Phytochrome: Bakterien sehen Rot

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WISSENSCHAFT
Photorezeptoren
Phytochrome:
Bakterien sehen Rot
SONJA BRANDT UND NICOLE FRANKENBERG-DINKEL
FAKULTÄT FÜR BIOLOGIE UND BIOTECHNOLOGIE, AG PHYSIOLOGIE DER
MIKROORGANISMEN, RUHR-UNIVERSITÄT BOCHUM
Phytochrome sind eine weit verbreitete Familie von Rotlichtrezeptoren.
Seit einigen Jahren ist bekannt, dass Phytochrome nicht auf das Pflanzenreich beschränkt sind, sondern auch in Pilzen und Bakterien vorkommen.
Während Phytochrome in photosynthetischen Bakterien und Pilzen als
klassische Photorezeptoren fungieren, bleibt ihre Rolle in heterotrophen
Bakterien bisher weitgehend unverstanden.
ó Die Wahrnehmung von Licht ist eine der
wichtigsten Eigenschaften für fast alle Lebewesen. Viele Organismen haben daher mehr
oder weniger komplexe Strukturen für die
Lichtperzeption entwickelt. Auch in Bakterien findet man Photorezeptoren, die oft große Ähnlichkeiten zu solchen aus höheren
Organismen besitzen. Neben Blaulichtrezeptoren, die oft Homologien zu pflanzlichen
Phototropinen besitzen, enthalten einige Bakterien Rhodopsine, UV-Rezeptoren oder Phytochrome. Besonders ihr Vorhandensein in
heterotrophen Arten wirft die Frage nach der
Funktion in diesen Organismen auf.
Phytochrome sind molekulare
„Lichtschalter“
Phytochrome sind Rot-/Dunkelrotlicht-absorbierende Photorezeptoren, die vor fast 50 Jahren in Pflanzen entdeckt wurden[1]. Die ausgedehnten genomischen Analysen und Daten
der vergangenen Jahre zeigten, dass Phytochrome unter Eu- und Prokaryoten weit verbreitet sind. Die Phytochrom-Superfamilie
lässt sich in fünf Klassen organisieren: pflanzliche (Phy), cyanobakterielle (Cph), bakterielle (Bph) und pilzliche Phytochrome (Fph)
sowie ein Cluster von Phy-ähnlichen Sequenzen (Abb. 1).
Phytochrome sind befähigt, zwischen zwei
stabilen Konformationen, der Rotlicht-absorbierenden Pr-Form und der Dunkelrotlichtabsorbierenden Pfr-Form, reversibel zu photoisomerisieren. Diese Photokonversion wird
durch ein lineares Tetrapyrrol als Chromophor hervorgerufen, welches in einer auto-
katalytischen Reaktion an die Sulfhydrylgruppe eines konservierten Cysteinrestes im
Apo-Protein gebunden wird. Bei Absorption
von rotem (R) bzw. dunkelrotem (FR) Licht
erfolgt eine 15Z/15E-Isomerisierung zwischen
den Pyrrolringen C und D, was eine Konformationsänderung im Protein zur Folge hat.
Beide Formen lassen sich spektral voneinander unterscheiden (Abb. 2). Da Pr und Pfr im
Allgemeinen überlappende Absorptionsspektren besitzen, führen beide Photokonversionen unter gesättigten Lichtbedingungen zu einem Photoäquilibrium. Dabei variiert das Verhältnis von Pr/Pfr unter den vielfältigen Phytochromen, doch grundlegend
gemein ist ihnen, dass die biologische Antwort durch das Verhältnis beider Formen
determiniert ist. Die Pfr-Form ist in den meisten Phytochromen thermisch instabil und
relaxiert im Dunkeln zurück zur Pr-Form –
ein Vorgang, den man als Dunkelreversion
bezeichnet. Das Äquilibrium von Pr/Pfr wird
daher ebenfalls durch die Dunkelreversion
beeinflusst und hat somit einen Einfluss auf
das Output-Signal.
Durch den Mechanismus der Photoisomerisierung werden Phytochrome gerne als
molekulare Lichtschalter bezeichnet.
Domänenstruktur der Phytochrome
Pflanzliche und bakterielle Phytochrome
besitzen im Wesentlichen einen homologen
Aufbau. Sie bestehen aus einer N-terminalen
photosensorischen Domäne, an welche das
Tetrapyrrol kovalent gebunden ist, und einer
C-terminalen regulatorischen Domäne, dem
Output-Modul (Abb. 1). Der photosensorische
Teil des Proteins besitzt drei konservierte
Subdomänen, PAS, GAF und PHY, wobei sich
pflanzlichen und pilzlichen Phytochromen
eine N-terminale variable Domäne voranstellt.
PAS-Domänen sind oftmals Bestandteil von
Signalproteinen und fungieren als Sensordomänen durch ihre Ligand-bindende Eigenschaft. Bevorzugt gebunden werden kleine,
planare, aromatische Liganden wie Flavine,
Häme oder lineare Tetrapyrrole. Die strukturell ähnlichen GAF-Domänen binden ebenfalls planare, aromatische Liganden und sind
gleichermaßen in Signalproteinen zu finden.
In den pflanzlichen und cyanobakteriellen
Phytochromen wird die GAF-Domäne oft auch
als Bilinlyase-Domäne bezeichnet, da sie die
minimale Einheit darstellt, die in der Lage ist,
lineare Tetrapyrrole autokatalytisch zu binden. Die PHY-Domänen leiten sich evolutionär
von den GAF-Domänen ab und stellen eine
für die Phytochrom-Familie typische GAFDomäne dar. Ein essenzieller Unterschied zwischen den verschiedenen Phytochromen präsentiert sich hier bereits in der Art und der
Bindestelle des linearen Tetrapyrrol-Chromophors. Während pflanzliche und cyanobakterielle Phytochrome Phytochromobilin
oder Phycocyanobilin (ein Dihydro- bzw. Tetrahydro-Biliverdin) an einen konservierten
Cysteinrest in der GAF-Domäne binden, ist
das weniger reduzierte Tetrapyrrol Biliverdin
bei bakteriellen und pilzlichen Phytochromen
über eine Thioetherbrücke an einen konservierten Cysteinrest in der PAS-Domäne assoziiert.
Das C-terminale Output-Modul ist bei den
meisten Phytochromen eine Histidinkinaseähnliche Domäne (HKD). Sie besitzt insbesondere bei bakteriellen Phytochromen ein
Zwei-Komponenten-Histidinkinase-Motiv, dessen konserviertes Histidin nach Autophosphorylierung den Phosphatrest auf einen konservierten Aspartatrest des entsprechenden
Antwortregulators transferiert. Oftmals ist
das den Antwortregulator kodierende Gen
Bestandteil des Phytochrom-Operons oder
direkt im Phytochrom C-terminal integriert,
wie es beim pilzlichen Phytochrom FphA aus
Aspergillus nidulans der Fall ist[2] (Abb. 1).
Dass das C-terminale Output-Modul variabel sein kann, zeigen Untersuchungen an
einem ungewöhnlichen Phytochrom aus
Rhodobacter sphaeroides sowie an Cph2
aus Synechocystis sp. PCC6803, in denen
man GGDEF- und EAL-Domänen innerhalb
des Output-Moduls findet[3] (Abb. 1). Diese
Domänen spielen eine wichtige Rolle beim
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Photosensorische
Domäne
Regulatorische
Domäne
Pflanzen (Phy)
C
Umsatz des Signalmoleküls c-di-GMP. Es
scheint hierbei möglich zu sein, die photosensorische Domäne mit verschiedenen Output-Modulen zu verknüpfen, um eine spezifische lichtgesteuerte physiologische Antwort zu erhalten.
PAS GAF PHY PAS PAS HKD
Cyanobakterien
(Cph)
C
Bakterien (Bph)
C
RRD
Cyanobakterielle Phytochrome
Phytochrome photosynthetisch
aktiver Bakterien
Phytochrome, die man in photosynthetischen
Bakterien findet, gehören klassifikationsgemäß zu den BphPs, da sie im Allgemeinen BV
in der N-terminalen PAS-Domäne binden. In
vielen Fällen konnte gezeigt werden, dass die
Expression der Photosyntheseapparate mittels BphPs durch Detektion von dunkelrotem
Licht reguliert wird.
Unter den BphPs photosynthetischer Bakterien existieren auch solche mit außergewöhnlichen spektralen Eigenschaften. So
kodiert das Genom von R. palustris insgesamt
vier putative BphPs. Eines davon, RpBphP2,
bindet BV, führt allerdings keine klassische
Pr/Pfr-Photokonversion durch, sondern bildet statt der Pfr-Form eine Pnr-Form bei 650
nm aus[6].
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Bakterien (Bph)
C
GGDEF EAL
C
Pilze (Fph)
0.03
0.10
A
B
Pr
Δ Absorption
0.06
Pfr
0.04
700 nm
0.02
0.08
Absorption
Die Familie der cyanobakteriellen Phytochrome ist mit der pflanzlichen am nächsten
verwandt. Cyanobakterielle Phytochrome
assemblieren Phycocyanobilin (PCB) über
eine Thioetherbrücke zwischen einem konservierten Cysteinrest in der GAF-Domäne
und dem C31-Kohlenstoffatom der Ethylidengruppe am A-Ring des Bilins[4]. PCB wird in
Cyanobakterien in großem Maßstab als Pigment für die Phycobiliproteine der Lichtsammelkomplexe synthetisiert und steht daher
für die Assemblierung zum Holo-Phytochrom
bereit. PCB entsteht sukzessive durch oxidative Spaltung von Häm zu Biliverdin IXα (BV)
durch eine Hämoxygenase (HO) mit anschließender Reduktion von BV zu PCB durch eine
spezifische Ferredoxin-abhängige Bilinreduktase[5]. Das am besten untersuchte cyanobakterielle Phytochrom ist das Cph1 aus Synechocystis sp. PCC6803. Cph1 zeichnet sich
durch den charakteristischen Domänenaufbau aus und zeigt, assembliert mit PCB, die
charakteristischen R/FR-Spektren[4]. Cph1
weist eine lichtabhängige Histidinkinase- und
Aspartat-Phosphotransferase-Aktivität auf,
wie es bei typischen Zwei-Komponenten-Systemen von Prokaryoten der Fall ist. Welche
Regulationskaskade allerdings durch Einstrahlung von rotem oder dunkelrotem Licht
hier ausgelöst wird, ist noch ungeklärt.
¯ Abb. 1: Domänenstruktur
pflanzlicher (Phy), cyanobakterieller (Cphs), bakterieller (Bphs) und
pilzlicher (Fphs) Phytochrome.
PAS-Domäne, GAF-Domäne; PHY,
Phytochromdomäne; HKD, Histidinkinasedomäne; RRD, Antwortregulatordomäne; GGDEF, Domäne
mit Guanylatzyklase-Aktivität;
EAL, Domäne mit Phosphodiesterase-Aktivität. C, konserviertes
Cystein für Chromophorbindung.
0.02
0.01
0.00
-0.01
-0.02
0.00
500
550
600
650
700
750
-0.03
500
800
754 nm
550
600
COO-
9
10
NH
6
12
11
B
HN
C
14
4
31
Cys-S
2
3
15
NH
19
HN
16
D
2
1
O
5
4
FR
31
Cys-S
Pr
N
6
18
A
3
9
10
12
11
B
O
17
800
COO-
8
7
R
13
5
750
COO-
COO-
8
7
700
Wellenlänge [nm]
Wellenlänge [nm]
C
650
32
H
N
C
13
14
2
D
15
NH
HN
A
3
1
OH
O
P fr
˚ Abb. 2: A, Absorptionsspektren von rekombinantem P. aeruginosa-apo-BphP inkubiert mit BV
IXα. Pfr- bzw. Pfr-angereicherte Form nach Bestrahlung mit hellrotem Licht (630 nm): rote Linie;
Pr-Form nach Bestrahlung mit dunkelrotem Licht (750 nm): blaue Linie. B, Pr-Pfr-Differenzspektrum. C, Struktur des kovalent gebundenen BV-Chromophors in der Pr- und Pfr-Form.
Ein weiteres Phytochrom mit unkonventionellen Eigenschaften ist das kürzlich entdeckte bradyrhizobielle BrBphP3.ORS278.
Phylogenetisch ist es von den anderen BphPs
weit entfernt. Es bindet ungewöhnlicherweise
PCB als Chromophor, was die Frage aufwirft,
ob es cyanobakteriellen Ursprungs ist. Die
Photokonversion erfolgt hier zwischen einer
Pr-Form (670 nm) und einer Po-Form, die im
orangen Wellenlängenbereich bei 610 nm ihr
Maximum besitzt[7].
Phytochrome heterotropher
Bakterien
Bakterielle Phytochrome findet man in heterotrophen und photosynthetischen Bakterien.
Ein wesentliches Merkmal, das sie von cyanobakteriellen und pflanzlichen Phytochromen
unterscheidet, ist die kovalente Bindung von
Biliverdin IXα (BV) in der N-terminalen PASDomäne[8]. Durch den stärker oxidierten
Zustand des BV verschieben sich die Spektren der Pr- und Pfr-Form in den roten
Bereich, was mit der höheren Anzahl an Doppelbindungen im π-Elektronensystem des
Chromophors korreliert. Bakterielle Phytochrome binden BV über eine Thioetherbrücke zwischen einem konservierten
Cysteinrest in der PAS-Domäne und dem C32Kohlenstoffatom der Endo-Vinylgruppe am
A-Ring des Biliverdins (Abb. 2C)[9, 10]. Genaueren Aufschluss über die Bindung und Struk-
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˚ Abb. 3: Kristallstruktur der Chromophorbindedomäne (PAS-GAF) des BphPs aus
Deinococcus radiodurans mit dem kovalentgebundenen BV-Chromophor (Grün);
nach[11]. Die GAF-Domäne (Blau) bildet an
der Grenzfläche zur PAS-Domäne (Grün) eine
loopartige Kleeblattstruktur, durch die der
N-Terminus und der Start der PAS-Domäne,
inklusive der Chromophorbindestelle
(Cys24), gereicht wird. Dieser Loop verankert das an Cys24 (Gelb) gebundene BV in
der GAF-Domäne.
tur des Bilins lieferte die Kristallstruktur der
Chromophor-Bindedomäne (CBD = PAS-GAF)
mit BV als Chromophor in der Pr-Form von D.
radiodurans DrBphP[11]. Die Chromophorbindestelle C24 in der PAS-Domäne befindet sich
strukturell in unmittelbarer Nähe zur Bindestelle cyanobakterieller und pflanzlicher Phytochrome in der GAF-Domäne, während der
Chromophor tief in einer Tasche der GAFDomäne liegt[11] (Abb. 3). Die CBD aller Phytochrome scheint somit eine konservierte Struktur zu besitzen, lediglich der Bindemechanismus ist bei bakteriellen Phytochromen vermutlich ein anderer.
Spektroskopische Analysen zeigen, dass
man bakterielle Phytochrome grundsätzlich
in zwei Typen einteilen kann. Zum ersten Typ
zählen solche, die sich spektral wie typische
Pflanzenphytochrome verhalten und im Dunkeln eine Pr-Form generieren. Zu diesen
BphPs gehört das gut charakterisierte Agp1
aus A. tumefaciens[9, 12]. Vertreter des zweiten Typs, die bathyBphPs (griech. bathos =
tief) verhalten sich genau umgekehrt und liegen im Grundzustand in der längerwelligen
Pfr-Form vor. Zu den bislang entdeckten und
charakterisierten gehören P. aeruginosaPaBphP[10] und AtBphP2 (Agp2) aus A. tumefaciens[12]. Da in einigen Organismen wie A.
tumefaciens ein BphP (Agp1) und ein
bathyBphP (Agp2) vorkommen, die antagonistisch funktionieren, wird spekuliert, dass
diese bathyBphPs die Wahrnehmung von fluktuierenden Lichtverhältnissen erhöhen.
Diese Beispiele verdeutlichen, dass sich
innerhalb der Phytochrome eine sehr hohe
spektrale Varianz entwickelt hat, die durch
die Wahl des Chromophors, der Bindestelle,
aber auch der Proteinumgebung bedingt ist.
BphPs als bakterielle Photorezeptoren?
In vielen Laboratorien wurden intensive Versuche unternommen, die Funktion der bakteriellen Phytochrome in heterotrophen Bakterien aufzuklären. Obwohl sämtliche Untersuchungen an rekombinanten BphPs darauf
hindeuten, dass es sich um Photorezeptoren
handelt, konnte dies in den meisten Fällen in
vivo noch nicht bestätigt werden. Vor allem
bleibt unklar, welche physiologischen Prozesse letztendlich durch diese Sensorkinasen
gesteuert werden.
Chromosomale Knock-out-Mutanten zeigen
in der Regel keinen Wachstumsphänotyp im
Vergleich zum entsprechenden Wildtyp. Auch
die Zuhilfenahme von Proteom- oder Transkriptomanalysen brachten bisher nicht den
Durchbruch. Unveröffentlichte Daten aus
unserem eigenen Labor deuten darauf hin,
dass bphP aus P. aeruginosa zelldichteabhängig exprimiert wird und somit eine Rolle
unter Stressbedingungen wie Nährstoff- oder
Sauerstoffmangel spielen könnte. Inwieweit
unter solchen Bedingungen ein Photorezeptor
nötig sein könnte, oder ob man über alternative Rollen nachdenken muss, hoffen wir in
den nächsten Jahren beantworten zu können.
Danksagung
Die Arbeiten in unserem Labor wurden durch
das Emmy-Noether-Programm der DFG, den
Fonds der chemischen Industrie und die VWStiftung finanziell unterstützt.
ó
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Korrespondenzadresse:
Prof. Dr. Nicole Frankenberg-Dinkel
Ruhr-Universität Bochum
Fakultät für Biologie und Biotechnologie
AG Physiologie der Mikroorganismen
Universitätsstr. 150
D-44780 Bochum
Tel.: 0234-3223101
Fax: 0234-3214620
[email protected]
AUTORINNEN
Sonja Brandt
Nicole Frankenberg-Dinkel
Jahrgang 1978. 1997–2000 Ausbildung zur MTAL, Dr. Gillmeister-Schule, Heide. 2000–2003 BSc (Biochemie), Studiengang Biologie der Zellen an der Universität Osnabrück.
2003–2005 MSc (Mikrobiologie), Biologie der Zellen an der
Universität Osnabrück. Seit 2005 Dissertation in der Arbeitsgruppe von Nicole Frankenberg-Dinkel (Braunschweig,
Bochum).
Jahrgang 1971. 1990–1996 Studium der Biologie an den
Universitäten Regensburg und Boulder, Colorado, USA. Diplom bei Günter Hauska. 1996–1999 Promotion bei Dieter
Jahn in Freiburg. 1999–2002 Postdoc bei J. Clark Lagarias
an der UC Davis, USA. 2003–2005 Nachwuchsgruppe im
Emmy-Noether-Programmm der DFG an der TU Braunschweig. 2005 Habilitation. Seit 2006 W2-Professorin für
Physiologie der Mikroorganismen an der Ruhr-Universität
Bochum.
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