Dokument_29.

Aus der Klinik mit Poliklinik für Kinder und Jugendliche der
Friedrich-Alexander-Universität Erlangen-Nürnberg
Direktor: Prof. Dr. med. Dr. h. c. W. Rascher
Suppression von Interleukin 8, Cyclooxygenase 2, Prostaglandin E 3Rezeptor und Prostaglandinen durch Parecoxib und Indometacin im
Tiermodell der neonatalen B- Streptokokkensepsis
Inaugural-Dissertation
zur Erlangung der Doktorwürde
der Medizinischen Fakultät
der Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
vorgelegt von Julia May
aus Arnstadt
Gedruckt mit Erlaubnis der
Medizinischen Fakultät der
Friedrich-Alexander-Universität
Erlangen-Nürnberg
Dekan:
Prof. Dr. med. Dr. h.c. J. Schütter
Referent:
Prof. Dr. med. Dr. h.c. W. Rascher
Korreferent:
PD Dr. med. M. Kandler
Tag der mündlichen Prüfung: 25. November 2011
Widmung
Den Tieren, ohne die diese Arbeit nicht möglich gewesen wäre.
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1
Zusammenfassung
3
1.1
Zusammenfassung (deutsch)
3
1.2
Abstract (englisch)
4
2
Einleitung
1
2.1
B- Streptokokken- Sepsis bei Neugeborenen
1
2.1.1
Streptokokken im Überblick
1
2.1.2
B- Streptokokken
2
2.1.3
Definition Sepsis
3
2.1.4
Neonatale B- Streptokokkensepsis
4
2.1.5
Pathogenese und Physiologie der neonatalen B- StreptokokkenSepsis
6
2.2
Prostaglandine
9
2.2.1
Prostaglandinsynthese
9
2.2.2
Prostaglandin E 3- Rezeptor und pulmonalarterieller Druck
12
2.2.3
Medikamentöse Beeinflussung der Synthese von Prostaglandinen
13
2.2.3.1
Indometacin
13
2.2.3.2
Parecoxib
14
2.3
Zytokine
16
2.3.1
Interleukin 8
16
2.4
Ziel der vorliegenden Arbeit
17
3
Material und Methoden
18
3.1
Tierexperimentelle Präparationen
3.2
Einteilung in Gruppen und weitere Maßnahmen gemäß Protokoll
19
3.3
Medikamentöse Therapie
19
3.4
Monitoring
20
3.5
Bestimmung der Prostaglandin- Metabolite im Urin
22
3.6
Polymerasekettenreaktion
22
3.6.1
Quantitative Polymerasekettenreaktion
24
4
Ergebnisse
18
26
4.1
Einfluss auf den Entzündungsvorgang im Lungengewebe
26
4.1.1
Suppression von Interleukin 8 durch Parecoxib und Indometacin
26
Inhaltsverzeichnis
4.1.2
Suppression der Cyclooxygenase 2 durch Indometacin und
Parecoxib
27
4.1.3
Suppression der Thromboxansynthase durch Indometacin und
Parecoxib
28
4.1.4
Einfluss von Indometacin und Parecoxib auf den
Prostaglandinrezeptor E 3
28
4.2
Hämodynamische Parameter
29
4.2.1
Einfluss von Indometacin und Parecoxib auf den mittleren
arteriellen Druck
29
Einfluss von Indometacin und Parecoxib auf den mittleren
pulmonalarteriellen Druck
31
4.2.3
Überleben der Tiere
33
4.3
Messung der Prostaglandinausscheidung im Urin
33
4.3.1
Thromboxan B2
33
4.3.2
2, 3- dinor- Thromboxan B2
35
4.3.3
Messung der Konzentration von 6- keto- Prostaglandin F1 α und 2,
3- dinor- 6- keto- Prostaglandin F1 α im Urin
36
4.2.2
5
Diskussion
38
5.1
Hemmung der pulmonalen Entzündungsreaktion
38
5.2
Beeinflussung der Hämodynamik durch Indometacin und
Parecoxib
39
Einfluß von Indometacin und Parecoxib auf die
Thromboxasynthese
40
5.3
6
Schlussfolgerung
41
7
Quellenverzeichnis
42
7.1
Literaturverzeichnis
42
7.2
Verzeichnis der Internetquellen
51
8
Abkürzungsverzeichnis
52
9
Abbildungsverzeichnis
55
10
Anhang
56
10.1
Anhang 1: Erlaubnis Tierschutzkomission
56
11
Danksagung
57
12
Lebenslauf
58
Zusammenfassung
1
1.1
Zusammenfassung
Zusammenfassung (deutsch)
Hintergrund und Ziele
Die Infektion mit B- Streptokokken im Neugeborenenalter kann zu dem
Krankheitsbild der neonatalen B- Streptokokkensepsis führen. Anfangs sehr
unspezifische Symptome wie Blässe, Lethargie und reduzierte periphere
Durchblutung führen zu einer raschen Progredienz und zum Schock und erfordern eine frühzeitige effektive Therapie, um das Behandlungsergebnis zu
verbessern. Ziel der Arbeit war es, die Wirkung einer Hemmung der
Prostaglandinsynthese auf den Verlauf der experimentellen B- Streptokokkensepsis am Tiermodell zu untersuchen. Die Hemmung der Prostaglandinsynthese erfolgte mit Indometacin und dem spezifischen Cyclooxygenase 2
Inhibitor Parecoxib. Neben der Hämodynamik wurden die Entzündungsmediatoren Interleukin 8, Cyclooxygenase 2, der Prostaglandinrezeptor E 3 und
verschiedene Prostaglandine im Urin untersucht.
Methoden
Neugeborene Schweine wurden unter Narkose nach Anlage von Kathetern
zur intraarteriellen Messung des mittleren arteriellen Blutdruckes, des mittleren pulmonal arteriellen Druckes und nach Anlage eines Blasenkatheters in 4
Gruppen randomisiert (Infektion mit Streptokokken der Gruppe B, Infektion
mit Streptokokken der Gruppe B + Indometacin, Infektion mit Streptokokken
der Gruppe B + Parecoxib, Kontrollgruppe ohne Infektion und Therapie).
Während des Versuches wurde invasiv der MAD und der MPAD gemessen.
Am Ende des Versuches wurden die Tiere getötet, Lungengewebe zur Isolierung der Genaktivität (mRNA) verschiedener Entzündungsmarker entnommen und mittels quantitativer PCR gemessen. Zudem wurden Prostaglandinmetabolite im Urin der Tiere massenspektrometrisch quantifiziert.
Zusammenfassung
Ergebnisse und Beobachtungen
Die Untersuchungen an dem entnommenen Lungengewebe zeigten, dass
die Gabe von Indometacin beziehungsweise Parecoxib sowohl die Expression der IL 8 und EP 3- mRNA, als auch von COX 2- mRNA und der Thromboxansynthese supprimiert. Im Urin zeigte sich, dass beide Medikamente die
Ausscheidung der Prostaglandine unterschiedlich beeinflussen. Auf die Ausscheidung des Thromboxans hatte Parecoxib im Vergleich zu Indomentacin
keinen Einfluss. Weder Indometacin noch Parecoxib konnten den Abfall des
MAD längerfristig verhindern, aber sie senkten den MPAD.
Praktische Schlussfolgerungen
Beide Medikamente haben sowohl auf die Hämodynamik, als auch auf die
Entzündungsreaktion der Lunge einen positiven Einfluss, verhindern aber
nicht den Abfall des system- arteriellen Blutdrucks. Während durch die Anwendung von Indometacin und Parecoxib eine vergleichbare Hemmung des
Prostaglandinrezeptors E 3 erfolgt und der MPAD abgesenkt wurde, bewirkt
nur die Gabe von Indometacin eine deutliche Inhibition der Thromboxansynthese.
1.2
Abstract (englisch)
Background
Group B streptococcus infections in the neonatal period can cause a severe
sepsis. Initially, unspecific symptoms such as pallor, lethargy and decreased
peripheral blood flow lead to a rapid progression and shock and make an
early effective therapy to improve outcomes necessary. The purpose of the
study was to determine the effect of the inhibition of prostaglandin synthesis
on the course of the experimental B streptococci sepsis in animal models.
Inhibition of prostaglandin synthesis was carried out with Indomethacin and
specific COX 2 inhibitor Parecoxib. In addition to the hemodynamics, inflammatory mediators such as IL 8, COX 2, EP 3 receptor and various prostaglandins in the urine were examined.
Zusammenfassung
Methods
Newborn piglets under anesthesia were randomized into different groups (infection with streptococcus group B, infection with streptococcus group B +
indomethacin, infection with streptococcus group B + parecoxib and control
group without infection and therapy). Due to monitoring of MAP, MPAP and
urine, the piglets got catheters for invasively measurement. After the observation time all pigs were killed and lung tissue for the isolation of the gene
expression (mRNA) of various inflammatory markers was taken and measured by quantitative PCR. In addition prostaglandin metabolites in the urine
were quantified by mass spectrometry.
Results
The COX 2, EP 3 and IL 8- mRNA expression in lung tissue were quantified
by TaqMan PCR. Indomethacin and Parecoxib prevented the increase of the
mRNA expression of all markers as well. The urine analysis demonstrated
that the drug effect on thromboxane metabolites differed. Parecoxib treatment did not affect thromboxane formation. After intravenous infusion of GBS
MAP decreased continously, neither Indometacin nor Parecoxib could prevent arterial hypotension. The infection induced rise of MPAP however was
prevented by both pharmaceuticals.
Conclusions
Both drugs had a positive influence on the pulmonal hemodynamics, as well
as the prevention of the inflamemation of the lungs. On the other hand both
could not avoid the decrease of system- arterial blood pressure. While during
the application of Indomethacin and Parecoxib a comparable inhibition of the
EP 3 receptor and the MPAD were achieved, only the application of indomethacin caused a significant inhibition of thromboxane synthesis.
1
2
Einleitung
Einleitung
2.1
2.1.1
B- Streptokokken- Sepsis bei Neugeborenen
Streptokokken im Überblick
Streptokokken sind grampositive unbewegliche, katalasenegative Kokken.
Sie besitzen eine kugelige bis eiförmige Gestalt, sind in gewundenen Ketten
angeordnet und nicht zur Sporenbildung befähigt [10].
Abbildung 2–1:
gram- gefärbte Streptokokken unter dem Lichtmikroskop
Quelle: [54]
Die meisten Bakterien dieser Art gehören zur physiologischen Flora der
menschlichen Haut und Schleimhaut, können jedoch auch pathogen wirken.
Die Einteilung erfolgt nach einer Klassifikation, die neben dem Hämolyseverhalten und der Antigenstruktur auch den Sauerstoffbedarf berücksichtigt.
Im Bezug auf die unterschiedlichen Gattungen differenziert man
•
pyogene hämolysierende Streptokokken
•
orale Streptokokken
•
Pneumokokken
•
Laktokokken
•
anaerobe Streptokokken
•
und andere Streptokokken.
2
Einleitung
Einige Arten benötigen zum Wachsen 5 bis 10 Volumenprozent CO2. Allen
humanpathogenen Streptokokken ist das Wachstum bei 37°C gemein. [10].
Das Hämolyseverhalten ist von besonderer Bedeutung für den Nachweis der
fakultativ anaeroben Kokken. Pneumokokken weisen ein vergrünendes, auch
α- Hämolyse genanntes Verhalten auf. Bei intakter Erythrozytenmembran
kommt es unter der Freisetzung von H2O2 zur Hämoglobinreduktion. Es bilden sich biliverdinähnliche Substanzen, die für den gräulich- grünen Farbhof
um die Kolonie verantwortlich sind [10].
Zur vollständigen Auflösung der Erythrozyten kommt es bei Streptokokkenkolonien, die Hämolysine absondern. Streptococcus pyogenes (A- Streptokokken) und Streptococcus agalactiae (B- Streptokokken) gehören zu dieser
Gruppe der β- hämolysierenden Streptokokken. Hier zeigt sich auf dem sich
auf dem Agar ein klarer durchscheinender Hof [10].
Bei Streptokokken, die kein Hämolyseverhalten aufweisen, spricht man von
γ- Hämolyse [10].
Die serologische Einteilung geht auf Rebecca C. Lancefield zurück. Sie schuf
eine Klassifikation aufgrund des Antigenmusters der Zellwandbestandteile.
Die bedeutendste Rolle spielt ein Polysaccharid, die sogenannte CSubstanz. Dieses Polysaccharid wird mit Hilfe von Antikörpern als Antigen
identifiziert und kann so eingeteilt werden. Nach der Lancefield- Gruppierung
lassen sich die Streptokokken in die Serogruppen A bis W und die Streptokokken ohne Gruppenantigen typisieren [10].
2.1.2
B- Streptokokken
Die B-Streptokokken sind primär tierpathogene Bakterien, die von einer Polysaccharidkapsel umgeben sind. Sie sind jedoch auch beim Menschen in
der Lage, Wund- und Harnwegsinfekte hervorzurufen. Eine besondere Bedeutung haben sie in der Geburtshilfe und Pädiatrie, da sie bei maternaler
Scheidenbesiedlung in den meisten Fällen bereits intrauterin über kolonisiertes Fruchtwasser [56], oder intrapartal auf das Kind übergehen können und
so zu Sepsis, Pneumonie, Osteomyelitis und Meningitis führen können [12],
[10]. In 10 – 30 Prozent erfolgt der Nachweis von Streptokokken der Gruppe
3
Einleitung
B als Teil der physiologischen Flora im Anogenitalbereich symptomloser
Schwangerer. Nach neuen Studien liegt die Durchseuchungsrate in Deutschland bei 16 Prozent [30], [3]. Seit etwa 1970 zählen die invasiven Infektionen
mit Streptokokken der Gruppe B zu den Häufigsten im Neugeborenenalter
[6].
Der kulturelle Nachweis der Bakterien kann aus Blut, Liquor und Sekreten
erfolgen [10].
2.1.3
Definition Sepsis
1989 definierte Roger C. Bone die Sepsis „als eine Invasion von Mikroorganismen und/ oder ihrer Toxine in den Blutstrom zusammen mit der Reaktion
des Organismus auf diese Invasion“1. Diese Definition wurde 1991 durch die
Konsensus-Konferenz des American College of Chest Physicans und der
Society of Critical Care Medicine erweitert [68]. So spricht man heute von einer Sepsis, wenn als systemische Antwort auf eine Infektion mindestens zwei
der folgenden Kriterien zu treffen
•
Temperatur > 38°C oder < 36°C
•
Herzfrequenz > 90/min
•
Atemfrequenz > 20/min
•
der PaCO2 < 32 mmHg
•
Leukozyten > 12 000/µl oder < 4 000/µl
•
> 10 Stabkernige [65].
Ursache für die Sepsis ist in den meisten Fällen die Streuung der Erreger
über die Blutbahn von einem Infektionsherd ausgehend. Diesen Fokus zu
diagnostizieren und zu sanieren wird größte Bedeutung beigemessen. Neben
der Blutbahn können auch Hohl- und Weichteilorgane, sowie das Lymphsystem Wege für die septische Streuung bieten [38].
1
R.C. Bone,1989, www.sepsis-gesellschaft.de
4
2.1.4
Einleitung
Neonatale B- Streptokokkensepsis
Eine Sepsis wird bei Neugeborenen klinisch diagnostiziert, die Blut- oder Liquorkultur ist nur in 0,05 Prozent positiv. [2]. Beim Neugeborenen gelten folgende Symptome als Hinweis auf eine Sepsis
•
schlechter Allgemeinzustand mit Trinkschwäche, Thermoinstabilität und
Berührungsempfindlichkeit
•
Tachykardie um 180/min, Blässe, Hypotonie mit Zentralisation und
schlechter Hautperfusion sowie einer Rekapilarisierungszeit > 3 Sekunden
•
thorakale Einziehungen, Stöhnen, Apnoe, Dys- oder Tachypnoe und ein
erhöhter Sauerstoffbedarf beim reifen Neugeborenen
•
Blässe, Zyanose, Petechien, Abszesse, Ikterus, Omphalitis, Paronychie,
Ödeme an Haut oder Weichteilen
•
geblähtes Abdomen, Erbrechen, verzögerte Magenpassage, Obstipation,
Diarrhoe, fehlende Darmgeräusche, Nahrungsverweigerung
•
Lethargie, Irritabilität, gespannte Fontanelle, Krampfanfälle, Hypo- oder
Hypertonie der Muskulatur. [38], [47], [30]
Manifeste Schockzeichen wie Blutdruckabfall, grau-blasses Kolorit und metabolische Azidose sind als Finalzeichen der Sepsis zu werten [47].
Die Inzidenz der neonatalen B- Streptokokken- Sepsis beträgt 0,47/1000 Lebendgeborene [12], [13]. Definitionsgemäß wird bei der neonatalen BStreptokokkensepsis zwischen der early- und der late- onset Sepsis unterschieden. Die frühe Form tritt bei 0,28/1000 lebenden Neugeborenen innerhalb der ersten 3 Lebenstagen, im Mittel bereits innerhalb der ersten 20 Lebensstunden [12], [3], auf. Verantwortlich sind in diesem Fall Streptokokken
der Gruppe B mit den Kapseltypen I bis III, die aus der Vaginalflora der Mutter stammen [12]. Reife Neugeborene infizieren sich direkt nach der Geburt
mit einer Häufigkeit von 0,5 bis 1 Prozent. Bei Frühgeborenen erhöht sich
das Risiko auf 15- 20 Prozent und extreme Frühgeborene haben ein Erkrankungsrisiko von fast 100 Prozent [30]. Die Unreife des Immunsystems [27]
sowie die fehlende Leihimmunität durch die Mutter [9] spielen eine besondere Rolle. Die Kinder fallen durch schwer verlaufende Infektionen und Pneumonien auf. Fulminante Krankheitsverläufe sind bekannt, die Mortalität liegt
5
Einleitung
bei 4 Prozent. Des Weiteren besteht das Risiko neurologischer Folgeschäden, insbesondere bei einer Streptokokkenmeningitis [12].
Der late- onset type ist eine Infektion mit dem Kapseltyp III und präsentiert
sich häufig als Meningitis. Diese Form tritt mit einer Inzidenz von 0,19/1000
Lebendgeborene auf [12].
Es sind Risikofaktoren bekannt, die die Infektion eines Neugeborenen begünstigen.
Dazu zählen:
•
der Nachweis von B-Streptokokken im maternalen Genital- und Rektalbereich zum Zeitpunkt der Entbindung [30], [56]
•
vorzeitiger Blasensprung als Hinweis auf ein Amnioninfektionssyndrom [30]
•
mehr als 18 Stunden zwischen dem Blasensprung und der Entbindung
[30], [56]
•
Fieber der Mutter unter der Geburt [30], [56]
•
Frühgeburt vor der 37. Woche [30], [56]
•
GBS- Bakteriurie der Mutter während der Schwangerschaft [41], [56]
•
Zustand nach Geburt eines Neugeborenen mit B-Streptokokkeninfektion
[30] , [56]
Bei einem positiven B- Streptokokken- Testergebnis erkranken 0,5- 1 Prozent der Neugeborenen, soweit kein weiterer Risikofaktor auftritt. Im Fall eines zusätzlich auftretenden Amnioninfektionssyndroms steigt das Risiko einer postpartalen Infektion um den Faktor 5- 10 [47].
Die Deutsche Gesellschaft für Perinatale Medizin, sowie die Deutschen Gesellschaft für Gynäkologie und Geburtshilfe, empfiehlt alle Schwangeren zwischen der 35. und 37. SSW auf B- Streptokokken zu untersuchen. Hierzu erfolgt ein vaginaler und rektaler Abstrich. Ist das Testergebnis positiv, so wird
eine Chemoprophylaxe vom Wehenbeginn bis zur Geburt des Kindes empfohlen. Liegt bei Wehenbeginn kein Ergebnis vor, das weniger als 5 Wochen
alt ist, so wird eine Chemoprophylaxe auch in folgenden Situationen empfohlen:
6
•
Frühgeburt vor vollendeter 37. SSW
•
Blasensprung vor mehr als 8 Stunden
•
maternales Fieber über 38°C.
Einleitung
Kinder, die nach der Geburt Zeichen einer Infektion bieten, müssen unabhängig von der Risikokonstellation diagnostiziert und behandelt werden [56].
2.1.5
Pathogenese und Physiologie der neonatalen B- Streptokokken- Sepsis
„Der menschliche Organismus reagiert auf eine durch ein bestimmtes Agens
hervorgerufene Schädigung des Gewebes mit einer lokalen und systemischen Entzündungsreaktion.“2 Der Antigenkontakt führt rasch zu einer Freisetzung von Mediatoren, zu denen neben dem Komplementsystem vor allem
Cytokine und akut-Phase- Proteine gehören. Im Verlauf werden sekundäre
Mediatoren, wie PAF, Leukotriene, Prostaglandine, freie Sauerstoff- und
Stickstoffradikale, freigesetzt. Diese „führt zu Durchblutungsstörungen,
Transsudation, Transmigration und Exsudation sowie zu einer vermehrten
Zellproliferation der lokalen Zellverbände“3.
Gleichzeitig werden aber auch antiinflammatorische Substanzen gebildet.
Hierzu zählen lösliche TNF α-Rezeptoren, IL 1- Rezeptorantagonisten, IL 4
und IL 10. Es kommt aufgrund der Immunantwort des Organismus zu einer
Beeinträchtigung wesentlicher Körperfunktionen. Die Expression des tissue
factor´s auf Monozyten, neutrophilen Granulozyten und Endothelzellen führt
zur Aktivierung des Gerinnungssystems. Außerdem werden physiologische
Antikoagulantien, unter anderem Antithrombin III, inhibiert. Es folgt eine
schwere disseminierte intravasale Gerinnung. [30]
Adhäsionsmoleküle für Leukozyten werden von Endothelzellen gebildet.
Kommt es zum Kontakt der Adhäsionsmoleküle mit der Endothelzelloberfläche, bewirkt dies eine Aktivierung der Leukozyten und führt so zur Freisetzung zytotoxischer Substanzen. Die Substanzen wirken einerseits antimikrobiell, schädigen aber andererseits auch die Endothelzellen selbst. Diese
2
3
Pschyrembel, W., (2002), Pschyrembel Klinisches Wörterbuch, 259. Auflage, De Gruyter
Pschyrembel, W., (2002), Pschyrembel Klinisches Wörterbuch, 259. Auflage, De Gruyter
7
Einleitung
Schäden veranlassen Störungen in der Mikrozirkulation und die Ausbildung
eines Kapillarlecks. Intravasale Flüssigkeit kann so in das Interstitium austreten. In Folge der Flüssigkeitsverschiebung kann es zu einem immensen
intravasalen Volumenmangel kommen [30].
Ebenfalls stimuliert wird die Bildung von NO durch die endotheliale NO- Synthetase. NO hat starke vasodilatatorische Eigenschaften. Im septischen
Schock kommt es, bedingt durch die Vasodilatation, zur Senkung der kardialen Vorlast und somit zur arteriellen Hypotension. Dies verstärkt den Effekt,
den der ausbleibende venöse Rückstrom durch den Flüssigkeitsverlust über
das Kapillarleck hat. Auf Grund der daraus folgenden Mikrozirkulationsstörung mit reduzierter Perfusion und sinkender O2- Versorgung bei zeitgleich
steigendem Bedarf kommt es zur vermehrten Katecholaminausschüttung, um
so die Oxygenierung zu gewährleisten. Das Herzzeitvolumen wird so gesteigert. Auf die frühe Phase des septischen Schocks folgt eine späte Phase.
Diese ist dadurch gekennzeichnet, dass das durch das gesteigerte Herzzeitvolumen die Verteilungsstörung nicht kompensiert werden kann [30].
Im Rahmen eines septischen Geschehens kann es außerdem zur Ausbildung eines ARDS kommen. In Folge der gesteigerten Kapillarpermeabilität
bildet sich ein interstitielles Lungenödem. Es kommt zur Zerstörung der
Pneumozyten und zum Surfactantmangel. Die verminderte Entfaltung der
Alveolen bedingt die Entstehung eines alveolären Ödems, die Bildung hyaliner Membranen, Mikroatelektasen und intrapulmonaler Shunts. Letztendlich
kommt es in Folge von Endothelproliferation und zunehmender Fibroblastentätigkeit zur Ausbildung einer Lungenfibrose [18].
Folge der unterschiedlichen Organdysfunktionen ist im extremsten Fall ein
Multiorganversagen, welches die häufigste Todesursache bei septischen Patienten darstellt [68].
8
Abbildung 2–2:
Einleitung
Pathogenesemodell der Sepsis nach X. Sáez- Llorens und G.H. Mc Cracken Jr. 1993
Quelle: [29]
Gerade bei den invasiven neonatalen Infektionen wird der Kapsel der BStreptokokken eine bedeutende Rolle zugeordnet. Um die verschiedenen
Kapseltypen (Ia, Ib, Ic, II- IV) zu erkennen und zu opsonieren, müssen für
den jeweiligen Typ spezifische Antikörper vorhanden sein. Mütter infizierter
Neugeborener fallen durch besonders niedrige Antikörperspiegel gegen den
jeweiligen speziellen Kapseltyp auf. Der passive maternale Schutz reicht also
nicht aus, um das Kind vor einer Infektion zu schützen. Rezeptoren des angeborenen Immunsystems des Kindes erkennen Zellbestandteile und andere
lösliche Faktoren der Bakterien und lösen die oben beschriebene Kaskade
aus. Ausschlaggebend für das Ausmaß der Infektion ist die Reife des Kindes.
Je unreifer das Neugeborene und somit auch das T- Zellsystem des Kindes
ist, umso höher ist das Infektionsrisiko. Hinzu kommt, dass Frühgeborene
diaplazentar nur ungenügend humorale Antikörper übertragen bekommen.
9
Einleitung
Somit ist die Erregeropsonierung als Grundlage für die Phagozytose vermindert. Gerade Frühgeborene jedoch imponieren dadurch, dass sie trotz septischen Krankheitsverlaufes wenig Symptome bieten [2], [25], [47].
Im Rahmen zahlreicher Studien wurden in den letzten Jahren sowohl die Pathogenese des respiratorischen Versagens, als auch die des kardialen
Versagens und die damit verbundene Hypotension untersucht. So konnte
unter anderem herausgefunden werden, dass nach einer intravenöser Applikation von Streptokokken der Gruppe B ein deutlicher Anstieg von Thromboxan im Serum verschiedener Tiere zu verzeichnen ist [15]. Der Thromboxananstieg im Serum wird durch die Phospholipide der Bakterienmembran bedingt [8] und steht im Zusammenhang mit der im weiteren Verlauf entstehenden pulmonalen Hypertension. In früheren Studien wurde bereits der hemmende Einfluss von Indometacin auf die Entstehung einer pulmonalen Hypertension und systemischer Hypotension gezeigt [34].
2.2
2.2.1
Prostaglandine
Prostaglandinsynthese
Prostaglandine spielen als Mediatoren der Schmerzsensibilisierung, von inflammatorischen Reaktionen und bei der Entstehung von Fieber eine wesentliche Rolle in der systemischen Reaktion des Körpers auf einen infektiösen
Herd.
Grundsubstanz des Syntheseweges ist die Arachidonsäure. Diese wird,
durch die Phospholipase A2, aus Membranlipiden katalysiert. In einem zweiten Schritt wird aus Arachidonsäure Prostaglandin G2 [31]. Die Cyclooxygenasen sind hier das wesentliche und geschwindigkeitsbestimmende Enzym
und somit der Angriffspunkt für nichtsteroidale Antiphlogistika. Im nächsten
Schritt wird dann durch eine Peroxidase aus PG G2 das PG H2 [5], [32].
10
Abbildung 2–3:
Einleitung
Synthese von PGH2 aus Arachidonsäure
Quelle: [62]
Die verschiedenen Prostaglandine unterscheiden sich nur noch durch unterschiedliche Stellungen der Hydroxyl- und Ketongruppen, die in das PG H2
eingebaut werden [19], [31].
Abbildung 2–4:
Prostaglandinsynthese durch verschiedene Synthasen
Quelle: [62]
11
Einleitung
Die Cyclooxygenasen liegen in verschiedenen Isoformen vor. Bekannt sind
die Formen COX 1, COX 2 und COX 3, wobei die COX 3 als Variante der
COX 1 betrachtet wird. [59], [5].
Die COX 1 liegt in vielen Zellen konstitutiv vor und ist ständig aktiv. In den
Thrombozyten kommt ausschließlich COX 1 vor. Während auch in normalen
Blutgefäßen fast ausschließlich die COX 1 lokalisiert ist, kommt in den Endothelzellen proliferierender Blutgefäße, in entzündetem Gewebe und in atherosklerotischen Läsionen auch die COX 2 vor. In der Nierenrinde und im Nierenmark ist ebenfalls die COX 1 vorherrschend. Hier ist die Bildung von
Prostaglandin E2 und Prostacyclin maßgebend für die Nierendurchblutung
und die glomeruläre Filtrationsrate [32], [5].
Die COX 2 wird durch Leukozyten, Makrophagen und Entzündungsmediatoren wie TNFα oder Interleukin 1β sowie durch Lipopolysaccharide in Zellen
als Reaktion auf eine Noxe innerhalb von Stunden aktiviert. Die von dieser
Isoform produzierten Prostaglandine fördern die Entzündungsreaktion. Sie
führen über eine Vasodilatation zu einer erhöhten Gefäßpermeabilität und
somit zu einem vermehrten Flüssigkeitsaustritt. Hinzukommend werden die
Schmerzrezeptoren in dem betroffenen Gebiet sensibilisiert. Pyrogene, die
durch den Zerfall von Bakterien freigesetzt werden, vermehren im cerebralen
Wärmezentrum die Bildung von PG E2, dies hat eine Erhöhung des Temperatursollwertes zur Folge [32], [5], [16].
Der Abbau der verschiedenen Prostaglandine erfolgt nach relativ kurzer
Halbwertszeit von 1 Minute durch verschiedene Enzyme. Beteiligt an der Inaktivierung sind insbesondere die 15- Hydroxyprostaglandindehydrogenase
und die ∆13- Reduktase. Der weitere Abbau findet im Rahmen der β- Oxidation statt [31], [62].
Des Weiteren entsteht aus PG H2 durch die Wirkung der Thromboxansynthase Thromboxan A2. Die Thromboxansynthase ist ein Enzym, von dem
angenommen wird, dass es der COX 1 folgt und somit durch die selektiven
COX 2- Inhibitoren nicht beeinflusst werden kann. Tx A2 wird von Thrombozyten freigesetzt und ist verantwortlich für Vasokonstriktion, Bronchokonstriktion und Thrombozytenaggregation. Die Synthese kann über die Metabolitausscheidung im Urin gemessen werden. Der Anstieg der Metabolite im Urin
12
Einleitung
ist typisch für die durch B- Streptokokken bedingte pulmonale Hypertension.
[28]
2.2.2
Prostaglandin E 3- Rezeptor und pulmonalarterieller Druck
Postpartal sinkt der Lungengefäßwiderstand in den ersten Tagen bis Wochen
durch die Dilatation der Muskulatur, vor allem präkapillär. Der Druck in der
Lungenstrombahn ist dann mit einem Mitteldruck von 13mmHg deutlich geringer als der im Körperkreislauf. Die Gefäße der Lunge sind dünnwandiger
und weisen deutlich weniger glatte Muskulatur auf. Sie sind so viel dehnbarer
und zeigen einen sehr geringen Strömungswiderstand [24], [30].
Bedingt durch eine Infektion kann es zu einer erneuten Konstriktion der Lungengefäße kommen. Der pulmonale Gefäßwiderstand steigt infolge dessen
und der Blutdruck im Lungenkreislauf wird erhöht. Bleibt der Druck über einen längeren Zeitraum erhöht, so hat dies eine Zunahme des Umfangs der
Gefäßmuskulatur zur Folge. Die Muskulatur wird zu Bindegewebe umgebaut
und die Wand des Gefäßes verliert an Flexibilität. Durch diesen Umbau ist
der Sauerstoffaustausch in der Lunge stark eingeschränkt. Gleichzeitig verringert sich durch den erhöhten pulmonal- arteriellen Widerstand die Auswurfleistung des Herzens. Es entsteht eine pulmonale Hypertonie.
Phospholipide der B- Streptokokken führen, wie tierexperimentelle Studien
zeigen, zu einer Erhöhung des vaskulären Widerstands, beeinflussen so
auch den Gasaustausch in der Lunge und sind Ursache für die Bildung eines
pulmonalen Hypertonus [8].
Bakterielle Lipopolysaccharide und Zytokine bewirken während eines entzündlichen Geschehens in den Endothelzellen der Blut- Hirn- Schranke die
Stimulation der Prostaglandin E- Synthase. Diese bildet aus PG H2 das PG
E2. Sämtliche Prostaglandine, so auch dass PG E2, vermitteln ihre Wirkung
im Organismus über G-Proteingekoppelte Rezeptoren vom Rhodopsintyp,
der 7 Transmembrandomänen aufweist. Man unterscheidet 4 Rezeptorsubtypen, die eine unterschiedliche Affinität gegenüber der Prostaglandine besitzen. PG E2 entfaltet in der Lunge und im Gehirn vasokonstriktorische Eigenschaften über den EP 3- Rezeptor. [20], [21], [50], [51]
13
2.2.3
Einleitung
Medikamentöse Beeinflussung der Synthese von Prostaglandinen
Nicht steroidale Antiphlogistika können die Cyclooxygenase- Isoformen, die
für die Bildung von Prostaglandinen, Prostacyclin und Thromboxan aus Arachidonsäure verantwortlich sind, entweder unspezifisch, also beide Isoformen, oder selektiv, nur die COX 2, hemmen.
2.2.3.1
Indometacin
2-[1-(4-Chlorbenzoyl)- 5-methoxy-2-methyl-1H-indol-3-yl] essigsäure
Abbildung 2–5:
Strukturformel Indometacin
Quelle: [55]
Indometacin ist ein Medikament aus der Gruppe der sauren antiphlogistischen und antipyretischen Analgetika [32]. Es handelt sich um ein Arylessigsäure- Derivat mit hydrophob aromatischem Rest. Die Entwicklung erfolgte
1963, ebenso wie die Erstzulassung 1965, in den USA. Indometacin ist eine
ambiphile Säure. Auf Grund des niedrigen pH- Wertes und der hohen Eiweißbindung, über 90%, reichert sich Indometacin in besonders hoher Konzentration in entzündetem Gewebe an und wirkt dort antiinflammatorisch.
[39]. Wie alle Substanzen aus der Gruppe der nicht selektiven COX- Hemmer inhibiert Indometacin sowohl die COX 1, als auch die COX 2. Dies hat,
neben der gewünschten Blockierung der Synthese von Entzündungsmediatoren, auch die Beeinflussung der physiologisch aktiven Prostaglandine zur
Folge und erklärt so das Nebenwirkungsprofil. Neben Schädigungen der
14
Einleitung
Schleimhaut im Gastrointestinaltrakt sind Kopfschmerzen, Schwindel, Störungen der Leberfunktion und des Wasser- und Elektrolythaushaltes, pseudoallergische Reaktionen und andere Nebenwirkungen beschrieben. [32].
Der Abbau von Indometacin erfolgt durch eine Demethylierung am Sauerstoff, durch N- Deacylierung und durch Kopplung [32]. Der Plasmaspitzenspiegel wird nach zwei Stunden erreicht, die Plasmahalbwertszeit liegt
zwischen zwei und vier Stunden. Nach hepatischer Metabolisierung erfolgt
die Elimination zu 50 bis 70% renal [39].
2.2.3.2
Parecoxib
N-{[4-(5-Methyl-3-phenylisoxazol-4-yl) phenyl]sulfonyl}propionamid
Abbildung 2–6:
Strukturformel Parecoxib
Quelle: [70]
Die Coxibe besitzen, im Gegensatz zu dem oben aufgeführten Indometacin,
keine Säuregruppe und lagern sich mit einer bis 100fach höheren Affinität an
das Isoenzym COX 2 an [39]. Die COX 2 ist insbesondere für die Synthese
des Prostaglandin E 2 zuständig. Durch PGE 2 wird die Reizleitung in afferenten Nervenfasern erleichert. Auch blockiert PGE 2 die inhibitorische Wirkung spezifischer Glycinrezeptoren und führt auf spinaler Ebene zu einer
Hyperalgesie. [1], [52]
Parecoxib ist ein selektiver, schnell einsetzender und bis zu 12 Stunden wirkender COX 2 Inhibitor. Es ist der erste Wirkstoff aus der Gruppe der Coxibe,
der parenteral zugeführt werden kann.
15
Einleitung
Es handelt sich um ein Prodrug, das in der Leber zum wirksamen Metaboliten Valdecoxib und zu Propionsäure umgebaut wird.
Hydrolyse
Abbildung 2–7:
Hydrolyse von Parecoxib zu Valdecoxib
Quelle: [70]
Der Plasmaspitzenspiegel von Valdecoxib wird nach 30 bis 60 Minuten erreicht. Die Serumhalbwertszeit des Valdecoxib liegt bei 8 -12 Stunden. Valdecoxib hat mit bis zu 98% eine hohe Plasmaproteinbindung und weist auch
eine extensive Erythrozytenbindung auf. [39], [53].
An der Verstoffwechselung des Metaboliten Valdecoxib sind verschiedene
Enzyme beteiligt. Zu ca. 80 Prozent erfolgt der Abbau durch CYP 3A4 und
CYP 2C9, die restlichen ~ 20Prozent werden CYP- unabhängig glukuronidiert. Die Plasma- Clearance von Valdecoxib beträgt ca. 6 ½ Stunden.
Die COX 2- abhängigen Prozesse, wie Schmerzentstehung, Entzündung und
Fieber, werden durch die Selektivität unterdrückt, gleichzeitig werden die über die COX 1 vermittelten physiologischen Wirkungen auf die Blutgerinnung
sowie im Gastrointestinaltrakt kaum beeinflusst. Klassische Nebenwirkungen
der unselektiven Inhibitoren, wie Schädigung der Magenschleimhaut und
Nierenschäden, werden ausgespart [32]. Als häufigste Nebenwirkungen sind
Übelkeit und Erbrechen, sowie Kopfschmerzen und Hautreaktionen beschrieben [11].
16
2.3
Einleitung
Zytokine
Die intrazelluläre Kommunikation und die Modulation der Immunantwort sind
wesentlich über Zytokine vermittelt [26].
Neben proinflammatorischen Zytokinen, wie TNFα, IL 1 und IL 8, die die Entzündung fördern, existieren auch antiinflammatorische, die die Inflammation
eindämmen und die Regeneration der Zelle fördern [26].
Aufgabe der proinflammatorischen Zytokine ist die möglichst schnelle Elimination des schädigenden Agens. Hierzu werden lokale an der Entzündungsreaktion beteiligte Zellen aktiviert, diese wirken wiederum chemotaktisch auf
andere Zellen. Die Migration der Zellen in das entzündete Gewebe wird
durch Veränderungen in der Zellmatrix erleichtert [26].
2.3.1
Interleukin 8
IL 8, ein nicht- glykosiliertes Protein, wird von einer Vielzahl von Zellen, z.B.
Endothelzellen, Monozyten, Epithelzellen und Fibroblasten produziert. IL 8 ist
ein wesentlicher Faktor bei der Chemotaxis von Neutrophilen und stimuliert
die Expression von Adhäsionsmolekülen [63].
Gerade die unspezifische Symptomatik, die die Neugeborenen zu Beginn
einer Infektion bieten, und die drohende Progredienz zur Meningitis oder
Sepsis macht es nötig, dass zuverlässige und vor allem frühe Marker zur
Diagnostik herangezogen werden, um eine möglichst effektive und risikoadaptierte Therapie zu gewährleisten. Da das lange Zeit hierfür genutzte CrP
und ein Differentialblutbild nicht ausreichen, werden Zytokine, wie das IL 8
herangezogen. Der Vorteil ist, dass das IL 8 bei einer bakteriellen Infektion
viel früher und schneller ansteigt. Nach einem bakteriellen Stimulus reagiert
IL 8 bereits 12 bis 24 Stunden vor dem CrP. Auffällig ist, dass IL 8 nach seiner Synthese rasch an Erythrozyten und andere Zellen gebunden wird. So
kann das Messergebnis durch eine mögliche Hämolyse, den Transport und
die Dauer bis zur Durchführung der Messung beeinflusst werden. Trotzdem
wird laut Leitlinien der Gesellschaft für Neonatolgie und Pädiatrische Intensivmedizin eine Kombination aus Interleukin, zum Beispiel IL 8, und CrP
empfohlen [56],[69], [64] [57], [63].
17
Einleitung
Die Rolle von IL 8 im Verlauf einer Inflammation konnte während eines Vergleiches von IL 8 mit Laktatwerten gezeigt werden. Es zeigte sich eine eindeutige und signifikante Korrelation der beiden Werte. Im Gegenzug konnte
eine inverse Proportionalität zwischen IL 8, der Leukozyten- und der Plättchenzahl, sowie dem MAD aufgezeigt werden. Des Weiteren besteht eine
deutliche Korrelation zum frühen Infektionsmarker IL 6. Diese Ergebnisse
und die bekannte Aktivierung von Neutrophilen durch IL 8 sind der Grund,
warum diesem Marker eine bedeutende Rolle in der Pathophysiologie der
Sepsis beigemessen wird [17].
2.4
Ziel der vorliegenden Arbeit
Die neonatale B- Streptokokken- Sepsis hat eine Inzidenz von 0,47/1000 Lebendgeborene [12]. Neben dem möglichen schweren Verlauf der Infektion
steht in dieser Studie die Suppression der Einzündungsreaktion in der Lunge
als Ursache einer persistierenden pulmonalen Hypertonie im Mittelpunkt.
Gemessen wurde, neben dem mittleren Druck in der Arteria femoralis und
dem mittleren pulmonlarteriellen Druck, das Ausmaß der Entzündungsrekation exemplarisch durch die mRNA- Expression von IL 8, EP 3 und der COX 2
im Lungengewebe. Des Weiteren wurden einige Prostaglandinmetaboliten im
Urin bestimmt.
Folgende Fragen sollen in der Studie beantwortet werden:
•
Supprimieren Indometacin und Parecoxib die Entzündungsreaktion in
der Lunge beim Krankheitsbild der neonatalen B- Streptokokkensepsis
und ist eines der Medikamente dem Anderen in seiner Wirkung signifikant überlegen?
•
Hat die Wirkung von Indometacin und Parecoxib über die EP 3- Rezeptoren einen Einfluss auf die Entwicklung des Blutdruckes in der Arteria
pulmonalis und wird durch die Gabe der Medikamente die systemische
Hämodynamik, gemessen über den mittleren arteriellen Druck der Arteria femoralis, verbessert?
•
Welchen Einfluss hat die Gabe von Indometacin und Parecoxib auf die
Bildung von Thromboxan und dessen Metabolismus und können Unterschiede in der Wirkung der Medikamente aufgezeigt werden?
18
3
3.1
Material und Methoden
Material und Methoden
Tierexperimentelle Präparationen
Die Durchführung der Studie wurde von der Regierung Mittelfrankens genehmigt.
Es wurden neonatale Schweine ausgewählt, die zwischen neun und zwölf
Tagen alt und zwischen 3,4 und 4,2 kg schwer waren. Die Tiere wurden mit
Azaperon (1mg/kg KG) i.m. und Dormicum ® i.v. (Midazolam 0,5mg/kg KG)
über eine periphere Venenverweilkanüle in einer Ohrvene sediert. Die Narkose erfolgte initial mit einer Bolusinjektion von 5 mg/kg KG Ketanest S® (Ketamin), 1 mg/kg KG Dormicum® und 2,5 µg/kg KG Fentanyl. Im Anschluss
folgten kontinuierliche Infusionen von 1,5 mg/kg KG/h Midazolam, 0,01
mg/kg KG/h Fentanyl, und 15 mg/kg KG/h Ketamin um die Narkose aufrechtzuerhalten. Nachdem die Schweine tracheotomiert wurden, erfolgte die Intubation mit einem Endotrachealtubus (Mallinckrodt ®, I.D. 4,5mm), dessen
distales Ende 3,5cm oberhalb der trachealen Bifurkation zu liegen kam. Die
Kontrolle der der korrekten Tubuslage erfolgte mittels starrer Bronchoskopie.
Im Anschluss an die Intubation wurde die maschinelle Beatmung (Infant Star
950, Mallinckrodt, Hennef, Deutschland) begonnen. Hierfür wurden die Tiere
mit 0,2 mg/kgKG Norcuron® (Vecuronium) relaxiert und erhielten wiederholt
Fentanyl 5µg/kgKG i.v. Die Beatmung erfolgte initial mit einer Frequenz von
50 Atemzügen/ Minute, das Atemgas wurde auf 39°C erwärmt und angefeuchtet (MR 700, Fischer & Paykel, Welzheim, Deutschland).
Um die Messung des pulmonalarteriellen Druckes zu ermöglichen, wurde
intraoperativ eine 4,5 Ch Schleuse (Cook®) in die rechte Vena jugularis gelegt. Danach wurde über die Schleuse ein 4 Ch Thermodilutionskatheter (Arrow®, Erding, Deutschland) geführt und so eine kontinuierliche Messung gewährleistet. Die korrekte Lage der Spitze des Katheters in der Arteria pulmonalis wurde mit Hilfe der Druckkurve überwacht.
Um den Blutdruck der Tiere kontinuierlich invasiv zu überwachen, wurde in
die linke Arteria femoralis eine 20 Gage Kanüle (Arrow, Erding, Deutschland)
platziert.
19
Material und Methoden
Die Ableitung von Magensekret erfolgte über eine 10 Ch Magensonde.
Ein regelmäßiger Harnabfluss und die genaue Überwachung der Harnproduktion wurden realisiert, indem den Tieren durch suprapubische Punktion
der gefüllten Blase ein Blasenkatheter (Braun, Melsungen, Deutschland) gelegt wurde.
3.2
Einteilung in Gruppen und weitere Maßnahmen gemäß Protokoll
Im Anschluss erfolgte die Einteilung der Tiere in folgende Gruppen
•
1. Kontrollgruppe (keine B- Streptokokkenapplikation)
•
2. GBS
•
3. GBS und Einteilung in zwei Interventionsgruppen
•
Indometacin
•
Parecoxib
Bei den Tieren der 2. und 3. Gruppe wurden B- Streptokokken des Stammes
Ia Serotyp 90 (1,875 x 108 cfu/kg KG) über den ZVK in der rechten Vena
juglaris innerhalb von 30min infundiert.
3.3
Medikamentöse Therapie
Die Tiere in den Interventionsgruppen wurden mit Indometacin (5mg/kg KG)
i.v. beziehungsweise Parecoxib (20mg/kg KG) i.v. behandelt. Die Therapie
wurde zwei Stunden nach der GBS- Applikation begonnen. Eine erneute Injektion erfolgte im Fall von Indometacin alle 12 Stunden, Parecoxib wurde
alle 8 Stunden gegeben
Die Beobachtungszeit endete mit dem Tod der Tiere. Nach einer Observation
von 12 Stunden wurde das Leben der Tiere der Kontrollgruppe durch Injektion von Methohexital 50mg/kgKG und 20ml 1M Kaliumchhlorid beendet.
20
3.4
Material und Methoden
Monitoring
Um einerseits die ausreichende Tiefe der Narkose zu sichern und andererseits versuchsrelevante Parameter zu erhalten, wurden die Tiere regelmäßig
und engmaschig überwacht. In regelmäßigen Intervallen wurden die bestimmten Werte kontrolliert und protokolliert.
21
Abbildung 3–1:
Material und Methoden
Versuchsprotokoll der Studie
22
Material und Methoden
Die kontinuierliche Messung der Atemvolumina erfolgte mit einem Hitzedrahtmanometer(MIM® GmbH, Krugzell, Deutschland) und wurde mit Hilfe
des neonatalen Atemmonitors Florian® NRM-200 (MIM®) visualisiert. Ein kontinuierliches EKG wurde abgeleitet.
Folgende weitere Messungen wurden vorgenommen:
•
Alle fünfzehn Minuten: Dokumentation der Lungenfunktions- und Beatmungsparameter; Aufzeichnung von Herzfrequenz, Temperatur und pulsoxymetrischer Sättigung; Protokollierung von ZVD, Druck der Pulmonalarterie und der Arteria femoralis (CMS 2001 (Agilent (jetzt Philips) Böblingen,
Deutschland).
•
Alle dreißig Minuten: arterielle Blusgaskontrolle. Im Therapieintervall im
Anschluss wurden im selben zeitlichen Abstand die venösen Blutgase untersucht.
•
Alle sechzig Minuten: manuelle Analyse der gemischtvenösen Blutgase
(ABL 330 Radiometer Copenhagen, Dänemark).
•
Alle zwei Stunden: Ein- und Ausfuhrbilanz zur Überprüfung der Nierenfunktion.
Die Auswertung der hämodynamischen Daten erolgte mit der Two- WayANOVA mit Hilfe des Programms Graph Pad Prism.
3.5
Bestimmung der Prostaglandin- Metabolite im Urin
Vor Applikation der B- Streptokokken und präfinal wurde Urin über den
suprapubischen Katheter gewonnen. Der Urin wurde zunächst bei -20°C eingefroren. Die Messung der Prostaglandine im Urin erfolgte im Anschluß
massenspekrtometrisch im Prostaglandinlabor der Kinderklinik in Marburg.
[46]
3.6
Polymerasekettenreaktion
Das Verfahren zur Vervielfältigung von DNA, die Polymerasekettenreaktion,
wurde 1983 von dem amerikanischen Chemiker Kary Mullis entwickelt.
In drei verschiedenen Schritten wird die ursprüngliche DNA dupliziert.
23
Material und Methoden
1. Denaturieren
Als erstes wird die DNA, die verdoppelt werden soll, auf 96°C erwärmt
und so die komplementären Stränge voneinander getrennt. Gleichzeitig
werden auch die DNA- Polymerase, passende Primer und Nukleotide
erhitzt. Primer sind kurze DNA- Stücke, die es der Polymerase ermöglichen sich an die DNA anzulagern. Da die meisten im Organismus tätigen
DNA- Polymerasen ein Temperaturoptimum von 37°C aufweisen, werden in diesen Ansätzen Polymerasen des Thermus aquaticus genutzt.
Sie sind im Gegensatz zu den beispielsweise humanen Polymerasen
hitzeresistent und gegenüber Salzen und Säuren wenig anfällig.
2. Annealing
Dann wird das Gemisch auf 55°C abgekühlt. Die komplementären Primer
können sich nun an die Matrize anlagern. Dieser Prozess wird Hybridisierung genannt.
3. Elongation
Im nun folgenden Schritt erfolgt die Verlängerung der Matrize. Erneut wird
das Gemisch erwärmt, diesmal auf 70°C. Diese Temperatur ist optimal,
um die Synthese durch die Polymerase zu ermöglichen. Durch die Polymerase werden freie Nukleotide, die zur Orginalmatrize komplementär
sind, angelagert. Startpunkt ist das 3’ Ende des Primers.
Dieser Zyklus ist variabel oft durchführbar und so besteht die Möglichkeit,
eine unendliche häufige Vervielfältigung der ursprünglichen DNA vorzunehmen. [16]
24
Abbildung 3–2:
Material und Methoden
Polymerasekettenreaktion
Quelle: [58]
3.6.1
Quantitative Polymerasekettenreaktion
Das Verfahren der RTQ- PCR entspricht grundsätzlich dem oben beschriebenen Prinzip. Zusätzlich kann bei dieser Methode jedoch quantitativ die Anzahl der erstellten DNA- Kopien errechnet werden
Hierfür werden Fluoreszenz- Messungen genutzt, die während eines PCRDurchlaufes ermittelt werden. Da die Stärke der Fluoreszenz proportional zur
Anzahl der Menge der PCR- Produkte steigt kann die Quantifizierung vorgenommen werden. Bei diesem Verfahren wird die Quantifizierung in der exponentiellen Phase vorgenommen, da die Umgebungsbedingungen optimal
sind und sich die DNA so tatsächlich in jedem Zyklus annähernd verdoppelt
[44].
Bei der Messung mit TaqMan® - Sonden wird der Fluorescence resonance
energy transfer (FRET) genutzt. Die Sonde besteht aus einem Fluorochrom
und einem Quencher. Durch den FRET wird bei intakter Sonde die Fluoreszenz des Fluorochroms durch den Quencher abgefangen. Durch Anlagerung
des forward Primers und die folgende Extension wird die Sonde hydrolysiert
und der Quencher entfernt sich vom Fluorochrom. Dadurch wird der FRET
25
Material und Methoden
unterbrochen und die Fluoreszenz steigt an. Sie ist proportional zur amplifizierten DNA.
26
4
Ergebnisse
Ergebnisse
4.1
4.1.1
Einfluss auf den Entzündungsvorgang im Lungengewebe
Suppression von Interleukin 8 durch Parecoxib und Indometacin
Das Zytokin IL 8 ist ein schnell reagierender Entzündungsparameter und
spielt eine wesentliche Rolle bei der Chemotaxis und der Expression von
Adhäsionsmolekülen.
Bei der Messung des IL 8 im Lungengewebe ist bei den Tieren der Kontrollgruppe ein, in Abbildung 4.1. erkennbarer, diskreter Anstieg festzustellen.
Dieser ist durch die invasiven Maßnahmen, wie Intubationen und Katheterisierung, die die Tiere zu Beginn des Versuches erfahren haben erklärbar.
Die infizierten Tiere weisen im Vergleich zur Kontrollgruppe einen im Durchschnitt dreißigfachen Anstieg des IL 8 auf.
Bei den Tieren, die mit Parecoxib oder Indometacin behandelt wurden, ist
ebenfalls ein Anstieg des IL 8 zu erkennen. Jedoch ist dieser um etwa den
Faktor fünf geringer als in der nicht behandelten GBS- Gruppe. Durch Indometacin und Parecoxib wird IL 8 in gleichem Ausmaß supprimiert.
IL8/HPRT
30
20
10
***
***
Abbildung 4–1:
in
om
et
ac
ox
ib
re
c
Pa
BS
-K
G
Ko
n
tro
lle
0
o
***
In
d
relative units
40
Real- time PCR- Messung der IL 8- Suppression im
Lungengewebe: IL 8- mRNA bezogen auf das Housekeeping Gen HPRT
27
4.1.2
Ergebnisse
Suppression der Cyclooxygenase 2 durch Indometacin und Parecoxib
Die Cyclooxygenasen sind das geschwindigkeitsbestimmende Enzym bei der
Synthese von Prostaglandin G2 aus Arachidonsäure.
In der Kontrollgruppe lässt sich auch bei der Messung der Expression der
COX 2- mRNA ein geringgradiger Anstieg erkennen (Abbildung 4.2.). Auch
hier dürften die Präparationen zu Beginn der Untersuchung die Erklärung liefern.
Ein signifikanter Anstieg der COX 2- mRNA innerhalb der infizierten GBSGruppe im Vergleich zu Kontrollgruppe zeigt eine deutliche Überexpression
der COX 2 als entzündliche Reaktion auf die Infektion mit B- Streptokokken.
Bei den mit Indometacin beziehungsweise Parecoxib behandelten Tieren ist
die COX 2- mRNA- Expression supprimiert. In der Parecoxib- Gruppe ist die
COX 2- mRNA auf das Niveau der Kontrollgruppe reduziert, in der Indometacin- Gruppe findet man eine deutliche Suppression im Vergleich zur unbehandelten Gruppe um etwa den Faktor fünf.
COX2/HPRT
relative units
30
20
10
***
***
***
Abbildung 4–2:
In
do
m
et
ac
in
Pa
re
co
xi
b
G
BS
Ko
nt
ro
lle
0
Real- time PCR Messung der COX 2- Suppression
im Lungengewebe: COX 2- mRNA bezogen auf das
Housekeeping Gen HPRT
28
4.1.3
Ergebnisse
Suppression der Thromboxansynthase durch Indometacin und
Parecoxib
Thromboxan entsteht aus PGH 2 über das Enzym Thromboxansynthase.
Thromboxan aktiviert die Thrombozytenaggregation und wirkt vasokonstriktorisch auf die glatte Muskulatur und ist so auch an der möglichen Entstehung
einer pulmonalen Hypertonie beteiligt.
Nach Infektion mit B- Streptokokken konnten wir eine deutliche Zunahme der
mRNA- Expression des Enzyms Thromboxansythase zeigen.
Sowohl durch Indometacin, als auch durch Parecoxib erfolgte eine signifikante Suppression der mRNA- Expression. In beiden Medikamentengruppen war
die Thromboxansynthase- mRNA im Vergleich zur Kontrollgruppe nur leicht
erhöht. Die Suppression erfolgte durch beide Medikamente im selben Ausmaß.
T B X S /H P R T
relative units
5
4
3
2
***
***
1
***
Abbildung 4–3:
ac
in
In
do
m
et
Pa
re
co
xi
b
o
G
BS
-K
Ko
nt
ro
lle
0
Messung der Suppression der Thromboxansynthase
4.1.4
Einfluss von Indometacin und Parecoxib auf den Prostaglandinrezeptor E 3
Die Expression der mRNA des Prostaglandinrezeptors E 3 im Lungengewebe wurde ebenfalls untersucht. Dieser Rezeptor vermittelt unter anderem in
der Lunge eine Vasokonstriktion nach Bindung von PGE 2. [20], [21].
29
Ergebnisse
Verglichen mit den Ergebnissen der Kontrollgruppe war die Expression der
Rezeptor- mRNA in der Gruppe der mit B- Streptokokken infizierten Tiere im
Durchschnitt auf das Dreifache erhöht.
Durch die Gabe von Indometacin oder Parecoxib konnte die mRNA des EP
3- Rezeptors in gleichem Ausmaß signifikant reduziert werden.
Abbildung 4–4:
Messung der Suppression des Prostaglandinrezeptors E 3
4.2
4.2.1
Hämodynamische Parameter
Einfluss von Indometacin und Parecoxib auf den mittleren arteriellen Druck
Der mittlere arterielle Blutdruck war zu Beginn des Versuchs in allen Gruppen vergleichbar hoch.
30
Ergebnisse
Druck in mmHg
Kontrolle
55,11±2,86 SDS
GBS
56,71±3,84 SDS
Indometacin
59,90±8,45 SDS
Parecoxib
54,89±4,82 SDS
Zwei Stunden nach Infusion der B- Streptokokken stieg der MAD der Tiere
der GBS- Gruppe im Vergleich zur Kontrollgruppe leicht an, allerdings nicht
signifikant.
Nach diesem Zeitpunkt sank der MAD in allen Interventionsgruppen deutlich
ab. Bei Tieren, die mit Indometacin behandelt wurden, war der MAD nach 2
Stunden 15 min signifikant höher als bei unbehandelten GBS-Tieren
(p<0.01). Dieser Effekt war im weiteren Verlauf nicht mehr nachweisbar. Parecoxib führte zu einem geringen, nicht signifikanten Anstieg des MAD nach
2 Stunden 15 min.
31
Ergebnisse
Kontrolle
Zeit (h)
Abbildung 4–5:
Messung des mittleren arteriellen Druckes in der
Arteria femoralis
4.2.2
Einfluss von Indometacin und Parecoxib auf den mittleren pulmonalarteriellen Druck
Zu Beginn der Beobachtungszeit unterschied sich der pulmonalarterielle
Druck in den verschiedenen Gruppen nicht. Es wurden Werte zwischen 10
und 16mmHg gemessen.
32
Ergebnisse
Druck im mmHg
Kontrolle
12,58±0,83 SDS
GBS
15,71±1,21 SDS
Indometacin
12,21±0,70 SDS
Parecoxib
12,58±0,12 SDS
Fünfzehn Minuten nach Applikation der Bakterien kam es zu einem signifikanten Anstieg des MPAD. Der MPAD in der Kontrollgruppe blieb konstant.
Ein zweites Maximum wurde nach zwei bis fünf Stunden erreicht. In der Parecoxib Gruppe war der MPAD niedriger als in der unbehandelten GBSGruppe. Signifikant niedrigere Werte wurden im Vergleich zwischen diesen
Gruppen nach dreieinhalb, fünf und fünf Stunden und 15 min gemessen.
Zwischen der Indometacin- Gruppe und der GBS- Gruppe bestand kein signifikanter Unterschied.
33
Ergebnisse
Kontrolle
Zeit (h)
Abbildung 4–6:
4.2.3
Messung des mittleren pulmonalarteriellen Druckes
Überleben der Tiere
Weder die Behandung mit Indometacin noch mit Parecoxib konnten das
langfristige Überleben der Tiere verbessern. Alle Tiere sind nach 6 bis 12
Stunden gestorben.
4.3
4.3.1
Messung der Prostaglandinausscheidung im Urin
Thromboxan B2
Thromboxan B2 , 2, 3- dinor- Thromboxan B2, 11- dehydro- Thromboxan B2,
6- keto- Prostaglandin F1α und 2,3- dinor- 6- keto- Prostaglandin F1α wurden
massenspektrometrisch untersucht.
34
Ergebnisse
Thromboxan A2 wird durch die Thromboxansynthase gebildet, aus Thrombozyten freigesetzt und wirkt dann als Mediator der Thrombozytenaggregation,
Broncho- und Vasokonstriktion. Thromboxan B2 entsteht über nicht enzymatische Hydrolyse aus Thromboxan A2und ist wesentlich stabiler als sein aktiver Metabolit. Aus diesem Grund wird die Produktion von Thromboxan A2
über Thromboxan B2 und dessen Metabolite 2, 3- dinor- Thromboxan B2 beziehungsweise 11- dehydro- Thromboxan B2 gemessen.
In der Kontrollgruppe ergab die Messung von Thromboxan B2 sowohl zu Beginn, als auch am Ende der Beobachtungszeit konstant niedrige Werte
(2,671 ± 1,094ng/ml vs. 2,62 ± 1,48 ng/ml).
Innerhalb aller Gruppen war der Wert, der vor der Infektion gemessen wurde, ähnlich niedrig, wie in der Kontrollgruppe. Signifikante Unterschiede wurden dann jedoch bei der zweiten Messung kurz vor dem Tod der Tiere deutlich.
Die GBS- Tiere schieden bei der zweiten Messung signifikant mehr Thromboxan B2 im Vergleich zur Kontrollgruppe aus (Mann- Whitney- Test, p=
0.016).
Nach Behandlung mit Parecoxib wiesen die Tiere höhere Thromboxan B2Werte auf als die Tiere aller anderen Gruppen. Diese waren mit mit 16 ±
11,54 ng/ml auch höher als der der GBS- Tiere. Parecoxib hat demzufolge
auf die Thromboxan-Synthese keinen hemmenden Einfluss.
T x B 2 (n g /m l)
ng/ml
30
20
10
0
s ta r t
end
c o n tro l
Abbildung 4–7:
s ta r t
GBS
end
s ta r t
end
IN D O
s ta r t
end
PAR
Messung von Thromboxan B2 im Urin
35
4.3.2
Ergebnisse
2, 3- dinor- Thromboxan B2
Durch die β- Oxidation wird Thromboxan B2 zu 2, 3- dinor- Thromboxan B2
umgebaut. Die im Urin ausgeschiedene Menge an 2, 3- dinor- Thromboxan
B2 ist ein Marker der extrarenalen Thromboxanproduktion.
Zu Beginn des Versuchs unterschieden sich die 2, 3- dinor- Thromboxan B2
Werte in den Versuchsgruppen nicht. Im Urin der GBS- Tiere stieg der 2, 3dinor- Thromboxan B2 Wert auf durchschnittlich 97,99 ng/ml und damit etwa
auf den hundertfachen Wert an. Es zeigte sich jedoch eine sehr breite Streuung der Werte (± 64,47 SDS).
Auch unter Therapie mit Indometacin zeigte sich eine sehr breite Streuung
von 2,3- dinor- Thromboxan B2 (32,20 ± 42,52ng/ml). Auch bei den mit Parecoxib behandelten Tieren zeigten die Werte eine sehr breite Streuung (117,2
± 86,07ng/ml), waren signifikant höher als bei Therapie mit Indometacin
(Dunn´s multiple comparison test, p<0.05) und nicht signifikant niedriger als
in der GBS-Gruppe. Somit hat Parecoxib wahrscheinlich keinen Einfluss auf
die extrarenale Bildung von 2,3- dinor- Thromboxan B2.
dnTxB2 (ng/ml)
ng/ml
200
100
0
start
control
Abbildung 4–8:
end
start
end
GBS
start
end
INDO
start
end
PAR
Messung von 2, 3- dinor- Thromboxan B2 im Urin
Die Messung von 11- dehydro- Thromboxan B2 im Urin der Tiere verhielt sich
analog zur Messung von 2, 3- dinor- Thromboxan B2.
36
Ergebnisse
11dh TxB2 (ng/ml)
ng/ml
20
10
0
start
end
control
Abbildung 4–9:
4.3.3
start
end
start
GBS
end
start
INDO
end
PAR
Messung von 11- dehydro- Thromboxan B2 im Urin
Messung der Konzentration von 6- keto- Prostaglandin F1 α und
2, 3- dinor- 6- keto- Prostaglandin F1 α im Urin
Im Rahmen der Prostaglandinsynthese entsteht aus PGH 2 PGI 2, dieses
wird auch Prostacyclin genannt. Es wirkt sowohl der Thrombozytenaggregation entgegen, als auch vasodilatativ [5].
Aufgrund seiner Instabilität zerfällt PGI 2 sehr schnell in das stabilere, aber
biologische inaktive Hydrolyseprodukt 6- keto- Prostaglandin F1α. Bedingt
durch die sehr kurze Halbwertszeit der Ausgangssubstanz PGI 2 wird das
Hydrolyseprodukt 6- keto- Prostaglandin F1α gemessen.
Die Messungen in der Kontrollgruppe zu Anfang und am Ende des Versuchs
ergaben für keto- PGF1α eine Konzentration von 1,81 ± 0,68ng/ml, zu Ende
des Versuchs von 0,06 ± 0,05ng/ml.
Am Ende des Versuchs zeigte sich eine breite Streuung der gemessenen
Werte. In der GBS- Gruppe zeigte sich im Vergleich zur Kontrollgruppe ein
signifikanter Anstieg.
Die Behandlung mit Parecoxib und Indometacin führte zu einer signifikanten
Suppression von 6- keto- Prostaglandin F1α (One way- ANOVA, Dunn´s multiple comparison test, p <0.001).
37
Ergebnisse
6 keto PGFa (ng/ml)
40
ng/ml
30
20
10
0
start
end
start
control
Abbildung 4–10:
end
start
GBS
end
start
INDO
end
PAR
Messung von 6- keto Prostaglandin F1α im Urin
Prostacyclin wird im Verlauf wie alle Prostaglandine über die ß- Oxidation
verstoffwechselt. Es entsteht 2, 3- dinor- 6- keto- Prostaglandin F1α [60].
In der Kontrollgruppe sind die Ausgangs- und Endwerte des Stoffwechselprodukts erwartungsgemäß niedrig. (0,0 5± 0,07 ng/ml vs. 0,06 ± 0,05ng/ml).
Sowohl die mit Indometacin als auch mit Parecoxib behandelten Tiere hatten
signifikant niedrigere Werte als die Tiere der GBS- Gruppe (One wayANOVA, Dunn´s multiple comparison test, p <0.001).
dn-keto-PGF1a (ng/ml)
ng/ml
2
1
0
start
end
control
Abbildung 4–11:
start
end
GBS
start
end
INDO
start
end
PAR
Messung von 2,3- dinor- 6- keto- Prostaglandin F1α
im Urin
Indometacin und Parecoxib supprimieren signifikant und im nahezu gleichen
Ausmaß die Synthese des Prostacyclins.
38
5
5.1
Diskussion
Diskussion
Hemmung der pulmonalen Entzündungsreaktion
Bedingt durch die im Lungengewebe ablaufende Entzündungsreaktion während einer Infektion mit Streptokokken der Gruppe B kann es zu der Entwicklung eines pulmonalen Hochdrucks, sowie einer bronchopulmonalen Dysplasie kommen [48]. Die pulmonale Hypertonie entwickelt sich durch ein Ungleichgewicht zwischen protektiven und agressiven Faktoren in Folge von
Vasokonstriktion, Thrombose und Gefäßremodelling. Einen besonders starken Einfluss haben der Anstieg von Thromboxan und die Abnahme des protektiv wirkenden PGI 2. [18]
Wir haben durch die intravenöse Gabe von B- Streptokokken eine Entzündungsreaktion hervorgerufen und anschließend die mRNA- Expression der
Entzündungsparameter IL 8 und COX 2 gemessen. Gezeigt wurde das Ausmaß der Entzündung durch den Vergleich von IL 8- und COX 2- Expression
im Lungengewebe in den verschiedenen Gruppen. Des Weiteren wurde der
Einfluss der antiinflammatorisch wirksamen Medikamente Indometacin und
Parecoxib untersucht.
Während Indometacin ein unselektiver COX- Inhibitor ist, wurde die Selektivität von Parecoxib auf die COX 2 in vitro [23] und ex vivo [36] in Studien belegt. Da ein direkter Zusammenhang zwischen der Parecoxib- Dosis und der
Enzyminhibition besteht [34], wurden die Tiere in unserem Modell mit einer
Hochdosistherapie behandelt.
In unserer Studie konnten für Indometacin und Parecoxib ein vergleichbarer
Einfluss auf die Suppression der mRNA- Expression von IL 8 und COX 2 gezeigt werden.
Des Weiteren konnte eine signifikante Reduktion der mRNA- Expression der
Thromboxansynthase im Lungengewebe durch beide Medikamente erreicht
werden.
Die Untersuchung des Lungengewebes der Tiere zeigte eine gesteigerte Expression der EP 3- Rezeptoren innerhalb der mit B- Streptokokken infizierten
Gruppe. Der Rezeptor vermittelt eine Vasokonstriktion und könnte so eine
39
Diskussion
Rolle bei der Entwicklung der pulmonalen Hypertonie nach einer Infektion im
Neugeborenenalter spielen. Durch die Gabe von Indometacin und Parecoxib
konnte dieser Expressionsanstieg komplett unterbunden werden. Die verminderte Expression des Prostaglandinrezeptors unter der Gabe von Indometacin und Parecoxib könnte ein möglicher Ansatzpunkt für die pharmakologische Behandlung der pulmonalen Hypertonie sein.
5.2
Beeinflussung der Hämodynamik durch Indometacin und Parecoxib
Die wichtige Rolle der Prostaglandine bei der durch B- Streptokokken verursachten Sepsis und einer folgenden pulmonalen Hypertonie wurde bereits
durch verschiedene Studien aufgezeigt [15] [45] [43] [42]. Vorausgegangene
Studien haben gezeigt, dass die Gabe von Indometacin eine Stabilisierung
des mittleren arteriellen Druckes bei mit B- Streptokokken infizierten Schweinen bewirkt [42]. Der Beobachtungszeitraum in dieser Studie war auf 240
Minuten begrenzt [43]. In unserer Studie war der Beobachtungszeitraum
durch den Tod der Tiere limitiert und somit länger angesetzt. Wir konnten so
zeigen, dass der positive Effekt von Indometacin nur vorübergehend ist. Der
MAD steigt 2 Stunden nach der Gabe von Indometacin deutlich an, sank
dann aber zwischen 4 und 8 Stunden nach der Medikamentengabe ebenfalls
ab. Alle Tiere sind nach einer Beobachtungszeit zwischen 12 und 16 Stunden gestorben, das Outcome konnte nicht verbessert werden. Auch die Gabe
von Parecoxib hatte keinen stabilisierenden Einfluss auf den MAD und konnte somit das Outcome ebenfalls nicht verbessern.
Im Gegensatz hierzu konnte der mittlere pulmonalarterielle Druck durch Parecoxib vorübergehend gesenkt werden. Ursächlich dafür ist möglicherweise
eine durch die Infektion mit Streptokokken der Gruppe B hervorgerufene Infektion der Lunge bedingte lokale Überexpression der COX 2, der Thromboxansynthase und des EP 3- Rezeptors in der Lunge. Da durch Parecoxib eine Suppression der Genexpression der COX 2 und der Thromboxansynthase
bewirkt wird ist dies eventuell auch ein Grund für das Absinken des mittleren
pulmonalarteriellen Druckes.
40
5.3
Diskussion
Einfluß von Indometacin und Parecoxib auf die Thromboxasynthese
Der suprapubisch entnommene Urin der Tiere wurde im Anschluss an den
Versuch massenspektrometrisch auf die ausgeschiedene Menge von Indexmetaboliten untersucht. Durch die Gabe von Indometacin und Parecoxib
konnten unterschiedliche Ergebnisse erreicht werden.
Durch Parecoxib lies sich keine Reduktion der Ausscheidung von 6- ketoProstaglandin F1α, 2, 3- dinor- 6- keto- Prostaglandin F1α, ThromboxanB2, 2,
3-dinor- Thromboxan B2 und 11- dehydro- Thromboxan B2 erreichen. Ähnliche Ergebnisse wurden auch in früheren Studien erzielt [7]. Die Gabe von
selektiven COX 2- Inhibitoren hat demnach eine Abnahme von PGI 2 zur
Folge, auf die Thromboxansynthese jedoch keinen Einfluss [7]. Dies lässt
sich damit erklären, dass ein Großteil des Thromboxans in den Thrombozyten gebildet wird. Nur 8 Prozent der Thromboxansynthese werden durch die
COX 2- Isoform vermittelt, der Rest der Synthese läuft über die COX 1 [40].
Wir nehmen darum an, dass die Inhibition der Thromboxansynthase im Lungengewebe nur einen geringen Anteil der Synthese von Thromboxan während der Sepsis ausmacht. So lässt sich erklären, warum einerseits die Expression der Thromboxansynthase- mRNA im Lungengewebe unter Parecoxib supprimiert wird, andererseits die Ausscheidung der Indexmetaboliten im
Urin jedoch so hoch ist.
Indometacin hingegen hemmt sowohl die COX 1, als auch die COX 2- Isoform. Deshalb kann durch dieses Medikament auch die Thromboxansynthese in den Thrombozyten beeinflusst werden. Die Ausscheidung der Indexmetaboliten im Urin konnte durch Indometacin reduziert werden.
Auffällig ist außerdem ein Ungleichgewicht bei der Ausscheidung von
Thromboxan B2 und 6- keto- Prostaglandin F1α unter der Therapie mit Parecoxib. Wir vermuten, dass dieses Ungleichgewicht mitverantwortlich für eine
vermehrte Thrombogenität ist.
41
6
Schlussfolgerung
Schlussfolgerung
Bezugnehmend auf die in dieser Arbeit zu klärenden Fragen lässt sich feststellen, dass sowohl Indometacin, als auch Parecoxib der Entzündungsreaktion in der Lunge entgegenwirken. Die Expression von den untersuchten Enzymen COX 2 und Thromboxansynthase, sowie der Entzündungsmarker IL
8, konnten durch beide Medikamente in nahezu gleichem Ausmaß supprimiert werden. Eine signifikante Überlegenheit zwischen den Medikamenten
konnte nicht festgestellt werden.
Durch beide Medikamente konnte eine signifikante Verminderung der mRNAExpression des EP 3- Rezeptors erreicht werden. Die Suppression erfolgte
durch beide Medikamente im gleichen Ausmaß.
Die Entwicklung des mittleren arteriellen Druckes konnte unter Indometacin
passager verbessert werden, am Ende der Untersuchung fiel jedoch der
MAD auch in dieser Gruppe. Die Gabe von Parecoxib hatte auf den Abfall
des MAD keinen Einfluss. Im Gegensatz dazu konnte der mittlere pulmonalarterielle Druck durch den selektiven COX 2 Inhibitor vorübergehend gesenkt werden.
Während sowohl Indometacin als auch Parecoxib die Expression der Thromboxansynthase- mRNA im Lungengewebe reduzieren, kann nur durch die
Gabe von Indometacin die Ausscheidung der Indexmetaboliten im Urin vermindert werden.
42
7
7.1
Quellenverzeichnis
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8
Abkürzungsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis
AIS
Amnioninfektionssyndrom
ARDS
Akutes Respiratorisches Distress Syndrom
BSG
Blutsenkungsgeschwindigkeit
CAMP- Test
Christie, Atkins, Munch- Petersen Test
cDNA
Komplementäre Desoxyribonukleinsäure
COX
Cyclooxygenase
CrP
C reaktives Protein
CYP
Cytochrom P
CYP 2C9
Cytochrom P 2C9
CYP 3A4
Cytochrom P 3A4
DANN
Desoxyribonucleinsäure
dh TxB2
11- dehydro Thromboxan B2
dn keto PGF1a
2, 3- dinor 6- keto Prostaglandin F1a
dn TxB2
2, 3- dinor- Thromboxan B2
EKG
Elektrokardiogramm
EP 3
Prostaglandin E 3
FRET
Fluorescence resonance energy transfer
GBS
Streptokokken der Gruppe B
IL- 1
Interleukin 1
IL- 4
Interleukin 4
53
Abkürzungsverzeichnis
IL- 6
Interleukin 6
IL- 8
Interleukin 8
IL- 10
Interleukin 10
i.m.
Intramuskulär
i.v.
Intravenös
keto PGF1a
6- keto- Prostaglandin F1a
KG
Körpergewicht
MAD
Mittlerer arterieller Druck
MPAD
Mittlerer pulmonalarterieller Druck
MAP
Mean arterial pressure
MPAP
Mean pulmonal arterial pressure
mRNA
Messenger Ribonukleinsäure
NO
Stickoxid
NSAR
Nicht steroidale Antiphlogistika
PaCO2
Arterieller Kohlenstoffdioxidpartialdruck
PAF
Plättchenaktivierender Faktor
PaO2
Arterieller Sauerstoffpartialdruck
PCR
Polymerase- Ketten- Reaktion
PGF1a
Prostaglandin F1a
PGG2
Prostaglandin G2
PGH2
Prostaglandin H2
54
Abkürzungsverzeichnis
PGI2
Prostacyclin
PIP
Spitzendruck
PEEP
Positiv endexspiratorischer Druck
Q- PCR
Quantitative PCR
RNA
Ribonukleinsäure
SSW
Schwangerschaftswoche
TBXS
Thromboxan Synthase
TNF α
Tumornekrosefaktor α
TxA2
Thromboxan A2
TxB2
Thromboxan B2
ZVD
Zentralvenöser Druck
55
9
Abbildungsverzeichnis
Abbildungsverzeichnis
Abbildung 2–1: gram- gefärbte Streptokokken unter dem Lichtmikroskop
1
Abbildung 2–2: Pathogenesemodell der Sepsis nach X. Sáez- Llorens und
G.H. Mc Cracken Jr. 1993
8
Abbildung 2–3: Synthese von PGH2 aus Arachidonsäure
10
Abbildung 2–4: Prostaglandinsynthese durch verschiedene Synthasen
10
Abbildung 2–5: Strukturformel Indometacin
13
Abbildung 2–6: Strukturformel Parecoxib
14
Abbildung 2–7: Hydrolyse von Parecoxib zu Valdecoxib
15
Abbildung 3–1: Versuchsprotokoll der Studie
21
Abbildung 3–2: Polymerasekettenreaktion
24
Abbildung 4–1: Real- time PCR- Messung der IL 8- Suppression im
Lungengewebe: IL 8- mRNA bezogen auf das Housekeeping
Gen HPRT
26
Abbildung 4–2: Real- time PCR Messung der COX 2- Suppression im
Lungengewebe: COX 2- mRNA bezogen auf das
Housekeeping Gen HPRT
27
Abbildung 4–3: Messung der Suppression der Thromboxansynthase
28
Abbildung 4–4: Messung der Suppression des Prostaglandinrezeptors E 329
Abbildung 4–5: Messung des mittleren arteriellen Druckes in der Arteria
femoralis
31
Abbildung 4–6: Messung des mittleren pulmonalarteriellen Druckes
33
Abbildung 4–7: Messung von Thromboxan B2 im Urin
34
Abbildung 4–8: Messung von 2, 3- dinor- Thromboxan B2 im Urin
35
Abbildung 4–9: Messung von 11- dehydro- Thromboxan B2 im Urin
36
Abbildung 4–10: Messung von 6- keto Prostaglandin F1α im Urin
37
Abbildung 4–11: Messung von 2,3- dinor- 6- keto- Prostaglandin F1α im Urin
37
56
10 Anhang
10.1 Anhang 1: Erlaubnis Tierschutzkomission
Anhang
57
Danksagung
11 Danksagung
An dieser Stelle möchte ich mich bei Frau Dr. med. S. Nögel bedanken, die
meine Promotionsarbeit betreut hat.
Besonders danke ich außerdem meinen Eltern, Maximilian, Sebastian und
Benjamin, die mich im Laufe meines Studiums unterstützt haben und mir
nun während meiner Weiterbildungszeit zur Seite stehen.
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Lebenslauf
12 Lebenslauf
Persönliche Daten
Name
Julia Elfriede Astrid May
Geburtstag
21.06.1984 in Arnstadt
Familienstand
Ledig
Eltern
Dipl. - Ing. Holger May
Dipl. - Med. Astrid May
Geschwister
Zwei Brüder
Schulbildung
1994 – 2002
Neideck - Gymnasium Arnstadt
Studienverlauf
04/2003
Immatrikulation zum Studium der Humanmedizin an der
Friedrich- Alexander Universität Erlangen/Nürnberg
Seit 05/2005
Mitarbeit im „NeoLab“ der Universität Erlangen- Nürnberg
Seit 01/2006
Dissertation im „Neolab“ der Universität ErlangenNürnberg
Thema: Suppression von Interleukin 8, Cyclooxygenase
2, Prostaglandin E 3 und Prostaglandinen durch Parecoxib und Indometacin im Tiermodell der neonatalen BStreptokokkensepsis
Leitung: Herr Prof. Dr. med. Dr. h. c. W. Rascher,
Projektleitung: Herr PD Dr. med. M. Kandler
09/2005
Physikum
11/2009
2. Ärztliche Prüfung und Approbation als Ärztin
Exmatrikulation
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07/2011
Lebenslauf
Anzeige über die Annahme als Doktorandin und Antrag
auf Zulassung zum Promotionsverfahren
Berufserfahrung
09/2002
Praktikum Chirurgie
Kreiskrankenhaus Arnstadt
Betreuung: Pflegedienstleiterin Frau Uta Kessel
10/2002-
Krankenpflegepraktikum Chirurgie
11/2003
Kreiskrankenhaus Arnstadt;
Betreuung: Pflegedienstleiterin Frau Uta Kessel
01/2003-
Freiwilliges ökologisches Jahr
03/2003
Thüringer ÖKO- Herz e.V.
08/2005-
Studentische Nebentätigkeit als Hostess und Chef-
06/2008
hostess
Messen, Tagungen und andere Veranstaltungen
Inter Cris Messeagentur GmbH
02/2006-
Famulatur Gynäkologie und Geburtshilfe
03/2006
Praxis für Gynäkologie und Geburtshilfe Arnstadt
Betreuung: Facharzt Herr Ullrich Endisch
08/2006-
Famulatur Pädiatrie
09/2006
Klinik für Kinder- und Jugendmedizin der Ilm- Kreis- Kliniken Arnstadt- Ilmenau GmbH
Betreuung: Chefarzt Herr Dr. med. D. Stein
02/2007-
Famulatur Neurorehabilitation
03/2007
MediClin Hedon- Klinik, Fachklinik für Physikalische Medizin und Rehabilitation - neurologische Frührehabilitation Lingen (Ems)
Betreuung: Chefarzt Herr Prof. Dr. med. Th. Mokrusch
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03/2007
Lebenslauf
Famulatur Notfallmedizin
Notfallambulanz der Ilm- Kreis- Kliniken Arnstadt- Ilmenau
Betreuung: Leiter der Krankenhausaufnahme Facharzt
Herr Steffen Friese
07/2007-
Famulatur Notfallmedizin
08/2007
Notfallambulanz der Ilm- Kreis- Kliniken Arnstadt- Ilmenau
Betreuung: Leiter der Krankenhausaufnahme Facharzt
Herr Steffen Friese
08/2007
Famulatur Anästhesie
Abteilung für Anästhesie und Intensivmedizin des Wilhelminenspitals Wien
Betreuung: Oberarzt Herr Dr. med. W. Hartmann
07/2008-
Zusatzfamulatur Pädiatrie
08/2008
Klinik für Kinder- und Jugendmedizin der Ilm- Kreis- Kliniken Arnstadt- Ilmenau GmbH
Betreuung: Chefarzt Herr Dr. med. D. Stein
08/2008-
PJ Pädiatrie
10/2008
Kinder- und Jugendklinik, Universitätsklinikum Erlangen
Pädiatrische Nephrologie
Betreuung: Oberarzt Herr Prof. Dr. med. J. Dötsch
10/2008-
PJ Pädiatrie
12/2008
Kinder- und Jugendklinik, Universitätsklinikum Erlangen
Neonatologische Abteilung
Betreuung: Oberarzt Herr PD Dr. med. M. Schroth
12/2008-
PJ Innere Medizin
03/2009
Innere Abteilung der Kreisklinik Ottobeuren
Aufnahme- und Normalstation
Betreuung: Chefarzt Herr Dr. med. W. Pflederer
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Lebenslauf
03/2009-
PJ Chirurgie
07/2009
Chirurgische Abteilung der Kreisklinik Ottobeuren
Abteilungen für Allgemein- und Visceralchirurgie, Unfallund Orthopädische Chirurgie
Betreuung: Chefärzte Prof. Dr. med. U. Baumgartner
und Dr. med. S. Fritz
01/2010-
Ärztin in Weiterbildung
Vestische Kinder- und Jugendklinik Datteln
Ärztlicher Direktor: Prof. Dr. med. M. Paulusen
Seminare und Kurse
10/2005
Einführung in die Versuchstierkunde und tierexperimentelle Technik
09/2010
GCP- Kurs für Prüfärzte und Studienassistenz
Sonstige Qualifikationen
•
Sprachen: Englisch, Französisch Grundkenntnisse
•
EDV-Kenntnisse
•
Führerschein Klassen: B, M, L
Essen, den 27. November 2011