Aldehyd-Dehydrogenase aus Leber, ein Enzym des

229
ALDEHYD-DEHYDROGENASE AUS LEBER
Beobachtete Drudeänderungen:
At [Min.]
h [mm]
10
10
10
+ 20
+ 20,5
+ 20,5
Der pH-Wert der Ansätze war 6,9. Die Wellenlänge
des Meßlichtes betrug X = 366 m// und die Temperatur
des Thermostaten 2 0 ° C.
Der Logarithmus der Lichtschwächung veränderte sich
folgenderm aßen:
u ngew aschene W ürzezellen
+ 61
t
[Min.]
x co 2 = + 117 mm3, Q £ '= 1 2 0 ,8 .
A ln l?
i
A ln
//Mole Glucose,
//Mole MgCl2 ,
//Mole ATP,
//Mole TPN,
y Zwischenferment
0,184
0,238
0,305
0,362
A ln
i
A ln l°
Ät
i
0,030
0,031
0,030
0,031
0,030
0,076
0,114
0,147
0.186
0,224
0,019
0,019
0,018
0,019
0,019
A ln *°
1
0,0304 min- 1
l
At
~
0,0188 min- 1
A \n (iji)
1
At
mm3 Zellen
U7
Ungewaschene Würzezellen:
W = 7,6 • 10 - 3 • m in - 1 • mm - 3 .
Gewaschene Zellen: W = 4,7 • 1 0 - 3 • m in - 1 • mm - 3 .
Fräulein M a r i a S c h r a d e r und Fräulein L is e l o t t e
danke ich für ihre Mithilfe bei der Durchfüh­
rung der Experimente und der D e u t s c h e n F o r ­
s c h u n g s g e m e i n s c h a f t für die großzügige ap­
parative Unterstützung dieser Arbeiten.
P
sowie 0 , 2 cm 3 Suspension mit 4 mm 3 aufgeschlossenen
Hefezellen.
0 ,1 2 0
6
8
10
12
At
Die 1-cm-Küvette enthielt 2 , 8 cm 3 Trihydroxymethylaminomethan-HCl-Puffer (0,1-m.) mit:
25
25
3
2,2
40
4
A ln
At
i
Protokoll 111
Die Messung der Hexokinase-Aktivität.
Bäckerhefe, die 15 Stdn. lang in Würze gewachsen
war, wurde abzentrifugiert und in flüssigen Stickstoff
eingetragen. Eine zweite Probe wurde auf der Zentri­
fuge mit ra/20-NaHC0 3 und rc/20-KH2P 0 4 mit n / 18Glucose gewaschen, abzentrifugiert und ebenfalls unter
flüssigen Stickstoff gebracht. Nach einer Verweildauer
von 1 Stde. tauten die Hefen durch Überführen in ein
Eisbad langsam auf. 0,2 cm 3 jeder Gefrierhefe wurden
mit eiskaltem bidest. Wasser auf 5 cm 3 aufgefüllt und
0,2 cm 3 dieser Suspension zum optischen Test benutzt.
Optischer Test:
gew aschene Zellen
etersen
A ldehyd-D ehydrogenase aus Leber, ein Enzym
des Früctosestoffwechsels
Von A.
H
olldo rf,
C.
H
o lldo rf,
S. S
c h n e id e r
und
H . H
olzer
Aus dem Physiologisch-Chemischen Institut der Universität Freiburg im Breisgau
(Z. Naturforsdig. 14 b, 229—234 [1959] ; eingegangen am 2. Dezember 1958)
1. Bei der 16 —18-fadien Anreicherung der DPN-abhängigen Aldehyd-Dehydrogenase aus Rinder­
leber bleibt das Aktivitäts-Verhältnis des Enzyms mit Acetaldehyd und Glycerinaldehyd konstant.
2. Neben diesem Befund sprechen auch die Abhängigkeit der Dehydrierungs-Geschwindigkeit der
beiden Aldehyde vom pH , das Ausmaß der Hemmung durch verschiedene Hemmstoffe und die
Geschwindigkeit der Hydrierung von DPN bei einzelnem und gleichzeitigem Umsatz von Acetaldehyd
und Glycerinaldehyd für eine Dehydrierung der beiden Aldehyde durch ein und dasselbe Enzym.
3. Da das Enzym d - und L-Glycerinaldehyd dehydriert und die M i c h a e l i s - Konstante mit
Glycerinaldehyd 2 ,9 •IO-4 M ol/i beträgt, kann das gereinigte Enzym zur spektrophotometrisdien
Bestimmung von DL-Glycerinaldehyd benützt werden.
4. Wahrscheinlich ist das Enzym für den weiteren Umsatz des beim Fructoseabbau in der Leber
anfallenden D-Glycerinaldehyds verantwortlich. Letzterer wird unter Beteiligung von DPN zu D-Glycerinsäure oxydiert, die dann in einer früher beschriebenen ATP-abhängigen Reaktion zu D -Phosphoglycerinsäure phosphoryliert wird und damit in den Abbauweg der Glykolyse einmündet.
In einer früheren A rb e it 2 beschrieben w ir eine
D-Glyceratkinase aus R attenleber und wiesen auf
eine eventuelle Rolle dieses Enzym s im Stoffwechsel
der F ructose in d er L eber h in : nach L e u t h a r d t und
M ita rb b . 5 entsteht u n ter E inw irkung der Phosphofru ctald o lase aus F ructose-1-phosphat D-Glycerin-
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230
A. HOLLDOHF, C. HOLLDORF, S. SCHNEIDER UND H. HOLZER
aldehyd, der in einer D P N -abhängigen * R eaktion
w eiter zu D-Glycerat oxydiert w erden kann. Durch
die K inase w ird das D-Glycerat in P hosphoglycerat
ü b erfü h rt und dam it in den G lykolyseweg ein ­
geschleust. L am pr e c h t und H e i n z 4 teilten kürzlich
mit, daß die D P N -abhängige D ehydrierung von Gly­
cerinaldehyd zu D-Glycerat in R attenleber durch die
b ereits 1949 von R a c k e r 8 beschriebene AldehydD ehydrogenase erfolgt. In der vorliegenden A rbeit
w ird über U ntersuchungen an der A ldehyd-D ehydro­
genase aus R inderleber berichtet, die diesen Befund
bestätigen und ergänzen.
M ethoden
1. R e i n i g u n g d e s E n z y m s u n d
Aktivitätsbestimmung
Aldehyd-Dehydrogenase wurde in Anlehnung an die
Vorschrift von R a c k e r 8 aus Rinderleber präpariert. Die
Aktivität des Enzyms wurde im o p tisch en T e s t nach
W a r b u r g verfolgt. Testansatz: in einem Gesamtvolu­
men von 3,0 ml (bei einer Schichtdicke von 1,0 cm)
waren enthalten: 2,0 • 10 - 4 Mol NatriumpyrophosphatPuffer ph 9,2; 9 ,0 -1 0 ~ 7 Mol D P N ; 1 ,0 -IO “ 5 Mol
Acetaldehyd bzw. Glycolaldehyd oder 2 , 0 - I O - 5 Mol
D L -G lycerin ald eh yd ; 2,0- 10_ 6 Mol Ä th y le n d ia m in te tr a acetat; 0 , 1 —1 , 0 mg Enzymprotein. Die Aktivität 1 be­
sitzt die Proteinmenge, die im vorstehenden Testansatz
bei 366 mju und 20 —23° C in 60 sec eine ExtinktionsÄnderung von 0 , 0 0 1 bewirkt. Proteinbestimmungen er­
folgten nach W a r b u r g und C h r i s t i a n 1 0.
2. B e s t i m m u n g v o n D L - G l y c e r i n ­
aldehyd
DL-Glycerinaldehyd wurde im optischen Test mit ge­
reinigter Aldehyd-Dehydrogenase bestimmt. Testansatz:
Gesamtvolumen 2 ,0 m l; Schichtdicke 1,0cm : in der
Küvette sind enthalten: 5,0 • 10 ~ 5 Mol TRIS-HCl-Puffer ph 7,4; 1 ,0 -IO - 6 Mol DPN ; 1,0 mg Enzym; 0,4
bis 4,0 • 10 - 7 Mol d l - bzw. D-Glycerinaldehyd. Der Um­
satz von Glycerinaldehyd ergibt sich aus der durch Re­
duktion von DPN bedingten Zunahme der Extinktion
bei 366 m ^. Die Ablesungen erfolgten gegen eine Blind­
küvette, die alle Substanzen bis auf das zu bestimmende
Substrat enthielt. Nach Ablaufen der GlycerinaldehydBestimmungen wurden die Testansätze durch 5 min
Kochen enteiweißt und dann auf gebildetes D-Glycerat
untersucht.
3. B e s t i m m u n g
von D- G l y c e r a t
wurde durch die für die D-Form spezifi­
sche Glyceratkinase aus Rattenleber in Phosphoglyce­
rat überführt und dieses dann durch kristallisierte Gly­
kolyse-Enzyme über Brenztraubensäure zu Milchsäure
umgesetzt. Die Menge des umgesetzten D-Glycerats ent­
sp rich t der Abnahme der Extinktion bei 366 m ^ durch
Oxydation von DPNH bei der Reduktion der aus Glycerat gebildeten Brenztraubensäure zu Milchsäure:
D -G lycerat
D-Glycerinsäure + ATP ■ 3-Phosphoglycerinsäure * + ADP
3-Phosphoglycerinsäure • ■2-Phosphoglycerinsäure
2-Phosphoglycerinsäure • ■Phosphoenolbrenztraubensäure
Phosphoenolbrenztraubensäure + ADP
Brenztraubensäure + DPNH
Brenztraubensäure + ATP
• Milchsäure 4- DPN
Summe: D-Glycerinsäure + DPNH —> Milchsäure + DPN
Testansatz: Gesamtvolumen 3,0 ml; Schichtdicke
1,0 cm. Der Ansatz enthält: 5,0 ■10 ~ 4 Mol TRIS-HC1Puffer p h 7,4; 3,0 • 10 ~ 5 Mol M gS0 4 ; 1 , 5- I O “ 5 Mol
KCl; 2 , 0 - I O “ 5 Mol A TP; 7,0 • 10 ~ 7 Mol D PN H ;
1,5 ml der D-Glycerat-Probe (0,5 • 10 - 7 bis 2,5 • 10 ~ 7
Mol D-Glycerat enthaltend) ; 4 /iig Milchsäure-Dehydrogenase; 40 //g Pyruvatkinase aus Muskel; 40 jug Enolase; 3 5 0 //g Phosphoglycerat-Mutase; 5 0 0 //g D-Glyceratkinase. Die Ablesungen erfolgten gegen eine Blind­
küvette, die an Stelle der D-Glycerat-Probe Wasser ent­
hielt. Phosphoglycerat-Mutase wurde nach R o d w e l l ,
T o w n e und G r i s o l i a 9 aus Hefe k r is ta llisie r t; D -G lyceratkinase wurde nach der früher angegebenen V orschrift2
* A n m. b. d. K o r r . : Eventuell entsteht bei dieser Re­
aktion nicht 3- sondern 2-Phosphoglycerinsäure.
aus Rattenleber gereinigt; die übrigen Glykolyseenzyme
wurden von der Firma Boehringer (Mannheim) be­
zogen. Beispiele für den Reaktionsablauf der Glycerin­
aldehyd- und der D -G lycerat-B estim m u n g sind in den
Abb. 3 und 4 gegeben.
Ergebnisse
1.
A k t i v i t ä t des E n z y m s mit A c e t ­
a l d eh yd , G l y c e r i n a l d e h y d und Glykoaldehyd auf verschiedenen Stufen
der Reinigung
W ährend der R einigung des Enzyms w urde die
A ktivität m it G lycerinaldehyd, G lykolaldehyd und
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23J
ALDEHYD-DEHYDROGENASE AUS LEBER
Acetal dehyd
Gesamtspez.
aktivität
Aktivi- in % des
tä t
j Roh­
extraktes
Quotienl en der
spez. Ak tivitäten
Gesamtaktivität Acetalde- Acetaldein % des hyd/Gly- hyd/GlyRoh­
kolaldecerinalextraktes
hyd
dehyd
Protein
[mg/ml]
Gesamt­
aktivität
in % des
Rohextraktes
Glvkolaldehyd
1
Volumen
[ml]
Rohsaft
Äthanol Fällung
NucleinsäureFällung
AmmonsulfatFällung
Glycerinaldehyd
spez.
Aktivi­
tä t
150
39
29
100
51
100
50
100
0,58
0,57
60
20
72
52
137
55
123
50
0,58
0,53
spez.
Aktivitä t
24
3,2
240
14
421
11
390
10
0,62
0,57
5
5,9
490
9
830
9
900
9
0,50
0,60
Tab. 1. Aktivität des Enzyms mit verschiedenen Substraten.
A cetaldehyd verfolgt. In T ab. 1 sind die AktivitätsB estim m ungen zusam m engestellt.
Aus T ab. 1 erg ib t sich, daß das V erhältnis
d er spezifischen A ktivitäten au f allen Stufen der
R einigung nahezu konstan t ist. D ies spricht dafür,
daß die O xydation der drei A ldehyde durch ein und
dasselbe Enzym erfolgt. E ine w eitergehende R eini­
gung des Enzym s w ar wegen d er geringen H altb ar­
keit nicht zu erreichen. Zusatz von G lycerin, Cystein,
G lutathion oder D ithio p ro p an o l erbrachten keine
S tab ilisierung des Enzym s.
2
. p H- A b h ä n g i g k e i t
der
3. H e m m u n g u n d A k t i v i e r u n g
Enzymaktivität
Im üblichen A ktivitätstest (s. A bschnitt „M etho­
d en“ ) , jedoch ohne Z usatz von Ä thylendiam intetraacetat, w urde die E nzym aktivität durch die in T ab. 2
zusam m engestellten Substanzen gehem m t.
Hemmung der Aktivität des
Enzyms in % von Kon­
trollen ohne Hemmstoff
Hemmstoff'
Acetaldehyd
als Substrat
Glycerinaldehyd als
Substrat
N atriumarsenit
0,83 • 10- 3 Mol/i
1,67 • 10^ Molß
3,33 • ICH Molß
13
30
43
17
37
51
Jodacetat
1,67 • 10-» Mol/i
3,33 • ICH Mol/i
24
55
33
63
p-Chlor-mercurisulfonsäure
2,0 • 10-« Mol/Z
5,0 • 10-« Mol/Z
1,0 • 10- 5 Mol/Z
28
64
76
52
77
87
Salyrgan
1,5 • 10-® Mol/Z
3,0 • ICH Mol/Z
35
77
42
83
20
22
36
59
36
58
Reaktion
U nter den im A bschnitt „M ethoden“ angegebenen
B edingungen w urde die A bhängigkeit der D ehydrie­
ru n g von A cetaldehyd und G lycerinaldehyd vom
P H - W e r t verfolgt. Als P uffer dienten T riäthanolam inHC1 im pu-Bereich von 7,0 —8 , 8 und D iäthanolam in-HCl im pn-Bereich von 8 , 8 — 10,5 in K onzen­
tratio n en von 0,1 Mol/Z (A bb. 1) : Es zeigt sich, daß
Abb. 1. pH-Abhängigkeit der Dehydrierungs-Geschwindigkeit
von Acetaldehyd und Glycerinaldehyd.
die pn-A bhängigkeit fü r beide S u bstrate parallel ver­
läuft. D as pu-O ptim um liegt bei 9,2.
der
Tetraäthylthiuram disulfid (Antabus)
0,83 • 10-« Mol/Z
1,67 • ICH Mol/Z
3,33 • 10-« Mol/Z
Tab. 2. Wirkung von Hemmstoffen auf die
Aldehyd-Dehydrogenase.
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232
A. HOLLDORF, C. HOLLDORF, S. SCHNEIDER UND H. HOLZER
Aus T ab. 2 geht hervor, daß die H em m ung
der E nzym aktivität durch T etraäthylthiuram disulfid
(A n tab u s), das als charakteristischer Hemmstoff
fü r A ldehyd-D ehydrogenasen g ilt1’7, m it A cet­
aldehyd und G lycerinaldehyd als S u b strat völlig
gleich ist. D ie H em m ung des A cetaldehyd-U m satzes
durch A rsenit, Jodacetat, S alyrgan und p-Chlorm e rcurisulfonsäure ist etwas geringer als die H em ­
m ung des G lycerinaldehyd-U m satzes. D ies könnte
dadurch bedingt sein, daß das Enzym zu Acet­
aldehyd eine g rößere A ffinität besitzt als zu Gly­
cerinaldehyd. Auch die H em m versuche sprechen
dem nach fü r eine D ehydrierung beider S ubstrate
durch dasselbe Enzym .
E ine B eschleunigung der R eaktionsgeschw indig­
keit durch 0 , 0 2 M ol// N a 2 H P 0 4 oder N a 2 H A s0 4 ,
die auf einen p h o sphatabhängigen R eaktionsm echa­
nism us wie bei der T riosephosphat-D ehydrieru n g
hingew iesen hätte, w ar m it DL-Glycerinaldehyd als
S ub strat nicht zu beobachten.
Substrat
Acetaldehyd
Glykolaldehyd
d l - Glycerinaldehyd
Beim gleichzeitigen E insatz von A cetaldehyd und
G lycerinaldehyd in dem unter „M ethoden“ angege­
benen A ktivitätstest ist die Reaktionsgeschw indigkeit
Abb. 2. Gleichzeitige Dehydrierung von Acetaldehyd und Gly­
cerinaldehyd. Substratkonzentration jeweils 0,003 Mol//.
dieselbe wie m it A cetaldehyd allein (s. A bb. 2 ). Die
schneller ablaufende D ehydrierung des G lycerin­
aldehyds w ird durch die D ehydrierung des Acet­
aldehyds, zu dem das Enzym eine m ehr als zehnmal
höhere A ffinität besitzt (s. M i c h a e l i s - K onstan­
ten in T ab. 3 ) , zurückgedrängt. D ieser Versuch
spricht ebenso wie die vorangehend geschilderten
IO- 5
< 5 -IO - 5
= 2,9 • 10- 4
< 2
Tab. 3. M i c h a e l i s - Konstanten
Versuche fü r einen U m satz von G lycerinaldehyd
und A cetaldehyd an ein und dem selben Enzym .
5. M i c h a e l i s - K o n s t a n t e n
M essungen der R eaktionsgeschw indigkeiten bei
verschiedenen S u b stratk o n zen tratio n en w urden nach
L in e w e a v e r u nd B u r k 6 ausgew ertet (s. T ab. 3 ) . F ü r
A cetaldehyd und G lykolaldehyd liegen die K onzen­
tratio n en für halbm axim ale R eaktionsgeschw indig­
keit so tief, daß eine genaue E rfassu n g im optischen
Test nicht ohne w eiteres m öglich ist.
6
4. G l e i c h z e i t i g e r U m s a t z v o n
A c e t a l d e h y d u n d G 1y c e r i n a 1d e h y d
Zm
[Molfl]
. Stereospezifität der D ehydrierung
v o n G 1y c e r i n a 1d e h y d
Mit gereinigter A ldehyd-D ehydrogenase w urde
der Umsatz von d l - w ie auch von D-Glycerinaldehyd
m it überschüssigem D PN und den R eak tio n sab lau f
begrenzenden
K onzentrationen
G lycerinaldehyd
untersucht. D en A blauf eines solchen V ersuches gibt
Abb. 3 w ieder. Die bei q u an titativ em U m satz der
Abb. 3. Dehydrierung von d - (Kurve A) und DL-Glycerinaldehyd (Kurve B). Einzelheiten s. Text.
S ubstrate zu erw artende E xtinktions-Z unahm e hätte
0 ,330 betragen. W ie aus den K urven ersichtlich, w er­
den D- und DL-Glycerinaldehyd zu ü b er 75% um ­
gesetzt (s. auch Tab. 4 ) . D as Enzym d eh y d riert dem ­
nach sowohl D- wie L-G lycerinaldehyd. V erm utlich
beruhen die relativ zur T h eorie zu geringen Extink-
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ALDEHYD-DEHYDROGENASE AUS LEBER
tions-Zunahm en auf V erunreinigungen d er eingesetz­
ten G lycerinaldehyd-P räparate.
D as durch D ehydrierung von d - bzw. DL-Glycerinaldehyd gebildete D-Glycerat w urde d an n in einer
P ro b e der durch Kochen abgestoppten und enteiw eißten V ersuchsansätze bestim m t. D a die in diesen
Abb. 4. Bestimmung von D-Glycerat. Einzelheiten s. Text.
T esten verw endete D -Glyceratkinase spezifisch D-Glycerat u m se tz t2, w ird in diesen B estim m ungen das
durch D ehydrierung von L-G lycerinaldehyd gebildete
L-Glycerat nicht erfaß t. Dieses zeigt A bb. 4 : in
K urve A ist die U m setzung des G lycerats w ieder­
gegeben, das durch D ehydrierung von D-Glycerinaldehyd gebildet w urde, w ährend K urve B die Um-
233
D-G lycerinaldehyds eine E xtinktions-Ä nderung von
0 ,1 2 7 zu erw arten, w ährend in Versuch B au f G rund
d er Bestim m ung von DL-Glycerinaldehyd n u r die
h alb e E xtinktions-Ä nderung (0 ,0 6 3 ) zu erw arten
w ar, da die D-Glyceratkinase n u r gebildetes D-Gly­
cerat zu erfassen verm ag. Auch dieser V ersuch zeigt
dem nach, daß die D ehydrogenase sowohl m it d - wie
m it L-G lycerinaldehyd arbeitet, w ährend die K inase
n u r D-G lycerinsäure phosphoryliert.
T ab. 4. gibt eine Zusam m enstellung m eh rerer Be­
stim m ungen von G lycerinaldehyd und D-Glycerat
w ieder. Bei den optischen B estim m ungen w urden
stets etwas g eringere M engen gefunden, als es der
E inw aage entspricht. D ies d ürfte auf V eru n rein ig u n g
bzw. P olym erisation der eingesetzten Substanzen
zurückzuführen sein. Aus den E rgebnissen geht je ­
doch ein d eu tig hervor, daß d - und DL-Glycerin­
aldehyd in gleicher W eise d eh y d riert w erden. Die
A ldehyd-D ehydrogenase ist som it nicht fü r d - oder
L-G lycerinaldehyd stereospezifisch eingestellt.
Diskussion
Tab. 4. Bestimmung von Glycerinaldehyd und des daraus mit
Aldehyd-Dehydrogenase gebildeten D-Glycerats. Die Prozent­
angaben beziehen sich beim Glycerinaldehyd auf die Ein­
waage ( = 100%) und beim D-Glycerat auf die umgesetzten
Mengen Glycerinaldehyd ( = 100%).
D as V erhalten d er A ldehyd-D ehydrogenase gegen­
ü b er verschiedenen S ubstraten auf verschiedenen
S tufen d er R einigung, die gleiche A bhängigkeit der
D ehydrierungs-G eschw indigkeit von G lycerinaldehyd
und A cetaldehyd vom pu sowie die E rgebnisse der
H em m versuche und d er V ersuche ü ber den gleichzei­
tigen U m satz von G lycerinaldehyd und A cetaldehyd
lassen den Schluß zu, daß A cetaldehyd, G lykolaldehyd
u n d G lycerinaldehyd vom gleichen Enzym um gesetzt
w erden. D as Enzym ist som it eine unspezifische
A ldehyd-D ehydrogenase. Nach R a c k e r 8 setzt es
n eben den von uns untersuchten A ldehyden auch
F o rm ald eh y d , P ro p io n ald eh y d , B utyraldehyd und
Isovaleraldehyd um . A uf G rund dieser U nspezifität
bezüglich des S ubstrates und besonders au f G rund
d er M i c h a e l i s - K onstanten, die m it A cetaldehyd
und m it G lykolaldehyd wesentlich kleiner sind als
m it G lycerinaldehyd, sollte das Enzym nicht als
„G lycerinaldehyd-D ehydrogenase“ 4, sondern, wie
von R ac k e r v orgeschlagen8, w eiterhin als „A ldehydD ehy d ro g en ase“ bezeichnet werden.
Setzung von D-Glycerat w iedergibt, das bei E insatz
von DL-Glycerinaldehyd gebildet w urde. In V er­
such A w ar auf G rund der optischen B estim m ung des
D a die M i c h a e l i s - K onstante fü r G lycerin­
aldehyd 2,8 • 1 0 - 4 M ol// b eträg t und die M i c h a e ­
l i s - K onstante d er L eberalkohol-D ehydrogenase fü r
G lycerinaldehyd etwa um zwei Z ehnerpotenzen g rö ­
E ingesetzte Mengen
(aus der Einwaage
berechnet)
DL-GlyD-Glycerincerinaldehyd
aldehyd
[Mole-107] [Mole-107]
U m gesetzte
Mengen
G lycerinaldehyd
(auf Grund der
R eduktion
von D PN )
[Mole • 107]
(%)
2,00
4,00
4,00
—
—
—
_
—
—
2,5
4,0
2,0
1,50
3,58
3,16
2,12
3,30
1,67
(75)
(89)
(79)
(85)
(83)
(88)
Gefundene
Mengen
D-Glycerat
(auf Grund der
O xydation von
D P N H im Test
m it D-Glyceratkinase und G ly­
kolyseenzym en)
[Mole • 107]
(% )
0,66
1,79
1,58
1,64
2,78
1,36
(43)
(37,4)
(36,6)
(77)
(84)
(82)
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W. MENKE UND E. JORDAN
234
ß er i s t 3, kann m an verm uten, daß ein w esentlicher
Teil des beim F ructoseabbau in der L eber entstehen­
den G lycerinaldehyds nicht über G lycerin w eiter
um gesetzt w ird, sondern zu o-Glycerat dehydriert
Abkürzungen: DPN = Diphosphopyridinnucleotid, DPNH
= reduziertes Diphosphopyridinnucleotid; ATP = Adenosintriphosphat; ADP = Adenosindiphosphat; TRIS-Trishydroxymethylaminomethan.
1 W. D. G r a h a m , J. Pharmacy Pharmacol. 3, 160 [1951].
2 H . H o l z e r u. A. H o l l d o r f , Biochem. Z. 329, 283 [1957]
3 H . H o l z e r u. S . S c h n e id e r , Klin. Wschr. 33, 1006 [1955].
4 W. L a m p r e c h t u . F. H e in z , Z. Naturforschg. 13 b, 464
[1958].
5 F. L e u t h a r d t , E. T e s t a u . H. P. W o l f , Helv. chim. Acta 36,
.
w ird. Letzteres w ird dann über P h osp h oglycerat in
den G lyk olysew eg eingeschleust.
D er D e u t s c h e n F o r s c h u n g s g e m e i n s c h a f t
danken w ir für Sachbeihilfen.
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227 [ 1953]; H. P. W o l f u. F. L e u t h a r d t , Helv. chim. Acta
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O. W a r b u r g u . W . C h r i s t i a n , Biochem. Z. 310, 384 [1941].
Uber das lamellare Strukturproteid der Chloroplasten
von Allium porrum
(1. M itteilu n g ü b e r lam ellare S tru k tu rp ro te id e )
Von
W
il h e l m
M
enke
und
E
v a m a r ia
Jordan
Aus dem Botanischen Institut der Universität zu Köln
(Z. Naturforschg. 14 b, 234—240 [1959] ; eingegangen am 1. Dezember 1958)
Die präparative Darstellung des lamellaren Strukturproteids der Chloroplasten wird beschrieben.
Es ist in Wasser und Salzlösungen unlöslich und enthält 13,8% Stickstoff und 11% Kohlenhydrate. Das
lamellare Strukturproteid ist zu 3U in einem warmen Phenol-Wasser-Gemisch unlöslich. Etwa 6% des
Proteids lösen sich in Phenol. Die Kohlenhydrate werden bei der Phenolbehandlung nur zum Teil
abgespalten. Die Aminosäure-Zusammensetzung des lamellaren Strukturproteids wird quantitativ
bestimmt. Nach der Methode von S a n g e r wurden 9 verschiedene amino-endständige Reste fest­
gestellt. Mittels Hydrazinolyse nach A k a b o r i lassen sich 11 carboxyl-endständige Aminosäuren
nachweisen. Das lamellare Strukturproteid wird als Komplex verschiedener Fermentproteine aufgefaßt.
W enn m an C hloroplasten m it M ethanol und Ä ther
extrah iert, so verbleibt ein Rückstand, der 60 bis
75% d er w asserfreien C hloroplasten ausm acht. Aus
diesem lassen sich m it w äßrigen L ösungsm itteln
noch bis zu 25% P roteine und niederm olekulare V er­
b indungen herauslösen. D er ungelöste A nteil ist das
lam ellare S tru k tu rp ro teid der C hloroplasten. In lokkerer B indung m it L ipiden ist dieses S tru k tu rp ro teid
das B aum aterial der Lam ellensystem e der C hloro­
plasten. Es ist das T räg erp ro teid des Chlorophylls
und der C arotinoide. D ie lam ellare S tru k tu r des
P ro teid s bleibt bei schonendem V orgehen bei der
E xtrak tio n der L ipide und w asserlöslichen V erb in ­
dungen erhalten.
Der lamellare Feinbau der Chloroplasten hatte sich
zuerst aus ihren polarisationsoptischen Eigenschaften
ableiten lassen. Diese ließen sich durch Annahme eines
Systems, bestehend aus Lipidlamellen und Proteinlamel­
len mit eingelagertem Wasser, deuten1. Die Dicke der
Lamellen, die auch heute noch nicht genau bekannt ist,
konnte erstmalig an Hand von elektronenmikroskopi­
schen Aufnahmen auf 1 0 0 Ä geschätzt w erden2. Die
Unlöslichkeit der Hauptmenge der Chloroplasten-Proteine in wäßrigen Lösungsmitteln wurde erkannt, als es
gelungen war, Chloroplasten in einer zur Analyse aus­
reichenden Ausbeute zu erhalten3.
D arstellung und Reinigung des lamellaren
Strukturproteids
F ü r die vorliegenden U ntersuchungen w urden die
C hloroplasten von A lliu m p o rru m gew ählt, weil sie
keine S tärke enthalten. Um m öglichst hohe A usbeu­
ten zu erzielen, w urde au f eine v o rh erig e Isolierung
m orphologisch in ta k te r C hloroplasten verzichtet und
so fo rt auf das in W asser unlösliche L ipoproteid h in ­
gearb eitet, welches n u r noch w enig wasserlösliche
K om ponenten enthält. N ach mechanischem Aufschluß
erfolgte die Iso lieru n g des L ipoproteids der Chloro­
p lasten durch fra k tio n iertes Z entrifugieren und an1 W. M e n k e , Kolloid-Z. 85, 256 [1938].
2 W. M e n k e , Protoplasma 35, 115 [1941].
3 W. M e n k e , Hoppe-Seyler’s Z. physiol. Chem. 257, 43
[1938].
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