Ulrich_Adeno-DNA-Tumorviren_WS2016 4 MB

Vorlesung: „Molekulare Virologie“, WS 2016/2017
Adenoviren und DNA-Tumorviren
Rainer G. Ulrich
Friedrich-Loeffler-Institut
Institut für neue und neuartige Tierseuchenerreger
D-17493 Greifswald - Insel Riems
[email protected]
1. EINLEITUNG
(Nichttaxonomische) Klassifizierung von Viren
nach infiziertem Wirt: Bakterien, Pflanzen, Pilze, Tiere, Mensch
DNA-Viren bei Wirbellosen und Wirbeltieren
Struktur und Klassifizierung von DNA-Viren
Klassifikation von Viren nach der Art der mRNASynthese (Baltimore-Klassifikation)
Gruppe I: dsDNA. Genomform aller
Lebewesen (Papilloma-,
Polyoma-, Adeno-, Herpes-,
Poxviridae)
Gruppe II: ssDNA. Enthält DNA sowohl
positiver als auch negativer
Polarität (Parvoviridae)
Gruppe III: dsRNA (Reoviridae)
Gruppe IV: (+)ssRNA. Sie wirkt direkt als
mRNA (Picorna-, Toga-, Flavi-,
Calici-, Coronaviridae)
Gruppe V: (-)ssRNA. Sie wirkt als Matrize
zur mRNA-Synthese (Bunya-,
Arena-, Rhabdo-, Paramyxo-,
Orthomyxo-, Filoviridae)
Gruppe VI: (+)ssRNA, die in DNA
zurückgeschrieben und ins
Zellgenom eingebaut wird
(Retroviridae)
Kleine DNA-Viren und Adenoviren: Übersichtstabelle
Virusfamilie
Virusgröße
Genom
Genomlänge
Kodierungsstrategie
Hülle
Kapsid
Parvoviridae
18-26 nm
ssDNA, linear
4,8-5,6 kB
eine Leserichtung,
überlappende ORF
keine
ikosaedrisch,
VP1, VP2, (VP3)
Polyomaviridae
40-45 nm
dsDNA, zirkulär
ca. 5,2 kBp
ambisense,
überlappende ORF
keine
ikosaedrisch,
VP1, VP2, VP3
Papillomaviridae
55 nm
dsDNA, zirkulär
ca. 8 kBp
eine Leserichtung,
überlappende ORF
keine
ikosaedrisch,
L1, L2
Replikation
„rolling hairpin“Modell
Zellkern
zelluläre DNAPolymerase
Tröpfchen,
fäkal-oral,
vertikal,
Blutprodukte
hoch
Parvovirus B19,
Humanes Bocavirus,
(Parv4)
bidirektional,
semikonservativ
Zellkern
zelluläre DNAPolymerase
Schmierinfektion
bidirektional,
semikonservativ
Zellkern
zelluläre DNAPolymerase
Hautkontakt, sexuell,
perinatal
(hoch)
JCPyV, BKPyV,
WU-PyV, KI-PyV,
MCPyV und 8
weitere (2016)
PML bei HIVInfektion, Organabstoßung nach
Nierentransplantation
hoch
HPV 1-210 (24.05.
2016)
Replikationsort
Replikationsenzym
Übertragung
Wirtsspezifität
Humanpathogene Vertreter
Erkrankungen
Ringelröteln,
Erkrankungen des
Respirationstraktes
und des Gastrointestinaltraktes
Papillome,
Karzinome
Adenoviridae
80-110 nm
dsDNA, linear
36-38 kBp
ambisense,
überlappende ORF
keine
ikosaedrisch,
Pentonbasisprotein
(pIII), Fiberprotein (pIV),
Hexonprotein (pII), u.a.
semikonservativ
Zellkern
virale DNAPolymerase
Aerosol, fäkal-oral,
kontaminierte
Gegenstände und
Flüssigkeiten
niedrig
Arten (Subgenera) A-G,
Serotypen (HAdV) 1-53
Erkältungen und andere
Erkrankungen des
Respirationstraktes,
gastrointestinale Erkrankungen,
Keratokonjunktivitis
2. FAMILIE ADENOVIRIDAE
Familie Adenoviridae
Genus
Mensch
Tier
Mastadenovirus
Spezies A-G,
Serotypen
HAdV-1 bis -53
Adenoviren von Rind,
Schwein, Hund, Affe,
Pferd, Nagetieren
Aviadenovirus
Adenoviren der Vögel
Atadenovirus
Adenoviren von Schlange,
Ente, Opossum, Schaf,
Ziege, Rind
Siadenovirus
Adenoviren von Frosch,
Pute, Fasan
Phylogenetische Verwandtschaft von Adenoviren
Neuer Adenovirusserotyp – HAdV-52
Adenoviren: Eigenschaften
Aufbau und Größe:
Ikosaedrisch
ca. 80-110 nm
Membran:
Nicht vorhanden
Capsid:
252 Capsomere:
240 Hexone
12 Pentone + Fiber
Genom:
Lineare dsDNA, 35-38 kbp
Hohe genetische Stabilität
Wirtsspezifität:
niedrig
Adenoviren: Struktur des Kapsids
Adenoviren: Struktur des Kapsids
Genomorganisation
Genomorganisation: Ambisense-Kodierung
Genomorganisation bei den AdV-Genera
Replikationszyklus der Adenoviren
DNA-Replikation der Adenoviren
Hauptprodukte der E1-Region (IE-Region)
Eigenschaften und Funktionen von Adenovirusproteinen
Proteine
Molekular
gewicht
Modifikation
E1A
1.40 kD
phosphoryliert
Sehr frühes Protein; Transaktivator, Zinkfingermotiv, Bindung an
Histon-Acetyltransferasen; Bindung an Tumorsuppressorprotein
Rb105; Transformation zusammen mit E1B
E1B
1.55 kD
phosphoryliert
Sehr frühes Protein; Bindung an p53, Transformation zusammen mit
E1A; Regulation des RNA-Transports zusammen mit E4/34 kD
E2A
72 kD
phosphoryliert
Bindet an einzelsträngige DNA; aktiv bei DNA-Replikation
E2B
80 kD
E4-ORF1
140 kD
125 AS
Funktion
Vorläuferprotein des terminalen Proteins; TP ist kovalent gebunden;
wirkt als Primer bei der Initiation der DNA-Synthese
Virale DNA-Polymerase
Induktion von Mammatumoren bei HAdV-9 infizierten Ratten
E4-ORF2
17 kD
136 AS
Cytoplasmatisches Protein; Funktion unbekannt
E4-ORF3
11 kD
Wirkt zusammen mit E4-ORF6 und E1B/55 kD bei der Regulation des
mRNA-Transports
E4-ORF4
14 kD
Bindet an Proteinphosphatase 2A, beeinflusst Phosphorylierung zellulärer
und viraler Proteine, wirkt so regulierend auf die Transkription zellulärer
und viraler Proteine
E4-ORF6
34 kD
Interaktion mit E1B/55 kD und Abbau von p53, Regulation des mRNATransports vom Kern ins Cytoplasma; verstärkt die E1A- und E1Bvermittelte Transformation
E3-Region: Funktion der Proteinprodukte
Eigenschaften und Funktionen von Adenovirusproteinen
Proteine
Molekular
gewicht
Modifikation
E1A
1.40 kD
phosphoryliert
Sehr frühes Protein; Transaktivator, Zinkfingermotiv, Bindung an HistonAcetyltransferasen; Bindung an Tumorsuppressorprotein Rb105;
Transformation zusammen mit E1B
E1B
1.55 kD
phosphoryliert
Sehr frühes Protein; Bindung an p53, Transformation zusammen mit E1A;
Regulation des RNA-Transports zusammen mit E4/34 kD
E2A
72 kD
phosphoryliert
Bindet an einzelsträngige DNA; aktiv bei DNA-Replikation
E2B
80 kD
E4-ORF1
140 kD
125 AS
Funktion
Vorläuferprotein des terminalen Proteins; TP ist kovalent gebunden; wirkt
als Primer bei der Initiation der DNA-Synthese
Virale DNA-Polymerase
Induktion von Mammatumoren bei HAdV-9 infizierten Ratten
E4-ORF2
17 kD
136 AS
Cytoplasmatisches Protein; Funktion unbekannt
E4-ORF3
11 kD
Wirkt zusammen mit E4-ORF6 und E1B/55 kD bei der Regulation des
mRNA-Transports
E4-ORF4
14 kD
Bindet an Proteinphosphatase 2A, beeinflusst Phosphorylierung
zellulärer und viraler Proteine, wirkt so regulierend auf die
Transkription zellulärer und viraler Proteine
E4-ORF6
34 kD
Interaktion mit E1B/55kD und Abbau von p53, Regulation des mRNATransports vom Kern ins Cytoplasma; verstärkt die E1A- und E1Bvermittelte Transformation
Eigenschaften und Funktionen von Adenovirusproteinen
Proteine
Molekular
gewicht
Modifikation
Funktion
L-Bereich
L3-pII
120 kD
Hexonprotein, im Capsomer als Trimer; induziert Bildung gruppenspezifischer Antikörper
L2-pIII
80 kD
Pentonbasisprotein, Homopentamer
L3-pIIIa
66 kD
phosphoryliert
L5-pIV
62 kD
glycosyliert
Fiberprotein; liegt in der Fiber als Trimer vor; induziert Bildung
virusspezifischer Antikörper
L2-pV
48.5 kD
phosphoryliert
Nukleocapsidkomponente; interagiert mit dem Genom und der
Innenseite des Capsids
L3-pVI
23.4 kD
phosphoryliert
Hexonassoziiertes Protein; an der Innenseite des Capsids lokalisiert
L3 Protease
(Adenain)
23 kD
pIX
11.5 kD
Hexonassoziiert; an den Kontaktstellen der Hexoncapsomere
pXI/pXII
4.5/3 kD
Hexonassoziiert; an den Kontaktstellen der Hexoncapsomere
Pentonassoziiertes Protein
Cysteinprotease; Freisetzung der Viruspartikel aus dem Endosom
Nichtstruktur
proteine
L4-100 kD
pIVa2
Spätes Nichtstrukturprotein; Chaperon, aktiv bei Hexonassembly
50 kD
Spätes Nichtstrukturprotein; Chaperon, aktiv bei Morphogenese
33 kD
Spätes Nichtstrukturprotein; Chaperon, aktiv bei Morphogenese
Adenovirus-assoziierte RNA
Adenovirus-assoziierte RNA
VA-RNA:
● zwei Gene für kleine, nicht Protein kodierende RNAs (VARNA I und VA-RNA II)
● durch RNA-Polymerase III transkribiert
●160 nt lange RNAs mit ausgeprägter Sekundärstruktur
● VA-RNA I hemmt die zelluläre Proteinkinase R
(PKR, dsRNA-aktivierte Proteinkinase) und reguliert darüber
die Translation viraler Polypeptide
● VA-RNA I und VA-RNA II hemmen in der späten
Phase des Infektionszyklus die Regulation durch RNAInterferenz (mivaRNAs)
Humane AdV: Epidemiologie und Übertragung
Epidemiologie: ● weltweit verbreitet
● epidemisches, endemisches und
sporadisches Auftreten
Übertragung:
● Aerosole
● Kontaminierte Gegenstände und
Flüssigkeiten
● Fäkal-oral
Humane Adenoviren
Pathogenese:
- infizieren bevorzugt Epithelzellen des Pharynx,
Dünndarms sowie Konjunktivalzellen
- Persistenz einiger Serotypen in Tonsillen und
benachbarten Lymphknoten
Klinik:
- Erkältungen und andere Erkrankungen des
Respirationstraktes, Keratokonjunktivitis,
gastrointestinale Erkrankungen
- 50% der Infektionen verlaufen asymptomatisch
- Bedeutung bei immunsupprimierten Patienten
Humane Adenoviren: Diagnostik
1. Virusnachweis in Zellkultur
2. Nachweis von IgM-Antikörpern gegen die
viralen Strukturproteine
3. Nachweis Spezies-spezifischer Antikörper
mittels Immunoblot
4. Nachweis Serotyp-spezifischer Antikörper
mittels NT und HHT
5. Nachweis viraler Nukleinsäure mittels PCR
Humane Adenoviren: Prophylaxe und Therapie
Impfstoffe: Impfung gegen HAdV-4 und -7 beim
Personal des US-Militärs (Lebendvakzine,
nur für US-Streitkräfte zugelassen)
Therapie: Cidofovir
Interferon-β (bei schwerer Keratokonjunktivitis)
Ribavirin (für alle Vertreter der Spezies C, die
meisten Vertreter der Spezies A, B und D)
Gentherapievektoren: Vor- und Nachteile
Charakteristika
Retrovirus
Adenovirus
Wildtypvirus
Einzelsträngige
RNA, 9.2 kb
Doppelsträngige
DNA, 36 kb
Adeno-assoziiertes
Virus
Einzelsträngige DNA,
5 kb
Insertionsgröße
8 kb
7.5 kb
4.5 kb
Titer (colony forming
units/ml)
106-107
108-1010
106-108
Zielzellen
Nur
teilungsfähige
Zellen
Teilungsfähige und
nicht teilungsfähige
Zellen
Teilungsfähige und
nicht teilungsfähige
Zellen
Genexpressionsdauer
Langfristig
Transient
Transient bis
langfristig
Hoch
Mäßig
Genexpressionsausmaß Mäßig
Mögliche Hürden
Mutationen nach Immunantwort des
Insertion
Wirtes
Toxizität viraler
Proteine, Mutationen
nach Insertion
Mögliche
Wirtsimmunität
Nein
Ja
Ja
Replikationskompetent Nein
Eventuell
Ja
Virale Proteinexpression Nein
Ja
Nein
Entnommen aus N. Grewe (2005). Dissertation, Charité, Berlin
Adenoviren als Vektoren
Adenoviren als Vektoren: 1. Generation
- Deletion der E1-Region (Einbau heterologer Gene von
bis zu 4,7 kbp)
- Verpackungszelllinie (E1-Transkomplementation)
Problem: Bildung replikationsfähiger Adenoviren
Adenoviren als Vektoren: 2. Generation
- Umbau des E1-Deletionsvektors (E4-Region upstream von E1)
- bei Rekombination Verlust von E4
Adenoviren als Vektoren: 3. Generation
- nur inverted terminal repeats (ITR) und Signale für die
Verpackung der Virus-DNA im Vektor
ABER:
- viele virale Genprodukte bei Überexpression
für Zellen toxisch
- Problem bei der Etablierung von Verpackungszelllinien, die stabil rekombinante Viren
produzieren
Kleine DNA-Viren und Adenoviren: Übersichtstabelle
Virusfamilie
Virusgröße
Genom
Genomlänge
Kodierungsstrategie
Hülle
Kapsid
Parvoviridae
18-26 nm
ssDNA, linear
4,8-5,6 kB
eine Leserichtung,
überlappende ORF
keine
ikosaedrisch,
VP1, VP2, (VP3)
Polyomaviridae
40-45 nm
dsDNA, zirkulär
ca. 5,2 kBp
ambisense,
überlappende ORF
keine
ikosaedrisch,
VP1, VP2, VP3
Papillomaviridae
55 nm
dsDNA, zirkulär
ca. 8 kBp
eine Leserichtung,
überlappende ORF
keine
ikosaedrisch,
L1, L2
Replikation
„rolling hairpin“Modell
Zellkern
zelluläre DNAPolymerase
Tröpfchen,
fäkal-oral,
vertikal,
Blutprodukte
hoch
Parvovirus B19,
Humanes Bocavirus,
(Parv4)
bidirektional,
semikonservativ
Zellkern
zelluläre DNAPolymerase
Schmierinfektion
bidirektional,
semikonservativ
Zellkern
zelluläre DNAPolymerase
Hautkontakt, sexuell,
perinatal
(hoch)
JCPyV, BKPyV,
WU-PyV, KI-PyV,
MCPyV und 8
weitere (2016)
PML bei HIVInfektion, Organabstoßung nach
Nierentransplantation
hoch
HPV 1-210 (24.05.
2016)
Replikationsort
Replikationsenzym
Übertragung
Wirtsspezifität
Humanpathogene Vertreter
Erkrankungen
Ringelröteln,
Erkrankungen des
Respirationstraktes
und des Gastrointestinaltraktes
Papillome,
Karzinome
Adenoviridae
80-110 nm
dsDNA, linear
36-38 kBp
ambisense,
überlappende ORF
keine
ikosaedrisch,
Pentonbasisprotein
(pIII), Fiberprotein (pIV),
Hexonprotein (pII), u.a.
semikonservativ
Zellkern
virale DNAPolymerase
Aerosol, fäkal-oral,
kontaminierte
Gegenstände und
Flüssigkeiten
niedrig
Arten (Subgenera) A-G,
Serotypen (HAdV) 1-53
Erkältungen und andere
Erkrankungen des
Respirationstraktes,
gastrointestinale Erkrankungen,
Keratokonjunktivitis
3. DNA-TUMORVIREN
Onkogene Viren
Viren, die – neben ihren charakteristischen
Viruseigenschaften die Fähigkeit besitzen, normale Zellen in Tumorzellen
umzuwandeln.
Immortalisierung und maligne Transformation
Tumorviren: eine Übersicht
I. RNA-Viren
Retroviridae
- akut transformierende (transduzierende) Retroviren/Oncornaviren
- Genus Deltaretrovirus: Langsam transformierende Viren (HTLV-1, HTLV-2)
Flaviviridae (Hepatitis C-Virus)
II. DNA-Viren
Hepadnaviridae (Hepatitis B-Virus)
Polyomaviridae (Merkelzell-Polyomavirus)
Papillomaviridae (z.B. HPV-16 und HPV-18)
Adenoviridae
Herpesviridae (EBV=HHV-4, KSHV=HHV-8)
Onkogenität von Adenoviren in Nagetieren
Spezies
Serotyp
Onkogenität (Tier)
Zelltransformation
A
12, 18, 31
hoch (Sarkome)
+
D
9, 10
hoch (Adenome)
+
B
3, 7, 11
gering (Sarkome)
+
C-F
alle anderen
keine
+
Tumorentstehung: multifaktorieller und mehrstufiger Prozess
Chemikalien,
Strahlung,
virale Faktoren
Zellzyklus
Tumorsuppressor-Proteine
Zellzyklus-kontrollierende Proteine, die von einer bestimmten
Klasse zellulärer Proteine gebildet werden.
Proteine, welche in die negative Regulation des Zellzyklus
involviert sind (Halten in der G1-Phase).
50% der Tumoren, einschließlich der durch Viren induzierten,
werden durch veränderte Tumorsuppressorgene verursacht.
Bei einer Veränderung des Proteins (mit Funktionsverlust)
kommt es zu einer nicht gegenregulierten Wachstumsstimulation.
Tumorsuppressor-Proteine
Tumorsuppressor-Protein p53
- Aktivität in der späten G1-Phase des Zellzyklus
(G1-Arretierung): kein Übergang zur S-Phase
- Unterstützung der Einleitung der Apoptose
- Core-Domäne des p53 ist extrem sensitiv für Aminosäureaustausche (Funktionsverlust)
- Funktionsverlust durch Aminosäureaustausche oder Wechselwirkung mit viralen Proteinen
Eigenschaften der onkogenen
DNA-Viren
- die für die Transformation verantwortlichen Gene haben kein
zelluläres Homolog
- Viren besitzen eine geringe Transformationsrate (10-5)
- die für die Transformation verantwortlichen viralen Proteine
besitzen meist eine Kernlokalisation
- entweder produktive Replikation (Lyse der Zelle) oder nichtproduktive Infektion mit Transformation der Zelle
- virale DNA ist entweder ins zelluläre Genom eingebaut oder
liegt episomal vor
Viren als Erreger menschlicher Tumorerkrankungen
Virus
Tumor
Papillomviren
Polyomaviren
MCPyV
Merkelzell-Karzinom
Kofaktoren
DNA-Virus-Tumorigenese: VirusproteinWechselwirkung mit Tumorsuppressor-Proteinen
Funktionelle Domänen des großen
T- Antigens von Polyomaviren
Funktionen der zellulären Tumorsuppressorproteine
Rb105/Rb107
in nicht infizierten Zellen
Zellzyklus
Funktionen der zellulären Tumorsuppressorproteine
Rb105/Rb107
in HPV/AdV/PyV-transformierten Zellen
Zellzyklus
E7-Protein von HPV-16
Tumorbildung durch Papillomviren (HPV-16/HPV-18)
• Virale DNA:
– entweder episomal (selten) oder
– integriert, dadurch E2 defekt (E6 und E7 immer intakt)
• Virale Proteine:
– E2: Repressor bindet an Promotoren von E6 und E7 und
zelluläre Enhancer, außerdem an mindestens 7 zelluläre Proteine
– E6: bindet an p53, Degradation von p53, keine Apoptose,
Übergang in S-Phase ohne ausreichende Reparatur
– E7: bindet an Rb, Aufhebung der Repression des E2F,
deregulierte Zellteilung
Hepatitis B-Virus und HCC
1. Integration des HBV-Genoms
- Bildung von HBsAg und HBx-Protein möglich
- Störung zellulärer Funktionen infolge Insertionsmutagenese
2. HBx-Protein
- wirkt transaktivierend auf zelluläre Promotoren
- induziert Expression des HBsAg, dadurch Abfangen von
Antikörpern möglich; erhöhte Chronizität der Infektion
- Interaktion mit p53, Deregulation der Zellzykluskontrolle
(verfrühter Eintritt in die S-Phase)
- Zellteilungsstimulation über Proteinkinase C
3. Kofaktoren
- Aflatoxine bewirken Mutationen im Wirtsgenom
Burkitt-Lymphom und Epstein Barr-Virus
- Krebserkrankung ausgehend von B-Lymphozyten
- größte Bedeutung hat das endemische Burkitt-Lymphom in
malariaverseuchten Gebieten Afrikas (Inzidenz: 10 pro 100 000)
- befällt bevorzugt Kinder im Alter von drei bis acht Jahren
- extrem schnell wachsender Tumor (Bauchhöhle und Gesicht)
- in frühen Stadien erfolgreiche Chemotherapie-Behandlung möglich
Epstein Barr-Virus kausal an der Entstehung dieses Tumors beteiligt.
Epstein Barr-Virus: Transformierende Proteine
EBV kann in vitro B-Lymphozyten
infizieren und zu Blasten transformieren.
Dabei werden 6 “Nuclear antigens” (EBNA1, EBNA2, EBNA3A,
EBNA3B, EBNA3C, EBNALP),
drei Membranproteine (LMP1, LMP2A, LMP2B) und
EBV-kodierte RNA (EBER1 und EBER2) exprimiert.
EBNA1 und LMP1 sind von Bedeutung für die Immortalisierung
von primären B-Lymphozyten
EBNA2 - essentiell für die Etablierung der Latenz und die
Immortalisierung
- verstärkt Synthese von Cytokinen und Wachstumsfaktoren
Epstein Barr-Virus: Latenzzustände und Tumoren
Nach der Infektion wird das Genom episomal latent etabliert.
3 Typen von Latenz:
Typ 1-Latenz: nur das EBNA1-Protein exprimiert
(Burkitt-Lymphom)
Typ 2-Latenz: EBNA1-Protein, LMP1, LMP2A, LMP2B
exprimiert (Nasopharyngealkarzinom)
Typ 3-Latenz: EBNA1, EBNA2, EBNA3A, EBNA3B, EBNA3C,
LMP1, LMP2A, LMP2B exprimiert
(Lymphome assoziiert mit Immunsuppression)
Humanes Herpesvirus 8 (HHV-8)
Genus Rhadinovirus der Unterfamile g-Herpesvirinae
Humanes Herpesvirus 8 = Kaposi-Sarkom assoziiertes
Herpesvirus (KSHV)
Kaposi-Sarkom (KS): maligne, von den Gefäßendothelien
ausgehende Systemerkrankung.
Klinische Formen:
1. klassisches Kaposi-Sarkom (meist bei älteren Männern)
2. Kaposi-Sarkom bei Immunsuppression
3. afrikanisches endemisches Kaposi-Sarkom
4. epidemisches HIV-assoziiertes Kaposi-Sarkom
HHV-8: Latenz und Transformation
“latency-associated nuclear antigen” (LANA)
interagiert mit p53 und Rb.
Überleben der Zellen durch Interaktion von LANA mit p53
vermittelt
- durch Verhinderung der Apoptose und
- durch Aufhebung der Repression der Zellproliferation.
Viren als Erreger menschlicher Tumorerkrankungen
Virus
Tumor
Papillomviren
Polyomaviren
MCPyV
Merkelzell-Karzinom
Kofaktoren
DANKSAGUNG
Dr. G. Flunker, Greifswald
S. Drewes, Riems
Vielen Dank für Ihre
Aufmerksamkeit!