Biotechnologische Produktion von Octan- und 8

Biotechnologische Herstellung von Octan- und
8-Hydroxyoctansäure mit Escherichia coli
Biotechnological production of octanoic and 8-hydroxyoctanoic
acid with Escherichia coli
Von der Fakultät Energie-, Verfahrens- und Biotechnik der Universität Stuttgart
genehmigte Abhandlung zur Erlangung der Würde eines
Doktors der Naturwissenschaften (Dr. rer. nat.)
Vorgelegt von
Marko Kirtz
geboren in Backnang
Prüfungsvorsitz:
Prof. Dr. Karl-Heinrich Engesser
Hauptberichter:
Prof. Dr. Bernhard Hauer
Mitberichter:
PD Dr. Martin Siemann-Herzberg
Tag der mündlichen Prüfung: 07.06.2016
Institut für Technische Biochemie der Universität Stuttgart
2016
I Erklärung über die Eigenständigkeit der Dissertation
Ich versichere, dass ich die vorliegende Arbeit mit dem Titel „Biotechnologische
Herstellung von Octan- und 8-Hydroxyoctansäure mit Escherichia coli“ selbstständig
verfasst und keine anderen als die angegeben Quellen und Hilfsmittel benutzt habe.
Aus fremden Quellen entnommene Passagen und Gedanken sind als solche kenntlich
gemacht. Des Weiteren bestätige ich ausdrücklich, dass die hier vorgelegte
Dissertation nicht in gleicher oder ähnlicher Form bei einer anderen Institution zur
Erlangung eines akademischen Grades eingereicht wurde.
Heidelberg, den 14.10.2015 __________________________
(Marko Kirtz)
3
Meinen Eltern
II Danksagung
Ich möchte mich an erster Stelle bei Prof. Dr. Bernhard Hauer für die Bereitstellung des
hochinteressanten und sehr herausfordernden Themas bedanken. Durch die
hervorragenden Arbeitsbedingungen an seinem Institut war es mir möglich meine
theoretischen und praktischen Fähigkeiten unter seiner Führung beträchtlich zu
erweitern.
Sehr dankbar bin ich auch PD Dr. Martin Siemann-Herzberg für die freundliche
Übernahme der Position des Mitberichters und der Bewertung dieser Arbeit und Prof. Dr.
Karl-Heinrich Engesser für die Übernahme des Prüfungsvorsitzes.
Mein großer Dank gilt Dr. Janosch Klebensberger, der mir bei der Erstellung dieser Arbeit
immer mit hilfreichen Diskussionen zur Seite stand und alle meine Manuskripte sehr
kritisch gegenlas. Er verstand es meine Motivation immer wieder aufs Neue zu entfachen
und war mir auch abseits des Labors immer ein guter Freund. Seine Arbeit als
Gruppenleiter und vor allem als Wissenschaftler ist mir seither eine Inspiration. Du hast
aus mir einen besseren Wissenschaftler gemacht, Janosch.
Ich möchte meinen Workbench-Nachbarn B-J, Katze und Schelli danken. Ihr habt mir nicht
nur während der Arbeit an meinem Thema immer wieder hilfreiche Ansichten von außen
vermittelt, sondern auch für den nötigen Spaß während und nach der Arbeit gesorgt.
Des Weiteren gilt mein Dank M. Eng. Sven Richter, der mir bei etlichen
Fermentationsprozessen bis spät in die Nacht beiseite stand und mir einen großen Teil
seines umfangreichen Wissens zur Proteinaufreinigung zuteil werden ließ.
Elena und Lisa, ohne Eure immer wieder aufmunternden und motivierenden Worte sowie
Eure seelische und moralische Unterstützung hätte so manches bei dieser Arbeit gar nicht
funktioniert.
Mina, Meli und (nochmal) Sven, ich danke Euch für unsere Mittagspausen mit hohem
Unterhaltungsfaktor, die immer wieder ein Lichtblick waren.
Dani, Martin, Konrad, Sumi, Schnecki, Jenny, Wouzi, Trauzi, Vlatschi, Sara, Thorsten,
Andy, Jörg, Silke, Christine, Sebastian, Sooondra, Bettina, Bernd, Miri, Ingrid, Jule, Tobi,
Sandy, Mihaela, Silvia, Conny, Dorina, Lisa M. und Caro, ich danke Euch allen für die
angenehme und meistens amüsante Arbeitsatmosphäre, die hilfreichen und nicht
hilfreichen Diskussionen, die Späße, die Kaffeepausen, die gemeinsamen Grill- und
Thekleabende und alles, was ich mit Euch in meiner Zeit am ITB erleben durfte.
Nichts zuletzt gilt mein größter Dank meinen Eltern, die immer an mich geglaubt haben,
für mich verzichtet haben und alles dafür taten, mir zu ermöglichen meinen Weg zu
gehen. Ich danke Euch für Euren unerschütterlichen Glauben an mich und dass Ihr mir
stets den Rücken freihaltet. Ich liebe Euch.
7
IIII Inhalttsverzeiichnis
I Erkläru
ung über die
d Eigensttändigkeit der Disserrtation
3 III Danksa
agung
7 IIII Inhaltsv
verzeichniis
8 IV
V Abkürzzungsverze
eichnis
14 V 17 Zusamm
menfassun
ng
V
VI Abstracct
19 V
Vorwort
22 Die Notweendigkeit allternativer E
Energien un
nd Ressourccen
1 Einleitu
ung
22 25 1.1 A
Ausgangssto
offe für vielee Produkte:: Fettsäuren
n und ihre D
Derivate
25 1.2 K
Konventione
elle Synthesse von (ω-H
Hydroxy-)Feettsäuren
26 1.2.1 26 1.2.1.11 Autok
klavenspaltuung
27 1.2.1.22 Reaktivspaltung
27 1.2.1.33 Gegen
nstrom-Verrfahren
27 1.2.1.44 Parafffin-Oxidatioon
28 1.2.1.55 Oxosy
ynthese
28 1.2.1.66 Hydro
ocarboxylieerung
29 1.2.2 1.3 Herstellun
ng von ω-Hyydroxyfettssäuren
Biotechnolog
gische Hersstellung von
n (ω-Hydroxy-)Fettsäuuren
1.3.1 Herstellun
ng von Fettssäuren
30 31 31 1.3.1.11 Produ
uktion durch
h Monooxy
ygenasen un
nd Dehydroogenasen
31 1.3.1.22 Produ
uktion durch
h Nutzung der natürlicchen Fettsäuuresynthese
32 1.3.1.33 Produ
uktion durch
h Umkehru
ung der β-Oxidation
32 1.3.2 1.4 Herstellun
ng von Fettssäuren
Herstellun
ng von ω-Hyydroxyfettssäuren
Feettsäuresyn
nthese in deer Natur
33 33 8
1.4.1 Die Reaktiionen der dde novo Fettssäuresyntheese
34 1.4.2 Regulation
n der Fettsääuresynthese
36 1.5 T
Thioesterase
en
36 1.5.1 Funktion und
u Klassen
neinteilung
36 1.5.2 Strukturelle Charakteeristika
38 1.5.2.11 Hotdo
og-Faltung
38 1.5.2.22 α/β-H
Hydrolasen
39 1.5.2.33 SGNH
H-Hydrolaseen
40 1.5.2.44 Metallo-β-Lactam
masen
40 1.5.2.55 Sonstiige
40 1.5.3 Katalytisch
her Mechan
nismus
40 1.5.3.11 Hotdo
og-Thioesteerasen
40 1.5.3.22 α/β-H
Hydrolasen
42 1.5.4 Biotechnologische An
nwendungeen
43 1.5.5 Thioesteraase FatB2 auus Cuphea hookeriana
h
43 1.6 3--Ketoacyl-S
Synthasen
44 1.6.1 Funktion und
u Klassen
neinteilung
44 1.6.2 Strukturelle Charakteeristika
45 1.6.3 Katalytisch
her Mechan
nismus
46 1.6.4 3-Ketoacyll-ACP-Syntthase mtKA
AS aus Arab
bidopsis thalliana
47 1.7 C
Cytochrom
P450
P
Monoooxygenasen
n (CYP)
49 1.7.1 Funktion und
u Klassen
neinteilung
49 1.7.2 Strukturelle Charakteeristika
49 1.7.3 Katalytisch
her Mechan
nismus
51 1.7.4 Biotechnologische An
nwendungeen
53 1.7.5 ooxygenasee CYP153AMaq
P450 Mono
M -CPRBM3
1.8 *
Zielsetzung dieser
d
Arbeeit
54 55 9
2 Materialien und Methoden
2.1 57 Materialien
57 2.1.1 Chemikalien und Enzyme
57 2.1.2 Medien und Puffer
58 2.1.3 Stämme
59 2.1.4 Plasmide
60 2.1.5 Primer
62 2.1.6 Software
63 2.2 Mikrobiologische Methoden
64 2.2.1 Übernachtkulturen von Escherichia coli-Stämmen
64 2.2.2 Kurzfristige Haltung von Escherichia coli-Stämmen
64 2.2.3 Dauerlagerung von Escherichia coli-Stämmen
64 2.2.4 Präparation von elektrisch-kompetenten Escherichia coli-Zellen
64 2.2.5 Transformation von Escherichia coli-Zellen durch Elektroporation
65 2.3 Molekularbiologische Methoden
66 2.3.1 Plasmidaufreinigung
66 2.3.2 Isolierung von genomischer DNA aus Escherichia coli
66 2.3.3 DNA-Restriktionsverdau
67 2.3.4 Agarose-Gelelektrophorese
67 2.3.5 DNA-Gelaufreinigung
68 2.3.6 Produktaufreininung von PCR und Restriktionsverdau
68 2.3.7 DNA-Ligationen
68 2.3.8 Polymerasekettenreaktion
69 2.4 Klonierungen
72 2.4.1 Konstruktion von pJeM-FatB2, pKiM1, pKiM2 und pKiM4
72 2.4.2 Konstruktion von pJeM-mtKAS und pBAD18-mtKAS
73 2.4.3 Konstruktion von pBAD18-CYP
73 10
2.4.4 Entfernen der Deletionskassette aus Keio-Stämmen
73 2.4.5 Konstruktion der E. coli Stämme KK2 und KK3
74 2.5 75 2.5.1 Zellaufschluss
75 2.5.2 Konzentrationsbestimmung von Proteinlösungen
76 2.5.3 CO-Differenzspektrum-Assay zur P450-Bestimmung
76 2.5.4 SDS-Gelelektrophorese
77 2.5.5 Western Blot
78 2.5.6 Aufreinigung von FatB2+
78 2.5.7 Aktivitätstests von FatB2+
79 2.6 Sonstige Analytik
81 2.6.1 Extraktion von Fettsäuren
81 2.6.2 Analyse von Fettsäuren
81 2.6.3 Dünnschichtchromatographie
82 2.6.4 Densitometrische Analyse von Western blots
82 2.7 Produktion von Octansäure
83 2.7.1 Produktion von Octansäure im Schüttelkolben
83 2.7.2 Produktion von Octansäure im Bioreaktor
83 2.8 3 Proteinchemische Methoden
Produktion von 8-Hydroxyoctansäure
84 2.8.1 Produktion von 8-Hydroxyoctansäure im Schüttelkolben
84 2.8.2 Produktion von 8-Hydroxyoctansäure im Bioreaktor
87 +
2.9 Synthese potentieller Screeningsubstrate für FatB2 -Mutanten
87 2.10 Statistische Auswertung
88 Ergebnisse
3.1 90 Konstruktion eines Octansäure sekretierenden E. coli-Stammes
90 3.1.1 Wirtsstamm BW25113∆fadD
90 3.1.2 Expressionsplasmid pJeM1
90 11
3.1.3 Expression
n der Thioeesterase FatB
B2
91 3.1.4 Optimieru
ung der Octaansäureproduktion
93 3.1.4.11 Löslicchkeitssteig erung von FatB2
F
93 3.1.4.22 Optim
mierung weiiterer Param
meter
94 3.1.5 Zusätzlich
he Modifikattionen in deer Octansäu
ureproduktiion
100 3.1.6 Produktion
n von Octan
nsäure in Bioreaktoren
B
n
103 3.2 106 3.2.1 Zweizellsy
ystem
107 3.2.2 Einzellsysttem
111 3.3 4 H
Herstellung
von
v 8-Hydrroxyoctansääure
En
ntwicklung
g eines Thiooesterase-H
HTS-Assays
114 3.3.1 Screening auf
a Agarplaatten
115 3.3.2 Screening in
i Flüssigkeeit
116 3.3.3 Aufreinigu
ung von FattB2+
117 Diskussion
121 4.1 K
Konstruktion
n eines Octaansäure sek
kretierenden
n E. coli-Staammes
121 4.2 H
Herstellung
von
v 8-Hydrroxyoctansääure
133 4.3 En
ntwicklung
g eines Thiooesterase-H
HTS-Assays
138 5 Literatu
ur
144 6 Anhang
g
160 6.1 V
Verwendete
Chemikalieen
160 6.2 G
Gensequenze
en
162 6.2.1 Ch FatB2 (Originalseq
(
quenz)
162 6.2.2 Ch FatB2 (codon-opti
(
imiert von GeneArt)
G
163 6.2.3 At mtKAS (Originalseequenz)
163 6.2.4 At mtKAS (codon-opttimiert von GeneArt)
164 6.2.5 P450 Mono
ooxygenasee CYP153AM.aq.
M *-CPRBM
M3
165 6.3 Pllasmidkarteen
168 12
6.3.1 pBAD18-CYP
168 6.3.2 pBAD18-mtKAS
169 6.3.3 pCT302-FatB2
170 6.3.4 pJeM1-FatB2
171 6.3.5 pJeM-mtKAS
172 6.3.6 pKiM1
173 6.3.7 pKiM2
174 6.3.8 pKiM4
175 6.4 Ergänzende statistische Auswertungen
176 6.4.1 Ergebnisse des Shapiro-Wilk-Tests
176 6.4.2 Ergebnisse des Levene-Tests
177 6.4.3 Ergebnisse der Zweistichproben-t-Tests
178 6.5 Wachstumsexperimente aus Kapitel 3.2.1
179 6.6 Ergänzung zum Agarplatten-Assay in Kapitel 3.3.1
181 6.7 Ergänzung zur Aufreinigung des Thioesterase-Konstrukts
181 7 Abbildungsverzeichnis
182 8 Tabellenverzeichnis
184 13
IV Abkürzungsverzeichnis
(v/v)
Volumen pro Volumen
°C
Grad Celsius
µL
Mikroliter
µM
Mikromolar
ACP
acyl carrier protein
Ala
Alanin
APS
Ammoniumpersulfat
Arg
Arginin
Asn
Asparagin
Asp
Asparaginsäure
At mtKAS
mitochondriale 3-Oxoacyl Synthase aus Arabidopsis thaliana
ATP
Adenosintriphosphat
BM3
Cytochrom P450 aus Bacillus megaterium
bp
Basenpaar
C6
Hexansäure / Capronsäure
C8
Octansäure / Caprylsäure
C10
Decansäure / Caprinsäure
C12
Dodecansäure / Laurinsäure
C14
Tetradecansäure / Myristinsäure
C16
Hexadecansäure / Palmitinsäure
C18
Octadecansäure / Stearinsäure
Ch FatB2
Thioesterase FatB2 aus Cuphea hookeriana
CoA
Coenzym A
cww
Zellnassgewicht
CYP
Cytochrom P450 Monooxygenase
CYP*-CPR
Fusion aus CYP153AMaq G307A und CPRBM3
Cys
Cystein
ddH2O
Doppelt deionisiertes Wasser
DMSO
Dimethylsulfoxid
DNA
Desoxyribonukleinsäure
DTT
Dithiothreitol
14
E. coli
Eschericha coli
EDTA
Ethylendiamintetraessigsäure
FatB2+
N-terminale trxA Fusion von Ch FatB2
FPLC
fast protein liquid chromatography
g
Gramm
GC
Gaschromatographie
Glu
Glutamin
Gly
Glycin
h
Stunde
His
Histidin
IPTG
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid
Ile
Isoleucin
kb
Kilobasenpaare
kcat/Km
Katalytische Effizienz
KCl
Kaliumchlorid
kDa
Kilodalton
Km
Michaelis-Menten-Konstante
L
Liter
LB
lysogenic broth
Leu
Leucin
Lys
Lysin
M
molar
Maq
Marinobacter aquaeolei
Met
Methionin
mg
Milligramm
MgCl2
Magnesiumchlorid
min
Minute
mL
Milliliter
mM
millimolar
n.d.
nicht detektiert
NaCl
Natriumchlorid
NAD(P)H
Nikotinamidadenindinukleotid(phosphat)
nm
Nanometer
15
OD600
optische Dichte, gemessen bei 600 nm
PCR
Polymerasekettenreaktion
Phe
Phenylalanin
pmol
Pikomol
PMSF
Phenylmethansulfonylfluorid
Pro
Prolin
S. cerevisiae
Saccharomyces cerevisiae
SDS-PAGE
Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamid-Gelelektrophorese
Ser
Serin
TB
terrific broth
TEMED
N,N,N‘,N‘,-Tetramethylethylendiamin
Thr
Threonin
Tm
Schmelztemperatur der Primer
Tris
Tris(hydroxymethyl)aminomethan
Trp
Tryptophan
Tyr
Tyrosin
U
units
UV
Ultraviolett
Val
Valin
WT
Wildtyp
WU
Weiss units
16
V Zusammenfassung
In den letzten 20 Jahren rückt die Entwicklung biotechnologischer Prozesse zur
Produktion von Diesel- und Benzinersatzstoffen immer mehr in den Fokus von
Forschung und öffentlichem Interesse. Durch die Verknappung der Erdölressourcen[1],
die negativen Auswirkungen der extensiven Nutzung dieser Ressourcen auf die
Umwelt und nicht zuletzt das stetig wachsende Umweltbewusstsein der Bevölkerung
in Industrieländern, wurden Prozesse gefordert, die auf regenerierbaren Ressourcen
basieren, somit den permanent in Richtung Atmosphäre gerichteten CO2-Fluss
eingrenzen und zudem die Kostenexplosion für Kraftstoffe eindämmen. Jedoch ist
nicht nur der weltweite Transportsektor von Erdöl und seinen weiterverarbeiteten
Produkten abhängig, auch die produzierende chemische Industrie bezieht einen
Großteil ihrer Grundstoffe aus dem „schwarzen Gold“[2,3,4,5]. Hier gilt es, effektive
alternative Prozesse zu entwickeln, die zum Großziel einer „grünen Chemie“ beitragen
und von der Abhängigkeit von Erdöl losgelöst sind.
Diese Arbeit hatte das Ziel durch die Realisierung eines mikrobiellen
Produktionsprozesses von mittelkettigen Fett- und ω-Hydroxyfettsäuren einen Beitrag
zum Ziel der sog. „grünen Chemie“ zu leisten. Die wirtschaftliche und damit
einhergehend umweltschutztechnische Relevanz von Fettsäuren und ihren terminal
hydroxylierten Derivaten spiegelt sich in der großen Vielfalt an Produkten, deren
Grundbausteine sie bilden, wider.
Zum Einsatz kam hier das Bakterium Escherichia coli, für welches bereits in
vergangenen Studien Strategien entwickelt worden waren, um beispielsweise
[6]
(Hemi-)Cellulosen für den Aufbau von eigener Biomasse verwerten zu können .
Daher ist es für einen Ansatz, der auf regenerierbaren Ressourcen beruhen soll,
bestens geeignet. Um mit diesem Bakterium in einem Produktionsprozess Fettsäuren
zu generieren, musste seine native Fettsäurebiosynthese zu einer Überproduktion der
gewünschten Fettsäure angeregt werden. Dazu wurde die pflanzliche Thioesterase
FatB2 aus Cuphea hookeriana[7] in einer β-oxidationsdefizienten Zelle überexprimiert,
um sowohl die Fettsäuresynthese zu deregulieren als auch gleichzeitig die Länge des
Produktes zu bestimmen. Nach einer N-terminalen Fusion des Enzyms mit dem
Thioredoxin-1-Anhang trxA und einigen Optimierungen des Produktionsprozesses,
konnten mit diesem System in 24 h etwa 330 mg L-1 der für die Zellen toxischen
Fettsäure Octansäure in einem Bioreaktor-fed batch-Verfahren hergestellt werden.
17
Um aus dieser Fettsäure ihr ω-hydroxyliertes Derivat zu formen, wurde in den
Produktionsstamm zusätzlich ein Monooxygenase-Fusionsprotein eingebracht, das
bereits aus früheren Arbeiten des ITBs hervorging[8,9]. Das Fusionsprotein von
CYP153A aus Marinobacter aquaeolei mit der Reduktasedomäne CPR von CYP102A1
aus Bacillus megaterium ist in der Lage sich selbst mit Reduktionsäquivalenten zu
versorgen ohne dabei auf die Hilfe einer zusätzlichen Reduktase angewiesen zu sein.
Die in dieser Arbeit verwendete Mutante G307A ist zudem gegenüber Octansäure um
[9]
das 20-fache aktiver als es die Wildtypform ist . Diese Enzymmutante wurde in vier
unterschiedlichen Ansätzen mit dem octansäureproduzierenden Bakterienstamm
kombiniert. So konnte letztlich in einem Einzellsystem mit paralleler Expression der
Thioesterase sowie der Monooxygenase in 20 h ein 8-Hydroxyoctansäure-Titer von
-1
etwa 230 µM erreicht werden, was umgerechnet 40 mg L entspricht.
Nachdem der erfolgreiche konzeptionelle Beweis für dieses Produktionssystem
erbracht war, sollte ein ungerichtetes Mutageneseverfahren angewendet werden, um
die Möglichkeit das Endprodukt nach Wunsch in seiner Länge variieren zu können, zu
erhalten. Das Verfahren sollte gentechnisch veränderte Thioesterase-Varianten
generieren, die verglichen zum eingesetzten Wildtypenzym eine erhöhte Aktivität
gegen kürzere oder längere Fettsäuren als Octansäure aufwiesen. Für ein hierzu
benötigtes high throughput screening-Verfahren sollten im Rahmen dieser Arbeit die
Grundlagen erarbeitet werden. Getestet wurden dabei verschiedene Methoden des
screenings sowohl auf Agarplatten und in Flüssigmedium, so beispielsweise die
[10]
extrazelluläre Präsentation des Enzyms auf Hefezelloberflächen
Möglichkeit eines screenings mittels aufgereinigtem Enzym.
18
, als auch die
VI Abstract
For the last two decades public and scientific interest in the development of
biotechnological processes for the production of fuel alternatives has continuously
been growing, mainly due to the shortage of fossil resources[1]. In addition, the
increasing awareness about environmental issues of many oil-based processes further
pushed the demand for “greener” alternatives such as the use of regenerative
resources or electrical replacements based on solar or wind energy. Beside the need of
oil and petroleum for the transportation sector also the chemical industry largely
[2,3,4,5]
depends on oil-derived chemicals
. Therefore, it is evident to develop effective
production processes, that contribute to the big goal of green chemistry and to
eliminate the dependency of chemistry from crude oil.
The aim of this work was to contribute to “green chemistry” by the realization of a
microbial production process for medium-chained fatty and ω-hydroxyfatty acids. The
economical and therefore ecological significance of fatty acids and their terminal
hydroxylated derivatives is reflected by the great variety of products, that incorporate
these molecules as precursors.
In this study the bacterium Escherichia coli has been used as it is generally considered
as one of the model organisms and for which the conversion of regenerative
[6]
substrates such as (hemi-)cellulose into biomass or higher value products is feasible .
To overproduce a desired fatty acid with this bacterium in a production process, it is
necessary to modify its native fatty acid biosynthesis. For this purpose, the plant
thioesterase FatB2 from Cuphea hookeriana[7] was overexpressed in a β-oxidation
deficient host cell to deregulate the fatty acid biosynthesis and to control the length of
the produced fatty acid. After fusing this enzyme to a thioredoxin-1-tag (trxA) and
subsequent improvements of the production process, 330 mg L-1 of octanoic acid could
be produced in 24 h in a fed batch process.
To convert this fatty acid into its terminal hydroxylated derivative, a monooxygenase
fusion construct that was available from an earlier study at our institute was coexpressed in the aforementioned production strain[8,9]. The fusion of CYP153A from
Marinobacter aquaeolei and the reductase domain CPR of CYP102A1 from
19
Bacillus megaterium represents a self-sufficient enzyme in regards to the generation of
reduction equivalents which eliminates the need for the coexpression of an additional
reductase enzyme[9]. Moreover, its variant G307A is much more active (20-fold)
towards octanoic acid than its wildtype form. Four different combinations of
monooxygenase expression and the production strain were tested. Finally, a single cell
system with simultaneous expression of both enzymes in a bioreactor showed the best
result, leading to 230 µM 8-hydroxyoctanoic in a 20 h reaction, which is equivalent to
-1
about 40 mg L .
After this successful proof of concept, a random mutagenesis approach should have
been used to obtain the possibility to customize the chain length of the final product.
This approach should generate enzyme variants of FatB2 that exhibit an increased
activity towards shorter- or longer-chained fatty acids than octanoic acid. Therefore,
the basics for a high throughput screening system had to be established in this work.
Several methods on agar plates and in liquid medium have been tested, e.g. the
extracellular presentation of the enzyme on yeast cell surfaces[10], as well as the
possibility of a screening with the purified enzyme.
20
21
V
Vorwort
D
Die Notweendigkeitt alternattiver Eneergien un
nd Ressou
urcen
Seeit etwa 1550 Jahren ist das Erddöl einer der wichtig
gsten Enerrgielieferantten und
m
mittlerweile auch eine der
d bedeuten
ndsten Resssourcen fürr die chemissche Industrie. Hier
diient es zurr Herstellu
ung verschiiedener Ku
unststoffe[2]] sowie weeiterer cheemischer
Prrodukte wiie Lösungssmittel[3,4], Schmiersto
offe[3,5], Laacke[3] undd Bestandteeile von
Koosmetika[3] und Medik
kamenten[3]]. Weltweit wurde 2012 etwa 64 % des Erdölls alleine
voom Verkeh
hrssektor in
n weiterverrarbeiteter Form von Benzin, D
Diesel und Kerosin
veerbraucht[111]. Rund 10 % benötiigte die ch
hemische In
ndustrie zuur Produkttion der
obbengenanntten Produk
kte. Der rrestliche Anteil
A
des Erdöls diiente als direkter
En
nergieträgeer in der Industrie und der Land- un
nd Forstwiirtschaft oder zur
W
Wärmeerzeu
ugung in Haaushalten eetc. Der weltweite täglliche Erdölvverbrauch lag 2014
beei etwa 92 Millionen Barrel pro Tag[12] un
nd er steigt derzeit jähhrlich um 1,2 %[13].
Gleichzeitig wird, verscchiedenen P
Prognosen zufolge,
z
dass weltweite Ölförderm
maximum
(PPeak oil) in
nnerhalb der
d nächsteen 10 Jahrre erreichtt[1]. Dies bbedeutet, dass
d
die
Föördermengeen dann au
ufgrund derr begrenzteen Ölreserv
ven kontinnuierlich ab
bnehmen
w
werden. Diess äußert sich auch im Ö
Ölpreis: bettrug der Preeis 1915 fürr ein Barrel Öl noch
ettwa 15 US-D
Dollar, so ist
i er im Jaahr 2013, kn
napp 100 Jaahre späterr, auf über 108 USDollar pro Baarrel gestieg
gen[14,15].
Ab
bbildung 1: Erdölpreis
E
derr letzten 100 JJahre.
Scchwarz: gemitttelter Jahresp
preis, grau: gem
mittelter Jahrrespreis (inflattionsbereinigtt, 2013)
22
Aber nicht nur die steigende Preise auf dem Energiesektor, sondern auch der immer
lauter werdende Ruf der weltweiten Öffentlichkeit nach regenerierbaren Energien zur
Einschränkungen der CO2-Emissionen und der globalen Erwärmung erfordern ein
Umdenken und damit einhergehend eine allmähliche Abkehr von der Nutzung fossiler
Brennstoffe hin zur Verwendung alternativer Energien. Jedoch können die momentan
genutzten Verfahren in Solar-, Wind- und Wasserkraft noch nicht alle Lücken - vor
allem im Bereich der Treib- und Rohstoffversorgung - schließen. Dadurch rückte in
den letzten Jahren die Nutzung von Biokraftstoffen wie Bioethanol und Biodiesel in
den Mittelpunkt des Interesses von Forschung und Industrie. Diese beiden Kraftstoffe
machen momentan etwa 90 % der bisher genutzten Biokraftstoffe aus[16]. Jedoch ist
auch die Nutzung dieser Alternativen mit Problemen behaftet: Biodiesel wird
beispielsweise durch die Transesterifikation von unter anderem pflanzlichen
Triacylglycerolen mit Methanol gewonnen. Die Triacylglycerole werden dabei aus
Raps, Soja, Sonnenblumen oder aber auch aus Ölpalmen, Baumwollsamen und Oliven
gewonnen[17,18]. Das benötigte Methanol wird teilweise jedoch noch durch die
Nutzung fossiler Ressourcen wie Erdgas hergestellt[16,19]. Bioethanol wird durch die
Fermentation von regenerierbaren Kohlenstoffquellen durch Mikroorganismen wie
Saccharomyces cerevisiae, Zymomona mobilis, Escherichia coli oder Klebsiella oxytoca
produziert[16]. Als Substrate kommen hier zumeist Kohlenhydrate aus Zuckerrohr (in
Brasilien)[16,18,19], Mais (in den USA)[18,20,21] und Getreide und Zuckerrüben (in
Europa)[21] zum Einsatz. Kritiker dieser Biokraftstoffe führen an, dass viele
landwirtschaftliche Nutzflächen, die dringend zur Produktion von Nahrungsmittel
benötigt werden unnötigerweise nun für Pflanzen genutzt werden, die nur noch der
Herstellung und Gewinnung der Biokraftstoffe dienen[18,22]. Als Konsequenz daraus
steigen die Lebensmittelpreise, was wiederum zu einer weiteren Verschärfung der
Lebensmittelknappheit in Länder der Dritten Welt führt. Darüber hinaus belegen
Studien, dass unter umweltschutztechnischen Aspekten die Nutzung von diesen
Biokraftstoffen teilweise verheerender ist als der konventionelle Gebrauch fossiler
Kraftstoffe. Zwar ist die Nutzung von Pflanzenbiomasse, zu deren Aufbau
Kohlenstoffdioxid aus der Atmosphäre entnommen wird, auf den ersten Blick
emissionsneutral, jedoch wird dabei oft außer Acht gelassen, dass zur Produktion
dieser
Biomasse
auch
Faktoren
[23,24]
landwirtschaftlichen Nutzfläche
wie
Brandrodung
zur
Gewinnung
der
und intensive Nutzung von Dünger[22,24] gezählt
werden müssen. Im weiteren Verlauf des Produktionsprozesses vom Pflanzenmaterial
23
zum Biokraftstoff müssen ebenso Energieverbrauch für Reaktoren und beispielsweise
die Gewinnung von Methanol aus Erdgas als Emissionsfaktoren hinzugerechnet
werden. Zudem entstehen zusätzlich andere Schadstoffe wie Stickstoffmonoder -dioxid sowie Kohlenstoffmonoxid, die bei der Nutzung fossiler Ressourcen nicht
[22,25]
in einem solchen Ausmaß produziert werden würden
.
All diese Nachteile führen nun zur Entwicklung von Biokraftstoffen der
zweiten
Generation.
Hierbei
wird
versucht,
die
extensive
Nutzung
landwirtschaftlicher Anbauflächen einzuschränken, indem in mikrobiellen Prozessen
als Fermentationssubstrat nicht mehr zur Lebensmittelproduktion bestimmte
Pflanzenteile genutzt werden, sondern Pflanzenabfälle aus Forst- und Landwirtschaft,
die anderweitig nicht mehr verwertet werden können[26]. Dies erfordert mikrobielle
Systeme, die dazu in der Lage sind, Cellulose, Lignin und Hemicellulosen in
verwertbare Kohlenhydrate umzuwandeln und somit zum Aufbau ihrer Biomasse zu
verwerten. Eine weitere interessante Alternative ist die Nutzung von Mikroalgen wie
Chlorella spec. Sie nutzen – wie alle photosynthetisch aktiven Zellen - Licht als
Energiequelle und reichern bis zu 70 % des Zelltrockengewichts mit Lipiden an[27].
Entweder wird ihre Biomasse dann direkt in thermochemischen Reaktionen in
Biotreibstoffe umgewandelt oder die Lipide werden extrahiert und anschließend
weiterverwertet[27,28].
Mikrobielle Systeme bieten den Vorteil, dass der Platzbedarf durch die Nutzung
von Bioreaktoren in großem Maße verringert ist und zudem die meisten zur
Herstellung von Biokraftstoffen benötigten Moleküle in den Zellen selbst hergestellt
werden können ohne beispielsweise auf Erdgas basierendes Methanol dem Prozess
zuführen zu müssen. Auf diese Weise konnten bisher Prozesse zur Herstellung von
[29,30]
Fettsäuren(methylester)
, Alkoholen[29,30], Terpenen[30], Alkanen[31], Ethanol[32,33]
und etlichen anderen Chemikalien entwickelt werden. Jedoch stecken viele dieser
Prozesse noch im Entwicklungsstadium, da aufgrund mangelnder Effizienz von
beteiligten Enzymen oder ganzer enzymatischer Kaskaden, Toxizitätsproblemen und
zu langsamen Zellwachstums Rückschläge hingenommen werden müssen. Dies führt
dazu, dass diese alternativen Prozesse für die produzierende Industrie im Vergleich
mit etablierten konventionellen und zudem meist optimierten chemischen Prozessen
kommerziell noch nicht konkurrenzfähig sind.
24
1 Einleitung
Die vorliegende Arbeit hatte das Ziel, einen Beitrag zur Entwicklung von Prozessen
für die Produktion von Biochemikalien der zweiten Generation zu leisten. Im
Speziellen ging es hierbei um die Entwicklung und anschließende Realisierung eines
Prozesskonzepts
zur
mikrobiellen
de
novo
Biosynthese
der
mittelkettigen
Fettsäuremoleküle Octansäure und 8-Hydroxyoctansäure.
Dabei sollte durch die heterologe Expression dreier Fremdgene sowie weiterer
Modifikationen an Wirt und Prozess die Fettsäuresynthese des Bakteriums
Escherichia coli gezielt auf die genannten Endprodukte umgelenkt werden.
In die Entwicklung des Gesamtkonzepts für diesen Prozess wurden bereits
bestehende Verfahren aufgenommen und derart modifiziert, um die gesteckten Ziele
dieser Arbeit zu erreichen. Im Folgenden werden zunächst wichtige Eckpfeiler und
Grundlagen, die zum Verständnis der Arbeit wichtig sind, eingehend erklärt.
1.1 Ausgangsstoffe für viele Produkte: Fettsäuren und ihre
Derivate
Der wichtige Stellenwert von (mittelkettigen) Fettsäuren und Hydroxyfettsäuren in
der produzierenden Industrie erschließt sich, wenn man sich die Vielzahl an
Produkten vor Augen führt, für deren Herstellung diese Moleküle die Grundlage
bilden. So werden Fettsäuren durch Veresterung mit Ethanol oder Methanol in
Fettsäure(m)ethylester umgewandelt, die die Hauptbestandteile des bereits erwähnten
Biodiesels
bilden.
Außerdem
werden
Fettsäuren
bei
der
Produktion
von
Nahrungsmitteln (niedere Carbonsäuren, z. B. E260, E261, E262), Kosmetika (z. B.
Miglyol® 810N, Myritol® 312), Färbemittel (z. B. europäisches Patent 1048289 A2[34]),
[35]
Seifen
und
Reinigern
(z. B.
Mega-San®
Acid
Sanitizer),
Schmier-
und
Gleitmitteln[35] (z. B. Neutron-P, PNT), Insektiziden (z. B. Neudosan® Neu) und in der
Gummiherstellung[35,36] sowie als Nahrungsergänzungsmittel verwendet. Zusätzlich
[37]
dienen sie als Ausgangsstoffe für die Produktion von Alkoholen
Hydroxyfettsäuren.
Verwendung
als
Hydroxylierte
Geschmacks-
Fettsäuren
finden
[38,39]
oder
Duftstoffe
in
(z.
lactonisierter
B.
und
Form
γ-Decalacton,
Quercuslactone) oder Weichmacher (z. B. ε-Caprolacton). In linearer Form werden sie
als Bestandteile von Schmiermitteln, in pharmazeutischen Hautprodukten sowie
25
Koosmetika ggenutzt[40]. Des Weitteren werd
den sie homopolymeerisiert häufig als
Veerpackungssmaterial (zz. B. Polyh
hydroxybutttersäure, Po
olymilchsäuure) verwen
ndet. Es
w
wurde zudeem nachgeewiesen, daass beispieelsweise 10-Hydroxy--2-decensäu
ure, 10H
Hydroxydecaansäure un
nd 8-Hydrooxyoctansäu
ure[41], alless Bestandteeile aus dem Gelée
rooyale der Honigbiene
H
e Apis me lliferax, geegen Krebss[40,42,43] unnd gegen Diabetes
D
w
wirksame[40,442] und darü
über hinauss antibiotiscche Eigenschaften[42,43]] besitzen. Auch
A
die
H
Hydroxyfettssäuren dien
nen als Vo rstufe zur Produktion
n einer weiiteren Grup
ppe von
Feettsäurederiivaten, den
n Dicarbonssäuren. Dieese Molekülle bilden inn Kombination mit
an
nderen meh
hrfach funkttionalisierteen Moleküllen Heterop
polymere wi
wie beispielsweise in
Veerbindung mit
m Diamin
nen die versschiedenen Sorten des Nylons[44] (z. B. Polyaamid 6.6,
Poolyamid 4.66, Polyamid 6.10).
Ab
bbildung 1--1: Struktureen verschieddener Anwen
ndungsbeispiele von kurzz- und mitttelkettigen
Feettsäuren:
M
Miglyol
810N
N
und
Oleeylpalmitinsääureamid;
Hydroxyfettsäu
H
uren
bzw.
Lactone:
Poolyhydroxybu
uttersäure, ε-C
Caprolacton unnd Quercuslaacton; Dicarbo
onsäuren: Polyyamid 6.6.
1..2 Konv
ventionelle Syntheese von (ω
ω-Hydro
oxy-)Fettssäuren
1..2.1 Herstellung vo
on Fettsäurren
Großtechniscch werden heutzutagee verschiedeene Verfahren eingeseetzt, um Fettsäuren
heerzustellen. Während in Westeurropa und deen USA gro
oße Teile deer Fettsäureen durch
Sp
paltung nattürlicher Öle
Ö und Fettte wie z.B. Fischöl, Rindertalg,
R
Kokosfett, Palmöl,
Raapsöl, usw
w. produzieert werden
n (Reaktion
nsschema 1),
1 wird inn den eheemaligen
26
Ostblockstaaaten und China
C
verm
mehrt auff die vollsständige N
Neusynthesee dieser
Caarbonsäureen zurückgeegriffen[35,455].
Reeaktionsscheema 1: Hydrrolyse von T
Triacylglycerolen aus tierisschen und pfflanzlichen Fetten und
Öllen.
Beei der Spaaltung von
n tierischeen und pfflanzlichen Ölen undd Fetten kommen
k
haauptsächlich
h drei Prozeesse zum Eiinsatz:
1..2.1.1 Auto
oklavenspa
altung
Die Triacylgllycerole weerden in ein
nem diskonttinuierlichen Prozess inn säurebesttändigen
A
Autoklaven bei
b Temperraturen zwiischen 170 und 180 °C
C, einem Übberdruck biis 60 bar
nd einem Wasserantteil von 200 % hydrollytisch gesspalten[46,47]]. Hierbei werden
un
M
Magnesium- oder Zinko
oxid als cheemische Kaatalysatoren
n eingesetztt. Ab Tempeeraturen
voon 200 °C kaann auch oh
hne Katalyssatoren nocch wirtschaftlich gearbbeitet werdeen.
1..2.1.2 Reaktivspaltun
ng
Feette und Öle
Ö werden
n mit einem
m Wasseraanteil von 20 – 30 % katalytiscch unter
N
Normalbedin
ngungen od
der geringeem Überdrruck umgesetzt[46,47]. Als Kataly
ysatoren
koommen hierr Säuren, wie
w zum Beiispiel Schwefelsäure od
der aromatiische Sulfon
nsäuren,
soogenannte Twitchell-R
T
Reaktive[48], zum Einsattz. Dieser Prozess
P
ist ssehr langwierig und
m
muss absatzw
weise in biss zu 4 Schriitten mit eiiner Gesam
mtzeit bis zuu 40 h durch
hgeführt
w
werden, um eine
e
Ausbeu
ute von nah
hezu 100 % zu erreicheen.
1..2.1.3 Gegenstrom‐Veerfahren
Die Spaltungg kann auch
h kontinuieerlich im Gegenstromp
G
prinzip erfoolgen[49,50]. In einer
paltkolonnee wird vorg
geheiztes W
Wasser dem Prozess von oben zuggeführt. Auff seinem
Sp
W
Weg „nach unten“
u
löst das Wasseer das aus der
d Hydroly
yse entstand
ndene Glyceerol. Das
voorerhitzte Öl
Ö oder Fettt wird hinggegen von unten durcch die Koloonne gepum
mpt und
niimmt auf seeinem Weg
g nach oben
n die entstaandenen Fettsäuren auuf. In einer solchen
27
Koolonne herrrschen mitt bis zu 50 bar Überdrruck und Temperatur
T
ren bis 2600 °C sehr
haarsche Bedingungen, die Verweiilzeit kann dadurch jeedoch auf eetwa 2,5 h gesenkt
w
werden und es werden Spaltgrade
S
vvon bis zu 99
9 % erreich
ht.
Gemeinsam ist allen drrei Prozessttypen, dass sie auf der Hydrolysse natürlich
her Fette
un
nd Öle basiieren. In deer Regel beestehen die Triacylgly
ycerole dies er Fette ab
ber nicht
au
us einer eiinzigen besstimmten FFettsäure, sondern
s
en
nthalten Geemische mehrerer,
m
veerschiedeneer Fettsäurren wie in Tabelle 1-1 exemplarischh aufgefüh
hrt. Die
en
ntstandenen
n Mischun
ngen aus dder Fett- und Ölspaaltung müüssen ansch
hließend
en
nergieaufweendig übeer fraktion
nierte Desstillationen und/oderr Kristallissationen
au
ufgetrennt und
u die ein
nzelnen Fetttsäuren auffgereinigt werden.
w
Diees erfordertt je nach
Feettsäuregem
misch und angelegten
n Unterdrücken Temp
peraturen zzwischen 100
1 und
2990 °C.
Taabelle 1-1: Feettsäureanteilee in Kokosfettt und in Schw
weineschmalz (Gewichtsproozent)[51].
K
Kokosfett
Schweines
S
schmalz
Caaprylsäure
5 – 10 %
Laurinsäure
L
e
1–3%
Caaprinsäure
5–8%
Palmitinsäu
P
ure
Laaurinsäure
45 – 53 %
Palmitolein
P
nsäure
2–4%
M
Myristinsäurre
17 – 21 %
Stearinsäur
S
re
8 – 22 %
Paalmitinsäurre
8 – 10 %
Ölsäure
Ö
35 – 555 %
Sttearinsäure
2–4%
Linolsäure
L
4 – 12 %
Ölsäure
5 – 10 %
20 – 300 %
Beei der Neussynthese vo
on Fettsäurren werden
n ebenfalls hauptsächllich drei Veerfahren
geenutzt:
1..2.1.4 Para
affin‐Oxida
ation
H
Hierbei werd
den Alkanee mit einerr Kettenlän
nge bis zu 30 Kohlensstoffatomen
n in der
Fllüssigphase katalytisch
h – unter deer Zuhilfen
nahme von Mangansalz
M
zen bei etw
wa 130 °C
un
nd leichtem
m Überdruck – in eineer Radikalreaktion zu Carbonsäuuren oxidierrt (siehe
Reeaktionssch
hema 2 A). Hauptsächl
H
lich werden
n so C12 – C18-Fettsäureen produzieert[35,45].
1..2.1.5 Oxosynthese
Beei dieser Hydroform
H
mylierungsreeaktion dieenen Alken
ne, Kohlennstoffmonox
xid und
W
Wasserstoff als
a Edukte[335] (siehe Reeaktionssch
hema 2 B). Diese
D
werdeen bei einem
m Druck
28
voon bis zu 4550 bar und Temperatuuren bis zu 200 °C mith
hilfe von K
Kobalt-, Ruth
heniumodder
Rhodiium-haltigeen
Moleküülen
katallytisch
zu
u
Aldehydden
umgeesetzt[52].
A
Anschließend
d werden die Aldeh
hyde mit milden Oxidantien
O
wie beisp
pielweise
Lu
uftsauerstofff zu Carbo
onsäuren w
weiteroxidieert. Dies kaann ohne K
Katalysatoreen, dann
beei etwas hö
öherer Temp
peratur von
n 100 °C un
nd 7 bar Üb
berdruck, geeschehen oder aber
in
n Anwesenh
heit von Meetallsalzen, ddie Eisen, Kupfer,
K
Kobalt oder Maangan enthaalten[53].
1..2.1.6 Hyd
drocarboxyllierung
Beei diesem Verfahren
n werden Alkene, Kohlenstoffm
K
monoxid uund Wasseer unter
Übberdruck biis 240 bar und
u Temperraturen bis 320 °C mit Metallcarbo
M
onylen wie Ni(CO)4
zu
u Carbonsääuren umgeesetzt[54] (siiehe Reaktiionsschemaa 2 C). Dieeser zu den
n ReppeVeerfahren geehörende Prrozess wirdd meist jedo
och nur zurr Carboxyliierung von Ethylen
veerwendet, da
d es bei län
ngerkettigen
n Alkenen zur
z Isomeriisierung derr Doppelbin
ndungen
un
nd damit zu
u einer breitten Mischun
ng an Endp
produkten bzw.
b
Nebenpprodukten kommt.
k
Beei der Koch
h’schen Carb
bonsäure-S ynthese, die die gleich
hen Edukte nutzt und ebenfalls
e
un
nter den Obberbegriff der
d Hydroccarboxylieru
ung fällt, wird
w als Kataalysator jed
doch ein
Prrotonendon
nor wie Sch
hwefelsäuree oder Borttrifluorid verwendet. FFür diese Reaktion
R
köönnen etwaas mildere Bedingungeen wie etw
wa 80 °C und Druck voon 100 bar gewählt
w
werden, um Umsetzungen bis 10 0 % zu erreeichen. Aufgrund dess Reaktionssverlaufs
errhält man bei der Koch
h‘schen Syn
nthese verzw
weigte Carb
bonsäuren[555].
Reeaktionsscheema 2: Prinziip der A) Paraaffin-Oxidatio
on zu Fettsäuren, B) Oxosyynthese von Fettsäuren
F
un
nd C) Hydrocaarboxylierung
g von Alkenenn zu Fettsäureen.
29
Bei den drei oben genannten Syntheseverfahren entsteht durch die teils sehr rauen
Bedingungen eine Vielzahl an Nebenprodukten, die eine Aufreinigung der
Reaktionsprodukte unumgänglich machen. Auch hier werden wieder die fraktionierte
Destillation und die Kristallisierung genutzt.
Nachteile aller bisher beschriebenen Verfahren sind die sehr hohen Energiekosten zur
Aufrechterhaltung der beschriebene Drücke und Temperaturen, die Verwendung teils
sehr toxischer Katalysatoren und die relativ unspezifischen Reaktionsverläufe, die eine
aufwendige Abtrennung von Nebenprodukten nötig machen.
1.2.2 Herstellung von ω-Hydroxyfettsäuren
Die bisher geeignetsten Wege um ω-Hydroxyfettsäuren herzustellen, bestehen in der
oxidativen Umsetzung der Doppelbindungen in einfach ungesättigten Fettsäuren und
[40]
der entsprechenden Fettalkohole
, durch katalysierte Hydrierung von gesättigten
Carbonsäuren bei Temperaturen bis 300 °C und Drücken von bis zu 300 bar[56] oder
durch die reduktive alkalische Spaltung von langkettigen, ungesättigten Fettsäuren bei
Temperaturen bis 200 °C[57]. Bei all diesen Verfahren werden in der Regel die sehr
hohen Temperaturen benötigt, um die Reaktion zu ermöglichen oder die gewünschten
Produkte aufzureinigen. Diese hohen Temperaturen verursachen aber oft zugleich
eine Dimer- oder gar Oligomerbildung der Hydroxyfettsäuren, welche in den
Produktionsprozessen unerwünscht ist, weitere Aufreinigung erfordert und die
Gesamtausbeute schmälert. Um hohe Temperaturen zu vermeiden, wird auf die
Verseifung von Lactonen oder Hydroxyfettsäureester mit Kaliumhydroxid unter
[40]
Normalbedingungen zurückgegriffen
. Das entstandene Salz wird anschließend mit
Schwefelsäure angesäuert, um die reine Hydroxyfettsäure zu erhalten (siehe
Reaktionsschema 3 A).
Ein weiterer Ansatz bei milden Temperaturen besteht in der Kreuzmetathese
zwischen einem langkettigen Fettalkohol und Methylacrylat (siehe Reaktionsschema
3 B). Dabei entsteht neben dem Ester einer entsprechenden Fettsäure auch der Ester
einer ω-hydroxylierten Fettsäure, der nach der Hydrolyse zur reinen Hydroxyfettsäure
führt[58,59].
30
Reeaktionsscheema 3: Prinziip der A) Versseifung von Lactonen
L
und Aufarbeitungg zur Hydroxy
yfettsäure.
Daas Prinzip lässt sich auch auf
a die Methyylester von Hydroxyfettsäu
H
uren übertraggen. B) Kreuzm
metathese
am
m Beispiel von
n Oleylalkoho
ol und Methyllacrylat.
1..3 Biotechnologiische Herrstellung
g von (ω-H
Hydroxy
y-)Fettsäu
uren
1..3.1 Herstellung vo
on Fettsäurren
Biiotechnologgisch findet man drei A
Ansätze, um
m Fettsäuren
n herzustelllen, von den
nen aber
nooch keiner den Sprung
g von der En
ntwicklung
g im Labor in
i die indusstrielle Anw
wendung
geeschafft hatt.
1..3.1.1 Prod
duktiondurrchMonooxxygenasenundDehydrrogenasen
Dieser Ansaatz setzt den Einsatzz von prim
mären Alko
oholen, minndestens ab
ber von
Alkanen als Grundsubsstrate vorauus. Die Alk
kane werdeen von eineer Monoox
xygenase
A
nter NADP
PH-Verbrau
uch und miit molekulaarem Sauerrstoff zu prrimären Allkoholen
un
hy
ydroxyliert.. Stellvertreetend für viiele Arbeiteen sei hier auf die Stuudien von Scheps et
all. verwiesen
n, die mit einem Cyttochrom P4450-Enyzm aus Mycobbacterium marinum
m
un
nd einem weiteren
w
P450-Enzym aaus Polarom
monas sp. in
n vitro Umssätze bis zu 95% bei
m
mittelkettigeen Alkanen erreichten[[60].
Die primären Alkohole kön
nnen dann, ebenfalls in
n vitro, durcch Dehydro
ogenasen
übber eine Ald
dehyd-Zwisschenstufe zzu Carbonssäuren und weiteren D
Derivaten um
mgesetzt
w
werden. Beispielweise nutzten Asakura und Hosh
hino eine Alkohol/A
AldehydDehydrogenaase aus Glu
uconobacter sp., um besagte Reaktiion zu katallysieren[61].
31
Ab
bbildung 1-2
2: Prinzip der Alkanoxidaation zur Fetttsäure. Der erste Schritt w
wird hierbei von einer
Monooxygenase katalysiert, die letzten beeiden von eineer Dehydrogeenase.
1..3.1.2 Prod
duktiondurrchNutzunngdernatürrlichenFetttsäuresynthhese
Beei diesem Ansatz
A
wird
d die natürliiche Fettsäu
uresynthesee, die im follgenden Kaapitel 1.4
nooch genaueer erklärt wird,
w
in Miikroorganismen für diie Produktiion von Fettsäuren
geenutzt. Hierbei ist es jedoch niccht zwingen
nd notwend
dig den Zeellen ein ad
däquates
Voorläufermolekül zur Produktion
P
der Fettsäu
uren zur Verfügung
V
zzu stellen, sondern
lediglich eine für den Organismus
O
s verwertbaare Kohlenstoffquelle. Da Fettsäu
uren ein
w
wichtiger Beestandteil eines jeden
n Organism
mus sind, ist ihre SSynthese eiiner der
zeentralen Sto
offwechselw
wege und ddementspreechend bereeits weitestggehend volllständig
au
ufgeklärt. Um
U Mikroo
organismen
n für die Produktion
n von Fetttsäuren nu
utzen zu
köönnen, müssen mindeestens zweei Punkte erfüllt
e
sein: erstens m
muss gewäährleistet
w
werden, dasss die produzzierenden Z
Zellen das Produkt
P
nich
ht selbst veerstoffwechsseln. Als
w
weitere Maß
ßnahme mu
uss die Syntthese der Fettsäuren
F
dereguliert
d
werden. Der
D erste
Pu
unkt wird meist durcch ein Absschalten od
der Heruntterreguliereen der β-Oxidation
errreicht. Einee Deregulattion der Fetttsäuresynth
hese wird durch
d
die Übberexpression einer
Th
hioesterase und, dam
mit einhergeehend, dem
m Abbau des
d intrazellllularen Accyl-ACPTiiters, erreiccht (siehe dazu auch K
Kapitel 1.4.22 Regulation
n der Fettsääuresynthesse). Hier
w
wurde
beereits
ein
ne
[19,62,63,64,655,66,67]
veeröffentlich
ht
Vielzzahl
an
Arbeiten
n
zu
diesem
Thema
. Nebeen dem hau
uptsächlicheen Einsatz vvon Escheriichia coli
w
werden hierr aber aucch Saccharromyces ceerevisiae[68], Yarrowia lipolytica[69] oder
Cy
yanobakterrien wie Syn
nechocystis sp.[70] eingeesetzt.
1..3.1.3 Prod
duktiondurrchUmkehrrungderβ‐‐Oxidation
20011 veröffen
ntlichten Dellomonacoo et al. eine interessantte Studie übber die Umk
kehrung
deer β-Oxidattion, dem Gegenstück
G
uresynthese[71]. Währennd sich bis dato die
zur Fettsäu
Übberlegungeen und Exp
perimente zzur biotech
hnologischen Produktiion von Fettsäuren
eiinzig auf diie Fettsäureesynthese bbeschränkt hatten, sch
hlug diese Arbeitsgru
uppe mit
ih
hrem Ansattz einen neuen
n
Wegg ein. Sie berichteten
n, dass diee Enzyme in den
A
Abbauwege der β-Oxid
dation nich
ht nur katab
bolisch, son
ndern auchh zum Aufb
fbau von
Feettsäuren genutzt
g
werrden könntten. Dies würde
w
im Allgemeinen
A
n in Wildty
ypzellen
32
aber durch eine vielfache Regulation des Abbauweges verhindert werden. Durch
Mutationen der Regulatoren FadR und AtoC konnte eine konstitutive Expression der
Abbauenzyme erreicht werden. Um bei Anwesenheit einer Kohlenstoffquelle der
Repression der Expression durch den cAMP-Rezeptor (crp) entgegengewirkt, wurde
dieser durch eine cAMP-unabhängige Variante ersetzt. Schließlich wurde durch die
Deletion von arcA und einiger nativer Fermentationswege sowie der Überexpression
einiger terminierender Enzyme die Produktion von Fettsäuren über die β-Oxidation
erzielt. Dieser Ansatz soll sich vor allem durch eine größere Effektivität auszeichnen,
da er anders als der natürliche Syntheseweg mit CoA- an Stelle von ACPIntermediaten arbeitet. Daher werden bei diesem Schritt ein Molekül ATP und ein
Acetyl-CoA eingespart.
2014 wurde dieser Ansatz von Lian und Zhao zum ersten Mal auch auf ein
[72]
eukaryotisches System, auf Saccharomyces cerevisiae, übertragen
.
1.3.2 Herstellung von ω-Hydroxyfettsäuren
Bei der biotechnologischen Produktion von ω-Hydroxyfettsäuren beschränken sich
die Ansätze bisher auf die Zufütterung von Fettsäuren verschiedener Länge zu
Monooxygenase-exprimierenden Zellen. Als Beispiel soll hier die Arbeit von Honda
Malca et al. genannt werden, die mit der Zufütterung von Fettsäuren zu E. coli-Zellen,
die CYP153A aus Marinobacter aquaeolei exprimieren, Umsätze zu Hydroxyfettsäuren
von mehr als 90 % erreichten[9].
1.4 Fettsäuresynthese in der Natur
Fettsäuren sind ein essentieller Bestandteil von Zellmembranen in Form von Phosphound Sphingolipiden[73], dienen als Energiespeicher und Signalmoleküle[74] oder zur
[75]
posttranslationalen Modifikation von Proteinen
. Die Fettsäuresynthese ist daher
universal in allen Lebewesen zu finden. Dabei werden zwei unterschiedliche
Grundtypen von Synthesearten unterschieden. Typ I findet man in den Zellen aller
Tiere sowie in Hefen und einigen Pilzen und wird nochmals in die Typen Ia und Ib
[67]
unterteilt
. Die Fettsäuresynthese des Typs I zeichnet sich dadurch aus, dass alle
Schritte des Synthesezyklus von einem einzigen Multienzymkomplex im Cytosol
katalysiert werden. Während sich der Multienzymkomplex in Typ Ia aus einem
Heterododecamer der Form α6β6, codiert von zwei Genen, zusammensetzt, besteht er
[76]
in Typ Ib aus einem Homodimer, welches von einem Gen codiert wird
33
. Die Typ II-
Synthese herrscht hingegen bei Prokaryoten, Pilzen, in pflanzlichen Plastiden und in
Mitochondrien vor (vermutlich auch bei Archaeen). Die katalysierten Schritte sind
hier die gleichen wie in der Typ I-Synthese, jedoch werden diese Reaktionen nicht von
einem Multienzymkomplex katalysiert, sondern von mehreren autonomen Enzymen,
die jeweils einen Schritt im Zyklus umsetzen und deren Gene (teilweise in Gruppen
organisiert) im gesamten Genom des betreffenden Organismus oder Organell verteilt
[77]
sind
. Bei Mykobakterien gibt es einige seltene Ausnahmen, die beide Synthese-
Typen besitzen[78].
1.4.1 Die Reaktionen der de novo Fettsäuresynthese
Infolge ihrer grundlegenden und wichtigen Eigenschaften ist die Fettsäuresynthese in
allen Lebewesen hochkonserviert. Grundsätzlich beinhaltet die Synthese einer
Fettsäure eine Aneinanderreihung diverser Claisen-Kondensationen und darauf
folgender Reduktionen, bei denen die entstehende Fettsäure in jedem Zyklus um eine
C2-Einheit verlängert wird (siehe Abbildung 1-3)[67,77,79].
Der initiale Schritt besteht zunächst in der Erzeugung von Malonyl-CoA, dem
Grundbaustein für Fettsäuren, durch die Carboxylierung von Acetyl-CoA. Hierbei
wird unter ATP-Verbrauch ein Hydrogencarbonat-Ion von der Biotin-Gruppe der
Acetyl-CoA-Carboxylase
auf
Acetyl-CoA
übertragen.
Dies
ist
die
Schrittmacherreaktion des gesamten Synthesezyklus. Danach werden jeweils Acetylund Malonyl-Reste von der Acetyl- bzw. Malonyl-Transacylase über eine
Thioesterbindung an die distalen Sulfhydryl-Gruppen der Phosphopantein-Arme von
Acyl-Carrier-Proteinen (ACP) gebunden (siehe Abbildung 1-3, Punkt ①). Das ACPProtein dient im Verlauf der Synthese als Fettsäuretransporter und verhindert, dass
die wachsende Fettsäure degradiert wird. Im nun folgenden Schritt findet die erste
Elongations-Kondensation der entstehenden Fettsäure statt: unter Abspaltung von
CO2 wird durch die 3-Ketoacyl-ACP-Synthase der Acetyl-Rest des Acetyl-ACP auf das
Malonyl-ACP übertragen ②. Hierbei entsteht Acetoacetyl-ACP. Die Keto-Gruppe am
dritten Kohlenstoffatom wird anschließend durch eine 3-Ketoacyl-ACP-Reduktase
unter NADPH-Verbrauch zu einer Hydroxy-Gruppe reduziert ③. Es folgt die
Dehydratisierung an Position 3 des neu entstandenen 3-Hydroxybutyryl-ACP zu
Crotonyl-ACP durch die 3-Ketoacyl-ACP-Dehydratase ④. In einem letzten ZyklusSchritt wird wieder unter NADPH-Verbrauch die Doppelbindung am C-2-Atom des
Crotonyl-ACP durch eine Reduktase, in diesem Fall die Enoyl-ACP-Reduktase,
34
reeduziert und
d es entsteh
ht schließlicch Butyryl-A
ACP ⑤. Dieeses Moleküül kann nun
n immer
w
wieder den Zyklus, beginnend mit der Kondensaation an eein Malon
nyl-ACP,
du
urchlaufen und so steetig um zw
wei Kohlensstoffeinheiteen verlängeert werden
n. In der
Reegel wird der Zyklus 8 bis 9 mal durch
hlaufen bis eine Ketttenlänge vo
on C-16
(P
Palmitinsäurre) oder C--18 (Stearin
nsäure) vorlliegt. Dann katalysiertt im finalen
n Schritt
eiine Thioesterase die Hydrolyse
H
ddes Acyl-A
ACP in die entsprechennde freie Fettsäure
F
un
nd ein freies Acyl-Caarrier-Proteiin ⑥. Die freie Fettsääure kann nun von weiteren
w
En
nzymen mo
odifiziert weerden (Verllängerung, Einführen
E
von
v Doppellbindungen
n, Einbau
in
n Phospholip
piden, usw..) ⑦ oder zuu einem spääteren Zeitp
punkt über die β-Oxid
dation zu
A
Acetyl-CoA abgebaut
a
werden
w
⑧.
Ab
bbildung 1-3
3: Schema derr Fettsäuresynnthese.
35
1.4.2 Regulation der Fettsäuresynthese
In E. coli erfolgt die Regulation der Fettsäuresynthese und ihrer Produkte im
Wesentlichen
über
drei
verschiedene Mechanismen.
Die
Enzyme
für
die
Fettsäuresynthese und -degradation werden auf transkriptionellem Weg von den
Repressoren FabR und FadR reguliert. FabR bindet ungesättigte Fettsäuren und
inhibiert dann durch Blockade der Operatoren von fabA und fabB deren Expression.
Bei Anwesenheit von überwiegend gesättigten Fettsäuren wird die Repression
[80]
abgeschwächt und fabA und fabB können vermehrt exprimiert werden
. Speziell
FabA ist für die Produktion von ungesättigten Fettsäuren verantwortlich, indem es cisDoppelbindungen in 3-Hydroxydecansäure einfügt[81]. Jedoch wird fabA in größerem
Ausmaß von FadR reguliert. FadR inhibiert die Gene für den Abbau von Fettsäuren in
der β-Oxidation, während es gleichzeitig fabA, fabB sowie fabHDG positiv reguliert.
Liegt eine erhöhte Menge an Acyl-CoA in der Zelle vor, bindet dieses an FadR und der
Repressor gibt die Promotoren der fad-Gene frei[81,82].
Die zweite Regulationsmöglichkeit erfolgt über den intrazellulären Acyl-ACPTiter. Ist dieser in der Zelle erhöht, kommt es zu einer Feedback-Inhibierung innerhalb
der Fettsäuresynthese. Es werden überwiegend drei Enzyme durch die Anwesenheit
[83]
von Acyl-ACPs gehemmt: die Acetyl-CoA-Carboxylase
, die die Bausteine für die
Fettsäuresynthese zur Verfügung stellt, die 3-Ketoacyl-ACP-Synthase III (fabH)[84], die
den ersten Kondensationsschritt zwischen Acetyl- und Malonyl-ACP durchführt,
[84]
sowie die Enoyl-ACP-Reduktase (fabI)
. Sowohl freie Fettsäuren als auch
ungebundenes ACP haben keinen Einfluss auf diese drei Enzyme.
Weiterhin wird die Fettsäurezusammensetzung der Zellmembranen in E. coli
durch die Temperatur beeinflusst. Bei niedrigeren Temperaturen werden vermehrt
ungesättigte Fettsäuren in die Membranen eingebaut, um diese fluider zu halten.
Durch die niedrigere Temperatur steigt die Präferenz von FabF für Palmitoleinsäure,
[85]
was eine vermehrte Produktion von Vaccensäure (18:1 cis-11) zur Folge hat
.
1.5 Thioesterasen
1.5.1 Funktion und Klasseneinteilung
Thioesterasen gehören zur Familie der Hydrolasen und werden daher in die Klassen
EC 3.1.2.1 - 30[86] eingeteilt. Im Allgemeinen katalysieren sie die Hydrolyse einer
Thioesterbindung zwischen einer Carbonylgruppe und einem Schwefelatom. Allein
36
aufgrund des universellen Charakters der Fettsäuresynthese, bei der sie für die
Freisetzung der Fettsäuren verantwortlich sind, finden sich Thioesterasen in allen
Lebensdomänen und -reichen. Doch Thioesterasen katalysieren nicht nur die Spaltung
eines Acylrests von einem ACP-Protein, als Substrate dienen auch CoA-, Glutathion[87]
und Ubiquitin-Thioester sowie Protein-Acyl-Bindungen
. Aufgrund dessen findet
man sie nicht nur in der Fettsäuresynthese, sondern auch in der Polyketidsynthese
und der nicht-ribosomalen Synthese von Proteinen. Weiterhin ist die Klassifizierung
der Thioesterasen historisch bedingt sehr heterogen: da die Einteilung der EC-Klassen
zu einem Zeitpunkt erfolgte da noch nicht viele Informationen über Primär- und
Tertiärstrukturen der einzelnen Enzyme vorlagen, erfolgte die Einteilung der Proteine
nach Substraten und katalysierter Reaktion. Heute ist bekannt, dass viele Enzyme, die
als Thioesterasen in der Literatur beschrieben sind, diese Aktivität eigentlich als
Nebenreaktion zeigen und ihre Hauptaktivität auch in anderen Bereichen liegen kann.
Als Beispiel diene hier die Thioesterase I (TesA) aus Escherichia coli, die neben ihrer
Aktivität gegen Thioester auch als Protease und Lysophospholipase dient[88]. Diese
Heterogenität der Klassifizierung führte zu einer neuen Klasseneinteilung, die von
Cantu et al. erarbeitet wurde[87]. Die Einteilung der Thioesterasen erfolgt nun in die
Familien TE1 – TE23, ausgehend von Aminosäuresequenzidentität, Übereinstimmung
der Tertiärstruktur sowie Konserviertheit und Position der katalytisch aktiven
Aminosäurereste. Tabelle 1-2 zeigt die Einteilung der Familien nach Cantu et al.[87]
sowie ihre umgesetzten Substrate.
Tabelle 1-2: Klassifizierung von Thioesterasen sowie deren Hauptfunktion nach Cantu et al.[87].
Familie
Substrat
Beispiele (Protein- oder Gennamen)
TE1
Acyl-CoA Hydrolase
Ach1
TE2
Acyl-CoA Hydrolase
ACOT1 – ACOT4, ACOT6
TE3
Acyl-CoA Hydrolase
TesA, ApeA, PlcD
TE4
Acyl-CoA Hydrolase
TesB
TE5
Acyl-CoA Hydrolase
TesC, YbaW
TE6
Acyl-CoA Hydrolase
Acot7, Acot11, Acot12
TE7
Acyl-CoA Hydrolase
Acot9, Acot10
TE8
Acyl-CoA Hydrolase
hTHEM2
TE9
Acyl-CoA Hydrolase
YbgC, TE-Domäne von MKS2
37
Faamilie
Substrat
Beeispiele (Prrotein- odeer Gennam
men)
TE
E10
Acyl-CoA Hydrolase
4HBT-I
TE
E11
Acyl-CoA Hydrolase
4HBT-II
TE
E12
Acyl-CoA Hydrolase
DNHA-CoA Hyddrolase
TE
E13
Acyl-CoA Hydrolase
PaaI, PaaD
D
TE
E14
Acyl-ACP Hydrolase
FatA, FatB
B
TE
E15
Acyl-ACP Hydrolase
CalE7
TE
E16
Acyl-ACP Hydrolase
TE-Domänen
T
n von Fettsääuresynthasen
TE
E17
Acyl-ACP Hydrolase
TE
E18
Acyl-ACP Hydrolase
TE
E19
Acyl-ACP Hydrolase
Acyltransferasenn, LuxD
TE
E20
P
Protein-Acy
yl Hydrolasse
PPT1, PPT
T2
TE
E21
P
Protein-Acy
yl Hydrolasse
Ly
ysophospho
olipasen, Caarboxyesterrase
TE
E22
Glutathion
n-Hydrolasee
TE
E23
Glutathion
n-Hydrolasee
TE-Domänen von Polykeetidsynthaseen in
Streptomycces
Typ III TEs für Po
olyketid- unnd nichtribo
osomale
Peptidsynthe
P
ese
Caarboxyesterrasen, S-Forrmylglutath
hion
Hydrolasenn
Glyoxalase II
1..5.2 Struk
kturelle Ch
harakteris tika
1..5.2.1 Hotd
dog‐Faltung
In
n den 23 Thioesterase
T
e-Familien herrschen fünf tertiääre Grundsstrukturen vor: am
m
meisten verbreitet ist die sogen
nannte „Ho
otdog“-Faltu
ung. Alle Thioesteraasen der
Faamilien TE44 – TE15 besitzen
b
dieese tertiäre Struktur. In
I der Hotddog-Faltung
g gibt es
keeine definieerte Bindetaasche und auch das Fehlen
F
einer konservieerten kataly
ytischen
Trriade oder Dyade führt zu einer Vielzahl an
a möglicheen katalytisschen Amin
nosäureKoombination
nen und Reeaktionsmeechanismen
n. Die Faltu
ung zeichnnet sich du
urch ein
H
Homodimer aus, in welchem sich
h zwei antip
parallele β-Faltblätter V-förmig um
u zwei
zeentrale α-H
Helices legen
n. Abbildun
ng 1-4 A un
nd B illustrrieren diesee Form der Faltung
am
m Beispiel der
d β-Hydro
oxydecanoyyl-Thioesterr-Dehydratase aus E. ccoli[89].
38
1..5.2.2 α/β‐Hydrolasen
A
Als zweithäu
ufigste Faltung finde t man bei den Thioesterase daas Motiv der
d α/βH
Hydrolase (ssiehe Abbildung 1-4 C
C) vor[90]. Die
D Familieen TE2 sow
wie TE16 bis
b TE22
w
weisen diesees Faltungsmotiv auff. Die zen
ntrale Grun
ndstruktur besteht in
n einem
(aanti-)paralleelen β-Faltb
blatt mit biis zu neun Strängen, deren Orieentierung zwischen
eiinzelnen En
nzymen wechseln kaann. Verbu
unden werd
den die falltblattbilden
nden βSttränge in vielen
v
Fällen durch eiinzelne odeer mehrere α-Helices,, vereinzeltte LoopReegionen zw
wischen diessen Elementten können
n variieren[990]. Die kataalytische Trriade der
α//β-Hydrolassen befindet sich in diesen vaariablen Lo
oop-Regioneen und istt jedoch
äu
ußerst konsserviert. Wäährend die Aminosäurrepositionen
n der Triadde in versch
hiedenen
En
nzymen abbweichen können,
k
lieegt sie jed
doch immeer in der Kombinatiion X –
H
Histidin - Säu
ure vor, wo
obei X für SSerin, Cysteein oder Asp
partat stehtt und Asparrtat oder
[900]
Glutamat als Säurerest fungieren
f
.
Ab
bbildung 1--4: A) seitlicche Ansicht der Hotdog--Faltung am Beispiel derr β-Hydroxy
ydecanoylTh
hioester-Dehy
ydratase FabA
A aus E. coli B
B) Blick entlan
ng der zentralen α-Helices. rot: α-Helicees, gelb: βFaaltblätter, grün
n: Loop-Regio
onen (pdb-Einntrag 1MKA, Abbildung errstellt mit Pym
mol)[89] C) Scchema des
α//β-Hydrolase--Motivs am Beispiel
B
einess Monomers von RifR au
us Amycolatop
opsis mediterra
anei (pdbEintrag 3FLA)[991]. Die Pfeile repräsentiereen β-Stränge, während Zyliinder die α-H
Helices darstelllen. Loopnen Abweichu
ungen in Forrm von klein
neren Struktu
urelementen und untersch
hiedlichen
Reegionen könn
Läängen enthalteen (Abbildung
g erstellt mit dder Blender 3D Software in
n Anlehnung an Ollis et al.[90]).
39
1..5.2.3 SGN
NH‐Hydrolasen
Fü
ür die Mittglieder derr Familie T
TE3 wurdee noch keiin eindeutiiges Faltun
ngsmotiv
poostuliert.
Jedoch
wurde
w
auufgrund
verschieden
v
ner
Kristaallstrukturen
von
TA
AP(-Mutanten) aus E. coli eine kkatalytischee Triade wie bei α/β-H
Hydrolasen (Serin H
Histidin - Asspartat)
Seequenzabsch
hnitte
vorgeschlag
v
gen[88].
daarauf
hin,,
Allerdings
A
dass
die
d
deuten
vvier
TE3-T
Thioesteraseen
konsservierte
nicht
[92]
H
Hydrolasenfaamilie, son
ndern den SGNH-Hy
ydrolasen zuzuordnenn sind
dieser
. SGNH-
H
Hydrolasen besitzen eine flavodooxinähnlich
he Faltung,, die durchh ein zenttrales βFaaltblatt, besstehend auss fünf paralllel liegendeen Strängen
n, und eineer variablen
n Anzahl
an
n umringen
nden α-Helicces charaktterisiert wirrd.
1..5.2.4 Mettallo‐β‐Lacttamasen
Th
hioesterasen der Fam
milie TE23 w
weisen ein
ne den Metallo-β-Lactaamasen verwandte
Faaltung auf. In ihrem ak
ktiven Zenttrum sind zwei
z
Zink-Ionen koorddiniert, die aktiv an
deer katalysieerten Reakttion mitwirrken könntten[93]. Die Faltung zeeichnet sich durch
zw
wei einand
der gegenüb
berliegendeen β-Faltbläätter aus, die von m
mehreren α-Helices
α
um
mringt werrden. Am Rande
R
der β-Faltblätteer ist das aktive
a
Zenttrum mit den
d zwei
Ziink-Ionen lo
okalisiert[944].
1..5.2.5 Sonsstige
Übber die Stru
ukturen, kaatalytische Aminosäurrereste und Mechanism
men der Mitglieder
deer Familie TE1
T gibt es bis dato nooch keine verlässliche
v
Literatur, ddaher bleiben diese
Frragen vorerrst ungeklärrt.
1..5.3 Katallytischer Mechanism
M
mus
A
Aufgrund der in großer Vielfalt vo rkommend
den Reaktion
nsmechanissmen in derr Familie
deer Thioesteerasen, wirrd nachfolggend die Besprechun
B
g der Mecchanismen auf die
beeiden größtten Thioestterasen-Gruuppen, die zusammen auch den größten Anteil
A
an
diiesen Enzym
me stellen, beschränkt.
b
.
1..5.3.1 Hotd
dog‐Thioessterasen
Fü
ür die Thioeesterasen mit
m Hotdog--Faltung ist der genauee Reaktionsm
mechanism
mus noch
un
nbekannt, jedoch
j
wurrden zwei M
Mechanismen zur Katalyse der H
Hydrolyse-R
Reaktion
voorgeschlageen: eine Einfach-Subsstitutionsreeaktion, in der ein W
Wassermoleekül als
N
Nukleophil die
d Thioesteerbindung angreift, un
nd eine Do
oppel-Substiitutionsreak
ktion, in
deem diese Funktion
F
ein Aspartatt oder Gluttamat übernimmt[95]. Die Erklärung der
40
Eiinfachsubsttitution erffolgt am B
Beispiel derr humanen
n Acyl-CoA
A Thioesteerase 13
(A
ACOT13, Un
niprot: Q9N
NPJ3) und iist in Reakttionsschemaa 4 A schem
matisch darrgestellt.
Beei diesem Mechanismu
M
us richten A
Aspartat 65 und Serin 83
8 ein Wasssermolekül aus und
ak
ktivieren dieses durch die Basenfuunktion dess Aspartat. Durch das H
Hydroxid-IIon kann
nu
un ein nuk
kleophiler Angriff
A
auff das C-Atom der Caarbonylgrupppe des Th
hioesters
sttattfinden und
u
ein teetrahedralerr Übergangszustand wird gebilildet. Durch
h einen
an
nschließend
den Proton
nentransfer von Histiidin 134 wird
w
die aabgehende ThiolatGruppe, verm
mittelt durch Serin 83, zum Thiol protoniert. Eine freie FFettsäure so
owie ein
ym A werden aus dem
m aktiven Zeentrum entllassen[95,96].
freies Coenzy
Bei der Doppelsubstitutiion, wie sie zum Beispiel 2012 für die 4H
Hydroxybenzzoyl-CoA Thioesteras
T
se aus Pseeudomonas spec. posttuliert wurrde[97,98],
grreift das Aspartat
A
im aktiven Z entrum sellbst als Nu
ukleophil deen Kohlensstoff der
Caarbonylgru
uppe
des von
Tyroosin
24 ausgerichteeten
Thiooesters
an (siehe
Reeaktionssch
hema 4 B). Bei Anweesenheit vo
on Wasser wird die aabgehende ThiolatGruppe prottoniert, wäh
hrend die A
Anhydrid-B
Bindung du
urch das enntstandene WasserN
Nukleophil in
n zwei Carb
bonsäuren h
hydrolysierrt wird.
Reeaktionsscheema 4: A) Vo
orgeschlagenee Einfachsubstitution bei Hotdog-Thioes
H
sterasen. Hierr dient ein
W
Wassermoleküll als Nukleoph
hil (adaptiert nach Cantu et
e al. (2014)[95]). B) Postulieerte Doppelsu
ubstitution
fü
ür eine Hotdo
og-Thioesterasse. Hier diennt ein Aspartaat selbst als Nukleophil
N
(aadaptiert nach
h Zhuang
et al. (2012)[98])..
41
Th
hioesterasen mit Hotd
dog-Faltungg benutzen
n sehr wahrrscheinlich jeweils ein
nen von
diiesen beiden
n Mechanissmen. Jedocch kann es aufgrund
a
dees Fehlens eeiner konseervierten
kaatalytischen
n Triade bezüglich
b
dder an der Reaktion beteiligtenn Aminosäu
uren zu
Un
nterschiedeen zwischen
n einzelnen Enzymen innerhalb
i
eiiner Familiee kommen[87].
1..5.3.2 α/β‐Hydrolasen
Der katalytissche Mechaanismus beii Thioesterrasen mit α/β-Hydrola
α
ase-Faltung ist dem
deer Serin-Pro
oteasen seh
hr ähnlich uund für allee Enzyme id
dentisch (R
Reaktionssch
hema 5).
In
n der Regel besteht die katallytische Trriade aus Serin - Hisstidin - Asp
partat[87].
Sttabilisiert durch
d
das Aspartat
A
akttiviert der Histidinrest
H
t das Serin ①[99]. Dieses greift
nu
un nukleop
phil am Carbonyl-Koh
hlenstoffato
om des Sub
bstrates an. Es bildet sich ein
Bindung zwischen
teetrahedralerr Übergang
gszustand ②
②, der du
urch eine kovalente
k
B
z
En
nzym und Substrat
S
zu
ustande kom
mmt. Durch
h einen Wasserstofftraansfer des Histidins
H
zu
ur Thiolatgrruppe kann
n diese das aaktive Zenttrum verlassen ③. Bei Anwesenheit eines
W
Wassermolek
küls wird dieses durch
h das Histidin aktiviert und kann nnun nukleo
ophil das
C--Atom der Carbonylgrruppe des E
Esters zwiscchen Substraat und Enzyym angreifeen ④. Es
biildet sich errneut ein teetrahedralerr Übergang
gszustand ⑤.
⑤ Nach dem
m Protonen
ntransfer
voom Histidin
n ist das Serrin regeneriiert, währen
nd die freie Fettsäure ddas aktive Zentrum
Z
veerlässt ⑥.
Reeaktionsscheema 5: Hydro
olyse-Mechannismus von α//β-Hydrolasen
n (adaptiert naach Hedstrom
m[99]).
42
1.5.4 Biotechnologische Anwendungen
Während die Möglichkeit der mikrobiellen Produktion von Kohlenwasserstoffen
schon vor mehreren Jahrzehnten entdeckt wurde, findet ihre biotechnologische
Anwendung erst seit etwa dem letzten Jahrzehnt statt. Hierbei wurden bisher
vermehrt Ansätze zur Produktion für Biokraftstoffe entwickelt. Diese zumeist
experimentellen Ansätze basieren oft auch auf der heterologen Expression einer
Thioesterase, um die Länge der gewünschten Zwischen- oder Endprodukte zu steuern.
So benutzten 2011 Nawabi et al. unter anderem verschiedene Thioesterasen aus
unterschiedlichen Clostridien-Stämmen, Escherichia, Pseudomonas und Mycobacterium
[100]
marinum um in E. coli Fettsäuremethylester und 3-Hydroxyfettsäuren herzustellen
.
Bereits 2010 nutzte die Arbeitsgruppe um Steen und Keasling pflanzliche
Thioesterasen
aus
Cuphea,
Arabidopsis
und
Umbellularia
[29]
Fettsäureethylester und Fettalkohole in E. coli zu synthetisieren
um
langkettige
. Der Ansatz führte
u.a. zu einer Patentierung[101] und der kommerziellen Nutzung dieser Technologie
durch die Firma LS9 (San Franscisco, CA, USA), jetzt Teil der Renewable Energy
Group (Ames, IA, USA). Zwei Jahre später veröffentlichten Zheng et al. eine Studie in
der sie die Ausbeute an langkettigen Fettalkoholen in E. coli auf etwa 600 mg L-1 durch
die Expression der Thioesterase BTE aus U. californica sowie weiteren Enzymen
steigern konnten[102]. Weitere Beispiele für den biotechnologischen Einsatz von
Thioesterasen finden sich bei der Produktion von Alkanen und Aldehyden[103],
Ketonen[104] und Triacylglycerolen für Öle[69,105].
1.5.5 Thioesterase FatB2 aus Cuphea hookeriana
Die Samen der Pflanze Cuphea hookeriana enthalten bis zu 50 % Octansäure und bis zu
25 % Decansäure. Aus diesen Samen wurde das 46 kDa große Enzym FatB2 (Uniprot[7]
Eintrag Q39514) erstmals 1996 von Dehesh et al. isoliert und beschrieben . Nach
Expressionsstudien in E. coli konnte die Arbeitsgruppe bei Aktivitätstests eine etwa
gleich hohe Aktivität der Thioesterase gegen Octanoyl-, Decanoyl-, Hexadecanoylund Octadecanoyl-ACP nachweisen, wobei die stärkste Aktivität gegen DecanoylACP vorlag. Nach der Klassifizierung von Cantu et al. ist FatB2 der ThioesteraseFamilie TE14 zuzuordnen und besitzt demnach eine tertiäre Struktur in der HotdogFaltung mit einer katalytischen Triade bestehend aus Cystein – Histidin –
Asparagin[87]. Weitere Strukturinformationen sind nicht bekannt, da es weder
Analysedaten zu Kristallstrukturen noch NMR-Daten zu diesem Protein gibt. Auch der
43
Versuch der Erstellung eines robusten Homologiemodells innerhalb der vorliegenden
Arbeit scheiterte am Fehlen einer validen Vorlage.
Biotechnologische Ansätze, die das Enzym einbinden, sind in der Literatur in
[29]
den letzten Jahren bisher erst zweimal beschrieben worden: Steen et al.
nutzten
2010 die Thioesterase, um in einer künstlichen Enzymkaskade in E. coli
Fettsäureethylester für die Produktion von Biodiesel herzustellen. Ebenfalls 2010
nutzte die Arbeitsgruppe Liu et al. ein ähnliches System, um unterschiedliche
Fettsäuren in Cyanobakterien zu produzieren[70,106]. Jedoch gibt es einige Patente, die
diese Thioesterase aus Cuphea beinhalten. So sicherte sich beispielsweise Dehesh
bereits 1998 die Rechte für ein Verfahren zur Produktion von mittelkettigen
Fettsäuren in transgenen Pflanzensamen[107]. Es bestehen weitere Patente der Firmen
LS9, Evonik Degussa, Calgene, Solazyme, Genomatica und anderer für Verfahren oder
genetisch veränderte Organismen, die dieses Enzym umfassen und sich mit der
Produktion von Fettsäuren, Alkanen, Fettalkoholen und Aldehyden beschäftigen
(exemplarische Patente [107,108,109,110,111]).
1.6 3-Ketoacyl-Synthasen
1.6.1 Funktion und Klasseneinteilung
In der Datenbank für thioester-aktive Enzyme „ThYme“ sind über 21 000 Sequenzen
für 3-Ketoacyl-Synthasen (auch einfach Ketoacyl- oder Oxoacyl-Synthasen genannt)
verzeichnet[112]. Ketoacyl-Synthasen katalysieren die Claisen-Kondensation in der
Fettsäure- oder Polyketidsynthese, bei der eine Acyl-Kette um eine C2-Einheit
verlängert wird. Als Substrate dienen den Ketoacyl-Synthasen dabei Acyl-CoAs und
Acyl-ACPs in Form von überwiegend Acetyl-CoA/ACP und Malonyl-CoA/ACP, aber
auch mit längerkettigeren Acylresten verknüpfte CoAs und ACPs[86]. Aufgrund ihrer
essentiellen Funktion in der Fettsäure- und Polyketidsynthese finden sich auch die
3-Ketoacyl-Synthasen wie die Thioesterasen in allen Lebensdomänen. Sie werden
unter der E.C.-Nummer 2.3.1 klassifiziert und damit den Acyltransferasen
zugerechnet.
Ketoacyl-Synthasen werden in die 5 Familien KS1 – KS5 unterteilt (siehe
Tabelle 1-3), die aufgrund der Übereinstimmung zwischen Primärstruktur,
katalytischer Aminosäureresten, Reaktionsmechanismen und Tertiärstruktur erstellt
[113]
wurden
.
44
Taabelle 1-3: Kllassifizierung von 3-Ketoaccyl-ACP-Syntthasen nach Chen
C
et al.[113].
Faamilie
Su
ubstrat
Hauptverrtreter
KS1
Malonyl-ACP + Acetyyl-CoA
3-Ketoacyl-ACP Synthasen III
KS2
Malonyl-C
CoA + Acyll-CoA
3-Keetoacyl-CoA
A Synthasen
n
KS3
Malonyl-A
ACP + Acyll-ACP
3-Ketoacyl-ACP SSynthasen I + II
KS4
Malonyl-C
CoA + Acyll-CoA
KS5
Malonyl-C
CoA + Acyll-CoA
Chalkon
n-, Stilben- uund Naring
geninSynthaasen
Fettsäure-El
F
longasen
1..6.2 Struk
kturelle Ch
harakteris tika
In
n der ThYm
me-Datenban
nk sind 1355 Strukturd
daten von Ketoacyl-Syn
K
ynthasen reg
gistriert.
Diese verteilen sich allee auf die Fam
milie KS1, KS3
K und KS
S4. Von denn Familien KS2
K und
KSS5 liegen keine
k
Struk
kturdaten voor, daher sind
s
über die
d tertiärenn Strukturen dieser
Sy
ynthase-Fam
milien kein
ne Aussageen möglich
h. Die Mitg
glieder der anderen Familien
F
zeeigen alle eine
e
sehr sttarke Ähnl ichkeit bezzüglich ihreer räumlichhen Struktu
ur. Diese
w
wird aus eineem Homodimer gebilddet. Jede Do
omäne besittzt ein 5-strrängiges β-F
Faltblatt,
w
welches von α-Helices umgeben w
wird. Die eiinzelnen Domänen laggern sich derart
d
zu
eiinem Dimerr zusammen
n, dass einee 5-lagige Struktur
S
des Schemas α-β-α-β-α entsteht
zur Faltungg des β-Oxiidations(siehe Abbild
dung 1-5). Aufgrund
A
deer großen Ähnlichkeit
Ä
nzym Thiollase I, wird diese Faltun
ng auch alss Thiolase-F
Faltung bezeeichnet[114].
En
ng 1-5: Beispie
iel der Thiolasse-Faltung
Abbildun
am Modeell eines Monnomers der KetoacylSynthase mtKAS aus Arabidopsis thaliana.
richten sich so
o aus, dass
Die Struktturelemente ri
sich fünff abwechselnnde Schichten
n aus αnd β-Faltblätttern bilden. In
n Rot sind
Helices un
α-Helices dargestellt, in Gelb β-F
Faltblätter
Grün.
und Loop--Regionen in G
45
Die Aminosäuren der katalytischen Triaden in den Familien KS1, KS3 und KS4 sind
hoch konserviert und bestehen immer aus der Kombination Cys – His – His/Asn[113].
In der Regel liegen zwei aktive Zentren im Kern des Dimers an der Grenzfläche der
Monomere vor. Für einen Vertreter der Familie KS2 legten Mutationsexperimente
nahe, dass auch er eine katalytische Triade mit der Zusammensetzung Cys – His –
[115]
His/Asn
besitzt und daher den in 1.6.3 erklärten Ping-Pong-Mechanismus zur
Katalyse der Kondensation von Malonyl-CoA an Acyl-CoA nutzt. Über die Familie
KS5 gibt es bisher kaum strukturelle Informationen. Hier sind weder Strukturen noch
katalytische Aminosäurereste bekannt.
1.6.3 Katalytischer Mechanismus
Die von den Ketoacyl-Synthasen katalysierte Kondensationsreaktion lässt sich in drei
Teile aufgliedern:
i) die Bindung eines Acylrests an das katalytisch aktive Cystein,
ii) die Decarboxylierung von Malonyl-CoA/ACP zur Erzeugung eines Carbanions,
iii) und die nukleophile Attacke dieses Anions auf den Carbonyl-Kohlenstoff des
gebundenen Acylrest zur Knüpfung einer neuen kovalenten Bindung.
Im ersten Schritt greift ein durch Histidin aktiviertes Cystein ähnlich dem
Mechanismus der α/β-Hydrolasen nukleophil das Kohlenstoffatom des Thioesters
zwischen Acylrest und ACP/CoA an um einen tetrahedralen Übergangszustand zu
bilden, der im Abgang eines freien CoA/ACP endet (Reaktionsschema 6 A).
Anschließend wird Malonyl-ACP/CoA nach der Bindung des Acylrests von den
beiden
Histidinen
Asparaginsäure)
der
im
katalytischen
aktiven
Triade
Zentrum
(alternativ
ausgerichtet
und
von
es
Histidin
und
kommt
zur
Decarboxylierung des Malonylrestes bei der ein Histidin das Proton aus der freien
Carboxygruppe des Malonyl aufnimmt. Es entstehen CO2 und ein Carbanion, das von
einem Enol-Zwischenprodukt resonanzstabilisiert wird (Reaktionsschema 6 B). Das
Carbanion kann nun die Carbonylgruppe am Kohlenstoff nukleophil attackieren und
erzeugt somit erneut einen tetrahedralen Übergangszustand. Mittels Abgabe des zuvor
aufgenommenen Protons durch das Histidin kann das Cystein regeneriert werden und
eine um eine C2-Einheit verlängerte Acylkette verlässt das aktive Zentrum
(Reaktionsschema 6 C).
46
Reeaktionsscheema 6: A) Nu
ukleophiler Anngriff des Cysstein und kov
valente Bindunng des Acylreests an das
En
nzym. B) Decarboxylierun
ng von Maloonyl-ACP/CoA
A zum Carba
anion C) Nukkleophiler An
ngriff des
Caarbanions auff den Carbon
nyl-Kohlensto ff und Freiseetzen der verllängerten Acyylkette (adaptiert nach
Qiiu et al. (1999))[116]).
1..6.4 3-Kettoacyl-ACP-Synthasse mtKAS aus
a Arabid
dopsis thalliana
Die 3-Ketoaacyl-ACP-Sy
ynthase mttKAS (Unip
prot-Eintrag Q8L3X9)) stammt aus
a den
M
Mitochondrieen von Ara
abidopsis thhaliana. Daas 461 Amiinosäuren llange Proteein wird
un
nter der E.C
C.-Nummerr 2.3.1.41 kllassifiziert und
u der Ketoacyl-Syntthasen-Fam
milie KS3
zu
ugeordnet. Seine Sequ
uenz wurde 1999 von der Arbeitssgruppe um
m Craig Veenter bei
deer Sequenzzierung von
n Chromossom 2 enttdeckt[117]. Im nachfoolgenden Jaahrzehnt
w
wurden verm
mehrt Datten über sseine Struk
ktur und Funktion ggesammelt.. So ist
m
mittlerweile bekannt, dass
d
die teertiäre Stru
uktur sich mit
m der Grrundstruktu
ur vieler
an
nderer Keto
oacyl-Synth
hasen deckt.. Sie besteh
ht aus einem
m Homodim
mer mit dem
m bereits
47
beekannten α-β-α-β-α-T
α
Thiolase-Falttungsmotiv
v[118]. Die katalytische Triade dess 49 kDa
grroßen Enzy
yms setzt siich aus Cysstein 209, Histidin
H
350
0 und Histiidin 389 zusammen
un
nd der Reaktionsmecchanismus folgt dem unter 1.6.3 beschrieebenen Pin
ng-PongM
Mechanismu
us[118]. Als Substrate
S
n
nutzt diese Synthase Acyl-ACPs
A
und Malon
nyl-ACP.
Beesonders interessant
i
ist das bbimodale Produktspeektrum dess Enzyms, da es
haauptsächlich
h C8- und C14-18-ACP
Ps[119] produ
uziert. Christensen ett al. schlug
gen 2007
naach der Stu
udie mehreerer Kristal
allstrukturen
n vor, dasss dieser Um
mstand verrmutlich
du
urch Isoleu
ucin 154, welches
w
mitttig in derr Acylbindeetasche lieggt und durrch eine
Rootation sein
ner lipophiilen Seitenkkette die Tasche
T
in ihrer
i
Längee begrenzeen kann,
heervorgerufeen wird (Ab
bbildung 1-66 A). Somitt wäre es nu
ur Acyl-AC
CPs mit eineer Länge
biis zu sech
hs Kohlenstoffatomen
n möglich in die Bindetasche zu gelang
gen und
veerlängert zu
u werden[1220]. Bei Beddarf rotiert die Seitenk
kette des Isooleucin wieeder aus
deer Bindetascche heraus und gibt diiese kompleett frei (Abb
bildung 1-6 B).
Ab
bbildung 1-6
6: Aufsicht auf ein Monom
mer von At mtKAS. In grrün ist die O
Oberfläche dess Proteins
daargestellt, der gelbe Bereich
h markiert hiier den Aminssäurerest von Isoleucin an Position 154. In rot ist
ein
n Teil einer in
i die Acylbin
ndetasche kooordinierten Hexansäure
H
geezeichnet. Ist der Aminosääurerest in
diee Tasche gekllappt (A), ist die Bindetascche verkürzt und
u nur Substrate bis eineer zu einer Länge von 6
Koohlenstoffatom
men können binden. Klapp
ppt der Amino
osäurerest au
us der Taschee heraus (B), so ist der
Kaanal lang genu
ug um auch Substrate
S
bis zzu einer Längee von 16 Kohllenstoffatomeen zu fassen.
48
1.7 Cytochrom P450 Monooxygenasen (CYP)
1.7.1 Funktion und Klasseneinteilung
Aus der Superfamilie der häm-haltigen P450-Enzyme sind etwa 21 000 Sequenzen[121]
bekannt, die in über 700 Familien[122] eingeteilt und unter der E.C.-Nummer ab 1.14.
klassifiziert werden. Aufgrund der vielfältigen von ihnen katalysierten Reaktionen
kommen CYPs in allen Bereichen des Lebens vor. Es wurden sogar zwei Vertreter
[123]
(CYP5253A1 und CYP5254A1) in einem Mimivirus beschrieben
. Neben der für
diese Arbeit interessanten Fähigkeit nicht-aktivierte C-H-Bindungen regioselektiv zu
hydroxylieren, katalysieren Monooxygenasen auch Dealkylierungen, oxidative
Desaminierungen,
Epoxidierungen
[124]
Dehalogenierungen
.
Sie
von
übernehmen
damit
C-C-Doppelbindungen
im
Anabolismus
und
wichtige
Syntheseschritte, beispielweise beim Aufbau von Steroiden, Gallensalzen oder
Prostaglandinen, während sie im Katabolismus durch ihre oxidative Aktivität
hydrophobe Stoffe eine bessere Löslichkeit ermöglichen und somit entscheidend zum
Abbau von pharmazeutischen Molekülen, Schad- und Giftstoffen, Mutagenen,
Herbiziden (in Pflanzen), usw. beitragen[125]. Monooxygenasen nutzen für ihre
Funktion molekularen Sauerstoff. Von diesem wird ein Atom in das Zielmolekül
eingebaut, während das zweite während dieser Reaktion zu Wasser reduziert wird.
Um ihre Funktionalität zu ermöglichen benötigen diese Enzyme pro Substrat neben
molekularen Sauerstoff zwei Elektronen und zwei Protonen, die über ein Redoxsystem
von NAD(P)H übertragen werden.
1.7.2 Strukturelle Charakteristika
Obwohl seit der Entschlüsselung der ersten Struktur eines CYP-Proteins 1987
(seinerzeit CYP101 aus Pseudomonas putida[126]) weit über 40 weitere Strukturen von
P450-Enzymen erarbeitet wurden, hat sich am ersten grundlegenden Strukturmodell
wenig geändert: alle CYPs weisen die einzigartige, herzförmige sogenannte P450Faltung auf (Abbildung 1-8). Das gesamte Protein lässt sich in zwei Domänen
unterteilen: eine kleinere β-Domäne, die überwiegend aus β-Strängen besteht und eine
größere α-Domäne, die überwiegend aus α-Helices zusammengesetzt ist. Die
α-Domäne enthält das aktive Zentrum, während die β-Domäne den Substratkanal
49
Abbildu
ung 1-7: Sequ
uenzlogo der Konsensusseq
quenz der
konservieerten Amino
osäuren um die Hämgru
uppe. Die
Größe ein
nzelner Buchstaben korrelliert mit ihrerr an dieser
Stelle geefundenen Hä
äufigkeit in aallen Sequenzen (hier:
1023)[127].
en
nthält und mit der Errkennung ddes Substraates assoziieert wird[1288]. Im Zentrrum des
En
nzyms ist die prostheetische Häm
mgruppe gelegen.
g
Zw
war besteheen Untersch
hiede in
un
nterschiedliichen
(U
Unter-)Famiilien
Berreichen
der
zw
zwischen
P450-Enzyyme,
den
jedo
och
tertiären
nimmt
die
Struukturen
einzelner
e
Koonserviertheit
der
Prrimärstrukttur mit zun
nehmender Nähe zur Hämgruppe
H
e stark zu. H
Höchst kon
nserviert
istt hierbei ein
n Cysteinreest im Kern
n des Enzym
ms, der als fünfter
f
Ligaand die Häm
mgruppe
im
m Protein veerankert. Den Kern billdet hierbei die Gruppee der 4 α-H
Helices D, E, I und L,
diie beiden einzelnen
e
Helices
H
J un
nd K sowiie zwei β-F
Faltblätter. In diesem Bereich
w
wurde die Konsensus-S
K
Sequenz [FW
W]-[SGNH]]-x-[GD]-{F
F}-[RKHPT] -{P}-C-[LIV
VMFAP][G
GAD] um das Häm
m-bindende Cystein herum
h
als stark konnserviert ermittelt
e
(A
Abbildung 1-7)
1 [129]. Auch die Sequuenz [AG]-G
G-G-X-[DE]-T-[TS] im
m zentralen Teil der
I-H
Helix ist staark konserv
viert und w
wird mit derr Sauerstofff-Bindung uund -Aktivieerung in
Veerbindung gebracht. Die
D Sequen
nz E-X-X-R in Helix K dient zurr Stabilisierrung des
geesamten Keerns.
Abbildu
ung 1-8: M
Modell von CYP102A1
C
(pdb-Ein
ntrag 1JPZ). In Rot sind α-Helices
gekennzzeichnet, in G
Gelb β-Sträng
ge und in
Grün diie Loop-Regioonen. Die Hämgruppe
ist mittig in Magennta dargestelltt. Der im
Bild links oben darggestellte Bereeich bildet
meist β-Stränngen die kleinere βmit zum
Domänee
des
Enzzyms,
die
mit
der
Substratterkennung inn Verbindung
g gebracht
wird. Der
D Rest des Enzyms wird als αDomänee bezeichnet uund enthält das
d aktive
Zentrum
m[128].
50
1.7.3 Katalytischer Mechanismus
P450 Enzyme katalysieren, wie bereits erwähnt, eine Vielzahl an unterschiedlichen
Reaktionstypen. Der Mechanismus vieler dieser Reaktionen ist noch weitestgehend
unklar, deshalb wird hier nur die für diese Arbeit wichtige und zugleich am besten
dokumentierte regioselektive Hydroxylierungsreaktion besprochen.
Die Hämgruppe ist das Zentrum dieser katalytischen Aktivität. Über einen
konservierten Cysteinrest als fünften Ligand ist sie an das Enzym angebunden. Im
Ruhezustand ist ein Wassermolekül als sechster Ligand in das aktive Zentrum
integriert. Bei Eintritt eines alkylischen Substrats wird das Wassermolekül verdrängt
[128,130,131,132]
(siehe Reaktionsschema 7 ①)
. Es kommt dadurch zur Erhöhung des
Redoxpotentials der Hämgruppe und zu einer Verschiebung der Soret-Bande. Steht
dem Enzym nur Kohlenstoffmonoxid statt des molekularen Sauerstoffs zur Verfügung
kommt es zur Bindung von CO im aktiven Zentrum des Enzyms und die Bande
verschiebt sich von 420 auf 450 nm, was zur Namensgebung dieser Enzyme führte.
Durch die oben beschriebene Änderung des Redoxpotentials kommt es zur ersten
Reduktion des Zentralatoms des Porphyrinsystems von der Ferri- zur Ferroform ②
und anschließend zur Bindung von molekularem Sauerstoff ③. Nach der Aufnahme
eines weiteren Elektrons ④ und eines Protons ⑤ entsteht die Hydroperoxo-Form des
Enzyms. Durch Aufnahme eines weiteren Protons ⑥ kommt es zur Spaltung der
intramolekularen Sauerstoffbindung und zur Reduktion eines der Sauerstoffatome zu
Wasser. Gleichzeitig entsteht ein instabiler und hochreaktiver Ferryl-Komplex, der
vom anwesenden Substrat ein Wasserstoffatom übernimmt. Es entsteht ein AlkylRadikal, das dann seinerseits die komplette Hydroxy-Gruppe vom Eisenatom
übernimmt ⑦. Durch ein Wassermolekül wird das Endprodukt als sechster Ligand
verdrängt und das Enzym kehrt in den Ausgangszustand zurück ⑧.
51
Reeaktionsscheema 7: Reakttionsmechanissmus von P4550 Monooxyg
genasen für diie Hydroxylieerung von
nicht-aktivierteen C-H-Bindu
ungen (adaptieert nach Wercck-Reichhart et
e al. und Stryyer et al.[128,1300])
Um
m die besch
hriebenen Reaktionen
R
katalysiereen zu könneen, interagiieren fast allle CYPs
m
mit einem oder mehrerren Redoxppartnern, um
m die benö
ötigten Redduktionsäqu
uivalente
zu
u erhalten. Hierbei wu
urde eine seehr große Vielfalt
V
an möglichen
m
R
Redoxsystem
men vor
alllem in Baktterien gefun
nden. Diesee Vielfalt wu
urde nach Anzahl
A
undd Art der beteiligten
Prroteine in 10
1 Klassen aufgegliede
a
rt, wobei die Klassen I und II die meisten deer bisher
[133]
beekannten Redoxsystem
me abdecken
n
. In Klaasse I sind alle
a dreiteililigen Redox
xsysteme
au
us Bakterieen und Mittochondrien
n enthalten
n. Sie besteehen aus eeiner FAD--haltigen
Reeduktase, die
d Reduktiionsäquival ente von NAD(P)H
N
zu
z einem Fe
Ferredoxin (zumeist
(
voom Typ Fe
F 2S2, selten
ner vom T
Typ Fe3S4 oder Fe4S4)[134], trannsportiert, welches
seeinerseits diese
d
dann an
a P450 abbgibt. In Baakterien sin
nd alle drei Komponen
nten frei
lööslich, wäh
hrend in Mitochon
ndrien dass Reduktase- und
das P4500-Protein
m
membrangebbunden sin
nd. Klasse II beinh
haltet die meisten R
Redoxsystem
me aus
Eu
ukaryonten
n. Das einfaachste Systeem besteht hier aus ein
ner P450-M
Monooxygen
nase und
eiiner P450 Reduktase (CPR), w
welche seh
hr effektiv FAD undd FMN nu
utzt um
52
Reduktionsäquivalente von NADPH zu übertragen[135]. Die Reduktase ging im Laufe
der Evolution aus einer Fusion zweier Vorläuferproteine hervor[136]. Diesem Trend
folgend gibt es auch Redoxsysteme, die nur noch aus einer einzigen Polypetidkette
bestehen,
die
[137]
nachkommen
aber
trotzdem
allen
Funktionen
des
Elektronentransfers
. Diese Systeme sind den Klassen VII und VIII zugeordnet. Ein
Beispiel für ein solches einteiliges System ist das Redoxsystem von CYP102A1 aus dem
Bodenbakterium Bacillus megaterium. Es besteht aus der Fusion einer Cytochrom P450
Domäne und einer Cytochrom P450 Reduktasedomäne, die höchsteffektiv die
Reduktionsäquivalente von NADPH auf die Hämgruppe der Monooxygenasedomäne
überträgt[138].
1.7.4 Biotechnologische Anwendungen
Die selektive Funktionalisierung nicht aktivierter C-H-Bindungen war für chemische
Synthesen seit jeher äußerst interessant, da sie billige Rohstoffe wie Alkane in
wertvollere funktionalisierte Moleküle umwandelt, die dann ihrerseits als Edukte für
komplexere Synthesen dienen können. Die meisten momentanen Verfahren zur rein
chemischen Aktivierung solcher Bindungen beruhen auf Radikalreaktionen bei sehr
hohe Temperaturen, die aber unter anderem zur Nebenproduktbildung führen und
sich auch schwer selektiv steuern lassen[139]. P450 Monooxygenasen bieten sich daher
aufgrund ihres großen Substratspektrums, ihrer Stereo- und Regioselektivität und der
milden Reaktionsbedingungen für solche Reaktionen an. Jedoch gibt es trotz dieser
Vorteile bisher erst wenige Anwendungen für Monooxygenasen. Die Nachteile der
P450-Proteine bestehen hauptsächlich in der zu geringen Enzymstabilität, zu niedrigen
Umsatzraten
und
der
Nutzung
des
teuren
Cofaktors
[140]
Regenerationssystem desselben notwendig macht
NAD(P)H,
der
ein
. Daher lohnt sich der Einsatz
dieser Proteine eher im Bereich der Produktion hochpreisiger Moleküle wie sie
beispielsweise die Pharmaindustrie in Form von isomerreinen Vorläufermolekülen
oder Molekülen mit langen Syntheserouten benötigt. So wurde 2003 von
Szczebara et al. ein S. cerevisiae-Stamm entwickelt, der unter anderem mithilfe
verschiedener Monooxygenasen Glucose zu Hydrocortison metabolisiert[141]. 5 Jahre
zuvor hatte dieselbe Arbeitsgruppe um Duport et al. eine Studie veröffentlicht, in der
sie mit rekombinanten S. cerevisiae-Stämmen bis zu 60 mg L-1 Pregnenolon in 100 h
produzierten[142]. 2006 berichteten Ro et al. von ihrem erfolgreichen Versuch mit
-1
CYP71AV1 aus Artemisia annua in S. cerevisiae bis zu 100 mg L Artemisininsäure,
53
einem Vorläufermolekül von Artemisinin, herzustellen. Aber auch Prozesse zu
einfacheren Produkten wurden etabliert, da sie sich durch hohe Ausbeuten
auszeichnen, so zum Beispiel der von Lu et al. beschriebene Prozess zur Produktion
von langkettigen Hydroxyfettsäuren in Candida tropicalis, bei dem Konzentrationen
-1
-1
von über 170 g L 14-Hydroxytetradecansäure und über 6 g L der entsprechenden
Dicarbonsäure in einer 148 h-Fermentation erreicht wurden.
*
1.7.5 P450 Monooxygenase CYP153AMaq -CPRBM3
Die 127 kDa große Monooxygenase entstammt der Arbeit von Scheps et al.[8] Sie
besteht aus der Fusion einer Mutante der P450 Domäne von CYP153A aus
Marinobacter aquaeolei (CYP153AMaq) und der Cytochrom P450 Reduktasedomäne von
CYP102A1 aus Bacillus megaterium (CPRBM3). Monooxygenasen der Familie CYP153A
gehören zu den Klasse I-CYPs und hydroxylieren bevorzugt die ω-Position in
aliphatischen Molekülresten. Es wurden dabei die Oxidationen von Alkanen, Alkenen,
primären Alkoholen, Fettsäuren sowie aromatischen Molekülen beschrieben.
CYP153AMaq katalysiert vermehrt die ω-Hydroxylierung von Alkoholen und
[143]
Fettsäuren, hier vor allem in den Kettenlänge-Bereichen C12 - C14 und C16:1 - C18:1
.
Über bioinformatische Ansätze konnten mehrere hot spots in der Struktur von
CYP153AMaq identifiziert werden, die es über Einzelmutationen erlauben, die
Substratspezifität und/oder Enzymaktivität zu beeinflussen. Für das vorliegende
*
Projekt ist besonders die Mutante G307A von CYP153AMaq (CYP153AMaq ) interessant,
da in der Studie von Honda et al. belegt wurde, dass ihre Substratspezifität zu
[143]
mittelkettigen Fettsäuren bis hin zur Octansäure verschoben ist
. Während die
Wildtypform von CYP153AMaq kaum Octansäure umsetzte und ihr gegenüber einen
kcat-Wert von 0,13 ± 0,01 min-1 aufwies, betrug der kcat-Wert der G307A-Mutante
-1
2,55 ± 0,26 min , eine mehr als 19-fache Steigerung der Umsatzrate.
Das Klasse VIII-P450 System CYP102A1 aus B. megaterium wurde als das System
mit der bisher höchsten Umsatzrate beschrieben. Ein Grund dafür mag, neben der
hohen turnover number der Monooxygenase selbst, in der äußerst effizienten
Übertragung
der
Reduktionsäquivalente
von
NADPH
liegen[144].
Die
Reduktasedomäne dieses Systems (CPRBM3) besteht aus einer Ferredoxinreduktaseähnlichen FAD-Region und einer FMN-bindenden Region[145], die jeweils ein Elektron
übertragen können. Das Redoxsystem von CYP153A ist hingegen ein dreiteiliges
Proteinsystem (P450 + Reduktase + Ferredoxin), dessen Zusammenspiel schwer zu
54
stteuern und für Störun
ngen in derr Elektroneenübertragu
ung anfälligger ist. Um
m diesen
Um
mstand zu
u vermeiden, wurdee die CPR
RBM3-Domäne als Errsatz des nativen
*
Reedoxsystem
ms an die Monooxyge
M
enase-Domääne CYP153
3AM.aq. fussioniert. Beei einem
diirekten
Vergleich
zwischen
z
CYP153AMaq
M -CPRBM3
und
*
CY
YP153AMaq -CPR
BM3
(n
nachfolgend
d der Einfaachheit we gen CYP*-CPR genan
nnt) bei deer Umsetzu
ung von
Dodecansäurre setzte diee Mutante 224 % mehr Substrat
S
um
m[146].
1..8 Zielseetzung diieser Arb
beit
A
Als Modello
organismus kam in ddieser Arbeeit das Bak
kterium Esscherichia coli
c
zum
Eiinsatz,
weelches
au
ufgrund
seeines
sch
hnellen
Wachstums,
W
seiner
leichten
Ku
ultivierbark
keit, seinerr einfacheen genetiscchen Manipulierbarkkeit durch bereits
w
weitläufig etablierte
e
Methoden
M
uund seinerr weitgehend vollstänndig verstaandenen
Feettsäure-Bio
osynthese besonders
b
g eeignet ist.
Ab
bbildung 1-9
9: Übersicht der Modifikatioonen in E. colli zur Produktion von (8-Hyydroxy-)Octan
nsäure.
Um
m die eingaangs der Ein
nleitung erw
wähnten Ziiele dieser Arbeit
A
zu errreichen, wurde
w
sie
in
n drei Absch
hnitte unterrteilt:
Der erste
e
Teil der
d Arbeit beschäftigtte sich mit der de novvo Produkttion von
Octansäure, die im spätteren Prozeess als Subsstrat weiterv
verwendet wird. Hierzzu sollte
deer natürlicche Fettsäu
ure-Biosyntthesezyklus durch diie Überexppression heterolog
h
exxprimierter pflanzlicheer Proteine,, der Thioessterase FatB
B2 aus Cuphhea hookeriiana und
deer 3-Ketoaccyl-ACP-Sy
ynthase mttKAS aus Arabidopsiss thaliana, derart um
mgelenkt
w
werden, dasss überwiegeend das Zieelprodukt Octansäure
O
produziertt und aus der
d Zelle
au
usgeschleusst wird.
55
Im zweiten Teil der Arbeit sollte ein Zellsystem konstruiert werden, das dieses
Vorläufer-Molekül durch den Einsatz der modifizierten P450 Monooxygenase
*
CYP153AMaq -CPRBM3 terminal
in
ω-Position
hydroxyliert,
um
so
die
8-
Hydroxyoctansäure als Zielmolekül zu erhalten.
Im letzten Teil sollte versucht werden ein screening-Verfahren zu entwickeln,
welches es ermöglicht, Enzymvarianten der in dieser Arbeit verwendeten Thioesterase
FatB2 zu detektieren, mit denen es möglich wäre, den entwickelten Prozess mit
kürzerkettigen Fettsäuren durchzuführen.
56
2 Materialien und Methoden
2.1 Materialien
2.1.1 Chemikalien und Enzyme
Alle Chemikalien und Medien wurden, soweit nicht anders vermerkt, in analytischer
Reinheit oder höher, von den Firmen Sigma-Aldrich (Taufkirchen, Deutschland),
Riedel-de Haën (Seelze, Deutschland), Fluka Chemie (Buchs, Schweiz), Difco (Detroit,
Mi, USA) und Carl Roth (Karlsruhe, Deutschland) bezogen. Eine vollständige Liste
aller Chemikalien befindet sich im Anhang unter 6.1 auf Seite 160. Alle Enzyme und
Enzympuffer wurden, soweit nicht anders vermerkt, von den Firmen Thermo Fisher
Scientific Biosciences (St. Leon-Rot, Deutschland), Agilent Technologies (Waldbronn,
Deutschland) und New England Biolabs (Frankfurt/Main, Deutschland) bezogen. Das
Expressionsplasmid pJeM1 wurde freundlicherweise von Dr. Josef Altenbuchner
(Universität Stuttgart, Deutschland) zur Verfügung gestellt. Prof. Dr. Jay D. Keasling
(University of California, Berkeley, Ca, USA) überließ uns das Plasmid pES120. Das
Hefe-Plasmid pCT302-FatB2 und der S. cerevisiae-Stamm EBY100 stammten aus der
Arbeitsgruppe von Prof. Dr. Harald Kolmar (Technische Universität Darmstadt,
Deutschland). Die Plasmide pMA-T-FatB2 und pMA-T-mtKAS wurden durch die
Firma GeneArt (Regensburg, Deutschland) synthetisiert. Die Plasmide enthielten
jeweils eine für E. coli codon-optimierte Version der Gene FatB2 aus Cuphea
hookeriana und mtKAS aus Arabidopsis thaliana (Original- und optimierte Sequenz
befinden sich im Anhang unter 6.2, Seite 162).
57
2.1.2 Medien und Puffer
M9 Minimal-Medium
12,8 g L-1
3gL
-1
0,5 g L-1
1 g L-1
Dinatriumhydrogenphosphat-Heptahydrat
Kaliumdihydrogenphosphat
Natriumchlorid
Ammoniumchlorid
2 mL L
-1
1 M Magnesiumsulfat-Heptahydrat
1 mL L
-1
0,1 M Calciumchlorid
10 mL L
-1
20 % Glucose
LB Medium (lysogenic broth)
10 g L
-1
5 g L-1
10 g L-1
Trypton
Hefeextrakt
Natriumchlorid
TB Medium (terrific broth)
12 g L
-1
24 g L-1
Trypton
Hefeextrakt
4,6 mL L-1
Glycerol (87 %)
100 mL L-1
1 M Kaliumphosphatpuffer pH 7,0
SOC Medium (super optimal broth with catabolite repression)
20 g L
-1
5 g L-1
0,5 g L-1
Trypton
Hefeextrakt
Natriumchlorid
2,5 mL L-1
1 M Kaliumchlorid
10 mL L-1
1 M Magnesiumchlorid
20 mL L
-1
1 M Glucose
58
YPD Medium (yeast peptone dextrose)
20 g L-1
Pepton
10 g L-1
Hefeextrakt
20 g L
-1
Dextrose
SD + CAA Medium (synthetic minimal dextrose medium with casamino acids)
6,7 g L-1
Hefe-Stickstoff-Basismedium ohne Aminosäuren
5,4 g L
-1
Dinatriumhydrogenphosphat
8,56 g L
-1
Natriumdihydrogenphosphat-Hydrat
20 g L-1
5 g L-1
Dextrose
Casaminosäuren
Alle Medien und Zusätze wurden vor der Verwendung in einem Autoklaven bei
121 °C und 1 bar Überdruck für 25 min sterilisiert. Für den Einsatz von Festmedien
wurden vor dem Sterilisieren 1,5 % (w/w) Agar zu den Medien zugegeben.
Entsprechend der in den Kulturen eingesetzten Plasmide, wurde den Medien nach
dem Autoklavieren steril filtriertes Ampicillin (100 µg mL-1), Kanamycin (30 µg mL-1),
Tetracyclin (12,5 µg mL-1) oder Chloramphenicol (34 µg mL-1) zugesetzt.
2.1.3 Stämme
Tabelle 2-1: Stämme
ITBNr.
Stamm
Genotyp
Quelle
-
-
Escherichia coli
BL21(DE3)
F- ompT gal dcm lon hsdSB(rB mB )
λ(DE3 [lacI lacUV5-T7 gene 1 ind1
sam7 nin5])
Escherichia coli
BW25113
National
F ∆(araD-araB)567 ∆lacZ4787(::rrnBInstitute of
3) λ- rph-1, ∆(rhaD-rhaB)568,
Genetics,
hsdR514
Mishima, Japan
ITB2040
Escherichia coli
BW25113∆fadD
fadD Deletion in BW25113
National
Institute of
Genetics,
Mishima, Japan
ITB2041
Escherichia coli
fadE Deletion in BW25113
National
ITB7
ITB2039
59
Invitrogen,
Darmstadt,
Deutschland
ITBNr.
Stamm
Genotyp
Quelle
BW25113∆fadE
Institute of
Genetics,
Mishima, Japan
-
-
ITB15
Escherichia coli
C41(DE3)
F- ompT gal dcm hsdSB(rB mB )(DE3)
(und mindestens eine weitere nicht
charakterisierte Mutation)
Universität
Hohenheim,
Deutschland
ITB4
Escherichia coli
DH5α
F- Φ80lacZ∆M15 ∆(lacZYA-argF)
+
U169 recA1 endA1 hsdR17 (rK mK )
phoA supE44 λ– thi-1 gyrA96 relA1
Invitrogen,
Darmstadt,
Deutschland
ITB2049
Escherichia coli
KK2
attTn7::tetA-fatB2 Integration in
BW25113∆fadD
diese Arbeit
ITB254
Escherichia coli
Origami B
F ompT hsdSB(rB mB ) gal dcm lacY1
ahpC
gor522::Tn10 (TcR) trxB::kan (DE3)
Invitrogen,
Darmstadt,
Deutschland
Escherichia coli
XL-1 blue
endA1 gyrA96(NalR) thi-1 recA1
+
relA1 lac glnV44 F'[ ::Tn10 proAB
+
q
lacI ∆(lacZ)M15] hsdR17(rK mK )
Stratagene
Europe,
Amsterdam,
Niederlande
-
ITB12
-
MATa AGA1::GAL1­AGA1::URA3
Saccharomyces
ITB2047
ura3­52 trp1 leu2-∆200 his3-∆200
cerevisiae EBY100
pep4::HIS3 prb11.6R can1 GAL
Prof. Dr. H.
Kolmar, TU
Darmstadt,
Deutschland
2.1.4 Plasmide
Tabelle 2-2: Plasmide
ITB-Nr.
Plasmid
Relevante Gene
pBAD18-PSC
araPBAD, pBR322, AmpR, CmR
ITB2046
pBAD18-CYP
CYP153AMaq*-CPRBM3 als NcoIXbaI Fragment in pBAD18-PSC
diese Arbeit
pITB1160
pBAD18-mtKAS
mtKAS als NcoI-XbaI Fragment
in pBAD18-PSC
diese Arbeit
pCP20
FLP1, λ pR , AmpR, CmR
-
-
ts
60
Quelle
Phillip Scheller,
Uni Stuttgart,
Deutschland
[147]
ITB-Nr.
-
-
Plasmid
Relevante Gene
pCT302-FatB2
TRP1, pBR322, AmpR, CEN/ARS,
GAL10 Promotor, Aga2p, MycEpitop, HA-Epitop, fatB2
R
Quelle
Prof. Dr. H.
Kolmar, TU
Darmstadt,
Deutschland
Merck KGaA,
Darmstadt,
Deutschland
pET32a
trxA, pBR322, Amp
pJeM1
6xHis-eGFP, rhaPBAD, pBBR1,
R
Kan
-
pJeM1-FatB2
fatB2 als BamHI-HindIII
Fragment in pJeM1
diese Arbeit
-
pJeM1-mtKAS
mtKAS als BamHI-HindIII
Fragment in pJeM1
diese Arbeit
pITB333
po
R
[148]
MoBiTec GmbH,
Göttingen,
Deutschland
pITB1162
pJL3
lac , p15A1, Cm , BRP
pITB469
pJOE4782.1-CYP
CYP153AMaq*-CPRBM3, rhaPBAD,
R
pBBR1, Kan
-
pKD46
ts
gam, bet, exo, araPBAD, A101 ,
AmpR
[149]
pITB1158
pKiM1
6xHis, rhaPBAD, pBBR1, KanR
diese Arbeit
ITB2043
pKiM2
trxA-fatB2 als BamHI-HindIII
Fragment in pJeM1
diese Arbeit
pITB1159
pKiM4
trxA-fatB2* als BamHI-HindIII
Fragment in pJeM1
diese Arbeit
pITB1163
pMA-T-FatB2
[146]
GeneArt,
Regensburg,
Deutschland
R
fatB2, ColE1, Amp
GeneArt,
pMA-T-mtKAS
mtKAS, ColE1, Amp
Regensburg,
Deutschland
Genkarten der Plasmide pBAD18-CYP, pBAD18-mtKAS, pCT302-FatB2, pJeM1-FatB2,
R
pITB1164
pJeM-mtKAS, pKiM1, pKiM2 und pKiM4 befinden sich im Anhang (siehe 6.3, ab
Seite 168 ).
61
2.1.5 Primer
Tabelle 2-3: Verwendete Primer
Name
Sequenz
Tm
Ch FatB2_fwd
5’-GAGCTCGGATCCGAATT
CATGGTTG-3’
55 °C PCR fatB2 von pMA-T-FatB2
Ch FatB2_rev
5’-GGTACCAAGCTTTCTAG
ATTAGCTAAC-3’
54 °C
Reverseprimer für fatB2 von
pMA-T-FatB2
Ch FatB2_neu_fwd
5’-CGCGGATCCAAAGCCA
ATGGTAGCGCAGTTAGCC
TG-3’
64 °C
Vorwärtsprimer für fatB2*
mit SacI-Erkennungssequenz
Ch FatB2_neu_rev
5’-CGGTAAGCTTTCTAGAT
TAGCTAACGCTATTACC-3’
64 °C
Reverseprimer für fatB2* mit
HindIII-Erkennungssequenz
trx-pJeM_fwd
5’-CGCGGATCCCATATGAG
CGATAAAATTATTCACCT
GACTGAC-3’
60 °C
Vorwärtsprimer für trxA mit
BamHI-Erkennungssequenz
trx-pJeM_rev
5’-CGAGCTCGGCCAGGTTA
GCGTCGAGG-3’
60 °C
Reverseprimer für trxA mit
SacI-Erkennungssequenz
CYP-NcoI_fwd
5’-CATGCCATGGGTATGCC
AACACTGCCCAGAACATT
TG-3’
Vorwärtsprimer
für
59 °C CYP153AMaq*-CPRBM3
mit
NcoI-Erkennungssequenz
CYP-XbaI_rev
5’-CTAGTCTAGATTACCCA
GCCCACACGTCTTTTGC-3’
Reverseprimer
für
59 °C CYP153AMaq*-CPRBM3
mit
XbaI-Erkennungssequenz
mtKAS-NcoI_fwd
5’-CATGCCATGGCCAGCCA
TCGTCGTGTTG-3’
60 °C
Vorwärtsprimer für mtKAS
mit NcoI-Erkennungssequenz
mtKAS-XbaI_rev
5’-CTAGTCTAGATTAAATG
CTTGCAAACAGCAGGCTT
GC-3’
62 °C
Reverseprimer mtKAS mit
XbaI-Erkennungssequenz
tetA-coli_fwd
5’-GTTACGGTTGAGTAATA
AATGGATGCCCTGCGTAA
GCGCCTAATTTTTGTTGAC
ACTCTATCATTGATAGAGT
TATTTTACCACTCC-3’
Vorwärtsprimer für tetA mit
Anlagerungsstelle attTn7 und
65 °C
35 bp upstream DNA des
E. coli Genoms
tetA-coli_rev
5’-GCGCCTGAATTCGCGAC
CTTCTCGTTACCCCTCTTG
GGTTATCAAGAGGGTCAT
TATATTTCGCG-3’
Reverseprimer für tetA mit
66 °C 28 bp der Promotorregion von
FatB2 auf dem Plasmid pKiM2
FatB-coli_fwd
5’-CGCGAAATATAATGACC
CTCTTGATAACCCAAGAG
GGGTAACGAGAAGGTCGC
GAATTCAGGCGC-3’
Vorwärtsprimer für fatB2 mit
65 °C der Terminatorregion von
tetA
FatB-coli_rev
5’-ATGTTTGATTAAAAACA
66 °C Reverseprimer für fatB2 mit
62
Nutzung
Name
Sequenz
Tm
TAACAGGAAGAAAAATGC
CCTTAGCTAACGCTATTA
CCATTGCTGGTTTTACCGG
TG-3’
fusion_fwd
5’-AACCTGGCAAAATCGGT
TACGGTTGAGTAATAAAT
GGATGCCCTGCGTAAG-3’
Nutzung
Anlagerungsstelle attTn7 und
37 bp downstream DNA des
E. coli Genoms
Vorwärtsprimer
für
die
Upstream- Verlängerung des
65 °C
tetA-fatB2 Fusionprodukts um
15 bp
5’-AGTTTTATGACAGAGAG
ATAAAGTCTTCAGTCTGAT
Downstream-Verlängerung
TTAAATAAGCGTTGATGTT
fusion_rev
65 °C
TGATTAAAAACATAACAG
des tetA-fatB2 Fusionprodukts
GAAGAAAAATGCCCTTAG
CTAAC-3’
Schnittstellen für Restriktionsenzyme sind unterstrichen, Nukleotide der Anlagerungsstelle attTn7 sind
dick gedruckt. Alle Primer wurden von der Firma Metabion (Planegg, Deutschland) synthetisiert.
2.1.6 Software
Name
Hersteller
Verwendung
Blender 3D
Blender Foundation
Erstellen von Schemata
ChemDraw
Perkin Elmer
Erstellung von Strukturformeln
Clone Manager
Sci-Ed Software
Erstellung von Klonierungsstrategien
Excel
Microsoft
Tabellenkalkulation
Gimp
GIMP
Erstellen von Schemata
ImageJ
Wayne Rasband
Densitometrische Analyse
Pymol
DeLano Scientific LLC
3D-Darstellung von Proteinen
SnapGene
GSL Biotech LLC
Erstellung von Plasmidkarten
SPSS
IBM
Statistikberechnungen
Unichrom
Seachrom, Inc
Auswertungen von GC-Daten
Word
Microsoft
Erstellen dieser Arbeit
63
2.2 Mikrobiologische Methoden
2.2.1 Übernachtkulturen von Escherichia coli-Stämmen
Übernachtkulturen wurden grundsätzlich von auf Agarplatten gewachsenen
Einzelkolonien angesetzt. Dazu wurden unter sterilen Bedingungen 5 mL LB-Medium
(gegebenenfalls mit entsprechenden Antibiotika) durch eine Impföse mit Zellen der
Einzelkolonie inokuliert und die Kultur bei 37 °C mit 180 min-1 schüttelnd (Multitron,
Infors AG, Bottmingen, Schweiz) über Nacht inkubiert.
2.2.2 Kurzfristige Haltung von Escherichia coli-Stämmen
Für eine kurzfristige Haltung von maximal 10 Tagen wurden E. coli-Zellen auf LBAgarplatten mit entsprechendem Antibiotikum kultiviert. Die beimpften Petrischalen
wurden nach einer Übernachtinkubation im Brutschrank bei 37 °C (bei Stämmen mit
pKD46- oder pCP20-Plasmid bei 30 °C) mit Parafilm umwickelt und bei 5 °C gelagert.
Nach spätestens 10 Tagen wurden die Stämme auf neue Platten ausgestrichen bzw.
autoklaviert und verworfen.
2.2.3 Dauerlagerung von Escherichia coli-Stämmen
2 mL der Übernachtkultur eines Stammes wurden in einem sterilen Kryoröhrchen bei
4 °C für 2 min bei 4 000 × g (Centrifuge 5417R, Eppendorf, Wesseling-Berzdorf,
Deutschland) abzentrifugiert. Der Überstand wurde unter sterilen Bedingungen
entnommen und verworfen. Anschließend erfolgte die Resuspension der pelletierten
Zellen in 1 mL sterilem LB-Medium + 30 % Glycerol. Die so präparierten Zellen
wurden bei -80 °C gelagert. Zur Reaktivierung der Zellen wurden mit einer sterilen
Impföse Zellen aus dem Kryoröhrchen entnommen und auf einer frisch präparierten
LB-Agarplatte
(+
entsprechendes
Antibiotikum)
per
Dreistrich-Technik
zur
Einzelkolonie ausgestrichen. Über Nacht gewachsene Einzelkolonien wurden
anschließend für Experimente weiter verwendet.
2.2.4 Präparation von elektrisch-kompetenten Escherichia coli-Zellen
Um die Kompetenz für eine Einführung von Plasmiden durch Elektroporation
herzustellen, wurde zunächst eine Übernachtkultur von einer Einzelkolonie des
entsprechenden Stammes angeimpft. Die Übernachtkultur diente am nächsten Tag als
Inokulum für eine 50 mL LB-Hauptkultur (+ eventuell entsprechende Antibiotika). Die
-1
Hauptkultur wurde bei 37 °C und 180 min schüttelnd inkubiert. Nach Erreichen einer
64
OD600 zwischen 0,6 und 0,8, wurden die Zellen bei 4 °C und 4 000 × g für 15 min
(Centrifuge 5810R, Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Deutschland) abzentrifugiert und
anschließend in 50 mL eiskaltem sterilem Wasser durch vorsichtiges Auf- und
Abpipettieren resuspendiert. Dieser Waschschritt wurde ein zweites Mal mit 25 mL
eiskaltem sterilem Wasser wiederholt. Im dritten Waschritt wurden die Zellen in
10 mL eiskaltem sterilem Wasser + 10 % Glycerol resuspendiert. Nach erneutem
Abzentrifugieren wurden die pelletierten Zellen nunmehr in 200 µL eiskaltem sterilem
Wasser + 10 % Glycerol resuspendiert. Die Zellsuspension wurde in 50 µL Aliquote
aufgeteilt, welche in flüssigem Stickstoff schockgefroren und anschließend bis zur
weiteren Verwendung bei -80 °C gelagert wurden.
2.2.5 Transformation von Escherichia coli-Zellen durch Elektroporation
Bei der Elektroporation entstehen durch Einbringen einer Zellsuspension in ein
elektrisches Feld kurzfristig Löcher in den Membranen der Zellen. Diese Löcher
ermöglichen
es
großen
Molekülen,
die
sie
normalerweise
zurückhaltende
Zellmembran zu passieren. Das Verfahren wird genutzt um Plasmide und
Ligationsprodukte in mikrobielle Zellen einzubringen. Dazu wurden bereits zuvor
präparierte elektrisch-kompetente Zellen (siehe 2.2.4, Seite 64) auf Eis aufgetaut und
steril in eine vorgekühlte 0,2 cm-Elektroporationsküvette (Gene Pulser®, Biorad,
Hercules, CA, USA) überführt. Nach Zugabe der zu transformierenden entsalzten
DNA (Plasmide: 1 - 10 ng, Ligationsprodukte: ~ 20 ng) wurde das Gemisch einige
Minuten auf Eis inkubiert. Die Elektroporation erfolgte in einem MicroPulser™
Elektroporator bei 2,5 kV mit 200 Ω Widerstand und einer Kapazität von 25 µF. Nach
erfolgter Elektroporation wurden sofort 2 mL auf 37 °C vorgewärmtes SOC-Medium in
die Küvette gegeben und die Zellen vorsichtig darin gemischt. Der Ansatz wurde für
1 h bei 37 °C inkubiert um den Zellen die Gelegenheit zu geben sich zu regenerieren
und das neue Resistenzgen zu exprimieren. Anschließend wurden 10 und 100 µL des
Ansatzes jeweils getrennt auf frischen LB-Agarplatten mit entsprechendem
Antibiotikum ausplattiert und über Nacht bei 37 °C bebrütet.
65
2.3 Molekularbiologische Methoden
2.3.1 Plasmidaufreinigung
Zur Isolierung von Plasmiden aus Escherichia coli-Übernachtkulturen wurde das
Präparationskit Zyppy™ Plasmid Miniprep Kit von Zymo Research (Zymo Research,
Irvine, CA, USA) benutzt. Hierbei wurde nach den Angaben in der beiliegenden
Anleitung vorgegangen und das Plasmid mit doppelt deionisiertem (ddH2O) Wasser
eluiert. Die Konzentrationen der aufgereinigten Plasmid-Lösungen wurden an einem
Nanodrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA) bestimmt und die
Reinheit und korrekte Größe über Agarose-Gelelektrophorese (siehe 2.3.4, Seite 67)
geprüft.
2.3.2 Isolierung von genomischer DNA aus Escherichia coli
Die Zellen aus 2 mL einer Übernachtkultur von E. coli XL-1 blue wurden durch
Zentrifugation für 1 min bei 20 000 × g und Raumtemperatur (Centrifuge 5417R,
Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Deutschland) geerntet und anschließend in 500 µL
TE-Puffer (10 mM Tris(hydroxymethyl)aminomethan / 1 mM Ethylendiamintetraacetat / pH 7,6) resuspendiert. Nach Zugabe einer 10-prozentigen SDS-Lösung (w/v)
und 500 µg Proteinase K wurde das Reaktionsgefäß unter gelegentlichem Invertieren
bei 55 °C 30 min lang inkubiert. Durch die Zugabe von 575 µL einer 1 : 1 (v/v)Mischung aus Chloroform und Phenol und vorsichtiges Durchmengen der
Flüssigkeiten entstand eine milchige Lösung. Diese wurde für 10 min bei
Raumtemperatur bei 20 000 × g zentrifugiert. Von der dabei entstandenen oberen
wässrigen Phase wurden 500 µL in ein frisches Reaktionsgefäß überführt. Nach
erneuter Durchmischung von 500 µL der Chloroform/Phenol-Mischung mit der
abgenommenen Phase, wurde diese erneut zentrifugiert (10 min, 20 000 × g,
Raumtemperatur) und 500 µL der wässrigen Phase abgenommen. Nach Ansäuern mit
50 µL 3 M Natriumacetat (pH 5,2) und Zugabe von 330 µL Isopropanol (100 %) konnte
die
präzipitierte
DNA
durch
erneute
Zentrifugation
(10 min,
20 000 × g,
Raumtemperatur) abgetrennt werden. Der Überstand wurde verworfen und das
verbliebene DNA-Pellet dreimal in Ethanol-Lösung (70 %) gewaschen. Nach
anschließender Trocknung unter einem Stickstoffgasstrom wurde die DNA in 250 µL
TE-Puffer aufgenommen und bis zur weiteren Verwendung bei -20 °C gelagert.
66
2.3.3 DNA-Restriktionsverdau
Der Restriktionsverdau diente in der Regel dazu, an einem PCR-Produkt eines Gens
sowie in der DNA des gewünschten Ziel-Plasmids zueinander komplementäre Enden
zu erzeugen. Zumeist wurde mit einem Doppelverdau durch zwei unterschiedliche
Enzyme gearbeitet, um bei der späteren Ligation zu gewährleisten, dass das Ziel-Gen
in gewünschter Orientierung in das Plasmid integriert wurde. Um die optimalen
Bedingungen für beide Enzyme im Reaktionsansatz zu erhalten, wurde ein 20 µLVerdau (maximal 10 % Enzymlösung, min. 50 % Aktivität der Enzyme) nach den
Empfehlungen
auf
der
[150]
Enzymhersteller-Webseite
zusammengesetzt
und
durchgeführt. Zur Überprüfung der korrekten Fragmentgrößen wurde ein geringer
Teil der verdauten DNA-Stränge in der Agarose-Gelelektrophorese (siehe 2.3.4,
Seite 67) eingesetzt.
2.3.4 Agarose-Gelelektrophorese
Zur Überprüfung der korrekten DNA Fragmentgrößen und der Kontrolle auf mögliche
Kontaminationen nach einem Restriktionsverdau, einer Plasmidpräparation oder einer
PCR
wurde
die
Agarose-Gelelektrophorese
eingesetzt.
Hierfür
wurde
ein
einprozentiges Agarosegel in TAE-Puffer (40 mM Tris / 20 mM Essigsäure / 1 mM
Ethylendiamintetraessigsäure) benutzt. Als externer Standard wurde der kommerziell
erhältliche Marker GeneRuler™ 1 kb DNA ladder (Thermo Fisher Scientific
Biosciences, St. Leon-Rot, Deutschland) mit definierten Bandengrößen von 0,25 –
10 kb bei jeder Elektrophorese aufgetragen. Zur Durchführung der Elektrophorese
wurde eine Spannung von 90 V für 60 – 90 min angelegt. Als Laufpuffer diente 1facher TAE-Puffer. Der 5-fache Ladepuffer für die DNA-Proben bestand aus 40-1
prozentiger Sucroselösung und 2 g L des Farbstoffs Orange G (Fluka Chemie, Buchs,
Schweiz). Zur Detektion der DNA-Banden nach der Elektrophorese wurde bei der
Herstellung des Agarosegels dieses mit GelRed™ (Biotium, Hayward, CA, USA)
versetzt (1 : 10 000). Die Detektion erfolgte unter ultraviolettem Licht (Wellenlänge
von 365 nm) im Geldokumentationssystem Quantum ST4 (Vilber Lourmat,
Eberhardzell, Deutschland).
67
2.3.5 DNA-Gelaufreinigung
Um die Produkte eines Restriktionsverdaus aufzutrennen und das gewünschte
Fragment zu isolieren, wurde das Zymoclean™ Gel DNA Recovery Kit (Zymo
Research, Irvine, CA, USA) verwendet. Dazu wurde nach erfolgter AgaroseGelelektrophorese die gewünschte Bande mit einem Rasiermesser derart vom
restlichen Agarosegel abgetrennt, dass möglichst wenig Agarose ohne DNA mit in den
Extraktionsansatz gelangte. Nach Wiegen des ausgeschnittenen Agarosestücks wurde
entsprechend den dem Kit beiliegenden Anweisungen verfahren und die aufgereinigte
DNA
anschließend
mit
doppelt
deionisiertem
Wasser
eluiert.
Die
Konzentrationsbestimmung erfolgte am Nanodrop 2000 (Thermo Fisher Scientific,
Rockford, IL, USA).
2.3.6 Produktaufreininung von PCR und Restriktionsverdau
Um PCR Produkte nach der erfolgten Amplifizierung oder einen Restriktionsverdau
mit anderen Enzymen weiterverarbeiten zu können, war es notwendig, die DNA
aufzureinigen und somit Enzyme, überschüssige Ionen und sonstige Komponenten
einer PCR (siehe 2.3.8, Seite 69) bzw. eines Verdaus abzutrennen. Hierfür wurde das
DNA Clean & Concentrator™-5 Kit (Zymo Research, Irvine, CA, USA) verwendet. Die
Aufreinigung erfolgte nach den beiliegenden Anweisungen des Herstellers. Die
aufgereinigte DNA wurde mit doppelt deionisiertem Wasser eluiert und ihre
Konzentration am Nanodrop 2000 (Thermo Fisher Scientific, Rockford, IL, USA)
bestimmt.
2.3.7 DNA-Ligationen
Um Ziel-Gen und Vektor-DNA in einer Ligation gezielt miteinander zu verknüpfen,
wurde die T4 DNA-Ligase (Thermo Fisher Scientific Biosciences, St. Leon-Rot,
Deutschland) verwendet. Hierbei wurden immer 100 ng an Vektor-DNA eingesetzt.
Das molare Verhältnis des zu klonierenden Elements zur Vektor-DNA betrug 3 : 1 (bei
glatten Enden 5 : 1). Die Menge des Ziel-Gens war somit abhängig von der Länge der
zu ligierenden Elemente und wurde nach der Formel
100 ng Vektor-DNA × Größe Ziel-Gen in kb
× Verhältnis
Größe Vektor-DNA in kb
68
berechnet. Der Ligationsansatz wurde bei 16 °C für 8 h inkubiert und das Enzym
anschließend bei 70 °C für 20 min inaktiviert. Mit dem Ligationsprodukt wurden
daraufhin elektrokompetente E. coli DH5α-Zellen transformiert und per colony PCR
(siehe unter 2.3.8, Seite 71) nach Plasmiden mit erfolgreicher Insertion des Ziel-Gens
in das Plasmid gesucht.
Tabelle 2-4: Zusammensetzung eines Ligation-Ansatzes
Reagenz
Menge
Vektor-DNA
100 ng
Ziel-DNA
3 : 1 zur Vektor-DNA (molar)
T4 DNA-Ligasepuffer
2 µL
T4 DNA-Ligase
1 WU
ddH2O
ad 20 µL
2.3.8 Polymerasekettenreaktion
Konventionelle PCR
Die Polymerasekettenreaktion (engl. polymerase chain reaction, PCR) ist ein von Kary
Mullis entwickeltes Verfahren um eine von zwei spezifischen Oligonukleotiden (engl.
primer) flankierte DNA-Sequenz zu amplifizieren[151]. Die PCR wurde in dieser Arbeit
benutzt um für Klonierungsarbeiten eine ausreichende Menge an DNA zur Verfügung
zu stellen sowie um spezifische Sequenzen in Klonierungsprodukten und in
bakteriellen Zellen (colony PCR) nachzuweisen. Die hierfür verwendeten Primer sind
in Tabelle 2-3 (Seite 62) aufgeführt. Um die gewünschten DNA-Sequenzen zu
amplifizieren, kamen je nach Einsatzgebiet die Polymerasen Taq (Thermo Fisher
Scientific Biosciences, St. Leon-Rot, Deutschland), Pfu, PfuUltra II Fusion und
Herculase II Fusion (alle drei von Agilent Technologies, Waldbronn, Deutschland)
zum Einsatz. So wurde die Taq Polymerase für den Nachweis von Sequenzen sowie für
erste Test-Amplifikationen verwendet, wohingegen die Pfu Polymerase zum
Bereitstellen von Sequenzen für Klonierungen zum Einsatz kam. Das Enzym PfuUltra
II Fusion wurde beim Einfügen von einzelnen Mutationen in Plasmiden ab einer
Größe von 7 kb benutzt. Bei sehr GC-reichen Sequenzvorlagen wurde hingegen die
Polymerase Herculase II Fusion verwendet. Der prinzipielle Ablauf einer
Polymerasekettenreaktion besteht in einer Temperaturerhöhung um die vorhandene
69
doppelsträngige DNA in Einzelstränge aufzuschmelzen. Anschließend wird die
Temperatur auf ein bestimmtes Niveau gesenkt, damit die Oligonukleotide spezifisch
durch Wasserstoffbrückenbindungen an die zu amplifizierende Sequenz binden
können. Durch erneutes Anheben der Temperatur auf 72 °C amplifizieren die nun
aktiven Polymerasen die Sequenz möglichst effektiv. Reaktionszusammensetzungen
und Zyklenverläufe sind in Tabelle 2-5 und Tabelle 2-6 zusammengefasst.
Tabelle 2-5: Zusammensetzung der PCR-Ansätze mit unterschiedlichen DNA Polymerasen
Reagenz
Endkonzentration
Taq
Pfu
PfuUltra II
Herculase II
Forward-Primer
0,5 µM
0,5 µM
0,5 µM
0,5 µM
Reverse-Primer
0,5 µM
0,5 µM
0,5 µM
0,5 µM
je 200 µM
je 200 µM
je 200 µM
je 200 µM
1x
1x
1x
1x
1,5 U
1U
1,5 U
0,5 U
0,2 ng µL-1
0,2 ng µL-1
0,2 ng µL-1
0,2 ng µL-1
ddH2O
ad 50 µL
ad 50 µL
ad 50 µL
ad 25 µL
Zusätze
MgCl2 2 mM
-
-
DMSO 4%
dNTPs
Reaktionspuffer
10x
DNA Polymerase
DNA Vorlage
Tabelle 2-6: Zyklenverlauf der PCR-Ansätze mit unterschiedlichen DNA Polymerasen
Temperatur
Dauer
Taq
Pfu
PfuUltra II
Herculase II
1.
95 °C
2 min
2 min
2 min
2 min
2.
98 °C
15 s
15 s
15 s
15 s
3.
Tm – 5 °C
30 s
30 s
30 s
30 s
4.
72 °C
1 min/kb
2 min/kb
0,5 min/kb
0,5 min/kb
5.
72 °C
1 min/kb × 4
2 min/kb × 4
0,5 min/kb × 4
0,5 min/kb × 4
6.
8 °C
bis Entnahme
Wiederholung der Schritte 2 - 4 bis zu 30x
Die Produkte der PCRs wurden anschließend auf ihre richtige Länge durch AgaroseGelelektrophorese (siehe 2.3.4, Seite 67) überprüft und bis zur weiteren Verwendung
bei -20 °C gelagert.
70
Colony PCR
Zur Identifikation von Klonen, die (neu konstruierte) Plasmide mit einem
gewünschten Gen enthielten, wurde die colony PCR eingesetzt. Dazu wurde mit einem
sterilen Zahnstocher etwas Zellmasse einer Kolonie abgenommen und diese am Boden
eines PCR-Reaktionsgefäßes leicht zerrieben. Der Zahnstocher wurde steril
aufbewahrt um mit diesem bei einem positiven Signal eine Übernachtflüssigkultur
anzuimpfen. Die PCR-Zusammensetzung sowie das Temperaturprogramm folgten der
Methodik der konventionellen Taq-PCR, jedoch mit dem Unterschied, dass hier nicht
mit Volumina von 50, sondern von nur 20 µL gearbeitet wurde.
Touchdown PCR
Bei gelegentlich auftretenden unspezifischen PCR-Produkten wurde die touchdownTechnik angewendet. Hierbei blieb die entsprechende PCR-Zusammensetzung
erhalten, jedoch wurde das Standard-Temperaturprogramm derart abgewandelt, dass
es nun aus zwei Phasen bestand: im ersten Zyklus lag die Temperatur zur Anlagerung
der Primer 10 °C über der normalerweise benötigten Temperatur. In jedem folgendem
Zyklus wurde die Temperatur des Anlagerungsschritts um 1 °C gesenkt bis nach 10
Zyklen die Standardtemperatur erreicht war. Danach folgten in der zweiten Phase 20
Zyklen mit Standardtemperaturen. Diese Methodik gewährleistete, dass in der ersten
Phase zunächst hochspezifisch das gewünschte Produkt gebildet wird. Wenn die
zweite Phase startet, liegt dieses Produkt im Überschuss vor und wird daher häufiger
repliziert als unspezifische Produkte.
Asymmetrische PCR
Um einzelsträngige PCR-Produkte zu erhalten, wurde die asymmetrische PCR genutzt.
Hierbei werden die beiden Primer nicht in gleichen Konzentrationen zugegeben,
sondern in einem Verhältnis von 50 : 1. Hierdurch wird ein Primer in den ersten
Zyklen aufgebraucht und lediglich der zweite Primer kann noch zur Amplifikation der
Ziel-DNA dienen. Das Temperaturprogramm gleicht der konventionellen PCR.
Overlap extension PCR
In der overlap extension PCR dienen zwei einzelsträngige, teilweise zueinander
komplementäre
DNA-Stücke
sich
gegenseitig
71
als
Primer
und
die
jeweils
überhängenden 5‘-Enden werden dann von der DNA-Polymerase aufgefüllt.
Anschließend wird das Gesamtkonstrukt durch Primer an den 3‘-Enden amplifiziert.
2.4 Klonierungen
2.4.1 Konstruktion von pJeM-FatB2, pKiM1, pKiM2 und pKiM4
Das Plasmid pJeM1-FatB2 wurde durch Subklonierung des codon-optimierten Gens
FatB2 aus dem von GeneArt erhaltenen Plasmid pMA-T-FatB2 in Plasmid pJeM1[148]
an den Restriktionsstellen BamHI und HindIII konstruiert.
Der Leervektor pKiM1 sollte als Negativkontrolle dienen. Dazu wurde aus
Plasmid pJeM1 das Gen eGFP durch einen Restriktionsverdau an den Schnittstellen
BamHI und HindIII und eine Gelextraktion entfernt. Die überstehenden Enden des
Vektors wurden über das Klenow-Fragment (Thermo Fisher Scientific Biosciences, St.
Leon-Rot, Deutschland) aufgefüllt und in einer darauf folgenden T4 Ligase-Reaktion
miteinander verbunden.
Das Plasmid pKiM2 sollte durch N-terminale Fusion der Thioesterase FatB2 mit
Thioredoxin-1
eine
gesteigerte
Löslichkeit
der
exprimierten
Thioesterase
gewährleisten. Für die Konstruktion dieses Plasmids wurde eine gleichzeitige Ligation
von drei Fragmenten durchgeführt. Das Gen trxA wurde vom Plasmid pET32a mit den
Primern trx-pJeM_fwd und trx-pJeM_rev durch eine konventionelle Pfu-PCR
amplifiziert und anschließend mit den Restriktionsenzymen BamHI und SacI verdaut.
Das Gen fatB2 wurde aus dem Vektor pMA-T-FatB2 durch Verdau mit SacI und
HindIII und anschließende Gelextraktion des Fragments der Größe 1,3 kb erhalten. Als
Ziel-Plasmid diente der durch BamHI und HindIII linearisierte Vektor pJeM1. Durch
die 3-Fragment-Ligation entstand das dem mit L-Rhamnose induzierbaren Promotor
+
rhaPBAD nachgelagerte Genkonstrukt His6-trxA-FatB2 (FatB2 ). Nach Transformation
der 3-Fragment-Ligation in elektro-kompetente DH5α-Zellen wurde das Konstrukt
durch eine colony PCR mit den Primern trx-pJeM_fwd und Ch FatB2_rev identifiziert
und anschließend durch Sequenzierung (GATC Biotech, Konstanz, Deutschland)
verifiziert.
Das Plasmid pKiM4 enthielt die gleiche Gen-Konstellation wie pKiM2, jedoch mit dem
Unterschied, dass die ersten 168 Basen des FatB2-Gens deletiert waren, da es sich
hierbei um ein mögliches Signalpeptid handelte. Zur Konstruktion des Plasmids wurde
mit den Primern FatB2_neu_fwd und FatB2_neu_rev eine PCR durchgeführt, die die
72
um 168 Basen verkürzte Version des Gens ergab. Diese wurde dann über die
Restriktionsstellen SacI und HindIII in den Vektor pKiM2 eingesetzt und ersetzte dort
die vollständige Version von fatB2. Kolonien, die nach der Transformation das
gewünschte Plasmid erhielten, wurden über colony PCR mit den Primern trxpJeM_fwd und FatB2_neu_rev identifiziert. Durch Sequenzierung wurde die
erfolgreiche Konstruktion bestätigt.
2.4.2 Konstruktion von pJeM-mtKAS und pBAD18-mtKAS
Das Plasmid pJeM-mtKAS wurde für erste Expressionsstudien von mtKAS konstruiert.
Dazu wurde die von GeneArt codon-optimierte Version von pMA-T-mtKAS auf den
Vektor pJeM1 über die Restriktionsschnittstellen BamHI und HindIII umkloniert.
Das Plasmid pBAD18-mtKAS ermöglichte die gleichzeitige Expression der 3Ketoacyl-ACP-Synthase mtKAS neben dem Plasmid pKiM2 und entstand durch die
Pfu-Amplifikation von mtKAS von pMA-T-mtKAS mit den Primer mtKAS_NcoI_fwd
und mtKAS_XbaI_rev und das anschließende Einfügen des PCR-Produkts in pBAD18PSC
über
die
Restriktionsschnittstellen
NcoI
und
XbaI.
Alle
Plasmid-
Neukonstruktionen wurden durch Elektroporation in kompetente DH5α-Zellen
transferiert
und
durch
entsprechende
Antibiotika
selektioniert.
Durch
Sequenzierungen wurden die erfolgreichen Klonierungen bestätigt.
2.4.3 Konstruktion von pBAD18-CYP
Um eine gleichzeitige Expression des Fusionsprotein CYP*-CPR aus Monooxygenase
+
und Reduktasedomäne neben der Expression der Thioesterase FatB2 von Plasmid
[146]
pKiM2 zu ermöglichen, wurde das Enzym vom Vektor pJOE4782.1-CYP
durch die
Restriktionsenzyme NcoI und XbaI auf den Vektor pBAD18-PSC umkloniert. Dazu
wurden über eine PCR mit den Primern CYP_NcoI_fwd und CYP_XbaI_rev die
entsprechenden Schnittstellen an das Gen des Fusionsproteins angehängt. Nach
Transformation von DH5α-Zellen und anschließender Selektion wurde die
erfolgreiche Insertion des Gens durch Sequenzierung nachgewiesen.
2.4.4 Entfernen der Deletionskassette aus Keio-Stämmen
Da bei der Erstellung der einzelnen Mutantenstämme in der Keio-Sammlung eine
Kanamycin-Deletionskassette mit flankierenden FRT-Stellen in den Stämmen
zurückblieb, musste diese vor der Nutzung von Kanamycin-Plasmiden wie pJeM1 oder
pJOE4782.1 entfernt werden. Hierfür wurde die FLP Rekombinase von Plasmid pCP20
73
zum Einsatz gebracht[147]. Vom entsprechenden Stamm aus der Keio-Sammlung
wurden zunächst elektro-kompetente Zellen hergestellt (siehe 2.2.4, Seite 64) um sie
anschließend mit dem Plasmid pCP20 zu transformieren (siehe 2.2.5, Seite 65,
Inkubation nach Elektroporation jedoch bei 30 °C). Die ausplattierten Zellen wurden
über Nacht bei 30 °C inkubiert. Von den gewachsenen Einzelkolonien wurden 10 auf
eine frische Agarplatte ohne Antibiotikum übertragen und bei 42 °C eine weitere
Nacht inkubiert. Zur Kontrolle, ob sowohl die Kanamycin-Deletionskassette als auch
das Plasmid pCP20 aus der Zelle entfernt waren, wurden Zellen aus den 10
Einzelkolonien jeweils auf Ampicillin- und auf Kanamycin-Platten ausgestrichen. Die
Ampicillin-Platte wurde bei 30 °C, die Kanamycin-Platte bei 37 °C bebrütet. Zeigten
sich am nächsten Tag auf beiden Antibiotikum-Platten keine Kolonien, war die
Entfernung der Deletionskassette erfolgreich und von den jeweiligen Klonen wurden
Dauerkulturen angelegt (siehe 2.2.3, Seite 64).
2.4.5 Konstruktion der E. coli Stämme KK2 und KK3
Um das Gen fatB2 für ein Einzellsystem in das Genom des Stammes BW25113∆fadD
zu integrieren, wurde das Rekombinationssystem des Phagen λ verwendet. Die dafür
[149]
benötigten Red-Gene (exo, β, y) sind auf dem Plasmid pKD46 codiert
. Während das
Protein Gam (Gen y) das RecBCD-System inhibiert, baut Exo (Gen exo) die
einzubauende doppelsträngige DNA zu Einzelsträngen ab. Das Rekombinationsprotein
Bet (Gen β) schützt diese Einzelstränge vor Abbau[152,153]. Die so vorbereitete DNA
kann nun mit der genomischen DNA rekombinieren, indem sie vermutlich bei der
[153]
Replikation als Art Okazaki-Fragment eingebaut wird
. Damit der Einbau der DNA
spezifisch erfolgt, wird das interessierende Gen von zum Zielort homologen
Sequenzen flankiert, die eine Länge von 50 bp besitzen. Um die Möglichkeit zu
besitzen nach Zellen zu suchen, die das Gen fatB2 erfolgreich in ihr Genom
eingegliedert haben, wurde es mit dem Tetracyclin-Resistenzgen tetA aus Transposon
Tn10 fusioniert und anschließend in die Anlagerungsstelle für das Transposon Tn7
(attTn7) zwischen die Gene glmS und glmU im E. coli-Genom integriert. Dazu wurde
tetA mitsamt seiner Promotorregion von genomischer DNA des E. coli-Stammes XL-1
blue durch eine asymmetrische PCR (siehe 2.3.8, Seite 71) mit den Primern
tetA_coli_fwd und tetA_coli_rev im Verhältnis 50 : 1 amplifiziert. Die Thioesterase
FatB2+ sowie ihre Promotorregion wurden auf ähnliche Weise vom Plasmid pKiM2
amplifiziert, hier jedoch mit den Primern FatB_coli_fwd und FatB_coli_rev im
74
Verhältnis 1 : 50. Die sich ergebenden, zumeist einzelsträngigen, Produkte dieser
beiden PCRs tragen am 3‘-Ende eine 35 Basen lange zueinander komplementäre
Sequenz. Die beiden Produkte wurden nun in einer overlap extension PCR (siehe 2.3.8,
Seite 71), in der sie sich gegenseitig als Primer dienten, aufgefüllt. In einer letzten PCR
wurde dann das Gesamtkonstrukt über die Primer fusion_fwd und fusion_rev
amplifiziert.
Für die Konstruktion des Stammes KK2 wurden elektrisch kompetente
BW25113∆fadD-Zellen
(siehe
2.2.5,
Seite 65
und
2.4.4,
Seite 73)
mit
dem
temperatursensitiven Plasmid pKD46 transformiert und auf Chloramphenicolhaltigem LB-Agar bei 30 °C inkubiert. Von den über Nacht gewachsenen Kolonien
wurden Übernachtflüssigkulturen angeimpft und ebenfalls bei 30 °C schüttelnd
inkubiert. Diese Übernachtkulturen dienten anschließend als Inokulum für die
Hauptkulturen (LB + Chloramphenicol), die auf eine optische Dichte von 0,05
angeimpft wurden. Nach einer Stunde Wachstum bei 30 °C wurde die Genexpression
der Red-Gene durch Zugabe von L-Arabinose (Endkonzentration 0,2 %) induziert.
Nach Erreichen einer optischen Dichte von etwa 0,6 wurden die Zellen durch
Zentrifugation (10 min, 4 000 × g, 4 °C) geerntet und erneut für eine Elektroporation
vorbereitet. Durch diese wurde nun das PCR-Fusionsprodukt tetA-fatB2 in die Zellen
eingebracht. Auf Tetracyclin-haltigen Agarplatten wurde anschließend auf Zellen mit
Integration der Thioesterase selektioniert.
Die Konstruktion des Stammes KK3 folgte der Methodik zur Erstellung des
Stammes KK2, jedoch mit dem Unterschied, dass hierfür elektrisch kompetente
BW25113∆fadE-Zellen eingesetzt wurden.
2.5 Proteinchemische Methoden
2.5.1 Zellaufschluss
Um die Produktion von heterolog in E. coli-Zellen exprimierten Proteinen durch SDSGelelektrophorese zu verifizieren, wurden die Zellen zunächst durch Ultraschall
lysiert.
Dazu
wurden
die
Zellen
einer
50 mL
Hauptkultur
in
2 mL
Kaliumphosphatpuffer (50 mM / pH 7,5 / 0,1 mM Phenylmethylsulfonylfluorid)
resuspendiert und anschließend mit dem Ultraschall-Desintegrator Sonifier 250
(200 W, Branson, Danbury, CT, USA) bei einer Frequenz von 20 kHz in 3 Zyklen zu je
1,5 min im gepulsten Modus mit einem Arbeitsintervall von 40 % und einer
75
Leistungsabgabe in Stufe 4 aufgeschlossen. Nicht aufgeschlossene Zellen und
Zellfragmente wurden in einem anschließenden Zentrifugationsschritt für 15 min bei
20 000 × g und 4 °C) (Centrifuge 5417R, Eppendorf, Wesseling-Berzdorf, Deutschland)
von der löslichen Proteinfraktion abgetrennt und der Zentrifugationsüberstand mit
den darin enthaltenen löslichen Proteinen weiterverwendet
Um die Thioesterase Ch FatB2 chromatographisch aufzureinigen (siehe 2.5.6,
Seite 78), wurden größere Mengen an Zellen aufgeschlossen, für die die Kapazitäten
der Ultraschall-Lyse nicht ausreichend waren. Deshalb wurde hier der Zellaufschluss
mit dem Hochdruck-Homogenisator EmulsiFlex-C5 (Avestin, Ottawa, ON, Kanada)
mit einem Arbeitsdruck von 500 bar durchgeführt. Die Zellen einer 500 mL TB-Kultur
wurde in 20 mL gekühltem Kaliumphosphatpuffer (50 mM / pH 7,5) gelöst und 3 x
homogenisiert. Die Zellfragmente wurden anschließend in einer Sorvall® RC-6™ Plus
Zentrifuge (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) bei 20 000 × g und 4 °C für
15 min abzentrifugiert. Um zu gewährleisten, dass auch die bei der Trennung von
Überstand und Pellet eventuell übertragenen Zellen und größeren Partikel entfernt
wurden, wurde der Überstand anschließend zusätzlich durch einen 0,2 µm-Filter
(VWR International GmbH, Bruchsal, Deutschland) filtriert.
2.5.2 Konzentrationsbestimmung von Proteinlösungen
Zur Konzentrationsbestimmung von Proteinlösungen wurde das Pierce® BCA Protein
Assay Kit (Thermo Fisher Scientific Biosciences, St. Leon-Rot, Deutschland)
verwendet. Die Konzentrationsbestimmung erfolgte durch Triplikatmessungen in
Mikrotiterplatten. Vor den Messungen wurde das BCA-Reagenz frisch nach den
Angaben des Herstellers angesetzt und in einem 1 : 8-Verhältnis mit den zu
untersuchenden Proben gemischt. Nach zehnminütiger Inkubation bei 37 °C wurde im
Mikrotiterplatten-Lesegerät SpectraMax 340 PC (Molecular Devices, Sunnyvale, CA,
USA) die Absorption bei 562 nm bestimmt und über lineare Regression an einer
vorher
angefertigten
BSA-Kalibrierungsgeraden
die
gesuchte
Konzentration
errechnet. Gegebenenfalls wurde die Messung mit einer 1 : 10-verdünnten
Probenlösung wiederholt, wenn sich die Absorptionsmesswerte außerhalb des
linearen Bereichs der Kalibriergeraden befanden.
2.5.3 CO-Differenzspektrum-Assay zur P450-Bestimmung
III
Basierend auf der Bildung des charakteristischen Fe -CO-Komplexes bei 448 nm
[154]
wurden die Konzentrationen von P450-Enzymen im CO-Differenzspektrum-Assay
76
bestimmt. Zunächst wurden Zellen auf Eis mit Ultraschall, wie unter 2.5.1 beschrieben,
aufgeschlossen. Durch Zugabe einer Spatelspitze Natriumdithionit wurden die
Enzyme in den zellfreien Lysaten reduziert und durch langsames Durchströmen von
Kohlenstoffmonoxidgas für ca. 30 Sekunden anschließend der CO-Komplex gebildet.
Die Konzentrationen von P450 Monooxygenasen in den Probelösungen wurden dann
über die Absorptionsdifferenz zur Kontroll-Enzymlösung (nur durch Natriumdithionit
reduziert, jedoch ohne Bildung eines CO-Komplexes durch Durchströmen mit
Kohlenstoffmonoxid) bei einer Wellenlänge von 450 und 490 nm und einem
-1
-1
Extinktionskoeffizienten von 91000 M cm berechnet.
2.5.4 SDS-Gelelektrophorese
Bei der SDS-Gelelektrophorese werden durch einen konstanten Stromfluss Proteine
und Proteinfragmente in einem Polyacrylamidgel der Größe nach aufgetrennt. Die
Stärke einer Bande korreliert dabei mit der Konzentration des entsprechenden Enzyms
in der Probe. Man bedient sich dieser Methode um die Expression eines Proteins in
einem Stamm zu verifizieren, grobe Vergleiche der Expressionsmuster zweier Stämme
anzustellen oder die Reinheit eines Proteins zu überprüfen. Dazu wurden in dieser
Arbeit die Proteinproben bekannter Konzentration mit einem 6-fach Ladepuffer
(350 mM Tris pH 6,8 / 600 mM Dithiothreitol / 30% Glycerol / 350 mM
Natriumdodecylsulfat / 180 µM Bromphenolblau) gemischt und 10 min bei 95 °C
aufgekocht. Nach Abkühlen der Proben wurden maximal 15 µg Gesamtprotein pro
Tasche auf ein Sammelgel (5 % Acrylamid/Bisacrylamid-Lösung (29 : 1) / 195 mM Tris
pH 6,8 / 4 mM Natriumdodecylsulfat / 5 mM Ammoniumpersulfat / 7 mM
Tetramethylethylendiamin) aufgetragen. Die eigentliche Größentrennung der Proteine
erfolgt nach Durchlaufen des Sammelgels im Trenngel (8 % Acrylamid/BisacrylamidLösung (29 : 1) / 375 mM Tris pH 8,8 / 4 mM Natriumdodecylsulfat / 5 mM
Ammoniumpersulfat / 7 mM Tetramethylethylendiamin). Als Laufpuffer für die
Elektrophorese wurde eine Lösung aus 4 mM Natriumdodecylsulfat, 25 mM Tris und
190 mM Glycin eingesetzt und ein konstanter Strom von 25 mA pro Gel für etwa
60 min angelegt. Auf jedem Gel wurde der Marker PageRuler Unstained Protein
Ladder (Thermo Fisher Scientific Biosciences, St. Leon-Rot, Deutschland) mit
definierten Proteinbanden von 10 bis 200 kDa als externer Standard aufgetragen. Nach
erfolgter Auftrennung wurden die in den Gelen enthaltenen Proteinbanden in einer
Coomassie-Färbelösung (45 % Methanol / 10 % Essigsäure / 3 mM Coomassieblau R77
250) über Nacht angefärbt. Eine anschließende Entfärbung des umgebenden
Acrylamidgels erfolgte in der Entfärbelösung (45 % Methanol / 10 % Essigsäure) für
mindestens 4 h bis sich die Proteinbanden deutlich vom Hintergrund abhoben.
Dokumentiert
wurden
die
SDS-Gele
abschließend
unter
Weißlicht
im
Geldokumentationssystem Quantum ST4 (Vilber Lourmat, Eberhardzell, Deutschland).
2.5.5 Western Blot
Für die Übertragung der Proteinbanden aus SDS-Gelen auf Nitrocellulosemembranen
(Pall, Port Washington, USA) wurden eine Spannung von 15 V für 45 min in einer
Trans-Blot SD Semi-dry Transferzelle (Bio-Rad, München, Deutschland) verwendet.
Zuvor waren Membran und SDS-Gel für 15 min in Transferpuffer (40 mM Glycin /
50 mM Tris / 1 mM Natriumdodecylsulfat / 20 % Methanol) äquilibriert worden. Zur
Detektion der His6-markierten Proteine wurden monoklonale Anti-PolyhistidinAntikörper
(Sigma-Aldrich,
Taufkirchen,
Deutschland)
aus
Mäusen
als
Primärantikörper und Anti-Maus-IgG-Antikörper gekoppelt mit einer Peroxidase
(Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland) aus Hasen als sekundäre Antikörper
genutzt. Die primären Antikörper wurden in einer 1 : 10 000-Verdünnung, die
Sekundärantikörper
in
einer
1 : 2 000-Verdünnung
in
Blockingpuffer
(5 %
Magermilchpulver (w/v) / 25 mM Tris pH 7,5 / 150 mM NaCl) verwendet. Nach den
einzelnen Immunmarkierungsschritten wurde die Membran 3 x für 10 min in TBSTPuffer (50 mM Tris / 150 mM NaCl / 0,1 % Tween 20) gewaschen. Die Western blots
wurden mit dem Amersham ECL Western blot Analysekit (GE Healthcare, UK) gemäß
Anleitung des Herstellers entwickelt und anschließend in einem Fusion-SL 3500 WLBilderfassungssystem (Vilber Lourmat, Eberhardzell, Deutschland) dokumentiert. Als
Größenmarker diente der vorgefärbte Proteinmarker PageRuler Prestained Protein
Ladder von Fermentas. Dieser wurde zunächst unter Weißlicht fotografiert und
anschließend in die Chemolumineszenz-Aufnahme des Blots eingefügt.
+
2.5.6 Aufreinigung von FatB2
Zur Aktivitätsbestimmung der heterolog exprimierten Thioesterase FatB2+ wurde
diese zunächst über die fast protein liquid chromatography (FPLC) aufgereinigt. Durch
die N-terminal sechs angehängten Histidin-Aminosäuren konnte das Protein sehr
spezifisch mit einer mit Nickel-Ionen beladenen Chromatographie-Säule von den
restlichen Zellproteinen abgetrennt werden. Zum Einsatz kam hierbei eine 1 mL
HisTrap HP-Säule (GE Healthcare, Little Chalfont, UK) in einem auf 4 °C gekühlten
78
ÄKTApurifier 10 FPLC-System (GE Healthcare, Little Chalfont, UK). Als Laufmittel
diente ein Kaliumphosphatpuffer (50 mM pH 8 / 300 mM NaCl / 50 mM Imidazol), als
Elutionsmittel der gleiche Puffer, jedoch mit einer höheren Imidazolkonzentration
(500 mM).
In einer 500 mL TB-Kanamycin-Flüssigkultur wurde mit Zellen des Stammes
BW25113∆fadD(pKiM2) die Thioesterase für 6 h produziert. Nach der Zellernte
wurden die Zellen wie unter 2.5.1 auf Seite 75 beschrieben aufgeschlossen und das
Lysat anschließend komplett auf die mit 5 Säulenvolumina äquilibrierte Säule mit
-1
einem linearen Fluss von 1 mL min aufgetragen. Anschließend wurde die Säule mit
10 Säulenvolumina gespült um unspezifisch gebundene Proteine von der Säule zu
spülen. Ch FatB2 wurde anschließend in einem 3-Schrittgradient von der Säule eluiert.
Im ersten Schritt wurden mit 10 Säulenvolumina weitere unspezifisch gebundene
Proteine mit einer Imidazolkonzentration von 95 mM von der Säule entfernt. Im
darauffolgenden Schritt wurde die Imidazolkonzentration auf 140 mM erhöht um die
Thioesterase selbst in 10 Säulenvolumina zu eluieren. Im dritten und letzten Schritt
wurden mit reinem Elutionspuffer die restlichen noch anhaftenden Proteine von der
Säule
getrennt.
Die
Thioesterase
enthaltenden
Fraktionen
wurden
durch
Absorptionsmessungen bei 280 nm identifiziert und anschließend vereinigt. Die
Entfernung
des
Imidazols
aus
der
Proteinlösung
erfolgte
durch
Größenausschlusschromatographie. Als Säulenmaterial in einer XK16-Säule (GE
Healthcare, Little Chalfont, UK) dienten 30 mL Toyopearl HW-50 (Tosoh Bioscience
GmbH, Stuttgart, Deutschland). Als Laufmittel wurde Kaliumphosphatpuffer (50 mM
pH 8 / 300 mM NaCl) verwendet. Anschließend wurde die Proteinlösung mit Amicon
4 Ultra-Zentrifugalfiltern (NMWL: 10 kDa, Merck Millipore, Schwalbach, Deutschland)
nach dem Protokoll des Herstellers aufkonzentriert.
2.5.7 Aktivitätstests von FatB2+
4-Nitrophenol-Acylester
Um die synthetisierten (siehe 2.9, Seite 87) und erworbenen 4-Nitrophenol-Acylester
als mögliche Substrate für Hochdurchsatz-Screenings zu testen, wurde nach der
Methodik von Gupta et al.
[155]
verfahren. Dazu wurden als Substratlösung 8 mM
Lösungen der Acylester in Isopropanol hergestellt. Als Reaktionspuffer diente ein
50 mM
Kaliumphosphat-Puffer
(pH 8
/
1 g L-1
Gummi
arabicum
/
5 mM
Natriumdesoxycholsäure). Substrat- und Reaktionspuffer wurden unmittelbar vor
79
einem Aktivitätstest im Verhältnis 1 : 10 gemischt und auf 37 °C vorgewärmt. 150 µL
dieser Lösung wurden in Mikrotiterplatten vorgelegt und verschiedene Mengen an
aufgereinigter Thioesterase zugegeben. Der Ansatz wurde 15 min bei 37 °C inkubiert
und anschließend die Absorption bei 412 nm erfasst. Als Negativkontrolle diente die
gleiche Lösung, jedoch wurde statt aufgereinigter Thioesterase lediglich der
Enzympuffer zugegeben. Trat während der Reaktion eine Trübung der Flüssigkeit
durch freiwerdende Fettsäuren auf, so wurde diesen durch Zugabe von 1,6 µL einer
CaCl2-Lösung (1 mM) als Calciumsalze ausgefällt und abzentrifugiert.
Acyl-CoA-Thioester
Für die Aktivitätsbestimmungen der Thioesterase sollte der von Tilton et al.[156]
entwickelte Assay herangezogen werden. In diesem indirekten Assay wird die durch
die Hydrolyse freiwerdende Thiolgruppe des Coenzyms A durch das Ellman-Reagenz
(5,5‘-Dithiobis-2-nitrobenzoesäure) nachgewiesen. Dazu wurden Lösungen der AcylCoA-Thioester (100 µM), von DTNB (1 mM), von BSA (1 mg mL-1) sowie ein
Kaliumphosphat-Puffer (50 mM pH 8), der gleichzeitig als Lösemittel für die hier
zuvor genannten Reagenzien diente, hergestellt. Ein Reaktionsansatz setzte sich in
Mikrotiterplatten wie folgt zusammen:
Tabelle 2-7: Zusammensetzung des Thioesterase-Aktivitätsassay
Als
Reagenz
Volumen Endkonzentration
Acyl-CoA
18 µL
20 µM
BSA
18 µL
200 µg mL-1
DTNB
18 µL
200 µM
Kpi-Puffer
36 µL
50 mM
FatB2+
100 µL
variierend
Negativkontrolle
diente
die
gleiche
Ansatzzusammensetzung
mit
dem
Unterschied, dass statt Enzymlösung weitere 100 µL KPi-Puffer (50 mM ph 8)
zugegeben wurden. Die Absorption wurde in 2 s-Intervallen im MikrotiterplattenLesegerät SpectraMax 340 PC (Molecular Devices, Sunnyvale, CA, USA) bei 412 nm
aufgezeichnet. Um anschließend die spezifische Aktivität des Enzyms zu berechnen,
wurde der molare Extinktionskoeffizient von DTNB mit 1,36 × 104 M-1 cm-1 eingesetzt.
80
2.6 Sonstige Analytik
2.6.1 Extraktion von Fettsäuren
Fettsäuren wurden zur Analyse jeweils aus 1 mL Kulturmedium extrahiert. Vor der
eigentlichen Extraktion wurden die Kulturproben für 2 min bei 20 000 × g und
Raumtemperatur zentrifugiert und der zellfreie Überstand dazu verwendet eine Probe
aus der selben Kultur auf eine optische Dichte von 1 einzustellen. Die Proben wurden
mit 5 µL konzentrierter Salzsäure (37 %) angesäuert, mit 10 µL einer ethanolischen
-1
Lösung von Heptadecansäure (1 mg mL ) als interner Standard versetzt, und
anschließend zweimal mit 1 mL einer 1 : 1 (v/v)-Mischung von Chloroform und
Methan extrahiert. Dazu wurde das Extraktionsgemisch etwa 30 s auf einem VF2
Vortex Mixer (Janke & Kunkel, Staufen, Deutschland) auf höchster Stufe durchmischt
und anschließend für 1 min bei 20 000 × g und Raumtemperatur abzentrifugiert. Die
Chloroform-Phasen wurden jeweils entnommen, gesammelt und unter einem
Stickstoffgasstrom verdampft. Der Rückstand wurde in 200 µL Methyl-tert-butylether
gelöst und 100 µL dieser Lösung wurden mit 20 µl einer 1-prozentigen Lösung von
Trimethylchlorsilan in N,O-bis(trimethylsilyl)fluoracetamid (Macherey-Nagel, Düren,
Deutschland) gemischt, für 30 min bei 70 °C in verschlossenen GC-Probegefäßen
derivatisiert und anschließend bis zur weiteren Verwendung bei Raumtemperatur
gelagert.
2.6.2 Analyse von Fettsäuren
Extrahierte Fettsäure-Proben wurden an einem GC-2010 Plus/FID-2010 Plus
(Shimadzu, Kyōto, Japan) analysiert. Als Trägergas wurde Helium (Flussrate 0,69 mL
min-1, lineare Geschwindigkeit 30 cm s-1) auf einer DB-5 MS Säule (30 m × 0.25 mm ×
0.25 μm, Agilent, Waldbronn, Deutschland) eingesetzt. Der Säulenofen wurde zu
Beginn der Messung für 2 min bei 70 °C gehalten, anschließend auf 300 °C mit einer
-1
Rate von 20 °C min aufgeheizt und abschließend bei dieser Temperatur eine weitere
Minute gehalten. Zur Identifizierung der einzelnen Signale von Fettsäuren und 8Hydroxyoctansäure diente der Vergleich der Retentionszeiten mit bekannten
Standards (C6-, C8-, C10-, C12-, C14-, C16-, C17-, C18-Fettsäuren, 8-Hydroxyoctansäure).
Die Konzentrationen von Fett- und 8-Hydroxyoctansäure wurden über die Nutzung
von Kalibrierungskurven bestimmt. Diese waren durch die Mittelwerte von drei
unabhängigen Messserien pro Fettsäure und der hydroxylierten Octansäure erstellt
81
worden. Die Peakflächen des Analyten wurden mit der Unichrom Software
(Seachrom Inc.) integriert, über den internen Standard angeglichen und anschließend
über die lineare Regression der jeweiligen Kalibrierungsgerade die gesuchte
Konzentration berechnet.
2.6.3 Dünnschichtchromatographie
Zur Kontrolle der in 2.9 (Seite 87) synthetisierten Esterverbindungen wurden diese in
etwas Laufmittel (Hexan-Diethylether im Verhältnis 1:9) gelöst. Mit Kapillaren
wurden die Proben sowie entsprechende Standards auf eine mit Kieselgel 60
beschichtet Alu-Platte (Macherey-Nagel, Düren, Deutschland) getupft. Nach
Antrocknen der Proben wurde die Aluplatte in eine Chromatographiekammer mit
etwas Laufmittel gestellt. Kurz bevor die aufsteigende Laufmittelfront die obere Kante
der Alu-Platte erreichte, wurde die Platte entnommen und das Laufmittel abgedampft.
Zur Detektion der Laufstrecke der einzelnen Proben wurde die Platte in 1 M
Schwefelsäure getaucht und anschließend mit einem Heißluftgebläse erhitzt bis die
Proben als braune Flecken sichtbar wurden. Die Identifikation der in den Proben
enthaltenen Substanzen erfolgte über mitgelaufene Referenzsubstanzen.
2.6.4 Densitometrische Analyse von Western blots
Zur Bestimmung der Verteilung der Thioesterase zwischen Lysat und unlöslichen
Zellbestandteilen wurde das Programm ImageJ verwendet. Dazu wurde zunächst eine
Kulturprobe mit Thioesterase enthaltenden Zellen abzentrifugiert und der Überstand
verworfen. Die Zellen wurden anschließend in einem definiertem Volumen
Natriumphosphatpuffer (50 mM) resuspendiert und wie unter 2.5.1 beschrieben mit
Ultraschall aufgeschlossen. Nach Abzentrifugieren der Zelltrümmer wurden Pellet und
Lysat
separiert
und
das
Pellet
danach
wieder
im
gleichem
Volumen
Natriumphosphatpuffer resuspendiert. Nach Trennung und Detektion dieser Proben
durch SDS-Gelelektrophorese und Western blotting (wie unter 2.5.4 und 2.5.5
beschrieben), wurden mit ImageJ die Signalintensitäten der einzelnen Banden ermittelt
und über die Peakflächen der Signale auf ihre Verteilung zurückgerechnet.
82
2.7 Produktion von Octansäure
2.7.1 Produktion von Octansäure im Schüttelkolben
Für die Produktion von Octansäure in 250 mL Erlenmeyerkolben wurden 50 mL TBKanamycin-Medium mit Zellen des Stammes BW25113∆fadD(pKiM2) von einer
Übernachtflüssigkultur auf eine OD600 von 0,05 eingestellt und bei 37 °C unter
Schütteln bei 180 min-1 (Multitron, Infors AG, Bottmingen, Schweiz) inkubiert. Nach
Erreichen einer optischen Dichte von 10, wurde die Expression der Thioesterase codiert auf Plasmid pKiM2 - durch Zugabe einer sterilen 20-prozentigen L-RhamnoseLösung (Endkonzentration von 0,2 %) induziert. Die Kultur wurde bei 30 °C für weitere
20 h inkubiert. Anschließend erfolgte die Fettsäureextraktion (siehe 2.6.1, Seite 81) und
Analyse (siehe 2.6.2, Seite 81).
2.7.2 Produktion von Octansäure im Bioreaktor
Für Fed-batch-Experimente in 1 L-Bioreaktoren (Multifors 2, Infors AG, Bottmingen,
Schweiz) wurden 900 mL TB-Kanamycin-Medium zu einer OD von 0,5 angeimpft.
Hierfür wurden 50 mL-Übernachtkulturen des Stammes BW25113∆fadD(pKiM2) in
TB-Medium benutzt. Die Zellen wurden bei einer konstanten Temperatur von 37 °C,
einer Belüftungsrate von 2 vvm (Volumen pro Volumen pro Minute) und einer
-1
Rührergeschwindigkeit von 600 min bis zu einer optischen Dichte von 10 kultiviert.
Die Expression der Thioesterase wurde mit Zugabe steriler L-Rhamnose-Lösung (20 %)
bis zu einer Endkonzentration von 0,2 % gestartet. Die Zellen wurden anschließend
weitere 20 h bei 30 °C und mit der konstanten Zufütterung einer Glycerol-Lösung
(85 %) von 4 g h-1 kultiviert. Der pH wurde permanent durch eine integrierte pHElektrode erfasst und durch computergesteuerte Zugabe von NH4OH (28 %) und
H3PO4 (10 %) konstant bei 7,4 gehalten. Außerdem wurde der Sauerstoffpartialdruck in
der Kultur durchgehend während der Experimente aufgezeichnet. Bei starkem
Aufschäumen des Mediums wurden jeweils etwa 500 µL steriles Antischaummittel 204
der Firma Sigma-Aldrich zugegeben.
83
2..8 Produ
uktion vo
on 8-Hyd
droxyocta
ansäure
2..8.1 Produktion von
n 8-Hydro
oxyoctansä
äure im Sch
hüttelkolbben
Die von BW
W25113∆fa
adD(pKiM2) -Zellen prroduzierte Octansäuree sollte in
n einem
zw
weiten Schrritt terminaal in ω-Possition hydroxyliert weerden. Da ddie beiden für den
Gesamtprozeess benötigtten Enzymee, die Thioesterase FatB2+ und ddie Monoox
xygenase
CY
YP153AMaq*-CPR
*
patible, z.T
T. unabhäängig voneeinander
BM3, auf mehrrere komp
in
nduzierbare Vektoren kloniert
k
woorden waren
n, gab es fü
ür die Kombbination der beiden
Prroteine vierr prinzipiellle Möglichkkeiten:
a) in ein
nem Zweizeellsystem, in
n dem die Expression
E
beider
b
Enzyyme gleichzeitig
erfolggte (parallelles Zweizelllsystem, sieehe Abbildu
ung 2-1),
b) in ein
nem Zweizeellsystem, in
n dem die Expression
E
der
d Enzymee zeitlich versetzt
erfolggte (sequenttielles Zweiizellsystem,, siehe Abbiildung 2-2),,
c) in ein
nem Einzellssystem, in ddem die Exp
pression beider Enzym
me gleichzeitig
erfolggte (parallelles Einzellsyystem, siehee Abbildung
g 2-3),
d) in ein
nem Einzellssystem, in ddem Expresssion der En
nzyme zeitliich versetztt
erfolggte (sequenttielles Einzeellsystem, siehe
s
Abbild
dung 2-4).
Die in diesem
m Abschnittt beschriebeenen Haupttkulturen wurden
w
jewe
weils von ein
ner 5 mL
Übbernachtku
ultur mit en
ntsprechenddem Antibiotikum inokuliert. Sooweit nichtt anders
veermerkt, errfolgte die Kultivierun
ng bei 180 min-1 in einem HT M
Multitron-S
Schüttler
(In
nfors AG, Schweiz).
S
Die Zellerntee erfolgte beei 4 000 × g für 15 min bei Raumteemp.
Paaralleles Zw
weizellsystem
m
Fü
ür die Prod
duktion der benötigten
n Octansäure sowie diie
Um
msetzung dieser zu ihrem ω-h
hydroxylierrten Derivaat
w
wurden
diee
Stämmee
BW251 13∆fadD(pK
KiM2)
un
nd
BW
W25113∆faadD(pJOE47782.1-CYP) simultan in
n 50 mL TB
BKaanamycin-M
Medium beii 37 °C angeezogen. Ab
b einer OD600
voon 1 wurd
de die Exprression beidder Enzym
me durch diie
Zu
ugabe einer sterilen L-Rhamnos
L
e-Lösung (20
( %) bis zu
z
eiiner Endko
onzentration
n von 0,22 % gestartet. Vor deer
Abbildu
ung 2-1: Prrinzip des
Exxtraktion der
d Octansääure und ih
hres Derivaats und derren parallel induzierten ZweizellA
Analyse wu
urden die Zellen w
weitere 24 h bei 30 °C systemss.
ku
ultiviert.
84
Seequentielles Zweizellsysstem
Fü
ür eine sequ
uentielle Um
msetzung w
wurde zunäächst Octansäure wie uunter 2.7.1, Seite 83
beeschrieben, produziertt. Nach derr 24-stündig
gen Produk
ktion der O
Octansäure wurden
diie Zellen durch
d
Zenttrifugation für 15 min
n bei 4 000 × g undd Raumtem
mperatur
(C
Centrifuge
5810R,
Eppendorf,,
Wesselin
ng-Berzdorf,
Deutscchland)
vo
on
der
Ku
ulturflüssiggkeit abgetrrennt. Der Ü
Überstand wurde
w
durcch Zugabe von NH4OH
H (28 %)
au
uf den pH von 7,5 ein
ngestellt un
nd anschlieeßend sterill filtriert (00,2 µm-Filteer, VWR
In
nternationall GmbH, Bruchsal, Deeutschland)). Gleichzeiitig waren für die Exp
pression
deer Monooxygenase-Zeellen des S tamms BW
W25113∆fad
dD(pJOE47882.1-CYP) in
n 50 mL
TB
B-Kanamyccin-Medium
m bei einerr OD600 vo
on 1 durch
h Zugabe eeiner L-RhaamnoseLöösung (End
dkonzentrattion 0,2 %) induziert worden.
w
Naach einer EExpressionszeit von
4 h bei 30 °C und 180 min
m -1, wurdeen die Zelleen bei 4 000
0 × g und R
Raumtemperratur für
155 min abzen
ntrifugiert und
u im steriilen octansääurehaltigen Überstannd der ersten
n Kultur
m
mit einer Ko
onzentration
n von 100 g cww L-1 ressuspendiertt. Diese Zelllsuspension
n wurde
w
weitere 20 h bei 30 °C
C und 180 min-1 inku
ubiert, bevo
or Proben für die FeettsäureExxtraktion un
nd die anscchließende A
Analyse enttnommen wurden.
w
Abbildung
g 2-2: Prinzip des sequentieell induzierten
n Zwei-zellsysstems.
85
Paaralleles Ein
nzellsystem
Um
m 8-Hydroxyoctansääure mit n
nur einem
m Stamm zu
z
prroduzieren, wurden ellektrokomppetente BW
W25113∆fadD
DZeellen mit deen beiden kompatiblen
k
n Plasmiden
n pKiM2 un
nd
pB
BAD18-CYP
P transformiert. Ein
ne Hauptk
kultur dieses
Sttammes wu
urde auf OD
O 0,05 an
ngeimpft und
u
bis zu
um
Errreichen deer optischeen Dichte von 1 beei 37 °C un
nd
1880 min-1 ku
ultiviert. An
nschließend wurde die gleichzeitige
Prroduktion von
v FatB2+ und CYP*-C
CPR durch Zugabe ein
ner
stterilen
L--Rhamnose-Lösung
und
ein
ner
sterileen
L--Arabinose--Lösung (E
Endkonzen
ntration jeeweils 0,2 %)
in
nduziert. Diie Zellen wurden
w
daraaufhin weiitere 20 h bei
b
Abbilddung 2-3: Prinzip
P
des
parallell
induzierteen
Einzell-
system
ms.
300 °C inkubieert und abscchließend P
Proben für die
d FettsäurreExxtraktion un
nd die anscchließende A
Analyse enttnommen.
Seequentielles Einzellsysteem
Fü
ür die sequ
uentielle Pro
oduktion deer 8-Hydroxyoctansäu
ure
w
wurde eine Hauptkulltur des iim vorherrigen Absaatz
beeschriebeneen Stammess zu einer OD von 0,05 angeimp
pft
un
nd bei 37 °C und 1880 min-1 biis zu OD 1 kultiviert.
A
Anschließend
d erfolgte die Produuktion von
n Oktansäu
ure
urch
du
Zuggabe
von
n
(E
Endkonzenttration
Prroduktionszzeit
sterilerr
0,2 %).
erfolg
gte
auch
L-Rham
mnose-Lösun
ng
Nach
die
4-stündig
ger
Ind
duktion
der
d
Exxpression der Mono
ooxygenase CYP*-CPR
R durch die
d
Zu
ugabe sterriler L-Araabinose-Lössung (End
dkonzentrattion Abbilddung 2-4: Prinzip des
sequenntiell
0,2 %). Nach weiterer Kultivierung
K
g für 20 h bei 30 °C und
u
1880 min-1 wu
urden Probeen für die FFettsäure-E
Extraktion und
u
diie anschließ
ßende Analy
yse entnom
mmen.
86
Einzellssystems.
induzierten
2.8.2 Produktion von 8-Hydroxyoctansäure im Bioreaktor
Die Experimente, beschrieben unter 2.8.1, wurden auch in 1 L-Bioreaktoren mit den
Parameter wie unter 2.7.2 beschrieben, durchgeführt. Allerdings wurde bei den
Experimenten des sequentiellen Zweizellsystems, die Zelldichte im zweiten Teil des
-1
-1
Experiments nicht auf 100 gcww L , sondern auf 25 gcww L eingestellt, da
konstruktionsbedingt in den Reaktoren ein bestimmtes Mindestvolumen an Medium
vorliegen musste, damit eine Durchmischung durch das Rührwerk gewährleistet war.
2.9 Synthese potentieller Screeningsubstrate für FatB2+-Mutanten
Lee et al. zeigten in ihrer Arbeit[157], dass Thioesterasen neben ihrer Hauptaktivität
gegen Thioester, ebenfalls eine Aktivität gegen 4-Nitrophenolester besitzen. Dieser
Umstand sollte in einem Screening-Ansatz genutzt werden, um Mutanten der
+
Thioesterase Ch FatB2
zu finden, welche eine veränderte Aktivität bzgl.
verschiedener Fettsäure-Kettenlängen aufweisen. Als Screeningsubstrate sollten neben
den bereits im Labor vorhandenen Nitrophenolestern der Octan-, Dodecan- und der
Hexadecansäure auch die Ester der Hexan-, Decan- und der Tetradecansäure zum
Einsatz kommen. Letztere wurden zu diesem Zweck chemisch synthetisiert. Zunächst
erfolgte die Herstellung der Säurechloride der Fettsäuren. Hierzu wurden 0,1 mol der
Fettsäuren jeweils getrennt mit 0,15 mol Thionylchlorid versetzt und unter
Rückflusskühlung und Ausschluss von Feuchtigkeit solange gekocht bis keine
Gasentwicklung mehr zu beobachten war. Anschließend wurde überschüssiges
Thionylchlorid durch einen Rotationsverdampfer bei 50 °C unter Vakuum aus dem
Ansatz entfernt. Die Säurechloride wurden im folgenden Schritt genutzt um die
[158]
gewünschten 4-Nitrophenolester durch Alkoholyse nach Einhorn darzustellen
.
Hierzu wurden jeweils 0,5 g 4-Nitrophenol in 3 mL Pyridin gelöst und mit 2 g des
betreffenden Säurechlorids unter Eiskühlung versetzt. Anschließend wurde das
Gemisch auf 85 °C für eine Stunde erwärmt und dann in mit Salzsäure angesäuertes
Eiswasser überführt. Der aufgeschwommene Ester wurde von der Wasseroberfläche
abgenommen. Nach einem Zentrifugationsschritt - um restliches Wasser aus dem
Gemisch zu entfernen - wurden die Produkte über Silicagelsäulen aufgereinigt um
nichtreagierte Produkte und Lösemittel abzutrennen. Dazu wurde als Laufmittel ein
Hexan-Diethylether-Gemisch (10 : 90) verwendet und das Eluat in Fraktionen
aufgefangen.
Fraktionen
mit
dem
gewünschten
87
Produkt
wurden
über
Dünnschichtchromatographie (siehe 2.6.3, Seite 82) identifiziert. Zur Verifizierung der
Esterprodukte wurden diese mit einer Esterase versetzt und die einsetzende
Gelbfärbung photometrisch bei 412 nm erfasst. Die Lagerung der Nitrophenolester
erfolgte trocken bei -20 °C.
2.10 Statistische Auswertung
Um die Ergebnisse für die Fettsäureproduktion statistisch abzusichern, wurde immer
mit Triplikaten gearbeitet. Die Triplikatmessungen wurden mit dem Levene-Test auf
[159]
ihre Varianzhomogenität untersucht
. Hierbei wurde ein p-Wert größer oder gleich
0,05 als homogen angesehen. Die Teststatistik wurde wie folgt ermittelt:
∑
1 ∑
∑
mit

W = Teststatistik

k = Anzahl der Stichproben

ni = Umfang der Stichproben in der i-ten Gruppe

N = Gesamtumfang der Stichproben aller Gruppen

xij = j-ter Einzelwert der i-ten Stichprobe

Dij = Differenzbetrag des j-ten Einzelwertes der Gruppe i zu seinem
Gruppenmittelwert

Dix = Gruppenmittel aller zur i-ten Gruppe gehörenden Dij

Dxx = Gesamtmittelwert aller Dij.
Mit dem Shapiro-Wilk-Test wurde die Normalverteilung der Messwertergebnisse
untersucht[160]. War der ermittelte p-Wert kleiner als das Signifikanzniveau α = 0,95
wurde die Nullhypothese und damit die Normalverteilung abgelehnt. Die Werte
wurden wie folgt ermittelt:
∑
∑
mit


X(i) = i-te Ordnungsstatistik
= Stichprobendurchschnitt
88

ai = Konstante, gegeben durch [160].
Waren die Ergebnisse normalverteilt und die Varianzen homogen, wurde zur
Ermittlung der signifikanten Unterschiede zwischen zwei Triplikatmessungen der
Zweistichproben-t-Test
[161]
eingesetzt
für
unabhängige
Stichproben
(ungepaarter
t-Test)
. Ein p-Wert von unter 0,05 wurde hierbei als signifikant definiert. Die
Werte wurden wie folgt ermittelt:
∑
∑
∑
∑
1
2
1
mit

X = Zufallsvariable der Stichprobe

n = Stichprobengröße der jeweiligen Gruppe

∑

∑
= Summe der quadrierten Messwerte
= Summe der Messwerte.
Sollte die Voraussetzung der Homoskedastizität nicht erfüllt gewesen sein, wurde der
Welch-Test mit einer modifizierten Anzahl an Freiheitsgraden angewandt[162]. Diese
wurde wie folgt berechnet:
1
1
mit

df = Anzahl der Freiheitsgrade

s = Standardabweichung

n = Stichprobengröße der jeweiligen Gruppe.
Die Statistiken wurde alle mithilfe der Statistik-Software SPSS des Softwareherstellers
IBM berechnet.
89
3 Ergebnisse
3.1 Konstruktion
eines
Octansäure
sekretierenden
E. coli-
Stammes
3.1.1 Wirtsstamm BW25113∆fadD
Wie in verschiedenen Publikationen bereits beschrieben[29,30,163,164], ist es für die
Konstruktion eines Fettsäure sekretierenden Bakterienstammes zunächst notwendig,
die intrazelluläre Hauptsenke für Fettsäuren, die β-Oxidation, zu deaktivieren,
während gleichzeitig durch die Überexpression einer Thioesterase eine gesteigerte
Freisetzung von Fettsäuren bewirkt wird. Die β-Oxidation wird durch ein Reihe von
Enzymen (fadD, fadE, fadB, fadA)[82] katalysiert, deren jeweilige Deletionen im
Wirtsgenom prinzipiell alle zu einer Unterbrechung des Fettsäurekatabolismus führen.
Die Acyl-CoA Synthetase FadD katalysiert hierbei im ersten Schritt der β-Oxidation
die Verknüpfung der freien Fettsäure mit Coenzym A. Dieses aktivierte Produkt dient
dann im weiteren Verlauf der Oxidationskette der Acyl-CoA Dehydrogenase FadE als
Substrat oder aber als Ausgangsstoff für die Produktion von Phospholipiden,
Triacylglyceriden,
Wachsestern
und
weiteren
[64]
Stoffwechselprodukten
.
Des
Weiteren ist FadD am einwärts gerichteten Transport von Fettsäuren über die innere
[165]
Membran von E. coli beteiligt
. Um die Metabolisierung der produzierten Fettsäuren
zur Energiegewinnung und nicht gewünschten Produkten zu verhindern und
gleichzeitig die Sekretion der Produkte zu erleichtern, wurde daher der E. coliWirtsstamm BW25113[166] (WT) mit genomischer fadD-Deletion verwendet (Ansatz I).
Dieser Stamm zeichnet sich weiterhin durch Deletionen des rhaBAD- sowie des
araBAD-Operons aus, die eine Verstoffwechselung von L-Rhamnose und L-Arabinose
verhindern
und
somit
den
Einsatz
dieser
Zucker
als
Induktoren
für
Proteinexpressionen ermöglichen.
3.1.2 Expressionsplasmid pJeM1
2010 zeigten Lennen et al. in einer Studie[62], dass die Expression einer Thioesterase
von Plasmiden mit einer geringen Kopienzahl von bis zu 20 zu einer 6-fach größeren
Ausbeute an freien Fettsäuren führt als die Expression der gleichen Thioesterase von
90
Plasmiden mit einer hohen Kopienzahl von bis zu 700 Kopien. Die Autoren
vermuteten, dass die Expression im zweiten Fall zu einer zu raschen Anhäufung der
Thioesterasen im Zellinneren und somit zur Akkumulation der freien Fettsäuren
innerhalb der inneren Membran führt, welche dadurch destabilisiert wird. In der
[148]
vorliegenden Arbeit wurde daher das Expressionsplasmid pJeM1
verwendet, da es
den Replikationsursprung pBBR1 trägt, für welchen eine Kopienzahl von 30 - 40
ermittelt wurde[167]. Ferner trägt das Plasmid die Promotorregion des rhaBADOperons und ist somit für die induzierte Proteinexpression im BW25113-Stamm
geeignet. Eine solche Induktion ist notwendig, um in den Kulturen zunächst über die
langkettigen Produkte der unbeeinflussten Fettsäure-Biosynthese (z.B. in Form von
Phospholipiden für Membranen) genügend Biomasse zu erzeugen. Zu einem
geeigneten Zeitpunkt können dann die Zellen in einen Produktionsmodus für
Octansäure bzw. Hydroxyoctansäure versetzt werden.
3.1.3 Expression der Thioesterase FatB2
Nach erfolgter Klonierung von fatB2 in das Plasmid pJeM1 (Plasmidkarte siehe 6.3.4
auf Seite 171) wurde die Thioesterase im E. coli-Stamm BW25113∆fadD in einem
ersten Versuch exprimiert (Ansatz II). Dazu wurden Kulturen von 3 unterschiedlichen
Klonen in LB-Medium bis zu einer OD600 von 1 kultiviert und anschließend mit
Rhamnoselösung (Endkonz. 0,1 %) die Expression von FatB2 bei 37 °C für 24 h
induziert. Die anschließende gaschromatographische Analyse der geradzahligen
Fettsäuren von Hexan- bis Octadecansäure zeigte verglichen mit Wildtyp-Kulturen
unter gleichen Bedingungen eine generell höhere Ausbeute an Fettsäuren in der
Kulturflüssigkeit (siehe Tabelle 3-1, weitere Ergebnisse der statistischen Auswertung
befinden sich im Anhang unter Kapitel 6.4). Den größten Teil machten hierbei Octanund Dodecansäure aus, die den 45-fachen bzw. 87,3-fachen Betrag der Wildtypwerte
zeigten.
91
Taabelle 3-1: Konzentratio
onen der ein
inzelnen Fetttsäuren in Ansatz
A
II-Kuulturen abzüglich der
en
ntsprechenden
n Konzentrationen in Wildttyp-Kulturen (WT)
Konzentraation in
Zuna
ahme
signifika
ant im
Ku
ulturflüssiggkeit [µM]]
gegenü
über WT
t-Test (p ≤ 0,05)
1,7 x
nein
n
45,0 x
ja
H
Hexansäure
+ 4,0 ± 2,,5
Octansäure
+ 61,4 ± 113,3
Decansäure
+ 0,5 ± 0,,8
1,2 x
nein
n
Dodecansäurre
+ 17,7 ± 11,3
87,3 x
ja
Teetradecansääure
+ 1,3 ± 0,,5
1,3 x
ja
H
Hexadecansääure
+ 0,2 ± 0,,4
23,8 x
nein
n
Octadecansäu
ure
+ 0,2 ± 0,,2
1,1 x
nein
n
Beezogen auf die Konzen
ntration von
n Octansäu
ure wirkte sich die Exppression derr codonop
ptimierten Thioesteraase FatB2 jjedoch lediiglich mit einem Zuw
wachs von
n 61,4 ±
133,3 µmol LKultur
K
-1
aus. Eine Übeerprüfung der
d Protein
nlöslichkeit von FatB2 durch
W
Western blottting (Abbild
dung 3-1 A
A) und eine anschließen
nde densitoometrische Analyse
(A
Abbildung 3-1
3 B) ergab
ben, dass ettwa 91 % der
d Thioesteerase als Agggregat aussgefallen
w
waren und damit lediiglich 9 % des Proteiins zur Pro
oduktion dder Fettsäu
uren zur
Veerfügung sttanden.
Ab
bbildung 3-1
1: A) Western
n blot von Peellet (P II) un
nd Lysat (L III) aus Ansatzz II-Zellen. FaatB2 ist in
beeiden Fraktion
nen deutlich bei
b einer Größße von ca. 477 kDa zu erkeennen. B) Dennsitometrische Analyse
dees Western bloots mit der Sofftware ImageJJ. Die obere Hälfte
H
zeigt diie erfassten D
Dunkelwerte aus
a Spur P
II, die untere aus
a Spur L II,
I die jeweilss rot schraffiierte Fläche wurde
w
zur Beerechnung deer Anteile
heerangezogen.
92
3..1.4 Optim
mierung der Octansääureprodu
uktion
3..1.4.1 LösllichkeitssteigerungvonnFatB2
Um
m die Aussbeute an Octansäuree zu erhöh
hen, sollte zunächst ddie Löslichkeit der
Th
hioesterase FatB2 erhö
öht werden
n. Dazu wurrde fatB2 au
uf pJeM1 N
N-terminal mit
m trxA,
deem Gen fü
ür Thioredo
oxin-1 aus E. coli, fussioniert. Diie Löslichkeeit des Konstrukts
(FFatB2+) wurrde anschlieeßend an ein
ne 24-stünd
dige Expresssion durchh einen Wesstern blot
(A
Abbildung 3-2
3 A) und dessen den
nsitometriscche Analysee (Abbildunng 3-2 B) üb
berprüft.
H
Hier zeigte sich eine Steigerung
S
der löslich
hen Fraktio
on des nunn 59,9 kDa großen
Fu
usionsproteeins von urrsprünglich
h knapp 9 % ohne trxA
A-Anhang auf etwa 31
3 % mit
en
ntsprechend
dem Anhan
ng.
Ab
bbildung 3-2
2: A) Western blot von Pelllet (P III) und Lysat (L III) aus
a Zellen, diee das Konstru
ukt FatB2+
exxprimieren. Das
D Konstruk
kt mit einer Gesamtgrößee von 59,9 kDa
k
ist in beeiden Spuren
n deutlich
erkennbar. B) Densitometris
D
sche Analyse des Western blots mit derr Software Im
mageJ. Die obeere Hälfte
pur P III gehö
örige Graustuufenprofil, wäährend die un
ntere Hälfte di
die Werte für Spur L III
zeeigt das zur Sp
nung der einzzelnen Anteile wurde jeweeils die Flächhe des rot sch
hraffierten
wiiedergibt. Fürr die Berechn
Beereichs ausgew
wertet.
A
Auch hinsicchtlich derr Stabilitätt der Thioesterase wirkte sicch die Fussion an
Th
hioredoxin--1 positiv au
us. Die Ergeebnisse von
n Western blots,
b
die denn zeitlichen
n Verlauf
dees Thioesteerase-Gehallts in jeweeils der glleichen Meenge Zellenn (~ 8 x 10
1 7) vor
(A
Abbildung 3-3
3 A) und nach der ttrxA-Fusion
n (Abbildung 3-3 B) wi
wiedergeben, zeigen,
daass vorhan
ndene Thio
oesterase oohne Thiorredoxin-An
nhang bereeits 3 h naach der
Exxpressionsin
nduktion wieder
w
abgeebaut wird und
u spätesttens 4 h naach Induktio
on keine
93
Th
hioesterase mehr nach
hgewiesen werden kaann. Mit Th
hioredoxin-A
Anhang nim
mmt die
Koonzentratio
on des Protteins jedoch
h nach Ein
nsetzen der Expressionn kontinuieerlich zu
un
nd ist auch nach 5 h no
och deutlich
h nachweisbar.
Ab
bbildung 3-3:
3
Western blots überr den zeitllichen Verla
auf des Thiioesterase-Geehalts im
Exxpressionsstam
mm. A) FatB
B2, B) FatB22+ (hier wurrde eine seh
hr kurze Beliichtungszeit des Blots
ein
ngestellt. Diess äußert sich in
i dem schwaachen ausgegrrauten Banden
nmuster).
3..1.4.2 Optiimierungw
weitererParrameter
Um
m die Aussbeute an Octansäuree aus einerr Kultur weiter
w
zu vverbessern, wurden
zu
unächst weeitere Param
meter der K
Kulturbedin
ngungen un
ntersucht. IIn die Gru
uppe der
un
ntersuchten
n Parameterr fielen ins besondere die Temperratur der K
Kultur währrend der
Exxpression, die
d Medienzusammenssetzung, diee Konzentraation des ggenutzten In
nduktors
L--Rhamnose sowie der optimale Z
Zeitpunkt deer Induktion zur bestm
möglichen ProduktP
Zeeit-Ausbeutte.
Um eine
e
geeign
netere Tem
mperatur fü
ür die Exp
pression deer Thioesteerase zu
errmitteln, wurden
w
nebeen der opttimalen Waachstumstemperatur ffür Eschericchia coli
(337 °C) mit 255 °C eine Teemperatur iim Bereich der etwa halbmaximallen Wachsttumsrate
soowie mit 300 °C eine Temperatur
T
r im Mittelb
bereich zwischen diessen beiden Werten
geewählt. Diee Zellen wurden
w
beii 37 °C bis zu einer OD600 vonn 1 kultiviiert und
an
nschließend
d die Exp
pression vvon FatB2 gestartet,, währendd gleichzeiitig die
Um
mgebungstemperatur der Kulturren auf die zu unterrsuchendenn Werte ein
ngestellt
w
wurde. Nach vierstün
ndiger Exppressionsdau
uer wurdeen die Zelllen geerntet, per
Ulltraschall aufgeschloss
a
sen, in lösliiche und unlösliche
u
Proteinantei
P
ile fraktion
niert und
peer Western blotting an
nalysiert (s iehe Abbild
dung 3-4). In diesem Experimen
nt zeigte
94
sich, dass daas beste Ex
xpressionseergebnis mit
m 33 % löslicher Thiooesterase bei
b 30 °C
errhalten wurrde. Während bei 25 ° C gar keine nachweissbare Produuktion des Proteins
zu
ustande kaam, wurdee bei 37 °C
C ein grö
ößenmäßig sehr heteerogenes Gemisch
G
prroduziert. Dieses
D
Peptiidgemisch üüberwiegt in seiner Sig
gnalstärke w
weit die Erg
gebnisse
deer 30 °C-Exp
pression, wurde
w
jedoch
h weitgehen
nd in der unlöslichen PProteinfrak
ktion des
Zeellaufschlusss vorgefun
nden. Abzüüglich der Peptide
P
mitt falscher G
Größe (≠ 59,9 kDa)
zeeigte der Exxpressionsansatz auch lediglich einen löslich
hen Anteil aan FatB2 vo
on unter
9 %. Ab dieesem Zeitp
punkt wur de daher 30 °C als Standardteemperatur für die
Exxpression der
d Thioesteerase genutzzt.
Abbildung
A
3-4: Western bblots der Versuche zur
optimalen
o
Ex
xpressionstem
mperatur vo
on FatB2.
Getestet
G
wurd
den 25 °C, 30 °°C und 37 °C. Von jeder
Temperatur
T
wurden
unlösliche
u
und
u
aufgetragen.
a
Die
diee
löslichee
hier
Zellen
jeeweils
Fraktion
in
getrennt
E
gezeigten Ergebnisse
wurden
w
aus 3 verschieedenen Westtern blotAufnahmen
A
nnzeichnet
zusammengessetzt (geken
durch
d
gestrich
helte Linie). Die Laufstreecken der
einzelnen
e
Ba
anden
bliebben
dabei
von
v
den
Originalaufna
O
hmen erhalten
en.
Um
m den Einfluss
E
deer Kulturbbedingungen
n auf diee Octansääureprodukttion zu
un
ntersuchen,, wurden 3 unterschiiedliche Meedien getesstet. Zum EEinsatz kam
men das
deefinierte Miinimalmedium M9, dass Standardv
vollmedium LB (lysogenny broth) so
owie das
geepufferte Vollmedium
V
TB (terriffic broth). Nach
N
einer 24-stündiggen Expresssion der
Th
hioesterase bei 30 °C Grad wurdden dazu die
d Fettsäurrezusammennsetzungen
n in den
un
nterschiedliichen Kultu
urflüssigkeiiten gaschro
omatograph
hisch bestim
mmt. Hierzu
u wurde
alllen Proben
n nach deer Express ion ein in
nterner Staandard in gleichen Mengen
zu
ugegeben, auf
a den die Werte alleer Fettsäureen normalissiert wurdenn (siehe Ab
bbildung
3--5). Hier zeeigte sich das
d TB-Meddium im Beereich der mittelkettiggen Fettsäu
uren den
an
nderen geteesteten Medien deutliich überleg
gen. Im TB-Medium w
war der An
nteil der
Octansäure um
u das 7-faache höher als im M9-Medium un
nd um etwaa das 3-fach
he höher
alls im ungepufferten LB-Mediuum. Gleichzzeitig blieb
ben jedochh die Anteeile der
95
laangkettigen Fettsäuren
n ab Dodecaansäure kon
nstant. Dah
her wurde ddas TB-Med
dium als
Sttandardmed
dium für diee Produktioon von Fettssäuren festg
gelegt.
Abbildung 3-5: A
Analytik-Ergeb
bnisse der
Experrimente
geeignetsten
zurr
Bestimmu
ung
M
Mediums
für
f
des
die
nsäureprodukktion. Getesteet wurden
Octan
das
medium
Minimalm
M9,
M
das
medium LB sowie das gepufferte
g
Vollm
Vollm
medium TB. Die Fettsäu
urezusammensetzungen in den einzelneen Proben
wurden gaschromaatographisch bestimmt
ü
einen ggemeinsamen
n internen
und über
Stand
dard (IS) norm
malisiert.
A
Als weitereer Faktor der Prozzessverbesseerung wurrde die K
Konzentratiion des
Exxpressionsin
nduktors Rhamnose
R
üüberprüft. Nach
N
Indukttion der Exxpression mit
m 0,1 %,
0,2 %, 0,4 % und
u 0,8 % Rhamnose,
R
w
wurden übeer den Verllauf von 211 h mehreree Proben
geenommen und
u anschlieeßend überr Western bllots (siehe Abbildung
A
33-6) analysiiert. Von
alllen untersu
uchten Kon
nzentration
nen liefertee 0,1 % Rhaamnose (A
A) die schw
wächsten
Errgebnisse. Bereits naach 5 h w
war nur no
och ein scchwaches T
Thioesterasse-Signal
deetektierbar, welches naach 21 h koomplett verschwunden
n war. Die K
Konzentratiionen ab
0,2 % Rhamn
nose (B bis D) lieferten
n jedoch üb
ber den gesaamten beobbachteten Zeitraum
Z
hmäßige Errgebnisse, iin denen diie Thioesterase in alleen Proben deutlich
reelativ gleich
iddentifiziert werden
w
kon
nnte. Da keeine wesenttliche Unterrschiede beezüglich derr Menge
un
nd Langzeittstabilität des
d Enzymss zwischen der Induktiion mit 0,2 %, 0,4 % un
nd 0,8 %
en
ntdeckt werrden konntte, wurden 0,2 % Rham
mnose als Standardend
S
dkonzentraation zur
In
nduktion deer Thioesterrase eingeseetzt.
96
Ab
bbildung 3-6
6: Western bloots der Versucchsreihe zur Ermittlung
E
derr optimalen R
Rhamnosekonzzentration
zu
ur Induktion der
d FatB2-Prod
duktion. Geteestet wurden die
d Konzentra
ationen 0,1 % (A), 0,2 % (B), 0,4 % (C)
un
nd 0,8 % (D). Über
Ü
den Verllauf von 21 h w
wurden mehrrere Proben geenommen undd im Blot aufg
getragen.
Da es sich beei den freien
n Fettsäureen – wie un
nter 4.1 auf Seite 121 geenauer bescchrieben
– um Produk
kte handeltt, welche siich in der Zellmembra
Z
an akkumuulieren könn
nen und
daamit einen toxischen
t
Effekt
E
auf ddie Zellen haaben könneen, wurden Wachstum
mskurven
in
n der Anweesenheit verschiedenerr Konzentrrationen des gewünschhten Zielprroduktes
Octansäure durchgefüh
hrt. Aus ddiesen Expeerimenten zeigte sichh, dass bereits ab
onen
Koonzentratio
von
500 mg
Octansäu
ure
pro
Liter
Kuulturmedium
m
eine
W
Wachstumsin
nhibition der
d Zellen vorlag (Ab
bbildung 3-7). Neben einer verriingerten
W
Wachstumsrate wurde ebenfalls nuur noch ein
ne maximalle OD600 voon etwa 15 erreicht,
w
was etwa 75 % der urrsprünglich
h maximaleen Dichte von
v
20 in Abwesenh
heit von
Octansäure entspricht.
e
97
Abbilddung 3-7: Veerlauf der
Wachsstumskurve des
d Wirtsms BW25113∆
∆fadD bei
stamm
unterscchiedlichen
Konzen-
trationnen an Octan
nsäure in
TB-Meedium. Neben octansäurefrreiem
Medium
als
Referennz wurden diee Konzentrationnen 0,5, 1, 2,
2 4, und
8 g L-1 in den Waachstumsmenten verweendet.
experim
Beedingt durcch diesen Umstand solllte ein Zeitp
punkt der Induktion errmittelt weerden, zu
deem möglich
hst früh die maximalee Produktio
onsrate fürr Octansäurre erreicht werden
kaann. Dazu wurden
w
Zelllen zunäch
hst bei 37 °C
C kultiviert, geerntet uund gewaschen und
an
nschließend
d in frischem
m TB-Mediium auf verrschiedene Zelldichten
Z
n zwischen 1 und 35
eiingestellt, die
d Expressiion mit 0,22 % Rhamno
ose bei 30 °C induziertt und nach
h 2 h der
Gehalt an Octansäure in
i der Kultturflüssigkeeit durch Gaschromato
G
ographie beestimmt.
Um
m die Probben miteinaander vergleeichen zu können,
k
wu
urden sie üüber einen internen
i
Sttandard aneeinander an
ngeglichen. Die Ergebn
nisse (siehe Abbildungg 3-8) zeigen
n bis OD
100 eine stetiig wachsen
nde Konzen
ntration an
n Octansäurre, die innnerhalb diesser zwei
Sttunden pro
oduziert wu
urde. Ab O
OD 11 gehtt die produ
uzierte Mennge an Octtansäure
alllmählich in
n einen leich
ht höheren , jedoch konstanten Wert
W über, aauf den höh
here ODs
scchließlich keinen
k
Einffluss mehr haben. Au
ufgrund dieser Experrimente wu
urden in
naachfolgendeen Versuch
hen die Kultturen - wen
nn nicht anderweitig aangegeben - jeweils
biis OD 10 kultiviert
k
und
u
erst daann induzieert, um in einer nichht von Octtansäure
geehemmten Phase mög
glichst schn
nell Biomassse aufzubauen, in weelcher ansch
hließend
zu
um effektivssten Zeitpu
unkt die Exppression derr Thioesteraase induzierrt wurde.
98
Ab
bbildung
3-8:
Gasch
hromatographhische
Ergeebnisse
zur
Bestimmuung
des
optimalen
+
In
nduktionszeitp
punkts für diee FatB2 -Exprression. Die Ex
xpressionen wurden
w
zu denn gegebenen optischen
h 2 h der Geehalt an Octaansäure in deen im Triplikkat angelegteen Proben
Diichten gestarrtet und nach
geemessen. Um die Proben untereinander vergleichen zu können, wurden
w
sie übber einen gem
meinsamen
internen Standaard normalisieert.
Das FatB2+-FFusionsprottein wurde n
nun unter den
d verbessserten Kultiivierungspaarameter
exxprimiert (A
Ansatz III), die Fettsäuurezusamm
mensetzung erneut gascchromatogrraphisch
an
nalysiert und
u
anschliießend dem
m Fettsäurreprofil von
n Wildtypp-Zellen geegenüber
geestellt (Tabbelle 3-2). Durch die zuvor besschriebenen
n Optimieruungen kon
nnte der
Gehalt an Occtansäure gegenüber
g
A
Ansatz II no
och einmal um das caa. 8-fache geesteigert
w
werden. Som
mit produzieerte Ansatzz III verglicchen mit deer Wildtyp--Kultur in 24
2 h pro
Liiter Kultur bis zu 518 µmol mehrr an Octan
nsäure. Auch die Zunaahmen der anderen
beeiden mittelkettigen Feettsäuren, D
Decan- und
d Dodecansääure, warenn mit einem
m Faktor
voon 50 bzw
w. 230 deuttlich, jedocch wirkte sich diese Zunahme in der ab
bsoluten
Koonzentratio
on der jeweeiligen Säurren nicht so stark auss wie bei dder Octansääure. Die
Zu
unahmen der
d restlicheen untersucchten Fettsääuren wareen gering bbis nicht sig
gnifikant
naachweisbar.
99
Tabelle 3-2: Konzentrationen der einzelnen Fettsäuren in Ansatz III-Kulturen abzüglich der
entsprechenden Konzentrationen in Wildtyp-Kulturen (WT).
Konzentration in
Zunahme
signifikant im
Kulturflüssigkeit [µM]
gegenüber WT
t-Test (p ≤ 0,05)
1,7 x
nein
Hexansäure
+ 4,3 ± 2,3
Octansäure
+ 517,7 ± 25,8
372,0 x
ja
Decansäure
+ 118,9 ± 5,7
50,1 x
ja
Dodecansäure
+ 46,7 ± 1,7
228,4 x
ja
Tetradecansäure
+ 12,2 ± 0,4
3,6 x
ja
Hexadecansäure
+ 8,3 ± 0,3
3,1 x
ja
Octadecansäure
+ 0,2 ± 0,2
1,1 x
nein
3.1.5 Zusätzliche Modifikationen in der Octansäureproduktion
Nachdem ein robustes Produktionssystem für Octansäure etabliert worden war,
sollten nun zwei weitere Modifikationen am Produktionsstamm vorgenommen
+
werden. Die erste beinhaltete die Integration des Fusionsproteins FatB2 in das Genom
der Wirtszellen. Auf diese Weise sollten die Zellen nicht dem metabolischen Stress der
Aufrechterhaltung einer Antibiotikumresistenz sowie der ständigen Replikation von
zusätzlicher Plasmid-DNA ausgesetzt sein und somit mehr Energie für die Produktion
der Octansäure erübrigen können. Dazu wurde das Fusionskonstrukt in die
Anlagerungsstelle für das Transposon Tn7 in der Terminatorregion des Gens glmS per
Red recombineering eingefügt (Ansatz IV). Die Thioesterase wurde unter den in
Kapitel 3.1.4 ermittelten Parametern für 24 h exprimiert und anschließend die
einzelnen Fettsäurewerte in den Kulturen erfasst (Tabelle 3-3).
Es zeigte sich gegenüber Ansatz II mit 288,2 ± 25,7 µM zwar eine Verbesserung
des Octansäuregehalt um den Faktor 4,5, jedoch wurde lediglich etwa die Hälfte des
Konzentrationsüberschuss von Ansatz III erreicht. Die Produktion von Decansäure
gegenüber Ansatz III war um weitere 27 % erhöht worden, während gleichzeitig die
Erzeugung von Dodecansäure auf ein Drittel abgesunken war. Weitere Unterschiede
im Fettsäureprofil waren (bis auf den Gehalt von Hexansäure) zwar signifikant im
Vergleich zu Wildtyp-Zellen, jedoch nur im Bereich weniger µmol pro Liter.
100
Tabelle 3-3: Konzentrationen der einzelnen Fettsäuren in Ansatz IV-Kulturen abzüglich der
entsprechenden Konzentrationen in Wildtyp-Kulturen (WT).
Konzentration in
Zunahme
signifikant im
Kulturflüssigkeit [µM]
gegenüber WT
t-Test (p ≤ 0,05)
Hexansäure
- 2,4 ± 1,3
0,6 x
nein
Octansäure
+ 288,2 ± 25,7
207,5 x
ja
Decansäure
+ 151,2 ± 6,7
63,4 x
ja
Dodecansäure
+ 15,6 ± 0,2
77,1 x
ja
Tetradecansäure
+ 6,6 ± 0,2
2,4 x
ja
Hexadecansäure
+ 6,1 ± 0,2
2,6 x
ja
Octadecansäure
+ 0,3 ± 0,1
1,2 x
ja
Die zweite Modifikation des etablierten Zellsystems sollte die zusätzliche Expression
einer für mittelkettige Fettsäuren spezifischeren 3-Ketoacyl-ACP-Synthase sein, des
Proteins mtKAS aus den Mitochondrien der Pflanze Arabidopsis thaliana[117]. Durch
die Expression dieses Enzyms sollten dem Fettsäure-Synthesezyklus vermehrt
mittelkettige Acyl-Substrate zu Verfügung gestellt werden. Das Protein wurde auf das
zu pJeM1 kompatible Plasmid pBAD18 kloniert und dann gleichzeitig mit der
Thioesterase FatB2+ in Ansatz V exprimiert. Nach 24-stündiger Expressionszeit
wurden die Fettsäuren aus der Kultur extrahiert und im Gaschromatographen
analysiert (Tabelle 3-4).
In diesen Experimenten zeigte sich, dass der Gehalt an Octansäure sich nur auf
68 %
des
Wertes
in
Ansatz
III
steigerte,
während
Änderungen
der
Fettsäurekonzentrationen von Tetra- bis Octadecansäure sowie Hexansäure entweder
nicht
signifikant
oder
nur
im
Bereich
um
Faktor
2
vorlagen.
Die
Konzentrationssteigerung von Decansäure war hier unter den verbesserten Ansätzen
III bis V mit 58,5 ± 4,0 µM am geringsten, während die Erhöhung der
Dodecansäurekonzentration mit 45,2 ± 0,4 µM in etwa genauso hoch ausfiel wie in
Ansatz III.
101
Tabelle 3-4: Konzentrationen der einzelnen Fettsäuren in Ansatz V-Kulturen abzüglich der
entsprechenden Konzentrationen in Wildtyp-Kulturen (WT).
Konzentration in
Zunahme
signifikant im
Kulturflüssigkeit [µM]
gegenüber WT
t-Test (p ≤ 0,05)
Hexansäure
- 0,9 ± 2,0
0,8 x
nein
Octansäure
+ 308,2 ± 22,1
Decansäure
221,8 x
ja
+ 58,5 ± 4,0
25,1 x
ja
Dodecansäure
+ 45,2 ± 0,4
220,8 x
ja
Tetradecansäure
+ 5,4 ± 0,4
2,2 x
ja
Hexadecansäure
+ 3,5 ± 0,2
1,9 x
ja
Octadecansäure
+ 0,0 ± 0,0
1,0 x
nein
Abbildung 3-9 stellt alle Ergebnisse der Octansäure-Produktionen einander gegenüber.
Die Expression der Thioesterase sowie weiterer Modifikationen des FettsäureSynthesezyklus wirkten sich in nennenswerten Ausmaß lediglich auf die 3 Fettsäuren
der Länge C8 bis C12 aus. Hier liegt der Schwerpunkt der Änderungen auf der
Octansäure. Mit einer Steigerung von über 500 µmol zusätzlich produzierter
Octansäure pro Liter Kultur schnitt hier der Ansatz III mit FatB2+ und verbesserten
Kultivierungsbedingungen am besten ab. Durch zusätzliche Modifikationen wie die
Integration der Thioesterase ins Wirtsgenom oder die zusätzliche Expression einer
3-Ketoacyl-ACP-Synthase wurde der Ertrag an Octansäure jeweils etwa halbiert. Die
Konzentration von Decansäure wurde am meisten durch die Integration des
Thioesterase-Fusionproteins in das Wirtszellengenom beeinflusst. In diesem Ansatz
wurden zusätzlich etwa 150 µmol Octansäure produziert, während Ansatz III
immerhin noch etwa 120 µmol mehr produzierte als eine Wildtypkultur. Die
Erhöhung der Dodecankonzentrationen in den einzelnen Ansätzen bewegte sich bis
maximal etwa 50 µmol in Ansatz III und erreichte außer in Ansatz V ansonsten nur
noch Bruchteile dieser Konzentrationssteigerung.
102
Abbildung 3-9: D
Direkter Verg
gleich der
Fettssäureüber-schhüsse der Anssätze I bis
V ab
bzüglich der Werte der Wildtypkultu
uren, wobei ees sich bei An
nsatz I um
die
Fettsäurezussammensetzun
ngen
im
mm mit der ffadD-Deletion
n handelt,
Stam
Ansa
atz II zeigt die Ergebn
nisse der
einfa
achen Expresssion der Th
hioesterase
in diesem
d
Deletiionsstamm, Ansatz
A
III
zeigtt im Vergleicch die Ergeb
bnisse der
Exprression des FFusionsprotein
ns FatB2+,
Ansa
atz IV die EErgebnisse dees in das
Geno
om
des
Deletionsstamms
integ
grierten Proteeins FatB2+ un
nd Ansatz
V sttellt die Ergeebnisse der parallelen
Exprression von Th
Thioesterase FatB2+ und
3-Ketoacyl-ACP-SSynthase mtK
KAS dar.
3..1.6 Produktion von
n Octansäu
ure in Biorreaktoren
Die nächste Stufe der verbesserten
v
n Octansäu
ureproduktio
on bestand in der Um
mstellung
dees batch-Prozesses in Schüttelkollben zu ein
nem fed battch-Verfahre
ren in Bioreeaktoren
(A
Ansatz VI). Die Bioreeaktoren bbieten gegeenüber Sch
hüttelkolbenn den Vorrteil der
M
Möglichkeit des sterilen Zufütteerns von Nährstoffen
N
n und Sauuerstoff sow
wie der
zeeitgleichen Erfassung und Kontroolle einzeln
ner Parametter wie zum
m Beispiel des
d pHs.
A
Abbildung 3--10 zeigt hieer beispielh
haft den Verrlauf einer solchen
s
Proozessführun
ng.
103
Abbildung
A
3-10: Zeitlicherr Verlauf versschiedener
Prozessparame
P
eter
währennd
des
fed
d
batch-
Verfahrens
V
zu
ur Octansäurre-produktion
n. Erfasste
Werte
W
sind hier
h
der pH (grau, durch
hgezogen,
Primärachse),
P
Zufüttern von
n NH4OH
der durch Z
(g
grau, gepunktet, Primärachhse) konstantt gehalten
wird.
w
Weiterh
hin wurde ddie Temperattur (grau,
gestrichelt,
g
Prrimärachse), OD (graue Quadrate,
Primärachse)
P
sowie der Sauerstoffpaartialdruck
(sschwarz, durchgezogen, SSekundärachsee) erfasst.
Zusätzlich
Z
wirrd hier ebenfaalls die Zufüttterung des
Glycerols
G
(sch
hwarz, gestriichelt, Sekun
ndärachse)
dargestellt.
d
Die Kultur wurde zun
nächst bei 37 °C angezogen um
m Biomassee aufzubau
uen. Der
Zu
uwachs an
n Biomassee ist durcch eine sttetig stärker werdennde Abnah
hme der
Saauerstoffkon
nzentration
n im Mediuum gekennzzeichnet. Beeim Erreicheen einer OD
D600 von
ettwa 10 nach
h 3 bis 4 Stu
unden, wurrde die Exprression des FatB2+ Fussionsprotein
ns durch
Zu
ugabe von L-Rhamnose (Endkon
nzentration 0,2 %) indu
uziert. Gleiichzeitig wu
urde die
Ku
ultur auf 30
3 °C herun
ntergekühltt und bei dieser
d
Tem
mperatur geehalten. Ab
b diesem
Zeeitpunkt wurde
w
ebenffalls mit deer konstantten Zufütterung von G
Glycerollössung zur
Ku
ultur
mit einer Rate
R
Durchmischu
ung
und
von
4 g h-1 beegonnen. Durch
Belüftungg
des
Mediums
M
stieg
diie gleichbleibende
beddingt
durch
die
Teemperaturssenkung derr Anteil dees gelösten Sauerstoffss kurzfristigg wieder an
n, wurde
senden Zelllen wiederr eingeholt und pendeelte sich
abber durch die
d stetig weiterwachs
w
letztendlich als limitierender Fakttor während
d des restliichen Prozeesses nahe 0 % ein.
Ettwa zeitgleich mit derr Induktion
n setzte diee pH-Reguliierung ein und durch
h nahezu
koonstante Zu
ugabe von Ammonium
mhydroxid
d wurde der pH währrend des gesamten
Prrozesses beii pH 7,4 geh
halten.
Die Ergebnisse
E
dieser Kullturführung
g sind in Tabelle
T
3-5 zusammen
ngefasst.
Grundsätzlich zeigte sicch, dass sicch durch daas durchgefführte fed bbatch-Verfah
hren die
Koonzentratio
onen aller gemesseneen Fettsäurren - außer Hexanssäure - sig
gnifikant
errhöhten (Faaktor 5 - 6)). Wie bei aallen bisherr getesteten
n Ansätzenn, lag auch hier die
grrößte Konzzentrationsssteigerung bei der Occtansäure vor,
v
bei deer - verglichen mit
104
-1
Wildtypzellen - mehr als 2300 ± 226 zusätzlichen µmol LKultur detektiert wurden, was
einer etwa 1660-fachen Zunahme entspricht.
Tabelle 3-5: Konzentrationen der einzelnen Fettsäuren in Ansatz VI abzüglich der entsprechenden
Konzentrationen in Wildtyp-Kulturen (WT).
Konzentration in
Zunahme
signifikant im
Kulturflüssigkeit [µM]
gegenüber WT
t-Test (p ≤ 0,05)
Hexansäure
+ 16,2 ± 10,2
Octansäure
+ 2320,0 ± 226,0
Decansäure
3,8 x
nein
1663,3 x
ja
+ 327,3 ± 28,2
136,0 x
ja
Dodecansäure
+ 191,7 ± 35,8
933,6 x
ja
Tetradecansäure
+ 28,7 ± 1,5
7,2 x
ja
Hexadecansäure
+ 42,4 ± 2,1
12,0 x
ja
In Ansatz VI wurde - zusätzlich zum Octansäureüberschuss - 327 ± 28 µmol mehr an
Decansäure sowie 192 ± 36 µmol mehr an Dodecansäure pro Liter Kultur in Relation
zum Wildtyp-Stamm produziert. Auch die Konzentrationen von Tetra- und
Hexadecansäure wurde durch den fed batch-Prozess gesteigert, schlugen jedoch mit
knapp 30 bzw. 40 µM verhältnismäßig gering zu Buche.
Abbildung 3-11 stellt die erfassten Konzentrationen aller vermessenen Stämme
in direkter Relation zueinander dar. Hier wird deutlich, dass das fed batch-Verfahren
sämtliche batch-Kulturen in der Ausbeute von Octansäure weit überragt. Die
-1
erreichten 2320 µM entsprechen 335 mg L Octansäure, die auf diese Weise in 24 h
produziert werden konnten.
105
Ab
bbildung 3-1
11: Direkter Vergleich
V
der FFettsäureüberrschüsse der Ansätze
A
I bis V
VI abzüglich der Werte
deer Wildtypkullturen, wobei es sich bei A
Ansatz I um die Fettsäurezzusammensettzungen im Stamm mit
deer fadD-Deletiion handelt, Ansatz
A
II zeiggt die Ergebniisse der einfacchen Expressiion der Thioeesterase in
dieesem Deletio
onsstamm, Ansatz
A
III zzeigt im Veergleich die Ergebnisse der Expresssion des
Fu
usionsproteinss FatB2+, Anssatz IV die Erggebnisse des in das Genom
m des Deletionnsstamms inttegriertem
Prroteins FatB2+, Ansatz V sttellt die Ergebbnisse der paarallelen Expression von Thhioesterase FatB2+ und
3-K
Ketoacyl-ACP
P-Synthase
mtKAS
darr
und
Anssatz
VI
repräsentiert
die
nisse
Ergebn
der
Occtansäureprod
duktion im Biioreaktor.
3..2 Hersttellung vo
on 8-Hyd
droxyoctansäure
Die in den Zellen pro
oduzierte O
Octansäure sollte anscchließend iin einem weiteren
w
kaatalytischen
n
Schritt
in
ω-P
Position
hydroxylier
h
rt
werdenn,
um
so
s
zur
8--Hydroxyocctansäure zu gelanggen. Für diese Reaaktion solllte eine terminal
t
hy
ydroxyliereende Monoo
oxygenase m
mit Affinitäät zu mittelkettigen Feettsäuren eingesetzt
w
werden. Hon
nda et al. zeigten in ihrrer Arbeit, dass
d sie mitt einem Ausstausch des Glycins
an
n Position 307 zu Alaanin, die A
Aktivität vo
on CYP153A
A aus Marrinobacter aquaeolei
a
geegen Octan
nsäure sign
nifikant steiigern konn
nten[143]. Diiese Mutannte wurde in einer
w
weiteren Arbbeit von Sccheps et all. zu einem
m „selbstverssorgendem““ Fusionsko
onstrukt
errweitert[8]. Dazu wurrde an dass Protein C-terminall die Reduuktasedomääne von
CY
YP102A1 aus
a
Bacillu
us megaterrium fusio
oniert. Auff diese W
Weise ist es dem
Gesamtproteein möglich sich, währrend der Kaatalyse selbsst mit Reduuktionsäquiv
valenten
zu
u versorgen
n, ohne auff ein zweitees separatees Protein angewiesen
a
n zu sein, das
d diese
Ä
Äquivalente auf die Mon
nooxygenasse überträg
gt.
Wie
bereits
im
i
Materiial
und
Methoden--Teil
bescchrieben,
ist
die
Reeaktionsabffolge zur Produktion des Zielpro
oduktes 8-H
Hydroxyocttansäure prrinzipiell
106
in einem Einzell- bzw. Zweizellsytem als auch parallel bzw. sequentiell durchführbar.
In einem ersten Schritt wurde zunächst ein Zweizellsystem in Schüttelkolben getestet,
bei dem in einer Kultur ein Gemisch an Zellen mit zwei unterschiedlichen Plasmiden
vorlag: bei den Zellen handelt es sich um den in der β-Oxidation defizienten
Wirtsstamm aus den vorherigen Experimenten (Stamm BW25113∆fadD). Sie trugen
+
entweder das Plasmid pKiM2 zur Expression des FatB2 -Fusionsproteins oder aber das
*
Plasmid pJOE4782.1-CYP zur Expression der Monooxygenase CYP153AMaq -CPRBM3.
So sollte eine Zelle die Octansäure produzieren, die von der zweiten Zelle
aufgenommen und durch die Monooxygenase hydroxyliert wird. In diesen
Mischkulturen wurde in unterschiedlichen Versuchen getestet, ob bei einer
gleichzeitigen
oder
einer
zeitlich
verzögerten
Expressionsinduktion
8-Hydroxyoctansäure entsteht. Anschließend wurden die Experimente auf 1 LBioreaktoren übertragen, um die Versuche unter kontrollierten Bedingungen
durchzuführen.
Zusätzlich zum Zweizellsystem wurde die Produktion der Hydroxyfettsäure in
einem Einzellsystem durchgeführt. Hierzu musste das Fusionsprotein CYP*-CPR auf
das zu pKiM2 kompatible Plasmid pBAD18 umkloniert werden (pBAD18-CYP). Dieses
Plasmid wurde anschließend zusätzlich zu pKiM2 in den Wirtsstamm eingebracht.
Auch hier wurde mit der gleichzeitigen und zeitverzögerten Induktion und in einem
späteren Stadium mit Bioreaktoren gearbeitet.
3.2.1 Zweizellsystem
Die vorausgegangenen Versuche hatten gezeigt, dass das FatB2+-Fusionsprotein
funktional in den Wirtszellen exprimiert wurde. Um zu überprüfen, ob dies auch bei
der Expression der Monooxygenase von Plasmid pJOE4782.1-CYP der Fall war, wurde
das
Kohlenstoffmonoxid-Differenzspektrum
von
Zell-Lysaten
von
CYP*-CPR
exprimierenden Zellen und einer Negativkontrolle aufgenommen (Abbildung 3-12).
107
Abbildun
ung
3-12::
CO-
Differenzzspektrum von
v
ZellLysat vonn ∆fadD-Zelleen, die die
Monooxyygenase von
n Plasmid
pJOE47822.1-CYP
und
einnem
ex
xprimieren
Zell-Ly
ysat
aus
∆fadD-Zeellen ohne Plaasmid.
Der Höhepu
unkt des Differenzver
D
rlaufs bei 450
4 nm in Abbildung 3-12 indizziert das
Voorhandenseein der CO-reduzier
C
rten Form der Mon
nooxygenasee und somit die
grrößtenteils funktionalee Expressioon der Mon
nooxygenasse. Der zweeite Höhepu
unkt bei
4220 nm deutet jedoch auch
a
in gerringerem Ausmaß
A
auff Abbauproodukte des Proteins
beeziehungsw
weise auf niccht funktion
nal exprimiierte Monoo
oxygenase hhin.
Zw
weizellsysteem in Schütttelkolben
In
n einer Miscchkultur wu
urde nun diie Expressio
on von Thio
oesterase unnd Monoox
xygenase
zeeitgleich du
urch die Zugabe von
n L-Rhamno
ose gestartet und diee Zellen beei 30 °C
in
nkubiert. Übber 24 h wu
urden zu vverschiedenen Zeitpun
nkten Probeen entnomm
men und
au
uf ihren Occtansäure- und
u 8-Hydrroxyoctansääuregehalt hin untersuucht. Es zeiigte sich
jedoch, dass unter diesen Umstän
nden zu keiinem Zeitpu
unkt 8-Hyddroxyoctansäure in
deer Kultur zu finden war und auch die Octansäure
O
eproduktionn selbst waar stark
abbgeschwäch
ht (69 µmol L-1Kultur nacch 24 h).
Da diie parallelee Expressioon nicht zu
um Erfolg führte,
f
wurrden Versu
uche mit
eiiner sequen
ntiellen Abffolge der E
Expressioneen gestartett. Hierzu w
wurde zunäächst die
FaatB2+-Thioeesterase bei 30 °C fürr 24 h von
n BW25113
3∆fadD-Zelllen in TB-Medium
exxprimiert und
u
Octanssäure in daas Medium
m abgegeben. Anschlieeßend wurrden die
Zeellen vom octansäureh
o
haltigen Übeerstand abg
getrennt un
nd dieser steeril filtriert.. Parallel
w
wurde das CYP*-CPR-F
C
Fusionsproddukt für seechs Stunden in einerr separaten
n Kultur
exxprimiert un
nd die Zelleen anschließ
ßend geern
ntet und gew
waschen. D
Diese Zellen wurden
daann in deer octansääurehaltigen
n Kulturflü
üssigkeit der
d
ersten Kultur in einer
-1
Koonzentratio
on von 100 gcww L reesuspendiert und dariin für weittere 24 h bei
b 30 °C
in
nkubiert. Auch
A
hier wurde zuu mehrereen Zeitpun
nkten der Octan- und
u
der
H
Hydroxyoctaansäuregehaalt bestimm
mt. Jedoch konnte
k
auch
h hier zunäächst, ebenffalls wie
108
bei der parallelen Prozessführung, keine endständig hydroxylierte Octansäure
detektiert werden. Es zeigte sich jedoch, dass durch die Produktion der Octansäure der
pH-Wert des TB-Mediums trotz des zugesetzten Puffers von 7,5 auf etwa 5,5 sank.
Viele Monooxygenasen weisen einen relativ engen pH-Bereich auf, in welchem sie mit
ihrem
Substrat
interagieren
[168]
können
.
Im
Hinblick
darauf
wurde
im
octansäurehaltige Überstand vor der Resuspension der CYP-haltigen Zellen der pH
wieder auf einen Wert von 7,5 angehoben. Von den im Medium vorliegenden 622 µM
Octansäure wurden dann 198,1 µM (31,7 % Umsatz) in 8-Hydroxyoctansäure
umgewandelt.
Tabelle 3-6: Konzentrationen der einzelnen Fettsäuren bei der Produktion von 8-Hydroxyoctansäure
beim sequentiellen Zweizellsystem im Schüttelkolben abzüglich der entsprechenden Konzentrationen in
Wildtyp-Kulturen (WT).
Konzentration in
Kulturflüssigkeit [µM]
Zunahme gegenüber WT
Hexansäure
- 4,4
0,2 x
Octansäure
+ 197,3
140,9 x
Decansäure
+ 52,3
21,8 x
Dodecansäure
+ 7,0
36,0 x
Tetradecansäure
+ 1,8
0,4 x
Hexadecansäure
+ 11,6
3,9 x
8-Hydroxyoctansäure
+ 198,1
n.d.
Auffällig war jedoch auch, dass weitere 36,6% der Ausgangssubstratmenge
fehlten. Dies ließ darauf schließen, dass die Hydroxyoctansäure eventuell weiter
umgesetzt wurde, z.B. durch Überoxidation in die Dicarbonsäure, oder dass das
Produkt eventuell von den Zellen verstoffwechselt wurde. Nach einem Abgleich der
gaschromatographischen Auswertungen mit einem Suberinsäure-Standard konnte die
Überoxidation jedoch ausgeschlossen werden, da von dieser Dicarbonsäure in keinem
Fall eine signifikante Steigerung gegenüber der Ausgangskonzentration detektiert
wurde (Daten nicht gezeigt). Um zu klären, ob die Zellen die Octansäure oder deren
hydroxyliertes Derivat metabolisieren konnten, wurden Wachstumsexperimente in
M9-Minimalmedium durchgeführt. Die Vorgehensweise und Ergebnisse sind im
109
Anhang in Kapitel 6.5 auf Seite 179 aufgeschlüsselt. Diese Experimente zeigten, dass
die Zellen nicht auf diesen Molekülen als alleinige Kohlenstoffquelle wachsen können.
Zweizellsystem in Bioreaktoren
Wie die sequentielle Prozessführung zur Produktion von 8-Hydroxyoctansäure zeigte,
war es grundsätzlich möglich, mit diesem Zweizellsystem 8-Hydroxyoctansäure de
novo zu produzieren. In einem weiteren Ansatz sollte nun erneut versucht werden,
durch einen Parallel-Ansatz dieses System funktional zu verwirklichen. Da der pHWert offensichtlich großen Einfluss auf die Aktivität der Monooxygenase besaß, sollte
das System in 1 L-Bioreaktoren übertragen werden, in denen Parameter wie pH,
Temperatur,
Sauerstoffsättigung
und
Substratkonzentration
kontrolliert
und
beeinflusst werden konnten. Hierfür wurden in Schüttelkolben BW25113∆fadD-Zellen
mit Plasmid pKiM2 und mit Plasmid pJOE4782.1-CYP jeweils getrennt bis zu einer OD
von 4 angezogen, geerntet, gewaschen und anschließend in einem 1:1-Verhältnis in
die Bioreaktoren gemischt. Nach der Induktion wurde die Kultur für weitere 24 h bei
30 °C inkubiert. Der pH wurde in dieser Zeit durch Zugabe von Ammoniumhydroxid
bei 7,4 gehalten. Nach der gaschromatographischen Analyse zeigte sich, dass auch hier
bei paralleler Induktion beider Protein keine 8-Hydroxyoctansäure erzeugt werden
konnte.
In einem weiteren Ansatz wurde auch die sequentielle Prozessführung auf den
Bioreaktor übertragen. Dabei wurde wie beim gleichen Experiment in Schüttelkolben
verfahren, jedoch konnte, durch die Bauart bedingt, in den Bioreaktoren im zweiten
-1
Schritt lediglich eine Zelldichte von 25 gcww LMedium eingestellt werden. Im Gegensatz
zum parallelen Ansatz zeigte sich in diesem Experiment eine Produktion von 44,5 µM
an hydroxylierter Octansäure, während die nicht hydroxylierte Fettsäure eine
Konzentration von 478,9 µM erreichte.
110
Taabelle 3-7: Konzentration
K
en der einzellnen Fettsäureen bei der Produktion vonn 8-Hydroxyo
octansäure
beeim sequentieellen Zweizelllsystem im B
Bioreaktor abzüglich der entsprechende
e
en Konzentraationen in
W
Wildtyp-Kulturren (WT).
Ko
onzentratiion in
Kultu
urflüssigk
keit [µM]
Zunahm
me gegenüb
ber WT
H
Hexansäure
- 3,5
0,6 x
Octansäure
+ 477,4
341,0 x
Decansäure
+ 144,7
60,3 x
Dodecansäurre
+ 11,8
59,0 x
Teetradecansääure
+ 9,1
2,0 x
H
Hexadecansääure
+ 26,1
6,7 x
8--Hydroxyocctansäure
+ 44,5
n.d.
3..2.2 Einzeellsystem
Fü
ür das Etablieren einess Einzellsysstems, wurd
de wieder der
d Stamm BW25113∆
∆fadD, in
w
welchem diee kompatib
blen Plasm
mide pKiM22 und pBA
AD18-CYP repliziert werden,
veerwendet. Auch
A
hier wurde zun
nächst per CO-Differeenzspektrum
m ermitteltt, ob die
M
Monooxygen
nase in fun
nktioneller Form von den Zellen
n exprimierrt wird. Ab
bbildung
3--13 zeigt das entsprecchende Diffferenzspekttrum zwiscchen Lysateen von Zelllen, die
CY
YP*-CPR von
v
Plasmiid pBAD188-CYP exprimieren und
u
von K
Kontrollzellen. Der
H
Höhepunkt bei 450 nm
m bestätiggt die Exp
pression deer Monooxxygenase in
i ihrer
fu
unktionalen
n Form.
Abbildu
ung 3-13:
CO-Diffeerenzspektrum
m
von
Zell-Lysaat aus ∆fad
dD-Zellen,
die die Monooxygen
nase von
Plasmid
pBA
AD18-CYP
nem Zellexprimieeren und ein
Lysat auus ∆fadD-Zelllen ohne
Plasmid.
111
Einzellsystem in Schüttelkolben
Wie bereits im Zweizellsystem sollten hier die parallele und die sequentielle
Prozessführung miteinander verglichen werden. Bei der parallelen Induktion von
+
*
FatB2 und von CYP -CPR durch Rhamnose bzw. Arabinose wurden die Zellen
zunächst bis zu einer OD600 von etwa 1 angezogen, anschließend die Temperatur der
Kultur auf 30 °C gesenkt und die Expressionen gleichzeitig gestartet. Nach 24 h
Inkubationszeit wurden die Fettsäureanteile der Kulturen gaschromatographisch
analysiert. Die Untersuchung ergab hierbei, dass nun im Gegensatz zum
Zweizellsystem mit paralleler Prozessführung das terminal hydroxylierte Derivat der
Octansäure in der Kultur nachgewiesen werden konnte. So erreichte die
Konzentration von 8-Hydroxyoctansäure einen Wert von 55,3 µM, während außerdem
435,9 µM Octansäure in diesem System produziert wurden.
Tabelle 3-8: Konzentrationen der einzelnen Fettsäuren bei der Produktion von 8-Hydroxyoctansäure
beim parallelen Einzellsystem im Schüttelkolben abzüglich der entsprechenden Konzentrationen in
Wildtyp-Kulturen (WT).
Konzentration in
Kulturflüssigkeit [µM]
Zunahme gegenüber WT
Hexansäure
- 2,4
0,6 x
Octansäure
+ 435,9
312,1 x
Decansäure
+ 109,3
20,1 x
Dodecansäure
+ 32,6
164 x
Tetradecansäure
+ 11,4
3,5 x
Hexadecansäure
+ 18,5
5,7 x
8-Hydroxyoctansäure
+ 55,3
n.d.
Bei der sequentiellen Prozessführung im Einzellsystem in Schüttelkolben
wurden die Zellen ebenfalls bis zu einer OD600 von 1 kultiviert, die Temperatur auf
+
30 °C gesenkt und zunächst dann nur die Expression des FatB2 -Fusionproteins
induziert. Nach 6 h FatB2+-Expression wurde dann ebenfalls die Expression der
Monooxygenase gestartet. Nach weiteren 24 h Inkubation erfolgte wieder eine
gaschromatographische Auswertung der Fettsäurezusammensetzung in der Kultur.
Diese ergab bei einer Produktion von 139,7 µM Octansäure die gleichzeitige
Erzeugung von 49,5 µM 8-Hydroxyoctansäure.
112
Tabelle 3-9: Konzentrationen der einzelnen Fettsäuren bei der Produktion von 8-Hydroxyoctansäure
beim sequentiellen Einzellsystem im Schüttelkolben abzüglich der entsprechenden Konzentrationen in
Wildtyp-Kulturen (WT).
Konzentration in
Kulturflüssigkeit [µM]
Zunahme gegenüber WT
Hexansäure
- 5,7
0,03 x
Octansäure
+ 139,7
100,8 x
Decansäure
+ 45,9
20,1 x
Dodecansäure
+ 4,3
22,5 x
Tetradecansäure
+ 3,5
1,8 x
Hexadecansäure
+ 10,7
3,7 x
8-Hydroxyoctansäure
+ 49,5
n.d.
Einzellsystem in Bioreaktoren
Nach der erfolgreichen Produktion der hydroxylierten Fettsäure im Einzellsystem,
sollten die Schüttelkolben-Ergebnisse mit denen aus Bioreaktoren verglichen werden.
Der Prozess an sich war genauso gestaltet wie in den Schüttelkolben, jedoch mit dem
Unterschied des konstant gehalten pH-Werts, einer besseren Durchmischung und
Sauerstoffversorgung in den Bioreaktoren. Zunächst wurde wieder die parallele
Induktion der Enzyme getestet. Hierbei ergab die Analyse der Fettsäurewerte im
Gaschromatograph für Octansäure einen Wert von 1333,4 µM, während ebenfalls
233,5 µM Hydroxyoctansäure produziert wurden.
Tabelle 3-10: Konzentrationen der einzelnen Fettsäuren bei der Produktion von 8-Hydroxyoctansäure
beim parallelen Einzellsystem im Bioreaktor abzüglich der entsprechenden Konzentrationen in
Wildtyp-Kulturen (WT).
Konzentration in
Kulturflüssigkeit [µM]
Zunahme gegenüber WT
Hexansäure
- 0,2
0,6 x
Octansäure
+ 1333,4
953,5 x
Decansäure
+ 366,3
153,6 x
Dodecansäure
+ 32,4
163,5 x
113
Konzentration in
Kulturflüssigkeit [µM]
Zunahme gegenüber WT
Tetradecansäure
+ 33,1
8,2 x
Hexadecansäure
+ 34,5
9,8 x
8-Hydroxyoctansäure
+ 233,5
n.d.
Bei der sequentiellen Prozessführung bei der die Induktionen wieder um 6 h
zeitversetzt stattfanden, wurden jeweils etwa 70 % dieser Werte erreicht. Hier
produzierten die Zellen neben 880,6 µM Octansäure 167,9 µM des ω-hydroxylierten
Derivats.
Tabelle 3-11: Konzentrationen der einzelnen Fettsäuren bei der Produktion von 8-Hydroxyoctansäure
beim sequentiellen Einzellsystem im Bioreaktor abzüglich der entsprechenden Konzentrationen in
Wildtyp-Kulturen (WT).
Konzentration in
Kulturflüssigkeit [µM]
Zunahme gegenüber WT
Hexansäure
- 2,4
0,6 x
Octansäure
+ 880,6
630,0 x
Decansäure
+ 263,5
109,9 x
Dodecansäure
+ 22,1
113,0 x
Tetradecansäure
+ 20,0
5,3 x
Hexadecansäure
+ 32,3
9,3 x
8-Hydroxyoctansäure
+ 167,9
n.d.
3.3 Entwicklung eines Thioesterase-HTS-Assays
Um das Produktspektrum des Verfahrens zu erweitern, sollte die Aktivität der
Thioesterase FatB2+ durch Mutagenese erweitert werden. Da aber bis dato keine
strukturellen Informationen zu diesem Pflanzenenzym vorliegen, sollte die
Mutagenisierung in einem zufallsbedingten Ansatz durch error prone PCR erfolgen.
Voraussetzung für einen solchen Ansatz ist jedoch ein effektives high throughput
screening (HTS)-System, mit welchem auf kostengünstige und zuverlässige Art und
Weise in einem kurzem Zeitraum eine große Anzahl an Mutanten nach den
gewünschten Eigenschaften, wie der veränderten Spezifität, durchmustert werden
114
kann. Die Grundbedingung für einen solches Durchmusterungssystem ist die
Verfügbarkeit eines geeignetes Substrat.
Lee et al.[157] und Shahi et al.[169] zeigten in ihren Arbeiten, dass 4Nitrophenolester als mögliche Substrate für Thioesterasen genutzt werden können,
auch wenn diese jedoch im Allgemeinen eher schwache Aktivitäten gegenüber diesen
Estern aufweisen. Diese Klasse an Molekülen erschien für diese Arbeit jedoch
besonders geeignet, da die Spaltung dieser kostengünstigen Ester direkt optisch
identifiziert und photometrisch bei 420 nm quantifiziert werden kann. Außerdem
ermöglichen relativ einfache chemische Verfahren die Variation des Acylrestes in
unterschiedlichen Längen (siehe Kapitel 2.9 auf Seite 87). Als weiteres mögliches
Substrat kam der für Thioesterase-Aktivitätsassays standardmäßig genutzte Acylester
mit Coenzym A in Frage. Da er für viele Thioesterasen ein natürliches Substrat ist, ist
er für einen Aktivitätsassay besser geeignet als die Nitrophenolester. Jedoch besitzen
Acyl-CoA-Ester den Nachteil, dass sie teuer sind, was einen größeren Einsatz in einem
HTS-System erschwert. Ebenfalls ein Nachteil dieses Substrates ist, dass die Spaltung
nicht direkt nachgewiesen werden kann, sondern nur indirekt über den Umweg der
Detektion der durch die Esterspaltung freiwerdenden Thiolgruppe am Coenzym A
(z.B. durch 5,5′-Dithiobis-2-nitrobenzoesäure (DTNB)).
Dieser Teil des Projekts lässt sich in drei Unterteile gliedern. Im ersten Teil
wurde versucht, ein screening-System auf Agarplatten zu entwickeln. Im zweiten Teil
sollte das gleiche Vorhaben in einem Flüssigsystem umgesetzt werden. Der dritte Teil
+
schließlich befasste sich mit der Aufreinigung des FatB2 -Konstruktes, um eine
genaue Charakterisierung der Aktivität des Enzyms gegenüber den ausgewählten
Substraten zu ermöglichen.
3.3.1 Screening auf Agarplatten
Da die oben beschriebenen Substrate nicht membrangängig sind, bestand die
Schwierigkeit zunächst darin, der intrazellulären Thioesterase die Interaktion mit den
Substraten physisch zu ermöglichen. Dazu wurden drei Methoden getestet: ein
einfacher Gefrier-Tau-Zyklus mit auf Filterpapier gewachsenen Kolonien, das
Bedampfen gewachsener Kolonien mit Chloroform sowie der Einsatz des Plasmids
pJL3, von welchem das bacteriocin release protein (BRP) exprimiert wird. Dieses
Protein aktiviert die Phospholipase A, was zur Schaffung von für Proteine permeablen
Zonen in den Zellmembranen führt[170].
115
Zunächst sollte der 4-Nitrophenylester der Octansäure als Substrat in M9-Agar
vorgelegt werden, um Thioesterase exprimierende Zellen darauf über Nacht zu
inkubieren. Dies stellte sich jedoch als nicht praktikabel heraus, da bei der Herstellung
der Agarplatten die Temperatur des flüssigen Agar zu einer starken Hydrolyse des
Estersubstrates führte und eine Gelbfärbung des kompletten Agars auftrat. Als
möglicher Ausweg sollte das gelöste Substrat auf bereits gewachsene Kolonien
aufgesprüht werden. Jedoch konnte hier mit keiner der obig aufgeführten
Lysemethoden eine vermehrte Aktivität von Zellen, welche die Thioesterase
exprimierten, gegenüber den Kontrollzellen festgestellt werden. Außerdem führte das
Versprühen der Substratlösung teilweise zu einem Ineinanderlaufen der gewachsenen
Kolonien. Um zu überprüfen, ob diese Negativergebnisse mit einer mangelnden Lyse
der Zellen oder einer zu geringen Aktivität gegen das eingesetzte Substrat herrührten,
wurde in einem weiteren Ansatz Octanoyl-CoA eingesetzt und in Verbindung mit
DTNB auf die unterschiedlich lysierten Zellen gesprüht. Auch hier konnten keine
+
Unterschiede in der Aktivität zwischen FatB2 -Zellen und Kontrollzellen ohne
zusätzliche Thioesterase festgestellt werden. Schließlich wurde ein M9-Softagar (1 %
Agar) mit Thioesterase-exprimierenden Zellen versetzt und über Nacht bei 30 °C
inkubiert. Auf den am nächsten Tag durchwachsenen Agar wurde die Assaylösung in
unterschiedlichen Konzentrationen aufgetropft und anschließend für eine Stunde
inkubiert. Jedoch war selbst bei dieser sehr hohen Zahl an Bakterien, die dem Assay
die Thioesterase zulieferten, die Gelbfärbung nur minimal und mit dem bloßen Auge
kaum erkennbar (siehe Abbildung 6-11 im Anhang unter Kapitel 0 auf Seite 180). Die
Negativkontrolle (nicht gezeigt) zeigte gar keine Gelbfärbung.
3.3.2 Screening in Flüssigkeit
Um die Probleme des Festphasen-Assays aus dem vorherigen Kapitel (wie
autohydrolysierende Ester aufgrund zu hoher Temperaturen, zu geringe Zellzahlen,
geringe Membrangängigkeit der Substrate) zu umgehen, sollten die Grundlagen für
einen Flüssigphasen-Assay gelegt werden. Dafür sollte die Thioesterase mithilfe der
Oberflächenpräsentation, welche von Wittrup et al. entwickelt wurde[10], auf
Hefezellen der Gattung Saccharomyces cerevisiae exprimiert werden. In Abbildung
3-14 ist das Prinzip der Oberflächenpräsentation schematisch dargestellt.
116
Abbildung
3-14:
ntation
Oberrflächenpräsen
Schema
voon
Protein
nen
zur
mit
Hefeezellen. Das zu untersuuchende Prottein, hier
FatB2+, wird an Aga2
A
fusionieert, welches seinerseits
s
über zwei Disulfidbindung an Aga1 in der Zellwand
v
istt. So bleibt das zu
der Hefezelle verankert
untersuchende
Protein
an
die
exprimierende
nden und kkann durch geeignete
Wirttszelle gebun
Subsstrate identifiiziert und aanschließend über die
Wirttszelle selektio
oniert werdenn.
In
n Kooperatio
on mit der Arbeitsgrup
A
ppe um Pro
of. Dr. Harald Kolmar aan der Tech
hnischen
Un
niversität Darmstadt entstand ein entsp
prechendes Hefeplasm
mid, mit dem
d
die
Th
hioesterase FatB2+ an
n der Obeerfläche derr Hefezelleen präsentiiert werden
n sollte.
Jeedoch konn
nte in versch
hiedenen E
Expressionsansätzen weder
w
mit 44-Nitrophen
nolestern
nooch mit Octtanoyl-CoA
A-Estern ein
ne Aktivitätt verzeichneet werden, ddie signifikant über
diie Hintergru
und-Hydrollyse von Koontrollzellen
n hinaus gin
ng.
3..3.3 Aufreinigung von
v FatB2+
Da vorausggegangene Versuche zur Aktiv
vitätsbestim
mmung vonn FatB2+ an der
veermutlich zu
z geringen
n Aktivitätt des Enzy
yms scheiteerten, solltte dieses in
n einem
w
weiteren An
nsatz aufgerreinigt undd aufkonzen
ntriert werd
den, um diee Substratsspezifität
übber versch
hiedene Fettsäurelänggen zu un
ntersuchen. Die Aufr
freinigung erfolgte
zu
unächst übeer eine gekü
ühlte Nickellaffinitäts-C
Chromatogrraphie.
117
Ab
bbildung 3-1
15: Chromato
ogramm der FatB2+-Aufreeinigung. In blau
b
ist die A
Absorption beei 280 nm
ein
ngezeichnet. Die in den
n Proteinen enthaltenden
n aromatisch
hen Aminosääurereste weeisen ein
Abbsorptionsmaaximum bei 280 nm auf, ddaher ist diesee Kurve in etwa mit dem
m Proteingehaalt der die
Messzelle durcchlaufenden Flüssigkeit
F
glleichzusetzen.. In braun isst die Konduuktivität dargestellt (in
mm ohne Dimension). D
Die grüne Ku
urve stellt deen voreingesttellten Gradieenten des
dieesem Diagram
Elutionsbuffers dar. Das jew
weiligen Misschverhältnis ist der Seku
undärachse zuu entnehmen
n, die den
nteil des Elutiionspuffers am
m Puffergemissch wiedergib
bt.
An
A
Abbildung 3-15
3
stellt beispielhaft
b
t den Verlaauf einer Aufreinigun
A
ng über ein
ne 1 mL
H
HisTrap HP--Säule (GE Healthcare
H
Europe Gm
mbH) dar. Wie
W dem zuugehörigen Dot blot
in
n Abbildungg 3-16 linkss zu entneh
hmen ist, wurde
w
das Thioesterasee-Konstruktt nahezu
voollständig aus
a dem Durchlauf
D
(FFraktionen A1 - B10)) entfernt. Ab dem Start
S
der
Ellution (ab Fraktion B4)
B enthieltten fast allle Fraktioneen das Fussionsprotein
n. Diese
Frraktionen beinhalten
b
neben
n
der T
Thioesterase (59,9 kDaa) auch anddere Protein
ne (siehe
A
Abbildung 3-16 rechts). Währendd die B-Frak
ktionen zussammen nuur etwa 144,3 % des
geesuchten Prroteins bein
nhalteten, sttieg der An
nteil über diie C-Fraktioonen mit 344,8 % auf
444,8 % in den
n D-Fraktion
nen.
118
Ab
bbildung 3-1
16 links: Dott blot verschieedener Fraktiionen aus derr Nickelaffiniitäts-Aufreiniigung von
FaatB2+. Als Zieel für den priimären Antikkörper diente hier der 6 x Histidin-Anhhang am ThioesteraseKoonstrukt, der auch schon zur Aufreiniigung diente. Die Fraktion
nen des Durcchlaufs enthieelten kein
Ziielprotein, wäährend die Fraaktionen ab B
B2 jeweils ein
n sehr starkes Signal abgabben. Rechts: SDS-PAGE
S
deer gepoolten B-,
B C- und D-F
Fraktionen (M
M = Marker), der
d Pfeil mark
kiert die korreekten Proteinb
banden.
Um
m die Akttivität der partiell geereinigten Thioesteras
T
e zu testenn, musste das zur
Ellution verw
wendete Imiidazol aus der Protein
nlösung enttfernt werdden, da es mit
m dem
A
Aktivitätsasssay interag
gierte und die Autoh
hydrolyse der
d Esterve
verbindungeen stark
beeschleunigte (Daten niicht gezeigtt). Hier wurrde die Dialy
yse gegen vverschieden
ne Puffer
soowie eine Entsalzung
gssäule gettestet. So wurde
w
unter anderem
m die schrrittweise
Dialyse gegeen Puffer mit sinkendeer Imidazol--Konzentrattion getesteet, gegen Pu
uffer mit
deen pHs 6 und
u
8 (stattt des üblicchen pH 7, da sich ein
e Wechseel des pHs bei der
A
Aufreinigungg pflanzlich
her Thioestterasen in anderen
a
Arrbeiten bereeits bewährrt hatte)
un
nd gegen Puffer mit proteinstaabilisierend
den Zusätzeen wie Gly
lycerol (1 M),
M PEG
(1,5 %), PVP (1,5 %) odeer Arginin ((1 M). Jedoch konnte mit keinem
m Puffer verhindert
w
werden, dasss das Proteein noch im
m Dialyseschlauch nacch wenigenn Stunden komplett
k
prräzipitierte (siehe im Anhang
A
auff Seite 181 Abbildung
A
6-12)
6
und keeine Aktivittät mehr
geegen die Substrate
S
feestgestellt werden ko
onnte (Daten nicht ggezeigt). Auch
A
die
Veerwendungg einer Entssalzungssäuule brachte keinen Erffolg und daas Protein fiel
f noch
au
uf der Säulee aus.
Beim Einsatz einer Anioonentausch
hersäule (R
Resource Q der Firrma GE
H
Healthcare Europe
E
Gmb
bH) trat daas Problem auf, dass daas Protein iin untersch
hiedliche
Frraktionen über
ü
den gesamten
g
LLauf verteillt auftauch
hte und ebbenfalls aucch nicht
koomplett auss dem Durcchlauf entfeernt wurdee (siehe Abb
bildung 3-117 links). Aufgrund
A
diieser Unspeezifität wurd
den die Verrsuche mit Anionentau
A
uschersäulenn aufgegebeen.
119
Ab
bbildung
3
3-17
links:
Dot
blot
der
Fraktio
onen
einer
FatB2+-Aufrreinigung
über
eine
An
nionentauschersäule. Das Zielprotein
Z
isst im Durchlau
uf und über mehrere
m
separrate Fraktioneen verteilt
voorhanden. Recchts: Dot blot der
d Fraktioneen einer FatB22+-Aufreinigun
ng über eine K
Kationentauschersäule.
Hiier befindet siich das Zielprotein zu großßen Teilen in den
d Fraktioneen D7 bis D9.
Beei Aufreinigungen miit einer Kattionentauscchersäule (H
HiTrap SP Sepharose FF vom
H
Hersteller GE
E Healthcarre Europe G
GmbH) war das Vorkom
mmen des PProteins auff wenige
Frraktionen beschränkt
b
(siehe Abbiildung 3-177 rechts). Anhand des stark verbrreiterten
Peeaks im zuggehörigen FPLC-Chro
F
omatogramm
m (Daten nicht
n
gezeiggt), konnte auf eine
niicht ausreiichende Au
ufreinigungg von FatB
B2+ geschlo
ossen werdden. Daherr wurde
veersucht, diee Aufreinig
gung über die Nickeelsäule mitt der Aufrreinigung über
ü
die
Kaationentausschersäule
zu
kopppeln
um
einerseitss
das
Im
midazol
aus
a
der
A
Affinitätschrromatograph
hie zu entffernen und
d andererseeits eine hööhere Reinheit des
Ziielproteins
zu
errreichen.
Jedoch
zeigte
z
deer
Dot
blot
nacch
der
Ioonentauscheeraufreinigu
ung, dass in
n diesem Schritt
S
wied
der sämtlichhes Protein
n auf der
Sääule ausfiel und somit verloren giing.
Ab
bbildung 3-118: Dot blot nach der
Ion
nentauscherauufreinigung, der eine
Afffinitätsaufreinnigung
über
eine
Nicckelsäule vorrausgegangen
n war. In
keiiner
der
hier
auffgeführten
Fra
aktionen 5 bis 15 kon
nnte das
Zieelprotein nachhgewiesen weerden.
120
4 Diskussion
Vor dem Hintergrund der regenerierbaren Energien und Werkstoffe ging es in der
vorliegenden Arbeit um die Machbarkeitsanalyse eines mikrobiellen GanzzellProzesses für die de novo Biosynthese der mittelkettigen Fettsäuremoleküle
Octansäure und 8-Hydroxyoctansäure, ohne dabei auf die Zufütterung von erdölabhängigen Substraten wie Alkane angewiesen zu sein. Dabei konnte Octansäure
erfolgreich durch die heterologe Expression einer pflanzlichen Thioesterase in einer
E. coli-Wirtszelle produziert werden. Durch weitere Optimierungen verschiedener
Parameter innerhalb dieses Prozesses konnte die Konzentration der Fettsäure um
mehr als den Faktor 1000 gesteigert werden. In einem weiteren Schritt wurde,
basierend auf diesem Stamm, ein Gesamtsystem entwickelt, in welchem durch die
zusätzliche
Expression
einer
spezifischen
Monooxygenase
das
Endprodukt
8-Hydroxyoctansäure produziert wurde.
4.1 Konstruktion
eines
Octansäure
sekretierenden
E. coli-
Stammes
Die Thioesterase Ch FatB2
Bei der Produktion/Akkumulation von Fettsäuren aus der de novo Biosynthese der
Organismen bestehen die beiden kritischen Punkte zum einen in der gezielten
Freisetzung der gewünschten Fettsäure mittels spezifischer Thioesterasen und der
Unterbindung der β-Oxidation als hauptsächlicher Abbauweg der Fettsäuren in der
Zelle. Da das Zielmolekül, 8-Hydroxyoctansäure, aus der terminalen Oxidation der
Octansäure produziert werden sollte, wurde das Enzym FatB2 aus der in Mexico
beheimateten Pflanze Cuphea hookeriana, ausgewählt. Hintergrund für diese
Entscheidung war die Studie von Dehesh et al.
[7]
aus dem Jahr 1996, in der die
Arbeitsgruppe die Identifikation des Enzyms beschrieb, welches sie für die
ungewöhnliche Fettsäurezusammensetzung in den Samen eben dieser Pflanze
verantwortlich zeichnete. Mit etwa 50 % Anteil an allen gemessenen Fettsäuren war
hier die Octansäure am stärksten vorherrschend, während Decansäure mit 25 % am
zweithäufigsten vertreten war[171].
Als
Wirtszelle
für
die
Expression
dieser
Thioesterase
sollte
eine
Deletionsmutante des Stammes E. coli BW25113 dienen. Dieser Stamm eignete sich
121
durch die Deletionen des Arabinose- und Rhamnose-Operons am besten im
Zusammenspiel mit den für diese Arbeit benötigten Plasmiden pJeM1 und pBAD18.
Durch die genomische Deletion des Gens fadD, welches für das Protein Acyl-CoA
Synthetase codiert und damit für den ersten Schritt der β-Oxidation verantwortlich ist,
sollte dieser katabolische Weg direkt zu Beginn gestoppt werden. Das Fettsäureprofil
dieser Deletionsmutante (siehe Abbildung 3-11) zeigte unter den getesteten
Kulturbedingungen zunächst keine signifikanten Unterschiede zum Profil des
Wildtyps. Vor dem Hintergrund, dass zu diesem Zeitpunkt noch keine Faktoren
vorlagen, die das Profil in irgendeiner Art und Weise beeinflussen (wie etwa eine
Thioesterase, die die Fettsäuresynthese dereguliert), erscheint dieses Ergebnis
schlüssig.
Wie zu erwarten war, nahm jedoch der Anteil an Octansäure durch die
heterologe Expression der beschriebenen Thioesterase FatB2 in diesem Stamm
signifikant zu. Durch einige Optimierungen und den Einsatz eines fed batch-1
Verfahrens konnte durch diese Expression Spitzenwerte von 335 mg L Octansäure
und 56 mg L-1 Decansäure erreicht werden.
Interessanterweise fand die Dehesh-Arbeitsgruppe bei in vitro Messungen eine
um 30% höhere Aktivität der Thioesterase FatB2 gegenüber Decanoyl-ACP als
gegenüber Octanoyl-ACP[7]. Um die Diskrepanz zwischen diesem Ergebnis und der
Fettsäurezusammensetzung in den Samen von C. hookeriana zu erklären, boten die
Autoren der Studie mehrere Hypothesen an: eine Möglichkeit wäre, dass innerhalb
der Samen eine große Menge an Thioesterase vorläge. Die zwar etwas niedrigere, aber
dennoch sehr hohe Affinität von FatB2 zur Octansäure führe dann dazu, dass bereits
soviel Octanoyl-ACP aus dem Synthesezyklus entfernt würde, sodass für die weitere
Synthese von Decanoyl-ACP nicht mehr genug Vorläufermoleküle zur Verfügung
ständen. Damit ein solcher Fall eintreten kann, muss also die Octanoyl-ACPHydrolyseaktivität die Synthesekapazität der Fettsäuresynthese beinahe ausgleichen.
So wäre gewährleistet, dass der Synthesezyklus nicht mehr genug Octanoyl-Bausteine
für die Decanoyl-Synthese nachliefern kann und der Kohlenstofffluss überwiegend in
die Produktion von Octansäure geht. Bezieht man nun jedoch die Fettsäureprofile der
Ansätze II und III aus dieser Arbeit mit ein, so ist festzustellen, dass in Ansatz II die
Synthesekapazität noch nicht erschöpft war, da diese im Schritt zu Ansatz III
nochmals um das 11-fache gesteigert werden konnte. Trotzdem zeigte Ansatz II
bereits ein eindeutiges Produktmaximum bei Octan- und nicht bei Decansäure.
122
Ein weiterer Lösungsvorschlag war die Annahme, dass in vivo weitere Enzyme
für die Fettsäurezusammensetzung der Samen zuständig sein könnten. So sollten
weitere unbekannte Thioesterasen oder Ketoacyl-Synthasen den Überschuss an
Octansäure bewirken. Dies lässt sich auch mit den Ergebnissen der vorliegenden
Arbeit nicht vollständig ausschließen, jedoch legen die Ergebnisse, in denen der
Octansäuregehalt regelmäßig den 3- bis 4-fachen Gehalt an Decansäure überschritt,
den Schluss nahe, dass kein weiteres Enzym notwendig wäre, um die in den CupheaSamen erreichte Fettsäurezusammensetzung herzustellen.
Unter Einbezug der hier präsentierten Ergebnisse sowie der Methodenwahl der
Dehesh-Studie könnte ein weiterer Lösungsvorschlag, um den Umstand der
veränderten Substrataffinität zu erklären, folgendermaßen lauten: Dehesh et al.
klonierten bei ihrer Studie ein um etwa 150 bp kürzeres Fragment von FatB2 ohne
Stopcodon in frame in das auf Plasmid pUC118 liegende Gen lacZα zur Expression ein.
Diese fehlenden 150 bp sowie das stattdessen angehängte Fragment des α-Fragments
der β-Galactosidase könnten einen entscheidenden Einfluss auf die Spezifität des
Enzyms haben. Auch kann nicht ausgeschlossen werden, dass die Nutzung einer
anderen Wirtszelle (im Falle der Dehesh-Studie E. coli DH5α) einen Einfluss auf die
Spezifität der Thioesterase haben könnte. Die Fragestellung kann letztendlich jedoch
nur durch in vitro Aktivitätstests mit dem aufgereinigten Enzym geklärt werden.
Betrachtung der Löslichkeit von Ch FatB2
Wie durch die Western blot-Analyse belegt, war der Anteil der löslich exprimierten
Thioesterase an ihrer Gesamtmenge mit 9 % sehr niedrig. Da es sich bei der hier
verwendeten Thioesterase um ein pflanzliches Protein handelt, könnte die geringe
Produktion löslichen Enzymes an einer fehlenden posttranslationalen Modifizierung
innerhalb von prokaryotischen Zellen – wie in dieser Studie Escherichia coli – liegen.
Eine
der
häufigsten
posttranslationalen
[172]
Phosphorylierung die Glykosylierung
Modifikationen
ist
neben
der
, die von Prokaryoten aber nicht angewandt
wird. Über das Glycosylation prediction tool GlycoEP[173] wurden 2 potentielle N- sowie
7 potentielle O-Glykosylierungsstellen in der Sequenz von FatB2 identifiziert, die aber
bisher in keiner Datenbank hinterlegt und bestätigt sind.
Da Glykosylierungen oft an der korrekten Faltung von Proteinen beteiligt
[174]
sind
, könnte dies in Zusammenhang mit den Ergebnissen durch GlycoEP auf eine
erhöhte Fehlfaltungs- und Aggregatbildungsrate der pflanzlichen Thioesterase
123
hinweisen, die sich dann in Form von Einschlusskörperchen ablagert[175]. Zur Bildung
von Einschlusskörperchen kommt es unter anderem, wenn die Rate der Expression
gegenüber der Faltungsgeschwindigkeit eines Proteins zu hoch ist. Während die
Primärstruktur des Proteins an den Ribosomen gebildet wird und sich mit wachsender
Länge der Peptidkette allmählich Sekundär- und Tertiärstruktur formen, werden
immer wieder hydrophobe Bereiche des Proteins - die im Endzustand normalerweise
zum größten Teil ins Proteininnere gerichtet sind - nach außen exponiert. Ist nun die
Expressionsgeschwindigkeit zu hoch, sprich, ist die Konzentration an gerade
wachsenden Peptidketten lokal in der Zelle sehr hoch, kommt es zu einer vermehrten
Interaktion
und
Zusammenlagerung
der
hydrophoben
Bereiche
zwischen
unterschiedlichen Peptidketten. Dies führt letztendlich zur Agglomeration der
kompletten
Proteine.
Glykosylierungen
oder
separate
Proteine,
sogenannte
Chaperone, können die korrekte Faltung des Proteins dahingehend unterstützen,
[175]
indem sie diese Interaktionen zwischen den einzelnen Peptidketten unterbinden
.
Um der Bildung von Einschlusskörperchen entgegenzuwirken, wurde in dieser
Arbeit versucht, die angesprochene etwaig zu hohe Expressionsgeschwindigkeit durch
das Absenken der Expressionstemperatur und der Induktorkonzentration zu
reduzieren. Diese Maßnahmen hatten zwar einen positiven Effekt auf die
Gesamtmenge an produzierter Thioesterase (siehe Abbildung 3-4 auf Seite 95 und
Abbildung 3-6 auf Seite 97) jedoch hatten sie keinen Einfluss auf die Aggregatbildung.
Letztlich konnte eine Verbesserung der Verteilung zwischen löslicher und als
Agglomerat gebildeter Thioesterase nur durch die N-terminale Fusion an Thioredoxin
erzielt werden. In der Literatur wird der löslichkeitssteigernde Effekt von Thioredoxin
[176]
seiner möglicherweise vorhandenen chaperonähnlichen Wirkung zugeschrieben
.
Durch die Fusion an das interessierende Protein kann Thioredoxin direkt während der
Proteinsynthese seine Chaperon-Wirkung entfalten.
Die Fusion mit Thioredoxin konnte die Aggregatbildung zum Teil verhindern
und damit die Löslichkeit des Enzyms verdreifachen. Mit insgesamt etwa 30 %
Löslichkeitsanteil besteht hier jedoch noch Potential, um den Ertrag aus dem hier
vorgeschlagenen Prozess der Octansäureproduktion in zukünftigen Experimenten
weiter zu verbessern. Neben der Fusion mit Thioredoxin sind weitere Fusionspartner
bekannt, die in der Biotechnologie Verwendung finden. Interessant wären in diesem
Zusammenhang Fusionen mit der IgG-Domäne B1 des Protein G aus Streptococcus
[177]
(GB1)
, mit dem Small Ubiquitin Modifier (SUMO)[178] oder mit hydrophilen
124
Solubility Enhancing Peptide Sequences (SEP)[179], da es sich hierbei um relativ kleine
Fusionspartner handelt (<100 Aminosäuren), bei denen eine geringere Gefahr besteht,
dass sie Einfluss auf Konformation und Aktivität von FatB2 nehmen.
Sollte die schlechte Löslichkeit der Thioesterase tatsächlich auf einer fehlenden
posttranslationalen Modifikation wie der Glykosylierung beruhen, wäre auch die
Möglichkeit, eine eukaryotische Wirtszelle zu verwenden sehr interessant. Die
Expression von FatB2 in einer Hefezelle wie Saccharomyces spec oder Pichia spec,
welche die notwendigen Modifikationen prinzipiell durchführen können, wäre eine
vielversprechende Alternative, auch wenn sich selbst hier die Art der Glykosylierung
von derer aus Pflanzenzellen unterscheiden würde. So kommt in Hefezellen bei der
[180]
Glykosylierung hauptsächlich der Zucker Mannose zum Einsatz
, während
[181]
pflanzliche Zellen neben Mannose auch Xylose, Fucose und Galactose einbauen
.
Jedoch können auch nicht völlig identische Zuckerketten die gleichen Aufgaben wie
etwa das Kaschieren eines hydrophoben Bereiches auf der Proteinoberfläche
übernehmen. Zudem könnten solche Zellen auch im Hinblick auf Teil 3 dieser Arbeit,
der Entwicklung eines Thioesterase-Assays, interessante Aspekte bieten, da es für
diese Organismen etablierte Möglichkeiten der Oberflächenpräsentation von Enzymen
gibt.
Im Hinblick auf die Glykosylierung dürften auch neuartige Bakterienstämme
interessant
sein,
verfügen[182,183].
So
die
bliebe
über
die
rekombinante
Modifizierbarkeit
Glykosylierungsmöglichkeiten
der
Fettsäuresynthese
bei
gleichzeitiger verbesserter Expression der Thioesterase erhalten.
Co-Expression der 3-Ketoacyl-ACP-Synthase mtKAS aus Arabidopsis thaliana
Die Entscheidung, eine zusätzliche Ketoacyl-ACP-Synthase zu exprimieren, entstand
aus der Überlegung heraus, dem Fettsäure-Synthesezyklus die Möglichkeit zu
minimieren längere Fettsäuremoleküle als C8 zu synthetisieren. Durch die
Überexpression der spezifischen Synthase sollte ein großer Überschuss an OctanoylACP generiert werden, der im Zusammenspiel mit der Aktivität von FatB2+ gegenüber
diesem Molekül die C8-Spezifität des Gesamtprozesse weiter erhöhen und somit die
Konzentration der Nebenprodukte Decan- und Dodecansäure minimieren sollte.
Gestützt wurde diese Idee durch eine Studie von Leonard et al.[184], in der die Gruppe
berichtete, dass die heterologen Überexpressionen einer Ketoacyl-ACP-Synthase
sowie einer Thioesterase aus Cuphea wrightii in Samen von Arabidopsis thaliana eine
125
doppelt so starke Verschiebung des Fettsäureprofils in Richtung mittelkettiger
Carbonsäuren bewirken wie die Überexpression der Thioesterase alleine.
Als Kandidat für die Co-Expression wurde die Oxoacyl-ACP-Synthase mtKAS
aus den Mitochondrien der Pflanze Arabidopsis thaliana ausgewählt. Grundlegende
Arbeiten zu diesem Enzym wurden hier vor allem von der Arbeitsgruppe um Penny
[118,119,120]
von Wettstein-Knowles geleistet
. Die Autoren der einzelnen Studien
beschreiben bei diesem Enzym ein bimodales Produktspektrum, dessen Höhepunkte
bei Octanoyl- und Hexadecanoyl-ACP liegt. Dieses Produktspektrum kommt dabei
sehr wahrscheinlich durch die Aminosäure Isoleucin an Position 154 zustande, deren
Kettenrest mittig an der Acylbindetasche des Enzyms positioniert ist und durch eine
Klappbewegung die Bindetasche für kürzere Substrate beschränken oder für längere
[120]
Acylreste erweitern kann
(siehe Abbildung 1-6).
Die Expression der mtKAS hatte jedoch nicht den erwarteten positiven Effekt
der Schärfung des Produktprofils hin zur Octansäure, sondern, im Gegenteil, sogar
negativen Einfluss auf die Octansäurekonzentration (Tabelle 3-4 auf Seite 102). Diese
verringerte sich in Folge der Co-Expression um fast 40 % gegenüber Ansatz III, in dem
nur die Thioesterase alleine exprimiert wurde, während das Verhältnis von
Hauptprodukt Octansäure zu Nebenprodukt Decansäure in beiden Stämmen mit etwa
jeweils 5 : 1 gleich blieb. Der erste Verdacht, dass diese Einbuße im Ertrag der
Octansäure durch die metabolische Last zustande kommt, die der Zelle mit dem
zweiten Plasmid (und damit auch einem zweiten Antibiotikum in der Kultur) auferlegt
wird, greift in diesem Fall zu kurz. Dies kann daraus geschlossen werden, dass im
weiteren Verlauf der Arbeit auch CYP*-CPR im Einzellsystem von diesem Plasmid
exprimiert wurde, jedoch hier eine solche Einbuße an Octansäure nicht zu bemerken
war und das Level an Octansäure mit den Ergebnissen des Ansatz III vergleichbar
blieb (siehe Einzellsystem in Schüttelkolben, Kapital 3.2.2).
Ein möglicher Hinweis zur Klärung dieses Umstands findet sich in der Arbeit
von Subrahmanyam et al.[185] Sie berichteten, dass sie bei der homologen
Überexpression der Ketoacyl-ACP-Synthase II (KAS II) in E. coli einen sehr toxischen
Effekt feststellten. Sie gaben an, dass in diesem Stamm der Gehalt von Malonyl-CoA
um das 80-fache über dem Normalniveau der Zelle lag und fast 40 % des gesamten
zellulären CoA-Gehalts ausmachte, ein Zustand der auf eine völlige Blockade der
Fettsäuresynthese hindeuten würde. Dieser Zustand konnte jedoch nicht durch die
Aktivität der überexprimierten KAS II erklärt werden, da dieses Enzym Malonyl-ACP,
126
nicht jedoch den CoA-Ester, als Substrat umsetzt. Das bestätigte auch der Versuch, in
dem die Aktivität des überexprimierten Proteins durch Cerulenin inhibiert wurde und
dies jedoch keinen Einfluss auf die bestehende Blockade der Synthese hatte. Die
Erhöhung des Malonyl-CoA deutete eher auf die Inhibierung eines weiteren Enzyms,
der Malonyl-CoA:ACP Transacylase, hin. Dieses Protein setzt Malonyl-CoA zu
Malonyl-ACP um und liefert damit erst den Ketoacyl-ACP-Synthasen ihr
entsprechendes Substrat
[186]
. Bestätigt wurde dies durch die parallele Überexpression
der Transacylase in einem KAS II überexprimierenden Stamm. Die Folge dessen war
eine Auflösung der Blockade des Fettsäuresynthese-Zykluses. Die Autoren schlugen
daraufhin die schlüssige Hypothese vor, dass es beim normalen Verlauf der Synthese
zu einer Interaktion der Ketoacyl-ACP-Synthasen mit der Transacylase kommt, die
ihnen dann Malonyl-ACP als Substrat zuliefert. Durch die Überexpression von KAS II
okkupiert jedoch dieses Enzym allein den Großteil der zur Verfügung stehenden
Transacylasen, die dann wiederum den anderen Ketoacyl-ACP-Synthasen I und III für
deren Funktion nicht mehr zur Verfügung stehen. Als Folge davon können essentielle
Fettsäuren, die nicht von KAS II alleine synthetisiert werden, vom Organismus nicht
mehr produziert werden. Zu dieser Hypothese wurde jedoch keine weiterführende
Literatur gefunden, die diese Interaktion von Synthase und Transacylase mit
Experimenten bestätigt, jedoch bietet sie sich trotzdem auch als mögliche Erklärung
für die Ergebnisse dieser Arbeit an.
Da keine Aussage über den Gehalt an Malonyl-CoA im Expressionstamm in
Ansatz V aus dieser Studie getroffen werden kann, könnte eine andere Begründung in
der Aktivität von mtKAS zu finden sein. Wenn diese übermäßig höher als die
Hydrolyse-Aktivität der Thioesterase ist, würde es zwangsläufig zu einer allmählichen
Anhäufung von Acyl-ACPs im Organismus kommen. Dies hätte dann sehr
wahrscheinlich eine feedback Inhibierung auf den Synthesezyklus - wie sie bereits in
Kapitel 1.4.2 beschrieben wurde – zur Folge. Diese Inhibierung könnte zwar durch die
Thioesterase nach und nach immer wieder abgebaut werden, jedoch würde sich die
Gesamtausbeute in einem bestimmten Zeitintervall aufgrund der stetig stockenden
Synthese verringern. Um ein Zutreffen dieser Hypothese zu überprüfen, müssten
jedoch weitere Experimente durchgeführt werden. Diese könnten entweder der
+
Verifizierung (z.B. Co-Expressionen von mtKAS und FatB2
mit sukzessiv
verringerten Anteilen an mtKAS und Beobachtung des Octansäuregehalts) oder der
Widerlegung (z. B. Messung des Malonyl-ACP-Gehalts) der Hypothese dienen.
127
Integration von FatB2+ ins Wirtsgenom
Der Hintergrund zur Entscheidung die Thioesterase FatB2+ in das Genom der
Wirtszelle zu integrieren, bestand in der Überlegung die Octansäureproduktion zu
steigern, indem der Zelle zusätzlicher metabolischer Stress durch die Replikation eines
relativ großen multi-copy Plasmids (und dadurch bedingt, die Verwendung von
Antibiotika) erspart bleibt. Weiterhin ist mit dem Verzicht auf ein Plasmid eine
gesteigerte Stabilität der Genexpression gewährleistet, da Faktoren wie die
strukturelle Plasmidstabilität (Fehleranfälligkeit der Plasmidreplikation) sowie die
segregative
Plasmidstabilität
(Fehleranfälligkeit
der
Plasmidverteilung
auf
Tochterzellen) nicht mehr ins Gewicht fallen[187]. Dieser Ansatz führte jedoch nicht
zum gewünschten Erfolg. Der Grund hierfür liegt vermutlich in der direkten
Korrelation zwischen der zur Verfügung stehenden Thioesterasemenge und der
Produktmenge. Die Thioesterase wird in Ansatz IV nur noch von einer Genkopie
exprimiert, was sich vermindernd auf die Gesamtzahl an FatB2+-Enzymen in der Zelle
auswirkt. Der Vorteil der stressfreieren Kulturführung kann hier offensichtlich den
Nachteil der verringerte FatB2+-Konzentration in der Zelle nicht ausgleichen.
Interessanterweise schafft es Ansatz IV trotz dieser nur einfach vorhandenen
Genkopie auf 56 % des Octansäuregehalts von Ansatz III. Dies spricht augenscheinlich
für eine Bestätigung der Ergebnisse der Studie von Lennen et al., in der sie dem bisher
sehr schlecht charakterisierten Replikationsursprung pBBR1 eine Kopienzahl von 2 - 5
[62]
zuschreiben
. In diesem Fall ließe sich eine direkte lineare Korrelation zwischen
Thioesterase- und Produktmenge herstellen. Dahingehend wären zukünftige
Experimente interessant, ob ein oder zwei weitere Kopien von fatB2 oder dieses Gen
unter einem stärkeren Promotor im Genom der Wirtszelle ausreichen würden, um die
Werte von Ansatz III zu erreichen oder gar zu übertreffen.
Betrachtung zum Expressionssystem und Beurteilung des Gesamtprozesses zur
Octansäureproduktion
Obwohl es sich bei dieser Arbeit um eine Machbarkeitsstudie handelt, die in erster
Linie die Hydroxyoctansäureproduktion mit E. coli-Bakterien experimentell belegen
sollte, konnten bereits Octansäure-Titer von etwas über 0,3 g L-1 in einem fed batchVerfahren erreicht werden. Dieses Ergebnis reiht sich damit in die Ergebnisse einer
Anzahl von Studien ein, in denen bereits ähnliche Verfahren zur Produktion von
128
freien Fettsäuren in Escherichia coli beschrieben wurden[30,62,65,71,163,188,189,190,191,192]. Je
nach eingesetzter Thioesterase, E. coli-Stamm und Kulturführung wurden hier
Fettsäurekonzentrationen zwischen überwiegend 0,16[65] und 1,1 g L-1[29], aber auch
bis zu 4,8 g L
-1[192]
erreicht. Diese Studien können aber nur bedingt zum Vergleich
dieser Arbeit herangezogen werden, da sie ausnahmslos alle nicht die Ausbeute einer
einzelnen bestimmten Fettsäure angeben, sondern meist ein Gemisch mehrerer
langkettiger Carbonsäuren. So erreichten Jeon et al. in ihrer Studie eine
Fettsäurekonzentration von 0,16 g L-1. Diese setzte sich dabei aus der Summe der
Konzentrationen der Hexadecan- (etwa 0,12 g L-1) und der Octadecansäure (0,04 g L-1)
zusammen. Liu et al. erreichten mit einer fed batch-Prozessführung in einem Zeitraum
von 38 h einen Fettsäure-Titer von etwa 4,8 g L-1. Hierbei wurde jedoch die
Gesamtheit aller geradkettigen Fettsäuren zwischen Dodecan- und Octadecansäure
(C12 bis C18) sowie entsprechend einfach ungesättigter Derivate (C12:1 bis C18:1)
angegeben. Dabei entfiel gut ein Drittel der gemessenen Fettsäuren auf die
Hexadecansäure, etwa 18 % auf cis- oder trans-9-Tetradecaensäure und 12 % auf die
Tetradecansäure. Beinahe ausnahmslos beziehen sich auch alle voran erwähnten
Studien auf langkettige, nicht toxische Fettsäuren. Einzig die Studie von Lennen et
al.[190] bezieht auch die toxischeren, mittelkettige Fettsäuren ab Octansäure mit ein
und die Autoren geben hier einen erreichten Fettsäure-Titer von 0,77 g L-1 an. Jedoch
werden auch hier wie in vielen anderen Studien die Konzentrationen einzelner
Fettsäuren nicht explizit aufgeschlüsselt und die Hauptanteile an der erreichten
Endkonzentration
den
langkettigen,
hier
allen
voran
der
Hexadecansäure,
zugeschlagen. In einer weiteren Studie berichten Lennen et al. von der Konstruktion
eines E. coli-Stammes, mit dem es möglich war, nach 23 h eine Konzentration von
-1
etwa 450 mg L Dodecansäure im Medium zu erreichen. Auch hierbei handelt es sich
wieder um eine nicht toxische Fettsäure, jedoch scheint diese Studie aufgrund der
Kettenlänge des Produkts am geeignetsten zu sein, um einen Vergleich mit der
vorliegenden Arbeit zu ziehen.
Die in dieser Arbeit im fed batch-Prozess erreichten 330 mg L-1 Octansäure
(Ansatz VI) sind, bezogen auf die molare Konzentration, auf den ersten Blick mit den
450 mg L-1 Dodecansäure aus der Lennen-Studie vergleichbar (C8: 2,3 mM vs. C12:
2,25 mM). Jedoch nutzte die Arbeitsgruppe um Lennen für ihre Versuche einen batchAnsatz, der in seinen Möglichkeiten zur Kontrolle einzelner Parameter natürlich
limitiert ist. Eine dauerhafte Kontrolle und Einstellung des pHs, beispielsweise, war in
129
diesem System nicht möglich und offensichtlich auch nicht nötig. Zieht man den
entsprechenden batch-Ansatz (Ansatz III, erreichte Endkonzentration ~0,5 mM) aus
der vorliegenden Arbeit zum Vergleich heran, wird ein Unterschied von fast 75 %
sichtbar. Dieser Unterschied liegt sehr wahrscheinlich im Toxizitätsgrad der einzelnen
Produkte begründet. Marounek und Rada berichteten 2003 von der antibakteriellen
Wirkung von Octan- und Decansäure und schlossen hierbei explizit eine solche
[193]
Wirkung bei kürzeren (C2 - C6) und längeren (C12 - C18) Fettsäuren aus . Desbois
und Smith trugen in ihrer Veröffentlichung jedoch auch Beispiele für die
inhibitorische Wirkung der Kettenlänge C12 - C20 zusammen[194]. Unstrittig ist in
beiden Fällen, dass eine Überproduktion von freien Fettsäuren für die produzierende
Zelle schädlich ist. Experimente von Lennen et al. mit dem Nukleinsäure-Farbstoff
SYTOX belegen, dass die übermäßige Produktion von Fettsäuren zu Poren in der
inneren Membran führt und es zum Verlust intrazellulärer Metabolite kommt[190].
Obwohl der genaue Mechanismus wie der inihibtorische Effekt von Fettsäuren
zustande kommt noch nicht genau bekannt ist, nimmt man an, dass es durch die frei
diffundierbare Octansäure, die nun als Protonentransporter agiert, zu einer teilweisen
Entkopplung der oxidativen Phosphorylierung und damit zu einem eingeschränkten
ATP-Titer innerhalb der Zelle kommt. Aufgrund von in der inneren Membran
entstehende Poren wird der Protonengradienten durch frei einströmende Protonen
zerstört, daraus resultieren der Zusammenbruch des Membranpotentials sowie die
Ansäuerung des Cytosols[64,195]. Des weiteren beobachtete die Arbeitsgruppe von
[190]
Lennen einen Anstieg des Anteils an ungesättigten Fettsäuren in den Membranen
.
Dies wurde jedoch nicht als Folge einer Anpassung der Zelle an äußere Umstände
interpretiert, sondern als Unfähigkeit des Organismus, den Überschuss an
ungesättigten Acyl-ACPs, der durch die Präferenz der überexprimierten Thioesterase
für gesättigte Acyl-ACPs zustande kommt, abzubauen.
Um nun die Ausbeute an Octansäure trotz der voran erwähnten Hindernisse
weiter zu erhöhen, würde es sich zunächst anbieten, die Diffusion der Fettsäure durch
die Membranen zu verhindern oder zumindest weitestgehend einzuschränken. Dazu
würde sich eine Prozessführung in Form einer Flüssig-Flüssig-Extraktion anbieten.
Hierbei könnte in einem biphasischen System, die von den Zellen ins Medium
abgegebene Octansäure direkt in eine zweite Phase aufgenommen und somit aus der
wässrigen Phase entfernt werden. Eine Schädigung der Zellen durch im Medium
gelöste Octansäure wäre somit größtenteils ausgeschlossen. Um die Fettsäure
130
weitestgehend auch von der Diffusion innerhalb der Zelle nach außen abzuhalten,
wäre ein Exporterprotein notwendig, das die Fettsäuren über die Membranen
transportiert. Jedoch wurde bis dato noch kein solches Protein in Escherichia coli
beschrieben. Es sind lediglich Systeme bekannt, die wie fadL, vor allem langkettige
Fettsäuren in die Gegenrichtung, also zelleinwärts, transportieren. Analoge Proteine
in S. cerevisiae wie der ABC-Transporter Pdr12 belegen allerdings die Existenz solcher
[196]
Proteine
und legen die Vermutung nahe, dass solche Proteine auch in Bakterien
existieren und für diesen Lösungsansatz genutzt werden könnten. Auf diese Weise
könnten die Zerstörung des Protonengradienten über die innere Membran und die
damit zusammenhängenden Probleme wie die entkoppelte Phosphorylierung und die
Ansäuerung des Cytosols zumindest vermindert werden.
Eine weitere Möglichkeit den toxischen Effekt der freien Fettsäuren
einzuschränken,
wäre
die
gleichzeitige
Expression
einer
entsprechenden
Methyltransferase im Produktionsstamm. Auf diese Weise würde die entstehende
Octansäure direkt verestert werden, was wiederum ihren unkontrollierten Transport
von Protonen über die Zellmembran verhindern dürfte. Natürlich bedarf es dann einer
späteren Aufarbeitung des Methylesters um das Produkt „Fettsäure“ zu erhalten[197].
Um den Überschuss an ungesättigten Fettsäuren in den Membranen zu
korrigieren, wäre der Einsatz einer Thioesterase mit Aktivität gegen ungesättigte
Acyl-ACPs sinnvoll, um das entstehende Ungleichgewicht zwischen gesättigten und
ungesättigten Acyl-ACPs abzubauen. Idealerweise würde es sich dabei um ein Enzym
handeln, dass sowohl die Aktivität gegen die gewünschte Fettsäure als auch gegen
ungesättigte Derivate besitzt, jedoch wäre auch die Expression zweier Thioesterasen,
auf die diese Eigenschaften aufgeteilt sind, denkbar.
Die Expression der Acetyl-CoA Carboxylase (accABCD) wäre noch ein weiterer
Ansatzpunkt um die Ausbeute an Octansäure weiter anzuschieben. Dieses Enzym ist
für die chemische Addition von CO2 an Acetyl-CoA verantwortlich und liefert mit
Malonyl-CoA als Endprodukt den Grundbaustein für die Fettsäurebiosynthese. In
einigen Publikationen wurde beschrieben, dass mit dieser Strategie der Ertrag der
Zielfettsäure erfolgreich um das 2,5- bis 6-fache gesteigert werden konnte[163,198],
andere Veröffentlichungen beschreiben, dass sie mit dieser Methode keinen Erfolg
hatten[62]. Hier sind vermutlich die gewünschte Fettsäure sowie der genomische
Hintergrund des Produktionwirts ausschlaggebende Faktoren, die über Erfolg oder
131
Misserfolg entscheiden und deswegen sollte in künftigen Experimenten mit diesem
Stamm diese Option auf jeden Fall getestet werden.
Im direkten Vergleich mit den voraus beschriebenen Studien reiht sich das in
dieser Arbeit bis zu diesem Punkt etablierte Zellsystem zur Produktion von
Octansäure im Mittelfeld bezüglich der Ausbeuten ein. Es gibt jedoch noch, wie bereits
erörtert, einige Parameter und Stellschrauben am System, mit denen die Ausbeute
weiter verbessert werden könnte.
Im August 2011 veröffentlichten Dellomonaco et al. einen neuen Ansatz, um
[71]
die biotechnologische Produktion von Fettsäuren zu bewältigen
. Sie beschäftigten
sich darin mit der Umkehr der β-Oxidation in E. coli. Durch die in Kapitel 1.3.1.3
(Produktion durch Umkehrung der β-Oxidation auf Seite 32) beschriebenen
genomischen Modifikationen eines E. coli-Stammes konnten sie die Produktion von
langkettigen Fettsäuren in hohem Maßstab erreichen. So konnten sie über einen
Zeitraum von 60 h in Minimalmedium im batch-Verfahren langkettige Fettsäuren
(hauptsächlich Palmitin- und Stearinsäure) mit einem Titer von ~ 7 g L-1 anreichern.
Dies kann sich bereits mit den voran beschriebenen Ergebnissen von Liu et al.[192]
messen, die bis dato die höchsten erreichten Werte in E. coli darstellen. Dellomonaco
und ihre Kollegen führen diese hervorstechenden Ergebnisse auf ein effektiveres
Verhalten ihres Systems zurück: während bei der Fettsäuresynthese erst 2 AcetylCoA-Bausteine sowie ein ATP-Molekül und ACP-Protein aufgewendet werden
müssen um den Grundbaustein Malonyl-ACP zu erzeugen, kann bei ihrem Ansatz
direkt vom Grundbaustein Acetyl-CoA ausgegangen und die Fettsäure durch
Anhängen neuer Acetyl-CoAs rückproduziert werden.
2014 wurde dieser Ansatz von Lian und Zhao auch in die Hefe S. cerevisiae
übertragen. Mit diesem Stamm wurde als konzeptioneller Beweis versucht,
mittelkettige Fettsäuren zu produzieren. Hierbei wurde hauptsächlich Octansäure
-1
hergestellt, jedoch nur bis zu einem Titer von etwa 8 mg L . Dieses Ergebnis fällt weit
hinter den in dieser Arbeit erreichten Werten mit über 300 mg L-1 zurück. Jedoch darf
dabei nicht außer Acht gelassen werden, dass Saccharomyces für die Produktion von
Octansäure denkbar ungeeignet ist, da dieser Organismus eine äußerst geringe
Toleranz gegenüber Octansäure aufweist[199].
Der von Dellomonaco gelieferte Ansatz in Escherichia coli hingegen würde
nach einer Anpassung zur Produktion von Octansäure sicherlich interessante
Vergleichsdaten liefern. Sollten sich diese Ergebnisse besser als die hier präsentierten
132
Werte erweisen, sollte grundsätzlich über einen Wechsel des Moduls Produktion von
Octansäure durch die Fettsäurebiosynthese zum Modul Produktion von Octansäure durch
umgekehrte β-Oxidation im Gesamtprozess Produktion von 8-Hydroxyoctansäure
nachgedacht werden.
4.2 Herstellung von 8-Hydroxyoctansäure
Wachstumsexperimente auf den potentiellen Produkten Octan-, 8-Hydroxyoctan- und
Suberinsäure
Um zu klären, ob der eingesetzten Wirtsorganismus dazu in der Lage ist, trotz fadDDeletion
die
Fettsäure
sowie
ihre
Derivate
zu
verstoffwechseln,
wurden
Wachstumsexperimente in Minimalmedium mit dem jeweiligen Produkt als einziger
C-Quelle durchgeführt. Getestet wurden jeweils der Wildtyp-Stamm BW25113, seine
+
fadD-Deletionsmutante, diese Mutante während der Expression des FatB2 -Konstrukts
und die Mutante während der Expression des CYP*-CPR-Konstrukts.
Bei allen getesteten Stamm-Substrat-Kombinationen konnte kein signifikantes
Wachstum festgestellt werden, welches über das Wachstum der Negativkontrolle
hinausging. Auch blieben alle Kombinationen im Wachstum spätestens beim letzten
Messpunkt deutlich hinter der Positivkontrolle zurück. Die leicht unterschiedlichen
Verläufe der Wachstumskurven der Positivkontrollen lassen sich vermutlich durch das
Messsystem erklären: die optischen Dichten wurden in Mikrotiterplatten bestimmt,
daher müssen durch das Lambert-Beer’sche Gesetz bedingt, die Messwerte mit einem
Korrekturfaktor von 3,21 beaufschlagt werden, um die korrekten Werte für die
Zelldichten zu erhalten. Messfehler wirken sich dementsprechend ebenfalls aus, was
wiederum zu den unterschiedlichen Kurven führen dürfte.
Die Ergebnisse legen insgesamt den Schluss nahe, dass keiner der Stämme dazu
in der Lage war, die erzeugten Produkte zum Aufbau eigener Biomasse zu
verstoffwechseln. Auch vor dem Hintergrund des Vorliegens von wesentlich leichter
verwertbarer Kohlenstoffquellen im TB-Medium, wie etwa Glycerol, scheint eine
solche Metabolisierung der Produkte sehr unwahrscheinlich.
Etablierung eines 8-Hydroxyoctansäure-produzierenden Zellsystems
Um die de novo produzierte Fettsäure Octansäure in vivo zur gewünschten terminal
+
hydroxylierten 8-Hydroxyoctansäure weiterzuverarbeiten, sollte neben dem FatB2 -
Konstrukt die Expression einer spezifischen Monooxygenase gewährleistet werden. In
133
der vorliegenden Arbeit wurde dazu die G307A-Mutante von CYP153AM.aq.-CPRBM3
verwendet[9], bei welcher eine erhöhte Aktivität gegenüber Octansäure gezeigt wurde.
Für die Umsetzung einer solchen Enzymkaskadenreaktion bestand prinzipiell die
Möglichkeit ein solches System auf zwei (Abbildung 2-1 und Abbildung 2-2) oder
einer Zelle (Abbildung 2-3 und Abbildung 2-4) basierend zu etablieren. Innerhalb des
jeweiligen System bestand weiterhin die Möglichkeit, die Produktionen von Octanund 8-Hydroxyoctansäure parallel (Abbildung 2-1 und Abbildung 2-3) oder
nacheinander (Abbildung 2-2 und Abbildung 2-4) zu starten. Zunächst wurde das
Zweizell-System untersucht: Dabei zeigte sich, dass die parallelen Produktionsstarts in
sowohl Schüttelkolben als auch Bioreaktoren beide nicht zum gewünschten Ergebnis
der Produktion von 8-Hydroxyoctansäure führten. Dieser Umstand kann durch zwei
Hypothesen erklärt werden. Beide Hypothesen stützen sich dabei auf die Annahme,
dass bei der fehlenden Produktbildung das Problem in einer mangelnden Funktion der
Monooxygenase liegt. In der ersten Hypothese wäre es möglich, dass kein oder
Substrat in nur ungenügender Menge vorhanden ist. Es ist zwar gewährleistet, dass
das Enzym vom eingesetzten Plasmid funktional exprimiert werden kann, jedoch kann
keine Aussage darüber getroffen werden, ob das Enzym in der Mischkultur auch
tatsächlich zum Einsatz kommt. Da auf beide Plasmide in den jeweiligen Zellen mit
dem gleichen Antibiotikum selektioniert wird, kann nicht ausgeschlossen werden,
dass beispielsweise der Monooxygenase-produzierende Stamm seinen Gegenpart in
der Mischkultur überwächst und verdrängt. Somit wäre der octansäure-zulieferende
Teil der Kultur ausgeschaltet und der Monooxygenase würde kein Substrat zur
Verfügung stehen. Dies würde auch die stark verringerte Octansäurekonzentration in
den Kulturen erklären, die nach 20 h nur etwa 10 - 20 % des erwarteten Werts betrug.
Der zweiten Erklärungsversuch stützt sich auf die geringe katalytische
-1
[143]
Effizienz der Monooxygenase (0,527 min mM gegen Octansäure ). Weil zu Beginn
des Prozesses nur sehr geringe Mengen an Octansäure den Monooxygenasen zur
Verfügung stehen, da die Säure erst aus einer anderen Zelle in die Monooxygenaseenthaltende Zelle diffundieren muss, reicht die geringe Affinität des CYP*-CPREnzyms nicht aus, um diese wenigen Moleküle umzusetzen. Da es sich bei
Monooxygenasen um Enzyme handelt, die eine relativ kurze Halbwertszeit
aufweisen[200], sind jedoch zu einem späteren Zeitpunkt, wenn die Konzentration an
Octansäure in allen Zellen deutlich zugenommen hat, die Monooxygenasen eventuell
bereits
wieder
inaktiv
und
es
findet
134
ebenfalls
keine
Umsetzung
zur
Hydroxyoctansäure mehr statt. Versuche, in denen den Mischkulturen Octansäure in
höherer Konzentration zugefüttert wird und nach 20 h der Hydroxyoctansäuregehalt
bestimmt wird, könnten Aufschluss über die möglichen Ursachen liefern.
Im Gegensatz zur parallelen Prozessführung konnte bei der der sequentiellen
Prozessführung die Produktion von 198,7 µM 8-Hydroxyoctansäure beobachtet
werden. Dabei stellte sich der pH-Wert als entscheidendes Kriterium für das Gelingen
der Umsetzung heraus. Su et al. wiesen in ihrer Veröffentlichung von 2012 bereits auf
[168]
die starke Abhängigkeit von Monooxygenasen gegenüber dem pH hin
. So zeigten
sie unter anderem, dass ein Absinken des pHs um 0,3 bereits eine Halbierung der
Bindungsrate zwischen Enzym und Substrat zur Folge hat. Erste Versuche, in denen
im octansäurehaltigen Überstand der FatB2+-Zellen die Monooxygenase-Zellen
resuspendiert wurden, führten daher auch zu keinen Erfolg, da der pH durch die
Octansäureproduktion oft um mehr als 2,0 gefallen war, was die Inaktivität der
Monooxygenase erklären würde. Dies wird zusätzlich durch die Tatsache gestützt,
dass durch das Anheben des pHs zurück auf 7,5 die Umsetzung der Octansäure zu
ihrer ω-hydroxylierten Form erfolgreich durchgeführt werden konnte.
Da das entwickelte sequentielle Zweizellsystem in der Handhabung relativ
kompliziert, zeitaufwendig und dadurch impraktikabel ist, wurde auch hier ein
Einzellsystem getestet. Dazu wurde das Monooxygenase-Fusionsprotein auf ein zu
pKiM2 kompatibles Plasmid umkloniert und anschließend zusätzlich zu pKiM2 in die
Wirtszelle eingebracht. In einem solchen Einzellsystem führten nun sowohl die
sequentielle als auch die parallele Prozessführung zum Erfolg. Da in diesem Fall durch
zwei Antibiotika gewährleistet werden konnte, dass beide Plasmide und damit auch
FatB2+- und CYP*-CPR-Konstrukt in der Zelle vorhanden waren, konnte auch in der
zuvor gescheiterten parallelen Prozessführung 8-Hydroxyoctansäure produziert
werden, während die Konzentration an produzierter Octansäure sich in Bereichen
bewegte, die durchaus auch ohne die zusätzliche Expression eines zweiten Enzyms
erreicht worden wären. Ausschlaggebend für das Gelingen dieser Ansätze dürfte
zudem sicherlich die lokal relativ hohe Konzentration an Octansäure innerhalb der
Zellen sein, die durch die nun anwesende Monooxygenase trotz niedriger Affinität
direkt umgesetzt werden kann. Während im Schüttelkolben-Maßstab sowohl parallele
als auch sequentielle Prozessführung mit etwa 30 µM 8-Hydroxyoctansäure relativ
gleich abschnitten, zeigte sich im Bioreaktor die parallele Prozessführung überlegen.
Hier wurden knapp 40 % mehr 8-Hydroxyoctansäure produziert als in der
135
sequentiellen Prozessführung was zu einer maximalen Konzentration von 233,5 µM
Hydroxyoctansäure nach 24 h führte. Zu erklären ist dieser Umstand vermutlich
damit, dass direkt mit Beginn der Octansäureproduktion diese auch von der ebenfalls
anwesenden Monooxygenase umgesetzt werden kann, während im sequentiellen
System die Octansäure in den ersten 6 h die Zelle zuerst verlässt und später wieder
hinein diffundieren muss um von der Monooxygenase umgesetzt zu werden. Wie im
vorherigen Kapitel bereits dargelegt, ist der Vorgang der Fettsäurediffusion über die
Membran jedoch für die Zellen schädlich und mindert gegebenenfalls somit deren
Produktionsleistung.
Bewertung der Produktionsleistung
Die höchste Konzentration an 8-Hydroxyoctansäure, die in dieser Arbeit erreicht
werden konnte, betrug 233,5 µM in 20 h im Einzellsystem mit simultaner Induktion
-1
des Thioesterase- und des Monooxygenase-Konstrukts. Dies entspricht etwa 40 mg L
an hydroxylierter C8-Fettsäure. Vergleicht man diesen Wert mit den Ergebnissen
anderer Arbeitsgruppen, die ebenfalls das Ziel hatten, ω-Hydroxyfettsäuren zu
produzieren, erscheint dies zunächst wenig. Die koreanische Gruppe um J. H. Bae
erreichten mit ihrem konstruierten E. coli-Stamm in 36 h eine Umsetzung von 2,5 g
Hexadecansäure zu 2,2 g 16-Hydroxyhexadecansäure[201]. In der Arbeit von Scheps et
al., die das Monooxygenase-Konstrukt CYP153AM.aq.-CPRBM3 in einem E. coli-Stamm
benutzte,
wurden
Endkonzentrationen
von
4 g L-1
12-Hydroxydodecansäure
[8]
erreicht , was den Faktor 100 zu den in der vorliegenden Arbeit erreichten Werten
ausmacht. Gatter et al. erreichten mit einem gentechnisch verändertem Yarrowia
lipolytica-Stamm
in
3
[202]
Hydroxydodecansäure
Tagen
sogar
eine
Konzentration
von
9 g L-1
12-
. Jedoch darf bei diesen Vergleichen nicht außer Acht
gelassen werden, dass in diesen Studien tatsächlich nur reine Umsetzungen eines
zugefütterten Substrats in das Endprodukt in genetisch optimierten Stämmen
vermessen wurden, während in der vorliegenden Arbeit das erste Mal die
biotechnologische de novo Synthese von 8-Hydroxyoctansäure beschrieben wird. Des
weiteren wurde in dieser Arbeit mit einer Monooxygenase gearbeitet, deren
Optimallänge des Substrates nicht bei Octansäure, sondern bei längerkettigen
Molekülen wie Dodecan- oder Tetradecansäure liegt: Honda Malca et al. errechneten
in ihrer Publikation zur G307A-Mutante von CYP153AM.aq für das Enzym eine
katalytische Effizienz von 0,527 min mM-1 gegen das Substrat Octansäure[143]. Dies ist
136
eine um den Faktor 400 schlechtere Effizienz als beispielsweise gegen das Substrat
Tetradecansäure mit 214 min mM-1. Zusätzlich kommt auch hier wieder der Umstand
zum Tragen, dass die Zellen in dieser Studie mit einem wesentlich toxischeren
-1 [193]
arbeiten mussten als in den oben erwähnten Studien mit
Substrat (IC50 = 0,3 g L )
Do-, Tetra- oder Hexadecansäure (jeweils IC50 > 5 g L-1)[193].
Da es sich bei dieser Arbeit um eine Machbarkeitsstudie handelt, lag der
primäre Fokus nicht auf der Optimierung der Endausbeute des hydroxylierten
Produkts.
Nichtsdestotrotz
lassen
sich
aus
diesen
Versuchen
einige
Optimierungsvorschläge zur Erhöhung der Ausbeute an 8-Hydroxyoctansäure
ableiten: die ersten Optimierungen sollten der Monooxygenase gelten. Wie bereits
beschrieben, weist diese eine sehr geringe katalytische Effizienz auf. Das erste Ziel
sollte
hier
sicherlich
das
Auffinden
einer
Monooxygenase
sein,
deren
Susbtratspektrum eher im Bereich der Octansäure angesiedelt ist. Des Weiteren
beschreiben
Scheps
et
al.
eine
sehr
hohe
Produktion
von
Acetat
und
[8]
Wasserstoffperoxid beim Einsatz des CYP*-CPR-Konstruktes . So wurden im Verlauf
ihrer Experimente Acetat-Konzentrationen erreicht, die intrazelluläre Proteine
destabilisieren könnten[203], während die Wasserstoffperoxid-Konzentration ein
Vielfaches dessen überschritt, was E. coli-Zellen metabolisch bewältigen können[204].
Hervorgerufen wird dieser Umstand durch eine schlechte coupling efficiency der
Monooxygenase[8]. Daher sollte entweder eine Monooxygenase gefunden und
eingesetzt werden, deren natürliches Substrat die Octansäure ist und deren coupling
efficiency der bisher eingesetzten Monooxygenase überlegen ist oder über gezieltes
protein engineering die coupling efficiency des hier verwendeten Konstruktes
verbessert werden.
Prinzipiell zeigten die Experimente im Einzellsystem bessere Ergebnisse als die
des Zweizellsystems. Begründet werden kann dies sicherlich mit der unmittelbaren
räumlichen Nähe zwischen Thioesterase und Monooxygenase im Einzellsystem.
Interessant wäre hier aber sicherlich trotzdem noch der Vergleich zwischen einem
optimierten Einzellsystem und einem optimiertem Zweizellsystem, bei dem
beispielsweise eine Zelle die Thioesterase und einen Exporter für Octansäure
überexprimiert, während die zweite Zelle einen Importer für Octansäure und die
Monooxygenase produziert. Hier muss dann experimentell ermittelt werden, ob der
Vorteil der räumlichen Nähe der beiden Enzyme oder der Vorteil von Transportern,
die die Zellviabilität erhöhen, überwiegt.
137
Um weitere Optimierungen an den Zellen vorzunehmen, wären zunächst
zusätzliche Analysen der metabolischen Flüsse notwendig, um weitere limitierende
Faktoren zu identifizieren. Sind diese gefunden, können durch weitere genetische
Manipulationen (wie beispielsweise die Überexpression eines limitierenden Enzyms)
diese Hindernisse umgangen werden. Auch das Ausschalten konkurrierenden
Stoffwechselwege, die ATP, NAD(P)H oder Acetyl-CoA verbrauchen, könnte auf diese
Weise die Erträge an Fettsäuren steigern. Eine zusätzliche Möglichkeit könnte auch
das Abschalten der normalen Fettsäuresynthese durch induzierbare knockouts sowie
das Versehen der Wirtsthioesterasen mit spezifischen Protease-Erkennungssequenzen
sein, um deren Halbwertszeit im Organismus zu verkürzen. In diesem Fall könnte mit
solchen Zellen zu Beginn der Produktion unter gewohnten Kulturbedingungen
zunächst ausreichend Biomasse aufgebaut werden. Durch Zugabe eines oder mehrerer
Induktoren werden die Zellen dann in einen „Produktionsmodus“ versetzt, in dem der
Kohlenstofffluss nur noch in den Aufbau der gewünschten Fettsäure geht und nicht
mehr in den Aufbau von Biomasse oder unerwünschten Fettsäuren und anderen
Nebenprodukten.
Ob sich jedoch, trotz all dieser vorgeschlagenen Optimierungen, das de novoPrinzip gegen die einfache Umsetzung von zugefütterten Substraten durchsetzen
kann, hängt letztendlich von wirtschaftlichen Faktoren ab, genauer von den Kosten
für die zugefütterten Fettsäuren. Da diese in der Regel jedoch relativ niedrig sind, wird
der größte Teil der ω-hydroxylierten Fettsäuren sicherlich durch Umsetzungen
produziert werden. Trotzdem könnte das de novo-Prinzip eine ergänzende Funktion in
dieser Produktion einnehmen, indem beispielsweise der „Abfallstoff“ Glycerol aus der
Fettspaltung dann ebenfalls in hydroxylierte, maßgeschneiderte Fettsäuren umgebaut
werden kann.
4.3 Entwicklung eines Thioesterase-HTS-Assays
Screening auf Agarplatten
Um die de novo Biosynthese von ω-Hydroxyfettsäuren auch für andere Kettenlängen
wie zum Beispiel 6-Hydroxyhexansäure oder 10-Hydroxydecansäure durch die
zufallsgerichtete Mutagenese der Thioesterase zu ermöglichen, sollten in der
vorliegenden Arbeit die Grundlagen für einen benötigten HTS-Assay gelegt werden.
Die anfänglichen Ergebnisse zu den Versuchen einen Festphasenassay zu entwickeln,
138
belegen jedoch die generellen Schwierigkeiten dieses Unterfangens: durch die in
Kapitel 3.1.3 angesprochene geringe Löslichkeit der Thioesterase, steht nur wenig
Enzym dem Assay zur Verfügung. Bedingt durch die Expression von einem Plasmid
mit geringer Kopienzahl liegt bereits zu Beginn wenig des zu untersuchenden Proteins
in der Zelle vor. Die Menge des für den Assay nutzbaren Proteinanteils verringert sich
dann durch die schlechte Löslichkeit um weitere 70 %. In Kombination mit einem
nicht natürlichen Assaysubstrat, für welches das Enzym nur eine geringe Affinität
und/oder Aktivität besitzt (wie beispielsweise die 4-Nitrophenylester) und welches
zudem auch von anderen Enzymen der Wirtszelle, wie Esterasen und Lipasen, die die
Hintergrund-Aktivität erhöhen, umgesetzt werden kann, kommt es schließlich zu
einer von der Negativkontrolle nicht unterscheidbaren Aktivität oder wie im
vorliegenden Fall zu gar keiner identifizierbaren Aktivität. Des Weiteren besteht das
schwerwiegende Problem der Substratzulieferung zum Enzym: dieses liegt
intrazellulär vor, während der Substrat von außen zugegeben werden muss und
zudem schwer membrangängig ist.
Um einige dieser Problem zu umgehen, wurde in einem weiteren Ansatz das
[10]
sogenannte Oberflächenpräsentationsverfahren auf Hefezellen verwendet
. Dies
sollte zwei Vorteile bieten: zum einen sollten durch das neue Expressionssystem
posttranslationale Modifikationen wie beispielsweise Glykosylierungen ermöglicht
werden, die gegebenenfalls auch zu einer besseren Löslichkeit und Aktivität der
Thioesterase führen. Zum anderen würde durch die Oberflächenpräsentation des
Enzyms eine künstlich herbeigeführte Lyse der Zellen obsolet werden. Proteine der
Wirtszelle,
die
das
Substrat
ebenfalls
umsetzen
und
somit
bei
den
Aktivitätsmessungen den Hintergrund stark erhöhen würden, könnten somit
größtenteils in der Zelle zurückgehalten werden. Dies hätte eine starke Vergrößerung
des
dynamischen
Bereichs
des
Assays
in
den
Bereich
niedrigerer
Substratkonzentrationen zur Folge, was bei einem späteren etwaigen Screening zu
einer schärferen Trennung zwischen Positiv- und Negativergebnissen führen würde.
Zunächst
sollte
die
Oberflächenpräsentation
in
einem
Flüssigassay
durchgeführt werden. Bei erfolgreicher Etablierung in der Flüssigphase wäre dieser
Assay wieder auf Agarplatten rücktransferiert worden, um eine höhere Durchsatzzahl
im Kolonienscreening zu ermöglichen.
139
Screening in einem Flüssigassay
Ob dieser Ansatz zur Aktivitätsbestimmung der Thioesterase hätte erfolgreich sein
können, lässt sich durch die Ergebnisse der vorliegende Arbeit nicht belegen. Im
+
Aktivitätsassay konnten keine Unterschiede zwischen FatB2 -exprimierenden
Hefezellen und Kontrollzellen festgestellt werden. Daher ist davon auszugehen, dass
das Protein nicht funktionell auf der Oberfläche der Zellen exprimiert wurde. Dies
könnte beispielsweise durch die Fusion an Aga2 zustande kommen, die eine korrekte
Faltung des Proteins verhindert. Allerdings lässt sich auch nicht sagen, ob das Protein
überhaupt von den Zellen exprimiert wurde, da die Möglichkeit zur Überprüfung
dieser Frage (etwa durch einen Peptidanhang wie c-myc oder 6xHis) fehlte. Es wurden
zwar vier Expressionsstandardbedingungen, die von Prof. Dr. Kolmar von der TU
Darmstadt empfohlen worden waren (mit/ohne Schütteln in Kombination mit/ohne
Zusatz von PEG), mit den Aktivitätsassays getestet, jedoch konnte in keinem Fall eine
Aktivität nachgewiesen werden. Ob dies jedoch auf eine Inaktivität, eine zu geringe
Aktivität des Enzyms oder auf eine nicht gelungene Expression zurückzuführen ist,
ließ sich jedoch im Laufe dieser Arbeit leider nicht ermitteln.
Aufreinigung des Thioesterase-Fusionkonstruktes
Für die genaue biochemische Charakterisierung des Substratspektrums von FatB2+
empfahl sich aufgrund des N-terminalen Polyhistidinanhangs zunächst eine NickelAffinitätschromatographie. Da das zur Elution verwendete Imidazol mit dem Assay
interagierte und zu einer Esterspaltung der Substrate führte, wurde dieses durch
Dialyse gegen unterschiedliche Puffer oder durch eine Entsalzungssäule entfernt.
Jedoch kam es hierbei zur Präzipitation des Enzyms. Mögliche Ursachen dafür
könnten anwesende Nickelionen im Eluat sein, die zusammen mit dem Protein von
der Säule gewaschen wurden. Durch Entfernen des Imidazols kommt es zu einer
Aggregation der Enzyme, bei der sich die Enzyme über den Polyhistidin-Anhang
wieder an einige in der Lösung befindliche Nickelionen anlagern, da diese nun nicht
mehr durch das Imidazol „maskiert“ werden und so als Aggregationskerne dienen
könnten. Um dies zukünftig zu verhindern, könnte eine zusätzliche ProteaseSchnittstellen (zum Beispiel für die Protease des Tabacco etch virus) zwischen Protein
und Polyhistidinanhang eingebaut werden um das Enzym ohne die Verwendung von
Imidazol eluieren zu können. Auch der Einsatz von EDTA um die Nickelionen in der
140
eluierten
Enzymlösung
abzufangen,
oder
eine
hohe
Salzkonzentration
im
Dialysepuffer zur Abschirmung der Nickelionen könnte getestet werden.
Jedoch war die Reinheit des Enzyms trotz dieser normalerweise sehr
spezifischen Aufreinigung nicht sehr hoch (siehe SDS-Gel in Abbildung 3-16 auf
Seite 119). Dies könnte ebenfalls auf die bereits mehrfach angesprochene geringe
Konzentration der Thioesterase im Zelllysat zurückzuführen sein. Durch die geringe
Menge an Zielprotein im Lysat ist es bei der Aufreinigung auch mehr Proteinen aus
der Wirtszelle (wie beispielsweise der Peptidyl-Prolyl-cis-trans-Isomerase vom FKBP[205]
Typ (slyD)
) möglich, freie Bindungsplätze an der Säule zu belegen, da sie ebenfalls
Wechselwirkungen
mit
dem
Säulenmaterial
zeigen
(etwa
durch
an
der
Proteinoberfläche liegende Histidinreste). Um jedoch die Säule komplett mit
Zielprotein belegen zu können und nicht erwünschte Proteine zu verdrängen, müssten
Probenvolumina aufgetragen werden, die weit über den empfohlenen Angaben des
Säulenherstellers liegen. Eine Verbesserung der Proteinlöslichkeit und damit der
Konzentration von FatB2+ im Zelllysat wäre also auch dem Punkt der Aufreinigung
zuträglich.
Wie
in
den
Ergebnissen
bereits
gezeigt,
führten
auch
die
Aufreingungsversuche mit Anionentauschersäulen zu keinem Erfolg, da das Enzym
nicht gezielt von der Säule eluiert werden konnte. Die Aufreinigung über eine
Kationentauschersäule zeigte hingegen wesentlich bessere Resultate. Hier konnte die
Elution des Proteins auf wenige Fraktionen eingegrenzt werden. Die Ergebnisse
indizieren eine leicht positive Gesamtladung des Enzyms. Aber auch hier war nur eine
mäßige Aufreinigung zu beobachten. Jedoch hätte sich diese Methode in Kombination
mit einer zusätzlichen Aufreinigung als durchaus effektiv herausstellen können.
Daher wurde sie mit der Nickelaffinitätschromatographie, die im Vorfeld ebenfalls
bereits Reinigungseffekt bewiesen hatte, kombiniert. Damit kein Imidazol im Endeluat
vorhanden
war,
wurde
Ionentauscherchromatographie
erst
die
Affinitäts-
und
Jedoch
zeigten
ausgeführt.
anschließend
die
die
anschließend
durchgeführten dot blots kein Protein mehr im Eluat. Ein Grund hierfür könnten die
bereits
angesprochenen
Nickelionen
sein,
die
bei
der
vorausgegangenen
Nickelaffinitätschromatographie von der Säule gewaschen wurden. Diese könnten
einerseits an die Kationentauschersäule binden und andererseits weiterhin mit den
Hexahistidinanhängen der Proteine koordinieren. Somit wären diese an die Säule
gebunden und ließen sich nicht durch die gewählten Bedingungen wieder eluieren.
141
Hier wäre es durchaus auch sinnvoll, die Kombination an Chromatographien in
umgekehrter Reihenfolge zu testen. Durch eine erste Vorreinigung durch den
Kationentauscher, könnte im zweiten Schritt die zusätzliche Bindung von
Wirtsproteinen an die Nickelsäule bereits erheblich eingeschränkt sein, was zu einer
deutlichen Verbesserung der Reinheit des Endeluats führen würde. Allerdings würde
dann weiterhin das Problem bestehen das Imidazol wieder aus dem Eluat entfernen zu
müssen ohne dass es zu einer Aggregation der Thioesterase kommt.
Beurteilung aller Ergebnisse zur Assayentwicklung
In dieser Arbeit wurde versucht, mit unterschiedlichen Ansätzen einen high
throughput screening-Assay für Thioesterasen zu entwickeln. Hier kam es in allen
Bereichen zu einigen Problemen. Bereits die Suche nach einem passenden Substrat
gestaltete sich sehr schwierig. Als möglicher Ausweg könnte hier die Synthese des
[206,207]
Originalsubstrats der Thioesterase, Acyl-ACP, im Labor dienen
. Dieses Substrat
könnte in beliebiger Länge hergestellt werden, jedoch ist zu beachten, dass dies ein
sehr aufwendiger Prozess ist, der den Einsatz des Moleküls bzw. der Moleküle in
einem HTS-Assay, in welchem eine sehr große Menge an Klonen mit einer großen
Menge an Substrat durchmustert werden muss, überaus teuer macht.
Auch der Umgang mit der Thioesterase an sich gestaltete sich als sehr
schwierig. Eine Aufreinigung kam nur teilweise zustande und konnte nie vollständig
durchgeführt werden, da das Enzym immer wieder in Zwischenschritten komplett
präzipitierte. Auch hier müssten weitere Experimente folgen, um den Grund für die
Präzipitation zu ermitteln.
Insgesamt ist die Assay-Entwicklung (nicht nur, aber auch) für Thioesterasen
sehr komplex und stellt den Experimentator vor einige Herausforderungen. Um diese
Herausforderungen zu bewältigen, müssen bereits im Vorfeld durch zahlreiche
Experimente viele Parameter optimiert werden, um überhaupt erste Erfolge erzielen
zu können, an deren Ergebnissen schließlich erst einmal eine Optimierung und
Etablierung des Assays stattfinden können. Die Komplexität dieses Themas könnte
auch der Grund sein, warum bisher noch keine high throughput screening-Systeme für
Thioesterasen in der Literatur bekannt sind und Patente, die mit verschieden langen
Fettsäuren
und
Thioesterasen
arbeiten,
immer
mit
mehreren
natürlichen
Thioesterasen aus verschiedenen Quellen arbeiten anstatt beispielsweise mit einer
142
natürlichen Thioesterase und ihren verschiedenen Enzymvarianten, die aus einem
Ansatz mit zufällig eingefügten Mutationen identifiziert wurden.
143
5 Literatur
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Energy Policy 36: 881–889 (2008)
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578–597 (2010)
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159
6 Anhang
6.1 Verwendete Chemikalien
Tabelle 6-1: Verwendete Chemikalien
Chemikalie
Quelle
3-(N-Morpholino)-Propansulfonsäure
Alfa Aesar, Ward Hill, US
8-Hydroxyoctansäure
Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland
Aceton
Merck, Darmstadt, Deutschland
Acetylchlorid
Fluka Chemie, Buchs, Schweiz
Acrylamid
Fluka Chemie, Buchs, Schweiz
Agar
Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland
Agarose
Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland
Ammoniumperoxodisulfat
Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland
Bromphenolblau
Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland
Calciumchlorid
Fluka Chemie, Buchs, Schweiz
Casaminosäuren
Difco, Detroit, Michigan, USA
Coomassie-Brilliantblau R-250
Fluka Chemie, Buchs, Schweiz
Cyclohexan
Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland
Decansäure
Fluka Chemie, Buchs, Schweiz
Dikaliumhydrogenphosphat
Fluka Chemie, Buchs, Schweiz
Dimethylsulfoxid
Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland
Dinatriumhydrogenphosphat
Fluka Chemie, Buchs, Schweiz
Dithiothreitol
Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland
Dodecansäure
Fluka Chemie, Buchs, Schweiz
Essigsäure
Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland
Ethylendiamintetraessigsäure
Fluka Chemie, Buchs, Schweiz
Glucose
Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland
Glycerol
Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland
Glycin
Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland
Hefeextrakt
Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland
Hefe-Stickstoff-Basismedium
Difco, Detroit, Michigan, USA
Heptadecansäure
Fluka Chemie, Buchs, Schweiz
160
Chemikalie
Quelle
Hexadecansäure
Fluka Chemie, Buchs, Schweiz
Hexansäure
Fluka Chemie, Buchs, Schweiz
Imidazol
Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland
Isopropylthiogalaktosid (IPTG)
Fermentas, St. Leon-Rot, Deutschland
Kaliumacetat
Fluka Chemie, Buchs, Schweiz
Kaliumchlorid
Fluka Chemie, Buchs, Schweiz
Kaliumdihydrogenphosphat
Fluka Chemie, Buchs, Schweiz
Kaliumhydroxid
Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland
Kanamycin
Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland
Kieselgel
Chemikalienausgabe Universität Stuttgart
L-Arabinose
Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland
L-Rhamnose
Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland
Magnesiumchlorid
Fluka Chemie, Buchs, Schweiz
Magnesiumsulfat-Heptahydrat
Fluka Chemie, Buchs, Schweiz
Manganchlorid
Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland
Methanol
Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland
Methyl-tert-butylether (MTBE)
Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland
Milchpulver
Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland
N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin
Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland
N,O-Bis(trimethylsilyl)trifluoroacetamid
+ 1% TrimethylchlorosilanMCS
Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland
Natriumchlorid
Fluka Chemie, Buchs, Schweiz
Natriumdodecylsulfat
Fluka Chemie, Buchs, Schweiz
Natriumhydroxid
Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland
Octadecansäure
Fluka Chemie, Buchs, Schweiz
Octansäure
Fluka Chemie, Buchs, Schweiz
Orange G
Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland
Rubidiumchlorid
Alfa Aesar, Ward Hill, US
Saccharose
Fluka Chemie, Buchs, Schweiz
Salzsäure
Chemikalienausgabe Universität Stuttgart
Schwefelsäure
Fluka Chemie, Buchs, Schweiz
Seesand
Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland
161
Chemikalie
Quelle
Suberinsäure
Fluka Chemie, Buchs, Schweiz
Tetradecansäure
Fluka Chemie, Buchs, Schweiz
Tetramethylendiamin
Carl Roth, Karlsruhe, Deutschland
Triethylamin
Fluka Chemie, Buchs, Schweiz
Trimethylsulfoniumhydroxid
Fluka Chemie, Buchs, Schweiz
Tris(hydroxymethyl)-aminomethan
Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland
Trypton
Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland
Tween 20
Sigma-Aldrich, Taufkirchen, Deutschland
6.2 Gensequenzen
6.2.1 Ch FatB2 (Originalsequenz)
ATGGTGGCTGCTGCAGCAAGTTCCGCATTCTTCCCTGTTCCAGCCCCGGGAGCC
TCCCCTAAACCCGGGAAGTTCGGAAATTGGCCCTCGAGCTTGAGCCCTTCCTTC
AAGCCCAAGTCAATCCCCAATGGCGGATTTCAGGTTAAGGCAAATGACAGCGC
CCATCCAAAGGCTAACGGTTCTGCAGTTAGTCTAAAGTCTGGCAGCCTCAACA
CTCAGGAGGACACTTCGTCGTCCCCTCCTCCTCGGACTTTCCTTCACCAGTTGC
CTGATTGGAGTAGGCTTCTGACTGCAATCACGACCGTGTTCGTGAAATCTAAGA
GGCCTGACATGCATGATCGGAAATCCAAGAGGCCTGACATGCTGGTGGACTCG
TTTGGGTTGGAGAGTACTGTTCAGGATGGGCTCGTGTTCCGACAGAGTTTTTCG
ATTAGGTCTTATGAAATAGGCACTGATCGAACGGCCTCTATAGAGACACTTAT
GAACCACTTGCAGGAAACATCTCTCAATCATTGTAAGAGTACCGGTATTCTCCT
TGACGGCTTCGGTCGTACTCTTGAGATGTGTAAAAGGGACCTCATTTGGGTGGT
AATAAAAATGCAGATCAAGGTGAATCGCTATCCAGCTTGGGGCGATACTGTCG
AGATCAATACCCGGTTCTCCCGGTTGGGGAAAATCGGTATGGGTCGCGATTGG
CTAATAAGTGATTGCAACACAGGAGAAATTCTTGTAAGAGCTACGAGCGCGTA
TGCCATGATGAATCAAAAGACGAGAAGACTCTCAAAACTTCCATACGAGGTTC
ACCAGGAGATAGTGCCTCTTTTTGTCGACTCTCCTGTCATTGAAGACAGTGATC
TGAAAGTGCATAAGTTTAAAGTGAAGACTGGTGATTCCATTCAAAAGGGTCTA
ACTCCGGGGTGGAATGACTTGGATGTCAATCAGCACGTAAGCAACGTGAAGTA
CATTGGGTGGATTCTCGAGAGTATGCCAACAGAAGTTTTGGAGACCCAGGAGC
TATGCTCTCTCGCCCTTGAATATAGGCGGGAATGCGGAAGGGACAGTGTGCTG
162
GAGTCCGTGACCGCTATGGATCCCTCAAAAGTTGGAGTCCGTTCTCAGTACCAG
CACCTTCTGCGGCTTGAGGATGGGACTGCTATCGTGAACGGTGCAACTGAGTG
GCGGCCGAAGAATGCAGGAGCTAACGGGGCGATATCAACGGGAAAGACTTCA
AATGGAAACTCGGTCTCTTAG
6.2.2 Ch FatB2 (codon-optimiert von GeneArt)
ATGGTTGCAGCAGCAGCAAGCAGCGCATTTTTTCCGGTTCCAGCACCGGGTGC
AAGCCCGAAACCGGGTAAATTTGGTAATTGGCCGAGCAGCCTGAGCCCGAGCT
TTAAACCGAAAAGCATTCCGAATGGTGGCTTTCAGGTTAAAGCAAATGATAGC
GCACATCCGAAAGCCAATGGTAGCGCAGTTAGCCTGAAAAGCGGTAGCCTGAA
TACCCAAGAAGATACCAGCAGCAGTCCGCCTCCGCGTACCTTTCTGCATCAGCT
GCCGGATTGGAGCCGTCTGCTGACCGCAATTACCACCGTTTTTGTTAAAAGCAA
ACGTCCGGATATGCATGATCGCAAAAGTAAACGCCCTGATATGCTGGTTGATA
GCTTTGGTCTGGAAAGCACCGTTCAGGATGGTCTGGTTTTTCGTCAGAGCTTTA
GCATTCGCAGCTATGAAATTGGCACCGATCGTACCGCAAGCATTGAAACCCTG
ATGAATCATCTGCAAGAAACCAGCCTGAATCATTGTAAAAGCACCGGTATTCT
GCTGGATGGTTTTGGTCGTACCCTGGAAATGTGTAAACGTGATCTGATTTGGGT
GGTGATCAAAATGCAGATTAAAGTGAATCGTTATCCGGCATGGGGTGATACCG
TTGAAATTAATACCCGTTTTAGCCGTCTGGGTAAAATTGGTATGGGTCGTGATT
GGCTGATTAGCGATTGTAATACCGGTGAAATTCTGGTTCGTGCAACCAGCGCAT
ATGCAATGATGAATCAGAAAACCCGTCGTCTGAGCAAACTGCCGTATGAAGTT
CATCAAGAAATTGTTCCGCTGTTTGTTGATAGTCCGGTTATTGAAGATAGCGAT
CTGAAAGTGCATAAATTTAAAGTGAAAACCGGTGATAGCATCCAGAAAGGTCT
GACACCGGGTTGGAATGATCTGGATGTTAATCAGCATGTGAGCAACGTGAAAT
ATATTGGTTGGATTCTGGAAAGCATGCCGACCGAAGTTCTGGAAACCCAAGAA
CTGTGTAGCCTGGCACTGGAATATCGTCGTGAATGTGGTCGTGATAGCGTTCTG
GAAAGCGTTACCGCAATGGACCCGAGCAAAGTTGGTGTTCGTAGCCAGTATCA
GCATCTGCTGCGTCTGGAAGATGGCACCGCAATTGTTAATGGTGCAACCGAAT
GGCGTCCGAAAAATGCCGGTGCAAATGGTGCAATTAGCACCGGTAAAACCAGC
AATGGTAATAGCGTTAGCTAA
6.2.3 At mtKAS (Originalsequenz)
ATGGCGACATCTAATCTCCGTAGACACTTGAGCGCAAGTCGCCTCCGCTTAAAC
CGCTTCATCTCTACTTCTTCTTCTTATCATTCACATCGCCGTGTTGTTGTCACTG
GTCTAGGCATGGTGACTCCACTTGGTAGAGGCGTTGAAACAACGTGGAGGCGT
163
TTAATTGATGGAGAATGTGGGATTAGAGGATTGACTCTTGATGATCTCAAGATG
AAGTCTTTTGATGAAGAGACAAAGTTATATACTTTTGATCAGCTTTCTTCTAAA
GTTGCTGCTTTTGTGCCTTATGGATCAAACCCTGGTGAATTTGATGAAGCCCTT
TGGCTAAACTCTAAGGCAGTTGCGAATTTTATCGGATATGCTGTATGTGCTGCC
GATGAAGCTTTGAGAGATGCAGAGTGGTTACCAACTGAAGAAGAAGAAAAAG
AGAGAACAGGAGTCTCTATTGGTGGTGGAATTGGAAGTATATGTGATATTGTG
GAGGCAGCGCAGCTGATTTGTGAAAAGAGGCTGCGGCGGCTTAGTCCGTTTTTC
ATTCCAAAAATATTGGTAAACATGGCATCTGGTCATGTGAGCATGAAGTATGG
ATTTCAGGGGCCAAATCATGCTGCTGTGACAGCTTGCGCAACTGGTGCACATTC
TATAGGCGATGCCACTAGGATGATTCAATTTGGAGATGCAGATGTTATGGTGG
CTGGTGGAACTGAGTCTAGCATTGATGCTCTGTCCGTAGCTGGATTCTCTAGAT
CAAGGGCTTTGTCAACTAAATTCAATTCTTCTCCACAAGAAGCTTCACGGCCTT
TTGATTGTGACCGGGATGGTTTTGTGATAGGGGAAGGTTCAGGGGTTATAGTAT
TAGAGGAATATGAGCATGCAAAAAGACGAGGAGCAAAAATTTATGCTGAGCTT
TGTGGATATGGGATGTCAGGCGATGCACACCATATTACTCAACCTCCTGAAGAT
GGAAAAGGAGCTGTTTTGGCCATGACGCGTGCCTTAAGACAGTCTGGTCTGTGT
CCAAACCAAATTGATTATGTAAACGCACATGCAACATCAACCCCAATAGGCGA
TGCCGTGGAAGCGAGAGCTATCAAGACGGTATTCTCTGAACATGCTACTTCAG
GCACCTTGGCATTCTCCTCCACCAAGGGGGCTACTGGTCATCTTCTTGGAGCAG
CTGGAGCAGTGGAAGCTATTTTCAGTATCCTTGCTATACATCACGGGGTTGCTC
CTATGACGCTGAATGTCAAGAATCCAGATCCCATCTTCGACAAGAGGTTCATG
CCTTTAACCACTTCGAAAAAGATGTTAGTTAGGACAGCAATGTCGAATTCGTTT
GGCTTTGGAGGAACAAATGCATCTTTGCTCTTTGCCTCTATCTAA
6.2.4 At mtKAS (codon-optimiert von GeneArt)
ATGAGCCATCGTCGTGTTGTTGTTACCGGTCTGGGTATGGTTACACCGCTGGGT
CGTGGTGTTGAAACCACCTGGCGTCGTCTGATTGATGGTGAATGTGGTATTCGT
GGTCTGACCCTGGATGATCTGAAAATGAAATCCTTTGATGAAGAAACCAAACT
GTACACCTTTGATCAGCTGAGCAGCAAAGTTGCAGCATTTGTTCCGTATGGTAG
CAATCCGGGTGAATTTGATGAAGCACTGTGGCTGAATAGCAAAGCAGTTGCAA
ACTTTATTGGTTATGCAGTTTGTGCAGCAGATGAAGCCCTGCGTGATGCAGAAT
GGCTGCCGACCGAAGAAGAAGAAAAAGAACGTACCGGTGTTAGCATTGGTGGT
GGTATTGGTAGCATTTGCGATATTGTTGAAGCAGCACAGCTGATTTGTGAAAAA
CGTCTGCGTCGTCTGAGCCCGTTTTTTATTCCGAAAATTCTGGTTAATATGGCC
164
AGCGGTCATGTGAGCATGAAATATGGTTTTCAGGGTCCGAATCATGCAGCAGT
TACCGCATGTGCTACAGGTGCACATAGCATTGGTGATGCAACCCGTATGATTCA
GTTTGGTGATGCAGATGTTATGGTTGCCGGTGGCACCGAAAGCAGCATTGATGC
ACTGAGCGTTGCAGGTTTTAGCCGTAGCCGTGCACTGAGCACCAAATTTAATAG
CAGTCCGCAAGAAGCAAGCCGTCCGTTTGATTGTGATCGTGATGGTTTTGTTAT
TGGTGAAGGTAGCGGTGTTATTGTGCTGGAAGAATATGAACATGCAAAACGTC
GTGGTGCCAAAATCTATGCAGAACTGTGTGGTTATGGTATGAGCGGTGATGCA
CATCATATTACCCAGCCTCCGGAAGATGGCAAAGGTGCAGTTCTGGCAATGAC
CCGTGCACTGCGTCAGAGCGGTCTGTGTCCGAATCAGATTGATTATGTTAATGC
ACATGCAACCAGCACCCCGATTGGTGATGCCGTTGAAGCACGTGCAATTAAAA
CCGTTTTTAGCGAACATGCGACTAGCGGCACCCTGGCATTTAGCAGCACCAAA
GGTGCAACCGGTCATCTGCTGGGTGCAGCTGGTGCAGTTGAAGCAATTTTTAGC
ATTCTGGCCATTCAT
CATGGTGTTGCACCGATGACCCTGAATGTTAAAAATCCTGATCCGATCTTCGAT
AAACGTTTTATGCCGCTGACCACGAGCAAAAAAATGCTGGTTCGTACCGCAAT
GAGCAATAGCTTTGGTTTTGGTGGCACCAATGCAAGCCTGCTGTTTGCAAGCAT
TTAA
6.2.5 P450 Monooxygenase CYP153AM.aq.*-CPRBM3
ATGGGTATGCCAACACTGCCCAGAACATTTGACGACATTCAGTCCCGACTGATT
AACGCCACCTCCAGGGTGGTGCCGATGCAGAGGCAAATTCAGGGACTGAAATT
CTTAATGAGCGCCAAGAGGAAGACCTTCGGCCCACGCCGACCGATGCCCGAAT
TCGTTGAAACACCCATCCCGGACGTTAACACGCTGGCCCTTGAGGACATCGAT
GTCAGCAATCCGTTTTTATACCGGCAGGGTCAGTGGCGCGCCTATTTCAAACGG
TTGCGTGATGAGGCGCCGGTCCATTACCAGAAGAACAGCCCTTTCGGCCCCTTC
TGGTCGGTAACTCGGTTTGAAGACATCCTGTTCGTGGATAAGAGTCACGACCTG
TTTTCCGCCGAGCCGCAAATCATTCTCGGTGACCCTCCGGAGGGGCTGTCGGTG
GAAATGTTCATAGCGATGGATCCGCCGAAACACGATGTGCAGCGCAGCTCGGT
GCAGGGAGTAGTGGCACCGAAAAACCTGAAGGAGATGGAGGGGCTGATCCGA
TCACGCACCGGCGATGTGCTTGACAGCCTGCCTACAGACAAACCCTTTAACTG
GGTACCTGCTGTTTCCAAGGAACTCACAGGCCGCATGCTGGCGACGCTTCTGGA
TTTTCCTTACGAGGAACGCCACAAGCTGGTTGAGTGGTCGGACAGAATGGCAG
GTGCAGCATCGGCCACCGGCGGGGAGTTTGCCGATGAAAATGCCATGTTTGAC
GACGCGGCAGACATGGCCCGGTCTTTCTCCAGGCTTTGGCGGGACAAGGAGGC
165
GCGCCGCGCAGCAGGCGAGGAGCCCGGTTTCGATTTGATCAGCCTGTTGCAGA
GCAACAAAGAAACGAAAGACCTGATCAATCGGCCGATGGAGTTTATCGGTAAT
TTGACGCTGCTCATAGTCGGCGGCAACGATACGACGCGCAACTCGATGAGTGG
TGGCCTGGTGGCCATGAACGAATTCCCCAGGGAATTTGAAAAATTGAAGGCAA
AACCGGAGTTGATTCCGAACATGGTGTCGGAAATCATCCGCTGGCAAACGCCG
CTGGCCTATATGCGCCGAATCGCCAAGCAGGATGTCGAACTGGGCGGCCAGAC
CATCAAGAAGGGTGATCGAGTTGTCATGTGGTACGCGTCGGGTAACCGGGACG
AGCGCAAATTTGACAACCCCGATCAGTTCATCATTGATCGCAAGGACGCACGA
AACCACATGTCGTTCGGCTATGGGGTTCACCGTTGCATGGGCAACCGTCTGGCT
GAACTGCAACTGCGCATCCTCTGGGAAGAAATACTCAAGCGTTTTGACAACAT
CGAAGTCGTCGAAGAGCCCGAGCGGGTGCAGTCCAACTTCGTGCGGGGCTATT
CCAGGTTGATGGTCAAACTGACACCGAACAGTATTCCTTCACCTAGCACTGAA
CAGTCTGCTAAAAAAGTACGCAAAAAGGCAGAAAACGCTCATAATACGCCGCT
GCTTGTGCTATACGGTTCAAATATGGGAACAGCTGAAGGAACGGCGCGTGATT
TAGCAGATATTGCAATGAGCAAAGGATTTGCACCGCAGGTCGCAACGCTTGAT
TCACACGCCGGAAATCTTCCGCGCGAAGGAGCTGTATTAATTGTAACGGCGTCT
TATAACGGTCATCCGCCTGATAACGCAAAGCAATTTGTCGACTGGTTAGACCA
AGCGTCTGCTGATGAAGTAAAAGGCGTTCGCTACTCCGTATTTGGATGCGGCG
ATAAAAACTGGGCTACTACGTATCAAAAAGTGCCTGCTTTTATCGATGAAACG
CTTGCCGCTAAAGGGGCAGAAAACATCGCTGACCGCGGTGAAGCAGATGCAAG
CGACGACTTTGAAGGCACATATGAAGAATGGCGTGAACATATGTGGAGTGACG
TAGCAGCCTACTTTAACCTCGACATTGAAAACAGTGAAGATAATAAATCTACT
CTTTCACTTCAATTTGTCGACAGCGCCGCGGATATGCCGCTTGCGAAAATGCAC
GGTGCGTTTTCAACGAACGTCGTAGCAAGCAAAGAACTTCAACAGCCAGGCAG
TGCACGAAGCACGCGACATCTTGAAATTGAACTTCCAAAAGAAGCTTCTTATC
AAGAAGGAGATCATTTAGGTGTTATTCCTCGCAACTATGAAGGAATAGTAAAC
CGTGTAACAGCAAGGTTCGGCCTAGATGCATCACAGCAAATCCGTCTGGAAGC
AGAAGAAGAAAAATTAGCTCATTTGCCACTCGCTAAAACAGTATCCGTAGAAG
AGCTTCTGCAATACGTGGAGCTTCAAGATCCTGTTACGCGCACGCAGCTTCGCG
CAATGGCTGCTAAAACGGTCTGCCCGCCGCATAAAGTAGAGCTTGAAGCCTTG
CTTGAAAAGCAAGCCTACAAAGAACAAGTGCTGGCAAAACGTTTAACAATGCT
TGAACTGCTTGAAAAATACCCGGCGTGTGAAATGAAATTCAGCGAATTTATCG
CCCTTCTGCCAAGCATACGCCCGCGCTATTACTCGATTTCTTCATCACCTCGTG
TCGATGAAAAACAAGCAAGCATCACGGTCAGCGTTGTCTCAGGAGAAGCGTGG
166
AGCGGATATGGAGAATATAAAGGAATTGCGTCGAACTATCTTGCCGAGCTGCA
AGAAGGAGATACGATTACGTGCTTTATTTCCACACCGCAGTCAGAATTTACGCT
GCCAAAAGACCCTGAAACGCCGCTTATCATGGTCGGACCGGGAACAGGCGTCG
CGCCGTTTAGAGGCTTTGTGCAGGCGCGCAAACAGCTAAAAGAACAAGGACAG
TCACTTGGAGAAGCACATTTATACTTCGGCTGCCGTTCACCTCATGAAGACTAT
CTGTATCAAGAAGAGCTTGAAAACGCCCAAAGCGAAGGCATCATTACGCTTCA
TACCGCTTTTTCTCGCATGCCAAATCAGCCGAAAACATACGTTCAGCACGTAAT
GGAACAAGACGGCAAGAAATTGATTGAACTTCTTGATCAAGGAGCGCACTTCT
ATATTTGCGGAGACGGAAGCCAAATGGCACCTGCCGTTGAAGCAACGCTTATG
AAAAGCTATGCTGACGTTCACCAAGTGAGTGAAGCAGACGCTCGCTTATGGCT
GCAGCAGCTAGAAGAAAAAGGCCGATACGCAAAAGACGTGTGGGCTGGGTAA
167
6..3 Plasm
midkarten
n
Im
m Folgenden
n werden alle
a für diesse Arbeit erzeugten
e
Plasmide unnd ihre enth
haltenen
Sttrukturelem
mente angeg
geben.
6..3.1 pBAD
D18-CYP
Ab
bbildung 6-1
1: Plasmidkartte von pBAD118-CYP
arraC: Sequenz des Regulato
orprotein für ddas araBAD-O
Operons, araB
BAD promotter: Sequenz des durch
L--Arabinose in
nduzierbaren Promotors ffür das Operon araBAD, CYP153A-C
CPR: Monoo
oxygenase
CY
YP153AMaq*-C
CPRBM3, rrnB T1 terminaator: Transkriptionstermin
natorsequenz T1 von rrnB, rrnB T2
terminator: Trranskriptionsterminatorseqquenz T2 von
n rrnB, AmpR
R promoter: Sequenz des Promotor
fü
ür das β-Laactamase-Gen
n bla, Amp
pR: Sequenzz des Ampicillin-Resisteenzgen bla, f1 ori:
Reeplikationsurssprung des Ph
hagen f1, orii pBR322: Replikationsursprung von PPlasmid pBR3322, bom:
Errkennungsstellle für Mobilissierungsproteeine.
168
6..3.2 pBAD
D18-mtKA
AS
Ab
bbildung 6-2
2: Plasmidkartte pBAD18-m
mtKAS
arraC: Sequenz des Regulato
orprotein für ddas araBAD-O
Operons, araB
BAD promotter: Sequenz des durch
L--Arabinose induzierbaren
i
n Promotors für das Operon
O
araB
BAD, At m
mtKAS: Sequ
uenz der
miitochondrialen 3-Ketoacyl--ACP-Synthasse mtKAS (
aus Arabidopsis
A
thaliana), rrnB
r
T1
terminator: Transkriptio
onsterminatorrsequenz T1
T
von rrnB,
r
rrnB
B T2 terrminator:
Trranskriptionstterminatorseq
quenz T2 vonn rrnB, Amp
pR promote
er: Sequenz ddes Promotor für das
β-Lactamase-Geen bla, AmpR
R: Sequenz ddes Ampicillin
n-Resistenzgen bla, f1 orii: Replikationssursprung
dees Phagen f1, ori pBR322
2: Replikationnsursprung von Plasmid pBR322,
p
bom
m: Erkennungssstelle für
Mobilisierungsp
proteine.
169
6..3.3 pCT3
302-FatB2
Ab
bbildung 6-3
3: Plasmidkartte von pCT30 2-FatB2
TR
RP1 promotter: Sequenz des Promotoor für das TR
RP1-Gen, TR
RP1: Gensequuenz zur Seleektion auf
koomplementierrte Tryptophaan-Biosynthesse, f1 ori: Replikationsur
R
rsprung des PPhagen f1, M13
M
fwd:
Errkennungsseq
quenz für Seq
quenzierungspprimer, T7 promoter: Seq
quenz des Prromotors der T7-RNAPoolymerase, Myc:
M
Sequenz des humaneen Myc-Epitop
p, FatB2: Sequenz der Thhioesterase FatB2
F
(aus
Cu
uphea hookeriiana), Linker: Verbindunggssequenz, HA
A: Sequenz dees Hämagglutiinin-Epitop, Factor
F
Xa
sitte: Schnittstelle für Fak
ktor Xa, Agga2p: Sequen
nz des Oberrflächenproteiins Aga2p (dient
(
als
Membranankerr), GAL10 promoter:
p
Seequenz des durch Galacctose induzieerbaren Prom
motor, T3
prromoter: Seq
quenz des Prromotors für die T3-RNA--Polymerase, M13 rev: EErkennungsseq
quenz für
Seequenzierungssprimer, lac operator:
o
Binndesequenz fü
ür den lac Rep
pressor, lac p
promoter: Sequenz des
Prromotors für das lac-Operron, ori: Repllikationsursprrung von Plasmid pBR3222, AmpR: Seq
quenz des
Am
mpicillin-Resiistenzgens bla
a, AmpR pro
omoter: Sequ
uenz des Prom
motors für daas β-Lactamasegen bla,
CE
EN/ARS: selbbstständig rep
plizierende Seqquenz des CE
EN6-Centromeer.
170
6..3.4 pJeM
M1-FatB2
Ab
bbildung 6-4
4: Plasmidkartte von pJeM1--FatB2
pB
BBR1 oriV: Replikationsu
ursprung vonn Plasmid pB
BBR1, pBBR1
1 Rep: Replikkationsprotein für das
Plasmid pBBR11, Ch FatB2: Sequenz der Thioesterase FatB2 (aus Cuphea
C
hookerriana), 6xHiss: Sequenz
dees 6-fach Histtidin-Affinitättsanhang, rhaaP: Sequenz des
d durch L-R
Rhamnose indduzierbaren Promotors
P
rh
haBAD, rhaS
S: Sequenz des Transkrriptionsfaktorrs des rhaB
BAD-Operon, rhaR: Sequ
uenz des
Trranskriptionsffaktors des rhaRS-Operron, NeoR/K
KanR: Sequ
uenz des N
Neomycin/KaanamycinReesistenzgen apph(3‘)-II, mob
b: Sequenz fürr das Mobilisieerungsprotein
n.
171
6..3.5 pJeM
M-mtKAS
Ab
bbildung 6-5
5: Plasmidkartte von pJeM1--mtKAS
pB
BBR1 oriV: Replikationsu
ursprung vonn Plasmid pB
BBR1, pBBR1
1 Rep: Replikkationsprotein für das
Plasmid pBBR1, At mtKA
AS: Sequenz der mitocho
ondriale 3-Keetoacyl-ACP-SSynthase mtK
KAS (aus
Arrabidopsis thaaliana), 6xHiss: Sequenz dees 6-fach Histtidin-Affinitättsanhang, rhaaP: Sequenz des durch
L--Rhamnose in
nduzierbaren Promotors
P
rhhaBAD, rhaS: Sequenz des Transkriptioonsfaktors dess rhaBADOp
peron, rhaR: Sequenz dees Transkrip tionsfaktors des rhaRS-O
Operon, NeoR
R/KanR: Seq
quenz des
Neeomycin/Kanaamycin-Resistenzgen aph(3
(3‘)-II, mob: Seequenz für da
as Mobilisierunngsprotein.
172
6..3.6 pKiM
M1
Ab
bbildung 6-6
6: Plasmidkartte von pKiM1
pB
BBR1 oriV: Replikationsu
ursprung vonn Plasmid pB
BBR1, pBBR1
1 Rep: Replikkationsprotein für das
Plasmid pBBR11, 6xHis: Seequenz des 66-fach Histid
din-Affinitätsa
anhang, rhaP
P: Sequenz des
d durch
L--Rhamnose in
nduzierbaren Promotors
P
rhhaBAD, rhaS: Sequenz des Transkriptioonsfaktors dess rhaBADOp
peron, rhaR: Sequenz dees Transkrip tionsfaktors des rhaRS-O
Operon, NeoR
R/KanR: Seq
quenz des
Neeomycin/Kanaamycin-Resistenzgen aph(3
(3‘)-II, mob: Seequenz für da
as Mobilisierunngsprotein.
173
6..3.7 pKiM
M2
Ab
bbildung 6-7
7: Plasmidkartte von pKiM22
pB
BBR1 oriV: Replikationsu
ursprung vonn Plasmid pB
BBR1, pBBR1
1 Rep: Replikkationsprotein für das
Plasmid pBBR11, TrxA: Sequ
uenz für Thiooredoxin-Anh
hang, Ch FatB
B2: Sequenz dder Thioesterrase FatB2
(au
us Cuphea hookeriana),
h
6xHis: Sequennz des 6-fach
h Histidin-Afffinitätsanhanng, rhaP: Seq
quenz des
du
urch L-Rhamn
nose induzierrbaren Promootors rhaBAD
D, rhaS: Sequ
uenz des Traanskriptionsfaaktors des
rh
haBAD-Operon
n, rhaR: Seq
quenz des Traanskriptionsfaaktors des rha
aRS-Operon, NeoR/KanR
R: Sequenz
dees Neomycin/K
Kanamycin-R
Resistenzgen aaph(3‘)-II, mob
b: Sequenz fü
ür das Mobilisiierungsproteiin.
174
6..3.8 pKiM
M4
Ab
bbildung 6-8
8: Plasmidkartte von pKiM44
pB
BBR1 oriV: Replikationsu
ursprung vonn Plasmid pB
BBR1, pBBR1
1 Rep: Replikkationsprotein für das
Plasmid pBBR11, TrxA: Sequ
uenz für Thiorredoxin-Anhaang, Ch FatB
B2*: Sequenz dder Thioesterrase FatB2
oh
hne potentiellles Signal-Peeptid (aus C
Cuphea hookeriana), 6xH
His: Sequenz des 6-fach HistidinAfffinitätsanhan
ng, rhaP: Sequenz des ddurch L-Rham
mnose induzieerbaren Prom
motors rhaBA
AD, rhaS:
Seequenz des Trranskriptionsffaktors des rhhaBAD-Opero
on, rhaR: Seq
quenz des Traanskriptionsfaaktors des
rh
haRS-Operon, NeoR/KanR
R: Sequenz dess Neomycin/K
Kanamycin-Reesistenzgen apph(3‘)-II, mob
b: Sequenz
fü
ür das Mobilisiierungsprotein.
175
6.4 Ergänzende statistische Auswertungen
Alle Messungen zur Fettsäureanalytik der verschiedenen Stämme wurden mindestens
im Triplikat durchgeführt. Als Voraussetzungen für die Verwendung des t-Tests
müssen die überprüften Werte einer normalverteilten Grundgesamtheit entstammen
und Homoskedastizität vorliegen.
6.4.1 Ergebnisse des Shapiro-Wilk-Tests
Beim Shapiro-Wilk-Test auf Normalverteilung wird bei einer Signifikanz p < 0,05 die
Nullhypothese, und damit eine Normalverteilung der ermittelten Werte, abgelehnt.
Tabelle 6-2: Shapiro-Wilk-Ergebnisse für die Fettsäureanalysen aus Kapitel 3.1.
WT
Ansatz I
Ansatz II
W
df
Signifikanz
W
df
Signifikanz
W
df
Signifikanz
C6
0,775
3
0,068
0,998
3
0,896
0,801
3
0,128
C8
0,859
3
0,264
0,807
3
0,142
0,943
3
0,463
C10
0,853
3
0,251
0,884
3
0,324
0,998
3
0,898
C12
0,988
3
0,793
1,000
3
0,980
0,873
3
0,298
C14
0,822
3
0,177
0,962
3
0,531
0,876
3
0,305
C16
0,890
3
0,338
0,992
3
0,842
0,922
3
0,413
C18
0,801
3
0,129
0,967
3
0,578
1,000
3
0,980
Ansatz III
Ansatz IV
Ansatz V
W
df
Signifikanz
W
df
Signifikanz
W
df
Signifikanz
C6
0,967
3
0,584
0,893
3
0,345
0,996
3
0,883
C8
1,000
3
0,98
0,782
3
0,083
1,000
3
0,98
C10
0,916
3
0,398
0,910
3
0,4384
0,840
3
0,220
C12
0,975
3
0,668
0,819
3
0,169
0,774
3
0,066
C14
0,848
3
0,238
0,999
3
0,943
0,791
3
0,106
C16
0,980
3
0,72
0,988
3
0,802
0,920
3
0,409
C18
0,825
3
0,186
0,999
3
0,943
0,912
3
0,388
Ansatz VI
W
df
Signifikanz
C6
0,822
3
0,177
C8
0,994
3
0,862
C10
0,782
3
0,084
C12
0,809
3
0,148
C14
0,838
3
0,215
C16
0,885
3
0,325
176
Für alle gemessenen Werte konnte die Normalverteilung bestätigt werden.
6.4.2 Ergebnisse des Levene-Tests
Der
Signifikanztest
nach
Levene
überprüft
die
Varianzgleichheit
zweier
Wertegruppen. Ist ein Signifikanzwert p kleiner als 0,05, so sind die Unterschiede in
den Varianzen überzufällig und die Nullhypothese der Varianzgleichheit wird
abgelehnt. Die Homoskedastizität bildet eine weitere notwendige Bedingung für den
unabhängigen
Zweistichproben-t-Test.
Verglichen
wurden
jeweils
Triplikatmessungen der in der Kultur enthaltenen Fettsäuren der Ansätze I - VI mit
der entsprechenden Triplikatmessung des Wildtypstamms WT.
Tabelle 6-3: Levene-Test-Ergebnisse für die Fettsäureanalysen aus Kapitel 3.1.
Ansatz I - WT
Ansatz II - WT
Ansatz III - WT
F
Signifikanz
F
Signifikanz
F
Signifikanz
C6
2,201
0,212
3,167
0,150
1,129
0,348
C8
2,831
0,168
8,765
0,042
4,018
0,116
C10
11,299
0,028
0,389
0,566
8,524
0,043
C12
3,816
0,122
12,937
0,023
6,868
0,059
C14
1,024
0,369
5,633
0,077
5,469
0,080
C16
2,799
0,170
1,991
0,231
1,017
0,370
C18
0,342
0,590
2,107
0,220
8,595
0,043
Ansatz IV - WT
Ansatz V - WT
Ansatz VI - WT
F
Signifikanz
F
Signifikanz
F
Signifikanz
C6
1,354
0,309
0,351
0,586
11,743
0,027
C8
15,525
0,017
4,094
0,113
5,178
0,085
C10
9,123
0,039
10,204
0,033
15,138
0,018
C12
14,746
0,018
15,738
0,017
15,288
0,017
C14
0,029
0,873
6,418
0,064
11,866
0,026
C16
0,837
0,412
0,093
0,775
10,531
0,032
C18
0,000
0,997
4,833
0,093
-
-
Kursiv gedruckte Werte in Tabelle 6-3 kennzeichnen Signifikanzergebnisse, die unter
das Signifikanzniveau α fallen. Hier wurde die Hypothese der Varianzhomogenität
abgelehnt.
177
6.4.3 Ergebnisse der Zweistichproben-t-Tests
Mit
dem
Zweistichproben-t-Test
für
unabhängige
Stichproben
wird
die
Mittelwertgleichheit zweier unbekannter Grundgesamtheiten aufgrund unabhängiger
Stichproben abgeschätzt. Dabei wird die Nullhypothese der Gleichheit der beiden
Grundgesamtheiten
abgelehnt,
wenn
der
Signifikanzwert
p
unter
dem
Signifikanzniveau α von 0,05 liegt. Alle Mittelwertdifferenzen wurden mit
Triplikatmessungen berechnet. Hierbei diente die Triplikatmessung des Wildtyps als
Bezugspunkt
für
alle
anderen
Stämme.
Sollte
die
Voraussetzung
der
Homoskedastizität nicht erfüllt gewesen sein, wurde der Welch-Test mit einer
[162]
modifizierten Anzahl an Freiheitsgraden angewandt
.
Tabelle 6-4: Signifikanzwerte des t-Tests für die Mittelwertdifferenzen der Stämme I - VI und WT.
Ansatz I - WT
Ansatz II - WT
Ansatz III - WT
T
df
Signifikanz
T
df
Signifikanz
T
df
Signifikanz
C6
0,487
4
0,652
1,618
4
0,181
1,892
4
0,131
C8
14,862
4
0,000
4,629
2,001
0,044
20,074
4
0,000
C10
3,473
2,035
0,072
0,646
4
0,553
20,754
2,043
0,002
C12
21,717
4
0,000
13,848
2,000
0,05
27,585
4
0,000
C14
3,382
4
0,028
2,817
4
0,48
28,674
4
0,000
C16
-0,202
4
0,850
0,448
4
0,677
23,976
4
0,000
C18
-0,638
4
0,558
0,768
4
0,485
0,920
2,195
0,447
Ansatz IV - WT
Ansatz V - WT
Ansatz VI - WT
T
df
Signifikanz
T
df
Signifikanz
T
df
Signifikanz
C6
-1,827
4
0,142
-0,439
4
0,683
1,588
2,047
0,250
C8
11,222
2,000
0,008
13,948
4
0,000
10,267
4
0,001
C10
22,492
2,031
0,002
14,458
2,088
0,004
11,589
2,002
0,007
C12
74,330
2,000
0,000
101,001
2,000
0,000
5,362
2,000
0,033
C14
33,122
4
0,000
12,195
4
0,000
18,659
2,032
0,003
C16
30,814
4
0,000
14,110
4
0,000
19,845
2,023
0,002
C18
4,564
4
0,010
0,031
4
0,977
-
-
-
Kursiv gedruckte Werte in Tabelle 6-4 zeigen Fettsäure-Vergleiche an, bei denen kein
signifikanter Unterschied der Mittelwerte festgestellt werden konnte.
178
6..5 Wach
hstumsex
xperimen
nte aus Ka
apitel 3.2
2.1
Um
m zu klären, ob die eingesetzten
n Wirtszelleen Octansäu
ure oder deeren hydrox
xyliertes
Derivat
meetabolisiereen
könne n,
wurdeen
Wachsstumsexperrimente
in
n
M9-
M
Minimalmed
dium durchgeführt. Alls Kohlensttoffquelle dienten
d
enttweder Octtansäure
(C
C8), 8-Hydrroxyoctansääure (C8OH
H), Suberin
nsäure (C8C
COOH) odeer Glycerol in der
Poositivkontro
olle (jeweilss 25 mM). D
Der Negativ
vkontrolle wurde
w
keinee Kohlensto
offquelle
zu
ugesetzt. Getestet
G
wu
urden der BW25113-W
Wildtypstam
mm, seine Deletionsmutante
BW
W25113∆faadD,
dieseer
Stamm
mit
ind
duziertem FatB2+-Konnstrukt
und
der
Deletionsstam
mm mit induziertem
m CYP*-C
CPR-Konstrukt. Überrnachtkuturren der
jeweiligen Sttämme wurrden geernteet und 3x in
n Kaliumph
hosphatpufffer (50 mM,, pH 7,5)
geewaschen um zu geewährleiste n, dass die Zellen nicht auf Rückständ
den der
Übbernachtku
ultur bzw. auf
a abgestoorbenen Zelllen wachsen. Anschliießend wurrden die
Zeellen mit eiiner OD von
n 0,1 in 2000 µL Medium
m in Mikrotiterplattenn resuspend
diert und
fü
ür 36 h bei 30 °C inkub
biert. Alle 12 h wurdeen die OD-W
Werte erfassst. Die Erg
gebnisse
sin
nd in den Abbildung
A
6-9
6 Abbildun
ng 6-10 darrgestellt.
Ab
bbildung 6-9: Verlauf der Wachstum
mskurven dess Wildtyps BW25113
B
(A)) und des Wirtsstamms
W
BW
W25113∆fadD
D (B) mit unteerschiedlichenn Kohlenstofffquellen in M9
9. Die Zellen wurden jeweeils zu einer
OD
D600 von 0,1 in 200 µL M9-Medium
M
aangeimpft un
nd für 36 h bei
b 37 °C unteer Schütteln (600 min-1)
inkkubiert. Alle 12 h erfolgte eine
e Zelldichttebestimmung
g durch Photo
ometrie bei 6000 nm.
179
Ab
bbildung
6
6-10:
Verlau
uf
der
Wacchstumskurveen
des
FatB2+
exprim
mierenden
Wirtsstamms
W
BW
W25113∆fadD
D (A) sowie CY
YP*-CPR exprrimierenden Stammes
S
BW2
25113∆fadD (B
B) mit unterschiedlichen
Koohlenstoffquellen in M9. Die
D Zellen w
wurden jeweills zu einer OD
O 600 von 0,11 in 200 µL M9-Medium
M
an
ngeimpft und
d für 36 h bei
b 37 °C untter Schütteln
n (600 min-1) inkubiert. A
Alle 12 h erfolgte eine
Zeelldichtebestim
mmung durch
h Photometriee bei 600 nm.
180
6..6 Ergän
nzung zum
m Agarp
platten-Assay in Kapitel
K
3.33.1
Ab
bbildung 6-11: Durchw
wachsener SSoftagar mit aufgetropfter Octanoyll-CoA-Assaylö
ösung in
un
nterschiedlich
her Konzentraation. Die Pfeeile kennzeich
hnen jeweils die Stellen dder Gelbfärbu
ung durch
Essterhydrolyse..
6..7 Ergän
nzung zurr Aufrein
nigung dees Thioessterase-K
Konstrukts
Abbildun
ng 6-12: Präziipitat des ThioesteraseKonstrukts nach der D
Dialyse zur Entfernung
des Imidazzols aus dem EEnzympuffer.
181
7 Abbildungsverzeichnis
Abbildung 1: Erdölpreis der letzten 100 Jahre.
22 Abbildung 1-1: Strukturen verschiedener kurz- und mittelkettigen Fettsäuren.
26 Abbildung 1-2: Prinzip der Alkanoxidation zur Fettsäure.
32 Abbildung 1-3: Schema der Fettsäuresynthese.
35 Abbildung 1-4: Schema der Hotdog-Faltung.
39 Abbildung 1-5: Beispiel der Thiolase-Faltung.
45 Abbildung 1-6: Aufsicht auf ein Monomer von At mtKAS.
48 Abbildung 1-7: Konsensussequenz um die Hämgruppe.
50 Abbildung 1-8: Modell von CYP102A1.
50 Abbildung 1-9: Übersicht zur Produktion von (8-Hydroxy-)Octansäure.
55 Abbildung 2-1: Prinzip des parallel induzierten Zweizellsystems.
84 Abbildung 2-2: Prinzip des sequentiell induzierten Zweizellsystems.
85 Abbildung 2-3: Prinzip des parallel induzierten Einzellsystems.
86 Abbildung 2-4: Prinzip des sequentiell induzierten Einzellsystems.
86 Abbildung 3-1: Western blot von FatB2.
92 Abbildung 3-2: Western blot von FatB2+.
93 Abbildung 3-3: Western blots über den zeitlichen Verlauf des Thioesterase-Gehalts. 94 Abbildung 3-4: Western blots zur optimalen Expressionstemperatur.
95 Abbildung 3-5: Analytik-Ergebnisse zur Bestimmung des geeignetsten Mediums. 96 Abbildung 3-6: Western blots zur Ermittlung der optimalen Rhamnosekonz.
97 Abbildung 3-7: Verlauf der Wachstumskurve des Wirtsstamms BW25113∆fadD.
98 Abbildung 3-8: Ergebnisse zur Bestimmung des optimalen Induktionszeitpunkts.
99 Abbildung 3-9: Fettsäureüberschüsse der Ansätze I bis V.
103 Abbildung 3-10: Zeitlicher Verlauf verschiedener Prozessparameter.
104 Abbildung 3-11: Fettsäureüberschüsse der Ansätze I bis VI.
106 Abbildung 3-12: CO-Differenzspektrum.
108 Abbildung 3-13: CO-Differenzspektrum.
111 Abbildung 3-14: Schema zur Oberflächenpräsentation von Proteinen.
+
117 Abbildung 3-15: Chromatogramm der FatB2 -Aufreinigung.
118 Abbildung 3-16: Dot blot aus der Nickelaffinitäts-Aufreinigung von FatB2+.
119 Abbildung 3-17: Dot blots zweier Ionentauscheraufreinigungen.
120 Abbildung 3-18: Dot blot nach der Ionentauscheraufreinigung.
120 182
Abbildung 6-1: Plasmidkarte von pBAD18-CYP.
168 Abbildung 6-2: Plasmidkarte pBAD18-mtKAS.
169 Abbildung 6-3: Plasmidkarte von pCT302-FatB2.
170 Abbildung 6-4: Plasmidkarte von pJeM1-FatB2.
171 Abbildung 6-5: Plasmidkarte von pJeM1-mtKAS.
172 Abbildung 6-6: Plasmidkarte von pKiM1.
173 Abbildung 6-7: Plasmidkarte von pKiM2.
174 Abbildung 6-8: Plasmidkarte von pKiM4.
175 Abbildung 6-9: Verlauf von Wachstumskurven.
179 Abbildung 6-10: Verlauf von Wachstumskurven.
180 Abbildung 6-11: Softagar-Assay.
181 Abbildung 6-12: Präzipitat des Thioesterase-Konstrukts.
181
183
8 Tabellenverzeichnis
Tabelle 1-1: Fettsäureanteile in Kokosfett und in Schweineschmalz.
28 Tabelle 1-2: Klassifizierung von Thioesterasen.
37 Tabelle 1-3: Klassifizierung von 3-Ketoacyl-ACP-Synthasen.
45 Tabelle 2-1: Stämme.
59 Tabelle 2-2: Plasmide.
60 Tabelle 2-3: Verwendete Primer.
62 Tabelle 2-4: Zusammensetzung eines Ligation-Ansatzes.
69 Tabelle 2-5: Zusammensetzung der PCR-Ansätze.
70 Tabelle 2-6: Zyklenverlauf der PCR-Ansätze.
70 Tabelle 2-7: Zusammensetzung des Thioesterase-Aktivitätsassay.
80 Tabelle 3-1: Fettsäuren in Ansatz II-Kulturen.
92 Tabelle 3-2: Fettsäuren in Ansatz III-Kulturen.
100 Tabelle 3-3: Fettsäuren in Ansatz IV-Kulturen.
101 Tabelle 3-4: Fettsäuren in Ansatz V-Kulturen.
102 Tabelle 3-5: Fettsäuren in Ansatz VI-Kulturen.
105 Tabelle 3-6: Konzentrationen beim sequentiellen Zweizellsystem.
109 Tabelle 3-7: Konzentrationen beim sequentiellen Zweizellsystem.
111 Tabelle 3-8: Konzentrationen beim parallelen Einzellsystem.
112 Tabelle 3-9: Konzentrationen beim sequentiellen Einzellsystem.
113 Tabelle 3-10: Konzentrationen beim parallelen Einzellsystem im Bioreaktor.
113 Tabelle 3-11: Konzentrationen sequentiellen Einzellsystem im Bioreaktor.
114 Tabelle 6-1: Verwendete Chemikalien
160 Tabelle 6-2: Shapiro-Wilk-Ergebnisse für die Fettsäureanalysen aus Kapitel 3.1.
176 Tabelle 6-3: Levene-Test-Ergebnisse für die Fettsäureanalysen aus Kapitel 3.1.
177 Tabelle 6-4: Signifikanzwerte des t-Tests
178 184