Aus der Klinik mit Poliklinik für Kinder und Jugendliche der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Direktor: Prof. Dr. med. Dr. h. c. W. Rascher Suppression von Interleukin 8, Cyclooxygenase 2, Prostaglandin E 3Rezeptor und Prostaglandinen durch Parecoxib und Indometacin im Tiermodell der neonatalen B- Streptokokkensepsis Inaugural-Dissertation zur Erlangung der Doktorwürde der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg vorgelegt von Julia May aus Arnstadt Gedruckt mit Erlaubnis der Medizinischen Fakultät der Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg Dekan: Prof. Dr. med. Dr. h.c. J. Schütter Referent: Prof. Dr. med. Dr. h.c. W. Rascher Korreferent: PD Dr. med. M. Kandler Tag der mündlichen Prüfung: 25. November 2011 Widmung Den Tieren, ohne die diese Arbeit nicht möglich gewesen wäre. Inhaltsverzeichnis Inhaltsverzeichnis 1 Zusammenfassung 3 1.1 Zusammenfassung (deutsch) 3 1.2 Abstract (englisch) 4 2 Einleitung 1 2.1 B- Streptokokken- Sepsis bei Neugeborenen 1 2.1.1 Streptokokken im Überblick 1 2.1.2 B- Streptokokken 2 2.1.3 Definition Sepsis 3 2.1.4 Neonatale B- Streptokokkensepsis 4 2.1.5 Pathogenese und Physiologie der neonatalen B- StreptokokkenSepsis 6 2.2 Prostaglandine 9 2.2.1 Prostaglandinsynthese 9 2.2.2 Prostaglandin E 3- Rezeptor und pulmonalarterieller Druck 12 2.2.3 Medikamentöse Beeinflussung der Synthese von Prostaglandinen 13 2.2.3.1 Indometacin 13 2.2.3.2 Parecoxib 14 2.3 Zytokine 16 2.3.1 Interleukin 8 16 2.4 Ziel der vorliegenden Arbeit 17 3 Material und Methoden 18 3.1 Tierexperimentelle Präparationen 3.2 Einteilung in Gruppen und weitere Maßnahmen gemäß Protokoll 19 3.3 Medikamentöse Therapie 19 3.4 Monitoring 20 3.5 Bestimmung der Prostaglandin- Metabolite im Urin 22 3.6 Polymerasekettenreaktion 22 3.6.1 Quantitative Polymerasekettenreaktion 24 4 Ergebnisse 18 26 4.1 Einfluss auf den Entzündungsvorgang im Lungengewebe 26 4.1.1 Suppression von Interleukin 8 durch Parecoxib und Indometacin 26 Inhaltsverzeichnis 4.1.2 Suppression der Cyclooxygenase 2 durch Indometacin und Parecoxib 27 4.1.3 Suppression der Thromboxansynthase durch Indometacin und Parecoxib 28 4.1.4 Einfluss von Indometacin und Parecoxib auf den Prostaglandinrezeptor E 3 28 4.2 Hämodynamische Parameter 29 4.2.1 Einfluss von Indometacin und Parecoxib auf den mittleren arteriellen Druck 29 Einfluss von Indometacin und Parecoxib auf den mittleren pulmonalarteriellen Druck 31 4.2.3 Überleben der Tiere 33 4.3 Messung der Prostaglandinausscheidung im Urin 33 4.3.1 Thromboxan B2 33 4.3.2 2, 3- dinor- Thromboxan B2 35 4.3.3 Messung der Konzentration von 6- keto- Prostaglandin F1 α und 2, 3- dinor- 6- keto- Prostaglandin F1 α im Urin 36 4.2.2 5 Diskussion 38 5.1 Hemmung der pulmonalen Entzündungsreaktion 38 5.2 Beeinflussung der Hämodynamik durch Indometacin und Parecoxib 39 Einfluß von Indometacin und Parecoxib auf die Thromboxasynthese 40 5.3 6 Schlussfolgerung 41 7 Quellenverzeichnis 42 7.1 Literaturverzeichnis 42 7.2 Verzeichnis der Internetquellen 51 8 Abkürzungsverzeichnis 52 9 Abbildungsverzeichnis 55 10 Anhang 56 10.1 Anhang 1: Erlaubnis Tierschutzkomission 56 11 Danksagung 57 12 Lebenslauf 58 Zusammenfassung 1 1.1 Zusammenfassung Zusammenfassung (deutsch) Hintergrund und Ziele Die Infektion mit B- Streptokokken im Neugeborenenalter kann zu dem Krankheitsbild der neonatalen B- Streptokokkensepsis führen. Anfangs sehr unspezifische Symptome wie Blässe, Lethargie und reduzierte periphere Durchblutung führen zu einer raschen Progredienz und zum Schock und erfordern eine frühzeitige effektive Therapie, um das Behandlungsergebnis zu verbessern. Ziel der Arbeit war es, die Wirkung einer Hemmung der Prostaglandinsynthese auf den Verlauf der experimentellen B- Streptokokkensepsis am Tiermodell zu untersuchen. Die Hemmung der Prostaglandinsynthese erfolgte mit Indometacin und dem spezifischen Cyclooxygenase 2 Inhibitor Parecoxib. Neben der Hämodynamik wurden die Entzündungsmediatoren Interleukin 8, Cyclooxygenase 2, der Prostaglandinrezeptor E 3 und verschiedene Prostaglandine im Urin untersucht. Methoden Neugeborene Schweine wurden unter Narkose nach Anlage von Kathetern zur intraarteriellen Messung des mittleren arteriellen Blutdruckes, des mittleren pulmonal arteriellen Druckes und nach Anlage eines Blasenkatheters in 4 Gruppen randomisiert (Infektion mit Streptokokken der Gruppe B, Infektion mit Streptokokken der Gruppe B + Indometacin, Infektion mit Streptokokken der Gruppe B + Parecoxib, Kontrollgruppe ohne Infektion und Therapie). Während des Versuches wurde invasiv der MAD und der MPAD gemessen. Am Ende des Versuches wurden die Tiere getötet, Lungengewebe zur Isolierung der Genaktivität (mRNA) verschiedener Entzündungsmarker entnommen und mittels quantitativer PCR gemessen. Zudem wurden Prostaglandinmetabolite im Urin der Tiere massenspektrometrisch quantifiziert. Zusammenfassung Ergebnisse und Beobachtungen Die Untersuchungen an dem entnommenen Lungengewebe zeigten, dass die Gabe von Indometacin beziehungsweise Parecoxib sowohl die Expression der IL 8 und EP 3- mRNA, als auch von COX 2- mRNA und der Thromboxansynthese supprimiert. Im Urin zeigte sich, dass beide Medikamente die Ausscheidung der Prostaglandine unterschiedlich beeinflussen. Auf die Ausscheidung des Thromboxans hatte Parecoxib im Vergleich zu Indomentacin keinen Einfluss. Weder Indometacin noch Parecoxib konnten den Abfall des MAD längerfristig verhindern, aber sie senkten den MPAD. Praktische Schlussfolgerungen Beide Medikamente haben sowohl auf die Hämodynamik, als auch auf die Entzündungsreaktion der Lunge einen positiven Einfluss, verhindern aber nicht den Abfall des system- arteriellen Blutdrucks. Während durch die Anwendung von Indometacin und Parecoxib eine vergleichbare Hemmung des Prostaglandinrezeptors E 3 erfolgt und der MPAD abgesenkt wurde, bewirkt nur die Gabe von Indometacin eine deutliche Inhibition der Thromboxansynthese. 1.2 Abstract (englisch) Background Group B streptococcus infections in the neonatal period can cause a severe sepsis. Initially, unspecific symptoms such as pallor, lethargy and decreased peripheral blood flow lead to a rapid progression and shock and make an early effective therapy to improve outcomes necessary. The purpose of the study was to determine the effect of the inhibition of prostaglandin synthesis on the course of the experimental B streptococci sepsis in animal models. Inhibition of prostaglandin synthesis was carried out with Indomethacin and specific COX 2 inhibitor Parecoxib. In addition to the hemodynamics, inflammatory mediators such as IL 8, COX 2, EP 3 receptor and various prostaglandins in the urine were examined. Zusammenfassung Methods Newborn piglets under anesthesia were randomized into different groups (infection with streptococcus group B, infection with streptococcus group B + indomethacin, infection with streptococcus group B + parecoxib and control group without infection and therapy). Due to monitoring of MAP, MPAP and urine, the piglets got catheters for invasively measurement. After the observation time all pigs were killed and lung tissue for the isolation of the gene expression (mRNA) of various inflammatory markers was taken and measured by quantitative PCR. In addition prostaglandin metabolites in the urine were quantified by mass spectrometry. Results The COX 2, EP 3 and IL 8- mRNA expression in lung tissue were quantified by TaqMan PCR. Indomethacin and Parecoxib prevented the increase of the mRNA expression of all markers as well. The urine analysis demonstrated that the drug effect on thromboxane metabolites differed. Parecoxib treatment did not affect thromboxane formation. After intravenous infusion of GBS MAP decreased continously, neither Indometacin nor Parecoxib could prevent arterial hypotension. The infection induced rise of MPAP however was prevented by both pharmaceuticals. Conclusions Both drugs had a positive influence on the pulmonal hemodynamics, as well as the prevention of the inflamemation of the lungs. On the other hand both could not avoid the decrease of system- arterial blood pressure. While during the application of Indomethacin and Parecoxib a comparable inhibition of the EP 3 receptor and the MPAD were achieved, only the application of indomethacin caused a significant inhibition of thromboxane synthesis. 1 2 Einleitung Einleitung 2.1 2.1.1 B- Streptokokken- Sepsis bei Neugeborenen Streptokokken im Überblick Streptokokken sind grampositive unbewegliche, katalasenegative Kokken. Sie besitzen eine kugelige bis eiförmige Gestalt, sind in gewundenen Ketten angeordnet und nicht zur Sporenbildung befähigt [10]. Abbildung 2–1: gram- gefärbte Streptokokken unter dem Lichtmikroskop Quelle: [54] Die meisten Bakterien dieser Art gehören zur physiologischen Flora der menschlichen Haut und Schleimhaut, können jedoch auch pathogen wirken. Die Einteilung erfolgt nach einer Klassifikation, die neben dem Hämolyseverhalten und der Antigenstruktur auch den Sauerstoffbedarf berücksichtigt. Im Bezug auf die unterschiedlichen Gattungen differenziert man • pyogene hämolysierende Streptokokken • orale Streptokokken • Pneumokokken • Laktokokken • anaerobe Streptokokken • und andere Streptokokken. 2 Einleitung Einige Arten benötigen zum Wachsen 5 bis 10 Volumenprozent CO2. Allen humanpathogenen Streptokokken ist das Wachstum bei 37°C gemein. [10]. Das Hämolyseverhalten ist von besonderer Bedeutung für den Nachweis der fakultativ anaeroben Kokken. Pneumokokken weisen ein vergrünendes, auch α- Hämolyse genanntes Verhalten auf. Bei intakter Erythrozytenmembran kommt es unter der Freisetzung von H2O2 zur Hämoglobinreduktion. Es bilden sich biliverdinähnliche Substanzen, die für den gräulich- grünen Farbhof um die Kolonie verantwortlich sind [10]. Zur vollständigen Auflösung der Erythrozyten kommt es bei Streptokokkenkolonien, die Hämolysine absondern. Streptococcus pyogenes (A- Streptokokken) und Streptococcus agalactiae (B- Streptokokken) gehören zu dieser Gruppe der β- hämolysierenden Streptokokken. Hier zeigt sich auf dem sich auf dem Agar ein klarer durchscheinender Hof [10]. Bei Streptokokken, die kein Hämolyseverhalten aufweisen, spricht man von γ- Hämolyse [10]. Die serologische Einteilung geht auf Rebecca C. Lancefield zurück. Sie schuf eine Klassifikation aufgrund des Antigenmusters der Zellwandbestandteile. Die bedeutendste Rolle spielt ein Polysaccharid, die sogenannte CSubstanz. Dieses Polysaccharid wird mit Hilfe von Antikörpern als Antigen identifiziert und kann so eingeteilt werden. Nach der Lancefield- Gruppierung lassen sich die Streptokokken in die Serogruppen A bis W und die Streptokokken ohne Gruppenantigen typisieren [10]. 2.1.2 B- Streptokokken Die B-Streptokokken sind primär tierpathogene Bakterien, die von einer Polysaccharidkapsel umgeben sind. Sie sind jedoch auch beim Menschen in der Lage, Wund- und Harnwegsinfekte hervorzurufen. Eine besondere Bedeutung haben sie in der Geburtshilfe und Pädiatrie, da sie bei maternaler Scheidenbesiedlung in den meisten Fällen bereits intrauterin über kolonisiertes Fruchtwasser [56], oder intrapartal auf das Kind übergehen können und so zu Sepsis, Pneumonie, Osteomyelitis und Meningitis führen können [12], [10]. In 10 – 30 Prozent erfolgt der Nachweis von Streptokokken der Gruppe 3 Einleitung B als Teil der physiologischen Flora im Anogenitalbereich symptomloser Schwangerer. Nach neuen Studien liegt die Durchseuchungsrate in Deutschland bei 16 Prozent [30], [3]. Seit etwa 1970 zählen die invasiven Infektionen mit Streptokokken der Gruppe B zu den Häufigsten im Neugeborenenalter [6]. Der kulturelle Nachweis der Bakterien kann aus Blut, Liquor und Sekreten erfolgen [10]. 2.1.3 Definition Sepsis 1989 definierte Roger C. Bone die Sepsis „als eine Invasion von Mikroorganismen und/ oder ihrer Toxine in den Blutstrom zusammen mit der Reaktion des Organismus auf diese Invasion“1. Diese Definition wurde 1991 durch die Konsensus-Konferenz des American College of Chest Physicans und der Society of Critical Care Medicine erweitert [68]. So spricht man heute von einer Sepsis, wenn als systemische Antwort auf eine Infektion mindestens zwei der folgenden Kriterien zu treffen • Temperatur > 38°C oder < 36°C • Herzfrequenz > 90/min • Atemfrequenz > 20/min • der PaCO2 < 32 mmHg • Leukozyten > 12 000/µl oder < 4 000/µl • > 10 Stabkernige [65]. Ursache für die Sepsis ist in den meisten Fällen die Streuung der Erreger über die Blutbahn von einem Infektionsherd ausgehend. Diesen Fokus zu diagnostizieren und zu sanieren wird größte Bedeutung beigemessen. Neben der Blutbahn können auch Hohl- und Weichteilorgane, sowie das Lymphsystem Wege für die septische Streuung bieten [38]. 1 R.C. Bone,1989, www.sepsis-gesellschaft.de 4 2.1.4 Einleitung Neonatale B- Streptokokkensepsis Eine Sepsis wird bei Neugeborenen klinisch diagnostiziert, die Blut- oder Liquorkultur ist nur in 0,05 Prozent positiv. [2]. Beim Neugeborenen gelten folgende Symptome als Hinweis auf eine Sepsis • schlechter Allgemeinzustand mit Trinkschwäche, Thermoinstabilität und Berührungsempfindlichkeit • Tachykardie um 180/min, Blässe, Hypotonie mit Zentralisation und schlechter Hautperfusion sowie einer Rekapilarisierungszeit > 3 Sekunden • thorakale Einziehungen, Stöhnen, Apnoe, Dys- oder Tachypnoe und ein erhöhter Sauerstoffbedarf beim reifen Neugeborenen • Blässe, Zyanose, Petechien, Abszesse, Ikterus, Omphalitis, Paronychie, Ödeme an Haut oder Weichteilen • geblähtes Abdomen, Erbrechen, verzögerte Magenpassage, Obstipation, Diarrhoe, fehlende Darmgeräusche, Nahrungsverweigerung • Lethargie, Irritabilität, gespannte Fontanelle, Krampfanfälle, Hypo- oder Hypertonie der Muskulatur. [38], [47], [30] Manifeste Schockzeichen wie Blutdruckabfall, grau-blasses Kolorit und metabolische Azidose sind als Finalzeichen der Sepsis zu werten [47]. Die Inzidenz der neonatalen B- Streptokokken- Sepsis beträgt 0,47/1000 Lebendgeborene [12], [13]. Definitionsgemäß wird bei der neonatalen BStreptokokkensepsis zwischen der early- und der late- onset Sepsis unterschieden. Die frühe Form tritt bei 0,28/1000 lebenden Neugeborenen innerhalb der ersten 3 Lebenstagen, im Mittel bereits innerhalb der ersten 20 Lebensstunden [12], [3], auf. Verantwortlich sind in diesem Fall Streptokokken der Gruppe B mit den Kapseltypen I bis III, die aus der Vaginalflora der Mutter stammen [12]. Reife Neugeborene infizieren sich direkt nach der Geburt mit einer Häufigkeit von 0,5 bis 1 Prozent. Bei Frühgeborenen erhöht sich das Risiko auf 15- 20 Prozent und extreme Frühgeborene haben ein Erkrankungsrisiko von fast 100 Prozent [30]. Die Unreife des Immunsystems [27] sowie die fehlende Leihimmunität durch die Mutter [9] spielen eine besondere Rolle. Die Kinder fallen durch schwer verlaufende Infektionen und Pneumonien auf. Fulminante Krankheitsverläufe sind bekannt, die Mortalität liegt 5 Einleitung bei 4 Prozent. Des Weiteren besteht das Risiko neurologischer Folgeschäden, insbesondere bei einer Streptokokkenmeningitis [12]. Der late- onset type ist eine Infektion mit dem Kapseltyp III und präsentiert sich häufig als Meningitis. Diese Form tritt mit einer Inzidenz von 0,19/1000 Lebendgeborene auf [12]. Es sind Risikofaktoren bekannt, die die Infektion eines Neugeborenen begünstigen. Dazu zählen: • der Nachweis von B-Streptokokken im maternalen Genital- und Rektalbereich zum Zeitpunkt der Entbindung [30], [56] • vorzeitiger Blasensprung als Hinweis auf ein Amnioninfektionssyndrom [30] • mehr als 18 Stunden zwischen dem Blasensprung und der Entbindung [30], [56] • Fieber der Mutter unter der Geburt [30], [56] • Frühgeburt vor der 37. Woche [30], [56] • GBS- Bakteriurie der Mutter während der Schwangerschaft [41], [56] • Zustand nach Geburt eines Neugeborenen mit B-Streptokokkeninfektion [30] , [56] Bei einem positiven B- Streptokokken- Testergebnis erkranken 0,5- 1 Prozent der Neugeborenen, soweit kein weiterer Risikofaktor auftritt. Im Fall eines zusätzlich auftretenden Amnioninfektionssyndroms steigt das Risiko einer postpartalen Infektion um den Faktor 5- 10 [47]. Die Deutsche Gesellschaft für Perinatale Medizin, sowie die Deutschen Gesellschaft für Gynäkologie und Geburtshilfe, empfiehlt alle Schwangeren zwischen der 35. und 37. SSW auf B- Streptokokken zu untersuchen. Hierzu erfolgt ein vaginaler und rektaler Abstrich. Ist das Testergebnis positiv, so wird eine Chemoprophylaxe vom Wehenbeginn bis zur Geburt des Kindes empfohlen. Liegt bei Wehenbeginn kein Ergebnis vor, das weniger als 5 Wochen alt ist, so wird eine Chemoprophylaxe auch in folgenden Situationen empfohlen: 6 • Frühgeburt vor vollendeter 37. SSW • Blasensprung vor mehr als 8 Stunden • maternales Fieber über 38°C. Einleitung Kinder, die nach der Geburt Zeichen einer Infektion bieten, müssen unabhängig von der Risikokonstellation diagnostiziert und behandelt werden [56]. 2.1.5 Pathogenese und Physiologie der neonatalen B- Streptokokken- Sepsis „Der menschliche Organismus reagiert auf eine durch ein bestimmtes Agens hervorgerufene Schädigung des Gewebes mit einer lokalen und systemischen Entzündungsreaktion.“2 Der Antigenkontakt führt rasch zu einer Freisetzung von Mediatoren, zu denen neben dem Komplementsystem vor allem Cytokine und akut-Phase- Proteine gehören. Im Verlauf werden sekundäre Mediatoren, wie PAF, Leukotriene, Prostaglandine, freie Sauerstoff- und Stickstoffradikale, freigesetzt. Diese „führt zu Durchblutungsstörungen, Transsudation, Transmigration und Exsudation sowie zu einer vermehrten Zellproliferation der lokalen Zellverbände“3. Gleichzeitig werden aber auch antiinflammatorische Substanzen gebildet. Hierzu zählen lösliche TNF α-Rezeptoren, IL 1- Rezeptorantagonisten, IL 4 und IL 10. Es kommt aufgrund der Immunantwort des Organismus zu einer Beeinträchtigung wesentlicher Körperfunktionen. Die Expression des tissue factor´s auf Monozyten, neutrophilen Granulozyten und Endothelzellen führt zur Aktivierung des Gerinnungssystems. Außerdem werden physiologische Antikoagulantien, unter anderem Antithrombin III, inhibiert. Es folgt eine schwere disseminierte intravasale Gerinnung. [30] Adhäsionsmoleküle für Leukozyten werden von Endothelzellen gebildet. Kommt es zum Kontakt der Adhäsionsmoleküle mit der Endothelzelloberfläche, bewirkt dies eine Aktivierung der Leukozyten und führt so zur Freisetzung zytotoxischer Substanzen. Die Substanzen wirken einerseits antimikrobiell, schädigen aber andererseits auch die Endothelzellen selbst. Diese 2 3 Pschyrembel, W., (2002), Pschyrembel Klinisches Wörterbuch, 259. Auflage, De Gruyter Pschyrembel, W., (2002), Pschyrembel Klinisches Wörterbuch, 259. Auflage, De Gruyter 7 Einleitung Schäden veranlassen Störungen in der Mikrozirkulation und die Ausbildung eines Kapillarlecks. Intravasale Flüssigkeit kann so in das Interstitium austreten. In Folge der Flüssigkeitsverschiebung kann es zu einem immensen intravasalen Volumenmangel kommen [30]. Ebenfalls stimuliert wird die Bildung von NO durch die endotheliale NO- Synthetase. NO hat starke vasodilatatorische Eigenschaften. Im septischen Schock kommt es, bedingt durch die Vasodilatation, zur Senkung der kardialen Vorlast und somit zur arteriellen Hypotension. Dies verstärkt den Effekt, den der ausbleibende venöse Rückstrom durch den Flüssigkeitsverlust über das Kapillarleck hat. Auf Grund der daraus folgenden Mikrozirkulationsstörung mit reduzierter Perfusion und sinkender O2- Versorgung bei zeitgleich steigendem Bedarf kommt es zur vermehrten Katecholaminausschüttung, um so die Oxygenierung zu gewährleisten. Das Herzzeitvolumen wird so gesteigert. Auf die frühe Phase des septischen Schocks folgt eine späte Phase. Diese ist dadurch gekennzeichnet, dass das durch das gesteigerte Herzzeitvolumen die Verteilungsstörung nicht kompensiert werden kann [30]. Im Rahmen eines septischen Geschehens kann es außerdem zur Ausbildung eines ARDS kommen. In Folge der gesteigerten Kapillarpermeabilität bildet sich ein interstitielles Lungenödem. Es kommt zur Zerstörung der Pneumozyten und zum Surfactantmangel. Die verminderte Entfaltung der Alveolen bedingt die Entstehung eines alveolären Ödems, die Bildung hyaliner Membranen, Mikroatelektasen und intrapulmonaler Shunts. Letztendlich kommt es in Folge von Endothelproliferation und zunehmender Fibroblastentätigkeit zur Ausbildung einer Lungenfibrose [18]. Folge der unterschiedlichen Organdysfunktionen ist im extremsten Fall ein Multiorganversagen, welches die häufigste Todesursache bei septischen Patienten darstellt [68]. 8 Abbildung 2–2: Einleitung Pathogenesemodell der Sepsis nach X. Sáez- Llorens und G.H. Mc Cracken Jr. 1993 Quelle: [29] Gerade bei den invasiven neonatalen Infektionen wird der Kapsel der BStreptokokken eine bedeutende Rolle zugeordnet. Um die verschiedenen Kapseltypen (Ia, Ib, Ic, II- IV) zu erkennen und zu opsonieren, müssen für den jeweiligen Typ spezifische Antikörper vorhanden sein. Mütter infizierter Neugeborener fallen durch besonders niedrige Antikörperspiegel gegen den jeweiligen speziellen Kapseltyp auf. Der passive maternale Schutz reicht also nicht aus, um das Kind vor einer Infektion zu schützen. Rezeptoren des angeborenen Immunsystems des Kindes erkennen Zellbestandteile und andere lösliche Faktoren der Bakterien und lösen die oben beschriebene Kaskade aus. Ausschlaggebend für das Ausmaß der Infektion ist die Reife des Kindes. Je unreifer das Neugeborene und somit auch das T- Zellsystem des Kindes ist, umso höher ist das Infektionsrisiko. Hinzu kommt, dass Frühgeborene diaplazentar nur ungenügend humorale Antikörper übertragen bekommen. 9 Einleitung Somit ist die Erregeropsonierung als Grundlage für die Phagozytose vermindert. Gerade Frühgeborene jedoch imponieren dadurch, dass sie trotz septischen Krankheitsverlaufes wenig Symptome bieten [2], [25], [47]. Im Rahmen zahlreicher Studien wurden in den letzten Jahren sowohl die Pathogenese des respiratorischen Versagens, als auch die des kardialen Versagens und die damit verbundene Hypotension untersucht. So konnte unter anderem herausgefunden werden, dass nach einer intravenöser Applikation von Streptokokken der Gruppe B ein deutlicher Anstieg von Thromboxan im Serum verschiedener Tiere zu verzeichnen ist [15]. Der Thromboxananstieg im Serum wird durch die Phospholipide der Bakterienmembran bedingt [8] und steht im Zusammenhang mit der im weiteren Verlauf entstehenden pulmonalen Hypertension. In früheren Studien wurde bereits der hemmende Einfluss von Indometacin auf die Entstehung einer pulmonalen Hypertension und systemischer Hypotension gezeigt [34]. 2.2 2.2.1 Prostaglandine Prostaglandinsynthese Prostaglandine spielen als Mediatoren der Schmerzsensibilisierung, von inflammatorischen Reaktionen und bei der Entstehung von Fieber eine wesentliche Rolle in der systemischen Reaktion des Körpers auf einen infektiösen Herd. Grundsubstanz des Syntheseweges ist die Arachidonsäure. Diese wird, durch die Phospholipase A2, aus Membranlipiden katalysiert. In einem zweiten Schritt wird aus Arachidonsäure Prostaglandin G2 [31]. Die Cyclooxygenasen sind hier das wesentliche und geschwindigkeitsbestimmende Enzym und somit der Angriffspunkt für nichtsteroidale Antiphlogistika. Im nächsten Schritt wird dann durch eine Peroxidase aus PG G2 das PG H2 [5], [32]. 10 Abbildung 2–3: Einleitung Synthese von PGH2 aus Arachidonsäure Quelle: [62] Die verschiedenen Prostaglandine unterscheiden sich nur noch durch unterschiedliche Stellungen der Hydroxyl- und Ketongruppen, die in das PG H2 eingebaut werden [19], [31]. Abbildung 2–4: Prostaglandinsynthese durch verschiedene Synthasen Quelle: [62] 11 Einleitung Die Cyclooxygenasen liegen in verschiedenen Isoformen vor. Bekannt sind die Formen COX 1, COX 2 und COX 3, wobei die COX 3 als Variante der COX 1 betrachtet wird. [59], [5]. Die COX 1 liegt in vielen Zellen konstitutiv vor und ist ständig aktiv. In den Thrombozyten kommt ausschließlich COX 1 vor. Während auch in normalen Blutgefäßen fast ausschließlich die COX 1 lokalisiert ist, kommt in den Endothelzellen proliferierender Blutgefäße, in entzündetem Gewebe und in atherosklerotischen Läsionen auch die COX 2 vor. In der Nierenrinde und im Nierenmark ist ebenfalls die COX 1 vorherrschend. Hier ist die Bildung von Prostaglandin E2 und Prostacyclin maßgebend für die Nierendurchblutung und die glomeruläre Filtrationsrate [32], [5]. Die COX 2 wird durch Leukozyten, Makrophagen und Entzündungsmediatoren wie TNFα oder Interleukin 1β sowie durch Lipopolysaccharide in Zellen als Reaktion auf eine Noxe innerhalb von Stunden aktiviert. Die von dieser Isoform produzierten Prostaglandine fördern die Entzündungsreaktion. Sie führen über eine Vasodilatation zu einer erhöhten Gefäßpermeabilität und somit zu einem vermehrten Flüssigkeitsaustritt. Hinzukommend werden die Schmerzrezeptoren in dem betroffenen Gebiet sensibilisiert. Pyrogene, die durch den Zerfall von Bakterien freigesetzt werden, vermehren im cerebralen Wärmezentrum die Bildung von PG E2, dies hat eine Erhöhung des Temperatursollwertes zur Folge [32], [5], [16]. Der Abbau der verschiedenen Prostaglandine erfolgt nach relativ kurzer Halbwertszeit von 1 Minute durch verschiedene Enzyme. Beteiligt an der Inaktivierung sind insbesondere die 15- Hydroxyprostaglandindehydrogenase und die ∆13- Reduktase. Der weitere Abbau findet im Rahmen der β- Oxidation statt [31], [62]. Des Weiteren entsteht aus PG H2 durch die Wirkung der Thromboxansynthase Thromboxan A2. Die Thromboxansynthase ist ein Enzym, von dem angenommen wird, dass es der COX 1 folgt und somit durch die selektiven COX 2- Inhibitoren nicht beeinflusst werden kann. Tx A2 wird von Thrombozyten freigesetzt und ist verantwortlich für Vasokonstriktion, Bronchokonstriktion und Thrombozytenaggregation. Die Synthese kann über die Metabolitausscheidung im Urin gemessen werden. Der Anstieg der Metabolite im Urin 12 Einleitung ist typisch für die durch B- Streptokokken bedingte pulmonale Hypertension. [28] 2.2.2 Prostaglandin E 3- Rezeptor und pulmonalarterieller Druck Postpartal sinkt der Lungengefäßwiderstand in den ersten Tagen bis Wochen durch die Dilatation der Muskulatur, vor allem präkapillär. Der Druck in der Lungenstrombahn ist dann mit einem Mitteldruck von 13mmHg deutlich geringer als der im Körperkreislauf. Die Gefäße der Lunge sind dünnwandiger und weisen deutlich weniger glatte Muskulatur auf. Sie sind so viel dehnbarer und zeigen einen sehr geringen Strömungswiderstand [24], [30]. Bedingt durch eine Infektion kann es zu einer erneuten Konstriktion der Lungengefäße kommen. Der pulmonale Gefäßwiderstand steigt infolge dessen und der Blutdruck im Lungenkreislauf wird erhöht. Bleibt der Druck über einen längeren Zeitraum erhöht, so hat dies eine Zunahme des Umfangs der Gefäßmuskulatur zur Folge. Die Muskulatur wird zu Bindegewebe umgebaut und die Wand des Gefäßes verliert an Flexibilität. Durch diesen Umbau ist der Sauerstoffaustausch in der Lunge stark eingeschränkt. Gleichzeitig verringert sich durch den erhöhten pulmonal- arteriellen Widerstand die Auswurfleistung des Herzens. Es entsteht eine pulmonale Hypertonie. Phospholipide der B- Streptokokken führen, wie tierexperimentelle Studien zeigen, zu einer Erhöhung des vaskulären Widerstands, beeinflussen so auch den Gasaustausch in der Lunge und sind Ursache für die Bildung eines pulmonalen Hypertonus [8]. Bakterielle Lipopolysaccharide und Zytokine bewirken während eines entzündlichen Geschehens in den Endothelzellen der Blut- Hirn- Schranke die Stimulation der Prostaglandin E- Synthase. Diese bildet aus PG H2 das PG E2. Sämtliche Prostaglandine, so auch dass PG E2, vermitteln ihre Wirkung im Organismus über G-Proteingekoppelte Rezeptoren vom Rhodopsintyp, der 7 Transmembrandomänen aufweist. Man unterscheidet 4 Rezeptorsubtypen, die eine unterschiedliche Affinität gegenüber der Prostaglandine besitzen. PG E2 entfaltet in der Lunge und im Gehirn vasokonstriktorische Eigenschaften über den EP 3- Rezeptor. [20], [21], [50], [51] 13 2.2.3 Einleitung Medikamentöse Beeinflussung der Synthese von Prostaglandinen Nicht steroidale Antiphlogistika können die Cyclooxygenase- Isoformen, die für die Bildung von Prostaglandinen, Prostacyclin und Thromboxan aus Arachidonsäure verantwortlich sind, entweder unspezifisch, also beide Isoformen, oder selektiv, nur die COX 2, hemmen. 2.2.3.1 Indometacin 2-[1-(4-Chlorbenzoyl)- 5-methoxy-2-methyl-1H-indol-3-yl] essigsäure Abbildung 2–5: Strukturformel Indometacin Quelle: [55] Indometacin ist ein Medikament aus der Gruppe der sauren antiphlogistischen und antipyretischen Analgetika [32]. Es handelt sich um ein Arylessigsäure- Derivat mit hydrophob aromatischem Rest. Die Entwicklung erfolgte 1963, ebenso wie die Erstzulassung 1965, in den USA. Indometacin ist eine ambiphile Säure. Auf Grund des niedrigen pH- Wertes und der hohen Eiweißbindung, über 90%, reichert sich Indometacin in besonders hoher Konzentration in entzündetem Gewebe an und wirkt dort antiinflammatorisch. [39]. Wie alle Substanzen aus der Gruppe der nicht selektiven COX- Hemmer inhibiert Indometacin sowohl die COX 1, als auch die COX 2. Dies hat, neben der gewünschten Blockierung der Synthese von Entzündungsmediatoren, auch die Beeinflussung der physiologisch aktiven Prostaglandine zur Folge und erklärt so das Nebenwirkungsprofil. Neben Schädigungen der 14 Einleitung Schleimhaut im Gastrointestinaltrakt sind Kopfschmerzen, Schwindel, Störungen der Leberfunktion und des Wasser- und Elektrolythaushaltes, pseudoallergische Reaktionen und andere Nebenwirkungen beschrieben. [32]. Der Abbau von Indometacin erfolgt durch eine Demethylierung am Sauerstoff, durch N- Deacylierung und durch Kopplung [32]. Der Plasmaspitzenspiegel wird nach zwei Stunden erreicht, die Plasmahalbwertszeit liegt zwischen zwei und vier Stunden. Nach hepatischer Metabolisierung erfolgt die Elimination zu 50 bis 70% renal [39]. 2.2.3.2 Parecoxib N-{[4-(5-Methyl-3-phenylisoxazol-4-yl) phenyl]sulfonyl}propionamid Abbildung 2–6: Strukturformel Parecoxib Quelle: [70] Die Coxibe besitzen, im Gegensatz zu dem oben aufgeführten Indometacin, keine Säuregruppe und lagern sich mit einer bis 100fach höheren Affinität an das Isoenzym COX 2 an [39]. Die COX 2 ist insbesondere für die Synthese des Prostaglandin E 2 zuständig. Durch PGE 2 wird die Reizleitung in afferenten Nervenfasern erleichert. Auch blockiert PGE 2 die inhibitorische Wirkung spezifischer Glycinrezeptoren und führt auf spinaler Ebene zu einer Hyperalgesie. [1], [52] Parecoxib ist ein selektiver, schnell einsetzender und bis zu 12 Stunden wirkender COX 2 Inhibitor. Es ist der erste Wirkstoff aus der Gruppe der Coxibe, der parenteral zugeführt werden kann. 15 Einleitung Es handelt sich um ein Prodrug, das in der Leber zum wirksamen Metaboliten Valdecoxib und zu Propionsäure umgebaut wird. Hydrolyse Abbildung 2–7: Hydrolyse von Parecoxib zu Valdecoxib Quelle: [70] Der Plasmaspitzenspiegel von Valdecoxib wird nach 30 bis 60 Minuten erreicht. Die Serumhalbwertszeit des Valdecoxib liegt bei 8 -12 Stunden. Valdecoxib hat mit bis zu 98% eine hohe Plasmaproteinbindung und weist auch eine extensive Erythrozytenbindung auf. [39], [53]. An der Verstoffwechselung des Metaboliten Valdecoxib sind verschiedene Enzyme beteiligt. Zu ca. 80 Prozent erfolgt der Abbau durch CYP 3A4 und CYP 2C9, die restlichen ~ 20Prozent werden CYP- unabhängig glukuronidiert. Die Plasma- Clearance von Valdecoxib beträgt ca. 6 ½ Stunden. Die COX 2- abhängigen Prozesse, wie Schmerzentstehung, Entzündung und Fieber, werden durch die Selektivität unterdrückt, gleichzeitig werden die über die COX 1 vermittelten physiologischen Wirkungen auf die Blutgerinnung sowie im Gastrointestinaltrakt kaum beeinflusst. Klassische Nebenwirkungen der unselektiven Inhibitoren, wie Schädigung der Magenschleimhaut und Nierenschäden, werden ausgespart [32]. Als häufigste Nebenwirkungen sind Übelkeit und Erbrechen, sowie Kopfschmerzen und Hautreaktionen beschrieben [11]. 16 2.3 Einleitung Zytokine Die intrazelluläre Kommunikation und die Modulation der Immunantwort sind wesentlich über Zytokine vermittelt [26]. Neben proinflammatorischen Zytokinen, wie TNFα, IL 1 und IL 8, die die Entzündung fördern, existieren auch antiinflammatorische, die die Inflammation eindämmen und die Regeneration der Zelle fördern [26]. Aufgabe der proinflammatorischen Zytokine ist die möglichst schnelle Elimination des schädigenden Agens. Hierzu werden lokale an der Entzündungsreaktion beteiligte Zellen aktiviert, diese wirken wiederum chemotaktisch auf andere Zellen. Die Migration der Zellen in das entzündete Gewebe wird durch Veränderungen in der Zellmatrix erleichtert [26]. 2.3.1 Interleukin 8 IL 8, ein nicht- glykosiliertes Protein, wird von einer Vielzahl von Zellen, z.B. Endothelzellen, Monozyten, Epithelzellen und Fibroblasten produziert. IL 8 ist ein wesentlicher Faktor bei der Chemotaxis von Neutrophilen und stimuliert die Expression von Adhäsionsmolekülen [63]. Gerade die unspezifische Symptomatik, die die Neugeborenen zu Beginn einer Infektion bieten, und die drohende Progredienz zur Meningitis oder Sepsis macht es nötig, dass zuverlässige und vor allem frühe Marker zur Diagnostik herangezogen werden, um eine möglichst effektive und risikoadaptierte Therapie zu gewährleisten. Da das lange Zeit hierfür genutzte CrP und ein Differentialblutbild nicht ausreichen, werden Zytokine, wie das IL 8 herangezogen. Der Vorteil ist, dass das IL 8 bei einer bakteriellen Infektion viel früher und schneller ansteigt. Nach einem bakteriellen Stimulus reagiert IL 8 bereits 12 bis 24 Stunden vor dem CrP. Auffällig ist, dass IL 8 nach seiner Synthese rasch an Erythrozyten und andere Zellen gebunden wird. So kann das Messergebnis durch eine mögliche Hämolyse, den Transport und die Dauer bis zur Durchführung der Messung beeinflusst werden. Trotzdem wird laut Leitlinien der Gesellschaft für Neonatolgie und Pädiatrische Intensivmedizin eine Kombination aus Interleukin, zum Beispiel IL 8, und CrP empfohlen [56],[69], [64] [57], [63]. 17 Einleitung Die Rolle von IL 8 im Verlauf einer Inflammation konnte während eines Vergleiches von IL 8 mit Laktatwerten gezeigt werden. Es zeigte sich eine eindeutige und signifikante Korrelation der beiden Werte. Im Gegenzug konnte eine inverse Proportionalität zwischen IL 8, der Leukozyten- und der Plättchenzahl, sowie dem MAD aufgezeigt werden. Des Weiteren besteht eine deutliche Korrelation zum frühen Infektionsmarker IL 6. Diese Ergebnisse und die bekannte Aktivierung von Neutrophilen durch IL 8 sind der Grund, warum diesem Marker eine bedeutende Rolle in der Pathophysiologie der Sepsis beigemessen wird [17]. 2.4 Ziel der vorliegenden Arbeit Die neonatale B- Streptokokken- Sepsis hat eine Inzidenz von 0,47/1000 Lebendgeborene [12]. Neben dem möglichen schweren Verlauf der Infektion steht in dieser Studie die Suppression der Einzündungsreaktion in der Lunge als Ursache einer persistierenden pulmonalen Hypertonie im Mittelpunkt. Gemessen wurde, neben dem mittleren Druck in der Arteria femoralis und dem mittleren pulmonlarteriellen Druck, das Ausmaß der Entzündungsrekation exemplarisch durch die mRNA- Expression von IL 8, EP 3 und der COX 2 im Lungengewebe. Des Weiteren wurden einige Prostaglandinmetaboliten im Urin bestimmt. Folgende Fragen sollen in der Studie beantwortet werden: • Supprimieren Indometacin und Parecoxib die Entzündungsreaktion in der Lunge beim Krankheitsbild der neonatalen B- Streptokokkensepsis und ist eines der Medikamente dem Anderen in seiner Wirkung signifikant überlegen? • Hat die Wirkung von Indometacin und Parecoxib über die EP 3- Rezeptoren einen Einfluss auf die Entwicklung des Blutdruckes in der Arteria pulmonalis und wird durch die Gabe der Medikamente die systemische Hämodynamik, gemessen über den mittleren arteriellen Druck der Arteria femoralis, verbessert? • Welchen Einfluss hat die Gabe von Indometacin und Parecoxib auf die Bildung von Thromboxan und dessen Metabolismus und können Unterschiede in der Wirkung der Medikamente aufgezeigt werden? 18 3 3.1 Material und Methoden Material und Methoden Tierexperimentelle Präparationen Die Durchführung der Studie wurde von der Regierung Mittelfrankens genehmigt. Es wurden neonatale Schweine ausgewählt, die zwischen neun und zwölf Tagen alt und zwischen 3,4 und 4,2 kg schwer waren. Die Tiere wurden mit Azaperon (1mg/kg KG) i.m. und Dormicum ® i.v. (Midazolam 0,5mg/kg KG) über eine periphere Venenverweilkanüle in einer Ohrvene sediert. Die Narkose erfolgte initial mit einer Bolusinjektion von 5 mg/kg KG Ketanest S® (Ketamin), 1 mg/kg KG Dormicum® und 2,5 µg/kg KG Fentanyl. Im Anschluss folgten kontinuierliche Infusionen von 1,5 mg/kg KG/h Midazolam, 0,01 mg/kg KG/h Fentanyl, und 15 mg/kg KG/h Ketamin um die Narkose aufrechtzuerhalten. Nachdem die Schweine tracheotomiert wurden, erfolgte die Intubation mit einem Endotrachealtubus (Mallinckrodt ®, I.D. 4,5mm), dessen distales Ende 3,5cm oberhalb der trachealen Bifurkation zu liegen kam. Die Kontrolle der der korrekten Tubuslage erfolgte mittels starrer Bronchoskopie. Im Anschluss an die Intubation wurde die maschinelle Beatmung (Infant Star 950, Mallinckrodt, Hennef, Deutschland) begonnen. Hierfür wurden die Tiere mit 0,2 mg/kgKG Norcuron® (Vecuronium) relaxiert und erhielten wiederholt Fentanyl 5µg/kgKG i.v. Die Beatmung erfolgte initial mit einer Frequenz von 50 Atemzügen/ Minute, das Atemgas wurde auf 39°C erwärmt und angefeuchtet (MR 700, Fischer & Paykel, Welzheim, Deutschland). Um die Messung des pulmonalarteriellen Druckes zu ermöglichen, wurde intraoperativ eine 4,5 Ch Schleuse (Cook®) in die rechte Vena jugularis gelegt. Danach wurde über die Schleuse ein 4 Ch Thermodilutionskatheter (Arrow®, Erding, Deutschland) geführt und so eine kontinuierliche Messung gewährleistet. Die korrekte Lage der Spitze des Katheters in der Arteria pulmonalis wurde mit Hilfe der Druckkurve überwacht. Um den Blutdruck der Tiere kontinuierlich invasiv zu überwachen, wurde in die linke Arteria femoralis eine 20 Gage Kanüle (Arrow, Erding, Deutschland) platziert. 19 Material und Methoden Die Ableitung von Magensekret erfolgte über eine 10 Ch Magensonde. Ein regelmäßiger Harnabfluss und die genaue Überwachung der Harnproduktion wurden realisiert, indem den Tieren durch suprapubische Punktion der gefüllten Blase ein Blasenkatheter (Braun, Melsungen, Deutschland) gelegt wurde. 3.2 Einteilung in Gruppen und weitere Maßnahmen gemäß Protokoll Im Anschluss erfolgte die Einteilung der Tiere in folgende Gruppen • 1. Kontrollgruppe (keine B- Streptokokkenapplikation) • 2. GBS • 3. GBS und Einteilung in zwei Interventionsgruppen • Indometacin • Parecoxib Bei den Tieren der 2. und 3. Gruppe wurden B- Streptokokken des Stammes Ia Serotyp 90 (1,875 x 108 cfu/kg KG) über den ZVK in der rechten Vena juglaris innerhalb von 30min infundiert. 3.3 Medikamentöse Therapie Die Tiere in den Interventionsgruppen wurden mit Indometacin (5mg/kg KG) i.v. beziehungsweise Parecoxib (20mg/kg KG) i.v. behandelt. Die Therapie wurde zwei Stunden nach der GBS- Applikation begonnen. Eine erneute Injektion erfolgte im Fall von Indometacin alle 12 Stunden, Parecoxib wurde alle 8 Stunden gegeben Die Beobachtungszeit endete mit dem Tod der Tiere. Nach einer Observation von 12 Stunden wurde das Leben der Tiere der Kontrollgruppe durch Injektion von Methohexital 50mg/kgKG und 20ml 1M Kaliumchhlorid beendet. 20 3.4 Material und Methoden Monitoring Um einerseits die ausreichende Tiefe der Narkose zu sichern und andererseits versuchsrelevante Parameter zu erhalten, wurden die Tiere regelmäßig und engmaschig überwacht. In regelmäßigen Intervallen wurden die bestimmten Werte kontrolliert und protokolliert. 21 Abbildung 3–1: Material und Methoden Versuchsprotokoll der Studie 22 Material und Methoden Die kontinuierliche Messung der Atemvolumina erfolgte mit einem Hitzedrahtmanometer(MIM® GmbH, Krugzell, Deutschland) und wurde mit Hilfe des neonatalen Atemmonitors Florian® NRM-200 (MIM®) visualisiert. Ein kontinuierliches EKG wurde abgeleitet. Folgende weitere Messungen wurden vorgenommen: • Alle fünfzehn Minuten: Dokumentation der Lungenfunktions- und Beatmungsparameter; Aufzeichnung von Herzfrequenz, Temperatur und pulsoxymetrischer Sättigung; Protokollierung von ZVD, Druck der Pulmonalarterie und der Arteria femoralis (CMS 2001 (Agilent (jetzt Philips) Böblingen, Deutschland). • Alle dreißig Minuten: arterielle Blusgaskontrolle. Im Therapieintervall im Anschluss wurden im selben zeitlichen Abstand die venösen Blutgase untersucht. • Alle sechzig Minuten: manuelle Analyse der gemischtvenösen Blutgase (ABL 330 Radiometer Copenhagen, Dänemark). • Alle zwei Stunden: Ein- und Ausfuhrbilanz zur Überprüfung der Nierenfunktion. Die Auswertung der hämodynamischen Daten erolgte mit der Two- WayANOVA mit Hilfe des Programms Graph Pad Prism. 3.5 Bestimmung der Prostaglandin- Metabolite im Urin Vor Applikation der B- Streptokokken und präfinal wurde Urin über den suprapubischen Katheter gewonnen. Der Urin wurde zunächst bei -20°C eingefroren. Die Messung der Prostaglandine im Urin erfolgte im Anschluß massenspekrtometrisch im Prostaglandinlabor der Kinderklinik in Marburg. [46] 3.6 Polymerasekettenreaktion Das Verfahren zur Vervielfältigung von DNA, die Polymerasekettenreaktion, wurde 1983 von dem amerikanischen Chemiker Kary Mullis entwickelt. In drei verschiedenen Schritten wird die ursprüngliche DNA dupliziert. 23 Material und Methoden 1. Denaturieren Als erstes wird die DNA, die verdoppelt werden soll, auf 96°C erwärmt und so die komplementären Stränge voneinander getrennt. Gleichzeitig werden auch die DNA- Polymerase, passende Primer und Nukleotide erhitzt. Primer sind kurze DNA- Stücke, die es der Polymerase ermöglichen sich an die DNA anzulagern. Da die meisten im Organismus tätigen DNA- Polymerasen ein Temperaturoptimum von 37°C aufweisen, werden in diesen Ansätzen Polymerasen des Thermus aquaticus genutzt. Sie sind im Gegensatz zu den beispielsweise humanen Polymerasen hitzeresistent und gegenüber Salzen und Säuren wenig anfällig. 2. Annealing Dann wird das Gemisch auf 55°C abgekühlt. Die komplementären Primer können sich nun an die Matrize anlagern. Dieser Prozess wird Hybridisierung genannt. 3. Elongation Im nun folgenden Schritt erfolgt die Verlängerung der Matrize. Erneut wird das Gemisch erwärmt, diesmal auf 70°C. Diese Temperatur ist optimal, um die Synthese durch die Polymerase zu ermöglichen. Durch die Polymerase werden freie Nukleotide, die zur Orginalmatrize komplementär sind, angelagert. Startpunkt ist das 3’ Ende des Primers. Dieser Zyklus ist variabel oft durchführbar und so besteht die Möglichkeit, eine unendliche häufige Vervielfältigung der ursprünglichen DNA vorzunehmen. [16] 24 Abbildung 3–2: Material und Methoden Polymerasekettenreaktion Quelle: [58] 3.6.1 Quantitative Polymerasekettenreaktion Das Verfahren der RTQ- PCR entspricht grundsätzlich dem oben beschriebenen Prinzip. Zusätzlich kann bei dieser Methode jedoch quantitativ die Anzahl der erstellten DNA- Kopien errechnet werden Hierfür werden Fluoreszenz- Messungen genutzt, die während eines PCRDurchlaufes ermittelt werden. Da die Stärke der Fluoreszenz proportional zur Anzahl der Menge der PCR- Produkte steigt kann die Quantifizierung vorgenommen werden. Bei diesem Verfahren wird die Quantifizierung in der exponentiellen Phase vorgenommen, da die Umgebungsbedingungen optimal sind und sich die DNA so tatsächlich in jedem Zyklus annähernd verdoppelt [44]. Bei der Messung mit TaqMan® - Sonden wird der Fluorescence resonance energy transfer (FRET) genutzt. Die Sonde besteht aus einem Fluorochrom und einem Quencher. Durch den FRET wird bei intakter Sonde die Fluoreszenz des Fluorochroms durch den Quencher abgefangen. Durch Anlagerung des forward Primers und die folgende Extension wird die Sonde hydrolysiert und der Quencher entfernt sich vom Fluorochrom. Dadurch wird der FRET 25 Material und Methoden unterbrochen und die Fluoreszenz steigt an. Sie ist proportional zur amplifizierten DNA. 26 4 Ergebnisse Ergebnisse 4.1 4.1.1 Einfluss auf den Entzündungsvorgang im Lungengewebe Suppression von Interleukin 8 durch Parecoxib und Indometacin Das Zytokin IL 8 ist ein schnell reagierender Entzündungsparameter und spielt eine wesentliche Rolle bei der Chemotaxis und der Expression von Adhäsionsmolekülen. Bei der Messung des IL 8 im Lungengewebe ist bei den Tieren der Kontrollgruppe ein, in Abbildung 4.1. erkennbarer, diskreter Anstieg festzustellen. Dieser ist durch die invasiven Maßnahmen, wie Intubationen und Katheterisierung, die die Tiere zu Beginn des Versuches erfahren haben erklärbar. Die infizierten Tiere weisen im Vergleich zur Kontrollgruppe einen im Durchschnitt dreißigfachen Anstieg des IL 8 auf. Bei den Tieren, die mit Parecoxib oder Indometacin behandelt wurden, ist ebenfalls ein Anstieg des IL 8 zu erkennen. Jedoch ist dieser um etwa den Faktor fünf geringer als in der nicht behandelten GBS- Gruppe. Durch Indometacin und Parecoxib wird IL 8 in gleichem Ausmaß supprimiert. IL8/HPRT 30 20 10 *** *** Abbildung 4–1: in om et ac ox ib re c Pa BS -K G Ko n tro lle 0 o *** In d relative units 40 Real- time PCR- Messung der IL 8- Suppression im Lungengewebe: IL 8- mRNA bezogen auf das Housekeeping Gen HPRT 27 4.1.2 Ergebnisse Suppression der Cyclooxygenase 2 durch Indometacin und Parecoxib Die Cyclooxygenasen sind das geschwindigkeitsbestimmende Enzym bei der Synthese von Prostaglandin G2 aus Arachidonsäure. In der Kontrollgruppe lässt sich auch bei der Messung der Expression der COX 2- mRNA ein geringgradiger Anstieg erkennen (Abbildung 4.2.). Auch hier dürften die Präparationen zu Beginn der Untersuchung die Erklärung liefern. Ein signifikanter Anstieg der COX 2- mRNA innerhalb der infizierten GBSGruppe im Vergleich zu Kontrollgruppe zeigt eine deutliche Überexpression der COX 2 als entzündliche Reaktion auf die Infektion mit B- Streptokokken. Bei den mit Indometacin beziehungsweise Parecoxib behandelten Tieren ist die COX 2- mRNA- Expression supprimiert. In der Parecoxib- Gruppe ist die COX 2- mRNA auf das Niveau der Kontrollgruppe reduziert, in der Indometacin- Gruppe findet man eine deutliche Suppression im Vergleich zur unbehandelten Gruppe um etwa den Faktor fünf. COX2/HPRT relative units 30 20 10 *** *** *** Abbildung 4–2: In do m et ac in Pa re co xi b G BS Ko nt ro lle 0 Real- time PCR Messung der COX 2- Suppression im Lungengewebe: COX 2- mRNA bezogen auf das Housekeeping Gen HPRT 28 4.1.3 Ergebnisse Suppression der Thromboxansynthase durch Indometacin und Parecoxib Thromboxan entsteht aus PGH 2 über das Enzym Thromboxansynthase. Thromboxan aktiviert die Thrombozytenaggregation und wirkt vasokonstriktorisch auf die glatte Muskulatur und ist so auch an der möglichen Entstehung einer pulmonalen Hypertonie beteiligt. Nach Infektion mit B- Streptokokken konnten wir eine deutliche Zunahme der mRNA- Expression des Enzyms Thromboxansythase zeigen. Sowohl durch Indometacin, als auch durch Parecoxib erfolgte eine signifikante Suppression der mRNA- Expression. In beiden Medikamentengruppen war die Thromboxansynthase- mRNA im Vergleich zur Kontrollgruppe nur leicht erhöht. Die Suppression erfolgte durch beide Medikamente im selben Ausmaß. T B X S /H P R T relative units 5 4 3 2 *** *** 1 *** Abbildung 4–3: ac in In do m et Pa re co xi b o G BS -K Ko nt ro lle 0 Messung der Suppression der Thromboxansynthase 4.1.4 Einfluss von Indometacin und Parecoxib auf den Prostaglandinrezeptor E 3 Die Expression der mRNA des Prostaglandinrezeptors E 3 im Lungengewebe wurde ebenfalls untersucht. Dieser Rezeptor vermittelt unter anderem in der Lunge eine Vasokonstriktion nach Bindung von PGE 2. [20], [21]. 29 Ergebnisse Verglichen mit den Ergebnissen der Kontrollgruppe war die Expression der Rezeptor- mRNA in der Gruppe der mit B- Streptokokken infizierten Tiere im Durchschnitt auf das Dreifache erhöht. Durch die Gabe von Indometacin oder Parecoxib konnte die mRNA des EP 3- Rezeptors in gleichem Ausmaß signifikant reduziert werden. Abbildung 4–4: Messung der Suppression des Prostaglandinrezeptors E 3 4.2 4.2.1 Hämodynamische Parameter Einfluss von Indometacin und Parecoxib auf den mittleren arteriellen Druck Der mittlere arterielle Blutdruck war zu Beginn des Versuchs in allen Gruppen vergleichbar hoch. 30 Ergebnisse Druck in mmHg Kontrolle 55,11±2,86 SDS GBS 56,71±3,84 SDS Indometacin 59,90±8,45 SDS Parecoxib 54,89±4,82 SDS Zwei Stunden nach Infusion der B- Streptokokken stieg der MAD der Tiere der GBS- Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe leicht an, allerdings nicht signifikant. Nach diesem Zeitpunkt sank der MAD in allen Interventionsgruppen deutlich ab. Bei Tieren, die mit Indometacin behandelt wurden, war der MAD nach 2 Stunden 15 min signifikant höher als bei unbehandelten GBS-Tieren (p<0.01). Dieser Effekt war im weiteren Verlauf nicht mehr nachweisbar. Parecoxib führte zu einem geringen, nicht signifikanten Anstieg des MAD nach 2 Stunden 15 min. 31 Ergebnisse Kontrolle Zeit (h) Abbildung 4–5: Messung des mittleren arteriellen Druckes in der Arteria femoralis 4.2.2 Einfluss von Indometacin und Parecoxib auf den mittleren pulmonalarteriellen Druck Zu Beginn der Beobachtungszeit unterschied sich der pulmonalarterielle Druck in den verschiedenen Gruppen nicht. Es wurden Werte zwischen 10 und 16mmHg gemessen. 32 Ergebnisse Druck im mmHg Kontrolle 12,58±0,83 SDS GBS 15,71±1,21 SDS Indometacin 12,21±0,70 SDS Parecoxib 12,58±0,12 SDS Fünfzehn Minuten nach Applikation der Bakterien kam es zu einem signifikanten Anstieg des MPAD. Der MPAD in der Kontrollgruppe blieb konstant. Ein zweites Maximum wurde nach zwei bis fünf Stunden erreicht. In der Parecoxib Gruppe war der MPAD niedriger als in der unbehandelten GBSGruppe. Signifikant niedrigere Werte wurden im Vergleich zwischen diesen Gruppen nach dreieinhalb, fünf und fünf Stunden und 15 min gemessen. Zwischen der Indometacin- Gruppe und der GBS- Gruppe bestand kein signifikanter Unterschied. 33 Ergebnisse Kontrolle Zeit (h) Abbildung 4–6: 4.2.3 Messung des mittleren pulmonalarteriellen Druckes Überleben der Tiere Weder die Behandung mit Indometacin noch mit Parecoxib konnten das langfristige Überleben der Tiere verbessern. Alle Tiere sind nach 6 bis 12 Stunden gestorben. 4.3 4.3.1 Messung der Prostaglandinausscheidung im Urin Thromboxan B2 Thromboxan B2 , 2, 3- dinor- Thromboxan B2, 11- dehydro- Thromboxan B2, 6- keto- Prostaglandin F1α und 2,3- dinor- 6- keto- Prostaglandin F1α wurden massenspektrometrisch untersucht. 34 Ergebnisse Thromboxan A2 wird durch die Thromboxansynthase gebildet, aus Thrombozyten freigesetzt und wirkt dann als Mediator der Thrombozytenaggregation, Broncho- und Vasokonstriktion. Thromboxan B2 entsteht über nicht enzymatische Hydrolyse aus Thromboxan A2und ist wesentlich stabiler als sein aktiver Metabolit. Aus diesem Grund wird die Produktion von Thromboxan A2 über Thromboxan B2 und dessen Metabolite 2, 3- dinor- Thromboxan B2 beziehungsweise 11- dehydro- Thromboxan B2 gemessen. In der Kontrollgruppe ergab die Messung von Thromboxan B2 sowohl zu Beginn, als auch am Ende der Beobachtungszeit konstant niedrige Werte (2,671 ± 1,094ng/ml vs. 2,62 ± 1,48 ng/ml). Innerhalb aller Gruppen war der Wert, der vor der Infektion gemessen wurde, ähnlich niedrig, wie in der Kontrollgruppe. Signifikante Unterschiede wurden dann jedoch bei der zweiten Messung kurz vor dem Tod der Tiere deutlich. Die GBS- Tiere schieden bei der zweiten Messung signifikant mehr Thromboxan B2 im Vergleich zur Kontrollgruppe aus (Mann- Whitney- Test, p= 0.016). Nach Behandlung mit Parecoxib wiesen die Tiere höhere Thromboxan B2Werte auf als die Tiere aller anderen Gruppen. Diese waren mit mit 16 ± 11,54 ng/ml auch höher als der der GBS- Tiere. Parecoxib hat demzufolge auf die Thromboxan-Synthese keinen hemmenden Einfluss. T x B 2 (n g /m l) ng/ml 30 20 10 0 s ta r t end c o n tro l Abbildung 4–7: s ta r t GBS end s ta r t end IN D O s ta r t end PAR Messung von Thromboxan B2 im Urin 35 4.3.2 Ergebnisse 2, 3- dinor- Thromboxan B2 Durch die β- Oxidation wird Thromboxan B2 zu 2, 3- dinor- Thromboxan B2 umgebaut. Die im Urin ausgeschiedene Menge an 2, 3- dinor- Thromboxan B2 ist ein Marker der extrarenalen Thromboxanproduktion. Zu Beginn des Versuchs unterschieden sich die 2, 3- dinor- Thromboxan B2 Werte in den Versuchsgruppen nicht. Im Urin der GBS- Tiere stieg der 2, 3dinor- Thromboxan B2 Wert auf durchschnittlich 97,99 ng/ml und damit etwa auf den hundertfachen Wert an. Es zeigte sich jedoch eine sehr breite Streuung der Werte (± 64,47 SDS). Auch unter Therapie mit Indometacin zeigte sich eine sehr breite Streuung von 2,3- dinor- Thromboxan B2 (32,20 ± 42,52ng/ml). Auch bei den mit Parecoxib behandelten Tieren zeigten die Werte eine sehr breite Streuung (117,2 ± 86,07ng/ml), waren signifikant höher als bei Therapie mit Indometacin (Dunn´s multiple comparison test, p<0.05) und nicht signifikant niedriger als in der GBS-Gruppe. Somit hat Parecoxib wahrscheinlich keinen Einfluss auf die extrarenale Bildung von 2,3- dinor- Thromboxan B2. dnTxB2 (ng/ml) ng/ml 200 100 0 start control Abbildung 4–8: end start end GBS start end INDO start end PAR Messung von 2, 3- dinor- Thromboxan B2 im Urin Die Messung von 11- dehydro- Thromboxan B2 im Urin der Tiere verhielt sich analog zur Messung von 2, 3- dinor- Thromboxan B2. 36 Ergebnisse 11dh TxB2 (ng/ml) ng/ml 20 10 0 start end control Abbildung 4–9: 4.3.3 start end start GBS end start INDO end PAR Messung von 11- dehydro- Thromboxan B2 im Urin Messung der Konzentration von 6- keto- Prostaglandin F1 α und 2, 3- dinor- 6- keto- Prostaglandin F1 α im Urin Im Rahmen der Prostaglandinsynthese entsteht aus PGH 2 PGI 2, dieses wird auch Prostacyclin genannt. Es wirkt sowohl der Thrombozytenaggregation entgegen, als auch vasodilatativ [5]. Aufgrund seiner Instabilität zerfällt PGI 2 sehr schnell in das stabilere, aber biologische inaktive Hydrolyseprodukt 6- keto- Prostaglandin F1α. Bedingt durch die sehr kurze Halbwertszeit der Ausgangssubstanz PGI 2 wird das Hydrolyseprodukt 6- keto- Prostaglandin F1α gemessen. Die Messungen in der Kontrollgruppe zu Anfang und am Ende des Versuchs ergaben für keto- PGF1α eine Konzentration von 1,81 ± 0,68ng/ml, zu Ende des Versuchs von 0,06 ± 0,05ng/ml. Am Ende des Versuchs zeigte sich eine breite Streuung der gemessenen Werte. In der GBS- Gruppe zeigte sich im Vergleich zur Kontrollgruppe ein signifikanter Anstieg. Die Behandlung mit Parecoxib und Indometacin führte zu einer signifikanten Suppression von 6- keto- Prostaglandin F1α (One way- ANOVA, Dunn´s multiple comparison test, p <0.001). 37 Ergebnisse 6 keto PGFa (ng/ml) 40 ng/ml 30 20 10 0 start end start control Abbildung 4–10: end start GBS end start INDO end PAR Messung von 6- keto Prostaglandin F1α im Urin Prostacyclin wird im Verlauf wie alle Prostaglandine über die ß- Oxidation verstoffwechselt. Es entsteht 2, 3- dinor- 6- keto- Prostaglandin F1α [60]. In der Kontrollgruppe sind die Ausgangs- und Endwerte des Stoffwechselprodukts erwartungsgemäß niedrig. (0,0 5± 0,07 ng/ml vs. 0,06 ± 0,05ng/ml). Sowohl die mit Indometacin als auch mit Parecoxib behandelten Tiere hatten signifikant niedrigere Werte als die Tiere der GBS- Gruppe (One wayANOVA, Dunn´s multiple comparison test, p <0.001). dn-keto-PGF1a (ng/ml) ng/ml 2 1 0 start end control Abbildung 4–11: start end GBS start end INDO start end PAR Messung von 2,3- dinor- 6- keto- Prostaglandin F1α im Urin Indometacin und Parecoxib supprimieren signifikant und im nahezu gleichen Ausmaß die Synthese des Prostacyclins. 38 5 5.1 Diskussion Diskussion Hemmung der pulmonalen Entzündungsreaktion Bedingt durch die im Lungengewebe ablaufende Entzündungsreaktion während einer Infektion mit Streptokokken der Gruppe B kann es zu der Entwicklung eines pulmonalen Hochdrucks, sowie einer bronchopulmonalen Dysplasie kommen [48]. Die pulmonale Hypertonie entwickelt sich durch ein Ungleichgewicht zwischen protektiven und agressiven Faktoren in Folge von Vasokonstriktion, Thrombose und Gefäßremodelling. Einen besonders starken Einfluss haben der Anstieg von Thromboxan und die Abnahme des protektiv wirkenden PGI 2. [18] Wir haben durch die intravenöse Gabe von B- Streptokokken eine Entzündungsreaktion hervorgerufen und anschließend die mRNA- Expression der Entzündungsparameter IL 8 und COX 2 gemessen. Gezeigt wurde das Ausmaß der Entzündung durch den Vergleich von IL 8- und COX 2- Expression im Lungengewebe in den verschiedenen Gruppen. Des Weiteren wurde der Einfluss der antiinflammatorisch wirksamen Medikamente Indometacin und Parecoxib untersucht. Während Indometacin ein unselektiver COX- Inhibitor ist, wurde die Selektivität von Parecoxib auf die COX 2 in vitro [23] und ex vivo [36] in Studien belegt. Da ein direkter Zusammenhang zwischen der Parecoxib- Dosis und der Enzyminhibition besteht [34], wurden die Tiere in unserem Modell mit einer Hochdosistherapie behandelt. In unserer Studie konnten für Indometacin und Parecoxib ein vergleichbarer Einfluss auf die Suppression der mRNA- Expression von IL 8 und COX 2 gezeigt werden. Des Weiteren konnte eine signifikante Reduktion der mRNA- Expression der Thromboxansynthase im Lungengewebe durch beide Medikamente erreicht werden. Die Untersuchung des Lungengewebes der Tiere zeigte eine gesteigerte Expression der EP 3- Rezeptoren innerhalb der mit B- Streptokokken infizierten Gruppe. Der Rezeptor vermittelt eine Vasokonstriktion und könnte so eine 39 Diskussion Rolle bei der Entwicklung der pulmonalen Hypertonie nach einer Infektion im Neugeborenenalter spielen. Durch die Gabe von Indometacin und Parecoxib konnte dieser Expressionsanstieg komplett unterbunden werden. Die verminderte Expression des Prostaglandinrezeptors unter der Gabe von Indometacin und Parecoxib könnte ein möglicher Ansatzpunkt für die pharmakologische Behandlung der pulmonalen Hypertonie sein. 5.2 Beeinflussung der Hämodynamik durch Indometacin und Parecoxib Die wichtige Rolle der Prostaglandine bei der durch B- Streptokokken verursachten Sepsis und einer folgenden pulmonalen Hypertonie wurde bereits durch verschiedene Studien aufgezeigt [15] [45] [43] [42]. Vorausgegangene Studien haben gezeigt, dass die Gabe von Indometacin eine Stabilisierung des mittleren arteriellen Druckes bei mit B- Streptokokken infizierten Schweinen bewirkt [42]. Der Beobachtungszeitraum in dieser Studie war auf 240 Minuten begrenzt [43]. In unserer Studie war der Beobachtungszeitraum durch den Tod der Tiere limitiert und somit länger angesetzt. Wir konnten so zeigen, dass der positive Effekt von Indometacin nur vorübergehend ist. Der MAD steigt 2 Stunden nach der Gabe von Indometacin deutlich an, sank dann aber zwischen 4 und 8 Stunden nach der Medikamentengabe ebenfalls ab. Alle Tiere sind nach einer Beobachtungszeit zwischen 12 und 16 Stunden gestorben, das Outcome konnte nicht verbessert werden. Auch die Gabe von Parecoxib hatte keinen stabilisierenden Einfluss auf den MAD und konnte somit das Outcome ebenfalls nicht verbessern. Im Gegensatz hierzu konnte der mittlere pulmonalarterielle Druck durch Parecoxib vorübergehend gesenkt werden. Ursächlich dafür ist möglicherweise eine durch die Infektion mit Streptokokken der Gruppe B hervorgerufene Infektion der Lunge bedingte lokale Überexpression der COX 2, der Thromboxansynthase und des EP 3- Rezeptors in der Lunge. Da durch Parecoxib eine Suppression der Genexpression der COX 2 und der Thromboxansynthase bewirkt wird ist dies eventuell auch ein Grund für das Absinken des mittleren pulmonalarteriellen Druckes. 40 5.3 Diskussion Einfluß von Indometacin und Parecoxib auf die Thromboxasynthese Der suprapubisch entnommene Urin der Tiere wurde im Anschluss an den Versuch massenspektrometrisch auf die ausgeschiedene Menge von Indexmetaboliten untersucht. Durch die Gabe von Indometacin und Parecoxib konnten unterschiedliche Ergebnisse erreicht werden. Durch Parecoxib lies sich keine Reduktion der Ausscheidung von 6- ketoProstaglandin F1α, 2, 3- dinor- 6- keto- Prostaglandin F1α, ThromboxanB2, 2, 3-dinor- Thromboxan B2 und 11- dehydro- Thromboxan B2 erreichen. Ähnliche Ergebnisse wurden auch in früheren Studien erzielt [7]. Die Gabe von selektiven COX 2- Inhibitoren hat demnach eine Abnahme von PGI 2 zur Folge, auf die Thromboxansynthese jedoch keinen Einfluss [7]. Dies lässt sich damit erklären, dass ein Großteil des Thromboxans in den Thrombozyten gebildet wird. Nur 8 Prozent der Thromboxansynthese werden durch die COX 2- Isoform vermittelt, der Rest der Synthese läuft über die COX 1 [40]. Wir nehmen darum an, dass die Inhibition der Thromboxansynthase im Lungengewebe nur einen geringen Anteil der Synthese von Thromboxan während der Sepsis ausmacht. So lässt sich erklären, warum einerseits die Expression der Thromboxansynthase- mRNA im Lungengewebe unter Parecoxib supprimiert wird, andererseits die Ausscheidung der Indexmetaboliten im Urin jedoch so hoch ist. Indometacin hingegen hemmt sowohl die COX 1, als auch die COX 2- Isoform. Deshalb kann durch dieses Medikament auch die Thromboxansynthese in den Thrombozyten beeinflusst werden. Die Ausscheidung der Indexmetaboliten im Urin konnte durch Indometacin reduziert werden. Auffällig ist außerdem ein Ungleichgewicht bei der Ausscheidung von Thromboxan B2 und 6- keto- Prostaglandin F1α unter der Therapie mit Parecoxib. Wir vermuten, dass dieses Ungleichgewicht mitverantwortlich für eine vermehrte Thrombogenität ist. 41 6 Schlussfolgerung Schlussfolgerung Bezugnehmend auf die in dieser Arbeit zu klärenden Fragen lässt sich feststellen, dass sowohl Indometacin, als auch Parecoxib der Entzündungsreaktion in der Lunge entgegenwirken. Die Expression von den untersuchten Enzymen COX 2 und Thromboxansynthase, sowie der Entzündungsmarker IL 8, konnten durch beide Medikamente in nahezu gleichem Ausmaß supprimiert werden. Eine signifikante Überlegenheit zwischen den Medikamenten konnte nicht festgestellt werden. Durch beide Medikamente konnte eine signifikante Verminderung der mRNAExpression des EP 3- Rezeptors erreicht werden. Die Suppression erfolgte durch beide Medikamente im gleichen Ausmaß. Die Entwicklung des mittleren arteriellen Druckes konnte unter Indometacin passager verbessert werden, am Ende der Untersuchung fiel jedoch der MAD auch in dieser Gruppe. Die Gabe von Parecoxib hatte auf den Abfall des MAD keinen Einfluss. Im Gegensatz dazu konnte der mittlere pulmonalarterielle Druck durch den selektiven COX 2 Inhibitor vorübergehend gesenkt werden. Während sowohl Indometacin als auch Parecoxib die Expression der Thromboxansynthase- mRNA im Lungengewebe reduzieren, kann nur durch die Gabe von Indometacin die Ausscheidung der Indexmetaboliten im Urin vermindert werden. 42 7 7.1 Quellenverzeichnis Quellenverzeichnis Literaturverzeichnis 1. Ahmadi, S., Lippross, S., Neuhuber, WL., Zeilhofer, H.U. PGE2 selectively blocks inhibitory glycinergic neurotransmission onto rat superficial dorsal horn neurons Nat Neurosci 5 2002, pp. 34– 40 2. Berner, R. Group B streptococcal infections during the neonatal period Monatsschrift Kinderheilkunde, Nummer 4/ April 2003 3. 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Intramuskulär i.v. Intravenös keto PGF1a 6- keto- Prostaglandin F1a KG Körpergewicht MAD Mittlerer arterieller Druck MPAD Mittlerer pulmonalarterieller Druck MAP Mean arterial pressure MPAP Mean pulmonal arterial pressure mRNA Messenger Ribonukleinsäure NO Stickoxid NSAR Nicht steroidale Antiphlogistika PaCO2 Arterieller Kohlenstoffdioxidpartialdruck PAF Plättchenaktivierender Faktor PaO2 Arterieller Sauerstoffpartialdruck PCR Polymerase- Ketten- Reaktion PGF1a Prostaglandin F1a PGG2 Prostaglandin G2 PGH2 Prostaglandin H2 54 Abkürzungsverzeichnis PGI2 Prostacyclin PIP Spitzendruck PEEP Positiv endexspiratorischer Druck Q- PCR Quantitative PCR RNA Ribonukleinsäure SSW Schwangerschaftswoche TBXS Thromboxan Synthase TNF α Tumornekrosefaktor α TxA2 Thromboxan A2 TxB2 Thromboxan B2 ZVD Zentralvenöser Druck 55 9 Abbildungsverzeichnis Abbildungsverzeichnis Abbildung 2–1: gram- gefärbte Streptokokken unter dem Lichtmikroskop 1 Abbildung 2–2: Pathogenesemodell der Sepsis nach X. Sáez- Llorens und G.H. Mc Cracken Jr. 1993 8 Abbildung 2–3: Synthese von PGH2 aus Arachidonsäure 10 Abbildung 2–4: Prostaglandinsynthese durch verschiedene Synthasen 10 Abbildung 2–5: Strukturformel Indometacin 13 Abbildung 2–6: Strukturformel Parecoxib 14 Abbildung 2–7: Hydrolyse von Parecoxib zu Valdecoxib 15 Abbildung 3–1: Versuchsprotokoll der Studie 21 Abbildung 3–2: Polymerasekettenreaktion 24 Abbildung 4–1: Real- time PCR- Messung der IL 8- Suppression im Lungengewebe: IL 8- mRNA bezogen auf das Housekeeping Gen HPRT 26 Abbildung 4–2: Real- time PCR Messung der COX 2- Suppression im Lungengewebe: COX 2- mRNA bezogen auf das Housekeeping Gen HPRT 27 Abbildung 4–3: Messung der Suppression der Thromboxansynthase 28 Abbildung 4–4: Messung der Suppression des Prostaglandinrezeptors E 329 Abbildung 4–5: Messung des mittleren arteriellen Druckes in der Arteria femoralis 31 Abbildung 4–6: Messung des mittleren pulmonalarteriellen Druckes 33 Abbildung 4–7: Messung von Thromboxan B2 im Urin 34 Abbildung 4–8: Messung von 2, 3- dinor- Thromboxan B2 im Urin 35 Abbildung 4–9: Messung von 11- dehydro- Thromboxan B2 im Urin 36 Abbildung 4–10: Messung von 6- keto Prostaglandin F1α im Urin 37 Abbildung 4–11: Messung von 2,3- dinor- 6- keto- Prostaglandin F1α im Urin 37 56 10 Anhang 10.1 Anhang 1: Erlaubnis Tierschutzkomission Anhang 57 Danksagung 11 Danksagung An dieser Stelle möchte ich mich bei Frau Dr. med. S. Nögel bedanken, die meine Promotionsarbeit betreut hat. Besonders danke ich außerdem meinen Eltern, Maximilian, Sebastian und Benjamin, die mich im Laufe meines Studiums unterstützt haben und mir nun während meiner Weiterbildungszeit zur Seite stehen. 58 Lebenslauf 12 Lebenslauf Persönliche Daten Name Julia Elfriede Astrid May Geburtstag 21.06.1984 in Arnstadt Familienstand Ledig Eltern Dipl. - Ing. Holger May Dipl. - Med. Astrid May Geschwister Zwei Brüder Schulbildung 1994 – 2002 Neideck - Gymnasium Arnstadt Studienverlauf 04/2003 Immatrikulation zum Studium der Humanmedizin an der Friedrich- Alexander Universität Erlangen/Nürnberg Seit 05/2005 Mitarbeit im „NeoLab“ der Universität Erlangen- Nürnberg Seit 01/2006 Dissertation im „Neolab“ der Universität ErlangenNürnberg Thema: Suppression von Interleukin 8, Cyclooxygenase 2, Prostaglandin E 3 und Prostaglandinen durch Parecoxib und Indometacin im Tiermodell der neonatalen BStreptokokkensepsis Leitung: Herr Prof. Dr. med. Dr. h. c. W. Rascher, Projektleitung: Herr PD Dr. med. M. Kandler 09/2005 Physikum 11/2009 2. Ärztliche Prüfung und Approbation als Ärztin Exmatrikulation 59 07/2011 Lebenslauf Anzeige über die Annahme als Doktorandin und Antrag auf Zulassung zum Promotionsverfahren Berufserfahrung 09/2002 Praktikum Chirurgie Kreiskrankenhaus Arnstadt Betreuung: Pflegedienstleiterin Frau Uta Kessel 10/2002- Krankenpflegepraktikum Chirurgie 11/2003 Kreiskrankenhaus Arnstadt; Betreuung: Pflegedienstleiterin Frau Uta Kessel 01/2003- Freiwilliges ökologisches Jahr 03/2003 Thüringer ÖKO- Herz e.V. 08/2005- Studentische Nebentätigkeit als Hostess und Chef- 06/2008 hostess Messen, Tagungen und andere Veranstaltungen Inter Cris Messeagentur GmbH 02/2006- Famulatur Gynäkologie und Geburtshilfe 03/2006 Praxis für Gynäkologie und Geburtshilfe Arnstadt Betreuung: Facharzt Herr Ullrich Endisch 08/2006- Famulatur Pädiatrie 09/2006 Klinik für Kinder- und Jugendmedizin der Ilm- Kreis- Kliniken Arnstadt- Ilmenau GmbH Betreuung: Chefarzt Herr Dr. med. D. Stein 02/2007- Famulatur Neurorehabilitation 03/2007 MediClin Hedon- Klinik, Fachklinik für Physikalische Medizin und Rehabilitation - neurologische Frührehabilitation Lingen (Ems) Betreuung: Chefarzt Herr Prof. Dr. med. Th. Mokrusch 60 03/2007 Lebenslauf Famulatur Notfallmedizin Notfallambulanz der Ilm- Kreis- Kliniken Arnstadt- Ilmenau Betreuung: Leiter der Krankenhausaufnahme Facharzt Herr Steffen Friese 07/2007- Famulatur Notfallmedizin 08/2007 Notfallambulanz der Ilm- Kreis- Kliniken Arnstadt- Ilmenau Betreuung: Leiter der Krankenhausaufnahme Facharzt Herr Steffen Friese 08/2007 Famulatur Anästhesie Abteilung für Anästhesie und Intensivmedizin des Wilhelminenspitals Wien Betreuung: Oberarzt Herr Dr. med. W. Hartmann 07/2008- Zusatzfamulatur Pädiatrie 08/2008 Klinik für Kinder- und Jugendmedizin der Ilm- Kreis- Kliniken Arnstadt- Ilmenau GmbH Betreuung: Chefarzt Herr Dr. med. D. Stein 08/2008- PJ Pädiatrie 10/2008 Kinder- und Jugendklinik, Universitätsklinikum Erlangen Pädiatrische Nephrologie Betreuung: Oberarzt Herr Prof. Dr. med. J. Dötsch 10/2008- PJ Pädiatrie 12/2008 Kinder- und Jugendklinik, Universitätsklinikum Erlangen Neonatologische Abteilung Betreuung: Oberarzt Herr PD Dr. med. M. Schroth 12/2008- PJ Innere Medizin 03/2009 Innere Abteilung der Kreisklinik Ottobeuren Aufnahme- und Normalstation Betreuung: Chefarzt Herr Dr. med. W. Pflederer 61 Lebenslauf 03/2009- PJ Chirurgie 07/2009 Chirurgische Abteilung der Kreisklinik Ottobeuren Abteilungen für Allgemein- und Visceralchirurgie, Unfallund Orthopädische Chirurgie Betreuung: Chefärzte Prof. Dr. med. U. Baumgartner und Dr. med. S. Fritz 01/2010- Ärztin in Weiterbildung Vestische Kinder- und Jugendklinik Datteln Ärztlicher Direktor: Prof. Dr. med. M. Paulusen Seminare und Kurse 10/2005 Einführung in die Versuchstierkunde und tierexperimentelle Technik 09/2010 GCP- Kurs für Prüfärzte und Studienassistenz Sonstige Qualifikationen • Sprachen: Englisch, Französisch Grundkenntnisse • EDV-Kenntnisse • Führerschein Klassen: B, M, L Essen, den 27. November 2011