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Wiener Tierärztliche Monatsschrift – Veterinary Medicine Austria
103 (2016)
Aus der Abteilung Fischmedizin, Universitätsklinik für Geflügel und Fische, Department für Nutztiere und öffentliches Gesundheitswesen in der Veterinärmedizin, der Veterinärmedizinischen Universität Wien
Diagnose der Infektiösen Hämatopoietischen Nekrose in
Österreich, 1994–2014: Unterschiedliche Symptomatik,
Inzidenz und Infektiosität des Virus in verschiedenen
Fischzell-Linien. Fallbericht und Originalarbeit
O. SCHACHNER*, E. LICEK, A. DRESSLER, M. SALEH und M. EL-MATBOULI
eingelangt am 25. Jänner 2016
angenommen am 19. Oktober 2016
Schlüsselwörter: Epitheloid, fibroblastoid, ZellkulturAdaptierung, N-Acetylglucosamin, SchwefelbrückenBindung, Mykoplasmen.
Zusammenfassung
Das Krankheitsbild der anzeigepflichtigen Infektiösen
Hämatopoietischen Nekrose war in österreichischen
Fischbeständen von Fall zu Fall und individuell unterschiedlich. Nach der ersten Epidemie 1994 war der
Erreger in Österreich nicht mehr oft nachzuweisen. Der
Nachweis erfolgte stets durch Virusanzucht in Zellkultur.
Regelmäßig war das Rhabdovirus nur in epithelartigen
Fischzell-Linien zu isolieren, Fibroblasten zeigten Resistenz. Von dieser Regel abweichend waren hingegen
sechs verschiedene Zell-Linien für die letzte Virusprobe aus 2014 empfänglich. Ähnlich hohe Infektiosität
in verschiedenen Zellmorphotypen war bisher nur in
Ausnahmefällen beim jährlichen Ringversuch zum Vergleich der Zellkultur-Empfänglichkeiten festzustellen.
In weiteren, eigenen Zellkulturvergleichen wurde nach
Ursachen der unterschiedlichen Virus-Empfänglichkeit
und -Infektiosität gesucht. Die API ZYM-Reaktionen
verschiedener Zellen und ihr Lektin-Bindungsmuster
bei Infektion lassen ihre Stoffwechselaktivität und die
Verfügbarkeit von N-Acetylglucosamin wesentlich
erscheinen. Die Empfänglichkeit der enzymatisch
aktiveren epitheloiden Zellen kann durch Zugabe
von D-Glukose ins Kulturmedium herabgesetzt und
durch Nährstoffentzug gesteigert werden. Eine höhere
Mercaptan-Toleranz der fibroblastoiden Zellen lässt
auf höheren Gehalt an Schwefelbrücken-Bindungen
schließen, die der Virusinfektion und auch dem bakteriellen Abbau mehr Widerstand entgegensetzen. Doch
Mykoplasmen können vermutlich stabile Glykoproteine
aufschließen und Virusempfänglichkeit vermitteln.
Empfängliche fibroblastoide Zellen und embryonale
Lachszellen fördern unspezifische Virus-Infektiosität.
Keywords: epithelioid, fibroblastoid, cell culture
adaptation, N-acetylglucosamine, disulfide bonds,
Mycoplasma.
Summary
Diagnosis of Infectious Hematopoietic Necrosis
in Austria, 1994–2014: Varying fish pathology,
occurrence and infectivity of the virus in various
fish cell lines.
Introduction
Up to 2015 cell culture isolation of Infectious Hematopoietic Necrosis Virus (IHNV) was obligatory for
the surveillance of the related notifiable fish disease.
The EU diagnostic guidelines recommended the use
of distinct epithelioid cell lines. The final case of IHN
in Austria in 2014 showed an unusual susceptibility of
fibroblastoid cells. Reasons for the different affinities
of IHNV to various cell lines are suggested.
Materials and Methods
IHNV was isolated from farmed rainbow trout. Six
cell lines were used for virus cultivation. The impact
of adaptation to cell culture on the infectivity of IHNV
was assessed by crosswise titration of selected isolates
from various cell lines. Infectivity was determined in
cell lines grown in normal, glucose-supplemented and
diluted culture medium. Enzymatic activities were
visualized on API ZYM test strips. The toxicity of mercaptane and the binding of the N-acetylglucosaminespecific lectins Bandeiraea simplicifolia and wheat germ
agglutinin (WGA) were inspected microscopically. Mycoplasma were stained with diamidino phenylindole.
Results
The consequences of IHN infection varied between
individual rainbow trout. IHNV has been detected in
*E-Mail: [email protected]
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Austria less often since 1994. For routine diagnostics
as well as in annual proficiency tests for comparison
of cell line susceptibility IHNV was usually grown only
from epithelioid cell lines, including Chinook salmon
embryo (CHSE-214). Fibroblastoid cells were refractory to infection. Embryonic salmon cells – combining
properties of both cell lines – may mediate unspecific
infectivity. The susceptibility of epithelioid cells could
be restricted by the addition of D-glucose and elevated
in diluted culture medium. IHNV-susceptible fibroblastoid Rainbow trout gonad (RTG-2) cells, infected with
Mycoplasma, may regain some resistance in diluted
medium. Fibroblastoid cells displayed limited enzymatic activity and a higher resistance to mercaptane. The WGA-binding pattern of IHNV-infected RTG-2
cells resembled virus-specific immunofluorescence
and the distribution of DAPI-stained Mycoplasma spp.
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Conclusion
Varying IHNV susceptibilities reflect quantitative differences in enzymatic activities and contents of N-acetylglucosamine. High mercaptane tolerance of fibroblastoid cells with lower sugar demands may indicate
a distinct glycoprotein with abundant sulfur bridges,
which normally restricts a progressive virus infection,
and massive bacterial sugar degradation. Immediatevicinity of Mycoplasma on RTG-2 cells that bind WGA
and IHNV antibodies suggests that IHNV susceptibility
is mediated by microbes. An osmotic imbalance my
result from Mycoplasma breaking disulfide bonds and
making sugar binding sites available and might lead
to IHNV susceptibility and pathogenesis.
Abkürzungen: BF-2 = Bluegill fry; BS-II = Bandeiraea simplicifolia; CHSE-214 = Chinook salmon embryo; DAPI = Diamidinphenylindol; EPC = Epithelioma papillosum cyprini; EU = Europäische Union; FHM = Fathead minnow; FITC = Fluoresceinisothiocyanat; FN = Fibronektin; IHNV = Infektiöse Hämatopoietische Nekrose-Virus; IFT = Immunfluoreszenztest; (N)RLF
= (nationales) Referenzlabor für Fischkrankheiten; p.i. = post infectionem; RF = Regenbogenforelle; RTG-2 = Rainbow trout
gonad; RT-PCR = Reverse Transkriptase-Polymerase-Kettenreaktion; SSE-30 = Sockeye salmon embryo; TCID = Tissue
culture infectious dose; VHS = Virale Hämorrhagische Septikämie; WGA = Weizenkeim-Agglutinin, Triticum vulgaris; ZK =
Zellkultur; ZL = Zell-Linie; ZPE = zytopathischer Effekt
Einleitung
Die Krankheit wurde ursprünglich bei verschiedenen
Lachs-Arten der Gattung Oncorhynchus in AufzuchtAnlagen an der Westküste Nordamerikas beschrieben
(RUCKER et al., 1953; WATSON et al., 1954; ROSS et
al., 1960). Später wurde ihr Erreger, ein Rhabdovirus,
aus der Regenbogenforelle (RF) Oncorhynchus mykiss
in Zellkultur isoliert und ihr Name, Infektiöse Hämatopoietische Nekrose (IHN) geprägt. Er verweist auf den
histopathologischen Milz- und Nieren-Befund im frühen
Stadium der Infektion, die Nekrose des blutbildenden
Gewebes (AMEND et al., 1969; WINGFIELD et al., 1969).
In Europa wurde IHN-Virus (IHNV) erstmals 1987 im
Zuge von Massensterben junger RF (Brütlinge und Setzlinge) in Frankreich und Italien nachgewiesen (BAUDINLAURENCIN, 1987; BOVO et al., 1987). 1994, zwei Jahre
nachdem in Deutschland vier unterschiedlich schwere
IHN-Fälle verzeichnet worden waren (ENZMANN et al.,
1992), kam es in Österreich zum ersten Ausbruch. Am
vormaligen Institut für Fischkunde der Veterinärmedizinischen Universität Wien, wo Prof. Walter Grünberg
eben das nationale Referenzlabor für Fischkrankheiten
(RLF) etabliert hatte, folgte eine Serie von IHNV-Nachweisen. Die verlustreiche Epidemie erfasste zuerst nur
juvenile, dann auch adulte RF. Eine IHNV-Probe von
1995 wurde dem übergeordneten EU-RLF zur Analyse
übermittelt und in Virulenz-Tests bei RF unterschiedlichen Alters eingesetzt. Anders als IHNV aus USA,
Frankreich und Italien zeigte dieses Isolat auch bei der
älteren Versuchsgruppe tödliche Wirkung (BERGMANN
et al., 2003). Die Infektiosität hängt offenbar nicht vom
Virus-Glykoprotein ab. Jene Probe und weitere Isolate
310
von unterschiedlich schweren IHN-Fällen verschieden
alter RF aus Österreich wiesen vollkommen gleiche
G-Gen-Sequenzfolgen auf (KOLODZIEJEK et al., 2008).
Die ursprünglichen IHNV-Stämme aus verschiedenen
Lachs-Arten waren morphologisch, physikochemisch
und serologisch ebenfalls nicht zu unterscheiden, zeigten aber hohe Wirtsspezifität (AMEND u. CHAMBERS,
1970; McCAIN et al., 1971). Die Virulenz des Erregers
schwankt zwischen Fischen unterschiedlicher Art,
Altersgruppen und Konstitution in Abhängigkeit von
der Temperatur und anderen Haltungsbedingungen
(WOLF, 1988; BOOTLAND u. LEONG, 1999).
Die IHNV-Infektiosität schwankt auch zwischen
Fischzell-Linien unterschiedlicher Gestalt, Herkunft und
Passagenzahl. In unserem RLF wurden IHNV-Nachweise regelmäßig mittels Zellkultur (ZK) und Immunfluoreszenztest (IFT) erbracht. Nach herkömmlichen
diagnostischen EU-Richtlinien war zur Überwachung
der Erregerfreiheit klinisch gesunder Fische, die für
die anzeigepflichtigen Rhabdovirosen IHN und Virale
Hämorrhagische Septikämie (VHS) empfänglich sind,
ein Infektionsversuch mit bestimmten Fischzell-Linien
unverzichtbar. Aufgrund unterschiedlicher Empfänglichkeiten ist für die IHNV-Kontrolle standardgemäß
eine epithelartige Zell-Linie (ZL), Epithelioma papillosum cyprini (EPC) oder Fathead minnow (FHM),
zu verwenden und für die VHSV-Kontrolle die fibroblastenartigen Bluegill fry (BF-2)- oder Rainbow trout
gonad (RTG-2)-Zellen (LORENZEN et al., 1999). Die
embryonale Königslachs-ZL Chinook salmon embryo
(CHSE-214) ist nach EU-Standard für keines der beiden
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Viren empfohlen, obwohl man in Deutschland gute Erfahrungen mit ihr machte (ROBERTS u. SCHLOTFELDT,
1985). In unserem Labor war eine hohe IHNV-Affinität
zu allen epitheloiden ZL einschließlich CHSE-214 regelmäßig und besonders deutlich ausgeprägt. Diese
Spezifität hatte hier gewissermaßen den Stellenwert
eines differentialdiagnostischen in vitro-Merkmales,
das IHNV von VHSV unterschied; ein zytopathischer
Effekt (ZPE) nur in epitheloiden Zellen galt als sicheres
IHNV-Indiz. Das letzte Isolat von 2014 wich von dieser
Regel deutlich ab. Markante Abweichungen der Infektiosität in verschiedenen ZL waren auch beim jährlichen
EU-Ringversuch zum Vergleich der ZK-Empfänglichkeit
festzustellen. Die IHNV-Titer variierten von Jahr zu Jahr
laborintern und vor allem im internationalen Laborvergleich. Die Empfänglichkeitsschwankungen wurden als
Artefakte interpretiert. Eine ZL kann durch häufiges
Subkultivieren, durch Virus-Adaptierung an eine andere
ZL oder durch eine Mykoplasmen-Infektion unempfindlich werden. Deshalb müssen Subkulturen regelmäßig mit bekannten Viruskonzentrationen überprüft
und bei mangelhafter Infizierbarkeit entsorgt werden
(AHNE u. WEILER, 1978; WOLF, 1988; McALLISTER,
1997; LORENZEN et al., 1999). Dass Mykoplasmen
verschiedene Zellen unterschiedlich schädigen und
auch IHNV-empfänglich machen können, blieb bisher
unerwähnt. Während die Nützlichkeit verschiedener
Fischzell-Linien für die Grundlagenforschung noch
lange nicht ausgeschöpft ist, halten virusdiagnostische
EU-Regeln an Kochs Postulat nicht mehr fest. Seit 2015
ist ein genetischer Virus-Nachweis direkt vom Fisch als
Alternative zum zeitaufwändigen ZK-Versuch zulässig.
Die ungewöhnliche ZK-Empfänglichkeit 2014 und die
neue diagnostische Gewichtung des Infektionsversuches gaben Anlass, Bilanz zu ziehen.
Neben der routinemäßigen Verwendung verschiedener Fisch-ZL zur Virus-Anzucht wurden einige
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zytologische Beobachtungen und Vergleiche zur Abklärung von Grundlagen der IHNV-Infektiosität angestellt.
Nach einer kurzen Rückschau auf die IHN-Pathoanatomie, die Häufigkeit des Erregernachweises und die
Virusempfänglichkeit der Zellkulturen sind sie hier als
Vorschau auf weiterführende zytologische Analysen
und Vergleiche mit in vivo-Verhältnissen (bei Forellen
in Aquakultur) notiert. Die Beobachtung, dass infizierte
Zellen oft mehr Nährlösung verbrauchen, erinnerte an
Mitteilungen von Forellenzüchtern, wonach sich der
Ausbruch einer Virose in gesteigertem Appetit ankündigt. Die Assoziation von erhöhtem Nährstoff-Verbrauch
in vitro mit erhöhtem Energie-Bedarf (Hunger) in vivo
ließ an eine virusbedingte Störung des Zuckerstoffwechsels denken. Unterschiedliche Empfänglichkeit
verschiedener Zellen könnte sich aus Unterschieden
im Zuckerhaushalt, in der Bindungsweise und Verfügbarkeit von Glukose ergeben.
Material und Methoden
Fischproben
Von den meisten gezüchteten Lachsfischen (Ordnung Salmoniformes), die aus Teichanlagen zu diagnostischen Zwecken oder
zur virologischen Überwachung ins Labor gelangten, wurden Milz-,
Kopfnieren- und Gehirn-Anteile für einen Zellkulturinfektionsversuch
entnommen. Lagen mehrere Fische mit unauffälligem oder einheitlichem Erscheinungsbild zur Untersuchung vor, so wurden die Organproben von zwei bis zehn Individuen zu einer Probe zusammengefasst. In einigen Fällen dienten die Geschlechtsprodukte als Probe.
Zellkulturverfahren und Virus-Diagnostik
Die Proben wurden gemäß Entscheidung 2001/183/E (Diagnosehandbuch) in Transportmedium (MEM-Glutamax, 2 % FKS, 0,1 %
Gentamycin; gibco life technologies, UK) homogenisiert, filtriert und
in frische Einschicht-Zellkulturen, acht bis 24 Std nach der Aussaat
inokuliert. Für die IHNV- und VHSV-Diagnostik kamen zumindest
zwei, seit einigen Jahren meistens vier der folgenden etablierten
Zell-Linien (ZL) zum Einsatz: EPC und FHM, BF-2- und RTG-2 und die
embryonalen Lachszellen CHSE-214, zuletzt auch Sockeye salmon
Abb. 1: Regenbogenforellen mit uneinheitlichem IHN-Krankheitsbild - A: unspezifische Blässe der Kiemen; B: pathoanatomisches
Bild zweier gleich großer Individuen: gelber Darm-Katarrh in Pyloruscaeca beim oberen, Milzschwellung beim unteren / Varying clinical
appearance of IHNV-infected rainbow trout - A: unspecific paleness of gills; B: intestinal congestion with yellow mucus in the upper,
splenomegalia in the lower fish
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Beobachtungen zur zellspezifischen
IHNV-Infektiosität und ihrer Variabilität
An ausgewählten Isolaten wurde der Einfluss einer Zellkultur-Adaptierung auf ihre Infektiosität überprüft. Nach kontinuierlichem
Passagieren in einzelnen Linien wurde der
Virustiter in der gleichen Linie und kreuzweise in anderen Zell-Linien bestimmt.
Die Wirkung von Glukose auf die Empfänglichkeit für einzelne Virusisolate wurde
in fünf der o.a. Zell-Linien durch Virus-Titration sowie in einem Monolayer-ELISA
und im IFT überprüft. Die Zellen wurden
parallel in einer Mikrotiterplatte jeweils in
Standardkulturmedium, sowie in Medium
mit 0,1 M D-Glukose-Gehalt ausgesät und
nach zwölf Stunden mit zehnfach-Serienverdünnungsreihen einzelner Isolate inokuliert.
Nach sieben Tagen Inkubation wurde der
Virustiter bestimmt. In gleicher Anordnung
wurden die Kulturansätze in je zwei weiteren
Platten zum einen Teil nach zwölf Stunden
mit den einzelnen Proben in drei Verdünnungen, sowie zum anderen nach zwölf, 24
und 48 Std. mit konstanter Virusverdünnung
(1:1000) inokuliert. Drei Tage p.i. wurden sie
in der einen Platte einem IFT und Lektintest
in der anderen einem ELISA mit dem o.a.
monoklonalen Antikörper unterzogen.
Die Wirkung eines Nährstoffentzuges auf
den Virustiter wurde nach einwöchiger Inkubation der verschiedenen Zellen bei 15 °C in
wässriger Verdünnung des Kulturmediums
(50 %) kontrolliert.
Abb. 2: Diagnostische Verfahren – A: IHNV-ZPE in EPC-Zellen am dritten Tag p.i.: plaDie Enzymaktivitäten der verschiedenen
queförmiger Nekroseherd, B: gesunde BF-2-Zellen mit gleicher Probe drei Tage p.i.; C:
Linien wurden an Suspensionen von VirusImmunfluoreszenz mit monoklonalem IHNV-Antikörper in SSE-30 Zellen drei Tage p.i.;
D: ELISA mit monoklonalem Antikörper gegen IHNV: die Zellkultur-Überstände reagiefreien und infizierten Zellen fünf Tage nach
ren nach zwei Tagen Inkubation der Probe von 2014 erst schwach; E: Gel Elektropheroder Aussaat in API ZYM-Teststreifen nach 48
gramm vom IHNV-PCR-Produkt aus RTG-2-Überstand nach fünf Tagen Inkubation mit
Std. Inkubation bei 20 °C verglichen.
derselben Probe / Diagnostic procedures – A: IHNV-CPE in EPC cells, three days p.i.:
An EPC- und RTG-2-Zellen wurde die Tofocal necrosis; B: undamaged BF-2 cells incubated with the same sample as in A, three
xizität von Mercaptoethanol in Konzentradays p.i.; C: FITC-immunofluorescence of the monoclonal antibody anti IHNV (Biox) in
tionen von 5–50 mmol visuell kontrolliert.
SSE-30 cells, three days p.i.; D: IHNV-ELISA (Biox): weak reaction of supernatants from
Der Gehalt an N-Acetylglukosamin in den
cells incubated for two days with the sample from 2014; E: gel electropherogram of the
verschiedenen Zellen wurde im Virus-freien
IHNV pcr product obtained from supernatant of RTG-2 cells incubated five days with
Zustand und drei Tage nach Infektion mit
the same sample as in D
ausgewählten Isolaten im Fluoreszenztest
mit den FITC- konjugierten Lektinen Bandeiraea simplicifolia (BS-II) und Triticum vulgaris
embryo (SSE-30). Proben, die nach zweimal sieben Tagen Inkuba(Weizenkeim-Agglutinin, WGA) vor und nach einstündiger Einwirtion (Subkultur nach einer Woche) bei 15 °C keinen ZPE auslösten,
kung von 5 mmol Mercaptan sichtbar gemacht. Die Lektin-Bindung
wurden als virusfrei eingestuft. Die Kulturüberstände von deutlich
wurde mit der IHNV-Immunreaktion von Replikaten derselben Zellen
infizierten Zellen wurden regelmäßig in frische Kulturen übertragen
verglichen.
und zwei bis drei Tage p.i. auf Immunfluoreszenz (IF) mit einem moMykoplasmen gelangten mit der Diamidin-phenylindol (DAPI)noklonalen IHNV-Antikörper (Bio-X Diagnostics S.P.R.L, Belgien;
Kernfärbung nach dem Fluoreszenztest mit FITC-konjugiertem IHFICHTNER et al., 2000) getestet, zuletzt fallweise auch direkt in einem
NV-Antikörper oder Weizenkeim-Agglutinin (WGA) zur Darstellung.
ELISA (Bio-X Diagnostics). Proben, die IHNV-positive Immunreaktionen zeigten, wurden schließlich in einer RT-PCR überprüft. Die
Virus-RNA wurde nach EU-Vorgaben mit Primern des mittleren GGen-Abschnittes amplifiziert (EMMENEGGER et al., 2000) und die
Nucleotidsequenzen des gereinigten PCR-Produktes mit entsprechenden Genom-Abschnitten aus der BLAST Datenbank verglichen.
IHN-Symptomatik
Ergebnisse
IHNV-Empfänglichkeitstest, Ringversuch
Die Empfänglichkeit unterschiedlich alter Passagen von regelmäßig verwendeten Zell-Linien wurde laufend laborintern überprüft und zusätzlich seit 1997 alljährlich in einem EU-Ringversuch
einem Laborvergleich unterzogen. Dabei wurden zehnfach-Verdünnungsreihen bekannter Isolate bzw. der anonymen Proben in
frische Monolayer von zwei bis sechs der oben angeführten Zellinien in Mikrotiterplatten inokuliert und nach sieben Tagen Inkubation
die höchste Probenverdünnung mit zytopathologischer Wirkung
als Infektionsdosis (Tissue Culture Infectious Dose, TCID, gemäß
REED u. MUENCH, 1938) bestimmt.
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Das Erscheinungsbild betroffener Fische bei der
Adspektion und Sektion war individuell und von Fall zu
Fall unterschiedlich. Am häufigsten war Anämie an den
Kiemen (Abb. 1A) und inneren Organen (Herz, Leber,
Niere) auffällig sowie am Verdauungstrakt verminderte
Konsistenz und vermehrt Schleim, der im Magen oft
klar war, im Darm gelb oder weiß verfärbt. Krankheitsanzeichen wie Dunkelfärbung der Haut, Exophthalmus,
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Blähbauch, Blutungen an den
Flossenansätzen, im viszeralen
Peritoneum, in der Schwimmblase oder im Bauchfett, sowie eine
Schwellung der Milz waren meist
nur bei einzelnen Individuen deutlich ausgeprägt. Manchmal waren
keine Anzeichen einer Erkrankung
zu erkennen.
Zellkulturverfahren und IHNVDiagnostik
Typischerweise zeichnete sich
eine Infektion in den meisten Fällen
in den epitheloiden EPC- und FHMZellen zwei oder drei Tage nach der
Inokulation in Form von klar abgegrenzten Plaques ab, in den embryonalen Lachszellen CHSE-214
und SSE-30 meist einen Tag später,
während in BF-2 und RTG-2-Zellen
keinerlei Effekt zu bemerken war.
(Abb. 2 A,B). Beim IFT zeigten größere Zellgruppen im noch intakten
EPC- und FHM-Zellrasen bereits
ein bis zwei Tage p.i., im Rasen der
embryonalen Lachszellen CHSE
und SSE einen Tag später starke
Reaktion mit dem monoklonalen
IHNV-Antikörper. Der Kulturüberstand dieser Zellen reagierte im
ELISA erst bei fortgeschrittener
Zell-Lysis nach dem dritten Tag
deutlich. Die Immuntestreaktionen
wurden in der RT-PCR bestätigt.
(Abb. 2C-E).
Abb. 3: RTG-2-Zellen im Phasenkontrast- (A) und im Fluoreszenzmikroskop- (B); A1: spinIn den fibroblastoiden Linien BF-2
delförmige Zellen drei Tage nach der Aussaat ohne Inokulum, A2: mit der Probe 70/14
und RTG-2 trat in der Regel auch
infizierte abgerundete Zellen, rechts oben, drei Tage p.i; B1: einzelne mit IHNV-113/94 infizierte Zelle und Einschlusskörperchen im unbeschädigten Zellrasen, drei Tage p.i.; B2:
in der zweiten Inkubationswoche
zahlreiche mit IHNV-70/14 infizierte kubische Zellen, drei Tage p.i. / RTG-2 cells in phase
kein ZPE in Erscheinung (Abb.
contrast (A) and fluorescence microscopy (B); A1: spindle-shaped control cells three days
3A1) obwohl im IFT wenige Tage p.i.
after seeding; A2: roundish cells (above) infected with the sample from 2014, three days
p.i.; B1: single cell infected with a sample from 1994 and viral inclusions in an undamaged
vereinzelt unversehrte Zellen oder
monolayer three days p.i.; B2: several cubic cells three days p.i. with the sample of 2014
Einschlusskörper-ähnliche Zellderivate im vollständigen Monolayer
mit dem Antikörper reagierten (Abb. 3B1).
Boden lösten (Abb. 3A2). Anders als sonst erschieVon dieser Regel der Zellspezifität wich die letzte
nen im IFT bereits im frühen Stadium der Infektion
Probe aus 2014 ab. Jene Probe von drei Regenbogen(„Transformationsstadium“) größere Gruppen von Zellen
forellen zeigte in sechs Zell-Linien nach zwei bis drei
infiziert. Das Bild der Immunfluoreszenz entsprach dem
Tagen zytopathische Wirkung und starke Reaktion im
der embryonalen Lachszellen (Abb. 3B2).
IFT. In RTG-2- und BF-2-Rasen zeichneten sich die
G-Gen-Analyse
Infektionsherde – ähnlich wie in den Lachszellen – langsamer als in den epitheloiden Zellen, jedoch deutlich
ab. Der ZPE erschien nicht direkt in Form fokaler NekDas ungewöhnliche letzte, in vitro unspezifische
rose und Ablösung. Die spindelförmigen RTG-2-Zellen
Isolat aus 2014 war in seinen G-Gen-Sequenzen mit
nahmen zunächst die Form von Epithelzellen, dann
den Isolaten der vorangegangenen Jahre vollständig
Kugel-Gestalt an, bevor sie sich im Zentrum des Herdes
identisch und demnach dem europäischen Genotypus
aufgebläht, langsam aus dem Zellverband und vom
M (italienischer Ausprägung) zuzuordnen.
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so empfänglich wie die epitheloiden
Linien, in den letzten beiden Jahren
waren sie wieder resistent (Abb. 5).
Beobachtungen zur zellspezifischen IHNV-Infektiosität und
ihrer Variabilität
CHSE- und SSE-Zellen erwiesen
sich durch hohe IHNV-Empfänglichkeit und Robustheit für die IHNVDiagnostik besonders vorteilhaft. Da
die Schädigung und Zerstörung ihres
Abb. 4: IHNV-Nachweis-Bilanz; während die Anzahl der Nachweise bis 1996 mit der Anzahl
Rasens im Zuge der Infektion langsader untersuchten Zuchtbestände abnahm, bestand danach kein proportionaler Zusammenmer voranschritten als in EPC- und
hang / Farms tested for IHVN in Austria. Black bars: Number of farms keeping Salmonidae
FHM-Zellen, waren sie günstig im
free from IHN; red bars: Rainbow trout farms positive for IHNV. Up to 1996 the number of
cases decreased with the number of farms tested, after 1996 there was no correlation.
Fluoreszenztest einzusetzen. Darüber hinaus vermittelten sie den meisten IHNV-Isolaten „zellunabhängige“
Infektiosität. Während RTG-2 und
BF-2-Zellen gegenüber Virusisolaten
von EPC- und FHM-Zellen Resistenz
zeigten, waren sie für Passagen von
CHSE- und SSE-Zellen empfänglich.
Das letzte Isolat von 2014 erlangte
in den fibroblastoiden Zellen ähnlich
unspezifische Virulenz wie in Lachszellen. Während seine Infektiosität in
epitheloiden Zellen mit zunehmender
Passagenzahl abnahm, wurde sie in
Abb. 5: IHNV-Titer in verschiedenen Fischzelllinien aus dem nationalen Referenzlabor
fibroblastoiden Zellen gesteigert. Der
der Vetmeduni Vienna bei den internationalen Ringversuchen zur Überprüfung der VirusVirustiter von RTG-2 und BF-2-PasEmpfänglichkeit / IHNV susceptibility of cell lines from the laboratory at the Vetmeduni
sagen war in EPC- und FHM-Zellen
Vienna in the annual proficiency tests of the EU reference laboratory for fish diseases
höher als in der gleichen Zell-Linie
IHNV-Nachweis-Bilanz
und am höchsten in CHSE- und SSE-Zellen (Abb. 6).
Glukoseanreicherung und Nährstoffentzug wirkten
In zwanzig Jahren wurde bei der virologischen Unsich auf die Infektiosität verschiedener IHNV-Isolate in
tersuchung von Proben aus 518 Lachsfisch-Beständen
den verschiedenen Linien unterschiedlich aus. Während
in 32 Fällen IHNV mittels Zellkultur nachgewiesen.
erhöhter D-Glukose-Gehalt (0,1 M) des Nährmediums
Abgesehen von einem Fall bei Äschen, handelte es
bei CHSE-Zellen meist keine Wirkung auf den Virus-Titer
sich durchwegs um Organproben aus Regenbogenzeigte, senkte er die Infektiosität mancher IHNV-Isolate
forellen unterschiedlicher Alters- bzw. Größenklassen.
in EPC-Zellen um das Zehnfache, in FHM Zellen sogar
Nach dem Erstnachweis waren 1994 im Zuge einer
um den Faktor 100. Die Hemmung der Infektiosität war
Epidemie sieben von 52 Forellen-Betrieben IHNVdirekt an den Zellen im IFT und in der Reaktion des
positiv. Die Anzahl der IHN-Fälle ging in den beiden
Kulturüberstandes im ELISA erkennbar (Abb. 7).
darauffolgenden Jahren mit der Zahl der Einsendungen
Im Gegensatz zu FHM- und EPC-Zellen wuchsen
deutlich zurück und schwankte dann unabhängig von
RTG-2- und BF-2-Zellen in stark verdünnter Nährlösung
dieser zwischen drei und Null (Abb. 4).
zumindest während einer Inkubationswoche genauso gut
wie im „gewohnten“ Medium; mit Mykoplasmen infizierte
IHNV-Empfänglichkeitstest, Ringversuch
RTG-2-Zellen wuchsen im „Hungermedium“ sogar besser;
dabei wurde die Keimvermehrung eingeschränkt und ihre
Der Regel einer zellspezifischen IHNV-Empfängungewöhnliche Empfänglichkeit für das letzte IHNV von
lichkeit entsprachen meist auch die IHNV-Titer beim
2014 um den Faktor zehn verringert, die Empfänglichkeit
jährlichen Ringversuch. Sie waren in EPC- oder
von FHM-Zellen im gleichen Maße gesteigert.
FHM- und in CHSE-Zellen, die seit 2008 zusätzlich
Zell-Linien verschiedener Gestalt waren auch in ihren
regelmäßig verwendet wurden, meistens deutlich höher
Enzymaktivitäten zu unterscheiden. EPC-, FHM- und
als in BF-2- und RTG-2-Zellen. Doch 2009 und 2011
CHSE-Zellen zeigten in den API ZYM-Teststreifen mehr und
waren die fibroblastoiden BF-2 und RTG-2-Zellen fast
stärkere Reaktionen als BF-2 und RTG-2-Zellen (Abb. 8).
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Die toxische Wirkung von Mercaptan war bei den verschiedenen
Zell-Morphotypen unterschiedlich.
RTG-2-Zellen waren resistenter als
EPC-Zellen. Während sie zwei Tage
eine Konzentration von 50 mmol
überlebten, war für EPC-Zellen eine
Dosis von 5 mmol bereits nach zwölf
Stunden letal (Abb. 9).
Die BS-II- und WGA-Bindungsintensität war in den verschiedenen Zelltypen ähnlich und bei
IHNV-infizierten Zellen allgemein
verstärkt. Je nach Virus-Isolat war
das Bindungsmuster der Lektine
mehr oder weniger deckungsgleich mit dem Muster der IHNVImmunreaktion (Abb. 10, AB). Dies
traf vor allem für die Bindung des
N-Acetylglucosamin-spezifischeren
BS-II nach Merkaptan-Einwirkung
zu. Die Verteilung von WGA- und
IHNV-Antikörper-bindenden RTG2-Zellen, die mit dem letzten Isolat
von 2014 infiziert waren, entsprach
dem Verteilungsmuster von Mykoplasmen (Abb. 10, 2–3).
Diskussion
Der bei IHN häufige Darmkatarrh
ist offenbar mit SchleimhautAblösungen und jener MastzellDegeneration im Bindegewebe
der Submucosa verbunden, die
neben der Nekrose des blutbildenden Gewebes (in Milz und Niere),
als typisches IHN-Kennzeichen
beschrieben wurde (YASUTAKE,
1975). Auffälligkeiten wie Anämie
Abb. 6: Embryonale Lachszell-Linien – A: eine Woche nach der Aussaat ohne Inokulum; B:
in Mikrotiterplatte nach einer Woche Inkubation mit zehnfach-Verdünnungsreihen der Probe
und verminderte Organ-Konsistenz
aus dem Jahr 2014 und eines Isolates von 1994: zerstörte Zellrasen in den Reihen A (10-2) bis
erschienen eher unspezifisch; sie
E (10-6) im Kontrast zu Kristallviolett gefärbten, nicht infizierten Zellen C1: CPE des Isolates
waren bei gemästeten RF häufiger
70/14 in CHSE-214, vier Tage p.i.: zahlreiche pyknotische Zellen im Verband mit perforiertem Rasen; C2: SSE-30-FITC-Immunfluoreszenz von 70/14 im Zytoplasma, vier Tage p.i.,
festzustellen als IHNV. Umgekehrt
DAPI-Kernfärbung / Embryonic salmon cell lines – A: control cells one week after seeding;
war nie Virus aus Fischen mit
B: incubated for one week with serial ten-fold dilutions of the isolate from 2014 and one from
festen, gut durchbluteten Organen
1994: destroyed monolayers in the rows A (10 -2) to E (10-6) C1: CPE of the last isolate in CHSE214, four days p.i.: pycnotic cells still in contact with the nearly undamaged monolayer; C2:
zu isolieren. Möglicherweise sind
strong FITC immunofluorescence of undamaged SSE-30 cells four days p.i., DAPI-staining
ernährungsbedingte Gewebsdefizite
(wie z.B. Kollagen-Mangel) Voraussetzung für eine akute IHNV-Infektion. Regelmäßiger
aus unterschiedlicher Enzymaktivität und Glukoseals durch ein typisches Krankheitsanzeichen am Fisch
Bindungskapazität. Die Virus-Bindung beruht auf einem
gab sich der Krankheitserreger in vitro schon vor einem
bestimmten Zuckerspiegel, osmotischem Druckgefälle
Identitätstest durch seine markante Zellspezifität, seine
der Zelle, in dem sich normalerweise Bindegewebszellen
Affinität zu epithelartigen Zellen zu erkennen.
von Epithelzellen unterscheiden. Die Infektiosität hoher
Die in vitro-Notizen nährten folgende Hypothesen:
Virusverdünnungen ist bei empfänglichen, epitheloiden
Die IHNV-Infektiosität hängt vom Zucker-Haushalt
Zellen durch Zucker-Übersättigung (Glukose-Zusatz)
der ZL ab. Empfänglichkeitsunterschiede zwischen
zu blockieren, durch Nährstoffentzug (Verdünnung
fibroblasten- und epithelartigen Zellen ergeben sich
des Mediums) hingegen zu steigern. So wäre auch
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Wiener Tierärztliche Monatsschrift – Veterinary Medicine Austria
Abb. 7: Wirkung von 0,1 M D-Glukose auf die IHNV-Titer. oben: Zellkultur-IHNV-ELISA (mit
den Zellrasen als Substrat); verschiedene Zell-Linien wurden mit einem Isolat aus 2003 in verschiedenen Verdünnungen (Reihen A-D) und in verschiedenen Zeitintervallen (E-H) infiziert;
in normalem Medium und mit 0,1 M D-Glukose-Gehalt (glc+); Reduktion der Reaktionen bei
erhöhtem Glukose-Gehalt um den Faktor zehn in den epitheloiden Zellen. unten: Titer von
fünf IHNV-Isolaten aus Österreich in fünf Zell-Linien, ohne/mit Glukose-Zusatz; die Titer sind
durch Glukose-Zusatz (glc+) bei verschiedenen epitheloiden Zellen und Virus-Isolaten unterschiedlich verringert, am deutlichsten bei allen Isolaten in den FHM-Zellen (100x) / Impact of
0,1 M D-glucose on IHNV titers. above: cell culture IHNV-ELISA; various cell lines infected
with an isolate from 2003 in normal and glucose-supplemented medium (glc+); reduction of
reactions in epithelioid cells. below: titers of five isolates from Austria in five cell lines in normal and glucose-supplemented medium (glc+); different reduction of titers varying between
cell lines and virus isolates; most significant impact in FHM cells
Abb. 8: API ZYM-Teststreifen mit Zellsuspensionen, fünf Tage nach der Aussaat; EPCZellen zeigen stärkere Reaktionen als BF-2-Zellen / API ZYM test strips containing cell
suspensions, harvested five days after seeding; EPC cells exhibit some stronger reactions than BF-2 cells
316
103 (2016)
das Phänomen der umgekehrt
proportionalen dosisabhängigen
Infektiosität zu verstehen; oft ist
bei Titrationen die höchste Viruskonzentration nicht oder weniger
infektiös; sie wirkt scheinbar wie
Glukose-Übersättigung
hyperosmotisch. Zucker ist vermutlich
bei verschiedenen Zellen in unterschiedlicher Form und Menge
gebunden. Fibronektin (FN) dürfte
bei den ersten Infektionsschritten
eine Schlüsselrolle spielen. Mit FNAntikörpern konnte die Bindung von
VHSV und IHNV bei RTG-2-Zellen
blockiert werden, nicht jedoch bei
EPC-Zellen (BEARZOTTI et al.,
1999). Sehr wahrscheinlich ist
Zucker bei den fibroblastenartigen
Zellen in einem Glykoprotein wie
FN oder Fisch-Lektin stabiler
fixiert. Die höhere Resistenz fibroblastoider Zellen gegenüber dem
hochtoxischen Mercaptan deutet
auf größeres Vorkommen von Disulfidbrücken hin; dem würde ein
höherer FN-Gehalt entsprechen
und – damit verbunden – ihre
stärkere Adhärenz, Trypsin- und
IHNV-Resistenz. Das Virus wird
hier in der Regel scheinbar so fest
gebunden, dass ein zerstörerischer
Infektionsprozess nicht oder nur
langsam, im Gleichschritt mit neuen
Zellteilungen voranschreiten kann.
Die unspezifische Infektiosität
der vorläufig letzten IHNV-Probe
von 2014 erinnerte an ursprüngliche Isolate vom Königslachs, die
geringere Zell-Spezifität aufwiesen
als RF-Isolate (WINGFIELD et al.,
1969; FENDRICK et al., 1982) und
an den Ringversuch 2009. Beim
jährlichen Ringversuch wurden
besonders bei den fibroblastoiden
Zell-Linien große Empfänglichkeitsunterschiede zwischen verschiedenen Laboratorien festgestellt
(ARIEL et al., 2009). Als mögliche
Ursache kommt neben einer bakteriellen Infektion auch der Effekt
einer Zellkultur-Adaptierung in
Frage. Schon ein bis zwei Passagen in einer Zell-Linie können
die Infektiosität eines bestimmten
Virus-Isolates in einer anderen ZellLinie verändern (LORENZEN et al.,
1999). Die Ringversuchsprobe 2009
Wiener Tierärztliche Monatsschrift – Veterinary Medicine Austria
103 (2016)
war ebenfalls in den RTG-2-Zellen
fast so infektiös wie in den EPCZellen. Es handelte sich dabei um
ein nordamerikanisches IHNV-Isolat
vom Genotyp L, während das „neue“
Isolat aus Österreich (2014) dem
europäischen Genotypus M zuzuordnen war. Es wurde ursprünglich
aus dem Königslachs isoliert, von
dem auch die CHSE-214-Zellen
stammen (NICHOL et al., 1995).
Abb. 9: unterschiedliche Toxizität von 50 mM Mercaptoethanol in EPC- Zellen nach zwölf
Die Empfänglichkeit embryonaler
Stunden und RTG-2-Zellen nach 24 Stunden / Toxicity of 50 mM mercaptoethanol in EPC
Lachszellen für ein Lachs-spezifiafter twelve hours and RTG-2 cells after 24 hours exposure
sches Virus verwundert nicht. Doch
da sich „normalerweise“ EPC- und
FHM-Zellen aus Karpfen und Elritze
besser zur IHNV-Anzucht eignen als
RTG-2-Zellen aus der RF, scheinen
für die IHNV-Empfindlichkeit nicht
Fisch-spezifische, sondern morphogenetische, Zelltyp-spezifische
Eigenschaften ausschlaggebend
zu sein. Vermutlich beruht auch die
Empfänglichkeit der Lachs-Zellen
mehr auf ihren epithelartigen Eigenschaften als auf ihrer Herkunft vom
Königslachs. Doch einige Merkmale
teilen sie mit fibroblastenartigen
Zellen: Sie zeigen ähnlich hohen
Widerstand gegen Trypsin und
Mykoplasmen, die IHNV-Infektion
verläuft auch bei ihnen langsamer
als bei EPC- und FHM-Zellen und
sie verleihen dem Virus mit jeder
Passage unspezifische Infektiosität.
In den anderen epithelartigen Zellen
hingegen kann die Infektiosität
mit zunehmender Passagenzahl
abnehmen. Dieser umgekehrte
Adaptierungseffekt
(allgemeine
Virulenz-Steigerung anstatt „Spezifizierung“ und Virulenzabnahme)
könnte ebenfalls mit Fibronektin
und einer latenten MykoplasmenInfektion zusammenhängen.
Abb. 10: Immun- und Lektinfluoreszenz von IHNV und Mykoplasmen in RTG-2-Zellen mit
Die ungewöhnliche Infektiosität
IHNV-A-70/14 infiziert, drei Tage p.i.; links: FITC-IHNV-Antikörper-Bindung (A1,2); rechts:
der letzten IHNV-Probe von 2014
FITC-WGA-Bindung (B1,2), oben (A,B1): ohne Kernfärbung, Mitte (A,B2) - in Kombination
in Fibroblasten kann auf baktemit DAPI-Färbung; die IHNV-spezifische Immunfluoreszenz erscheint wie die Lektin-Fluoreszenz in unmittelbarer Nähe von Mykoplasmen; starke WGA-Bindung der Mykoplasmen
rielle Einwirkung zurückgeführt
(B2); unten: (A,B3) - DAPI-Fluoreszenz von großen RTG-2-Zellkernen und kleinen Mykowerden. In unserem Labor zeigten
plasmen / Immuno- and lectin fluorescence of IHNV and Mycoplasma spp. in RTG-2 cells
RTG-2-Zellen auch hohe Resistenz
infected with the isolate from 2014, three days p.i.; left side: IHNV-immune reaction (A1,2);
right side: FITC-WGA-binding (B1,2); above (A,B1): without DAPI staining; mid (A,B2): in
gegenüber Mykoplasmen. Während
combination with DAPI staining; IHNV-specific immunofluorescence close to Mycoplasma
die Bakterien EPC- und FHM-Zellen
spp. exhibiting strong WGA bindung (B2); below (A,B3): DAPI fluorescence of large nuclei
meistens zerstörten, bevor eine Viof RTG-2 cells and small Mycoplasma spp.
rusinfektion erfolgen konnte, wirkten
sie auf RTG-2 Zellen lange nicht wachstumshemmend,
der Ovarialflüssigkeit weniger empfindlich als EPC
verstärkten aber zunehmend ihre Adhärenz. In Japan
und FHM-Zellen, für IHNV aber genauso (YOSHINAKA
waren RTG-2-Zellen gegenüber toxischen Substanzen in
et al., 1997). Möglicherweise haben Mykoplasmen
317
Wiener Tierärztliche Monatsschrift – Veterinary Medicine Austria
dort wie hier 2014 die Virus-Empfänglichkeit vermittelt.
Dass verschiedene Zell-Linien zu latenten Infektionen
mit Viren und Mykoplasmen neigen, die eine gezielte
Infektion beeinträchtigen können, ist bekannt. Es ist
jedoch hervorzuheben, dass Bakterien eine IHNVInfektion bei fibroblastoiden Zellen fördern können.
Die fast deckungsgleiche Verteilung von Mykoplasmen
und Lektin-bindenden IHNV-infizierten RTG-2-Zellen,
die dem Bild der virusspezifischen Immunfluoreszenz
entsprach, deutet darauf hin. Sie zehren scheinbar am
„sparsamen“ Zuckerhaushalt fibroblastoider Zellen.
Indem sie allmählich die feste FN- oder Lektin-Struktur
durch Spaltung der Disulfidbrücken aufschließen,
können sie möglicherweise Zucker-Anteile der Zellmembran als Virus-„Rezeptoren“ verfügbar machen.
Ihr Glukose-Abbau führt wahrscheinlich zu einem hyposmotischen Druck, der eine Virus-Aufnahme fördert.
Bemerkenswert ist die Veränderung der Zellgestalt
im frühen Stadium der Infektion, dem sogenannten
„Transformationsstadium“. Möglicherweise nehmen
Bindegewebszellen durch bakterielle Destabilisierung
ihrer Struktur langsam epitheloide Gestalt an und
diese „Metamorphose“ wird durch eine IHNV-Infektion
beschleunigt. Im verdünnten Medium wuchsen die
kontaminierten RTG-2-Zellen im Gegensatz zu den
Mykoplasmen genau so gut wie im nährstoffreichen
und ihre IHNV-Empfänglichkeit war – bei geringerer
Keimbelastung - wieder eingeschränkt. FHM-Zellen
hingegen wuchsen hier bei gesteigerter Empfänglichkeit
langsamer. In ersten Enzym-Tests zeigten die fibroblastenartigen Zellen schwächere Reaktionen; vermutlich
wird – vor allem bei geringerem Keimwachstum im
„Hungermedium“ – ihr Zucker langsamer abgebaut.
Dementsprechend verläuft eine IHNV-Infektion in ihnen
nicht so akut wie in epitheloiden Zellen.
Wenn IHNV-Empfänglichkeit bei gezüchteten fibrozytenartigen Zellen auf Destabilisierung beruht, so
könnte sie auch bei rasch gemästeten („überzüchteten“) Regenbogenforellen mit der Beschaffenheit des
Bindegewebes zusammenhängen. Organe gesunder,
kräftiger Fische deuten schon am höheren Widerstand
beim Suspendieren und Filtrieren Virusfreiheit an. Wahrscheinlich stellt Bindegewebe in der Regel eine Barriere
für eine akute systemische IHNV-Infektion dar. Es
wäre noch in genaueren Experimenten nachzuweisen,
103 (2016)
jedoch zu erwarten, dass qualitativ und quantitativ
angemessene (dem Energiebedarf und Stoffwechsel
entsprechende) Ernährung einer IHN vorbeugen kann.
Danksagung
Die Etablierung der Fischzellkultur im NRL an der Vetmeduni Vienna verdanken wir der Hilfe mehrerer externer Fachkräfte, die uns hochwertige Zellpassagen,
Viruskontrollen und -antikörper, sowie praktische Ratschläge anvertraut haben. Repräsentativ für alle sind
hier von jedem Labor nur zwei namentlich angeführt:
Maura Ferrari, Giovanni L. Alborali (Laboratorio Centro
Substrati Cellulari, Istituto Zooprofilattico Sperimentale
della Lombardia e dell‘ Emilia Brescia); Sandra Essbauer, Winfried Ahne (ehemaliges Institut für Zoologie, Veterinärmedizinische Universität München); Dieter
Fichtner, Roland Riebe (Bundesforschungsanstalt für
Viruskrankheiten der Tiere, BFAV, Riems); Heike Schütze, Peter-Joachim Enzmann (ehem. BFAV, Tübingen);
Nicole Nikolajson, Niels Jørgen Olesen (ehem. Danish
Institute for Food and Veterinary Research, Fish Diseases Section, Aarhus; Dänische Technische Universität,
EU-RLF, Kopenhagen).
Zhang Xinquan (Abteilung Geflügelmedizin, Klinik
für Geflügel und Fische, Vetmeduni Vienna) danken
wir für seine Assistenz bei der digitalen FluoreszenzMikrophotographie.
Fazit für die Praxis:
Die anzeigepflichtige Lachskrankheit Infektiöse Hämatopoietische Nekrose (IHN) erschien in Österreich bisher
seltener als die Virale Hämorrhagische Septikämie (VHS). Sie ist bei Regenbogenforellen in unterschiedlicher Ausprägung aufgetreten, bei Bachforellen noch nie. Die IHN-Pathoanatomie zeichnete sich eher durch
Darmkatarrh und Anämie als durch Hämorrhagien aus. Der Erreger IHNV zeigte in der Regel auch in vitro
höhere Spezifität als VHSV. Die unterschiedliche Empfänglichkeit von epithelartigen und bindegewebsartigen
Fischzellkulturen beruht auf Differenzen im Zucker-Haushalt. Bindegewebszellen sind normalerweise IHNVresistent, können jedoch durch bakteriellen Zuckerabbau empfänglich werden. Möglicherweise ist auch die
IHNV-Empfänglichkeit der Regenbogenforellen in Aquakultur von ihrem Bindegewebszustand abhängig und
daher durch entsprechende Ernährungs- und Haltungsbedingungen zu beeinflussen.
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Wiener Tierärztliche Monatsschrift – Veterinary Medicine Austria
103 (2016)
Literatur
AHNE, W., WEILER A. (1978): Untersuchungen zur Virusempfänglichkeit von Fischzellkulturen. Deut Tierarztl Woch 87, 161–164.
AMEND, D.F., YASUTAKE, W.T., MEAD, R.W. (1969): A hematopoietic virus disease of rainbow trout and sockeye salmon. Trans
Am Fish Soc 98, 796–804.
AMEND, D.F., CHAMBERS, V.C. (1970): Morphology of certain viruses of salmonid fishes. I. In vitro studies of some viruses causing
hematopoietic necrosis. J Fish Res Board Can 27, 1285–1295.
ARIEL, E., SKALL, H.F., OLESEN, N.J. (2009): Susceptibility testing
of fish cell lines for virus isolation. Aquaculture 298, 125–130.
BAUDIN-LAURENCIN, F. (1987): IHN in France. Bull Eur Assoc Fish
Pathol 7, 104.
BEARZOTTI, M., DELMAS, B., LAMOUREUX, A., LOUSTAU, A-M.,
CHILMONCZYK, S., BREMONT, M. (1999): Fish rhabdovirus cell
entry is mediated by fibronectin. J Virol, 73, 7703–7709.
BERGMANN, S.M., FICHTNER, D., SKALL, H.F., SCHLOTFELDT, H.J.
OLESEN, N.J. (2003): Age- and weight-dependent susceptibility
of rainbow trout Oncorhynchus mykiss to isolates of infectious
haematopoietic necrosis virus (IHNV) of varying virulence. Dis
Aquat Org 55, 205–210.
BOOTLAND, L.M., LEONG, J.C. (1999): Infectious hematopoietic
necrosis virus. In: WOO, P.T.K., BRUNO, D.W. (Eds.): Fish diseases
and disorders, Volume 3: Viral, Bacterial and Fungal Infections,
CAB International, Oxon, UK, 57–121.
BOVO, G., GIORGETTI, G., JORGENSEN, P.E.V., OLESEN, N.J.
(1987): Infectious haematopoietic necrosis: first detection in Italy.
Bull Eur Assoc Fish Pathol 7, 124.
EMMENEGGER, E.J., MEYERS, T.R., BURTON, T.O., KURATH, G.
(2000): Genetic diversity and epidemiology of infectious hematopoietic necrosis virus in Alaska. Dis Aquat Org 40, 163–176.
ENZMANN, P.-J., DANGSCHAT, H., FENEIS, B., SCHMITT, D., WIZIGMANN, G., SCHLOTFELDT, H.-J. (1992): Demonstration of IHN
virus in Germany. Bull Eur Assoc Fish Pathol 12, 185.
FENDRICK, J.L., GROBERG, W.J. JR, LEONG, J.C. (1982): Comparative sensitivity of five fish cell lines to wild type infectious
haematopoietic necrosis virus from two Oregon sources. J Fish
Dis 5, 87–95.
FICHTNER, D., BERGMANN, S., ENZMANN, P.J., GRANZOW, H.,
SCHÜTZE, H., MOCK, D., SCHÄFER, J.W. (2000): Isolation and
characterization of a variant strain of infectious haematopoietic
necrosis (IHN) virus. Bull Eur Assoc Fish Pathol 20, 135–142.
KOLODZIEJEK, J., SCHACHNER, O., DÜRRWALD, R., LATIF, M.
NOWOTNY, N. (2008): “Mid-G” region sequences of the glycoprotein gene of Austrian infectious hematopoietic necrosis virus
isolates form two lineages within European isolates and are distinct
from American and Asian lineages. J Clin Microbiol 46, 22–30.
LORENZEN, E., CARSTENSEN, B., OLESEN, N.J. (1999): Inter-laboratory comparison of cell lines for susceptibility to three viruses:
VHSV, IHNV and IPNV. Dis Aquat Org 37, 81–88.
McALLISTER, P.E. (1997): Susceptibility of 12 lineages of Chinook
salmon embryo cells (CHSE-214) to four viruses from salmonid fish: implications for clinical assay sensitivity. J Aquat Anim
Health 9, 291–294.
McCAIN, B.B., FRYER, J.L., PILCHER, K.S. (1971): Antigenic relationship in a group of three viruses of salmonid fish by cross
neutralization. Proc Soc Exp Biol Med 137, 1042–1046.
NICHOL, S.T, ROWE, N.J.E, WINTON, J.R (1995): Molecular epizootiology and evolution of the glycoprotein and non-virion protein
genes of infectious hematopoietic necrosis virus, a fish rhabdovirus. Virus Res 38, 159–173.
REED, L., MUENCH, H. (1938): A simple method of estimation of
fifty percent endpoints. Am J Hyg 27, 493–497.
ROBERTS, R.J., SCHLOTFELDT, H.-J. (1985): RNS-Viruskrankheiten. In: ROBERTS, R.J. (Hrsg.): Grundlagen der Fischpathologie.
Parey, Berlin u. Hamburg, 124–156.
ROSS, A.J., PELNAR, J., RUCKER, R.R. (1960): A virus-like disease
of Chinook salmon. Trans Am Fish Soc 89, 160–163.
RUCKER, R.R., WHIPPLE, W.J., PARVIN, J.R., EVANS, C.A. (1953):
A contagious disease of salmon, possibly of virus origin. US Fish
Wild Serv Fish Bull 54, 35–46.
WATSON, S.W., GUENTHER, R.W., RUCKER , R.R. (1954): A virus
disease of sockeye salmon: interim report. US Fish Wild Serv
Fish Bull 138, 1–36.
WINGFIELD, W.H., FRYER, J.L., PILCHER, K.S. (1969): Properties
of the sockeye salmon virus (Oregon strain). Proc Soc Exp Biol
Med 130, 1055–1059.
WOLF, K. (1988): Infectious hematopoietic necrosis. In: WOLF, K.:
Fish viruses and fish viral diseases. Cornell University Press,
Ithaca, NY, 83–114.
YASUTAKE, W.T. (1975): Fish viral diseases: clinical, histopathological
and comparative aspects. In: RIBELIN, W.E., MIGAKI, G. (Eds.).
The pathology of fishes. Univ. Wisconsin Press, Madison, 247–271.
YOSHINAKA, T., YOSHIMIZU, M., EZURA, Y. (1997): Selection of
suitable cell line for isolation of the infectious hematopoietic
necrosis virus (IHNV) from ovarian fluid of salmonid fish. Fish
Pathol 32, 75–80.
Rechtsnormen:
Entscheidung 2001/183/E – Entscheidung der Kommission vom
22. Februar 2001 zur Festlegung der Probenahmepläne und Diagnoseverfahren zur Erkennung und zum Nachweis bestimmter
Fischseuchen und zur Aufhebung der Entscheidung 92/532/EWG.
319