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nnnnnn nn nnnnn nn nnnnnnn nn nnnnnnn nn nnnnn nn nnnnnnn nn nnnnnnn nn nnnnn nn nnnnnnn nn nnnnnnn nn nnnnn nn nnnnnnn nn nnnnnnn nn nnnnn nn nnnnnnn nn nnn nnnn nn nnnnn nn nnnnnnn nn nnnnnnn nn nnnnn nn nnnnnnn nn nnnnnnn nn n ÜBERSICHT nn nn nnnnnnn nn nnnnn nn nnnnnnn nn nnnnnnn nn nnnnn nn nnnnnnn nn nnnnnnn nn nnnnn nn nnnnnnn nn nnnnnnn nn nnnnn nn nnnnnnn nn nnnnnnn nn nnnnn nn nnnnnnn nn nnnnnnn nn nnnnn nn nnnnnnn nn nnnnnnn nn nnnnn nn nnnnnnn nn nnnnn 375 Tumorzelldissemination und Metastasierung beim gastrointestinalen Karzinom: Mechanismen, Nachweis und Bedeutung H. Spatz1, T. Kerner1, P. Vogel1, A. Fürst1, W. Dietmaier2, K.-W. Jauch1 Klinik und Poliklinik für Chirurgie der Universität Regensburg, Regensburg, Germany 2 Institut für Pathologie der Universität Regensburg, Regensburg, Germany Zusammenfassung. In Deutschland werden ca. ein Drittel der tumorbedingten Sterbefälle durch gastrointestinale Malignome verursacht. Die Therapieoption der ersten Wahl ist beim gastrointestinalen Karzinom die chirurgische Resektion entsprechend den chirurgisch-onkologischen Prinzipien nach möglichst früher Diagnosestellung. Während die Wahrscheinlichkeit für das Auftreten und die Häufigkeit eines Lokalrezidives mit durch den ¹Prognosefaktorª Chirurg beeinflusst wird, ist die Fernrezidivrate von über 30 % nach potenziell kurativer Resektion nach heutigem Kenntnisstand in erster Linie auf eine prä- bzw perioperative Tumorzelldissemination zurückzuführen. Diese früh aus dem primären Tumorverband herausgelösten Zellen sind mit konventionellen histopathologischen Verfahren und bildgebenden Staginguntersuchungen nicht nachweisbar, spielen jedoch bei der Metastasierungskaskade eine entscheidende Rolle. Im Sinne eines erweiterten Stagings ist heute jedoch deren Nachweis in verschiedenen Körperkompartimenten mittels immunzytochemischer oder molekularbiologischer Verfahren möglich, wobei eine Vielzahl von Studien deren klinische Relevanz und unabhängige prognostische Bedeutung belegt hat. Die gelegentlich jahrelange Latenzphase zwischen Resektion des Primärtumors und der Manifestation von Fernmetastasen mag teilweise durch die Beobachtung erklärt sein, dass die Mehrzahl der disseminierten Tumorzellen mitotisch inaktiv ist (¹dormancyª). Gleichzeitig könnte dies die eingeschränkte Wirksamkeit zellzyklusabhängiger, antiproliferativer Chemotherapeutika bedingen. Antikörpervermittelte, proliferationsunabhängige adjuvante Therapieverfahren scheinen hier eine neue, nebenwirkungsarme Therapieoption darzustellen, zumal mikrometastatische Tumorzellen leicht für intravenös applizierte Chemotherapeutika, Makromoleküle und immunkompetente Effektozellen zugänglich sind. Zusätzlich könnte die Analyse der Tumorzelldissemination im Verlauf einer systemischen Therapie auch als Surrogatmarker für deren Effizienz Verwendung finden. Schlüsselwörter: Tumorzelldissemination ± Minimal residual disease ± Knochenmark ± Lymphknoten ± Prognose ± Metastasierung Viszeralchirurgie 2000; 35: 375 ± 384 Georg Thieme Verlag Stuttgart New York · Tumor cell dissemination and metastasis in gastrointestinal cancer: Mechanisms, detection and clinical relevance. In Germany, about one third of tumor-related deaths are caused by gastrointestinal carcinomas. Complete resection according to surgical and oncological principles after early diagnosis is the therapeutic approach of choice. While the incidence of local recurrence after complete resection is considerably affected by the skills of the surgeon, distant relapse in up to 30 % is mainly due to pre- and/or perioperative tumor cell dissemination. Conventional histopathological methods and current radio-imaging techniques are unlikely to detect these cells that have left the primary tumor site and play a crucial role in the formation of distant metastasis. Immunocytochemical and molecular methods have made individual disseminated tumor cells detectable in various compartments of a patients organism and their presence is increasingly considered as a clinically relevant and independent prognostic factor. The majority of these tumor cells appears to be nonproliferating (ªdormancyª) which may explain the limited efficacy of cell-cycle dependent antiproliferative chemotherapeutic agents. This mitotic inactivity could also account for the latency period between resection of the primary tumor and the manifestation of distant metastasis. In this context, antibody mediated therapeutic approaches directed against quiescent disseminated tumor cells seem to be of clinical relevance, particularly since isolated micrometastatic cells are easily accessible for intravenously applied therapeutic agents, macromolecules and immunologic effector cells. In addition, the monitoring of circulating cancer cells in the course of a systemic therapy could be useful in determining the efficacy of new therapeutic agents at an early point. Key words: Tumor cell dissemination ± Minimal residual disease ± Bone marrow ± Lymph node ± Prognosis ± Metastasis Heruntergeladen von: Thieme E-Books & E-Journals. Urheberrechtlich geschützt. 1 Viszeralchirurgie 2000; 35 Spatz H et al Einleitung Tumorzellnachweis Ergebnisse epidemiologischer Studien legen nahe, dass 30 ± 40 % der Bevölkerung westlicher Industrienationen an einem malignen Tumorleiden versterben werden. Ungefähr 90 % dieser Tumoren sind Karzinome, also Malignome epithelialen Ursprungs. In Deutschland werden ca. 35 % der tumorbedingten Sterbefälle durch gastrointestinale Malignome verursacht [1]. Die Therapieoption der ersten Wahl ist beim gastrointestinalen Karzinom die chirurgische Resektion entsprechend den chirurgisch-onkologischen Prinzipien nach möglichst früher Diagnosestellung. Während die Wahrscheinlichkeit für das Auftreten und die Häufigkeit eines Lokalrezidives mit durch den ¹Prognosefaktorª Chirurg beeinflusst wird [2], ist die Fernrezidivrate von über 30 % nach potenziell kurativer Resektion nach heutigem Kenntnisstand auf eine prä- bzw perioperative Tumorzelldissemination im Sinne einer frühen systemischen Tumorerkrankung zurückzuführen [3]. Seit der schrittweisen Etablierung zunächst immunhistochemischer und später molekularbiologischer Verfahren seit Anfang der 80er Jahre zum Nachweis disseminierter Tumorzellen [4] in verschiedenen Körperkompartimenten weist eine Vielzahl von Studien jedoch auf deren prognostische Bedeutung hin. Diese früh aus dem primären Tumorverband herausgelösten Zellen sind mit konventionellen histopathologischen Verfahren und bildgebenden Staginguntersuchungen nicht nachweisbar und gehen bisher nur optional als ¹miª (für Mikrometastasen) und ¹iª (für isolierte Tumorzellen) in die Staging-Nomenklatur der UICC ein [5]. Die Entscheidung zur adjuvanten systemischen Therapie nach potenzieller R0-Resektion des Primärtumors wird heute anhand statistisch gewonnener Prognoseindizes gestellt, wobei die für das individuelle Risikoprofil wichtige Komponente der systemischen Tumorzelldissemination noch nicht miteingeht. Gerade das Wissen um den Zusammenhang zwischen systemischer Tumorzelldissemination und erhöhtem Rezidivrisiko macht den Nachweis dieser Zellen besonders attraktiv, um Patienten zu selektionieren, die von neueren postoperativen Therapiestrategien profitieren könnten oder auch andererseits, Patienten ohne Tumorzellnachweis die belastende Therapie ersparen zu können. Im Gegensatz zu soliden Metastasen stellen isolierte mikrometastatische Tumorzellen speziell im Knochenmark aufgrund ihrer Zugänglichkeit für Makromoleküle und immunkompetente Effektorzellen geeignete Ziele für intravenös verabreichte Therapeutika dar. Da die Mehrzahl der disseminierten Tumorzellen mitotisch inaktiv ist [6], müssen konventionelle chemotherapeutische Agenzien zum Scheitern verurteilt sein. Antikörpervermittelte, zellgerichtete Therapieverfahren scheinen hier eine neue, nebenwirkungsarme Therapiealternative darzustellen, die auch als Kombinationsbehandlung mit Chemotherapeutika sinnvoll erscheint. Diese therapeutische Rationale scheint mit dem Antikörper 17-1A für das kolorektale Karzinom im Stadium Dukes C nach 7-jähriger Nachbeobachtungszeit belegt [7]. Neben dem rein quantitativen Nachweis disseminierter Zellen ist auch deren phänotypische Charakterisierung hinsichtlich metastasierungsrelevanter Gene oder ihres Proliferationsverhaltens zum besseren Verständnis tumorbiologischer Vorgänge entscheidend. Auûerdem kann die Analyse der Tumorzelldissemination im Verlauf einer systemischen Therapie auch als Surrogatmarker für deren Effizienz Verwendung finden. Der Nachweis isolierter disseminierter Tumorzellen ist prinzipiell in verschiedenen Kompartimenten möglich. Bisher konnten einzelne Zellen in peripherem Blut, Peritoneallavage, Knochenmarksaspiraten und drainierenden Lymphknoten sowie parenchymatösen Organen detektiert werden. Das Knochenmark hat sich in den meisten Studien als Indikatororgan etabliert, da in diesem mesenchymalen Kompartiment normalerweise keine Zellen epithelialen Ursprungs zu finden sind, gleichzeitig jedoch ein intensiver Zellaustausch zwischen Blut und Interstitium in den Sinusoiden des Organs stattfindet. Vom Primärtumor hierher disseminierte Zellen müssen hypothetisch zur Gefäûinvasion und Extravasation befähigt gewesen sein und sich zusätzlich dem hohen Zelluntergang während der Kreislaufpassage widersetzt haben. Dadurch erscheinen diese Zellen hinsichtlich ihres metastatischen Potenzials von besonderer Bedeutung. Auûerdem ist die Aspiration der Proben einfach, wiederholbar und für den Patienten ungefährlich [8]. Methoden Bereits mit histopathologischen und zytomorphologischen Methoden lassen sich einzelne Tumorzellen in verschiedenen Geweben nachweisen, dabei ist jedoch sowohl die Sensitivität als auch die Spezifität sowie die Praktikabilität dieser Detektionsverfahren ungeeignet, um groûe Mengen an Probenmaterial auf das Vorliegen zum Teil einzelner Zellen zu untersuchen [9,10]. Zum Nachweis disseminierter epithelialer Zellen in den verschiedenen Kompartimenten kommen daher die Immunzyto-Histochemie und molekularbiologische Methoden zur Anwendung. Zur immunhistochemischen Detektion disseminierter Tumorzellen werden vornehmlich monoklonale Antikörper verwendet, die gegen stabil exprimierte Zytokeratine der epithelialen Tumorzelle gerichtet sind. Vorraussetzung ist die fehlende Zytokeratinexpression in den Zellen des jeweils untersuchten Zielgewebes. Zusätzlich finden Antikörper gegen membrangebundene Muzine oder tumorassoziierte Glykoproteine (z. B. TAG12) Verwendung. Mit dieser Technik liegt die Sensitivität bei einer Nachweisquote von etwa einer Tumorzelle in 105 ± 106 mononukleären Zellen [11]. Neuere Arbeiten verwenden zum Nachweis isolierter Tumorzellen auch deren Anreicherung mit immunomagnetischen Techniken [12]. Mit Hilfe der Polymerasekettenreaktion als molekularbiologischen Ansatz lassen sich disseminierte Tumorzellen ebenfalls mit hoher Sensitivität und Spezifität nachweisen. Neben dem Nachweis tumorspezifischer DNA-Mutationen (z. B. k-ras- oder p53-Mutationen) mittels PCR lässt sich auch die Expression von Markergenen auf m-RNA-Ebene mit Hilfe der Reverse-Transkriptase-PCR (RT-PCR) nachweisen. Die Sensitivität dieser Methodik liegt bei einer Nachweisrate von 1 Tumorzelle auf 107 [13] mononukleare Zellen. Tumorzelldissemination und Metastasierung Während das Knochenmark häufiges Zielorgan für Metastasen einiger solider epithelialer Tumoren ist (Mamma, Lunge, Prostata), führen gastrointestinale Karzinome nur selten zu ossären Filiae. Der Nachweis von so genannten disseminierten Tumorzellen im Knochenmark ist in diesem Fall ein Hinweis auf eine hämatogene Tumorzellaussaat, wobei die sekundäre Absiedlung in das jeweilige Zielorgan durch die Interaktion Heruntergeladen von: Thieme E-Books & E-Journals. Urheberrechtlich geschützt. 376 Tumorzelldissemination und Metastasierung beim gastrointestinalen Karzinom Viszeralchirurgie 2000; 35 377 Tab. 1 Studien zur prognostischen Bedeutung des immunhistochemischen Nachweises epithelialer Zellen im Knochenmark von Patienten mit gastrointestinalen Karzinomen Detektionsrate prognostischer Wert Ösphaguskarzinom Thorban et al. CK2, KL1, A45-B/B3 30/71 (42,3 %) R0: DFS Magenkarzinom Jauch et al. CK-18 95/180 (53 %) Schlimok et al. CK-18 34/97 (35,1 %) R0: DFS, OS T1/T2: DSF* N0: DSF* Intestinal (Lauren): DSF* R0: DFS Heiss et al. uPA-R CK-18 20/44 (45 %) 47/87 (60 %) R0: DFS R0: DFS 41,5 (9 ± 61) maximal 12 Monate keine 63 24/42 (57 %) 25/48 (52 %) R0 und Bauchhöhle und/oder Knochenmark: OS R0: DSF, OS R0: OS 12,7 (3 ± 32) 22,8 (3 ± 48) Rezidifhäufigkeit Rezidivhäufigkeit 64 66 28/88 (32 %) 36/145(25 %) R0: DFS* R0: OS,DFS* 35 (12 ± 58) 39 (12 ± 62) keine keine 71 72 Pankreaskarzinom Juhl et al. Thorban et al. Roder et al. Marker CEA, Ca19-9, 17-1A, 17/28 (61 %) Ra96,C54-0 CK-18 CK2, KL1, A45-B/B3 Kolorektales Karzinom Lindemann et al. CK-18 Leinung et al. A45-B/B3 Nachbeobachtung (Monate) Korrelation mit klinischpatholog. Parametern Literatur keine 44 30,6 (6 ± 56) T-Stadium, Borrmann-Klass 55 25,4 LaurØn-Klass, N-Stadium Lymphangiose 54 9,5 (3 ± 24) 33 DSF =¹disease free survivalª (rezidivfreie Überlebenszeit), OS =¹overall survivalª (Gesamtüberlebenszeit), * prognostischer Wert als unabhängiger Parameter durch multivariate Analyse bestätigt der losgelösten Tumorzelle und dem ¹microenvironmentª des jeweiligen Zielorgans bedingt wird (¹seed and soilª). Prinzipiell ist eine Vielzahl von Milieubedingungen und Tumorzelleigenschaften erforderlich, um die Metastasierungskaskade von der Loslösung der Tumorzelle aus dem Primärverband bis zur Absiedelung und Proliferation im metastatischen Zielorgan zu ermöglichen (Abb. 1). Zunächst erfolgt die Loslösung einer Tumorzelle aus dem Primärtumorverband durch Lockerung der Zell-Zell-Kontakte, wobei die herunteregulierte Expression von Zelladhäsionsmolekülen, die den interzellulären Kontakt des Tumorverbundes stärken, eine wichtige Rolle spielen kann [14 ± 16]. Proteolyse und die Sekretion migrationsstimulierender Faktoren führen dann zur Desintegration der Basalmembran und einer zielgerichteten Abwanderung über das umgebende Stroma und letztlich zur Gefäûinvasion. Während der Kreislaufpassage geht ein Groûteil dieser disseminierten Zellen aufgrund mechanischer und immunologischer Vorgänge zugrunde. Die erneute Extravasation des verbleibenden Rests dieser Zellen und deren Absiedelung im jeweiligen Zielorgan ist unter anderem abhängig von der Interaktion zwischen den endothelständigen Adhäsionsmolekülen und den jeweiligen auf der Tumorzelle exprimierten Liganden [17,18]. Die organspezifischen Expressionsmuster der einzelnen Adhäsionsmoleküle unterliegen jedoch einer ausgesprochenen Heterogenität. Dieses Phänomen mag neben den rein anatomischphysikalischen Bedingungen ein Erklärungsansatz für die Organpräferenz der Metastasierung einzelner Tumore sein [19, 20]. Für das Überleben der einzelnen isolierten Zelle während dieses Metastasierungsprozesses und ihrer erfolgreichen Proliferation im jeweiligen Zielgewebe spielen nach derzeitiger Datenlage neben ¹Seed and soilª-Faktoren auch Abb. 1 Schematische Darstellung der Tumorzelldissemination die Immunüberwachung, Angiogenese und das Phänomen einer mitotischen Inaktivität (¹dormancyª) eine entscheidende Rolle. Malignitätsnachweis disseminierter Tumorzellen Der reine Nachweis des Vorhandenseins von Zellen epithelialen Ursprungs im Blut, drainierenden Lymphknoten oder Knochenmark von Patienten mit einem gastrointestinalen Malignom beweist noch nicht, dass es sich dabei um vom primären Tumorverband losgelöste Krebszellen handelt. Das maligne Potenzial disseminierter zytokeratin-positiver Zellen wurde anhand immunhistochemischer Doppelfärbun- Heruntergeladen von: Thieme E-Books & E-Journals. Urheberrechtlich geschützt. Tumorart Autor Viszeralchirurgie 2000; 35 Spatz H et al Tab. 2 Studien zur prognostischen Bedeutung des Nachweises epithelialer Zellen in histopathologisch als ¹tumorfreiª klassifizierten Lymphknoten von Patienten mit gastrointestinalen Karzinomen der Kategorie N0 Tumorart Autor Marker Ösphaguskarzinom Izbicki et al. Ber-Ep4 Natsugoe et al. AE1/AE3 Magenkarzinom Harrison et al. CAM 5.2 Maehara et al. CAM 5.2 Pankreaskarzinom Hosch et al. Ber-Ep4 Kolorektales Karzinom Greenson et al. AE1/AE3 Liefers et al. CEA mRNA (RT-PCR) Detektionsrate Lymphknoten 67/399 (17 %) Patienten prognostischer Wert Nachbeobachtung Korrelation (Monate) mit klinischpatholog. Parametern Literatur 15/30 (50 %) 15/41 (36,6 %) OS*, DFS* OS 25 (2 ± 51) 38 (12 ± 78) keine keine 47 48 9/25 (36 %) 25 (4 ± 195) nicht ermittelt 61 > 180 Tumorstadium 60 15/420 (3,6 %) 8/34 (23,5 %) 5 Jahres Überlebensrate OS 16/37 (43,2 %) 9/12 (75 %) DFS*, OS* 16,7 (5 ± 44) keine 67 33/568 (5,8 %) 36/192 (19 %) 14/50 (28 %) 14/26 (54 %) OS* DFS, OS* 60,3 73 (66 ± 85) nicht ermittelt keine 82 83 DSF =¹disease free survivalª (rezidivfreie Überlebenszeit), OS =¹overall survivalª (Gesamtüberlebenszeit), * prognostischer Wert als unabhängiger Parameter durch multivariate Analyse bestätigt gen näher untersucht. Dabei konnten tumorassoziierte Charakteristika wie die Expression von Lewis-Y-Blutgruppenvorläuferantigenen und p53, die Überexpression des erb-B2-Onkogens und die herunterregulierte Expression von MHC-Klasse-1Molekülen beschrieben werden [6, 21, 22]. Interessanterweise lieûen sich p53-Genprodukte oder Mutationen im p53-Tumorsuppressorgen nicht gehäuft in CK-positiven Zellen des Knochenmarks nachweisen [23]. Die Herunterregulierung der Oberflächenexpression von HLA-1- Molekülen, die als Restriktionselemente für die T-Lymphozyten vermittelte Tumorzellerkennung dienen, könnte die fehlende Erkennung dieser Zellen durch Immun-Effektorzellen erklären und eine Überlebensbedingung disseminierter Zellen im Verlauf des Metastasierungsprozesses darstellen [6]. Ein weiterer Nachweis maligner Eigenschaften mikrometastatischer Zellen im Knochenmark gelang mit Hilfe der Fluoreszenz-in-Situ-Hybridisierungs-Technik (FISH). Dabei konnten numerische Aberrationen in den Chromosomen 7,8 und 18 detektiert werden. Ebenso gelang der Nachweis einer Amplifikation des erb-B2-Gens (Thyrosin-Kinase-Rezeptor) in diesen Zellen [6, 24]. Mit Hilfe der RT-PCR konnte auf mRNA-Ebene die Expression von Genen der MAGE-Familie gezeigt werden, ein weiteres übliches Charakteristikum maligner Zellen [25]. Zusätzlich wurde in neueren Arbeiten sowohl ein Verlust der Heterozygotie (¹Loss of hetercygosityª, LOH) [26, 27] bestimmter tumorrelevanter Gene wie z. B. des APC Tumor-Suppressor-Genes als auch Kiras-Mutationen und das Vorliegen von Mikrosatelliten Instabilitäten (MSI) in disseminierten Tumorzellen des Knochenmarks beschrieben. So können MSI die Expression von Genen beeinflussen, die mit Zellproliferation, Zelladhäsion, Invasion und Metastasierung in Verbindung gebracht werden [28]. Letztlich gelang sogar erstmals der Nachweis des tumorigenen Potenzials von immunistochemisch detektierten und in Zellkultur gebrachten Tumorzellen aus einem histopathologisch tumorfreien Lymphknoten eines Patienten mit Ösophaguskarzinom. Nach subkutaner Injektion dieser Zelllinie in immundefiziente SCID-Mäuse kam es bei allen Tieren zu einer fortschreitenden Tumorbildung [29]. Proteolytisches Potenzial und Invasivität Die für die Invasion und Metastasierung erforderliche Proteolyse umgebender Matrixkomponenten wird durch eine ganze Reihe von tumorassoziierten Serin-, Cystein-, Threonin und Metalloproteinasen erreicht. Zahlreiche Untersuchungen konnten zeigen, dass die Überexpression von proteolytischen Parametern auf dem Primärtumor mit einer erhöhten Aggressivität bzw. Invasivität und einer schlechteren Prognose beim gastrointestinalen Karzinom einhergeht [30, 31]. Für das Magenkarzinom konnte die Überexpression von PAI-1, eine Komponente aus dem Urokinase-Plasminogen-Aktivator-Komplex auf dem Primärtumor als unabhängiger prognostischer Faktor ermittelt werden [32]. Die gleiche Arbeitsgruppe konnte auûerdem zeigen, dass die Expression von uPA-R auf disseminierten Tumorzellen im Knochenmark nicht nur signifikant mit der Lymphgefäûinvasion korrelierte sondern auch ein signifikanter Prädiktor für ein frühes Tumorrezidiv und ein starker unabhängiger prognostischer Faktor war [33]. Putz et al. konnten an in Kultur gebrachten Zelllinien aus Knochenmarksaspiraten von Patienten mit verschiedenen soliden Tumoren (Prostata, Mamma, Lunge, Kolon) ein sehr differenziertes Expressionsmuster von tumor- bzw metastasierungsassoziierten Antigenen feststellen [34]. Auffallend war die Herunterregulation der Expression verschiedener homophiler Adhäsionsrezeptoren (z. B. Plakoglobin und Desmoglein), was zum Verlust von Zell-Zell-Kontakten führen und damit die Dissemination von Tumorzellen erleichtern könnte. Zusätzlich zeigte sich ein Übergang von epithelialer zu mesenchymaler Prägung dieser Zellen durch die starke Koexpression des mesenchymalen Zytoskellett-Proteins Vimentin auf CK-positive Zellen. In vitro kann dies eine erhöhte Motilität, Plastizität und Wachstumsrate mikrometastatischer Zellen bedeuten und erhöht damit das metastatische Potenzial dieser Zellen [35 , 36]. Heruntergeladen von: Thieme E-Books & E-Journals. Urheberrechtlich geschützt. 378 Tumorzelldissemination und Metastasierung beim gastrointestinalen Karzinom In einer Vielzahl von Zellkulturexperimenten wurde ein zeitlich limitiertes proliferatives Potenzial dieser ins Knochenmark disseminierten Zellen gezeigt [37]. Damit scheint eine autonome Proliferation dieser Zellen erschwert und dies mag den oft jahrelangen Latenzzustand erklären, der im englischen Sprachgebrauch auch als ¹dormancyª bezeichnet wird. Diese Vermutung wurde durch Doppelfärbetechniken untermauert, wobei gezeigt werden konnte, dass nur ein kleiner Anteil dieser ins Knochenmark disseminierten Zellen Proliferationsmarker wie Ki-67 oder p120 exprimiert [6]. Welche lokalen Bedingungen herrschen müssen, damit eine Tumorzelle diese Phase der mitotischen Inaktiviät (G0-Phase) verlassen kann, um durch Proliferation letztlich eine Tochtergeschwulst enstehen zu lassen, ist weithin unbekannt. Chekmareva et al. gelang jedoch kürzlich die Entdeckung einer neuen Region auf Chromosom 17, welche die Gene von mikrometastatischen Zellen beim Prostatakarzinom steuern könnte, die für die Regulierung der ¹dormancyª verantwortlich sind [38]. Therapeutische Implikationen Mit bisherigen adjuvanten Therapieschemata kann nach radikaler Entfernung eines nicht metastasierten Primärtumors (R0) nur eine relative Reduktion der Mortalität von bis zu 30 % erreicht werden [39]. Neben dem Versuch, die Chemosensibiliät [40] von Tumorzellen zu erhöhen, könnten disseminierte Tumorzellen in diesem Szenario als Angriffspunkt neuer Therapiestrategien eine wichtige Rolle spielen, da sie als Korrelat der ¹minimal residual diseaseª in ca. 50 % aller kurativ resezierten Patienten mit gastrointestinalen Tumoren nachweisbar sind. Die Elimination einzelner Zellen in einem durch intravenöse Applikation von therapeutischen Agenzien leicht zugänglichen Kompartiment wie dem Knochenmark erscheint wesentlich erfolgverprechender als die Behandlung einer klinisch manifesten Metastasierung mit entsprechend groûer Tumormasse. Die Effizienz antiproliferativer Chemotherapeutika muss bei einer mitotisch überwiegend inaktiven disseminierten Tumorzelle jedoch allein vom Wirkmechanismus her eingeschränkt sein. Adjuvante Therapieansätze mit spezifischen Antikörpern erscheinen hier vielversprechend, da sie die Zielzelle unabhängig von deren proliferativem Status oder eventuell vorliegenden Chemotherapieresistenzen attackieren können. Die Elimination kann dann durch zell,- komplement,oder andere humorale Faktoren vermittelte Wirkmechanismen erfolgen [41]. Aufgrund der Heterogenität residualer Tumorzellen und deren Primärtumoren hinsichtlich der Expression von Oberflächenantigenen erscheint die Gabe eines einzelnen Antikörpers als Monotherapie nicht ausreichend. Vorstellbar wäre, das individuelle Profil an Membranproteinen vorab anhand Doppelfärbungsanalysen zu ermitteln, um dann durch die Gabe eines Antikörpercocktails einen besseren Therapieeffekt zu erzielen [42]. Zusätzlich erscheint die Entwicklung von Tumorvaccinen mit Hilfe in Kultur gebrachter immortalisierter disseminierter Tumorzellen ein interessanter Therapieansatz zu sein. Eine mögliche Wirksamkeit dieser Methode wird durch die Beobachtung gestützt, dass bei der Prozessierung dieser Zellen die sonst beschriebene Herunterregulierung von HLA-1-Antigenen oder ICAM-1 nicht stattzufinden scheint [37]. 379 Letztlich gelang der bisher einzig publizierte Wirksamkeitsnachweis einer antikörpervermittelten adjuvanten Therapie (17 - 1A) im Rahmen einer prospektiven randomisierten Studie beim kolorektalen Karzinom im Stadium UICC III nach R0Resektion. Hier konnte eine signifikante Verbesserung des Gesamtüberlebens für behandelte Patienten nach einer Nachbeobachtungszeit von 7 Jahren demonstriert werden, wobei es zusätzlich im Rahmen der Therapie zu einer signifikanten Reduktion von Fernmetastasen kam, ein Einfluss auf die Lokalrezidivrate war jedoch nicht nachweisbar [7]. Diese Beobachtung scheint die Richtigkeit der therapeutischen Rationale der antikörpervermittelten Therapie im Sinne einer Elimination mikrometastatischer Zellen zu unterstreichen. Gleichzeitig hebt dieses Ergebnis jedoch die Bedeutung der radikalen chirurgischen Resektion im Hinblick auf die Entwicklung eines Lokalrezidivs hervor [43]. Prognostische Bedeutung disseminierter Tumorzellen beim gastrointestinalen Karzinom Ösophaguskarzinom Die Prävalenz disseminierter Tumorzellen im Knochenmark von Patienten mit Ösophaguskarzinomen wurde bislang nur in wenigen Studien mit zum Teil geringen Fallzahlen untersucht. Thorban et al. fanden in 30 von 71 Patienten (42,3 %) disseminierte Tumorzellen im Knochenmark [44, 45], wobei die Nachweisrate in fortgeschrittenen Stadien deutlich höher war als in niedrigen (49 % vs. 37 %). In einem Nachbeobachtungszeitraum von 9,5 Monaten zeigte sich eine signifikante Korrelation von Knochenmarksbefund und rezidivfreiem Überleben potenziell kurativ operierter Patienten [44]. Groûen Einfluss auf die Nachweisrate scheint der Ort der Knochenmarksentnahme zu spielen. OSullivan et al. verglichen Knochenmark aus dem Beckenkamm mit Knochenmark aus bei der Operation resezierten Rippensegmenten und fanden sehr unterschiedliche Nachweisraten (15 % Beckenkamm vs. 88 % Rippen). Es bestand keine Korrelation zur Tumorgröûe, Lymphknotenstatus oder histologischem Typ [46]. Von hoher prognostischer Bedeutung scheinen disseminierte Tumorzellen in regionalen Lymphknoten zu sein. Izbicki et al. untersuchten 399 in der konventionellen Histologie tumorfrei befundete Lymphknoten zusätzlich immunhistologisch und konnten in 17 % disseminierte Tumorzellen nachweisen. In einer multivariaten Analyse wurde dieser Lymphknotenbefund als unabhängiger prognostischer Parameter sowohl für das rezidivfreie als auch für das Gesamtüberleben bestätigt, während dem Knochenmarksbefund in dieser Studie keine prognostische Bedeutung zukam [47]. Für das Plattenepithelkarzinom des Ösophagus fanden Natsugoe et al. heraus, dass die Gesamtüberlebensraten von Patienten mit immunhistochemisch nachweisbaren Mikrometastasen in histopathologisch als ¹tumorfreiª befundeten regionalen Lymphknoten (N0) und Patienten mit histopathologisch nachweisbarem Lymphknotenbefall (N1) vergleichbar waren. Die Autoren fordern daher, solche Patienten nach immunhistochemischer Untersuchung ebenfalls als N1 zu klassifizieren [48]. Magenkarzinom Die Nachweisraten disseminierter Tumorzellen im Knochenmark von Patienten mit Magenkarzinom schwanken zwischen 25 % und 82 % [49, 50]. Korrelationen zwischen Knochenmarks- Heruntergeladen von: Thieme E-Books & E-Journals. Urheberrechtlich geschützt. Latenzphase (¹dormancyª) Viszeralchirurgie 2000; 35 Viszeralchirurgie 2000; 35 befund und histologischer Differenzierung, Lauren-Klassifikation, UICC-Stadium und anderen klinisch-pathologischen Parametern wurden in mehreren Studien gefunden [49 ± 54]. In der bislang gröûten Studie von Jauch et al. [55] mit 180 Patienten bestand bei einer Prävalenz disseminierter Tumorzellen von 53 % eine Korrelation zur Tumorgröûe und der Bormann-Klassifikation. In einer multivariaten Analyse bestätigte sich der Knochenmarksbefund als unabhängiger prognostischer Parameter für das rezidivfreie Überleben von Patienten mit T1- oder T2-Tumoren, Karzinomen vom intestinalen Typ und Magenkarzinomen ohne Lymphknotenbefall. Der Nachweis disseminierter Tumorzellen im Knochenmark bei Tumoren, die vorwiegend hämatogen metastasieren, wie lokal begrenzte Tumoren vom intestinalen Typ ohne Lymphknotenbeteiligung, scheint geeignet, bereits in frühen Tumorstadien eine systemische Erkrankung anzuzeigen. Diese Bedeutung kommt dem Tumorzellnachweis im Knochenmark bei fortgeschritteneren Tumoren oder Tumoren mit histologisch nachgewiesenem diffusen Typ nicht zu. Die Prognose dieser Tumoren hängt von der peritonealen Metastasierung ab. Die prognostische Bedeutung des peritonealen Tumorzellnachweises beim Magenkarzinom wurde in einer Reihe von Studien gezeigt, wobei durch Verwendung immunzytologischer Nachweisverfahren eine höhere Aussagekraft erreicht wird [55 ± 58]. Ein weiterer prognostischer Aspekt zeigt sich bei der Betrachtung des Knochenmarksstatus im Langzeitverlauf. Während in einer Serie von 78 potenziell kurativ operierten Patienten der Knochenmarksstatus zum Zeitpunkt der Primäroperation keine Korrelation mit dem rezidivfreien Überleben zeigte, kam den in Folgepunktionen (9 bis 61 Monate postoperativ) ermittelten Veränderungen prognostische Bedeutung zu. Eine günstige Prognose zeigten Patienten, die sowohl primär wie in der Folge tumorzellfrei waren oder zwar primär positiv aber in Folgepunktionen negativ [33]. Demgegenüber hatten Patienten, die zwar zum Operationszeitpunkt tumorzell-negativ waren aber in der Folgepunktion eine Tumorzelldissemination aufwiesen, eine schlechtere Prognose. Diese Beobachtungen zeigen, dass neben der frühen systemischen Komponente die Interaktion des Organismus mit disseminierten Tumorzellen im zeitlichen Verlauf die Prognose der Tumorerkrankung bestimmt. Die Enzym- und Rezeptorausstattung isolierter Tumorzellen ist ebenfalls von prognostischer Bedeutung, da diese Bestandteile bei der Zellmigration und somit der Vorstufe der Metastasenbildung eine wichtige Rolle spielen. Die Expression des Urokinase-Typ-Plasminogen-Aktivator-Systems (uPA) mit seinem entsprechenden Rezeptor (uPA-R) auf disseminierten Tumorzellen beim Magenkarzinom korreliert mit einer höheren Rezidivrate und somit schlechteren Prognose [33]. Der immunzytologische Nachweis disseminierter Tumorzellen gelingt auch in regionalen Lymphknoten. Verglichen mit der konventionellen histologischen Aufarbeitung lässt sich dadurch ein deutlich höherer Anteil befallener Lymphknoten, auch bei kleinen und auf die Mukosa beschränkten Tumoren nachweisen. Die Aussagen zur prospektiven Bedeutung dieser okkult befallenen Lymphknoten differiert jedoch, so dass keine klare Empfehlung dieser Methode gegeben werden kann [59 ± 61]. Spatz H et al Pankreaskarzinom Die Nachweisraten disseminierter Tumorzellen im Knochenmark von Patienten mit Pankreaskarzinomen schwanken zwischen 48 % und 61 %, wobei in einem hohen Prozentsatz (43 %) der Nachweis bereits in frühen Stadien (I/II) gelang [62, 63]. In einer Studie an 34 Patienten mit Pankreaskarzinom konnten Juhl et al. erstmals zeigen, dass mikrometastatische Zellen in der Bauchhöhle bei 58 % und im Knochenmark bei 61 % zum Zeitpunkt der Operation immunhistochemisch nachweisbar waren. Die Nachweisrate dieser Zellen in Bauchhöhle und/ oder Knochenmark lag bei radikal resezierbaren Patienten bei 54 % gegenüber 89 % bei palliativ operierten Patienten. Die Einjahresüberlebensrate von 29 nachuntersuchten Patienten schien dabei signifikant mit dem Nachweis dieser Zellen aus Bauchhöhle und/oder Knochenmark korreliert zu sein. Der alleinige Nachweis dieser Zellen im Knochenmark war nicht von prognostischer Bedeutung [63]. Thorban et al. konnten in einer Untersuchung an 42 Patienten darstellen, dass Rezdivfreiheit und das Ausbleiben von Fernmetastasen signifikant mit dem Nachweis einer Tumorzelldissemination ins Knochenmark korrelierte (mittlere Nachbeobachtung 12,7 Monate). Zusätzlich lieû sich ein Überlebensvorteil der R0-resezierten Patienten (n = 24) in Abhängigkeit ihres Knochenmarkstatus ermitteln (max. Nachbeobachtung 50 Monate) [62, 64]. Diese Beobachtungen konnte von denselben Autoren anhand höherer Patientenzahlen verifiziert werden [65, 66]. Die Wertung dieser Aussagen ist jedoch sowohl aufgrund der Kürze der Nachbeobachtung und der geringen Fallzahl unter Vorbehalt vorzunehmen. Der Nachweis isolierter Tumorzellen in den drainierenden Lymphknoten wurde auch beim Pankreaskarzinom mittels verschiedener Techniken vorgenommen. Erste Untersuchungen wiederum an kleinen Kollektiven weisen darauf hin, dass der immunhistochemischen Detektion von isolierten Tumorzellen in histopathologisch freien Lymphknoten eine mögliche prognostische Bedeutung hinsichtlich rezidivfreiem Überleben und der Gesamtüberlebenszeit zukommen könnte [67]. Der Nachweis solcher Zellen mittels PCR-vermittelter Detektion von k-ras-Mutationen ist ebenso beschrieben, wobei die prognostische Wertigkeit dieser Beobachtung noch aussteht [68]. Kolorektales Karzinom Schon seit Mitte der 30er Jahre wurden mit Hilfe zytologischer Untersuchungen von Blutausstrichpräparaten im peripheren Blut zirkulierende Tumorzellen während der Resektion des kolorektalen Karzinoms nachgewiesen. Die Inzidenz lag dabei in verschiedenen Studien zwischen 25 ± 67 %. Die prognostische Relevanz dieser Befunde wird jedoch aufgrund der unsicheren Spezifität des zytologischen Tumorzellnachweises infrage gestellt [69]. Mit immunhistochemischer Technik gelang Leather u. Mitarb. der Nachweis von disseminierten Tumorzellen bei ca. 10 % der Patienten, wobei sie keine Aussage über die prognostische Wertigkeit dieses Befundes machen konnten [10]. In einer neueren Arbeit konnte unter Zuhilfenahme der RT-PCR gegen das Zielgen Cytokeratin 20 auf zirkulierenden Tumorzellen eine signifikante Korrelation zwischen Nachweisquote und Tumorstadium gezeigt werden, auûerdem gelang bei 19% der Patienten durch sequenzielle Blutabnahmen der Nachweis einer statistisch signifikanten perioperativen Tumor- Heruntergeladen von: Thieme E-Books & E-Journals. Urheberrechtlich geschützt. 380 Tumorzelldissemination und Metastasierung beim gastrointestinalen Karzinom Im Knochenmark wurde die unabhängige prognostische Relevanz hinsichtlich des rezidivfreien Überlebens und der immunhistochemischen Detektion von disseminierten Tumorzellen zum Zeitpunkt der Operation an 88 Patienten durch Lindemann et al. gezeigt [71]. In mehreren Folgestudien, zuletzt von Leinung et al. wurde dies bestätigt. Auch in diesem Kompartiment ist der Nachweis solcher Zellen mit der CK20 RT-PCR möglich, wobei die Nachweisquote mit dem Tumorstadium korreliert zu sein scheint, ohne dass bereits Daten zur prognostischen Wertigkeit dieser Beobachtung vorliegen [73]. Am eigenen Kollektiv zeigt sich eine deutlich höhere Nachweisrate disseminierter Tumorzellen bei synchroner Lebermetastasierung im Vergleich zu Patienten ohne Fernmetastasen (63 % vs. 46 %). Bei der konventionellen Lymphknotendiagnostik ist der histopathologische Nachweis einzelner Tumorzellen durchaus ein bekanntes Phänomen, die Sensitivität dieser Methodik ist jedoch durch die in der Routinediagnostik nur geringe Schnittzahl des jeweiligen Lymphknotens deutlich eingeschränkt. Die Rate an falschnegativer histopathologischer Lymphknotenbefundung kann bis zu 20 % betragen, eine Tatsache, die nicht verwundert, wenn man bedenkt, dass ein Pathologe nur eine errechnete Chance von 1 % hat, einen mikrometastatischen Fokus (3 Zelldurchmesser) zu identifizieren [74]. Unter Verwendung immunhistochemischer Methoden mit der so genannten ¹Fettclearance-Technikª kann in bis zu 55 % der Fälle ein Tumorzellnachweis erfolgen [75]. Auch mittels PCR und RTPCR können isolierte Tumorzellen in Lymphknoten nachgewiesen werden. Hyashi et al. konnten beim kolorektalen Kazinom mittels mutant-allel-spezifischer Amplifikation zur Detektion von k-ras- bzw p53-Mutationen zeigen, dass alle Patienten (34/71), bei denen mit dieser Methodik keine Lymphknotenmetastasen nachweisbar waren (obwohl der korrespondierende Primärtumor zumindest eine der beiden og. Mutationen aufwies), eine Rezidivfreiheit von 5 Jahren erlebten [76]. Die prognostische Relevanz dieser und anderer Beobachtungen in einer Vielzahl von Studien mit zum Teil widersprüchlichen Ergebnissen ist jedoch aufgrund methodischer Mängel und unterschiedlicher Studiendesigns sehr umstritten [69]. Bei einem Vergleich der Inzidenz des Nachweises disseminierter Tumorzellen in den Kompartimenten Blut (12,5 %), Kochenmark (21,4 %) und Lymphknoten (87,5 %) beim kolorektalen Karzinom im Stadium I und II mittels CK20RT-PCR zeigte sich nach Stratifikation der positiven Lymphknotenbefunde anhand ihrer Lokalisation, dass die Häufigkeit des Tumorzellnachweises entlang des anatomischen Lymphabflusses abnahm (parakolische LK 87,5 %, stammgefäûnahe LK 75 % und apikaler LK 37,5 % positiver Befund [69]. Ohne eine bisher belegte prognostische Wertigkeit dieser Beobachtungen sprechen diese Zahlen für eine vorwiegend lymphogene statt hämatogene Tumorzellaussaat in frühen Tumorstadien. Zur prognostischen Wertigkeit des Nachweises disseminierter Zellen in der Perionealhöhle existieren widersprüchliche Ergebnisse [57, 58], so dass deren Bedeutung anhand weiterer Studien geklärt werden muss. Ob der positive peritoneale Zytologiebefund sinnvolle Indikation für eine intraperitoneale Chemotherapeutikaapplikation sein kann, ist anhand der vorliegenden Literatur noch nicht eindeutig zu entscheiden [77 ± 79]. 381 Zusammenfassung Trotz Fortschritten in den Therapiemöglichkeiten durch Verbesserung der chirurgischen Operationstechniken und der Anwendung multimodaler Therapiekonzepte ist die Prognose von Patienten mit GI-Tumoren nach wie vor unbefriedigend. Die 5-Jahres-Überlebensraten der einzelnen Tumorentitäten liegen zwischen 45 % für das Rektumkarzinom und < 10 % für das Leber- bzw. Pankreaskarzinom. Einer der Gründe für die eingeschränkte Prognose dieser Karzinome ist die frühzeitige systemische Tumorzelldissemination, die bei ca. 50 % aller Patienten mit malignen gastrointestinalen Tumoren bereits zum Zeitpunkt der Operation mittels verschiedener Nachweisverfahren gezeigt werden kann. Dieser Nachweis gelingt bei einem Groûteil der Patienten auch in frühen Tumorstadien, so dass rein rechnerisch von einer systemischen Komponente der Tumorerkrankung weit vor dem Zeitpunkt der Diagnosestellung auszugehen ist. Diese Beobachtung unterstreicht die Notwendigkeit einer möglichst frühen Diagnosestellung. In einer Vielzahl von Studien konnte der Nutzen der Detektion disseminierter Zellen in verschiedenen Geweben und Körperkompartimenten zur individuellen verbesserten Risikoabschätzung vor allem hinsichtlich eines erhöhten Metastasierungsrisikos belegt werden. Dennoch scheint die definitive prognostische Wertigkeit des Nachweises epithelialer Zellen im Knochenmark noch durch weitere Studien mit standardisierten methodischen Protokollen und gröûeren Fallzahlen erhärtet werden zu müssen [80]. Zunehmende Bedeutung gewinnt der immunhistochemische und molekularbiologische Nachweis einzelner epithelialer Zellen in histopathologisch ¹tumorfreienª Lymphknoten und Resektionsrändern, der ein verfeinertes Staging ermöglicht und ggf. die Selektion von Patientengruppen erlaubt, die von einer adjuvanten Therapie profitieren könnten [47]. Ein weiterer möglicher Nutzen der Analyse der Tumorzelldissemination in den leicht zugänglichen Kompartimenten Blut oder Knochenmark wäre die Effizienzkontrolle neuer Therapieansätze [81]. Das Monitoring der Tumorzelldissemination im Verlauf der Therapie könnte dabei Hinweise auf die Wirksamkeit des jeweiligen therapeutischen Ansatzes geben [42]. Die Erfolgswahrscheinlichkeit neuer Therapiestrategien wäre somit ggf. früher abschätzbar als durch mehrjährige klinische Beobachtung. Die mögliche Wirksamkeit einer antikörpervermittelten Elimination von disseminierten Tumorzellen konnte in einer Studie bei den gastrointestinalen Tumoren bisher nur für das kolorektale Karzinom gezeigt werden [7]. Dennoch bleibt die disseminierte Tumorzelle als Korrelat der ¹minimal residual diseaseª und Zielscheibe neuer Therapieansätze nicht zuletzt durch ihre leichte Erreichbarkeit durch systemisch applizierte Agentien interessant. Heruntergeladen von: Thieme E-Books & E-Journals. Urheberrechtlich geschützt. zellaussat [70]. Auch hier konnte die prognostische Bedeutung dieser Befunde noch nicht gezeigt werden. Viszeralchirurgie 2000; 35 Viszeralchirurgie 2000; 35 Literatur 1 Engel J, Hölzel D, Reimer B. Epidemiologie Gastrointestinaler Malignome. Gastrointestinale Tumoren; Empfehlungen zur Diagnostik, Therapie und Nachsorge. 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