Pränataldiagnostik

PRÄNATALE DIAGNOSTIK
Biochemie-Protokoll
Gruppe 1
13.05.16
Julia Gnann & Christoph Hartmann
Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Die PCR wurde 1984 von Kary Mullis erfunden und ist eine unentbehrliche Methode für viele
Fragestellungen der heutigen molekularen Genetik. Damit gelingt der Nachweis kleinster Mengen
spezifischer DNA-Sequenzen bei einfacher Handhabung.
Ziel ist die Amplifizierung (=Vermehrung) einer spezifischen Sequenz eines DNA-Doppelstranges.
Dadurch ist es möglich, selbst mit minimalen Probenmengen (Blut- od. Gewebeproben) eine Reaktion
in Gang zu setzen bzw. Diagnosen festzustellen. So kann man z.B. Diagnosen aus einer halben
Chorionzotte durchführen. Dabei kann völlig auf radioaktive Marker verzichtet werden.
1. Mechanismus
1.1.
Ansatz:
DNA mit Zielsequenz, deren Anfangs- und Endsequenz
bekannt sein muß, um geeignete Primer zu konstruieren;
2 verschieden Primer (für je einen der komplementären
Stränge);
Nucleotide (ATP, GTP, TTP, CTP);
DNA-abhängige DNA-Polymerase (stabil bis >90°C 
taq-Polymerase)
1.2.






Methode: (sh.Abb.)
Die zu vermehrende DNA wird auf 90°C erhitzt  sie
denaturiert;
Abkühlen  Primer lagert sich an (Hybridisierung der
Primer)
Erhitzen auf Polymerase-Optimum (72°C für taqPolymerase)

Polymerase
synthetisiert
komplementären Strang;
Dieser Zyklus wird mehrfach wiederholt.
Nach dreimaligem Durchlaufen des Zyklus liegt die
Zielsequenz zweimal als Doppelhelix vor.
Nach 25 Zyklen ist die Zielsequenz auf das etwa 10 6fache amplifiziert.
1.3.
Variante: RT-PCR

RNA als Ausgangsmaterial anstatt DNA

RNA      cDNA  PCR
Re verseTranskriptase
2. Anwendung
PCR-Methoden werden in der Medizin zur Diagnostik von
genetischen Krankheiten und zum Nachweis von Virusoder Bakterieninfektionen verwendet. Darüber hinaus ist
die PCR-Methode nützlich bei der Isolierung von DNAKlonen aus Genom- oder cDNA-Bibliotheken und
anderen Verfahren der Molekularbiologie.
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Abbildung 1: PCR
Biochemie-Protokoll
Gruppe 1
PRÄNATALE DIAGNOSTIK
13.05.16
Julia Gnann & Christoph Hartmann
3. Fragen
3.1.




Gewinnung und Isolierung von DNA
Virus-DNA-Sequenz am Anfang und am Ende der Sequenz muß für die Primer-Herstellung
bekannt sein
Durchführung der PCR  bei Vermehrung ist Virus-DNA enthalten
Kontrolle mittels Gel-Elektrophorese (?)
3.2.

Sie erhalten Biopsiematerial eines Patienten und sollen überprüfen, ob
eine Virusinfektion vorliegt (V.a. Herpesvirusinfektion = DNA-Virus).
Überlegen Sie sich notwendige Schritte eines PCR gestützten
Nachweises von der Probenaufarbeitung bis zur Ergebnisauswertung.
Welche Informationen benötigen Sie zur Planung des Experimentes?
Welche Kontrollen sollten mitgeführt werden?
Sie wollen ein RNA-Virus mit Blut mittels PCR nachweisen. In welchen
Schritten läuft die Analyse ab?
Zunächst Herstellung eines DNA-Doppelstranges mit Reverser Transkriptase; dann PCR wie
gehabt.
3.3.
Sie sollen untersuchen, ob ein bestimmtes Gen (Gesamtlänge ca. 2kb)
in der DNA eines Patienten eine bekannte Deletion von 10 Basen
enthält, die für eine Erbkrankheit verantwortlich sein könnte. Anfangsund Endsequenzen der kodierenden Region des Gens sowie die Region,
die die Deletion tragen kann (in Klammern gesetzt, etwa in der Mitte des
Gens lokalisiert), sind unten dargestellt. Überlegen Sie sich ein
Nachweissystem. Wie könnten die Primer aussehen (5‘-3‘ Orientierung).
5‘-ATGGACTCATTTTTTTTTTTTTATAGATCCAAAAAGCCATGCCACACGATTAAGGGGATTTCCAT
GGG(AAAAAGAGAT)AGCAGAGTCGATCTCTGTCTATCCGAGGACCCTTTATATGATGCCCCAAGG
GGGTATCCCTGTGAAAGAGTCCCTAG-3‘
 Primer1: 5‘-CTAGGGACTCTTTCACAGGGATACCCCC-3‘
 Primer2: 5’-ATGGACTCATTTTTTTTTTTTTATAGATCC-3’
 PCR mit der vermutlich kranken DNA und als Kontrolle PCR mit einer gesunden DNA. Danech
Gel-Elektrophorese: DNA mit Deletion wandert weiter, da leichter.
Abbildungsverzeichnis
 Abbildung 1: Taschenatlas Biochemie; Thieme
Quellen:
 CD-Römpp, Chemielexikon; Thieme
 Taschenatlas Biochemie; Thieme
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