Elektrophysiologische und echokardiographische Phänotypisierung

Aus dem Physiologischen Institut der Tierärztlichen Hochschule Hannover,
der Medizinischen Klinik und Poliklinik C - Kardiologie und Angiologie,
Universitätsklinikum Münster,
dem Institut für Pharmakologie und Toxikologie, Universitätsklinikum Münster und
dem Interdisziplinären Zentrum für Klinische Forschung, Münster
Elektrophysiologische und echokardiographische
Phänotypisierung A1 und A3 Adenosinrezeptor überexprimierender
Mäuse
INAUGURAL-DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer
DOKTORIN DER VETERINÄRMEDIZIN
(Dr. med. vet.)
durch die Tierärztliche Hochschule Hannover
vorgelegt von
LISA FORTMÜLLER
aus Lünen
Hannover 2004
Wissenschaftliche Betreuung:
Prof. Gerhard Breves
PD Dr. Paulus Kirchhof
Prof. Joachim Neumann
1. Gutachter:
Prof. Gerhard Breves
2. Gutachter:
Prof. Ulrich Ebert
Tag der mündlichen Prüfung: 25.11.2004
Gefördert durch die Deutsche Forschungsgemeinschaft und das IZKF Münster
Meinen Eltern und Großeltern
Inhaltsverzeichnis
1. Einleitung ............................................................................................7
2. Stand der Forschung......................................................................... 10
2.1 Adenosin .................................................................................................... 10
2.2 A1 und A3 Adenosinrezeptoren................................................................... 11
2.3 Zelluläre Physiologie im Herzen................................................................. 15
2.4 Kardiale Folgen der A1 Adenosinrezeptoraktivierung ................................. 18
2.5 Folgen der A3 Adenosinrezeptoraktivierung ............................................... 22
2.6 Kardiale Überexpression von A1 und A3 Adenosinrezeptoren- Tiermodell . 26
2.7 Elektrokardiogramm bei der Maus ............................................................. 31
2.8 Fragestellung ............................................................................................. 32
3. Experimenteller Teil .......................................................................... 34
3.1 Tiere und Tierhaltung ................................................................................. 34
3.1.1 A1-Adenosin-Rezeptor (A1AR) überexprimierende Mäuse ...... 34
3.1.2 A3-Adenosin-Rezeptor (A3AR) überexprimierende Mäuse ...... 35
3.1.3 Tierhaltung............................................................................... 36
3.1.4.Genehmigung .......................................................................... 36
3.2 Elektrophysiologische Untersuchungen ..................................................... 37
3.2.1 Erstellung des Oberflächenelektrokardiogramms .................... 37
3.2.2 Erstellung des telemetrischen Elektrokardiogramms............... 38
3.2.3 Auswertung der Elektrokardiogramme..................................... 42
3.2.4 Telemetrisches EKG nach Gabe von Pertussistoxin ............... 44
3.3 Transthorakale Echokardiographie ............................................................ 45
3.3.1 Durchführung........................................................................... 45
3.3.2. Auswertung............................................................................. 48
3.4 Histologische Untersuchung....................................................................... 51
3.5 Biochemische Untersuchungen.................................................................. 51
3.6 Statistik....................................................................................................... 52
3.7 Versuchsablauf und Tierversuchsgruppen ................................................. 53
4. Ergebnisse ........................................................................................ 56
4.1 A1AR überexprimierende Mäuse ................................................................ 57
4.1.1 Oberflächenelektrokardiogramm ............................................. 57
4.1.2 Telemetrisches Elektrokardiogramm ....................................... 58
4.1.3 Echokardiographie................................................................... 64
4.1.4 Applikation von Pertussistoxin ................................................. 65
4.1.5 Histologische Untersuchung .................................................... 66
4.1.6 Biochemische Untersuchungen ............................................... 67
4.2 A3 AR überexprimierende Mäuse ............................................................... 67
4.2.1 Oberflächenelektrokardiogramm ............................................. 67
4.2.2 Telemetrisches Elektrokardiogramm ....................................... 72
4.2.3 Echokardiographie................................................................... 80
4.2.4 Histologische Untersuchung .................................................... 86
4.2.5 Biochemische Untersuchungen ............................................... 88
5. Diskussion......................................................................................... 90
5.1 Methodik..................................................................................................... 90
5.1.1 EKG-Aufzeichnungen .............................................................. 90
5.1.2 Echokardiographie................................................................... 91
5.1.3. Injektion von Pertussistoxin .................................................... 93
5.2 Versuchsergebnisse................................................................................... 95
5.2.1 Zusammenfassung .................................................................. 95
5.2.2 Elektrophysiologie- Mechanismus ........................................... 96
5.2.3 Herzfrequenzvariabilität ......................................................... 101
5.2.4 Arrhythmien ........................................................................... 102
5.2.5 Bradykardie, Bradykardiomyopathie ...................................... 106
5.3 Schlussfolgerungen.................................................................................. 111
6. Zusammenfassung.......................................................................... 113
7. Summary......................................................................................... 115
Literaturverzeichnis ............................................................................. 117
Abbildungsverzeichnis ........................................................................ 142
Tabellenverzeichnis ............................................................................ 144
Abkürzungsverzeichnis ....................................................................... 145
Anhang ............................................................................................... 147
Geräte ............................................................................................................ 147
Verbrauchsmaterialien ................................................................................... 148
1. Einleitung
1. Einleitung
Adenosin ist ein endogen gebildetes Nukleosid und kommt in jeder lebenden Zelle
vor. Neben seiner biologischen Rolle im zellulären Metabolismus hat es eine
Bedeutung als Signal-Transduktor im kardiovaskulären System (SHNEYVAYS et al.,
1998).
Adenosin wird im Herzen während Hypoxiephasen und unter adrenerger Stimulation
vermehrt gebildet (NEUMANN et al., 1999). In ischämischem Myokard steigt die
Adenosinproduktion auf ein sehr hohes Niveau. Adenosin wirkt am Herzen über
Adenosinrezeptoren
an
der
Zelloberfläche
und
kann
während
und
nach
Ischämiephasen das Ausmaß der Zellnekrosen verringern und die Funktion des
Herzens nach der Reperfusion verbessern (DOWNEY et al., 1993; VANDER HEIDE
u.
REIMER,
1996;
PEART
u.
HEADRICK,
2003).
Die
Möglichkeit,
die
Widerstandskraft des Herzens gegenüber nachfolgenden Ischämiephasen durch
eine ischämische Präkonditionierung zu steigern, wird ebenfalls teilweise durch
Adenosin vermittelt (DOWNEY et al., 1993). Wegen seiner potenten und
unterschiedlichen Schutzwirkungen auf das Herz besteht ein großes Interesse darin
Therapien zu entwickeln, die auf eine Steigerung der Wirkungsfähigkeit von
endogenem
Adenosin
abzielen.
Bisher
wurden
zwei
verschiedene
Therapiemethoden getestet (BLACK et al., 2002). Zum einen wurde versucht, die
Adenosinwirkung durch Zugabe von Rezeptoragonisten nachzuahmen, zum anderen
so
in
den
endogenen
Adenosinkonzentration
im
Adenosinstoffwechsel
Extrazellulärraum
einzugreifen,
deutlich
gesteigert
dass
wird.
die
Unter
experimentellen Bedingungen zeigten beide Methoden eine kardioprotektive
Wirkung, in der klinischen Anwendung wiesen beide Methoden jedoch deutliche
Mängel, wie systemische Nebenwirkungen und Rezeptordesensitivierung, auf.
Teilweise ist die fehlende Wirksamkeit dieser Therapieformen wahrscheinlich auf die
extrem hohen endogenen Adenosinkonzentrationen im ischämischen Myokard
zurückzuführen.
Viele der bisherigen Forschungsergebnisse, die Aufschluss über die Bedeutung und
die Funktion von Adenosinrezeptoren geben sollen, sind wohl nicht als endgültig
7
1. Einleitung
einzustufen und weisen auch Widersprüche auf. Dies ist zum einen auf die
dramatischen
Speziesunterschiede
Agonistenaffinität
des
zurückzuführen.
Adenosinrezeptoragonisten
auch
Rezeptorsubtypenaufbaus
Zum
anderen
innerhalb
einer
zeigen
Spezies
sowie
der
verschiedene
eine
deutliche
Konzentrationsabhängigkeit bezüglich der spezifischen Subtypenaffinität. So kann z.
B. ein spezifischer A3 Adenosinrezeptor- Agonist in höheren Konzentrationen auch
am A1 Adenosinrezeptor als partieller Agonist wirken. Die experimentelle
Untersuchung von Herzen, die einen Adenosinrezeptorsubtyp überexprimieren,
versucht die Schwierigkeiten der Agonistenwahl und der Abhängigkeit von deren
Konzentrationen zu umgehen. Dieses Verfahren bietet die Möglichkeit, einen
Rezeptorsubtypen nahezu isoliert zu untersuchen. Eine hochgradige Überexpression
kann markante Veränderungen hervorrufen, die auch Hinweise auf die Wirkung eines
„normal“
exprimierten
Rezeptors
geben
können.
Abstufungen
des
Expressionsniveaus sind möglich.
Eine neu angedachte alternative kardioprotektive Therapiemöglichkeit von z. B.
Herzinfarkten, zielt auf die molekulargenetische Steigerung der Rezeptorexpression
ab. Die Adenosinrezeptoren A1 und A3 scheinen bei der Vermittlung der
Kardioprotektion durch Adenosin die Hauptrolle zu spielen. In Experimenten an
isolierten Mausherzen, die den A1 oder den A3 Adenosinrezeptor überexprimieren,
erwies sich die Rezeptorüberexpression als kardioprotektiv (MATHERNE et al.,
1997). Dennoch gibt es Hinweise, dass eine chronische Rezeptorüberexpression
auch Erkrankungen am Herzen verursachen kann (BLACK et al., 2002). Diese
Veränderungen, die vermutlich in direktem Zusammenhang mit der erzeugten
genetischen Veränderung stehen, werden augenblicklich näher untersucht, um neue
Perspektiven für gentherapeutische Behandlungsmöglichkeiten des Herzinfarktes zu
finden. Hierbei spielen mechanistische Untersuchungen eine Rolle, aber auch
präklinische Tests zur Evaluation der Sicherheit einer möglichen Gentherapie mit
Adenosinrezeptoren.
Die
Untersuchung
von
Mausherzen,
die
eine
Überexpression
der
Adenosinrezeptoren A1 und A3 aufweisen, bietet nicht nur die Grundlage zur
8
1. Einleitung
Evaluierung einer neuen präventiven Therapiemethode zur Behandlung von
ischämischem Myokard, sondern auch die Möglichkeit, die Grundfunktion der
Rezeptoren unabhängig von Agonisten näher charakterisieren zu können.
In der vorliegenden experimentellen Arbeit sollten die phänotypischen Auswirkungen
einer herzspezifischen chronischen Überexpression der Adenosinrezeptoren A1 und
A3 am transgenen in vivo Mausmodel untersucht werden. Hierzu wurden in erster
Linie elektrokardiographische, elektrophysiologische und echokardiographische
Untersuchungen der Mäuse in vivo, aber auch histologische und biochemische
Untersuchungen der entnommenen Herzen durchgeführt.
Es sollen folgende Fragen untersucht werden:
Hat die herzspezifische, chronische Überexpression der Adenosinrezeptoren A1 und
A3 transgener Mäuse Auswirkungen auf die Elektrophysiologie und die Morphologie
des Herzens? Wenn ja, besteht ein Zusammenhang zwischen den Veränderungen?
Üben überexprimierte A1 und A3 Adenosinrezeptoren in vivo eine Wirkung auf den
Sinus- oder den AV-Knoten in Ruhe oder während Belastungsphasen aus?
Sind Folgen einer A3 Adenosinrezeptorüberexpression vom Alter der Tiere oder vom
Expressionsniveau abhängig?
Die Dissertation wurde angefertigt im Rahmen der zentralen Projektgruppe
„Kleintierphänotypisierung“ des IZKF Münster
(ZPG 4) und der zentralen
Projektgruppe Z2 „Kardiale Phänotypisierung transgener Mäuse - Pumpfunktion und
Elektrophysiologie“
im
Sonderforschungsbereich
Arrhythmien“.
9
556
„Herzinsuffizienz
und
2. Stand der Forschung
2. Stand der Forschung
2.1 Adenosin
Adenosin ist ein endogen gebildetes Nukleosid aus Adenin und Ribose. Im Herzen
werden die Effekte von Adenosin durch die direkte Aktivierung von Kardiomyocyten,
Endothelzellen und Muskelzellen in Koronargefäßen vermittelt (MUBAGWA u.
FLAMENG, 2001). Adenosin spielt eine Rolle in der Wachstumsregulation und
Differenzierung, der Angiogenese, dem koronaren Blutfluss, beeinflusst die
Leitungsgeschwindigkeit, die Herzfrequenz und die Sensitivität des Herzens
gegenüber adrenerger Stimulation (HEADRICK et al., 2003).
Adenosin ist eines der am häufigsten verwendeten Medikamente zur Diagnose und
akuten Beendigung von supraventrikulären Tachykardien. Desweiteren wird es
gelegentlich zur Vasodilatation während der Untersuchung der Koronargefäße
verwendet (OLAH u. STILES, 1995).
Die biologische Grundfunktion von Adenosin ist seine Fähigkeit, als Modulator eines
negativen „feedback“ Mechanismus bezüglich der Anforderung und des Verbrauches
von Energie in Zellen und Organen zu agieren (SHYROK u. BELARDINELLI, 1997).
Der Adenosinmetabolismus ist sehr komplex und seine Untersuchung wird durch die
extrem kurze Halbwertszeit der Metaboliten erschwert. Enzyme, die die Produktion
von Adenosin katalysieren haben ihren Sitz sowohl intra-, als auch extrazellulär
(DEUSSEN, 2000). Die wichtigsten intrazellulären Quellen für Adenosin sind 5`-AMP
und S-adenosyl-Homozytein (SCHUTZ et al., 1981). Die Adenosinproduktion wird
während Phasen schlechter Energieversorgung der Zelle deutlich gesteigert
(DEUSSEN et al., 1999). Der 5`-AMP-Katabolismus scheint auch von der Herzgröße
abzuhängen. Bei kleinen Tieren mit höheren Stoffwechselraten wird mehr Adenosin
aus 5-AMP gebildet als bei größeren Tieren (HEADRICK et al., 2001). Ob auch unter
adrenerger Stimulation die Adenosinproduktion ansteigt, ist nicht eindeutig
nachgewiesen (DEUSSEN, 2000).
10
2. Stand der Forschung
2.2 A1 und A3 Adenosinrezeptoren
Rezeptoren, die durch ATP, ADP, AMP und Adenosin aktiviert werden, werden als
„Purinrezeptoren“ bezeichnet und in 2 Gruppen unterteilt. Man unterscheidet P1 und
P2 Rezeptoren. Auf die P1 Rezeptoren wirkt Adenosin am stärksten, ATP am
schwächsten. Genau umgekehrt verhält es sich bei den P2 Rezeptoren. AMP und
ADP haben intermediäre Rezeptoraffinitäten. Die P1 Purinrezeptoren, deren stärkster
Agonist Adenosin ist, werden als Adenosinrezeptoren bezeichnet. Sie können durch
Methylxanthin blockiert werden (FORTH et al. (Hrsg.) 1992).
Adenosinrezeptoren kommen in zahlreichen Geweben des Körpers vor. Sie spielen
eine wichtige Rolle in der Niere (Senkung der glomerulären Filtrationsrate durch
Vasokonstriktion (OSSWALD, 1984)), im zentralen Nervensystem (antikonvulsive
und sedative, antidepressive Wirkung), im Pankreas (Beteiligung an der Regulation
der Hormonfreisetzung (STONE et al., 1995)), im Herzen (z. B. chrono- und
dromotrope Wirkung, Vasodilatation der Koronargefäße (STONE et al., 1995)), in den
Mastzellen (Mastzelldegranulation (SALVATORE et al., 2000)) und in den Hoden
(Beeinflussung der Reproduktion (ZHOU et al., 1992)).
Adenosinrezeptoren lassen sich in Untergruppen unterteilen. Die Einteilung richtet
sich nach der Primärstruktur, nach dem an den Rezeptor gekoppelten „second
messenger“ System und nach ihren pharmakologischen Eigenschaften gegenüber
verschiedenen Agonisten und Antagonisten (ZHAO et al., 2002). So gibt es bisher
die Unterteilung in A1, A2 (A2a, A2b), A3 und A4 Adenosinrezeptor- (AR) Unterfamilien
(TUCKER u. LINDEN, 1993). Die A3AR wurden zuerst als eine Untergruppe der
A1AR eingeordnet. Dass sie eine eigenständige Unterfamilie bilden, wurde 1992 von
ZHOU et al. an Rattenzellen und 1997 von HILL an Kaninchenzellen nachgewiesen.
Die
dort
geklonten
Rezeptoren
wiesen
zu
geringe
Ähnlichkeiten
in
der
Aminosäuresequenz zur A1AR Unterfamilie auf und unterschieden sich auch deutlich
in ihren pharmakologischen Eigenschaften. So sind z.B. die A3AR, im Gegensatz zu
den anderen AR Unterfamilien, nicht durch Alkylxanthine hemmbar. Die bisher
geklonten AR-Subtypen unterscheiden sich zwischen den einzelnen Tierarten
untereinander und weisen auch gegenüber dem des Menschen deutliche
11
2. Stand der Forschung
Unterschiede auf. Besonders die Gruppe der A3AR weist starke Speziesunterschiede
im Aufbau auf (HILL, 1997). Alle Rezeptorsubtypen werden im Herzen exprimiert
(AUCHAMPACH u. BOLLI, 1999).
Allen AR Unterfamilien gemeinsam ist das Vorkommen von 7 in die Zellmembran
eingelagerten
hydrophoben
Abschnitten
aus
Glykoproteinen
(SHYROK
u.
BELARDINELLI, 1997, HILL, 1997). Die Bindungsstelle für das Adenosin liegt auf der
Membranaußenseite. Rezeptoren, die diese 7 hydrophoben Domänen besitzen, sind
an ein bestimmtes „second messenger“ System gekoppelt. Es handelt sich dabei um
ein guanosinbindendes Protein (G-Protein gekoppelte Rezeptorfamilie) (SHYROK u:
BELARDINELLI, 1997). Andere G-Protein gekoppelte Rezeptorfamilien sind die der
Adrenalin- und Dopamin-Rezeptoren.
Die guanosinbindenden Proteine bilden eine Gruppe von Proteinen, die an der
Membraninnenseite liegen und an weitere „second messenger“- Systemen gekoppelt
sind. Nach Bindung eines Rezeptoragonisten wird das G-Protein vom Rezeptor
aktiviert und kann so z. B. die Adenylatzyklase aktivieren (Gs- Protein) (McKENZIE u.
MILLIGAN 1990) oder hemmen (Gi- Protein) (LEHNINGER et al. (Hrsg)., 1994) oder
eine Phospholipase aktivieren (Gq-Protein) (MULLANY et al., 1992). Neben den
genannten Enzymen gibt es noch weitere „second messenger“- Systeme, die an GProteine gekoppelt sind. Neben anderen scheint Rho eine Bedeutung für die
Signaltransduktion distal von Gq zu haben. Gi-Proteine sind durch Pertussistoxin, ein
Produkt des gramnegativen Bakteriums Bordetella pertussis, vollständig und
irreversibel hemmbar (UI, 1984).
Der A1 Adenosinrezeptor (A1AR) in Herzzellen scheint über mehrere „second
messenger“- Systeme zu agieren. In Muskelzellen des Atriums und des Ventrikels
des Herzens hemmt der Rezeptor die Aktivierung der Adenylatzyklase durch
Katecholamine und Histamine, diese Wirkung ist Gi Protein-vermittelt. Katecholamine
aktivieren die Adenylatzyklase über Gs (Abb. 1). Ist keine Aktivierung der
Adenylatzyklase durch Katecholamine vorhanden, wird diese nach den bisherigen
Befunden nur in einem sehr geringen Maße durch A1AR gehemmt (SHYROK u.
BELARDINELLI, 1997). A1AR schwächen so die Ionenströme in der Zellmembran,
12
2. Stand der Forschung
die durch eine Katecholaminstimulierung (und damit einen cAMP Anstieg)
hervorgerufen werden (BELARDINELLI et al., 1995).
Nach einer Aktivierung von A1AR konnte sowohl eine Stimulation sowie eine
Hemmung der Aktivität der Phospholipase C festgestellt, des weiteren allerdings
auch deren Steigerung nachgewiesen werden, wenn diese vorher durch andere
Rezeptoren, z. B. muskarinerge Rezeptoren, aktiviert wurde. Dies führt entweder zu
einem intrazellulären Anstieg oder zu einer Verringerung der intrazellulären Ca2+Konzentration. In einigen Studien konnte kein Einfluss von A1AR auf die
Phospholipase C nachgewiesen werden (OLAH u. STILES, 1995).
A1AR können auch als präjunktionale Rezeptoren an adrenergen Synapsen die
Freisetzung von Neurotransmittern reduzieren (LOKHANDWALA, 1979).
A1AR kommen vor allem im Gehirn und in den Hoden, bei der Ratte auch im
Fettgewebe vor. Im Herzen werden sie in kleinen Mengen exprimiert, vermitteln dort
aber wichtige physiologische Veränderungen, insbesondere eine negativ chronotrope
und inotrope Wirkung (BELARDINELLI et al., 1989).
Wie die A1AR werden auch A3 Adenosinrezeptoren (A3AR) in Herzzellen exprimiert
(ZHOU et al., 1992; WANG et al., 1997). Ihre genaue Funktion und die Vermittlung
dieser auf zellulärer Ebene (Signaltransduktion) ist aber nicht eindeutig bekannt
(ZUCCHI et al., 2001). Erschwert wird die Forschung an A3AR durch die
dramatischen Speziesunterschiede, vor allem bezüglich der Antagonisten-Affinität
und der pharmakologischen Effekte. Die verschiedenen Effekte der A3AR Aktivierung
erscheinen sowohl in vitro als auch in vivo dual und auch gegensätzlich. So kann
eine Aktivierung z. B. zytoprotektiv oder auch zytotoxisch sein, abhängig vom Level
der Rezeptoraktivierung oder dem Versuchsobjekt (JACOBSON, 1998).
PALMER wies 1995 nach, dass der A3AR von Ratten bestimmte Untereinheiten von
Gi (Gi-Q-2, Gi-Q-3) und an Gq (und Gll) bindet und aktiviert. Eine Aktivierung von Gs
konnte nicht nachgewiesen werden. Durch A3AR Stimulation wird möglicherweise
über Gi die Adenylatzyklase gehemmt (LINDEN, 1994).
Die Freisetzung von Ca2+ aus dem sarkoplasmatischen Retikulum scheint durch
A3AR moduliert zu werden. Eine inotrope Stimulierung des Herzens, z. B. durch
13
2. Stand der Forschung
Katecholamine, führt zu einer vermehrten Freisetzung von Ca2+ aus dem
sarkoplasmatischen
Retikulum.
Die
Aktivierung
von
A3AR
könnte
durch
Beeinflussung der Ca2+- Freisetzung dem inotropen Stimulus entgegenwirken
(ZUCCHI et al., 2001). In basophilen Zellen konnte ein Ca2+ -Einstrom in die Zelle
nach A3AR Aktivierung ohne Steigerung des IP3-Spiegels (Abb. 2) nachgewiesen
werden (JACOBSON, 1998).
Neben einer Kopplung an die beschriebenen durch Pertussistoxin hemmbaren GProteine scheint der A3AR auch an eine GTPase mit geringem Molekulargewicht
gekoppelt zu sein (LEE et al., 2001). Diese zellmembrangebundene GTPase, die
durch Bindung von GTP aktiviert, nach Bindung von GDP inaktiviert wird, ist das
„second messenger“-Protein RhoA (MACKAY u. HALL, 1998). RhoA ist eine Isoform
der Rho-Proteinfamilie. Die aktivierte Form interagiert innerhalb der Zellen mit
verschiedenen Zielproteinen oder Effektoren und kann so z. B. Veränderungen im
Zytoskelett der Zelle oder auch in der Gentranskription bewirken (MACKAY u. HALL,
1998). RhoA aktiviert zahlreiche intrazelluläre Kinasen und auch die Phospholipase
D (CACHERO et al., 1998) (Abb 2).
A3AR kommen vor allem in der Lunge vor. Nach der Einatmung von Adenosin kommt
es zur Bronchokonstriktion (LINDEN, 1994). Am Herzen spielen die Rezeptoren vor
allem eine Rolle in der Kardioprotektion, z. B. nach Ischämiephasen (LIANG u.
JACOBSON, 1998). Die vollständige Bedeutung der Rezeptoren am Herzen ist
bisher unbekannt.
14
2. Stand der Forschung
2.3 Zelluläre Physiologie im Herzen
An der Membran lebender Zellen besteht eine Spannung, eine elektrische
Potentialdifferenz, die durch aktiven Ionentransport eine intrazellulär negative
Ladung
aufrecht
erhält
und
als
„Ruhemembranpotential“
bezeichnet
wird
(GOODMAN u. GILMAN, 1998 a).
Die Erregung und das Aktionspotential von Herzmuskelzellen unterscheidet sich von
denen anderer Nerven- und Muskelzellen. Wird eine Herzzelle in Ruhe über ein
Schwellenpotential depolarisiert, ändern sich Na+ Kanalproteine in ihrer Konformation
vom geschlossenen in einen offenen (leitenden) Zustand. Dies hat einen Einstrom
von Na+ in die Zelle zur Folge. Nach wenigen Millisekunden werden die Na+ -Kanäle
aufgrund des veränderten Membranpotentials inaktiviert und können erst wieder
geöffnet werden, nachdem sie ihre Ruhe- oder geschlossene Konformation
wiedererlangt haben (zeit- und membranpotentialabhängig). Dies trifft nicht für alle
Na+ Kanäle zu, so kann ein kleiner Teil der Na+ -Kanal Population während des
Aktionspotentials geöffnet bleiben (s. Abb. 1).
Die Änderung des Membranpotentials durch die Öffnung der Na+-Kanäle bewirkt
wiederum eine Reihe von Öffnungen anderer Kanäle (s. Abb. 1). Es kommt zu einer
Repolarisation der Herzzelle, die in Abhängigkeit von der Spezies etwa 30 bis 500
ms nach dem Beginn des Aktionspotentials vollständig abgeschlossen ist.
Die
Herzzellen
unterscheiden
Aktionspotentialprofilen.
So
sich
besitzen
je
atriale
nach
Lokalisation
Zellen
kurze
in
ihren
Aktionspotentiale.
Außerdem gibt es dort zusätzliche repolarisierende K+-Ströme (IK-Ach), die durch den
Neurotransmitter Acetylcholin aktiviert werden. Bei Zellen des Sinus- und
Atrioventrikularknotens (AV-Knoten) fehlen die starken Na+-Ströme (geringere Dichte
der Na+ Kanäle). Der Anstieg des Aktionspotentials ist dadurch langsam und wird u.
a. durch einen Ca2+ -Einstrom nach der Öffnung von L-Typ-Kalziumkanälen
verursacht.
15
2. Stand der Forschung
Abbildung 1: Beziehung zwischem einem hypothetischen Aktionspotential aus dem
Reizleitungssystem und dem zeitlichen Ablauf der dabei entstehenden Ströme
Quelle: Goodman u. Gilman, 1998
Die Stromamplituden sind nicht maßstabsgerecht dargestellt. Es gibt verschiedene
2+
Ca Ströme, verschiedene Arten des transienten Auswärtsstromes (ITO), und des
verzögerten Gleichrichters (IK). ITO2 kann bei manchen Spezies ein Cl Strom sein.
ITO-Ströme sind 4-Aminopyridin (4-AP) sensitiv, IK-Ströme nicht. Die Komponenten
von IK können nach ihrer Aktivierungsgeschwindigkeit unterschieden werden: IKs,
langsam (slow), IKr, schnell (rapid), IKur, ultraschnell (ultra rapid). Der
spannungsaktivierte, zeitunabhängige Einwärtsgleichrichter IK1 könnte von ChloridIonen (ICl) oder von Kalium-Ionen (IKp, p für Plateau) gebildet werden. Im oberen Teil
der Abbildung ist ein normales Aktionspotential in verschiedene Phasen unterteilt.
+
+
Es kommt zur transienten Öffnung von K -Kanälen. Der Ausstrom von K (ITO)in
dieser Phase trägt zur Phase 1 (Kerbe, s Abb. 1) bei manchen Aktionspotentialen
+
+
bei. Die K -Kanäle werden schnell inaktiviert. Andere auswärtsgerichtete K -Kanäle
+
(verzögerter Gleichrichter) werden geöffnet. Dieser K -Auswärtsstrom (Ik) wird durch
2+
einen einwärtsgerichteten, depolarisierenden Strom von primär Ca -Kanälen
(Kalziumkanäle vom L-Typ, ICa(L)) ausgeglichen (Phase 2/ Plateau des
+
Aktionspotentials). Verzögerte K -Gleichrichterströme (Ik) wachsen mit der Zeit an,
2+
während die Ca -Ströme inaktiviert werden und sich so mit der Zeit verringern.
Phase 3 zeigt die Repolarisation der Herzzelle, Phase 4 spiegelt die spontane
diastolische Depolarisation wieder.
16
2. Stand der Forschung
Die Zellen des Sinus- und AV-Knotens besitzen kein konstantes Ruhepotential. So
steigt nach jeder Repolarisation (maximales diastolisches Potential MDP) das
Potential
langsam
wieder
an
(Schrittmacherpotential,
spontane
diastolische
Depolarisation), bis das Schwellenpotential erreicht ist und ein Aktionspotential
ausgelöst wird. Diese spontane Positivierung des Membranpotentials führt zu
regelmäßiger Schrittmacheraktivität. Dem Sinusknoten kommt die Rolle des
führenden Schrittmachers des Herzens zu, da seine Zellen die schnellste
Schrittmacherfrequenz besitzen (SILBERNAGEL u. DESPOPOULOS, 1991 b,
GOODMAN u. GILMAN, 1998 b). Das Schrittmacherpotential wird durch einen nettoEinwärtsstrom (If) hervorgerufen. If wird bereits durch geringe Konzentrationen
adrenerger und cholinerger Agonisten beeinflusst. Die Rolle von If scheint in
verschiedenen Schrittmacherregionen des Herzens zu variieren (DiFRANCESCO,
1995).
Normale kardiale Impulse haben ihren Ursprung im Sinusknoten und breiten sich von
hier über das gesamte Herz aus. Die Ausbreitung der Erregung verlangsamt sich
deutlich im AV-Knoten, wo der einwärtsgerichtete Strom (durch Ca2+ -Kanäle)
geringer ist. Durch diese Verzögerung können die kontrahierten Vorhöfe Blut in die
Ventrikel pumpen. Anschließend werden die Impulse sehr schnell weitergeleitet, da
im Reizleitungssystem große Na+ -Ströme auftreten (GOODMAN u. GILMAN,
1998b).
Der Eintritt von Ca2+ während des Aktionspotentials durch Öffnung von Ca2+-Kanälen
auf der Zelloberfläche dient als Signal für das sarkoplasmatische Retikulum (SR)
Ca2+
freizusetzen
(durch
Ca2+-Freisetzungskanäle:
Inositol
1,4,5-triphosphat-
Rezeptoren (IP3R) und Ryanodinrezeptoren) (MARKS, 2001). Durch den Anstieg der
intrazellulären Ca2+-Konzentration können kalziumabhängige kontraktile Prozesse
ablaufen. Nach der Kontraktion wird Ca2+ über eine ATP-abhängige Pumpe (SR
Ca2+-ATPase=SERCA2a) wieder in das SR zurückgepumpt oder durch einen
elektrogenen Na+/Ca2+-Austauschmechanismus in der Zellmembran nach außen
gebracht. Eine schnelle Entfernung von Ca2+ aus dem Zellinnenraum ist für die
Relaxation der Herzmuskelzellen essentiell. SERCA2a wird unter anderem durch das
Protein
Phospholamban
gehemmt.
Durch
17
die
Phosphorylierung
von
2. Stand der Forschung
Phosospholamban durch ß-adrenerge Stimulation und eine gesteigerte Aktivität der
cAMP abhängigen Proteinkinase A schwächt die Hemmung von SERCA2a ab. Dies
führt zu einer besseren Relaxation und zu einer höheren Kalziumkonzentration im SR
und hat eine bessere Kontraktilität der Herzmuskelzellen zur Folge (FRANK et al.,
2003).
2.4 Kardiale Folgen der A1 Adenosinrezeptoraktivierung
Der zelluläre elektrophysiologische Effekt von Adenosin im Herzen ist sowohl
spezies-, als auch zelltypabhängig (BELARDINELLI et al., 1989).
Sinusknoten
Über die Aktivierung von A1AR verursacht Adenosin dosisabhängig in den
Sinusknotenzellen eine Hyperpolarisation des Membranpotentials. Dadurch wird die
Rate der diastolischen Depolarisation und damit die der Schrittmacheraktivität
herabgesetzt. Im Sinusknoten übt Adenosin über die A1AR einen negativ
chronotropen
Effekt
aus
(BELARDINELLI
et
al.,
1989).
Hohe
Adenosinkonzentrationen führen zu einem Sistieren der Schrittmacheraktivität
(WEST und BELARDINELLI, 1985). In isolierten Sinusknotenzellen aktiviert
Adenosin einen zeitunabhängigen zelleinwärtsgerichteten K+-Strom (IK-ADO). Die K+Kanäle werden dabei direkt über ein G-Protein (nicht cAMP vermittelt) geöffnet. Die
Aktivierung U-adrenerger Rezeptoren bewirkt einen Anstieg von ICa(L) und If ,was die
spontane Repolarisation beschleunigt. Adenosin hat einen hemmenden Einfluss auf
beide Ionenströme. Ohne vorherige U-adrenerge Stimulation hat Adenosin keinen
Einfluss auf ICa(L) und If., Adenosin scheint also indirekt auf diese Ionenströme zu
wirken (BELARDINELLIi et al., 1988), allerdings konnte auch eine Hemmung von If
ohne vorherige Steigerung durch Katecholamine an sinoatrialen (ZAZA et al., 1994)
und atrioventrikulären Zellen (WANG u. BELARDINELLI, 1994) nachgewiesen
werden. Da aber die Zellen in vivo unter dem tonischen Einfluss des sympathischen
Nervensystems stehen, scheint eine indirekte Aktivierung in vivo wahrscheinlich
18
2. Stand der Forschung
(BELARDINELLI et al., 1995). PORCIATTI et al. (1997) zeigten an humanen atrialen
Zellen, dass eine A1AR Aktivierung eine Aktivierung von If erst bei negativeren
Potentialen alleine und indirekt nach adrenerger Stimulation bewirkt.
Atrium
Im Atrium bewirkt Adenosin über A1AR ein verkürztes Aktionspotential, eine
Verkürzung der refraktären Phase und eine Verminderung der Kontraktionskraft
(BELARDINELLI et al., 1989). In den Zellen des Atriums aktiviert Adenosin über
A1AR, wie in Sinusknotenzellen, einen zelleinwärtsgerichteten Gleichrichter-K+-Strom
(IK-ADO). Die K+-Kanäle werden dabei direkt über ein G-Protein aktiviert (KURACHI et
al., 1986). IK-ADO bewirkt dabei eine Verkürzung des Aktionspotentials sowie eine
Hyperpolarisation. Dieses kurze Aktionspotential führt dazu, dass die Zeit für den
Ca2+-Einstrom in die Zelle verkürzt wird und /oder ein verminderter Eintritt von Ca2+
über den Na+/Ca2+-Austauscher erfolgt und dadurch die Kontraktilität der atrialen
Zellen vermindert wird (BELARDINELLI et al., 1995). Der durch Adenosin
hervorgerufene IK-ADO entspricht dem Kaliumstrom IK-ACh, der durch Acetylcholin
aktiviert wird (BELARDINELLI u. ISENBERG, 1983). Die effektive Refraktärperiode
der atrialen Zellen wird durch Adenosin verkürzt (WORKMANN et al., 1999).
Ebenfalls G-proteinvermittelt ist die abschwächende Wirkung von Adenosin auf ICa(L)
in den Vorhofzellen nach Katecholaminstimulierung (HOSEY et al., 1984,
BELARDINELLI et al., 1995). Die Adenylatzyklase wird gehemmt, cAMP in der Zelle
sinkt. CAMP bewirkt hier eine cAMP abhängige Phosphorylierung von Ca2+-Kanälen
im SR und L-Typ Ca2+-Kanälen (CERBAI et al., 1988). VISENTIN et al (1990) wiesen
an Meerschweinchenatriozyten eine direkte hemmende Wirkung von Adenosin auf
ICA(L) (ohne vorherige Katecholaminstimulation) nach. Dieser nur sehr gering
verminderter ICA(L) trägt dabei aber kaum/ gar nicht zur Verkürzung des
Aktionspotentials bei (VISENTIN et al., 1990).
Es gibt also „anti-adrenerge“ und katecholaminunabhängige Wirkungen von
Adenosin über A1AR.
19
2. Stand der Forschung
AV-Knoten
Der Kalziumstrom ICa(L) stellt bei Zellen des AV-Knotens die hauptsächliche
Komponente des Aktionspotentials dar (WORKMANN et al., 1999). In der kompakten
Zone des AV-Knotens (ANDERSEN u. HO, 1998) verursacht Adenosin eine
konzentrationsabhängige
Hyperpolarisation
sowie
eine
Verringerung
der
Aktionspotentialsdauer und –amplitude (negativ dromotrope Wirkung von Adenosin
(CLEMO u. BELARDINELLI, 1986)). Die Verkürzung des Aktionspotentials wird
durch einen Anstieg des einwärtsgerichteten K+-Stroms IK-ADO verursacht. Die
adenosinvermittelte geringere Amplitude des Aktionspotentials wird durch eine
deutliche Verringerung von ICa(L) (katecholamin-unabhängig) verursacht. Die
Abschwächung von ICa(L) ist erst bei höheren Adenosinkonzentrationen deutlich
nachweisbar, als dies für die Aktivierung von IK-ADO nötig ist (BELARDINELLI et al.,
1995). Es tritt zusätzlich eine Verminderung der Aktionspotentialsrate auf, die
Erregbarkeit wird verringert. Bei höheren Adenosinkonzentrationen wird gar kein
Aktionspotential mehr gebildet (CLEMO u. BELARDINELLI, 1986, GOODMAN u.
GILMAN, 1998b). Durch Adenosin kommt es im AV-Knoten zu einer Verlängerung
der Refraktärzeit. Diese Refraktärzeitverlängerung wird durch die adenosininduzierte
Verzögerung der Erholung von ICa(L) nach der Inaktivierung der Kanäle bewirkt
(WORKMANN et al., 1999). Im AV-Knoten wird auch If von Adenosin gehemmt und
seine Aktivierungsschwelle gesenkt. Diese Hemmung von If und die Steigerung von
IK-ADO können das Auftreten einer Hyperpolarisation, die Abschwächung der
diastolischen Depolarisation und die Reduktion der spontanen Schlagfrequenz von
Zellen des AV-Knotens erklären (WANG u. BELARDINELLI, 1994).
Ventrikel
In
ventrikulärem
Myokard
löst
Adenosin
deutliche
speziesabhängige
elektrophysiologische Effekte aus. So kann Adenosin ohne Effekt bleiben (z.B.
Meerschweinchen, Mensch), kann eine Verkürzung des Aktionspotentials durch IKADO
hervorrufen (z.B. Ratte, Frettchen), sowie ICa(L) und damit die Kontraktionskraft
abschwächen (z.B. Frettchen) (BELARDINELLI et al., 1995).
20
2. Stand der Forschung
Antiadrenerge Wirkung
Wie bereits beschrieben, besitzt Adenosin eine antiadrenerge Wirkung. So werden
Ionen-Ströme durch die Membran, die durch Katecholamine gesteigert werden, durch
A1AR Aktivierung abgeschwächt. Katecholamine stimulieren die Adenylatzyklase und
steigern
dadurch
die
intrazelluläre
cAMP-Konzentration.
Bei
hoher
cAMP-
Konzentration werden ICa(L) (ISENBERG u. BELARDINELLI, 1984) und IK und ICl
stimuliert
(SONG
et
al.,
1994),
durch
Adenosin
über
Gi
abgeschwächt.
Katecholamine können dabei in verschiedenen Zellen entweder durch Stimulierung
von ICa(L) das Aktionspotential verlängern oder durch Aktivierung von IK und ICl das
Aktionspotential verkürzen (SONG et al., 1994). Der antiadrenerge Effekt beruht
darauf, die durch Katecholamine verursachte Verlängerung oder Verkürzung des
Aktionspotentials abzuschwächen. Auch Nachdepolarisationen und getriggerte
Arrhythmien im Ventrikel, die durch Katecholamine verursacht werden, können durch
Adenosin abgeschwächt werden. Adenosin hemmt die durch Katecholamine
induzierten Arrhythmien stärker, als es die durch Katecholamine verstärkte
Kontraktilität senkt. Es hemmt nach A1AR-Aktivierung den katecholaminstimulierten
ICa(L) zehn mal stärker, als es direkt IK-ADO aktiviert (SONG et al., 2002).
Aufgrund des unterdrückenden Effektes von Adenosin auf die Aktionspotentiale von
AV-Knoten-Zellen
kann
Adenosin
nach
A1AR-Aktivierung
paroxysmale
supraventrikuläre Tachykardien beenden, wenn der AV-Knoten in den reentry Zyklus
involviert ist (BELARDINELLI et al. ,1995). Proarrhythmisch kann Adenosin aufgrund
der verkürzten Aktionspotentiale in atrialen Zellen wirken. So kann eine Aktivierung
von A1AR dosisabhängig Vorhofflattern und -flimmern verursachen (KABELLl et al.,
1994, GOODMAN u. GILMAN, 1998b). Auch Bradyarrhythmien können, durch die
Wirkung von Adenosin im Sinusknoten, hervorgerufen werden (BELARDINELLI et
al., 1989).
21
2. Stand der Forschung
2.5 Folgen der A3 Adenosinrezeptoraktivierung
Bei den meisten Spezies werden A3AR im Herzen nur in geringem Maße exprimiert
(CROSS et al., 2002). Eine massive Rezeptorexpression zeigen Hodengewebe
sowie eosinophile, basophile und neutrophile Granulozyten. Eine Aktivierung der
A3AR führt zelltypabhängig zu einer Weiterleitung des Signals über unterschiedliche
Wege (FISHMAN u. BAR-YEHUDA, 2003).
Signaltransduktion
Wie auch in anderen Geweben ist die genaue funktionelle Bedeutung und
Wirkungsweise
der
A3AR
im
Herzen
bisher
nur
unvollständig
geklärt.
Elektrophysiologische Veränderungen in Herzzellen, wie für den A1AR beschrieben,
ließen sich für den A3AR bisher nicht nachweisen. Dies liegt teilweise daran, dass
keine ausreichend spezifischen Agonisten oder Antagonisten verfügbar sind.
Eine Aktivierung des A3AR führt über Gi zu einer Hemmung der Adenylatzyklase mit
nachfolgend sinkendem cAMP-Spiegel und einer verminderten Aktivität der
Proteinkinase
A
(FISHMAN
u.
BAR-YEHUDA,
2003).
Die
Wirkung
der
Phospholipasen C und D wird nach Rezeptoraktivierung gesteigert und führt über
Inositol-1,4,5-Triphosphat zu einer vermehrten Mobilisation von Kalzium aus intraund extrazellulären Speichern (KUDO et al, 2002). Die hohe intrazelluläre
Kalziumkonzentration und das nach der Aktivierung der Phospholipasen ebenfalls
entstandene
Proteinkinase
Diacylglycerol
C-Q.
Eine
führen
andere
zur
Aktivierung
Proteinkinase,
die
einer
kalziumsensitiven
Proteinkinase
C-W,
ist
kalziumunabhängig, wird aber auch nach A3AR-Aktivierung durch DAG aktiviert
(ZHAO u. KUKREJA, 2003). Nach Translokation der Proteinkinase C-W scheint es zur
Aktivierung des Transkriptionsfaktors NF-XB zu kommen, der neben weiteren
Mechanismen mit einer kardioprotektiven Wirkung der A3AR in Verbindung gebracht
wird. Der genaue Mechanismus ist dabei unbekannt (ZHAO u. KUKREJA, 2003). Die
Kopplung des Rezeptors an weitere „second messenger“-Proteine wie RhoA, Ras
oder die Tyrosinkinase mit nachfolgender Aktivierung der Phosphatidyl-3-Kinase
22
2. Stand der Forschung
(PI3-Kinase) scheint ebenfalls vorzukommen (HEADRICK et al., 2003). Unklar sind
dabei meistens die „Endeffektoren“ der Signaltransduktionswege.
Kardioprotektion
Der bisher bekannteste allgemeine Effekt einer A3AR Aktivierung am Herzen ist die
protektive Wirkung auf Myozyten während und nach Ischämiephasen (LIANG u.
JACOBSON,
1998).
Eine
Vorbehandlung
des
Myokards,
eine
sogenannte
„Präkonditionierung“, durch eine sublethale Ischämieperiode lässt es gegenüber
einer nachfolgenden Ischämie resistenter werden, so dass nach einer Reperfusion
des Herzens entstehende Infarktgebiete kleiner ausfallen als bei Herzen, die nicht
vorbehandelt wurden (MURRY et al., 1986). Dass Adenosin in diesem Mechanismus
eine wichtige Rolle spielt und direkt zur Kardioprotektion beiträgt wurde zuerst 1985
von ELY et al. nachgewiesen.
Auch die Aktivierung von A1AR wirkt kardioprotektiv. Eine Beteiligung des an GProteine
gekoppelten
A1AR
an
der
Kardioprotektion
durch
ischämische
Vorbehandlung des Herzens wurde an mehreren Tierarten und für den Menschen
nachgewiesen (SCHWARZ et al., 1991, DOWNEY et al., 1993; HEADRICK et al.,
2003). A1AR-vermittelt triggert Adenosin nicht nur die Kardioprotektion während der
Präkonditionierung, sondern vermittelt diese auch während einer nachfolgenden
Ischämiephase (DOWNEY et al., 1993). Wird Adenosin oder ein anderer AR-Agonist
von außen vor der eigentlichen Ischämiephase hinzugefügt, kann dies allein einen
vergleichbaren Effekt in der Kardioprotektion hervorrufen wie eine kurzzeitige
ischämische Präkonditionierung (DOWNEY et al. 1993). Eine Beteiligung auch von
A3AR an der Kardioprotektion wurde für den Menschen (CARR et al., 1997) und
zahlreiche Tierarten (LIU et al., 1994; LIANG u. JACOBSON, 1998; ZUCCHI et al.,
2001) postuliert. Die durch eine Aktivierung von A3AR vermittelte Kardioprotektion
scheint längeranhaltend zu sein als die der A1AR (LIANG u. JACOBSON, 1998). Im
Gegensatz zu den A1AR, die ihre protektive Wirkung allein durch eine Aktivierung
durch endogen gebildetes Adenosin entfalten können, scheinen A3AR einen
exogenen Agonisten zur Wirkungsentfaltung zu benötigen (HEADRICK et al., 2003).
MADDOCK et al. (2002) wiesen nach, dass eine A3AR Aktivierung von Ratten sogar
23
2. Stand der Forschung
erst zum Zeitpunkt der Reperfusion nach vorangegangener Ischämiephase eine
Verringerung der Nekrose und Apoptose im betroffenen Zellgebiet hervorruft.
Die Kardioprotektion der A1AR soll durch die PLC, die Kardioprotektion der A3AR
dagegen durch eine Aktivierung der PLD vermittelt werden (PARSONS et al., 2000).
A1AR sollen die PLC über Gi aktivieren, im Gegensatz dazu scheinen die A3AR die
PLD RhoA abhängig zu aktivieren (LEE et al., 2001, MOZZICATO et al., 2004). Eine
Aktivierung von A1 und A3AR scheint desweiteren zu einer Reduktion der Sensitivität
von
Ca2+-freisetzenden
(Ryanodinrezeptoren) zu
Kanälen
führen.
im
sarkoplasmatischen
Dies könnte die
Retikulum
ischämieinduzierte
Ca2+-
Überladung der Zelle abschwächen und die Zellen vor einem Ca2+ induzierten
Schaden schützen (HEADRICK et al., 2003). Die Öffnung ATP sensitiver KaliumIonen-Kanäle während Ischämiephasen könnte ebenfalls an der kardioprotektiven
Wirkung der Adenosinrezeptoren A1 und A3 beteiligt sein (GROVER et al., 1990;
GROSS u. AUCHAMPACH, 1992; PEART u. HEADRICK, 2003). Intrazelluläres ATP
hemmt die Öffnung der KATP-Kanälen (NICHOLS u. LEDERER, 1991). Die Öffnung
mitochondrialer
KATP-Kanäle
durch
Adenosin
scheint
einen
Rückgang
von
Zellnekrosen nach Ischämiephasen zu bewirken (PEART u. HEADRICK, 2003). Viele
Studien geben jedoch auch Hinweise, dass eine Beteiligung von ATP-sensitiven K+
Kanälen an der Adenosinrezeptor-vermittelten Kardioprotektion nicht besteht
(DOWNEY et al., 1993; BELARDINELLI et al., 1995; OBATA, 2002).
Die Rolle des A3AR in der Kardioprotektion ist nicht eindeutig. So zeigen Versuche
an A3AR knock-out Mäusen, dass gerade das Nichtvorhandensein von A3AR
kardioprotektiv wirkt (MUBAGWA u. FLAMENG, 2001, HARRISON et al., 2002).
Desweiteren scheinen A3AR Agonisten in geringen (nanomolaren) Konzentrationen
protektiv zu wirken, in höheren (mikromolaren) Konzentrationen aber Apoptose und
Zelltod zu vermitteln (JACOBSON, 1998).
Die intrazellulären Signalwege sind zusammenfassend in Abb. 2 dargestellt.
24
2. Stand der Forschung
Adrenalin
Adenosin
Adren.
R
A1/A3
AR
Gs
GTP
Gi
GDP
-
+
GTP
Ionenkanal
G?
GDP
Adenosin
Adenosin
A1/(A3)
AR
A3
AR
Gq/Gi
RHoA
GTP
GDP
AC
ATP
+
+
PLC
PLD
spaltet
spaltet
PIP2
cAMP
IP3
GTP
GDP
PC
DAG
Pi
PK
Abbildung 2: Schematische Darstellung der in der Literatur beschriebenen vermuteten
Signaltransduktionswege von A1 und A3 Adenosinrezeptoren
Die Adenylatcyclase (AC) ist ein Protein in der Plasmamembran. Wird es durch Gs
aktiviert (z. B. nach Aktivierung eines Adrenalinrezeptors), katalysiert es die
Umwandlung von ATP in cAMP, ebenfalls ein sekundärer Botenstoff in der Zelle.
CAMP kann eine cAMP abhängige Proteinkinase aktivieren. Gi hemmt die
Adenylatcyklase, die Konzentration von cAMP im Cytosol sinkt (LEHNINGER et al.
(Hrsg.), 1994) (indirekte Wirkung einer Adenosinrezeptoraktivierung). Das vom
Rezeptor ( z. B. A1 AR) aktivierte Protein Gp (oder Gi, für A1AR nachgewiesen (LEE et
al., 2001)) aktiviert eine membrangebundene Phospholipase C, die ein Substrat aus
der Plasmamembran hydrolytisch in 2 sekundäre Botenstoffe spaltet. Zum einen
entsteht Diacylglycerin, welches verschiedene Proteinkinasen aktiviert, die wiederum
verschiedene Zielproteine phosphorylierten. Der andere Botenstoff ist Inositol-1,4,5triphosphat. Seine Wirkung entfaltet es am sarkoplasmatischen Reticulum, indem dort
2+
Rezeptoren aktiviert werden, die für eine Öffnung der Ca -Kanäle des
2+
sarkoplasmatischen Retikulums sorgen. Es gelangt so vermehrt Ca ins Zytosol, die
2+
Ca Konzentration steigt dort um das bis zu 100 fache (LEHNINGER et al. (Hrsg.),
1994), was die Kontraktion der Herzmuskelzelle über eine Bindung von Kalzium an
Troponin auslöst. Die Phospholipase D scheint nach A3AR-Aktivierung über RhoA
aktiviert zu werden (CACHERO et al., 1998, HEADRICK et al., 2003). Auch die
Phospholipase D spaltet ein Substrat, aus dem Diacylglycerin hervorgeht. Sowohl der
A1 als auch der A3AR scheinen über ein G-Protein direkt an einen Ionenkanal
A1AR oder IKgekoppelt zu sein. Hierbei kann es sich um einen Kaliumkanal (IK-Ado
A1 und A3AR) (GROVER et al., 1990, GROSS u. AUCHAMPACH, 1992;
ATP
A1AR)
PEART u. HEADRICK, 2003) oder Kalziumkanal handeln (ICa(L)
(BELARDINELLII et al., 1988).
A3AR: A3 Adenosinrezeptor,
Adren R:
A1AR: A1 Adenosinrezeptor,
Adrenalinrezeptor, AC: Adenylatcyclase, DAG: Diacylglycerin, IP3: Inositol(1,4,5)-
25
2. Stand der Forschung
Triphosphat, PC: Phosphatidylcholin, PIP2: Phosphatidylinositol(4,5)-Diphosphat, PK:
Proteinkinase, PLC: Phospholipase C, PLD: Phospholipase D
Herzfrequenz
Auf die Herzfrequenz scheinen verschiedene untersuchte A3AR Agonisten bei
verschiedenen Tierarten keinen Einfluss auszuüben. So hatte die Applikation der
Agonisten IB-MECA (50 nM) und Cl-IB-MECA (50 nM) auf isolierte Herzen von
Ratten und Kaninchen, so wie auf in situ untersuchte Herzen von Schweinen (5µg/kg
und 25µg/kg) keinen signifikanten Einfluss auf die Herzfrequenz (LASLEY et al.,
1999). IB-MECA rief auch bei anästhesierten Hunden in einer Konzentration von
100µg/kg keine Veränderungen der Herzfrequenz hervor (AUCHAMPACH et al.,
2003). Auch der A3AR Agonist CB-MECA blieb bei Kaninchenherzen auch bei einer
Konzentration von 20 nM ohne Einfluss auf die Herzfrequenz (TRACEY et al.,1998).
2.6
Kardiale
Überexpression
von
A1
und
A3
Adenosinrezeptoren- Tiermodell
Die experimentelle kardioprotektive Wirkung von Adenosin während Ischämiephasen
im Myokard und bei der Reperfusion des Herzens scheint es zu einem wertvollen
pharmakologischen Werkzeug z. B. bei der präoperativen Behandlung des
menschlichen Herzens vor chirurgischen Eingriffen zu machen. Dies bestätigte sich
beim klinischen Einsatz jedoch nicht. Eine adenosinerge Therapie konnte
ischämische
und
postischämische
Gewebsverletzungen
nicht
beeinflussen
(VANDER HEIDE u. REIMER, 1996). Eine Möglichkeit, dies zu erklären, ist die
Tatsache, dass die Adenosinproduktion in Herzzellen während Ischämie- und
Reperfusionsphasen
bereits
maximal
(KITAKAZE
u.
KITABATAKE,
1991,
HEADRICK, 1996) und es deshalb schwierig ist, eine solche maximale dem Körper
eigene Gewebsproduktion pharmakologisch noch zu steigern (MATHERNE et al.,
1997). Dies konnte auch an Mausherzen für die A1AR nachgewiesen werden,
26
2. Stand der Forschung
exogen hinzugefügtes Adenosin blieb während und nach einer Ischämiephase ohne
Wirkung
(PEART
et
Adenosinrezeptoragonisten
al.,
2002).
unter
Außerdem
klinischen
ist
der
Einsatz
Einsatzbedingungen
mit
von
starken
Nebenwirkungen in nichtkardialem Gewebe verbunden. Desweiteren führt die Gabe
hoher Konzentrationen von Agonisten zu einer Rezeptordesensitivierung (MANGONI
u. BARRERE-LEMAIRE, 2004).
RUDOLPHI et al. schlugen bereits 1989 eine „Hochregulation“ der A1AR als eine
alternative Möglichkeit zur Verminderung ischämischer Zellschädigung vor.
Die erste Maus, die den A1AR im Myokard überexprimierte, wurde 1997 von
MATHERNE et al. hergestellt und für alle nachfolgenden Arbeiten, einschließlich
dieser Dissertation, verwendet. Für die Versuche wurden die Herzen isoliert.
MATHERNE et al. wiesen als erste nach, dass eine genetische Manipulation des
A1AR eine effektive Methode zur Kardioprotektion sein kann, wenn konventionelle
pharmakologische Methoden zu wenig effektiv sind. Im Einzelnen zeigten die A1AR
überexprimierenden (A1AR+) isolierten Herzen eine grundsätzlich signifikant
reduzierte Herzfrequenz, eine längere Zeit bis zur ischämischen Kontraktur und eine
verbesserte
Kontraktilität
der
Herzmuskelzellen
während
und
nach
der
Reperfusionsphase. Desweiteren wiesen die isolierten A1AR+-Herzen nach einer 30
minütigen Ischämiephase einen verbesserten energetischen Status auf als
Wildtypherzen (HEADRICK et al., 1998). 1998 zeigten GAUTHIER et al., dass
isolierte A1AR+-Ventrikel unter maximalen Isoprenalinkonzentrationen geringere
Leistungen zeigen als Wildtypventrikel, bei elektrisch stimulierten Herzen die
Kontraktilität der Ventrikel von Wildtypen und transgenen Mäusen bei gleichen
Herzfrequenzen aber keine Unterschiede aufweisen.
HEADRICK et al. (2000) wiesen an isolierten A1AR+-Herzen nach, dass die
Überexpression nur die kardiovaskuläre Antwort dieser Rezeptoren sensitiviert und
dass die Größe der, aber nicht die Fähigkeit zur chronotropen Wirkung von
Isoprenalin im Herzen durch A1AR Überexpression verringert wird (antiadrenerger
Effekt).
NEUMANN et al. zeigten 1999 und 2003, dass A1AR überexprimierende Herzzellen
einen veränderten Post-Rezeptor-Übertragungsweg zeigen als bisher bei den A1AR
27
2. Stand der Forschung
bekannt, und dies auch bei anderen G-Protein gekoppelten Rezeptoren, z. B. den
muskarinergen Cholinrezeptoren, bewirken. Sie verglichen die Wirkung von Adenosin
und Carbachol (Agonist am muskarinergen Cholinrezeptor) in Wildtyp und A1AR
überexprimierenden Vorhöfen und den Einfluss von Pertussistoxin auf Chronotropie
und Inotropie in isolierten Vorhofpräparaten. Adenosin zeigte bei Wildtypherzen
einen negativ inotropen und chronotropen Effekt, der durch PTX hemmbar war. Bei
transgenen Herzen war Adenosin positiv inotrop, nicht durch PTX hemmbar,
wirksam, außerdem zeigte es einen PTX-hemmbaren negativ chronotropen Effekt.
Der indirekte Effekt von Adenosin (nach Aktivierung U-adrenerger Rezeptoren) ist bei
Wildtypherzen negativ chrono- und inotrop, beide Wirkungen sind PTX hemmbar. Die
Zugabe von Isoprenalin blieb bei transgenen Vorhöfen bezüglich der Inotropie ohne
Effekt und zeigte nur eine geringe chronotrope Wirkung. Nach Zugabe von Adenosin
hatte dieses einen positiv inotropen und einen negativ chronotropen Effekt. Nur die
letztgenannte Wirkung war durch PTX hemmbar. Carbachol verursachte bei den
Versuchen die gleichen Veränderungen wie Adenosin. NEUMANN et al. (2003)
kamen zu dem Ergebnis, dass eine Überexpression von A1AR auch die
Signalweiterleitung anderer G-Protein gekoppelter Rezeptoren beeinflusst und dass
zwar die negativ chronotrope und inotrope, aber nicht die positiv inotrope Wirkung
von Adenosin und Carbachol durch PTX-sensitive G-Proteine vermittelt wird.
MORRISON et al. (2000) zeigten an isolierten Herzen, dass der kardioprotektive
Effekt, der durch eine A1AR Überexpression hervorgerufen wird, den der
ischämischen Präkonditionierung nachahmt, durch diese aber nicht gesteigert
werden kann. Da die Kardioprotektion durch Präkonditionierung bei Wildtypherzen
und durch die Überexpression von A1AR bei transgenen Herzen in beiden Fällen
durch A1AR Antagonisten gehemmt wird, scheinen beide über ähnliche / gleiche
Mechanismen vermittelt zu werden. Durch den Einsatz eines spezifischen KATPKanal-Blockers zeigten HEADRICK et al. (2000) zum ersten Mal, dass die
Kardioprotektion im Mausherzen durch KATP-Kanäle vermittelt wird. Dies traf auch für
A1AR+ Herzen zu. Die Aktivierung von KATP-Kanälen führt zu einem funktionellen
Schutz (verbesserte Kontraktion nach der Ischämiephase) des Herzens.
28
2. Stand der Forschung
Desweiteren zeigen Herzen, die den A1AR überexprimieren, Veränderungen im Ca2+Transport des SR, es kommt zu einer verminderten Wiederaufnahme von Ca2+ ins
SR (ZUCCHI et al., 2002). Während der Diastole wird daher in den transgenen
Herzen
mehr
Ca2+
aus
der
Zelle
ausgeschleust.
Dies
scheint
unter
Ruhebedingungen keinen Einfluss auf die Kontraktionskraft zu haben. Während
Ischämiephasen könnte der niedrigere intrazelluläre Ca2+-Spiegel kardioprotektiv
wirken.
Parameter
WT
A1 AR+
PTX hemmbar
WT
A1 AR+
Eigenschlagfrequenz der
Allgemeine
Herzen geringer
Charakteristika
Beeinflussung anderer
ja
Rezeptoren
Kleineres Infarktgebiet auch
ohne Präkonditionierung
Reaktion auf
Kardioprotektion durch
durch Präkonditionierung
Ischämie
Präkonditionierung
nicht steigerbar
KATP Kanal an kardioprotektiver Wirkung beteiligt
Adenosin
Wirkung
a
t
Negativ inotrop
Positiv inotrop
ja
nein
Negativ chronotrop
Negativ chronotrop
ja
ja
Isoprenalin
r
Positiv inotrop
Kein / kaum Effekt
Wirkung
i
Positiv chronotrop
Ggr. positiv chronotrop
Negativ inotrop
Positiv inotrop
ja
Nein
Negativ chronotrop
Negativ chronotrop
ja
ja
Indirekte
Wirkung von
Adenosin
a
l
Tabelle 1: Zusammenfassung der Ergebnisse bisheriger Studien an A1 AR überexprimierender
Herzen von Mäusen gegenüber Wildtypherzen
Quellen: MATHERNE et al, 1997, HEADRICK et al., 1998, GAUTHIER et al., 1998,
NEUMANN et al., 1999, HEADRICK et al., 2000, , NEUMANN et al., 2000
29
2. Stand der Forschung
Da auch A3AR in die kardioprotektive Wirkung von Adenosin involviert sein könnten,
wurde von BLACK et al. 2002 eine transgene Maus hergestellt, die den A3AR im
Herzen überexprimiert. An isolierten Herzen erwies sich die Überexpression als
kardioprotektiv (CROSS et al., 2002). CROSS et al. (2002) wiesen den A3AR+Herzen nach einer Ischämiephase gegenüber Wildtypherzen einen geringeren ATPVerlust und eine verbesserte postischämische Funktion nach. Auch bei A1AR+Herzen konnte eine Kardioprotektion durch verminderten ATP-Verlust nachgewiesen
werden. Unstimulierte A3AR+-Herzen zeigten eine langsamere Grundherzfrequenz
und eine verminderte Kontraktionskraft des Ventrikels im Vergleich zu Wildtypherzen.
Wurden transgene und Wildtypherzen elektrisch stimuliert, waren bei gleicher
Herzfrequenz keine Kontraktionsunterschiede mehr nachweisbar. BLACK et al.
(2002) zeigten an einem in vivo Modell, dass die kardiale Wirkung der A3AR vom
Grad der Überexpression abhängt. So zeigten Mäuse, die den Rezeptor in
geringerem Maße überexprimieren, in einem in vivo Infarktmodell eine deutliche
Verringerung der Infarktgröße gegenüber Wildtypmäusen. Bei Mäusen mit einem
höheren Grad der Überexpression entwickelten sich hingegen Kammerdilatationen,
Anzeichen für Hypertrophie, Bradykardie, erniedrigten Blutdruck und systolische
Dysfunktion. In diesen Untersuchungen wurde der Herzrhythmus nicht systematisch
erfasst. Den Rezeptor in noch höherem Maße exprimierende Mäuse starben im Alter
von 4 Wochen, sie zeigten dabei stark dilatierte Herzen, Lungenödeme und
Pleuraergüsse. ZHAO et al. (2002) wiesen nach, dass bei Mausembryonen im Alter
von 15 Tagen A3AR in geringem Maße nur im Herzen und der Aorta exprimiert
werden, bei 4 Wochen alten Tieren werden A3AR in geringem Maße im Gehirn und in
der Milz, in hohem Maße in den Hoden exprimiert. In anderen Geweben, z. B. Herz,
sind sie bei erwachsenen Mäusen nicht nachweisbar.
30
2. Stand der Forschung
2.7 Elektrokardiogramm bei der Maus
Im Jahr 1952 beschrieb LOMBARD, 1953 RICHARDS et al. das Elektrokardiogramm
(EKG) kleiner Säugetiere. Die EKGs von Mäusen und kleineren Tieren unterschieden
sich deutlich von dem des Menschen. So war bei einigen EKGs keine T-Welle oder
aber eine T-Welle, die direkt auf die S-Zacke folgt, vorhanden. Dabei trat kein
isoelektrisches ST-Segment auf. Desweiteren zeigten die Tiere eine schnellere
Herzfrequenz mit kürzeren P-R und QRS-Intervallen. Diese bereits 50 Jahre alten
Befunde
geben
bereits
Hinweise
auf
typische
Charakteristika
der
Elektrokardiogramme kleiner Säugetiere. Charakteristisch für das Maus-EKG ist,
dass kein klares ST-Segment nachweisbar ist und dass die T-Welle mit dem letzten
Teil des QRS-Komplexes verschmilzt (WEHRENS et al., 2000).
Die Repolarisation des Ventrikels beginnt in Oberflächen-EKGs am J-Punkt und
endet mit dem Ende der T-Welle. Der J-Punkt wird definiert als der Punkt, an dem
der QRS-Komplex abrupt in das ST-Segment übergeht (GUSSAK et al., 2000). Liegt
der J-Punkt nicht auf der isoelektrischen Linie, kommt es zur Bildung der J-Welle. Die
J-Welle
ist
eine
typische
EKG-Veränderung
bei
Hypothermie,
also
eine
pathophysiologische Veränderung (GUSSAK et al., 1995). Bei Ratten und Mäusen,
jedoch
nicht
beim
Meerschweinchen,
ist
die
J-Welle
Teil
des
normalen
(physiologischen) Oberflächen-EKGs bei Tieren, die älter als 14 Tage sind (GUSSAK
et al., 2000). Bei Mäusen werden die Aktionspotentiale im Ventrikel mit
zunehmendem Alter kürzer. Die Plateauphase wird dabei durch die altersabhängige
Zunahme eines 4-AP sensitiven Kaliumauswärtsstromes (ITO) verkürzt. ITO ist bei
Meerschweinchen kaum, bei Menschen deutlich nachweisbar. Interessanterweise ist
ITO bei Patienten mit Herzinsuffizienz, bei Hunden mit Herzmuskeldystrophie und bei
Deutschen Schäferhunden mit Erbanlagen für einen plötzlichen Herztod reduziert
(GUSSAK et al., 2000).
Aufgrund einer hohen Dichte von ITO in Mausventrikelzellen adulter Tiere erfolgt hier
die Repolarisation sehr schnell und stellt sich im Oberflächen-EKG als J-Welle dar
(GUSSAK et al, 2000). ITO kann in 2 Ströme unterteilt werden, ITO,f (öffnet sich schnell
und wird schnell inaktiviert) und ITO,s (öffnet sich schnell, schließt langsam) (GUO et
31
2. Stand der Forschung
al., 1999). Zwei weitere K+ Auswärtsströme (IK,s und Iss) sind verantwortlich für die
langsamere
Repolarisationsphase
und
die
Rückkehr
der
Zelle
zum
Ruhemembranpotential (GUSSAK et al., 2000) (siehe auch Abb. 1).
Die beschriebenen elektrophysiologischen Besonderheiten resultieren in einem z. B.
vom Menschen abweichenden Aussehen der aufgezeichneten EKG-Kurven.
Abbildung 3: Schematische Darstellung einer typischen Maus-EKG-Kurve
2.8 Fragestellung
Die Tiermodelle der A1 und A3AR überexprimierenden Maus sind bereits in
verschiedenen Untersuchungen näher charakterisiert worden. Meistens war nur das
aus dem Organismus entnommene Organ Herz Gegenstand der Untersuchung, im
Vordergrund stand dabei die Vertiefung von Erkenntnissen der kardioprotektiven
Wirkung beider Rezeptoren sowie die möglichen Auswirkungen einer Überexpression
auf die Verringerung von ischämischen Schäden im Myokard. Systematische
Untersuchungen zur Elektrophysiologie, wie z. B. Langzeit-EKGs, Einfluss von
Belastung
oder
zur
Morphologie
im
Rahmen
von
echokardiographischen
Untersuchungen, wurden bisher kaum durchgeführt. In der vorliegenden Arbeit
wurden die Herzen der transgenen Mäuse in vivo phänotypisiert. Dies ermöglichte
auch die Darstellung eines (altersabhängigen) Verlaufs eventuell auftretender
Veränderungen. Die Frage, ob die Überexpression von A1 oder A3AR kardioprotektiv
wirkt, ist nicht Gegenstand dieser Arbeit. Die molekularen Mechanismen, die bei der
32
2. Stand der Forschung
Kardioprotektion eine Rolle spielen können, bilden aber für die vorliegende Arbeit
eine Arbeitsgrundlage.
Die Beeinflussung einer A1AR Aktivierung auf
die
Schrittmacherregionen im Herz ist zum Teil schon bekannt, überexprimierte A1AR
könnten jedoch teilweise andere Signaltransduktionswege (gegenteilige Wirkung
überexprimierter Rezeptoren gegenüber „normalen“ Rezeptoren, s. Tab. 1) nutzen.
Eine kardiale Überexpression von A3AR scheint mit negativen morphologischen
Veränderungen einherzugehen, Hinweise auf deren Ursache gibt es bisher nicht. Die
Überexpression von A3AR scheint die Grundherzfrequenz herabzusetzen, eine
Aktivierung „normaler“ Rezeptoren zeigte bei verschiedenen Versuchen keinen
Einfluss auf die Herzfrequenz.
In dieser Arbeit sollen daher folgende Fragen untersucht werden:
Hat die herzspezifische, chronische Überexpression der Adenosinrezeptoren A1 und
A3 transgener Mäuse Auswirkungen auf die Elektrophysiologie und die Morphologie
des Herzens? Wenn ja, besteht ein Zusammenhang zwischen den Veränderungen?
Üben überexprimierte A1 und A3 Adenosinrezeptoren in vivo eine Wirkung auf den
Sinus- oder den AV-Knoten in Ruhe oder während Belastungsphasen aus?
Sind Folgen einer A3 Adenosinrezeptorüberexpression vom Alter der Tiere oder vom
Expressionsniveau abhängig?
33
3. Experimenteller Teil
3. Experimenteller Teil
3.1 Tiere und Tierhaltung
3.1.1 A1-Adenosin-Rezeptor (A1AR) überexprimierende Mäuse
Die Entwicklung der transgenen A1AR überexprimierenden Mäuse erfolgte in den
Departments of Pediatrics and Internal Medicine und dem Cardiovascular Research
Center der University of Virginia, Charlottesville (MATHERNE et al., 1997). Einzelne
Tiere wurden im Rahmen einer Zusammenarbeit an das Institut für Pharmakologie
und Toxikologie der Universität Münster weitergegeben und hier vermehrt. Da die
transgene Tierlinie, die in dieser Arbeit verwendet wurde, zum Zeitpunkt der
Versuche bereits an anderer Stelle hergestellt und genotypisiert wurde, wird im
folgenden auf beide Verfahrensweisen nur kurz eingegangen.
Zur Herstellung der transgenen Maus wurde zunächst ein Fragment der Ratten A1AR cDNA mittels der Restriktions-Endonuklease EcoRIXhoI abgespalten und mit
einem konstruierten Q-MHC Promotor verbunden. Der so hergestellte Promotor
bewirkte im entwickelten Tier eine hohe Expression der DNA-Sequenz im Herzen
und in geringem Masse auch in der Aorta. Das A1AR cDNA Promotor-Konstrukt
wurde mit der Restriktions-Endonuklease NotI gespalten, gereinigt und in den
Vorkern eines befruchteten, einzelligen Mausembryos injiziert (MATHERNE et al.,
1997).
Die Mauslinie, die hier verwendet wurde, zeigte eine 200- bis 300-fache
herzspezifische Überexpression des A1AR.
Um im Folgenden den Genotyp der Maus zu bestimmen (wt= Wildtyp, nicht transgen,
oder tg= transgen) wurde im Alter von 3 Wochen eine Genotypisierung mittels
Polymerasekettenraktion (PCR) und einer anschließenden Größenbestimmung der
amplifizierten Genabschnitte vorgenommen. Die DNA wurde aus einem bis zu 1
Zentimeter langen Stück der Schwanzspitze isoliert.
34
3. Experimenteller Teil
Der bei der PCR verwendete vordere Primer bindet innerhalb des transgenen Q-MHC
Promotors, der reverse Primer bindet innerhalb der Kodierungssequenz des RattenA1AR. Nur bei transgenen Tieren entstanden PCR-Produkte der erwarteten Größe
von 460 bp (NEUMANN et al., 1999, MATHERNE et al., 1997). Eine große Anzahl
der überexprimierten Rezeptoren war an G-Proteine gekoppelt (MATHERNE et al.,
1997).
3.1.2 A3-Adenosin-Rezeptor (A3AR) überexprimierende Mäuse
Die Herstellung der transgenen A3AR überexprimierenden Mäuse erfolgte im
Department of Pharmacology & Toxicology, Medical College of Wisconsin (BLACK et
al., 2002). Einzelne Tiere wurden im Rahmen einer Zusammenarbeit an das Institut
für Pharmakologie und Toxikologie der Universität Münster weitergegeben und hier
vermehrt. Herstellung und Genotypisierung der Mäuse soll auch hier nur kurz
dargestellt werden.
Zur Herstellung der transgenen Maus wurde ein lineares DNA Fragment, das den QMHC-Promotor, die cDNA des caninen A3AR in voller Länge, sowie die
Polyadenylationssequenz
eines
humanen Wachstumshormon
enthält,
mittels
Digestition mit NotI freigesetzt und in den Vorkern einer befruchteten Mausoozyte
injiziert. Anschließend wurde die Oozyte in den Eileiter einer scheinschwangeren
Maus transferiert.
Die
Genotypbestimmung
der
entstandenen
F0
Mäuse
erfolgte
mittels
Polymerasekettenreaktion. Ein Primer war dabei spezifisch für den A3 AR, der
anderer Primer war spezifisch für den Q-MHC-Promotor (BLACK et al., 2002).
Um die Genotypen der nachgezüchteten Mäuse zu bestimmen wurde bei ihnen im
Alter von 3 Wochen aus einem bis zu einem Zentimeter langen Stück der
Schwanzspitze DNA isoliert und mittels PCR genotypisiert.
Es wurden 2 Mauslinien untersucht, die den A3AR in unterschiedlicher Menge
überexprimieren. Die eine Linie exprimiert den Rezeptor in einem geringen Maße
(A3low, 12,7 +/- 3,2 fmol A3AR pro mg Protein, Insertion einer Kopie des Konstruktes),
die andere in einem hohen Maße (A3high, 66,3 +/- 9,4 fmol A3AR pro mg Protein,
35
3. Experimenteller Teil
Insertion von 6 Kopien des Konstruktes). Die Rezeptoren beider Linien sind mit einer
hohen Affinität an das Gi Protein gekoppelt (BLACK et al., 2002).
3.1.3 Tierhaltung
Während der Telemetriephase wurden die Tiere einzeln in Makrolonkäfigen Typ II auf
staubfreiem Weichholzgranulat gehalten. Zusätzlich wurden die Käfige mit einem
Papiertuch als Nestmaterial ausgestattet, um den Tieren eine Rückzugsmöglichkeit
zu bieten. Tiere, die nur für elektro- oder echokardiographische Untersuchungen
verwendet wurden, wurden in Gruppen bis zu 4 Tieren in Makrolonkäfigen Typ II
ebenfalls auf staubfreiem Weichholzgranulat gehalten. Die Tiere erhielten ebenfalls
Papiertücher als Nestmaterial.
Die Raumtemperatur lag für alle Tiergruppen bei 22 +/- 2°C, die relative
Luftfeuchtigkeit bei 55 +/- 5%, die Belichtung fand von 07.00 bis 19.00 Uhr MEZ statt.
Die Mäuse wurden mit einem pelletierten, autoklavierten Haltungsfutter für
Ratten/Mäuse der Firma Altromin GmbH (Lage, D) (Inhaltsstoffe: Rohprotein 19,0%,
Rohfett 4,0%, Rohfaser 6,0%, Rohasche 7,0%, Calcium 0,9% und Phosphor 0,7%;
Zusatzstoffe je kg: Vit. A 15.000 IE, Vit. D3 600 IE, Vit. E 75 mg, Kupfer 5 mg) ad
libitum gefüttert. Zur Wasserversorgung wurde Leitungswasser aus Tränkeflaschen
ad libitum bereitgestellt.
3.1.4.Genehmigung
Das Versuchsvorhaben wurde von der Bezirksregierung Münster unter der Nummer
G 61/99 genehmigt.
36
3. Experimenteller Teil
3.2 Elektrophysiologische Untersuchungen
3.2.1 Erstellung des Oberflächenelektrokardiogramms
Die Erstellung des 6 Kanal Elektrokardiogramms (EKG) erfolgte nichtinvasiv, als
Oberflächen-EKG
(KORTE
Standardableitungen
I,
II
2002).
und
III
Abgeleitet
nach
wurden
Einthoven
sowie
die
bipolaren
die
unipolaren
Standardableitungen aVR, aVL, aVF nach Goldberger.
Vor der Aufzeichnung wurden die Mäuse narkotisiert. Es wurden hiefür Ketamin und
Xylazin (50 mg Ketamin und 10 mg Xylazin pro kg Körpergewicht) oder Urethan (2g
pro kg Körpergewicht) intraperitoneal injiziert.
Zur Aufzeichnung der Oberflächen-EKGs wurden die Mäuse in Rückenlage auf eine
Wärmeplatte (40°C) gelegt. Schlaufenelektroden aus weichem, geflochtenem, nichtoxidierbarem Stahldraht wurden in Elektrodengel getaucht und sanft um die
Gliedmaßen der Mäuse gezogen. Anschließend wurden die Gliedmaßen leicht vom
Tierkörper abgespreizt und mit Klebeband fixiert.
Die EKG-Schlaufenelektroden waren mit einem herkömmlichen EKG-Schreiber
verbunden.
Die
EKGs
wurden
vorverstärkt
und
ohne
Filter
mit
einer
Laufgeschwindigkeit von 100mm/s und einer Amplitude von 20mm/mV auf
handelsüblichem EKG-Papier aufgezeichnet.
Bei 3 Wochen alten Mäusen konnten Oberflächen-EKGs ohne Narkose durchgeführt
werden. Die Mäuse wurden dabei mit der Hand im Nacken gehalten, in Rückenlage
auf die Wärmeplatte gelegt, die Schlaufenelektroden angebracht und das EKG
aufgezeichnet.
37
3. Experimenteller Teil
3.2.2 Erstellung des telemetrischen Elektrokardiogramms
Zur
telemetrischen
Datenerfassung
wurde
in
dieser
Arbeit
die
drahtlose
Radiotelemetrie, die Übertragung von Messwerten über Funkwellen verwendet.
3.2.2.1 Aufbau der Anlage
Bildschirm
Maus mit
Transmitter
OutputMatrix
InputMatrix
Receiver
PC
PC mit
Speichermedium
Abbildung 4: Schematische Darstellung des Aufbaus der Telemetrieanlage
Zunächst wurden die vom schlagenden Mausherzen erzeugten elektrischen
Potentialänderungen von einem in den Mauskörper implantierten Transmitter
registriert und die empfangenen Signale mit Hilfe von elektrischen Schaltsystemen
innerhalb des Transmitters verstärkt und gefiltert. Anschließend wurden die Signale
in Radiofrequenzsignale konvertiert und über weitere Schaltkreise und Antennen des
Transmitters an einen Receiver gesandt. Dieser Receiver hatte die Form einer Platte,
die sich unter dem Käfig der Maus befand und die gesamte Käfiggrundfläche bzw.
den gesamten Aktivitätsrahmen der Maus (z.B. beim Schwimmen) abdeckte. Die
Radiofrequenzsignale wurden von dem Receiver empfangen, die vom Transmitter
verstärkten Signale über ein Kabel an eine sogenannte „Input-Matrix“ weitergeleitet.
Hier wurden die Signale digital gefiltert und an einen Computer weitergeleitet. Mit
Hilfe des Computerprogramms der Firma „Data Science“ konnten die Daten
registriert und die Funktion der einzelnen Receiver überwacht werden. Von hier
38
3. Experimenteller Teil
wurden die Daten weitergeleitet an die sogenannte „Output-Matrix“, dort erneut
analogisiert und anschließend an einen weiteren Computer, der die Daten mit Hilfe
eines in der Arbeitsgruppe Kirchhof/Fabritz in Zusammenarbeit mit der Arbeitsgruppe
Knollmann/Morad und Franz, Dept. of Pharmacology, Georgetown University,
Washington DC erstellten Programmes aufzeichnet und off line digital auswertete,
weitergegeben. Das Programm basierte auf einem veröffentlichten Programm zur
Analyse von monophasischen Aktionspotentialen (FRANZ et al., 1995). Die
Elektrokardiogramme wurden mit einer sampling rate von 1000 Hz aufgezeichnet und
zur off line Analyse auf CD gespeichert.
Der in dieser Arbeit verwandte kommerziell erhältliche implantierbare EKGTransmitter besteht aus einem versiegelten, biokompatiblen Plastikgehäuse. Der
Transmitter hat ein Volumen von 1,9 ml und wiegt 4 g. Er enthält die Batterie, einen
Signalverstärker und Radiofrequenzelektronik. Am vorderen Ende entlässt der
Transmitter 2 flexible, ca. 7 cm lange, rostfreie, flexible Stahldrähte. Diese sind mit
farbigem Silikon zur Isolierung überzogen (rot (-) und weiß (+)). Der Transmitter kann
mit Hilfe eines Magneten aktiviert oder deaktiviert werden. Der Aktivitätsstatus kann
durch Empfang der Amplituden-modulierten Signale mit einem handelsüblichen
Radio überprüft werden. Ist der Transmitter implantiert, ist für jeden Herzton ein
„Piep“-Ton hörbar. So ließ sich auch ohne ein weiteres System die Herzfrequenz, z.
B. intra- und postoperativ, überwachen.
Aufgrund der Lokalisation der Drahtenden des Transmitters innerhalb des
Mauskörpers (rechter Arm, linkes Bein) wurde die Standardableitung II nach
Einthoven abgeleitet.
3.3.2.2 Implantation des Transmitters
Die Maus wurde mit 50 mg Ketamin pro kg Körpergewicht und 10 mg Xylazin pro kg
Körpergewicht,
intraperitoneal
injiziert,
anästhesiert.
Nach
Ausfall
des
Zwischenzehen-Reflexes wurde die Haut im Bereich des Bauches, des rechten
39
3. Experimenteller Teil
Armes, der rechten Achselhöhle und der linken Oberschenkelinnenseite großzügig
rasiert und enthaart.
Nun wurde die Maus auf einer steril abgedeckten Wärmeplatte an allen 4
Gliedmaßen fixiert. Um die Wärmeaufnahme der Maus zu verbessern, wurde der
Schwanz ebenfalls auf der Platte fixiert. Zur Desinfektion der Haut im Operationsfeld
diente ein handelsübliches Spray.
Zunächst wurde die Haut am Bauch mit einem 2 cm langen Schnitt entlang der
Mittellinie, anschließend die darunterliegende Bauchmuskulatur entlang der Linea
alba eröffnet. Der Transmitter wurde nun vorsichtig vollständig in die Bauchhöhle auf
das Darmkonvolut geschoben. Die Drähte zeigten dabei in Richtung des Kopfes der
Maus, die in den Transmitter eingelassenen „Schlaufen“ in Richtung des Betrachters.
Im Bereich des cranialen Wundwinkels wurde die Bauchmuskulatur auf der rechten
Seite ca. 2 mm unterhalb des Wundrandes mit einem dünnen Trokar von außen nach
innen durchstochen, der rote Draht eingefädelt und nach außen gezogen. Der weisse
Draht blieb im vorderen Wundwinkel liegen. Nun wurde die Bauchmuskulatur mit
einer einfachen Knopfnaht vollständig verschlossen. Durch Fixierung der 3 Schlaufen
des Transmitters in der Bauchmuskelnaht wurde ein Verrutschen des Transmitters
verhindert.
Anschließend wurde ein kleiner Hautschnitt im Bereich der Achsel gesetzt, der
Trokar eingeführt und subkutan nach caudal, entlang der seitlichen Brustwand bis in
den Bereich des cranialen Wundwinkels des Bauchschnittes vorgeschoben. Der rote
Draht wurde erneut eingefädelt und durch Rückziehen des Trokars subkutan verlegt.
Das Kabel wurde nun gekürzt, so dass es etwa 5 mm aus dem Hautschnitt an der
Achsel hervorragte. Die Kabelisolierung wurde am Ende ca. 5 mm entfernt. Um
spätere Irritationen zu vermeiden, wurde die Drahtspitze mit einem aufdrehbaren
Silikonhütchen versehen. Der nichtisolierte Bereich des Kabels wurde nun mittels
eines Einzelheftes und nichtresorbierbarem Nahtmaterial an der Oberarmmuskulatur
fixiert.
Der Trokar wurde ein weiteres Mal subkutan durch einen Hautschnitt im Bereich der
linken Oberschenkelinnenseite an der seitlichen Bauchwand entlang ebenfalls in den
cranialen Wundwinkel vorgeschoben. Die Haut im Bereich der seitlichen Bauchwand
40
3. Experimenteller Teil
wurde vorher großzügig von der Unterlage gelöst, um eine Tasche für den Draht zu
bilden. Der weiße Draht wurde eingefädelt und durch Zurückziehen des Trokars
subkutan bis zum Hautschnitt am Oberschenkel verlegt. Hier wurde der Draht wie an
der Schulter gekürzt, entisoliert und die Spitze versiegelt. Anschließend erfolgte die
Fixierung des entisolierten Kabelendes an der inneren Oberschenkelmuskulatur. Von
jetzt an konnte die Herzfrequenz mit Hilfe eines Radios überprüft werden. Die
Hautwunden wurden mit fortlaufenden Kürschnernähten und resorbierbarem
Nahtmaterial verschlossen.
Die Gesamtzeit der Operation (Injektion der Narkose bis Hautverschluss) betrug etwa
50 Minuten. Die Maus wurde nach der Operation in ihren Käfig gelegt, zur Regulation
des Flüssigkeitshaushaltes erhielten die Tiere 2 ml Sterofundin subkutan in 2 bis 4
Dosen innerhalb von 15 Minuten direkt im Anschluss an die Operation. Außerdem
wurden die Mäuse noch 24 h unter Rotlicht gehalten, um ein Auskühlen in der
postoperativen Aufwach- und Erholungsphase zu vermeiden. Ein Analgetikum
(Ibuprofen 7 mg/kg, GABRISCH u. ZWART (Hrsg.),1998) wurde über 4 Tage über
das Trinkwasser und eingeweichte Futterpellets verabreicht. Über 3 Tage wurde
prophylaktisch ein Antibiotikum (Enrofloxacin 5mg/kg, GABRISCH u. ZWART
(Hrsg.),1998), täglich subkutan injiziert, eingesetzt.
Nach einer 10 bis 14 tägigen Erholungsphase begannen die Messungen. Die Tiere
wurden täglich gewogen und die Wundheilung kontrolliert.
3.3.2.3 Erstellung des Ruhe-EKGs
Je nach Genotyp wurde eine Zeitspanne von 30 Minuten (A1AR+ Mäuse) oder einer
Stunde (A3AR+ Mäuse) gewählt. Die auszuwertende Zeitspanne wurde dabei aus
einer 24h-Aufzeichnung in der Zeit zwischen 13 und 14 Uhr isoliert.
3.3.2.4 Erstellung des Belastungs-EKGs
Das Belastungs-EKG wurde während einer 5 minütigen Schwimmphase der Maus
aufgezeichnet. Das „Schwimmbecken“ war 20 cm hoch, 35 cm lang und 13,5 cm
breit. Die Wassertemperatur betrug 36°C.
41
3. Experimenteller Teil
Es wurden bis zu 4 Mäuse gleichzeitig unter ständiger Kontrolle schwimmen
gelassen.
Jede
Maus
hatte
dabei
ihr
„eigenes
Schwimmbecken“,
jedes
Schwimmbecken wurde auf einem Receiver platziert.
Nach Ablauf der 5 Minuten wurde die Maus in ihren Käfig gesetzt und das EKG
anschließend noch eine Stunde (Erholungsphase) aufgezeichnet. Während der
ersten halben Stunde wurde ein Teil des Käfigs mit Rotlicht ausgeleuchtet, um die
Trocknungsphase der Maus zu beschleunigen, da sich die Qualität des EKGs durch
starke Fellpflegeaktivität verschlechterte.
3.2.3 Auswertung der Elektrokardiogramme
Die
Oberflächen-EKGs
wurden
manuell
ausgewertet.
Dabei
wurden
der
Herzrhythmus, die Amplitude und die Dauer der P-Welle, die Amplitude des QRSKomplexes, die Dauer des PQ- sowie des RR-Intervalls bestimmt. Die Messungen
erfolgten am Ende jeder Registrierungsperiode. Es wurden dabei jeweils 10
Einzelwerte gemessen und aus diesen der Mittelwert errechnet. Die Herzfrequenz
wurde aus den Daten errechnet.
Die Amplituden wurden von ihrer Basis auf der isoelektrischen Linie bis zur
Zackenspitze gemessen. Die Intervalle und die Dauer der P-Welle wurden
gemessen, indem der früheste Beginn und das späteste Ende der atrialen und
ventrikulären Abweichungen von der isoelektrischen Linie in 3 im Oberflächen EKG
simultan aufgezeichneten Ableitungen bestimmt wurde. Im telemetrischen EKG stand
nur eine Ableitung zur Verfügung.
42
3. Experimenteller Teil
Abbildung 5: Schematische Darstellung eines einkanaligen Maus-Elektrokardiogramms
Quelle: Hagendorff et al., 1999
Die Analyse der telemetrischen EKGs jeder Maus erfolgte mit einem halbautomatischen Analyseprogramm für die off-line-Analyse von Maus-EKG-Signalen,
das auf der LABVIEW-Programmiersprache basiert. Das Programm bestimmte die
Länge der RR-Intervalle und errechnete die Herzfrequenz. Die vom Computer
bestimmten Intervalle wurden vollständig manuell durchgesehen und Ausreißer durch
EKG-Vergleich bestimmt und eliminiert.
Die telemetrischen EKGs wurden vollständig visuell kontrolliert, um Arrhythmien zu
erfassen.
Zur Auswertung des Ruhe-EKGs wurden die RR-Intervalle aus den ausgewählten
Sequenzen, beim Belastungs-EKG aus der fünfminütigen Schwimmphase und der
anschließenden
einstündigen
Erholungsphase
ermittelt.
Um
das
Ende
der
Erholungsphase genauer charakterisieren zu können, wurden die letzten 5 Minuten
zusätzlich auch noch als Einzelsequenz behandelt. Für die RR-Intervalle und die
daraus errechnete Herzfrequenz jedes Protokollabschnittes wurden der Mittelwert,
die Standardabweichung sowie die Quantile berechnet und das maximalste und
minimalste Intervall bestimmt.
43
3. Experimenteller Teil
Neben den RR-Intervallen wurden auch PQ-Intervalle gemessen. Diese wurden für
die einzelnen Protokollabschnitte manuell bestimmt. Es wurden jeweils 20
Einzelwerte gemessen und deren Mittelwert bestimmt.
Für die Auswertung war der Auswerter bezüglich des Genotyps geblindet.
3.2.4 Telemetrisches EKG nach Gabe von Pertussistoxin
Um die antiadrenerge Wirkung von überexprimierten A1AR näher zu untersuchen,
wurde bei 4 Paaren von transgenen A1AR+ Tieren und nichttransgenen
Geschwistern nach Abschluss der Versuche Pertussistoxin (PTX) in einer Dosierung
von 150 µg/kg Körpergewicht intraperitoneal injiziert, um eine Hemmung der GiProteine zu induzieren. Die verwendete Dosierung ruft an isolierten linken Vorhöfen
von Mäusen eine Hemmung des negativ inotropen Effekts von Adenosin und
Carbachol hervor (NEUMANN et al., 1999). Zur Kontrolle der Herzfrequenz wurde
eine ½ stündige telemetrische Aufzeichnung vor der Applikation sowie jeweils 24 und
48 Stunden nach der PTX-Applikation zugrunde gelegt und die durchschnittlichen
und maximalen Herzfrequenzen bestimmt. Es wurden jeweils manuell 30 PQIntervalle gemessen, innerhalb der ausgewählten ½ -stündigen Sequenz alle 5
Minuten 5 aufeinanderfolgende Intervalle.
Nach Ablauf der 48 Stunden wurden die Tiere eingeschläfert.
44
3. Experimenteller Teil
3.3 Transthorakale Echokardiographie
3.3.1 Durchführung
Zur Durchführung der Ultraschalluntersuchung wurde die Maus zunächst sediert (30
mg Ketamin S und 10 mg Xylazin pro kg Körpergewicht intraperitoneal).
Anschließend mußte der ventrale und linksseitige Brustkorb, sowie der craniale
Bauchbereich vom Haarkleid befreit werden. Um die Bildqualität zu verbessern,
wurde der rasierte Bereich mit einer Creme vollständig enthaart. Die sedierte Maus
wurde in Rückenlage mit Hilfe von Klebestreifen an den Gliedmaßen auf einer
Plexiglaswärmeplatte fixiert. Mit Kontaktgel benetzte EKG-Elektrodenplättchen
wurden unter die beiden Vorderpfoten und die linke Hinterpfote geschoben und in die
Fixation integriert. So konnte simultan mit der echokardiographischen Untersuchung
ein Ein-Kanal-EKG aufgezeichnet werden. Das Ultraschallgerät bestimmte laufend
die Herzfrequenz der Maus. Im seltenen Fall von tiefen Bradykardien (HF<170/min)
wurde die Untersuchung abgebrochen und tachykardisierende Maßnahmen (externe
Erwärmung, Entfernung der Fixation, Körpermassage, Isoprenalingabe) eingeleitet.
Die Wärmeplatte wurde in einem Winkel von 15° gekippt, so dass die Maus in linker
Seitenlage zu Liegen kam. Der Brustkorb wurde nun mit zentrifugiertem
Ultraschallgel
großzügig
bedeckt.
Zunächst
wurden
mit
einem
15
MHz
Linearschallkopf Längs- und Querachsenansichten des Herzens dargestellt. Hierbei
wurden aus der Echokradiographie beim Menschen bekannte Standardeinstellungen
(lange und kurze parasternale Achse) gewählt. Bei der Längsachsenansicht wurde
der Schallkopf, vom linken Rippenbogen zur rechten Schulter weisend, leicht in das
Gelkissen eingetaucht, ohne Druck auszuüben. In der bildlichen Darstellung lag die
Aortenwurzel waagerecht im rechten Bildausschnitt. Bei geschlossener Aortenklappe
erschien diese als Mittelecho innerhalb der Aorta. Der linke Ventrikel schloß sich im
Bild waagerecht nach links weisend an. Weiterhin sichtbar waren das linke Atrium
und Teile des rechten Ventrikels (s. Abb. 6).
45
3. Experimenteller Teil
Abbildung 6: Schematische Darstellung einer echokardiographischen Längsachsenansicht des
Herzens
Quelle: nach Köhler u. Tataru, 2001
IVS:
Interventrikuläres Septum
LV:
Linker Ventrikel
LVW:
Hinterwand des linken Ventrikels
RV:
Rechter Ventrikel
In
der
Querachsenansicht
(Drehung
des
Schallkopfes
um
90°
mit
dem
Uhrzeigersinn) wurde die Standardeinstellung durch die Papillarmuskelebene
repräsentiert. Der rechte Ventrikel liegt dem linken Ventrikel dabei im linken oberen
Bildauschnitt an (s. Abb. 7).
46
3. Experimenteller Teil
Abbildung 7: Schematische Darstellung einer echokardiographischen Querachsenansicht des
Herzens
Quelle: nach Köhler u. Tataru, 2001
IVS:
Interventrikuläres Septum
LV:
Linker Ventrikel
LVW:
Hinterwand des linken Ventrikels
RV:
Rechter Ventrikel
Ein Scan von der Aorten- und Mitralklappenebene bis zur Herzspitze wurde ebenfalls
durchgeführt.
Time Motion-Modes (M-Mode) wurden in der Längsachsenansicht dicht unterhalb der
Mitralklappe mit deutlicher Darstellung des interventrikulären Septums, des linken
Ventrikels und der linken Ventrikelwand angefertigt. Bei im Querschnitt auf
Papillarmuskelebene angefertigten M-Modes wurde der Schallstrahl direkt zwischen
die Papillarmuskeln gelegt. So konnten die gleichen Strukturen und die gleiche
Ebene wie im Längschnitt dargestellt werden.
Zur Doppler-Echokardiographie wurde ein 12 MHz Sektorschallkopf verwendet. Ihm
wurde zur Linearisierung der Ultraschallsignale eine ca. 1 cm lange Vorlaufstrecke
(Zeigefinger
eines
handelsüblichen
puderfreien
Latexhandschuhs)
aus
zentrifugiertem Ultraschallgel vorgeschaltet. Es wurde das CW- (continuous wave)
Dopplerverfahren verwendet, um den Blutstrom im Bereich der Aorten- und der
Mitralklappe darzustellen. Dabei werden ständig Ultraschallwellen ausgesandt und
47
3. Experimenteller Teil
gleichzeitig
empfangen.
Geschwindigkeiten
So
registriert
können
langsame,
werden
und
aber
auch
sehr
es
entstehen
schnelle
typische
Dopplerfrequenzspektren, mit deren Hilfe der gedoppelte Gefäßbereich definiert
werden und die Flussgeschwindigkeiten gemessen werden können (NAUTRUP und
TOBIAS (Hrsg), 2001). Der Schallkopf wurde dabei so ausgerichtet, dass im 2-D-Bild
eine Querachsenansicht des Herzens dargestellt wird (links parasternal). Der Strahl
wurde durch die Aorta gelegt. Zur Darstellung des Blutstromes durch die Mitralklappe
wurde der Schallkopf stark geneigt, so dass er in seiner Verlängerung auf die rechte
Schulter der Maus treffen würde (Annäherung an den apikalen Vierkammerblick). Es
entstanden Kurven, die denen des Menschen oder des Hundes ähneln.
Zur Minimierung der Untersuchungszeit wurden die Bilddaten digital auf MagnetoOptical Disc zur off line Analyse gespeichert.
Nach der Untersuchung wurde die Maus von der Fixation befreit und anschließend
noch mindestens 2 Stunden unter Rotlicht gehalten. Von der Sedation bis zum Ende
der Untersuchung vergingen in der Regel 20 bis 25 Minuten.
3.3.2. Auswertung
Alle Messungen erfolgten offline durch einen Untersucher. Dieser war dabei
bezüglich des Genotyps (transgen- nicht transgen) geblindet. Einzelne Variablen, die
sich nicht optimal messen ließen oder bei denen die Anschallungsebene nicht den
Standardschnitten entsprachen, wurden, nach vordefinierten Qualitätskriterien, in der
Auswertung nicht berücksichtigt.
Die
Messungen
der
Echokardiographiegerät
einzelnen
Parameter
integrierten
erfolgte
Messsystem.
mit
Bei
dem
in
das
quantitativen
Distanzmessungen wurde nach der „Leading-Edge-Methode“, entsprechend den
Leitlinien der „Amerikanischen Gesellschaft für Echokardiographie“, verfahren.
Hierbei wird von der Vorderkante der jeweils interessierenden Echolinie gemessen.
In den 2 dimensionalen Standardeinstellungen wurden 9 Parameter gemessen. So
wurden
in
der
enddiastolischen
Längsachenansicht
der
linksventrikuläre
Ausflusstrakt (LVOT) und der Aortenwurzeldurchmesser (AoV) gemessen. Der
48
3. Experimenteller Teil
linksatriale Durchmesser (LA) wurde in der endsystolischen Längsachsenansicht,
zum Zeitpunkt seiner größten Ausdehnung, gemessen. Ausgemessen wurde die
Distanz zwischen der rückwärtigen Vorhofwand und der hinteren Begrenzung der
hinteren Aortenwand.
Jeder Parameter wurde 5 mal in verschiedenen Einstellungen gemessen und
anschließend der Mittelwert aus den Einzelwerten bestimmt.
Im M-Mode wurden die Wanddicken und der Ventrikeldurchmesser des linken
Herzens bestimmt. In der Diastole wurde die Dicke des interventrikulären Septums
(IVSd) und der linksventrikulären Kammerwand (LVWd) zum Zeitpunkt der
Enddiastole
bestimmt.
Die
Messung
des
linksventrikulären
diastolischen
Durchmessers (LVEDd) erfolgte zum Zeitpunkt der maximalen dorsal gerichteten
Bewegung
des
Kammerseptums
und
der
größten
Anteriorbewegung
der
linksventrikulären Hinterwand. Der linksventrikuläre Durchmesser in der Systole
(LVEDs) wurde zum Zeitpunkt der maximalen Bewegung des Kammerseptums und
der linksventrikulären Hinterwand (kürzeste senkrechte Verbindung zwischen
Septum und Hinterwand) bestimmt. Zum gleichen Zeitpunkt erfolgte die Messung des
interventrikulären Septums (IVSs) und der linksventrikulären Hinterwand (LVWs).
Es wurden für jeden der oben genannten Parameter 5 Messungen in 5 Einstellungen
durchgeführt. Dafür wurden 2 M-Modes des Längsschnittes und 3 M-Modes des
Querschnittes verwendet. Aus den 5 Einzelwerten wurde der Mittelwert bestimmt.
Alle Messwerte wurden in mm angegeben.
Im
CW-Doppler
wurden
5
Parameter
gemessen.
Es
wurden
maximale
Flussgeschwindigkeiten in der Aorta (AoVmax) als Punkt des frühsystolischen
Geschwindigkeitsmaximums
im
Aortendoppler,
desweiteren
maximale
Flussgeschwindigkeiten im atrioventrikulären Übergang im Bereich der Mitralklappe
gemessen. Diese wurden frühdiastolisch (MV Vmax oder MV E Punkt) als der Punkt
der höchsten Flussgeschwindigkeit während des frühdiastolischen Blutstroms zu
Beginn der Diastole direkt nach Klappenöffnung im Mitraldoppler (dies entsprach
dem „ersten Gipfel“ der zweigipfligen Darstellung (E- und A-Welle) des Bluflusses
durch die Mitralklappe) und enddiastolisch (MV A Punkt) als Punkt der höchsten
Flussgeschwindigkeit zum Zeitpunkt der Vorhofkontraktion am Ende der Diastole im
49
3. Experimenteller Teil
Mitraldoppler (dieser entspricht dem „zweiten Gipfel“ der Welle) ermittelt. Die
Geschwindigkeiten werden in cm/s angegeben. Im Aortendoppler wurde außerdem
der
zeitliche
Abstand
zwischen
2
Aortenschlägen
(Ao
R-R)
sowie
die
Dezelerationszeit über der Mitralklappe in ms gemessen. Die genannten Parameter
wurden jeweils 3 mal in 3 verschiedenen Einstellungen gemessen und aus diesen
der Mittelwert errechnet.
Aus den gemessenen Werten wurden folgende Parameter rechnerisch ermittelt:
Parameter
Abk.
Formel
Einheit
Herzfrequenz
HF
1000/AoRR×60
Schläge/min
Linksventrikuläre
Verkürzungsfraktion
FS
((LVEDdLVEDs)/LVEDd)×100
%
Herzzeitvolumen
HZV
Schlagvolumen×Herzfrequenz
ml/min
LVET
Zeit in ms des
Aortendopplersignals
ms
MV E/A
MV E Punkt/ MV A Punkt
Masse des linken Ventrikels
LV
Masse
((IVSd+LVEDd+LVWd) 3
LVEDd )×1,055
mg
Cirkuläre Faserverkürzung
Vcf
10× FS/LVET
Circ/s
nach HF korrigiert
Vcfc
Vcf / Wurzel (RR×100)
Circ/s
Verhältnis vom HZV zum
Körpergewicht
HZV/KG
HZV/KG
g
Linksventrikuläre
Ejektionszeit
Verhältnis von E Punkt zum A
Punkt
3
Tabelle 2: Errechnete Werte aus echokardiographischen Daten
50
3. Experimenteller Teil
3.4 Histologische Untersuchung
Die Mäuse wurden mit Urethan (2g/kg Körpergewicht) tief narkotisiert. Dann wurde
zügig der Brustkorb eröffnet, das Brustbein vom kaudalen Ende angehoben, die
Rippen durchtrennt und das Herz von seiner Fixation gelöst. Zur Säuberung des
Herzens von Blutresten wurde es in gekühlter Natriumchloridlösung geschwenkt,
anschließend wurden die Vorhöfe abgetrennt und in Formalin fixiert. Die
histologischen Untersuchungen der Vorhöfe wurden von Prof. H. A. Baba am Institut
für Pathologie des Universitätsklinikums Münster durchgeführt. Die histologischen
Schnitte wurden mit Hematoxylin-Eosin (HE) und Siriusrot gefärbt. Die Zellen wurden
auf Höhe des Zellkerns vermessen.
A1 AR überexprimierende Mäuse
Es wurden die Vorhöfe von transgenen Mäusen und nichttransgenen Kontrolltieren
im Alter von 26 Wochen untersucht.
A3high und A3low AR überexprimierende Mäuse
Im Alter von 5 Wochen wurden die Vorhöfe von transgenen und nichttransgenen
Kontrolltieren histologisch untersucht. Weitere Untersuchungen erfolgten an 14
Wochen alten Tieren.
3.5 Biochemische Untersuchungen
Die
Kalziumfreisetzung
aus
dem
sarkoplasmatischen
Retikulum
ist
der
Hauptauslöser der kardialen Kontraktion und ein bedeutender Modulator der
Schrittmacheraktivität (MARKS, 2001). Die Wiederaufnahme von Kalzium in das
srakoplasmatische Retikulum hat entscheidende Bedeutung für die Relaxation der
Herzzelle (HAGHIGHI et al., 2001). Um ausschließen zu können, dass eine
Veränderung
im
Kalziumstoffwechsel
für
51
Funktionsstörungen
der
Vorhöfe
3. Experimenteller Teil
verantwortlich sind, wurde die Proteinexpression des kalziumregulatorischen Proteins
Phospholamban und die der Ca2+-ATPase des sarkoplasmatischen Retikulums
SERCA, durch Westernblot bestimmt.
Die biochemischen Untersuchungen erfolgten in Zusammenarbeit mit dem Institut für
Pharmakologie und Toxikologie der Westfälischen Wilhelms-Universität in Münster
von Prof. J. Neumann.
Gewebeteile
des
rechten
und
linken
Vorhofes,
die
bereits
während
der
histologischen Untersuchungen entfernt wurden, und des Ventrikels wurden
schockgefroren und für die biochemischen Untersuchungen präpariert. Die
Gewebeteile von transgenen und Wildtypmäusen wurden homogenisiert und einem
Immunoessay unterzogen. Die Proteine wurden auf Nitrozellulosemembranen
aufgebracht und mit dem Maus-anti-Phospholamban monoklonalen Antikörper 2D12
oder dem herzspezifischem Maus-anti-Ca2+-ATPase monoklonalen Antikörper 2A7A1 inkubiert. Die Antikörper, die nach der Inkubation an die gesuchten Proteine
gebunden waren, wurden mit
125
I-Protein A markiert und mittels Autoradiographie
visualisiert. Die gebundenenen radioaktiven Proteine konnten durch die Benutzung
eines Bio-Rad GS-250 Molekular-Imagers quantifiziert werden.
3.6 Statistik
Die Analyse erfolgte bezüglich des Genotyps geblindet. Die Werte wurden mit Hilfe
des Kolmogorov-Smirnov-Tests auf Normalverteilung überprüft. Nach Feststellung
der Normalverteilung wurden alle Variablen nach Genotypen mit Hilfe des post-hoc
Student`s T test (Microsoft Exel 2000) für gepaarte Stichproben und ANOVA
analyses (SPSS Version 10) verglichen. Als signifikant wurden Unterschiede
anerkannt, die einen zweiseitigen alpha-Fehler mit p-Wert < 0,05 aufwiesen (p<
0,05). Alle Werte wurden als Mittelwert +/- Standardfehler angegeben.
52
3. Experimenteller Teil
3.7 Versuchsablauf und Tierversuchsgruppen
Alle
Versuche
wurden
paarweise
durchgeführt.
Dabei
wurden
immer
ein
nichttransgenes und ein transgenes Geschwistertier gleichen Geschlechts und
gleichen Alters gleichzeitig (Telemetrie) oder direkt hintereinander (OberflächenEKG, Echokardiographie) untersucht.
Die einzelnen Protokollabschnitte waren so geplant, dass an jedem Tier, das
telemetriert wurde, alle Versuche (Oberflächen-EKG, Telemetrie, Echokardiographie)
nacheinander
und
mit
einem
genügenden
Abstand
zwischen
den
Protokollabschnitten durchgeführt werden konnten. 2 Tage vor der TransmitterImplantation wurden die Tiere in den Raum verbracht, in dem alle nachfolgenden
Versuche stattfanden. Am Tag der Implantation wurden die Tiere narkotisiert, das
Oberflächen-EKG geschrieben und die Mäuse anschließend operiert. Nach einer
Zeitspanne von 10 bis 14 Tagen wurden die telemetrischen EKGs aufgezeichnet.
Das
Belastungs-EKG
wurde
zum
Schluss
aufgezeichnet.
Nach
einer
„Erholungsphase“ von 2 Tagen wurden die Tiere erneut narkotisiert und die
Echokardiographie durchgeführt.
Die Versuche wurden zunächst an adulten Tieren durchgeführt.
A1AR überexprimierende Mäuse
Für die Untersuchungen wurden 7 transgene männliche Tiere, sowie 7 nicht
transgene männliche Geschwistertiere mit einem Alter von 28 bis 38 Wochen
verwendet. Die echokardiographischen Untersuchungen wurden an denselben
Tieren nach Abschluss der Telemetrie durchgeführt.
A3high/ A3lowAR überexprimierende Mäuse
Für die Untersuchungen wurden 6 transgene Mäuse (5 weiblich, 1 männlich), sowie 6
nichttransgene Geschwistertiere (4 weiblich, 2 männlich) im Alter von 21 Wochen der
A3high Linie und 4 transgene Tiere ( 2 weiblich, 2 männlich) und 3 nichttransgene
53
3. Experimenteller Teil
Geschwistertiere (1 weiblich, 2 männlich) im Alter von 18 Wochen der A3low Linie
verwendet.
Um Veränderungen der A3highAR überexprimierenden Mäuse im Oberflächen-EKG
und in den telemetrischen EKGs in Beziehung zu altersabhängigen Veränderungen
in der Echokardiographie setzten zu können, erfolgten weitere telemetrische
Untersuchungen an 3 männlichen transgenen Mäusen sowie 2 männlichen
nichttransgenen Geschwistertieren im Alter von 12 Wochen der A3high Linie.
Im Alter von 12 Wochen wurden ebenfalls telemetrische Untersuchungen an 6
transgenen A3lowAR überexprimierenden Mäusen (1 weiblich, 3 männlich), sowie 4
nichttransgenen Geschwistertieren (2 weiblich, 4 männlich) durchgeführt.
Weiterhin wurden im Alter von 5 Tagen und 3 Wochen an 4 transgenen A3highAR
überexprimierenden Mäusen und 4 nichttransgenen Geschwistertieren (jeweils 2
weiblich und 2 männlich) Oberflächen-EKGs ohne Narkose aufgezeichnet.
Um größere n-Zahlen für die Echokardiographie zu erhalten und altersabhängige
serielle echokardiographische Untersuchungen durchführen zu können, wurden
weitere Tiere nur für die jeweilige Untersuchung rekrutiert. Diese Tiere wurden
ebenfalls 2 Tage vor den geplanten Untersuchungen in den Laborraum verbracht, in
dem die Untersuchung durchgeführt wurde.
Serielle echokardiographische Untersuchungen wurden an 13 transgenen Tieren (5
weiblich, 8 männlich) und 13 nichttransgenen Geschwistertieren (5 weiblich, 8
männlich) im Alter von 8 und 12 Wochen der A3high Linie durchgeführt. Für die
echokardiographischen Untersuchungen der A3high Linie im Alter von 23 Wochen
wurden zum einen die Mäuse aus der Telemetrie, zum anderen 3 transgene und 3
nichttransgene Geschwistertiere (alle männlich), die bereits vorher geschallt wurden
(serielle Untersuchung), verwendet. 7 transgene Mäuse der A3high Linie sowie 7
nichttransgene Geschwistertiere wurden im Alter von 2 Wochen untersucht.
An Mäusen der A3low Linie wurden ebenfalls serielle echokardiographische
Untersuchungen durchgeführt. Es wurden 9 transgene (4 weiblich, 5 männlich) sowie
54
3. Experimenteller Teil
deren
nichttransgene
Geschwistertiere
(4
weiblich,
4
männlich)
vor
der
Transmitterimplantation im Alter von 8 Wochen geschallt. Im Alter von 15 Wochen
wurden die gleichen Mäuse (bis auf ein transgenes Männchen) erneut geschallt.
Verstorbene Tiere wurden, wenn möglich, durch neue Tiere ersetzt.
Histologische Untersuchungen wurden im Alter von 5 und 14 Wochen durchgeführt.
Es wurden bei den A1AR+ und A3highAR+ Mäusen 5 Paare (2 Paare weiblich, 3 Paare
männlich) im Alter von über 24 Wochen bzw. 5 Wochen untersucht. Zusätzlich
wurden einzelne Tiere im Alter von 14 Wochen untersucht.
55
4. Ergebnisse
4. Ergebnisse
Zunächst eine Übersicht über die Anzahl der in den einzelnen Versuchsabschnitten
ausgewerteten Tiere. Anschließend werden die Ergebnisse der Versuchsprotokolle
nach Genotypen getrennt dargestellt.
Maustyp
A1 AR+
Genotyp
A3highAR+
A3lowAR+
WT
TG
WT
TG
WT
TG
5 Tage
a
a
4
4
a
a
21 Tage
a
a
4
4
a
a
Ket/Xyl
16 Wochen
6
6
8
9
6
6
Urethan
18 Wochen
6
6
8
8
5
5
12 Wo
a
a
2
3
4
6
16 Wo u. älter
6
6
6
6
6
6
2 Wo
a
a
7
7
a
a
8 Wo
a
a
14
14
8
9
12 Wo/ 15 Wo
a
a
13
13
8
8
18 Wo u. älter
6
6
10
10
a
a
5 Wochen
a
a
5
5
5
5
14 Wochen
a
a
3
2
2
2
24 Wo u. älter
5
5
a
a
a
a
unsediert
Oberflächen-EKG
Telemetrie
Echokardiographie
Histologie
Tabelle 3: Anzahl der Mäuse in den einzelnen Versuchsgruppen
56
4. Ergebnisse
4.1 A1AR überexprimierende Mäuse
4.1.1 Oberflächenelektrokardiogramm
Alle erstellten Oberflächen-EKGs konnten ausgewertet werden. Keine Maus starb
während der Untersuchung.
Die gemessenen Parameter der Oberflächen-EKGs der mit Ketamin/Xylazin oder
Urethan
sedierten
Mäuse
unterschieden
sich
nicht
zwischen
A1AR
überexprimierenden (A1AR+) Tieren und den Wildtypen. Arrhythmien traten nicht auf,
bei beiden Mausgruppen zeigte sich durchgängig ein regelmäßiger Sinusrhythmus.
Ketamin/Xylazin
Urethan
WT
A1AR+
WT
A1AR+
RR-Intervall (ms)
236 ± 12
274 ± 19
97 ± 5
115 ± 0,2
HF (Schläge/Minute)
257 ± 13
223 ± 17
628 ± 33
529 ± 46
P-Wellenlänge (ms)
13 ± 0,3
13 ± 1
18,3 ± 0,6
15,4 ± 2,1
PQ-Intervall (ms)
44 ± 2
46 ±2
37,3 ± 2
36,9 ± 1
QT-Intervall (ms)
66 ± 3
66 ± 2
50 ± 2
54 ± 1
QRS-Amplitude (mV)
0,98 ± 0,06
1,16 ± 0,12
0,76 ± 0,07
0,75 ± 0,07
P-Amplitude (mV)
0,1 ± 0,05
0,08 ± 0,01
0,09 ± 0,02
0,07 ± 0,01
Tabelle 4: Werte der im Oberflächen-EKG gemessenen Parameter von A1AR+ Mäusen und
Wildtypen
Die Werte werden angegeben als Mittelwert ± Standardfehler. Sternchen (*) kennzeichnen
signifikante Unterschiede zwischen den Genotypen.
57
4. Ergebnisse
4.1.2 Telemetrisches Elektrokardiogramm
Während der Implantation des Transmitters starben eine transgene und eine
Wildtypmaus. Während der postoperativen Erholungsphase verstarb eine transgene
Maus. Bei einer Wildtypmaus war das abgeleitete EKG sehr stark verrauscht und
dadurch nicht auswertbar.
Die Unterschiede im EKG zwischen A1AR+-Mäusen und Wildtypen ohne Belastung,
im sogenannten Ruhe-EKG, stellten sich wie folgt dar: die minimalen und
durchschnittlichen Herzfrequenzen unterschieden sich nicht voneinander (minimale
HF 399 ± 32 für WT gegenüber 389 ± 24, durchschnittliche HF 455 ± 27 für WT
gegenüber 414 ± 22 Schläge pro Minute für transgene Tiere). Die maximale erreichte
Herzfrequenz unterschied sich dagegen zwischen Wildtypen und A1AR+-Mäusen,
deren maximale Herzfrequenz niedriger war (522 ± 24 für WT gegenüber 437 ± 18
Schlägen pro Minute für transgene Tiere, p< 0,05) (s. Abb. 8).
Herzfrequenz (Schläge/min)
Normale Aktivität
600
500
400
300
200
100
0
WT
TG
Minimum
*
Mittelwert
Maximum
Abbildung 8: Herzfrequenzvergleich zwischen A1AR+-Mäusen und Wildtypen bei normaler
Aktivität (Ruhe)
Es wird die minimale, die durchschnittliche und die maximale Herzfrequenz für
A1AR+-Mäuse (schwarze Balken) und Wildtypen (weiße Balken) während normaler
Aktivität (Ruhe) dargestellt. Sternchen (*) kennzeichnen signifikante Unterschiede
zwischen transgenen Mäusen und Wildtypen (p< 0,05). Signifikant unterschiedlich ist
nur die maximale Herzfrequenz.
58
4. Ergebnisse
Auch unter körperlicher Belastung unterschied sich die minimale Herzfrequenz nicht
zwischen nichtttransgenen (540 ± 47 Schläge pro Minute) und transgenen (515 ±16
Schläge pro Minute) Tieren. Aber anders als bei den Ruhewerten lag sowohl die
durchschnittliche (698 ± 34 für Wildtypen, 589 ± 16
Schläge pro Minute für
transgene Tiere, p< 0,05) als auch die maximale Herzfrequenz (765 ± 28 für
Wildtypen gegenüber 650 ± 13 Schläge pro Minute für transgene Tiere, p< 0,05) der
A1AR+-Mäuse unter der der Wildtypen (s. Abb. 9).
Herzfrequenz (Schläge/min)
Belastung durch Schwimmen
1000
800
WT
TG
*
*
600
400
200
0
Minimum
Mittelwert
Maximum
Abbildung 9: Herzfrequenzvergleich zwischen A1AR+-Mäusen und Wildtypen bei Belastung
Es wird die minimale, die durchschnittliche und die maximale Herzfrequenz für
A1AR+-Mäuse (schwarze Balken) und Wildtypen (weiße Balken) während körperlicher
Belastung durch Schwimmen dargestellt. Sternchen (*) kennzeichnen signifikante
Unterschiede zwischen transgenen Mäusen und Wildtypen. Signifikant unterschiedlich
sind die durchschnittliche und die maximale Herzfrequenz.
Um das Ende der einstündigen Erholungsphase nach der Belastung genauer zu
charakterisieren, wurden auch hier die Herzfrequenzen verglichen. Die Unterschiede
zeigten sich wie unter Belastung zwischen den nichttransgenen Tieren und den
A1AR+-Mäusen in den durchschnittlichen (698 ± 34 für Wildtypen, 589 ± 16 Schlägen
pro Minute für transgene Tiere, p< 0,05) und maximalen (765 ± 28 gegenüber 650 ±
59
4. Ergebnisse
13 Schlägen pro Minute, p< 0,05) Herzfrequenzen, die bei den transgenen Tieren
erniedrigt waren (s. Abb. 10).
Herzfrequenz (Schläge/min)
1 Stunde nach Belastung
800
WT
TG
*
*
600
400
200
0
Minimum
Mittelwert
Maximum
Abbildung 10:Herzfrequenzvergleich zwischen A1AR+-Mäusen und Wildtypen am Ende der
einstündigen Erholungsphase
Es wird die minimale, die durchschnittliche und die maximale Herzfrequenz für A1AR
überexprimierende Mäuse (schwarze Balken) und Wildtypen (weiße Balken) am Ende
der Erholunsphase nach der körperlichen Belastung dargestellt. Sternchen (*)
kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen transgenen Mäusen und Wildtypen.
Signifikant unterschiedlich sind die durchschnittliche und die maximale Herzfrequenz.
Durch Bestimmung der Standardabweichung der RR-Intervalle über einen längeren
Zeitraum konnte die Herzfrequenzvariabilität dargestellt werden. Um das gesamte
Herzfrequenzspektrum
abzudecken,
wurden
die
Herzfrequenzen
der
Protokollabschnitte „Ruhe“, „Schwimmen“ und „nach Belastung“ zusammengefasst
und die Standardabweichungen bestimmt. Die Herzfrequenzvariabilität war bei den
A1AR+-Mäusen herabgesetzt (6,3 ±1 ms für die Wildtypen gegenüber 3,7 ± 0,4 ms
bei den transgenen Mäusen, p< 0,05) (s. Abb. 11).
60
4. Ergebnisse
Stabw der RR-Intervalle
Herzfrequenzvariabilität
8
6
*
4
2
0
WT
TG
Abbildung 11: Vergleich der Herzfrequenzvariabilität zwischen A1AR+-Mäusen und Wildtypen
Die Herzfrequenzvariabilität, berechnet als Standardabweichung der RR-Intervalle
(ms), ist bei den transgenen Mäusen herabgesetzt. Sternchen (*) kennzeichnen
signifikante Unterschiede zwischen transgenen Mäusen und Wildtypen.
Die Standardabweichungen der RR-Intervalle in den einzelnen Protokollabschnitten
unterschieden sich nur während der Ruhephase zwischen A1AR+-Mäusen und
Wildtypen (7 ± 1,1 ms für die Wildtypen und 3,7 ± 0,7 ms für die transgenen Tiere, p<
0,05) (s. Abb. 12). Während der Schwimmphase ergeben sich Werte von 2,8 ± 0,5
ms für die Wildtypen und 2,7 ± 0,3 ms für die transgenen Mäuse. Während der
Erholungsphase sind die Standardabweichungen der transgenen Tiere kleiner als die
der Wildtypen, dieses Phänomen erreicht aber keine statistische Signifikanz (8,1 ±
1,5 ms für die Wildtypen gegenüber 4,9 ± 0,5 ms bei den A1AR+-Mäusen).
61
4. Ergebnisse
Stabw der RR-Intervalle
Standardabweichungen im Vergleich
Abbildung
10
8
6
4
2
0
12:
WT
TG
*
Ruhe
Schwimmen
Vergleich der Standardabweichungen
Belastungsprotokollabschnitten
nach
Erholung
der
RR-Intervalle
in
den
Die Standardabweichungen der RR-Intervalle (ms) sind für Wildtypen und A1AR+Mäuse in den einzelnen Protokollabschnitten vergleichend dargetsellt. Signifikant
unterschiedlich sind diese nur während der Ruhephase. Sternchen (*)
kennzeichnen signifikante Unterschiede.
Im Gegensatz zu den nicht veränderten PQ-Intervallen der narkotisierten Mäuse im
Oberflächen-EKG, erwiesen sich die PQ-Intervalle bei wachen A1AR+ Mäusen
verlängert gegenüber den Wildtypen. Verlängerte PQ-Intervalle bei den transgenen
Tieren ließen sich unter Ruhebedingungen (38,1 ± 1,1 ms für Wildtypen, 41,6 ± 0,8
ms für transgene Tiere, p< 0,05) und unter Schwimmbelastung (für Wildtypen 32,1 ±
1,3 ms, für transgene Tiere 37,2 ± 1,1 ms, p< 0,05) nachweisen. Die Längen der PWellen wiesen keine Unterschiede auf (für Wildtypen 13,9 ± 0,6 ms in Ruhe / 9,4 ±
0,6 ms unter Belastung, für A1AR+-Mäuse 13,8 ± 0,6 ms in Ruhe / 9,9 ± 0,6 ms unter
Belastung). Somit zeigte sich bei den transgenen Tieren eine verlängerte AVÜberleitungszeit (s. Abb 12 u. 13).
62
4. Ergebnisse
Abbildung 13: Verlängertes PQ-Intervall bei A1AR+-Mäusen
Darstellung einer Herzaktion im telemetrischen EKG einer A1AR+ Maus (rechts) und
eines Wildtyps (links) bei gleicher Herzfrequenz. Das PQ-Intervall ist eingezeichnet.
PQ-Intervalle
WT
PQ (ms)
50
*
TG
*
40
30
20
10
0
Ruhe
Schwimmen
Abbildung 14: Verlängerte PQ-Intervalle bei A1AR+-Mäusen in Ruhe und unter Belastung
Es werden die PQ-Intervalle von A1AR+-Mäusen (schwarze Balken) und Wildtypen
(weiße Balken) in Ruhe und unter Schwimmbelastung im Vergleich dargestellt. Die
Messung der PQ-Werte erfolgte bei einer Ruheherzfrequenz von 480 und einer
Belastungsherzfrequenz von 670 Schlägen pro Minute bei transgenen und
nichttransgenen Tieren. Sternchen (*) kennzeichnen signifikante Unterschiede
zwischen transgenen Mäusen und Wildtypen. Sowohl in Ruhe, als auch unter
63
4. Ergebnisse
Belastung wiesen die A1AR+-Mäuse ein signifikant verlängertes PQ-Intervall auf. Die
P-Intervalle wiesen keine signifikanten Unterschiede auf.
4.1.3 Echokardiographie
Alle untersuchten Mäuse überstanden die Untersuchungen ohne Probleme.
In der Echokardiographie konnte bei den A1AR überexprimierenden Mäusen ein
minimal größerer linksventrikulärer Durchmesser und eine gegenüber den Wildtypen
herabgesetzte Ventrikelverkürzungsfraktion (FS) festgestellt werden. Die übrigen
gemessenen und errechneten Parameter wiesen keine signifikanten Unterschiede
auf.
Atrium
Ventrikel
Parameter
WT
A1AR+
Körpergewicht (g)
32,8 ± 0,8
32,5 ± 0,7
HF (Schläge/min)
247 ± 9
264 ± 11
LA (mm)
1,57 ± 0,02
1,57 ± 0,02
MV Vmax (cm/s)
83,8 ± 2,8
81,6 ±- 2,9
IVSd (mm)
0,64 ± 0,03
0,63 ± 0,02
LVWd (mm)
0,75 ± 0,03
0,81 ± 0,04
LVEDd (mm)
4,0 ± 0,09
4,28 ± 0,11
LVEDs (mm)
2,64 ± 0,05
2,94 ± 0,08 *
FS (%)
33,8 ± 0,8
31,3 ±0,9 *
LV Masse (mg)
98,9 ± 6,3
114,8 ± 5,9
Tabelle 5: Echokardiographieergebnisse ausgewählter Parameter
Die Werte werden angegeben als Mittelwert ± Standardfehler. Sternchen (*) kennzeichnen
signifikante Unterschiede zwischen den Genotypen.
HF:Herzfrequenz, LA: linkes Atrium, MV Vmax: maximale Geschwindigkeit im
Mitraldoppler, IVSd: Durchmesser des Interventrikulären Septums in der Diastole, LVWd:
diastolischer Durchmesser der Hinterwand des linken Ventrikels, LVEDd/LVEDs:
64
4. Ergebnisse
linksventrikulärer Durchmesser in der Diastole/Systole, FS: Ventrikelverkürzungsfraktion,
LV-Masse: errechnete Masse des linken Ventrikels
4.1.4 Applikation von Pertussistoxin
48 Stunden nach der Applikation von Pertussistoxin zeigten die transgenen Tiere
maximale Herzfrequenzen, die sich nicht mehr von denen der Wildtypen
unterschieden (s. Abb. 14).
Herzfrequenzen nach PTX
HF (Schläge/min)
700
*
*
600
500
400
300
200
WT
TG
100
vor PTX
24h
48h
Abbildung 15: Veränderungen in der Herzfrequenz von A1AR+-Mäusen und Wildtypen nach
PTX-Gabe
Es werden die Herzfrequenzen vor, sowie 24 und 48 Stunden nach der
intraperitonealen Injektion von Pertussistoxin (PTX) (150µg/kg Körpergewicht) um 16
Uhr vergleichend zwischen A1AR+-Mäusen (schwarze Kästchen) und Wildtypen
(weiße Kästchen) dargestellt. Sternchen (*) kennzeichnen signifikante Unterschiede
zwischen transgenen Mäusen und Wildtypen. 48 Stunden nach der PTX-Injektion sind
die Herzfrequenzunterschiede zwischen Wildtypen und transgenen Tieren nicht mehr
signifikant. Die Herzfrequenz der A1AR+-Mäuse steigt 48h nach der PTX-Gabe zwar
an, zeigt aber gegenüber ihrem Ausgangswert vor der PTX-Gabe keine signifikanten
Unterschiede.
65
4. Ergebnisse
Das PQ-Intervall der A1AR+-Mäuse verkürzte sich nach der Pertussistoxin-Injektion
gegenüber seinem Ausgangswert, unterschied sich aber auch nach 48 Stunden noch
von dem der Wildtypen (s. Abb. 15).
PQ-Intervall nach PTX
PQ-Intervall (ms)
60
*
50
*
*
#
40
30
20
10
WT
TG
0
vor PTX
24h
48h
Abbildung 16: Veränderungen im PQ-Intervall bei A1AR+-Mäusen und Wildtypen nach PTXInjektion
Es werden die PQ-Intervalle vor, sowie 24 und 48 Stunden nach der intraperitonealen
Injektion von Pertussistoxin (PTX) (150µg/kg Körpergewicht) um 16 Uhr vergleichend
zwischen A1AR+-Mäusen (schwarze Kästchen) und Wildtypen (weiße Kästchen)
dargestellt. Sternchen (*) kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen
transgenen Mäusen und Wildtypen. Die Raute (#) kennzeichnet die signifikante
Verkürzung der PQ-Intervalle der A1AR+ Mäuse vor und 48 Stunden nach PTX-Gabe.
Der Unterschied zu den Wildtypen bleibt aber auch 48 Stunden nach PTX signifikant.
4.1.5 Histologische Untersuchung
Wildtypen und A1AR+-Mäuse wiesen keine histologischen Unterschiede im Herzen
auf. Pathologische Veränderungen konnten nicht festgestellt werden.
66
4. Ergebnisse
4.1.6 Biochemische Untersuchungen
Die Expression sowie die im Gewebe des rechten Vorhofs vorkommende Menge der
Proteine Phospholamban, GiQ und SERCA wiesen zwischen Wildtypen und
transgenen Tieren keine Unterschiede auf.
Atriales PLB (aU)
Atriales SERCA (aU)
Atriales GiM (aU)
WT
A1AR+
463,2 ± 52,1
502,8 ± 40,7
22400325 ± 2160804
20478485 ± 1475041
2127309 ± 230183
1984573 ± 183867
Tabelle 6: Ergebnisse der biochemischen Untersuchungen an rechten Vorhöfe von Wildtypen
und A1AR+ Mäusen
PLB: Phospholamban, SERCA: ATPase am sarco-endoplasmatischen Retikulum, aU:
„arbitrary units“, selbstbestimmte Einheiten
4.2 A3 AR überexprimierende Mäuse
4.2.1 Oberflächenelektrokardiogramm
Zur
Erstellung
(A3highAR+)
des
Oberflächen-EKGs
wurden
A3highAR
überexprimierende
Mäuse und Wildtypen im Alter von 16 Wochen und 18 Wochen
untersucht. Es wurden dabei unterschiedliche Injektionsnarkotika verwendet, eine
Mischung aus Ketamin/Xylazin für die 16 Wochen alten und Urethan bei den 18
Wochen alten Mäusen.
Unter dem Einfluß beider Injektionsnarkotika zeigten die transgenen Mäuse
anhaltende Arrhythmien. Diese waren im EKG bei allen mit Ketamin/Xylazin
sedierten Mäusen und bei 2/3 der mit Urethan sedierten transgenen Tiere
nachweisbar. Es traten vor allem Sinusbradykardien mit der Entwicklung eines
ventrikulären Ersatzrhythmusses auf. Kurzzeitig zeigten sich wiederholt Phasen
atrialer Tachyarrhythmien. Bei keinem Wildtypen traten längeranhaltende (mehr als 2
67
4. Ergebnisse
Herzaktionen umfassende) Arrhythmien auf, alle besaßen einen regelmäßigen
Sinusrhythmus.
A3highAR+
WT
high
Abbildung 17: Darstellung eines repräsentativen 6-Kanal-Oberflächen-EKGs einer A3
Maus und eines Wildtypen im Alter von 18 Wochen
AR+-
Rechts ist ein Ausschnitt aus einem typischen 6-Kanal-EKG eines Wildtypens und links
high
ein Ausschnitt einer A3 AR+-Maus dargestellt. Die Tiere wurden mit Urethan sediert.
Bei der transgenen Maus besteht zunächst eine Sinusbradykardie. Der Ventrikel wird
durch einen ventrikulären Ersatzrhythmus erregt. Am Ende des Ausschnittes zeigt sich
eine Sinustachykardie. Das EKG des Wildtypen wird durch einen regelmäßigen
Sinusrhythmus bestimmt. Sternchen (*) kennzeichnen die P-Wellen.
Der senkrechte Balken im linken unteren Bildrand entspricht 1 mV, der waagerechte
Balken entspricht 100 ms.
Unter Urethan waren alle gemessenen Parameter unterschiedlich. Die Herzfrequenz
der A3highAR+-Mäuse war langsamer, das PQ- und QT Intervall verlängert.
Die Ketamin/Xylazinnarkose verursachte auch bei den Wildtypen eine deutliche
Bradykardie. Die Herzfrequenz der A3highAR+-Mäuse war noch langsamer, aber nicht
signifikant unterschiedlich. Auch die Länge der P-Wellen war bei den transgenen
Mäusen größer, jedoch nicht verlängert. Unter der Ketamin/Xylazinnarkose war nur
das PQ-Intervall bei den A3highAR+-Tieren verlängert.
68
4. Ergebnisse
Ketamin/Xylazin
Urethan
WT
A3highAR+
WT
A3highAR+
RR-Intervall (ms)
313 ± 28
361 ± 36
141 ± 12
222 ± 21*
HF (Schläge/Minute)
197 ± 19
177 ± 14
447 ± 39
286 ± 25*
P-Wellenlänge (ms)
18,6 ± 0,9
28,4 ± 4,3
12,8 ± 0,7
25,5 ± 1,8*
PQ-Intervall (ms)
34 ± 2,6
50,4 ± 4,3*
31,1 ± 1,2
43,3 ± 3,9*
QT-Intervall (ms)
73 ± 3
82 ± 3
70 ± 5
106 ± 8*
QRS-Amplitude (mV)
0,9 ± 0,05
0,9 ± 0,04
0,7 ± 0,08
0,9 ± 0,09*
P-Amplitude (mV)
0,08 ± 0,01
0,08 ± 0,01
0,09 ± 0,01
0,07 ± 0,01*
high
Tabelle 7: Werte der im Oberflächen EKG gemessenen Parameter von adulten A3
Mäusen und Wildtypen
AR+-
Die Werte werden angegeben als Mittelwert ± Standardfehler. Sternchen (*) kennzeichnen
signifikante Unterschiede zwischen den Genotypen.
6-Kanal-Oberflächen-EKGs wurden an wachen A3highAR+-Mäusen und Wildtypen im
Alter von 5 und 21 Tagen geschrieben. Die EKGs im Alter von 5 Tagen wiesen keine
Unterschiede zwischen transgenen und nichtransgenen Mäusen auf. Beide Gruppen
zeigten einen regelmäßigen Sinusrhythmus mit ähnlichen Herzfrequenzen (531 ± 4
für Wildtypen und 556 ± 6 Schlägen pro Minute für transgene Mäuse) und PQIntervallen (für Wildtypen 33,3 ± 0,7 und für transgene Tiere 35,0 ± 0,4 ms).
Im Alter von 21 Tagen traten bei den unsedierten A3highAR+-Mäusen bereits
Arrhythmien auf. Wie bei den älteren sedierten Mäusen waren diese Arrhythmien
durch eine Sinusbradykardie, ventrikulären Ersatzrhythmus und Phasen atrialer
Tachyarrhythmien gekennzeichnet.
69
4. Ergebnisse
A3highAR+
WT
Abbildung 18: Darstellung der 2. Ableitung eines repräsentativen 6-Kanal-Oberflächen-EKGs
high
einer A3 AR+-Maus und eines Wildtypen im Alter von 3 Wochen
Rechts ist ein Ausschnitt aus einem typischen 6-Kanal-EKG eines Wildtypens und
high
links ein typischer Ausschnitt einer A3 AR+-Maus dargestellt. Da die Tiere wach und
weitgehend unfixiert waren, traten häufig verrauschte Bereiche im EKG auf. So
konnten oft nur einzelne Ableitungen analysiert werden. Daher wurde hier auf die
Darstellung aller Kanäle verzichtet und ein typischer, rauschfreier Bereich ausgewählt.
Bei der transgenen Maus besteht eine Sinusbradykardie. Der Ventrikel wird durch
einen ventrikulären Ersatzrhythmus erregt. Das EKG des Wildtypen wird durch einen
regelmäßigen Sinusrhythmus bestimmt. Sternchen (*) kennzeichnen die P-Wellen.
Der senkrechte Balken im linken unteren Bildrand entspricht 1 mV, der waagerechte
Balken entspricht 100 ms.
Neben den Rhythmusstörungen wurde eine geringere Herzfrequenz und ein
verlängertes PQ-Intervall bei den 21 Tagen alten A3highAR+-Mäusen gemessen (p<
0,05). Die gemessenen Werte sind in der nachfolgenden Tabelle zusammengefasst.
3 Wochen alt, ohne Anästhesie
WT
A3highAR+
RR-Intervall (ms)
90 ± 2
145 ± 6*
Herzfrequenz (Schläge/Minute)
655 ± 9
434 ± 25*
P-Wellenlänge (ms)
11,0 ± 0,2
12,0 ± 0,6*
PQ-Intervall (ms)
28,5 ± 0,4
47,4 ± 1,3*
QRS-Amplitude (mV)
0,71 ± 0,05
1,34 ± 0,07*
P-Amplitude (mV)
0,13 ± 0,02
0,1 ± 0,01*
high
Tabelle 8: Werte der im Oberflächen-EKG gemessenen Parameter bei unsedierten A3
Mäusen und Wildtypen im Alter von 3 Wochen
70
AR+-
4. Ergebnisse
Die Werte werden angegeben als Mittelwert ± Standardfehler. Sternchen (*) kennzeichnen
signifikante Unterschiede zwischen den Genotypen.
A3lowAR+-Mäuse wurden im Alter von 15 Wochen mit Ketamin/Xylazin und 18
Wochen mit Urethan sediert und das Oberflächen-EKG erstellt. Bei beiden
Injektionsnarkotika konnte bei allen Mäusen ein regelmäßiger Sinusrhythmus
nachgewiesen werden. Die Herzfrequenz war bei der Urethannarkose wesentlich
höher als bei der Ketamin/Xylazinnarkose, zwischen transgenen und nichttransgenen
Mäusen aber nicht unterschiedlich. Als verlängert erwies sich bei den A3lowAR+Mäusen das PQ-Intervall bei langsamen Herzfrequenzen (p< 0,05), bei schnelleren
Herzfrequenzen konnte kein Unterschied im PQ-Intervall mehr nachgewiesen
werden.
Ketamin/Xylazin
Urethan
WT
A3lowAR+
WT
A3lowAR+
RR-Intervall (ms)
317 ± 20
280 ± 24
130 ± 19
136 ± 19
HF (Schläge/Minute)
189 ± 18
214 ± 16
461 ± 23
441 ± 25
P-Wellenlänge (ms)
22 ± 1
21 ± 1
19 ± 0,6
19 ± 1,8
PQ-Intervall (ms)
36 ± 1
41 ± 1*
34 ± 1,8
35 ± 1,6
QT-Intervall (ms)
69 ± 2
70 ± 2
53 ± 5
56 ± 6
QRS-Amplitude (mV)
0,8 ± 0,2
0,9 ± 0,1
0,6 ± 0,6
0,9 ± 0,1
P-Amplitude (mV)
0,09 ± 0,01
0,07 ± 0,01
0,09 ± 0,02
0,12 ± 0,01
low
Tabelle 9: Werte der im Oberflächen-EKG gemessenen Parameter von adulten A3
Mäusen und Wildtypen
AR+-
Die Werte werden angegeben als Mittelwert ± Standardfehler. Sternchen (*) kennzeichnen
signifikante Unterschiede zwischen den Genotypen. Bei gleichen Herzfrequenzen ist das
PQ-Intervall bei langsamen Herzfrequenzen (Ketamin/Xylazin-Narkose) bei den
transgenen Mäusen signifikant verlängert. Bei schnelleren Herzfrequenzen
(Urethannarkose) tritt dieses Phänomen nicht auf.
71
4. Ergebnisse
4.2.2 Telemetrisches Elektrokardiogramm
Eine transgene A3highAR+-Maus starb während der Transmitterimplantation, eine
andere 3 Wochen nach der Implantation.
Da die Ergebnisse der mit 12 Wochen und mit 16 Wochen telemetrierten Tiere sich
innerhalb der Genotypen nicht unterschieden, wurden sie hier im Folgenden
zusammengefasst dargestellt.
Wie im 6-Kanal-Oberflächen-EKG für sedierte Mäuse beschrieben, zeigten auch die
telemetrierten
A3highAR+-Mäuse
deutliche
Herzrhythmusstörungen.
Unter
Ruhebedingungen zeigten alle untersuchten 16 Wochen alten A3highAR+-Mäuse
atriale Arrhythmien. Dabei dominierten Bradykardien, es traten aber auch häufig
tachykarde Abschnitte atrialer Rhythmen auf. Die Ventrikelerregung erfolgte
hauptsächlich über einen ventrikulären Ersatzrhythmus. Bei allen A3highAR+-Tieren
waren Phasen mit Sinusrhythmus kaum zu finden. Trat dieser auf, war er durch eine
deutliche
Bradykardie
gekennzeichnet.
Bei
keinem
Wildtypen
konnten
im
telemetrischen EKG (atriale) Arrhythmien festgestellt werden, es war durch einen
regelmäßigen Sinusrhythmus gekennzeichnet (s. Abb. 19).
high
Abbildung 19: Repräsentatives telemetrisches EKG eines Wildtypen und einer A3
unter Ruhebedingungen
72
AR+-Maus
4. Ergebnisse
Der obere Teil der Abbildung zeigt ein typisches Wildtyp-EKG mit regelmäßigem
high
Sinusrhythmus. Vergleichend dazu im unteren Teil ein typisches EKG einer A3 AR+Maus. Es zeigt eine deutliche Sinusbradykardie zu Beginn, die dann von einer atrialen
Tachykardie abgelöst wird. Die Erregung des Ventrikels erfolgt über einen
ventrikulären Ersatzrhythmus. Sternchen (*) kennzeichnen die P-Wellen. Sie Skala
am rechten Bildrand entspricht 1 mV, die waagerechte Skala 200 ms.
Unter Schwimmbelastung entwickelten alle A3highAR+-Mäuse einen im Verhältnis zu
den Wildtypen bradykarden, aber regelmäßigen Sinusrhythmus mit einer 1:1
Überleitung zum Ventrikel (s. Abb. 20).
high
Abbildung 20: Repräsentatives telemetrisches EKG eines Wildtypen und einer A3
bei körperlicher Belastung (Schwimmen)
AR+-Maus
Der obere Teil der Abbildung zeigt ein typisches Wildtyp-EKG mit regelmäßigem
high
Sinusrhythmus. Vergleichend dazu im unteren Teil ein typisches EKG einer A3 AR+
Maus. Es zeigt eine deutliche Sinusbradykardie, eine atriale Arrhythmie tritt unter
Belastung nicht auf. Jede Vorhoferregung wird zum Ventrikel weitergeleitet und
bestimmt so den jetzt regelmäßigen, aber im Verhältnis zum Wildtypen bradykarden
Herzrhythmus. Sternchen (*) kennzeichnen die P-Wellen. Die Skala am rechten
Bildrand entspricht 1 mV, die waagerechte Skala 200 ms.
Wie schon bei den A1AR+-Mäusen wurden auch für die A3highAR+-Tiere die
auftretenden Herzfrequenzen für die einzelnen Protokollabschnitte analysiert. Bei
normaler Aktivität (Ruhe) war aufgrund der ausgeprägten atrialen Bradykardie und
73
4. Ergebnisse
des
ventrikulären
Ersatzrhythmusses
der
A3highAR+-Mäuse
die
minimale
Herzfrequenz (406 ± 19 für Wildtypen, 217 ± 19 Schläge pro Minute für A3highAR+Mäuse, p< 0,05) und der Mittelwert (für Wildtypen 510 ± 15, für transgene Tiere 402
± 15 Schläge pro Minute, p< 0,05) geringer als die der Wildtypen. Die maximal
erreichte Herzfrequenz (615 ± 14, 594 ± 40 Schläge pro Minute) unterschied sich
nicht (s. Abb. 20).
Herzfrequenz (Schläge/min)
Normale Aktivität
800
WT
TG
600
400
*
*
200
0
Minimum
Mittelwert
high
Abbildung 21: Herzfrequenzvergleich zwischen A3
Aktivität (Ruhe)
Maximum
AR+-Mäusen und Wildtypen bei normaler
Es wird die minimale, die durchschnittliche und die maximale Herzfrequenz für
high
A3 AR+-Mäuse (schwarze Balken) und Wildtypen (weiße Balken) während normaler
Aktivität (Ruhe) dargestellt. Sternchen (*) kennzeichnen signifikante Unterschiede
zwischen transgenen Mäusen und Wildtypen. Signifikant unterschiedlich sind die
minimale und die durchschnittliche Herzfrequenz.
Unter Schwimmbelastung trat bei den A3highAR+-Tieren ein zwar regelmäßiger, aber
in der minimal (605 ± 6 für Wildtypen, 362 ± 23 Schläge pro Minute für transgene
Tiere, p< 0,05), durchschnittlich (730 ± 14 gegenüber 527 ± 16 Schläge pro Minute,
74
4. Ergebnisse
p< 0,05) und maximal (796 ± 25 gegenüber 658 ± 13 Schläge pro Minute, p< 0,05)
erreichten Herzfrequenz langsamerer Herzrhythmus auf (s. Abb. 21).
Herzfrequenz (Schläge/min)
Belastung durch Schwimmen
WT
1000
800
600
400
TG
*
*
*
200
0
Minimum
Mittelwert
high
Abbildung 22: Herzfrequenzvergleich zwischen A3
Maximum
AR+-Mäusen und Wildtypen bei Belastung
Es wird die minimale, die durchschnittliche und die maximale Herzfrequenz für
high
A3 AR+ -Mäuse (schwarze Balken) und Wildtypen (weiße Balken) während
körperlicher Belastung durch Schwimmen dargestellt. Sternchen (*) kennzeichnen
signifikante Unterschiede zwischen transgenen Mäusen und Wildtypen. Signifikant
unterschiedlich sind die minimale, die durchschnittliche und die maximale
Herzfrequenz.
Nach der einstündigen Erholung traten wieder atriale Arrhythmien und ein
ventrikulärer Ersatzrhythmus in den Vordergrund. Im Gegensatz zum EKG unter
Ruhebedingungen, waren tachykarde atriale Arrhythmien mit Überleitungen zum
Ventrikel noch nicht so ausgeprägt, weshalb die maximale Herzfrequenz der
A3highAR+ -Mäuse (für Wildtypen 737 ± 37, für transgene Mäuse 610 ± 44 Schläge
pro Minute, p< 0,05) sich ebenso wie die minimale (464 ± 68 gegenüber 230 ± 66
Schläge pro Minute, p< 0,05) und durchschnittliche (577 ± 53 gegenüber 392 ± 64
Schläge pro Minute, p< 0,05) von denen der Wildtypen unterschied (s. Abb. 22).
75
4. Ergebnisse
Herzfrequenz (Schläge/min)
1 Stunde nach Belastung
WT
1000
800
600
400
TG
*
*
*
200
0
Minimum
Mittelwert
high
Abbildung 23: Herzfrequenzvergleich zwischen A3
einstündigen Erholungsphase
Maximum
AR+-Mäusen und Wildtypen am Ende der
Es wird die minimale, die durchschnittliche und die maximale Herzfrequenz für
high
A3 AR überexprimierende Mäuse (schwarze Balken) und Wildtypen (weiße Balken)
am Ende der Erholunsphase nach der körperlichen Belastung dargestellt. Sternchen
(*) kennzeichnen signifikante Unterschiede zwischen transgenen Mäusen und
Wildtypen. Signifikant unterschiedlich sind die minimale, die durchschnittliche und die
maximale Herzfrequenz.
Die PQ-Intervalle unter Ruhebedingungen bei A3highAR+-Mäusen zu messen war oft
kaum möglich, da der atriale Rhythmus meist langsamer war als der ventrikuläre
Ersatzrhythmus. In Ruhephasen dominierte ein AV-Block III. Grades bei den
A3highAR+-Mäusen. Während einzelner Sinusrhythmusphasen mit Überleitung zum
Ventrikel wurde das PQ-Intervall bestimmt, allerdings standen hier insgesamt nur
wenige Werte zur Verfügung. Da unter Belastung ein regelmäßiger Rhythmus mit
einer 1:1 Überleitung auftrat, konnten hier die PQ-Intervalle gut gemessen werden.
Diese waren während der Ruhe- und der Belastungsphase bei den A3highAR+-Tieren
verlängert (Ruhephase, zugrunde liegende HF von 460 Schlägen pro Minute: PQIntervall von 36 ± 1,2 für Wildtypen, 58 ± 4,5 ms für transgene Mäuse, p< 0,05,
Belastung, zugrunde liegende HF von 590 Schlägen pro Minute: PQ-Intervall von 30
± 1,9 ms für Wildtypen, für transgene Tiere 36 ± 1,5 ms, p< 0,05) (s. Abb. 23). Die P-
76
4. Ergebnisse
Wellen waren während der Ruhephase bei den transgenen Mäusen verlängert (16,1
± 0,45 ms bei den Wildtypen gegenüber 19,3 ± 0,79 ms bei den A3highAR+-Mäusen,
p< 0,05). Unter Belastung zeigten die transgenen Mäuse zwar eine gegenüber den
Wildtypen ebenfalls verlängerte P-Wellenlänge, dieses Phänomen erreichte aber
keine statistische Signifikanz (14,1 ± 0,66 ms bei den transgenen Tieren gegenüber
12,7 ± 0,32 ms bei den Wildtypen).
PQ-Intervalle
PQ (ms)
WT
60
50
40
30
20
10
0
*
TG
*
Ruhe
Schwimmen
high
Abbildung 24: Verlängertes PQ-Intervall im Sinusrhythmus bei A3
unter Belastung
high
AR+-Mäusen in Ruhe und
Es werden die PQ-Intervalle von A3 AR+-Mäusen (schwarze Balken) und Wildtypen
(weiße Balken) in Ruhe und unter Schwimmbelastung im Vergleich dargestellt. Die
Messung der PQ-Werte erfolgte bei einer Ruheherzfrequenz von 450 und einer
Belastungsherzfrequenz von 590 Schlägen pro Minute bei transgenen und
nichttransgenen Tieren. Sternchen (*) kennzeichnen signifikante Unterschiede
zwischen transgenen Mäusen und Wildtypen. Sowohl in Ruhe, als auch unter
high
Belastung, wiesen die A3 AR+-Mäuse ein signifikant verlängertes PQ-Intervall auf.
high
Die P-Intervalle waren bei den A3 AR+-Mäuse nur in der Ruhephase signifikant
verlängert.
77
4. Ergebnisse
Alle
A3lowAR+-Mäuse
Sinusrhythmus.
Es
zeigten
im
telemetrischen
traten
keine
EKG
Rhythmusstörungen
einen
auf.
regelmäßigen
Auch
im
Herzfrequenzvergleich konnten in den verschiedenen Versuchsprotokollen keine
Unterschiede nachgewiesen werden.
Ruhe
Schwimmen
1 Stunde nach Erholung
WT
A3lowAR+
Minimum
443 ± 6
491 ± 36
Mittelwert
636 ± 48
646 ± 36
Maximum
747 ± 38
784 ± 4
Minimum
394 ± 12
406 ± 5
Mittelwert
683 ± 24
689 ± 26
Maximum
811 ± 11
809 ± 10
Minimum
475 ± 66
423 ± 12
Mittelwert
681 ± 45
614 ± 44
Maximum
811 ± 4
790 ± 8
low
Tabelle 10: Herzfrequenzvergleich zwischen A3 AR+-Mäusen und Wildtypen in Ruhe, unter
Schwimmbelastung und nach Erholung
Die Werte werden angegeben als Mittelwert ± Standardfehler. Sternchen (*) kennzeichnen
signifikante Unterschiede zwischen den Genotypen.
Bei dem Vergleich der PQ-Intervalle zwischen A3lowAR+-Tieren und Wildtypen
konnten unter Ruhebedingungen Unterschiede festgestellt werden. So erwies sich
das PQ-Intervall bei einer Herzfrequenz von 460 Schlägen pro Minute bei den
transgenen Mäusen (38 ± 0,7 ms) gegenüber den Wildtypen (35 ± 1 ms) als
verlängert (p< 0,05). Nach einer Steigerung der Herzfrequenz während der
Schwimmbelastung waren keine Unterschiede im PQ-Intervall nachweisbar (31 ± 1,2
für Wildtypen gegenüber 32 ± 0,7 ms für A3lowAR+-Mäuse). Bei unsedierten Mäusen
zeigte sich ein ähnliches Phänomen wie bei den sedierten Mäusen, verlängertes PQ-
78
4. Ergebnisse
Intervall bei langsamen, gegenüber den Wildtypen unverändertes PQ-Intervall bei
höheren Herzfrequenzen (s. Abb. 24). Die Länge des P-Wellen-Intervalls wies
während Ruhe- und Belastungsphasen zwischen A3lowAR+-Mäusen und Wildtypen
keine Unterschiede auf.
PQ-Intervalle
WT
TG
*
PQ (ms)
40
30
20
10
0
Ruhe
Abbildung 25: Verlängertes PQ-Intervall bei A3
Schwimmen
low
AR+-Mäusen unter Ruhebedingungen
low
Es werden die PQ-Intervalle von A3 AR+-Mäusen (schwarze Balken) und Wildtypen
(weiße Balken) in Ruhe und unter Schwimmbelastung im Vergleich dargestellt. Die
Messung der PQ-Werte erfolgte bei einer Ruheherzfrequenz von 460 und einer
Belastungsherzfrequenz von 670 Schlägen pro Minute bei transgenen und
nichttransgenen Tieren. Sternchen (*) kennzeichnen signifikante Unterschiede
zwischen transgenen Mäusen und Wildtypen. Nur unter Ruhebedingungen wiesen die
low
A3 AR+-Mäuse ein signifikant verlängertes PQ-Intervall auf. Die P-Intervalle wiesen
keine signifikanten Unterschiede auf.
79
4. Ergebnisse
4.2.3 Echokardiographie
Es wurden serielle Untersuchungen an A3highAR+-Mäusen und Wildtypen im Alter von
2, 8, 12 und 21 Wochen durchgeführt. Eine transgene 8 Wochen alte Maus verstarb
zwei Stunden nach der echokardiographischen Untersuchung.
Wie bereits im Kapitel über die Ergebnisse des Oberflächen-EKGs geschildert wurde,
zeigen
A3highAR+-Mäuse
unterschiedliche
und
Herzfrequenzen.
Wildtypen
Die
unter
Analyse
Ketamin/Xylazin-Sedation
der
echokardiographischen
Darstellungen erfolgte daher bei den Wildtypen in bradykarderen Phasen, um eine
ähnliche Herzfrequenz bei der Analyse für beide Mausgruppen zu erreichen.
Die Größe des linken Vorhofes unterschied sich bereits im Alter von 2 Wochen
zwischen Wildtypen und A3highAR+-Mäusen (p< 0,05). Der Vorhof der transgenen
Tiere war stets größer als der der Wildtypen. So betrug der Unterschied in der
Vorhofgröße zwischen transgenen und nichttransgenen Mäusen im Alter von 2
Wochen 10%, mit 12 Wochen 15% und mit 21 Wochen 30% (s. Abb. 25 u. 26).
LA Durchmesser
WT
LA (mm)
3
2
TG
*
*
*
*
2 Wo
8 Wo
12 Wo
1
0
21 Wo
high
Abbildung 26: Vergleich des endsystolischen linken Vorhofdurchmessers zwischen A3
Mäusen und Wildtypen im Alter von 2, 8, 12 und 21 Wochen
high
AR+-
Es wird der endsystolische linksatriale Durchmesser der A3 AR+ Mäuse (schwarze
Balken) und Wildtypen (weiße Balken) im Alter von 2, 8 12 und 21 Wochen
dargestellt. Ab einem Alter von 8 Wochen vergrößert sich der Vorhof bei den
80
4. Ergebnisse
Wildtypen bis zum Alter von 21 Wochen nur noch geringgradig (jeweils um etwa 3 %),
bei den transgenen Tieren erfolgt die stärkste Größenzunahme (17 %) in der
Altersspanne zwischen 12 und 21 Wochen. Sternchen (*) kennzeichnen signifikante
Unterschiede. Diese bestehen bereits ab einem Alter von 2 Wochen.
high
Abbildung 27: Echokardiographische Darstellung von Längsschnitten des Herzens von A3
AR+-Mäusen mit 8, 12 und 21 Wochen
Der Vorhofdurchmesser wird in allen Bildern durch einen senkrechten Strich
gekennzeichnet
A)
Wildtyp im Alter von 8 Wochen
high
AR+ Maus im Alter von 8 Wochen
B)
A3
high
AR+ Maus im Alter von 12 Wochen
C)
A3
high
AR+ Maus im Alter von 21 Wochen
D)
A3
Mit zunehmendem Alter vergrößerte sich der Vorhof der transgenen Mäuse stetig. Der
Vorhofdurchmesser der Wildtypen blieb in etwa gleich, er ist daher nur einmal
dargestellt.
81
4. Ergebnisse
Aus der morphologischen Veränderung des Vorhofes ergab sich auch eine
funktionelle Beeinträchtigung. Der zweite Peak im typischen Dopplerbild auf Höhe
der Mitralklappe (MV A-Punkt), der durch die Kontraktion des linken Vorhofes, der
Blut durch die Mitralklappe in den Ventrikel pumpt, verursacht wird, erwies sich bei
den A3highAR+-Mäusen als geringer als bei den Wildtypen (62,1 ± 8,0 für die
Wildtypen, 39,1 ± 3,5 m/s für die transgenen Tiere, p< 0,05). Diese Verringerung war
auch im Alter von 8, 12 und 21 Wochen nachweisbar. Dies spricht für eine
verminderte Kontraktionskraft und Leistungsfähigkeit des linken Vorhofes, die schon
im Alter von 2 Wochen vorhanden war (s. Abb. 27).
A3highAR+-Maus
WT
Abbildung 28: Vergleichende Darstellung eines CW-Dopplers auf Höhe der Mitralklappe
Links sind die E- und A-Wellen eines Wildtypen, rechts die einer A3
Alter von 21 Wochen dargstellt
high
WT: Wildtyp, TG: A3 AR+ Maus, E: E-Welle, A: A-Welle
high
AR+-Maus im
Der diastolische Durchmesser des linken Ventrikels (LVEDd) war ab einem Alter von
8 Wochen bei den A3highAR+-Mäusen vergrößert. Während bei den Wildtypen die
Größe des linken Ventrikels ab diesem Alter kaum noch zunahm, vergrößerte sich
dieser bei den transgenen Mäusen weiter. Im Alter von 21 Wochen betrug die
Vergrößerung gegenüber den Wildtypen 20 %. Dies beeinträchtigte auch die
Kontraktionsfähigkeit des Ventrikels. Im Alter von 21 Wochen war die FS bei den
82
4. Ergebnisse
A3highAR+-Tieren herabgesetzt (35,1 ± 0,9 gegenüber 39,0 ± 1,0% bei den Wildtypen,
p< 0,05) (s. Abb 28).
LVEDd (mm)
LVEDd im Vergleich
6
5
4
3
2
1
0
WT
TG
2 Wo
*
8 Wo
*
12 Wo
*
21 Wo
high
Abbildung 29: Vergleich des diastolischen linken Ventrikeldurchmessers zwischen A3
Mäusen und Wildtypen im Alter von 2, 8, 12 und 21 Wochen
AR+-
high
Es wird der diastolische linksventrikuläre Durchmesser der A3 AR+-Mäuse
(schwarze Balken) und Wildtypen (weiße Balken) im Alter von 2, 8 12 und 21 Wochen
dargestellt. Während der Ventrikeldurchmesser bei den Wildtypen ab einem Alter von
8 Wochen nur noch wenig zunimmt, vergrößert er sich bei den transgenen Mäusen
deutlich weiter. Sternchen (*) kennzeichnen signifikante Unterschiede. Diese sind ab
einem Alter von 8 Wochen vorhanden. Im Alter von 21 Wochen ist auch die FS bei
den transgenen Mäusen signifikant verringert (hier nicht dargestellt).
Im Alter von 21 Wochen besitzen A3highAR+-Mäuse ein höheres linksventrikuläres
Gewicht als die Wildtypen.
83
4. Ergebnisse
Die Untersuchungsergebnisse sind in der folgenden Tabelle zusammenfassend
dargestellt.
Parameter
Atrium
Ventrikel
8 Wochen
21 Wochen
WT
A3highAR+
WT
A3highAR+
Körpergewicht (g)
25,0 ± 0,9
25,0 ± 0,8
29,1 ± 1,1
31,3 ± 0,9
HF (Schläge/min)
330 ± 12
303 ± 9
312 ± 16
272 ± 16
LA (mm)
1,68 ± 0,04
1,82 ± 0,04*
1,77 ± 0,08
2,3 ± 0,14*
MV E Punkt (cm/s)
72,7 ± 2,4
73,7 ± 3,0
65,9 ± 3,4
67,1 ± 3,1
MV A-Punkt (cm/s)
35,7 ± 2,5
28,3 ± 1,9*
29,1 ± 1,8
23,4 ± 1,6*
MV E/A
2,14 ± 0,14
2,71 ± 0,17*
2,33 ± 0,19
2,97 ± 0,20*
IVSd (mm)
0,53 ± 0,02
0,45 ± 0,02*
0,56 ± 0,03
0,55 ± 0,03
MV Decel-Zeit (ms)
60 ± 3
58 ± 2*
55 ± 4
60 ± 8
LVEDd (mm)
4,00 ± 0,06
4,22 ± 0,08*
3,92 ± 0,07
4,67 ± 0,13*
LVEDs (mm)
2,44 ± 0,04
2,66 ± 0,07*
2,39 ± 0,04
3,02 ± 0,07*
FS (%)
38,9 ± 0,8
37,1 ± 0,7
38,9 ± 1,0
35,4 ± 0,8*
Ao Vmax (cm/s)
95,5 ± 2,4
92,7 ± 2,9
81 ± 2
87 ± 3
HZV (ml)
32 ± 7
34 ± 8
28 ± 7
34 ± 9
Vcf (circ/s)
4,9 ± 0,2
4,6 ± 0,2
4,9 ± 0,2
4,5 ± 0,3
korrigiert Vcf
(circ/s)
11,5 ± 0,6
10,4 ± 0,5
11,2 ± 0,6
9,6 ± 0,6 !
LV Masse (mg)
76,1 ± 4,1
74,8 ± 3,7
77,9 ± 3,6
105,8 ± 0,8*
Tabelle 11: Echokardiographieergebnisse ausgewählter Parameter von 8 und 21 Wochen alten
high
A3 AR+-Mäusen und Wildtypen
Die Werte werden angegeben als Mittelwert ± Standardfehler. Sternchen (*) kennzeichnen
signifikante Unterschiede zwischen den Genotypen.
HF: Herzfrequenz, LA: linkes Atrium, MV E Punkt: höchster Punkt der E-Welle im
Mitraldoppler, MV A Punkt: höchster Punkt der A-Welle im Mitraldoppler, MV E/A:
Verhältnis des E-Punktes zum A-Punkt, IVSd: Durchmesser des Interventrikulären Septums
in der Diastole, MV Decel-Zeit: Dezelerationszeit der Mitralwelle, LVEDd/LVEDs:
linksventrikulärer Durchmesser diastolisch/systolisch, FS: Ventrikelverkürzungsfraktion, Ao
Vmax: maximale Geschwindigkeit des Aortendopplers, HZV: Herzzeitvolumen, Vcf:
zirkuläre Faserverkürzung, LV-Masse: errechnete Masse des linken Ventrikels
84
4. Ergebnisse
Serielle echokardiographische Untersuchungen an 8 und 15 Wochen alten A3lowAR+Mäusen und Wildtypen wiesen weder in der Morphologie, noch in der Funktion der
Herzen Unterschiede auf.
Einzelne Untersuchungsergebnisse sind in der nachfolgenden Tabelle dargestellt.
8 Wochen
15 Wochen
Parameter
WT
A3lowAR+
WT
A3lowAR+
Körpergewicht (g)
24 ± 1,2
25 ± 1
26 ± 1,6
26 ± 1,1
HF (Schläge/min)
315 ± 8
318 ± 8
333 ± 10
319 ± 7
LA (mm)
1,58 ± 0,03
1,59 ± 0,03
1,63 ± 0,02
1,67 ± 0,05
MV E Punkt (cm/s)
68,1 ± 2,6
68,3 ± 2,4
88,7 ± 2,6
66,5 ± 2,05
MV A-Punkt (cm/s)
29,7 ± 2,8
29 ± 1,3
31,8 ± 2,7
26,6 ± 2
IVSd (mm)
0,45 ± 0,02
0,47 ± 0,02
0,50 ± 0,03
0,48 ± 0,02
LVEDd (mm)
3,68 ± 0,08
3,75 ± 0,09
3,88 ± 0,11
4,1 ± 0,08
LVEDs (mm)
2,27 ± 0,06
2,33 ± 0,08
2,42 ± 0,07
2,52 ± 0,07
FS (%)
38,2 ± 1,6
37,9 ± 1,4
37,5 ± 1,66
38,5 ± 0,83
LV Masse (mg)
45,5 ± 4
58,7 ± 4,2
62,4 ± 6,9
65,0 ± 3,7
Atrium
Ventrikel
Tabelle 12: Echokardiographieergebnisse ausgewählter Parameter von 8 und 15 Wochen alten
low
A3 AR+-Mäusen und Wildtypen
Die Werte werden angegeben als Mittelwert ± Standardfehler. Sternchen (*) kennzeichnen
signifikante Unterschiede.
HF:Herzfrequenz, LA: linkes Atrium, MV Vmax: maximale Geschwindigkeit im
Mitraldoppler, IVSd: Durchmesser des Interventrikulären Septums in der Diastole, LVWd:
diastolischer Durchmesser der Hinterwand des linken Ventrikels, LVEDd/LVEDs:
linksventrikulärer Durchmesser in der Diastole/Systole, FS: Ventrikelverkürzungsfraktion,
LV-Masse: errechnete Masse des linken Ventrikels
85
4. Ergebnisse
4.2.4 Histologische Untersuchung
Die Durchmesser atrialer Zellen wiesen im Alter von 5 Wochen keine signifikanten
Unterschiede zwischen Wildtypen, A3high und A3lowAR überexprimierenden Mäusen
auf. Fibrotische Veränderungen konnten bei Wildtypen und A3lowAR+-Mäusen
ebenfalls nicht nachgewiesen werden. Eine der untersuchten A3highAR+-Mäuse zeigte
bereits Fibrosen in atrialen Zellen. Diese Maus war aber bereits durch eine deutliche
Bradykardie aufgefallen. Die übrigen untersuchten Vorhöfe der A3highAR+-Tiere
zeigten im Alter von 5 Wochen keine fibrotischen Veränderungen.
Im Alter von 14 Wochen wurden 2 Wildtypen, 3 A3high und 2 A3lowAR+-Mäuse
untersucht. Die Zelldurchmesser der Wildtypen und A3lowAR+-Tiere wiesen keine
Unterschiede auf. Fibrosen traten nicht auf. Die A3highAR+-Mäuse zeigten jedoch
einen vergrößerten Zelldurchmesser und zahlreiche fibrotische Veränderungen in
den atrialen Zellen (s. Abb. 29 u. 30).
Abbildung 30: Histologischer Ausschnitt eines Vorhofes eines 14 Wochen alten Wildtypen
Das Gewebe wurde mit Siriusrot gefärbt. Pathologische Veränderungen sind nicht
nachweisbar.
86
4. Ergebnisse
high
Abbildung 31: Histologischer Ausschnitt eines Vorhofes einer 14 Wochen alten A3
AR+-Maus
Das Gewebe wurde mit Siriusrot gefärbt. Fibrotische Veränderungen sind in diesem
Ausschnitt deutlich sichtbar.
87
4. Ergebnisse
4.2.5 Biochemische Untersuchungen
Die Ca2+-ATPase SERCA wurde in den Vorhöfen und Ventrikeln der A3highAR+Mäuse gegenüber denen der Wildtypen und A3lowAR+ Mäuse verringert exprimiert.
Das Expressionlevel von Phospholamban wies zwischen Wildtypen und beiden
A3AR+ Genotypen keine signifikanten Unterschiede auf.
Atriales PLB (aU)
Atriales SERCA (aU)
Ventrikuläres PLB (aU)
Ventrikuläres SERCA (aU)
WT
A3highAR+
101,7 ± 13,4
80,2 ± 15,2
559999 ± 59271
174217 ± 67985*
160,4 ± 36,6
150,9 ± 37,9
7437924 ± 514045
4230801 ± 290231*
Tabelle 13: Ergebnisse der biochemischen Untersuchungen an Herzen von Wildtypen und
A3AR+-Mäusen
PLB: Phospholamban, SERCA: ATPase am sarco-endoplasmatischen Retikulum, aU:
„arbitrary units“, selbstbestimmte Einheiten
88
4. Ergebnisse
In der folgenden Abbildung sind die Ergebnisse von 6-Kanal-Oberflächen-EKG,
Telemetrie, Echokardiographie und Histologie noch einmal abhängig vom Alter der
A3highAR+-Mäuse und der Wildtypen zusammengefasst.
atriale Arrhytmien
LA-Dilatation
histolog. Veränderungen
Ventrikel-Dilatation
WT-A3high (%)
100
80
60
40
20
0
1
4
7
10
13
16
19
Alter in Wochen
high
Abbildung 32: Zeitabhängiger Verlauf der beobachteten Veränderungen zwischen A3
Mäusen und Wildtypen
high
AR+-
Es sind die relativen Unterschiede von A3 AR+-Tieren und Wildtypen (angegeben in
Prozent, schematisiert) im altersabhängigen Verlauf dargestellt. Atriale Arrhythmien
führen zu einer Dilatation zunächst im linken Vorhof, später auch im linken Ventrikel.
Histologische Veränderungen in Form von Fibrosen treiben den Prozess weiter voran.
Da keine histologischen Ergebnisse von älteren als 14 Wochen alten Tieren zur
Verfügung standen, bleibt der Wert in der Darstellung auf gleich hohem Niveau.
Wahrscheinlich ist aber ein weiteres verstärktes Auftreten fibrotischer Veränderungen
bei zunehmendem Alter der transgenen Tiere.
89
5. Diskussion
5. Diskussion
5.1 Methodik
Eine Veränderung der genetischen Grundausstattung, z. B. das Ausschalten oder
auch die verstärkte Expression verschiedener Gene, kann Aufschluss über die
eigentliche
Grundfunktion
der
zugehörigen
Proteine
geben.
Die
elektrophysiologischen und funktionellen in vivo Auswirkungen der Überexpression
von zwei Subtypen der Adenosinrezeptoren wurden in der vorliegenden Arbeit mit
Hilfe
elektro-
und
echokardiographischer
in
vivo
Untersuchungen
näher
charakterisiert.
5.1.1 EKG-Aufzeichnungen
Für die elektrokardiographischen Untersuchungen wurden zum einen 6-KanalOberflächen-EKGs von sedierten Mäusen, sowie 1 kanalige EKGs von sich frei
bewegenden Mäusen erstellt. Beide Methoden haben verschiedene Vor- und
Nachteile. Die Erstellung der Oberflächen-EKGs ist nichtinvasiv, aufgrund der
reduzierten Muskelaktivität der Tiere artefaktfrei und durch die 6 ExtremitätenAbleitungen gut charakterisiert. Der Einsatz von Anästhetika beeinflusst allerdings
die normale Herzaktivität, besonders die Herzfrequenz. Die Wahl des Anästhetikums
an sich kann schon Einfluss auf die zu gewinnenden Ergebnisse nehmen (CHAVES
et al., 2003). Daher wurden in dieser Arbeit zwei verschiedene Injektionsanästhetika
verwendet.
Eine Anästhesie mit der Kombination von Ketamin und Xylazin wirkt kardiodepressiv,
die Herzfrequenz sinkt deutlich (ROTH et al., 2002). Deutlich höhere Herzfrequenzen
während der Narkose verursacht das Injektionsanästhetikum Urethan. Da es eine
sehr tiefe Narkose verursacht, aus der die Tiere nur schlecht wieder erwachen,
wurde diese Technik nur für Terminalversuche verwendet. Zuerst wurde das EKG
geschrieben, anschließend wurde das Herz für weitere Versuche entnommen.
90
5. Diskussion
Ein Einfluss von Injektionsanästhetika wird beim telemetrischen EKG ausgeschaltet.
Es können physiologische EKGs bei sich frei bewegenden Tieren aufgezeichnet
werden (KRAMER et al., 1993). Bei der Anwendung von definierten physiologischen
Belastungsprotokollen kann zudem die EKG-Aktivität in Ruhe und unter Belastung,
analog
zum
Belastungs-EKG
beim
Menschen,
aufgezeichnet
werden.
Die
Implantation des Transmitters ist allerdings eine invasive Prozedur. Die Mäuse
verlieren nach der Operation zunächst an Gewicht und brauchen einige Tage, um
sich vollständig zu erholen. Desweiteren könnte das Volumen des in die Bauchhöhle
implantierten Transmitters eventuell auch Druck-/ Volumenveränderungen im
Brustkorb bewirken und dadurch die Herztätigkeit beeinflussen. Die Methode ist
allerdings für experimentelle Untersuchungen an Mäusen etabliert und validiert. Zur
Ausnutzung der verschiedenen Vorteile und zur gegenseitigen Kontrolle der
Oberflächen- und telemetrischen EKGs wurden beide Methoden kombiniert.
Oberflächen-EKGs an wachen, fixierten Mäusen durchzuführen, führt bei den Tieren
natürlich zu Stress und zu erhöhten Herzfrequenzen. Außerdem ist die Qualität der
EKGs nicht so gut wie bei sedierten Mäusen. Es ergibt sich aber der Vorteil, EKGs
bei sehr jungen Mäusen (in dieser Studie minimal 5 Tage alt) erstellen zu können,
ohne sie dem Risiko einer Narkose und einer nachfolgenden Hypothermie
auszusetzen.
5.1.2 Echokardiographie
TANAKA et al. zeigten 1996, dass die transthorakale Echokardiographie als
Möglichkeit
einer
nichtinvasiven
Untersuchungsmethode,
eine
sowohl
morphologische als auch funktionale Charakterisierung des kardialen Phänotyps von
Mäusen ermöglicht. Sie erwies sich als zuverlässiges Mittel, um Veränderungen im
linken Ventrikel, vor allem Kammergröße, Wanddicken, Masse und Funktion, in vivo
festzustellen. Die Masse des linken Ventrikels kann dabei nach einer Formel von
MANNING et al. (1994) und GARDIN et al. (1995) berechnet werden. In linker
Seitenlage können Motion (M)-Modes von der parasternalen kurzen Achse in der
Nähe
der
Papillarmuskelebene
angefertigt
91
und
die
Wanddicken
und
5. Diskussion
Ventrikeldurchmesser bestimmt werden. In einem modifizierten parasternalen
Längsachsenblick mit nach apikal angenähertem Winkel wird im gepulsten Doppler
das Maximum des Flusses aus dem Ventrikel durch die Aorta und das des Flusses in
den Ventrikel durch die Mitralklappe bestimmt (TANAKA et al., 1996; STYPMANN et
al., 2002). Absolute Werte bei der Doppleruntersuchung des Aortenflusses
transthorakal zu messen ist kaum praktikabel, da der Winkel zwischen dem
Dopplerstrahl
und
dem
Blutstrom
nicht
gleich
null
ist
und
daher
die
Flussgeschwindigkeiten unterschätzt werden. Das Mausherz vom Apex im richtigen
Winkel zu treffen ist aufgrund des kleinen echokardiographisch zugänglichen
Fensters des Herzens bei der Maus erschwert. Die relativen Dopplerwerte zeigten
sich in dieser Arbeit aber untereinander gut vergleichbar. Nahezu gegen null geht der
Winkel bei der Doppleruntersuchung des Flusses durch die Mitralklappe (TANAKA et
al., 1996). Für die echokardiographischen Studien in der vorliegenden Arbeit wurde
eine Sedierung der Mäuse mit einer Mischung aus Ketamin und Xylazin verwendet.
Im Gegensatz zu anderen untersuchten Injektionsanästhetika ruft diese Kombination
eine deutliche Bradykardie hervor. Verschiedene Injektionsanästhetika bei Mäusen
führen zunächst zu einer Reduktion der Kontraktionskraft des Herzens und des
Herzzeitvolumens, im Laufe der Zeit kommt es allerdings zu einem Ansteigen der
Pumpkraft, die zuerst deutlich herabgesetzt war (ROTH et al., 2002). Die FS ist dabei
mit
der
Herzfrequenz
positiv
korreliert
(CHAVES
et
al.,
2001).
Das
Herzschlagvolumen wird durch Ketamin/Xylazin gegenüber der Verwendung von
Inhalationsanästhetika
deutlich
herabgesetzt
(CHAVES
et
al.,
2001).
Die
Verwendung von Inhalationsanästhetika, besonders Isofluran, scheint für die
echokardiographische Untersuchung der Maus das Mittel der Wahl zu sein. Neben
nur geringem Einfluss auf die Herztätigkeit sind auch die Ergebnisse besser
reproduzierbar als bei der Verwendung von Injektionsanästhetika (CHAVES et al.,
2001; ROTH et al., 2002). Bei der echokardiographischen Untersuchung einiger
Mausmodelle kann eine Verwendung von Ketamin/Xylazin aber Vorteile gegenüber
Isofluran bieten (ROTH et al., 2002). Langsamere Frequenzen ermöglichen eine
bessere zeitliche Bildauflösung und damit auch die Darstellung besonders feiner
Strukturen wie der Vorhofwand. Zudem wird bei langsameren Frequenzen ein
92
5. Diskussion
Verschmelzen der E- und A-Welle verhindert, so dass die Vorhoffunktion und die
diastolische Ventrikelfunktion besser gemessen werden können. Daher wurde in
dieser Arbeit unter Abwägung der Vor- und Nachteile eine Ketamin/Xylazinnarkose
verwendet.
Die echokardiographische Messung des Durchmessers des linken Vorhofes bei der
Maus ist, nach meinem Wissen, in der Literatur bisher nicht dokumentiert. In dieser
Arbeit wurde der linke Vorhof in der parasternalen Längsachsenansicht des Herzens
zum Zeitpunkt seiner größten Ausdehnung (endsystolisch) vermessen. Diese
Messtechnik wird auch bei Hunden und Katzen verwendet (POULSEN NAUTRUP u.
TOBIAS, 2001). Auch bei der Maus erwies sich diese Technik als gut anwendbar.
Die Identifikation der Vorhofwand bereitete gelegentlich Schwierigkeiten, war aber
dennoch bei allen Mäusen darstellbar. Es wurden nur Darstellungen in die
Auswertung einbezogen, in denen die Vorhofwandstruktur kontinuierlich in das Echo
des Epikards der Hinterwand des linken Ventrikels überging. Es wurden pro Maus 5
Einzelmessungen in 5 verschiedenen Einstellungen durchgeführt. Die Methode
erlaubt nicht-invasive und damit serielle Messungen, die den Innendurchmesser des
linken Vorhofes erfassen. Das Prinzip der seriellen Messungen an alternden Mäusen
machte eine direkte Überprüfung der Größe des Vorhofs durch direkte Messung am
entnommenen Herzen unmöglich. Die vergleichende Untersuchung zwischen
Wildtypen und transgenen Tieren erlaubte aber zuverlässig die Registrierung von
Unterschieden. Der Vergleich der Vorhofgröße bei den Wildtypen unterschiedlicher
Altersgruppen, in denen die Vorhofgröße nur noch geringgradig zunahm, konnte
auch der Kontrolle der Reproduzierbarkeit der Messungen dienen.
5.1.3. Injektion von Pertussistoxin
Pertussitoxin (PTX) ist eines der von Bordetella pertussis produzierten Enterotoxine.
Es gelangt retrograd über den Golgi-Apparat ins endoplasmatische Retikulum (ER).
Von hier gelangt es maskiert ins Zytosol der Zelle und katalysiert den Transfer einer
Adenosindiphosphat (ADP)-Ribose eines Nikotinamidadenindinukleotids an die
inhibitorische Untereinheit eines Gi-Proteins (GiQ). Das GiQ -Protein kann jetzt keine
93
5. Diskussion
hemmende
Wirkung
mehr
auf
die
Adenylatzyklase
ausüben.
Die
cAMP-
Konzentration innerhalb der Zelle steigt anhaltend an (BAGLEY et al., 2002).
Zeitabhängige Versuche an Ratten zeigten, dass intraperitoneal injiziertes PTX in
einer Dosierung von 10µg/kg Körpergewicht nach 48 eine deutliche Wirkung zeigt,
eine vollständige Blockierung der hemmenden Wirkung von Norepinephrin auf die
Stimulierung einer Insulinfreisetzung aus dem Pankreas durch PTX aber erst nach 72
Stunden erfolgt (KOMATSU et al., 1995). Die PTX-Dosierung von 150 µg/kg
Körpergewicht, die in dieser Arbeit verwendet wurde, richtete sich nach Erfahrungen
der Arbeitsgruppe von Prof Neumann, die Versuche an A1AR+-Mäusen mit PTX und
anschließender Untersuchung isolierter Herzen durchgeführt hat (NEUMANN et al.,
2003). Bei diesen Versuchen wurden die Herzen auch erst 72 Stunden nach der
Injektion von Pertussistoxin entnommen. Bei den Versuchen in der vorliegenden
Arbeit wurden die Frequenzen nur über einen Zeitraum bis 48 Stunden
aufgezeichnet, da es nach diesem Zeitraum zu einer deutlichen Verschlechterung
des Allgemeinbefindens der Tiere kam. Die Tiere wurden daher euthanasiert. 2 Tiere
verstarben spontan. Wie auch bei den Versuchen von KOMATSU et al., 1995, zeigte
sich nach 48 Stunden eine deutliche Wirkung des PTX gegenüber den
Veränderungen, die nach 24 Stunden sichtbar waren. Die Einschleusung von PTX in
die Zelle und die nachfolgende Ribosylation und damit anhaltenden Hemmung einer
ausreichenden Anzahl an Gi-Proteinen um einen Effekt induzieren zu können,
scheint 24 bis 48 Stunden in Anspruch zu nehmen. Eine vermutlich erst nach 72
Stunden maximale Wirkung von PTX wurde in der vorliegenden Arbeit nicht
untersucht. Ein dann auch signifikantes Ansteigen der Herzfrequenzen der
transgenen Mäuse nach dieser Zeitspanne im Vergleich zum Ausgangswert und
nicht nur ein Verschwinden der signifikanten Unterschiede gegenüber den Wildtypen
erscheint wahrscheinlich.
94
5. Diskussion
5.2 Versuchsergebnisse
5.2.1 Zusammenfassung
Die Überexpression von A1AR beeinflusste die chronotrope Anpassungsfähigkeit der
Mäuse an körperliche Belastung und hatte nur geringen Einfluss auf die
Herzfrequenzen in Ruhe. Die Überexpression der A1AR schien vor allem die indirekte
Wirkung der Rezeptoraktivierung, die Abschwächung der durch Katecholamine
verursachten Veränderungen am Herzen, zu verstärken. Im Gegensatz dazu schien
die hochgradige Überexpression der A3AR hauptsächlich die Herzfrequenzen unter
Ruhebedingungen zu beeinflussen. Bei niedrigen Herzfrequenzen verursachte die
A3AR
Überexpression
deutliche
atriale
Bradykardien
mit
anhaltenden
Rhythmusstörungen. Körperliche Belastung der Tiere resultierte in einem fast
vollständigen Sistieren der Rhythmusstörungen und der Wiederherstellung der
normalen Herzerregung ausgehend vom Sinusknoten. Die durchschnittliche
Herzfrequenz lag dabei deutlich unter der der Wildtypen und auch unter der der
A1AR+-Mäuse.
Die
A3highAR+-Mäuse
zeigen
somit
eine
deutliche
Sinusknotendysfunktion vor allem in Ruhe.
Die
Überexpression
beider
Adenosinrezeptorsubtypen
beeinflusste
die
Überleitungszeit im AV-Knoten in Ruhe sowie unter Belastung. Ein AV-Block ersten
Grades wurde von einer Überexpression der A1AR, bei Belastung auch durch die
hochgradige Überexpression der A3AR verursacht. Die hochgradige Überexpression
der A3AR unter Ruhebedingungen resultierte im gehäuften Auftreten von
hochgradigen und totalen AV-Blockierungen. Die niedriggradige Überexpression der
A3AR zeigte deutlich abgeschwächte Veränderungen, und auch diese nur unter
Ruhebedingungen. Es trat ein AV-Block ersten Grades auf, der durch den
adrenergen Einfluss körperlicher Arbeit vollständig verschwand. Die überexprimierten
A1AR schienen im Gegensatz zu den überexprimierten A3AR in Herzgewebe
oberhalb des AV-Knotens keine direkte Wirkung zu entfalten.
Eine funktionelle Beeinflussung des Herzens wurde durch die Überexpression beider
Subtypen hervorgerufen. Allerdings führte eine Überexpression der A1AR zu
95
5. Diskussion
minimalen Veränderungen in der Ventrikelpumpfunktion. Bei den A3AR+-Mäusen
führten die atrialen Arrhythmien und eine atriale Hypertrophie bei älteren Tieren zu
einer atrialen und später auch zu einer ventrikulären Kardiomyopathie.
5.2.2 Elektrophysiologie- Mechanismus
Die Überexpression von A1AR bewirkte bei sedierten Mäusen keine nachweisbaren
elektrokardiographischen Veränderungen. Bei telemetrisch untersuchten transgenen
Tieren konnten hingegen Beeinflussungen der Herzfrequenz in Ruhe und unter
Belastung nachgewiesen werden. In Ruhe betraf die Beeinflussung nur die maximal
erreichten Herzfrequenzen.
Bei niedrigen Isoproterenolkonzentrationen steigt die Frequenz von isolierten A1AR+Herzen durch indirekte Hemmung zunächst kaum an, bei Wildtypherzen erfolgt
bereits ein mäßiger Anstieg (HEADRICK et al., 2000). Dies kann eine Erklärung dafür
sein, dass die hier gemessenen maximalen Herzfrequenzen unter Ruhebedingungen
(und
stärkerer
adrenerger
Stimulation
als
die
mittleren
und
niedrigen
Herzfrequenzen) bei den transgenen Tieren signifikant niedriger als die der
Wildtypen waren.
Bei wachen Mäusen scheint die Ruheherzfrequenz vor allem durch den Tonus des
Sympatikus bestimmt zu werden, da sie durch Isoproterenol nicht steigerbar scheint
(GEHRMANN et al., 2000). Allerdings wurden in der Studie von GEHRMANN et al.
(2000) Ruheherzfrequenzen von durchschnittlich 724 Schlägen pro Minute zugrunde
gelegt, Frequenzen also, die in dieser Arbeit bei den Wildtypen erst unter
Schwimmbelastung auftraten. Die Aufzeichnungen von GEHRMANN et al. wurden
nach einer 15 minütigen Eingewöhnungsphase der Mäuse erstellt, einer Zeitspanne,
die nach Erfahrungen, die während der Anfertigung der vorliegenden Arbeit gemacht
wurden, nicht ausreichen, um die Mäuse wirklich „zu beruhigen“. In der vorliegenden
Arbeit wurden die Ruheaufzeichnungen aus einem 24 Stunden-EKG entnommen.
Die durchschnittlichen Ruheherzfrequenzen lagen in dieser Arbeit bei 455 Schlägen
pro Minute. Diese HF entspricht der intrinsischen Herzfrequenz bei Mäusen im
96
5. Diskussion
isolierten Herzen und wurde von der Arbeitsgruppe für die Wildtypen des hier
untersuchten Mausmodells bestätigt (KIRCHHOF et al., 2003).
Unter Belastung führte die Rezeptorüberexpression allerdings zu einer deutlichen
Hemmung der adrenergen Stimulation auf die sowohl durchschnittlichen als auch
maximalen Herzfrequenzen.
Die Herabsetzung der in Ruhe maximal erreichten HF sowie die unter Belastung
verminderte chronotrope Anpassungsfähigkeit der A1AR+Mäuse sprechen für einen
Mechanismus
der
Hemmung
einer
adrenergen
Stimulation
durch
die
überexprimierten A1AR. Diese indirekte hemmende Wirkung auf adrenerge Stimuli
scheint auch bei überexprimierten A1AR über ein Gi-Protein mit nachfolgender
Hemmung der Adenylatzyklase zu erfolgen (NEUMANN et al., 1999 u. 2003). Die
Ergebnisse der Versuche mit Pertussistoxin an isolierten A1AR+- und WildtypHerzen, die das Gi-Protein hemmen, konnten in dieser Arbeit in vivo bestätigt
werden. Zwei Tage nach der Injektion des Toxins erreichten die transgenen Mäuse
den Wildtypen ähnliche maximale Herzfrequenzen. Auch die Tatsache, dass keine
A1AR+-Maus in vivo Arrythmien entwickelt hat, die durch eine Verkürzung des
Aktionspotentials im Vorhof begünstigt würden (KABELL et al., 1994; BELARDINELLI
et al., 1995), wenn die überexprimierten Rezeptoren in hohem Maße an
Kaliumkanäle gebunden wären, könnte für eine überwiegende Kopplung der A1AR an
Gi-Proteine sprechen. Die antiadrenerge Wirkung der Rezeptorüberexpression bei
Belastung unterstützt diese These ebenfalls.
Eine für die A1AR+-Herzen herabgesetzte Eigenschlagrate im intakten Organismus,
wie sie bei isolierten Herzen auftritt (MATHERNE et al., 1997), konnte in vivo nicht
nachgewiesen werden. Spätere Messungen am isolierten transgenen Herzen einiger
der in dieser Arbeit untersuchten Tiere zeigten allerdings eine herabgesetzte
Eigenschlagfrequenz (KIRCHHOF et al., 2003). Um den direkten negativ
chronotropen Effekt ohne Adenosinapplikation an isolierten Herzen zu erklären, wird
eine durch die Überexpression hervorgerufene tonische Aktivierung der A1AR
vorgeschlagen (MATHERNE et al., 1997). Im in vivo Herz scheint die antiadrenerge
Wirkung der überexprimierten A1AR aber im Vordergrund zu stehen.
97
5. Diskussion
Eine kardiale Überexpression des A3AR führt in vivo bei Mäusen unter Sedation und
auch bei sich frei bewegenden Tieren zu einer deutlichen und anhaltenden
Ruhebradykardie gegenüber den Wildtypen, zu dauerhaften atrialen Arrhythmien mit
ventrikulärem Ersatzrhythmus und zu verschiedengradigen AV-Blöcken. Werden
A3highAR+-Mäuse einer adrenergen Stimulation ausgesetzt, kommt es zu einer
Veränderung der in Ruhe erhobenen elektrophysiologischen Befunde. Der
Sinusknoten
übernimmt
bei
Belastung
wieder
seine
physiologische
Schrittmacherfunktion. Die Frequenz, mit der er das Herz erregt, ist dabei gegenüber
Wildtypmäusen jedoch weiterhin bradykard und AV-Blockierungen ersten Grades
sind weiterhin nachweisbar. Die Stimulation des sympathischen Nervensystems
scheint die Wirkung einer Überexpression von A3AR auf den AV- und den
Sinusknoten jedoch abzuschwächen.
Bei hypertrophen Rattenmyozyten konnten MEYER et al. (2001) eine Abschwächung
des antiadrenergen Wirkungspotentials von Adenosin nachweisen. Die antiadrenerge
Wirkung von Adenosin und deren Abschwächung in hypertrophem Myokard war
A1AR -vermittelt. Die in dieser Arbeit gezeigte Verringerung der durch eine A3AR
Überexpression hervorgerufenen Rhythmusstörungen durch adrenerge Stimulation
(Schwimmbelastung) könnte auf einem ähnlichen Phänomen beruhen. Die
Schwimmbelastung
erfolgte
nur
bei
adulten
Mäusen,
die
in
der
echokardiographischen Untersuchung bereits ein hypertrophiertes Herz zeigten.
Durch Schwimmbelastung könnte sich die adrenerge Stimulation des Herzens
aufgrund der herabgesetzten adenosinergen Hemmung stärker auswirken. So
könnte durch die positiv chrono- und dromotrope Wirkung der adrenergen Stimulation
wieder ein „normaler“ Sinusrhythmus erzeugt werden. Der Übertragungsweg der
antiadrenergen Wirkung von A1AR über die Aktivierung von Gi und Hemmung der
Adenylatzyklase und damit der PKA ist auch für A3AR nachgewiesen (PALMER,
1995). BLACK et al. (2002), die an A3AR+-Mäusen wie in dieser Arbeit eine dilatative
Kardiomyopathie nachwiesen, schlugen als Entstehungsgrund eine verstärkte
Aktivierung der Gi-Proteine durch die Überexpression der A3AR vor. Sie begründeten
diese Annahme mit Beobachtungen, die zeigten, dass die Überexpression eines
ebenfalls
Gi-Protein-gekoppelten
Opioidrezeptors
98
dilatative
Kardiomyopathien
5. Diskussion
induziert. Eine Aktivierung von A2 und A3AR hatte allerdings in den Versuchen von
MEYER et al. (2001) weder bei gesundem noch hypertrophem Myokard eine
antiadrenerge
Wirkung
zur
Folge.
Auch
das
Phänomen,
dass
die
elektrophysiologischen Folgen einer A3AR Überexpression vor allem in Ruhephasen
ausgeprägt sind und durch adrenerge Stimulation abgeschwächt (A3high) oder sogar
beseitigt werden (A3low), spricht für eine, im Gegensatz zu A1AR, nicht primär
antiadrenerge
Wirkung
der
Rezeptoren
und
somit
für
einen
anderen
(vorherrschenden) Übertragungsweg als der des Gi-Proteins mit nachfolgender
Hemmung der Adenylatzyklase.
So könnte eine direkte Kopplung der überexprimierten A3AR an einen oder mehrere
Ionenkanäle (DOBREV et al., 2004) die beschriebenen Veränderungen induzieren.
Hierfür spricht die depressive Wirkung, die eine A3AR-Überexpression auf den Sinusund
AV-Knoten
ausübt.
Diese
entspricht
der
Wirkung,
die
hohe
Agonistenkonzentrationen am A1AR durch Aktivierung von IK-Ado und eine Hemmung
von ICA(L) hervorrufen (WEST u. BELARDINELLI, 1985; CLEMO u. BELARDINELLI,
1986). So kann es zum Sistieren der Aktionspotentialbildung im Sinusknoten und der
Weiterleitung von Aktionspotentialen im AV-Knoten kommen. Beide Phänomene
konnten in dieser Arbeit im in vivo-Mausmodell der A3AR Überexpression beobachtet
werden.
Auch
der
möglicherweise
für
die
kardioprotektive
Wirkung
verantwortliche
Signaltransduktionsweg der A3AR über RhoA könnte für die dargestellten
elektrophysiologischen und morphologischen Veränderungen verantwortlich sein. So
führt eine Überexpression des GTP-bindenen Proteins RhoA zu deutlichen
Veränderungen am Herzen, die den Folgen einer A3AR Überexpression ähneln (SAH
et al., 1999). So zeigen Mäuse, die RhoA überexprimieren deutliche Vergrößerungen
der Vorhöfe, reduzierte Herzfrequenz, Vorhofflimmern, AV-Block und nachfolgend
Herzversagen. Die Ähnlichkeiten zwischen RhoA+ und A3AR+ Mäusen sprechen für
eine Vermittlung der A3AR- Wirkung auch über RhoA.
99
5. Diskussion
Zusammenfassend lässt sich postulieren, dass die überexprimierten A1AR
hauptsächlich über Gi-Proteine agieren und die intrazelluläre Wirkung von
Katecholaminen abschwächen und so vor allem eine indirekte antiadrenerge Wirkung
besitzen, die Überexpression der A3AR hingegen eine direkte, nicht antiadrenerge
Beeinflussung der Herzphysiologie bewirkt. Diese könnte durch die Kopplung an
Ionenkanäle und/oder an eine Bindung des Proteins RhoA vermittelt werden.
Abbildung 32 fasst diese Signaltransduktionswege zusammen.
Adrenalin
Adenosin
Adenosin
Adren.
R
A1
AR+
A3
Gs
Gi
GTP
GDP
-
+
GTP
Ionenkanal
AR+
GDP
+
RHoA
?
GTP
GDP
PLD
AC
Abbildung 33: Schema von vermuteten Signaltransduktionswegen, die bei der Überexpression
von A1 und A3AR eine Rolle spielen
In Anlehnung an Abb. 2 spiegelt dieses Schema die Ergebnisse dieser Arbeit wieder.
Dargestellt sind die Signaltransduktionswege, die als Verursacher der beobachteten
elektrophysiologischen Veränderungen in Frage kommen könnten. Bei dem
schematisch dargestellten Ionenkanal könnte es sich um einen Kalium- oder
Kalziumkanal handeln. Eine Kopplung der überexprimierten A3AR an mehrere
Ionenkanäle ist ebenfalls denkbar.
A1AR+: überexprimierter A1 Adenosinrezeptor, A3AR+: überexprimierter A3
Adenosinrezeptor, Adren R: Adrenalinrezeptor, AC: Adenylatzyklase, PLD:
Phospholipase D,
100
5. Diskussion
5.2.3 Herzfrequenzvariabilität
Die eigentliche Herzfrequenzvariabilität (HFV), die Modulation von Schlag zu Schlag,
spiegelt die autonome Aktivität des Herzens wieder. Beim Menschen ist eine
herabgesetzte HFV ein unabhängiges Anzeichen zahlreicher Herzerkrankungen
(GEHRMANN et al., 2000). Bei starkem Sympathikuseinfluss sinkt die HFV (FEI et
al., 1996).
Mit der Zusammenlegung der verschiedenen Protokollabschnitte der Belastung der
Maus sollte nicht nur die autonome Aktivität des Herzens (umfasst die
Standardabweichungen der RR-Intervalle während „unbelasteter“ Phasen, meistens
über einen Zeitraum von 24 Stunden), wie sie normalerweise bei der Darstellung der
HFV untersucht wird, sondern auch die „chronotropische Inkompetenz“ (FEI et al.,
1996) der A1AR+-Mäuse untersucht werden. Die in dieser Arbeit dargestellte HFV
soll alle Herzfrequenzspektren umfassen.
Die antiadrenerge Hemmung der überexprimierten A1AR+ auf eine Wirkung des
Sympathikus schränkt das Spektrum der möglichen Herzfrequenzen ein. Während
Ruhe- und Belastungsphasen zeigen die A1AR+ Mäuse geringere maximale
Herzfrequenzen als die Wildtypen. Die minimalen Herzfrequenzen unterscheiden
sich dagegen nicht zwischen transgenen Mäusen und Wildtypen. Durch den starken
Einfluss des Sympathikus unter Belastung wird die HFV vermutlich sowohl bei
Wildtypen als auch bei A1AR+-Tieren kurzfristig weiter eingeschränkt. Die
Überexpression der A1AR könnte aber durch die vermittelte antiadrenerge Wirkung
auch einen hemmenden Einfluss auf die Herabsetzungsfähigkeit einer adrenergen
Stimulation auf die HFV ausüben. Dies würde bedeuten, dass in Phasen
längeranhaltender sympathischer Aktivität die HFV der A1AR+-Mäuse sich der HFV
der Wildtypen, die durch den starken Sympathikuseinfluss vermindert ist, angleicht.
Hierfür spricht eine Angleichung der Standardabweichungen der RR-Intervalle
zwischen beiden Genotypen während der Belastungsphase. So scheinen vor allem
die Phasen, die von langsamen und mittleren Herzfrequenzen dominiert werden, zu
der beobachteten Einschränkung der (Gesamt-)HFV der A1AR+-Mäuse gegenüber
den Wildtypen zu führen.
101
5. Diskussion
Da zur Bestimmung der HFV das Vorliegen eines stabilen Sinusrhythmus
Grundvorraussetzung ist, konnte diese bei den A3highAR+ Mäusen nicht untersucht
werden. Die HFV zwischen A3lowAR+ Mäusen und Wildtypen wies keine
Unterschiede auf. Niedriggradig überexprimierte A3AR scheinen keinen hemmenden
Einfluss auf eine adrenerge Stimulation zu besitzen.
5.2.4 Arrhythmien
Sinusknotendysfunktion
Atriale Arrhythmien traten weder bei den Wildtypen noch bei den A1AR+- Mäusen in
vivo nach Sedierung, in Ruhe oder unter Belastung auf.
Im Gegensatz zu den A1AR+-Mäusen kam es bei den A3highAR+-Tieren bereits ab
einem Alter von 3 Wochen zu elektrophysiologischen und auch morphologischen
Veränderungen im Vorhof. Ab diesem Alter scheint der Sinusknoten als eigentlicher
Schrittmacher bei den transgenen Tieren kaum oder gar nicht mehr zur
Herzfrequenzbildung beizutragen. Die Vorhöfe wurden zwar von ihm erregt,
allerdings in so langsamer und unregelmäßiger Frequenz, dass die Ventrikel
schneller
durch
einen
ventrikulären
Ersatzrhythmus
erregt
wurden.
Dieser
Ersatzrhythmus bestimmte die Herzfrequenz. Die bradykarde Vorhoferregung wurde
von gelegentlich auftretenden Vorhof-Arrhythmien unterbrochen. Aufgrund der
kurzzeitigen tachykarden Abschnitte der Vorhoferregung, die auch teilweise zum
Ventrikel weitergeleitet wurden, unterschieden sich in Ruhe die maximalen
Herzfrequenzen zwischen A3highAR+ Mäusen und Wildtypen nicht.
Die bradykarden Phasen der Vorhoferregung könnten durch ein kurzzeitiges
Sistieren der Sinusknotenfunktion als Zeichen eines „Sick sinus syndrome“
verursacht werden (DaCOSTA et al., 2002). Hierfür spricht das Fehlen von P-Wellen
in den EKGs der A3AR+ Mäuse während bradykarder Phasen und das Auftreten von
breitkomplexigen Ersatzrhythmen.
Der Mechanismus einer proarrhythmischen Wirkung von Adenosin über eine
Aktivierung von A1AR, der auf einer Verkürzung der Aktionspotentiale im Vorhof
102
5. Diskussion
beruht (KABELL et al., 1994), könnte vielleicht auch in den kurzzeitigen Abschnitten
der tachykarden Vorhoferregung bei den überexprimierten A3AR eine Rolle spielen.
Überexprimierte A3AR müssten dann, auch ohne Agonistenapplikation, einen
Einfluss auf das Aktionspotential von Vorhofzellen über Ionenkanäle besitzen. Die
Ursache
der
atrialen
Arrhythmien
bei
A3AR+-Mäusen
könnten
dann
Nachdepolarisationen und getriggerte Aktivitäten im Vorhofmyokard sein. Isolierte
A1AR+-Herzen zeigten allerdings keine gegenüber den Wildtypen verkürzten
Aktionspotentiale im Vorhof (KIRCHHOF et al., 2003). Fraglich ist, ob im Gegensatz
dazu überexprimierte A3AR+-Herzen veränderte Vorhofaktionspotentialsdauern
aufweisen, die für die Entstehung tachykarder Arrhythmien verantwortlich sein
könnten.
Um die genauen Mechanismen der atrialen Arrhythmien von A3AR+-Mäusen
genauer
bestimmen
zu
können,
sind
also
weitere
elektrophysiologische
Untersuchungen nötig. Zu berücksichtigen ist dabei vielleicht auch die Tatsache,
dass hypertrophierte Herzen Veränderungen im Adenosinstoffwechsel aufweisen. So
zeigten MEYER et al. (2001), dass Herzen von Ratten, die eine kompensierte
Hypertrophie aufgrund eines erhöhten Blutdruckes entwickelt haben, eine erhöhte
Adenosinproduktion aufweisen. Es könnte also auch bei den A3AR+-Herzen durch
die
sich
entwickelnde
Hypertrophie
der
Myozyten
zu
Veränderungen
im
Adenosinstoffwechsel kommen, die pathologische Mechanismen unterstützen
könnten. Dies würde möglicherweise die Entstehung eines „Circulus vitiosus“
begünstigen.
Bei sehr jungen A3highAR+-Mäusen (5 Tage alt) traten noch keine Arrhythmien auf.
Grundsätzlich unterscheiden sich die EKGs von neugeborenen Mäusen bis zu einem
Alter von 14 Tagen deutlich von denen adulter Mäuse. R-R, P-R und Q-T-Intervalle
sind bei den jungen Mäusen und Ratten deutlich länger (DIETZ u. SCHWARTZE,
1991; WANG et al., 2000). Dies scheint mit einer altersabhängigen Zunahme der
Empfindlichkeit
gegenüber
sympathischer
Stimulation
des
Herzens
zusammenzuhängen (DIETZ u. SCHWARTZE, 1991). Die Repolarisation der
Herzzellen wird bei neugeborenen Mäusen und adulten Tieren durch die Beteiligung
103
5. Diskussion
unterschiedlicher Kalium-Kanäle bestimmt (WANG et al., 2000). Die Repolarisation
ist
bei
jungen
Mäusen
deultich
langsamer
(RICHARDS
et
al.,
1953).
Adenosinrezeptoren, die unter anderem durch einen Kaliumstrom (IK-ADO) und auch
durch eine Beeinflussung des Sympathikus ihre Wirkung entfalten, könnten daher bei
sehr jungen Mäusen noch unwirksam sein. Aber der vermutete Hauptgrund, der für
ein Fehlen von Veränderungen bei den sehr jungen Mäusen verantwortlich ist, ist die
Tatsache, dass die Genabschnitte des Q-MHC-Promotors, der für die Expression der
transgenen Adenosinrezeptoren verantwortlich ist, bei Mäusen zum Zeitpunkt der
Geburt zwar transskribiert wird, die Transskription bis zu 7 Tage nach der Geburt
durch die vermehrte Freisetzung von Schilddrüsenhormonen aber noch deutlich
gesteigert wird (LYONS et al., 1990; SHERIDAN et al., 2000). Ein hohes Maß an
Rezeptorüberexpression wird daher vermutlich erst bei Mäusen wirksam, die ein
gewisses Alter erreicht haben.
Die Befunde der telemetrischen EKG-Aufzeichnungen der A3AR+ Tiere mit
phasenweisem
Sinusknotenstillstand
Tachyarrhythmien
entsprechen
(silent
den
atria)
im
Beobachtungen
Wechsel
bei
mit
atrialen
Patienten
mit
Sinusknotenerkrankungen (ISOBE et al., 1998; BRIGNOLE, 2002; SNEZHITSKII,
2003). A3AR könnten somit ein potentielles Kandidatengen für die Suche nach
genetischen Ursachen dieser Erkrankung darstellen.
AV-Block
A1AR Agonisten üben eine negativ dromotrope Wirkung aus (BELARDINELLI, 1995).
Besetzte A1AR aktivieren den auswärtsgerichteten Kaliumstrom IK-ADO und verlängern
die Refraktärzeit der Kalziumkanäle vom L-Typ (WORKMANN et al., 1999). So
können A1AR-Agonisten die Überleitungszeit im AV-Knoten verlangsamen (LERMAN
et al., 2001; WU et al., 2001). Mäuse, die den A1AR überexprimieren, zeigten in
dieser Arbeit eine Verlangsamung der AV-Knoten-Überleitungszeit gegenüber den
Wildtypen ohne Applikation eines externen Agonisten, also mutmaßlich aufgrund der
Stimulation durch endogen und lokal produzierten Adenosins. Die Verlangsamung
war sowohl unter Ruhebedingungen, als auch unter Belastung präsent. Durch die
belastungsinduzierte U-adrenerge Stimulation wurde bei den Wildtypen die AV-
104
5. Diskussion
Überleitungszeit um 16%, bei den transgenen Mäusen nur um 12% reduziert. Die
Belastung führte zu einer vermehrten Bildung von Adrenalin im Organismus. Die
Aktivierung der überexprimierten A1AR führt wahrscheinlich zu einer Erhöhung von
IK-ADO und indirekt zu einer Verminderung von ICa(L), der zunächst durch die Uadrenerge Stimulation gesteigert wurde, und damit zu einer Verkürzung der AVÜberleitungszeit geführt hat. Diese Verkürzung in der Überleitungszeit war bei den
Wildtypen stärker ausgeprägt als bei den transgenen Mäusen. Die Überexpression
der A1AR scheint eine indirekte Hemmung der Verkürzung der Überleitungszeit im
AV-Knoten durch eine U-adrenerge Stimulation auszuüben.
Der Beitrag von IK-ADO zur negativ dromotropen Wirkung einer A1AR-Aktivierung
scheint von der Konzentration des Agonisten abzuhängen (MARTYNYUK et al.,
2002).
Bei
Meerschweinchen
und
Kaninchen
scheint
bei
höheren
Adenosinkonzentrationen IK-ADO den negativ dromotropen Effekt zu vermitteln. Eine
belastungsinduzierte Steigerung der körpereigenen Adenosinkonzentration könnte
daher bei Mäusen, die A1AR überexprimieren, neben der indirekten auch eine direkte
Wirkung, über die Aktivierung eines Ionenkanals, die größere Zunahme des P-QIntervallunterschiedes von Ruhe- zu Belastungsbedingungen gegenüber den
Wildtypen hervorrufen. Überexprimierte A1AR könnten demnach unter Belastung ihre
negativ dromotrope Wirkung sowohl indirekt als auch direkt bewirken.
Eine tonische Aktivierung der überexprimierten A1AR (MATHERNE et al., 1997) im
AV Knoten könnte den negativ dromotropen Effekt unter Ruhebedingungen erklären.
Bei niedrigen Konzentrationen eines A1AR-Agonisten scheint der vermittelte negativ
dromotrope Effekt bei Meerschweinchen weitgehend IK-ADO-unabhängig zu sein
(MARTYNYUK et al., 2002). Das Auftreten anderer Kaliumströme könnte den
dromotropen Effekt bei niedrigen Agonistkonzentrationen vermitteln (MARTYNYUK
et al., 2002). Diese noch unbekannten Kaliumströme könnten auch bei einer
Rezeptorüberexpression bei niedrigen Adenosinkonzentrationen im Mausmodell eine
Rolle spielen. Bei niedrigeren Herzfrequenzen würden die überexprimierten A1AR
dann über einen direkten Mechanismus negativ chronotrop wirken.
105
5. Diskussion
Wurden Vorhoferregungen bei den untersuchten A3AR+-Mäusen zum Ventrikel
weitergeleitet,
fand
sich
Vorherrschend
war
das
eine
verlängerte
Auftreten
von
Überleitungszeit
AV-Blockierungen
im
III.
AV-Knoten.
Grades.
Die
Überexpression von A3AR hatte demnach in Ruhe im AV-Knoten eine so stark
negative dromotrope Wirkung, dass meistens keine Überleitung der Erregung vom
Vorhof zu den Kammern stattfand. Die massive negativ dromotrope Wirkung der
überexprimierten A3AR in Ruhephasen könnte ihre Ursache in einer direkten
Kopplung des Rezeptors an Ionenkanäle und einer dadurch ermöglichten
Veränderung der Ionenströme haben (DOBREV et al., 2004) (s. auch 5.2.1).
Die hochgradig überexprimierten A3AR üben auch bei hohen Herzfrequenzen eine
negativ dromotrope Wirkung aus, die einen AV-Block I. Grades bewirkt. Ob diese
direkt durch eine Beeinflussung von Ionenströmen und/oder indirekt durch eine
Hemmung adrenerger Stimulation vermittelt wird, bleibt zum jetzigen Zeitpunkt
hypothetisch und soll Gegenstand weiterer Untersuchungen sein.
Die Überexpression von A3AR in geringem Maß (A3low) äußerte sich lediglich in einer
Verlängerung der atrioventrikulären Überleitungszeit bei niedrigen Herzfrequenzen.
Arrhythmien traten nicht auf, der Sinusknoten übte seine Schrittmacherfunktion
normal aus. Eine Beeinträchtigung der Sinusknotenfunktion mit nachfolgender
Bradykardie
und
atrialen
Arrhythmien
scheint
erst
durch
ein
höheres
Expressionsniveau der A3AR zu erfolgen.
5.2.5 Bradykardie, Bradykardiomyopathie
Die linken Herzventrikel von 23 Wochen alten A1AR+ Mäuse kontrahierten schlechter
als
die
der
nichttransgenen
Geschwistertiere,
wiesen
aber
sonst
keine
morphologischen oder funktionellen Veränderungen auf. Eine Möglichkeit, die bei
den transgenen Mäusen herabgesetzte Kontraktionsfähigkeit des linken Ventrikels zu
erklären, ist die Ausübung einer negativ inotropen Wirkung der überexprimierten
A1AR im Ventrikel. Die Wirkung einer Aktivierung „normaler“ A1AR im Ventrikel
variiert speziesabhängig sehr deutlich. Es konnte bei einigen Tierarten (Ratte,
Frettchen) ein direkter negativ inotoper Effekt nachgewiesen werden. Unklar ist, ob
106
5. Diskussion
dieser durch eine Verkürzung des Aktionspotentials über IK-ADO und damit einer
Verringerung von ICa(L) oder durch eine direkte Abschwächung von ICa(L)
hervorgerufen wird (BELARDINELLI et al., 1995). So könnte die Überexpression der
A1AR in Mausherzen in vivo ohne Zugabe eines Rezeptoragonisten ebenfalls negativ
inotrop wirken und so zu einer Verminderung der FS führen. Allerdings zeigten
NEUMANN et al. (2003), dass bei Versuchen an isolierten Herzen nach
Adenosinapplikation die Überexpression der Rezeptoren einen positiv inotropen
Effekt im Ventrikel bewirkt. Ein negativ inotroper Effekt in vivo erscheint daher bei
den in dieser Arbeit untersuchten Tieren unwahrscheinlich (s. Tab. 1).
Desweiteren spielt die Freisetzung aus dem und die Wiederaufnahme von Kalzium in
das
sarkoplasmatische
Retikulum
ebenfalls
eine
wichtige
Rolle
bei
der
Aufrechterhaltung der systolischen und diastolischen Funktion der Herzzellen (LINCK
et al., 1996). Die Proteine, die für die Regulation des intrazellulären Kalziumspiegels
über das SR verantwortlich sind, vor allem SERCA2a, Phospholamban und
Ryanodinrezeptoren, wiesen in den transgenen Mausherzen keine Veränderungen
im Expressionslevel oder der Proteinmenge gegenüber den Wildtypherzen auf. Aber
Herzen, die den A1AR überexprimieren, zeichnen sich durch einen verminderten
Rücktransport von Kalzium ins SR aus (ZUCCHI et al., 2002). Die dauerhaft erhöhte
intrazelluläre Kalziumkonzentration beeinflusst die diastolische Relaxation der
Herzzellen und wirkt bei längerem Bestehen negativ inotrop (FRANK et al., 2003).
Unter Ruhebedingungen zeigten die von ZUCCHI et al. (2002) untersuchten
isolierten, denervierten transgenen Herzen 25 Wochen alter Mäuse jedoch keine
negativ
inotrope
Beeinflussung.
Bei
den
in
vivo
untersuchten
A1AR
überexprimierenden Herzen, die durch das autonome Nervensystem, vor allem den
Sympathikus auch in Ruhe, beeinflusst werden, könnten die Veränderungen im
Kalziumtransport dennoch eine negativ inotrope Wirkung bewirken und so die
echokardiographisch erhobenen Befunde erklären.
Versuche an isolierten A1AR+-Herzen zeigten ebenfalls eine verminderte kontraktile
Funktion bei spontanem bradykardem Herzschlag. Nach elektrischer Stimulation der
transgenen und Wildtypherzen mit gleicher Frequenz waren allerdings keine
Kontraktionsunterschiede mehr nachweisbar (MATHERNE et al., 1997; GAUTHIER
107
5. Diskussion
et al., 1998). Die in der vorliegenden Arbeit in vivo echokardiographisch festgestellte
verminderte Kontraktionskraft des linken Ventrikels zeigte sich allerdings bei den
transgenen Mäusen trotz nicht unterschiedlicher Herzfrequenzen gegenüber den
Wildtypen.
Dennoch
wiesen
die
meisten
transgenen
Mäuse
niedrigere
Herzfrequenzen gegenüber den Wildtypen während der echokradiographischen
Untersuchung auf (die durchschnittlich schnelleren in der Tabelle angegebenen HF
ergeben sich durch 2 transgene Mäuse mit einer relativ, auch gegenüber den
Wildtypen, sehr hohen Herzfrequenz). Da auch bei Mäusen die Kontraktionskraft des
Herzens positiv mit der Schlagfrequenz korreliert ist (CHAVES et al., 2001), könnte
dieses
Phänomen daher doch eine wichtige
Rolle
bei den
signifikanten
Unterschieden in der FS spielen. Die Tatsache, dass in den Versuchen an isolierten
A1AR+-Herzen eine negativ inotrope Beeinflussung nur durch eine gegenüber den
Wildtypen herabgesetzte Eigenschlagfrequenz hervorgerufen wird (MATHERNE et
al., 1997; GAUTHIER et al., 1998; ZUCCHI et al., 2002), unterstützt diese These.
Atriale Arrhythmien bei A3highAR+ Mäusen traten bereits bei sehr jungen Mäusen auf.
Funktionsstörungen oder histologische Veränderungen der Herzzellen als Zeichen
von Fehlfunktionen in den Vorhöfen oder den Ventrikeln waren zu diesem frühen
Zeitpunkt noch nicht nachweisbar. Eine geringgradige Vergrößerung des linken
Vorhofes scheint eine erste Folge der Rhythmusstörungen zu sein. Eine weitere
altersabhängige
Zunahme
der
Vorhofgröße
bei
gleicher
Ausprägung
der
Rhythmusstörungen spricht für ein Auftreten der Rhythmusstörungen vor der
Vorhofvergrößerung. Durch die unregelmäßige Entleerung der Vorhöfe kann es zu
einer stärkeren Ansammlung von Blut in diesen und einer damit einhergehenden
Größenzunahme (CHAVES et al., 2003) schon bei sehr jungen Mäusen während der
Messung kommen. Eine Hypertrophie der Vorhöfe muss dann noch nicht bestehen,
wird jedoch durch die chronische Volumenüberlastung induziert. Allerdings zeigten
schon transgene Tiere im Alter von 3 Wochen ein gegenüber den Wildtypen
signifikant verlängertes P-Wellenintervall. Dieses Phänomen könnte für eine
Vergrößerung des linken Vorhofes (MARTIN, 2001) bereits bei sehr jungen Mäusen
sprechen.
108
5. Diskussion
Eine Hypertrophie des Myokards ist die Antwort des Herzens auf verschiedene
mechanische, hämodynamische, hormonelle und pathologische Stimuli, um das Herz
an einen erhöhten Bedarf an Leistung anzupassen (HUNTER u. CHIEN, 1999). Bei
den A3highAR+ Mäusen kommt es vermutlich zu einer dauerhaften Überladung der
Vorhöfe aufgrund der arrhythmischen und bradykarden Kontraktionen. Auf zellulärer
Ebene führt der biochemische Stress zu verschiedenen Prozessen, die zur
Hypertrophie oder zur Apoptose der Zelle führen und in Herzversagen enden
können. Eine Dilatation und Hypertrophie des Herzens kann durch eine
Abschwächung der Kontraktilität der Myozyten hervorgerufen werden. Bei einigen
Formen der dilatativen Kardiomyopathie resultiert die verminderte Kontraktilität aus
Änderungen des intrazellulären Kaliziumtransportes (HUNTER u. CHIEN, 1999). Die
Ca2+-ATPase SERCA2a im SR spielt die Hauptrolle bei der Wiederherstellung
intrazellulärer Kalziumkonzentrationen und beendet kalziumabhängige kontraktile
Prozesse in der Zelle (FRANK et al., 2003). Eine Hemmung von SERCA2a führt zu
einer herabgesetzten Aufnahme von Kalzium in das SR während der Diastole und zu
einer verminderten Kontraktilität, sowie zu einer verschlechterten systolischen und
diastolischen Funktion des Herzens (HAGHIGHI et al., 2001). Bei einigen Studien am
Menschen konnte eine Herunterregulation des SERCA2a-Proteins in Herzen
nachgewiesen werden, die Herzversagen zeigten. Auch bei den A3highAR+-Mäusen
wurde eine Verminderung von SERCA2a in einem Alter von 14 Wochen in den
Vorhöfen nachgewiesen. Dies könnte zu einer reduzierten Kontraktionskraft und
Leistungsminderung zunächst der Vorhöfe und dann der Ventrikel führen. Neben
einer Änderung der intrazellulären Kalziumkonzentration in der Zelle durch die
Verschiebung ins SR kann auch die Freisetzung von Kalzium eine Rolle bei der
Entstehung
von
Herzversagen
führen.
Aktivierte
A3AR
scheinen
die
Kalziumfreisetzung aus dem SR herabzusetzen (ZUCCHI et al., 2001).
Biochemischer Stress, wie z. B. chronische Überladung der Vorhöfe, kann in der
Zelle neben hypertrophen Prozessen auch apoptotische Signale induzieren. Dies
kann zu einem Verlust funktioneller Myozyten und Herzversagen führen. Die
Apoptose eliminiert die Zellen ohne Entzündungsanzeichen und lässt histologisch
nur sehr geringe oder keine Anzeichen für den Zellverlust erkennen. Den Beitrag
109
5. Diskussion
apoptotischer Prozesse zum Herzversagen genau zu bestimmen ist daher schwierig
(HUNTER u. CHIEN, 1999). Die Balance zwischen Hypertrophie und Apoptose der
Zelle scheint mitzubestimmen, ob es zur Dilatation der Herzkammer kommt (HIROTA
et al., 1999). Der Verlust der Integrität der Myofibrillen während der Apoptose
kardialer Zellen führt zu einer Kontraktionsunfähigkeit der Myozyten (KROEMER et
al., 1995). Eine Aktivierung von A3AR durch hohe Agonistkonzentrationen kann eine
Apoptose in kultivierten kardialen Myozyten neugeborener Ratten bewirken
(SHNEYVAYS et al., 1998). Die hohe Agonistenkonzentration könnte bei den
transgenen Mäusen durch die hohe Anzahl von tonisch aktivierten A3AR ersetzt
werden. Die Überexpression der Rezeptoren könnte so durch eine Induktion
apoptotischer Prozesse zu den beobachteten dilatativen Prozessen zunächst in den
Vorhöfen, später auch in den Hauptkammern beitragen.
Die rhythmischen und morphologischen Veränderungen in den Vorhöfen hatten
Auswirkungen auf die Leistungsfähigkeit der Kammern. Bereits im Alter von 2
Wochen war die vom linken Vorhof aktiv ausgeworfene Blutmenge gegenüber der
der Wildtypen verringert. Die echokardiographischen Befunde an den A3highAR+Mäusen weisen darauf hin, dass die atriale und ventrikuläre Dilatation und die
Fehlfunktionen der Kammern eine zeitabhängige Entwicklung durchmachen. Die
funktionellen und morphologischen Veränderungen können vielleicht mit der
Bezeichnung
„Bradykardiomyopathie“
gekennzeichnet
werden.
Diese
Bradykardiomyopathie scheint sich dabei mit zunehmendem Alter der Mäuse von
den Vorhöfen auf die Ventrikel auszudehnen. Bei Hunden mit einer chronischen
Blockade des AV-Knotens konnten ähnliche hypertrophe Veränderungen im rechten
und linken Ventrikel beobachtet werden (VOLDERS et al., 1998).
Ein Zusammentreffen von atrialen Arrhythmien, einer Vergrößerung der Vorhöfe und
der Nachweis von Fibrosen im Vorhofmyokard tritt außer bei A3AR+-Mäusen auch
bei Mausmodellen auf, die eine kardiale Überexpression von RhoA (SAH et al., 1999)
oder Junctin (HONG et al., 2002) zeigen. Ein zeitabhängiger Verlauf der
Veränderungen in den beiden Mausmodellen, wie er hier für die A3AR+-Mäuse
studiert wurde, wurde dabei nicht untersucht. Ein Vorangehen atrialer Arrhythmien
mit negativen Folgen für die Funktionsfähigkeit von Vorhof und Ventrikel, also die
110
5. Diskussion
Entwicklung
einer
Bradykardiomyopathie,
wie
in
dem
in
dieser
Arbeit
phänotypisierten Mausmodell einer herzspezifischen Überexpression des A3AR
charakterisiert, scheint so bisher noch nicht dargestellt worden zu sein.
5.3 Schlussfolgerungen
Die in dieser Arbeit durchgeführten Untersuchungen zeigten die Veränderungen, die
eine Überexpression von 2 Adenosinrezeptorsubtypen, in vivo und über einen
längeren Zeitraum betrachtet, bewirken können. Zusammenfassend lässt sich
feststellen,
dass
eine
herzspezifische
chronische
Überexpression
des
A1
Adenosinrezeptorsubtyps zu elektrophysiologischen, nicht aber zu morphologischen
Veränderungen am Herzen führt. Im Vordergrund steht dabei die Hemmung
adrenerger Effekte am Herzen. Durch diese indirekte Hemmung des A1
Adenosinrezeptors über das GTP-bindende Protein Gi kommt es zu einer
Beeinflussung der Sinusknotens vor allem in Belastungsphasen. Im AV-Knoten übt
die A1AR-Überexpression einen negativ dromotropen Effekt aus, der die Entstehung
eines AV-Block I. Grades in Ruhe- und Belastungsphasen bewirkt.
Die herzspezifische chronische Überexpression des A3 Adenosinrezeptorsubtyps hat,
in Abhängigkeit vom Grad des Expressionsniveaus, sowohl elektrophysiologische als
auch daraus resultierende morphologische und funktionelle Konsequenzen für das
Mausherz. So kommt es in Ruhephasen zu einer Beeinflussung der Sinus- und AVKnotenfunktion, die phasenweise sogar ein Sistieren der Aktionspotentialsbildung
und/oder -weiterleitung in beiden Zentren mit nachfolgenden atrialen Arrhythmien
und ventrikulärem Ersatzrhythmus hervorruft. Der A3AR vermittelt seine Wirkung
dabei vermutlich direkt über mit ihm verbundene Ionenkanäle und/oder über das
GTP-bindende Protein RhoA. Adrenerge Stimulation der A3AR+-Herzen führt zu
einer Abschwächung der elektrophysiologischen Veränderungen. Die arrhythmischen
Veränderungen treten bereits bei jungen Mäusen auf und führen altersabhängig zur
Ausbildung einer Bradykardiomyopathie.
Die hier geschilderten Ergebnisse sind durch Beobachtungen transgener Tiere in
vivo gewonnen worden. Solche Untersuchungen an transgenen Tieren erlauben es,
111
5. Diskussion
die physiologische Bedeutung definierter genetischer Defekte zu untersuchen. Die
Methoden,
die
für
diese
Arbeit
weiterentwickelt
wurden,
können
für
die
phänotypische Untersuchung weiterer transgener Mausmodelle herangezogen
werden.
Eine Verstärkung der Expression oder der Funktion von Adenosinrezeptoren als eine
Art der Gentherapie mit dem Ziel, das Herz vor postischämischem Schaden zu
bewahren oder diese zu verringern, wurde bereits mehrfach vorgeschlagen
(RUDOLPHI, 1989; MATHERNE et al., 1997; BLACK et al., 2002). Obwohl deutliche
Unterschiede in der Herzfrequenz, im Vorkommen und den Eigenschaften von
Ionenkanälen und in der Größe von Herzen zwischen Mäusen, größeren Säugetieren
und dem Menschen bestehen, und eine Übertragung von Forschungsergebnissen
von der Maus auf den Menschen nur mit Vorsicht möglich ist, geben die in dieser
Arbeit beobachteten Befunde doch bestimmte Hinweise, dass eine Überexpression
der Adenosinrezeptoren A1 und besonders A3 über einen längeren Zeitraum zu
elektrophysiologischen und nachfolgend zu kontraktilen und morphologischen
Veränderungen führen kann. Ungeachtet des potentiellen Nutzens ist eine
vorsichtige
Zielsetzung
und
Dosierung
in
Begleitung
einer
vollständigen
kardiovaskulären Auswertung nötig, um ein maximales Sicherheitsniveau einer
Gentherapie zu erreichen, die auf einer Verstärkung der Expression oder der
Funktion von Adenosinrezeptoren basiert.
112
6. Zusammenfassung
6. Zusammenfassung
Lisa Fortmüller:
Elektrophysiologische und echokardiographische Phänotypisierung A1 und A3
Adenosinrezeptor überexprimierender Mäuse
Die Aktivierung der AR A1 und A3 bewirkt in Herzen während und nach
Ischämiephasen eine Verringerung der Zellschädigung und eine verbesserte
Wiederherstellung
der
Funktionsfähigkeit.
Eine
gesteigerte
Expression
von
Adenosinrezeptoren als Gentherapie scheint eine vielversprechende Maßnahme
darzustellen, das Herz vor ischämischem Schaden zu bewahren. Um die
phänotypischen Auswirkungen einer gesteigerten AR-Expression zu untersuchen,
wurden vergleichende elektro- und echokardiographische Untersuchungen an
Mäusen durchgeführt, die den A1 oder den A3AR im Herzen überexprimieren. EKGs
wurden als 6-Kanal-Oberflächen-EKG unter Narkose und bei jungen unsedierten
Mäusen, sowie als Langzeit-EKG bei adulten Mäusen mit Hilfe eines telemetrischen,
implantierten Transmitters bei sich frei bewegenden, sowie bei körperlich belasteten
Mäusen durchgeführt. Es wurden altersabhängige serielle echokardiographische
sowie histologische und biochemische Untersuchungen der Herzen durchgeführt.
Eine Überexpression des A1AR resultierte in einer verminderten chronotropen
Antwort des Herzen auf körperliche Belastung. Unabhängig vom autonomen Tonus
zeigten sie eine verlängerte Überleitungszeit im AV-Knoten gegenüber WildtypHerzen. A3AR+ Mäuse zeigten eine Ruhebradykardie mit atrialen Arrhythmien und
verschiedengradigen AV-Blockierungen und ventrikulärem Ersatzrhythmus. Unter
Belastung wiesen die transgenen Herzen einen bradykarden Sinusrhythmus mit AVBlock I. Grades auf. Mit zunehmendem Alter entwickelten die A3AR+-Mäuse eine
Bradykardiomyopathie, die sich von den Vorhöfen auf die Ventrikel ausbreitete.
Die überexprimierten A3AR scheinen in die tonische Regulation der Herzfrequenz im
Sinusknoten und die Überleitungszeit im AV-Knoten während Perioden mit niedrigem
autonomen Tonus involviert zu sein. Die überexprimierten A1AR hingegen scheinen
113
6. Zusammenfassung
die Abschwächung einer adrenergen Stimulation auf die Herzfrequenz zu bewirken,
aber auch die Überleitungszeit im AV-Knoten, unabhängig vom Tonus des
autonomen Nervensystems, zu beeinflussen. Die elektrophysiologischen und
morphologischen Folgen einer AR-Überexpression machen deutlich, dass eine
Gentherapie, die auf der Rezeptorüberexpression beruht, auch mit negativen
Auswirkungen auf das Herz rechnen muss.
114
7. Summary
7. Summary
Lisa Fortmüller:
Electrophysiological and echocardiographical phenotypic characterization of mice
overexpressing the A1 and A3 adenosine receptor
During as well as after phases of ischemia, an activation of A1 and A3AR in the heart
induces decreased cellular damage as well as an improved restoration of cardiac
functioning. Gene therapy aimed at enhancing expression of adenosine receptors
appears to be a promising method to protect the heart from ischemic damage. In
order to investigate electrophysiological and functional impact of enhanced AR
expression, electro- and echocardiographic studies were conducted on mice
overexpressing A1 or A3AR in the heart. 6-channel-surface-ECGs were carried out on
narcotized adult mice and non-narcotized five days old mice, while long-term ECGs
were realized using telemetric transmitter implants on freely moving and physically
stressed adult mice. Age-related echocardiographic examination series were
conducted. Furthermore, cardial atria and ventricles of A1 and A3AR+ mice were
examined histologically and biochemically.
A1AR overexpression caused decreased chronotropic response of the heart on
physical stress. No matter which autonomic tone, AV nodal conduction delay was
found when compared to wild type mice. A3AR+ mice display bradycardia at rest with
atrial arrhythmia, diverse AV nodal blocks and ventricular escape rhythm. Physically
stressed, transgenetic hearts showed bradycardic sinus rhythm with 1st degree AV
block without arrhythmia. With ongoing aging process, transgenetic mice developed
bradycardiomyopathy in the atria over time also extending to the ventricular level.
Overexpressed A3AR appears to be involved in the tonic regulation of the heart rate
in sinus node and in AV-nodal conduction time during periods of low autonomic tone.
On the other hand, overexpressed A1AR seemingly induces decreasing adrenergic
stimulation of the heart rate, while also affecting conduction time in AV nodes, with
autonomic
tone
being
independent.
Electrophysiological
115
and
morphological
7. Summary
consequences of AR overexpression indicate that gene therapy based on receptor
overexpression may consequently induce negative effects on the heart.
116
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Abbildungsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Beziehung zwischem einem hypothetischen Aktionspotential aus dem
Reizleitungssystem und dem zeitlichen Ablauf der dabei entstehenden
Ströme ..................................................................................................... 16
Abbildung 2: Schematische Darstellung der in der Literatur beschriebenen
vermuteten Signaltransduktionswege von A1 und A3 Adenosinrezeptoren
................................................................................................................. 25
Abbildung 3: Schematische Darstellung einer typischen Maus-EKG-Kurve ............. 32
Abbildung 4: Schematische Darstellung des Aufbaus der Telemetrieanlage ........... 38
Abbildung 5: Schematische Darstellung eines einkanaligen MausElektrokardiogramms............................................................................... 43
Abbildung 6: Schematische Darstellung einer echokardiographischen
Längsachsenansicht des Herzens ........................................................... 46
Abbildung 7: Schematische Darstellung einer echokardiographischen
Querachsenansicht des Herzens............................................................. 47
Abbildung 8: Herzfrequenzvergleich zwischen A1AR+-Mäusen und Wildtypen bei
normaler Aktivität (Ruhe) ......................................................................... 58
Abbildung 9: Herzfrequenzvergleich zwischen A1AR+-Mäusen und Wildtypen bei
Belastung................................................................................................. 59
Abbildung 10:Herzfrequenzvergleich zwischen A1AR+-Mäusen und Wildtypen am
Ende der einstündigen Erholungsphase .................................................. 60
Abbildung 11: Vergleich der Herzfrequenzvariabilität zwischen A1AR+-Mäusen und
Wildtypen ................................................................................................. 61
Abbildung 12: Vergleich der Standardabweichungen der RR-Intervalle in den
Belastungsprotokollabschnitten ............................................................... 62
Abbildung 13: Verlängertes PQ-Intervall bei A1AR+-Mäusen ................................... 63
Abbildung 14: Verlängerte PQ-Intervalle bei A1AR+-Mäusen in Ruhe und unter
Belastung................................................................................................. 63
Abbildung 15: Veränderungen in der Herzfrequenz von A1AR+-Mäusen und
Wildtypen nach PTX-Gabe ...................................................................... 65
Abbildung 16: Veränderungen im PQ-Intervall bei A1AR+-Mäusen und Wildtypen
nach PTX-Injektion .................................................................................. 66
Abbildung 17: Darstellung eines repräsentativen 6-Kanal-Oberflächen-EKGs einer
A3highAR+-Maus und eines Wildtypen im Alter von 18 Wochen ............... 68
Abbildung 18: Darstellung der 2. Ableitung eines repräsentativen 6-KanalOberflächen-EKGs einer A3highAR+-Maus und eines Wildtypen im Alter von
3 Wochen................................................................................................. 70
142
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 19: Repräsentatives telemetrisches EKG eines Wildtypen und einer
A3highAR+-Maus unter Ruhebedingungen ................................................ 72
Abbildung 20: Repräsentatives telemetrisches EKG eines Wildtypen und einer
A3highAR+-Maus bei körperlicher Belastung (Schwimmen) ...................... 73
Abbildung 21: Herzfrequenzvergleich zwischen A3highAR+-Mäusen und Wildtypen bei
normaler Aktivität (Ruhe) ......................................................................... 74
Abbildung 22: Herzfrequenzvergleich zwischen A3highAR+-Mäusen und Wildtypen bei
Belastung................................................................................................. 75
Abbildung 23: Herzfrequenzvergleich zwischen A3highAR+-Mäusen und Wildtypen am
Ende der einstündigen Erholungsphase .................................................. 76
Abbildung 24: Verlängertes PQ-Intervall im Sinusrhythmus bei A3highAR+-Mäusen in
Ruhe und unter Belastung ....................................................................... 77
Abbildung 25: Verlängertes PQ-Intervall bei A3lowAR+-Mäusen unter
Ruhebedingungen ................................................................................... 79
Abbildung 26: Vergleich des endsystolischen linken Vorhofdurchmessers zwischen
A3highAR+-Mäusen und Wildtypen im Alter von 2, 8, 12 und 21 Wochen . 80
Abbildung 27: Echokardiographische Darstellung von Längsschnitten des Herzens
von A3high AR+-Mäusen mit 8, 12 und 21 Wochen ................................... 81
Abbildung 28: Vergleichende Darstellung eines CW-Dopplers auf Höhe der
Mitralklappe ............................................................................................. 82
Abbildung 29: Vergleich des diastolischen linken Ventrikeldurchmessers zwischen
A3highAR+-Mäusen und Wildtypen im Alter von 2, 8, 12 und 21 Wochen . 83
Abbildung 30: Histologischer Ausschnitt eines Vorhofes eines 14 Wochen alten
Wildtypen ................................................................................................. 86
Abbildung 31: Histologischer Ausschnitt eines Vorhofes einer 14 Wochen alten
A3highAR+-Maus ....................................................................................... 87
Abbildung 32: Zeitabhängiger Verlauf der beobachteten Veränderungen zwischen
A3highAR+-Mäusen und Wildtypen............................................................ 89
Abbildung 33: Schema von vermuteten Signaltransduktionswegen, die bei der
Überexpression von A1 und A3AR eine Rolle spielen ............................ 100
143
Tabellenverzeichnis
Tabellenverzeichnis
Tabelle 1: Zusammenfassung der Ergebnisse bisheriger Studien an A1 AR
überexprimierender Herzen von Mäusen gegenüber Wildtypherzen ....... 29
Tabelle 2: Errechnete Werte aus echokardiographischen Daten.............................. 50
Tabelle 3: Anzahl der Mäuse in den einzelnen Versuchsgruppen ............................ 56
Tabelle 4: Werte der im Oberflächen-EKG gemessenen Parameter von A1AR+
Mäusen und Wildtypen ............................................................................ 57
Tabelle 5: Echokardiographieergebnisse ausgewählter Parameter.......................... 64
Tabelle 6: Ergebnisse der biochemischen Untersuchungen an rechten Vorhöfe von
Wildtypen und A1AR+ Mäusen................................................................. 67
Tabelle 7: Werte der im Oberflächen EKG gemessenen Parameter von adulten
A3highAR+-Mäusen und Wildtypen............................................................ 69
Tabelle 8: Werte der im Oberflächen-EKG gemessenen Parameter bei unsedierten
A3highAR+-Mäusen und Wildtypen im Alter von 3 Wochen....................... 70
Tabelle 9: Werte der im Oberflächen-EKG gemessenen Parameter von adulten
A3lowAR+-Mäusen und Wildtypen............................................................. 71
Tabelle 10: Herzfrequenzvergleich zwischen A3lowAR+-Mäusen und Wildtypen in
Ruhe, unter Schwimmbelastung und nach Erholung ............................... 78
Tabelle 11: Echokardiographieergebnisse ausgewählter Parameter von 8 und 21
Wochen alten A3highAR+-Mäusen und Wildtypen ..................................... 84
Tabelle 12: Echokardiographieergebnisse ausgewählter Parameter von 8 und 15
Wochen alten A3lowAR+-Mäusen und Wildtypen ...................................... 85
Tabelle 13: Ergebnisse der biochemischen Untersuchungen an Herzen von
Wildtypen und A3AR+-Mäusen ................................................................ 88
144
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
A1AR
A1 Adenosinrezeptor
A3highAR
in hohem Maße überexprimierter A3AR
A3lowAR
in niedrigem Maße überexprimierter A3AR
ADP
Adenosindiphosphat
AMP
Adenosinmonophosphat
Ao R-R
zeitl. Abstand zweier Aortenausschläge im Doppler
AoV
Aortenwurzeldurchmesser
AoVmax
Maximale Geschwindigkeit des Aortendopplers
AR
Adenosinrezeptor
AR+
überexprimierter Adenosinrezeptor
ATP
Adenosintriphosphat
AV-Knoten
Atrioventrikularknoten
bp
„base pairs“, Basenpaare
Ca
2+
Kalzium
cAMP
zyklisches Adenosinmonophosphat
CW-Doppler
Doppler im „continous wave“ Modus
DAG
Diacylglycerin
DNA
Desoxyribonukleinsäure
EKG
Elektrokardiogramm
ER
endoplasmatisches Retikulum
fmol
Femtomole (1×10-15 Mole)
FS
Ventrikelverkürzungsfraktion: „fractional shorting“
g
Gramm
GDP
Guanosindiphosphat
GTP
Guanosintriphosphat
HE
Hematoxylin-Eosin
HF
Herzfrequenz
HFV
Herzfrequenzvariabilität
Hz/ MHz
Hertz/Megahertz
145
Abkürzungsverzeichnis
I()
Ionenstrom, tiefgestellt in Klammern Art der Ionen
IMP
Inositolmonophosphat
IP3
Inositol(1,4,5)-Triphosphat
IVS
Interventrikuläres Septum
K
+
Kalium
kg
Kilogramm
LA
linkes Atrium
LV
linker Ventrikel
LVED
linksventrikulärer Durchmesser
LVOT
linksventrikulärer Ausflusstrakt
LVW
Hinterwand des linken Ventrikels
mg
Milligramm
MHC
“myosin heavy chain”
mm
Millimeter
M-Mode
Time Motion Mode
mV
Millivolt
MV A-Punkt
Höchster Punkt der A-Welle im Mitraldoppler
MV E-Punkt
Höchster Punkt der E-Welle im Mitraldoppler
MV-Decelzeit
Dezelerationszeit der Mitralwelle in ms
MV Vmax
Maximale Geschwindigkeit des Mitraldopplers
Na+
Natrium
PCR
Polymerasekettenreaktion
PKC
Proteinkinase C
PTX
Pertussistoxin
RV
rechter Ventrikel
SR
Sarkoplasmatisches Retikulum
wt
Wildtyp
tg
transgenes Tier
146
Anhang
Anhang
Teile dieser Arbeit wurden bereits veröffentlicht in:
KIRCHHOF, P., L. FABRITZ, L. FORTMÜLLER, G. P. MATHERNE, A. LANKFORD,
H. A. BABA, W. SCHMITZ, G. BREITHARDT, J. NEUMANN, u. P. BOKNIK (2003)
Altered sinus nodal and atrioventricular nodal function in freely moving mice
overexpressing the A1 adenosine receptor
Am J Physiol, 285: H145-H153, 2003
FABRITZ, L., P. KIRCHHOF, L. FORTMÜLLER, J. A. AUCHAMPACH, H. A. BABA,
G. BREITHARDT, J. NEUMANN, P. BOKNIK, u. W. SCHMITZ (2004)
Gene dose dependent atrial arrhythmias, heart block, and brady-cardiomyopathie in
mice overexpressing A3 adenosine receptors
Cardiovasc Res, 2004, im Druck
Geräte
Telemetrieanlage
-
Transmitter TA10ETA-F20-L20 ( Data Science, St. Paul, MN)
-
Receiver RA1010 (Data Science, St. Paul, MN)
-
Standardcomputer
-
Input-Matrix
-
Output-Matrix
-
Datenacquisitions-Software, basierend auf der LabVIEW Programmiersprache
-
Semi-automatisches EKG-Analyseprogramm, basierend auf der LabVIEW
Programmiersprache
147
Anhang
EKG-Gerät
-
Megacart (1993, Siemens, Erlangen)
-
Selbstangefertigte Schlaufenelektroden aus dünnem Stahldraht
Ultraschallgerät
- Sonos 5500 (Philipps Medical Systems)
- 12 MHz Sektorschallkopf
- 15 MHz Linearschallkopf
Zentrifuge
- Labofuge III (Heraeus, )
Wärmeplatten
- In Eigenkonstruktion hergestellte Glas- bzw. Plexiglas-Wärmeplatten
- Heiz-Umwälzpumpe
Elektrischer Rasierer
-Golden A4, Model 5-55E (Oster, USA)
Radio / Magnet
- Phapsody®, RY-103/H, AM/FM Radio, Dual Sound
- Magnet (DSI, Data Science International, )
Verbrauchsmaterialien
Desinfektion
-
Neo-Kodan, farblos(Schülke&Mayr, Norderstedt)
Kanülen
-
Terumo® Neolus 27G, 0,4 mm (TERUMO EUROPE N.V., Leuven, Belgien)
148
Anhang
-
Terumo® Luer 18G, 0,4 mm (TERUMO EUROPE N.V., Leuven, Belgien)
Klebeband
-
Leukosilk® (BSN medical GmbH&Co.KG, Hamburg)
-
Leukoplast® (BSN medical GmbH&Co.KG, Hamburg)
-
Leukofix® (BSN medical GmbH&Co.KG, Hamburg)
Medikamente
-
Baytril® 2,5% (Bayer, Leverkusen)
-
Ibuflam®2%, Sirup (Lichtenstein Pharmazeutica, Mühlheim-Kärlich)
-
Bepanthen® Augen- und Nasensalbe (Hoffmann-La Roche AG, GrenzachWyhlen)
-
Sterofundin® (Braun, Melsungen)
Nahtmaterial
-
Ethicon PROLENE® , 4/0 (1,5 metric), P-3, 45 cm (Jonson+Johnson Intl,
Brüssel)
-
Ethicon VICRYL , 4-0 (1,5 metric), P-3 (13,0 mm 3/8c) (Jonson+Johnson Intl,
Brüssel)
Narkotika
-
Xylazin® 2% (CEVA Tiergesundheit GmbH, Düsseldorf)
-
Ketamin 10% (CEVA Tiergesundheit GmbH, Düsseldorf)
-
Ketanest® S (Parke-Davis GmbH, Berlin)
-
Urethane (SIGMA-Aldrich Chemie GmbH, Steinheim)
OP-Unterlagen
-
klinidrape® (Mölnlycke Health Care OY Fin, Finnland)
149
Anhang
Speichermedien
- Platinum® CD-R 80 min/700 MB
- Magneto optical Disk, Fujifilm 1.3 GB MO rewritable
10 Mbit-Ethernet-kompatibles Netzwerk (telemetrisches EKG)
Ultraschallgel
-
Aquasonic® 100 (Parker Laboratories, INC, Fairfield)
Sonstiges
-
Druckpapier für das Ultraschallgerät (Superior density printing paper, 110 mm
× 18 m, Sony Corporation Tokyo Japan)
-
EKG-Papier, handelsüblich
-
Elektrodencreme (Marquette Hellige GmbH, Freiburg)
-
Enthaarungscreme Pilca®med (ASID BONZ GmbH, Böblingen)
-
Plastikröhrchen (50 ml) mit Schraubverschluß (Sarstedt, Nümbrecht)
150
Anhang
DANKSAGUNG
An erster Stelle möchte ich mich bei PD Dr. Paulus Kirchhof herzlich für die
tatkräftige Unterstützung und Betreuung bei der Planung der Experimente und der
Anfertigung der Dissertation bedanken.
Weiterhin möchte ich Herrn Prof. Dr. Gerhard Breves (Physiologisches Institut der
Tierärztlichen
Hochschule
Hannover)
für
die
freundliche
Übernahme
der
Begutachtung dieser Dissertation danken.
Frau Dr. Larissa Fabritz möchte ich für die herzliche und kompetente Einarbeitung in
die
Geheimnisse
der
echokardiographischen
Untersuchung
der
Maus,
die
geduldigen Erläuterungen allgemeiner statistischer Zusammenhänge und Ihre
unermüdliche fachliche und persönliche Unterstützung danken.
Herrn Dr. Johannes Wiekowsky danke ich für die erfrischende Weitergabe und
Vermittlung seiner Erfahrungen mit den unwegsamen Tiefen der Telemetrie.
Für die Umschiffung computertechnischer Klippen möchte ich mich bei Christoph
Kaletka, Marcel Tekook und Kai Bembenek bedanken.
Für die freundschaftliche und hervorragende Zusammenarbeit auf „engem Raum“
danke ich Daniela Volkery und Marcel Tekook.
Christoph Kaletka danke ich für die richtigen Worte in verfahrenen Situationen und
seine ansteckende Unerschütterlichkeit.
Schließlich möchte ich mich von Herzen bei meinen Eltern bedanken, die mich
während des gesamten Studiums und der Promotion wie selbstverständlich
unterstützt haben.