Molekulargenetische Untersuchungen zur kongenitalen
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Aus dem Institut für Tierzucht und Vererbungsforschung der Tierärztlichen Hochschule Hannover Molekulargenetische Untersuchungen zur kongenitalen Mikrophthalmie des Texelschafes INAUGURAL – DISSERTATION zur Erlangung des Grades eines Doktors der Veterinärmedizin (Dr. med. vet.) durch die Tierärztliche Hochschule Hannover vorgelegt von Jens Tetens aus Heide Hannover 2006 Wissenschaftliche Betreuung: Dr. Cord Drögemüller 1. Gutachter: Dr. Cord Drögemüller 2. Gutachter: Prof. Michael H. Boevé, PhD Tag der mündlichen Prüfung: 30. Mai 2006 Diese Arbeit wurde gefördert von der H. Wilhelm Schaumann Stiftung, Hamburg. Martina und meinen Eltern gewidmet. Inhaltsverzeichnis 1. Einführung.......................................................................................................................... 11 2. Literaturübersicht.............................................................................................................. 12 2.1. Augenentwicklung bei Vertebraten............................................................................... 12 2.1.1. Embryologische Grundlagen.................................................................................. 12 2.1.2. Genetische Aspekte der Augenentwicklung und von Augenmissbildungen ......... 16 2.2. Mikrophthalmie............................................................................................................. 21 2.1.2. Definition und Vorkommen ................................................................................... 21 2.1.2. Die kongenitale Mikrophthalmie des Texelschafes ............................................... 24 2.3. Genomkartierung........................................................................................................... 26 2.3.1. Genetische Kartierung............................................................................................ 27 2.3.2. Physikalische Kartierung........................................................................................ 28 2.3.3. Vergleichende Genomkartierung ........................................................................... 31 2.4. Stand der Genomanalyse beim Schaf............................................................................ 32 2.4.1. Genomkartierung beim Schaf................................................................................. 32 2.4.2. Molekulare Aufklärung hereditärer Merkmale ...................................................... 34 2.5. Schlussfolgerungen ....................................................................................................... 38 3. Material und Methoden..................................................................................................... 39 3.1 Material .......................................................................................................................... 39 3.1.1. Tiere und Probenmaterial ....................................................................................... 39 3.1.1.1. Beschaffung des Probenmaterials ................................................................... 39 3.1.1.2. Einteilung der Familien für die Kopplungsstudie ........................................... 39 3.1.1.3. Durchführung des Zuchtversuches.................................................................. 43 3.1.2. Oligonukleotide, Chemikalien, Verbrauchsmaterialien und Glaswaren ................ 46 3.1.2.1. Oligonukleotide............................................................................................... 46 3.1.2.2. Chemikalien .................................................................................................... 46 3.1.2.3. Verbrauchsmaterialien und Glaswaren ........................................................... 46 3.1.3. Laborgeräte............................................................................................................. 47 3.2. Methoden....................................................................................................................... 49 3.2.1. Versuchsstrategie ................................................................................................... 49 3.2.1.1. Kopplungsanalyse ........................................................................................... 49 3.1.1.2. Vergleichende RH-Kartierung ........................................................................ 51 3.2.2. Molekulargenetische Methoden ............................................................................. 52 3.2.2.1. Isolierung von genomischer DNA aus Vollblut.............................................. 52 3.1.2.2. Polymerasekettenreaktion (PCR) .................................................................... 52 3.1.2.3. Polyacrylamidgelelektrophorese ..................................................................... 53 3.1.2.3.1. Mikrosatellitengele................................................................................... 53 3.1.2.3.1. Auswertung der Mikrosatellitengele ........................................................ 55 3.1.2.3. Agarosegelelektrophorese ............................................................................... 55 3.2.3. Statistische Methoden und Computeranalysen ...................................................... 56 3.2.3.1. Abstammungskontrolle, Qualitätskontrolle der Genotypisierungsdaten und Pedigree-Analyse ..................................................................................... 56 3.2.3.2. Auswertung der Markereigenschaften ............................................................ 57 3.2.3.3. Kopplungs- und Haplotypenanlyse ................................................................. 57 3.2.3.4. Sequenzvergleich und Primerdesign ............................................................... 58 3.2.3.4. Radiation Hybrid Mapping.............................................................................. 58 3.2.4. Klinische Untersuchungen ..................................................................................... 59 3.2.5. Pathologisch-anatomische und pathologisch-histologische Untersuchungen........ 60 4. Ergebnisse ........................................................................................................................... 61 4.1. Klinische Untersuchungen ............................................................................................ 61 4.2. Pathologische und pathologisch-histologische Untersuchungen .................................. 63 4.3. Kopplungsanalyse ......................................................................................................... 68 4.3.1. Markerstatistik........................................................................................................ 68 4.3.2. Nicht-parametrische Kopplungsanalyse................................................................. 68 4.3.2.1. Analyse mit einem initialen Markerset ........................................................... 68 4.3.2.2. Analyse mit einem erweiterten Markerset ...................................................... 68 4.3.3. Parametrische Kopplungsanalyse für Chromosom 23 ........................................... 72 4.3.4. Haplotypenanalyse ................................................................................................. 74 4.4. Radiation- Hybrid Mapping .......................................................................................... 76 4.4.1. Markerentwicklung ................................................................................................ 76 4.4.2. Zweipunktanalyse................................................................................................... 80 4.4.3. Erstellung der RH-Karte......................................................................................... 80 5. Diskussion ........................................................................................................................... 84 5.1. Zuchtversuch ................................................................................................................. 84 5.2. Klinische und pathologische Untersuchungen .............................................................. 85 5.3. Kopplungs- und Haplotypenanalyse ............................................................................. 86 5.4. RH-Kartierung............................................................................................................... 91 6. Zusammenfassung.............................................................................................................. 98 7. Summary............................................................................................................................. 99 8. Literaturverzeichnis......................................................................................................... 100 9. Anhang .............................................................................................................................. 129 Anhang 1: In der Kopplungsanalyse eingesetzte Marker.. .............................................. 129 Anhang 2: Anzahl der Allele, Allelgrößen, PIC und Allelfrequenzen der in der Kopplungsanalyse eingesetzten Marker......................................................... 132 Anhang 3: Am Familienmaterial getestete Rindermikrosatelliten von BTA24............... 136 Anhang 4: Stammbäume der 28 Familien sowie Haplotypen für OAR23 ...................... 137 Anhang 5: In der RH-Kartierung eingesetzte STS- und EST- Marker.. .......................... 166 Anhang 6: Detaillierte Befunde der pathologisch-anatomischen und pathologischhistologischen Untersuchungen am Institut für Pathologie............................ 167 Abkürzungsverzeichnis A Adenin Abb. Abbildung ad. adult APS Ammoniumperoxidsulfat Aqua bidest. Aqua bidestilata, doppelt destilliert BAC bacterial artificial chromosome BES BAC-Endsequenz BLAST Basic Local Alignment Search Tool bp base pairs (Basenpaare) BTA Rinderchromosom, Chromosom von Bos taurus bzw. beziehungsweise C Cytidin ca. circa cDNA copyDNA (durch reverse Transkriptase aus mRNA erzeugt) CHI Ziegenchromosom, Chromosom von Capra hircus cM Centimorgan cm Zentimeter cR Centiray D genetische Distanz d.h. das heißt Diss. Dissertation DMSO Dimethylsulfoxid DNA deoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure) EDTA Ethylendiamintetraacetat EST expressed sequence tag et al. et alii E-Wert Erwartungswert, Expectation value FISH Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung G Guanidin g Gramm h Stunde HCl Salzsäure HET Heterozygotiegrad HLOD Heterogeneity LOD IBD identical by descent IMF International Mapping Flock der AGResearch, Neuseeland INRA Institut National de la Recherche Agronomique juv. juvenil Kap. Kapitel kb Kilobasen kg Kilogramm KG Körpergewicht l Liter ln natürlicher Logarithmus LOD Logarithm logarithm of the odds log dekadischer Logarithmus M Molar (mol / l) mA Milliampére MARC Meat Animal Research Center des USDA Mb Megabasen min Minute ml Milliliter mM Millimolar (mmol / l) mRNA messenger-RNA MS Mikrosatellit µl Mikroliter NCBI National Center for Biotechnology Information nm Nanometer OAR Schafchromosom, Chromosom von Ovis aries OMIA Online Mendelian Inheritance in Animals PAA Polyacrylamid PCR polymerase chain reaction (Polymerasekettenreaktion) pg Pikogramm PIC polymorphism information content Prnp Prionprotein RFLP Resriktionsfragmentlängen-Polymorphismus RH radiation hybrid RNA ribonucleic acid (Ribonukleinsäure) s Sekunde s. siehe skFS Schwarzköpfiges Fleischschaf SNP single nucleotide polymorphism sOMS Schwarzes Ostfriesisches Milchschaf SSCP single strand conformation polymorphism STS sequence tagged site T Thymidin Tab. Tabelle TBE TRIS-Borat-EDTA-Puffer TEMED N,N,N,N-Tetramethylendiamin TRIS Aminohydroxymethylpropandiol TSP-Units ,Travelling Salesman Problem´ - Units θ Rekombinationsfrequenz oder Bruchfrequenz U Units (Enzymeinheiten) USDA United States Department for Agriculture UV-Licht ultraviolettes Licht V Volt v/v Volumen zu Volumen W Watt w/v Gewicht zu Volumen z.B. zum Beispiel Einführung 11 1. Einführung Seit der Einfuhr von Schafen der Rasse Texel aus den Niederlanden nach Deutschland in den 1960er Jahren sind in verschiedenen Zuchtgebieten immer wieder Lämmer mit bilateraler Mikrophthalmie ohne weitere Missbildungen geboren worden (HARING und GRUHN 1970). Bereits Ende der 1950er Jahre war der Defekt in den Niederlanden und Frankreich beschrieben worden (DE GROOT 1957; ZWIEP 1958; HANSET 1961). Im Jahre 2003 wurde das Auftreten erstmals für Neuseeland beschrieben (ROE et al. 2003). Die betroffenen Lämmer sind hilflos und finden in der Herde ihre Mutter nicht. Sie bedürfen zu ihrer Erhaltung bis zum schlachtreifen Alter der besonderen individuellen Pflege und Betreuung, welche ihnen aber in der Praxis von großen Schäfereien in der Regel nicht zuteil werden kann. Daher müssen sie im Allgemeinen den Lämmerverlusten zugerechnet werden. Bisherige Untersuchungen zur kongenitalen Mikropthalmie des Texelschafes beschäftigen sich hauptsächlich mit morphologischen Aspekten (LABS 1977; VAN DER LINDE SIPMAN et al. 2003). Genetische Untersuchungen konnten einen monogen autosomal rezessiven Erbgang zeigen (HARING und GRUHN 1970). Im Jahr 2000 wurden allein in Deutschland mehr als 230.000 Texelmutterschafe gehalten. Die Gründe dafür sind die gute Fleischleistung und die Eignung zur Koppelschafhaltung. Dadurch wird das Texelschaf zum einen der stärkeren Fokussierung auf die Schlachtlammerzeugung und zum anderen der heute üblichen Koppelhaltung gerecht (SÜSS 2001). Der zunehmende Anteil an Texelschafen sowie die Einkreuzung von Texelschafen in andere Rassen hat zur Verbreitung der Mikrophthalmie beigetragen. In Deutschland werden keine systematischen Daten zum Auftreten von angeborenen Anomalien beim Schaf erfasst. In der niederländischen Zuchtpopulation wird jedoch von einer Häufigkeit von 10% unerkannten Anlageträgern ausgegangen. Eine ungezielte Anpaarung dieser heterozygoten Elterntiere erklärt das nach wie vor relativ häufige Auftreten des Defekts. Für eine effektive Bekämpfung der Mikrophthalmie ist der Zuchtausschluss von Anlageträgern notwendig. Das würde bedeuten, die Eltern betroffener Lämmer sowie all deren Nachkommen von der Zucht auszuschließen, was in der Praxis jedoch nicht durchgeführt wird. Um Anlageträger zukünftig ohne einen zeitaufwändigen Nachkommentest zu identifizieren, soll ein gendiagnostisches Verfahren entwickelt werden. Das Ziel dieser Arbeit ist die Identifizierung der chromosomalen Lokalisation des für die kongenitale Mikrophthalmie des Texelschafes verantwortlichen Defektgens mit einer anschließenden Feinkartierung im Schafgenom. 12 Literaturübersicht 2. Literaturübersicht 2.1. Augenentwicklung bei Vertebraten 2.1.1. Embryologische Grundlagen Die verschiedenen Anteile des Auges und seiner Hilfsorgane entstammen unterschiedlichen Keimblättern. Während die Retina, der Nervus opticus und der größte Teil des Glaskörpers Derivate des Neuroektoderms sind, bilden sich Linse, Hornhautepithel, Liddrüsen und Tränenapparat aus dem Oberflächenektoderm. Alle übrigen Strukturen des Auges entwickeln sich aus dem Mesoderm. Dazu gehören die Sklera, die Choroidea, das Stroma des Ziliarkörpers und der Musculus ciliaris (SCHNORR und KRESSIN 2001). Während der Phase der Gastrulation wird die Augenanlage vom unpaaren Augenfeld gebildet. Dieses liegt median am vorderen Ende der Neuralplatte. Die unpaare Anlage teilt sich und die getrennten Augenanlagen erfahren eine Lateralisation (GRAW 2003). Das erste morphologische Zeichen der Augenentwicklung im Stadium der frühen Neurula ist dann die Ausbildung der Augengruben, die sich schließlich durch Ausstülpung des Diencephalons zu den Augenblasen entwickeln (CHOW und LANG 2001). Die Augenblasen wachsen durch das Mesenchym hindurch auf das Oberflächenektoderm zu. Dabei setzen sie sich durch den Augenblasenstiel immer weiter vom Zwischenhirn ab (SCHNORR und KRESSIN 2001). Die Augenblase tritt schließlich unter Verdrängung des Mesenchyms mit dem sich dabei zur Linsenplakode verdickenden Oberflächenepithel in Kontakt. Morphologisches Äquivalent der an diesem entscheidenden Punkt der Augenentwicklung ablaufenden Induktionsvorgänge ist der enge Kontakt zwischen Augenblase und Linsenplakode, die durch ein Netzwerk von zahlreichen Kollagenfibrillen und Zytoplasmafortsätzen miteinander in Verbindung treten (MCAVOY 1980). Mit der Verdickung des Oberflächenektoderms zur Linsenplakode beginnt die Entwicklung der Linse. Auf molekularer Ebene ist dies gekennzeichnet durch den Beginn der CrystallinExpression (GRAW 1996, 1997, 2004; BHAT 2003). Als Ergebnis der Interaktionen zwischen Linsenplakode und Augenblase stülpt sich die Linsenplakode zur Linsengrube und zum Linsenbecher ein und schnürt sich schließlich als Linsenbläschen vollständig vom Oberflächenektoderm ab. Dabei wird die Augenblase zum doppelwandigen Augenbecher eingestülpt (SCHNORR und KRESSIN 2001). Literaturübersicht 13 Gleichzeitig mit dem Umformungsprozess zum Augenbecher wird dessen unterer mittlerer Rand zur Becherspalte eingestülpt, die sich als Stielrinne auf den Augenbecherstiel fortsetzt. Gemeinsam stellen sie die fetale Augenspalte oder optische Fissur dar, in welche die Arteria hyaloidea einwächst. Die Ränder der Augenspalte vereinigen sich miteinander, so dass der Augenbecherstiel zu einem doppelwandigen Rohr wird, in dem die Arteria hyaloidea verläuft. Gleichzeitig rundet sich die Öffnung des Augenbechers ab und bildet die vorläufige Pupille (CHOW und LANG 2001; SCHNORR und KRESSIN 2001). Ein unvollständiger Schluss der fetalen Augenspalte ist die embryologische Grundlage kongenitaler Kolobomata (ONWOCHEI et al. 2000; LEVIN 2003; GREGORY-EVANS et al. 2004). In der weiteren Entwicklung der Linse beginnen die Zellen der retinaseitigen Wand des Linsenbläschens in die Länge zu wachsen und primäre Linsenfasern zu bilden. Dabei schwindet der flüssigkeitsgefüllte Hohlraum und die Linse wird zu einem soliden Gebilde. Die Zellen der anterioren Seite bleiben ein Leben lang als Linsenepithel erhalten. Mitotisch aktive Zellen des Linsenepithels wachsen im Bereich des Linsenäquators in die Länge und differenzieren sich zu sekundären Linsenfasern. Das ist ein Prozess, der sich lebenslang fortsetzt (RÜSSE und SINOWATZ 1991). Das innere Blatt der Augenbecherwandung entwickelt sich zur Neuroretina, während das äußere Blatt sich zum Pigmentepithel weiterentwickelt (SCHNORR und KRESSIN 2001). Das vordere Fünftel des Augenbechers entwickelt sich zur Pars caeca retinae, während der hintere Teil sich zur Pars optica retinae differenziert. Im vorderen Teil bleiben beide Blätter einschichtig. Die beiden Blätter verwachsen miteinander und überziehen als Pars ciliaris retinae bzw. Pars iridica retinae den Ziliarkörper und die Iris. Am Pupillenrand gehen beide Blätter ineinander über. Im Bereich der Pars optica retinae bleibt das äußere Blatt einschichtig und entwickelt sich zum Pigmentepithel (Stratum pigmentosum). Das innere Blatt bildet die vielschichtige Neuroretina (Stratum nervosum). Diese Entwicklung beginnt mit der Bildung einer Neuroepithelschicht, aus der die Photorezeptoren (Stäbchen und Zapfen) und die so genannte Mantelschicht hervorgehen. Die Mantelschicht differenziert sich zu den übrigen Anteilen der Neuroretina (Ganglienzellen, bipolare Zellen, amakrine Zellen, Horizontalzellen, Stützzellen) (SCHNORR und KRESSIN 2001). Die Neuriten der Ganglienzellen der Netzhaut wachsen im Bereich des späteren Sehnervenkopfes in den Augenbecherstiel ein. Dieser dient den auf das Gehirn zuwachsenden Neuriten als Leitstruktur und aus seinen Epithelzellen gehen die Gliazellen des Nervus opticus hervor (SCHNORR und KRESSIN 2001; GRAW 2003). 14 Literaturübersicht Zeitgleich mit der Entwicklung von Retina und Linse kommt es auch zur Bildung des Glaskörpers. Er entwickelt sich aus Mesenchymzellen, die mit der Arteria hyaloidea in den Augenbecher eingewandert sind und aus Gliazellen der Retina (Müller´sche Stützzellen). Bereits vor dem Schluss der Augenspalte beginnen diese mit der Bildung von radiären Fasern, die bis an die Hinterseite der Linse reichen. Diese Fasern liefern die Grundlage des primitiven Glaskörpers. Später bilden sie Querverzweigungen, wodurch das Grundgerüst des definitiven Glaskörpers gebildet wird. In den Maschen dieses Netzwerkes lagert sich eine extrazelluläre Matrix ein, die reich an Glykosaminoglykanen, insbesondere Hyaluronsäure, ist. Die Arteria hyaloidea, welche im Wesentlichen für die Versorgung der Linse zuständig ist, durchquert anfangs noch innerhalb eines Kanals (Canalis hyaloideus) den Glaskörper. Gegen Ende der Gravidität obliteriert sie und der Canalis hyaloideus wird vom Glaskörper ausgefüllt (RÜSSE und SINOWATZ 1991; SCHNORR und KRESSIN 2001). Die Entwicklung der Kornea und der vorderen Augenkammer erfolgt gemeinsam. Die Bildung der Kornea aus dem Oberflächenektoderm sowie aus dem umgebenden Mesenchym, das der Neuralleiste entstammt, ist ein mehrstufiger Prozess, in dem das Linsenbläschen die Bildung des Korneaepithels aus dem über ihm liegenden Ektoderm induziert (HAY 1979; CHOW und LANG 2001). Das Corneaepithel besteht aus ein bis zwei Zelllagen, die einer Basalmembran (Bowman´sche Membran) aufsitzen (GOULD et al. 2004). Die Epithelzellen sezernieren eine kollagenreiche extrazelluläre Matrix. Später kommt es zur Einwanderung von Mesenchymzellen aus dem periokulären Gewebe. Diese Migration erfolgt in zwei Wellen (CHOW und LANG 2001; GRAW 2003). Die während der ersten Welle einwandernden Mesenchymzellen formieren sich zum Korneaendothel, das ebenfalls einer Basalmembran (Descemet´sche Membran) aufliegt. Die während der zweiten Migrationswelle einwandernden Zellen differenzieren sich zu Keratinozyten. Sie sezernieren Kollagen Typ I und Hyaluronidase, was zur Schrumpfung des umgebenden Stromas führt. Unter dem Einfluss eines erhöhten Thyroxinspiegels aus der sich entwickelnden Schilddrüse kommt es parallel zur Dehydratation des Stromas. So entwickelt sich aus der kollagenreichen extrazellulären Matrix, die einerseits von den Zellen des Korneaepithels und andererseits von den Keratinozyten produziert wurde, die transparente Kornea (GRAW 2003). Nach der Formierung des Korneaendothels kommt es zwischen Kornea und Linse zur Bildung eines Spaltes, der die Anlage der vorderen Augenkammer darstellt (GOULD et al. 2004). Die Entwicklung eines funktionellen Endothels scheint eine Grundvoraussetzung für die Bildung der vorderen Augenkammer zu sein (KIDSON et al. 1999; RENEKER et al. 2000). Literaturübersicht 15 Das hinter der vorderen Augenkammer am Frontalpol der sich entwickelnden Linse liegende Mesenchym entwickelt sich peripher zum Irisstroma, während es zentral die Membrana pupillaris bildet. Diese Membran enthält zahlreiche Blutgefäße, die der Versorgung der gefäßlosen Linse dienen. Diese Gefäße stehen in Verbindung mit dem aus der Arteria hyaloidea kommenden Gefäßsystem der Tunica vasculosa lentis (CRISPIN 2000). Im letzten Drittel der Gravidität atrophieren die Blutgefäße. Die Tunica vasculosa lentis und die Membrana pupillaris verschwinden (RÜSSE und SINOWATZ 1991). Eine ungenügende Rückbildung wird als Membrana pupillaris persistens bezeichnet (JACOBS et al. 1991; CRISPIN 2000; LEVIN 2003). Der periphere Bereich der Membrana pupillaris entwickelt sich zum Irisstroma. Dieses verbindet sich mit dem vorderen Rand des zweischichtigen Augenbechers (Pars iridica retinae) zur Iris. Nach Auflösung der Membrana pupillaris stehen vordere und hintere Augenkammer miteinander in Verbindung und die definitive Pupille ist entstanden (SCHNORR und KRESSIN 2001). Das dem Augenbecher außen direkt anliegende Mesenchym differenziert sich innen zur Aderhaut (Choroidea) und verdichtet sich außen zur faserreichen Sklera. Außerdem stellt das Mesenchym die Grundlage für die Ziliarfortsätze und den Musculus ciliaris dar. Zusammen mit der Pars ciliaris retinae wird so der Ziliarkörper gebildet (SCHNORR und KRESSIN 2001). Über die zeitliche Abfolge der Ereignisse während der Augenentwicklung gibt es insbesondere für den Menschen und die Maus detaillierte Angaben (CVEKL und PIATIGORSKY 1996; GRAW 2004). Abbildung 2-1 zeigt den zeitlichen Verlauf der wichtigsten Ereignisse der Augenentwicklung am Beispiel der Maus. Diesbezügliche Angaben sind für das Schaf nur begrenzt verfügbar. Die Augenblase ist beim Schaf am 19. Tag der Gravidität entwickelt und am Tag 21 ist die Linsenplakode auszumachen. Der Augenbecher entwickelt sich zwischen dem 24. und 25. Tag (RÜSSE und SINOWATZ 1991). Am Tag 24 ist erkennbar, dass sich das Linsenbläschen vom Oberflächenektoderm separiert hat und zwei Tage später ist es bereits teilweise mit primären Linsenfasern angefüllt und die vordere Augenkammer beginnt sich zu entwickeln (VAN DER LINDE-SIPMAN et al. 2003). 16 Literaturübersicht Abbildung 2-1: Ablauf der grundlegenden Prozesse der Augenentwicklung am Beispiel der Maus (modifiziert nach CVEKL und PIATIGORSKY 1996) 2.1.2. Genetische Aspekte der Augenentwicklung und von Augenmissbildungen Man kennt heute eine Vielzahl von Genen der Augenentwicklung und auch viele okuläre Phänotypen, die durch Mutationen in diesen Genen hervorgerufen werden. Je weiter oben Gene in der Hierarchie der Augenentwicklung liegen, desto früher in der Augenentwicklung werden sie exprimiert und desto schwerwiegender sind in der Regel die Defekte, die Mutationen in diesen Genen hervorrufen können. Die bisher identifizierten Gene, die am Anfang der Entwicklungskaskade stehen und grundlegende Prozesse der Augenentwicklung in Gang setzten sowie weitere Gene, für die ein Mikrophthalmie-Phänotyp bei Mensch oder Maus bekannt ist, werden im Folgenden dargestellt (Tab. 2-1). Unter den in Tabelle 2-1 aufgeführten Genen sind zahlreiche, die als ursächlich für Mikrophthalmie-Phänotypen identifiziert wurden. Bislang sind jedoch lediglich fünf dieser Gene (CHX10, SHH, SOX2, RAX, MFRP) mit kausalen Mutationen für die isolierte nicht syndromische bilaterale Literaturübersicht 17 Mikrophthalmie aufgeklärt worden. Für die beiden Phänotypen NNO1 (OTHMAN et al. 1998) und MCOP (BESSANT et al. 1999) sowie einen weiteren, noch unbenannten Phänotyp (MICHON et al. 2004) konnte bislang eine Kopplung zu bestimmten Chromsomenabschnitten identifiziert werden, jedoch sind die ursächlichen Genveränderungen derzeit noch unbekannt. Gene, die mittels der von ihnen in der Regel codierten Transkriptionsfaktoren eine Reihe ihnen hierarchisch untergeordneter Gene unter Kontrolle halten und dadurch grundlegende Mechanismen der Entwicklung kontrollieren, werden als so genannte Master-Kontrollgene bezeichnet. Andere entwicklungssteuernde Gene codieren für Signalmoleküle, Rezeptoren, Elemente der Signaltransduktion oder extrazelluläre Enzyme (MÜLLER und HASSEL 1999; GRAW 2003). Drosophila stellt einen Schlüsselorganismus dar, anhand dessen viele Zusammenhänge der Augenentwicklung bei Vertebraten aufgeklärt werden konnten. Man kennt sieben grundlegende Kontrollgene der Augenentwicklung bei Drosophila: twin of eyeless (toy), eyless (ey), eyes absent (eya), sine oculis (so), optix (opt), eye gone (eyg) und dachshund (dac) (BONINI et al. 1993; CHEYETTE et al. 1994; MARDON et al. 1994; QUIRING et al. 1994; SERIKAKU und O´TOUSA 1994; HALDER et al. 1998; CZERNY et al. 1999; SEIMIYA und GEHRING 2000). Eine Null-Mutation in einem dieser Gene resultiert in einem Fehlen der Augen oder zumindest einer drastischen Reduktion des Auges (KUMAR 2001). Im Gegenzug sind diese Gene mit Ausnahme von sine oculis in der Lage, die ektopische Bildung okulärer Strukturen zu induzieren (HALDER et al. 1995; SHEN und MARDON 1997; CZERNY et al. 1999; SEIMIYA und GEHRING 2000; KUMAR und MOSES 2001). Das Studium dieser so genannten Kerngene hat grundlegende Erkenntnisse über ihr Zusammenwirken in der Augenentwicklung und über grundlegende Prinzipien der Entwicklungsbiologie geliefert. Wenngleich das Zusammenspiel dieser Gene hierarchisch strukturiert ist, folgen sie keiner einfachen linearen Hierarchie (Abb. 2-2). Vielmehr handelt es sich um ein dichtes Netzwerk von regulatorischen Interaktionen, in dem neben diesen sieben zentralen Genen noch zahlreiche andere Faktoren eine Rolle spielen (HANSON 2001; KUMAR 2001). 18 Literaturübersicht Abbildung 2-2: Genetische Steuerung der Augenentwicklung: grundlegende Wechsel- wirkungen zwischen den sieben so genannten Kerngenen der Augenentwicklung bei Drosophila. (modifiziert nach TREISMAN 1999 und KUMAR 2001). Sowohl für die oben genannten Gene als auch für weitere bei Drosophila identifizierte Gene der Augenentwicklung existieren orthologe Gene in Wirbeltieren. Von den sieben Kerngenen bei Drosophila sind die beiden paralogen Gene eyeless und twin of eyeless dem PAX6 des Menschen ortholog, wobei twin of eyeless in der Hierarchie der Augenentwicklung bei Drosophila noch oberhalb von eyless steht (QUIRING et al. 1994; CZERNY et al. 1999). Ein orthologes Gen von eye gone, das synergistisch mit eyeless wirkt, ist bei Wirbeltieren nicht bekannt (JANG et al. 2003). Es codiert jedoch ein PAX-ähnliches Protein, das in seiner Struktur der Pax6-Isoform Pax6(5a) ähnelt (DOMINGUEZ et al. 2004). Es konnte gezeigt werden, dass Mäuse, die zwar Pax6 aber kein Pax(5a) exprimieren können, Irishypoplasie und Defekte an Kornea, Retina und Linse zeigen (SINGH et al. 2001). Die Gene sine oculis und optix codieren Transkriptionsfaktoren, die neben eine DNA bindenden HomöoboxDomäne eine proteinbindende so genannte sine oculis-Domäne enthalten. Bei Wirbeltieren hat man die sechs orthologen Gene SIX1-6 (sine oculis homeobox homolog 1-6) identifiziert. Von diesen sechs Genen hat SIX3 die größte Ähnlichkeit zu sine oculis, während SIX6 (Optx2) die größte Ähnlichkeit mit optix aufweist. Beide Wirbeltiergene spielen eine wichtige Rolle in der Augenentwicklung (SEO et al. 1999; KENYON et al. 2005). Die drei während der Embryonalentwicklung bei Wirbeltieren in unterschiedlichen okulären Strukturen exprimierten Gene EYA1-3 stellen Orthologe des Drosophila-Gens eyes absent dar, während Literaturübersicht 19 DACH1 bei Wirbeltieren ortholog zu dachshund bei Drosophila ist (BONINI et al. 1997; TREISMAN 1999). PAX6 ist der Prototyp des Master-Kontrollgens der Augenentwicklung. Es konnte gezeigt werden, dass die ektopische Expression von eyeless in Drosophila zur Bildung funktionsfähiger zusätzlicher Augen führt. Der gleiche Effekt kann bei Drosophila durch das murine Pax6 induziert werden. Beide Gene haben also die gleiche Funktion: sie initiieren die Augenentwicklung und starten damit eine Kaskade, an der ca. 2000 Gene beteiligt sind (HALDER et al. 1995; GEHRING 2000). Die Beobachtung, dass sowohl die Entwicklung der Facettenaugen von Drosophila, als auch die Entwicklung des Wirbeltierauges durch das gleiche orthologe Gen induziert werden konnten, hat zur Theorie einer monophyletischen Evolution des Auges geführt (GEHRING 2002, 2005), die jedoch kontrovers diskutiert wird (BAILEY et al. 2004). Es gibt mehrere bekannte Phänotypen bei Mensch und Maus, die auf Mutationen im PAX6 Gen beruhen. Eine Haploinsuffizienz aufgrund einer heterozygoten Null-Mutation führt bei small eye Mäusen zu Mikrophthalmie (HILL et al. 1991). Beim Menschen ist PAX6 Haploinsuffizienz die häufigste Ursache der erblich bedingten Aniridie. Das Erscheinungsbild dieses Defektes ist sehr variabel und schließt die so genannte Peters-Anomalie ein (VAN HEYNINGEN und WILLIAMSON 2002; Human PAX 6 Allelic Variant Database Website: http://pax6.hgu.mrc.ac.uk/). PAX6 spielt auch bei der Entwicklung weiterer Organe eine zentrale Rolle, da homozygote Null-Mutationen neben Anophthalmie auch zu Nasenmissbildungen sowie Hirn- und Pankreasmissbildungen führen und perinatal letal sind (HILL et al. 1991; GLASER et al. 1994; GRINDLEY et al. 1995; ST-ONGE et al. 1997). Tabelle 2-1: Gene für Transkriptionsfaktoren, Signalmoleküle sowie Linsen- und Transmembranproteine, die bei kongenitalen Augenanomalien von Mensch und Maus beteiligt sind (modifiziert nach WAWERSIK und MAAS 2000; KUMAR 2001; GRAW 2003). Gen1) Fkt.2) Phänotypen / Bemerkungen PAX6 RAX TF TF SOX2 TF siehe Text Mensch: Anophthalmie / Mikrophthalmie bei Haploinsuffizienz (VORONINA et al. 2004) Maus: Rezessive Anophthalmie (TUCKER et al. 2001) Der Effekt tritt sehr früh auf; bereits die Bildung der Augenblase bleibt aus, was darauf hindeutet, dass Rax bei Wirbeltieren in der Hierarchie über Pax6 steht (MATHERS et al. 1997; ZHANG et al. 2000; BAILEY et al. 2004). Mensch: Anophthalmie / Mikrophthalmie (FANTES et al. 2003) 20 Literaturübersicht Tabelle 2-1: Fortsetzung. Gen1) Fkt.2) Phänotypen / Bemerkungen SIX3 TF SIX6 (Optx2) EYA1 TF TF DACH1 TF PITX2 TF PITX3 TF FOXC1 TF FOXE3 TF MAF TF CHX10 TF MITF TF VSX1 OTX1 TF TF Mensch: Holoprosenzephalie bei Haploinsuffizienz, aber auch mildere Phänotypen mit Mikrophthalmie und Kolobomata (WALLIS et al. 1999) Mensch: Chromosomale Deletionen der Optx2-Region führen zu bilateraler Anophthalmie (GALLARDO et al. 1999, 2004). Mensch: branchio-oto-renales Syndrom bei Haploinsuffizienz (ABDELHAK et al. 1997); auch andere Mutationen sind bekannt, die Katarakte und Missbildungen des vorderen Augensegmentes hervorrufen (AZUMA et al. 2000). Auch EYA2 und EYA3 werden im Auge in Abhängigkeit von Pax6 exprimiert (BONINI et al. 1997 XU et al. 1997). Null-Mutationen des dachshund-Gens (dac) führen bei Drosophila neben anderen Mutationen zum Fehlen der Augen (MARDON et al. 1994). Die Rolle des dachshund-Homologs Dach1 in der Augenentwicklung der Wirbeltiere ist unklar, wenngleich das Expressionsmuster eine Rolle in der Augenentwicklung nahe legt (DAVIS et al. 1999). Mensch: PITX2-Mutationen wurden im Zusammenhang mit verschiedenen Missbildungen des vorderen Augensegmentes (AxenfeldRieger-Syndrom, Irishypoplasie) identifiziert (WALTER 2003). Mensch: Katarakt und mesenchymale Dysgenesie des vorderen Augensegmentes (SEMINA et al. 1998) Maus: Aphakie (SEMINA et al. 2000; RIEGER et al. 2001) Mensch: Axenfeld-Rieger-Syndrom, Glaukom (MEARS et al. 1998; NISHIMURA et al. 1998; SMITH et al. 2000) Mensch: Defekte des vorderen Augensegmentes, Peters-Anomalie (SEMINA et al. 2001; ORMESTADT et al. 2002; LEHMANN et al. 2003) Maus: Linsenmissbildungen in homozygoten Tieren (BLIXT et al. 2000) Mensch: Katarakte, Mikrophthalmie, Kolobomata (JAMIESON et al. 2002; LYON et al. 2003) Maus: Katarakt in heterozygoten Tieren; in homozygoten Tieren neben anderen Missbildunegn Mikrophthalmie und Katarakt (RING et al 2000); Verschiedene Autoren konnten eine Beteiligung an der Regulation der Crystallin-Expression nachweisen (GRAW 2004). Mensch: Mikrophthalmie und Katarakt (PERCIN et al 2000; BARYOSEF et al. 2004) Maus: Mikrophthalmie (BURMEISTER et al. 1996) In homozygoten Knock-out Mäusen lassen sich noch in der adulten Retina Progenitorzellen nachweisen (DHOMEN et al. 2006). Mensch: Waardenburg-Syndrom (LALWANI et al. 1998; HERSHEY und FISHER 2005) Maus: Mikrophthalmie (STEINGRIMSSON 1994) Mensch: Keratokonus und Korneadystrophie (HÉON et al. 2002) Maus: Augenmissbildungen in Knock-out-Mäusen (ACAMPORA et al. 1996; SIMEONE et al. 2002) Literaturübersicht 21 Tabelle 2-1: Fortsetzung. Gen1) Fkt.2) Phänotypen / Bemerkungen SHH SM BMP4 SM BMP7 SM GJA1 LP MFRP (NNO2) TM Mensch: Holoprosenzephalie, Mikrophthalmie mit Kolobomata (SCHIMENTI et al. 2003) Maus: Shh-knock-out-Mäuse zeigen schwere Entwicklungsdefekte inklusive Zyklopie (CHIANG et al. 1996). Es ist anzunehmen, dass SHH sehr weit oben in der Hierarchie steht, denn die Zyklopie resultiert aus dem Ausbleiben eines der frühesten Ereignisse in der Augenentwicklung, nämlich der Zweiteilung des Augenfeldes. Maus: Heterozygote Knock-out-Mäuse zeigen Anomalien des vorderen Augensegmentes; in homozygoten Tieren bleibt die Bildung der Linsenplakode aus (FURUTA und HOGAN 1998). Maus: Eine Deletion des Bmp7-Gens führt zu schweren renalen Missbildungen und Anophthalmie (DUDLEY et al. 1995; LUO et al. 1995); die PAX6-Expression bleibt aus, was eine Rolle upstream von Pax6 nahe legt (WAWERSIK et al. 1999). Mensch: Neben andere Missbildungen treten Katarakte, Mikrophthalmie sowie Missbildungen des vorderen Augensegmentes auf (PAZNEKAS et al. 2003). Mensch: isolierte bilaterale Mikrophthalmie (SUNDIN et al. 2005) 1) PAX6: paired box gene 6; RAX: retina and anterior neural fold homeobox gene; SOX2: SRYbox-containing gene 2; SIX: sine oculis homeobox homolog; Optx2: optic homeobox 2; EYA: eyes absent homolog; DACH1: dachshund homolog 1; SHH: sonic hedgehog homolog; BMP: bone morphogenic protein; PITX: paired-like homeodomain transcription factor; FOX: forkhead box C1; MAF: musculoaponeurotic fibrosarcoma oncogene homolog; CHX10: Caenorhabditis elegans ceh-10 homeodomain containing homolog; MITF: microphthalmia associated transcription factor; VSX1: visual system homeobox 1 homolog; OTX1: orthodenticle homolog 1; GJA1: gap-junction membrane-channel protrein; NNO: nanophthalmus; MFRP: membrane-type Frizzled-related protein;. 2) Funktion: TF: Transkriptionsfaktor; SM: Signalmolekül; LP: Linsenprotein; TM: Transmembranprotein. 2.2. Mikrophthalmie 2.1.2. Definition und Vorkommen Als Mikropthalmie werden alle Fälle von Augenmissbildungen bezeichnet, bei denen der Augapfel eine mehr oder weniger ausgeprägte Verkleinerung zeigt. Es sind jedoch stets Bulbusreste in der Orbita vorhanden, was die Mikrophthalmie von der Anophthalmie abgrenzt, die durch ein vollständiges Fehlen okulärer Strukturen gekennzeichnet ist. Das ist 22 Literaturübersicht jedoch ein vergleichsweise seltenes Ereignis. In den meisten Fällen von klinischer Anophthamie lassen sich durch histopathologiache Serienschnitte Reste okulärer Strukturen in der Orbita nachweisen (COOK 1998). Das von Mikrophthalmie betroffene Auge kann weitgehend normal oder von weiteren Missbildungen betroffen sein. Die Ursache der Mikrophthalmie ist ein Sistieren der Augenentwicklung in dem Zeitraum nach der Bildung der Augenblase. Das Ausmaß der Affektionen ist davon abhängig, zu welchem Zeitpunkt das Sistieren der Augenentwicklung einsetzt. Wird die Entwicklung noch vor dem Schluss der fetalen Augenspalte gestört, ist in der Regel mit weiteren okulären Defekten wie zum Beispiel einer Dysgenesie des vorderen Augensegmentes, Katarakt oder Retinadysplasie zu rechnen. Findet die Störung jedoch erst zu einem späteren Zeitpunkt statt, resultiert daraus ein einfacher Mikrophthalmus, das heißt ein verkleinerter Augapfel ohne größere Missbildungen (RÜSSE und SINOWATZ 1991). Diese Form der Mikrophthalmie bezeichnet man auch als Nanophthalmus (GELATT 2000). Auf Grund dieser unterschiedlichen Formen und Ausprägungsgrade ist die Beeinträchtigung des Sehvermögens variabel. Diese reicht von einer leichten Fehlsichtigkeit bis hin zu völliger Blindheit. Angaben darüber, unterhalb welcher Bulbusgröße man von Mikrophthalmie spricht, fehlen für die Haustiere. In der Humanmedizin findet ein Klassifizierungsschema Anwendung, demzufolge unterhalb eines anterio-posterioren axialen Bulbusdurchmessers von 20 mm bei Neugeborenen eine Mikrophthalmie vorliegt (WARBURG 1993). Mikrophthalmie tritt häufig syndromisch, das heißt in Verbindung mit anderen Missbildungen auf. Dabei handelt es sich in erster Linie um Gesichtsmissbildungen, aber auch andere Organsysteme sind beteiligt (RÜSSE und SINOWATZ 1991). Das Auftreten von Mikrophthalmie ist für verschiedene Spezies beschrieben. In der OMIA (Online Mendelian Inheritance in Animals) Datenbank (http://omia.angis.org.au/) befinden sich derzeit 15 Einträge von Mikrophthalmie- oder Anophthalmie-Phänotypen bei 10 verschiedenen Wirbeltierspezies. Beim Rind ist das Auftreten von Mikrophthalmie und Anophthalmie bei Kälbern verschiedener Rassen beschrieben worden (ZAYED und GHANEM 1964; LEIPOLD und HOUSTON 1968; MORIMOTO et al. 1994). Anophthalmie wurde isoliert, in Verbindung mit Schwanzmissbildungen (THOM 1963; MORIMOTO et al. 1995) oder mit weiteren Missbildungen im Kopfbereich (KOCH und FISCHER 1950; KUNDU und PANDEY 1967; ASOKAN und PATTABIRMAN 1982; BÄHR et al. 2003) beobachtet. Die Ursachen dieser Defekte sind im Einzelnen nicht klar. In einigen Fällen wurde ein monogen autosomal rezessiver Ergang vermutet (KOCH und FISCHER 1950; ZAYED und GHANEM 1964). Beim japanischen Schwarzvieh wurde eine als MOD Literaturübersicht 23 (congenital multiple ocular defects) bezeichnete kongenitale Augenanomalie beschrieben, die duch Mikrophthalmie, Torsion der Augäpfel und vollständige Blindheit gekennzeichnet ist. Der putative Defektgenort wurde auf dem bovinen Chromosom 18 lokalisiert (ABBASI et al. 2005, 2006). Beim Schwein wurden verschiedene Formen der Mikrophthalmie und Anophthalmie beschrieben und unter anderem auf eine Vitamin-A-Unterversorgung der tragenden Sau zurückgeführt (HALE 1933, 1935; BENDIXON 1944; ROBERTS 1948). Beim Hund wurde Mikrophthalmie im Zusammenhang mit anderen Missbildungen des Auges wie Defekten des vorderen Augensegmentes, Katarakten oder Retinadysplasie bei verschiedenen Rassen beschrieben. Zu den betroffenen Rassen gehören der Bernhardiner (MARTIN und LEIPOLD 1974), der Dobermann (ARNBJERG und JENSEN 1982; PFEIFER und FISCHER 1983; BERGSJO et al. 1984; LEWIS et al. 1986), der Altenglische Schäferhund (BARRIE et al. 1979), der Akita (LARATTA et al 1985) der Zwergschnauzer (GELATT et al. 1983, SAMUELSON et al. 1987), der Chow Chow (COLLINS et al. 1992), der Cavalier King Charles Spaniel (NARFSTROM und DUBIELZIG 1984) und der Cocker Spaniel (STRANDE et al. 1988) sowie der Irische Wolfshund (KERN 1981). Mikrophthalmie in variabler Ausprägung ist außerdem ein Bestandteil des Merle-Syndroms (Merle ocular dysgenesis, MOD) und der Collie-Augenanomalie (Collie eye anomaly, CEA). Beim MerleSyndrom ist Mikrophtalmie dabei häufiger und in stärkerer Ausprägung zu beobachten als bei der Collie-Augenanomalie (COOK et al. 1991). Darüber hinaus enthält die OMIA Datenbank Einträge über das Auftreten von Mikrophthalmie oder Anophthalmie bei der Ziege (ASHTURKAR et al. 1996), beim Wasserbüffel (GARG et al. 1990), beim Hamster (HUGES und GEERAETS 1962; WADA und TSUDZUKI 1998), beim Wapiti und bei der Ratte sowie beim Huhn (EHRLICH et al. 1989; SOMES 1992). Wenngleich viele Formen der Mikrophthalmie genetische Ursachen haben, kommen auch andere auslösende Faktoren in Betracht. Viele teratogene Substanzen können Mikrophthalmie verursachen. So können beispielsweise nach der Verabreichung von Griseofulvin an trächtige Katzen oder Stuten betroffene Welpen oder Fohlen auftreten (RÜSSE und SINOWATZ 1991; SCHUTTE und VAN DEN INGH 1997). Als Ursache beim Schaf wurde eine chronische Selenose beschrieben (ROSENFELD und BEATH 1947). Dieser Zusammenhang wird jedoch kontrovers dikutiert (O´TOOLE et al. 1996). Bei Kaninchen wurden Pilztoxine als Auslöser identifiziert (WANGIKAR et al. 2005). Auch Giftpflanzen sind als Auslöser kongenitaler Augenanomalien bekannt. Beim Schaf wurde nach der Ingestion von Veratrum californicum am Tag 14 der Trächtigkeit das Auftreten von Lämmern mit verschiedenen Missbildungen des Kopfes, darunter Zyklopie und Anophthalmie, beschrieben (BINNS et al. 1965). Auch 24 Literaturübersicht eine Fehlernährung trächtiger Tiere, insbesondere Vitamin-A-Mangel, kommt als Auslöser in Betracht (HALE 1935; ROBERTS 1948). 2.1.2. Die kongenitale Mikrophthalmie des Texelschafes Ende der 1950er Jahre wurde in den Niederlanden und Frankreich eine Form von kongenitaler bilateraler isolierter Mikrophthalmie bei Texelschafen sowie deren Kreuzungen beschrieben (DE GROOT 1957; ZWIEP 1958; HANSET 1961). Bereits DE GROOT (1957) nahm an, dass eine erbliche Genese zu Grunde liege, da insbesondere Nachkommen aus Inzuchtanpaarungen betroffen gewesen seien. Durch Versuchsanpaarungen konnte schließlich gezeigt werden, dass sich die Mikrophthalmie bei Texelschafen mit einem monogen autosomal rezessiven Erbgang erklären lässt (HARING und GRUHN 1970). Seit der Einfuhr von Schafen der Rasse Texel aus den Niederlanden nach Deutschland in den 1960er Jahren sind in verschiedenen Zuchtgebieten immer wieder Lämmer mit zumeist bilateraler Mikrophthalmie ohne weitere Missbildungen geboren worden (HARING und GRUHN 1970). Vereinzelt tritt diese kongenitale Anomalie auch in anderen Schafrassen auf. Die betroffenen Lämmer sind hilflos und finden in der Herde ihre Mutter nicht. Sie bedürfen zu ihrer Erhaltung bis zum schlachtreifen Alter der besonderen individuellen Pflege und Betreuung, welche ihnen aber in der Praxis von großen Schäfereien in der Regel nicht zuteil werden kann. Eine ungezielte Anpaarung von in der Regel unerkannten heterozygoten Elterntieren erklärt das nach wie vor relativ häufige Auftreten dieses Defekts. In den Niederlanden wird eine Häufigkeit von 10% Anlageträgern ohne phänotypische Anzeichen in der Zuchtpopulation angenommen. In Neuseeland wurde das erstmalige Auftreten dieser Missbildung bei Texelkreuzungen im Jahre 1999 auf den Import von Texelschafen sowie Embryonen aus Dänemark und Finnland im Jahre 1986 zurückgeführt (ROE et al. 2003). Anhand von sechs betroffenen Tieren im Alter von 2 bis 12 Wochen aus dem Material der Versuchsanpaarungen von HARING und GRUHN (1970) erfolgte eine Beschreibung der Morphologie der kongenitalen Mikrophthalmie des Texelschafes. Iris, Linse und Glaskörper fehlen bei betroffenen Augen vollständig. Das vordere Augensegment ist von einer bindegewebigen Masse angefüllt, die freie Epithelzysten enthält. Der Inhalt dieser Zysten besteht größtenteils aus Ansammlungen isolierter, großer, polymorpher Zellen sowie einer feinkörnigen amorphen Substanz fibrinösen Charakters. Das umgebende Bindegewebe enthält häufig Drüsengewebe, Knorpelinseln und Fettgewebe. Der Ziliarkörper ist rudimentär vorhanden und in die bindegewebige Masse integriert. Regelmäßig wird ein Fehlen der Literaturübersicht 25 Bowman´schen und Descemet´schen Membran sowie des Endothels der vorderen Augenkammer beschrieben. In einigen Fällen wurden ein desquamiertes vorderes Hornhautepithel sowie Einlagerungen von Drüsengewebe im Korneaparenchym beobachtet. Die Retina haftet lediglich im Bereich des Sehnervenkopfes am teilweise mehrschichtigen Pigmentepithel. Ansonsten ist sie abgelöst und liegt ungeordnet rosettenförmig im Auge. Die identifizierbaren Zellen lassen die retinaspezifische Schichtung weitestgehend vermissen (LABS 1977). Aufgrund der Veränderungen am Auge erlangen kaum retinale Ganglienzellen Verbindung zum Gehirn. Daher können atrophische Veränderungen am Nervus opticus sowie im visuellen Cortex des Großhirns beobachtet werden (ARNDT et al. 1978). VAN DER LINDE-SIPMAN et al. (2003) beschreiben die Augen betroffener neugeborener Lämmer wie folgt: Die Augen sind klein, aber normal geformt. Die vordere Augenkammer und die Linse fehlen. Stattdessen ist eine konische, bindegewebige Masse ausgebildet, die an der Sehnervenpapille befestigt ist. Mikroskopisch wird ein Fehlen der Descemet´schen Membran beschrieben. Innerhalb der Bindegewebsmasse befinden sich Knorpelgewebe, glatte Muskulatur und Fettgewebe sowie epitheliale Zysten, die mit Keratin und manchmal Haaren gefüllt sind. Ziliarkörper und -fortsätze sind in die Masse integriert. Die Netzhaut scheint normal entwickelt, ist aber von der Unterlage abgelöst und in Falten gelegt. Das erste histopathologisch nachweisbare Ereignis in der Morphogenese der kongenitalen Mikrophthalmie des Texelschafes ist eine abweichende Entwicklung des Linsenbläschens ab dem 24. Tag der Gestation (VAN DER LINDE-SIPMAN et al. 2003). Zu diesem Zeitpunkt besteht das Linsenbläschen aus einer soliden Zellproliferation ohne Linsenkapsel. Ab dem Tag 35 ist die Linse nicht mehr auszumachen und ungeordnete mesenchymale Proliferation bestimmt das Bild. Der Augenbecher wird zunächst normal angelegt, bleibt aber ab dem 45. Tag der Embryonalentwicklung deutlich im Größenwachstum zurück. Die Retina ist anfänglich ebenfalls regelgerecht entwickelt, löst sich aber zwischen dem 45. und 56. Tag von ihrer Unterlage (VAN DER LINDE-SIPMAN et al. 2003). 26 Literaturübersicht Normale Entwicklung Mikrophthalmie Tag 24 Tag 32 Abbildung 2-3: Vergleich von mikrophthalmischen (rechte Bildhälfte) mit sich normal entwickelnden (linke Bildhälfte) Augenanlagen am Tag 24 (obere Bildhälfte) und Tag 32 (untere Bildhälfte) der Embryonalentwicklung beim Schaf (modifiziert nach VAN DER LINDE-SIPMAN et al. 2003). 2.3. Genomkartierung Generell erschwert die Größe des Säugergenoms die gezielte Suche nach einzelnen Genen. Abhilfe verspricht die vollständige Sequenzierung der Genome, die mittlerweile beim Menschen (VENTER et al. 2001), bei der Maus (WATERSTON et al. 2002), beim Hund (KIRKNESS et al. 2003; LINDBLAD-TOH et al. 2005) und bei der Ratte (GIBBS et al. 2004) durchgeführt wurde. Bei weiteren Spezies bestehen derzeit entsprechende internationale Initiativen zur Entschlüsselung der Genome (http://www.intlgenome.org/). Bevor diese umfassenden Informationen zur Verfügung standen, wurde mit der Kartierung zunächst kleinerer Genomanteile begonnen, um ein Bild über das gesamte Genom zu erhalten. Das Ziel der Genomartierung ist die Erstellung möglichst dichter Markerkarten mit gleichmäßig über das gesamte Genom verteilten hochpolymorphen Markerloci. Durch den Literaturübersicht 27 Nachweis von Kopplung eines bisher unbekannten Gens mit einem oder mehreren chromosomal bereits lokalisierten DNA-Markern kann das Gen einer bestimmten Chromosomenregion zugeordnet werden. Durch schrittweises Einengen dieser Region mit zusätzlichen Markern und verschiedenen Klonierungsstrategien erhält man schließlich die korrekte Position des Gens. Man bezeichnet dieses Verfahren auch als positionelles Klonieren (COLLINS 1992). Man unterscheidet zwischen genetischen und physikalischen Genomkarten. Genetische Karten geben den relativen Abstand zwischen den Loci wieder, während physikalische Genomkarten die Lage von DNA-Sequenzen direkt auf dem Chromosom darstellen. 2.3.1. Genetische Kartierung Die genetische Karte wird durch Kopplungsanalyse erstellt (MORTON 1955). Dabei werden die Abstände zwischen polymorphen DNA-Fragmenten gemessen, die über das gesamte Genom verteilt vorkommen Dies geschieht indirekt auf Basis der beobachteten Frequenz meiotischer Rekombinationen innerhalb so genannter Ressourcenfamilien, die in der Regel eine Sammlung umfangreicher Vollgeschwisterfamilien darstellen. Rekombinante und nichtrekombinante Nachkommen innerhalb der Familie müssen unterscheidbar sein. Dazu muss mindestens ein Elternteil für die untersuchten Genorte doppelt heterozygot sein (OTT 1991). Die genetische Distanz zwischen zwei Loci ergibt sich aus der Rekombinationsfrequenz θ und wird in Centimorgan (cM) angegeben, wobei 1 cM einer Rekombinationsfrequenz von 1%, also dem Auftreten von einer Rekombination auf 100 Meiosen entspricht. Besteht keine Kopplung zwischen zwei Loci, beträgt die Rekombinationsfrequenz θ = 0,5. Unabhängig davon also, wie weit zwei Loci voneinander entfernt sind, kann die Rekombinationsfrequenz nie größer als 0,5 sein (0 ≤ θ ≤ 0,5). Daher ist die Rekombinationsfrequenz nicht additiv und muss zur Erstellung einer genetischen Karte in die genetische Distanz umgerechnet werden (OTT 1991). Dazu dienen verschiedene Kartierungsfunktionen, zum Beispiel nach Haldane oder Kosambi. Diese Funktionen unterscheiden sich insofern, als dass die Funktion nach Kosmabi im Gegensatz zu der nach Haldane die Interferenz berücksichtigt. Wenn ein Crossing-over die Entstehung weiterer Chiasmata in der Nähe verhindert, bezeichnet man das als Interferenz (BROMAN und WEBER 2000). Als Faustregel kann gelten, dass ein cM auf einer genetischen Karte einem Abstand von durchschnittlich einer Million Basenpaaren (1 Mb) entspricht. Es gibt aber sowohl Unterschiede zwischen einzelnen chromosomalen Regionen als auch zwischen den Geschlechtern (BROMAN et al. 1998). 28 Literaturübersicht Je geringer der Abstand zwischen zwei Genorten auf einem Chromosom ist, desto höher ist die Wahrscheinlichkeit, dass zwischen ihnen kein Rekombinationsereignis stattfindet und sie gekoppelt vererbt werden. Bei der Kopplungsanalyse wird θ am genotypisierten Familienmaterial geschätzt und getestet, wie groß die Wahrscheinlichkeit für Kopplung ist. Dazu wird bei der klassischen Kopplungsanalyse ein LOD-Score (logarithm of the odds) bestimmt. Dieser dient zur Prüfung der Hypothese der Kopplung gegenüber der Nullhypothese der freien Rekombination. Ist der Wert ≥ 3, so betrachtet man die Genorte als gekoppelt. Bei einem Wert gleich oder kleiner als -2 kann man die Kopplung für die betrachteten Genorte ausschließen (OTT 1991). Als Marker für die Kopplungsanalyse benötigt man polymorphe genetische Marker, das heißt Genorte, an denen verschiedenen Allele auftreten, zum Beispiel Restriktionsfragmentlängenpolymorphismen (RFLPs), SNPs (single nucleotide polymorphisms), SSCPs (single strand conformation polymorphisms) und Mikrosatelliten. Mikrosatellitenmarker sind in der Regel wesentlich polymorpher als die übrigen Typen genetischer Marker. Sie bestehen aus einer Aneinanderreihung von Mono-, Di-, Tri- oder Tetra- Nukleotidsequenzen, wobei die Motivlänge zwischen 1-10 Basenpaare variieren kann (TAUTZ 1989). Die Anzahl der Motive beträgt bis zu 30 und mehr so genannte Tandem- Wiederholungen (HEARNE et al. 1992). Mikrosatellitenmarker sind gut geeignet zur Identifizierung der chromosomalen Lokalisation von Genorten durch Kopplungsanalyse bei der Aufklärung monogener Merkmale (HOLMES 1994; Kap. 2.4.2.). Je polymorpher sich ein Marker verhält, desto höher ist die Chance, informative Meiosen zu beobachten, bei denen die Weitergabe der Markerallele an die Nachkommen verfolgt werden kann (FRIES 1993). Ein Marker ist umso informativer, je mehr Allele er besitzt und je niedriger die Frequenz des häufigsten Alles ist. Ein Maß für den Informationsgehalt ist der so genannte PIC (polymorphism information content). Dieser könnte im Idealfall (alle Meiosen informativ) einen Maximalwert von 1 annehmen. 2.3.2. Physikalische Kartierung Physikalische Genomkarten stellen die Lage von DNA-Sequenzen direkt auf dem Chromosom dar. Häufig eingesetzte Methoden für die Kartierung sind die Fluoreszenz-insitu-Hybridisierung (FISH), die Verwendung von somatischen sowie radiation hybrid (RH) Zell-Hybriden und die Anordnung überlappender genomischer Klone zu so genannten Contigs. Bei der zytogenetischen Technik der Fluoreszenz-in-situ-Hybridisierung werden fluoreszenzmarkierte DNA-Sonden auf fixierten Metaphase-Chromosomen dargestellt (SOLINAS- Literaturübersicht 29 TOLDO et al. 1993). Bei der radiation hybrid (RH) Kartierung werden durch Bestrahlung von Donor-Zelllinien (z.B. ovine Fibroblasten) mit Röntgen- oder γ-Strahlen so genannte Radiation Hybrid Panels erzeugt (GOSS und HARRIS 1975). Die Chromosomen der Donorzellen werden durch die Bestrahlung in Fragmente gespalten. Anschließend werden die letal geschädigten Zellen unter Einsatz von Polyethylenglycol mit Rezipientenzellen (Hamster- oder Mauszelllinien) verschmolzen. Durch die Integration von Fragmenten in das Genom der Rezipientenzelle entstehen Hybridzellen. Die Fragmente werden entweder in die Chromosomen der Rezipientenzelle integriert oder rekonstituieren sich zu „neuen“ Chromosomen (Abb. 2-2). Ein Selektionssystem gewährleistet, dass nur Hybridzellen überleben (WALTER et al. 1994). Die durchschnittliche Größe der Fragmente und damit das Auflösungsvermögen des verwendeten RH-Panels ist abhängig von der Strahlendosis, was bedeutet, dass das Auflösungsvermögen steuerbar ist. Generell besitzen RH-Karten ein etwa 15 bis 20-fach höheres Auflösungsvermögen als Kopplungskarten (COX et al.1990; WALTER et al. 1994). Abbildung 2-2: Herstellung von Hybridzellen durch Bestrahlung (modifiziert nach WALTER et al. 1994). 30 Literaturübersicht Zur Kartierung werden Marker-Loci mittels PCR an den Zelllinien typisiert, das heißt es wird bestimmt, ob ein bestimmter Genort in einer hybriden Zelllinie vorhanden ist oder nicht. Es werden also im Gegensatz zur genetischen Kartierung keine hochpolymorphen DNA-Marker benötigt. Es genügen spezifische DNA-Sequenzen für die Auswahl geeigneter PCR-Primer (COX et al. 1990; WALTER et al. 1994; YANG et al. 1998). Die lineare Anordnung sowie die physikalische Distanz zwischen den Genorten können anhand der Koretentionsfrequenz, das heißt der Häufigkeit, mit der die Genorte gemeinsam in einer hybriden Zelllinie vorkommen, geschätzt werden (GOSS und HARRIS 1975; COX et al. 1990). Je enger die Genorte auf einem Chromosom benachbart sind, desto geringer ist die Wahrscheinlichkeit, dass sie durch einen zufälligen Bruch getrennt werden und desto höher ist die Wahrscheinlichkeit, dass sie gemeinsam in einer Zelllinie vorhanden sind. Diese einfache Betrachtungsweise wird allerdings dadurch verkompliziert, dass die Hybridzellen häufig mehr als nur ein chromosomales Fragment enthalten. Zwei Marker können gemeinsam in einer hybriden Zelllinie vorkommen, weil sie nicht durch einen Bruch getrennt wurden und in einem Fragment liegen oder weil sie durch einen Bruch getrennt wurden und auf zwei verschiedenen Fragmenten in der Hybridzelle vorliegen. Wenn zwei Genorte in einer Zelllinie nicht vorliegen, lässt sich ebenfalls keine Aussage darüber machen, ob sie gemeinsam oder unabhängig voneinander verloren gegangen sind. Deshalb lässt sich die Bruchfrequenz θ zwischen Markern nicht direkt aus dem beobachteten Retentionsmuster ableiten. Nimmt man aber an, dass der Bruch unabhängig vom Verbleib der beiden Marker ist und dass die Retention eines Fragments unabhängig von jedem anderen beliebigen Fragment ist, lässt sich die Bruchfrequenz schätzen. Die Bruchfrequenz θ ist mit meiotischen Rekombinationsfrequenz vergleichbar. Anders als diese kann sie aber von 0 (die Marker werden nie getrennt) bis 1 (die Marken werden immer getrennt) variieren. Für weit voneinander entfernte Marker wird die tatsächliche Distanz (D) von der Bruchfrequenz unterschätzt. Die Distanz ergibt sich aus der Funktion D = -ln(1- θ) und wird in Centiray (cR) angegeben. Da die Bruchfrequenz und somit auch die Distanz von der Strahlendosis abhängen, wird diese Angabe um die Angabe der zur Erzeugung des RH-Panels eingesetzten Strahlendosis ergänzt. Ein Abstand von 1 cR5000 zwischen zwei Genorten entspricht einer Bruchfrequenz von einem Prozent nach einer Exposition mit einer Strahlendosis von 5000 Rad (COX et al. 1990). Literaturübersicht 31 2.3.3. Vergleichende Genomkartierung Das Ziel der vergleichenden Genomkartierung ist zum Beispiel die Nutzbarmachung der detaillierten Informationen des humanen Genoms für andere, weniger gut kartierte Spezies. Neben den Erkenntnissen zur Evolution der Säugergenome vereinfachen und beschleunigen diese vergleichenden Genomkarten die Arbeiten an weniger detaillierten Karten. Die Suche nach Genen bei einer Spezies kann durch die Kenntnis konservierter Chromosomenabschnitte bei anderen Spezies wesentlich erleichtert werden. Eine Methode zur Verknüpfung von Spezieskarten ist die Verwendung von genassoziierten Markern, so genannten Ankergenorten, deren Anwendung speziesübergreifend möglich ist (O´BRIEN et al. 1993; LYONS et al. 1997). Auch Mikrosatelliten, die von speziesspezifischen Sequenzen flankiert werden, können bei nah verwandten Arten als Marker zur vergleichenden Kartierung Verwendung finden (z.B. CRAWFORD et al. 1995, Kap. 2.6.). Eine Möglichkeit der Identifizierung von konservierten Chromosomensegmenten zwischen verschiedenen Spezies durch interspezifische in-situ-Hybridisierung bietet die so genannte ZOO-Fish-Methode (SCHERTHAN et al. 1994). Damit können auch Vergleiche zwischen Arten aus verschiedenen Ordnungen angestellt werden. In den 1990er Jahren wurde damit konservierte Chromosomensegmente zwischen verschiedenen Säugerspezies und dem Menschen identifiziert, so zum Beispiel für das Schwein (GOUREAU et al. 1996), das Rind (CHOWDHARY et al. 1996; SOLINAS-TOLDO et al. 1995), das Pferd (RAUDSEPP et al. 1996) und das Schaf (IANNUZZI et al 1999). Eine Verfeinerung der vergleichenden Kartierung kann dann durch die Erstellung hoch auflösender RH-Karten erreicht werden. Dazu wurden beispielsweise beim Rind so genannte expressed sequence tag (EST) Sequenzen aus der ungerichteten Sequenzierung von Klonen gewebespezifischer cDNA-Bibliotheken herangezogen (SMITH et al. 2001). Die Zuordnung der anonymen bovinen EST Sequenzeinträge erfolgte über Identitätsvergleiche zu bekannten cDNA Sequenzen humaner Gene. Eindeutig übereinstimmende Sequenzen wurden danach auf der bovinen RH Karte über das gesamte Rindergenom verteilt kartiert (BAND et al. 2000). Mit der RH Kartierung einer Auswahl aus den ständig zunehmenden bovinen EST Sequenzen der Sequenzdatenbanken wurde die vergleichende Genomkarte zwischen Mensch und Rind mittlerweile weiter verfeinert (ITOH et al. 2005; EVERTS-VAN DER WIND et al. 2004). Im Gegensatz zum Rind stehen für das Schaf vergleichsweise wenige EST-Sequenzeinträge in den öffentlichen Sequenzdatenbanken zur Verfügung (Stand: 18.02.2006: 15.888 ovine und 1.588.784 bovine EST Sequenzen; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). 32 Literaturübersicht 2.4. Stand der Genomanalyse beim Schaf 2.4.1. Genomkartierung beim Schaf Das Schaf besitzt drei meta- und 23 akrozentrische Autosomen und unterscheidet sich darin vom Rind und der Ziege, die beide 29 akrozentrische Autosomen besitzen. Dieser Unterschied erklärt sich durch drei im Laufe der Evolution des Schafes aufgetretene Robertson-Translokationen, bei denen jeweils zwei akrozentrische zu einem metazentrischen Chromosom fusionierten. Daher sind die ovinen Chromosomen 1 bis 3 jeweils homolog zu zwei verschiedenen Rinder- und Ziegenchromosomen (MADDOX 2004). Vor 1994 war die genetische Karte des Schafes nur rudimentär. Es waren lediglich 17 genetische Marker in sieben Kopplungsgruppen bekannt (MONTGOMERY und CRAWFORD 1997). Der Grundstein für eine genetische Karte war gelegt, als 1994 52 polymorphe genetische Marker (46 Mikrosatelliten und 6 RFLPs) in 19 syntänischen Gruppen angeordnet und 13 Schafchromosomen zugeordnet werden konnten (CRAWFORD et al. 1994). Das war die Konsequenz aus einem Genomscan zur Kartierung des Booroola-Genortes (MONTGOMERY et al. 1993; Kap. 2.4.2.). Diese unvollständig dominant vererbte Mutation beeinflusst die Ovulationsrate und wurde danach als Marker zur Selektion auf eine verbesserte Wurfgröße eingesetzt. Die erste umfangreichere genetische Karte beinhaltete 246 polymorphe genetische Marker auf allen Autosomen und umfasste 2070 cM (CRAWFORD et al. 1995). Als Vorraussetzung dafür wurde eine Ressourcenfamilie (International Mapping Flock, IMF) erzeugt, die aus neun umfangreichen, sich über drei Generationen erstreckenden Vollgeschwisterfamilien mit insgesamt 98 Nachkommen besteht. Insgesamt 133 der auf dieser Karte angeordneten Marker stellen bovine Mikrosatelliten dar (CRAWFORD et al. 1995). Aufgrund der hohen Sequenzhomologien zwischen Rind und Schaf liegt die Verwendung boviner Mikrosatelliten nahe. Jedoch ist nicht mit jedem heterologen Primerpaar ein PCR-Produkt zu erzielen und nicht alle bovinen Mikrosatelliten erweisen sich beim Schaf als polymorph (COCKETT 2003a). Insgesamt erwiesen sich 53% der getesteten bovinen Mikrosatelliten als polymorph beim Schaf. In einer späteren Studie, in der über 1000 bovine Mikrosatelliten getestet wurden, ließen sich mit ca. 39% der heterologen Primerpaare polymorphe Mikrosatelliten-Loci amplifizieren (DE GORTARI et al. 1997). DE GORTARI et al. veröffentlichten 1998 eine genetische Karte mit 519 genetischen Markern. Neben 101 ovinen Mikrosatelliten enthält diese Karte 402 bovine Mikrosatelliten Literaturübersicht 33 und 16 bekannte Gene. Sie umfasst 3063 cM auf allen Autosomen mit einem durchschnittlichen Markerabstand von 6,5 cM (http://www.marc.usda.gov/genome/genome.html). Zur Erstellung dieser Karte wurde neben dem IMF auch eine weitere Ressourcenfamilie des USDA / MARC verwendet. Diese besteht aus vier Halbgeschwisterfamilien mit insgesamt 247 Nachkommen. Durch eine internationale Kooperation verschiedener Laboratorien entstand schließlich unter Verwendung des IMF eine genetische Karte mit 1062 Loci (MADDOX et al. 2001). Diese als SheepMap 4 bezeichnete Karte umfasste 3400 cM auf den Autosomen und 132 cM auf dem X-Chromosom. In ihr waren zunächst 121 bekannte Gene enthalten. Die Konstruktion dieser Karte wird laufend fortgesetzt. Im Januar 2006 wurde die Version SheepMap 4.5 veröffentlicht (Australian Sheep Gene Mapping Website: http://rubens.its.unimelb.edu.au/~jillm/jill.htm). Diese enthält 1372 Loci und umfasst etwa 3500 cM auf den Autosomen und 132 cM auf dem X-Chromosom. Diese Karte enthält Mikrosatelliten, die durch systematische Durchmusterung einer HautcDNA-Bibliothek des Schafes nach repetitiven Dinukleotid-Sequenzmotiven entwickelt wurden. Durch 5´Sequenzierung wurden EST Sequenzen generiert. Diese wurden zur Identifizierung der Gene und zur Anordnung innerhalb der humanen Genomsequenz genutzt. Der Vorteil ist, dass diese Marker sowohl als genassozierte wie auch anonyme Markerloci fungieren können (DE SILVA et al. 2003). Insgesamt 2030 Marker-Loci, die aus 518 Publikationen zusammengetragen wurden sind derzeit in der öffentlichen Datenbank Sheep Base (http://www.thearkdb.org/) enthalten. An der Utah State University wurde in Zusammenarbeit mit der Texas A&M University ein RH Panel mit einer Strahlendosis von 5.000 Rad erzeugt, das zur vergleichenden Kartierung beim Schaf dienen soll (COCKETT 2003b). Der Vergleich des Schafgenoms mit dem Rindergenom erbrachte einen hohen Grad an Konservierung innerhalb der Familie der Bovidae. Ein Vergleich mit der genetischen Karte des Rindes von KAPPES et al. (1997) ergab lediglich in acht Fällen eine Inversion von Markerpositionen (DE GORTARI et al. 1998). Durch Hybridisierungsexperimente wurden 48 zwischen Schaf und Mensch konservierte Chromosomensegmente gefunden (BURKIN et al. 1997; IANNUZZI et al. 1999). MADDOX et al. (2003) identifizierten 53 syntänische Beziehungen zwischen Schaf und Mensch. SCHIBLER et al. (1998) berichten über mehr als 100 zwischen den Bovidae und dem Menschen konservierte Chromosomenabschnitte mit einer durchschnittlichen Größe von 25 cM. Sie kommen deshalb zu dem Schluss, dass der Grad chromosomaler Umordnungen, der durch Hybridisierungsexperimente ermittelt wurde, 34 Literaturübersicht die tatsächlichen Verhältnisse unterschätzt. Die von EVERTS-VAN DER WIND et al. (2005) erstellte hochauflösende vergleichende RH-Karte zwischen Rind und Mensch enthält 201 zwischen zwischen den Spezies konservierte Chromosomenabschnitte mit einer durchschnittlichen Größe von 7,6 Mb. Die Triebfeder intensiver Bemühungen zur Entschlüsselung des Schafgenomes ist die Verbesserung der Produktivität, insbesondere die Maximierung der Fleisch- und Wollproduktion und –qualität sowie die Erhöhung der Resistenz gegen Endoparasiten (FADIEL et al. 2005). Um diese Ziele zu erreichen, wurde im September 2004 das Programm SheepGenomics ins Leben gerufen (www.sheepgenomis.com). Vornehmlich australische Investoren haben mittlerweile 50 Millionen Dollar in dieses Projekt investiert. Das Ziel des Projektes ist die Entwicklung praxistauglicher DNA Marker für kommerzielle Zuchtprogramme und letztlich die Sequenzierung des Schafgenoms. Zur Entwicklung von Markern wurde im Jahr 2004 ein Zuchtprogramm begonnen, das etwa 5000 Schafe beinhaltet. Dabei fanden Deckböcke Verwendung, die in interessierenden Merkmalen differieren (FADIEL et al. 2005; www.sheepgenomics.com). Im Zuge von SheepGenomics wurden zudem genomische Ressourcen erstellt. Das bacterial artifical chromosome (BAC) Klonierungssystem hat sich aufgrund des einfachen Umgangs und der Stabilität des Klonierungssystems zur experimentellen Analyse der Säugergenome durchgesetzt. Für das Schaf steht eine BAC Genbank zur Verfügung, deren Klone durchschnittlich etwa 180 kb genomische Schafsequenz beinhaltenden (http://bacpac.chori.org/). Die Enden zufällig ausgewählter BAC Klone wurden 2005 entschlüsselt und es stehen derzeit 376.602 ovine BES Sequenzeinträge in den öffentlich zugänglichen Datenbanken zur Verfügung (Stand: 18.02.2006; http://www.ncbi.nlm.nih.gov/). Für das Jahr 2006 ist die genomweite Entwicklung von SNP Markern geplant, wobei zur Anordnung der Marker auch die Genomsequenz des Rindes genutzt werden soll. Bis 2008 ist die Entwicklung eines DNA Mikroarrays zur genomweiten Typisierung von DNA Markern für wirtschftlich relevante Merkmale geplant, der in kommerziellen Zuchtprogrammen eingesetzt werden soll (www.sheepgenomics.com). 2.4.2. Molekulare Aufklärung hereditärer Merkmale Die genetische Grundlage ist bislang nur für vergleichsweise wenige hereditäre Merkmale des Schafes bekannt. Von insgesamt 179 beim Schaf bekannten hereditären Merkmalen beruhen 59 auf einem monogenen Erbgang (OMIA, http://www.angis.org.au/omia/). Für verschiedene Literaturübersicht 35 dieser Merkmale konnte durch genetische Kartierung eine Kopplung zu bestimmten Chromosomenregionen nachgewiesen werden. Auf diese Weise wurde beispielsweise der so genannte Horn-Locus beim Merinoschaf auf OAR10 lokalisiert (MONTGOMERY et al. 1996). Derzeit wird in einer genomweiten Kopplungsanalyse nach dem Genort für die ovine kongenitale Arthrogrypose gesucht (MURPHY et al. 2004) Der Nachweis kausaler Mutationen ist bisher nur für sehr wenige Merkmale gelungen. Eine autosomal rezessiv vererbte Form der hereditären Chondrodysplasie wurde in den 1970er Jahren erstmals bei Schafen der Rasse Suffolk beschrieben (SAPERSTEIN et al. 1975). Die Krankheit äußert sich neben verschiedenen anderen Skelettdeformationen auch in langen, gebogenen Beinen, was zu der Bezeichnung Spider Lamb Syndrome geführt hat. Durch eine genomweite Kopplungsanalyse konnte der Genort auf OAR6 lokalisiert werden (COCKETT et al. 1999). Als verursachendes Gen wurde das fibroblast growth factor receptor 3 (FGFR3)Gens identifiziert (BEEVER et al. 2006). Die als Callipyge-Syndrom bezeichnete Muskelhypertrophie des Schafes zeigt einen Erbgang, den man als paternale polare Überdominanz bezeichnet (COCKETT et al. 1996). Das bedeutet, der Callipyge-Phänotyp wird nur gezeigt, wenn das betreffende Tier vom Vater das mutierte und von der Mutter das Wildtyp-Allel erhalten hat. Durch Kopplungsanalyse wurde zunächst die chromosomale Lokalisation des Callipyge-Locus OAR18 identifiziert (COCKETT et al. 1994). Es wurde eine kausale Punktmutation identifiziert, die jedoch in einer intergenischen Region liegt (FREKING et al. 2002). Es konnte gezeigt werden, dass das benachbarte DLK1-Gen (delta-like 1 homolog) in betroffenen Tieren während der postnatalen Periode viel stärker exprimiert wird als in nicht betroffenen Individuen. Der molekulare Zusammenhang zwischen der Mutation und der gesteigerten Expression ist noch unklar (MURPHY, S. K. et al. 2005). Andere bekannte Genorte für eine erhöhte Muskelfülle sind der Rib-eye muscle (REM)-Genort (MCEWAN et al. 1998) sowie der Double-MusclingGenort des Texelschafs. Von letzterem wurde auf Grund von Kopplungsanalysen angenommen, das Myostatin-Gen beinhalte die ursächliche Mutation. Eine Mutation konnte aber nicht nachgewiesen werden (MARCQ et al. 1998). In drei verschiedenen Genen wurden bisher Mutationen mit Einfluss auf die Ovulationsrate identifiziert. Für den Genort des Booroola-Phänotyps (FecB) wurde zunächst eine Kopplung zu Markern nachgeweisen, die einer Region auf HSA4q zugeordnet werden konnten (MONTGOMERY et al. 1993). Nach der Entwicklung neuer Marker konnte der Genort mittels Kopplungsanalyse auf OAR6 lokalisiert werden (MONTGOMERY et al. 1994). Der 36 Literaturübersicht Phänotyp beruht auf einer Mutation im bone morphogenic protein receptor 1B (BMPR1B) Gen. Der Effekt dieser Mutation wirkt additiv, das heißt homozygote Mutterschafe zeigen die höchste Ovulationsrate von durchschnittlich 5 bis 14 Eizellen pro Ovulation (WILSON et al. 2001). Durch Nachkommenschaftstests bei Romney-Schafen mit überdurchschnittlicher Wurfgröße konnte ein weiteres Gen mit Einfluss auf die Ovulationsrate auf dem XChromosom lokalisiert werden (DAVIS 1991). Insgesamt vier unabhängige Punktmutationen konnten daraufhin im bone morphogenic protein 15 (BMP15)-Gen nachgewisen werden. Diese Mutationen wurden als Inverdale- (FecXI), Hanna- (FecXH), Cambridge- (FecXG) und Belclare- (FecXB) Mutation bezeichnet (GALLOWAY et al. 2000; DAVIS et al. 2001; HANRAHAN et al. 2004). Mutterschafe, die neben dem Wildtypallel eines der mutierten Alle aufweisen, zeigen eine erhöhte Ovulationsrate, während Tiere ohne Wildtypallel steril sind. Eine weitere Mutation ist im autosomalen growth differentiation factor 9 (GDF9)-Gen bekannt. Heterozygote Mutterschafe zeigen einer erhöhte Ovulationsrate, während homozygote Tiere steril sind. In Tieren, die sowohl heterozygot für eine FecX- als auch für eine GDF9-Mutation sind, verstärkt sich dieser Effekt noch (HANRAHAN et al. 2004). Das Vorgehen bei der Identifizierung der kausalen Mutation im GDF9 Gen unterscheidet sich grundlegend von der Aufklärung der zuvor genannten monogenen Merkmale. Anstatt einer Kopplungsanalyse wurde auf der Grundlage der bekannten Funktion des murinen Gdf9 Gens eine gezielte Kandidategenanalyse vorgenommen (HANRAHAN et al. 2004). Dieses Vorgehen ist nur möglich, sofern ein vergleichbarer Phänotyp bei einer anderen Spezies, in der Regel Mensch oder Maus, existiert und das ursächliche Gen bekannt ist. Auf diese Weise konnten weitere monogene Merkmale beim Schaf aufgeklärt werden. Die dominant schwarze Fellfarbe des Schafes wird durch das EB-Allel des so genannten Extension-Locus hervorgerufen. Auf der Grundlage bekannter Mutationen bei Maus und Fuchs wurde als molekulargenetische Grundlage eine Punktmutation im melanocortin 1 receptor (MC1R) Gen ist (VÅGE et al. 1999). Verschiedene Formen der Porphyria cutanea tarda des Menschen werden durch Mutationen des uroporphyrinogen decarboxylase (UROD) Gens hervorgerufen. Ein ähnlicher Phänotyp mit Photosensibilität und Porphyrinurie wurde bei Schafen der Rasse Schwarzköpfiges Fleischschaf beobachtet. Als ursächliches Gen konnte auch hier das UROD-Gen identifiziert werden. Die Tatsache, dass alle untersuchten Tiere heterozygot für die Defektmutation waren führte zu dem Schluss, dass das homozygote Vorliegen der Mutation embryonal letal sei (NEZAMZADEH et al. 2004, 2005). Literaturübersicht 37 Die neuronalen Ceroid-Lipofuszinosen stellen eine Gruppe von Speicherkrankheiten dar, die durch progressive, psychomotorische Störungen, Blindheit und verringerte Lebenserwartung gekennzeichnet sind. Bei Schafen der Weißen Schwedischen Landrasse wurde eine Punktmutation im Cathepsin D Gen als ursächlich für eine neuronale Ceroid-Lipofuszinose mit autosomal rezessivem Erbgang beschrieben (TYYNELÄ et al. 2000). Eine Glykogen-Phosphorylase-Defizienz im Skelettmuskel ist verantwortlich für eine metabolische Myopathie (McArdle´s Disease), die sich klinisch in Asthenie, Krämpfen, Unbeweglichkeit und paroxysmaler Myoglobinurie äußert. Nach der Beobachtung des gleichen Phänotyps bei Schafen und einer darauf folgenden gezieleten Kandidatengenanalsyse wurde eine ursächliche Mutation im glycogen myophosphorylase (PYGM) Gen identifiziert (TAN et al. 1997). Das teilweise oder vollständige Fehlen des Haarkleides bereits bei der Geburt wird als kongenitale Hypotrichose bezeichnet. Bei Schafen der sizilianischen Rasse Valle de Belice wurde eine Mutation des hairless-Gens nachgewiesen (FINOCCHIARO et al. 2003), das bereits beim Menschen als ursächlich für generalisierte Alopezie identifiziert worden war (AHMAD et al. 1998). Die genetisch determinierte Empfänglichkeit gegenüber der Traberkrankheit (Scrapie) beruht auf Polymorphismen an den Codons 136, 154 und 171 des ovinen Prionprotein-Gens auf OAR 13q15 (GOLDMANN et al. 1994). Fünf Allele bzw. Haplotypen, die durch die von den oben genannten Codons codierten Aminosäuren definiert sind, sind entscheidend für die Scrapie-Empfänglichkeit (BELT et al. 1995). Für das ARR- (Alanin-Arginin-Arginin) Allel homozygote Tiere, zeigen die geringste Empfänglichkeit, während Tiere, die das VRQ(Valin-Arginin-Glutamin) Allel tragen, eine hohe Empfänglichkeit aufweisen. Neben der der Aufklärung dieser wenigen monogenen Merkmale wurden verschiedene quantitaive trait loci (QTL) für wirtschaftlich relevante Merkmale des Schafes identifiziert. So konnten verschieden Genfamilien, die Keratin-Filamente und assoziierte Proteine codieren und von denen angenommen wird, dass sie einen entscheidenden Einfluss auf die Wollqualität und –produktion haben, chromosomal lokalisiert werden (MCLAREN et al. 1997). Außerdem wurden QTL für Muskelfülle, Milchleistung, Resistenz gegen Endoparasiten und weitere Merkmale identifiziert, wobei jedoch kaum Hinweise auf ursächliche Gene vorliegen. 38 Literaturübersicht 2.5. Schlussfolgerungen Im Verhältnis zu anderen Nutztieren ist das Schafgenom nur sehr wenig untersucht. Bei der Aufklärung hereditärer Merkmale ist es daher hilfreich, Kenntnisse von besser untersuchten Spezies zu nutzen. Bei der Suche nach funktionellen Kandidatengenen lassen sich die umfangreichen Kenntnisse aus der Human- oder Mausgenetik für viele Merkmale auf andere Spezies übertragen. Dieser komparative Ansatz soll daher in der vorgelegten Arbeit zur Aufklärung der kongenitalen Mikrophthalmie des Texelschafes herangezogen werden. Bei Mensch und Maus sind viele ähnliche okuläre Phänotypen sowie teilweise die ursächlichen Gene bekannt. Diese vielfältigen Kenntnisse über die Augenentwicklung zeigen aber auch, dass viele Phänotypen sehr variabel sind, was häufig auf allelische Heterogenität zurückgeführt werden kann. Daher soll bei der komparativen Suche nach Kandidatengenen nicht nur der Phänotyp in Folge einer fehlgeleiteten Entwicklung, sondern vielmehr auch Kenntnisse über die Funktion der Gene im Prozess der Augenentwicklung in die Untersuchungsstrategie einfließen. Da eine Vielzahl von potenziellen Kandidatengenen für die Mikrohthalmie bekannt sind, soll eine auf die jeweiligen Kandidatengenregionen fokussierte Kopplungsanalyse beim Schaf durchgeführt werden. Zunächst soll die ungefähre chromosomale Lokalisation dieser Gene im Schafgenom identifiziert werden. Das ist mit den zur Verfügung stehenden vergleichenden Genomkarten möglich, wenngleich die aktuell zur Verfügung stehenden vergleichenden Genomkarten des Schafgenoms nicht hoch auflösend genug sind, um die genaue Position vorherzusagen. Außerdem sollen geeignete polymorphe Marker für die zuvor ermittelten chromosomalen Regionen ausgewählt werden. Bei einem positiven Nachweis von Kopplung soll vor der gezielten Analyse des jeweiligen Kandidatengenes zunächst dessen angenommene exakte Lokalisation im Schafgenom überprüft werden. Dazu soll ein ovines RH-Panel eingesetzt werden, um EST- oder STSMarker, die mit Hilfe der in den öffentlichen Datenbanken für das Schaf verfügbaren ESTund BAC-Endsequenzen entwickelt werden, auf den Schafchromosomen im Verhältnis zu den eingesetzten Mikrosatelliten anzuordnen. Ziel der Arbeit ist eine möglichst exakte Positionierung des Mikrophthalmie-Genortes im Schafgenom. Material und Methoden 39 3. Material und Methoden 3.1 Material 3.1.1. Tiere und Probenmaterial 3.1.1.1. Beschaffung des Probenmaterials Das Probenmaterial wurde durch die Entnahme von Blutproben in Schäfereibetrieben in den Ablammsaisons der Jahre 2004 und 2005 beschafft. Insgesamt wurden 29 Betriebe mit Hinweisen auf Mikrophthalmie bei Lämmern in Schleswig-Holstein und Niedersachsen ausfindig gemacht und besucht. Bis auf wenige Ausnahmen handelte es sich dabei um Gebrauchsschafherden mit wiederholter Texeleinkreuzung. Die als betroffen vorgestellten Lämmer wurden zunächst zur Bestätigung des Phänotyps klinisch untersucht. Anschließend wurde den betroffenen Tieren, ihren Vollgeschwistern, der Mutter und, sofern bekannt und verfügbar, dem Vater durch Punktion der Vena jugularis 5-10 ml venöses Vollblut in eine mit dem Gerinnungshemmer EDTA präparierte Monovette® entnommen. In Fällen mit unklarer Vaterschaft wurden nach Angaben des Besitzers bis zu drei mögliche Vatertiere beprobt. Wenn der Bock nicht zur Probenentnahme verfügbar war, wurde der Vater als unbekannt erfasst. Daneben stammt ein Teil der Proben aus dem durchgeführten Zuchtversuch (Kap. 3.1.1.3). Insgesamt wurden Blutproben von 234 Tieren gesammelt sowie die zugehörigen Abstammungsdaten erfasst und katalogisiert. 3.1.1.2. Einteilung der Familien für die Kopplungsstudie Aus dem nach der Ablammsaison 2004 vorhanden Material wurden zunächst 20 Familien unter dem Kriterium ausgewählt, dass mindestens zwei Nachkommen in Form von Halb- oder Vollgeschwistern beprobt worden waren, von denen eines oder beide von Mikrophthalmie betroffen waren. Nach der Typisierung von Mikrosatelliten (Kap. 3.1.2.2. und 3.1.2.3.) an diesen Familien erfolgte eine Überprüfung der Abstammungsdaten. Familien mit Fehlern in den Abstammungsdaten wurden von der weiteren Untersuchung ausgeschlossen. Mit dem in der Ablammsaison 2005 gesammelten Material wurde analog verfahren, so dass schließlich 28 Familien in die Kopplungsstudie (Kap. 3.2.3.) Eingang fanden. Zwei dieser Familien entstammen dem durchgeführten Zuchtversuch (Kap. 3.1.1.3.). 40 Material und Methoden Die 28 ausgewählten Familien bestanden aus 163 Individuen (Tab. 3-1). Davon waren 134 Tiere in Form von Blutproben verfügbar. Die verbleibenden 29 Individuen stellen unbekannte Individuen dar, davon 28 Eltern (26 Väter und 2 Mütter) und ein Nachkomme. Insgesamt enthält das Familienmaterial 79 Eltern und 84 Nachkommen. Es sind 56 betroffene Tiere enthalten. Demzufolge sind 66,7 % der Nachkommen betroffen. Das Verhältnis von männlichen zu weiblichen Tieren unter den betroffenen Nachkommen beträgt 30:26 (ca. 1,2:1). Bei einem Nachkommen ist der Phänotyp und bei einem Nachkommen das Geschlecht unbekannt. Tabelle 3-1: Zusammenfassung der Familienstruktur. Die Zahlen in Klammern bezeichnen jeweils den Anteil betroffener Tiere. Gründer Nachkommen Gesamt Männlich Weiblich 30 (0) 42 (30) 73 (30) 49 (0) 40 (26) 89 (26) Unbekannt Gesamt 0 1 (0) 1 (0) 79 (0) 84 (56) 163 (56) Die einzelnen Familien umfassen 4 bis 18 Tiere und die durchschnittliche Familiengröße beträgt 5,82 Tiere pro Familie. Am häufigsten (15 von 28) sind Familien mit vier Mitgliedern vertreten, bestehend aus einem Vollgeschwisterpaar mit Eltern. Die Stammbäume von 25 der 28 Familien erstrecken sich über zwei Generationen. Drei Familien umfassen drei Generationen, wovon zwei aus dem Zuchtversuch hervorgegangenen sind (Kap. 3.1.1.3.). Es treten 49 betroffene relative Paare auf, d.h. es besteht in 49 Fällen ein verwandtschaftliches Verhältnis zwischen zwei betroffenen Individuen. Dabei handelt es sich um neun Vollgeschwister- und 31 Halbgeschwisterpaare sowie neun Eltern-Nachkommen-Paare. Insgesamt treten 145 informative Meiosen für den Defektgenort auf. Die Stammbäume der einzelnen Familien sind im Anhang 3 aufgeführt. Material und Methoden 41 Tabelle 3-2: Struktur der 28 für die Kopplungsanalyse verwendeten Familien. Familie Familienstruktur Tierzahl informative Meiosen 1 einfache Halbgeschwisterfamilie (1 Vater / 3 Mütter); 4 betroffene Nachkommen 8 8 2 einfache Halbgeschwisterfamilie (1 Vater / 2 Mütter); 3 Nachkommen, davon 1 betroffen 6 6 3 einfache Halbgeschwisterfamilie (1 Vater / 2 Mütter); 4 Nachkommen, davon 3 betroffen 7 8 4 Vollgeschwisterfamilie; 2 Nachkommen, davon 1 betroffen 4 4 7 8 4 4 4 4 6 4 5 4 4 4 7 6 5 6 7 8 9 10 11 einfache Halbgeschwisterfamilie (1 Vater / 2 Mütter); 4 Nachkommen, davon 2 betroffen Vollgeschwisterfamilie; 2 Nachkommen, davon 1 betroffen Vollgeschwisterfamilie; 2 Nachkommen, davon 1 betroffen einfache Halbgeschwisterfamilie (1 Vater / 2 Mütter); 3 Nachkommen, davon 2 betroffen einfache Halbgeschwisterfamilie (1 Vater / 2 Mütter); 2 betroffene Nachkommen Vollgeschwisterfamilie; 2 Nachkommen, davon 1 betroffen Halbgeschwisterstruktur (1 Vater / 2 Mütter) inkl. der Vorfahren eines Muttertieres (3 Generationen); 2 betroffene Nachkommen 12 Vollgeschwisterfamilie; 2 Nachkommen, davon 1 betroffen 4 4 13 Vollgeschwisterfamilie; 2 Nachkommen, davon 1 betroffen 4 4 14 Vollgeschwisterfamilie; 2 betroffene Nachkommen 4 4 15 Vollgeschwisterfamilie; 2 betroffene Nachkommen 4 4 16 einfache Halbgeschwisterfamilie (1 Vater / 2 Mütter); 2 betroffene Nachkommen 5 4 42 Material und Methoden Tabelle 3-2: Struktur der 28 für die Kopplungsanalyse verwendeten Familien (Fortsetzung). Familie Familienstruktur Tierzahl informative Meiosen 17 Vollgeschwisterfamilie; 1 betroffener und ein Nachkomme mit unbekanntem Phänotyp 4 2 18 Vollgeschwisterfamilie; 2 Nachkommen, davon 1 betroffen 4 4 19 Vollgeschwisterfamilie; 2 Nachkommen, davon 1 betroffen 4 4 20 einfache Halbgeschwisterfamilie (1 Vater / 2 Mütter); 4 Nachkommen, davon 3 betroffen 7 8 21 Vollgeschwisterfamilie; 2 betroffene Nachkommen 4 4 22 einfache Halbgeschwisterfamilie (1 Vater / 2 Mütter); 3 Nachkommen, davon 2 betroffen 6 6 23 Vollgeschwisterfamilie; 2 Nachkommen, davon 1 betroffen 4 4 24 Vollgeschwisterfamilie; 2 betroffene Nachkommen 4 4 25 Vollgeschwisterfamilie; 2 Nachkommen, davon 1 betroffen 4 4 26 einfache Halbgeschwisterfamilie (1 Vater / 2 Mütter); 2 betroffene Nachkommen 5 4 *) Halbgeschwisterstruktur mit 1 betroffenen Vater und 6 Mütter inkl. den Vorfahren des betroffenenVaters (3 Generationen); enthält einen Loop (Mutter-Sohn-Anpaarung); 8 Nachkommen, davon 5 betroffen 16 10 *) Halbgeschwisterstruktur mit 2 Vätern (davon 1 betroffen) und 4 Müttern inkl. den Vorfahren des betroffenen Vaters (3 Generationen); 10 Nachkommen, davon 4 betroffen 18 13 27a 27b *) Zuchtversuch (Kap. 3.1.1.3.) Material und Methoden 43 3.1.1.3. Durchführung des Zuchtversuches Bei dem durchgeführten Zuchtversuch handelt es sich um einen genehmigungspflichtigen Tierversuch nach § 8 des Tierschutzgesetzes. Die Genehmigung wurde vom Niedersächsischen Landesamt für Verbraucherschutz und Lebensmittelsicherheit erteilt (Aktenzeichen 33-42502-04/851, Versuchsleiter: Prof. Dr. Ottmar Distl, Institut für Tierzucht und Vererbungsforschung; Stellvertretender Versuchsleiter: Prof. Dr. Martin Ganter, Klinik für kleine Klauentiere). Im Sommer 2004 wurden aus verschiedenen Schäfereien drei betroffene Böcke sowie zehn Mutterschafe angekauft, die aufgrund in der Vergangenheit aufgetretener betroffener Nachkommen relativ sicher als Anlageträgerinnen identifiziert werden konnten. Die drei Böcke und neun der Mutterschafe stammten aus Familien, die auch im Rahmen der Probensammlung im Feld beprobt worden waren (Kap. 3.1.1.1.). Diese Tiere wurden in die Klinik für kleine Klauentiere eingestellt, wo im Herbst 2004 die Verpaarung erfolgte. Auf Grund der späteren Abstammungskontrolle konnte gezeigt werden, dass alle Mutterschafe vom gleichen Bock (Tier Nummer 79) gedeckt worden waren. Als Ergebnis dieser Verpaarungen wurden zischen dem 04. März und dem 09. Mai 2005 insgesamt 17 Lämmer geboren, von denen neun den Phänotyp der Mikrophthalmie aufwiesen (Tab. 3-3). Die Aufnahme von Kolostrum wurde aufgrund des Maedi - Status der Mutterschafe unterbunden. Stattdessen wurden die Tiere mit einem Kolostrumersatzpräparat (Globulac L®, Bergophor, Kulmbach) versorgt und nach der Entnahme von Blutproben für die molekulargenetischen Untersuchungen in das Institut für Tierzucht und Verebungsforschung verbracht. Dort erfolgte eine Handaufzucht mit einem handelsüblichen Milchaustauscher für Lämmer. Der Verbleib der Lämmer ist Tabelle 3-3 zu entnehmen. Unter Einbeziehung der Herkunftsbestände der Elterntiere ergibt sich eine umfangreiche Familie mit 50 Mitgliedern, die sich über drei Generationen erstreckt (Abb. 3-1). Im Hinblick auf die erforderliche Rechenkapazität für die statistischen Auswertungen wurden die Herkunftsfamilien in den meisten Fällen als separate Familien betrachtet und die Kernfamilie 27 wurde in zwei Familien aufgeteilt (Abb. 3-1). 44 Material und Methoden Tabelle 3-3: Im Rahmen des Zuchtversuches erzielte Nachzucht sowie deren Verbleib. Lab-Nr.1) Sex2) 509 510 511 512 513 514 515 516 517 518 519 520 521 522 523 539 553 1) 1 2 1 1 1 2 1 1 2 1 1 1 2 1 1 2 1 GeburtsVater Phäno3) datum (Lab-Nr.) 04.03.´05 06.03.´05 06.03.´05 06.03.´05 08.03.´05 09.03.´05 09.03.´05 12.03.´05 12.03.´05 12.03.´05 16.03.´05 17.03.´05 17.03.´05 18.03.´05 18.03.´05 02.04.´05 09.05.´05 2 1 1 1 1 2 2 2 1 2 2 2 1 1 2 2 1 79 79 79 79 79 79 79 79 79 79 79 79 79 79 79 79 79 Mutter (Lab-Nr.) 85 232/04 232/04 232/04 83 107 107 57 57 57 55 86 86 65 65 99 84 Bemerkungen Pathologie4) Aufzucht tot geboren verendet Schlachtung verendet Pathologie4) verendet verendet Aufzucht musste euthanasiert werden Schlachtung Aufzucht Pathologie4) Pathologie4) musste euthanasiert werden Pathologie4) Labornummer 2) Geschlecht: 1 = männlich, 2 = weiblich 3) Phänotyp: 1 = nicht betroffen, 2 = betroffen 4) Diese Tiere wurden für pathologische Untersuchungen verwandt. 5) Diese Tiere wurden zur Fortführung des Zuchtversuches wieder in die Klinik für kleine Klauentiere verbracht. Fam. 27b 512 520 Kernfamilie (Fam. 27) 107 519 55 Fam. 27a 522 513 553 84 61 79 83 62 66 63 Fam. 5 67 523 97 65 98 539 54 99 64 Fam. 4 Fam. 10 514 515 108 109 110 Fam. 9 84 79 80 509 86 81 Fam. 22 82 521 85 510 511 232/04 516 56 517 518 45 57 Material und Methoden Abbildung 3-1: Stammbaum der Ressourcenfamilie sowie deren Beziehungen zu anderen Familien innerhalb des verwendeten Materials. Die gestrichelte Linie in der Mitte symbolisiert die Teilung der Kernfamilie 27. 46 Material und Methoden 3.1.2. Oligonukleotide, Chemikalien, Verbrauchsmaterialien und Glaswaren 3.1.2.1. Oligonukleotide Die verwendeten IRD700- und IRD800-fluoreszenzmarkierten Primerpaare für die Mikrosatellitenanalyse wurden von der Firma MWG-Biotech AG (Ebersberg) bezogen. Unmarkierte Primerpaare für die RH-Kartierung stammten von der Firma biomers.net GmbH (Ulm) und der Firma Invitrogen GmbH (Karlsruhe). 3.1.2.2. Chemikalien Die verwendeten Chemikalien und Reagenzien wurden von folgenden Firmen bezogen: - AppliChemGmbH (Darmstadt): EDTA, Ethanol - Carl Roth GmbH & Co. KG (Karlsruhe): Borsäure, EDTA, Ethidiumbromid, Formamid, PAA-Lösung, TEMED, TRIS, DMSO, HCl - Invitrogen GmbH (Karlsruhe): Agarose - Merck KGgA (Darmstadt): Bromphenolblau, Paraffinöl, Xylencyanol - Sigma-Aldrich GmbH (Seelze): APS, Ficoll® 3.1.2.3. Verbrauchsmaterialien und Glaswaren Die eingesetzten Verbrauchsmaterialien und Glasgeräte wurden von folgenden Firmen bezogen: - Abgene (Hamburg): 96-Well Mikrotiterplatten - Biozym Diagnostik GmbH (Hessisch Oldendorf): 96-Well Mikrotiterplatten - Brand GmbH & Co. KG (Wertheim): Glaspipetten (10 und 25 ml), Pipettenspitzen - BSN Medicals GmbH & Co. KG (Hamburg): Einwegkanülen Neolus® zur Injektion und Blutentnahme - Carl Roth GmbH & Co. KG (Karlsruhe): Pipettenspitzen - Eppendorf Ag (Hamburg): Pipettenspitzen - Gilson International (Bad Camberg): Pipettenspitzen - Greiner (Nürtingen): Kunstoff-Röhrchen - Hemke-Sass Wolf GmbH (Tuttlingen): Einwegspritzen - Matrix Technologies (Wehrheim): Pipettenspitzen, Spitzen für Multipette®, Reaktionsgefäße („Eppendorf-Tubes“, 1,5 ml) Material und Methoden 47 - Nalgene® Labware (Neerijse, BE): Kunststoffflaschen - Noba Verbandmittel Danz GmbH & Co KG (Wetter-Wengern): Nitril Untersuchungshandschuhe - Omnilab Laborzentrum GmbH & Co. KG (Hamburg): Pipettenspitzen - Sarstedt AG & Co. (Nümbrecht): Blutentnahmesystem Monovette®, Kunststoffröhrchen - Schleicher & Schuell GmbH (Einbeck): Filterpapier - Schott Duran Produktions GmbH & Co. KG (Mainz): Bechergläser, Erlenmeyerkolben, Glasflaschen - Vitlab GmbH (Seeheim-Jungenheim): Bechergläser (Kunststoff), Messzylinder, Trichter 3.1.3. Laborgeräte • Pipetten - 0,1 - 10 µl Multi-12-Kanalpipette, Micronic® (Lelystad, NL) - Matrix Impact® elektronische Multi-8-Kanalpipette 100-1250 µl, Matrix Technologies (Wehrheim) - 0,5 - 10 µl Matrix Multi-12-Kanalpipette, Matrix Technologies, (Wehrheim) - Gilson Pipetman®P: 1-10µl, 2-20µl, 20-200µl, 200-1000µl, Gilson International (Bad Camberg) - Multipette® plus, Eppendorf Ag (Hamburg) - pipetus® akku, Pipettierhilfe für Glaspipetten von 0,1 - 200 ml, Hirschmann Laborgeräte GmbH & Co. KG (Eberstadt) - 8-Kanal Gel-Ladespritze 0,2 - 10 µl (Hamilton), Omnilab Laborzentrum GmbH & Co. KG (Hamburg) • Zentrifugen - Sigma Zentrifuge 4-15, Rotor 09100 (Sigma Laborzentrifungen GmbH, Osterode) - Eppendorf Tischzentrifugen 5415C und 5415D (Eppendorf AG, Hamburg) - Heraeus Sepatech biofuge A (Kendro Laboratory Products GmbH, Heraeus und SORVALL Laborgeräte, Hanau) 48 • Material und Methoden PCR-Geräte - PTC-100® und PTC-200® Peltier Thermo Controller, Thermocycler für Mikrotiterplatten (MJ Research Inc. / Bio-Rad Laboratories, München) - Primus 96 plus, Thermocycler für Mikrotiterplatten (MWG Biotech AG, Ebersberg) • Sonstiges - Automatische DNA-Sequenziergeräte: Li-Cor 4200 DNA Sequencer und LiCor 4300 DNA Analysis System (LI-COR®, Bad Homburg) - Geldokumentationssystem: BioDocAnalyze 312 nm (Biometra GmbH, Göttingen) - Gelkammern für Agrosegelelektrophorese Bio-Rad Ready Sub-Cell GT und Spannungsgeber Bio-Rad PowerPac 3000 (Bio-Rad Laboratories, München) - Reinstwasseranlage: Milli-Q biocel System (Millipore GmbH, Eschborn) - Magnetrührer MR 2002 (Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Schwabach) - IKA MTS 2/4 digital Mikrotiterschüttler (IKA-Werke GmbH & Co. KG, Staufen) - Reagenzglasschüttler (Vortexer): Reax top (Heidolph Instruments GmbH & Co. KG, Schwabach) - GFL Schüttelwasserbad 1083 (GFL Gesellschaft für Labortechnik mbH, Burgwedel) - Waage 1500S, Feinwaage 1801 (Sartorius AG, Göttingen) - Brutschrank Heraeus elektronic (Kendro Laboratory Products GmbH, Heraeus und SORVALL Laborgeräte, Hanau) - Digital-pH-Meter 643 (Knick GmbH & Co., Berlin) Material und Methoden 49 3.2. Methoden 3.2.1. Versuchsstrategie Abb. 3-2: Versuchsstrategie der Kopplungsanalyse. 3.2.1.1. Kopplungsanalyse Für die durchgeführte Kopplungsanalyse zur Lokalisierung des für die kongenitale Mikrophthalmie des Texelschafes verantwortlichen Genortes wurde ein komparativer Kandidatengenansatz gewählt. Zum Zeitpunkt der Untersuchung waren bei Mensch und Maus 26 Genorte im Zusammenhang mit kongenitaler Mikrophthalmie bekannt, die überwiegend für Transkriptionsfaktoren und Signalmoleküle der frühembryonalen Augendifferenzierung kodieren (Kap. 2.1.2.). Diese 26 Genorte wurden als Kandidatengene ausgewählt (Tab. 3-4). Ihre vorhergesagte chromosomale Lage beim Schaf wurde der Sheep Predicted Map 1.4 (Australian Sheep Gene Mapping Website: http://www1.angis.org.au/jmaddox/cgibin/shp_ predict_map.pl) entnommen. Für jedes dieser Kandidatengene wurden aus der aktuellen genetischen Karte des Schafes (SheepMap 4.5, Australian Sheep Gene Mapping Website: http://www1.angis.org.au/jmaddox/pages/shpmapbp.htm) im ersten Schritt zwei bis drei 50 Material und Methoden flankierende polymorphe Mikrosatellitenmarker ausgewählt. Insgesamt kamen somit 49 Mikrosatellitenmarker zum Einsatz (Anhang 1). Tabelle 3-4: Genorte für angeborene Mikrophthalmie bei Mensch bzw. Maus Symbol Funktion1) 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 EYA3 FOXE3 SOX2 SIX3 OTX1 SHH PITX2 MFRP BMP4 SIX6 SIX4 CHX10 GJA1 EYA1 DACH1 VSX1 EYA2 BMP7 MAF PAX6 MCOP MITF FOXC1 NNO1 PITX3 RAX TF TF TF TF TF SM TF TM SM TF TF TF LP TF TF TF TF SM TF TF ? TF TF ? TF TF Chromosomale Lage Mensch HSA 1p36 1p32 3q26.3-q27 2p16-p21 2p13 7q36 4q25-q27 15q12-q15 14q22-q23 14q22.3-q23 14q23 14q24 6q21-q23.2 8q13.3 13q22 20p11.23-p11.22 20q13.1 20q13 16q22-q23 11p13 14q32 3p14.2-p14.1 6p25 11p 10q25 18q21 Vorhergesagte chromosomale Lage Schaf2) OAR cM 1 1 1 3 3 4 6 7 7 7 7 7 8 9 10 13 13 13 14 15 18 19 20 21 22 23 20 38 241 75 90 152 24 75 90 99 99 119 80 72 57 73 115 126 13 88 90 40 90 55 36 24 1) TF: Transkriptionsfaktor; SM: Signalmolekül; TM: Transmembranprotein; ? bislang unbekanntes Gen 2) Sheep Predicted Map 1.4: http://rubens.its.unimelb.edu.au/~jillm/jill.htm; (MADDOX 2005) Nach der Isolierung von DNA aus den Vollblutproben des ausgewählten Tiermaterials wurde eine Genotypisierung mittels PCR und anschließender Auftrennung der Markerallele durch Polyacrylamidgelelektrophorese vorgenommen. Außerdem wurde für alle Tiere der Genotyp an drei variablen PRNP-Codons bestimmt und die Polymorphismen im ovinen PrionproteinGen ebenfalls als genetische Marker genutzt (DRÖGEMÜLLER et al. 2001). Mit den gewonnenen Daten wurden sowohl eine nicht-parametrische als auch eine parametrische Material und Methoden 51 Kopplungsanalyse sowie eine Haplotypenanalyse vorgenommen. Anhand der dabei ermittelten Ergebnisse wurden weitere Mikrosatellitenmarker in Regionen ausgewählt, für die Hinweise auf Kopplung mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit von p ≤ 0,05 bestanden. Dadurch erweiterte sich das Markerset auf insgesamt 80 Marker. Im Anschluss an die Kopplungsanalyse wurde in Regionen mit Hinweis auf Kopplung eine vergleichende RHKartierung zur humanen Genomsequenz durchgeführt. Abbildung 3-2 gibt einen Überblick über die gesamte Versuchsstrategie. 3.1.1.2. Vergleichende RH-Kartierung Für die vergleichende RH-Kartierung zwischen Schaf und Mensch wurde ein an der Utah State University (COCKETT 2003b) entwickeltes ovines RH-Panel verwendet. Dieses wurde aus ovinen Zellen und Hamsterzellen durch Röntgenbestrahlung mit einer Strahlendosis von 5000 Rad erzeugt (Kap. 2.5.2.). Das Panel besteht aus 88 hybriden Zelllinien. Neben der DNA dieser Zelllinien enthält das Panel je eine Kontrolle in Form von originärer genomischer Schaf- und Hamster-DNA. Diese Kontrollen dienen zur Bestätigung dafür, dass die am Panel typisierten Primerpaare auf originärer Hamster-DNA kein PCR-Produkt liefern, dies aber auf originärer Schaf-DNA tun (Positivkontrolle). Für die vergleichende Kartierung wurden bereits bekannte Homologien zwischen Schaf und Mensch als Anhaltspunkte herangezogen. Außerdem wurden bekannte Homologien zwischen Rind und Mensch genutzt (z.B. ITOH et al. 2005). Zur Entwicklung von STS-Markern wurden Sequenzübereinstimmungen zwischen in den öffentlichen Datenbanken verfügbaren ovinen BAC-Endsequenzen (BES) und der humanen Sequenz mit Hilfe der Software BLAST gesucht. Für BES mit signifikanten Sequenzübereinstimmungen (E ≤ 10-5) wurden Primerpaare für eine PCR an der DNA der Zelllinien des ovinen RH-Panels ausgewählt. Außerdem wurden ovine Mikrosatelliten aus den gekoppelten Regionen für eine RH-Typisierung ausgewählt, um einen Bezug zur genetischen Karte des Schafes zu erhalten. Aufgrund der bekannten Lokalisation dieser Mikrosatelliten wurden sie zur Erzeugung einer so genannten Rahmenkarte (framework-map) verwendet, innerhalb derer anschließend die übrigen Marker angeordnet wurden. 52 Material und Methoden 3.2.2. Molekulargenetische Methoden 3.2.2.1. Isolierung von genomischer DNA aus Vollblut Für die Isolierung hochreiner genomischer DNA aus Vollblut wurden zwei unterschiedliche Research-Kits verwendet. Für größere Probenzahlen wurde das NucleoSpin® 96 Blood QuickPure Kit (Macherey-Nagel, Düren) nach Herstellerangaben verwendet, mit dem eine Isolierung von 96 Proben gleichzeitig im Mikrotiterformat durchgeführt werden kann. Kleinere Probenzahlen wurden gemäß Herstellerangaben mit dem QIAamp® DNA Blood Mini Kit (Qiagen, Hilden) bearbeitet. Das Prinzip der DNA-Isolierung der beiden Kits gleicht sich grundsätzlich. Zunächst erfolgt eine Lyse der Blutzellen durch einen enzymatischen Verdau mit Proteinase K. Anschließend wird die freie DNA mit Ethanol (96-100%) gefällt. Das Lysat wird durch eine SilicaMembran zentrifugiert, wobei die DNA an die Membran bindet. Nach dem Waschen der Membran (1x beim NucleoSpin® 96 Blood QuickPure Kit, 2x beim QIAamp® DNA Blood Mini Kit) kann die gebundene DNA mit einem Puffer eluiert werden. 3.1.2.2. Polymerasekettenreaktion (PCR) Für die Typisierung der Mikrosatelliten am Familienmaterial und die RH-Kartierung wurden jeweils unterschiedliche PCR-Protokolle gewählt. Für die Typisierung der Mikrosatelliten wurde Taq-Polymerase (5 U/µl) der Firma Qbiogene (Heidelberg) verwendet. Gemäß den Annealingtemperaturen, den Allelgrößen und der Markierung der Primer (IRD-700 oder IRD-800) wurden mehrere (2-4) Mikrosatelliten in einem Ansatz amplifiziert (Multiplex-PCR). Folgender Ansatz wurde verwendet: genomische Schaf-DNA (ca. 12,5 ng/µl): 2 µl 10 x PCR-Puffer des Herstellers inkl. 1,5 mM Mg: 1,2 µl Vorwärtsprimer, IRD- markiert (10 pmol/µl): je 0,6 µl Rückwärtsprimer (10 pmol/µl): je 0,6 µl Taq-DNA-Polymerase (5U/µl): 0,15 µl dNTPs des Herstellers (10 mM jeweils): 0,2 µl DMSO: 0,24 µl Wasser: ad 12 µl Material und Methoden 53 Alle Komponenten wurden auf Eis pipettiert und anschließend in ein auf 94°C vorgeheiztes PCR-Gerät überführt. Es folgte eine initiale Denaturierung bei 94 °C für 3 min. Anschließend wurden 32 Zyklen mit einer Denaturierung bei 94°C für 30s, einem Annealing bei der jeweiligen Annealingtemperatur des Primerpaares (Anhang 1) für 1 min und einer Elongation bei 72°C für 30 s. Abschließend erfolgte eine finale Elongation bei 72°C für 4 min sowie eine anschließende Kühlung auf 4°C für 5 min. Für die PCR zur Typisierung der Mikrosatelliten-, STS- und EST-Marker auf dem ovinen RH-Panel wurde Taq- DNA-Polymerse der Firma Invitrogen (5 U/µl) verwendet. Folgender Ansatz wurde gewählt: Zelllinien-DNA (ca. 12,5 ng/µl): 2 µl 10 x PCR-Puffer des Herstellers: 1,2 µl MgCl2-Lösung des Herstellers (50mM): 0,36 µl Vorwärtsprimer (10 pmol/µl): 0,5 µl Rückwärtsprimer (10 pmol/µl): 0,5 µl Taq-DNA-Polymerase (5 U/µl): 0,1 µl dNTPs des Herstellers (10 mM jeweils): 0,2 µl Wasser: ad 12 µl Alle Komponenten wurden auf Eis pipettiert und anschließend in ein auf 94°C vorgeheiztes PCR-Gerät überführt. Es folgte eine initiale Denaturierung bei 94 °C für 3 min. Anschließend wurden 40 Zyklen mit einer Denaturierung bei 94°C für 30s, einem Annealing bei der jeweiligen Annealingtemperatur des Primerpaares (Anhang 5) für 45 s und einer Elongation bei 72°C für 30 s. Abschließend erfolgte eine finale Elongation bei 72°C für 4 min sowie eine anschließende Kühlung auf 4°C für 5 min. 3.1.2.3. Polyacrylamidgelelektrophorese 3.1.2.3.1. Mikrosatellitengele Die Auftrennung der Mikrosatellitenallele erfolgte mittels denaturierender Polyacrylamid (PAA)-gelelektrophorese. Die Gelbildung erfolgt durch Polymerisation mit Hilfe eines Radikalbildners. Acrylamid und N,N-Methylen-Bisacrylamid werden nach Zusatz von Ammoniumperoxidsulfat (APS) und dem Katalysator N,N,N,N-Tetramethylendiamin (TEMED) zu einer Gelmatrix vernetzt (SAMBROOK et al. 1989). 54 Material und Methoden Für die Auftrennung doppelsträngiger DNA-Fragmente wählt man denaturierende Bedingungen. Die Denaturierung der PCR-Produkte erfolgt zum einen durch das im Auftragspuffer enthaltenen Formamid und zum anderen durch den Harnstoff in der Gellösung. Es wurden 6%ige (w/v) Gele verwendet. Die eingesetzte PAA-Lösung (Roth, Karlsruhe) ist 40%ig (w/v), wobei das Verhältnis von Acrylamid zu N,N-Methylen-Bisacrylamid 19:1 beträgt. Die Gellösung setzt sich folgendermaßen zusammen: Endkonzentration Harnstoff/TBE- Stammlösung (50% w/v Harnstoff, 1,18 x TBE): 12,75 ml Harnstoff: 42,5 % w/v TBE: 1 x Acrylamidlösung (40% w/v, 19:1) 2,25 ml APS-Lösung (10% w/v) 95 µl TEMED 9,5 µl 6 % w/v Die noch flüssige Lösung wurde zwischen Glasplatten luftblasenfrei gegossen. Beide Platten wurden zuvor gründlich gereinigt. Die ca. 20 cm langen Glasplatten werden durch 0,2 mm starke so genannte Spacer getrennt aufeinander gelegt und durch zwei Schienen zusammengehalten. Die Gelpolymerisation erfolgt innerhalb einer Stunde, in der Regel wurden die Gele jedoch am Abend des Vortages gegossen. Nach der Polymerisation wurde das Gel in das LICOR-Gerät eingebaut und die Puffertanks wurden mit 1x TBE-Laufpuffer befüllt. Es wurde ein Haifischzahnkamm mit 48 Taschen zum Probenauftrag benutzt. Die PCR-Produkte wurden mit einem Auftragspuffer (Formamidpuffer) für denaturierende Gele im Verhältnis 1:10 bis 1:20 verdünnt. Nach etwa 15 min wurde 1 µl der verdünnten Probe mit einer 8Kanal-Gelladespritze (Hamilton) auf das Gel aufgetragen. Als Längenstandard diente der LICOR 50-350 bp sizing standard IRD-700 und IDR-800 (LI-COR®, Bad Homburg). Während eines Gellaufes konnten 3-4 mal nacheinander Proben aufgetragen werden. Die Gelelektrophorese wurde bei 48 °C, 1500 V, 35 mA und 31 W durchgeführt und dauerte je nach Fragmentlänge zwischen 0,5 h und 2,5 h. Material und Methoden 55 Herstellung der Harnstoff/TBE-Stammlösung Es werden 425 g Harnstoff in eine Glasflasche eingewogen. Dazu werden 100 ml 10x TBE und etwa 250 ml Aqua bidest. gegeben. Dann wird bei 65 °C im Wasserbad unter gelegentlichem Schütteln so lange inkubiert, bis der Harnstoff gelöst ist. Dann wird mit Aqua bidest. auf 850 ml aufgefüllt und anschließend filtriert. Herstellung von 10 x TBE Endkonzentration TRIS 108 g 890 mM Borsäure 55 g 890 mM EDTA 7,44 g 20 mM Aqua bidest. ad 1000 ml Mit HCl wurde auf pH 8 eingestellt. Herstellung des Ladepuffers Zur Herstellung des Ladepuffers wurden 18 ml deionisiertes Formamid mit 2 ml einer vorher hergestellten Färbelösung gemischt. Färbelösung: Endkonzentration im Ladepuffer Bromphenolblau 0,5 g 0,1 % w/v (0,5 M, pH 8) 10 ml 10 mM Aqua bidest. ad 50 ml EDTA-Lösung 3.1.2.3.1. Auswertung der Mikrosatellitengele Die erzeugten Bilder der Mikrosatellitengele wurden visuell ausgewertet. Dabei wurde jedes Gel zweimal an zwei verschiedenen Tagen ausgewertet, um Fehltypisierungen zu vermeiden. Die Bezeichnungen der Allele entsprechen ihrer Länge in bp. 3.1.2.3. Agarosegelelektrophorese Je nach Größe der zu untersuchenden DNA-Fragmente wurden Agarose-Konzentrationen von 1,0 bis 2,0% gewählt. Die jeweilige Menge Agarose (Invitrogen) wurde in einen ErlenmeyerKolben eingewogen und mit dem entsprechenden Volumen 1x TBE-Laufpuffer (Kap. 56 Material und Methoden 3.1.2.3.1.) aufgeschlämmt. Die Suspension wurde in der Mikrowelle aufgekocht und bis zum Entstehen einer homogenen Lösung gerührt. Nach Abkühlen auf ca. 50-60°C wurde die Lösung mit Ethidiumbromid (Roth, Karlsruhe) in einer Endkonzentration von 0,5 µg/ml versetzt und in einen Gelträger mit dem gewünschten Kamm überführt. Anschließend wurde bis zum Erstarren des Gels erkalten lassen. Der Kamm wurde vorsichtig gezogen und das Gel in einer Elektrophoresekammer mit 1x TBE-Laufpuffer bedeckt. Jeweils 5 µl PCR-Produkt wurden mit 3 µl Auftragspuffer vermischt und die Taschen des Gels geladen. Der Auftragspuffer dient zum einen dazu, die Dichte der Probe zu erhöhen, damit sie in die Tasche fällt und zum anderen wird die Probe farblich sichtbar gemacht. Zur Größenbestimmung wurde gleichzeitig ein Fragmentlängenstandard aufgetragen (100 bp DNA Ladder, 100-1500 bp, New England Biolabs GmbH, Frankfurt a. M.). Die Elektrophorese erfolgte bei Feldstärken von 3-7,5 V/cm. Das Ethidiumbromid interkaliert während der Elektrophorese in die DNA und die Banden kann durch UV-Licht (Wellenlänge 312 nm) sichtbar gemacht werden. Die Betrachtung und Dokumentation der Gele erfolgte mit dem Geldokumentationssystem BioDocAnalyze (Biometra, Göttingen). Herstellung des Auftragspuffers Endkonzentration Ficoll® 400 6g 20 % (w/v) Xylencyanol 60 mg 0,2 % (w/v) Bromphenolblau 60 mg 0,2 % (w/v) EDTA-Lösung (0,5 M, pH 8) 6 ml Aqua bidest. 0,1 M ad 30 ml 3.2.3. Statistische Methoden und Computeranalysen 3.2.3.1. Abstammungskontrolle, Qualitätskontrolle der Genotypisierungsdaten und Pedigree-Analyse Die Genotypisierungsdaten wurden zunächst mit der Software PEDSTATS Version 0.6.3. (WIGGINGTON und ABECASIS 2005) analysiert, um fragliche Abstammungen zu überprüfen und Genotypisierungsfehler auszuschließen. Außerdem liefert diese Software statistische Daten über die Zusammensetzung des Familienmaterials. In einem zweiten Schritt wurden die Genotypisierungsdaten mit der ERROR-Option der MERLIN-Software (ABECASIS et al. 2002) überprüft. Fragliche Genotypen wurden überprüft, erneut typisiert und entsprechend korrigiert. Material und Methoden 57 3.2.3.2. Auswertung der Markereigenschaften Der Informationsgehalt sowie die Allelfrequenzen der Marker wurden mit SAS/Genetics® (SAS Institute Inc., Cary, NC, USA.) bestimmt. 3.2.3.3. Kopplungs- und Haplotypenanlyse Die nicht-parametrische und die parametrische Kopplungsanalyse wurden mit der Software MERLIN Version 1.0.1. (ABECASIS et al. 2002; ABECASIS und WIGGINGTON 2005) durchgeführt. Bei der nicht-parametrischen Analyse kamen die Optionen NPL und PAIRS zum Einsatz. Diese entsprechen den Teststatistiken Sall und Spairs nach WHITTEMORE und HALPERN (1994). Dabei wird die Kopplungsanalyse anhand einer IBD-Matrix durchgeführt, wobei Spairs betroffene relative Paare innerhalb einer Familie berücksichtigt, während Sall alle betroffenen Tiere einer Familie einbezieht. Als Ergebnis der Analyse erhält man für jeden Marker den Z-score (Zmean), den LOD-Score nach dem linearen Modell von KONG und COX (1997) sowie die jeweiligen Irrtumswahrscheinlichkeiten (pZmean und pLOD-Score). Die parametrischen Berechnungen wurden mit der Option MODEL durchgeführt. Dazu müssen in einer separaten Datei Modellparameter spezifiziert werden. Diese Parameter beinhalten die Defektallelfrequenz in der betrachteten Population sowie Angaben zum Erbgang. Für jeden der drei möglichen Genotypen muss die Wahrscheinlichkeit angegeben werden, mit der sein Träger betroffen ist. Dadurch ist es möglich, ein differenziertes Modell zu erstellen, in das auch variable Penetranzen und Phänokopien einfließen können. Als Ergebnis erhält man für jeden Marker den parametrischen LOD-Score, den Anteil von Familien, für die eine Kopplung besteht (α) sowie den HLOD-Score (Heterogeneity LOD-Score). Wenn α < 1 ist, dann gibt es Familien für die am betreffenden Markerlocus keine Kopplung besteht. Das kann auf genetische Heterogenität oder Phänokopien hindeuten. Der HLOD-Score berücksichtigt dies (HLOD > LOD, wenn α < 1). Unter der Annahme, dass für einen Markergenort tatsächlich eine Kopplung besteht, kann man anhand von α sowie dem LOD-Score für eine einzelne Familie die bedingte Wahrscheinlicht für das Vorliegen einer Kopplung an diesem Markergenort berechnen. Die Berechnung erfolgt nach der Formel α 10LOD(i) / [10LOD(i) + (1α)], wobei LOD(i) den LOD-Score für eine bestimmte Familie i verkörpert. Zur Bestimmung der wahrscheinlichsten Haplotypen wurde die Option BEST der MERLINSoftware verwendet. 58 Material und Methoden 3.2.3.4. Sequenzvergleich und Primerdesign Im Zuge der vergleichenden RH-Kartierung zwischen Schaf und Mensch wurde das Programm BLAST (ALTSCHUL et al. 1990, http://www3.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/) verwendet, um Sequenzhomologien zwischen den in den öffentlichen Datenbanken (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) verfügbaren ovinen BAC-Endsequenzen (BES) und der humanen Sequenz zu finden. Zu diesem Zweck wurden zunächst repetitive Elemente in den BES maskiert, um Sequenzhomologien aufgrund von solchen repetitiven Elementen auszuschließen. Dazu diente die Online-Software REPEATMASKER (http://www. repeatmasker.org/) unter Berücksichtigung der für das Schaf bzw. das Rind spezifischen repetitiven Elemente. Die ovinen BES mit einer signifikanten Sequenzübereinstimmung (einzigartiger Blasthit mit einem E-Wert ≤ 10-5) wurden zur Entwicklung von STS-Markern verwendet. Zu diesem Zweck wurden Primerpaare für eine PCR ausgewählt, um die Marker am ovinen RH-Panel zu typisieren (Anhang 5). Zur Auswahl der Primer diente die Online-Sofware PRIMER3 (http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi). 3.2.3.4. Radiation Hybrid Mapping Zur Analyse der durch PCR am ovinen RH-Panel gewonnenen Typisierungsdaten wurde das Softwarepaket RHMAP 3.0 (BOEHNKE et al. 1992, LANGE et al. 1995) verwendet. Zunächst wurde das Programm RH2PT verwendet. Es diente einerseits zur statistischen Beschreibung der Daten. Andererseits wurden damit eine Zweipunkt-Analyse durchgeführt sowie Kopplungsgruppen bestimmt (LOD-Score-Schwellenwert > 8). Zur Anordnung der Marker dienten die Programme RHMINBRK und RHMAXLIK. Zunächst wurde eine so genannte Gerüst- oder Rahmenkarte (framework map) mit RHMAXLIK generiert. Für die Anordnung eines Markers wurde eine minimale relative Wahrscheinlichkeit von 1:1000 gewählt (ADDMIN = 3). Es wurde eine schrittweise Anordnung unter dem Modell der gleichen Retentionswahrscheinlichkeit (BOEHNKE et al. 1991; BISHOP und CROCKFORD 1992; BOEHNKE et al. 1992) durchgeführt. Dieses Modell minimiert die Anzahl der Brüche, die zur Erklärung des beobachteten Retentionsmusters notwendig sind und führt eine maximum-likelihood-Analyse aus. Die endgültige, umfassende RH-Karte (comprehensive map) wurde durch Anordnung der verbleibenden Marker an ihrer wahrscheinlichsten Position innerhalb des Gerüstes erzeugt. Dazu wurde RHMAXLIK verwendet (ADDMIN = 0). Material und Methoden 59 3.2.4. Klinische Untersuchungen In der Klinik für kleine Haustiere der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover wurden an insgesamt 21 Tieren klinische Untersuchungen durchgeführt. Das Material setzte sich aus sechs Merkmals- und fünf Anlageträgern sowie zehn nicht verwandten Tieren anderer Rassen zusammen (Tabelle 3-5). Alle Tiere wurden, soweit im Einzelfall möglich, einer kompletten klinischen Augenuntersuchung unterzogen. Bei einzelnen Tieren wurden Ultraschalluntersuchungen am Auge durchgeführt. Tabelle 3-5: Tiermaterial für die klinischen Untersuchungen. Lab-Nr.1) * 1) 2) 3) 4) 5) Sex2) Status3) Alter4) 61 * 67 * 79 * 509 * 515 * 507 1 1 1 1 1 2 2 2 2 2 2 2 ad. ad. ad. juv. juv. juv. 510 * 512 * 513 * 521 * 522 * Referenz Referenz Referenz Referenz Referenz Referenz * 2 1 1 2 1 1 2 2 1 2 2 1 1 1 1 1 0 0 0 0 0 0 juv. juv. juv. juv. juv. juv. juv. juv. juv. juv. juv. Referenz Referenz Referenz Referenz 2 2 2 2 0 0 0 0 ad. ad. ad. ad Rasse5) Herkunft Texel Texel Texel Texel Texel Texel Zuchtversuch Zuchtversuch Zuchtversuch (Vatertier) Zuchtversuch Zuchtversuch Einzelfall aus der Klinik für Kleine Klauentiere Texel Zuchtversuch Texel Zuchtversuch Texel Zuchtversuch Texel Zuchtversuch Texel Zuchtversuch sOMS Institut für Tierzucht sOMS Institut für Tierzucht sOMS Institut für Tierzucht sOMS Institut für Tierzucht sOMS Institut für Tierzucht Kamerunschaf Institut für Tierzucht x sOMS skFS Institut für Tierzucht Bentheimer Institut für Tierzucht sOMS Institut für Tierzucht Kamerunschaf Institut für Tierzucht Labornummer; für die Referenztiere wurde keine Labornummer vergeben; alle mit einem Stern gekennzeichneten Tiere wurden auch pathologisch untersucht. Geschlecht; 1 = männlich, 2 = weiblich. 2 = Merkmalsträger, 1 = Anlageträger, 0 = nicht verwandtes Referenztier einer anderen Rasse. juv. = juvenil, ad. = adult; unter juvenil sind hier Tiere mit einem Alter von < 8 Wochen zu verstehen. Es handelt sich meist nicht um reinrassige Texelschafe, denn die Gründertiere der Ressourcenfamilie stammen aus Gebrauchsschafherden mit einem nicht bestimmbaren Texelanteil; sOMS= schwarzes Ostfriesisches Milchschaf, skFS = schwarzköpfiges Fleischsschaf. 60 Material und Methoden 3.2.5. Pathologisch-anatomische und pathologisch-histologische Untersuchungen Insgesamt wurden zehn Tiere von den Mitarbeitern des Institutes für Pathologie der Stiftung Tierärztliche Hochschule Hannover untersucht. Es wurden sowohl betroffene als auch nicht betroffene Tiere untersucht. Nach Allgemeinanästhesie mit einer Kombination aus Ketamin (10 mg pro kg KG, Ursotamin®, Serumwerk Bernburg AG, Bernburg) und Xylazin (0,1 mg pro kg KG, Rompun®, Bayer Vital GmbH, Leverkusen) und anschließender schmerzloser Tötung (T61® 0,5 ml pro kg KG, Intervet Deutschland GmbH, Unterschleißheim) wurde bei allen Tieren eine Sektion durchgeführt, wobei insbesondere die Suche nach bisher nicht beschriebenen assoziierten Missbildungen im Vordergrund stand. Die Augen wurden entnommen, in einer Lösung mit 4 % Paraformaldehyd, 2,5 % Glutaraldehyd und 1 % Natriumcacodylat fixiert und sagittal geschnitten. Darüber hinaus wurden Gewebeproben aus Lymphknoten, Muskulatur, Herz, Lunge, Milz, Leber, Nieren, Harnblase, Geschlechtsorganen, Vormägen, Labmagen, Dünn- und Dickdarm, Gehirn, Rückenmark, Thymus, Schilddrüse, Nebenniere und Hypophyse entnommen. Diese Gewebeproben wurden in einer ungepufferten 10 %igen Formalinlösung fixiert. Die Proben wurden nach Paraffineinbettung für die histopathologische Untersuchung geschnitten (4 µm) und nach der HaematoxylinEosin (HE) Methode gefärbt. Neben einem gesunden Tier einer anderen Rasse (schwarzes Ostfriesisches Milchschaf), von dem angenommen werden kann, dass es kein Anlageträger war, kamen zwei Anlageträger und sieben betroffene Tiere zur Untersuchung. Drei der betroffenen Tiere waren adulte Böcke, während alle anderen Tiere juvenil waren (< 8 Wochen). Bis auf ein Tier (Nr. 523) wurden alle untersuchten Tiere zuvor einer klinischen Untersuchung in der Klinik für kleine Haustiere unterzogen (Kap. 3.2.4.; Tab. 3-5). Ergebnisse 61 4. Ergebnisse 4.1. Klinische Untersuchungen Bei der ophthalmologischen Untersuchung von sechs Merkmalsträgern lag in allen Fällen beidseitig ein hochgradiger Mikrophthalmus vor. Lidränder, Konjunktiven und Nickhaut waren regelgerecht ausgebildet, so dass sie in allen Fällen sehr prominent wirkten und die verkleinerten Augäpfel bis auf kleinere Areale verdeckt waren (vier Tiere, sieben Augen). Bei drei Tieren (fünf Augen) war der Augapfel so stark verkleinert, dass er nicht einsehbar war. Bei den einsehbaren Augäpfeln erwies sich die Kornea gesamthaft diffus getrübt mit starker Vaskularisation und einer granulierten Oberfläche. In einem Fall war die Kornea stark pigmentiert. In keinem Fall war die vordere Augenkammer einzusehen. Abbildung 4-1: Mikrophthalmie bei einem etwa sechs Wochen alten Lamm. Abbildung 4-2: Mikrophthalmie bei einem etwa 2 Wochen alten Lamm. 62 Ergebnisse Abbildung 4-3: Direkter Vergleich der linken Augen eines von Mikrophthalmie betroffenen (links) und eines normal entwickelten (rechts) Lammes. Bei der Ultraschalluntersuchung konnten sieben Augen von vier verschiedenen betroffenen Tieren dargestellt werden. Bei zwei Tieren (vier Augen) war der Glaskörperraum gesamthaft hyperechogen und keine Linse abgrenzbar. Bei zwei Tieren (drei Augen) befand sich im Glaskörperraum eine hyperechogene, klar abgegrenzte Struktur mit Kontakt zur Retina, in diesen Fällen war ebenfalls keine Linse darstellbar. Linsenhinterfläche Glaskörperraum Sehnerv Abbildung 4-4: Ultraschallbilder eines mikrophthalmischen (links) und eines normal entwickelten (rechts) Auges. Im mikrophthalmischen Auge sind keine normalen okulären Strukturen erkennbar. Ergebnisse 63 Die opthalmologische Untersuchung von fünf Anlageträgern ergab keine Abweichungen von der Norm. Es konnten keine Unterschiede zu den zehn untersuchten Vergleichstieren festgestellt werden. Die Schafe waren sehfähig mit positivem Drohreflex. Der Blendreflex sowie der direkte und indirekte Pupillarreflex waren positiv. Kornea, vordere Augenkammer und Iris waren ohne Abweichungen von der Norm. Nach der Verabreichung eines Mydriatikums wurden Linse und Augenhintergrund untersucht und dabei ebenfalls keine Abweichungen von der Norm festgestellt. 4.2. Pathologische und pathologisch-histologische Untersuchungen Am Institut für Pathologie der Tierärztlichen Hochschule wurden insgesamt elf Schafe untersucht. Davon stammten neun Tiere aus dem Zuchtversuch. Von diesen zeigten sieben den Phänotyp der Mikrophthalmie. Dabei handelte es sich um drei adulte und vier juvenile Tiere im Alter von unter acht Wochen. Die drei adulten Tiere waren die anfänglich zur Gründung der Ressourcenfamilie angeschafften betroffenen Böcke. Zwei untersuchte juvenile Tiere waren Anlageträger. Als nicht betroffene Nachkommen eines betroffenen Vaters müssen diese Tiere aufgrund des rezessiven Erbganges heterozygot für den Defektgenort gewesen sein. Zusätzlich wurde ein weiteres unverwandtes Tier der Rasse Schwarzes Ostfriesisches Milchschaf als Referenztier hinzugezogen. An allen Tieren wurde zunächst eine pathologisch-anatomische Untersuchung vorgenommen. Dabei wurde insbesondere nach bisher nicht beschriebenen assoziierten Missbildungen gesucht. Mit Ausnahme der Befunde an den Augen der mikrophthalmischen Tiere konnten jedoch keine besonderen pathomorphologischen Befunde erhoben werden. Im Anschluss wurde eine pathologisch-histologische Untersuchung der Augen sowie der weiteren entnommenen Gewebeproben verschiedener Organe (Kap. 3.2.5.) vorgenommen. Die Augen der Anlageträger und des Referenztieres waren makroskopisch ohne besonderen pathomorphologische Befund. Die Augen der von Mikrophthalmie betroffenen Tiere hatten einen Durchmesser von 0,7 bis 1,1 cm. Der Durchmesser der Nervi optici lag zwischen 1,0 und 1,1 mm. Im Inneren der mikrophthalmischen Augen waren keine vordere Augenkammer, kein Ziliarkörper, kein Glaskörper und keine Linse erkennbar (Abb. 4-5). Stattdessen wurde eine weiße, skirrhöse Masse gefunden, die an der Sehnervenpapille befestigt war. In einigen Fällen waren proximal der Kornea Zysten erkennbar. 64 Ergebnisse 5 mm Abbildung 4-5: Mikrophthalmisches Auge eines etwa 2 Wochen alten Lammes. Abbildung 4-6: Makroskopischer Vergleich eines mikrophthalmischen (links) mit einem normal entwickelten (rechts) Auge von zwei etwa 2 Wochen alten Lämmern in der Aufsicht (oben) und im Sagittalschnitt (unten). Ergebnisse 65 Mikroskopisch wurde eine variable Vaskularisation sowie Pigmentierung der Kornea gefunden. Ansonsten waren das Korneaparenchym und das vordere Hornhautepithel regelgerecht ausgebildet (Abb. 4-8). Die Descemet´sche Membran und das hintere Hornhautepithel fehlten und es konnte keine vordere Augenkammer nachgewiesen werden. Proximal der Kornea wurden bei vier von sieben betroffenen Tieren eine bis mehrere Zysten von variabler Größe gefunden (Abb. 4-7). Sie waren mit verhornendem Plattenepithel ausgekleidet und mit Keratin gefüllt. Teilweise befanden sich Haarstrukturen innerhalb der Zysten. Das Augeninnere war von einer Masse ausgefüllt, die an der Sehnervenpapille befestigt war und aus Bindegewebe, glatter Muskulatur sowie Knorpel- und Fettgewebe bestand. Der deutlich pigmentierte dysplastische Ziliarkörper war randständig in die bindegewebige Masse integriert. Die Masse war von retinalen Strukturen bedeckt. Das Pigmentepithel war intakt und zeigte eine pflastersteinartige Struktur. Es hatte Kontakt zur Choroidea, nicht jedoch zur Neuroretina, die von ihrer Unterlage abgelöst war. Die normale Schichtung der Neuroretina war nicht vorhanden. Es waren aber Strukturen erkennbar, die an die innere und äußere Körnerzellschicht, die innere und äußere plexiforme Schicht sowie die Ganglienzellschicht erinnern. Teilweise waren Rosetten erkennbar, die aus Zellen der Körnerschichten gebildet werden und stellenweise war eine Photorezeptorenschicht nachweisbar (Abb. 4-8). Die Choroidea war breit, enthielt lockeres Bindewebe sowie starke Blutgefäße und war deutlich pigmentiert. Die Kollagenfasern der Sklera erschienen nur wenig organisiert. In keinem der betroffenen Augen konnte eine Linse nachgewiesen werden. Der Nervus opticus war sehr zellreich. Die pathohistologische Untersuchung der Augen von zwei Anlageträgern und einem Referenztier sowie der übrigen Gewebeproben aller elf Schafe erbrachte keine besonderen pathomorphologischen Befunde. Die an den Augen erhobenen makro- und mikroskopischen Einzeltierbefunde sind in Anhang 6 aufgeführt. 66 Ergebnisse I II 200 µm 200 µm Zi K Zy F III 500 µm Abbildung 4-7: Auschnitte aus einem mikrophthalmischen Auge im Bereich der zentralen bindegewebigen Masse. I. Kleinere epitheliale Zyste (Pfeil) mit umgebendem Bindegewebe. II. Knorpel- und Bindegewebe sowie ein Blutgefäß im Anschnitt (Pfeil). III. Übersichtsvergrößerung. F = Fettgewebe, K = Knorpelgewebe, Zi = in die Masse integrierter Ziliarkörper, Zy = epitheliale Zyste. Ergebnisse 67 Mikrophthalmie Normal entwickelt I vAk K K L I Z Z 1mm 1mm II 200 µm 200 µm III 200 µm 200 µm Abbildung 4-8: Mikroskopischer Vergleich okulärer Strukturen zwischen den Augen von Mikrophthalmie betroffener (links) und nicht betroffener (rechts) Tiere. 1. Vorderes Augensegment: Im nicht betroffenen Auge sind die Kornea (K), der Ziliarkörper (Z) mit den Ziliarfortsätzen, die Iris (I) und die Linse (L) sowie die vordere Augenkammer (vAk) zu erkennen. Im mikrophthalmischen Auge sind die Kornea (K) und Reste des Ziliarkörpers (Z) erkennbar, die in die bindegewebige Masse integriert sind. 2. Vergrößerte Ausschnitte aus der Kornea. 3. Retina: Im normal entwickelten Auge sind das Pigmentepithel und die Schichtung der Neuroretina gut erkennbar, während diese Strukturen im mikrophthalmischen Auge ungeordnet vorliegen. Rosetten aus Körnerzellen sind erkennbar (Pfeil). 68 Ergebnisse 4.3. Kopplungsanalyse 4.3.1. Markerstatistik Die eingesetzten Mikrosatellitenmarker weisen einen durchschnittlichen PIC von 0,59 (0,12 0,85) und einen durchschnittlichen Heterozygotiegrad von 0,63 (0,14 - 0,90) auf. Die durchschnittliche Allelzahl pro Markergenort beträgt 6,85 (2 - 18). Die entsprechenden Werte sowie die Allelfrequenzen für alle typisierten Marker sind Anhang 2 zu entnehmen. 4.3.2. Nicht-parametrische Kopplungsanalyse 4.3.2.1. Analyse mit einem initialen Markerset Die nicht-parametrische Kopplungsanalyse mit dem initialen Markerset von 50 Markern (Anhang 1) lieferte in der Multipointanalyse Hinweise für eine Kopplung auf vier verschiedenen Chromosomen (p LOD-Score < 0,05). Die Ergebnisse dieser ersten Auswertung sind in Tabelle 4-1 für die betreffenden Marker dargestellt. Tabelle 4-1: Ergebnisse der nicht-parametrischen Kopplungsanalyse (Option NPL) mit dem initialen Markerset von 50 Markern. Auf 3 Chromosomen sind Marker mit einer möglichen Kopplung (p LOD-Score < 0,05) zu Mikrophthalmie lokalisiert. Marker BMS710 INRA133 BMS2721 BMS2270 OAR 3 6 7 23 cM 80,6 16,0 126,2 23,5 Zmean p Zmean LOD score 1,18 0,12 0,70 0,98 0,2 0,85 0,85 0,2 0,65 2,33 0,01 2,02 p LOD score 0,04 0,02 0,04 0,0012 4.3.2.2. Analyse mit einem erweiterten Markerset Als Konsequenz aus diesen ersten Ergebnissen wurden für die drei betreffenden Chromosomen schrittweise 30 weitere Marker ausgewählt und am vorhandenen Familienmaterial typisiert. Die abschließende Analyse erbrachte für OAR6 und OAR7 keine wesentliche Änderung des Ergebnisses (Tab. 4-2). Ergebnisse 69 Tabelle 4-2: Ergebnisse der nicht-parametrischen Kopplungsanalyse (Option NPL) mit dem erweiterten Markerset für OAR3, OAR6 und OAR7: Zmeans, nicht parametrischer LOD-Score sowie Irrtumswahrscheinlichkeiten. Marker ILSTS28 FCB129 BMS710 ILSTS49 BM9058 INRA133 MCM204 MCM53 MCMA14 INRA107 INRA71 BMS1620 MCM149 BMS2721 BP31 MCM156 ILSTS05 BMS2614 OAR cM 3 3 3 3 6 6 6 6 6 7 7 7 7 7 7 7 7 7 29,5 66,3 80,6 100,2 12,9 16,0 18,2 29,7 45,0 75,0 92,1 105,5 117,1 126,2 132,2 132,9 134,4 136,9 Zmean p Zmean LOD score 0,73 0,16 0,89 -0,01 0,82 1,00 1,01 0,51 0,32 -0,28 -0,09 0,03 -0,10 0,86 0,67 0,63 0,67 0,48 0,2 0,4 0,2 0,5 0,2 0,2 0,2 0,3 0,4 0,6 0,5 0,5 0,5 0,2 0,3 0,3 0,3 0,3 0,53 0,01 0,34 0,00 0,33 0,48 0,50 0,15 0,09 -0,03 0,00 0,00 0,00 0,25 0,11 0,09 0,11 0,05 p LOD score 0,06 0,4 0,11 0,5 0,11 0,07 0,06 0,2 0,3 0,6 0,6 0,5 0,6 0,14 0,2 0,3 0,2 0,3 Auf Grund der erzielten LOD-Scores auf OAR23 wurden für dieses Chromosom insgesamt 21 zusätzliche Marker ausgewählt. Bei der Auswahl dieser Marker wurde neben der genetischen Karte des Schafes auch die genetische Karte des Rindes verwendet. Für die zusätzliche Untersuchung von OAR23 wurden zehn Mikrosatelliten vom homologen Rinderchromosom 24 ausgewählt, die bisher nicht in der genetischen Karte des Schafes enthalten waren. Die heterologen Primer (Anhang 3) wurden am vorhandenen Familienmaterial getestet. Für sechs bovine Mikrosatelliten lieferten die heterologen Primer ein PCRProdukt, aber lediglich die beiden Loci DIK4464 und DIK5068 zeigten sich bei den untersuchten Schafen polymorph. Diese wurden anschließend an den Tieren des International Mapping Flock (IMF) der AgResearch genotypisiert. Die Typisierungsergebnisse wurden an Dr. Jillian F. Maddox (Centre for Animal Biotechnology, University of Melbourne) übermittelt und die beiden Mikrosatelliten wurden in die genetische Karte des Schafes integriert (Tab. 4-3). 70 Ergebnisse Tabelle 4-3: Vergleich der Versionen 4.3 und 4.4 der Kopplungskarte des Schafes. Die Version 4.4 enthält die beiden bovinen Mikrosatelliten DIK4464 und DIK5068. SheepMap 4.3 Marker BM723 UM72A BL6 MCM172 BM226 BMS2526 CSRD2148 MCMA1 cM 0,0 13,5 15,7 16,3 21,9 22,9 33,2 36,4 BMS2270 CSSM031 ILSTS065 AGLA269 37,7 44,9 45,5 49,1 ADCYAP1 MAF35 UW69A BMS1332 CSRD2172 MC2R HEL6S MCM136 MNS83 57,7 59,2 61,2 64,9 64,9 64,9 66,7 67,6 69,3 CGBP 76,7 URB031 97,0 SheepMap 4.4 Marker cM 0,0 BM723 13,5 UW72A 15,7 BL6 16,3 MCM172 21,9 BM226 22,9 BMS2526 33,2 CSRD2148 36,4 MCMA1 37,1 CABB12 38,1 BMS2270 44,8 CSSM31 45,5 ILSTS65 49,0 AGLA269 49,0 DIK4464 57,7 ADCY1AP 59,1 MAF35 61,2 UW69A 65,1 BMS1332 65,1 CSRD2172 65,1 MC2R 66,9 HEL6 67,9 MCM136 69,6 MNS83A 77,0 DIK5068 78,1 CGBP 82,4 DIK2727A 89,8 DIK4984A 100,4 URB031 Für das ovine Chromosom 23 ergab sich in der Multipointanalyse (Option NPL) ein maximaler LOD-Score von 4,21 (p LOD score = 0,00001) für den Marker ADCY1AP (43,1 cM). Der Z-Score an dieser Stelle beträgt 4,82 (p Zmeans < 0,00001). Die detaillierten Ergebnisse sind in Tabelle 4-4 und Abbildung 4-9 dargestellt. Die mit dem zur Verfügung stehenden Familienmaterial vom Programm automatisch berechneten möglichen Maximalwerte betragen 6,47 für Zmeans und 5,3 für den nicht parametrischen LOD-Score. Ergebnisse 71 Tabelle:4-4: Ergebnisse der nicht-parametrischen Kopplungsanalyse (Option NPL) mit dem erweiterten Markerset für OAR23 (Zmeans, nicht-parametrischer LOD-Score sowie Irrtumswahrscheinlichkeiten). Marker cM Zmeans p Zmeans LOD score p LOD-Score OPTION NPL UW72A BL6 MCM172 BM266/BMS2526 CSRD148 MCMA1 CABB12 BMS2270 CSSM31 ILSTS65 DIK4464/AGLA269 ADCY1AP MAF35 UW69A BMS1332/CSRD127 HEL6 MCM136 DIK5068 CGBP DIK2727 URB31 DIK2727 URB31 0,0 0,19 2,4 0,22 2,9 0,26 8,2 1,27 18,7 2,11 21,9 2,47 22,6 2,50 23,5 2,63 30,3 3,37 30,9 3,45 34,5 3,68 43,1 4,82 44,6 4,22 46,7 3,92 50,5 3,67 52,3 3,37 53,3 3,25 62,4 2,17 63,5 2,06 67,9 1,63 85,8 0,78 67,9 1,64 85,8 0,80 0,4 0,4 0,4 0,1 0,02 0,007 0,006 0,004 0,0004 0,0003 0,00012 <0,00001 0,00001 0,00004 0,00012 0,0004 0,0006 0,015 0,02 0,05 0,2 0,05 0,2 0,01 0,01 0,01 0,35 1,13 1,43 1,47 1,76 2,72 2,78 2,96 4,21 3,78 3,49 3,21 3,00 2,88 1,63 1,62 1,06 0,47 1,07 0,48 0,4 0,4 0,4 0,10 0,011 0,005 0,005 0,002 0,0002 0,0002 0,00011 0,00001 0,00002 0,00003 0,00006 0,00010 0,00013 0,003 0,003 0,014 0,07 0,013 0,07 72 Ergebnisse pLOD-Score / pZmeans LOD-Score / Zmeans 5 1,0 LOD-Score pLOD-Score Zmeans 4 0,8 pZmeans 3 0,6 2 0,4 1 0,2 LOD-Score > 3 0 10 20 30 40 50 60 70 80 cM 0 1 0,8 0,6 PIC 0,4 0,2 0 10 20 30 40 50 60 70 80 cM Abbildung 4-9: Darstellung des nicht-parametrischen LOD-Scores und Zmeans sowie den zugehörigen Irrtumswahrscheinlichkeiten über den Verlauf von OAR23 (SheepMap 4.5). Im unteren Abbildungsteil sind die Lage sowie der Informationsgehalt der 24 untersuchten Mikrosatellitenmarker eingezeichnet. 4.3.3. Parametrische Kopplungsanalyse für Chromosom 23 Parallel zur nicht-parametrischen Analyse wurde für OAR23 eine parametrische Kopplungsanalyse vorgenommen. Als Modellparameter wurden eine Defektallelfrequenz von 10 % und ein rezessiver Erbgang mit vollständiger Penetranz vorgegeben. Der höchste HLOD-Score mit einem Wert von 7,908 wurde für den Marker MAF35 (44,6 cM) ermittelt, während der LOD-Score über den gesamten Verlauf von OAR23 als - ∞ errechnet wurde. Der Wert für α an der Stelle des höchsten HLOD-Scores betrug 0,912. Daher wurde für jede Familie die bedingte Wahrscheinlichkeit (a-posteriori-Wahrscheinlichkeit) für das Vorliegen Ergebnisse 73 einer Kopplung am Markergenort MAF35 unter der Bedingung errechnet, dass für diesen Marker tatsächlich eine Kopplung besteht (Tab. 4-5). Tabelle 4-5: Bedingte Wahrscheinlichkeiten für das Vorliegen einer Kopplung am Markergenort MAF35 (α = 0,912). Familie 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27a 27b 1) LOD(i) 1,121 0,426 0,626 0,125 0,524 0,125 0,121 0,043 0,064 0,125 0,299 0,106 0,125 -∞ 0,497 0,288 0 -0,022 0,125 1,026 0,592 0,426 0,125 0,596 0,125 0,289 0,903 0,957 P (Ki│K)1) 0,993 0,965 0,978 0,933 0,972 0,933 0,932 0,920 0,923 0,933 0,954 0,930 0,933 0,000 0,970 0,953 0,912 0,908 0,933 0,991 0,976 0,965 0,933 0,976 0,933 0,953 0,988 0,989 Ki = Vorliegen einer Kopplung für Familie i; K = Annahme, dass tatsächlich eine Kopplung betsteht Die bedingte Wahrscheinlichkeit für eine Kopplung am Markergenort MAF35 liegt für fast alle Familien über 0,9. Lediglich für die Familie 14 errechnet sich eine bedingte Wahrscheinlickeit von Null. Eine zweite parametrische Berechnung wurde unter Ausschluss dieser Familie ausgeführt. Für die Marker ADCY1AP (43,1 cM) und MAF35 (44,6 cM) wurden LOD-Scores von 8,706 bzw. 9,377 bei α = 1 ermittelt. Für die direkt benachbarten Marker ist α < 1 und der LOD-Score liegt bei - ∞ (Abb. 4-10). 74 Ergebnisse LOD-Score 10 LOD-Score 8 6 4 2 0 1,0 -2 0,8 -4 0,6 -6 0,4 -8 0,2 -10 0 0 20 40 60 80 OAR23 (cM) Abbildung 4-10: LOD-Score und Anteil gekoppelter Familien (α) für OAR23 (Berechnung unter Ausschluss der Familie 14; Modellparameter: Defektallelfrequenz = 10 %, einfach rezessiver Erbgang). Die gestrichelten Linien markieren die LOD-Score-Schwellenwerte von 3 bzw. -2 für den Nachweis bzw. den Ausschluss einer Kopplung. 4.3.4. Haplotypenanalyse Für das Chromosom 23 wurden die wahrscheinlichsten Haplotypen ermittelt, analysiert und grafisch dargestellt (Anhang 4). Es konnten insgesamt 45 unabhängige Rekombinationsereignisse beobachtet werden. Das Tier mit der Labornummer 79 sowie dessen Eltern sind sowohl in Familie 27a als auch in Familie 27b enthalten, wurden aber bei der Analyse nur einmal berücksichtigt. Daher wurden lediglich 83 der 84 vorhandenen Nachkommen berücksichtigt, was einer Summe von 166 Meiosen entspricht. Anhand der Lokalisation der Rekombinationsereignisse bei betroffenen Nachkommen konnte die Region, die das Mikrophthalmie-Defektallel beinhalten muss, auf einen 12,3 cM umfassenden Bereich zwischen den Markern DIK4464 bzw. AGLA269 und UW69A eingegrenzt werden. Dazu wurden die beobachteten Rekombinationen der betroffenen Nachkommen aller Familien außer Familie 14 herangezogen (Tab. 4-6). MO 133 190 149 132 150 401 136 230 92 131 115 270 226 103 108 158 140 192 185 140 192 265 184 234 Marker UW72A BL6 MCM172 BM226 BMS2526 CSRD148 MCMA1 CABB12 BMS2270 CSSM31 ILSTS65 AGLA269 DIK4464 ADCY1AP MAF35 UW69A BMS1332 CSRD172 HEL6 MCM136 DIK5068 CGBP DIK2727 URB031 cM 2,4 2,4 2,9 8,2 8,2 18,7 21,9 22,6 23,5 30,3 30,9 34,4 34,4 43,1 44,6 46,7 50,5 50,5 52,3 53,3 62,4 63,5 67,9 85,8 1 42 Familie Individuum 135 180 143 116 154 397 126 240 90 131 115 266 230 103 108 158 142 188 181 142 190 265 206 234 1 45 226 103 108 158 140 192 185 140 192 265 184 234 133 190 149 132 150 401 136 230 92 131 115 1 45 135 180 143 116 150 397 126 240 94 131 117 268 224 103 108 158 142 188 181 142 190 265 206 234 1 48 140 194 265 210 234 164 192 265 212 234 216 105 108 154 140 188 135 180 143 130 154 379 140 226 92 165 115 270 226 103 108 158 142 192 2 88 135 190 135 124 152 393 124 232 92 131 117 2 75 3 50 5 61 135 135 135 180 135 132 152 391 391 381 128 234 100 131 115 115 115 266 226 85 108 108 106 154 154 158 138 136 142 188 188 192 185 181 185 148 148 164 190 190 194 265 265 265 208 208 234 234 234 3 49 8 90 133 135 190 145 143 128 124 150 154 397 150 136 228 230 96 92 131 165 117 115 266 270 226 212 111 111 106 106 154 154 142 142 188 154 185 164 142 190 192 265 265 206 226 234 234 135 190 143 124 154 397 136 230 92 165 115 270 212 111 106 154 142 154 185 142 192 265 226 234 133 180 143 130 150 375 126 230 92 131 115 274 226 111 108 158 142 192 185 164 192 265 208 234 135 190 143 140 158 401 140 230 90 149 115 272 218 85 108 154 142 192 185 138 198 265 206 234 135 180 135 126 150 377 126 22 80 240 92 94 131 131 117 300 268 224 224 113 108 108 154 154 140 140 192 188 185 185 164 142 194 198 265 265 212 184 234 234 135 180 135 140 150 393 12 15 15 16 16 18 20 21 530 140 141 546 547 149 161 103 135 135 135 135 190 180 180 143 135 135 143 126 126 124 156 156 156 150 397 377 377 126 144 144 150 240 226 226 228 94 92 92 96 131 163 163 131 117 115 115 117 268 238 238 266 224 226 226 226 105 85 85 111 108 108 108 106 158 158 158 158 140 140 140 142 192 188 188 192 185 185 140 142 142 144 192 190 190 198 265 265 265 265 212 212 226 234 234 234 234 6 112 190 143 126 150 375 136 234 92 131 115 266 224 85 106 158 142 192 185 138 192 23 500 135 190 135 126 154 375 136 234 92 131 115 24 22 92 167 115 256 224 224 113 112 106 154 156 136 138 188 188 181 164 142 192 190 265 265 208 184 212 234 234 234 135 180 143 124 150 393 136 22 81 142 192 265 194 234 106 156 138 188 224 135 180 135 126 156 397 136 230 92 131 115 24 23 135 190 149 132 150 375 136 240 92 131 117 268 224 103 106 154 136 188 185 140 192 265 184 234 234 103 106 154 140 192 185 164 190 265 389 130 230 92 131 115 135 180 135 126 135 180 135 126 150 401 136 230 92 131 115 270 224 85 106 158 142 192 185 138 192 265 202 234 27 27 27 509 518 523 Tabelle 4-6: Haplotypen rekombinanter betroffener Nachkommen. Die Tabelle zeigt die beobachteten Rekombinationen aller betroffenen Nachkommen exklusive der Familie 14. Der Haplotyp, der mit dem Mikrophthalmie-Allel kosegregiert, ist dunkelgrau hinterlegt; hellgraue Hinterlegung markiert uninformative Marker. Leere Felder indizieren unbekannte Genotypen. Ergebnisse 75 76 Ergebnisse Das nicht betroffene Tier 98 und dessen betroffenes Vollgeschwistertier 97 (Familie 10) sind Nachkommen der phänotypisch gesunden Mutter 99 (s. Anhang 4). Diese Mutter kam auch im Zuchtversuch zum Einsatz (Familie 27a), wo sie einen betroffenen Nachkommen hervorbrachte (Tier 539). Die Mutter den identischen Haplotyp an beide betroffenen Nachkommen (97, 539) weitergegeben. Der maternale Haplotyp des nicht betroffenen Nachkommen 98 zeigt ein Rekombinationsereignis, das darauf schließen lässt, dass der Defektgenoort sich distal des Marker AGLA269 (34,4 cM) befinden muss. Das nicht betroffene Tier 553 (Familie 27a) ist der Nachkomme aus der Anpaarung des betroffenen Bockes 79 mit seiner nicht betroffenen Mutter 84 (Anhang 4). Da der Vater betroffen ist, muss der paternale Haplotyp das Defektallel beinhalten. Außerdem muss der Haplotyp, den die Mutter 84 an ihren Sohn 79 weitergegeben hat, ebenfalls das Defektallel beinhalten. Für den proximalen Abschnitt des Chromosoms bis einschließlich des Markers ADCY1AP hat die Mutter den gleichen Haplotyp an beide Nachkommen (79, 553) weitergegeben. Daraus kann geschlossen werden, dass der Mikrophthalmie-Genort distal davon liegen muss. Zusammengefasst kann damit angenommen werden, dass der Mikrophthalmie-Genort in einer 3,6 cM umfassenden Region zwischen den Markern ADCY1AP und UW69A liegen muss. 4.4. Radiation- Hybrid Mapping 4.4.1. Markerentwicklung Auf der Grundlage der bekannten Homologie zwischen OAR23 und HSA18 wurde mit Hilfe der Software BLAST nach Sequenzübereinstimmungen zwischen 376.602 in den öffentlichen Datenbanken verfügbaren ovinen BAC-Endsequenzen (http://www.ncbi. nlm.nih.gov/) und der humanen Genomsequenz gesucht. Anschließend wurden unter den Treffern 44 ovine BAC-Endsequenzen mit einem signifikanten (E < 10-5) und einzigartigen BLAST-Hit zur Entwicklung von STS-Markern für die RH-Kartierung ausgewählt. Aus den insgesamt 3676 für HSA18 erzielten BLAST-Hits wurden 38 Sequenzen mit möglichst gleichmäßig über das Chromosom verteilten Treffern ausgewählt. Sofern für eine Lokalisation auf HSA18 mehrere mögliche Sequenzen zur Verfügung standen, wurden wenn möglich Sequenzen mit BLAST-Hits innerhalb humaner Gene ausgesucht (Tab. 4-7). Bei einer Gesamtlänge des humanen Chromosoms 18 von 76,12 Mb (NCBI Build 35.1) sind die am weitesten proximal bzw. distal gelegenen BLAST-Hits bei 0,45 respektive bei 74,96 Mb lokalisiert. Der durchschnittliche Abstand der Treffer beträgt 1,94 Mb (0,63 bis 4,35). Zur möglichst genauen Lokalisierung des Kandidatengens auf OAR23 (Tab. 3-4) wurde Ergebnisse 77 zusätzlich die genomische Sequenz des bovinen RAX-Gens zur Entwicklung eines Markers herangezogen. Durch Sequenzvergleich der bovinen cDNA Sequenz des RAX Gens (GenBank Accession XM_867119) mit den im Trace-Archiv hinterlegten Sequenzen des Rindergenomprojektes wurde eine Whole Genome Shotgun Sequenz (gnl|ti|454297921) ermittelt, die das Exon 2 des bovinen RAX Gens enthält. Außerdem wurden je drei Sequenzen mit BLAST-Hits in interessierenden Regionen auf den humanen Chromosomen 1 und 16 sowie die genomische Sequenz des ovinen MC1R Gens (GenBank-Accession Z31369) zur Entwicklung von Markern herangezogen. Das humane Chromosom 1 wurde auf Grund der Lage des Mikrosatelliten BM723 bei 0,0 cM auf OAR23 in der zu dieser Zeit aktuellen genetischen Karte des Schafe (SheepMap 4.4) ausgewählt. Dieser auch beim Rind kartierte Mikrosatellit ließ eine syntänische Beziehung zu einer Region des bovinen Chromosoms 3 vermuten, die wiederum syntän zur untersuchten Region von HSA1 ist. Die übrigen vier Marker dienten der Überprüfung der Lage des MC1R Gens. Dieses liegt beim Menschen auf Chromosom 16 bei 88,5 Mb und wurde beim Schaf auf den beiden verschiedenen ovinen Chromosomen 23 und 14 lokalisiert (MADDOX et al. 2003, VAGE et al. 2003). Für alle ausgewählten Sequenzen wurden Primerpaare zur Typisierung (Abb. 4-11) an den Zelllinien des ovinen RH-Panels ermittelt (Anhang 5). Zusätzlich wurden 14 über das Chromosom verteilte ovine Mikrosatelliten aus dem Markerset der Kopplungsanalyse als Marker für die RH-Kartierung verwendet, um eine Beziehung zur genetischen Karte des Schafes herstellen zu können (Tab. 4-8). Drei dieser Mikrosatelliten sind laut Literaturangaben mit Genen assoziiert (WOOD und PHUA 1994; LARSEN et al. 1998; Tab. 4-8). Zusätzlich konnte eine Sequenzhomologie zwischen der ovinen Sequenz, die den Mikrosatelliten ADCY1AP beinhaltet (GenBank Accession S83511) und der humanen Genomsequenz innerhalb des betreffenden Gens nachgewiesen werden (BLAST-Hit bei 0,89 Mb auf HSA18, Bit-Score: 979, E-Wert: 0,00E+0). 78 Ergebnisse Tabelle 4-7: Signifikante (E < 10-5) und einzigartige BLAST-Hits in der humanen Genomsequenz für 44 ausgewählte ovine CHORI-243 BAC-Endsequenzen. BES-Accession DU337824 CL636757 CZ925601 CL637610 CL636288 DU271600 DU299080 DU526192 DU307072 CL638819 CZ926828 DU511641 CZ924357 CL632741 CL632826 DU313347 DU526001 CL633178 CZ920175 DU441168 DU485705 CL634992 CL637494 CL634369 CL634915 CL633165 CL633475 CZ924269 CZ925126 CZ924240 CZ922934 CL636996 DU318022 CL637552 CZ921099 CL632399 CL637363 CL638170 DU460539 DU462610 DU482950 CZ922047 DU450798 DU211659 Bit-Score E-Wert Orientierung HSA Mb 153 69,9 113 109 192 178 111 60 198 91,7 143 170 119 60 75,8 190 617 400 129 105 172 167 208 168 133 133 103 161 56 218 61,9 79,8 410 139 278 238 63,9 58 404 151 174 69,9 105 79,8 3,00E-34 4,00E-09 4,00E-22 5,00E-21 4,00E-46 4,00E-42 1,00E-21 3,00E-06 7,00E-48 1,00E-15 5,00E-31 1,00E-39 6,00E-24 2,00E-06 5,00E-11 1,00E-45 9,00E-174 9,00E-109 6,00E-27 8,00E-20 3,00E-40 2,00E-38 4,00E-51 5,00E-39 3,00E-28 4,00E-28 2,00E-19 2,00E-36 8,00E-05 9,00E-54 1,00E-06 4,00E-12 1,00E-111 4,00E-30 1,00E-71 9,00E-60 1,00E-07 1,00E-05 7,00E-110 1,00E-33 1,00E-40 5,00E-09 9,00E-20 4,00E-12 minus minus minus minus plus minus plus plus minus plus plus minus plus plus minus plus plus minus minus minus minus plus plus minus minus plus minus plus minus plus minus plus plus plus minus plus plus plus minus minus plus plus plus minus 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 18 1 1 1 16 16 16 0,45 0,78 2,23 5,35 8,03 10,10 12,58 16,94 17,79 18,62 23,46 24,09 26,34 27,22 29,52 31,18 32,53 34,44 37,31 37,89 39,10 40,57 43,39 44,72 47,11 50,00 52,50 55,21 55,94 58,76 60,06 61,78 63,54 65,82 67,27 68,68 72,20 74,96 109,80 116,65 120,01 77,83 84,45 88,09 Gensymbol COLEC12 PTPRM ROCK1 LOC441815 DSG4 KIAA1713 FHOD3 PIK3C3 SYT4 SETBP1 SMAD7 MBD2 WDR7 LOC284289 PLEKHE1 LOC400654 RTTN NETO1 ZNF516 ATP9B GPR61 ATP1A1 HMGCS2 Ergebnisse 79 Tabelle 4-8: In der RH-Kartierung eingesetzt Mikrosatelliten von OAR23. Mikrosatellit OAR23 cM (SheepMap 4.5) 0,0 8,2 18,7 30,3 30,9 34,4 43,1 44,6 46,7 50,5 50,5 53,3 62,4 67,9 UW72A BMS2526 CSRD148 CSSM31 ILSTS65 DIK4464 ADCY1AP MAF35 UW69A BMS1332 CSRD2172 MCM136 DIK5068 DIK2727 1) Gensymbol MBP HSA18 Mb (NCBI Build 35.1) 1) ADCYAP1 LAMA1 72,8 2) 0,9 1) 6,9 LARSEN et al. 1998; 2) WOOD und PHUA 1994 Fragmentlängenstandard 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 S 24 25 26 27 28 29 30 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 41 42 43 44 45 46 S 47 48 49 50 51 52 53 54 55 56 57 58 59 60 61 62 63 64 65 66 67 68 69 S 70 71 72 73 74 75 76 77 78 79 80 81 82 83 84 85 86 87 88 H SS N Abbildung 4-11: Typisierung an den Zelllinien des ovinen RH-Panels am Beispiel des Markers CL638170 (2 %iges Agarosegel, 5 V/cm für ca. 30 min). Zahlen von 1 bis 88 = Zelllinien des ovinen RH-Panels, S = Kontrollansatz mit originärer genomischer Schaf-DNA, H = Kontrollansatz mit originärer genomischer Hamster-DNA, N = Negativkontrolle (PCRAnsatz ohne Zugabe von Matritzen DNA). 80 Ergebnisse 4.4.2. Zweipunktanalyse Mit den Ergebnissen der Typisierung an den Zelllinien des ovinen RH-Panels wurde eine Zweipunktanalyse mit der Software RH2PT durchgeführt. Bei der Bestimmung von Kopplungsgruppen zeigte sich, dass alle 39 STS-Marker mit einem BLAST-Hit auf HSA18 sowie alle ovinen Mikrosatellitenmarker von OAR23, also insgesamt 53 Marker, bei einem LOD-Score-Schwellenwert von 8 eine Kopplungsgruppe bilden. Eine zweite Kopplungsgruppe wird von den beiden STS-Markern DU462610 und DU482950 (BLAST-Hit auf HSA1) gebildet. Die übrigen 7 Marker ließen sich keiner Kopplungsgruppe zuordnen. Mit einem LOD-Score-Schwellenwert von 6 wurde das gleiche Ergebnis erzielt, während bei einem LOD-Score-Schwellenwert von 4 alle drei Marker mit einem BLAST-Hit auf HSA1 eine Kopplungsgruppe bilden und der Marker CZ922047 (BLAST-Hit auf HSA16) in die Kopplungsgruppe der auf OAR23 lokalisierten Marker fällt. Daraus kann geschlossen werden, dass Homologie zwischen dem ovinen Chromosom 23 und dem humanen Chromosom 18 besteht. Die syntänischen Beziehungen zwischen OAR23 und HSA1 sowie HSA16 können dadurch nicht bestätigt werden. Es wurden drei Paare von Markern mit identischen Retentionsmustern beobachtet. Bei diesen vollständig gekoppelten Markerpaaren handelt es sich um CSSM31 und ILSTS65, DU511641 und CZ26828 sowie um ADCY1AP und CL636757 (Tab. 4-9, 4-12). Die durchschnittliche Retentionsfrequenz für alle 60 Marker beträgt 0,276 (0,091 - 0,412), während sie für die Kopplungsgruppe der 53 auf OAR23 lokalisierten Marker bei 0,286 (0,172 - 0,412) liegt. 4.4.3. Erstellung der RH-Karte Auf der Grundlage der Ergebnisse der Zweipunktanalyse wurde aus den 53 gekoppelten Markern eine RH-Karte für das ovine Chromosom 23 erstellt. Dazu wurde zunächst eine so genannte Rahmen- oder Gerüstkarte (framework-map) erzeugt. Insgesamt 25 der 53 Marker ließen sich darin mit einer relativen Wahrscheinlichkeit von mindestens 1:1000 anordnen (Tab. 4-9). Der Durchschnitt der in der Zweipunktanalyse ermittelten paarweisen LOD-Scores zwischen den einzelnen Markern liegt für aufeinander folgenden Gerüstmarker bei 13,1. Die verbliebenen 28 Marker wurden anschließend innerhalb dieser Gerüstkarte zu einer umfassenden RH-Karte (comprehensive map) angeordnet. Die resultierende umfassende RH-Karte hat eine Länge von 819,5 cR5000 (Tab. 4-9). Die Reihenfolge der Mikrosatelliten innerhalb der Karte stimmt mit der genetischen Karte des Schafes überein (Abb. 4-12). Die beiden Mikrosatelliten BMS1332 und CSRD172 zeigen in Ergebnisse 81 der genetischen Karte einen Abstand von 0,0 cM zueinander, während sie in der RH-Karte einen Abstand von 11,6 cR5000 zueinander haben. Die beiden Mikrosatelliten CSSM31 und ILSTS65 sind in der genetischen Karte des Schafes mit einem Abstand von 0,6 cM eng benachbart. Sie zeigten in der RH-Kartierung jedoch identische Retentionsmuster. Insgesamt entspricht ein Centimorgan auf der genetischen Karte durchschnittlich 10,9 cR5000 auf der errechneten RH-Karte. Der Vergleich zum Menschen zeigt das Vorhandensein von vier konservierten Blöcken mit einer Länge von ca. 12,13 bis 22,17 Mb (Abb. 4-12). Die Reihenfolge der Gene innerhalb der Blöcke ist für drei Blöcke vollständig konserviert. Einer der Blöcke enthält eine Inversion von 0,86 Mb Länge (Tab. 4-9; Abb. 4-12). Eine Megabase auf dem humanen Chromosom entspricht durchschnittlich 11,19 cR5000 auf der berechneten RH-Karte. Zusätzlich zu den kartierten Markern wurde die Lage des Mikrosatelliten URB031 auf der RH-Karte in silico bestimmt. Dieser Mikrosatellit liegt laut Literaturangaben innerhalb des ONECUT2-Gens auf dem humanen Chromosom 18 (MA et al. 1996). Es konnte eine Sequenzhomologie zwischen der bovinen Sequenz, die den Mikrosatelliten beinhaltet (GenBank Accession U21767) und der humanen Genomsequenz innerhalb des betreffenden Gens nachgewiesen werden (BLAST-Hit bei 53,29 Mb auf HSA18, Bit-Score: 142, E-Wert: 3,00E-31). Daraus kann eine Lage distal von WDR7 auf der RH-Karte abgeleitet werden. Aufgrund der direkten Nachbarschaft zu der oben genannten Inversion innerhalb des betreffenden konservierten Blockes gibt es allerdings zwei mögliche Positionen auf der RHKarte. Diese liegen zwischen WDR7 und LOC284289 oder zwischen RAX und PHLPP (Tab. 4-9; Abb. 4-12). 82 Ergebnisse Tabelle 4-9: Anordnung der 53 Marker auf dem ovinen Chromosom 23. Mikrosatellitenmarker sind durch Fettdruck hervorgehoben. Marker Markertyp CL638170 UW72A CL637363* CL632399 CZ921099 CL637552 BMS2526* DU318022* CL636996 CZ922934* DU485705 DU441168* CSRD148 CZ920175 CL633178 DU526001 DU313347 CSSM31* ILSTS65 CL632826 DIK4464* CL632741 CZ924357 DU511641 CZ926828* CL638819 DU307072* DU526192* DU337824* CL636757 ADCY1AP CZ925601 MAF35* CL637610* UW69A CL636288* DU271600* CSRD172* BMS1332* DU299080 MCM136* CL634992 CL637494* CL634369* DIK5068* CL634915 CL633165 DIK2727* CL633475 CZ925126* CZ924269* RAX_Ex2 CZ924240* STS MS STS STS STS STS MS STS STS STS STS STS MS STS STS STS STS MS MS STS MS STS STS STS STS STS STS STS STS STS MS STS MS STS MS STS STS MS MS STS MS STS STS STS MS STS STS MS STS STS STS STS STS * Framework Marker OAR23 cR5000 0,0 19,7 34,7 59,7 79,2 110,7 127,4 142,0 164,9 183,8 196,6 216,7 222,3 261,0 296,4 325,7 351,3 376,9 376,9 386,0 408,1 410,9 423,9 447,8 447,8 479,3 487,6 498,8 507,1 515,6 515,6 518,4 530,3 543,6 556,5 568,1 583,3 601,5 613,1 628,3 653,0 659,3 665,0 683,5 709,0 717,4 738,2 759,6 781,3 790,3 793,3 802,8 819,5 OAR23 cM (SheepMap 4.5) HSA18 Mb (NCBI Build 35.1) 74,97 0,0 72,20 68,68 67,27 65,83 Gensymbol ATB9B MBP ZNF516 NETO1 RTTN 8,2 63,54 61,78 60,06 39,11 37,89 LOC400654 SYT4 PIK3C3 18,7 37,32 34,44 32,53 31,18 FHOD3 30,3 30,9 29,52 KIAA1713 27,22 26,34 24,09 23,46 18,62 17,19 16,94 0,45 0,78 DSG4 34,5 43,1 LOC441815 COLEC12 ADCYAP1 2,23 44,6 5,35 46,7 8,03 10,10 LAMA1 PTPRM 50,5 50,5 12,58 53,3 40,57 43,39 44,72 SETBP1 SMAD7 62,4 47,11 50,00 MBD2 67,9 52,50 55,95 55,21 55,09 58,76 WDR7 LOC284289 RAX PHLPP Ergebnisse 83 OAR23 genetische Karte SheepMap 4.5 85,8 cM OAR23 RH-Karte 819,5 cR5000 0,0 0,0 UW72A CSRD148 34,5 55 20 300 CSSM31 ILSTS065 350 376,9 43,1 44,6 46,7 DIK4464 50,5 ADCYAP1 MAF35 UW69A 53,3 60 62,4 MCM136 65 408,1 67,9 515,6 530,3 556,5 DIK5068 500 498,8 507,1 550 601,5 613,1 600 653,0 650 DIK2727 80 URB031 85,8 709,0 30 PIK3C3 SYT4 35 SETBP1 628,3 659,3 70 75 ROCK1 LOC441815 DSG4 KIAA1713 FHOD3 25 400 450 CSRD2172 BMS1332 16,94 222,3 30,3 30,9 40 50 200 15 183,8 196,6 250 35 45 12,58 150 25 30 10 127,4 18,7 5 PTPRM 100 BMS2526 0,45 LAMA1 50 8,2 15 20 COLEC12 ADCYAP1 19,7 5 10 HSA18 Physikalische Karte NCBI Build 35.1 76,12 Mb 39,10 40,57 SMAD7 MBD2 WDR7 40 45 ONECUT2 RAX 50 LOC284289 PHLPP 55 LOC400654 58,76 60,06 700 60 65 RTTN 759,6 ? 750 800 NETO1 ZNF516 819,5 MBP ATB9B 70 74,96 75 Abbildung 4-12: Vergleich zwischen der RH-Karte und der genetischen Karte des ovinen Chromosoms 23 sowie der physikalischen Karte des humanen Chromosoms 18. Im Vergleich zwischen der RH-Karte des Schafes und der humanen Karte sind nur die auf OAR23 angeordneten Gene sowie die Endpunkte der konservierten Blöcke eingezeichnet. Die Lage von URB031 wurde in silico ermittelt. Aufgrund seiner direkten Nachbarschaft zu einer Inversion innerhalb eines konservierten Blockes kann die Lage auf der RH-Karte jedoch nicht genau determiniert werden, was durch die gestrichelte Linie angedeutet ist. 84 Diskussion 5. Diskussion 5.1. Zuchtversuch Es erschien sinnvoll, eine große Halbgeschwisterfamilie für die Kopplungsanalyse experimentell zu erzeugen, da die Sammlung von Proben im Feld oft nur sehr kleine Familien ergab. Im Regelfall sind nur die Mutter des betroffenen Tieres sowie eventuelle Wurfgeschwister verfügbar. Vornehmlich in großen Gebrauchsschafherden ist es meist nicht möglich, den Vater auszumachen. Ferner diente die gewonnene Ressourcenfamilie dazu, Material für pathologisch-histologische sowie klinische Untersuchungen zu erhalten. Diese beiden Ziele stellen allerdings unterschiedliche Anforderungen an das Design des Zuchtversuchs. Im Hinblick auf eine Kopplungsstudie wäre es ratsam gewesen, Anlageträger zu verpaaren. Dadurch wäre die Zahl informativer Meiosen für den Defektgenort deutlich gesteigert worden. Diese Vorgehensweise birgt allerdings zum einen das Problem, dass der Zuchtversuch nur dann erfolgreich verläuft, wenn der Bock auch tatsächlich Anlageträger ist. Dabei muss man sich auf die Angaben des Tierbesitzers verlassen. Das gleiche gilt zwar auch für die Mütter, aber das Ausmaß eines solchen Irrtums wäre bei einem einzelnen Vatertier ungleich größer. Wäre dieser kein Anlageträger, würde man gar keine betroffenen Nachkommen erzielen. Zum Beispiel erbrachten von den zehn Mutterschafen des Zuchtversuchs zwei Tiere (Abb. 3-1: Tier 83 und Tier 232/04) keine betroffenen Nachkommen. Die Annahme, dass diese Tiere Anlageträgerinnen sind, war auf die Aussagen des Besitzers gestützt. Eine reine Anlageträgerverpaarung würde zudem eine viel geringere Anzahl betroffener Nachkommen (ca. 25%) erwarten lassen. Aufgrund des betroffenen Vatertieres konnte für die klinischen Untersuchungen außerdem angenommen werden, dass die phänotypisch gesunden Nachkommen Anlageträger sind. Im Hinblick auf die beabsichtigten pathologischen Untersuchungen war die Auswahl eines betroffenen Vaters ebenfalls sinnvoll. Unter der Annahme eines monogen rezessiven Erbganges war zu erwarten, dass 50% der Nachkommen betroffen sein würden. Neun der 17 geborenen Lämmer sind betroffen. Das entspricht etwa dem erwarteten Anteil und bestätigt den rezessiven Erbgang. Außerdem konnte gezeigt werden, dass die Fruchtbarkeitt des betroffenen Bockes durch die Mikrophthalmie nicht beeinflusst wird. Eine erfolgreiche Anpaarung von Merkmalsträgern wurde zuvor bereits in der Literatur beschrieben (HARING und GRUHN 1970; VAN DER LINDE-SIPMAN et al. 2003) und konnte somit in dieser Untersuchung bestätigt werden. Die mutterlose Aufzucht der Lämmer bereitete einige Probleme. Auf Grund des Maedi-Status der Mütter wurde es den Lämmern verwehrt, Kolostrum aufzunehmen. Stattdessen wurden sie mit einem Kolostrumersatzpräparat versorgt. Solche Präparate können nicht den gleichen Diskussion 85 Schutz bieten wie das Kolostrum einer an die lokale Mikroflora angepassten Mutter. Der hohe Anteil an Lämmern, die verendeten oder euthanasiert werden mussten, lässt sich daher in erster Linie auf hochgradige neonatale Diarrhoe in Folge einer geschwächten Abwehrsituation zurückführen. 5.2. Klinische und pathologische Untersuchungen Ziele der klinischen und pathologischen Untersuchungen waren die Charakterisierung des Phänotyps und der Vergleich mit bisher veröffentlichten Untersuchungen. Außerdem sollte überprüft werden, inwieweit bei Anlageträgern Veränderungen vorliegen, die klinisch nicht prominent sind. Eine eingehende opthalmologische Untersuchung betroffener Tiere erwies sich als nur bedingt möglich. Auf Grund der variierenden Größe der mikrophthalmischen Bulbi waren nur bei drei der sechs untersuchten Tiere beide Augen einsehbar. Fünf der 12 untersuchten Augen waren so stark verkleinert, dass sie nicht eingesehen werden konnten. Die einsehbaren Augen wiesen eine granulierte Korneaoberfläche auf. Ob dieser Befund primär mit der Mikrophthalmie in Verbindung steht oder auf einer Irritation durch die regelgerecht entwickelten Augenlider beruht, ist unklar. Die bei der Ultraschalluntersuchung in drei Augen darstellbare konische Struktur mit Kontakt zur Retina korreliert gut mit früheren morphologischen Beschreibungen der kongenitalen Mikrophthalmie des Texelschafes (LABS 1977; ROE et al. 2003; VAN DER LINDE-SIPMAN et al. 2003). Anhand der pathologisch-anatomischen und pathologisch-histologischen Untersuchung von zehn betroffenen Schafen wurde die Pathomorphologie der kongenitalen Mikrophthalmie des Texelschafes beschrieben. Die dabei erhobenen Befunde stimmen mit den Ergebnissen früherer Untersuchungen überein (LABS 1977; ROE et al. 2003; VAN DER LINDESIPMAN 2003). Hereditäre Mikrophthalmie kann mit anderen Missbildungen assoziiert sein (Kap. 2.1.2. und 2.2.). Daher wurde über die Untersuchung der Augen hinaus nach etwaigen weiteren Missbildungen gesucht. Bei keinem der untersuchten Tiere wurden dabei Hinweise auf das Vorliegen weiterer Defekte gefunden, so dass hier von einer nicht syndromischen isolierten Mikrophthalmie ausgegangen werden kann. Sowohl die ophthalmologische als auch die pathologische Untersuchung phänotypisch gesunder Schafe erfolgte unter der Fragestellung, ob es Unterschiede zwischen Anlageträgern und Tieren gibt, die homozygot frei vom Defektallel sind. Da für das Schaf kaum Referenzwerte vorliegen, wurden zur Durchführung der ophthalmologischen Untersuchungen 86 Diskussion gesunde Vergleichstiere herangezogen. Um physiologische Variationen und Rassenunterschiede festzustellen, wurden dazu insgesamt zehn Tiere aus vier verschiedenen Rassen verwendet. Um die Wahrscheinlichkeit zu minimieren, dass sich unter den Referenztieren ein unerkannter Anlageträger befindet, wurden keine Texelschafe sowie Tiere aus Texelkreuzungen verwendet. Als sichere Anlageträger wurden nur Nachkommen aus dem Zuchtversuch untersucht. Die Untersuchungen erbrachten keine von der physiologischen Variation abweichenden Unterschiede zwischen Anlageträgern und Referenztieren. Es ist daher insgesamt davon auszugehen, dass ein rezessiver Erbgang mit vollständiger Penetranz und variabler Expressivität vorliegt. 5.3. Kopplungs- und Haplotypenanalyse Das für die Kopplungsanalyse ausgewählte Familienmaterial wurde durch die Typisierung mit Mikrosatellitenmarkern zunächst auf korrekte Abstammungsdaten überprüft. Der Abstammungskontrolle kam hier eine besondere Bedeutung zu, denn die Aussagen der Tierbesitzer hinsichtlich der Abstammung konnten aufgrund der betrieblichen Struktur innerhalb der Gebrauchsschafherden oft nur unter Vorbehalt gemacht werden. Für eine nicht-parametrische Kopplungsanalyse werden insbesondere Familien benötigt, in denen phänotypische betroffene relative Paare auftreten. Dabei handelt es sich in der Regel um betroffene Geschwister- oder Halbgeschwisterpaare. Bei der Auswahl von Familien für die Kopplungsanalyse wurden aber auch zehn Vollgeschwisterfamilien ausgewählt, in denen nur einer der beiden Nachkommen betroffen ist (Tab. 3-2; Anhang 3). Diese Familien sind zwar in der Kopplungsanalyse zunächst uninformativ, aber der Vergleich zwischen dem betroffenen und dem nicht betroffenen Nachkommen kann bei der späteren Analyse der Rekombinationsereignisse Rückschlüsse auf die Lokalisation des Defektgenorts zulassen. Die in der nicht parametrischen Kopplungsanalyse mit dem erweiterten Markerset von 80 Markern erzielten Ergebnisse weisen eine Kopplung des Mikrophthalmie-Genorts zum ovinen Chromosom 23 nach. Der maximale LOD-Score wird für den Marker ADCY1AP bei 43,1 cM erzielt und beträgt 4,21. Damit liegt er deutlich über dem Schwellenwert von 3 für den Nachweis einer Kopplung (OTT 1991). Der LOD-Score steigt zwischen 0,0 und 43,1 cM gleichmäßig von 0,01 auf den Maximalwert an und fällt bis zum Ende des Chromosoms fast genauso gleichmäßig auf einen Wert 0,47 ab (Tab. 4-4; Abb. 4-9). Der Bereich, in dem der LOD-Score einen Wert > 3 hat, ist annähernd 20 cM groß. Die mögliche Lage des Defektgenortes lässt sich durch dieses Ergebnis somit nur auf einen verhältnismäßig großen Bereich festlegen. Einen Grund dafür stellt wahrscheinlich die ungleichmäßige Verteilung der Diskussion 87 verwendeten Mikrosatellitenmarker dar. So befindet sich zum Beispiel direkt proximal des Markers ADCY1AP ein 8,6 cM umfassender Bereich, für den kein weiterer Mikrosatellitenmarker in der genetischen Karte des Schafes angeordnet ist. In der parallel durchgeführten parametrischen Kopplungsanalyse für OAR23 wurde zunächst für die gesamte Länge des Chromosoms ein LOD-Score von − ∞ bestimmt, während der maximale HLOD-Score 7,908 am Marker MAF35 betrug. An dieser Stelle lag der Wert für α bei 0,912. Als Parameter wurden ein rezessiver Erbgang mit vollständiger Penetramz vorgegeben. Daher war zu vermuten, dass eine einzelne Familie keine Kopplung für die betreffende Region zeigt, weil ansonsten ein α-Wert von 1 zu erwarten ist. Die Berechnung der bedingten Wahrscheinlichkeit für ein Vorliegen von Kopplung für die einzelnen Familien erbrachte für nahezu alle Familien einen Wert > 0,9. Lediglich für die Familie 14 war die bedingte Wahrscheinlichkeit, dass Kopplung vorliegt 0. Bei der anschließenden Betrachtung der wahrscheinlichsten Haplotypen innerhalb dieser Familie (Anhang 4) war zu sehen, dass die beiden betroffenen Nachkommen von der Mutter den gleichen Haplotyp für die Marker BM226 bis DIK2727 erhalten hatten. Vom phänotypisch gesunden Vater hatten sie jedoch unterschiedliche Haplotypen erhalten. Für diese Familie kann daher das Vorliegen einer Kopplung für den Bereich zwischen den Markern MCMA1 und DIK2727 ausgeschlossen werden. Für den Rest des Chromosoms sind die Haplotypen nicht informativ. Da nur die Mutter der beiden Lämmer bekannt ist, kann vermutet werden, dass die Tiere eigentlich gar keine Geschwister sind. Das so genannte Umsetzen von Lämmern ist ein übliches Vorgehen in großen Schäfereibetrieben. Dabei werden nicht betroffene gegen betroffene Lämmer ausgetauscht, so dass nur ein oder wenige Mutterschafe ausschließlich blinde Lämmer führen, während alle übrigen Mutterschfe nur gesunde Nachkommen haben. Dadurch lässt sich der Arbeitsaufwand zur Aufzucht betroffener Lämmer minimieren. Da jedoch die Typisierung von insgesamt 80 Mikrosatellitenmarker am Familienmaterial keinerlei Hinweise auf Abstammungsfehler ergab, ist es höchst unwahrscheinlich, dass hier ein solcher Fall vorliegt. Eine andere Möglichkeit ist das Vorliegen einer Phänokopie. Vor der Probenentnahme wurden die Tiere klinisch untersucht und der Phänotyp der kongenitalen Mikrophthalmie ist äußerlich einfach und sicher zu diagnostizieren. Es ist jedoch nicht mit letzter Sicherheit auszuschließen, dass dabei in Einzelfällen eine abweichende Ätiopathogenese zu Grunde liegt. Als nicht genetische Ursachen für angeborene Augendefekte kommen zum Beispiel Infektionskrankheiten oder teratogene Substanzen in Betracht. Beim Menschen etwa ist kongenitale Mikrophthalmie eine häufige okuläre Manifestationen einer Rubella-Virus Infektion der Mutter während der Schwangerschaft (O´NEILL 1998). Bei der Katze und beim 88 Diskussion Pferd sind Fälle von kongenitaler Mikrophthalmie in Folge einer Verabreichnung von Griseofulvin an trächtige Tiere beschrieben worden (RÜSSE und SINOWATZ 1991; SCHUTTE und VAN DEN INGH 1997). Im hier vorliegenden Fall lässt sich nicht klären, wie es zu der Mikrophthalmie kam. Es bleibt jedoch festzuhalten, dass der Defekt im Gegensatz zum gehäuften Auftreten beim Texelschaf bei anderen Schafrassen nur sehr selten sowie vereinzelt auftritt, obwohl anzunehmen ist, dass sie exogenen Mikrophthalmie auslösenden Faktoren in gleichem Maße ausgesetzt sind. Daher ist insgesamt eher davon auszugehen, dass es sich bei solchen Phänokopien um seltene Einzelfälle handelt. Die unter Ausschluss der Familie 14 erneut durchgeführte parametrische Kopplungsanalyse bestätigte die Annahme, dass das zunächst erzielte Ergebnis ausschließlich auf einer einzelnen Familie beruhte. Das Ergebnis der zweiten Analyse zeigte das Vorliegen einer Kopplung für alle Familien (α = 1) an den Markergenorten ADCY1AP und MAF35. Da der LOD-Score für die direkt benachbarten Marker als − ∞ (α < 1) berechnet wurde, kann auf eine Lage des Defektgenorts in der Region zwischen 34,5 und 46,7 cM geschlossen werden. In der Abbildung 4-10 scheint dieser Bereich zunächst kleiner. Das lässt sich damit erklären, dass die Skala des LOD-Scores auf der Ordinate im negativen Bereich bei – 10 endet, während die tatsächlichen Werte für die proximal und distal gelegenen Marker bei − ∞ liegen. Tatsächlich kann für einen Bereich von 8,6 cM proximal von ADCY1AP und 2,1 cM distal von MAF35 keine Aussage getroffen werden, da hier keine weiteren Marker verfügbar waren. In der Abbildung fällt zusätzlich auf, dass der LOD-Score am Ende des Chromosoms noch einmal auf einen Wert von 1,54 ansteigt. Dabei dürfte es ich um ein zufälliges Ergebnis handeln, das auf den niedrigen Informationsgehalt (PIC = 0,18) des am telomeren Chromosomenende gelegenen Markers URB031 zurückzuführen ist. In der nicht parametrischen Kopplungsanalyse war dieses Phänomen, wenn auch in weniger deutlicher Ausprägung, ebenfalls zu beobachten (Abb. 4-9). Der in der parametrischen Kopplungsanalyse ermittelte LOD-Score für den Marker MAF35 lag mit einem Wert von 9,38 oberhalb des Wertes für den Marker ADCY1AP, für den in der nicht parametrischen Kopplungsanalyse der maximale LOD-Score erzielt worden war. Da MAF35 für das typisierte Familienmaterial insgesamt nur fünf Allele aufweist, von denen eines mit einer Allelfrequenz von 55,4 % auftritt, ist sein Informationsgehalt geringer als der von ADCY1AP (Anhang 2). Daher kann angenommen werden, dass der LOD-Score für MAF35 im Verhältnis zu ADCY1AP in der parametrischen Analyse überschätzt wurde. Die Analyse der Rekombinationsereignisse bei allen betroffenen Nachkommen exklusive der Familie 14 lässt darauf schließen, dass der Defektgenort in einer 12,3 cM großen Region Diskussion 89 distal der Marker AGLA269 und DIK4464 liegen muss (Tab. 4-6). Unter den nicht betroffenen Nachkommen konnten nur zwei Rekombinationsereignisse beobachtet werden, die hinsichtlich der Lokalisation des Defektgenorts aussagekräftig sind. Die beiden in Kapitel 4.3.4. dargestellten Tiere (98, 553) bestätigen damit die oben genannte eingegrenzte Region. Die Festlegung der proximalen Grenze der 12,3 cM umfassenden Region beruht auf drei unabhängigen Rekombinationsereignissen. Ein bei Tier 141 beobachtetes Rekombinationsereignis schließt die Lage des Defektgenortes distal des Markers UW69A aus. Das in Kapitel 4.3.4. beschriebene Rekombinationsereignis bei Tier 553 lässt darauf schließen, dass der Defektgenort distal des Markers ADCY1AP lieg. Nimmt man die Lage des MikrophthalmieGens innerhalb dieser Region an, so beruht diese Annahme lediglich auf zwei beobachteten Rekombinationsereignissen (Tiere 553 und 141). Das entspricht den Erwartungen, denn je geringer der Abstand zwischen den betreffenden Markern und dem Defektgenort, desto geringer ist die Wahrscheinlichkeit, dass sie durch ein Rekombinationsereignis voneinander getrennt werden. In den Familien mit nicht betroffenen Nachkommen ist es in vielen Fällen möglich, anhand der Haplotypenanalyse indirekte Aussagen über den Genotyp am Mikrophthalmie-Genort der phänotypisch gesunden Nachkommen zu machen. Vergleicht man beispielsweise die beiden Nachkommen der Familie 19 (Anhang 4), so erkennt man, dass der nicht betroffene (153) und der betroffene (152) Nachkomme sich sowohl im paternalen als auch im maternalen Haplotyp unterscheiden. Daraus kann man schließen, dass das Tier 153 wahrscheinlich homozygot frei vom Defektallel ist. Betrachtet man hingegen die beiden Nachkommen 81 (betroffen) und 82 (nicht betroffen) der Familie 22, so sieht man, dass die beiden Vollgeschwister für die Mikrophthalmieregion von der Mutter den gleichen Haplotyp erhalten haben, während sie sich im paternalen Haplotyp unterscheiden. Daraus kann geschlossen werden, dass das Tier 82 wahrscheinlich ein heterozygoter Anlageträger für die Mikrophthalmie-Mutation ist. Wenn außer einem betroffenen Tier weitere Familienmitglieder für eine Genotypisierung zur Vefügung stehen, ist es also möglich, indirekte Aussagen über den Mikrophthalmie-Genotyp phänotypsich gesunder Nachkommen zu machen, wenn anhand eines betroffenen Nachkommen die elterlichen Kopplungsphasen des Mikrophthalmie-Allels bestimmt werden können. Die indirekte Gendiagnose durch flankierende Markergenorte unter Einbeziehung der Genotypen weiterer Familienmitglieder kommt auch bei anderen monogenen Merkmalen zum Einsatz. Ein indirektes Gendiagnoseverfahren am Polled-Locus des Rindes benötigt ebenfalls weitere Familienmitglieder zur Bestimmung der Kopplungsphase (EICHLER 1999). Es ist jedoch nicht möglich nur anhand der Markergenotypen eines nicht betroffenen Tieres 90 Diskussion Rückschlüsse auf dessen Mikrophthalmie-Genotyp zu ziehen. Je dichter ein Marker dem Defektgenort ist, umso geringer ist die Wahrscheinlichkeit, dass er durch ein Rekombinationsereignis von diesem getrennt wird. Wenn man davon ausgeht, dass es eine Mutation bei einem gemeinsamen Vorfahren (so genannte Gründertiermutatation) gegeben hat, auf die alle heutigen Fälle zurückgehen, dann sind zwei Dinge zu erwarten. Zum einen müssten eng benachbarte Marker einen Haplotyp bilden, dessen Auftreten bei einem phänotypisch gesunden Tier mit einer gewissen Wahrscheinlichkeit den Schluss zulässt, dass das Tier Anlageträger ist. Zum anderen müssten die betroffenen Tiere an diesen Markergenorten in der Regel homozygot sein. Für den Markergenort ADCY1AP sind jedoch nur zehn der insgesamt 56 betroffenen Nachkommen homozygot. Diese homozygoten Tiere zeigen zudem vier unterschiedliche Allele. Für den Markergenort MAF35 gilt das gleiche. Es sind 16 der betroffenen Tiere homozygot für das Allel 108, das am Markergenort MAF35 mit einer Allelfrequenz von 55,4 % das häufigste beobachtete Allel darstellt. Zusammengefasst legen diese Zusammenhänge nahe, dass keiner der gekoppelten Marker nahe genug am Defektgenort liegt, um die oben beschrieben Effekte beobachten zu lassen. Die Wahrscheinlichkeit, dass ein Allel eines Markers mit einer bestimmten Entfernung zum Defektgenort eine Assoziation zu diesem zeigt, sinkt mit der Anzahl der Generationen, die seit dem Auftreten der Gründertiermutation vergangen sind. Man kann jedoch keine Aussage darüber treffen, wann die ursprüngliche Mutation aufgetreten ist. Da der Phänotyp der kongenitalen Mikrophthalmie des Texelschafes erstmals im Jahre 1957 beschrieben wurde (DE GROOT 1997), kann man jedoch schlussfolgern, dass die Mutation mindestens seit etwa 50 Generationen in der europäischen Texelpopulation präsent ist. Bei der Kartierung des Genortes für die bovine renale Tubulusdysplasie beim Japanischen Schwarzvieh wurden zum Beispiel innerhalb einer zuvor durch Kopplungsanalyse ermittelten etwa 5 cM großen Region auf BTA1 Mikrosatellitenmarker identifiziert, die sich bei betroffenen Tieren homozygot zeigten. Dadurch konnte die Region weiter eingegrenzt werden. Dieses so genannte homozygosity mapping konnte erfolgreich angewendet werden, weil keines der betroffenen untersuchten Tiere weiter als vier Generationen vom mutmaßlichen Träger der Gründertiermutation entfernt war (OHBA et al. 1999). Es ist jedoch auch denkbar, dass es beim Texelschaf mehrere unterschiedliche Mutationen im gleichen Gen oder chromosomal eng benachbarten Genen gegeben hat. Dieses Phänomen bezeichnet man als allelische Heterogenität. Derzeit lässt sich allerdings keine Aussage hinsichtlich dieser theoretischen Möglichkeit machen. Das erstmalige Auftreten der kongenitalen Mikrophthalmie des Texelschafes in Neuseeland wird auf den Import weniger Tiere im Jahre 1986 zurückgeführt Diskussion 91 (ROE et al. 2003). Daraus kann geschlossen werden, dass die Defektmutatation in der dortigen Texelpopulation erst seit etwa 20 Generationen präsent ist. In jüngster Zeit wurde von einer neuseeländischen Arbeitsgruppe ein patentgeschütztes indirektes Gendiagnoseverfahren für die kongenitale Mikrophthalmie entwickelt, das keine weiteren Familienmitglieder benötigen soll. Die Frage, ob dieses Verfahren auch in der europäischen Texelpopulation anwendbar ist, kann aus oben genannten Gründen bisher nicht beantwortet werden (ANONYMUS 2005). Bisher konnten beim Schaf weniger als 20 Genorte für monogene Merkmale chromosomal lokalisiert oder molekulargenetisch aufgeklärt werden (Kap. 2.4.2.). In dieser Arbeit wurde mit der kongenitalen Mikrophthalmie des Texelschafes ein weiterer Genort für ein monogenes Merkmal chromosomal lokalisert. Der komparative Kandidatenansatz führte dabei vergleichsweise schnell zum Erfolg. Während beispielsweise bei einem zur Identifizierung des Genortes für die ovine hereditäre Chondrodysplasie (SLS) durchgeführten klassichen Genomscan ein initiales Markerset von 161 Mikrosatellitenmarkern eingesetzt wurde (COCKETT et al. 1999), konnte hier mit einem initialen Markerset von nur 50 Markern eine Kopplung gefunden werden. 5.4. RH-Kartierung Die vergleichende Karte zwischen Schaf und Mensch beruht größtenteils auf in silico Sequenzanalysen und nur zu einem kleinen Teil auf experimentell kartieren Markerloci. Daher ist sie nicht so informativ wie beispielsweise die unlängst veröffentlichte hoch auflösende vergleichende RH-Karte zwischen Rind und Mensch (EVERTS-VAN DER WIND et al. 2005). Der in der Kopplungsanalyse ermittelte LOD-Score erreicht seinen höchsten Wert nicht im Bereich des Mikrosatelliten BMS2270 (23,5 cM), der auf Grund der vorhergesagten Lage des RAX Gens (ca. 24 cM; Tab. 3-4) zum initialen Markerset gehörte. Das kann entweder bedeuten, dass die vorhergesagte Lage des ovinen RAX Gens falsch ist oder dass RAX nicht das für die kongenitale Mikrophthalmie des Texelschafes ursächliche Gen ist. Für die erste Möglichkeit spricht, dass die in silico vorhergesagte vergleichende Karte zwischen Schaf und Mensch (Australian Sheep Genen Mapping Website: http://rubens.its.unimelb. edu.au/~jillm/jill.htm) nur eine vorlaufige Schätzung darstellt. Auf der Seite wird ausdrücklich davor gewarnt, sich auf die Angaben zu verlassen, ohne sie selbst zu überprüfen. Aufgrund von überlappenden Bereichen auf der humanen Genomkarte, die daraus resultieren, dass die Bruchpunkte zwischen Mensch und Schaf nur unzureichend 92 Diskussion charakterisiert sind, haben viele Loci auf der vorhergesagte Karte des Schafes mehr als nur eine Position. Zur möglichst genauen Lokalisation des Gens auf dem ovinen Chromosom 23 wurde daher eine vergleichende RH-Karte zum humanen Chromosom 18 erstellt. Beim Sequenzvergleich zwischen ovinen BAC-Endsequenzen und der humanen Genomsequenz zur Entwicklung geeigneter STS-Marker wurden insgesamt 3676 BLAST-Hits auf HSA18 erzielt. Daher war es möglich, die Treffer so auszuwählen, dass sie möglichst gleichmäßig über das humane Chromosom verteilt sind. In einer 4,36 Mb umfassenden Region zwischen 12,58 Mb und 16,94 Mb auf HSA 18 wurden jedoch keine geeigneten BLAST-Hits erzielt. Das ist wahrscheinlich darauf zurückzuführen, dass sich etwa bei 15 Mb das Zentromer des humanen Chromosoms 18 befindet (NUSBAUM et al. 2005). Neben dem humanen Chromosom 18 wurden außerdem Regionen der humanen Chromosmen 1 und 16 in die vergleichende Kartierung einbezogen. Der Mikrosatellitenmarker BM723 war in früheren Versionen der genetischen Karte des Schafes 13,5 cM oberhalb von UW72A am Zentromer von OAR23 annotiert. Es handelt sich dabei um einen bovinen Mikrosatelliten, der bei 46,04 cM auf dem bovinen Chromosom 3 liegt (http://www.marc.usda.gov/genome/genome.html). Dieser Bereich von BTA3 ist syntän zum humanen Chromosom 1. Auf der bovinen RH-Karte von ITOH et al. (2005) liegt BM723 nur etwa 6 cR7000 distal des ATP1A1-Gens, das auf HSA1 bei 116,6 Mb lokalisiert ist. Es wurde daher angenommen, dass der proximale Bereich von OAR23 ebenfalls Syntänie zu diesem Bereich von HSA1 zeigt. Zur Überprüfung dieser Zusammenhänge wurden drei STS-Marker für diesen Bereich erstellt und an den Zelllinien des ovinen RH-Panels typisiert. Aufgrund des Abstandes von 13,5 cM zwischen den Markern BM723 und UW72A auf der genetischen Karte des Schafes wäre zu erwarten gewesen, dass die genannten Marker etwa 140 bis 150 cR3000 proximal von UW72A liegen. Es wäre somit eine Kopplung zu den proximalen Markern auf OAR23 zu erwarten gewesen. Die in der Zweipunktanalyse ermittelten paarweisen LOD-Scores zwischen den drei Markern und den beiden proximalsten Markern auf OAR23 betrugen jedoch maximal 0,01. Daraus war zu schließen, dass BM723 auf der genetischen Karte nicht korrekt angeordnet worden war. Vor der Erstellung der aktuellen Version der genetischen Karte (SheepMap 4.5) wurden daher die BM723 Genotypen der IMF Tiere überprüft und es ergab sich eine Anordnung in einem Bereich auf OAR1, der bereits als syntän zu HSA1 identifiziert wurde. Das humane Melanocortin-1-Rezeptor Gen liegt bei 88,5 Mb auf HSA16. Beim Rind wurde es auf Chromosom 18 angeordnet (BARENDSE et al. 1997). Von VAGE et al. (2003) wurde es auf OAR14 kartiert, während es in der genetischen Karte des Schafes das Gen auf OAR23 Diskussion bei 50,5 93 cM angeordnet wurde (SheepMap 4.5, http://rubens.its.unimelb.edu.au/ ~jillm/jill.htm). Diese Chromosom ist homolog zu BTA24, während das Rinderchromosom 18 dem ovinen Chromosom 14 homolog ist (http://www1.angis.org.au/ jmaddox/pages/ shp_bov.htm). Aufgrund dessen wird auf der Australian Sheep Gene Mapping Website darauf hingewiesen, dass es sich um eine Verwechslung mit dem Melanocortin-2-Rezeptor Gen handeln könnte, das auf HSA18 lokalisiert ist (http://www1.angis.org.au/ jmaddox/cgibin/marker_q.pl?marker=MC1). Die vier zur Überprüfung der Lokalisation von MC1R verwendeten Marken konnten bei einem LOD-Score-Schwellenwert von 8 keiner Kopplungsgruppe auf OAR23 zugeordnet werden. Der höchste für einen der vier Marker errechnete LOD-Score betrug 5,59 zwischen CZ922047 (BLAST-Hit bei 77,89 Mb auf HSA16) und dem Mikrosatelliten DIK4464. Die auf der umfassenden RH-Karte des ovinen Chromosoms 23 angeordneten Marker sind bei einem durchschnittlichen Abstand zueinander von 15,8 cR3000 gleichmäßig über das gesamte Chromosom verteilt und direkt benachbarte Marker sind mit einem LOD-Score von durchschnittlich 14,45 gekoppelt. Es ist daher anzunehmen, dass das MC1R Gen nicht auf OAR23 lokalisiert ist. Die Reihenfolge der Gene innerhalb der vier gefundenen Syntänieblöcke zwischen OAR23 und HSA18 ist nahezu vollständig konserviert. Es wurde lediglich eine Inversion beim Schaf in der Region der RH-Karte zwischen 790,3 und 802,8 cR5000 beobachtet. An dieser Stelle sind drei aufeinander folgende Marker im Vergleich zur Abfolge auf dem humanen Chromosom 18 in ihrer Reihenfolge umgekehrt. Aufgrund der direkten Nachbarschaft zum RAX Gen wurden die Marker an dieser Stelle in einem geringeren Abstand zueinander gewählt, um eine möglichst exakte Positionierung des Kandidatengens zu erreichen. Daher umfasst die beobachtete Inversion auf dem humanen Chromosom lediglich eine Region von 0,86 Mb und es muss durch Typisierung weiterer flankierender STS Marker überprüft werden, ob die Inversion tatsächlich vorhanden ist. Das ist insofern von Bedeutung, als das RAX Gen zu den drei an der Inversion beteiligten Markern gehört. Unabhängig davon kann hinsichtlich seiner Lage ausgesagt werden, dass sich die vorhergesagte Lage bei 24 cM nicht bestätigt hat. Das Gen liegt auf der errechneten RH-Karte bei 802,8 cR5000. Überträgt man diese Lage auf die genetische Karte, so liegt das Gen im Bereich des Mikrosatelliten URB031, also am distalen Ende des Chromosoms bei etwa 85 cM. Damit ist das Kandidatengen mehr als 40 cM von den gekoppelten Markern ADCY1AP und MAF35 entfernt und kann daher auf Grund seiner chromosomalen Position mit hoher Wahrscheinlichkeit als Defektgen ausgeschlossen werden. 94 Diskussion Mit der vorliegenden RH-Karte des ovinen Chromosoms 23 steht erstmals eine detaillierte hochauflösende umfassende vergleichende Genkarte eines Schafchromosoms zur Verfügung. Durch die Kartierung von Mikrosatellietn ist eine Verknüpfung zur genetischen Karte gegeben. Bisherige vergleichende Genomkarten zwischen Schaf und Mensch auf der Grundlage von Hybridisierungsexperimenten und der Kartierung von Ankergenorten identifizieren lediglich einzelne konservierte Chromosmenabschnitte (BURKIN et al 1997; IANNUZZI et al. 1999; MADDOX et al. 2003). Für das Rind stehen dagegen hochauflösende vergleichende Genomkarten humanen Genom zur Verfügung (EVERTS-VAN DER WIND et al. 2005; ITOH et al. 2005). EVERTS-VAN DER WIND et al. (2005) bedienten sich dabei ebenfalls der Methode, STS-Marker auf der Grundlage von Sequenzhomologien zwischen bovinen BAC-Endsequenzen und der humanen Genomsequenz zu erstellen. Dabei wurden 201 zwischen Mensch und Rind konservierte Chromosomenabschnitte mit einer durchschnittlichen Größe von 7,6 Mb identifiziert. Die Abdeckung der humanen Genomsequenz wird mit 91 % angegeben. Der Vergleich zwischen der so erzeugten Karte des Rinderchromosoms 24 mit der RH-Karte von OAR23 ergibt eine nahezu völlige Übereinstimmung zwischen Rind und Schaf (Abb. 5-1). Das belegt den hohen Grad der Konservierung inneralb der Familie der Bovidae (DE GORTARI et al. 1998) und macht deutlich, dass die derzeit stattfindende Sequenzierung des Rindergenoms auch von großer Bedeutung für die Genomanalyse des Schafes ist. Neben dem humanen Genom gehört das vollstänig sequenzierte Genom der Maus zu den am besten untersuchten Säugetiergenomen (WATERSTON et al. 2002). Um diese Kenntnisse bei der Suche nach weiteren Kandidatengenen nutzen zu können, wurde in silico eine vergleichenden Karte zwischen OAR23 und den homologen murinen Chromosomen erstellt. Dazu wurde nach Sequenzhomologien zwischen den in der RH-Kartierung verwendeten ovinen BAC-Endsequenzen und der Genomsequenz der Maus gesucht. Zusätzlich wurde die Lage der bei der Maus annotierten und auf OAR23 angeordneten Gene zu Grunde gelegt. Dabei wurden Homologien zu den murinen Chromosomen 1, 17 und 18 gefunden (Abb. 5-3). Der Grad der Konservierung zwischen Schaf und Maus ist bedeutend geringer als zwischen Schaf und Mensch. Anhand der Anzahl aufgetretener Chromosomenbrüche berechneten SCHIBLER et al. (1998), dass die Trennung zwischen Mensch und Wiederkäuern etwa 70 Millionen Jahre zurückliegen müsse, während die Trennung von Maus und Wiederkäuer bereits 100 Millionen Jahre zurückliege. Frühere Untersuchungen haben gezeigt, dass sich die grundsätzlichen strukturellen Unterschiede zwischen den Chromosomen der Primaten, Paarhufer, Unpaarhufer und Fleischfresser durch das Rearrangement von etwa 40-50 größeren Diskussion 95 OAR23 RH-Karte 819,5 cR5000 HSA18 Physikalische Karte NCBI Build 35.1 76,12 Mb COLEC12 0,0 0,45 50 0,20 USP14 ADCYAP1 5 100 50 10 12,58 150 200 BTA24 RH-Karte (Everts van der Wind et al. 2005) 468 TSP-units 15 183,8 196,6 16,94 13,87 LAMA1 16,81 MC2R 100 20 250 ROCK1 ROCK1 25 150 CSSM31 300 CSSM31 30 200 350 SYT4 SYT4 35 400 SETBP1 450 500 39,10 40,57 300 ONECUT2 SERPINB12 659,3 PHLPP LOC400654 58,76 60,06 60 59,38 60,26 400 700 65 URB031 750 800 350 55 628,3 URB031 250 41,35 50 600 650 39,10 45 498,8 507,1 550 40 70 819,5 ATB9B 74,96 75 450 75,08 ATB9B Abbildung 5-1: Gegenüberstellung der vergleichenden RH-Karten des ovinen Chromosoms 23 und des bovinen Chromosoms 24 zum humanen Chromosom 18. Segmenten erklären lassen, innerhalb derer dann weitere kleinere Rearrangements stattgefunden haben (SCHIBLER 1998). Die Nagetiere passen jedoch nicht in dieses Schema, da bei ihnen zur in der Evolution verstrichenen Zeit überproportional viele chromosomale Rearrangements auftreten (GRAVES 1996). Beim Vergleich der Genomkarten von Maus, Schaf und Mensch (Abb. 5.3) sieht man dass drei der konservierten Abschnitte zwischen Schaf und Mensch in anderer Form bei der Maus wiedergefunden werden können. Auf den ersten Blick scheint der Abschnitt zwischen 16,94 und 39,10 Mb auf HSA18 (in Abb. 5-3 blau dargestellt) sowohl beim Schaf als auch bei der Maus konserviert zu sein. Man erkennt aber, dass der zwischen Schaf und Mensch konservierte Block auch das Gen COLEC12 einschließt und daher Beziehungen zu zwei verschiedenen der auf HSA18 dargestellten konservierten Abschnitte (in Abb. 5-3 grün und blau dargestellt) bestehen. Das deckt sich mit der Beobachtung, dass es bestimmte chromosomale Lokalisationen gibt, in deren Umgebung bevorzugt Brüche autreten (MURPHY, W. J. et al. 2005). 96 Diskussion Fasst man die Ergebnisse der hier durchgeführten vergleichenden RH-Kartierung zusammen und nimmt außerdem an, dass das humane und ovine Genom eine ähnliche Gesamtgröße haben, lässt die in silico Analyse der syntänischen Chromosomenabschnitte von HSA18 und OAR23 den Schluss zu, dass das ovine Chromosom 23 eine Länge von etwa 76 Mb hat. Hinsichtlich der Rolle des RAX Gens als Kandidatengen, lässt sich sagen, dass das RAX Gen auf Grund seiner chromosomalen Position mit großer Wahrscheinlichkeit als kausales Gen der kongenitalen Mikrophthalmie ausgeschlossen werden kann. Anhand der hier gezeigten hoch auflösenden umfassenden RH-Karte des ovinen Chromosoms 23 ist es möglich, weitere Kandidatengene anhand ihrer Lokalisation im humanen oder murinen Genom ausfindig zu machen. Die beiden mit Mikrophthalmie gekoppleten Marker ADCY1AP und MAF35 liegen bei 515,6 bzw. 530,3 cR5000 auf der RH-Karte von OAR23. Die gekoppelte Region liegt somit im Bereich eines Bruchpunktes zwischen zwei bei Mensch und Schaf konservierten Chromosomenabschnitten (Abb. 5-3). Bei der Suche nach positionellen Kandidatengenen kommen daher zwei Regionen von HSA18 in Betracht. Dabei handelt es sich zum einen um die Region zwischen 0,0 und etwa 7 Mb und zum anderen um die Region distal von 12,58 Mb. Letztere beinhaltet das Zentromer sowie eine proximal des Zentromers gelegene so genannte gene desert, das heißt diese Bereich ist genarm und in einen Bereich von mindestens 500 kB Länge liegen gar keine codierenden Gene (NUSBAUM et al. 2005). Bei der Maus kommen die Regionen im Bereich von 65 Mb auf MMU17 und im Bereich von 9 Mb auf MMU18 in Frage (Abb. 5-3). Für den auf HSA18 nur etwa 0,35 Mb distal des ADCYAP1-Gens gelegenen offenen Leserahmen C18orf2 wurde im Zusammenhang mit der Aufklärung der senilen MaculaDegeneration des Menschen eine retinaspezifische Expression ausgemacht (STÖHR et al. 2000). Es fehlen allerdings bisher Hinweise auf die konkrete Funktion des Genproduktes. Das bei 3,4 Mb auf HSA18 gelegene transforming growth factor beta induced factor (TGIF) Gen codiert einen Transkriptionsfaktor und ist als ursächlich für eine Form der humanen Holoprosenzephalie identifiziert worden (GRIPP et al. 2000). Es wird angenommen, dass Mutationen in diesem Gen auch das Wachstum der Sklera während der Augenentwicklung beeinflussen (LAM et al. 2003). Das bei 64,1 Mb auf dem murinen Chromosom 17 lokalisierte twisted growth factor homolog 1 (twsg1) Gen codiert einen Transkriptionsfaktor, der die Expression von Bmp4 beeinflusst und spielt eine Rolle in der Entwicklung des Prosenzephalons (ZAKIN et al. 2004). Bei der Maus sind ein Ausbleiben der Linseninduktion, ein abnormale Retinaentwicklung sowie Anophthalmie als okuläre Phänotypen beschrieben, die durch Mutationen in diesem Gen hervorgerufen werden (Mouse Genome Informatics: http://www. Diskussion 97 informatics.jax.org/). Das homologe TWSG1 Gen des Menschen liegt bei 9,3 Mb auf HSA18. Bei der Suche nach den molekulargenetischen Ursachen für vererbte Anomalien muss man neben so genannten funktionellen Kandidatengenen aber auch die Möglichkeit in Betracht ziehen, dass ein bisher unbekanntes Gen die kaussale Muatation enthält. Beim Rind wurde beispielsweise im Rahmen ienr positionellen Klonierungsstudie das vorher auch beim Mensch und Maus unbekannte LIMBIN Gen als ursächlich für den bovinen chondrodysplastischen Zwergwuchs identifiziert (TAKEDA et al. 2002). MMU17 Physikalische Karte NCBI Build 35.1 93,30 Mb 60 65 MMU18 Physikalische Karte NCBI Build 35.1 90,92 Mb OAR23 RH-Karte 819,5 cR5000 70 75 5 Atp9b Rttn 5 9,91 100 10 12,58 150 20 250 Syt4 Pik3c3 25 15 183,8 196,6 20 ROCK1 25 300 Dsg4 30 350 SYT4 31,83 Rock1 35 Colec12 60 Adcyap1 64,10 Ptprm Wdr7 70,96 75 Rax SETBP1 450 500 39,10 40,57 50 550 55 600 628,3 650 81,02 659,3 85 105 LOC400654 58,76 60,06 800 60 65 750 106,07 110 PHLPP 700 Smad7 Setbp1 40 45 498,8 507,1 Mbd2 79,04 89,23 35 400 Lama1 66,32 Onecut2 90 16,94 Fhod3 30 80 0,45 50 200 70 COLEC12 Neto1 91,40 15 65 HSA18 Physikalische Karte NCBI Build 35.1 76,12 Mb 0,0 Mbp 90 10 64,94 65,97 70 819,5 ATB9B 74,96 75 Phlpp MMU1 Physikalische Karte NCBI Build 35.1 194,92 Mb Abbildung 5-3: Vergleich der RH-Karte des ovinen Chromosoms 23 mit den homologen murinen Chromosomen 1, 17 und 18. Auf der rechten Seite ist zum Vergleich die physikali sche Karte des humanen Chromosoms 18 dargestellt. 98 Zusammenfassung 6. Zusammenfassung Jens Tetens: „Molekulargenetische Untersuchungen zur kongenitalen Mikrophthalmie des Texelschafes“ Das Ziel der vorliegenden Arbeit war die Identifizierung der chromosomalen Lokalisation des für die monogen autosomal rezessiv vererbte kongenitale Mikrophthalmie des Texelschafes verantwortlichen Defektgens. Dazu wurde ein komparativer Kandidatengenansatz auf der Grundlage der vielfältigen Kenntnisse über ähnliche Phänotypen bei Mensch und Maus gewählt. Das benötigte Familienmaterial wurde durch Probensammlung im Feld sowie die Etablierung einer experimentell erzeugten Ressourcenfamile gewonnen. An Tieren der Ressourcenfamilie wurden klinische und pathologische Untersuchungen vorgenommen. Dabei wurde die Pathomorphologie der kongenitalen Mikrophthalmie des Texelschafes übereinstimmend mit früheren Untersuchungen charakterisiert. Durch den Zuchtversuch und die klinischen sowie pathologischen Untersuchungen konnte gezeigt werden, dass es ich um eine nicht syndromische isolierte Mikrophthalmie handelt und dass ein rezessiver Erbgang mit vollständiger Penetranz und variabler Expressivität vorliegt. Eine auf die vorhergesagten Kandidatengenregionen fokussierte Kopplungsanalyse mit insgesamt 80 Mikrosatellitenmarkern erbrachte mit einem maximalen nicht parametrischen LOD-Score von 4,21 den Nachweis für die Kopplung des putativen Mikrophthalmie-Genortes zu einer Region auf dem ovinen Chromosom 23 im Bereich der Mikrosatellitenmarker ADCY1AP und MAF35. Außerdem zeigte sich, dass durch die Genotypisierung mehrerer Familienmitglieder und anschließender Betrachtung der wahrscheinlichsten Haplotypen Aussagen über den wahrscheinlichen Mikrophthalmie-Genotyp phänotypisch gesunder Familienmitglieder gemacht werden können, sofern ein betroffenes Tier zur Bestimmung der Kopplungsphasen verfügbar ist. Zur Feinkartierung des Defektgenorts wurde eine umfassende hoch auflösende vergleichende Radiation Hybrid-Karte zwischen ovinen Chromosom 23 und dem humanen Chromosom 18 unter Verwendung eines ovinen 5000 Rad Panels erstellt. Es zeigte sich, dass die Genreihenfolge innerhalb der vier gefundenen syntänischen Chromosomenabschnitte zwischen Schaf und Mensch nahezu vollständig konserviert ist und dass in dieser Hinsicht sehr hohe Übereinstimmung mit dem homologen bovinen Chromosom 24 besteht. Auf der Grundlage dieser Ergebnisse konnte gezeigt werden, dass die mit Mikrophthalmie gekoppelte Region im Bereich eines evolutinären Bruchpunktes zwischen zwei bei Schaf und Mensch konservierten Chromosomenabschnitten liegt und daher weiter eingegrenzt werden muss. Summary 99 7. Summary Jens Tetens: “A molecular genetic study on congenital mirophthalmia in the Texel sheep.” The aim of the current study was to localise the disease gene locus responsible for monogenic autosomal recessive inherited congenital microphthalmia in the Texel breed. A comparative candidate gene approach was applied based upon previously mapped disease loci in human and mouse. The family material was obtained by collecting blood samples in the field and by establishing an experimentally derived ressource family. Clinical and pathological investigations were performed on affected and unaffected animals from this family and the morphology was described coincidently with previous studies. No other malformations in addition to the isolated microphthalmia were found in any of the animals and recessive pattern of inheritance with a complete pentrance and variable expressivity was shown. Focussed on the predicted candidate gene regions linkage analysis was performed using a set of 80 microsatellite markers. Linkage between the putative disease gene and a region on OAR23 surrounding the markers ADCY1AP and MAF35 was found with a maximum non parametric LOD score of 4.21. It was shown that genotyping several family members, including an affected offspring to determine the linkage phases, makes it possible to give an indirect diagnosis on the probale microphthalmia genotype of unaffected family members. A subsequent fine mapping was carried out by radiation hybrid mapping using an ovine 5000 rad radiation hydrid panel. An integrated high resolutition comprehensive comparative radiation hybrid map between ovine chromosome 23 and human chromosome 18 was generated. Between human and sheep four syntenic blocks were established and the gene order was found to be highly conserved within these blocks showing accordance to the homologous cattle chromosome 24. Based upon these findings it was shown that the identified linked region is situated within an evolutionary breakpoint between homologous chromosome segments in sheep and human. Therefore further fine mapping is indicated. 100 Literaturverzeichnis 8. Literaturverzeichnis ABBASI, A. R., N. IHARA, T. WATANABE, M. KHALAJ, T. TSUJI, Y. SUGIMOTO und T. KUNIEDA (2005): Linkage mapping of the locus responsible for congenital multiple ocular defects in cattle on bovine Chromosome 18. Mamm. Genome 16, 731-7 ABBASI, A. R., GERILETOYA, N. IHARA, M. KHALAJ, Y. SUGIMOTO und T. KUNIEDA (2006): An integrated radiation hybrid map of bovine chromosome 18 that refines acritical region associated with multiple ocular defects in cattle. Anim. Genet. 37, 58-61 ABDELHAK, S., V. KALATZIS, R. HEILIG, S. COMPAIN, D. SAMSON , C. VINCENT, D. WEIL, C. CRUAUD, I. SAHLY, M. LEIBOVICI, M. BITNER-GLINDZICZ, M. FRANCIS, D. LACOMBE, J. VIGNERON, R. CHARACHON, K. BOVEN, P. BEDBEDER, N. VAN REGEMORTER, J. 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(cM) Vorwärtsprimer Rückwärtsprimer AT (°C) OAR1: 340,4 cM INRA197* EPCDV21* BMS835* BM7231) BM6506* BMS4008* LS6* MCM130* BM1824* 16,8 23,8 40,3 111,9 229,5 230,6 235,3 250,3 287,9 TTGCCCTAGAAACCACATGC GATCTGCGCACTGCTCTGTC T C A T G T G C A T G G G G T T T G ACCCTTGGTTTTCTGCTGG GCACGTGGTAAAGAGATGGC CGGCCCTAAGTGATATGTTG GACTTCTCCCAGTAGGCTGG AAACTTTGTGCTGTTGGGTGTATC GAGCAAGGTGTTTTTCCAATC AGAAACTGCAGGGTGTTGTGG GGCTGACCTGGTCGAACTTG ATCTGCCTACCTGGGCATC CATCCTGTGTGAGTGTTGTGG AGCAACTTGAGCATGGCAC GAAGAGTGTGAGGGAAAGACTG GCTGTTCGGAAGTGATGTAG CTCACCTCTGCCTTTCTATCTCTCT CATTCTCCAACTGCTTCCTTG 55 58 57 50 54 58 54 60 55 OAR3: 304,3 cM ILSTS28 FCB129 BMS710* ILSTS49* 29,5 66,3 80,6 100,2 TCCAGATTTTGTACCAGACC GCGACTTAGCAGCAGCAGCATCC C AGCAGCAGTGTTGGCTCCAAGAGC CAATTTTCTTGTCTCTCCCC GTCATGTCATACCTTTGAGC CATCAAGAGATGAATGAGTAAAGAAGATG GTGCATGGACAATAATTCTACTCTCCAC GCTGAATCTTGTCAAACAGG 55 60 60 49 OAR4: 147,8 cM HH64* 139,5 CGTTCCCTCACTATGGAAAGTTATATATGC CACTCTATTGTAAGAATTTGAATGAGAGC 55 CCACTAGGAAAGTGACTAGGTTCA GAATCTTCTCCCCCTGCATC GT A AC AGC T TA CCC AA CT GT TC A CC GAGCAAAGGTCATGTCAGGTGT GCCCTATTAAGCCAATATACAG 54 56 56 52 52 GGAGAGCCGAGGGCTTCAGC GGCAGGACCTGAAGTGTGGTC TTGCCCAAAAATAGACCTTAAA CAGGTTCTTTACCACTCCACCTG ATCCATGCAATAAAATTTAAAAG TG TTCTTTCACTTTAGGTCCATCC CAAAGAAGCCAGGAAAGTATCGT TGTTCTGTGAGTTTGTAAGC CAGAGCTGGCAC CAGAGG 58 58 61 58 58 58 55 55 58 TGACTTCAGGGAATAAGTTCCA ATTTCAGGTTTGTTGGTTCCC AACTGAGCTGTATGGTGGACG 54 58 58 OAR6: 155,7 cM BM9058 INRA133* MCM204 MCM53* MCMA14* 12,9 16,0 18,2 29,7 45,0 TGTTAGTGTGTTTGAATTTGTGTG ATCCTCAAAGCAACCTGGC TCAGCTATAAAATGTTTCAGCTCTACG CATGGAGTTGTAGAGTCAGACATG A TGTTTCCTCTTCTCCAAATATC OAR7: 148,9 cM INRA107* INRA71* BMS1620* MCM149* BMS2721* BP31 MCM156 ILSTS05 BMS2614 75,0 92,1 105,5 117,1 126,2 132,2 132,9 134,4 136,7 TCCCAGATACAGATGCAACAG GCCTAGCATCCACAATACCAC TATGAACTCACATGGTTACCACA CACTAGCACTACCTGGGAAGCC GTTCTCTGGGATTTGTGTCATT ACGCACCTTTATGTTCATTGC TTCTTGCCTGGAAGCAGAGG GGAAGCAATGAAATCTATAGCC ACTTTCTTTTCCTGTGGCTCG OAR8: 128,0 cM BMS434* BMS1724* BMS1967* 1) 61,4 88,6 128,0 GTTTCTCCTTTCCCCTCTGA GACTTGCCCCAATCCTACTG GGGCA GAT GTGAGTAA TTTT CC BM723 war nicht im anfänglichen Markerset enthalten. Der Marker wurde ausgewählt, da er in der zu diesem Zeitpunkt aktuellen Version der genetischen Karte des Schafes bei 0,0 cM auf OAR23 annotiert war (s. Kap. 4.2). 130 Anhang 1: Marker Anhang In der Kopplungsanalyse eingesetzte Marker (Fortsetzung). Lok. (cM) Vorwärtsprimer Rückwärtsprimer AT (°C) OAR9: 126,9 cM ILSTS11* MCM42* 40,1 78,4 GCTTGCTACATGGAAAGTGC CATCTTTCAAAAGAACTCCGAAAGTG BMS975* 53,9 TGGAGCTAAATCAATGCGTG CTAAAATGCAGAGCCCTACC CTTGGAATCCTTCCTAACTTTCGG 52 55 CCCAATGGCCAATTAAGTACC 53 CAGCATCTCATGTCTGCTTG GGACCTTTGGCAATGGAAGG ACAGTATAAAGAAATGGACCATTGATCTT GTGAGGATAGCACTTGGTCTGGCT ACTTTTCAAGCAGGGCTCAC 59 52 56 58 58 GAGGGCAAAAAGGTTTGGGGTGTATGG CACTGTGGTTTGTATTAGTCAG G CTTAGGGGTGAAGTGACACG 52 55 50 CCACTCCTCCTGAGAATATAACATG GCAACTGGCAAAATTTCATTC ATTGTTCCATTGCATGTTCC CGGGATTCACACTAGAATCAC AAAGGTCCTACGTTCTGAAGAT C 60 60 55 60 58 OAR10: 101,2 cM OAR13: 128,3 cM PrP HUJ616* CSTBJ12* MMP9* BMS995* ca. 30 65,0 98,2 115,4 125,9 AAAAGCCACATAGGCAGTTG TTCAAACT ACACATTGACAGGG GCGACTGAACAACCACAACGA T CTTGCCTTCTCATGCTGGGACT AATTCTTCCAACCTCCAGTGC OAR14: 120,0 cM TGLA357* CSRD47* ILSTS02* 13,0 26,6 73,3 GCAGAGTCTGAGTTTAAACTTCTCTAACACC GGACTTGC CAGAACTC TGCAAT TCTATACACATGTGCTGTGC OAR15: 123,8 cM MAF65* HBB2* BMS2812* SHP4* BMS1660* 46,5 69,4 79,2 92,5 96,0 AAAGGCCAGAGTATGCAATTAGGAG GCAGCAATCAGTACAAAAGAGG TCCAGGTTAGCTGACATAATCC TATACCAGAATTTCTGGAGATAGG GTGCATGCTGATTGCATTAC OAR18: 127,7 cM HH47* TGLA122* 77,0 88,7 TTTATTGACAAACTCTCTTCCTAACTCCACC CCCTCCTCCAGGTAAATCAGC GTAGTTATTTAAAAAAATATCATACCTCTTAAGG AATCACATGGCAAATAAGTACATAC 60 53 OAR19: 7 2 , 1 c M MILVET8* FCB304* 31,7 64,8 AATATGTCTCCTGTTGCTGG CCCTAGGAGCTTTCAATAAAGAATCGG GAGAAGTTGTCATTTGAGCC CGCTGCTGTCAACTGGGTCAGGG 55 63 O A R 2 0 : 9 1 ,4 c M BM1258* MCMA23* 30,8 91,4 GTATGTATTTTTCCCACCCTGC ATCGAACCCAGGTCTCCTG GAGTCAGACATGACTGAGCC TG AAAGAATCAGACGATGAGTGG A 63 52 CTCAGTTTAATTCCATAGACCAACAGG 65 OAR21: 75,5 cM HH22* 46,0 CAACAGGACCTTGAAAACCACACC O A R 2 2 : 8 2 ,9 c M BMS1314* MAF36* 34,5 77,2 TTCCTCCTCTTCTCTCCAAAC TTGCGAAAAGTTGGACACAATTGAGC ATCTCAAACGCCAGTGTGG CATATACCTGGGAGGAATGCATTACG 55 63 Anhang Anhang 1: Marker 131 In der Kopplungsanalyse eingesetzte Marker (Fortsetzung). Lok. (cM) Vorwärtsprimer Rückwärtsprimer AT (°C) OAR23: 85,8 cM UW72A BL6* MCM172 BM226 BMS2526 CSRD148 MCMA1 CABB12 BMS2270* CSSM31 ILSTS65 AGLA269 DIK4464# ADCY1AP MAF35 UW69A BMS1332 CSRD172 HEL6 MCM136 DIK5068# CGBP* DIK2727 URB031 # 0,0 2,4 2,9 8,2 8,2 18,7 21,9 22,6 23,5 30,3 30,9 34,4 34,4 43,1 44,6 46,7 50,5 50,5 52,3 53,3 62,4 63,5 67,9 85,8 TTCTGTATTGCACCTCCTCCACCT TTTTTCACTGTACTAAAACGCTGC CATGCTTGCACCTATACGAATATG ATTGCCTTGTCCGTGTATCC CAGGCTCCATGTTGGACAC GAGAAGTGGTCAACAGAGGATGAG C A T T A C A GC C T G T GT G A G T G T G CATTTTCAGTAGAGCTGAGAAGAAGCAAT CTGCGTTAACACCCCACC CCAAGTTTAGTACTTGTAAGTAGA GCTGCAAAGAGTTGAACACC CTTTCAATGTATTTGCTTATTTGTT AAAAGACTGGCAGCCAAAAA CCAGACGCCGACTTCGCCGAG G AGTTACAAATGCAAGCATCATACCTG GGCAAAAGACCAGAAGCAAACCT GCTGCTGGAAATGTAAAAAGG GGAAGCCCAGTATCACCAAAGAAA GGACACGACTGAGCAAGTAA GCACACACATACACAGAGATGCG TGTGCAACCATCTTGTAAAACT G GATCTGCTTCGCCCCACAAAT GGACCCCCTCTCTTCCTTTA TGGACAGCATAGGGAACTAGA T bovine Mikrosatelliten (Kap. 4.1.1.2.; Anhang 3) TGACGGGTGTTCAATGTGTCAC T TCTCAAGTTTACATTTCCCTTTC C CATGCTGTCCTACAAAATAATGTTG CCGGCTGAATTGCTATAAGC CATCAGGTTGGCAGAGTCG TACAGAGAAGCACAAAGAGATGGG GATAGTTCTATCCAACCGTCCC CTCATGTCTCACATCTTCCTAATGCCT GCAGGAAGGCTGATGCAC GACTCTCTAGCACTTTATCTGTG T AACTATTACAGGAGGCTCCC GACACTAGTAGATTTGAAACCC A TTGCCTGGAGAATCCTGTG GCCTGAAGTCCACTGAGAAGAAAGGAG TCAAGAATTTTGGAGCACAATTCTGG AGGTATCTCTCAGCATTGCCTGC T GAGTTGGAAATGACTGAAGCG GCATCTCCAGGAATAAACTCACTT AGGCAGATACATTACCACTA AAAGAGGAAAGGGTTATGTCTGGA CATGGATGAACTCTGAGAACG TCACAGTGACCACAGTCCTCCG T TCCCAACTTGACTCCTGCAT CTCAGCCTTCATACCAGTATTG 58 50 58 47 58 60 52 58 58 55 55 55 58 60 60 58 60 55 56 55 55 58 55 52 132 Anhang 2: Anhang Anzahl der Allele, Allelgrößen, PIC und Allelfrequenzen der in der Kopplungsanalyse eingesetzten Marker. Marker Allele Allelgrößen (bp) PIC Allelfrequenzen kleinstes Allel > größtes Allel OAR1 INRA197 6 151-171 0,70 0,353 0,152 0,300 0,100 0,010 0,088 EPCDV21 7 130-166 0,41 0,736 0,005 0,130 0,019 0,034 0,024 0,053 BMS835 11 151-177 0,78 0,326 0,019 0,057 0,028 0,179 0,057 0,019 0,033 0,009 0,061 0,212 BM723 4 134-142 0,61 0,209 0,173 0,500 0,118 BM6506 7 192-206 0,38 0,011 0,758 0,021 0,095 0,100 0,005 0,011 BMS4008 6 164-188 0,62 0,297 0,460 0,163 0,025 0,035 0,020 MCM130 9 189-225 0,72 0,398 0,239 0,046 0,125 0,091 0,046 0,023 0,011 0,023 LS6 11 132-158 0,80 0,014 0,173 0,236 0,005 0,106 0,014 0,236 0,005 0,005 0,058 0,149 BM1824 5 168-174 0,58 0,029 0,486 0,039 0,327 0,120 OAR3 ILSTS28 6 126-170 0,55 0,017 0,267 0,560 0,043 0,043 0,069 FCB129 7 108-144 0,71 0,138 0,081 0,067 0,410 0,067 0,224 0,014 BMS710 9 98-144 0,79 0,165 0,185 0,121 0,257 0,068 0,005 0,189 0,005 0,005 ILSTS49 5 154-164 0,46 0,055 0,018 0,264 0,636 0,027 OAR4 HH64 8 118-134 0,44 0,016 0,025 0,123 0,049 0,008 0,049 0,721 0,008 BM9058 7 127-145 0,74 0,110 0,059 0,220 0,093 0,373 0,136 0,009 INRA133 8 216-242 0,26 0,005 0,853 0,025 0,054 0,025 0,010 0,005 0,025 MCM204 6 150-166 0,72 0,297 0,219 0,063 0,117 0,289 0,016 MCM53 6 75-99 0,74 0,070 0,009 0,254 0,254 0,254 0,158 MCMA14 6 194-212 0,65 0,066 0,198 0,019 0,019 0,443 0,255 OAR6 OAR7 INRA107 8 157-181 0,67 0,014 0,371 0,010 0,019 0,038 0,048 0,348 0,152 INRA71 3 196-208 0,53 0,194 0,546 0,259 BMS1620 7 90-110 0,37 0,776 0,051 0,020 0,082 0,020 0,041 0,010 MCM149 11 251-300 0,78 0,274 0,066 0,066 0,019 0,009 0,311 0,066 0,085 0,019 0,057 0,028 Anhang Anhang 2: 133 Anzahl der Allele, Allelgrößen, PIC und Allelfrequenzen der in der Kopplungsanalyse eingesetzten Marker (Fortsetzung). Allele Allelgrößen (bp) PIC Allelfrequenzen kleinstes Allel > größtes Allel BMS2721 6 143-169 0,53 0,629 0,155 0,035 0,060 0,009 0,112 BP31 9 203-221 0,62 0,010 0,060 0,005 0,065 0,285 0,490 0,050 0,025 0,010 MCM156 7 116-158 0,63 0,111 0,139 0,029 0,519 0,173 0,024 0,005 ILSTS05 7 187-215 0,68 0,054 0,020 0,206 0,397 0,010 0,270 0,044 BMS2614 5 106-118 0,59 0,435 0,374 0,005 0,108 0,079 Marker OAR8 BMS434 9 113-143 0,60 0,011 0,538 0,220 0,011 0,059 0,124 0,027 0,005 0,005 BMS1724 7 164-180 0,46 0,705 0,030 0,053 0,114 0,008 0,046 0,046 BMS1967 9 97-133 0,61 0,014 0,005 0,188 0,207 0,510 0,043 0,010 0,014 0,010 OAR9 ILSTS11 5 266-280 0,68 0,102 0,195 0,381 0,042 0,280 MCM42 5 86-100 0,56 0,226 0,557 0,145 0,008 0,065 BMS975 7 71-11 OAR10 0,74 0,183 0,008 0,008 0,135 0,175 0,143 0,349 OAR13 PrP 4 939 0,57 0,444 (ARR) 0,389 (ARQ) HUJ616 7 123-159 0,56 0,603 0,151 0,087 0,111 0,016 0,016 0,016 CSTBJ12 5 137-147 0,68 0,246 0,046 0,254 0,369 0,085 MMP9 7 183-199 0,70 0,048 0,016 0,262 0,016 0,333 0,064 0,262 BMS995 6 132-146 0,66 0,118 0,155 0,191 0,055 0,473 0,009 0,072 (ARH) 0,094 (VRQ) OAR14 TGLA357 7 120-134 0,64 0,063 0,039 0,047 0,148 0,008 0,188 0,508 CSRD47 7 216-242 0,56 0,073 0,057 0,605 0,040 0,169 0,016 0,040 ILSTS02 4 120-134 0,47 0,582 0,082 0,010 0,327 134 Anhang 2: Anhang Anzahl der Allele, Allelgrößen, PIC und Allelfrequenzen der in der Kopplungsanalyse eingesetzten Marker (Fortsetzung). Marker Allele Allelgrößen (bp) PIC Allelfrequenzen kleinstes Allel > größtes Allel OAR15 MAF65 4 127-137 0,55 0,544 0,202 0,026 0,228 HBB2 7 169-200 0,72 0,216 0,216 0,009 0,172 0,345 0,026 0,017 BMS2812 5 94-102 0,67 0,082 0,303 0,295 0,016 0,303 SHP4 8 96-142 0,75 0,197 0,361 0,172 0,049 0,090 0,107 0,008 0,016 BMS1660 5 140-152 0,69 0,073 0,225 0,341 0,058 0,304 OAR18 HH47 10 126-152 0,83 0,026 0,202 0,088 0,088 0,219 0,035 0,044 0,009 0,158 0,132 TGLA122 11 137-195 0,82 0,009 0,164 0,233 0,172 0,009 0,009 0,060 0,190 0,035 0,017 0,103 OAR19 MILVET8 7 145-157 0,65 0,008 0,214 0,119 0,103 0,016 0,492 0,048 FCB304 6 161-179 0,55 0,034 0,558 0,029 0,005 0,272 0,102 BM1258 6 104-123 0,47 0,686 0,016 0,121 0,105 0,057 0,016 MCMA23 4 270-290 0,42 0,686 0,226 0,029 0,059 OAR20 OAR21 HH22 2 115-131 0,17 0,898 0,102 OAR22 BMS1314 7 138-168 0,51 0,046 0,036 0,118 0,664 0,018 0,073 0,046 MAF36 7 148-184 0,59 0,574 0,164 0,098 0,115 0,016 0,025 0,008 OAR23 UW72A 2 133-135 0,19 0,118 0,882 BL6 12 164-194 0,72 0,008 0,042 0,100 0,008 0,017 0,371 0,008 0,021 0,050 0,300 0,008 0,067 MCM172 7 135-149 0,65 0,336 0,008 0,074 0,402 0,008 0,135 0,037 BM226 10 116-140 0,67 0,031 0,005 0,013 0,121 0,500 0,009 0,134 0,076 0,009 0,103 BMS2526 6 150-160 0,60 0,546 0,033 0,142 0,188 0,033 0,058 CSRD148 11 0,85 0,096 0,096 0,096 0,022 0,009 0,026 0,061 0,104 0,078 0,178 0,235 375-401 Anhang Anhang 2: 135 Anzahl der Allele, Allelgrößen, PIC und Allelfrequenzen der in der Kopplungsanalyse eingesetzten Marker (Fortsetzung). Allelgrößen (bp) PIC Allelfrequenzen kleinstes Allel > größtes Allel Marker Allele MCMA1 11 124-150 0,69 0,033 0,189 0,012 0,070 0,008 0,475 0,078 0,012 0,062 0,004 0,057 CABB12 6 226-240 0,69 0,118 0,145 0,425 0,013 0,083 0,215 BMS2270 6 88-100 0,58 0,052 0,137 0,569 0,182 0,040 0,020 CSSM31 11 129-167 0,48 0,013 0,701 0,034 0,039 0,009 0,021 0,004 0,026 0,077 0,060 0,017 ILSTS65 2 115-117 0,34 0,680 0,320 AGLA269 18 226-300 0,85 0,005 0,014 0,033 0,005 0,085 0,024 0,047 0,009 0,014 0,005 0,113 0,170 0,274 0,080 0,038 0,269 0,009 0,005 0,071 DIK4464 7 212-230 0,59 0,083 0,032 0,019 0,306 0,500 0,014 0,046 ADCY1AP 9 85-119 0,74 0,175 0,008 0,353 0,175 0,008 0,187 0,071 0,016 0,008 MAF35 5 98-114 0,55 0,112 0,264 0,554 0,058 0,012 UW69A 3 154-158 0,40 0,436 0,016 0,548 BMS1332 7 136-150 0,59 0,092 0,060 0,380 0,432 0,028 0,004 0,004 CSRD172 3 154-192 0,40 0,016 0,457 0,527 HEL6 3 181-187 0,33 0,267 0,722 0,011 MCM136 10 134-164 0,78 0,019 0,099 0,157 0,195 0,034 0,095 0,061 0,008 0,004 0,328 DIK5068 5 190-198 0,62 0,307 0,434 0,184 0,008 0,066 CGBP 3 261-265 0,12 0,052 0,016 0,932 DIK2727 12 174-226 0,82 0,016 0,087 0,152 0,011 0,022 0,071 0,283 0,092 0,163 0,005 0,011 0,087 URB031 4 230-242 0,18 0,009 0,897 0,084 0,009 136 Anhang Anhang 3: Am Familienmaterial getestete Rindermikrosatelliten von BTA24. (Chromosomale Lokalisation, Primersequenzen und PCR-Konditionen: http://www.ars.usda.gov/). Marker cM BTA24 DIK2662 16,34 DIK4661 26,36 DIK4464 32,24 BMS1862 35,50 BMS66 41,07 DIK2939 44,74 BMS466 48,81 DIK5068 54,47 DIK4779 54,47 DIK4971 78,13 Vorwärtsprimer Rückwärtsprimer GGACGTAGGAGTTGGGATGA CCCCTGATTTCAGGTTTTTG TCTGGGCCTTAGTTTCCTCA CCAATGCAGAAGACACGAGA AAAAGACTGGCAGCCAAAAA TTGCCTGGAGAATCCTGTG GCACATGCAATCTTGAAAGG ACCAGAGATGATGAAGAATCCC AAAGGTGTGTCCCTCCACTC GTATGCATTTTTCCTGTGTACCA AGGG GCGA TAACAAA A ATGA AGCAGTTCTGGCCAACTGAG AGCAGAGGGCAAATGTTATG GGATGTAAGAGGATGCAGACC TGTGCAACCATCTTGTAAAACTG CATGGATGAACTCTGAGAACG GATTCCACATGTAAGTGGTGTCA AAAGAATGAGTAAAGAAGATATGGTG TGGTTTGGTCTCCTTGCTGT AGCTACCTGGAAAGCCCACT AT (°C) Ergebnis 55 monomorph 60 kein PCR-Produkt 58 polymorph (7 Allele) 58 kein PCR-Produkt 60 kein PCR-Produkt 55 kein PCR-Produkt 58 monomorph 55 polymorph (5 Allele) 60 monomorph 60 monomorph Anhang Anhang 4: 137 Stammbäume der 28 Familien sowie Haplotypen für OAR23 Erläuterung zu den Abbildungen Die Beschriftung der Stammbäume entspricht den Labornummern. Unbekannte Tiere sind nicht mit einer Nummer versehen und durch einen Schrägstrich gekennzeichnet. Männliche Tiere werden durch quadratische und weibliche Tiere durch runde Symbole verkörpert. Auf der Spitze stehende Quadrate stehen für Tiere unbekannten Geschlechts. Schwarze Symbole bezeichnen Merkmalsträger, halbausgefüllte Symbole stehen für Anlageträger. Aufgrund der betroffenen Nachkommen sind alle Elterntiere als Anlageträger gekennzeichnet. Bei den Nachkommen sind gesunde Tiere hingegen durch leere Symbole gekennzeichnet. Lediglich in der Versuchsfamilie sind die gesunden Nachkommen aufgrund des betroffenen Elternteils als Anlageträgerträger gekennzeichnet. Ein Fragezeichen in einem leeren Symbol steht für einen unbekannten Phänotyp. Der paternale Haplotyp steht bei den Nachkommen immer auf der rechten Seite. Der elterliche Haplotyp, mit dem das Defektallel weitergegeben wurde, ist mit einem Stern markiert. Die Farbkodierung dient der Erkennbarkeit von Rekombinationen. Weiße Bereiche in den Haplotypen der Nachkommen verkörpern Bereiche mit uninformativen Markern, d.h. es kann keine Aussage über eine eventuelle Rekombination gemacht werden. Legende für die folgenden Abbildungen: Reihenfolge der 24 Mikrosatelliten-Marker auf OAR23. Marker UW72A BL6 MCM172 BM226 BMS2526 CSRD148 MCMA1 CABB12 BMS2270 CSSM31 ILSTS65 AGLA269 DIK4464 ADCY1AP MAF35 UW69A BMS1332 CSRD172 HEL6 MCM136 DIK5068 CGBP DIK2727 URB031 cM(SheepMap 4.5) 2,4 2,4 2,9 8,2 8,2 18,7 21,9 22,6 23,5 30,3 30,9 34,4 34,4 43,1 44,6 46,7 50,5 50,5 52,3 53,3 62,4 63,5 67,9 85,8 138 Anhang 46 41 133 190 149 132 150 401 136 230 92 131 115 270 226 105 98 158 140 188 ? 164 192 265 208 234 135 190 147 130 150 401 136 230 92 131 115 270 226 103 108 158 140 192 185 140 192 265 184 234 * 133 180 147 126 150 375 130 230 88 131 115 272 226 113 108 154 140 188 185 142 198 265 194 234 42 133 180 147 126 150 375 130 230 88 131 115 272 226 113 108 154 140 188 185 142 198 265 194 234 * 133 190 149 132 150 401 136 230 92 131 115 270 226 103 108 158 140 192 185 140 192 265 184 234 47 44 135 190 135 126 150 389 136 230 92 131 115 256 226 ? 108 158 ? 188 185 164 190 261 210 ? 135 180 143 126 150 375 136 230 92 131 115 256 226 91 108 158 142 188 181 164 190 261 194 234 43 135 180 143 126 150 375 136 230 92 131 115 256 226 91 108 158 142 188 181 164 190 261 194 234 * 133 180 147 124 156 397 136 226 90 163 115 300 224 103 106 154 136 188 181 164 192 265 208 234 135 190 147 130 150 401 136 230 92 131 115 270 226 103 108 158 140 192 185 140 192 265 184 234 Familie 1 48 45 135 180 143 116 154 397 126 240 90 131 115 266 230 103 108 158 142 188 181 142 190 265 206 234 135 174 143 126 150 397 126 240 94 131 117 268 224 103 108 158 142 188 181 142 90 265 206 234 133 190 149 132 150 401 136 230 92 131 115 270 226 103 108 158 140 192 185 140 192 265 184 234 135 180 143 116 150 397 126 240 94 131 117 268 224 103 108 158 142 188 181 142 190 265 206 234 * 135 190 147 130 150 401 136 230 92 131 115 270 226 103 108 158 140 192 185 140 192 265 184 234 135 180 143 116 154 397 126 240 90 131 115 266 230 103 108 154 142 188 185 148 90 265 208 ? Anhang 139 76 135 190 135 124 152 393 124 232 92 131 117 ? 216 105 108 154 140 188 ? 164 194 265 212 234 * 135 190 147 140 150 397 136 230 92 131 115 ? 216 107 106 154 140 188 ? 140 192 265 212 234 135 194 143 126 150 385 136 226 92 163 115 ? 224 115 108 158 142 188 ? 142 192 265 ? 234 75 135 194 143 126 150 385 136 226 92 163 115 ? 224 115 108 158 142 188 ? 142 192 265 ? 234 * 135 190 135 124 152 393 124 232 92 131 117 ? 216 105 108 154 140 188 ? 164 192 265 212 234 87 135 180 143 130 154 377 136 226 92 131 115 ? 224 111 106 154 140 188 ? 140 192 265 ? 234 88 89 135 180 143 130 154 379 140 226 92 165 115 270 226 103 108 158 142 192 ? 140 190 265 208 234 Familie 2 135 180 143 130 154 379 140 226 92 165 115 270 226 103 108 158 142 192 ? 140 190 265 208 234 135 190 135 140 150 397 136 230 92 131 115 ? 216 107 106 154 140 188 ? 140 192 265 212 234 135 180 143 130 154 379 140 226 92 165 115 270 226 103 108 158 142 192 ? 140 194 265 210 234 135 190 147 140 150 397 136 230 92 131 117 270 216 105 108 154 140 188 ? 164 194 265 212 234 135 180 143 130 154 379 140 226 88 131 115 270 226 103 108 158 142 192 ? 140 194 265 210 234 * 140 Anhang 52 135 ? ? ? ? 391 ? ? ? ? 115 ? ? ? 108 154 136 188 181 ? ? ? ? ? * 133 174 ? 126 150 ? 126 240 94 131 117 246 226 105 108 158 138 188 185 148 190 265 208 234 135 ? ? ? ? 391 ? ? ? ? 115 ? ? ? 108 154 142 188 185 144 192 265 210 234 50 49 135 ? ? ? ? 391 ? ? ? ? 115 ? ? ? 108 154 142 188 185 144 192 265 210 234 135 ? ? ? ? 391 ? ? ? ? 115 ? ? ? 108 154 138 188 185 148 190 265 208 234 135 ? ? ? ? 391 ? ? ? ? 115 ? ? ? 108 154 142 188 185 144 192 265 210 234 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 135 ? ? ? ? 391 ? ? ? ? 115 ? ? ? 108 154 136 188 181 148 190 265 208 234 Familie3 135 178 ? 126 150 ? 126 230 90 131 117 246 212 85 108 154 140 188 185 142 192 265 208 240 53 * 135 178 ? 126 150 ? 126 230 90 131 117 246 212 85 108 154 140 188 185 142 192 265 208 240 133 174 ? 126 150 ? 126 240 94 131 117 246 226 105 108 158 138 188 185 148 190 265 208 234 135 178 ? 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154 391 136 230 92 149 115 ? 226 111 106 154 140 192 ? 142 190 263 212 234 * * 519 135 180 135 126 156 389 130 230 92 131 115 ? 224 103 106 154 140 192 185 146 194 265 ? ? 135 180 135 126 156 377 136 240 92 131 117 270 226 105 98 158 140 188 185 138 190 265 194 234 55 C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C 135 180 135 126 156 389 130 230 92 131 115 ? 224 103 106 154 140 192 185 146 194 265 ? ? * 135 180 135 126 156 401 136 230 92 131 115 ? 224 105 98 158 142 192 185 140 192 265 ? ? 514 135 186 141 126 150 375 124 240 94 165 115 ? ? 113 112 158 142 192 185 146 190 265 194 234 135 174 143 126 156 377 136 240 92 131 117 270 226 105 98 158 140 188 185 138 190 265 194 234 A A A C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C 515 135 186 141 126 150 375 124 240 94 165 115 ? ? 113 112 158 142 192 185 146 192 265 174 234 C C C C C C C C C C C A A A A A A A A A 135 186 141 126 150 375 124 240 94 165 115 ? ? 113 112 158 142 192 185 146 192 265 174 234 107 135 174 143 126 150 397 126 240 94 131 117 ? 226 105 98 158 140 188 185 138 190 265 194 234 135 180 143 124 154 401 144 228 94 129 115 ? ? 111 108 154 142 188 ? 140 190 265 194 234 Familie 27 a A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A * 135 174 143 126 150 397 126 240 94 131 117 270 226 103 108 158 142 192 185 140 190 265 226 234 84 135 194 143 ? 150 397 126 240 92 131 117 246 226 105 112 154 140 192 ? 146 194 265 ? 234 B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B B A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A 135 180 135 126 156 377 136 240 92 131 117 270 226 105 98 158 140 188 185 138 190 265 194 234 * * 135 174 143 126 150 397 126 240 94 131 117 270 226 103 108 158 142 192 185 140 190 265 226 234 79 C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? Familie 27 b 135 180 ? ? 150 ? ? ? 92 ? 115 ? ? 113 112 154 136 188 181 164 ? 265 ? ? 520 * 135 180 135 126 156 377 136 240 92 131 117 270 226 105 98 158 140 188 185 138 190 265 194 234 135 180 135 126 156 377 136 240 92 131 117 270 226 105 98 158 140 188 185 138 190 265 194 234 D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D D C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C 135 190 ? ? 150 ? ? ? 94 ? 117 ? ? 85 108 158 140 188 181 164 ? 265 ? ? 521 135 174 143 126 150 397 126 240 94 131 117 270 226 103 108 158 142 192 185 140 190 265 226 234 A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A * 135 180 ? ? 150 ? ? ? 92 ? 115 ? ? 113 112 154 136 188 181 164 ? 265 ? ? 86 135 190 ? ? 150 ? ? ? 94 ? 117 ? ? 85 108 158 140 188 181 164 ? 265 ? ? 135 190 149 132 150 375 136 240 92 131 117 268 224 103 106 154 136 188 185 140 192 265 184 234 509 135 180 135 126 156 377 136 240 92 131 117 270 226 105 98 158 140 188 185 138 190 265 194 234 C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C * 135 190 149 132 150 375 136 240 92 131 117 268 224 103 106 154 140 192 185 146 194 265 184 234 85 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 115 ? ? 105 98 158 142 188 ? 164 ? 265 ? ? 510 135 188 143 140 150 397 140 230 92 131 115 246 226 105 112 154 136 188 185 140 192 265 184 234 135 174 143 126 150 397 126 240 94 131 117 270 226 103 108 158 142 192 185 140 190 265 226 234 A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 115 ? ? 105 98 158 142 188 ? 164 ? 265 ? ? 511 135 174 143 126 150 397 126 240 94 131 117 ? 226 103 108 158 142 192 185 138 190 265 194 234 C C C C C A A A A A A A A A A A A A A A A A A 512 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 115 ? ? 105 98 158 142 188 ? 164 ? 265 ? ? 135 174 143 126 150 397 126 240 94 131 117 270 226 103 108 158 142 192 185 140 190 265 226 234 A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 115 ? ? 105 98 158 142 188 ? 164 ? 265 ? ? 232/04 * ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 117 ? ? 103 108 154 140 188 ? 164 ? ? ? ? 135 180 135 126 ? 389 130 230 92 131 115 ? ? 103 106 154 140 192 185 146 194 265 ? 240 516 135 180 135 126 156 377 136 240 92 131 117 270 226 103 108 158 142 192 185 140 190 265 226 234 A A A A A A A A A A A C C C C C C C C C 135 180 135 126 ? 401 136 230 92 131 115 ? ? 113 108 154 140 192 185 164 190 265 ? 234 517 135 180 135 126 156 377 136 240 92 131 117 270 226 105 98 158 140 188 185 138 190 265 194 234 C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C 135 180 135 126 ? 389 130 230 92 131 115 ? ? 103 106 154 140 192 185 164 190 265 ? 234 518 135 180 135 126 156 377 136 240 92 131 117 270 226 105 98 158 140 188 185 138 190 265 194 234 C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C C * 135 180 135 126 ? 389 130 230 92 131 115 ? ? 103 106 154 140 192 185 146 194 265 ? 240 57 135 180 135 126 ? 401 136 230 92 131 115 ? ? 113 108 154 140 192 185 164 190 265 ? 234 135 180 135 126 ? ? 136 230 92 131 115 270 ? 113 108 154 140 192 185 164 190 265 ? 234 56 ? ? ? ? ? ? ? ? 94 ? ? 268 ? 111 108 ? 140 192 ? 142 ? 265 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 94 ? ? 268 ? 111 108 ? 140 192 ? 142 ? 265 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? Anhang 165 166 Anhang 5: Anhang In der RH-Kartierung eingesetzte STS- und EST- Marker: Markertyp, Primersequenzen, Annealingtemperatur (AT) und Produktlänge (bp). Marker Typ Vorwärtsprimer Rückwärtsprimer bp AT (°C) DU460539 DU462610 DU482950 CZ922047 DU450798 DU211659 DU337824 CL636757 CZ925601 CL637610 CL636288 DU271600 DU299080 DU526192 DU307072 CL638819 CZ926828 DU511641 CZ924357 CL632741 CL632826 DU313347 DU526001 CL633178 CZ920175 DU441168 DU485705 CL634992 CL637494 CL634369 CL634915 CL633165 CL633475 CZ924269 CZ925126 CZ924240 CZ922934 CL636996 DU318022 CL637552 CZ921099 CL632399 CL637363 CL638170 RAX_Ex2 MC1R STS STS STS STS STS STS STS STS STS STS STS STS STS STS STS STS STS STS STS STS STS STS STS STS STS STS STS STS STS STS STS STS STS STS STS STS STS STS STS STS STS STS STS STS STS EST TCTGGTCCTGCCTTGACTCT TTCCCATACATTCCCCCTTT GCAAGACGTTTCTGCAGGTC CCTTAGCGATCATCCCAGAA ATGGCCAGGACTTTTCCTTT CATGGGCAAAGTGCAAACTA GATCTCTCTTGTGGCCCATC AGCCTTGGCTGTAGCTCACT GCTGGTGGAGTCCCTTTGTA CAACCCAAGACTAGGCAAGC TCGGGTTCAATAAAGCCTTG GCGGGTCTTCTGATCTCTCA GGCAATGCTAGAGTGGTTCTG GGCTTACCCTACTGATATCTGCTC TGGCATGGAGCTGTAACTCA CAGAGGAGGCTTTCTTCTTGA CATCTGCCAGAGGGTTCAAT GATTTCTGTGCCCCTTCAGA TGAGGAAAATCAAAGCTGCAT ACTGCAATCGGCACATGTAA TGCAGCATAATGTGTGTGAGG CAGGCTTCTTCGCTGACTCT ACTGTTGGGGCTTTTTGATG AGTGACTTGGCACGCATGT GAAACCCCTGGTGTCTCAAA ATGTCAGCTTGCATCACTGC CACAGGATACATGCGACACC TACCTTGCCTTCACCTCCTG CTTGTCTCCTGCCTCCTGTC TACCCAGGGAATGGAGACAG CGGAAAGCGCTGTTAATTTC TGGCAAACACCAACAAAAGA TGCTTCTCAATTACACAAGGTTC CCCACGTATAATGCCTTGCT TGGTAGGGACTGTTGGGAGA ACAGTGTGGCCAGGAAAAAC CGGTCCCAGAAAGTTGAATG AACCAGTGGAGGGACACAAC TGGAGTTATGCCCTGGGTAG CTCCTCTGACATCCCCAGAA TGCTGCATTTCAAGTTGCAT GCGGCAGAATCAATTTTTGT CGGCAGCAAGCCTAGAAATA GAAGCTGAGCGTTGTTGTTG TTGGGCCAGCTAGGAGC ACTCAGAGGCCACTCAGGAA GGACAACCGGGTACAAGAGA CGTTCTGTCCAGAATTGCAG AAGGGCGTACATCAAAGCAC AGCATGGGATTCAGTGGAAC CAGAGGGGTTTTGGTTCTCA TTCTTGGTGAGGCAGTATAGCA GACATCATTTAAACACACGTGGA TCCTTGCTCTGAATCCAGGT TATTGGCACTGCCTGCATTA CTCTAGGGCCTTGGAGCTTT CATGCCTCATGATGCCTCTA GTGGCCCACTTGACTTCATT AAAAAGCAAAGGCATTGAATAGA TAAAGTGTAGGCTAACCCATGTCC TCAACACATTTGCAAACTCCA CCGTAGTTGGGTCACCAGTT TCAGGATTTTCCTGCTCCAC TTTCACCCTCCCAAAGTGTT GTGGAGAGCCTGGCTGATAG GATGGCAGTGACAGAGCAAA AGGAAAGGCATGGAAATGTG CCTTGTCTTTCAAGCGGAAC CAGGTCCAAGGAGAGGTCAG CCAGATCCAGTCAGACCACA TATGGATCGGTGAGCAGACA TGTACACTTTGCCCCTTGACT CGAAGCTTGGCTTCTCTTTT CACCAGCCAAGATACAGTGC ATTCATCACCAGGGTTGCTC AATGTCTTTGCCACCCTCAG GGCTTCTGATGCCAAGAATC CCCTACCATCTGTCCTGCAT CTGCCCTGCTTTTGAGAAAC ATACCTAACCCGCCCTGAAC CCACCTGTACACATGCCTTG AGAAATGCAACGAAGGCTGT TGAGATGGTTTTCTGGCTGA GAGTCACCCTGGGCAATCTA GGAAGAATGCAGAGGGAAAA GGAGTGTGGCTTCGTTGAAT CAAGCCAGCACTTGTCAAAA AGAAGGTGAGGGAGCCAAGT TTCAAATAACCCCCTGTTCG CACAGCTGGTGGTGTAATGG AGTGCCGCCATAAACGC CGTGATCCAGAGGGCTTAAC 346 324 287 124 465 409 553 453 358 390 401 124 474 476 466 405 427 644 357 436 428 444 356 403 408 382 466 417 454 433 561 434 499 426 581 351 408 518 433 212 402 124 465 409 375 315 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 59 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 60 Anhang Anhang 6: 167 Detaillierte Befunde der pathologisch-anatomischen und pathologischhistologischen Untersuchungen am Institut für Pathologie. Erläuterungen Die folgenden Befundbeschreibungen stellen Auszüge aus den im Institut für Pathologie erstellten Sektionsberichten dar. Aufgeführt sind jeweils nur die okulären Befunde. Jedes untersuchte Tier ist mit der Labornummer sowie der Sektionsnummer der Pathologie gekennzeichnet. Tier 79 ist das Vatertier aus dem Zuchtversuch. Die Tiere 61 und 67 sind Nachkommen aus der Familie 5, die zeitgleich mit Tier 79 angekauft wurden. Das Tier 504 stellt einen Einzelfall dar, dessen Familie nicht in der Kopplungsanalyse enthalten ist. Bis auf das Referenztier (Schwarzes Ostfriesisches Milchschaf) und die drei adulten Böcke sind alle übrigen untersuchten Tiere Nachkommen aus dem Zuchtversuch. 168 Anhang Labornr.: Sektionsnr.: Gebutsdatum: Geschlecht: Phänotyp: 79 F/05/000369/V Frühjahr 2004 männlich betroffen Pathologisch-anatomischer Befund am Auge Mikrophthalmie, Durchmesser Bulbus ca. 1,1 cm; keine vordere Augenkammer, Iris, Linse oder Glaskörper nachweisbar, dafür weiße weiche Masse, die an der Sehnervpapille befestigt ist, hinter der Kornea flüssigkeitsgefüllte Zyste, Durchmesser Sehnerv 1 mm. Pathologisch-histologischer Befund Kornea: mittelgradig pigmentiert und vaskularisiert, Fehlen von Descemet'scher Membran und hinterem Hornhautepithel; vorderes Hornhautepithel ohne besonderen Befund; vordere Augenkammer: fehlt, bindegewebige Proliferation mit epithelialen Anteilen und zentralständiger, von Plattenepithel ausgekleideter Zyste; Iris: Anteile teils zentral, teils randständig in bindegewebigen Anteilen; Linse: fehlt; Glaskörperraum: bindegewebige, bis zur Papille reichende Proliferation mit Anteilen von Knorpel, Fettgewebe und in Höhe der vorderen Augenkammer und des vorderen Glaskörperraums gelegene epitheliale Anteile mit multiplen zytischen Hohlräume, ausgekleidet mit einem mehrschichtigem Plattenepithel und zentralem Zelldetritus sowie retinale Strukturen mit Zellen ähnlich denen der Körnerzell- und plexiformen Schichten, diese allerdings unorganisiert oder Körnerzellen teilweise Rosetten bildend, teilweise Ganglienzellen erkennbar; Zilliarkörper: seitlich in die Masse mit integriert, stark pigmentiert, gefäßreicher und hyperplastisch; Augenhintergrund: pflastersteinartiges Pigmentepithel; Choroidea: breit aus lockerem Bindegewebe mit großen Gefäßen, stark pigmentiert; Sklera: Kollagenfasern erscheinen nur wenig organisiert; Sehnerv: zellreich. Anhang 169 Labornr.: Sektionsnr.: Gebutsdatum: Geschlecht: Phänotyp: 61 F/05/000367/V Frühjahr 2004 männlich betroffen Pathologisch-anatomischer Befund am Auge Mikrophthalmie, Sehnerv Durchmesser ca. 1 mm; Durchmesser Bulbus ca. 1,1 cm; keine vordere Augenkammer, Iris, Linse oder Glaskörper nachweisbar, dafür weiße weiche Masse, die an der Sehnervpapille befestigt ist. Pathologisch-histologischer Befund Kornea: mittelgradig pigmentiert und vaskularisiert, mittelgradige perivaskuläre lymphoplasmazelluläre Infiltration; herdförmige mittelgradige lymphohistiozytäre Infiltration, herdfömig randständig einzelne Insel einer apokrinen Drüse (vermutlich Tränendrüse); Fehlen von Descemet'scher Membran und hinterem Hornhautepithel; mehrschichtiges vorderes Hornhautepithel mit vorderer Grenzmembran; vordere Augenkammer: fehlt, stattdessen bindegewebige Proliferation mit epithelialen Anteilen bestehend aus multifokalen, zystischem, von einem verhornten Plattenepithel ausgekleideten Hohlräumen mit zentralen, teils zellulärem Debris und Keratinlamellen sowie Inseln einer apokrinen Drüse (vermutlich Tränendrüse) und Blutgefäßen; Iris: zentralständige Irisanteile innerhalb der bindegewebigen Proliferation, welche sich von der vorderen Augenkammer in die hintere Augenkammer erstreckt und bis in den Glaskörperraum ausdehnt; Linse: fehlt; Glaskörperraum: von der Sehnervpapille ausgehende bindegewebige Proliferation mit Anteilen von Knorpel, Rosetten-bildenden und ansatzweise strukturierten retinalen Zellen ähnlich denen der Körnerzell- und plexiformen Schichten sowie Ganglienzellen; teilweise Ausdehnung von Antuen der optischen Nervs in den Glaskörperraum; Zilliarkörper: randständig sowie teils in die Masse integriert, stark pigmentiert, gefäßreicher und hyperplastisch mit Angieektasien; Augenhintergrund: pflastersteinartiges Pigmentepithel; Choroidea: breit aus lockerem Bindegewebe mit großen Gefäßen, stark pigmentiert; Sklera: Kollagenfasern erscheinen nur wenig organisiert; Sehnerv: zellreich mit geringgradigen multifokalen Verkalkungen. 170 Anhang Labornr.: Sektionsnr.: Gebutsdatum: Geschlecht: Phänotyp: 67 F/05/000368/V Frühjahr 2004 männlich betroffen Pathologisch-anatomischer Befund am Auge Mikrophthalmie, Durchmesser Bulbus ca. 1,1 cm; keine vordere Augenkammer, Iris, Linse oder Glaskörper nachweisbar, dafür weiße weiche Masse, die an der Sehnervpapille befestigt ist, hinter der Kornea flüssigkeitsgefüllte Zyste, Durchmesser Sehnerv 1 mm. Pathologisch-histologischer Befund Kornea: hochgradige pigmentiert und mäßig vaskularisiert, Fehlen vonDescemet'scher Membran und hinterem Hornhautepithel; vorderes Hornhautepithel geringgradig desquamiert; vordere Augenkammer: fehlt, dafür bindegewebige Proliferation mit einer von einem Plattenepithel ausgekleideten, zentralständigen Zyste; Iris: Reste in bindegewebige Proliferation zentral eingebettet; Linse: fehlt; Glaskörperraum: Proliferation einer an der Sehnervpapille anheftenden Masse, bestehend aus Knorpel, Bindegewebe, Fettgewebe, Resten einer apokrinen Drüse (vermutlich Tränendrüse) und im Bereich der hinteren Augekammer epithelialen Anteilen bestehend aus multiplen zystischen, von einem verhornten Plattenepithel ausgekleideten Holhräumen mitZelldetritus sowie retinalen Zellen ähnlich der Körnerzell- und plexiformen Schichten teilweise Ganglienzellen und Rosetten-ähnliche Strukturen erkennbar; Zilliarkörper: seitlich in die Masse mit integriert, stark pigmentiert, gefäßreicher und hyperplastisch; Augenhintergrund: pflastersteinartiges Pigmentepithel; Choroidea: breit aus lockerem Bindegewebe mit großen Gefäßen, stark pigmentiert; Sklera: Kollagenfasern erscheinen locker und mäßig gerichtet; Sehnerv: sehr zellreich. Anhang 171 Labornr.: Sektionsnr.: Gebutsdatum: Geschlecht: Phänotyp: 507 F/05/000370/V 01/05 weiblich betroffen Pathologisch-anatomischer Befund am Auge Mikrophthalmie, keine vordere Augenkammer, Iris, Linse oder Glaskörper nachweisbar, dafür weiße weiche Masse, die an der Sehnervpapille befestigt ist, Durchmesser Bulbus ca. 0,8 cm, Durchmesser Sehnerv 1 mm. Pathologisch-histologischer Befund Kornea: mittelgradig pigmentiert und vaskularisiert, Fehlen von Descemet'scher Membran und hinterem Hornhautepithel; vorderes Hornhautepithel ohne besonderen Befund; vordere Augenkammer: fehlt, bindegewebige Proliferation mit epithelialen Anteilen und Ausbildung einer mit einem Plattenepithel ausgekleideten Zyste direkt kaudal der Kornea; Iris: Reste zentral und randständig in der bindegewebigen Proliferation, teils zystisch dilatiert; Linse: fehlt; Glaskörperraum: vorderer bis mittelerer Glaskörperraum mit bindegewebiger Proliferation mit Anteilen von Knorpel, epithelialen Anteilen, Blutgefäßen und Fettgewebe; in kaudalen Abschnitten ausgeprägte Retina-ähnliche Strukturen bestehend aus Zellen der Körnerzellund plexiformen Schichten, diese allerdings unorganisiert oder Körnerzellen teilweise Rosetten bildend, teilweise Ganglienzellen erkennbar, äußere Körnerzellschicht und teilweise Rezeptoren erkennbar; Zilliarkörper: seitlich in die Masse mit intergiert, stark pigmentiert, gefäßreicher und hyperplastisch; Augenhintergrund: pflastersteinartiges Pigmentepithel; Choroidea: breit aus lockerem Bindegewebe mit großen Gefäßen, stark pigmentiert; Sklera: Kollagenfasern erscheinen nur wenig organisiert; Sehnerv: zellreich. 172 Anhang Labornr.: Sektionsnr.: Gebutsdatum: Geschlecht: Phänotyp: 509 F/05/000372/V 04.03.05 männlich betroffen Pathologisch-anatomischer Befund am Auge Mikrophthalmie, keine vordere Augenkammer, Iris, Linse oder Glaskörper nachweisbar, dafür weiße weiche Masse, die an der Sehnervenpapille befestigt ist, Durchmesser Bulbus ca, 0,7 cm; Durchmesser Sehnerv 1 mm; Pathologisch-histologischer Befund Kornea: geringgradig pigmentiert, mittelgradig vaskularisiert, Fehlen von Descemet'scher Membran und hinterem Hornhautepithel; vorderes Hornhautepithel geringgradig bis mittelgradig hyperplastisch; vordere Augenkammer, Glaskörperraum: fehlt, dafür Einlagerung einer an der Sehnervpapille anheftenden bindegewebigen, bis zur Kornea reichenden Proliferation mit Anteilen von Knorpel, Fettgewebe, Blutgefäßen, und kaudalen Anteilen retinaler Zellen ähnlich denen der Körnerzell- und plexiformen Schichten, diese allerdings unorganisiert oder teilweise Rosetten bildend, teilweise Ganglienzellen erkennbar, äußere Körnerzellschicht und teilweise Rezeptoren erkennbar; teilweise Ausdehnung von Anteilen des optischen Nervs in den Glaskörperraum; Iris: Reste zentral und peripher in bindegewebiger Proliferation; Linse: fehlt; Zilliarkörper: seitlich in die Masse mit integriert, stark pigmentiert, gefäßreicher und hyperplastisch, zystisch dilatiert; Augenhintergrund: pflastersteinartiges Pigmentepithel; Choroidea: breit aus lockerem Bindegewebe mit großen Gefäßen, stark pigmentiert; Sklera: Kollagenfasern erscheinen nur wenig organisiert; Sehnerv: zellreich. Anhang 173 Labornr.: Sektionsnr.: Gebutsdatum: Geschlecht: Phänotyp: 515 F/05/000371/V 09.03.05 männlich betroffen Pathologisch-anatomischer Befund am Auge Mikrophthalmie, keine vordere Augenkammer, Iris, Linse oder Glaskörper nachweisbar, dafür weiße weiche Masse, die an der Sehnervenpapille befestigt ist, Durchmesser Bulbus ca. 0,7 cm; Durchmesser Sehnerv 1 mm. Pathologisch-histologischer Befund Kornea: geringgradig pigmentiert und vaskularisiert, Fehlen von Descemet'scher Membran und hinterem Hornhautepithel; vorderes Hornhautepithel ohne besonderen Befund; vordere Augenkammer, Glaskörperraum: bindegewebige Proliferation mit epithelialen Anteilen bestehend aus teils zystischen, von einem verhorntem Plattenepithel ausgekleideten Hohlräumen, Resten einer apokrinen Drüse (vermutlich Tränendrüse), einbis mehrreihigem Epithelanteilen mit Becherzellen; Knorpel, Fettgewebe, Blutgefäße und im hinteren Abschnitt gelegenen, retinalen Strukturen mit Zellen ähnlich denen der Körnerzell- und plexiformen Schichten, diese allerdings unorganisiert oder teilweise Rosetten bildend, teilweise Ganglienzellen erkennbar, äußere Körnerzellschicht und teilweise Rezeptoren erkennbar; Iris: zentral und peripher in der bindegewebiger Proliferation Reste; Linse: fehlt; Zilliarkörper: seitlich in die Masse mit integriert, stark pigmentiert, gefäßreicher und hyperplastisch, zystisch dilatiert; Augenhintergrund: pflastersteinartiges Pigmentepithel; Choroidea: breit aus lockerem Bindegewebe mit großen Gefäßen, stark pigmentiert; Sklera: Kollagenfasern erscheinen nur wenig organisiert; Sehnerv: zellreich. 174 Anhang Labornr.: Sektionsnr.: Gebutsdatum: Geschlecht: Phänotyp: 523 F/05/000380/V 18.03.05 männlich betroffen Pathologisch-anatomischer Befund am Auge Mikrophthalmie, Durchmesser Bulbus ca. 0,7 cm, keine vordere Augenkammer, Iris, Linse oder Glaskörper nachweisbar, dafür weiße weiche Masse, die an der Sehnervenpapille befestigt ist, Durchmesser Sehnerv 1 mm. Pathologisch-histologischer Befund Kornea: gering- bis mittelgradig pigmentiert und vaskularisiert, Fehlen von Descemet'scher Membran und hinterem Hornhautepithel; vorderes Hornhautepithel ohne besonderen Befund; vordere Augenkammer, Glaskörperraum: bindegewebige Proliferation von Kornea bis an Sehnervpapille reichend mit Blutgefäßen, epithelialen Anteilen und kaudal gelegenen retinalen Strukturen mit Zellen ähnlich denen der Körnerzell- und plexiformen Schichten, diese allerdings unorganisiert oder teilweise Rosetten bildend, teilweise Ganglienzellen erkennbar, äußere Körnerzellschicht und teilweise Rezeptoren erkennbar; Iris: Reste zentral und peripher in der bindegewebigen Proliferation, teils zystisch; Linse: fehlt; Zilliarkörper: kranial in die Masse mit integriert, stark pigmentiert, gefäßreicher und hyperplastisch; Augenhintergrund: Verdacht auf pflastersteinartiges Pigmentepithel; Choroidea: breit aus lockerem Bindegewebe mit großen Gefäßen, stark pigmentiert; Sklera: Kollagenfasern erscheinen nur wenig organisiert; Sehnerv: zellreich. Anhang 175 Labornr.: Sektionsnr.: Gebutsdatum: Geschlecht: Phänotyp: 522 F/05/000379/V 18.03.05 männlich frei Pathologisch-anatomischer Befund am Auge klinisch: Durchmesser Bulbus normal, Linsenstruktur dreieckig, Papille größer und eingesunken; ohne besonderen pathomorphologischen Befund; Durchmesser Auge: 2,2 cm; Durchmesser Sehnerv: 3 mm. Pathologisch-histologischer Befund Ohne besonderen pathomorphologischen Befund; Linse aufgrund von Fixierungsartefakten nicht beurteilbar. Labornr.: Sektionsnr.: Gebutsdatum: Geschlecht: Phänotyp: 553 F/05/000693/V 18.03.05 männlich frei Pathologisch-anatomischer Befund am Auge Ohne besonderen pathomorphologischen Befund; Durchmesser Auge: 2,3 cm; Durchmesser Sehnerv: 3 mm. Pathologisch-histologischer Befund Ohne besonderen pathomorphologischen Befund; Linse aufgrund von Fixierungsartefakten nicht beurteilbar. Labornr: Sektionsnr.: Gebutsdatum: Geschlecht: Phänotyp: Referenz F/05/000693/V 15.03.05 weiblich frei Pathologisch-anatomischer Befund am Auge Ohne besonderen pathomorphologischen Befund; Durchmesser Auge: 2,3 cm; Durchmesser Sehnerv: 3 mm. Pathologisch-histologischer Befund Ohne besonderen pathomorphologischen Fixierungsartefakten nicht beurteilbar. Befund; Linse aufgrund von Danke ! Besonders herzlich danke ich Herrn Dr. Cord Drögemüller für die Überlassung des Themas sowie die stets sehr engagierte Betreuung. Den Mitarbeiterinnen des Institutes für Pathologie Frau Dr. Carola Döpke und Frau Dr. Gundi Müller danke ich für die gute Zusammmenarbeit bei den pathologischen Untersuchungen. Frau Dr. Daniela Bürstel und Herrn Prof. Dr. Martin Ganter aus der Klinik für kleine Klauentiere gilt mein Dank für das Engagement bei der Durchführung des Zuchtversuchs. Frau Antje Krause und Frau Dr. Andrea Meyer-Lindenberg danke ich für die außergewöhnliche Untersuchung von Schafen in der Klinik für kleine Haustiere. Bei Herrn Dr. Hauke Peters bedanke ich mich für die tatkräftige Unterstützung vor Ort bei der Organisation von Blutproben. Allen Mitarbeitern des Instituts für Tierzucht und Vererbungsforschung danke ich für die freundliche Aufnahme und Hilsbereitschaft. Insbesondere danke ich den Mitarbeitern der Abteilung Labor bzw. unten. Mein besonderer Dank gilt Herrn Holger Lönneker und Herrn Lars Klütz für die Betreuung meiner nicht gerade pflegeleicheten Lämmer sowie Herrn Jörn Wrede für Computertips aller Art. Herrn Prof. Dr. Ottmar Distl sage ich Dank für die freundliche Aufnahme am Institut. Der H. Wilhelm Schaumann Stiftung, Hamburg danke ich besonders für die Gewährung eines Stipendiums und die Bereitstellung von Sachmitteln. Nicht zuletzt danke ich meinen Eltern, die mir vieles ermöglicht haben sowie meiner Martina für alle Aufmunterung und Unterstützung.
