bei etwa
16 kDa. Die Präparation weist nach Färbung keine Verunreinigungen auf. Die Präparation
wurde unter den Standardbedingungen zur Kristallisation gebracht (Daten nicht gezeigt). Aus
5 g Zellen des Stamms Rosetta(DE3)/pETBlue-1nuoEFhis wurden 7.7 mg NuoEFHis isoliert,
das entspricht 1.5 mg pro g Zellen. Durch Verwendung des Plasmids pETBlue-1nuoEFhis und
eine Vorauswahl des Klons über Expressionstests wurde die Produktion von NuoEFHis mehr
als verdreifacht.
81
Ergebnisse
A)
B)
C)
D)
Abbildung 4.11: Präparation von NuoEFHis aus dem Stamm Rosetta(DE3)/pETBlue-1nuoEFhis. Gezeigt ist
das Elutionsprofil der Affinitäts-Chromatographie an Ni2+-IDA A), das der ersten GrößenausschlussChromatographie an Superdex 200 B) das der Ionenaustausch-Chromatographie C) und das der zweiten
Größenausschluss-Chromatographie an Superdex 200. Die Absorbanz bei 280 nm ist in Blau, die Imidazol- bzw.
die NaCl-Konzentration in Grün und die NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität in Rot dargestellt.
1
2
3
4
5
M app. Mr [kDa]
NuoFHis →
← 66.2
← 45.0
← 35.0
← 25.0
NuoE →
← 18.4
← 14.4
Abbildung 4.12: Polyacrylamidgel der Präparation von A. aeolicus NuoEFHis. Spur M zeigt die Banden des
Proteinstandards Unstained Protein Molecular Weight Marker (Thermo Scientific), Spur 1 zeigt die
Proteinzusammensetzung des Cytosols, Spur 2 die des Eluats der Affinitäts-Chromatographie, Spur 3 die der
ersten Größenausschluss-Chromatographie, Spur 4 die der Ionenaustausch-Chromatographie und Spur 5 die des
gereinigten Proteins. Es wurden jeweils 10 µg Protein bzw. 30 µg der cytosolischen Fraktion auf das Gel
aufgetragen. Die Banden von NuoFHis und NuoE wurden zugeordnet.
82
Ergebnisse
4.2.2 Darstellung der E185F-Varianten des A. aeolicus Subkomplexes NuoEF
Die Mutanten pETBlue-1nuoEFhis E185A/D/G/H/N und Q wurden durch ortsgerichtete
Mutagenese mit den jeweiligen Oligonukleotid-Paaren (Tab. 3.4) generiert. Der Vektor
pETBlue-1nuoEFhis diente als Vorlage. Es wurden je 40 – 50 ng Vorlage-DNA für die PCR
verwendet. Die Anlagerungstemperatur betrug zwischen 50 und 60 °C. Die Ansätze wurden
gereinigt, mit DpnI verdaut und erneut gereinigt. Zellen des E. coli Stamms DH5α wurden mit
1 µL der gereinigten PCR-Ansätze transformiert und der gesamte Ansatz auf LB-Agar-Platten
mit Ampicillin ausgestrichen. Es wurden einzelne Klone angezogen, die Plasmide der Klone
isoliert und mittels Restriktion analysiert. Die erhaltenen DNA-Fragmente wurden durch
Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt und fotografisch dokumentiert (Abb. 4.13). Der
Erfolg der ortsgerichteten Mutagenese wurde durch Sequenzierung bestätigt.
Länge [bp]
1
2
19´329→
7743→
3472→
2690→
1882→
1489→
925→
Abbildung 4.13: Restriktionsanalyse des Vektors pETBlue-1nuoEFhis E185H mit VspI und NdeI. Die
Restriktionsanalysen der anderen Mutanten sahen identisch aus und werden daher nicht gezeigt. Spur 1 zeigt das
z
Bandenmuster des λ-DNA/Eco130I(StyI) Markers16 und Spur 2 das erwartete Bandenmuster mit Längen von
2980 und 1742 bp.
Zellen des Stamms Rosetta(DE3) wurden mit den mutierten Plasmiden transformiert und auf
LB-Agar-Platten mit Chloramphenicol und Ampicillin ausgestrichen. Es wurden je zehn
Klone angezogen und für Expressionstests verwendet. Die Ausbeute an positiven Klonen lag
zwischen 30 und 80%. Die Zellen wurden im 10 L-Maßstab in NuoEFaxa-Medium angezogen
(Abb. 4.14).
83
Ergebnisse
A)
B)
Abbildung 4.14: Wachstumskurven der Stämme Rosetta(DE3)/pETBlue-1nuoEFhis E185X. A) zeigt die
Wachstumskurven der Stämme E. coli Rosetta(DE3)/pETBlue-1nuoEFhis E185A (schwarz), E183D (rot), E183N
(grün) und B) die der Stämme Rosetta(DE3)/pETBlue-1nuoEFhis E185G (schwarz), E185H (rot) und E183Q
(grün). Die Pfeile markieren den Zeitpunkt der Induktion mit 0.7–1.0 mM IPTG. Es wurde im 10 L-Maßstab in
NuoEFaxa-Medium angezogen.
Aus den Zellzuchten wurden zwischen 16 und 30 g Zellen erhalten. Das unterschiedliche
Zellwachstum war vermutlich durch die unterschiedliche Expressionsleistung der einzelnen
Klone bedingt. Je dunkler die geernteten Zellen waren, desto geringer war die maximal
erreichte Zelldichte. Die Varianten wurden nach dem für den NuoEFHis-Subkomplex
etablierten Protokoll isoliert. Da die Präparationen sehr ähnlich waren, wird die der Variante
E185AF exemplarisch gezeigt. Für die Präparation wurden 5 g Zellen des Stamms
Rosetta(DE3)/pETblue-1nuoEFhis E185A
aufgeschlossen
und
das
Cytosol
durch
Ultrazentrifugation von Membranen und anderen unlöslichen Bestandteilen befreit. Die
Variante wurde durch Affinitäts-Chromatographie, Größenausschluss-Chromatographie,
Anionenaustausch-Chromatographie und erneuter Größenausschluss-Chromatographie bis zur
elektrophoretischen Homogenität gereinigt (Abb. 4.15). Die Ausbeuten der einzelnen
Präparationen sind in Tabelle 4.6 zusammengefasst.
84
Ergebnisse
A)
B)
C)
D)
Abbildung 4.15: Präparation der Variante E185AF aus dem Stamm Rosetta(DE3)/pETBlue-1nuoEFhis
E185A. A) zeigt das Elutionsprofil der Affinitäts-Chromatographie, B) das der ersten GrößenausschlussChromatographie, C) das der Anionenaustausch-Chromatographie und D) das der zweiten GrößenausschlussChromatographie. Die Absorbanz bei 280 nm ist in Blau, die Imidazol- bzw. die NaCl-Konzentration in Grün
und die NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität in Rot dargestellt.
Tabelle 4.6: Ausbeuten der Präparationen der Varianten E185XF. Für eine bessere Vergleichbarkeit wurden
die NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivitäten der Varianten auf die des ursprünglichen NuoEF His normiert,
wobei diese gleich 100% gesetzt wurde.
Variante
Eingesetzte
Zellen
[g]
Ausbeute
Protein
[mg]
NADH/Ferricyanid
Oxidoreduktaseaktivität
[µmol·min−1·mg−1]
Normierte
Aktivität
[%]
NuoEFHis
5.0
7.7
48.4
100
F
5.0
6.8
26.7
55
F
5.1
9.1
26.0
54
F
5.4
10.3
18.3
38
F
10.0
12.3
22.0
45
F
5.2
10.8
20.7
43
F
5.0
8.2
17.5
36
E185A
E185D
E185G
E185H
E185N
E185Q
85
Ergebnisse
Die Ausbeuten der Präparationen lagen zwischen 1.2 und 2.1 mg Protein pro g Zellen. Im
Gegensatz zu den homologen Varianten des E. coli Komplex I zeigen die NuoEFHis-Varianten
eine deutlich verringerte NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität. Die Reinheit und
Zusammensetzung der Präparationen wurde durch SDS-PAGE nach Laemmli überprüft (Abb.
4.16).
1
2
3
4
NuoFHis →
5
6
M app. Mr [kDa]
← 66.2
← 45.0
← 35.0
← 25.0
← 18.4
NuoE →
← 14.4
Abbildung 4.16: Polyacrylamidgel der Präparationen der NuoEFHis Varianten E185XF. Spur M zeigt die
Banden des Proteinstandards Unstained Protein Molecular Weight Marker (Thermo Scientific), Spur 1 das
Bandenmuster der Präparation der Variante E185AF, Spur 2 das von E185GF, Spur 3 das von E185NF, Spur 4
das von E185DF, Spur 5 das von E185HF und Spur 6 das von E185QF. Es wurden 5 – 10 µg Protein aufgetragen.
Die Banden von NuoFHis und NuoE wurden zugeordnet.
Das Polyacrylamidgel zeigt die korrekte Zusammensetzung der Präparationen ohne
nennenswerte Kontaminationen. In jeder Präparation wurde NuoFHis bei etwa 50 kDa und
NuoE bei etwa 16 kDa detektiert.
4.2.3 Kristallisation der Varianten E185XF
Die Präparationen sollten unter den für den Subkomplex NuoEFHis etablierten
Citratbedingungen
et al., 2008) kristallisiert werden (Tab. 3.20). Für die Variante
E185HF wurde die hanging drop, für die restlichen die sitting drop Methode verwendet. Nach
zwei bis drei Tagen wurden in den Bedingungen 1 bis 5 klare, dunkelbraune Kristalle der
Varianten E185D/H/N und QF beobachtet. Nach etwa neun Tagen wurde kein weiteres
Kristallwachstum beobachtet. Die für die Röntgendiffraktometrie verwendeten Kristalle
waren etwa 300 – 1000 µm groß und wiesen gleichmäßiges Wachstum mit scharfen Kanten
auf (Abb. 4.17).
86
Ergebnisse
A)
B)
C)
D)
Abbildung 4.17: Kristalle der Varianten E185D/H/N und QF, die in den Citratbedingungen erhalten
wurden. A) zeigt einen Kristall der Variante E185DF in 0.1 M Tris/HCl (pH 6.9) und 0.7 M Na3Citrat, B) einen
der Variante E185HF in 0.1 M Tris/HCl (pH 7.0) und 0.9 M Na3Citrat, C) einen der Variante E185QF in 0.1 M
Tris/HCl (pH 7.1) und 0.6 M Na3Citrat und D) einen der Variante E185NF in Tris/HCl (pH 6.9) und 0.8 M
Na3Citrat. Zudem enthielt jede Kristallisationsbedingung 0.2 M NaCl.
Zahlreiche Proteinkristalle wurden auf ihr Beugungsverhalten getestet. Die Kristalle der
Variante E185NF streuten maximal bis zu einer Auflösungsgrenze von 5 Å. Kristalle der
Variante E185QF wiesen Beugung bis zu einer Auflösungsgrenze von etwa 2.5 Å auf.
Allerdings konnte dieser Datensatz aufgrund einer mangelhaften Vollständigkeit der Reflexe
nicht ausgewertet werden. Von Kristallen der Varianten E185D und HF wurden vollständige
auswertbare Datensätze mit Auflösungsgrenzen von 2.4 Å bzw. 2.2 Å aufgenommen.
Von den Präparationen der Variante E185AF konnten mit den Citratbedingungen nur
Sphärolithe erhalten werden. Diese wurden verwendet, um Keimkristalle zu erzeugen. Die
Kristallisationsversuche wurden mit Keimkristallen wiederholt, lieferten aber nur sehr kleine,
nicht scharfkantige Kristalle in 0.1 M Tris/HCl (pH 6.8 – 7.0), 0.2 M NaCl und 0.9 M
Na3Citrat (Daten nicht gezeigt). Die Variante E185GF kristallisierte nicht unter den
Citratbedingungen. Um Kristallisationsbedingungen für die Variante E185AF zu verbessern
und um Initialbedingungen für die Variante E185GF zu finden, wurde der Hampton Index HT
screen
verwendet.
Für
die
Variante
E185GF
wurden
keine
geeigneten
Kristallisationsbedingungen gefunden. In 1.5 M D/L-Äpfelsäure (pH 7.0) und 20% (w/v) PEG
3350 wurden nur Sphärolithe erhalten (Abb. 4.18 A). Für die Variante E185AF wurden in
verschiedenen Puffern und bei verschiedenen pH-Werten mit (NH4)2SO4 als Präzipitant
große, braune und scharfkantige Kristalle erhalten (Abb. 4.18 B). Kristallisationsbedingungen
mit 0.49 M NaH2PO4 und 0.91 M K2HPO4 (pH 6.9) lieferten ebenfalls große, scharfkantige
Kristalle.
Von der Präparation der Variante E185GF wurden fine-screens um die Bedingung, in denen
Sphärolithe
erhalten
wurden,
angesetzt
(Anhang
7.2;
Tab.
7.5).
Für
die
87
Ergebnisse
Kristallisationsversuche wurden Keimkristalle des Subkomplexes NuoEFHis verwendet. Unter
keiner Bedingung konnten streufähige Kristalle erhalten werden.
A)
B)
Abbildung 4.18: Kristallisationsversuche im Hampton Index screen. A) zeigt Sphärolithe der Variante
E185GF in 1.5 M D/L-Äpfelsäure (pH 7.0) und 20% (w/v) PEG 3350. B) zeigt Kristalle der Variante E185AF in
0.1 M Tris/HCl (pH 8.5) mit (NH4)2SO4.
Für die Variante E185AF wurde fine-screens für die (NH4)2SO4- und Phosphat-Bedingungen
angesetzt. Die fine-screens um die Phosphat-Bedingungen (Anhang 7.2; Tab. 7.6) lieferten
mit Keimkristallen zwar scharfkantige Kristalle (Abb. 4.19 A), diese zeigten aber kein
Streuvermögen. Die (NH4)2SO4-Bedingungen (Tab. 4.7) lieferten mit Keimkristallen in einer
1:10´000 Verdünnung streufähige Kristalle in den Bedingungen 1-3 (Abb. 4.19 B und C).
Tabelle 4.7: (NH4)2SO4-Bedingungen zur Kristallisation der Variante E185AF.
1
2
A
0.1 M
MES/NaOH
pH 6.0, 1.5 M
(NH4)2SO4
0.1 M BisTris/HCl
pH 6.5, 1.5 M
(NH4)2SO4
0.1 M
HEPES/HCl
pH 7.0, 1.5 M
(NH4)2SO4
0.1 M
HEPES/HCl
pH 7.5, 1.5 M
(NH4)2SO4
0.1 M Tris/HCl 0.1 M Tris/HCl
pH 8.0,
pH 8.5,
1.5 M
1.5 M
(NH4)2SO4
(NH4)2SO4
B
0.1 M
MES/NaOH
pH 6.0, 1.7 M
(NH4)2SO4
0.1 M Bis-Tris/
HCl pH 6.5,
1.7 M
(NH4)2SO4
0.1 M
HEPES/HCl
pH 7.0, 1.7 M
(NH4)2SO4
0.1 M
HEPES/HCl
pH 7.5, 1.7 M
(NH4)2SO4
0.1 M Tris/HCl 0.1 M Tris/HCl
pH 8.0,
pH 8.5,
1.7 M
1.7 M
(NH4)2SO4
(NH4)2SO4
C
0.1 M
MES/NaOH
pH 6.0, 2.0 M
(NH4)2SO4
0.1 M Bis-Tris/
HCl pH 6.5,
2.0 M
(NH4)2SO4
0.1 M
HEPES/HCl
pH 7.0, 2.0 M
(NH4)2SO4
0.1 M
HEPES/HCl
pH 7.5, 2.0 M
(NH4)2SO4
0.1 M Tris/HCl 0.1 M Tris/HCl
pH 8.0,
pH 8.5,
2.0 M
2.0 M
(NH4)2SO4
(NH4)2SO4
D
0.1 M
MES/NaOH
pH 6.0, 2.1 M
(NH4)2SO4
0.1 M Bis-Tris/
HCl pH 6.5,
2.1 M
(NH4)2SO4
0.1 M
HEPES/HCl
pH 7.0, 2.1 M
(NH4)2SO4
0.1 M
HEPES/HCl
pH 7.5, 2.1 M
(NH4)2SO4
0.1 M Tris/HCl 0.1 M Tris/HCl
pH 8.0,
pH 8.5,
2.1 M
2.1 M
(NH4)2SO4
(NH4)2SO4
88
3
4
5
6
Ergebnisse
Von den Kristallen der Variante E185AF wurde ein Datensatz mit einer Auflösungsgrenze von
1.8 Å am hauseigenen Diffraktometer aufgenommen. Allerdings konnten die Datensätze
aufgrund fehlender Reflexe nicht ausgewertet werden.
A)
B)
C)
Abbildung 4.19: Kristalle der Variante E185AF. A) zeigt Kristalle in 0.3 M NaH2PO4 und 0.7 M K2HPO4, B)
in 0.1 M Bis-Tris/HCl (pH 6.5) und 1.7 M (NH4)2SO4 und C) in 0.1 M HEPES/HCl (pH 7.0) und 1.5 M
(NH4)2SO4.
4.2.4 Strukturen der Varianten E185DF und E185HF
In Zusammenarbeit mit Prof. Oliver Einsle, Institut für Biochemie (Albert-LudwigsUniversität, Freiburg), wurde ein Datensatz von Kristallen der Variante E185HF am
hauseigenen Diffraktometer aufgenommen. Als Kryoprotektant diente eine 25%ige
Saccharose-Lösung in Tris/HCl-Puffer (pH 7.0). Der Kristall wurde am Diffraktometer
langsam im Stickstoffstrom eingefroren und es wurde ein Datensatz mit einer
Auflösungsgrenze von 2.20 Å aufgenommen. Die Struktur wurde von Prof. Einsle über das
molecular replacement Verfahren mit Hilfe der Struktur des Subkomplexes NuoEFHis gelöst.
Die Struktur der Variante E185DF wurde von Sascha Jurkovic im Rahmen seiner
Diplomarbeit gelöst (Jurkovic, 2013). Beide Varianten kristallisierten wie NuoEFHis in der
Raumgruppe P 21 21 21. Die Auflösungsgrenze der Kristalle der Variante E185DF betrug
2.40 Å. Die Quartär- und Tertiärstruktur der Varianten unterscheidet sich nicht von der des
NuoEFHis-Subkomplexes (Abb. 4.20). Die kristallographischen Statistiken der von den
Varianten E185D und HF erhaltenen Datensätze sind in Tabelle 7.7 (Anhang 7.3)
zusammengefasst.
89
Ergebnisse
A)
B)
C)
Abbildung 4.20: Überlagerung der Strukturen der Varianten E185HF und E185DF mit NuoEFHis. A) zeigt
die Struktur von E185HF (blau) bei 2.20 Å und B) die von E185DF (cyan) bei 2.40 Å. Die für die Bindung von
NADH wichtigen Seitenketten sind gezeigt. C) zeigt die Überlagerung der Strukturen von NuoEFHis (rot) mit den
Varianten. Die Wurzel aus der mittleren quadratischen Abweichung (root mean square deviation; r.m.s.d.) der
Cα-Positionen bezogen auf NuoEFHis beträgt für E185HF 0.250 Å (416 Atom-Paare) und für E185DF 0.277 Å
(417 Atom-Paare).
Die Strukturen der Varianten unterscheiden sich kaum voneinander und von der des
NuoEFHis. Obwohl beide Varianten im oxidierten Zustand kristallisiert wurden, weisen sie
Merkmale der Struktur des unveränderten Subkomplexes im reduzierten als auch im
oxidierten Zustand auf. Die Carbonyl-Gruppe des Peptidrückgrats von Glu95F ist in beiden
Strukturen, wie in der Struktur des NuoEFHis im reduzierten Zustand orientiert und zeigt vom
FMN weg, um mehr Platz für die Anbindung des NADH zu schaffen. Der B-Faktor des
Peptid-Sauerstoffs von Glu95F beträgt für die Variante E185DF 40.3 Å2 (durchschnittlicher
90
Ergebnisse
B-Faktor: 52.3 Å2) und für die Variante E185HF 30.5 Å2 (durchschnittlicher B-Faktor:
28.9 Å2). Somit kann die Orientierung der Carbonyl-Gruppe zwar genau angegeben werden,
aber die hohen B-Faktoren deuten auf eine Flexibilität dieser Position hin. In beiden
Varianten bildet die Seitenkette des Glu97F keine H-Brücke mit der Seitenkette des Tyr180F
aus (Abb. 4.21 A und B). Dies stimmt mit der Struktur des NuoEFHis im oxidierten Zustand
überein. Das Peptidrückgrat von Asp185F und His185F ist genau wie im NuoEFHis im
oxidierten und reduzierten Zustand über zwei H-Brücken, eine vom Peptid-Stickstoff zum
FMN und eine von der Carbonyl-Gruppe zum Peptid-Stickstoff des Ile189F, fest verankert
(Abb. 4.21 C und D).
A)
B)
E95
E97
Y180
E97
D94
Y180
D185
E95
D94
H185
D)
C)
N3
N3
E184
D185
I392
E184
H185
I392
I189
I189
K202
R200
K202
Abbildung 4.21: Strukturmerkmale der NuoEFHis-Varianten E185DF und E185HF. H-Brücken sind mit
gestrichelten Linien dargestellt. A) zeigt das aktive Zentrum der Variante E185DF und B) das der Variante
E185HF. Gezeigt ist die Orientierung des Peptidrückgrats von Glu95F in beiden Strukturen. Das strukturell
konservierte H2O-Molekül (dunkelblau) ist in A) und B) wie in NuoEFHis im reduzierten Zustand koordiniert. C)
zeigt die Orientierung der Seitenkette des Lys202F und Wechselwirkungen mit anderen Resten in der Variante
E185DF und D) in der Variante E185HF. Die mit der Carbonyl-Gruppe von Asp185F bzw. His185F und dem
Peptid-Stickstoff von Ile189F gebildeten H-Brücken sind angedeutet.
91
Ergebnisse
Die Seitenkette des Lys202F in den Varianten E185DF und E185HF ist wie in dem reduzierten
NuoEFHis verdreht (Abb. 4.21 C und D). In dem oxidierten NuoEFHis bilden die Seitenketten
des Glu185F und des Lys202F eine H-Brücke aus (vgl. Abb. 2.12). Die um eine MethylenEinheit verkürzte Seitenkette des Asp185F kann keine H-Brücke mehr mit dem Lys202F
ausbilden, daher verdreht sich dessen Seitenkette und bildet eine H-Brücke mit der CarbonylGruppe des Ile392F aus (Abb. 4.21 C). Allerdings beträgt der Mittelwert der B-Faktoren der
einzelnen Seitenketten-Atome des Lys202F 45.7 Å2, was auf eine flexible Position hindeutet.
Dennoch ist in der Elektronendichtekarte bei einer Konturstufe von 1 σ die Seitenkette von
Lys202F teilweise und bei 2 σ vollständig definiert (Abb. 4.22 A). In der Variante E185HF
stoßen sich die positiven Ladungen des His185F und Lys202F ab und bewirken dadurch das
Verdrehen der Seitenkette des Lys202F (Abb. 4.21 D). Hier beträgt der Mittelwert der BFaktoren der einzelnen Seitenketten-Atome 33.4 Å2, was eine genauere Definition der Lage
der Seitenkette erlaubt, die aber auch hier nicht vollständig fixiert ist. Abbildung 4.22 B zeigt
die Elektronendichtekarte an dieser Position.
A)
B)
R200
I392
I392
E184
E184
K202
K202
Abbildung 4.22: Ausschnitte der Elektronendichtekarten am Lys202 F. A) zeigt die 2 Fo−Fc Elektronendichte
an den Seitenkette Lys202F, Glu184F und Ile392F der Variante E185DF bei einer Konturstufe von 1 σ (blau) und
2 σ (grün). B) zeigt die 2 Fo−Fc Elektronendichte an den gleichen Seitenketten und zusätzlich am Rückgrat von
Arg200F bei einer Konturstufe von 1 σ (blau) und 2 σ (grün) der Variante E185HF.
Durch die eingeführten Mutationen vergrößert sich die NADH-Bindetasche in dem Teil in
dem die Adenosin-Ribose gebunden wird. Dies erklärt die erhöhte Affinität der E. coli
Komplex I-Varianten zu NADPH. Das redox-induzierte Umklappen des Rückgrats von
Glu95F wird als „Auswurf-Mechanismus‟ für das verbrauchte Substrat diskutiert. Die
Orientierung der Carbonyl-Gruppe des Glu95F von der Bindetasche weg könnte in beiden
Varianten auf eine nicht effiziente Freisetzung des NAD+ hindeuten, was wiederum im
92
Ergebnisse
Kontrast zu den erhöhten Aktivitäten der E. coli Komplex I-Varianten steht. Zwar zeigen die
B-Faktoren dieser Positionen, dass deren Konformation nicht rigide ist, aber die gut
aufgelöste Elektronendichte an dieser Position verdeutlicht, dass die Varianten bevorzugt die
Konformation des reduzierten NuoEFHis einnehmen. Die Strukturen der NuoEFHis-Varianten
liefern keine Erklärung für die erhöhte Aktivität und ROS-Produktion der E. coli Komplex IVarianten. Da sonst keine konformativen Änderungen im Vergleich zu NuoEFHis beobachtet
wurden, liegt die Erklärung vermutlich in der Substrat-Anbindung.
4.2.5 Struktur der Variante E185DF mit gebundenem NAD+
Um die Anbindung des Nukleotids strukturell zu charakterisieren, wurden die NuoEFHisVarianten
E185XF
mit
NAD+
kokristallisiert.
Die
NAD+-Konzentration
im
Kristallisationstropfen betrug 10 mM. Die Varianten E185A/D/H und QF wurden mit NAD+
unter den gleichen Bedingungen kristallisiert wie ohne Nukleotid. Zur Kokristallisation der
Variante E185NF mit NAD+ mussten die Standard-Citratbedingungen um die Bedingungen
B2-4 und C2-4 (Tab. 3.20) verfeinert werden, da ansonsten nur Sphärolithe und verformte
Kristalle ohne scharfe Kanten erhalten wurden. Es konnte nur von der Variante E185DF ein
Datensatz aufgenommen werden, in dem die Elektronendichte des Nukleotids aufgelöst war.
Die Struktur wurde von Sascha Jurkovic im Rahmen seiner Diplomarbeit gelöst (Jurkovic,
2013). Die Struktur der Variante ohne Nukleotid wurde für das molecular replacement
verwendet. Die Auflösungsgrenze des Kristalls betrug 1.8 Å. Die Variante mit gebundenem
NAD+ kristallisierte wie NuoEFHis in der Raumgruppe P 21 21 21. Die Statistiken des
Datensatzes sind in der Tabelle 7.8 (Anhang 7.3) zusammengefasst. Aufgrund der geringen
Affinität des Enzyms zu NAD+ sind die Bindestellen im Kristall nicht vollständig besetzt,
wodurch elektronenarme Bereiche durch das allgemeine Signalrauschen überlagert wurden.
Um die volle Elektronendichte des NAD+ zu erhalten, wurde mit dem Programm Coot
(Emsley et al., 2010) die Elektronendichte des Proteins maskiert, so dass die Intensität der
Elektronendichte des NAD+ herausgearbeitet wurde und das komplette Molekül dargestellt
werden konnte (Abb. 4.23).
93
Ergebnisse
Abbildung 4.23: Elektronendichte des NAD+ in der Variante E185DF. Die herausgearbeitete 2 Fo−Fc
Elektronendichte des NAD+ ist bei einer Konturstufe von 2 σ gezeig .
Am O2' der Adenosin-Ribose wurde in der Elektronendichtekarte eine für eine HydroxylGruppe zu ausgedehnte Elektronendichte beobachtet. Diese wurde der Sulfon-Gruppe eines
MOPS-Moleküls zugeordnet, das als Puffer für die Präparation verwendet wurde (Abb. 4.24).
Die Sulfon-Gruppe bindet an dieselbe Position, an welche die Phosphat-Gruppe des NADPH
binden würde. Dies deutet darauf hin, dass diese Position für die Anbindung von negativgeladenen Molekülen oder Resten geeignet ist.
Abbildung 4.24: Ausschnitt aus der Elektronendichtekarte am O2' des gebundenen NAD + in der Variante
E185DF. Die für die Hydroxyl-Gruppe zu große 2 Fo−Fc Elektronendichte (Konturstufe 1.5 σ) am O2' der
Adenosin-Ribose und das zugeordnete MOPS-Molekül (grün) sind gezeigt.
Die Variante E185DF mit gebundenem NAD+ zeigt im Vergleich zu NuoEFHis ebenfalls keine
Unterschiede in der Quartär- und Tertiärstruktur. Wie die Variante ohne Nukleotid weist die
Nukleotid-gebundene Form dieselben Merkmale der Strukturen des reduzierten und
94
Ergebnisse
oxidierten NuoEFHis auf. Beim Vergleich der drei Strukturen mit gebundenen Nukleotiden
fallen interessante Unterschiede und Gemeinsamkeiten auf (Abb. 4.25). In der Variante
E185DF wird der Adenin-Rest des NAD+ wie in den Strukturen des NuoEFHis über
π-Wechselwirkungen mit den Seitenketten von Phe71F und Tyr204F stabilisiert (Abb. 4.25 A).
Die Seitenkette des Phe79F trägt nicht zu der Stabilisierung bei.
A)
D185
S96
B)
G68
F71
K76
E95
F79
E97
Y204
E185
Y180
E184
K202
C)
Abbildung 4.25: Struktur der Variante E185DF mit gebundenem NAD+ A) und des oxidierten NuoEFHis
mit gebundenem NAD+ B). C) zeigt die Struktur des reduzierten NuoEFHis mit gebundenem NADH. Die zur
Stabilisierung der gebundenen Nukleotide beitragenden H-Brücken sind durch gestrichelte Linien gezeigt. Die
Längen der H-Brücken sind in Ångström angegeben. Beteiligte H2O-Moleküle sind blau markiert. Das FMN ist
gelb dargestellt.
95
Ergebnisse
Da die Carbonyl-Gruppe der Peptidbindung von Glu95F in der Variante E185DF aus der
Bindetasche herausgeklappt ist, liegt das NAD+ tiefer in der Bindetasche als in NuoEFHis.
Seine Bindung in der Variante ähnelt daher eher der Bindung des NADH (Abb. 4.26 A). Wie
das NADH im reduzierten NuoEFHis, bildet das NAD+ mit der Amid-Gruppe des
Nikotinamidrings je eine H-Brücke zu den Amid-Stickstoffen des Glu97F und Ser96F aus.
Zudem bilden die Hydroxyl-Gruppen der Nikotinamid-Ribose keine H-Brücken zur
Carbonyl-Gruppe des Gly68F in der glycinreichen-Schleife (Abb. 4.25). In allen drei
Strukturen bildet das Pyrophosphat des Nukleotids zwei H-Brücken mit den HydroxylGruppen des FMNs aus. Durch die kurze Seitenkette des Asp185F ist die Adenosin-Ribose
des NAD+ gezwungen sich zu verkippen, um mit seinem O3' eine H-Brücke zum Asp185F
auszubilden (Abb. 4.25 A). Dadurch verdreht sich das C5' der Adenosin-Ribose um ca. 160°
(Abb. 4.26 B). Die zweite H-Brücke zur Adenosin-Ribose geht verloren, wodurch die
Anbindung des NAD+ geschwächt wird. In dieser Konformation der Adenosin-Ribose
vergrößert sich der Abstand zur Seitenkette des Lys76F, wodurch die H-Brücke um 0.5 Å
länger ist, was eine schwächere Wechselwirkung impliziert (Abb. 4.25 A).
A)
B)
E95
C5'
Abbildung 4.26: Überlagerung der Strukturen der Variante E185DF (grün) mit gebundenem NAD+ (blau)
und von NuoEFHis (hellblau) mit gebundenem NADH (magenta). A) zeigt die überlagerten Peptidrückgrate
und die Konformation der Carbonyl-Gruppe der Peptidbindung von Glu95F in beiden Strukturen. Bis auf die
verkippte Adenosin-Ribose des NAD+ unterscheidet sich die Anbindung der Nukleotide kaum. B) zeigt das um
etwa 160° verdrehte C5' (rot) der Adenosin-Ribose.
Da die Carbonyl-Gruppe der Peptidbindung von Glu95F der Variante E185DF dieselbe
Konformation wie im reduzierten NuoEFHis einnimmt, scheint der postulierte „AuswurfMechanismus“ für NAD+ in dieser Variante nicht funktional zu sein. Jedoch führt die
96
Ergebnisse
fehlende H-Brücke zum O2' der Adenosin-Ribose und die schwache H-Brücke zu Lys76F zu
einer deutlich schwächeren Anbindung des NAD+, so dass dieses leichter aus der Bindetasche
dissoziieren kann. Da die B-Faktoren des Carbonyl-Sauerstoffs zeigen, dass diese Position
nicht rigide ist, könnte der eingeschränkte „Auswurf-Mechanismus“ und die schwächere
Wechselwirkung der Adenosin-Ribose mit dem Enzym die erhöhte Aktivität der homologen
E. coli Komplex I-Variante mit NADH erklären.
Das durch die Mutation Glu185AspF induzierte Verkippen der Adenosin-Ribose des NAD+
schafft mehr Raum in der Substratbindestelle. Dies zeigen die Querschnitte der
Oberflächendarstellung von E185DF mit gebundenem NAD+ und von NuoEFHis mit
gebundenem NAD+ bzw. NADH. Durch die veränderte Konformation der Adenosin-Ribose
wird der Boden und zum Teil auch das Innere der Bindestelle nicht mehr vollständig
ausgefüllt (Abb. 4.27).
A)
B)
C)
Abbildung 4.27: Querschnitt durch die Oberflächendarstellung der Substrat-Bindestelle. Der Schnitt am
Halbacetal-O4' der Adenosin-Ribose ist dargestellt. Gezeigt sind die Strukturen von NuoEFHis mit gebundenem
NAD+ im oxidierten A) und gebundenem NADH im reduzierten B) Zustand. C) zeigt die Variante E185DF mit
gebundenem NAD+. Die Oberfläche des Asp185F in der Variante bzw. die des Glu185F in NuoEFHis ist rot
markiert. Das FMN ist in Gelb dargestellt.
In die nicht mehr vollständig abgeschirmte NADH-Bindestelle der Variante könnte Sauerstoff
eindiffundieren und vom reduzierten FMN reduziert werden. Dies würde die deutlich erhöhte
ROS-Produktion der homologen E. coli Komplex I-Variante bei der Oxidation von NADH
erklären.
97
Ergebnisse
4.3 Die Position Tyr178F im E. coli Komplex I
Mutationen im mitochondrialen Komplex I und die damit einhergehende erniedrigte Aktivität
und erhöhte ROS-Produktion führen zu zahlreichen neurodegenerativen Erkrankungen
(Pagniez-Mammeri et al., 2012). Der Großteil der von Komplex I produzierten ROS entstehen
am reduzierten FMN (Kussmaul und Hirst, 2006; Hirst et al., 2008). Strukturelle Analysen
des A. aeolicus NuoEFHis-Subkomplexes zeigen, dass Glu97F (in E. coli Glu95F) bei der
Bindung von NADH eine H-Brücke mit Tyr180F (in E. coli Tyr178F) bildet. Diese H-Brücke
ist wichtig für die korrekte Bindung des NADH und gewährleistet den Hydridtransfer auf das
FMN. Die Mutation des Glu95F zu Gln im E. coli Komplex I führte zur einer um etwa zwei
Drittel verringerten NADH:Decyl-Ubichinon Oxidoreduktaseaktivität in der isolierten
Variante (Euro et al., 2009). Zwar ist Gln immer noch in der Lage, eine H-Brücke mit der
Seitenkette des Tyr178F auszubilden, jedoch ist diese aufgrund der geringeren Ladungsdichte
im Vergleich zu Glu deutlich geschwächt. Glu95F und Tyr178F sind in Pro- und Eukaryoten
konserviert, was ein weiteres Indiz für die funktionelle Bedeutung beider Reste ist (Abb.
4.28).
E. coli
T. thermophilus
A. aeolicus
P. denitrificans
N. crassa
Y. lipolytica
B. taurus
H. sapiens
90
100
180
190
YLLCN ADEMEPGTYK D--------VHTGAGRYIC GEETALINSL
YLICN ADESEPGSFK D--------VHRGAGAYIC GEETALMNSL
YFICN ADESEPGTFK D--------VARGAGAYIC GEETALIESL
YLVIN ADESEPATCK D--------LHHGAGAYIC GEETALLESL
YLVVN ADEGEPGTCK D--------LHRGAGAYVC GEETSLIESL
YLVVN ADEGEPGTCK D--------IHRGMGAYVC GEETSLIESL
YLVVN ADEGEPGTCK D--------VVRGAGAYIC GEETALIESI
YLVVN ADEGEPGTCK D--------VVRGAGAYIC GEETALIESI
*:: * *** **:: * *
: * * *:* ****:*::*:
Abbildung 4.28: Ausschnitt eines Sequenzvergleichs der Homologen von NuoF um die Positionen Glu95F
und Tyr178F. Die Nummerierung nach der E. coli-Sequenz ist angegeben. Glu95F und Tyr178F sind gelb
hervorgehoben.
Die Doppelmutation Tyr178CysF/Cys180GlyF im menschlichen Genom führte bei einem
Patienten zum Leigh-like Syndrom (Pagniez-Mammeri et al., 2012). Da beide Mutationen
nahe der FMN-Bindestelle des Komplex I lokalisiert sind, haben die Autoren angenommen,
dass durch die Mutationen die Anbindung des FMNs gestört wird, konnten dies aber anhand
ihrer Untersuchungen experimentell nicht beweisen (Bénit et al., 2001). Es wird zudem
vermutet, dass Tyr178F, unter Ausbildung eines Tyrosyl-Radikals an der Verringerung der
ROS-Produktion beteiligt ist (Prof. Friedrich, persönliche Mitteilung). Die Auswirkungen der
Mutation von Tyr178F zu Ala, Leu, Phe und Cys auf die Aktivität und die ROS-Produktion
98
Ergebnisse
des E. coli Komplex I sollten in dieser Arbeit untersucht werden. Emmanuel Gnandt wurde
im Rahmen seiner Diplomarbeit zu den Arbeiten in diesem Kapitel angeleitet (Gnandt, 2012).
4.3.1 Darstellung der Komplex I-Varianten Y178A/C/F und LF
Die Mutationen Tyr178Ala/Cys/Phe und LeuF wurden mit Hilfe der λ-Red vermittelten
Rekombination in das Expressionsplasmid pBADnuo nuoFhis eingebracht. Die ortsgerichtete
Mutagenese wurde mit den Oligonukleotid-Paaren nuoF Y178A/C/F/L_fwd und rev (Tab.
3.4) in den Subklon pUC25nuoE´–G eingebracht. Die vier mutierten linearen DNAFragmente wurden mit dem Oligonukleotid-Paar nuoF_fwd und rev mittels PCR amplifiziert
(Tab. 3.6). Für die λ-Red vermittelte Rekombination wurden 50 ng pBADnuo nuoFhis::nptIsacB und 150 – 350 ng der linearen DNA-Fragmente verwendet. Der Erfolg der
Rekombination wurde durch Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzierung bestätigt.
Für die Überproduktion der Komplex I-Varianten wurde der E. coli Stamm BW25113Δnuo
verwendet. Die Mutanten und der Ausgangsstamm wurden im 10 L-Maßstab in
Autoinduktionsmedium angezogen. Die Zellausbeute lag zwischen 6 und 11 g pro L Medium.
Die Varianten und der ursprüngliche Komplex I wurden wie oben beschrieben isoliert, wobei
die Ausbeute zwischen 0.17 und 0.27 mg Protein pro g Zellen lag.
4.3.2 Charakterisierung der Komplex I-Varianten Y178A/C/F und LF
Um den Einfluss der eingeführten Mutation auf die Aktivität zu untersuchen, wurden die
Präparationen der Varianten und des Komplex I in polare Lipide rekonstituiert und die
NADH:Decyl-Ubichinon Oxidoreduktaseaktivitäten in Abhängigkeit von der Substratkonzentration bestimmt. Die Aktivitäten wurden für 5 – 150 µM NADH bestimmt, wobei eine
Decyl-Ubichinon-Konzentration von 60 µM verwendet wurde. Durch die Auftragung der
gemessenen Aktivitäten nach Hanes und linearer Regression wurde über die Steigung der
berechneten Ausgleichsgeraden und deren Ordinatenabschnitt die Michaelis-Konstante Km
und die maximale Umsatzgeschwindigkeit vmax bestimmt (Hanes, 1932). Aus vmax wurde die
Wechselzahl kcat berechnet und hieraus wiederum die katalytische Effizienz (kcat/Km). In
Tabelle 4.8 sind die kinetischen Parameter des Komplex I und der Varianten aufgeführt.
99
Ergebnisse
Tabelle 4.8: Kinetische Parameter des unveränderten Komplex I und der Varianten Y178A/C/F und LF.
Km
Variante
Komplex I
vmax
−1
kcat
−1
−1
kcat/Km
[µM]
[µmol·min ·mg ]
[s ]
[s−1·µM−1]
8.5 ± 0.5
3.1 ± 0.1
28 ± 1
3.3 ± 0.3
F
10 ± 1
1.1 ± 0.1
10 ± 1
1.0 ± 0.1
F
12 ± 1
1.1 ± 0.1
10 ± 1
0.8 ± 0.08
F
Y178F
23 ± 2
2.3 ± 0.1
21 ± 1
0.9 ± 0.1
Y178LF
12 ± 2
0.8 ± 0.1
7±1
0.6 ± 0.1
Y178A
Y178C
Die Varianten Y178A/C und LF zeigen im Vergleich zu Komplex I eine leicht verringerte
Affinität zu NADH, wobei die Km-Werte im Bereich der Fehler nahe beieinander liegen. Den
größten Effekt auf die Substrat-Affinität zeigte die Variante Y178FF mit einem knapp dreifach
erhöhten Km. Alle Varianten zeigen eine deutlich verringerte Umsatzgeschwindigkeit. Die der
Variante Y178FF ist um etwa ein Viertel verlangsamt. Für die Varianten Y178AF und Y178CF
beträgt vmax nur noch etwa ein Drittel des Komplex I. Die katalytische Effizienz der Varianten
ist jeweils stark erniedrigt und beträgt 18 – 30% der des Komplex I.
Die Auswirkung der einzelnen Mutationen auf die bei der Reaktion gebildeten ROS wurde
mit dem Amplex Red Assay bestimmt. Der Ansatz enthielt 5 µg in polare Lipide
rekonstituiertes Protein, 60 µM Decyl-Ubichinon, 2 U/mL HRP und 10 µM Amplex Red. Die
Reaktion wurde durch Zugabe von 30 µM NADH gestartet. Die Abnahme der NADHKonzentration und die Zunahme der Resorufin-Konzentration wurden gemessen und aus den
Steigungen die entstehende Menge H2O2 pro umgesetztem NADH berechnet (Tab. 4.9).
Tabelle 4.9: H2O2-Produktion pro umgesetztem NADH und FMN-Gehalt des Komplex I und der
Varianten Y178A/C/F und LF. Die H2O2-Produktion wurde mit dem Amplex Red Assay und der FMN-Gehalt
wurde spektroskopisch bestimmt.
Präparation
Komplex I
FMN-Gehalt
− NADH
+ NADH
[%]
0
1.1 ± 0.2
87 ± 3
F
0
8.1 ± 0.9
91 ± 5
F
0
5.4 ± 0.6
89 ± 1
F
0
13.0 ± 1.0
83 ± 4
F
0
6.5 ± 0.5
91 ± 5
Y178A
Y178C
Y178F
Y178L
100
H2O2-Produktion pro umgesetztem NADH [%]
Ergebnisse
Für alle Varianten war die H2O2-Produktion im Vergleich zum Komplex I deutlich erhöht.
Die Varianten Y178A/C und LF produzierten die fünf- bis achtfache Menge an H2O2 pro
umgesetztem NADH im Vergleich zum Komplex I. Für die Variante Y178FF war die ROSProduktion sogar fast 13-fach erhöht.
Der FMN-Gehalt der Präparationen wurde über Differenzspektroskopie bestimmt. Hierfür
wurden 0.5 mg des Komplex I oder der Varianten mit Dithionit reduziert und der zeitliche
Verlauf der Reoxidation durch Luftsauerstoff bei 450 nm (FMN) und 320 nm (Dithionit)
verfolgt. Anhand des Differenzspektrums des vollständig reduzierten und reoxidierten
Komplexes wurde mit Hilfe des Lambert-Beerschen Gesetzes die FMN-Konzentration
bestimmt.
Der
Differenz-Extinktionskoeffizient
(ε
x−re
)
für
freies
FMN
(Δε450 =
9 mM−1·cm−1; Ghisla, 1980) wurde um den Beitrag der bei 450 nm absorbierenden Fe/SZentren (ε450 = 6 mM−1·cm−1; Scheide, 2000) erweitert. Somit wurde ε450 = 15 mM−1·cm−1
verwendet, um den prozentualen FMN-Gehalt des Komplex I und der Varianten zu
bestimmen (Tab. 4.9).
Keine Präparation enthält eine quantitative FMN-Besetzung. Da der FMN-Gehalt aller
Präparationen im Rahmen der Fehlergrenzen mit dem des Komplex I identisch ist, kann der
Vorschlag, dass die Mutation Tyr178CysF zu einem Verlust des FMNs führt, ausgeschlossen
werden.
4.4 Die Beteiligung von Trp221G am Elektronentransfer
Aromatische Aminosäuren wie Tryptophan und Tyrosin dienen Enzymen als Trittsteine für
den Elektronentransfer (Gray und Winkler, 2003). Quantenmechanische Berechnungen haben
die Beteiligung konservierter, aromatischer Aminosäuren am Elektronentransfer in Komplex I
vorgeschlagen (Wittekindt et al., 2009). In vorangegangen Arbeiten unseres Arbeitskreises
wurde gezeigt, dass die Mutationen Phe515LeuCD bzw. Trp221LeuG einen deutlichen Effekt
auf die d-NADH Oxidaseaktivität der E. coli Cytoplasmamembranen der Mutanten hatten.
Die Aktivität war um mehr als ein Drittel reduziert (Dörner, 2010). Um auszuschließen, dass
die verringerten Aktivitäten strukturell bedingt sind, sollten in dieser Arbeit Doppelmutanten
dargestellt werden, die möglicherweise die ursprüngliche Aktivität aufweisen. Da die Mutante
101
Ergebnisse
Trp221LeuG die niedrigste Aktivität aufwies, wurde sie als Grundlage für die Konstruktion
weiterer Doppelmutanten ausgewählt. Es wurden aliphatische Aminosäuren, die sich in einem
ähnlichen Abstand zu N5 und N6a wie Leu221G befinden, identifiziert und gegen Tryptophan
ausgetauscht (Abb. 4.29).
N5
4
R245
G
(R219 )
3
T121
G
(V107 )
4
W247
G
(W221 )
4
L317
CD
(T504 )
4
9
N6a
T332
CD
(S519 )
L58
I
(L65 )
Abbildung 4.29: Positionen der ausgewählten aliphatischen Aminosäuren im T. thermophilus Komplex I
(PDB-Eintrag: 3IAM; Berrisford und Sazanov, 2009). Die T. thermophilus und die E. coli Nomenklatur (in
Klammern) der Aminosäuren ist angegeben. Die Fe/S-Zentren sind als Kalotten-Modelle mit Eisen in Rot und
Schwefel in Gelb dargestellt. Die Abstände zwischen den Fe/S-Zentren und den Cβ-Atome der Seitenketten sind
in Ångström angegeben.
Die quantenmechanischen Berechnungen der Gruppe von Prof. Koslowski zeigen, dass
basische Aminosäuren in direkter Nachbarschaft zum Aromaten die Energie unbesetzter
Orbitale senken, so dass diese leichter mit Elektronen besetzt werden können (Wittekindt et
al., 2009). Um den Einfluss des zum Trp221G benachbarten Arg219G auf die Aktivität zu
untersuchen, sollte dieser Rest ebenfalls gegen Leucin ausgetauscht werden. Zudem sollte
eine Mutante dargestellt werden, in der Arg219G und Trp221G gegeneinander ersetzt sind,
sowie eine in der Arg219G gegen Trp und Trp221G gegen Leu ausgetauscht ist. Doris Deković
und Manuel Schäuble wurden im Rahmen ihrer Diplomarbeiten zu den Arbeiten zu Teilen
dieses Kapitels angeleitet (Dek vić, 2012; Schäuble, 2013).
102
Ergebnisse
4.4.1 Darstellung der Doppelmutanten
Das Expressionsplasmid pBADnuo nuoFhis nuoG W221L und der Subklon pUC25nuoE´–G
W221L lagen bereits zu Beginn der Arbeit vor (Dörner, 2010). Für die Mutagenese von
nuoCD und nuoI dienten die Vektoren pCA24NnuoCD und pCA24NnuoI als Subklone. Die
Mutanten pCA24NnuoCD T504W, pCA24NnuoCD S519W und pCA24NnuoI L65W wurden
mit den entsprechenden Oligonukleotid-Paaren (Tab. 3.4) durch ortsgerichtete Mutagenese
dargestellt. Der Erfolg der ortsgerichteten Mutagenese wurde durch Restriktionsanalyse der
aus einzelnen Kolonien isolierten Plasmide und DNA-Sequenzierung bestätigt. Die für die λRed vermittelte Rekombination notwendigen linearen DNA-Fragmente lin_nuoCD T504W,
lin_nuoCD S519W
und
lin_nuoI L65W
wurden
mit
den
Oligonukleotid-Paaren
nuoCD_fwd/rev bzw. nuoI_fwd/rev (Tab. 3.6) mittels PCR amplifiziert.
Um die Mutationen in das Expressionsplasmid pBADnuo nuoFhis nuoG W221L einzufügen,
musste zunächst die nptI-sacB-Selektionskassette in nuoCD und nuoI mit Hilfe der λ-Red
vermittelten Rekombination eingebracht werden. Hierfür wurden die Selektions-Kassetten mit
den Oligonukleotiden nuoD::nptI-sacB_fwd/rev und nuoI2::nptI-sacB_fwd und nuoI::nptIsacB_rev (Tab. 3.5), die jeweils homologe Bereiche zu den Zielgenen enthielten, amplifiziert.
Elektrokompe en e Ze en e S amm DH5αΔnuo/pKD46 wurden hergestellt und jeweils mit
50 ng pBADnuo nuoFhis nuoG W221L und 200 ng nuoI::nptI-sacB bzw. 150 ng nuoCD::nptIsacB kotransformiert. Positive Klone wurden auf LB-Agar-Platten mit Kanamycin selektiert.
Einzelne Klone wurden angezogen und die Plasmide der Kulturen isoliert. Der Erfolg der
Rekombination wurde durch Restriktionsanalyse überprüft.
Zur
Darstellung
der
Mutanten
pBADnuo nuoFhis nuoCD T504W nuoG W221L
pBADnuo nuoFhis nuoCD S519W nuoG W221L
und
und
pBADnuo nuoFhis nuoG W221L
nuoI L65W wurden die Selektions-Kassetten gegen die linearen DNA-Fragmente
ausgetauscht. Für die λ-Red vermittelte Rekombination wurden 50 ng der Vektoren mit
Selektions-Kassette und jeweils 150 – 200 ng der linearen DNA-Fragmente verwendet.
Positive Klone wurden auf YP/SUC-Agar-Platten mit Chloramphenicol selektiert. Der Erfolg
der Rekombination wurde durch Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzierung überprüft.
Für eine effiziente Rekombination ist es wichtig, dass der Bereich in den die Mutation
eingefügt werden soll, durch die nptI-sacB-Kassette ersetzt ist. NuoG ist die größte
Untereinheit des Komplex I. Um die Rekombinations-Effizienz für nuoG zu erhöhen, wurden
für die Insertion der nptI-sacB-Kassette homologe Bereiche am Anfang und am Ende des
Gens ausgewählt. Die Selektionskassette nuoGc::nptI-sacB (c, complete) wurde mit den
103
Ergebnisse
Oligonukleotiden nuoGbeg::nptI-sacB_fwd sowie nuoGend::nptI-sacB_rev von dem Vektor
pVO1100 mi e
PCR amp ifizier un mi Hi fe er λ-Red vermittelten Rekombination in
pBADnuo nuoFhis eingebracht. Hierfür wurden 50 ng pBADnuo nuoFhis und 400 ng
nuoGc::nptI-sacB verwendet. Positive Klone wurden auf LB-Agar-Platten mit Kanamycin
selektiert. Einzelne Kolonien wurden angezogen und die Plasmide aus den Kulturen isoliert.
Der Erfolg der Rekombination wurde durch Restriktionsanalyse überprüft.
Der Subklon pUC25nuoE´–G diente als Vorlage-DNA für die ortsgerichtete Mutagenese an
den Positionen Arg219G und Trp221G. Die Mutationen Arg219LeuG, Arg219Trp/Trp221ArgG
und Arg219Trp/Trp221LeuG wurden mit den entsprechenden Oligonukleotid-Paaren
(Tab. 3.4) eingefügt. Bei der Darstellung von pUC25nuoE´–G V107W/W221L mit dem
Oligonukleotid-Paar nuoG V107W_fwd/rev diente der Subklon pUC25nuoE´–G W221L als
Vorlage-DNA. Die linearen DNA-Fragmente wurden mit dem Oligonukleotid-Paar
nuoGbeg_fwd/nuoGrec_rev Tab. 3.6) amp ifizier un
mi Hi fe
er λ-Red vermittelten
Rekombination in den Expressionsvektor eingebracht.
4.4.2 Komplex I-vermittelte Aktivitäten der Cytoplasmamembranen
Zur Überproduktion der Komplex I-Varianten wurden Zellen des E. coli Stamms
BW25113Δnuo mit 10 ng der dargestellten Doppel- und Einzel-Mutanten sowie dem
unveränderten Plasmid pBADnuo nuoFhis transformiert und auf LB-Agar-Platten mit
Chloramphenicol ausgestrichen. Vor der Zellzucht wurden die Plasmide aus den
Expressionsstämmen isoliert und zur Kontrolle erneut mittels Restriktion analysiert. Die
Mutanten wurden im 400 mL-Maßstab in Autoinduktionsmedium unter Schütteln bei 37 °C
kultiviert. Die maximalen OD600-Werte lagen zwischen 4.5 und 7.0, was einer Zellausbeute
von ca. 4 – 7 g pro L Medium entsprach. Die Cytoplasmamembranen der Mutanten und des
Ausgangsstamms wurden isoliert. Der Expressionsstamm BW25113Δnuo besitzt keinen
genomisch kodierten Komplex I aber die alternative NDH-II. Um sicher zu gehen, dass nur
die Komplex I-vermittelten Aktivitäten gemessen werden, wurde das NADH-Derivat
d-NADH als Substrat für die Aktivitätsmessungen verwendet. Der Proteingehalt der
Membranen wurde mit der Biuret-Methode bestimmt. Tabelle 4.10 gibt die gemessenen
d-NADH Oxidase- und d-NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivitäten wieder. Um die
Menge an überproduziertem Komplex I in der Membran zu berücksichtigen, wurden die
Oxidaseaktivitäten auf die d-NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivitäten bezogen.
104
Ergebnisse
Tabelle 4.10: Die d-NADH Oxidase- und d-NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivitäten der
dargestellten Mutanten und des ursprünglichen Stamms.
BW25113Δnuo/
pBADnuo nuoFhis
d-NADHOxidaseaktivität
d-NADH/Ferricyanid
Oxidoreduktaseaktivität
Normierte
d-NADHOxidaseaktivität
[µmol min−1 mg−1]
Verbleibende
Aktivität
[%]
unverändert
0.25 ± 0.02
1.6 ± 0.2
0.25 ± 0.02
100
nuoG W221L
0.09 ± 0.02
1.4 ± 0.2
0.11 ± 0.01
40 ± 4
nuoG R219L
0.14 ± 0.01
1.3 ± 0.1
0.17 ± 0.01
68 ± 5
nuoG
R219W/W221L
0.03 ± 0.01
1.4 ± 0.2
0.03 ± 0.01
12 ± 4
nuoG
R219W/W221R
0.02 ± 0.01
1.2 ± 0.1
0.03 ± 0.01
12 ± 6
nuoG
W221L/V107W
0.05 ± 0.01
1.5 ± 0.2
0.05 ± 0.01
20 ± 4
nuoG W221L
nuoI L65W
0.06 ± 0.01
1.3 ± 0.1
0.07 ± 0.01
28 ± 5
nuoG W221L
nuoCD T504W
0.04 ± 0.01
1.4 ± 0.2
0.05 ± 0.01
20 ± 5
nuoG W221L
nuoCD S519W
0.04 ± 0.01
1.6 ± 0.2
0.04 ± 0.01
16 ± 4
Die Mutation Arg219LeuG verringerte die normierte d-NADH Oxidaseaktivität um ein
Drittel. Dies deutet auf die Funktion dieser Aminosäure für den Elektronentransfer hin
(Wittekindt et al., 2009). Keine der zusätzlich eingeführten Mutationen konnte den Effekt der
Mutation Trp221LeuG auf die Aktivität ausgleichen. Die Aktivitäten der Doppelmutanten
waren
im
Gegenteil
deutlich
verringert.
Die
Aktivität
der
Doppelmutante
Arg219TrpG/Trp221ArgG betrug 12% der des ursprünglichen Stamms und etwa ein Drittel der
der Mutante Trp221LeuG. Alle Mutanten wiesen eine signifikante d-NADH/Ferricyanid
Oxidoreduktaseaktivität auf, die jedoch für einzelne Mutanten bis zu einem Viertel verringert
war.
Um
zu
untersuchen,
ob
die
verringerten
NADH-Oxidaseaktivitäten
und
NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivitäten durch die Mutationen oder durch eine
geringere Proteinproduktion verursacht werden, wurden die Proteine über einen Western Blot
analysiert. Je 300 µg Membranproteine wurden durch SDS-PAGE aufgetrennt und auf eine
PVDF-Membran transferiert. Zur Kontrolle wurden Membranen der Einzelmutanten und des
ursprünglichen Stamms mit aufgetragen. Zum Nachweis wurden Mouse Anti-His4 primäre
Antikörper gegen das N-terminal an NuoF fusionierte His6-Affinitätspeptid verwendet
(Abb. 4.30).
105
Ergebnisse
1
2
3
4
5
M
6
7
8
9
70
55
35
25
15
10
Abbildung 4.30: Western Blot der Membranproteine verschiedener BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFhisMutanten mit einem Mouse Anti-His4 Antikörper. Spur M zeigt die Banden des Proteinstandards PageRuler
Plus Prestained Protein Ladder (Thermo Scientific). Die apparenten Molekülmassen sind in kDa angegeben.
Spur 1 zeigt das Signal der Membranproteine der Mutante Trp221LeuG/Val107TrpG, Spur 2 das von
Trp221LeuG/Thr504TrpCD, Spur 3 das von Trp221LeuG/Ser519TrpCD, Spur 4 das von Trp221LeuG/Leu65TrpI,
Spur 5 das von Trp221LeuG, Spur 6 das von Trp221ArgG/Arg219TrpCD, Spur 7 das von Arg219LeuG, Spur 8 das
des ursprünglich Stamms und Spur 9 das der Mutante Trp221LeuG/Arg219TrpG.
Mittels Western Blot-Analyse wurde in den Membranen aller Mutanten eine Bande bei etwa
55 kDa nachgewiesen, die der katalytischen Untereinheit His6-NuoF (51.2 kDa) zugeordnet
wurde. Anhand der Signale kann die Menge an Komplex I in der Membran zwar nicht exakt
quantifiziert werden, dennoch lassen sich die ungefähren Intensitäten abschätzen. Die Bande
für die Mutante Trp221LeuG hat die geringste Intensität. Die verringerte d-NADH/Ferricyanid
Oxidoreduktaseaktivität der Membranen dieser Mutante ist durch eine geringere Produktion
der Variante zu erklären. Auch die Intensität der Banden für die Doppelmutanten
Trp221ArgG/Arg219TrpG
und
Trp221LeuG/Val107TrpG
ist
im
Vergleich
zum
Ausgangsstamm geringer. Dies erklärt die um ein Viertel verringerte d-NADH/Ferricyanid
Oxidoreduktaseaktivität der Membranen von Trp221ArgG/Arg219TrpG, aber nicht die kaum
verringerte Aktivität von Trp221LeuG/Val107TrpG. Die verminderte d-NADH/Ferricyanid
Oxidoreduktaseaktivität von Arg219LeuG lässt sich nicht durch den Western Blot erklären.
Die Bandenintensitäten zeigen eindeutig, dass die doppelt mutierten Varianten in ungefähr
gleichem Maß wie der ursprüngliche Komplex I produziert wurden. Dies lässt den Schluss zu,
dass die deutlich verringerte d-NADH-Oxidaseaktivität der Doppelmutanten durch die neu
eingeführten Mutationen verursacht wird. Da His6-NuoF die äußerste Untereinheit des
peripheren Arms von Komplex I ist, zeigt die Western Blot-Analyse ebenfalls, dass die
produzierten Varianten zumindest in der Membran stabil sind.
106
Ergebnisse
4.5 Der E. coli Stamm BW25113nptI Δnuo Δndh/pBADnuo nuoFhis
Der E. coli Stamm BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFhis wurde in vorangegangen Arbeiten als
Überproduktionsstamm für den Komplex I etabliert (Dörner, 2010). Er besitzt keinen
genomisch kodierten Komplex I, wodurch eine mögliche trans-Komplementation mit
episomal kodierten nuo-Genen verhindert wird. Allerdings enthält dieser Stamm noch das
Gen ndh, das für die nicht energiewandelnde NDH-II kodiert. Dies hat den Nachteil, dass das
Komplex I-spezifische, sehr teure Substrat d-NADH verwendet werden muss, um die
Aktivität des episomal kodierten Komplex I in der Membranen zu bestimmen. In dieser
Arbeit sollte der Stamm BW25113nptI Δnuo Δndh/pBADnuo nuoFhis als Überproduzent für
den E. coli Komplex I etabliert werden. Es wurde zudem vermutet, dass der Stamm ohne
NDH-II mehr Komplex I assembliert, um ausreichend NAD+ für den metabolischen Bedarf zu
regenerieren.
Zunächst
cytoplasmatischen
sollte
die
NADH-
Membranen
der
E. coli
und
Succinat-Oxidaseaktivität
Stämme
BW25113,
von
BW25113Δnuo,
BW25113ndh::nptI und BW25113nptI Δnuo Δndh bestimmt werden.
4.5.1 Oxidaseaktivitäten der Membranen
Die
E. coli
Stämme
BW25113,
BW25113Δnuo,
BW25113ndh::nptI
und
BW25113nptI Δnuo Δndh wurden im 400 mL-Maßstab in LB-Medium angezogen und durch
Zentrifugation
geerntet.
Der
Stamm
BW25113ndh::nptI
wuchs
ähnlich
wie
der
Ausgangsstamm BW25113 (Abb. 4.31). Die NDH-II scheint somit kaum einen Einfluss auf
das Wachstum von BW25113 zu haben. Für die Stämme BW25113 und BW25113ndh::nptI
wurden 4 g Zellen pro L Medium gewonnen. Die BW25113-Stämme ohne genomisch
kodierten Komplex I zeigten deutlich geringeres Wachstum. Auch hier ist klar zu erkennen,
dass die Anwesenheit oder das Fehlen der NDH-II das Wachstum der Komplex IDeletionsstämme nicht beeinflusst. Für die nuo-Deletionsstämme wurden 1.6 g Zellen pro L
Medium erhalten.
107
Ergebnisse
Abbildung 4.31: Wachstumskurven von BW25113 und von NADH-Dehydrogenase Deletionsstämmen in
LB-Medium. Die Wachstumskurve von BW25113 ist schwarz, die von BW25113Δnuo blau, die von
BW25113ndh::nptI grün und die von BW25113nptI Δnuo Δndh rot dargestellt.
Die cytoplasmatischen Membranen der Stämme wurden isoliert und die NADH- und
Succinat-Oxidaseaktivität der Membranen bestimmt. Die Komplex I-vermittelten Aktivitäten
der Membranen wurden mit 25 µM Piericidin A oder mit 50 µM Fenazaquin inhibiert. Zudem
wurde der Effekt der Komplex I-spezifischen Inhibitoren Piericidin A und Fenazaquin auf die
NDH-II untersucht. Tab. 4.11 listet die gemessenen NADH-Oxidaseaktivitäten und
(d-)NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivitäten der verschiedenen Deletionsstämme auf.
Tabelle
4.11:
(d)-NADH/Ferricyanid
Oxidoreduktase-
und
NADH-Oxidaseaktivitäten
der
cytoplasmatischen Membranen der Stämme BW25113, BW25113Δnuo, BW25113ndh::nptI und
BW25113nptI Δnuo Δndh. Alle Werte wurden dreifach bestimmt. Die Endkonzentration der eingesetzten
Hemmstoffe betrug für Piericidin A 25 µM und für Fenazaquin 50 µM.
E. coli
Stamm
NADH/Ferricyanid d-NADH/Ferricyanid
OxidoreduktaseOxidoreduktaseaktivität
aktivität
[µmol·min−1·mg−1]
NADH
Oxidase
Aktivität
Inhibition durch
Piericidin A
Fenazaquin
[%]
BW25113
1.7 ± 0.1
1.2 ± 0.1
0.36 ± 0.02
82 ± 1
85 ± 1
BW25113
ndh::nptI
1.4 ± 0.1
1.0 ± 0.1
0.29 ± 0.02
90 ± 1
90 ± 1
BW25113
Δnuo
BW25113
Δnuo Δndh
1.2 ± 0.1
0.6 ± 0.05
0.14 ± 0.02
50 ± 1
25 ± 1
0.6 ± 0.05
0.4 ± 0.05
0
-
-
108
Ergebnisse
Die NADH-Oxidaseaktivität von BW25113 ließ sich zu 82% mit Piericidin A bzw. zu 85%
mit Fenazaquin inhibieren. Die nur von Komplex I vermittelte NADH-Oxidaseaktivität des
Stamms BW25113ndh::nptI betrug ca. 80% der des Ausgangsstamms und wurde mit beiden
Hemmstoffen zu etwa 90% inhibiert. Die von der NDH-II vermittelte NADH-Oxidaseaktivität
betrug nur etwa 40% der des Ausgangsstamms, wurde aber erstaunlicherweise von den
Komplex I-spezifischen Inhibitoren Piericidin A zu 50% und Fenazaquin zu 25% gehemmt.
Diese Messungen zeigen, dass Komplex I den größten Beitrag zur NADH-Oxidaseaktivität
des Stamms BW25113 liefert. Die Membranen des Stamms BW25113nptI Δnuo Δndh
besaßen
erwartungsgemäß
keine
NADH-Oxidaseaktivität.
Die
NADH/Ferricyanid
Oxidoreduktaseaktivität der Membranen von BW25113 betrug 1.7 µmol·min−1·mg−1. Die
d-NADH/Ferricyanid
Oxidoreduktaseaktivität
betrug
etwa
70%
von
dieser.
Die
NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität von BW25113ndh::nptI war im Vergleich zu der
des Ausgangsstamms leicht erniedrigt und die d-NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität
betrug
Oxi
ebenfalls
70%
re uk a eak ivi
der
NADH-vermittelten.
Die
d-NADH/Ferricyanid
e Δnuo-Stamms betrug die Hälfte der des Ausgangsstamms, was
erstaunlich ist, da d-NADH ein spezifisches Substrat für Komplex I sein sollte (Matsushita et
al., 1987). Überraschenderweise zeigten ie Membranen e Δnuo Δndh-Stamms ebenfalls
NADH und d-NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität. Diese betrugen etwa ein Drittel
der des Ausgangsstamms.
Da die Membranen des Stamms BW25113nptI Δnuo Δndh keine NADH-Oxidaseaktivität
zeigen, kann ausgeschlossen werden, dass andere NADH oxidierende Oxidoreduktasen
Elektronen in die Atmungskette von E. coli einspeisen. Damit trifft die von Bekker et al.
diskutierte Beteiligung weiterer NADH-abhängiger Enzyme wie WrbA, QOR und YhdH an
der aeroben Atmungskette nicht zu (Bekker et al., 2009). WrbA ist eine vermutlich
monotopisch an der Membran assoziierte NAD(P)H:Chinon Oxidoreduktase und ist in der
Lage, sowohl NADH als auch NADPH zu oxidieren. Die genaue physiologische Rolle dieses
Enzyms ist nicht bekannt. Es wird vermutet, dass es als Schutz vor oxidativem Stress in der
Zelle dient (Patridge und Ferry, 2006; Pyla et al., 2010). QOR ist eine lösliche
NADPH:Chinon Oxidoreduktase und überträgt einzelne Elektronen von NADPH auf Chinone
um Semichinone zu bilden (Pan et al., 2009; Thorn et al., 1995). Die YhdH ist eine
Acryloyl-CoA Reduktase und dient als Schutz vor intrazellulär gebildetem Acryloyl-CoA
(Todd et al., 2012). Aufgrund der für QOR und YhdH beschriebenen Reaktionen ist es
unwahrscheinlich, dass diese Enzyme Elektronen von NADH in den Chinon-Pool der
Atmungskette einspeisen. Für WrbA wurde eine artifizielle NAD(P)H/Ferricyanid
109
Ergebnisse
Oxidoreduktaseaktivität nachgewiesen (Patridge und Ferry, 2006). Die NADH bzw.
d-NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität der Membranen von BW25113nptI Δnuo Δndh
könnte somit durch WrbA vermittelt sein.
Die Succinat-abhängige Oxidaseaktivität der NADH Dehydrogenase-Deletionsstämme wurde
bestimmt und zur Kontrolle mit Malonat (10 mM) gehemmt (Tab. 4.12). Um die inhibierende
Wirkung der Komplex I-spezifischen Hemmstoffe Piericidin A (25 µM) und Fenazaquin
(50 µM) auf die verbleibenden Enzyme der aeroben Atmungskette zu untersuchen, wurde
deren Wirkung auf die Succinat-Oxidaseaktivität untersucht.
Tabelle 4.12: Succinat-Oxidaseaktivität der cytoplasmatischen Membranen der Stämme BW25113,
BW25113Δnuo, BW25113ndh::nptI und BW25113nptI Δnuo Δndh. Es wurden Doppelbestimmung
durchgeführt. (n. b. = nicht bestimmt)
Inhibition durch
E. coli
Stamm
SuccinatOxidaseaktivität
Malonat
[10 mM]
[µmol·min-1·mg-1]
Piericidin A
[25 µM]
Fenazaquin
[50 µM]
[%]
BW25113
0.15 ± 0.01
99
18 ± 1
24 ± 1
BW25113
ndh::nptI
0.15 ± 0.01
98
n. b.
n. b.
0.12 ± 0.01
100
n. b.
n. b.
0.14 ± 0.01
99
16 ± 1
22 ± 1
BW25113
Δnuo
BW25113
Δnuo Δndh
Die Succinat-Oxidaseaktivitäten aller vier Stämme sind im Rahmen der Fehler identisch.
Somit kann ein reprimierender Effekt auf die Succinat Dehydrogenase durch die Deletion des
Komplex I und der NDH-II ausgeschlossen werden. Die Succinat-Oxidaseaktivität wurde in
den Membranen aller Stämme nahezu vollständig mit Malonat inhibiert. Die SuccinatOxidaseaktivitäten des Ausgangsstamms und des Δnuo Δndh-Stamms wurden durch
Piericidin A und Fenazaquin zu ca. 17 bzw. ca. 23% inhibiert. Ob die Inhibitoren die Succinat
Dehydrogenase oder die terminalen Oxidasen blockieren kann aus dieser Messung nicht
gefolgert werden.
110
Ergebnisse
4.5.2 Überproduktion des E. coli Komplex I
Zur Überproduktion des Komplex I wurde der Stamm BW25113nptI Δnuo Δndh/pBADnuo
nuoFhis in verschiedenen Medien kultiviert. Die Zellen wurden in LB-Medium und in
Autoinduktionsmedium mit 0.5% (w/v)
D-Mannitol
oder 0.5% (v/v) Glycerin angezogen
(Abb. 4.32). Die Expression der episomal kodierten nuo-Gene der Zucht in LB-Medium
wurde bei einer OD600 von 0.1 mit 0.2% (w/v) L-(+)-Arabinose induziert.
Abbildung
4.32:
Wachstumskurven
des
Stamms
BW25113nptI Δnuo Δndh/pBADnuo nuoFhis
in
verschiedenen Medien im 400 mL-Maßstab. Das Wachstum in Autoinduktionsmedium mit 0.5% (w/v)
D-Mannitol
(schwarz), bzw. 0.5% (v/v) Glycerin (rot) und in LB-Medium (blau) ist gezeigt. Der Pfeil markiert
den Zeitpunkt der Induktion mit 0.2% (w/v) L-(+)-Arabinose bei der Zellzucht in LB-Medium.
Im Autoinduktionsmedium mit
D-Mannitol
als zusätzlicher Kohlenstoffquelle wurde die
höchste OD600 erreicht. Aus dieser Zellzucht wurden aus 30 g Zellen 6.5 mg Komplex I, nach
dem etablierten Protokoll, isoliert. Die Zucht wurde wiederholt, wobei die Zellen vor einer
OD600 von 5.0 geerntet wurden. Aus 4.8 L Medium wurden 42 g Zellen erhalten. Aus der
gesamten Zellzucht wurden 12.5 mg Komplex I isoliert. Das entspricht 0.3 mg Komplex I pro
g Zellen. Die NADH:Decyl-Ubichinon Oxidoreduktaseaktivität der Präparation betrug 3.3 ±
0.1 µmol·min−1·mg−1. Im Vergleich zu der Präparation aus dem Stamm BW25113Δnuo/
pBADnuo nuoFhis konnte die Komplex I-Ausbeute nicht gesteigert werden. Aus diesem
Stamm wurden 0.29 mg Komplex I pro g Zellen isoliert (Dörner, 2010). Bei dieser
Präparation betrug vmax 2.9 ± 0.1 µmol·min−1·mg−1. Die leicht erhöhte Aktivität ist
111
Ergebnisse
wahrscheinlich
auf
Proteinkonzentration
geringere
genauer
Verunreinigung
bestimmt
wurde.
zurückzuführen,
Die
Verwendung
wodurch
des
die
Stamms
BW25113nptI Δnuo Δndh/pBADnuo nuoFhis bietet im Vergleich zu der von BW25113Δnuo/
pBADnuo nuoFhis deutliche Vorteile. Zum einen trägt die Doppeldeletionsmutante eine
genomisch kodierte Kanamycin-Resistenz, was eine Selektion auf zwei verschiedenen
Antibiotika erlaubt. Zum anderen kann bei der Messung der Oxidaseaktivitäten der
Membranen auf das kostspielige Substrat d-NADH verzichtet werden, um spezifisch eine
Komplex I-vermittelte Aktivität zu bestimmen.
4.6 Modulation des Mittenpunktspotentials von N1a
Das zweikernige Fe/S-Zentrum N1a wurde im intakten mitochondrialen Komplex I nicht
durch starke Reduktionsmittel reduziert. Daraus wurde gefolgert, dass es ein sehr negatives
Mittenpunktspotential von etwa −1 V haben muss (Reda et al., 2008). In anderen
Präparationen des mitochondrialen Komplexes wurde das Mittenpunktspotential von N1a zu
etwa −450 mV bestimmt (Ohnishi et al., 1981). Im E. coli Komplex I hat N1a ein höheres
Mittenpunktspotential von −330 mV (pH 7.0), wird somit durch NADH reduziert und ist
EPR-spektroskopisch nachweisbar (Leif et al., 1995; Uhlmann und Friedrich, 2005). Der
Grund für die unterschiedlichen Mittenpunktspotentiale von N1a in verschiedenen
Organismen ist nicht bekannt. Durch Mutagenesestudien an NuoE aus E. coli identifizierte die
Gruppe von Dr. Judy Hirst die Positionen Val96E und Asn142E in der zweiten
Koordinationssphäre um N1a, deren Mutagenese das Mittenpunktspotential von N1a
modulierte (Abb. 2.7). In Prokaryoten sind diese Positionen variabel, wohingegen in
Eukaryoten an diesen Positionen ein Pro96 und ein Met142 konserviert sind. In den NuoEVarianten V96P und N142M war das Mittenpunktspotential von N1a jeweils um etwa 60 mV
erniedrigt. Die Doppelmutation verschob das N1a Mittenpunktspotential um etwa −100 mV
(Birrell et al., 2013). Ob dieser Effekt auf den gesamten E. coli Komplex I übertragbar ist,
wurde in Zusammenarbeit mit Dr. James Birrell aus der Arbeitsgruppe von Dr. Judy Hirst
untersucht. Es sollte geklärt werden, ob N1a unter physiologischen Bedingungen als
Antioxidans im E. coli Komplex I wirkt. Die Arbeiten aus diesem Kapitel wurden publiziert
(Birrell et al., 2013).
112
Ergebnisse
4.6.1 Darstellung von pBADnuo nuoFhis nuoE V96P, N142M und V96P/N142M
Die
Mutationen
wurden
mit
den
Oligonukleotid-Paaren
nuoE V96P_fwd/rev
und
nuoE N142M_fwd/rev (Tab. 3.4) in den Subklon pCA24NnuoE eingeführt. Der Subklon
pCA24NnuoE V96P und das Oligonukleotid-Paar nuoE N142M_fwd/rev wurden zur
Konstruktion der Doppelmutation verwendet. Die mutierten Subklone wurden wie oben
beschrieben dargestellt. Die Anlagerungstemperatur betrug 55 °C. Der Subklon und der
Expressionsvektor
vermitteln
die
gleiche
Antibiotikum-Resistenz.
Um
die
Rekombinationseffizienz zu erhöhen, wurden die mutierten Subklone mit BamHI geschnitten
und das Fragment mit dem mutierten Gen aus einem Agarosegel isoliert. Diese Fragmente
dienten als Vorlage zur Amplifikation der mutierten linearen DNA-Fragmente. Diese wurden
mit dem Oligonukleotid-Paar nuoE_fwd/rev (Tab. 3.6) mittels PCR amplifiziert. Hier betrug
die Anlagerungstemperatur 60 °C. Für die λ-Red vermittelte Rekombination wurden 50 ng
pBADnuo nuoFhis nuoE::nptI-sacB (Dörner, 2010) und 100 – 450 ng der mutierten linearen
DNA-Fragmente verwendet. Der Erfolg der Rekombination wurde durch Restriktionsanalyse
und DNA-Sequenzierung überprüft.
Um die von Komplex I und den Varianten V96PE, N142ME und V96P/N142ME vermittelten
Oxidaseaktivitäten zu bestimmen, wurde der E. coli Stamm BW25113nptI Δnuo Δndh mit
den dargestellten Plasmiden transformiert und im 400 mL-Maßstab in Autoinduktionsmedium
angezogen. Die Membranen wurden wie oben beschrieben isoliert und ihre NADH-Oxidasesowie NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivitäten bestimmt (Tab. 4.13).
Tabelle 4.13:
NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivitäten und NADH-Oxidaseaktivitäten der
Cytoplasmamembranen des unveränderten Stamms und der dargestellten Mutanten.
BW25113nptI Δnuo
Δndh/pBADnuo nuoFhis
NADH/Ferricyanid
Oxidoreduktaseaktivität
Restaktivität
NADH-Oxidase
Aktivität
Restaktivität
[µmol·min−1·mg−1]
[%]
[µmol·min−1·mg−1]
[%]
unverändert
1.6 ± 0.1
100
0.25 ± 0.02
100
nuoE V96P
1.3 ± 0.1
81 ± 8
0.21 ± 0.02
84 ± 8
nuoE N142M
1.4 ± 0.1
88 ± 7
0.24 ± 0.02
96 ± 8
nuoE V96P/N142M
1.2 ± 0.1
75 ± 8
0.20 ± 0.02
80 ± 10
113
Ergebnisse
Die NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität und NADH-Oxidaseaktivität der Membranen
der Mutante Val96ProE und von Val96ProE/Asn142MetE sind geringer als die des
Ausgangsstamms. Die Membranen der Mutante Asn142MetE zeigen keine veränderte
Aktivität.
4.6.2 Präparation der Varianten V96PE, N142ME und V96P/N142ME
Der E. coli Stamm BW25113Δnuo wurde zur Überproduktion der Varianten V96PE, N142ME
und
V96P/N142ME
verwendet.
Die
Mutanten
wurden
im
10 L-Maßstab
in
Autoinduktionsmedium angezogen (Abb. 4.33). Die Mutationen hatten keinen Einfluss auf
den Wachstumsverlauf. Die Zellen wurden kurz vor Erreichen der stationären Phase geerntet,
um eine höhere Proteinausbeute zu erzielen. Aus 10 L Medium wurden 70 – 85 g Zellen
erhalten.
Abbildung 4.33: Wachstumskurven der NuoE-Mutanten und des Ausgangsstamms. Die Wachstumskurven
von BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFhis nuoE V96P (grün), N142M (rot), der Doppelmutante V96P/N142M
(schwarz) und des Ausgangsstamms (blau) sind dargestellt. Die Zellen wurde im 10 L-Maßstab in
Autoinduktionsmedium angezogen.
Die Varianten wurden wie oben beschrieben isoliert. Für die Präparationen wurden jeweils
30 – 35 g Zellen eingesetzt. Die Elutionsprofile der chromatographischen Reinigung an
Fractogel und Ni2+-IDA sind beispielhaft für die Variante V96P/N142ME gezeigt (Abb. 4.34).
114
Ergebnisse
Die Präparationen der anderen Varianten verliefen ähnlich und werden daher nicht gezeigt.
Tabelle 4.14 gibt die Ausbeuten der einzelnen Präparationen wieder.
A)
B)
Abbildung 4.34: Elutionsprofile der Präparation der Variante V96/N142ME. A) zeigt das Elutionsprofil der
Anionenaustausch-Chromatographie an Fractogel EMD TMAE Hicap (M) und B) das der AffinitätsChromatographie an ProBond Ni2+-IDA. Die Absorbanz bei 280 nm ist in Blau, die NaCl- bzw. ImidazolKonzentration in Grün und die artifizielle NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität in Rot dargestellt.
Tabelle 4.14: Zusammenfassung der Präparationen der NuoE-Varianten und des ursprünglichen
Komplex I.
Präparation
Komplex I
E
V96P
N142M
E
V96P/N142M
E
eingesetzte
Zellen
Protein
NADH/Ferricyanid
Oxidoreduktaseaktivität
Ausbeute der
Gesamtaktivität
[g]
[mg]
[µmol·min−1·mg−1]
[%]
35.0
6.5
79.0
8
31.5
6.3
72.0
10
34.0
4.6
71.0
4
35.0
8.0
65.2
5
Wie in den Membranen zeigen auch die isolierten Varianten eine nur geringfügig verminderte
spezifische NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität. Die Minderung der Aktivität ist
jedoch nicht signifikant, da Schwankungen in diesen Größenordnungen auch für verschiede
Präparationen des ursprünglichen Komplex I beobachtet wurden.
Die Reinheit und Zusammensetzung der Präparationen wurde durch SDS-PAGE analysiert
(Abb. 4.35). Das Polyacrylamidgel zeigt, dass die Präparationen der Varianten sämtliche
Nuo-Untereinheiten enthalten.
115
Ergebnisse
app. Mr [kDa] M
1
2
3
4
116.0 →
← Nu G
66.2 →
45.0 →
← Nu CD
← Nu F
35.0 →
← NuoL, NuoN
← NuoM
25.0 →
← NuoH
← NuoB
NuoI/J/E
18.4 →
← NuoA
14.4 →
}
← NuoK
Abbildung 4.35: Polyacrylamidgel der Präparationen der NuoE-Varianten. Spur M zeigt die Banden des
Proteinstandards Unstained Protein Molecular Weight Marker (Thermo Scientific). Spur 1 zeigt das
Bandenmuster des ursprünglichen Komplex I, Spur 2 das der Variante V96PE, Spur 3 das der Variante N142ME
und Spur 4 das der Variante V96P/N142ME. Von den Varianten wurden ca. 70 µg und vom unveränderten
Komplex I ca. 60 µg aufgetragen. Die Banden wurden aufgrund ihrer molekularen Masse den entsprechenden
Nuo-Untereinheiten zugeordnet.
Das Mittenpunktspotential für N1a in den einzeln produzierten NuoE-Varianten wurde durch
Cyclovoltammetrie an einem Proteinfilm bestimmt (Zu et al., 2002). Die Cyclovoltammetrie
wurde in 20 mM Tris/HCl (pH 8.0) und 0.5 M NaCl durchgeführt. Das Mittenpunktspotential
von N1a in den Varianten V96PE und N142ME war um −53 mV verschoben. In der Variante
V96P/N142ME ist es um −100 mV abgesenkt. Da die Einzelmutationen den gleichen Effekt
auf das Mittenpunktspotentiale der einzeln produzierten NuoE-Varianten hatten, wurden nur
die Komplex I-Varianten V96PE und V96P/N142ME für weitere Untersuchungen verwendet.
Der ursprüngliche Komplex I und die Varianten V96PE und V96P/N142ME wurden mit 5 mM
NADH (−370 mV, pH 6.5) sowie 1 mM NADH und 1 mM NAD+ (−310 mV, pH 6.5)
reduziert und EPR-spektroskopisch untersucht (Abb. 4.36). In der mit NADH (−370 mV, pH
6.5) reduzierten Variante V96PE war die Intensität des N1a-Signals um 40% im Vergleich
zum ursprünglichen Komplex I verringert. In dem Spektrum des mit NADH/NAD+ (1:1)
reduzierten ursprünglichen Komplex I sind die Signalintensitäten für N1a und N1b um 30%
verringert. Das Spektrum der mit NADH/NAD+ (1:1) reduzierten Variante V96PE zeigt, dass
das Signal für N1a sogar um 70% schwächer ist (Abb. 4.36). Dies deutet darauf hin, dass das
Mittenpunktspotential von N1a der Variante niedriger ist als im Komplex I. Die Mutation
ändert die Umgebung des Zentrums und verursacht so eine Verschiebung der gz- und gx116
Ergebnisse
Werte von N1a. In den Spektren der unter diesen Bedingungen reduzierten Variante
V96P/N142ME
fehlt
das
Signal
von
N1a
vollständig.
Dies
zeigt,
dass
das
Mittenpunktspotential von N1a auch im intakten Komplex I deutlich erniedrigt ist. Ein
Verlust des Zentrum kann ausgeschlossen werden, da in vorangegangen Arbeiten gezeigt
wurde, dass N1a essentiell für die Assemblierung des Komplex I ist (Dörner, 2010).
a)
b)
c)
Magnetische Flussdichte [mT]
Abbildung 4.36: EPR-Spektren des ursprünglichen Komplex I a) und der Varianten V96PE b) und
V96P/N142ME c). Die Spektren der unter anoxischen Bedingungen mit NADH (−370 mV) reduzierten Proben
sind schwarz abgebildet. Die grauen Spektren zeigen die mit NADH/NAD + (1:1, −310 mV) reduzierten Proben.
In allen Spektren sind die Signale von N1b eindeutig zuzuordnen. Der g z- und der gx-Wert von N1a ist in der
Variante V96PE durch die Mutation verschoben. In dem Spektrum der Variante V96P/N142ME ist kein Signal
für N1a detektierbar. Die Spektren wurden bei 40 K und 1 mW aufgenommen und auf die Proteinkonzentration
normalisiert. Die Mikrowellenfrequenz betrug 9.38 – 9.39 GHz, die Modulationsfrequenz 100 kHz, die
Modulationsamplitude 1 mT, die Zeitkonstante 81.92 ms und die Konversionszeit 20.48 ms. Der für die
Aufnahmen verwendete Puffer enthielt 50 mM MES/NaOH (pH 6.5), 50 mM NaCl, 0.1% DDM und 10%
Glycerin (Birrell et al., 2013).
In analoger Weise sollte das Mittenpunktspotential von N1a im Y. lipolytica Komplex I erhöht
werden. Hierfür wurden die homologen Positionen von Pro103E (in E. coli Val96E) und
Met149E (in E. coli Asn142E) gegen die entsprechenden E. coli NuoE-Reste ausgetauscht. Die
117
Ergebnisse
Mutagenese des Y. lipolytica Komplex I wurde von Dr. James Birrell durchgeführt. In der
einzeln produzierten Untereinheit NuoE von Y. lipolytica wurde das Mittenpunktspotential für
N1a in den Varianten P103VE um etwa +65 mV und M149NE um etwa +80 mV verschoben.
Für die Variante P103V/M149NE wurde das N1a Mittenpunktspotential sogar um 160 mV auf
−270 mV erhöht. Allerdings konnte N1a in den intakten Y. lipolytica Komplex I-Varianten
EPR-spektroskopisch nicht nachgewiesen werden.
Für den B. taurus Komplex I wurde gezeigt, dass am FMN hauptsächlich Superoxidradikale
(O2•−) gebildet werden, die zu H2O2 weiterreagieren. Dies spricht dafür, dass die Elektronen
einzeln auf O2 übertragen werden (Kussmaul und Hirst, 2006). Der E. coli Komplex I
produziert hingegen hauptsächlich H2O2 als Nebenprodukt der NADH-Oxidation (Esterházy
et al., 2008; Schulte, 2014). Das Zentrum N1a im E. coli Komplex I wird als
Zwischenspeicher für das zweite von NADH auf FMN übertragene Elektron diskutiert
(Sazanov, 2007). Um einen möglichen Zusammenhang zwischen der Fähigkeit von N1a,
Elektronen aufzunehmen und der Art der gebildeten ROS-Spezies zu untersuchen, wurden die
FMN-vermittelten Reaktionen des E. coli Komplex I sowie der Komplex I-Varianten V96PE,
N142ME und V96P/N142ME bestimmt (Abb. 4.37). Die mit der NADH Oxidation
verbundene Reduktion von Ferricyanid (FeCN), Hexaminruthenium-(III) (HAR) und
3-Acetylpyridinadenindinucleotid (APAD+) und die dabei entstehenden ROS wurden
bestimmt. Die H2O2-Produktion wurde mit dem Amplex Red Assay und die Superoxid-
Relative Reaktionsraten [%]
Produktion mit dem Dihydroethidium/DNA Assay bestimmt (Esterházy et al., 2008).
Abbildung 4.37: Relative Reaktionsraten der Varianten V96PE (grau), V96P/N142ME (dunkelgrau) zum
ursprünglichen
Komplex I
(hellgrau).
Die
NADH/Ferricyanid,
NADH/HAR
und
NADH/APAD+
Oxidoreduktaseaktivität und die während der NADH Oxidation entstehenden ROS wurden bestimmt (Birrell et
al., 2013).
118
Ergebnisse
Die Daten zeigen, dass die Varianten V96PE und V96P/N142ME nicht mehr O2•− produzieren
als der ursprüngliche Komplex I. Somit kann ausgeschlossen werden, dass durch die
Reduktion des N1a im ursprünglichen E. coli Komplex I bevorzugt H2O2 statt O2•− gebildet
wird (Birrell et al., 2013). Allerdings ist die H2O2-Produktion der Variante V96PE um 20%
und die der Variante V96P/N142ME um 60% im Vergleich zum ursprünglichen Komplex,
erhöht. Diese Messung zeigt die funktionelle Bedeutung der Reduzierbarkeit von N1a, da
seine Reduktion wichtig für den Schutz von E. coli vor einer erhöhten H2O2-Produktion ist.
4.7 Redox-induzierte Konformationsänderung des Glu95 auf NuoF
In unserem Arbeitskreis wurde der A. aeolicus Subkomplex NuoEFHis mit gebundenem NAD+
bzw. NADH kristallisiert
et al., 2008). Strukturvergleiche zeigten, dass das
Peptidrückgrat von Glu95F je nach Redox-Zustand eine unterschiedliche Konformation
einnimmt. Im reduzierten Zustand zeigt die Carbonyl-Gruppe vom FMN weg und ermöglicht
dadurch die Bindung des NADH. In dieser Konformation verdrängt die Carbonyl-Gruppe ein
H2O-Molekül und ersetzt zwei der drei von diesem Wasser gebildeten H-Brücken (Abb.
4.38). Die Carbonyl-Gruppe bildet eine H-Brücke mit der Seitenkette von Arg135F und eine
mit einem anderen strukturell konservierten H2O-Molekül aus (Abb. 4.38 B). Im oxidierten
Zustand zeigt Carbonyl-Gruppe der Peptidbindung des Glu95F zum FMN hin. Es wird
vermutet, dass dieses Umklappen als „Auswurf-Mechanismus“ für das NAD+ dient. In dieser
Arbeit sollte die Konformationsänderung der Peptidbindung zwischen von Glu95F und Ser96F
genauer untersucht werden. Die Peptidbindung sollte durch Einführen von H-Brücken in die
Konformation des reduzierten Proteins gezwungen werden. Hierfür sollte das Gly129E im
A. aeolicus Subkomplex jeweils gegen Serin und Aspartat ausgetauscht werden. Gly129E
befindet sich auf einer Schleife in der ersten Koordinationssphäre von N1a (Abb. 4.38). Durch
die Mutationen sollte versucht werden die beiden H2O-Moleküle zu verdrängen. Diese H2OMoleküle bilden H-Brücken sowohl mit der N1a koordinierende Proteinschleife als auch mit
der, auf der sich das Glu95F befindet. Die NuoEFHis-Varianten sollten isoliert und kristallisiert
werden. Um die physiologischen Auswirkungen zu untersuchen, sollten die gleichen
Mutationen an der homologen Position (Gly135E) in den E. coli Komplex I eingeführt
werden.
119
Ergebnisse
B)
A)
C127
T100
E
G129
F
F
F
E97
C127
E
G129
E95
T100
E
F
E97
E
F
E95
F
F
F
Y138
Y138
F
R135
R135
F
Abbildung 4.38: Konformationsänderung der Peptidbindung des Glu95 F. H-Brücken sind als gestrichelte
Linien angedeutet. A) zeigt die Konformation von Glu95F in der Struktur des oxidierten Proteins. Das in der
Struktur des reduzierten Proteins verdrängte H2O ist grün dargestellt. Das zweite konservierte H2O (rot) bildet
vier H-Brücken aus, von denen die zu Cys127E und den Carbonyl-Gruppen von Thr100F und Glu97E auch in der
Struktur des reduzierten Proteins erhalten bleiben B). In der Konformation des reduzierten Proteins B) sind die
zwei von der Carbonyl-Gruppe von Glu95F gebildeten H-Brücken zu Arg135F und dem rot dargestellten H2O
gezeigt. Die dritte H-Brücke zu Tyr138F geht verloren. Die Position des Gly129E auf der N1a koordinierende
Schleife ist rot dargestellt.
4.7.1 Darstellung der A. aeolicus NuoEFHis-Varianten G129DE und G129SE
Die Mutanten pETBlue-1nuoEFhis nuoE G129D und G129S wurden durch ortsgerichtete
Mutagenese an dem Vektor pETBlue-1nuoEFhis mit den entsprechenden OligonukleotidPaaren (Tab. 3.4) dargestellt. Der Erfolg der Mutagenese wurde durch Restriktionsanalysen
und DNA-Sequenzierungen überprüft. Zur Überproduktion der Varianten wurde der E. coli
Stamm Rosetta(DE3) mit diesen Plasmiden transformiert. Durch Expressionstests wurden
geeignete Klone selektiert. Diese wurden in NuoEFaxa-Medium im 10 L- bzw. im 400 mLMaßstab angezogen. Die Zellausbeute lag bei 2 – 3 g Zellen pro L Medium. Die Varianten
wurden
wie
beschrieben
isoliert.
Die
Elutionsprofile
der
chromatographischen
Reinigungsschritte der Varianten waren sehr ähnlich, daher werden nur die von G129DE
beispielhaft gezeigt (Abb. 4.39). Tabelle 4.15 gibt den Präparationsverlauf wieder und Tabelle
4.16 zeigt die Zusammenfassung der Präparationen. Die Reinheit der Varianten wurde durch
SDS-PAGE analysiert (Abb. 4.40).
120
Ergebnisse
A)
B)
C)
D)
Abbildung 4.39: Elutionsprofile der Präparation der NuoEFHis-Variante G129DE. A) zeigt das
Elutionsprofile der Affinitäts-Chromatographie, B) das der ersten Größenausschluss-Chromatographie, C) das
der Anionenaustausch-Chromatographie und D) das der abschließenden Größenausschluss-Chromatographie.
Die Absorbanz bei 280 nm ist in Blau, die Imidazol- bzw. die NaCl-Konzentration in Grün und die
NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität in Rot dargestellt.
Tabelle
4.15:
Präparationsverlauf
der
Variante
G129DE
aus
5g
Zellen
des
Stamms
Rosetta(DE3)/pETBlue-1nuoEFhis nuoE G129D.
Präparationsschritt
Cytosol
Probond Ni2+-IDA
Superdex 200 16/60
SQ15
Superdex 200 16/60
Volumen
Protein
[mL]
62
21
10
5
1.2
[mg]
742
110
40
21
13.5
NADH/Ferricyanid
Oxidoreduktaseaktivität
total
spezifisch
-1
[µmol·min ]
[µmol·min-1·mg-1]
2283
3.1
1105
10.0
808
20.2
735
35.0
616
45.6
Ausbeute
[%]
100
48
35
32
27
121
Ergebnisse
Tabelle 4.16: Zusammenfassung der Präparation von NuoEFHis und der Varianten G129DE und G129SE.
Präparation
eingesetzte
Zellen
[g]
Ausbeute
Protein
[mg]
NADH/Ferricyanid
Oxidoreduktaseaktivität
[µmol·min−1·mg−1]
normierte
Aktivität
[%]
NuoEFHis
G129DE
G129SE
5.0
5.0
14.6
7.7
13.5
22.0
48.4
45.6
46.2
100
45
44
app. Mr [kDa]
1
2
M
← 66.2
← 45.0
NuoFHis →
← 35.0
← 25.0
← 18.4
NuoE →
← 14.4
Abbildung 4.40: Acrylamidgel der Präparationen der Varianten G129DE (1) und G129SE (2). Spur M zeigt
die Banden des Proteinstandards Unstained Protein Molecular Weight Marker (Thermo Fisher Scientific). Die
Banden sind den Nuo-Untereinheiten anhand ihrer molekularen Masse zugeordnet.
Die Ausbeute der Präparation der Variante G129DE war im Vergleich zu der von NuoEFHis
deutlich erhöht. Es wurden 2.7 mg Protein pro g eingesetzter Zellen isoliert. Da es sich bei
nuoEFhis nuoE G129D um ein heterolog exprimiertes Gen handelt, ist die höhere
Proteinausbeute
auf
eine
bessere
Expression
zurückzuführen.
Die
spezifische
NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität beider Varianten entsprach in etwa der von
NuoEFHis. Dies ist ein starker Hinweis darauf, dass die NADH Oxidation in den Varianten
nicht gestört ist.
4.7.2 Strukturen der NuoEFHis-Varianten G129DE und G129SE
Die Varianten G129DE und G129SE wurden unter den etablierten Citratbedingungen (Tab.
3.20) kristallisiert
et al., 2008). Für die Variante G129SE wurden nach zwei bis
drei Tagen in den Bedingungen 1 – 4, eine Vielzahl von Kristallen beobachtet (Abb. 4.41 A).
Die Variante G129DE kristallisierte nur sehr schlecht ohne Keimkristalle. Um die Flexibilität
des Proteins einzuschränken, wurde die Variante mit NAD+ kokristallisiert. Mit
Keimkristallen und NAD+ wurden nach 3 – 4 Tagen unter den Bedingungen 1 – 3, mehrere
streufähige Kristalle erhalten (Abb. 4.41 B).
122
Ergebnisse
A)
B)
Abbildung 4.41: Proteinkristalle der NuoEFHis Varianten G129SE und G129DE. A) zeigt einen Kristall der
Variante G129SE in 50 mM Tris/HCl (pH 7.0), 0.8 M Na3Citrat und 0.2 M NaCl. B) zeigt Kristalle der Variante
G129DE mit 10 mM NAD+ in 50 mM Tris/HCl (pH 6.8), 0.6 M Na3Citrat und 0.2 M NaCl.
Von Kristallen beider Varianten wurden in Zusammenarbeit mit Herrn Prof. Oliver Einsle und
Herrn Dipl.-Chem. Sascha Jurkovic Datensätze aufgenommen und die Strukturen gelöst. Die
Struktur der Variante G129DE wurde bei einer Auflösungsgrenze von 1.85 Å gelöst. Die
Variante kristallisierte in der Raumgruppe P 1 21 1. Die Variante G129SE kristallisierte wie
NuoEFHis in der Raumgruppe P 21 21 21 und die Auflösungsgrenze betrug 2.44 Å. Die
zugehörigen kristallographischen Statistiken sind im Anhang 7.3 in den Tabellen 7.9 und 7.10
dargestellt. Die asymmetrische Einheit setzt sich aus zwei Monomeren zusammen, die sich
für G129DE ausschließlich in den äußeren, flexiblen Regionen und G129SE an der Position
Glu95F unterscheiden (Abb. 4.42).
A)
B)
Abbildung 4.42: Überlagerung der Monomere der asymmetrischen Einheit der Kristalle von G129DE und
G129SE. A) zeigt die Monomere von G129SE. Der Unterschied in der Glu95F tragenden Proteinschleife ist mit
einem roten Kreis markiert. B) zeigt die Monomere von G129DE mit gebundener ADP-Ribose.
123
Ergebnisse
In der Elektronendichtekarte der Variante G129DE ist der Nikotinamidrest des NAD+ nicht
aufgelöst. In beiden Monomeren der asymmetrischen Einheit ist die Esterbindung der ADPRibose zum Pyrophosphat verdreht. Dies ist ein Indiz dafür, dass das Nikotinamid durch
Hydrolyse abgespalten wurde. Die Tertiär- und Quartärstrukturen der Varianten unterscheiden
sich kaum von denen des NuoEFHis (Abb. 4.43).
A)
B)
C)
D)
Abbildung 4.43: Überlagerung der Monomere der asymmetrischen Einheit der Varianten G129SE und
G129DE mit NuoEFHis. A) und B) zeigen die Überlagerung der einzelnen Monomere von G129SE mit der
Struktur des oxidierten NuoEFHis (grau). C) zeigt die Überlagerung eines Monomers von G129DE mit der
Struktur des oxidierten NuoEFHis (grau) und D) die des selben Monomers mit der Struktur des reduzierten
NuoEFHis (hellblau). Die Position von Glu95F ist mit einem roten Kreis markiert.
Da die einzelnen Monomere der asymmetrischen Einheit der Variante G129SE sich an der
Position des Glu95F unterscheiden, wurden diese einzeln mit der Struktur des oxidierten
124
Ergebnisse
NuoEFHis überlagert. Es ist deutlich zu erkennen, dass eines der Monomere in der
Konformation des oxidierten und das andere in der des reduzierten NuoEFHis vorliegt (Abb.
4.43 A und B). Dies deutet darauf hin, dass die Mutation Gly129SerE die Carbonyl-Gruppe
des Glu95F zum Teil in die Konformation des reduzierten Proteins zwingt, aber nicht
vollständig fixiert. Die Monomere der asymmetrischen Einheit der Variante G129DF zeigen
keine großen Unterschiede. Daher wurde nur ein Monomer jeweils mit den Strukturen des
NuoEFHis im oxidierten und reduzierten Zustand überlagert. Die Glu95F-tragende
Proteinschleife befindet sich in derselben Position wie in der Struktur des NuoEFHis im
reduzierten Zustand (Abb. 4.43 D). Der B-Faktor der Carbonyl-Gruppe des Glu95F beträgt
19.0 Å2 bei einem durchschnittlichen B-Faktor von 29.7 Å2. Der niedrige B-Faktor des
Peptid-Sauerstoffs von Glu95F in der Variante G129DE weist auf eine geringe Flexibilität an
dieser Position hin. In beiden Varianten wurden die verbrückenden H2O-Moleküle verdrängt
(Abb. 4.44; vgl. Abb. 4.39).
B)
A)
F
T100
C)
F
T100
F
E97
F
T100
F
E97
E
D129
E
E
S129
S129
E95
F
F
E95
F
Y138
R135
E95
F
F
F
Y138
F
F
E97
Y138
F
R135
R135
F
Abbildung 4.44: Konformation des Peptidrückgrats von Glu95F in den Varianten G129DE A) und den
Monomeren der asymmetrischen Einheit von G129SE B) und C). A) zeigt das Rückgrat von G129DE. Der
Abstand zwischen der Seitenkette des Asp129E und der Carbonyl-Gruppe des Glu95F ist in Ångström
angegeben. Ein Monomer der asymmetrischen Einheit von G129SE liegt in der Konformation des reduzierten (B)
und eines in der des oxidierten NuoEFHis (C) vor. In B) ist die Länge der H-Brücke zwischen Ser129E und der
Carbonyl-Gruppe von Glu95F in Ångström angegeben.
In der Struktur der Variante G129DE muss beachtet werden, dass das Asp129E protoniert sein
muss, um ein H-Brücke zur Carbonyl-Gruppe des Glu95F ausbilden zu können. Die
Mutationen zeigten den gewünschten Effekt, allerdings in unterschiedlicher Ausprägung. Die
Peptidbindung des Glu95F befindet in der Variante G129DE komplett und in G129SE zum Teil
125
Ergebnisse
in der Konformation des reduzierten NuoEFHis. Zudem wurden beide verbrückenden H2OMoleküle durch die jeweils eingeführten Seitenketten verdrängt. Die unterschiedliche
Orientierung der Carbonyl-Gruppe des Glu95F in den einzelnen Monomeren der
asymmetrischen Einheit von G129SE weist auf eine eingeschränkte aber dennoch
vorhandenen Flexibilität dieser Position hin. Der niedrige B-Faktor des Peptidrückgrats von
Glu95F in der Variante G129DE hingegen deutet darauf hin, dass die Carbonyl-Gruppe in der
Konformation des reduzierten NuoEFHis fixiert ist.
4.7.3 Darstellung der Komplex I-Varianten G135DE und G135SE
Der Subklon pCA24NnuoE diente als Vorlage-DNA für die ortsgerichtete Mutagenese mit
den Oligonukleotid-Paaren nuoE G135D_fwd/rev und nuoE G135S_fwd/rev (Tab. 3.4). Die
Anlagerungstemperatur betrug 55 °C für 30 s. Die Plasmide einzelner Klone wurden isoliert
und der Erfolg der Mutagenese durch Restriktionsanalyse und Sequenzierung untersucht. Um
die Rekombinationseffizienz zu erhöhen, wurden die Subklone mit den Mutationen mit
BamHI geschnitten und das Fragment mit der Mutation aus einem Agarosegel isoliert. Die
linearen Fragmente wurden mittels PCR an den isolierten Fragmenten mit dem
Oligonukleotid-Paar
nuoE_fwd/rev
(Tab.
3.6)
amplifiziert.
Hier
betrug
die
Anlagerungstemperatur 60 °C für 30 sec. Zur λ-Red vermittelte Rekombination wurden 50 ng
pBADnuo nuoFhis nuoE::nptI-sacB (Dörner, 2010) und 100 – 450 ng der linearen DNAFragmente eingesetzt. Die Mutationen wurden durch Restriktionsanalyse und DNASequenzierung überprüft.
Zur Überproduktion der E. coli Komplex I-Varianten wurde der Stamm BW25113nptI Δnuo
Δndh mit den Plasmiden pBADnuo nuoFhis nuoE G135D und G135S transformiert und auf
LB-Agar-Platten mit Chloramphenicol und Kanamycin selektiert. Vor der Zellzucht wurden
die Plasmide aus den Expressionsstämmen isoliert und zur Kontrolle mittels Restriktion
analysiert. Die Mutanten wurden in Autoinduktionsmedium im 10 L- und 400 mL-Maßstab
angezogen. Die Cytoplasmamembranen wurden wie beschrieben präpariert und deren
Komplex I-vermittelte Oxidaseaktivität bestimmt (Tab. 4.17).
126
Ergebnisse
Tabelle 4.17: NADH/Ferricyanid Oxidoreduktase- und NADH-Oxidaseaktivität der Membranen des
Ausgangsstamms und der NuoE-Mutanten.
BW25113nptI Δnuo
Δndh/pBADnuo nuoFhis
NADH/Ferricyanid
Oxidoreduktaseaktivität
Restaktivität
NADH-Oxidase
Aktivität
Restaktivität
[µmol·min−1·mg−1]
[%]
[µmol·min−1·mg−1]
[%]
unverändert
1.6 ± 0.1
100
0.25 ± 0.02
100
nuoE G135S
1.3 ± 0.1
81 ± 8
0.12 ± 0.02
48 ± 8
nuoE G135D
1.1 ± 0.1
69 ± 8
0.0
0
Die NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität der Membranen der Gly135SerE-Mutante
waren um etwa ein Fünftel und die der Gly135AspE-Mutante um ein Drittel verringert. Jedoch
liegen beide Werte im Rahmen ihrer Fehler nahe beieinander. Die NADH-Oxidaseaktivität
der Gly135SerE-Mutante war im Vergleich zu der des Ausgangsstamms halbiert. Die
Membranen des Stamms BW25113nptI Δnuo Δndh/pBADnuo nuoFhis nuoE G135D besaßen
keine nachweisbare NADH-Oxidaseaktivität. Diese Messungen geben einen ersten Hinweis
auf die mechanistische Relevanz der konformativen Flexibilität des Peptidrückgrats von
Glu95F. Während die Menge des Enzyms in der Membran durch die Mutation nur
unwesentlich beeinflusst wird, scheint die Mutation Gly135AspE die physiologische Aktivität
vollständig zu blockieren.
Aus den Membranen wurden die Varianten wie beschrieben isoliert. Die Elutionsprofile
unterscheiden sich nicht von den anderer Präparationen und werden daher nicht gezeigt.
Beispielhaft ist Verlauf der Präparation von G135DE in Tabelle 4.18 aufgeführt. Tabelle 4.19
gibt die Zusammenfassung der Präparationen wieder. Die Reinheit der Proben wurde durch
SDS-PAGE analysiert (Abb. 4.45).
Tabelle 4.18: Präparation der Variante G135DE aus 42 g Zellen des Stamms BW25113nptI Δndh
Δnuo/pBADnuo nuoFhis nuoE G135D.
NADH/Ferricyanid
Oxidoreduktaseaktivität
total
spezifisch
Volumen
Protein
[mL]
[mg]
[µmol·min-1]
[µmol·min-1·mg-1]
[%]
Membranen
28.7
1828
2011
1.1
100
Detergenzextrakt
125.0
1409
1690
1.2
84
Fractogel EMD
60.0
358
1017
3.0
51
0.7
7.0
434
62.0
22
Präparationsschritt
2+
ProBond Ni -IDA
Ausbeute
127
Ergebnisse
Tabelle 4.19: Zusammenfassung der Präparationen des Komplex I und der Varianten aus den Stämmen
BW25113nptI Δnuo Δndh/pBADnuo nuoFhis, nuoE G135D und nuoE G135S.
Präparation
Komplex I
eingesetzte
Zellen
Protein
NADH/Ferricyanid
Oxidoreduktaseaktivität
Ausbeute aus
Gesamtaktivität
[g]
[mg]
[µmol·min−1·mg−1]
[%]
35.0
6.0
60.0
20
E
G135D
42.0
7.0
62.0
22
G135SE
31.0
4.3
61.0
18
1
M
116.0
2
← Nu G
66.2
← Nu CD
45.0
← Nu F
← NuoL
← NuoM
35.0
← NuoB
} NuoI/J/E
25.0
18.4
Abbildung 4.45: Polyacrylamidgel der Präparationen der Komplex I NuoE-Varianten. Spur M zeigt die
Banden des Proteinstandards Unstained Protein Molecular Weight Marker (Thermo Scientific). Spur 1 zeigt die
Banden der Präparation der Variante G135SE und Spur 2 die der Variante G129DE. Von den Varianten wurden
etwa 50 µg aufgetragen. Die hydrophoben Banden waren aufgrund der geringen Anfärbung kaum zu erkennen.
Die NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität beider Varianten ist unverändert zu der des
ursprünglichen Komplex I. Die genaue Enzymkinetik ist der Dissertation von Herrn Dipl.Chem. Marius Schulte zu entnehmen.
Die kinetischen Parameter der NADH:Decyl-Ubichinon Oxidoreduktaseaktivität der
Varianten wurden in Zusammenarbeit mit Marius Schulte bestimmt. Für die Variante G135SE
ergab sich ein vmax von 2.7 ± 0.2 µmol·min−1·mg−1 und ein Km von 13.6 ± 1.0 µM. Für die
Variante G135DE konnten keine kinetischen Parameter bestimmt werden, da die Aktivität mit
der Zeit abnahm (Schulte, 2014). Dies deutet auf eine inhibierende Wirkung des entstehenden
NAD+ auf die Variante hin und unterstützt die Hypothese der Umorientierung des
Peptidrückgrats von Glu95F als eine Art „Auswurf-Mechanismus“. Eine Inhibierung mit
128
Ergebnisse
NAD+ konnte nicht gemessen werden, da der Zusatz von NAD+ zu einer Aktivierung führte.
Das gleiche wurde auch für die Variante G135SE und den Komplex I beobachtet. Zur
Kontrolle wurden die einzelnen Strukturelemente des NAD+ (AMP, ADP-Ribose, NMN,
Nikotinamid) zu den Messungen gegeben. Diese hatten aber keinen Effekt auf die Aktivität.
Durch Messungen unter anoxischen Bedingungen wurde ein mögliche Elektronenübertragung
auf Sauerstoff ausgeschlossen. Daher ist die Aktivierung sehr wahrscheinlich auf
Verunreinigungen des NAD+ mit Metallionen zurückzuführen (Schulte, 2014). Die
NADH/HAR Oxidoreduktaseaktivität der Variante G135SE war im Vergleich zu der des
Komplex I um 18%, die der Variante G135DE um 87% vermindert. Die NADH/Ferricyanid
Oxidoreduktaseaktivität der Varianten ist im Vergleich zu der des Komplex I unverändert
(Schulte, 2014). Der negativ geladene [Fe(CN)6]3−-Komplex erhält die Elektronen direkt vom
reduzierten FMN, in dem er an die Position des NADH bindet. Dagegen bildet der positiv
geladene [Ru(NH3)6]3+-Komplex einen ternären Komplex aus reduziertem FMN und
gebundenem Nukleotid, um reduziert werden zu können. Hierfür bindet HAR vermutlich an
das Pyrophosphat des NAD+(H) (Birrell et al., 2011; Birrell und Hirst, 2013). Da die
NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität durch die eingeführten Mutationen nicht
beeinflusst ist, ist die NADH Oxidation durch die Mutationen nicht beeinträchtigt. Es ist aber
davon auszugehen, dass die Mutationen die Verweildauer des NAD+ im Komplex I erhöhen,
da die NADH/HAR Oxidoreduktaseaktivität vor allem die der Variante G135DE stark
verringert ist. Die Position von gebundenem NADH und NAD+ unterscheiden sich, so dass
das über die Pyrophosphat-Gruppe gebundene Ru3+ sich nicht mehr in einer für einen
schnellen Elektronentransfer benötigten Entfernung zum reduzierten FMN befindet.
Um zu untersuchen ob die Fe/S-Zentren der Variante G135DE durch die Zugabe von NADH
reduziert werden, wurde die Variante EPR-spektroskopisch untersucht. Abb. 4.46 zeigt die
EPR-Spektren der mit NADH bzw. Dithionit reduzierten Variante G135DE. Die EPRspektroskopischen Untersuchungen wurden in Zusammenarbeit mit Prof. Thorsten Friedrich
durchgeführt. Das Spektrum der mit Dithionit reduzierten Variante G135DE zeigt, dass alle
detektierbaren Fe/S-Zentren stöchiometrisch vorhanden sind. Dem Spektrum der NADH
reduzierten Variante ist zu entnehmen, dass die Fe/S-Zentren nicht vollständig reduziert sind.
Dies ist wahrscheinlich auf die sehr geringe Aktivität der Variante zurückzuführen.
129
Ergebnisse
N2
N7
N3
N4
N1a
A)
N1b
N3
N4
N2
B)
C)
300
320
340
360
380
Magnetische Flussdichte [mT]
Abbildung 4.46: EPR-Spektren der Variante G135DE und des Komplex I bei 13 K. A) zeigt das Spektrum
des mit Dithionit reduzierten Komplex I, B) das der mit NADH und c) das der mit Dithionit reduzierten Variante
G135DE. Die Mikrowellenfrequenz betrug 9.36 GHz, die Modulationsamplitude 0.6 mT, die Zeitkonstante
0.164 s und die Aufnahmegeschwindigkeit 17.9 mT/min.
Die ROS-Produktion der Variante G135DE wurde wie beschrieben mit dem Radikalfänger
DEPMPO untersucht. Hierfür wurde die Variante und der Komplex I in E. coli polare Lipide
rekonstituiert und mit 100 mM DEPMPO sowie 1 mM NADH versetzt. Die Reaktion wurde
durch Zugabe von 100 µM Decyl-Ubichinon gestartet. Um zu untersuchen, ob die oben
beschriebene Aktivierung der NADH:Decyl-Ubichinon Oxidoreduktaseaktivität durch NAD+
eine Erhöhung der ROS-Produktion zur Folge hat, wurde einem weiteren Ansatz der Variante
130
Ergebnisse
G135DE NAD+ (2.7 mM) zugesetzt. Zur Kontrolle wurde der Fenton-Test mit FeSO4 (2 mM)
und H2O2 (1%) eingesetzt. Abbildung 4.47 zeigt die gemessenen Spektren.
A)
B)
C)
D)
325
330
335
340
Magnetische Flussdichte [mT]
Abbildung 4.47: EPR-spektroskopischer Nachweis der ROS-Produktion durch die Variante G135DE. A)
zeigt die Signale des DEPMPO-OH Addukts, das durch die Hydroxylradikale der Fenton-Reaktion gebildet
wurde. Die Variante G135DE und der ursprüngliche Komplex I wurden in E. coli polare Lipide rekonstituiert
und mit 100 mM DEPMPO, 100 µM Decyl-Ubichinon sowie mit 1 mM NADH inkubiert. B) zeigt das Signal für
Komplex I, C) das der Variante und D) das der Variante die zusätzlich mit 2.7 mM NAD+ inkubiert wurde. Für
die Variante wurden keine erhöhte Radikal-Produktion detektiert. Die Spektren wurden bei Raumtemperatur
aufgenommen. Die Mikrowellenfrequenz betrug 9.36 GHz, die Modulationsamplitude 0.1 mT, die Zeitkonstante
0.082 s und die Aufnahmegeschwindigkeit 5.4 mT/min.
Mit der Variante G135DE konnte mit DEPMPO keine erhöhte Radikalproduktion
nachgewiesen werden. Auch die Zugabe von NAD+ hatte keine ROS-Produktion zur Folge.
Herr Dipl.-Chem. Marius Schulte konnte bei der quantitativen ROS-Bestimmung mit Hilfe
131
Ergebnisse
des Amplex Red Assays ebenfalls keine erhöhte H2O2-Produktion für diese Variante
beobachten. Die Variante produziert pro umgesetztem NADH genauso viel H2O2 wie der
Komplex I (Schulte, 2014).
4.8 Die Oberflächen-Salzbrücke in NuoG
Sequenz- und Strukturanalysen haben gezeigt, dass der C-Terminus von NuoG homolog zu
der katalytischen Untereinheit NarG der Chinol:Nitrat Oxidoreduktase ist (Chow et al., 1991;
Finel, 1998; Rothery et al., 2008). Es wurde gezeigt, dass die in NarG befindlichen
Kofaktoren, das Fe/S-Zentrum FS0 und der [Mo(MGD)2]-Kofaktor, von dem Chaperon NarJ
in die offene Form der Untereinheit eingebaut werden (Lanciano et al., 2007). Die
geschlossene Form wird von einer solvensexponierten Salzbrücke aus einem Arg/Glu-Paar
stabilisiert. Diese Salzbrücke ist in der katalytischen Untereinheit aller [Mo(MGD)2]-Kofaktor
tragenden Enzyme konserviert. Die Mutation einer der beiden Reste zu einem Alanin führt
dazu, dass NarG zwar produziert wird, aber weder das Fe/S-Zentrum noch den [Mo(MGD)2]Kofaktor trägt (persönliche Mitteilung Prof. Axel Magalon, CNRS, Marseilles). NuoG besitzt
ebenfalls eine Oberflächen-Salzbrücke, die von Arg280G und Glu617G gebildet wird. Diese ist
ähnlich zu N7 positioniert, wie die Salzbrücke in NarG zu FS0 (Abb. 2.10). In dieser Arbeit
sollte der Effekt der Deletion dieser Oberflächen-Salzbrücke auf die Assemblierung des
Komplex I untersucht werden. Hierfür wurde das Glu617G durch ortsgerichtete Mutagenese
und λ-Red vermittelte Rekombination gegen Alanin ausgetauscht und die Assemblierung der
Variante durch Saccharosedichtegradienten-Zentrifugation untersucht.
4.8.1 Darstellung der Mutante pBADnuo nuoFhis nuoG E617A
Der Subklon pUC25nuoE´–G diente als Vorlage-DNA für die ortsgerichtete Mutagenese mit
dem Oligonukleotid-Paar nuoG E617A_fwd/rev (Tab. 3.4). Der Subklon pUC25nuoE´–
G E617A wurde wie oben beschrieben dargestellt. Die Anlagerungstemperatur bei der PCR
betrug 55 °C. Der Erfolg der Mutagenese wurde durch Restriktionsanalyse und
Sequenzierung überprüft. Das lineare DNA-Fragment lin_nuoG E617A wurde von dem
Subklon mit Mutation mit dem Oligonukleotiden nuoGbeg_fwd und nuoGrec_rev (Tab. 3.6) bei
132
Ergebnisse
einer
Anlagerungstemperatur
von
60 °C
amplifiziert.
Für
die
λ-Red
vermittelte
Rekombination wurden 50 ng des Plasmids pBADnuoFhis nuoGc::nptI-sacB und 200 ng
lin_nuoG E617A verwendet. Es wurden einzelne Klone selektiert, die Plasmide isoliert und
der Erfolg der Rekombination durch Restriktionsanalyse und Sequenzierung überprüft.
4.8.2 Die Stabilität der Variante E617AG
Zur Überproduktion der Variante E617AG wurde der E. coli Stamm BW25113Δnuo
verwendet. Die Zellen wurden in 10 L Autoinduktionsmedium angezogen und vor Erreichen
der stationären Phase durch Zentrifugation geerntet (Abb. 4.48).
Abbildung 4.48: Wachstumskurve der Mutante BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFhis nuoG E617A in 10 L
Autoinduktionsmedium.
Aus 10 L Medium wurden 65 g Zellen erhalten. Die Membranen aus 5 g Zellen der Mutante
und des Stamms BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFhis wurden wie beschrieben isoliert. Aus
1.5 mL Membransuspension wurden die Proteine durch Zugabe von 3% (w/v) DDM gelöst.
Der Extrakt wurde durch Zentrifugation (150´000×g, 30 Psi, 25 min, Rotor A-100, Airfuge,
Beckmann) von unlöslichen Bestandteilen befreit. 400 µL des Extrakts wurden auf einen
Saccharosegradienten (12 mL, 5 – 30% (w/v) Saccharose in A*DDM-Puffer mit 50 µM PMSF)
aufgetragen und zentrifugiert. Die Gradienten wurden fraktioniert und die NADH/Ferricyanid
Oxidoreduktaseaktivität der Fraktionen bestimmt (Abb. 4.49).
133
Ergebnisse
Abbildung 4.49: NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität der Fraktionen des Saccharosedichtegradienten. Die Aktivitäten des Extrakts aus der Mutante BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFhis nuoG E617A (rot)
und des Ausgangsstamms BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFhis (schwarz) sind dargestellt.
Die Hauptaktivität der Ferricyanid-Redoxaktivität der Fraktionen des Saccharosegradienten,
der mit dem Extrakt des Ausgangsstamms beladen war, lag in den für Komplex I typischen
Fraktionen 12 – 16. Für die Mutante wurden die Aktivitätsmaxima in den für das NADHDehydrogenasefragment typischen Fraktionen 8 – 11 detektiert. In den Fraktionen 12 – 16
wurde ebenfalls Aktivität gemessen, diese war aber im Vergleich zum Ausgangsstamm
deutlich verringert. Die Aktivitätsverteilung über den Saccharosegradienten zeigt, dass die
Variante bei der Extraktion mit Detergenz zerfällt. Der Versuch, die Variante E617AE zu
isolieren, schlug fehl. Während der Affinitätschromatographie eluierten bei 260 mM Imidazol
keine Proteine. Bei 380 mM Imidazol wurde ein kleines Absorptionsmaximum erhalten. Eine
SDS-PAGE zeigte zwar einige Banden, die möglicherweise Untereinheiten des Komplex I
darstellen. Zudem wies das Polyacrylamidgel aber sehr starke Verunreinigungen auf (Daten
nicht gezeigt).
Um die Komplex I-vermittelte Aktivität in cytoplasmatischen Membranen zu bestimmen
wurde der E. coli Stamm BW25113nptI Δnuo Δndh mit dem Plasmid transformiert und in
Autoinduktionsmedium im 400 mL-Maßstab angezogen. Die Membranen wurden wie
beschrieben isoliert und die Komplex I-vermittelte NADH/Ferricyanid Oxidoreduktase- und
NADH-Oxidaseaktivität bestimmt (Tab. 4.20).
134
Ergebnisse
Tabelle 4.20: NADH/Ferricyanid Oxidoreduktase- und NADH-Oxidaseaktivität der Membranen des
Ausgangsstamms und der NuoG-Mutante.
BW25113nptI Δnuo
Δndh/pBADnuo nuoFhis
NADH/Ferricyanid
Oxidoreduktaseaktivität
Restaktivität
NADH Oxidase
Aktivität
Restaktivität
[µmol·min−1·mg−1]
[%]
[µmol·min−1·mg−1]
[%]
unverändert
1.4 ± 0.1
100
0.21 ± 0.02
100
nuoG E617A
1.0 ± 0.1
71 ± 7
0.14 ± 0.02
67 ± 14
Die Aktivitäten der Membranen der Mutante waren um etwa ein Drittel geringer als die der
Membranen des Ausgangsstamms. Um abzuschätzen, ob dies durch die Mutation oder eine
geringere Proteinproduktion bedingt war, wurde der Gehalt der Membranen an NuoF über
eine Western Blot-Analyse bestimmt. Hierfür wurden 100 µg der Membranproteine des
Ausgangsstamms und der Mutante durch eine SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend auf
eine PVDF-Membran transferiert. Zur Detektion wurden Mouse Anti-His4 primäre Antikörper
gegen das am N-Terminus von NuoF fusionierte His6-Affinitätspeptid verwendet (Abb. 4.50).
1
M
2
70
NuoFHis →
55
35
25
15
10
Abbildung 4.50: Western Blot der Membranproteine der Mutante BW25113nptI Δnuo Δndh/pBADnuo
nuoFhis nuoG E617A (1) und des Ausgangsstamms (2). Spur M zeigt die Banden des Proteinstandards
PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (Thermo Scientific). Die apparenten Molekülmassen sind in kDa
angegeben. In beiden Spuren ist eine Bande bei 55 kDa zu erkennen, deren Masse der His6-Affinitäspeptid
fusionierten Untereinheit NuoF entspricht.
Auf der PVDF-Membran war sowohl für die Membranen der Mutante als auch für die des
Ausgangsstamms eine Bande bei etwa 55 kDa nachweisbar, die der Untereinheit His6-NuoF
135
Ergebnisse
entspricht. Zwar kann die Produktion des Komplexes auf diese Weise nicht quantifiziert
werden, aber es ist deutlich zu erkennen, dass die Bande von NuoF für den Ausgangsstamm
deutlich intensiver als für die Mutante Glu617AlaE ist. Daher sind die verringerten Aktivitäten
der
Membranen
der
Mutante
vermutlich
auf
eine
geringere
Proteinproduktion
zurückzuführen.
Zusammenfassend kann gesagt werden, dass die Variante E617AE in der Membran wohl noch
stabil und aktiv ist, aber durch die Extraktion zerfällt. In vorangegangen Arbeiten wurde
gezeigt, dass der Verlust von N7 zum Zerfall von Komplex I bei der Extraktion aus der
Membran führt (Pohl et al., 2007b). Deshalb ist zu vermuten, dass durch die Deletion der
Oberflächen-Salzbrücke N7 möglicherweise verloren geht.
4.9 Zuordnung des EPR-Signals N4
Der E. coli Komplex I trägt neun Fe/S-Zentren von denen nur N1a, N1b, N2, N3, N4 und N7
(Nomenklatur nach Ohnishi, 1998) EPR-spektroskopisch nachweisbar sind (Leif et al., 1995;
Uhlmann und Friedrich, 2005; Pohl et al., 2007b). Die Zentren N5, N6a und N6b wurden im
E. coli Komplex I bislang EPR-spektroskopisch nicht nachgewiesen. Die detektierbaren EPRSignale wurden durch die Charakterisierung von einzeln produzierten Untereinheiten und
durch Mutagenese-Studien den jeweiligen Nuo-Untereinheiten zugeordnet (Ohnishi, 1998).
Tabelle 4.21 gibt die im E. coli Komplex I durch EPR-Spektroskopie nachgewiesenen Fe/SZentren wieder.
Tabelle 4.21: EPR-spektroskopisch detektierbare Fe/S-Zentren und die dazugehörigen Untereinheiten des
E. coli Komplex I (Leif et al., 1995; Uhlmann und Friedrich, 2005; Pohl et al., 2007b).
Feldposition
Fe/SZentrum
Art des Fe/SZentrums
koordinierende
Untereinheit
gx
gy
N1a
[2Fe-2S]
NuoE
1.92
1.96
2.00
N1b
[2Fe-2S]
NuoG
1.94
1.94
2.03
N2
[4Fe-4S]
NuoB
1.91
1.91
2.05
N3
[4Fe-4S]
NuoF
1.88
1.92
2.04
N4
[4Fe-4S]
NuoG
1.89
1.93
2.09
N7
[4Fe-4S]
NuoG
1.89
1.95
2.05
gz
Die Fe/S-Zentren N6a und N6b wurden über UV/Vis-Spektroskopie im HydrogenaseFragment bestehend aus NuoB, CD und I nachgewiesen (Rasmussen et al., 2001). Das
136
Ergebnisse
Zentrum N5 wurde in einem anderen, biochemisch nicht scharf definierten Fragment des
Komplex I nachgewiesen (Nakamaru-Ogiso et al., 2008).
Mit der Veröffentlichung der Struktur des hydrophilen Arms des T. thermophilus Komplex I
wurden die EPR-Signale den einzelnen strukturell definierten Fe/S-Zentren zugeordnet
(Sazanov und Hinchliffe, 2006; Abb. 2.4). Seit einigen Jahren wird diese Zuordnung der EPRSignale diskutiert. 2007 veröffentlichte die Gruppe von Dr. Judy Hirst ein neues Modell zur
Benennung der strukturell definierten Fe/S-Zentren (Yakovlev et al., 2007). Anhand von
EPR-spektroskopischen Untersuchungen an der einzeln produzierten Untereinheit NuoG aus
E. coli und durch den Vergleich mit den Spektren des gesamten Komplex I, wurde das Signal
N4 einem der beiden auf NuoI lokalisierten Fe/S-Zentren N6a oder N6b zugeordnet. 2010
wurde dieses Modell anhand von double electron-electron-resonance (DEER) Experimenten
am B. taurus Komplex I spezifiziert und das Signal N4 dem strukturell definierten
Fe/S-Zentrum N6a zugeordnet (Roessler et al., 2010).
In der Gruppe von Prof. Tomoko Ohnishi wurden die koordinierenden Cysteine des
strukturell definierten Zentrums N4 gegen Alanine ausgetauscht. Um NuoG einzeln löslich zu
erhalten, wurde diese Untereinheit mit einem Maltose-Bindeprotein (MBP) fusioniert. Durch
den Vergleich der EPR-Spektren des MBP-NuoG und der ΔN4-Variante wurde wiederum
gezeigt, dass das EPR-Signal N4 auch von dem strukturell definierten N4 erzeugt wird
(Ohnishi und Nakamaru-Ogiso, 2008). Zudem gelang es dieser Gruppe in einem Fragment
des E. coli Komplex I bestehend aus NuoCDEFG das schnell relaxierende EPR-Signal N5 bei
3 K und 5 mW zu detektieren. Alle koordinierenden Aminosäuren des strukturell definierten
Fe/S-Zentrums N5 wurden gegen Alanine ausgetauscht. In der ΔN5-Variante wurde das EPRSignal N5 nicht mehr detektiert (Nakamaru-Ogiso et al., 2008; Ohnishi und Nakamaru-Ogiso,
2008). Allerdings ordneten Yakovlev et al. (2007) dieses Signal dem strukturell definierten
Zentrum N4 zu.
EPR-Experimente mit dem E. coli Komplex I zur Lokalisierung der EPR-Signale N4 und N5
wurden entweder mit der einzeln produzierten Untereinheit NuoG oder mit Fragmenten des
Komplexes durchgeführt. Da aber neben dem pH-Wert und der Ionenstärke die chemische
Umgebung der Fe/S-Zentren einen entscheidenden Einfluss auf die Position der EPR-Signale
hat und alle EPR-Signale der Fe/S-Zentren des E. coli Komplex I, in einem sehr engen
spektralen Bereich auftreten und überlappen, sollte der Ursprung des EPR-Signals N4 mit
dem gesamten Komplex untersucht werden. Die koordinierenden Aminosäuren der strukturell
definierten Fe/S-Zentren N4 und N5 sollten einzeln gegen Alanine ausgetauscht werden.
Sabrina Burschel wurde im Rahmen ihrer Masterarbeit zu den Arbeiten zu Teilen dieses
137
Ergebnisse
Kapitels angeleitet (Burschel, 2013). N4 wird von Cys153G, Cys156G, Cys159G sowie
Cys203G und N5 von His101G, Cys105G, Cys108G sowie Cys114G koordiniert (Abb. 4.51).
C114
C159
C203
C108
N5
C156
C105
N4
C153
H101
Abbildung 4.51: Die Koordination der strukturell definierten Fe/S-Zentren N4 und N5 (PDB-Eintrag:
3IAM; Berrisford und Sazanov, 2009). Gezeigt ist NuoG aus T. thermophilus mit der Nummerierung nach
E. coli. N4 und N5 sind als Stabmodelle mit Fe in Rot und S in Gelb dargestellt.
4.9.1 Darstellung der N4- und N5-Mutanten
Die Subklone mit den Mutationen wurden durch ortsgerichtete Mutagenese an dem Subklon
pUC25nuoE´–nuoG mit der entsprechenden Oligonukleotid-Paaren (Tab. 3.4) darstellt. Die
für die λ-Red vermittelte Rekombination benötigten linearen Fragmente wurden mit den
Oligonukleotiden nuoGbeg_fwd und nuoGrec_rev (Tab. 3.6) mittels PCR amplifiziert. Für die
Rekombination wurden je 50 ng des Plasmids pBADnuo nuoFhis nuoGc::nptI-sacB und 200 –
500 ng der linearen Fragmente verwendet. Die Insertion der Mutationen wurde durch
Restriktionsanalyse und DNA-Sequenzierung untersucht.
Der Stamm E. coli BW25113nptI Δnuo Δndh wurde zur Überproduktion der Varianten
verwendet. Die Mutanten wurden in 10 L Autoinduktionsmedium angezogen. Die Mutationen
hatten keinen Einfluss auf das Wachstum der Mutanten (Daten nicht gezeigt). Um zu
untersuchen, ob die Mutationen den Verlust der Fe/S-Zentren bedingen und somit die
Elektronentransfer-Kette unterbrochen ist, wurden die Cytoplasmamembranen der Mutanten
isoliert und deren NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität und NADH-Oxidaseaktivität
bestimmt (Tab. 4.22).
138
Ergebnisse
Tabelle
4.22:
NADH/Ferricyanid
Oxidoreduktaseaktivität
und
NADH-Oxidaseaktivität
der
cytoplasmatischen Membranen der N4- und N5-Mutanten.
BW25113nptI
∆nuo ∆ndh/
pBADnuo nuoFhis
Ligand des
Fe/SZentrums
unverändert
NADH/Ferricyanid
NADHOxidoreduktaseaktivität Oxidaseaktivität
Restaktivität
Oxidase
[µmol·min−1·mg−1]
[%]
2.7 ± 0.2
0.21 ± 0.02
100
nuoG C153A
N4
1.5 ± 0.2
0
0
nuoG C156A
N4
2.0 ± 0.2
0.16 ± 0.02
76 ± 10
nuoG C159A
N4
1.7 ± 0.2
0.01 ± 0.01
5±5
nuoG C203A
N4
2.0 ± 0.2
0
0
nuoG H101A
N5
2.4 ± 0.2
0
0
nuoG C105A
N5
2.2 ± 0.2
0
0
nuoG C108A
N5
2.1 ± 0.2
0.01 ± 0.01
5±5
nuoG C114A
N5
2.0 ± 0.2
0
0
Die NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivitäten der N4- und N5-Mutanten sind im
Vergleich zum Ausgangsstamm teilweise bis zu 50% verringert. Keine der N5-Mutanten wies
signifikante NADH-Oxidaseaktivität auf. Mit Ausnahme der Membranen der Mutante
BW25113nptI Δnuo Δndh/pBADnuo nuoFhis nuoG C156A besaßen auch die N4-Mutanten
keine signifikante NADH-Oxidaseaktivität. Die Mutation Cys156AlaG führte demnach nicht
zum Verlust des strukturell definierten Fe/S-Zentrums N4. Der Elektronentransfer von NADH
auf Ubichinon wäre sonst aufgrund des zu großen Abstands zwischen den benachbarten
Zentren N1b zu N5, unterbrochen (Page et al., 1999).
Um zu untersuchen, ob die Varianten überhaupt produziert wurden oder ob der Verlust von
N4 bzw. N5 zu einer strukturellen Instabilität oder einer unvollständigen Assemblierung führt,
wurden die Membranproteine der Mutanten mittels Western Blot analysiert. Es wurden
jeweils 250 µg Membranproteine mittels SDS-PAGE aufgetrennt und anschließend auf eine
PVDF-Membran transferiert. Zur Detektion wurden Mouse Anti-His4 primäre Antikörper
gegen das N-terminal an NuoF fusionierte His6-Affinitätspeptid verwendet (Abb. 4.52).
139
Ergebnisse
1
2
3
4
5
M
6
7
8
9
70
NuoFHis →
55
35
25
15
Abbildung 4.52: Western Blot der Membranproteine aus den Stämmen BW25113nptI ∆nuo ∆ndh/pBADnuo nuoFhis
(Spur 1), nuoG C114A (Spur 2), C108A (Spur 3), C105A (Spur 4), H101A (Spur 5), C203A (Spur 6), C159A (Spur 7),
C156A (Spur 8) und C153A (Spur 9). In Spur M ist der PageRuler Plus Prestained Protein Ladder (Thermo Scientific)
aufgetragen. Die apparenten Molekülmassen sind gezeigt und NuoFHis mit einem Pfeil gekennzeichnet.
Auf der PVDF-Membran war in allen Spuren eine Bande bei etwa 55 kDa detektierbar, die
der Untereinheit His6-NuoF zugeordnet wurde. Es kann somit ausgeschlossen werden, dass
die Varianten nicht produziert wurden. Sollte die Assemblierung nicht gestört sein, sind die
Varianten zumindest in der Membran stabil. Die Bande auf der PVDF-Membran bei etwa
40 kDa ist wahrscheinlich auf eine unspezifische Bindung des primären Antikörpers
zurückzuführen. Diese ist auch in der Spur des Ausgangsstamms zu beobachten, wodurch ihr
Auftreten als Folge der Mutationen ausgeschlossen wird.
4.9.2 Charakterisierung der N4- und N5-Varianten
Die Varianten und der Komplex I wurden wie beschrieben isoliert. Tabelle 4.23 gibt die
Ausbeuten und Aktivitäten der Varianten wieder. Die Reinheit und Zusammensetzung der
Untereinheiten wurde mit SDS-PAGE analysiert (Abb. 4.53). Für die Variante C156AG sind
alle Nuo-Untereinheiten eindeutig zu erkennen. Für die Varianten C153AG, C159AG und
H101AG sind trotz starker Verunreinigungen dennoch einige Nuo-Untereinheiten zuordenbar.
Die anderen N5-Varianten C105AG, C108AG und C114AG sowie die N4-Variante C203AG
(Daten nicht gezeigt) zerfielen während der Präparation.
140
Ergebnisse
Tabelle 4.23: Zusammenfassung der Präparationen des Komplex I und der N4- und N5-Varianten.
Variante
eingesetzte
Zellen
Protein
NADH/Ferricyanid
Oxidoreduktaseaktivität
Ausbeute aus
Gesamtaktivität
[g]
[mg]
[µmol·min−1·mg−1]
[%]
Komplex I
28.0
2.8
49.4
7
G
C153A
38.0
1.2
11.5
1
C156AG
30.0
2.3
37.5
8
C159AG
34.0
0.5
16.6
1
G
45.0
1.0
14.6
1
G
H101A
30.0
1.2
40.1
2
C105AG
36.0
0.5
20.1
1
C108AG
30.0
0.5
76.3
3
C114AG
36.0
1.2
21.1
5
C203A
App. Mr [kDa]
M
1
2
3
4
5
6
7
116.0 →
← Nu G
66.2 →
← Nu CD
45.0 →
← Nu F
35.0 →
← NuoL, N
← NuoM
25.0 →
18.4 →
← NuoB
} NuoI/J/E
14.4 →
← NuoA
← NuoK
Abbildung 4.53: Polyacrylamidgel der isolierten N4- und N5-Varianten. Spur M zeigt das Bandenmuster des
Unstained Protein Molecular Weight Marker (Thermo Scientific). Spur 1 zeigt die Banden der Variante C153A G,
Spur 2 die der Variante C159AG, Spur 3 die der Variante H101AG. Spur 4 zeigt das Bandenmuster der Variante
C105AG, Spur 5 das der Variante C108AG, Spur 6 das der Variante C114AG und Spur 7 zeigt das Bandenmuster
der Variante C156AG. Die Banden der Präparation sind anhand ihrer apparenten Molekülmassen den
entsprechenden Untereinheiten zugeordnet.
Es wurde die NADH:Decyl-Ubichinon Oxidoreduktaseaktivität der einzelnen Varianten
bestimmt. Die maximale Umsatzrate betrug 3.3 ± 0.2 µmol·min−1·mg−1 für den Komplex I
und 2.6 ± 0.2 µmol·min−1·mg−1 für die Variante C156AG. Das entspricht 79% der des
141
Ergebnisse
Komplex I und steht im Einklang mit den Messungen in der Membran. Die anderen N4- und
N5-Varianten wiesen keine messbare NADH:Decyl-Ubichinon Oxidoreduktaseaktivität auf.
Die Präparationen der Varianten und des Komplex I wurden mit NADH und Dithionit
reduziert und bei 40 K und 5 mW sowie 12 K und 10 mW im X-Band EPR-spektroskopisch
untersucht (Abb. 4.54). Die Varianten C203AG, C105AG, C108AG und C114AG erzeugten
keine oder keine zuordenbaren Signale, daher werden die Spektren nicht gezeigt.
A)
B)
C)
D)
E)
Magnetische Flussdichte [mT]
Magnetische Flussdichte [mT]
Abbildung 4.54: EPR-Spektren des Komplex I A) und der N4-Varianten C153AG B), C156AG C), C159AG
D) und der N5-Variante H101AG E) bei 12 K und 10 mW. Zum besseren Vergleich ist das Spektrum des
Komplex I zweimal abgebildet Die Mikrowellenfrequenz betrug 9.36 GHz, die Modulationsamplitude 0.6 mT,
die Zeitkonstante 0.082 s und die Aufnahmegeschwindigkeit 71.5 mT/min.
Das EPR-Signal N4 ist in den Varianten C153AG, C156AG, C159AG und H101AG eindeutig
nachzuweisen. Somit kann ausgeschlossen werden, dass das Signal N4 von den strukturell
definierten Fe/S-Zentren N4 oder N5 erzeugt wird. Die Aktivität der Varianten bestätigen,
142
Ergebnisse
dass in den Varianten C153AG, C159AG und H101AG die strukturell definierten Zentren N4
bzw. N5 nicht mehr vorliegen. Das 40 K Spektrum der Variante C156AG zeigt, dass das
Signal des zweikernigen Fe/S-Zentrums N1b nur noch sehr schwach detektierbar ist. Dieses
ist sehr wahrscheinlich nicht mehr oder nur teilweise gebunden (Abb. 4.55).
A)
B)
Magnetische Flussdichte [mT]
Abbildung 4.55: EPR-Spektren des Komplex I A) und der N4-Variante C156AG B), bei 40 K und 5 mW.
Die Mikrowellenfrequenz betrug 9.36 GHz, die Modulationsamplitude 0.6 mT, die Zeitkonstante 0.082 s und die
Aufnahmegeschwindigkeit 71.5 mT/min.
Durch Sequenz- und Strukturvergleiche wurde Glu36G in der T. thermophilus Struktur als
potentieller Ligand für das strukturell definierte Fe/S-Zentrum N4 in der Variante C156AG
identifiziert. Im E. coli Komplex I befindet sich an der homologen Position ein Histidin (Abb.
4.56 B). Der Abstand zwischen N3 und N5 beträgt 13.8 Å, somit sollte auch ohne N1b der
Elektronentransfer im Komplex I theoretisch möglich (Page et al., 1999; Sazanov, 2007). In
dieser Arbeit konnte dies anhand der NADH-Oxidaseaktivität und der NADH:DecylUbichinon Oxidoreduktaseaktivität der Variante C156AG, deren Gehalt an N1b maximal 10%
der des Komplex I beträgt, bestätigt werden. Anhand der hier gezeigten Daten ist es
143
Ergebnisse
auszuschließen, dass das EPR-Signal N4 von einem der strukturell definierten Zentren N4
oder N5 erzeugt wird. Dies lässt vermuten, dass das über DEER-Experimente identifizierte
Fe/S-Zentrum N6a, das EPR-Signal N4 erzeugt (Roessler et al., 2010).
A)
N4
C156
N1b
E36
B)
T. thermophilus
E. coli
MVRVKVNDRIVEVPPGTSVMDAVFHAGYDVPLFCSEKHLSPIGACRMC
MATIHVDGKEYEVNGADNLLEACLSLGLDIPYFCWHPALGSVGACRQC
*. ::*:.: ** . .:::* : * *:* ** . *..:**** *
Abbildung 4.56: Koordination der Fe/S-Zentren N4 und N1b in NuoG (PDB-Eintrag: 3IAM; Berrisford
und Sazanov, 2009). A) zeigt die Fe/S-Zentren N1b und N4 als Kalottenmodelle. Die Abstände der Cβ-Atome
von Glu36 und Cys156 zu dem zu koordinierenden Fe-Ion des N4 ist angegeben. Es wurde die E. coli
Nummerierung verwendet. B) zeigt den zugehörigen Ausschnitt des Sequenzvergleichs zwischen
T. thermophilus Nqo3 und E. coli NuoG. Die Position 36 ist gelb unterlegt.
4.10 Mutationen der NADH-Bindestelle des A. aeolicus NuoEFHis
Strukturvergleiche der NADH-Bindestelle von A. aeolicus NuoEFHis im reduzierten und
oxidierten Zustand haben gezeigt, dass einigen Aminosäuren bei der Bindung von NADH
eine besondere Rolle zukommt. In Zusammenarbeit mit M. Sc. Biochemie Karoline Aierstock
und Dr. Lothar Kussmaul (Boehringer Ingelheim, Biberach) sollten die Positionen Glu95F,
Glu97F und Tyr180F des A. aeolicus Subkomplexes NuoEF gegen verschiedene Aminosäuren
ausgetauscht werden.
144
Ergebnisse
Für das Glu95F wurde gezeigt, dass seine Seitenkette über verschiedene H-Brücken im
oxidierten und reduzierten Zustand fixiert ist. Das Glu95F sollte gegen Asn, Asp und Gln
ausgetauscht werden.
Das Tyr180F und das Glu97F bilden im reduzierten Zustand eine H-Brücke, die der
Stabilisierung der NADH-Bindung dient. Die Mutation der Tyr180F zu Cys ist in einem
Patienten mit dem Leigh-like-Syndrom assoziiert (Bénit et al., 2001). Die Mutation des
Glu97F gegen Gln im E. coli Komplex I bewirkte einen drastischen Aktivitätsverlust (Euro et
al., 2009). Das Tyr180F sollte gegen Ala, Cys, Leu und Phe und das Glu97F gegen Asn, Asp
und Gln ausgetauscht werden. Therese Engel wurde im Rahmen ihrer Zulassungsarbeit bei
den Arbeiten zu Teilen dieses Kapitels angeleitet (Engel, 2010).
4.10.1 Darstellung der Mutanten
Das Plasmid pETBlue-1nuoEFhis diente als Templat für die ortsgerichtete Mutagenese. Die
Mutanten pETBlue-1nuoEFhis E95D/N/Q, pETBlue-1nuoEFhis E97D/N/Q und pETBlue-1
nuoEFhis Y180A/C/F/L wurden mit den entsprechenden Oligonukleotid-Paaren (Tab. 3.4)
dargestellt. Der Erfolg der ortsgerichteten Mutagenese wurde durch Restriktionsanalyse und
Sequenzierung untersucht. Es wurden entweder die isolierten Plasmide oder GlycerinDauerkulturen an M. Sc. Biochemie Karoline Aierstock zur Überproduktion und
Charakterisierung der Varianten versandt. Die Ergebnisse der strukturellen und kinetischen
Charakterisierung sind bei Böhringer Ingelheim noch in Arbeit. Die dargestellten Mutanten
sind in Tabelle 4.24 aufgelistet.
Tabelle 4.24: Dargestellte nuoF-Mutanten des A. aeolicus NuoEFHis.
Dargestellte Plasmide
pETBlue-1nuoEFhis
pETBlue-1nuoEFhis E95D
pETBlue-1nuoEFhis E95N
pETBlue-1nuoEFhis E95Q
pETBlue-1nuoEFhis E97D
pETBlue-1nuoEFhis E97N
pETBlue-1nuoEFhis E97Q
pETBlue-1nuoEFhis Y180A
pETBlue-1nuoEFhis Y180C
pETBlue-1nuoEFhis Y180F
pETBlue-1nuoEFhis Y180L
145
Diskussion
5 Diskussion
5.1 Die durch Glu183F vermittelten Substratselektivität
In dieser Arbeit wurde Glu183F als Schüsselposition für die Unterscheidung zwischen den
Substraten NADH und NADPH durch Komplex I identifiziert. Um die sterischen und/oder
elektrostatischen Ansprüche dieser Position zu senken, wurde Glu183F im E. coli Komplex I
gegen Ala, Asp, Asn, Gly und Gln ausgetauscht. Zudem wurde durch den Austausch gegen
das positiv geladene His, eine elektrostatische Anziehung zur Phosphat-Gruppe des NADPHs
eingebracht. Daten die mit der Variante E183HF erzeugt wurden, zeigten, dass die Oxidation
von NADPH mit der Translokation von Protonen gekoppelt ist (Abb. 4.8). EPRspektroskopische Analysen zeigten, dass alle Fe/S-Zentren der Variante auch mit NADPH
reduziert werden (Abb. 4.7). Alle Varianten zeigten eine deutlich höhere NADPH:DecylUbichinon Oxidoreduktaseaktivität als der Komplex I (Tab. 4.4). Die katalytischen
Effizienzen der Varianten E183NF und E183DF sind am wenigsten erhöht, dennoch betrugen
sie das 12- bzw. 50-fache des Komplex I. Die Varianten E183HF, E183GF und E183AF zeigen
eine sogar 220-, 360- bzw. das 2400-fach erhöhte katalytische Effizienz. Die konservative
Mutation zu Glutamin erhöhte die katalytische Effizienz 180-fach. Die elektrostatische
Abstoßung der Phosphatgruppe des NADPHs durch die Glu183F-Seitenkette hatte somit einen
größeren Effekt auf die Substratunterscheidung als der sterische Anspruch. Die stark erhöhten
Aktivitäten der Varianten E183AF und E183GF sind wahrscheinlich auf lokale strukturelle
Änderungen zurückzuführen. Außer bei den Varianten E183NF und E183GF waren auch die
NADH:Decyl-Ubichinon Oxidoreduktaseaktivitäten im Vergleich zum Komplex I erhöht.
Bemerkenswerterweise waren die katalytischen Effizienzen mit NADH als Substrat für die
Varianten E183DF und E183HF um mehr als das Doppelte erhöht. Die H2O2-Produktion bei
der Oxidation von NADPH durch die Varianten war, mit Ausnahme von E183DF, im
Vergleich zu Komplex I erniedrigt (Tab. 4.5). Das zeigt die durch die Mutationen bedingte
Anpassung der NADH-Bindestelle an das Substrat NADPH. Die höhere katalytische Effizienz
der Varianten bei der Umsetzung von NADH war immer mit einer höheren H2O2-Produktion
gekoppelt. Für eine effiziente Elektronenübertragung von NADH auf Ubichinon ist also ein
Glutamat an Position 183 erforderlich.
Da die kinetischen Daten keine Erklärung für die erhöhten ROS-Produktionen lieferten,
wurden die homologen Mutationen (E185A/D/G/H/N und QF) zur strukturellen Analyse in
den A. aeolicus Subkomplex NuoEFHis eingebracht. Die Varianten E185H/D/N und QF
146
Diskussion
kristallisierten unter denselben Bedingungen wie NuoEFHis. Für die Variante E185AF mussten
neue Kristallisationsbedingungen gefunden werden. Die Variante E185GF konnte nicht zur
Kristallisation gebracht werden. Die Kristallstrukturen der Varianten E185HF und E185DF
wurden bei 2.20 Å bzw. 2.40 Å gelöst (Abb. 4.21). Anhand dieser Strukturen konnte keine
Erklärung für die erhöhte Aktivität und H2O2-Produktion gefunden werden. Die Struktur der
Variante E185DF wurde zusätzlich mit gebundenem NAD+ bei 1.80 Å gelöst. Aus dieser
Struktur wurde die modifizierte Anbindung des Nukleotids ersichtlich (Abb. 4.27). Die
Adenosin-Ribose war um etwa 160° verkippt, um mit der kürzeren Seitenkette des Asp185F
eine H-Brücke zu bilden. Die zweite von Glu185F gebildete H-Brücke zur Adenosin-Ribose
war in der Variante nicht mehr vorhanden, wodurch die Anbindung der Phosphat-Gruppe des
NADPHs ermöglicht wurde. Zudem wurde die H-Brücke von Lys76F zum O3' der AdenosinRibose geschwächt. Der Verlust beider H-Brücken schwächt die Anbindung des NAD+,
dadurch kann es leichter aus der Bindetasche gelöst werden, was die erhöhte Aktivität der
E. coli Variante mit NADH erklärt. In allen drei Strukturen war interessanterweise das
Peptidrückgrat des Glu95F in der Konformation des reduzierten Proteins. Die B-Faktoren
zeigten jedoch, dass diese Position flexibel ist (Abb. 4.22).
Da durch die Mutationen keine drastischen strukturellen Änderungen zu erkennen waren, ist
die
erhöhte
ROS-Produktion
der
Varianten
auf
die
veränderte
Substratbindung
zurückzuführen. Die Tatsache, dass alle Varianten eine unterschiedlich stark erhöhte ROSProduktion aufweisen, lässt darauf schließen, dass NADH in allen Varianten unterschiedlich
gebunden wird. Der Querschnitt durch die Oberflächendarstellung von E185DF mit
gebundenem NAD+ zeigt, dass der Boden und das Innere der NADH-Bindestelle nicht
vollständig vom Nukleotid abgeschirmt werden (Abb. 4.28). Dadurch kann Sauerstoff in die
Bindetasche diffundieren und am reduzierten FMN zu H2O2 reduziert werden, was die erhöhte
ROS-Produktion der E. coli Komplex I-Varianten erklären würde. Um diese Hypothese zu
untersuchen, könnten in weiterführenden Arbeiten Kristalle mit Xenon, das in Größe und
Polarität molekularem Sauerstoff ähnelt, in einer Xenon-Druckkammer begast werden. Das
Xenon diffundiert in die für Sauerstoff zugänglichen Bereiche und kann dann
röntgendiffraktometrisch detektiert werden.
147
Diskussion
5.2 Die Position Tyr178F im E. coli Komplex I
Die im Genom eines am Leigh-like-Syndrom erkrankten Patienten detektierte Mutation
Tyr204Cys auf der Untereinheit NDUFV1 (Homolog von NuoF) wurde mit dem bakteriellen
Komplex I als Modellsystem untersucht. Strukturelle Analysen mit dem A. aeolicus NuoEFHis
im reduzierten und oxidierten Zustand zeigen, dass die homologe Position Tyr178F
(Nomenklatur nach E. coli) durch eine H-Brücke mit Glu95F die Bindung des NADH
stabilisiert. Der Verlust der für die H-Brücke notwendigen Hydroxyl-Gruppe des Tyr178F
wurde durch den Austausch gegen Phe, Leu, Ala und Cys im E. coli Komplex I untersucht.
Die Vermutung der Autoren, dass die Mutation Tyr178CysF zum Verlust des FMNs führt
(Bénit et al., 2001), konnte durch die Bestimmung des FMN-Gehalts der Variante widerlegt
werden (Tab. 4.9). In dieser Arbeit wurde gezeigt, dass das Tyr178F essentiell für die
Aktivität des Komplex I ist (Tab. 4.8). Alle Varianten zeigten eine um mindestens 70%
geringere katalytische Effizienz als der Komplex I. Die katalytische Effizienz der Variante
Y178LF war sogar um mehr als 80% verringert. Für die E. coli Komplex I-Variante E95QF
wurde bereits ein Aktivitätsverlust von 30% gezeigt (Euro et al., 2009).
Die Varianten Y178A/C und LF produzierten etwa fünf- bis achtfach mehr H2O2 pro
umgesetztem Substratmolekül als der Komplex I (Tab. 4.9). Die ROS-Produktion der
Variante Y178FF war sogar fast 13-fach erhöht. Für die Variante E95QF wurde eine um das
25-fache erhöhte ROS-Produktion publiziert. Allerdings behaupten die Autoren, dass die
Position Glu95F die ROS-Produktion im E. coli Komplex I kontrolliert (Knuuti et al., 2013).
Diese Aussage wird aber mit den von unserem Arbeitskreis publizierten Daten widerlegt
(Morina et al., 2011; Birrell et al., 2013).
Durch den Verlust der sterisch anspruchsvollen Seitenkette und der Hydroxyl-Gruppe des
Tyrosins kann die H-Brücke zu Glu95F nicht mehr gebildet werden. Dies führt zu einer
ineffizienten Elektronenübertragung auf FMN. Die Seitenketten der neu eingeführten Reste
haben alle einen geringeren Raumbedarf als Tyrosin, daher könnte mehr Sauerstoff in die
Bindestelle diffundieren. Im Zusammenspiel mit dem Verlust der H-Brücke führt dies
wahrscheinlich vermehrt zu Nebenreaktionen wie der Bildung von ROS.
148
Diskussion
5.3 Die Beteiligung von Trp221G am Elektronentransfer
In vorangegangenen Arbeiten wurde die vorgeschlagene Beteiligung aromatischer
Aminosäuren am Elektronentransfer in Komplex I untersucht (Dörner, 2010). Es wurde
gezeigt, dass der Austausch Trp221LeuG die d-NADH-Oxidaseaktivität der Cytoplasmamembranen um etwa ein Drittel vermindert. Um strukturelle Gründe für die verminderte
Aktivität möglicherweise ausschließen zu können, wurden in dieser Arbeit Doppelmutanten
auf Basis der Mutante Trp221LeuG dargestellt. Mit Hilfe der Struktur des hydrophilen Arms
des T. thermophilus Komplex I (Berrisford und Sazanov, 2009) wurden aliphatische
Aminosäuren identifiziert, die sich in ähnlichem Abstand jeweils zu N5 und N6a befinden wie
Leu221G. Diese wurden gegen Trp ausgetauscht, um im Idealfall eine Doppelmutante mit der
Aktivität des Ausgangsstamms zu erhalten. Um die vorgeschlagene Beteiligung von Arg219G
am Elektronentransfer zu untersuchen, wurde es gegen Leu ausgetauscht. Zudem wurde eine
Mutante dargestellt, in der Trp221G und Arg219G gegeneinander ersetzt waren.
Die Membranen der Doppelmutanten wiesen niedrigere d-NADH-Oxidaseaktivitäten auf als
die der Mutante Trp221LeuG (Tab. 4.10). Die Doppelmutante Arg219Trp/Trp221ArgG wies
12% der Aktivität des Ausgangsstamms und nur etwa ein Drittel der Mutante Trp221LeuG
auf. Die Mutation Arg219LeuG verringerte die d-NADH Oxidaseaktivität ebenfalls um ein
Drittel und unterstreicht die funktionelle Bedeutung der positiven Ladung für den
Elektronentransfer (Wittekindt et al., 2009). Eine Western Blot-Analyse zeigte, dass alle
Varianten produziert wurden und in der Membran stabil vorlagen. Dies impliziert, dass die
verringerten Aktivitäten auf die eingeführten Mutationen zurückzuführen sind. Die Tatsache,
dass die Aktivität durch die neu eingeführten zweiten Mutationen nicht erhöht wurde,
widerlegt nicht den postulierten hopping-Mechanismus. Da nicht nur die Distanz zu den
aromatischen Seitenketten, sondern auch deren Orientierung zu den Fe/S-Zentren für den
Elektronentransfer wichtig ist, kann ohne eine Struktur des E. coli Komplex I und der
Varianten keine abschließende Aussage zum Mechanismus getroffen werden.
Tryptophan und Tyrosin werden in einer Vielzahl von Enzymen für den Elektronentransfer
genutzt (Gray und Winkler, 2003). Phenylalanin spielt für den Elektronentransfer eine
geringere Rolle. Dennoch wurde gezeigt, dass Phe die zentrale Rolle bei der
Elektronenübertragung zwischen einem high-potential Eisen-Schwefel Protein (high-potential
iron-sulphur
protein;
HiPIP)
und
der
tetrahäm
Cytochrom c
Untereinheit
des
Reaktionszentrums des Photosystems von Allochromatium vinosum spielt (Venturoli et al.,
2004).
149
Diskussion
Die aromatischen Aminosäuren Phe515CD und His514CD sind ebenfalls zwischen N5 und N6a
lokalisiert. In vorangegangenen Arbeiten wurden beide Aminosäuren gegen Leu ausgetauscht.
Die Aktivität der Mutante Phe515LeuCD war um etwa ein Drittel die der Mutante
His514LeuCD um etwa 10% verringert (Dörner, 2010). Zudem wurde das Phe515CD von den
Autoren als wahrscheinlichster Kandidat für den hopping-Mechanismus vorgeschlagen
(Wittekindt et al., 2009). In weiterführenden Arbeiten könnten Doppelmutanten auf Basis der
Mutante Phe515LeuCD entworfen werden. Zudem könnte eine Mutante dargestellt werden, in
der die Positionen His514CD und Phe515CD gegeneinander ausgetauscht sind, um das Postulat
des hoppings zu untersuchen.
5.4 Überproduktion des E. coli Komplex I und des A. aeolicus NuoEFHis
In dieser Arbeit wurde der E. coli Stamm BW25113nptI Δnuo Δndh/pBADnuo nuoFhis als
Überproduzent für den Komplex I etabliert. Zunächst wurden die NADH- und SuccinatOxidaseaktivitäten des Stammes BW25113 und seiner Abkömmlinge BW25113Δnuo,
BW25113ndh::nptI und BW25113nptI Δnuo Δndh, sowie die Hemmbarkeit dieser Aktivitäten
mit den Komplex I-spezifischen Inhibitoren Piericidin A und Fenazaquin bestimmt (Tab.
4.11).
Die NADH-Oxidaseaktivität der Membranen des Ausgangsstamms ließ sich mit Piericidin A
zu 82% und mit Fenazaquin zu 85% inhibieren. Die Aktivität der Membranen von
BW25113ndh::nptI betrug etwa 80% der des Ausgangsstamms und war mit beiden
Hemmstoffen zu 90% inhibierbar. Die NDH-II-vermittelte NADH-Oxidaseaktivität der
Membranen des Stammes BW25113Δnuo betrug nur 40% der des Ausgangsstamms und war
überraschenderweise mit Piericidin A zu 50% und mit Fenazaquin zu 25% inhibierbar. Der
Stamm BW25113nptI Δnuo Δndh hatte erwartungsgemäß keine NADH-Oxidaseaktivität.
Diese Messungen zeigten, dass die von Bekker et al. (2009) formulierte Beteiligung von
weiteren NADH-verbrauchenden Enzymen in der aeroben Atmungskette von E. coli nicht
zutrifft. Die Membranen des Stamms BW25113nptI Δnuo Δndh wiesen überraschenderweise
noch ein Drittel der NADH bzw. d-NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität des
Ausgangsstamms auf. Diese Aktivität könnte durch WrbA vermittelt sein, da für dieses
membranassoziierte Enzym eine artifizielle NAD(P)H/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität
nachgewiesen wurde (Patridge und Ferry, 2006).
150
Diskussion
Die Succinat-Oxidaseaktivität war für alle Stämme identisch und ließ sich nahezu vollständig
durch Malonat hemmen (Tab. 4.12). Ein Effekt auf die restliche Atmungskette durch die
Deletion von Komplex I und der NDH-II kann somit ausgeschlossen werden. Um die
inhibierende Wirkung der Komplex I-spezifischen Hemmstoffe Piericidin A und Fenazaquin
auf den Rest der Atmungskette zu untersuchen, wurde versucht auch die SuccinatOxidaseaktivität mit diesen Hemmstoffen zu inhibieren. Die Aktivitäten der Membranen des
Ausgangsstamms und von BW25113nptI Δnuo Δndh ließen sich jeweils mit Piericidin A zu
17% und mit Fenazaquin zu 23% inhibieren. Allerdings geht aus den Experimenten nicht
hervor, ob die Inhibitoren die Succinat Dehydrogenase oder die terminalen Oxidasen
beeinflussen.
Das Autoinduktionsmedium war für die Anzucht des Stamms BW25113nptI Δnuo Δndh/
pBADnuo nuoFhis am besten geeignet. Zwar konnte die Komplex I-Ausbeute im Vergleich
zum Stamm BW25113Δnuo/pBADnuo nuoFhis nicht nennenswert erhöht werden, dennoch
wies der isolierte Komplex eine um etwa 10% erhöhte spezifische Aktivität auf. Dies ist
wahrscheinlich auf eine geringere Verunreinigung und die daraus resultierende genauere
Konzentrationsbestimmung zurückzuführen. Zudem kann nun bei der Messung der NADHOxidaseaktivität auf das kostspielige, Komplex I-spezifische Substrat d-NADH verzichtet
werden.
Um die Expression der A. aeolicus Gene nuoEFhis zu erhöhen, wurde in dieser Arbeit das
Plasmid pETBlue-1nuoEFhis ohne das Gen nuoG kloniert. Da NuoG bei der Präparation nur in
Form von Einschlusskörpern erhalten wird, sollte durch die Verwendung des kleineren
Vektors der Stress für die Zellen während der Expression und Produktion verringert werden.
Erste Präparationsversuche lieferten sehr geringe Ausbeuten an NuoEFHis, zudem wurden
Proteinspezies ohne Kofaktoren erhalten. Expressionstests zeigten, dass von den getesteten
Klonen nur etwa 30 – 80% die durch den Subkomplex NuoEFHis vermittelte, charakteristische
Braunfärbung aufwiesen. Die Ausbeute der Präparationen von NuoEFHis und seiner Varianten
hing stark von den verwendeten Klonen ab. Es wurden 1.2 – 2.7 mg Protein pro g eingesetzter
Zellen isoliert (Tab. 4.6 und Tab. 4.16). Zusammengefasst konnte durch die Verwendung des
kleineren Plasmids und vorhergehenden Expressionstests die Proteinausbeute im Vergleich
zum bisherigen Protokoll
dt et al., 2008) um mehr als das Sechseinhalbfache
gesteigert werden.
151
Diskussion
5.5 Modulation des Mittenpunktspotentials von N1a
Das Fe/S-Zentrum N1a des E. coli Komplex I hat im Vergleich zu seinem mitochondrialen
Homolog ein hohes Mittenpunktspotential von etwa −330 mV und kann deswegen durch
NADH reduziert und EPR-spektroskopisch nachgewiesen werden (Leif et al., 1995; Reda et
al., 2008). Der E. coli Komplex I produziert als Nebenreaktion am reduzierten FMN
vornehmlich H2O2, wohingegen der mitochondriale Komplex Superoxid-Radikale bildet
(Kussmaul und Hirst, 2006; Esterházy et al., 2008; Schulte, 2014). Die Fähigkeit von N1a
Elektronen aufzunehmen wurde für die Bildung der unterschiedlichen ROS verantwortlich
gemacht. Um dies zu untersuchen wurden in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe von
Dr. Judy Hirst Komplex I Varianten dargestellt, in denen durch die Mutationen Val96ProE
und Asn142MetE das Mittenpunktspotential von N1a um bis zu −100 mV verschoben war.
Die NADH-Oxidaseaktivität der Membranen der Mutanten BW25113nptI Δnuo Δndh/
pBADnuo nuoFhis nuoE V96P und N142M waren im Rahmen der Messgenauigkeit nicht oder
nur leicht verringert. Die Aktivität der Doppelmutante Val96Pro/Asn142MetE war um etwa
ein Fünftel erniedrigt (Tab. 4.13). Die Varianten V96PE und V96P/N142ME wurden EPRspektroskopisch untersucht. In der Variante V96PE wurde N1a durch NADH nur zu 40%
reduziert. Im EPR-Spektrum der Variante V96P/N142ME wurde N1a nicht mehr detektiert
(Abb.
4.37).
Die
NADH/Ferricyanid,
die
NADH/HAR
und
die
NADH/APAD+
Oxidoreduktaseaktivitäten sowie die H2O2- und Superoxid-Produktion der Varianten V96PE
und V96P/N142ME wurden bestimmt (Abb. 4.38). Die NADH/Ferricyanid und NADH/HAR
Aktivität der Varianten war im Vergleich zum Komplex I, um etwa 20 – 30% verringert. Die
NADH/APAD+ Oxidoreduktaseaktivität beider Varianten betrug die Hälfte der des
Komplex I. Die Superoxid-Produktion der Varianten war nicht erhöht. Somit kann
ausgeschlossen werden, dass die Art der produzierten ROS vom Mittenpunktspotential von
N1a abhängt (Birrell et al., 2013). Allerdings ist die H2O2-Produktion der Variante V96PE um
etwa ein Fünftel und die der Variante V96P/N142ME um 60% erhöht. Dies ist ein Hinweis auf
eine funktionelle Bedeutung des Zentrums N1a als Schutz vor erhöhter ROS-Produktion.
Da für die Aktivitätsbestimmungen der Varianten nur artifizielle Elektronenakzeptoren
verwendet wurden, könnten in weiterführenden Arbeiten die kinetischen Parameter der
physiologischen NADH:Decyl-Ubichinon Oxidoreduktaseaktivität der Varianten bestimmt
werden. Dies würde eine genauere Aussage zum Einfluss des N1a auf die Aktivität des
Komplex I geben. Die H2O2-Produktion wurde ohne Elektronenakzeptor im Assay gemessen.
Um einen physiologisch relevanten Wert für die ROS-Produktion zu erhalten, könnte in
152
Diskussion
weiterführenden Arbeiten die H2O2-Bildung durch die Varianten während des katalytischen
turnovers mit dem von Herrn Dipl.-Chem. Marius Schulte etablierten Amplex Red Assay
bestimmt werden.
5.6 Redox-induzierte Konformationsänderung des Glu95 auf NuoF
In unserem Arbeitskreis wurde der A. aeolicus Subkomplex NuoEFHis im oxidierten Zustand
mit NAD+ bzw. im reduzierten Zustand mit NADH kristallisiert. Anhand des Vergleichs
beider Strukturen wurde erkannt, dass die Peptidbindung zwischen Glu95F und Ser96F je nach
Redox-Zustand in einer anderen Konformation vorliegt. Im reduzierten Zustand zeigt die
Carbonyl-Gruppe des Glu95F vom FMN weg und ermöglicht so die Bindung des NADH. In
dieser Orientierung verdrängt die Carbonyl-Gruppe ein H2O-Molekül, das nur in der
oxidierten Konformation vorliegt und übernimmt teilweise die von diesem H2O-Molekül
gebildeten H-Brücken (Abb. 4.39). Im oxidierten Zustand zeigt die Carbonyl-Gruppe zum
FMN hin und verdrängt aufgrund seines sterischen Anspruchs das NAD+. In beiden
Konformationen
wird
die
Carbonyl-Gruppe
durch
H-Brücken
zu
verschiedenen
H2O-Molekülen stabilisiert (Abb. 4.39 und Abb. 2.14). Dieser Konformationswechsel wird als
„Auswurf-Mechanismus“ für das produzierte NAD+ interpretiert. Um die Bedeutung der
Konformationsänderung für den Mechanismus zu untersuchen, wurde die Carbonyl-Gruppe
des Glu95F durch das Einfügen neuer H-Brücken in der reduzierten Konformation fixiert.
Hierfür wurde das Gly129E jeweils gegen Ser und Asp ausgetauscht. In einem Monomer der
asymmetrischen Einheit der Variante G129SE zeigte die Carbonyl-Gruppe vom FMN weg,
was der reduzierten Konformation entspricht. In dem anderen Monomer lag die CarbonylGruppe in der oxidierten Konformation vor. Dies deutet auf eine eingeschränkte Flexibilität
hin, zeigt aber dennoch, dass die Peptidbindung immer noch flexibel ist (Abb. 4.44). Der
niedrige B-Faktor der Carbonyl-Gruppe des Glu95F in der Variante G129DE deutet darauf hin,
dass die Bindung in dieser Variante hingegen fixiert ist. Um die Auswirkungen der
eingeschränkten Flexibilität der Peptidbindung auf die physiologische Aktivität zu
untersuchen, wurden die homologen Mutationen (Gly135SerE und Gly135AspE) in den E. coli
Komplex I eingeführt. Die NADH-Oxidaseaktivität der Cytoplasmamembranen der Variante
G135SE war im Vergleich zum Ausgangsstamm in etwa halbiert. Die Membranen der
Variante G135DE wiesen keine NADH-Oxidaseaktivität auf (Tab. 4.17). Die isolierten
Varianten wurden in Zusammenarbeit mit Herrn Dipl.-Chem. Marius Schulte untersucht
153
Diskussion
(Schulte, 2014). Die Mutation G135SE hatte nur einen geringen Einfluss auf die
physiologische NADH:Decyl-Ubichinon Oxidoreduktaseaktivität. Die maximale Umsatzrate
vmax betrug 2.7 ± 0.2 µmol·min−1·mg−1 und der Km lag bei 13.6 ± 1.0 µM. Das spricht dafür,
dass die erniedrigte NADH-Oxidaseaktivität der Membranen dieser Mutante hauptsächlich
auf eine geringere Produktion der Variante zurückzuführen ist. Die kinetischen Parameter der
Variante G135DE konnte nicht aufgenommen werden, da die Aktivität im Laufe der Messung
stetig abnahm. Dies deutet auf eine Inhibition der Reaktion durch das produzierte NAD+ hin.
Diese eingeschränkte Aktivität zeigt die Bedeutung der konformativen Flexibilität der
Glu95E-Peptidbindung und unterstützt die Hypothese des „Au wurf-Mec ani mu ‟.
Die NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität der Varianten war im Vergleich zu
Komplex I unverändert (Tab. 4.19). Die NADH/HAR Oxidoreduktaseaktivität der Variante
G135SE war jedoch um 18% und die von G135DE um 87% im Vergleich zum Komplex I
verringert (Schulte, 2014). HAR kann nur in einem ternären Komplex, bestehend aus HAR,
reduziertem FMN und gebundenem NADH, reduziert werden (Birrell und Hirst, 2013). Daher
wird vermutet, dass durch die Mutationen die Verweildauer des NAD+ in der Bindetasche
verlängert wird.
Die EPR-spektroskopische Untersuchung der Variante G135DE zeigte, dass alle Fe/S-Zentren
durch NADH in einem geringeren Maß reduziert wurden als im Komplex I. Dies ist
wahrscheinlich auf die langsamere Umsetzung von NADH und die Reoxidation der Fe/SZentren zurückzuführen. Das Spektrum der mit Dithionit reduzierten Probe zeigt, dass alle
Fe/S-Zentren stöchiometrisch reduziert wurden. Für die Reaktion der Variante G135DE
konnten mit dem Radikalfänger DEPMPO keine ROS detektiert werden. Dies stimmt mit den
von Herrn Dipl.-Chem. Marius Schulte mit dem Amplex Red Assay bestimmten Werten
überein (Schulte, 2014).
In dieser Arbeit wurde durch Einführung von H-Brücken die Flexibilität der Peptidbindung
zwischen Glu95F und Ser96F eingeschränkt. Durch die Bestimmung der NADHOxidoreduktaseaktivitäten mit verschiedenen, artifiziellen Elektronenakzeptoren konnte
gezeigt wer en, a
ie F exibi i
er Pep i bin ung eine Ar „Auswurf-Mechanismus“ für
das produzierte NAD+ darstellt. Allerdings ist der Auslöser dieser konformativen Änderung
noch immer nicht identifiziert. Es könnte sich dabei um den Redox-Zustand des Zentrums
N1a handeln, da die Carbonyl-Gruppe über ein H2O-Molekül mit der Proteinschleife, die N1a
koordiniert, verbrückt ist. Für Flavodoxine wurde gezeigt, dass die Konformation einer
Peptidbindung in der Nähe zum FMN von der Oxidationsstufe des Kofaktors abhängt
(Ludwig et al., 1997). Bei diesen Proteinen zeigt in der reduzierten bzw. semichinoiden Form
154
Diskussion
der Peptid-Sauerstoff zum FMN hin und bildet eine H-Brücke zu dem protoniertem N5-Atom.
In der oxidierten Form zeigt der Peptid-Sauerstoff von dem FMN weg. Es wurde gezeigt, dass
die Orientierung des Peptidrückgrats die Mittenpunktspotentiale der verschiedenen FMNOxidationsstufen moduliert (Ludwig et al., 1997). Für Flavodoxin II aus Azotobacter
vinelandii wird angenommen, dass die Abwesenheit einer H-Brücke zum N5-Atom des FMNs
die oxidierte Form destabilisiert und so die Elektronenaufnahme erleichtert (Alagaratnam et
al., 2005). In Komplex I ist die von Glu95F und Ser96F gebildete Peptidbindung zu weit vom
FMN entfernt, als dass der Peptid-Sauerstoff von Glu95F direkt mit dem FMN wechselwirken
könnte. Allerdings befindet sich nahe am FMN ein H2O-Molekül, das in der oxidierten
Struktur des A. aeolicus NuoEFHis von der Seitenkette des Asp94F, den PeptidSauerstoffatomen von Tyr180F und Glu95F sowie dem O4-Atom des FMN über H-Brücken
gebunden wird (Abb. 2.14 A). In der Struktur des reduzierten Proteins zeigt der PeptidSauerstoff des Glu95F vom FMN weg, dadurch geht die H-Brücke zu diesem H2O-Molekül
verloren. Jedoch bildet dieses nun eine neue H-Brücke zum protonierten N5-Atom des FMNs
(Abb. 2.14 B). Diese H-Brücke könnte die semichinoide und vollreduzierte Form des FMNs
stabilisieren, so wie es bereits für Flavodoxine beschrieben wurde. Die in Kooperation mit
Dr. Judy Hirst durchgeführten Versuche mit der Variante V96P/N142ME zeigen, dass N1a in
der Variante nicht von NADH reduziert wird. Dennoch beträgt die NADH/HAR
Oxidoreduktaseaktivität noch ca. 70% des unveränderten Komplex I (Birrell et al., 2013).
Wäre N1a der Schalter für den Konformationswechsel, müsste diese Aktivität stärker
verringert sein. Es wird daher angenommen, dass die Änderungen des Redox-Zustands von
FMN die Orientierung der Peptidbindung vorgibt.
Um zu untersuchen, ob das strukturell konservierte H2O-Molekül das Mittenpunktspotential
von FMN moduliert, könnte in weiterführenden Arbeiten das Asp94F in dem A. aeolicus
Subkomplex NuoEFHis gegen verschiedene Aminosäuren ausgetauscht werden. Durch den
Austausch gegen Asn könnte die H-Brücke zum Wasser geschwächt werden. Der Austausch
gegen Glu könnte die Position des Wassers ändern, so dass dieses im reduzierten Protein
eventuell keine H-Brücke mehr zum N5-Atom des FMN bildet. Die Mutation gegen Ala oder
Gly könnte den Verlust dieses Wassers bedingen. Die Auswirkungen dieser Mutationen auf
die physiologische Aktivität des E. coli Komplex I müssten untersucht werden.
155
Diskussion
5.7 Oberflächen-Salzbrücke in NuoG
Das Fe/S-Zentrum N7 liegt in der C-terminalen Domäne von NuoG. Struktur- und
Sequenzanalysen haben gezeigt, dass die Domäne homolog zur Untereinheit NarG der
Nitratreduktase A ist (Chow et al., 1991; Finel, 1998; Rothery et al., 2008). Alle katalytischen
Untereinheiten der [Mo(MGD)2]-Enzymfamilie tragen an der Protein-Oberfläche eine von
einem Glu und einem Arg gebildete Salzbrücke. Eine von Arg280G und Glu617G gebildete
Salzbrücke befindet sich ebenfalls auf der Oberfläche von NuoG. Für die Nitratreduktase A
wurde gezeigt, dass eine Mutation die zum Verlust der Salzbrücke führt, in NarG die
Assemblierung der Kofaktoren dieser Untereinheit blockiert. In dieser Arbeit wurde die
Auswirkung der Mutation Glu617AlaG auf die Salzbrücke auf NuoG untersucht. Die Mutante
Glu617AlaG wurde angezogen und die Membranen präpariert. Die NADH-Oxidaseaktivität
der Membranen der Mutante war im Vergleich zu denen des unveränderten Stamms, um etwa
ein Drittel verringert. Durch eine Western Blot-Analyse wurde gezeigt, dass die Variante in
geringeren Mengen als der Komplex I produziert wurde. Daher ist die verringerte Aktivität
auf eine geringere Konzentration der Variante in der Membran zurückzuführen.
Durch Saccharosedichtegradienten-Zentrifugation wurde gezeigt, dass die Variante bei der
Extraktion mit DDM aus der Membran zerfiel. In den Komplex I-typischen Fraktionen war
für den Extrakt der Mutante kaum NADH/Ferricyanid Oxidoreduktaseaktivität nachzuweisen.
Der Versuch die Variante zu isolieren schlug fehl. In vorangegangen Arbeiten wurde gezeigt,
dass der Verlust des Zentrums N7 auf NuoG zum Zerfall des Komplexes bei der Extraktion
aus der Membran führt (Pohl et al., 2007b). Es wird daher angenommen, dass die fehlende
Salzbrücke ebenfalls zum Verlust des Zentrums führt. Dies unterstreicht die evolutionäre
Verwandtschaft von NuoG zu NarG. Ob die Fe/S-Zentren in NuoG ähnlich assembliert
werden wie das Zentrum FS0 und der [Mo(MGD)2]-Kofaktor in NarG bleibt zu untersuchen.
5.8 Zuordnung des EPR-Signals N4
In dieser Arbeit wurde versucht das EPR-Signal N4 den strukturell definierten Fe/S-Zentren
zuzuordnen. Dafür wurden die koordinierenden Aminosäuren von N4 und N5 jeweils gegen
Ala ausgetauscht. Anhand der NADH-Oxidaseaktivität der Membranen der Mutanten wurde
gezeigt, dass den Mutanten ein Fe/S-Zentrum im Komplex I fehlt und dadurch der
156
Diskussion
Elektronentransfer unterbrochen wurde. Nur die Variante C156AG wies in der Membran und
nach der Präparation noch 80% der NADH:Decyl-Ubichinon Oxidoreduktaseaktivität des
Komplex I auf (siehe unten).
Beim Versuch die Varianten zu präparieren, zerfielen die N5-Varianten C105AG, C108AG
und C114AG sowie die N4-Variante C203AG. Diese zerfallenen Komplexe zeigten keine
EPR-spektroskopisch eindeutigen Signale. Die N4-Varianten C153AG, C156AG, C159AG und
die N5-Variante H101AG konnten präpariert werden und die Präparationen zeigten Signale im
EPR-Spektrum, die den Fe/S-Zentren des Komplex I entsprachen.
In den Spektren der intakten Varianten war das EPR-Signal N4 eindeutig nachweisbar. Daher
kann ausgeschlossen werden, dass das Signal N4 von den strukturell definierten Zentren N4
oder N5 erzeugt wird. Das lässt vermuten, dass das Signal N4 von dem strukturell definierten
Fe/S-Zentrum N6a stammt, wie schon durch DEER-Experimente am mitochondrialen
Komplex I vorgeschlagen wurde (Roessler et al., 2010). Diese Ergebnisse decken sich
außerdem mit bereits veröffentlichten Experimenten, wobei das N6a koordinierende Cys63I
im E. coli Komplex I gegen Ser ausgetauscht wurde. Im EPR-Spektrum dieser Variante
konnte das Signal N4 nicht detektiert werden (Sinha et al., 2012).
Interessanterweise zeigte das EPR-Spektrum der hier hergestellten Variante C156AG bei 40 K
ein sehr schwaches Signal des Zentrums N1b. Durch Struktur- und Sequenzvergleiche wurde
His36G als möglicher neuer Ligand des strukturell definierten Zentrums N4 identifiziert. Die
durch das ligand swapping verursachten strukturellen Änderungen führten zu dem deutlichen
Verlust von N1b. Die Koordination des strukturell definierten Zentrums N4 in der Variante
müsste sich in einer Verschiebung der g-Werte des dazugehörigen EPR-Signals bemerkbar
machen, dies ist aber nicht der Fall. Dies deutet ebenfalls darauf hin, dass das Signal N4 nicht
von dem strukturell definierten Zentrum N4 stammt. Da der Abstand zwischen N3 und N5
unter 14 Å beträgt, ist ein Elektronentransfer im Komplex I auch ohne das Zentrum N1b
theoretisch möglich (Page et al., 1999; Sazanov, 2007). Diese Arbeit liefert anhand der
Aktivität der Variante C156AG einen experimentellen Hinweis darauf, dass dies wirklich
möglich ist. Die Variante trägt eine ungerade Anzahl an Fe/S-Zentren. Da NADH zwei
Elektronen auf das FMN überträgt, könnte dies bedeuten, dass das ein Elektron nun am FMN
lokalisiert ist. Dadurch könnte die ROS-Produktion dieser Variante stark erhöht sein. In
weiterführenden Arbeiten könnte für diese Variante die H2O2-Produktion pro umgesetztem
NADH-Molekül mit dem Amplex Red Assay bestimmt werden.
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172
Anhang
7 Anhang
7.1 H-Brücken Netzwerk um NAD+/NADH und FMN im A. aeolicus
NuoEFHis
Die
Tabellen
7.1 – 7.4
geben
das
H-Brücken
Netzwerk
in
erster
und
zweiter
+
Koordinationssphäre von NAD bzw. NADH und FMN im A. aeolicus Subkomplex NuoEFHis
wieder. Die H-Brücken wurden mit dem Programm UCSF Chimera nach den Kriterien von
Mills und Dean (1996) bestimmt (Pettersen et al., 2004). H2O-Moleküle sind mit Nummern
angeben. Konservierte H2O-Moleküle der Stuktur des oxidierten Proteins tragen in Klammern
die Nummer des H2O-Moleküls der Struktur des reduzierten Proteins und umgekehrt.
H-Brücken (HB) die nicht den exakten Kriterien nach Mills und Dean (1996) entsprechen sind
grau und für die Aktivität wichtige Aminosäuren sind gelb markiert. Sterische Abstoßungen
(SA) sind ebenfalls angegeben. Die Länge der HB bzw. der Abstand der SA sind angegeben.
Die Abbildungen 7.1 und 7.2 geben die Strukturen von NAD+/H und FMN sowie deren
Atomnummerierung wieder.
Abbildung 7.1: Struktur des NAD+ bzw. des NADH.
Abbildung 7.2: Struktur des FMN.
173
Anhang
Tabelle 7.1: H-Brücken Netzwerk des NAD+ im A. aeolicus Subkomplex NuoEFHis im oxidierten Zustand.
Erste Koordinationssphäre
Zweite Koordinationssphäre
Atom
NAD+
AO3'
InteraktionsPartner 1
Lys76F NZ
InteraktionsPartner 1
Lys76F N
Lys76F NZ
Lys76F O
Lys76F NZ
InteraktionsPartner 2
Pro72F O
Val218F O
Ala8 0F N
FMN O2P
AO2'
AO2'
AO3'
Glu185F OE1
Glu185F OE2
Glu185F OE1
HB 3.3
HB 2.6
HB 2.6
HB 2.4
Glu185F OE2
Glu185F O
Glu185F N
Glu185F OE1
HOH 483 (528)
Lys202F NZ
Ile189F N
FMN O2'
HOH 308 (103)
HOH 308 (103)
HB 2.9
HB 3.1
HB 3.0
HB 3.4
HB 2.8
AO2'
HOH 483 (528)
NO2'
NO2'
HOH 648
Gly68F O
HB 2.8
HB 3.3
HOH 648
Gly68F N
Glu97F OE1
HOH 129
HB 3.0
HB 2.7
NO3'
Gly68F O
HB 3.4
NO7
Glu95F O
SA 2.9
NO7
HOH 545
HB 2.5
NO1
HOH 145 (534)
HB 2.5
Glu95F O
Glu95F N
Glu95F OE2
Glu95F OE1
Glu95F OE1
Glu95F OE2
HOH 545
HOH 545
HOH 145 (534)
HOH 483 (528)
HOH 150 (6)
HOH 79 (527)
Asp103F N
Arg104F N
Tyr138F OH
HOH 61 (526)
HOH 61 (526)
HOH 241
Glu184F OE2
Gly394F N
HB 2.9
HB 3.1
HB 2.8
HB 3.2
HB 2.7
HB 2.7
HB 2.8
HB 2.9
HB 3.0
HB 2.9
NO2
NO2
FMN O2'
FMN O3'
HB 2.8
HB 2.6
AN3
HOH 483 (528)
HB 2.5
Abstand [Å]
HB 2.9
Abstand [Å]
HB 3.2
HB 2.9
HB 3.2
HB 3.2
Tabelle 7.2: H-Brücken Netzwerk des FMN im A. aeolicus Subkomplex NuoEFHis im oxidierten Zustand.
Erste Koordinationssphäre
Atom
FMN
O1P
InteraktionsPartner 1
Gly67F N
HOH 12 (18)
Zweite Koordinationssphäre
Abstand[Å]
HB 2.7
HB 2.7
O2P
Lys76F NZ
HB 3.2
O2P
O2P
HOH 134 (42)
HOH 514 (26)
HB 2.6
HB 2.7
O2P
Asn219F ND2
HB 3.4
174
InteraktionsPartner 1
InteraktionsPartner 2
Abstand [Å]
HOH 12 (18)
HOH 12 (18)
Ala69F N
HOH 514 (26)
HB 3.0
HB 2.8
Lys76F N
Lys76F NZ
Lys76F O
Lys76F NZ
HOH 134 (42)
HOH 134 (42)
HOH 514 (26)
Asn219F OD1
Pro72F O
Val218F O
Ala80F N
AO3' NAD+
Phe71F O
Thr73F OG1
Phe71F N
Trp77F NE1
HB 3.2
HB 2.9
HB 3.2
HB 2.9
HB 2.7
HB 3.2
HB 3.0
HB 3.0
Anhang
Tabelle 7.2; Fortsetzung.
O3P
Asn219F ND2
HB 2.9
O3P
Thr223F OG1
HB 2.6
O3P
Asn220F N
HB 2.9
O2
Asn220F ND2
HB 2.7
O2'
NAD+ NO2
HB 2.8
O3'
O3'
NAD+ NO2
HOH 12 (18)
HB 2.6
HB 2.9
O2'
Glu185F N
HB 3.4
O4
HOH 150 (6)
HB 3.2
N3
HOH 79 (527)
HB 3.2
Asn219F O
Asn219F N
Asn219F ND2
Thr223F OG1
Thr223F O
Asn220F OD1
Asn220F ND2
Asn220F OD1
Asn220F O
Asn92F N
Ile90F O
HOH 134 (42)
Arg66F N
Asn226F N
Lys102F NZ
Asp103F OD2
Glu222F N
Ile224F N
HB 2.8
HB 2.8
HB 3.2
HB 2.9
HB 3.1
HB 3.1
HB 2.9
HB 2.9
HB 3.2
HOH 12 (18)
HOH 12 (18)
Glu185F OE2
Glu185F O
Glu185F OE1
Glu185F OE1
Glu185F OE2
Glu185F OE1
HOH 150 (6)
HOH 150 (6)
HOH 150 (6)
HOH 79 (527)
HOH 79 (527)
HOH 79 (527)
Ala69F N
HOH 514 (26)
Lys202F NZ
Ile189F N
HOH 308 (103)
AO2' NAD+
AO2' NAD+
AO3' NAD+
Asp94F OD2
Glu95F O
Tyr180F O
Glu95F N
Asn92F O
Asp103F OD2
HB 3.0
HB 2.8
HB 2.9
HB 3.1
HB 3.4
HB 3.3
HB 2.6
HB 2.6
HB 2.4
HB 2.9
HB 2.8
HB 3.1
HB 2.7
HB 2.7
Tabelle 7.3: H-Brücken Netzwerk des NADH im A. aeolicus Subkomplex NuoEFHis im reduzierten
Zustand.
Erste Koordinationssphäre
Zweite Koordinationssphäre
AO3'
InteraktionsPartner 1
Lys76F NZ
Abstand
[Å]
HB 3.0
AO2'
AO2'
AO3'
Glu185F OE1
Glu185F OE2
Glu185F OE1
HB 3.3
HB 2.5
HB 2.6
AO2'
HOH 528 (483)
HB 2.7
NO2'
HOH 545
HB 2.7
NN7
HOH 526 (61)
HB 2.9
NN7
Gly67 O
HB 3.2
AN3
HOH 528 (483)
HB 3.0
Atom NADH
InteraktionsPartner 1
Lys76F N
Lys76F NZ
Lys76F O
Lys76F NZ
Glu185F OE2
Glu185F O
Glu185F N
Glu185F OE1
HOH 528 (483)
HOH 528 (483)
HOH 545
HOH 545
HOH 526 (61)
HOH 526 (61)
InteraktionsPartner 2
Pro72F O
Val218F O
Ala80F N
FMN O2P
HOH 540
Ile189F N
FMN O2'
HOH 103 (308)
HOH 103 (308)
AN3
Glu97F OE2
HOH 541
Glu95F OE2
Asp103F OD2
Abstand
[Å]
HB 3.3
HB 2.7
HB 3.4
HB 2.7
HB 2.7
HB 3.1
HB 3.0
HB 3.2
HB 2.9
HB 3.0
HB 2.9
HB 3.2
HB 2.7
HB 2.8
HOH 528 (483)
HOH 528 (483)
AO2'
HOH 103 (308)
HB 2.7
HB 2.9
175
Anhang
Tabelle 7.3; Fortsetzung.
NO7
Glu97F N
HB 3.0
NO1
HOH 534 (145)
HB 2.7
NO1
NO2
NO2
NO2
HOH 567
FMN O2'
FMN O3'
HOH 540
HB 2.7
HB 3.1
HB 2.7
HB 2.7
Glu97F O
Glu97F O
Glu97F OE2
Glu97F OE1
Glu97F OE2
Glu97F O
Glu97F OE1
Glu97F OE2
HOH 534 (145)
HOH 534
HOH 534 (145)
HOH 567
Thr100F N
Thr100F OG1
Tyr180F OH
Ala296F N
HOH 545
HOH 32
HOH 82
HOH 82
Gly394F N
Glu184F OE2
HOH 514
HOH 261
HB 3.0
HB 3.2
HB 2.7
HB 2.9
HB 2.9
HB 3.1
HB 2.7
HB 3.3
HB 3.1
HB 2.7
HB 2.7
HB 2.7
HOH 540
Glu185F OE2
HB 2.7
Tabelle 7.4: H-Brücken Netzwerk des FMN im A. aeolicus Subkomplex NuoEFHis im reduzierten Zustand.
Erste Koordinationssphäre
Zweite Koordinationssphäre
O1P
O1P
InteraktionsPartner 1
Gly67F N
HOH 18 (12)
O2P
Lys76F NZ
HB 2.7
O2P
HOH 26 (514)
HB 2.8
O2P
HOH 42 (134)
HB 2.7
O3P
Asn219F ND2
HB 2.7
O3P
HOH 42 (134)
HB 3.5
O3P
Thr223F OG1
HB 2.7
O3P
Asn220F N
HB 3.0
O2
Asn220F ND2
HB 2.7
O2'
Glu185F N
HB 3.0
Atom FMN
176
Abstand [Å]
HB 2.8
HB 2.8
InteraktionsPartner 1
InteraktionsPartner 2
Abstand [Å]
HOH 18 (12)
HOH 18 (12)
HOH 18 (12)
Lys76F N
Lys76F NZ
Lys76F O
Lys76F NZ
HOH 26 (514)
HOH 26 (514)
HOH 42 (134)
HOH 42 (134)
HOH 42 (134)
Asn219F OD1
Asn219F O
Asn219F N
Asn219F ND2
Thr223F OG1
Thr223F O
Asn220F ND2
Asn220F ND2
Ala69F N
HOH 26 (514)
O3'
Pro72F O
Val218F O
Ala80F N
AO3' NAD+
Phe71F N
HOH 18 (12)
Thr73F OG1
Phe71F O
Asn219F ND2
Trp77F NE1
Asn92F N
Ile90F O
HOH 42 (134)
Arg66F N
Asn226F N
Asn92F O
Asp103F OD2
HB 3.0
HB 2.7
HB 3.0
HB 3.3
HB 2.7
HB 3.4
HB 3.0
HB 2.9
HB 2.7
HB 2.9
HB 2.9
HB 2.9
HB 2.9
HB 2.8
HB 3.0
HB 2.9
HB 2.8
HB 3.2
HB 3.7
HB 2.8
Asn220F OD1
Asn220F O
Glu185F O
Glu185F OE1
Glu185F OE2
Glu185F OE1
Glu185F OE1
Glu185F OE2
Glu222F N
Ile224F N
Ile189F N
AO2' NADH
AO2' NADH
AO3' NADH
HOH 103 (308)
HOH 540
HB 3.0
HB 3.1
HB 3.1
HB 3.3
HB 2.5
HB 2.6
HB 3.2
HB 2.7
Anhang
Tabelle 7.3; Fortsetzung.
O2'
NADH NO2
HB 3.1
O3'
O3'
NADH NO2
HOH 18 (12)
HB 2.7
HB 3.0
O4'
Asn92F ND2
HB 2.9
O4
HOH 6 (150)
HB 2.8
N3
HOH 527 (79)
HB 2.9
N5
HOH 6 (150)
HB 3.0
HOH 18 (12)
HOH 18 (12)
HOH 18 (12)
Asn92F N
Asn92F O
Asn92F OD1
Asn92F ND2
Asn92F O
Asn92F O
HOH 6 (150)
HOH 6 (150)
HOH 6 (150)
HOH 527 (79)
HOH 527 (79)
HOH 527 (79)
Ala69F N
HOH 26 (514)
O1P
Asn219F O
Asn220F ND2
Asp94F N
Gly183F O
Val221F N
HOH 527 (79)
Asp94F OD2
Tyr180F O
N5
Glu95F N
Asn92F O
Asp103F OD2
HB 3.0
HB 2.7
HB 2.8
HB 2.8
HB 3.7
HB 3.3
HB 2.8
HB 3.4
HB 2.8
HB 2.7
HB 2.9
HB 3.0
HB 3.1
HB 2.8
HB 2.6
177
Anhang
7.2 Kristallisations-screens
Tabellen 7.5 und 7.6 gibt die fine-screens zur Kristallisation von E185AF und E185GF wieder.
Tabelle 7.5: Fine-screens um Sphärolith-Bedingungen zur Kristallisation von E185GF. Alle Bedingungen
waren auf pH 7.0 eingestellt. Alle Bedingungen enthielten PEG 3350 (PEG).
1
2
3
4
5
6
A
18% PEG
0.1 M
Äpfelsäure
20% PEG
0.1 M
Äpfelsäure
22% PEG
0.1 M
Äpfelsäure
18% PEG
0.1 M
Na3Citrat
20% PEG
0.1 M
Na3Citrat
22% PEG
0.1 M
Na3Citrat
B
18% PEG
0.15 M
Äpfelsäure
20% PEG
0.15 M
Äpfelsäure
22% PEG
0.15 M
Äpfelsäure
18% PEG
0.15 M
Na3Citrat
20% PEG
0.15 M
Na3Citrat
22% PEG
0.15 M
Na3Citrat
C
18% PEG
0.2 M
Äpfelsäure
20% PEG
0.2 M
Äpfelsäure
22% PEG
0.2 M
Äpfelsäure
18% PEG
0.2 M
Na3Citrat
20% PEG
0.2 M
Na3Citrat
22% PEG
0.2 M
Na3Citrat
18% PEG
5% Tacsimat
20% PEG
5% Tacsimat
22% PEG
5% Tacsimat
18% PEG
0.4 M
Na3Citrat
20% PEG
0.4 M
Na3Citrat
22% PEG
0.4 M
Na3Citrat
D
Tabelle 7.6: Fine-screens um Phosphat-Bedingung zur Kristallisation von E185AF.
A
B
C
D
178
1
2
3
4
5
6
0.08 M
NaH2PO4,
0.72 M K2HPO4
Σ 0.8M
0.16 M
NaH2PO4,
0.64 M
K2HPO4
0.2 M
NaH2PO4,
0.8 M
K2HPO4
0.24 M
NaH2PO4,
0.96 M
K2HPO4
0.3 M
NaH2PO4,
1.2 M
K2HPO4
0.24 M
NaH2PO4,
0.56 M
K2HPO4
0.3 M
NaH2PO4,
0.7 M
K2HPO4
0.36 M
NaH2PO4,
0.84 M
K2HPO4
0.45 M
NaH2PO4,
1.05 M
K2HPO4
0.32 M
NaH2PO4,
0.48 M
K2HPO4
0.4 M
NaH2PO4,
0.6 M
K2HPO4
0.48 M
NaH2PO4,
0.72 M
K2HPO4
0.6 M
NaH2PO4,
0.9 M
K2HPO4
0.4 M
NaH2PO4,
0.4 M
K2HPO4
0.5 M
NaH2PO4,
0.5 M
K2HPO4
0.6 M
NaH2PO4,
0.6 M
K2HPO4
0.75 M
NaH2PO4,
0.75 M
K2HPO4
0.48 M
NaH2PO4,
0.32 M
K2HPO4
0.6 M
NaH2PO4,
0.4 M
K2HPO4
0.72 M
NaH2PO4,
0.48 M
K2HPO4
0.9 M
NaH2PO4,
0.6 M
K2HPO4
0.1 M NaH2PO4,
0.9 M K2HPO4
Σ 1M
0.12 M
NaH2PO4,
1.08 M K2HPO4
Σ 1.2 M
0.15 M
NaH2PO4,
1.35 M K2HPO4
Σ 1.5 M
Anhang
7.3 Kristallographische Statistiken
Tabelle 7.7: Röntgendaten, Prozessierung und refinement Statistiken der Variante E185DF und E185HF.
Die statistischen Werte wurden den, aus der Prozessierung resultierenden Proteindatenbank-Dateien (*.pdb) und
den Protokolldateien der Programme Scala (Evans, 2006), XDS (Kabsch, 2009), PROCHECK (CCP4)
entnommen.
E185DF
P 21 21 21
62.1; 115.8; 190.9;
90; 90; 90
E185HF
P 21 21 21
63.3; 116.3; 190.6;
90; 90; 90
Auflösungsgrenze (Å)
Auflösungsbereich (Å)
Gesamte Vollständigkeit
der Reflexe (%)
2.40
99.0 – 2.4
98.73
2.20
99.20 – 2.20
80.72
Anzahl einzigartiger Reflexe
I/σ I)
Rmerge (% ) 1
Rgesamt (%) 2
84765
1.98
22.8
26.12
55576
23.69
Rfrei (%)
28.43
31.23
0.0084
1.3459
0.020
2.218
In den bevorzugtesten Regionen (%)
97.4
88.9
In zusätzlich erlaubten Regionen (%)
In großzügig erlaubten Regionen (%)
In unerlaubten Regionen (%)
2.4
0.2
-
8.7
1.6
0.8
Raumgruppe
Zellkonstanten a; b; c (Å)
α β γ °)
R.m.s. Abweichung der Idealwerte
Bindungslängen (Å)
Bindungswinkel (°)
Φ, Ψ, Winkelverteilung
fürAminosäurereste 3
1 Rmerge =
2 Rgesamt =
Rfrei ist der Vergleichsprüfungs R-Faktor für einen Prüfsatz von 5% der einzigartigen Reflexe
3 Ramachandran Statistiken, die über PROCHECK definiert wurden
179
Anhang
Tabelle 7.8: Röntgendaten, Prozessierung und refinement Statistiken der Variante E185DF mit
gebundenem NAD+. Die statistischen Werte
wurden den, aus der Prozessierung resultierenden
Proteindatenbank-Dateien (*.pdb) und den Protokolldateien der Programme Scala (Evans, 2006), XDS (Kabsch,
2009), PROCHECK (CCP4) entnommen.
Raumgruppe
Ze k n an en a b c α β γ Å; °)
P 21 21 21
62.3; 116.0; 190.4; 90; 90; 90
Auflösungsgrenze (Å)
1.8
Auflösungsbereich (Å)
99.0 – 1.8
Gesamte Vollständigkeit der Reflexe (%)
99.6
Anzahl einzigartiger Reflexe
128547
Multiplizität
2.0
I/σ I)
4.43 (0.69)
4
Rmerge (% )
1
34.1
Rgesamt (%)
2
18.2
Rfrei (%)
22.5
R.m.s. Abweichung der Idealwerte
Bindungslängen (Å)
0.01
Bindungswinkel (°)
Φ, Ψ, Winkelverteilung fürAminosäurereste
1.04
3
In den bevorzugtesten Regionen (%)
91.8
In zusätzlich erlaubten Regionen (%)
7.8
In großzügig erlaubten Regionen (%)
0.4
In unerlaubten Regionen (%)
-
1 Rmerge =
2 Rgesamt =
Rfrei ist der Vergleichsprüfungs R-Faktor für einen Prüfsatz von 5% der einzigartigen Reflexe
3 Ramachandran Statistiken, die über PROCHECK definiert wurden
4 Die Zahl in Klammer beschreibt die höchste Auflösungsschale
180
Anhang
Tabelle 7.9: Röntgendaten, Prozessierung und refinement Statistiken der Variante G129DE mit
gebundener ADP-Ribose. Die statistischen Werte wurden den, aus der Prozessierung resultierenden
Proteindatenbank-Dateien (*.pdb) und den Protokolldateien der Programme Scala (Evans, 2006), XDS (Kabsch,
2009), PROCHECK (CCP4) entnommen.
Raumgruppe
Ze k n an en a b c α β γ Å; °)
P1211
63.38; 92.86; 124.51; 107.22; 90.03; 90.01
Auflösungsgrenze (Å)
1.85
Auflösungsbereich (Å)
38.97 – 1.85
Gesamte Vollständigkeit der Reflexe (%)
89.0
Anzahl einzigartiger Reflexe
118104
Multiplizität
2.33
I/σ I)
1.39
4
Rmerge (% )
1
33.05
Rgesamt (%)
2
32.1
Rfrei (%)
36.9
R.m.s. Abweichung der Idealwerte
Bindungslängen (Å)
0.012
Bindungswinkel (°)
Φ, Ψ, Winkelverteilung fürAminosäurereste
1.24
3
In den bevorzugtesten Regionen (%)
91.4
In zusätzlich erlaubten Regionen (%)
8.2
In großzügig erlaubten Regionen (%)
0.4
In unerlaubten Regionen (%)
-
1 Rmerge =
2 Rgesamt =
Rfrei ist der Vergleichsprüfungs R-Faktor für einen Prüfsatz von 5% der einzigartigen Reflexe
3 Ramachandran Statistiken, die über PROCHECK definiert wurden
4 Die Zahl in Klammer beschreibt die höchste Auflösungsschale
181
Anhang
Tabelle 7.10: Röntgendaten, Prozessierung und refinement Statistiken der Variante G129SE. Die
statistischen Werte wurden den, aus der Prozessierung resultierenden Proteindatenbank-Dateien (*.pdb) und
PROCHECK (CCP4) entnommen.
Raumgruppe
Zellkonstanten a; b; c (Å)
α β γ °)
Auflösungsgrenze (Å)
P 21 21 21
62.8; 113.0; 188.1
90; 90; 90
2.44
Auflösungsbereich (Å)
52.71 – 2.44
Gesamte Vollständigkeit der Reflexe (%)
92.13
Anzahl einzigartiger Reflexe
44309
Rgesamt (%)
1
28.39
Rfrei (%)
34.07
R.m.s. Abweichung der Idealwerte
Bindungslängen (Å)
0.011
Bindungswinkel (°)
Φ, Ψ, Winkelverteilung für Aminosäurereste
2.742
2
In den bevorzugtesten Regionen (%)
88.5
In zusätzlich erlaubten Regionen (%)
9.5
In großzügig erlaubten Regionen (%)
1.1
In unerlaubten Regionen (%)
0.8
1 Rgesamt =
Rfrei ist der Vergleichsprüfungs R-Faktor für einen Prüfsatz von 5% der einzigartigen Reflexe
2 Ramachandran Statistiken, die über PROCHECK definiert wurden
182
Danksagung
Ich möchte mich hier bei meinem Doktorvater Prof. Dr. Thorsten Friedrich für die Bereitstellung der
interessanten Themen und die vielen hilfreichen Anregungen und Diskussionen im Rahmen dieser
Arbeit bedanken. Zudem bedanke ich mich herzlichst für sein stets offenes Ohr (und offene Tür!) und
die sehr angenehme Arbeitsatmosphäre.
Bei Prof. Dr. Oliver Einsle bedanke ich mich herzlich für die Übernahme des Korreferats, die große
Hilfe bei der Proteinkristallographie und die Bereitstellung der Gerätschaften für die selbige.
Dr. Stefan Gerhardt danke ich herzlich für die vielen Tipps und die Hilfe bei der Kristallographie.
Meinen Kooperationspartnern Dr. Judy Hirst, Dr. James Birrell, Dr. Lothar Kussmaul und M. Sc.
Biochemie Karoline Aierstock danke ich herzlich für die nette und fruchtbare Zusammenarbeit.
Frau Dörte Thiel möchte ich für ihre tatkräftige Unterstützung im Labor und organisatorischen
Arbeiten des Alltags danken. Unseren Damen im Büro: Frau Linda Williams, Frau Christiane
Zähringer-Steffens und Frau Angelika Maßler gilt ein ganz lieber Dank für ihre Hilfe in allen
bürokratischen Angelegenheiten.
Ein besonderer Dank gilt Frau Helga Lay, die selbst über den Ruhestand hinaus eine unverzichtbare
Hilfe beim Umzug des Labors, bei kleinen Fragen des Uni-Alltags und eine sehr nette Gesellschaft
beim Kaffee trinken war.
Christina Kress-Metzler danke ich für die sehr netten und hilfreichen Gespräche.
Ich bedanke mich herzlichst bei den von mir betreuten Diplomanden, Master-Absolventen und
Lehramtskandidaten Florian Hubrich, Therese Engel, Doris Kreuzer Deković, Sa c a Jurk vic,
Emmanuel Gnandt, Manuel Schäuble, Ina Psarjow (du weißt) und Sabrina Burschel für ihre tatkräftige
Unterstützung. Auch den von mir betreuten Bachelor-Absolventen und Praktikanten Sven Käfer,
Uljana Botscharowa und Sabrina Burschel gilt ein großer Dank. Die Arbeit mit euch hat mir großen
Spaß gemacht!
Meinen Mitdoktoranden Katerina Dörner, Heiko Erhardt, Udo Glessner, Marta Vranas, Stefan
Steimle, Doris Kreuzer Dek vić, Jo Hoeser und unseren "ganz jungen" Emmanuel Gnandt, Sascha
Jurkovic, Ina Psarjow und natürlich Sabrina Burschel danke ich für die tolle, hilfsbereite Atmosphäre
und die echt guten Partys!!! Die Mensa-Runde sei hier noch einmal besonders erwähnt..... ;-)!!!
Ein ganz herzlicher Dank geht an meinen Mitstreiter seit der Diplomarbeit Marius Schulte. Unsere
nächtlichen Labor-Sessions werden mir bestimmt fehlen! Mit Dir war es nur halb so schlimm!!!
Meinen Mädels: Danke, dass es euch gibt!!
Meiner gesamten Familie, vor allem meiner Mutter danke ich aus tiefstem Herzen für ihren Rückhalt
und ihre Unterstützung in allen Lebenslagen. Meinen süßen Nichten dafür, dass sie mich die Welt mit
ihren Augen sehen lassen.
Ed danke ich einfach für alles!