praktikum der medizinischen mikrobiologie und immunologie
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-1- PRAKTIKUM DER MEDIZINISCHEN MIKROBIOLOGIE UND IMMUNOLOGIE Praktikumsteil VIROLOGIE Sommersemester 2017 -2- Vorbemerkungen Wegen der nur begrenzt verfügbaren Zeit können im Rahmen dieses Praktikums nur einige der in der virologischen Labordiagnostik üblichen Untersuchungsverfahren praktisch durchgeführt bzw. demonstriert werden. Das gesamte für die Prüfungen und die spätere ärztliche Tätigkeit erforderliche theoretische Wissen in Medizinischer Virologie kann während der wenigen Praktikumsstunden nicht vermittelt werden und muss daher in den begleitenden Vorlesungen und/oder aus Lehrbüchern erworben werden. Moderne virologische Diagnostik ist mit einem enormen apparativen Aufwand verbunden. So erklärt sich, dass nicht jeder einzelne Praktikumsplatz individuell mit dem gesamten erforderlichen Instrumentarium ausgestattet sein kann. Eine gemeinschaftliche Nutzung ist v.a. bei den speziellen Mikroskopen unumgänglich. Dies erfordert zwangsläufig vom Kursteilnehmer besondere Sorgfalt im Umgang mit den Geräten, Flexibilität in der zeitlichen und räumlichen Koordination und nicht zuletzt eine gute Portion Teamgeist. -3- Programm Montag, 22.05.2017: Mikroskopierübungen mit in vitro gezüchteten lebenden Zellen Zellkultur: Passagierung einer Affennieren-Zellkultur durch Proteasebehandlung Bestimmung des Epstein-Barr-Virus (EBV)-Serostatus mittels des indirekten Immunfluoreszenztestes (IFT): Reaktionsstart durch Inkubation des Probandenserums mit EBV-tragenden Lymphomzellen Dienstag, 23.05.2017: Mikroskopierübungen mit in vitro gezüchteten lebenden Zellen Zellkultur: Beurteilung des Erfolges der Zellpassagierung Komplement-Bindungs-Reaktion (KBR): Theorie und Demonstration Nachweis von Rotavirus-Antigen in einer Stuhlprobe mittels Enzyme Immuno Assay (EIA) EBV-Serostatus: Auswertung des IFT am Fluoreszenzmikroskop Optional: Übung Fallvorstellungen Mittwoch, 24.05.2017: Mikroskopierübungen mit in vitro gezüchteten lebenden Zellen Kurzzeit-Kultur (Shell Vial Assay) zur fluoreszenzmikroskopischen Früherkennung therapierelevanter Virus-Infektionen: Theorie und Demonstration Polio-Neutralisationstest: Theorie und Demonstration EBV-Serostatus: Auswertung des IFT am Fluoreszenzmikroskop Optional: Übung Fallvorstellungen -4- Montag, 29.05.2017: Direktnachweis viraler Erreger mittels der Transmissions-ElektronenMikroskopie: Theorie und Demonstration Bestätigender Nachweis von Antikörpern mittels Immuno-Blot oder WesternBlot (WB) Dienstag, 30. 05. 2017: Molekulardiagnostik (Gel-PCR) Molekulardiagnostik (Seq., Resistenz) Mittwoch, 31.05.2017: Molekulardiagnostik (Fortsetzung Gel-PCR) Molekulardiagnostik (real-time PCR) Donnerstag, 01.06.2017: Klinische Virologie: Übungen für Befundinterpretation -5- Montag, 22.05.2017: Mikroskopierübungen mit in vitro gezüchteten lebenden Zellen Viren sind grundsätzlich von biochemischen Leistungen eines geeigneten Wirtsorganismus abhängig. Die Züchtung und Vermehrung von humanpathogenen Viren erfordert entweder ein lebendes Tier, einen funktionstüchtigen Gewebeverband oder eine Zellkultur. In der virologischen Routinediagnostik kommt heutzutage ausschließlich die Zellkultur zum Einsatz. Menschliche Zellen oder Zellen anderer Spezies (meistens Säugerarten), die unter weitgehend definierten Bedingungen gehalten und fortgezüchtet werden können, sind die hauptsächlichen Quellen der Komponenten für die Laboratoriumsdiagnostik virus-bedingter Erkrankungen. Zahlreiche humanpathogene Viren lassen sich durch Anzucht auf in vitro gezüchteten Zellen nachweisen (’Virusisolierung’). Virus-Wirt-Interaktionen können sehr präzise an in vitro kultivierten Zellen studiert werden. Große praktische Bedeutung besitzen Zellkulturverfahren bei der biologischen Charakterisierung von neu isolierten, noch nicht bekannten Viren und bei der Prüfung der Immunantwort gegenüber bereits bekannten Viren. Wachsen die Zellen überwiegend unter Anheftung an das Kulturgefäß, spricht man von adhärentem Wachstum, die Kultur nennt man Monolayer-Kultur. Nicht adhärent wachsende Zellen bilden Suspensions-Kulturen. In der virologischen Diagnostik haben sich zahlreiche etablierte Zell-Linien als geeignet erwiesen, welche wiederum je nach spezifischer Fragestellung einzeln oder in Kombination zum Einsatz kommen. Für die lichtmikroskopische Betrachtung von Kulturen lebender Zellen sind die auf Ihren Arbeitsplätzen vorhandenen Mikroskope ungeeignet. Hierfür sind sogenannte Umkehrmikroskope erforderlich, bei denen die Lichtquelle über dem Objekt-Tisch und die Objektiv-Linsen unter dem Objekt-Tisch angebracht sind. Einige dieser speziellen Mikroskope werden Ihnen zur Verfügung stehen. An jedem der Umkehrmikroskope finden Sie drei Zellkulturfläschchen mit frisch, d.h. am Vortag, angelegten Kulturen humaner Zellen: Fibroblasten (Monolayer-Kultur) Tumorzellen (Monolayer-Kultur) Lymphoide Zellen (Suspensions-Kultur) Betrachten Sie die Zellen mit dem Umkehrmikroskop und versuchen Sie, markante Unterschiede zu erkennen! Die drei Zellkulturen bleiben während der folgenden Kurstage uninfiziert und werden Ihnen an den folgenden Kurstagen zur Beobachtung des Wachstumsverhaltens vorgelegt. -6- Zellkultur: Passagierung einer Affennieren-Zellkultur durch Proteasebehandlung Je zwei benachbarten Kursteilnehmern wird ein Plastik-Gefäß mit adhärent wachsenden Affennierenzellen (Vero-Zelllinie) zur Verfügung gestellt, welche subkultiviert (passagiert, trypsiniert) werden sollen. Die Gefäße sind mit ungeraden Platznummern beschriftet. - Begutachten Sie Ihre Zellkultur zunächst makroskopisch: die den Zellrasen bedeckende Nährlösung (bestehend aus mehr als 30 Einzelkomponenten: Mineralien, Kohlenhydraten, Vitaminen, Antibiotika, fötalem Kälberserum und Phenolrot als pH-Indikator) sollte möglichst klar und blassrosa getönt sein. Trübung mit oder ohne gleichzeitige Farbabweichung wäre ein Indiz für kontaminierende Mikroorganismen (Pilze, Bakterien). Eine Farbabweichung ins Dunkelrot ist häufig bedingt durch einen zu niedrigen CO2-Partialdruck im Brutschrank und damit verbundener Alkalisierung des Nährmediums. Übersäuerung des Nährmediums mit Gelbfärbung tritt meist bei überalterten Zellkulturen auf. Außerhalb eines CO2-begasten Brutschrankes, u.a. auch im Kurssaal, müssen die Verschlusskappen der Kulturgefäße fest zugeschraubt sein, um einen für die Zellen lebensbedrohlichen pH-Anstieg zu vermeiden. Prüfen Sie mittels eines der Umkehrmikroskope Ihre Zellkultur auf etwa vorhandene Mikroorganismen und hinsichtlich Konfluenz des Monolayers. - Wenn Ihre Zellkultur alle geforderten Qualitätskriterien erfüllt, gießen Sie das Nährmedium möglichst vollständig in das Abwurfgefäß. Die Befürchtung, hierbei die Zellen zu verlieren ist unbegründet, weil diese sehr fest an der Plastikschicht haften. - Schütten Sie Waschpuffer, d.h. den gesamten Inhalt eines Glasröhrchens ‚P’, in die Zellkulturflasche, verschließen Sie diese und schwenken Sie die Flüssigkeit auf der Zellschicht (maximal 1 Minute), dann gießen Sie alles in das Abwurfgefäß. - Schütten Sie Trypsinlösung, d.h. den gesamten Inhalt eines Glasröhrchens ‚T’ in die Kulturflasche, schwenken für einige Sekunden, entfernen diesmal aber nur soviel von der Flüssigkeit, dass der Zellrasen noch gut benetzt bleibt (ca. 1 ml). Innerhalb mehrerer Minuten lösen sich die einzelnen Zellen zunächst von den benachbarten Zellen, runden sich ab, wobei sie anfangs noch Kontakt zur Plastikfläche behalten. Schließlich verlieren sie auch diesen Kontakt und flotieren einzeln und gruppenweise in der trypsinhaltigen Flüssigkeit. Beobachten Sie diesen Vorgang makroskopisch (verstärkte Lichtbrechung des Zellrasens bei -7- Abkugelung der Zellen und Trübung der Trypsinlösung durch flotierende Zellen und Zellgruppen) und mikroskopisch am Umkehrmikroskop. - Nun fügen Sie den gesamten Inhalt (10 ml) eines Glasröhrchens ‚M’ mit frischem Nährmedium hinzu, resuspendieren durch mehrmaliges leichtes Schwenken die abgelösten Zellen und überführen mittels einer sterilen Pipette 5 ml der Zellsuspension in ein leeres zweites Zellkulturgefäß, welches mit einer geraden Platznummer beschriftet ist. In dem ‚alten’ und in dem ‚neuen’ Kulturgefäß dürften sich jetzt in etwa gleich viele Zellen befinden. Verschließen Sie beide Flaschen fest und legen Sie sie wieder auf Ihren Arbeitsplatz. - Die Kulturflaschen werden (nach vorheriger Lockerung der Verschlusskappen) im Viruslabor in Brutschränken mit einer definierten CO2-Atmosphäre unter Wasserdampfsättigung inkubiert und Ihnen am folgenden Kurstag wieder übergeben. Bestimmung des Epstein-Barr-Virus (EBV)-Serostatus mittels des indirekten Immunfluoreszenztestes (IFT): Reaktionsstart durch Inkubation des Probandenserums mit EBV-tragenden Lymphomzellen Die Erstmanifestation einer Epstein-Barr-Virus-Infektion verläuft bei weitem nicht immer nach dem stereotypen Muster eines Pfeiffer’schen Drüsenfiebers. Andererseits manifestieren sich akute Erkrankungen sowohl infektiöser als auch nichtinfektiöser Ursache nicht selten unter dem klassischen klinischen Bild einer ‚Mononukleose’. Da mit zunehmendem Alter der Anteil der für eine EBVPrimärinfektion noch empfänglichen Individuen abnimmt, muss bei Erwachsenen grundsätzlich jede EBV-Mononukleose-Verdachtsdiagnose äußerst kritisch hinterfragt werden. Beispielsweise ist eine Erstmanifestation der HIV-Infektion klinisch nicht von der ‚typischen’ EBV-Primärinfektion zu unterscheiden. Die virologische Labordiagnostik der EBV-Infektion basiert im wesentlichen auf drei Parametern: IgG und IgM gegen das sog. virale Capsid-Antigen (VCA) und IgG gegen EBNA1, ein virus-codiertes regulatorisches Protein, welches im Kern von EBVGenom-tragenden Zellen lokalisiert ist. An den folgenden Kurstagen wird auf die Interpretation von EBV-Testergebnissen näher eingegangen werden, ebenso auf weitere spezielle Untersuchungsmethoden zur Abklärung problematischer Fälle. -8- Am heutigen Kurstag sollen Seren auf die Präsenz von Anti-EBV-VCA-IgG auf die folgende Weise getestet werden: Von einem Burkitt-Lymphom abstammende permanent wachsende Zellen (P3HR1Zelllinie) enthalten das EBV-Genom, zwischen 1-10 % dieser Zellen exprimieren virale Strukturproteine, u.a. auch in großen Mengen das sogenannte VCA. Die Zellen wachsen nicht adhärent und können durch einfaches Ausdünnen mit Nährmedium passagiert werden. Die ständig nachwachsenden Zellen, die eine hervorragende Antigenquelle für Antikörper-Nachweise darstellen, wurden zuvor im Viruslabor vorsichtig abzentrifugiert, in isotonischem Puffer resuspendiert und auf Objektträgern mit Feldereinteilung ausgestrichen. Nach Lufttrocknung wurden die Zellen mit Aceton behandelt zur Fixierung und Steigerung der Durchlässigkeit für Antikörper-Moleküle. Pro Bankreihe gibt es ein mit Feldereinteilung versehenen Objektträger. Entnehmen Sie aus dem beschrifteten Reaktionsgefäß mit der Deckelbeschriftung: EBV, 25 µl des bereits 1:10 verdünnten Probandenserums und bringen diese vorsichtig (ohne die Zellschicht zu zerkratzen) auf ein Feld des Objektträgers. Notieren Sie die Nummer des Objektträgers und die Nummer des Feldes. Wenn alle ein Feld des Objektträgers beschickt haben, wird dieser in einer Plastikbox mit feuchtem Papier verschlossen und bei Raumtemperatur 30 Minuten inkubiert. - Nach Ablauf der Inkubationszeit werden die Objektträger in Puffer kurz gewaschen, dann wird auf die einzelnen Felder 20 µl einer Konjugat-Lösung gegeben. Diese enthält Ziegen-Antikörper, die gegen menschliches IgG gerichtet sind und außerdem mit einem Fluoreszenzfarbstoff chemisch gekoppelt sind. Ein mit ’’K’’ beschriftetes Reaktionsgefäß steht für je eine Bankreihe zur Verfügung. - Nach 30 Minuten Inkubation werden die Objektträger für 5-10 Minuten in Puffer gewaschen und getrocknet. An den folgenden Kurstagen sollen Sie den IFT am Fluoreszenzmikroskop auswerten. -9- Dienstag, 23.05.2017: Mikroskopierübungen mit in vitro gezüchteten lebenden Zellen Zellkultur: Beurteilung des Erfolges der Zellpassagierung Am Vortag hatten Sie eine Monolayer-Kultur von Vero-Zellen durch Trypsinbehandlung vom Plastikboden der Kulturflasche abgelöst und auf zwei Kulturflaschen verteilt. Nach einer derartigen Prozedur sind die Zellen bestrebt, wieder Kontakt mit der festen Unterlage aufzunehmen und durch Zellteilung noch freie Stellen des Gefäßbodens zu besiedeln. - Prüfen Sie den Zustand Ihrer frisch 1:2 passagierten Zellkulturen makroskopisch und mikroskopisch (Umkehrmikroskop). EBV-Serostatus: Auswertung des IFT am Fluoreszenzmikroskop Nachweis von Rotavirus-Antigen in einer Stuhlprobe mittels Enzyme Immuno Assay (EIA) Der Enzyme Immuno Assay (auch Enzyme Linked Immuno Sorbent Assay ‚ELISA’) wird in der virologischen Diagnostik in vielfältigen Variationen zum Nachweis von Antikörpern (auch klassenspezifisch) und in den letzten Jahren auch mehr und mehr zur Erkennung viraler Antigene eingesetzt. Am Beispiel des mittlerweile recht gut bewährten Rotavirus-Testes soll das Prinzip des EIA verdeutlicht werden. - Stuhlvorbehandlung (erfolgte bereits im Virus-Labor): eine erbsengroße Menge des Stuhls wurde in 6 ml Puffer aufgeschwemmt, mit ca. 20 Glaskügelchen in einem geschlossenen Gefäß 5 Minuten lang kräftig geschüttelt. Anschließend wurden die groben Stuhlbestandteile mitsamt den Glaskügelchen in ein Zentrifugenröhrchen überführt und abzentrifugiert. Der weitgehend klare Überstand wurde vorsichtig abgenommen und soll von Ihnen in den VirusAntigen-EIA eingesetzt werden. - Sie erhalten in einem beschriften Reaktionsgefäß mit der Deckelbeschriftung: Rota, eine kleine Menge einer verdächtigen, bereits vorbehandelten, Stuhlprobe. Außerdem steht für zwei benachbarte Arbeitsplätze folgendes bereit: je ein Reaktionsgefäß mit einer bekannt positiven und negativen Probe, beschriftet mit - 10 - (+) oder (-), ein Reaktionsgefäß mit einer Lösung von Peroxidase-gekoppelten Anti-Rotavirus-Antikörpern (leicht rötliche Flüssigkeit; Beschriftung: ’’K’’ wie Konjugat), ein Reaktionsgefäß mit farbloser Substrat-Lösung (beschriftet mit ’’S’’), einen Teil einer Mikrotiterplatte mit 4 Vertiefungen (sind beschichtet mit Antikörpern gegen humane Rotaviren), ein Waschgefäß und ein Papierhandtuch. - Füllen Sie 50 µl der positiven und negativen Kontrollprobe in die jeweils beschrifteten Vertiefungen der Mikrotiterplatte und 50 µl der zu untersuchenden Proben in die übrigen beiden Vertiefungen. - Dann pipettieren Sie in alle Näpfchen 50 µl der Konjugat-Lösung ’’K’’. - Nach ca. 45 Minuten entfernen Sie den gesamten Inhalt der Näpfchen mit einer frischen Pipettenspitze und tauchen die Mikrotiterplatte mittels einer Pinzette in das mit Wasser gefüllte Waschgefäß. Nach 5 Minuten schütteln Sie das Wasser aus den Vertiefungen und legen die Mikrotiterplatte umgekehrt auf das Papierhandtuch um das restliche Wasser weitgehend zu entfernen. - Nun füllen Sie in alle Näpfchen je 50 µl Substratlösung. Nach wenigen Sekunden sollte in der positiven Kontrolle eine deutliche Farbentwicklung erkennbar sein, wohingegen die negative Kontrolle farblos bleiben muss. Entscheiden Sie durch optischen Vergleich mit den Kontroll-Näpfchen, ob die von Ihnen untersuchte Patientenstuhlprobe Rotaviren enthalten könnte. Protokollieren Sie Ihr Ergebnis. Weitere Anwendungen des EIA in diversen Varianten in der virologischen Diagnostik: Zum Erreger-Nachweis eignet sich der EIA, wenn in der Untersuchungsprobe mit hohen Virus-Konzentrationen zu rechnen ist. Routinemäßig wird am hiesigen Institut der Antigen-EIA außerdem noch eingesetzt bei: Adenoviren; Astroviren; Hepatitis B Virus (HBV): ‚Surface’ Antigen (HBsAg) und ‚Excreted’ Antigen (HBeAg); Humanes Immundefizienz-Virus (HIV): Capsid-Protein p24; Influenza-Viren; Parainfluenza-Viren; Respiratory Syncytial Virus (RSV). Sehr viel zahlreichere Anwendungsmöglichkeiten des EIA in der virologischen Diagnostik gibt es beim Nachweis von Antikörpern gegen Viren. In der hiesigen VirusDiagnostik werden z.Z. routinemäßig Antikörper (meist getrennt nach ImmunglobulinKlassen) gegen die folgenden Viren bzw. Virus-Proteine durchgeführt: CytomegalieVirus (CMV); EBV (Nukleäres Antigen EBNA); Frühsommer-MeningoenzephalitisVirus (FSME); Herpes simplex Viren (HSV); Hepatitis A Virus (HAV); HBV: Surface Antigen (Anti-HBs), Core Antigen (Anti-HBc), Excreted Antigen (Anti-HBe); Hepatitis C Virus (HCV); Hepatitis D Virus (HDV); Hepatitis E Virus (HEV); HIV (kombinierter Antikörper- und Antigen-Test); Masern-Virus; Mumps-Virus; Parvovirus B19; RötelnVirus; und Varicella Zoster Virus (VZV). - 11 - Komplement-Bindungs-Reaktion (KBR) zum Nachweis virus-spezifischer Antikörper: Theorie und Demonstration Wie bei dem Hämagglutinations-Hemm-Test (HHT) dienen auch in der Komplement-Bindungs-Reaktion (KBR) Erythrozyten als Indikatoren für AntigenAntikörper-Reaktionen. Im Gegensatz zum HHT müssen jedoch bei der KBR die Erythrozyten (meist vom Schaf) einer speziellen Vorbehandlung unterzogen werden (’’Sensibilisierung’’): Serum eines mit Schaf-Erythrozyten immunisierten Kaninchens wird in vitro mit gewaschenen Schaf-Erythrozyten inkubiert, nachdem zuvor das in Serum natürlicherweise vorhandene Komplement durch Hitzebehandlung (i.d.R. 30 Minuten bei 56°C) inaktiviert worden ist. Die mit Kaninchen-Antikörpern garnierten Schaf-Erythrozyten werden rasch zerstört, sobald sie mit aktivem Komplement (z.B. aus Meerschweinchen-Serum) in Kontakt kommen. Diese Antikörper/Komplementvermittelte Zytolyse ist ohne optische Hilfsmittel makroskopisch erkennbar (als Hämolyse) und eignet sich bei entsprechender Versuchsanordnung daher hervorragend als indirektes Indikatorsystem für Antigen-gebundene Antikörpermoleküle (hauptsächlich IgM, IgG1, IgG3). In der virologischen Labordiagnostik wird die KBR in folgender Weise durchgeführt: Das zu untersuchende Patientenserum (oder Liquor) wird zur Inaktivierung des Komplementes erhitzt. In Mikrotiterplatten werden Verdünnungen hergestellt (analog zu HHT). Zu den Serumverdünnungen werden definierte (in Vorversuchen ermittelte optimale) Mengen bekannter Viren (oder anderer Antigene) sowie Komplement (optimierte Verdünnung eines Meerschweinchenserums) hinzugefügt. Während einer mehrstündigen Inkubation erfolgt (unbemerkt vom Untersucher) die Bindung mutmaßlich vorhandener, zur Komplement-Aktivierung befähigter, Antikörpermoleküle an das zugesetzte Antigen, daraufhin die Bindung der Meerschweinchen-Komplementfaktoren an die entstandenen Immunkomplexe und schlussendlich die Erschöpfung der Komplement-Aktivität. Tropft man nun in die Näpfchen der Mikrotiterplatte sensibilisierte Schaf-Erythrozyten, werden sie nicht lysiert und bilden wie beim HHT ein kreis- oder ringförmiges Sediment (’’Knopf’’). In den Reaktionsansätzen, in denen die entsprechenden virus-spezifischen und gleichzeitig komplement-bindenden Antikörper nicht ausreichend oder überhaupt nicht vorhanden sind, wird das zugesetzte Meerschweinchen-Komplement die Lyse der sensibilisierten Erythrozyten bewirken sodass die Knopfbildung ausbleibt. Analog zum HHT kann man auch in der KBR einen Antikörper-Titer bestimmen. Es ist allerdings sehr wichtig, folgendes zu beachten: Während der Titer im HHT meistens sehr gut mit Immunität gegen den jeweiligen Erreger korreliert, eignet sich die KBR nicht zur Bestimmung der Immunitätslage, da häufig bereits wenige Monate nach der Infektion die Menge der Komplement-bindenden Antikörper unter die Nachweisgrenze der Routine-KBR absinkt. Die KBR ist hingegen sehr gut geeignet zur Erkennung einer frischen oder auch einer reaktivierten Infektion, insbesondere wenn die AntikörperTiter im zeitlichen Verlauf bestimmt werden können. Am hiesigen Institut werden Komplement-Bindungs-Reaktionen routinemäßig durchgeführt zum Nachweis von Antikörpern gegen Adenoviren, Cytomegalovirus, Enteroviren, Herpes-simplex-Viren, Influenza-Viren, Lymphozytäres ChoriomeningitisVirus, Masern-Virus, Mumps-Virus, Parainfluenza-Viren, Respiratory Syncytial Virus und Varicella-Zoster-Virus. - 12 - Mittwoch, 24.05.2017: Mikroskopierübungen mit in vitro gezüchteten lebenden Zellen EBV-Serostatus: Auswertung des IFT am Fluoreszenzmikroskop Polio-Neutralisationstest: Theorie und Demonstration Bei der hier vorgestellten Version des NT wird geprüft, ob im Serum der Testperson Antikörper vorhanden sind, die die Infektiosität definierter Testviren für eine infizierbare (empfängliche, suszeptible) Zellkultur eliminieren (‚neutralisieren’). Da bei diesem Verfahren nicht nur die Fähigkeit zur Bindung an das zugehörige Antigen abgefragt wird, sondern darüber hinaus v.a. die biologische Wirkung des individuellen Antikörper-Repertoires des Probanden erfasst wird, hat der NT eine herausragende Bedeutung bei der Prüfung der Immunität gegenüber manchen Viren. Der NT ist zwar der sog. „Gold-Standard“ um eine Immunität gegenüber eines Virus zu testen, jedoch spielt er in der Routine-Diagnostik heute keine Rolle mehr, da hier der Nachweis von Antikörpern von andere, weniger aufwändigen Methoden abgelöst wurde. Eine wichtige Rolle kommt dem NT jedoch noch in wissenschaftlichen Untersuchungen und in der Prüfung von Impfstoffen im Rahmen von Studien zu. Da der NT in der heutigen Virusdiagnostik kaum noch eine Rolle spielt, soll er hier nur theoretisch vorgestellt und demonstriert werden. Kurzzeit-Kultur (Shell Vial Assay) zur fluoreszenzmikroskopischen Früherkennung therapierelevanter Virus-Infektionen: Theorie und Demonstration Bei manchen Virusarten (beispielsweise Cytomegalovirus) kann ein klassischer Virusisolierungsversuch auf Zellkulturen u.U. einige Wochen dauern. Bei klinischem Verdacht auf eine erregerbedingte Erkrankung ist jedoch häufig eine rasche labormedizinische Erreger-Identifizierung unabdingbar. Durch Kombination von klassischer auf Zellbiologie basierender und immunchemischer Technologie ist es möglich, auch extrem langsam replizierende Viren innerhalb von Stunden zu detektieren. Eine Kurzzeit-Kultur (der sog. Shell Vial Assay) wird in der virologischen Labordiagnostik in der folgenden Weise durchgeführt: Empfängliche Zellen werden auf Deckgläschen angezüchtet und mit dem verdächtigen Untersuchungsmaterial beimpft. Etwa vorhandene infektionstüchtige Viren dringen in jeweils eine einzelne der ca. 100.000 Zellen ein und bewirken bereits unmittelbar danach die Expression virus-codierter Nicht-Struktur-Proteine mit meist regulatorischer Funktion für den Replikationsvorgang. Mittels spezifischer, fluoreszenzmarkierter Antikörper (meist monoklonal) werden die von Virus befallenen Zellen unter dem Fluoreszenzmikroskop sichtbar. - 13 - Eine Abwandlung der hier beschriebenen Technologie ist der CMV-pp65Antigen-Nachweis: Aus ungerinnbar gemachtem Blut werden mittels Dichtegradienten Leukozyten präpariert, angereichert, auf Objektträgern ausgestrichen und fixiert. Mit spezifischem Antikörper wird fluoreszenzmikroskopisch die Ablagerung von CMVspezifischem Protein in den Blutzellen des Patienten detektiert. Diese Untersuchungsverfahren sind von großer Bedeutung bei der Betreuung von Immungeschwächten (v.a. Transplantat-Empfänger, HIV-Infizierte). - 14 - Montag, 29.05.2017: Methode: Direktnachweis viraler Erreger mittels Elektronenmikroskopie (EM) Theorie und Demonstration: Da die Größe aller bekannten Viren bekanntlich jenseits des Auflösungsvermögens von Lichtmikroskopen liegt, ist zum direkten Nachweis ein Elektronenmikroskop erforderlich. Sofern in dem klinischen Untersuchungsmaterial eine ausreichend hohe Partikelzahl pro Volumeneinheit besteht (>1 Million pro ml) kann die Elektronenmikroskopie in speziellen Fällen richtungweisend oder gar entscheidend für die Diagnose sein. Bei der Untersuchung extrazellulärer Viruspartikel genügt idR. ein verhältnismäßig rasches Präparations- bzw. Kontrastierungs-Verfahren, das sog. ’’Negative Staining’’: Ein Tröpfchen (5-10 µl) der mutmaßlich virus-haltigen Probe wird vorsichtig auf ein Kupfernetzchen, welches mit einer hauchdünnen Kohle- oder Kunststoff-Membran bespannt ist, aufgetragen. Viruspartikel werden elektrostatisch an die Membran gezogen. Nach einigen Minuten wird die Flüssigkeit mit Filterpapier abgesaugt, eine Schwermetallsalz-Lösung aufgetropft und letztere nach 1-2 Minuten wieder abgesaugt. Die auf der Membran angetrockneten Salzreste stellen nunmehr einen negativen Abdruck der ansonsten nicht elektronen-dichten Virusstrukturen dar. Die Identifizierung der jeweiligen Viren erfolgt v.a. nach Größe, Kapsid-Form, Hülle. Nach den morphologischen Kriterien lässt sich i.d.R. eine Diagnose hinsichtlich der Familienzugehörigkeit des Erregers stellen. Zur Art-Bestimmung sind meistens weitere Informationen oder Untersuchungen erforderlich. Methode: Western Blot/Immunoblot zum Nachweis von Antikörpern in humanen Seren VERSUCH: Bestimmung von Hepatitis C Virus (HCV)-spezifischen Antikörpern in humanen Seren mittels Western Blot/Immunoblot. Bei der Hepatitis C Virus Infektion unterscheidet man zwischen der akuten und der chronischen Infektion. Die akute Phase, also das Stadium kurz nach der Infektion, verläuft in den meisten Fällen asymptomatisch. In weniger als 25% der Patienten tritt ein Ikterus während der akuten HCV Infektion auf. In ca. 20% aller Betroffenen heilt die HCV Infektion nach der akuten Phase aus, die verbleibenden 80% entwickeln eine chronische Infektion, d.h. sie bleiben lebenslang HCV-RNA positiv. Bei Verdacht auf eine Infektion mit dem Hepatitis C Virus gibt es verschiedene Möglichkeiten die Infektion nachzuweisen. Für das Screening führt man den Nachweis HCVspezifischer Antikörper durch. Dies erfolgt mittels ELISA. Allerdings gibt es bei diesem Verfahren nur die Information, ob das getestete Patienten-Serum im HCV-ELISA reagierte oder nicht. Etwas differenzierter ist der HCV-Blot. Bei diesem Verfahren kann man zusätzlich sehen gegen welche HCV-Proteine Antikörper nachweisbar sind. Der gleichzeitige Nachweis - 15 - mehrerer verschiedener HCV-spezifischer Antikörper im HCV-Immunoblot schließt eine unspezifische Reaktion oder eine Kreuzreaktion weitestgehend aus. Am heutigen Kurstag sollen vorbereitete Immunoblot-Streifen (ein Streifen pro 2 Studenten) auf das Vorhandensein verschiedener HCV-spezifischer Antikörper getestet werden: Um das Risiko einer HCV-Infektion der Studenten durch die Serum-Proben auszuschalten wurden einige Schritte des Immunoblots vorher im diagnostischen Labor des Institutes für Virologie durchgeführt. Die potentiell infektiösen Seren wurden vor ihrer Verwendung inaktiviert, so dass keine Infektionsgefahr mehr besteht! Bei dem ausgeteilten Immunoblot-Streifen handelt es sich um eine Nylonmembran, auf welche mehrere rekombinante HCV-spezifische Antigene getrennt voneinander aufgetragen wurden. Die HCV-Proteine binden unspezifisch an die Nylonmembran. Anschließend wurde die Membran mit einem Blocking Puffer behandelt. Dieser Puffer enthält Substanzen, die alle noch freien Stellen für eine unspezifische Bindung von Proteinen an die Membran besetzen. Das Besetzen aller Protein-Bindungsstellen ist wichtig, da ansonsten Proteine aus dem zu testenden Serum (u. a. Antikörper) unspezifisch an die Nylonmembran binden würden. Der Blot-Streifen ist nach dem Blocken vollständig mit Blocking-Substanz überzogen, lediglich unterbrochen von den vorher in regelmäßigen Abständen aufgetragenen HCV-Antigenen. In diesem Stadium erscheint die Nylon-Membran immer noch durchgehend weiß. Im diagnostischen Labor des Institutes für Virologie wurden die Immunoblot-Streifen mit in Puffer verdünnten humanen Seren für 16 Stunden inkubiert. Nach der Inkubation wurden die Seren abpipettiert und die Blot-Streifen 2 mal für je 10 Minuten mit einem Puffer (TBS-T; Tris buffered saline- Tween 20) gewaschen und anschließend getrocknet. In diesem Zustand befinden sich die von Ihnen zu untersuchenden HCV-Blot-Streifen. Die Oberseite der Teststreifen ist markiert, dies dient gleichzeitig als Orientierung für die spätere Auswertung des HCV-Immunoblots. Versuchsablauf: 1) Arbeitsmaterialien: An jedem Arbeitsplatz mit einer geraden Nummer befinden sich 4 verschiedene Reagenzien, und ein Blot-Streifen für die Durchführung des HCVImmunoblots. Außerdem finden Sie auf jeder Arbeitsbank 1 Pinzette, mehrere Plastikpipetten (1 oder 2 ml) und mehrere Lagen Zellstoff. a) Detektions-Antikörper: Dabei handelt es sich um eine Lösung, die anti-human Antikörper enthält. Dieser Antikörper ist mit dem Enzym „Alkalische Phosphatase“ (AP) gekoppelt. Etwas mehr als 1 ml dieser Lösung befindet sich in einem 2 ml Reaktionsgefäß, welches mit „Ak“ beschriftet ist. - 16 - b) Waschpuffer: Ungefähr 5 ml TBS-T Puffer befinden sich in einem 15 ml Gefäß, das mit „TBS“ beschriftet ist. c) Substrat: Die Substratlösung enthält (BCIP/NBT). Die ursprünglich farblose Substratlösung wird durch die Alkalische Phosphatase gespalten. Eines der Spaltprodukte, das nun eine dunkle violette Farbe annimmt verbleibt an der AP. Etwas mehr als 1 ml dieser Lösung befindet sich in einem 2 ml Reaktionsgefäß, welches mit „Sub“ beschriftet ist. d) Stopp-Lösung: Die Lösung enthält 0,1M Schwefelsäure, welche jegliche Aktivität der AP beendet. Etwas mehr als 1 ml dieser Lösung befindet sich in einem 2 ml Reaktionsgefäß, welches mit „Stop“ beschriftet ist. 2) Prozedere: a) In jeder Reihe à 6 Studenten befindet sich eine Schale mit 3 bzw. 4 länglichen Vertiefungen. Legen Sie ihren Blot-Streifen mit der Pinzette in eine Vertiefung der Schale, die Markierung auf dem Streifen („O“, „X“ oder „-„) soll sich dabei am oberen Ende der entsprechend markierten Vertiefung befinden. Wichtig: Fassen Sie die Blot-Streifen nur mit der Pinzette (nicht mit den Händen) am oberen Ende an! b) Jede Zweiergruppe pipettiert je 1 ml des Detektions-Antikörpers (Ak) so auf ihren TestStreifen, dass er vollständig mit der Lösung bedeckt ist. c) Inkubieren Sie den Versuchsansatz 1 Std. bei Raumtemperatur. d) Nach Beendigung der Inkubation entfernen Sie die Antikörper-Lösung mittels Pipette. e) Waschen Sie die Teststreifen 5 Minuten durch Zugabe von je 1 ml Waschpuffer (TBST) mit einer neuen Pipette. Schwenken Sie die Blot-Schale mehrfach in dieser Zeit. Anschließend wird die Waschlösung mit der gleichen Pipette abpipettiert. Dieser Vorgang muss noch 2 mal mit jeweils einer neuen Pipette wiederholt werden. f) Mit einer neuen Pipette geben Sie je 1 ml der Substrat-Lösung (Sub) auf die Teststreifen und inkubieren den Ansatz für 15 Minuten bei Raumtemperatur. Schwenken Sie die Blot-Schale in dieser Zeit mehrfach alle 2 Minuten. Während der Inkubation sollte mindestens eine dunkle Bande erkennbar werden. Entfernen Sie die Substrat-Lösung durch abpipettieren mit der gleichen Pipette. g) Stoppen Sie die Reaktion durch Zugabe von 1 ml Stopp-Lösung (Stop) mit einer neuen Pipette. Inkubieren Sie die Stopp-Lösung für 10 Minuten. Schwenken Sie die BlotSchale in dieser Zeit mehrfach alle 2 Minuten. h) Entfernen Sie die Stopp-Lösung. Greifen Sie den Teststreifen mit der Pinzette am oberen Ende und lassen Sie ihn in der Blot-Schale abtropfen. Anschließend platzieren Sie den Streifen auf einer Lage Zellstoff. 3) Auswertung: Auf jedem Teststreifen sollte am unteren Ende (gegenüber der Markierung) eine Bande sichtbar geworden sein. Dabei handelt es sich um eine Test-Kontrolle, die nicht HCVspezifisch ist. Wenn diese Bande nicht detektiert wird ist der Test nicht auswertbar und darf nicht diagnostisch verwendet werden. Bei einigen Studenten wird nur diese Kontrollbande sichtbar sein, d. h. das von ihnen untersuchte Serum enthielt keine HCV-spezifischen Antikörper. - 17 - Auf einigen Teststreifen wird nach der Detektion noch eine weitere Bande, oberhalb der Kontroll-Bande, zu erkennen sein, während bei den restlichen HCV-Blots insgesamt 4 Banden sichtbar sein sollten. Bei den Seren mit nur einer HCV-spezifischen Bande könnte es sich um eine beginnende Antikörper-Reaktion in der akuten Phase der HCV-Infektion handeln. Bei den Proben mit 3 HCV-spezifischen Banden ist die Immunantwort schon ausgeprägter. Hierbei könnte es sich um eine akute, eine chronische oder eine ausgeheilte HCV-Infektion handeln. Bei dem Nachweis von einer oder mehrerer HCV-spezifischer Banden ein NukleinsäureNachweis (z.B. PCR) durchgeführt werden, um zu ermitteln, ob es sich um eine akute, chronische oder durchgemachte Infektion handelt. - 18 - Dienstag, 30.05.2017 u. Mi. 31.05.2017 Molekularbiologische Methoden in der Virologie: EINLEITUNG In diesem Praktikumsteil sollen an zwei Kurstagen grundlegende molekularbiologische Methoden gelehrt werden, die in der diagnostischen Virologie täglich eingesetzt werden. Basale Labormethoden wie Polymerasekettenreaktion (Polymerase Chain Reaction, PCR), Nukleinsäure Sequenzierung und Echtzeit (Real time) PCR, sowie Sequenzanalysen sollen anhand von Beispielen aus der Labordiagnostik des Hepatitis C Virus (HCV) erläutert werden. Am ersten molekularbiologischen Kurstag werden sie eine „herkömmliche“ nicht quantitative PCR ansetzen, womit der Qualitative Nachweis von HCV RNA gelingen kann sowie HCVGenombereiche für Sequenzanalysen amplifiziert werden. Die Auswertung dieser PCR wird am zweiten Kurstag durchgeführt, weil einzelne Arbeitsschritte länger als ein Kurstag dauert. Außerdem werden Sie eine Real-Time Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion ansetzen, welche neben dem qualitativen Nachweis von Virusgenom auch für die Quantifizierung von Viren zum Beispiel im Serum benutzt werden kann. - 19 - HINTERGRUNDWISSEN Hepatitis C Virus: Es gibt sechs etablierte HCV Genoytpen mit unterschiedlicher geographischer Verteilung (ein siebter wurde vor kurzem beschrieben). Quelle: Simmonds P, J Gen Virol. 2004. Für die Behandlung des Hepatitis C Virus ist es sehr wichtig, den HCV Genotypen zu kennen, da verschiedene Genotypen unterschiedliche gut auf die bisherige Standardtherapie mit pegyliertem Interferon und Ribavirin ansprechen und diese Medikamente viele Nebenwirkungen haben können. Deshalb hängt oft auch die Behandlungsdauer vom HCV Genotypen ab. Methode: Aufreinigung der viralen RNA aus Patientenmaterial Vor der Durchführung der PCR ist es notwendig, die virale RNA oder DNA aufzureinigen. Das klinische Material würde zum einen die PCR hemmen, zum anderen liegt das virale Genom nicht frei vor, sondern ist von viralen Proteinen geschützt (z.B. dem Kapsid). Zur Aufreinigung können verschiedenste Methoden benutzt werden. Für diesen Kurs erhalten Sie bereits aufgereinigte RNA/DNA, die mit einem kommerziellen Kit (siehe Abbildung) aus der Patientenprobe extrahiert wurde. - 20 - Abbildung: Ablauf der RNA/DNA-Extraktion ( modifiziert von www.qiagen.com) Das Prinzip dieses Extraktionskits wurde bereits 1990 von Boom et al. publiziert (Journal of Clinical Microbiology, 1990). Zuerst wird die Probe mit einem Lyse-Puffer versetzt, der die virale Struktur aufbricht. Hierdurch wird das virale Genom frei zugänglich und die Probe ist nicht mehr infektiös. In diesem Puffer liegen chaotrope Salze in hoher Konzentration vor, in deren Gegenwart die virale RNA/DNA an Silikapartikel gebunden werden kann. Die Silikapartikel liegen in den säulenbasierte Verfahren als Membran in einer Säule vor. Durch die Membran kann die lysierte Probe mittels Zentrifugation gepresst werden, wobei die RNA/DNA an die Membran bindet. Nach mehrfachem Waschen mit Ethanolhaltigen Puffern wird die virale RNA/DNA schließlich von der Silikamembran in der Säule gelöst. Methode: Polymerasekettenreaktion (PCR) Die Polymerasekettenreaktion (PCR) dient der automatisierten Amplifikation von DNAFragmenten. Das Prinzip wurde 1983 durch Kary Mullis entwickelt. Hierfür erhielt er 1993 den Nobelpreis für Chemie. Die Vermehrung einer DNA-Matrize erfolgt zyklisch, indem zunächst die doppelsträngige DNA in einzelsträngige DNA bei 94 °C denaturiert wird. Daraufhin können bei niedrigeren Temperaturen (zwischen 50-60 °C) zwei kurze (20-25 Basen) Oligonukleotidprimer mit der Matrize hybridisieren. Anschließend erfolgt bei ca. 72 °C die Elongation der Primer vom 3’OH-Ende her mit Hilfe einer hitzestabilen Polymerase und freier Desoxynukleotide. Dies führt zur Komplementierung der Matrize in doppelsträngige DNA, welche der Ausgangsmatrize exakt gleicht. Bei jedem Durchlauf eines Zyklus verdoppelt sich somit das gewünschte Fragment. In einem so genannten Cycler findet eine automatisierte Wiederholung dieses Vorgangs statt, so dass die Anzahl der amplifizierten DNA exponentiell ansteigt. - 21 - Quelle: Wikipedia.org -Enzoklop Anmerkung zum Primerdesign und zur verwendeten Software: Primer (Oligonukleotide) die zur Amplifikation bestimmter Genabschnitte dienen, können anhand der Zielsequenz ausgewählt und mit verschiedenen Programmen (z.B. Oligo Calculator, s.u.) überprüft werden (z.B. Schmelztemperatur, mögliche Haarnadelstrukturen, sowie Selbst- und Heterodimerisierungen sind dabei zu berücksichtigen und zu Vermeiden). Allgemeine Regeln für das Primerdesign sind: eine Länge zwischen 20 und 30 nt, GC-Gehalt 40-60%, Schmelztemperatur zwischen 50 und 60°C. Es sollte zudem überprüft werden, dass der Primer spezifisch ist (z.B. über den Abgleich mit Sequenzen in GenBank oder anderen Datenbanken, über das BLAST Programm (siehe unten). Software Oligo Properties Calculator BLASTn Quelle/ Link http://www.basic.northwestern.edu/biotools/oligocalc.html http://www.ncbi.nlm.nih.gov/blast/ Methode: One-Step RT-PCR Wir benutzen eine Methode die aufgrund der besonderen Primer alle bekannten HCV Genotypen amplifizieren kann. Durch das Sequenzieren der PCR Produkte kann man schließlich Aussagen über den Genotyp einer positiven Probe machen. Die angewendete PCR (One-Step RT-PCR) ist eine modifizierte Form der PCR, da HCV als RNA Virus erst in DNA umgeschrieben werden muss, um in der PCR amplifiziert werden zu können. Hierfür benutzt man ein zweites Enzym: Reverse Transkriptase (RT). Man nennt das gemeinsame Durchführen in einem Reaktionsgefäß von RT und PCR auch One-Step RTPCR. - 22 - VERSUCH : One-Step RT-PCR zum Nachweis und Genotypsierung von HCV-RNA Alle Schritte sind mit Handschuhen durchzuführen! Dies ist wichtig, um Kontamination der Proben zu vermeiden (falsch-positive Ergebnisse) und die virale RNA vor dem Abbau durch ubiquitäre RNAsen zu schützen (falsch-negative Ergebnisse). RNAsen befinden sich u.a. auf der menschlichen Haut, Schweiß, Haaren usw. Die Durchführung der PCR erfolgt in 50 µl-Ansätzen. Dazu wird zunächst ein Mastermix erstellt, der alle Komponenten enthält (siehe Pipettierschema). Nach dem Vorlegen der aufgereinigten RNA/DNA aus der Patientenprobe wird der Mastermix zu den Ansätzen hinzupipettiert. Pipettierschema: Zur Vereinfachung werden Ihnen die unten stehenden einzelnen Reagenzien in zwei fertigen Sub Mastermixen gegeben. Diese werden auf Eis ausgegeben, um die Reverse Transkriptase Reaktion zu verlangsamen (dieses Enzym kann nicht reversibel blockiert werden). Die Zusammensetzung eines Reaktionsansatzes ist wie folgt: 50 µl Ansatz: Mix A (Gesamt: 20µL) Mix B (Gesamt: 25µL) PCR-Wasser Sense Primer: DM101*1 [10 µM] Antisense Primer: DM100*2 [10 µM] Enzym Mix aus Reverser Transkriptase und DNA Polymerase 2x Reaktionspuffer (enthält bereits 0.4 mM von jedem der vier dNTPs und 1.6 mM MgSO4) Template: HCV RNA aus Patienten Plasma Gesamt: 16 µl 1 µl 1 µl 2 µl 25 µl 5 µl 50 µl *1 DM101 5’-TTCTCRTATGAYACCCGCTGYTTTGA-3’ 2 * DM100 5’-TACCTVGTCATAGCCTCCGTGAA-3’ (Primersequenz nach Murphy et. al. JCM 2007) Anleitung: 1) Legen Sie 5 µL aufgereinigte RNA auf den Boden des 0.2 mL PCR-tube vor. 2) Pipettieren Sie 20 µL von Mix A 3) Pipettieren Sie 25 µL von Mix B 4) Verschließen Sie das PCR tube 5) Schreiben Sie Ihre Platznummer aus das Tube (bei mehreren Studenten pro Team stets die jeweils niedrigste) 6) Geben Sie das Tube dem Kursassistenten. - 23 - Die PCR-Reaktion wird vom Kurspersonal in einem Thermocycler durchgeführt. Für die Amplifikationen wird das folgende Temperaturprotokoll gewählt: PCR-Protokoll: Zeit [s] Temp. [°C] Zyklen Reverse Transkription 1800 50 1 Initiale Denaturierung (hier wird die RT inaktiviert und die Polymerase aktiviert, die bisher durch einen Antikörper blockiert war) 180 95 1 Denaturierung 15 95 Annealing 20 55 45x Elongation 40 68 Finale Elongation 120 68 1 Kühlung Pause 4 1 Nach der PCR wird von Ihnen eine Agarosegelelektrophorese durchgeführt, um zu prüfen, ob das gewünschte Amplifikat gebildet wurde. Methode: Agarose-Gelelektrophorese HINTERGUNDWISSEN Bei dieser molekularbiologischen Standardmethode werden DNA-Fragmente in einem elektrischen Feld der Größe nach aufgetrennt. Bedingung für die Wanderung der aufzutrennenden DNA zur Anode im Gleichstromfeld ist deren negative Gesamtladung, die durch gezielte Pufferbedingungen erhalten wird. Es besteht über einen weiten Größenbereich ein linearer Zusammenhang zwischen dem dekadischen Logarithmus des Molekulargewichtes einzelsträngiger, linearer DNA und ihrer Laufdistanz im Gel. Die Auftrennung ist u.a. beeinflussbar durch Pufferbedingungen, Agarosekonzentration und angelegter Feldstärke. Diese Methode wird unter anderem angewendet, um die erfolgreiche Amplifizierung von DNA in der PCR zu kontrollieren. Gemäß der Größe der aufgetragenen Fragmente wird hier ein 1,5-prozentiges Gel (100 bp Fragmentgröße) verwendet. Die Agarose wird in entsprechender Menge 1 x TBE-Puffer aufgekocht. Anschließend kann das Gel in eine entsprechende Form gegossen werden und aushärten. Die Probenbeladung erfolgt, indem der Probe final Gelbeladungspuffer (6x konzentriert) zugesetzt wird. Dieser hat die Aufgabe, die DNA in die Probentasche einsinken zu lassen. Als DNA-interkalierende Substanz ist dem Ladepuffer SYBR Green zugesetzt, wodurch die DNA unter UV-Anregung sichtbar gemacht wird. - 24 - VERSUCH Agarose-Gelelektrophorese der PCR Produkte der One-Step RT-PCR Gel: - - 100 ml TBE 1x 1,5 g / 1 % Roth Broad-Range Agarose (= 1,5%) Erhitzen in der Mikrowelle (ACHTUNG: SIEDEVERZUG MÖGLICH! NICHT DAS GEFÄSS MIT DER KOCHENDEN AGAROSE IN RICHTUNG DES EIGENEN KÖRPERS HALTEN! NICHT VON OBEN INS GEFÄSS SEHEN!) 10 µl PCR-Produkt + 2 µl 6x Loading Puffer; 5 µl 100 bp Ladder 250 V, 30 min Anschließend wird Ihr Gel unter UV Licht vom Kurspersonal fotografiert. Unten sehen Sie ein Beispiel Gelbild aus dem Labor. Ihr eigenes Bild kann sich je nach Fragmentgröße von diesem Beispiel in der Höhe der DNA Bande unterscheiden. Flankierend zu den Proben tragen Sie einen Marker (“DNA Ladder“) auf, der Ihnen erlaubt, die Größe der DNA Bande einzuordnen. Methode: Sequenzierung Die Sequenzierung der DNA erfolgt nach der Sanger-Kettenabbruchsynthese. Bei diesem Verfahren wird analog zur PCR der zu sequenzierende DNA-Einzelstrang nach Bindung eines spezifischen Primers durch eine Polymerase verlängert. Neben Desoxynukleotiden (dNTP) werden der Reaktion jedoch auch Didesoxynukleotide (ddNTP) beigefügt, welche keine 3’OH-Gruppe besitzen und nach deren Einbau die Synthese abbricht. In der Folge entstehen DNA-Fragmente unterschiedlicher Länge, die durch hochauflösende Gelelektrophorese aufgetrennt werden können. Anhand des Zeitpunktes, zu dem das gebildete Produkt mit einem fluoreszenzmarkierten ddNTP detektiert wird, lässt sich die Sequenz schlussfolgern. Mit Hilfe einer unterschiedlichen Fluoreszenzmarkierung der vier ddNTPs lässt sich das Verfahren auf die Verwendung eines einzigen Ansatzes reduzieren. - 25 - Es kann z.B. das ABI PRISM® Big Dye® Terminator Cycle Sequencing Ready Reaction Kit verwendet werden, welches alle benötigten Komponenten wie Puffer, Polymerase, dNTPs und ddNTPs als gebrauchsfertigen Reaktions-Mix (Big Dye®) enthält. Ein Beispiel für die genaue Zusammensetzung eines Sequenzieransatzes ist der Tabelle zu entnehmen. Reaktionsansatz Sequenzierung Komponente Wasser (Molekularbiologischer Standard) Menge [µL] Menge [µL] Minipräparation Maxipräpartion 4 4 Big Dye 2 2 Primer (5 µM) 2 2 Plasmid-DNA (0,5 -1 µg/µL) 2 3 Gesamtvolumen 10 11 ® Nach der Reaktion werden die Ansätze zunächst durch Gelfiltration (Sephadex) aufgereinigt und anschließend in einem Kapillarelektrophoresesequenzierautomaten aufgetrennt. - 26 - Sequenzierautomat ABI 3130 Methode: In-silico Sequenzanalyse Die NS5b Sequenz des HC-Virus aus der Patientenprobe kann nun mit Vergleichssequenzen aus GenBank (siehe oben) abgeglichen und so der Genotyp bestimmt werden. Es ist mit dem gleichen Verfahren auch möglich, einzelne Nukleinsäureaustausche (Mutationen) zu überprüfen, die z.B. eine Resistenz gegen antivirale Medikamente bewirken können. Die Sequenzanalyse erfolgt prinzipiell über zwei Wege: 1) Das Anfertigen sogenannter Alignments, in denen die erhaltene Sequenz an Sequenzen bekannter Referenzviren ausgerichtet wird und die Erstellung eines phylogenetischen Baums, der die Verwandschaftsverhältnisse der von Ihnen bestimmten Sequenz graphisch darstellt. 2) Der Abgleich der erhaltenen Sequenz mit den öffentlichen Datenbanken (GenBank), ein sogenannter Blast. Aufgrund mangelndem Internetzugang an Ihrem Arbeitsplatz wird dies nur vom Kursleiter durchgeführt und gemeinsam besprochen. Hier können neben der Bestimmung des viralen Genotyps auch Resistenzmutationen festgestellt werden. M Nach klicken von "Subtype" erfolgt eine farbkodierte graphische Darstellung des im BLAST (also dem Abgleich mit allen hier veröffentlichten Sequenzen) am nächsten verwandten Virus: - 27 - Methode: HIV-Resistenztypisierung (vom Kursleiter durchgeführt) Auch hierfür gibt es eine Reihe verfügbarer web-basierter Anwendungen, z.B. Geno2Pheno oder die hier durchgeführte Anwendung der Stanford University. Nach Aufrufen der Seite unter http://sierra2.stanford.edu/sierra/servlet/JSierra?action=sequenceInput kann die ermittelte Sequenz eingegeben oder hochgeladen werden: - 28 - Durch Klicken von "Analyze" weiter unten auf der Seite erfolgt zunächst eine Subtypsierung und eine Qualitätskontrolle auf unübliche Aminosäuren, Stop Codons, Leserahmenverschiebungen und andere Anzeichen für eine unsaubere Sequenz: - 29 - und eine Bestimmung der vorliegenden Mutationen, wobei rund um die Position im kodierten Protein Buchstaben den resistenzvermittelnden Aminosäureaustausch kodieren (z.B. M184V, also Methionin an Position 184 zu Valin durch eine einzelne Punktmutation, die zu Resistenz des Virus gegen den NRTI Lamivudin führt): Beispiel: HIV Resistenz gegen Lamivudin Resistenz-assoziierte Mutation im HIV-Genom unter Lamivudine (3TC) 81 82 83 84 85 86 87 88 89 90 91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 101 102 T C T A T C A A T A C G T G G A T G A T T T Bases Mutante: GTG = Valin G Wildtyp: ATG = Methionin 81 82 83 84 85 86 87 88 T C T A T C A A 89 90 91 92 93 T A C A T 94 95 G G 96 97 98 99 100 101 102 Bases A T G A T T T G Diesem Patienten würde also die Gabe von Nukleosidischen Reverse-Transkriptase Inhibitoren (NRTI) nicht nur nichts nützen, sondern neben den Nebenwirkungen der Medikamente die Progression zu AIDS gestatten. - 30 - Methode: Real time PCR HINTERGRUNDINFORMATION Die Real-time PCR ist eine Modifikation der “normalen” PCR mit einer wesentlichen Änderung: Es werden außer den beiden Primern noch farbmarkierte Sonden hinzugegeben. Diese Sonden sind mit 25-30 Basen etwas länger als die meisten Primer und hybridisieren deshalb bei höheren Temperaturen an das Template als die Primer. Wenn also die eigentliche PCR Reaktion startet, indem der Primer an das Template hybridisiert und sofort von der Polymerase in 3’-Richtung verlängert wird (5’-3’ Polymerase Aktivität des Enzyms), liegt die Sonde bereits am Template. Nun macht man sich eine weitere Aktivität des eingesetzten Enzyms zunutze, nämlich die 5’-3’-Exonuklease Aktivität. Hiermit kann das Enzym, wenn es beim Verlängern des zum Template komplementären DNA-Stranges auf die Sonde trifft, diese verdängen und zerschneiden. Auf der Sonde liegt am 5’-Ende ein Fluoreszenz Farbstoff (der Reporter) vor. Am anderen Ende (3’-) hingegen befindet sich ein Molekül, dass die Fluoreszenz des Reporters aufnimmt, so dass keine Emission im Gerät gemessen werden kann (der Quencher). Wenn nun die Polymerase die Sonde zerschneidet, können Reporter und Quencher sich durch Diffusion räumlich voneinander entfernen. Die Fluoreszenz des Reporters kann schließlich im Gerät gemessen werden. Abbildung: Prinzip der real-time PCR (appliedbiosystems.com und abbottmolecular.com) Je mehr DNA im Laufe der PCR entsteht, desto mehr Sonde kann hybridisieren und von der Polymerase zerschnitten werden. So entstehen messbare Kinetiken, die quantitative Rückschlüsse auf die Menge der anfangs vorliegenden viralen RNA oder DNA zulassen. Oft benutzt man Verdünnungen von Material, dessen Konzentration bekannt ist als Standards, mit deren Hilfe die Quantifizierung der Probe sehr genau möglich ist. - 31 - Verdünnung von Material bekannter Konzentration: Standardkurve (www.virologybonn.de) Da verschiedene Sonden in einer Reaktion benutzt werden können, ist die gleichzeitige Detektion mehrerer Ziele (=z.B. Viren) durch Farbmoleküle verschiedner Wellenlänge möglich. Ebenso kann eine interne Reaktionskontrolle mitgeführt werden, die stets positiv sein muss, um anzuzeigen, dass die Reaktion nicht inhibiert war oder aus anderen Gründen ausgefallen ist. So können falsch-negative Befunde häufig vermieden werden. Hier einige Beispiele für häufig benutzte Farbstoffe: Zur Bedeutung der quantitativen und qualitativen Detektion von HCV Durch die Real time PCR wird das Risiko von Laborkontaminationen durch alte PCR Produkte deutlich vermindert, weil die Reaktionsgefässe nach der Reaktion nicht mehr geöffnet werden müssen. Somit vermindert sich das Risiko falsch-positiver Befunde. Ein - 32 - weiterer wesentlicher Vorteil ist die im Vergleich zur konventionellen PCR höhere Sensitivität bei gleichzeitig höherem Probenumsatz. Besonders beim HCV ist eine molekulare Detektion wichtig, da die Zeit zwischen Infektion und serologisch (z.B. ELISA) detektierbaren Antikörpern gegen das Virus im Patientenblut (Serokonversion) bei diesem Virus besonders lange dauert (bis zu 5 Monate). Man spricht hier auch vom „diagnostischen Fenster“. Klinischer Verlauf der HCVInfektion Neben der qualitativen Detektion (=Ja/Nein) ist aber auch die quantitative Diagnostik bei HCV und anderen Viren von großer Bedeutung: als diagnostischer Marker als prognostischer Marker zur Therapieüberwachung zur Einschätzung des Übertragungsrisikos VERSUCH : One-Step real-time RT-PCR zum Nachweis und Quantifizierung von HCV-RNA Durchführung Die Durchführung der PCR erfolgt als one-step RT-PCR in 25 µL-Ansätzen. Dazu wird zunächst ein Mastermix erstellt, der alle Komponenten enthält (siehe Pipettierschema). Nach dem Vorlegen der aufgereinigten RNA/DNA aus der Patientenprobe wird der Mastermix zu den Ansätzen hinzupipettiert. Die Zusammensetzung eines Reaktionsansatzes ist wie folgt: Pipettierschema - 33 - Zur Vereinfachung werden Ihnen die unten stehenden einzelnen Reagenzien in zwei fertigen Sub Mastermixen gegeben. Diese werden auf Eis ausgegeben, um die Reverse Transcriptase Reaktion zu verlangsamen (dieses Enzym kann nicht reversibel blockiert werden). 50 µl Ansatz: Mix A (Gesamt: 10 µL) Mix B (Gesamt: 10 µL) PCR-Wasser Sense Primer: XT5* [10 µM] Antisense Primer: HCMgR2* [10 µM] Sonde HCVMGB2 [10 µM] Enzym Mix aus Reverser Transkriptase und DNA Polymerase Reaktionspuffer (enthält bereits 0.4 mM von jedem der vier dNTPs und 1.6 mM MgSO4) Bovines Serum Albumin (1mg/mL) Template: HCV RNA aus Patienten Plasma Gesamt: 6,5 µl 1 µl 1 µl 0,5 1 µl 9 µl 1 µL 5 µl 25 µl (Primersequenz nach Drexler et. al. PLoS Med. 2009 ) Anleitung: 1) Vor Ihnen steht eine Glaskapillare in einem speziellen Metallstift. Notieren Sie sich die Nummer Ihres Metallstifts (1-32), da Sie die Glaskapillare nicht beschriften können. Pipettieren Sie oben in die Öffnung der Kapillare 5 µL RNA. 2) Pipettieren Sie 10 µL von Mix A hinzu. 3) Pipettieren Sie 10 µL von Mix B hinzu. 4) Verschließen Sie die Kapillare mit dem hierfür vorgesehenen weißen Stopfen. Drücken Sie hierfür den Stopfen gerade von oben herunter in den Kopf der Kapillare. VORSICHT: NICHT ZU FEST UND NICHT SCHRÄG DRÜCKEN, SONST KANN DIE KAPILLARE ABBRECHEN. 5) Nehmen Sie den kompletten Metallstift, ohne die Kapillare zu entfernen, und stellen Sie den Stift mit der Kapillare in die Tischzentrifuge. - 34 - 6) Zentrifugieren Sie für 30 Sekunden bei 1000 Umdrehungen pro Minute. 7) Entnehmen Sie ihren Metallstift und gehen Sie mit dem Metallstift nach vorne zum Kurspersonal. 8) Entfernen Sie unter Anleitung die Glaskapillare aus dem Metallstift und lassen Sie die Kapillare vorsichtig in das Ihrer Nummer entsprechende Loch im hierfür vorgesehenen Karussell fallen. 9) Drücken Sie die Kapillare vorsichtig von oben an. VORSICHT: BRUCHGEFAHR! Das Kurspersonal startet nun den Lauf. Die PCR-Reaktion wird in einem Real time Thermocycler durchgeführt. Für die Amplifikation wird das folgende Temperaturprotokoll gewählt: PCR-Protokoll: Reverse Transkription Initiale Denaturierung (hier wird die RT inaktiviert und die Polymerase aktiviert, die bisher durch einen Antikörper blockiert war) Denaturierung Annealing und Elongation (in einem Schritt) Zeit [s] 900 Temp. [°C] Zyklen 55 1 180 15 20 95 95 58 Die Fluoreszenz wird in jedem der 45 PCR Zyklen nach dem Annealing- und Elongationsschritt gemessen. Die Auswertung erfolgt in Echtzeit und wird gemeinsam besprochen. 1 45x
