Untersuchungen zu Luciferase-ähnlichen

Untersuchungen zu Luciferase-ähnlichen Monooxygenasen,
Flavinreduktasen und Ketoreduktasen aus dem
Mensacarcin-Produzenten Streptomyces bottropensis
INAUGURALDISSERTATION
Zur Erlangung des Doktorgrades
der Fakultät für Chemie und Pharmazie
der Albert-Ludwigs-Universität Freiburg im Breisgau
vorgelegt von
Astrid Maria Erber
aus Balingen
2017
Dekan:
Prof. Dr. Manfred Jung
Vorsitzender des Promotionsausschusses:
Prof. Dr. Stefan Weber
Referent:
Prof. Dr. Andreas Bechthold
Korreferent:
Prof. Dr. Oliver Einsle
Drittprüfer:
Prof. Dr. Stefan Günther
Datum der mündlichen Prüfung:
02.06.2017
In Liebe und Dankbarkeit meinen Eltern gewidmet.
Wissenschaftliche Publikationen
Klementz D., Döring K., Lucas X., Telukunta K.K., Erxleben A., Deubel D., Erber A., Santillana I.,
Thomas O.S., Bechthold A., Günther S., StreptomeDB 2.0 – an extended resource of natural
products produced by streptomycetes. Nucleic Acids Res. 2016 Jan. 4
Vorträge
Experiments with monooxygenases, flavin reductases and ketoreductases from the mensacarcin
gene cluster. RTG 1976 functional diversity of cofactors in enzymes group retreat, 25.07.2016,
Schauinsland
Experiments with proteins from the mensacarcin gene cluster – an overview. PhD seminar,
14.10.2016, Freiburg
Poster
Sarah Maier, Tobias Pflüger, Astrid Erber, Katharina Hesselbach, Thomas Paululat, Susana L.A.
Andrade, Andreas Bechthold, The biosynthesis of mensacarcin and the function of the new
luciferase-like monooxygenases MsnO4 and MsnO8. DPHG annual meeting, 09.-11.10.2013,
Freiburg
Sarah Maier, Astrid Erber, Andreas Bechthold, FMNH2 – dependent enzymes involved in
mensacarcin biosynthesis. RTG 1976 symposium functional diversity of cofactors in enzymes,
24.10.2014, Freiburg
Astrid Erber, Emanuel Resin, Jana Derochefort, Sarah Maier, Tobias Pflüger, Susana L.A. Andrade,
Andreas Bechthold, Luciferase-like monooxygenases from the mensacarcin- and rishirilide-gene
clusters. RTG 1976 symposium structural biology, 15.-16.10.2015, Freiburg
Astrid Erber, Andreas Bechthold, The function of luciferase-like monooxygenases in the
biosynthesis and bioactivity of mensacarcin. VAAM-workshop biology of bacteria producing natural
products, 29.09.2016, Freiburg
Inhaltsverzeichnis
Inhaltsverzeichnis
1
Zusammenfassung ......................................................................................................................... 13
2
Einleitung ....................................................................................................................................... 15
2.1
Mensacarcin .......................................................................................................................... 15
2.2
Bakterielle Monooxygenasen ................................................................................................ 17
2.2.1
Die Funktion und Vielfalt Flavin-abhängiger Monooxygenasen ................................... 17
2.2.2
Die Proteinfamilie der Luciferasen ................................................................................ 19
2.2.3
Luciferase-ähnliche Monooxygenasen (LLM)................................................................ 23
2.2.4
Das FMN-abhängige Zweikomponentensystem LLM/Flavin-Reduktase....................... 27
2.3
Epoxidierung von Naturstoffen ............................................................................................. 29
2.4
Genclustern Cross-Regulierungen ......................................................................................... 33
2.5
Produktion und Aufreinigung von rekombinanten Proteinen .............................................. 35
3
Zielsetzung der Arbeit ................................................................................................................... 38
4
Material und Methoden ................................................................................................................ 39
4.1
Labor- und Analysengeräte ................................................................................................... 39
4.2
Verbrauchsmaterialien, Kits und Enzyme ............................................................................. 40
4.3
Chemikalien und Medienbestandteile .................................................................................. 41
4.4
Antibiotika ............................................................................................................................. 44
4.5
Puffer und Lösungen ............................................................................................................. 44
4.5.1
Antibiotika-Lösungen .................................................................................................... 44
4.5.2
Plasmidisolierung aus E. coli .......................................................................................... 45
4.5.3
DNA Agarose-Gelelektrophorese .................................................................................. 45
4.5.4
Herstellung von kompetenten E. coli-Zellen ................................................................. 46
4.5.5
Herstellung von Dauerkulturen ..................................................................................... 46
4.5.6
Blau-Weiß Selektion ...................................................................................................... 46
4.5.7
SDS-Page Gelelektrophorese......................................................................................... 46
4.5.8
Protein-Aufreinigung ..................................................................................................... 47
VII
Inhaltsverzeichnis
4.5.9
MsnO3/MsnO4 in vitro Aktivitätsassay [3] ................................................................... 48
4.5.10
FGD/MsnO4 in vitro Aktivitätsassay [3] ........................................................................ 49
4.5.11
Fütterungsexperiment mit potentiellen Substraten von MsnO4 in S. albus................. 49
4.5.12
Spurenelementlösungen ............................................................................................... 50
4.5.13
HPLC/MS........................................................................................................................ 50
4.6
Nähr- und Produktionsmedien .............................................................................................. 51
4.6.1
Nähr- und Produktions-Medien für E. coli..................................................................... 51
4.6.2
Nähr- und Produktions-Medien für Streptomyceten.................................................... 52
4.7
Bakterienstämme .................................................................................................................. 53
4.7.1
E. coli-Stämme ............................................................................................................... 53
4.7.2
Streptomyceten-Stämme .............................................................................................. 53
4.8
Vektoren und Plasmide ......................................................................................................... 54
4.8.1
In dieser Arbeit verwendete Vektoren und Plasmide ................................................... 54
4.8.2
In dieser Arbeit erstellte Vektoren und Plasmide ......................................................... 55
4.9
Software, Datenbanken und Internetservice ........................................................................ 56
4.10
Molekularbiologische Methoden .......................................................................................... 58
4.10.1
Polymerase-Kettenreaktion (PCR) ................................................................................. 58
4.10.2
Kolonie-PCR ................................................................................................................... 60
4.10.3
DNA-Sequenzierung ...................................................................................................... 60
4.10.4
In dieser Arbeit verwendete Primer .............................................................................. 61
4.10.5
Analyse und Isolierung von DNA mittels Agarose-Gelelektrophorese.......................... 62
4.10.6
Restriktion von DNA ...................................................................................................... 62
4.10.7
Ligation von DNA ........................................................................................................... 63
4.10.8
Plasmidisolierung mittels Alkalischer Lyse .................................................................... 64
4.10.9
Plasmid Minipräparation ............................................................................................... 64
4.10.10 Plasmid Midipräparation ............................................................................................... 65
4.11
Erstellung von Plasmiden ...................................................................................................... 65
4.11.1
VIII
Zwischenklonierung in pBSK- und pUC19 ..................................................................... 65
Inhaltsverzeichnis
4.11.2
Klonierung von Plasmiden für die Proteinproduktion in E. coli..................................... 65
4.11.3
Klonierung der Punktmutationsplasmide pKO10SA und pKO11SA ............................. 66
4.11.4
Klonierung der Punktmutationsplasmide pKO4E45A und pKO4H46A ........................... 67
4.12
Mikrobiologische Methoden ................................................................................................. 67
4.12.1
Kultivierung von E. coli .................................................................................................. 67
4.12.2
Herstellung von E. coli-Dauerkulturen........................................................................... 67
4.12.3
Herstellung von CaCl2-kompetenten E. coli-Zellen ........................................................ 68
4.12.4
Herstellung von elektrokompetenten E. coli-Zellen ...................................................... 68
4.12.5
Hitzeschock Transformation von E. coli-Zellen.............................................................. 68
4.12.6
Elektroporation von E. coli-Zellen.................................................................................. 69
4.12.7
Blau-Weiß-Selektion ...................................................................................................... 69
4.12.8
Kultivierung von Streptomyces spp ............................................................................... 69
4.12.9
Herstellung von Streptomyces spp.-Dauerkulturen ...................................................... 70
4.12.10 Kultivierung von Streptomyces spp. zur Produktion von Naturstoffen......................... 70
4.12.11 Intergenerische Konjugation ......................................................................................... 70
4.13
Fütterungsexperimente ......................................................................................................... 71
4.14
Proteinbiochemische Methoden ........................................................................................... 72
4.14.1
Testproduktionen .......................................................................................................... 72
4.14.2
Überproduktion in LB-Medium ..................................................................................... 73
4.14.3
Überproduktion in Autoinduktionsmedium.................................................................. 73
4.14.4
Zellaufschluss für spätere Proteinaufreinigung ............................................................ 73
4.14.5
Analytische Affinitätschromatographie ........................................................................ 74
4.14.6
Präparative Affinitätschromatographie ........................................................................ 74
4.14.7
Präparative Größenausschluss-Chromatographie ........................................................ 75
4.14.8
Aufkonzentrierung von Proteinlösungen ...................................................................... 75
4.14.9
SDS-PAGE....................................................................................................................... 75
4.14.10 Konzentrationsbestimmung von Proteinlösungen........................................................ 76
4.14.11 In vitro Enzym-Aktivitätsassays ..................................................................................... 76
IX
Inhaltsverzeichnis
4.14.12 Kristallisierungsversuche ............................................................................................... 77
4.15
4.15.1
Punktmutationen mittels ortsspezifischer Mutagenese (Quick-Change) ..................... 78
4.15.2
Punktmutationen mittels Overlap-Extension-PCR ........................................................ 79
4.15.3
Geninaktivierung mittels Redirect®-Methode .............................................................. 81
4.15.4
Geninaktivierung mittels Double-Crossover ................................................................. 82
4.16
5
Methoden zur Geninaktivierung ........................................................................................... 78
Analytik von Naturstoffen aus Streptomyces spp. ................................................................ 83
Ergebnisse ..................................................................................................................................... 84
5.1
Inaktivierungsexperimente ................................................................................................... 84
5.1.1
Punktmutationen im aktiven Zentrum der Ketoreduktasen MsnO10 und MsnO11 .... 84
5.1.2
Inaktivierung der Luciferase-ähnlichen Monooxygenase MsnO2 mittels Redirect® .... 89
5.1.3
Inaktivierung der auf Cos2 lokalisierten Integrase mittels Redirect® und anschließende
Inaktivierung von msnO2 in Streptomyces bottropensis mittels Double-Crossover..................... 92
5.2
5.2.1
Testproduktionen .......................................................................................................... 99
5.2.2
Heterologe Expression und Aufreinigung ................................................................... 100
5.2.3
In vitro Assay zur Untersuchung der Aktivität von MsnO3 ......................................... 101
5.2.4
Kristallisierungsexperimente mit MsnO3 .................................................................... 102
5.2.5
Das bioinformatische Homologiemodell von MsnO3 ................................................. 103
5.3
MsnO4-eine Luciferase-ähnliche Monooxygenase aus dem Mensacarcin-Gencluster ...... 106
5.3.1
Testexpressionen und Methodenoptimierung ........................................................... 108
5.3.2
Heterologe Produktion und Aufreinigung ................................................................... 109
5.3.3
In vitro Assay mit MsnO4 und FGD/F420 ...................................................................... 111
5.3.4
In vitro Assay mit MsnO4, MsnO3 und FMN ............................................................... 112
5.3.5
Kristallisierungsexperimente mit MsnO4 .................................................................... 114
5.3.6
Das bioinformatische Homologiemodell von MsnO4 ................................................. 114
5.4
X
Die Flavinreduktase MsnO3 aus dem Mensacarcin-Gencluster............................................ 97
MsnO2 - eine Luciferase-ähnliche Monooxygenase aus dem Mensacarcin-Gencluster .... 117
5.4.1
Heterologe Produktion und Aufreinigung von MsnO2 sowie Methodenoptimierung 119
5.4.2
Bioinformatisches Homologiemodell von MsnO2 ...................................................... 121
Inhaltsverzeichnis
5.5
Fütterungsexperimente mit potentiellen Anthrachinon-Substraten von MsnO4 .............. 124
5.6
Einfluss der kombinatorischen Substitution der Flavinreduktasen MsnO3 und RslO2 aus
dem Mensacarcin- und dem Rishirilid-Gencluster .......................................................................... 127
5.6.1
Produktionsverhalten der Mutante S. albus Cos2∆O3 und S. albus Cos2∆O3 x pKR1 . 129
5.6.2
Produktionsverhalten nach Komplementierung mit msnO3 oder rslO2 .................... 130
5.7
6
Bioinformatische Untersuchungen...................................................................................... 132
5.7.1
Untersuchungen auf Ebene der Primärstruktur.......................................................... 132
5.7.2
Homologiemodell-Vergleich........................................................................................ 136
Diskussion .................................................................................................................................... 145
6.1
Inaktivierungsexperimente
zur
weiteren
Aufklärung
der
Biosynthese
von
Didesmethylmensacarcin. ............................................................................................................... 145
6.1.1
Die Ketoreduktasen MsnO10 und MsnO11. ............................................................... 145
6.1.2
Die Funktion der Luciferase-ähnlichen Monooxygenase (LLM) MsnO2. .................... 149
6.2
Untersuchungen der Luciferase-ähnlichen Monooxygenasen MsnO4 und MsnO2 auf
Proteinebene. .................................................................................................................................. 152
6.2.1
Produktion und Aufreinigung von MsnO4. ................................................................. 153
6.2.2
Fütterungsexperimente und Enzymassays mit MsnO4............................................... 153
6.2.3
Kristallisierungsexperimente. ...................................................................................... 157
6.2.4
Bioinformatische Untersuchungen von MsnO4. ......................................................... 158
6.2.5
Produktion und Aufreinigung von MsnO2. ................................................................. 160
6.2.6
Bioinformatische Untersuchungen von MsnO2. ......................................................... 162
6.3
Die Flavinreduktasen MsnO3 und RslO2 aus dem Mensacarcin- und dem Rishirilid-
Gencluster. ...................................................................................................................................... 165
6.3.1
Aufreinigung und Kristallisierungsexperimente mit MsnO3. ...................................... 165
6.3.2
Die Austauschbarkeit von MsnO3 und RslO2.............................................................. 166
6.3.3
Bioinformatische Untersuchungen von MsnO3 und RslO2. ....................................... 167
7
Literaturverzeichnis ..................................................................................................................... 169
8
Abkürzungsverzeichnis ................................................................................................................ 180
8.1
Einheiten.............................................................................................................................. 180
XI
Inhaltsverzeichnis
8.2
Nukleotide ........................................................................................................................... 180
8.3
Physikalische Größen........................................................................................................... 181
8.4
Vorsilben.............................................................................................................................. 181
8.5
Aminosäuren ....................................................................................................................... 181
8.6
Sonstige Abkürzungen ......................................................................................................... 182
9
Anhang ........................................................................................................................................ 187
9.1
Proteinsequenz von MsnO2 ................................................................................................ 187
9.2
Proteinsequenz von MsnO3 ................................................................................................ 187
9.3
Proteinsequenz von MsnO4 ................................................................................................ 187
9.4
Proteinsequenz von MsnO8 ................................................................................................ 187
9.5
Proteinsequenz von RslO1................................................................................................... 188
9.6
Proteinsequenz von RslO6................................................................................................... 188
9.7
Proteinsequenz von RslO2................................................................................................... 188
9.8
Plasmide zur heterologen Produktion von Proteinen in E. coli ........................................... 189
9.9
Plasmide zur Komplementierung mit enthaltener Punktmutation .................................... 191
10
Danksagung ............................................................................................................................. 192
11
Bildungsgang ........................................................................................................................... 194
XII
Zusammenfassung
1 Zusammenfassung
Die Polyketide Mensacarcin, Rishirilid A und Rishirilid B wurden ursprünglich aus dem Stamm
Streptomyces bottropensis (ehemals Streptomyces sp. Gö C4/4) isoliert. Das im Rahmen dieser Arbeit
hauptsächlich untersuchte Mensacarcin zeichnet sich durch seinen hohen Oxygenierungsgrad sowie
zwei stabile Epoxidgruppen aus, die maßgeblich für die zytotoxische Aktivität des Stoffes
verantwortlich sind [1]. Ein weiteres ungewöhnliches Merkmal ist die große Anzahl an Luciferaseähnlichen Monooxygenasen (LLM) die an der Biosynthese von Mensacarcin (MsnO2, MsnO4 und
MsnO8) sowie Rishirilid (RslO1 und RslO6) in S. bottropensis beteiligt sind. LLM stellen, innerhalb der
großen Familie der Flavoprotein-Monooxygenasen, zusammen mit den Luciferasen eine
eigenständige Untergruppe strukturell verwandter Proteine dar. Die meisten dieser Enzyme sind in
ihrer Aktivität von der Zusammenarbeit mit einer Flavinreduktase abhängig [2]. In den BiosyntheseGenclustern von Mensacarcin (msn) und Rishirilid (rsl) befindet sich wiederum jeweils nur ein Gen,
das für eine solche Flavinreduktase kodiert (msnO3 und rslO2) [3].
Im Rahmen dieser Arbeit konnten die Luciferase-ähnlichen Monooxygenasen MsnO4 und die
Flavinreduktase MsnO3 erfolgreich heterolog in E. coli produziert und anschließend aufgereinigt
werden. Die so erhaltenen, reinen Proteine wurden in in vitro Aktivitätsassays und für
Kristallisierungsexperimente verwendet. Der Mechanismus der Zusammenarbeit von MsnO4 und
MsnO3 wurde zusätzlich mithilfe von Fütterungsexperimenten in Streptomyces albus untersucht. Des
Weiteren wurden für die Luciferase-ähnlichen Monooxygenasen MsnO2, MsnO4 und RslO1 sowie für
die Flavinreduktasen MsnO3 und RslO2 bioinformatische Homologiemodelle erstellt und
charakterisiert. Durch den Vergleich der Primär- und Sekundärstrukturen der Proteine konnten
Gemeinsamkeiten sowie Unterschiede zu bereits bekannten Kristallstrukturen verwandter Enzyme
definiert werden. Zudem konnte durch die Alignments der Modelle gezeigt werden, dass die
Strukturen
der
aus
S. bottropensis
stammenden
Luciferase-ähnlichen
Monooxygenasen
untereinander relativ große Unterschiede aufweisen.
Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit lag in der weiterführenden Aufklärung der MensacarcinBiosynthese. Durch die Einführung von Punktmutationen in den aktiven Zentren der Ketoreduktasen
MsnO10 und MsnO11 konnte gezeigt werden, dass diese nicht nur strukturell an der Stabilisierung
der minimalen PKS sowie der Polyketidkette beteiligt sind, sondern auch eine katalytische Funktion
erfüllen. Darüber hinaus wurde das Gen msnO2 auf der genomischen DNA des natürlichen
Mensacarcin-Produzenten Streptomyces bottropensis inaktiviert. Durch diesen Knockout konnte die
Biosynthese von Mensacarcin und von Mensacarcin-Derivaten komplett unterbunden werden.
Stattdessen erfolgte eine starke Produktion an Rishirilid B, was wiederum auf eine bisher unbekannte
13
Zusammenfassung
Cross-Regulierung zwischen dem msn- und dem rsl-Gencluster hindeutet. Zudem konnte gezeigt
werden, dass die Flavinreduktasen MsnO3 und RslO2 in ihrer Aktivität untereinander austauschbar
sind. Im Rahmen dieser Arbeit wurden Komplementierungen der Knockout-Mutante S. albus
Cos2∆O3 x pkR1 mit msnO3 und alternativ mit rslO2 durchgeführt. In beiden Fällen konnte die
Didesmethylmensacarcin-Produktion des Stammes wiederhergestellt werden. Somit wurde ein
weiterer Beweis für die Cross-Regulierung zwischen Genen der beiden Cluster erbracht.
14
Einleitung
2 Einleitung
2.1 Mensacarcin
Das Polyketid Mensacarcin (siehe Abbildung 2.1) wurde erstmals im Jahr 1998 aus dem
Bodenbakterium Streptomyces bottropensis Goe C4/4 isoliert [4]. In vivo zeigte es, in Abhängigkeit
von der getesteten Zelllinienart, eine potente zytostatische oder zytotoxische Aktivität. Diese war
zudem vergleichbar mit der des klinisch angewandten Doxorubicins [3]. Mithilfe von Aktivitätstests
von unterschiedlichen Mensacarcin-Derivaten konnte gezeigt werden, dass die antitumorale Wirkung
stark von der Epoxidgruppe der Seitenkette abhängt und sich mit abnehmender Elektrophilie der
Seitenkette verringert. Als Wirkmechanismus wurde für den Naturstoff die Alkylierung von Stickstoffhaltigen Molekülen wie DNA oder Proteinen durch diese Epoxidgruppe postuliert [1]. Da allerdings
auch Derivate ohne Epoxidfunktion in der Seitenkette eine schwache Antitumoraktivität aufwiesen,
wurde zusätzlich zur alkylierenden Wirkung eine Interkalation in die DNA angenommen. Das
Grundgerüst von Mensacarcin ist nahezu planar, wodurch es sich ähnlich wie im Fall von Doxorubicin
in die Doppelhelix der DNA einlagern und so die Replikation und Transkription verhindern könnte [5].
Neben Mensacarcin konnte noch ein anderes Polyketid, Rishirilid aus Streptomyces bottropensis Goe
C4/4 isoliert werden (siehe Abbildung 2.1). Durch weitere Untersuchungen des Stammes wurden drei
unterschiedliche PKS II Gencluster identifiziert–das msn-Cluster (Mensacarcin Biosynthesecluster),
das rsl-Cluster (Rishirilid-Biosynthesecluster) und das mec-Cluster (Biosynthesecluster eines
Sporenpigments).
Abbildung 2.1 Die Strukturen von Mensacarcin, Rishirilid A und Rishirilid B.
Die drei Polyketid-Naturstoffe wurden erstmalig aus dem Bodenbakterium Streptomyces bottropensis Goe C4/4 isoliert.
Im Rahmen der Erstellung einer genomischen Bibliothek von S. bottropensis konnte das MensacarcinCluster auf dem Cosmid Cos2 und das Rishirilid-Cluster auf dem Cosmid Cos4 lokalisiert werden. Nach
der heterologen Expression von Cos2 in Streptomyces albus J1074, produzierte der Stamm allerdings
15
Einleitung
nicht wie erwartet Mensacarcin, sondern dessen Vorläufermolekül Didesmethylmensacarcin
(DDMM). Dieses unterscheidet sich von Mensacarcin lediglich durch das Fehlen der zwei
Methylgruppen an den Hydroxygruppen in Position C-9 und C-10 (siehe Abbildung 2.2). Mithilfe einer
Sequenzanalyse von Cos2 konnte zudem nachgewiesen werden, dass Gene für die SAM-Regeneration
und den Methyltransfer auf dem Cosmid fehlen, was vermutlich den Grund für die DDMMProduktion darstellt [3].
Sowohl das Mensacarcin- als auch das Rishirilid-Gencluster weisen eine ungewöhnlich hohe Anzahl
an Luciferase-ähnlichen Monooxygenasen (LLM) auf. Im msn-Cluster konnten die entsprechenden
Gene msnO2, msnO4 sowie msnO8 und im rsl-Cluster die Gene rslO1 sowie rslO6 identifiziert werden
[1][6][7]. In der Mensacarcin-Biosynthese ist MsnO8 in Zusammenarbeit mit der Flavinreduktase
MsnO3 (vergleiche 2.2.4) für die Einführung der Epoxidgruppe in der Seitenkette von Mensacarcin
verantwortlich. Die Rolle der beiden anderen LLM MsnO2 und MsnO4 ist bisher nicht geklärt [1].
Im Rahmen ihrer Dissertationen inaktivierten Katharina Probst, Uwe Hardter und Sarah Maier Gene
der Mensacarcin-Biosynthese die für Luciferase-ähnliche Monooxygenasen (msnO2, msnO4 und
msnO8),
Anthronoxygenasen
(msnO5,
msnO6
und
msnO7),
Oxidoreduktasen
(msnO9),
Ketoreduktasen (msnO1, msnO10 und msnO11) und Flavinreduktasen (msnO3) kodieren. Durch die
heterologe Expression der Inaktivierungskonstrukte und die Analyse der neuen Intermediate wurde
ein möglicher Biosyntheseweg für DDMM postuliert (siehe Abbildung 2.2). Bis jetzt eindeutig
nachgewiesen ist allerdings nur die Einführung der Epoxidgruppe in die Seitenkette des Naturstoffs
durch das Zweikomponentensystem MsnO8/MsnO3 [8][9][1].
16
Einleitung
Abbildung 2.2 Die postulierte Mensacarcin-Biosynthese [1].
Der dargestellte Mensacarcin-Biosyntheseweg wurde aufgrund von Inaktivierungen von Genen aus dem msn-Cluster von
Sarah Maier im Rahmen ihrer Dissertation postuliert. Allerdings konnte bis jetzt nur die Einführung der Epoxidgruppe in der
Seitenkette durch MsnO8 in Zusammenarbeit mit MsnO3 experimentell eindeutig nachgewiesen werden.
2.2 Bakterielle Monooxygenasen
2.2.1 Die Funktion und Vielfalt Flavin-abhängiger Monooxygenasen
Seit ihrer chemischen Charakterisierung in den 30er Jahren des 20.Jahrhunderts wurde bis zum
heutigen Tag eine große Anzahl unterschiedlichster Flavoproteine beschrieben [10]. Diese große
Proteinklasse kann allgemein in FAD- und FMN-abhängige Enzyme unterteilt werden. Flavine
wiederum stellen die am weitesten verbreiteten organischen Cofaktoren dar, was darauf
zurückzuführen ist, dass diese in einer Vielzahl verschiedener Redoxzuständen existieren können
[11]. Chemische Reaktionen, welche von Flavoprotein-Monooxygenasen (FMO) katalysiert werden
sind sowohl für Prokaryonten als auch für Eukaryoten bekannt. Sie spielen eine wichtige Rolle im
Abbau von organischen Verbindungen, der Biosynthese von Polyketiden, der Entstehung von
Antibiotikaresistenzen und bei der Biosynthese von Schlüsselsubstanzen wie Cholesterol, Antibiotika
und Siderophoren. Allgemein kann zwischen externen (vergleiche Abbildung 2.3) und internen
Monooxygenasen unterschieden werden. Erstere erhalten das für ihre Aktivität benötigte reduzierte
Flavin mit Hilfe eines reduzierten Coenzyms (NADH oder NADPH), bei letzteren wiederum wird das
Flavin vom Substrat selbst reduziert. Beiden Gruppen ist gemein, dass sie den Flavin-Cofaktor nur
nicht-kovalent binden können. Eine Ausnahme stellen Flavin-abhängige Enzyme dar, die
Hydroxylierungen von organischen Verbindungen katalysieren und in denen das Flavin selbst die
Oxidierung des Substrats mithilfe eines vom wässrigen Milieu stammendem Sauerstoffatoms
17
Einleitung
durchführt. Gleichzeitig wird das Flavin durch den Sauerstoff (O2) recycelt [12]. Eine genauere
Einteilung in sechs Flavoprotein-Monooxygenase-Unterklassen (A-F) wurde 2006 aufgrund von
ähnlichen Struktur- und Sequenz-Eigenschaften durchgeführt. Allgemein lässt sich eine gewisse
Selektivität der katalysierten Reaktionen bedingt durch die jeweilige Proteinfaltung beobachten [2].
Abbildung 2.3 Die von externen Flavoprotein-Monooxygenasen katalysierten Oxygenierunsreaktionen.
Enzyme dieser Klasse benötigen NADH oder NADPH als Coenzym. Mit dessen Hilfe wird der Cofaktor FMN zu FMNH2
reduziert und daraufhin die eigentliche Oxygenierungsreaktion gestartet.
Unabhängig von den natürlichen, bekannten Flavoenzymen sind in den letzten Jahren zahlreiche,
künstlich modifizierte Formen hinzugekommen. Diese besitzen meist allgemein verbesserte, oder an
spezifische Reaktionen besser angepasste katalytische Eigenschaften. Desweiteren ist die Erhöhung
der Enantioselektivität und die Entwicklung von intelligenten Wirkstofffreisetzungssystemen im
Fokus der aktuellen Forschung [13]. Eine große Anzahl Flavin-abhängiger Monooxygenasen sind an
Baeyer-Villiger Oxidationen beteiligt. Hierbei werden Ketone mithilfe von Peroxycarbonsäuren oder
Wasserstoffperoxiden zu Estern oder Lactonen oxidiert [14]. Es können zwei Klassen von BaeyerVilliger-Monooxygenasen (BVMO) unterschieden werden. Die BVMO vom Typ I enthalten FAD und
sind NADPH-abhängig. Die BVMO vom Typ II wiederum sind FMN- und NADH-abhängig [15]. Im Jahr
2012 wurde die genaue Struktur der zu den BVMO vom Typ I gehörenden CyclohexanonMonooxygenase aus Rhodococcus sp. HI-31aufgeklärt. Die Kristallisierung erfolgte zusammen mit
dem Substrat Cyclohexanon, NADP+ und FAD [16]. Von Bedeutung war auch die Entdeckung der Typ
II BVMO’s 2,5-Diketocamphan-1,2-Monooxygenase (2,5-DKCMO) und 3,6-Diketocamphan-1,6Monooxygenase (3,6-DKCMO). Diese sind am Campher-Abbau in P. putida NCIMB 10007 beteiligt und
stellen interessanterweise ein FMN- und NADH-abhängiges Zweikomponentensystem aus
Monooxygenase und Reduktase dar. Gleichzeitig sind sie neben den Luciferasen aus Photobacterium
18
Einleitung
phosphoreum NCIMB 844 und Vibrio fischeri ATCC 7744 die einzigen bisher bekannten Enzyme die
Baeyer-Villiger Oxidationen an unterschiedlichen mono- und bizyklischen Ketonen durchführen
können [17]. Eine weitere, von Flavin-abhängigen Monooxygenasen katalysierte Reaktion ist die
spezifische Einführung von Epoxidgruppen. Ein Beispiel hierfür ist das ZweikomponentenStyrolmonooxygenase-System aus Pseudomonas sp., welches aus der Oxygenase StyrA und der
NADH-Flavin-Oxidoreduktase StyrB aufgebaut ist. Die Kristallstruktur der aus Pseudomonas putida
S12 isolierten Oxygenase-Untereinheit wurde 2010 veröffentlicht [18]. Auch die Luciferase-ähnliche
Monooxygenase MsnO8 aus Streptomyces bottropensis katalysiert die Einführung einer
Epoxidgruppe am Ende der postulierten Mensacarcin–Biosynthese [19]. Zu den von FMO
katalysierten Reaktionen gehören zudem Sulfoxidationen mit hoher Enantioselektivität und NOxidationen durch L-Ornithin- und L-Lysin-Hydroxylasen. Von der L-Ornithin-Hydroxylase aus
Pseudomonas aeruginosa PAO1 ist seit 2011 auch die Kristallstruktur bekannt [20][21]. Erst kürzlich
publiziert wurde die erste Kristallstruktur einer 4-Hydroxybenzoat-Hydroxylase mit gebundenem
Cofaktor FAD (3HB6H aus Rhodococcus jostii RHA1) [22]. Von Bedeutung ist dies vor allem aufgrund
der Fähigkeit dieser Hydroxylasen Monophenole zu o-Diphenolen zu oxidieren, was sie zu attraktiven
Biokatalysatoren macht [22]. In den letzten Jahren haben Flavin-abhängige Monooxygenasen eine
immer größere Rolle als Biokatalysatoren gespielt. Neben der Vielzahl an von ihnen katalysierten
Reaktionen, stehen dabei auch die umweltschonenden und kostensparenden Eigenschaften dieser
Systeme im Vordergrund [21].
2.2.2 Die Proteinfamilie der Luciferasen
Unter den bekannten Biolumineszenz-Systemen sind die bakteriellen Luciferasen, die Luciferase aus
Photinus (Glühwürmchen) Arten und Systeme die Imidazopyrazinon-Luciferine umsetzen, wie z.B.
Cypridinid und Coelenterazin aktuell im Fokus der Forschung. Letztere wurden unter anderem aus
Hohltieren, Würmern und Krebsen isoliert [23]. Eine Zusammenfassung der von den
unterschiedlichen Luciferasen katalysierten Luciferin-Reaktionen ist in Abbildung 2.4 zu finden.
19
Einleitung
Abbildung 2.4 Die Biolumineszenz-Schritte in Bakterien (I), Photinus-Arten (II), Cypridinid-Luciferin (III) und Coelenterazin
(IV).
20
Einleitung
Wenn man die ca. 10 bereits bekannten Luciferine untereinander vergleicht, stellt man fest dass
diese fast immer sehr unterschiedlich aufgebaut sind. Dies erklärt auch wieso es meist zu keinen
Cross-Reaktionen zwischen den jeweiligen Biolumineszenz-Systemen kommen kann [24]. Im
Gegensatz zu bakteriellen Systemen, konnten sowohl für Photinus, als auch Imidazopyrazinon
basierte Luciferasen mariner Herkunft kurzlebige, hoch energetische Intermediate nachgewiesen
werden. In beiden Fällen handelt es sich um Dioxetanon. Des Weiteren unterscheiden sich bakterielle
Luciferasen von allen anderen Luciferasen durch den Mechanismus der von ihnen katalysierten
Biolumineszenz. Es können zwei Arten von Biolumineszenz-Reaktionen unterschieden werden. Bei
„direkten“ wird die entstandene chemische Energie ohne weitere Zwischenstufen auf das Produkt
der Reaktion übertragen. Bei „indirekten“ wiederum wird diese von einem Intermediat auf ein
Molekül übertragen das an dem eigentlichen Prozess nicht beteiligt ist. Für die Biolumineszenz von
Photinus-, sowie Cypridinid-Luciferinen und Coelenterazinen wird ein direkter Prozess beschrieben.
Für bakterielle Luciferasen wiederum wird ein indirekter Prozess postuliert, obwohl der genaue
Mechanismus bis heute unaufgeklärt bleibt [23]. Eine weitere Besonderheit der bakteriellen
Luciferasen ist ihre Fähigkeit mit speziellen „Antennen-Proteinen“ zusammenzuarbeiten, die das
jeweilige Luciferin binden und dadurch die Farbe der Lumineszenz verändern können. Das älteste
und bekannteste Beispiel eines solchen „Antennen-Proteins“ ist das „Lumazin Protein“ (LumP), das
erstmals in Photobacterium Arten entdeckt wurde [25][26]. Die bisher identifizierten bakteriellen
Luciferasen gehören zu den relativ seltenen FMN-abhängigen Monooxygenasen bei denen das Flavin
Hydroperoxid als Nukleophil fungiert. Das Hydroperoxid als solches ist hier extrem stabil und besitzt
auch in Abwesenheit des langkettigen Aldehyd-Substrats eine Halbwertszeit von ca. 1 h bei 2 °C [27].
Alle bisher bekannten Luciferasen sind αβ-Dimere mit einer sehr langsamen katalytischen
Umsatzgeschwindigkeit von ca. 20 min-1 bei 23 °C [10]. Diese ca. 80 kDa großen Proteine sind im
Stande natürliche Biolumineszenz-Prozesse um den Faktor 1010 zu beschleunigen. Aus diesem Grund
werden bakterielle Luciferasen oft als die katalytisch aktivsten, bekannten Enzyme bezeichnet [28].
Als erste Kristallstruktur dieser Gruppe mit gebundenem FMN-Cofaktor wurde 2009 die Luciferase
aus Vibrio harveyi veröffentlicht [29]. Die Monomere sind jeweils in einem TIM (β/α)8-Barrel
angeordnet. Der Cofaktor FMN ist komplett in der α-Untereinheit der heterodimeren Struktur
lokalisiert. Er befindet sich in einem relativ großen Hohlraum von dem aus ein direkter Zugang zum
Lösungsmittel besteht (siehe Abbildung 2.5). Innerhalb der α-Untereinheit, in der Nähe der FMNBindetasche befindet sich auch die am stärksten konservierte Region der Luciferase-Sequenz [29]. Sie
stellt eine flexible Region (Loop) dar, die erst durch die Bindung von FMN oder eines polyvalenten
Anions vor proteolytischer Inaktivierung geschützt werden kann [30]. Gleichzeitig scheint dieser
Bereich von großer Bedeutung für die Stabilisierung des Dimers, sowie für die Interaktion von α- und
β-Untereinheit zu sein. Für die Position α272 (Phenylalanin) des Loops konnte eine direkte
21
Einleitung
Interaktion mit Position β151 (Tyrosin) der β-Untereinheit nachgewiesen werden [29] (vergleiche
Abbildung 2.6). Das planare, gebundene FMN ist nicht-kovalent gebunden und wird nur über
Wasserstoffbrücken innerhalb der Bindetasche stabilisiert [31].
Abbildung 2.5 Das αβ-Heterodimer der Luciferase aus Vibrio harveyi mit gebundenem Cofaktor FMN (in grün).
Die Cofaktor-Bindetasche befindet sich komplett in der α-Untereinheit des heterodimeren Enzyms und bietet einen guten
Zugang des gebundenen FMN zum Lösungsmittel.
Abbildung 2.6 Direkte Interaktion zwischen Phenylalanin α272 (rot) und Tyrosin β151 (gelb) an der Grenzfläche zwischen
der α- und der β-Untereinheit der Luciferase aus Vibrio harveyi.
Die hochkonservierten Positionen α272 (Phenylalanin) der α-Untereinheit und β151 (Tyrosin) der β-Untereinheit sind
essentiell für die Stabilisierung der heterodimeren Struktur.
22
Einleitung
2.2.3 Luciferase-ähnliche Monooxygenasen (LLM)
Die Gruppe der Flavoprotein-Monooxygenasen kann in sechs Unterklassen unterteilt werden. Es ist
auf
diese
Weise
möglich
Proteine
mit
ähnlichen
biochemischen
Eigenschaften,
Aminosäuresequenzen sowie Kristallstrukturen zusammenzufassen. Interessanterweise bilden
Luciferasen, gemeinsam mit Luciferase-ähnlichen Monooxygenasen in dieser Klassifizierung eine
eigenständige,
eindeutig
von
den
anderen
zu
unterscheidende
Gruppe
(Flavoprotein-
Monooxygenasen der Klasse C) [2]. Die bis jetzt am besten beschriebenen Enzyme der Klasse C sind
bakterielle Luciferasen. In Folge von Oxidierungsreaktionen, z.B. an langkettigen, aliphatischen
Aldehyden sind diese im Stande Licht zu emittieren. Dieser Prozess wird auch als Biolumineszenz
bezeichnet [32][33]. Sowohl Luciferasen, als auch Luciferase-ähnliche Proteine sind aus zwei
heterodimeren Untereinheiten aufgebaut und zeigen in ihrer Aminosäuresequenz und in ihrer
Struktur eine große Ähnlichkeit zur Modell-Struktur der bakteriellen Luciferase aus Vibrio harveyi
[29][34][35]. Die Monooxygenase Untereinheiten dieser Gruppe weisen stets eine charakteristische
TIM-Barrel Faltung auf [36]. In einer anderen Klassifizierung werden bakterielle Luciferasen und
verwandte Enzyme als Typ II Baeyer-Villiger Monooxygenasen (BVMO) zusammengefasst [37].
Begründet wird dies durch ihre oligomere Struktur, die auch in Typ II BVMO zu finden ist. Zusätzlich
sind LLM im Stande Baeyer-Villiger-ähnliche Oxidationen von Ketogruppen zu katalysieren [38].
Einheitlich für die Gruppe der Zweikomponenten FMN-abhängigen Monooxygenasen ist der Aufbau
aus einer Flavinreduktase und einer Monooxygenase, wobei beide Teile für die Aktivität essentiell
sind. Die von solchen Systemen katalysierten Reaktionen sind jedoch sehr unterschiedlich.
Ausgewählte Beispiele für von Luciferase-ähnlichen Proteinen katalysierte Reaktionen sind in
Abbildung 2.7 dargestellt.
23
Einleitung
Abbildung 2.7 Von FMN-abhängigen, Luciferase-ähnlichen Monooxygenasen katalysierte Reaktionen.
Obwohl diese Enzyme strukturell eine sehr große Ähnlichkeit aufweisen, sind die von ihnen katalysierten Reaktionen sehr
vielfältig.
Wie zuvor beschrieben, führen bakterielle Luciferasen (LuxA/LuxB; siehe Kapitel 2.2.2) eine Oxidation
von langkettigen Alkanen unter gleichzeitiger Emission von blau-grünem Licht durch. Des Weiteren
wurden unter anderem Reaktionen wie Desulfonierung von Alkansulfonaten (SsuD/SsuE),
Hydroxylierung
von
p-Hydroxyphenylacetat
(HpaH/C2),
EDTA
Abbau
(EmoA/EDTA-Mo),
Nitrilotriessigsäure-Abbau (NtaA/NTA-Mo), Oxidation von langkettigen Alkanen ohne Emission von
Licht (LadA) und Dibenzothiophen-Abbau (Dsz/SoxA und C) beschrieben [39]. Eine Übersicht der
bekannten Luciferase-ähnlichen Monooxygenase-Reduktase-Systeme ist in Tabelle 2.1 zu finden.
24
Einleitung
Tabelle 2.1 Luciferase-ähnliche Monooxygenasen und deren Reduktase-Partner.
LLM
MsuD [40]
Organismus
Reduktase-Partner
Pseudomonas aeruginosa
msuE (NADH-abhängige FMN-
(msu Operon)
Reduktase)
C2-Komponente einer
p-Hydroxyphenylacetat-
C1-Komponente
Actinobacter baumannii
hydroxylase [41]
AbyE [42]
PhenylacetonMonooxygenase PAMO [43]
Hgc3 [44]
MupA [45]
GarO [46], [47]
TpdA [48]
LadA [49]
(NADH-abhängige FMNReduktase)
Verrucosispora maris AB18-032
AbyZ (NAD(P)H-abhängige FMN-
(Abyssomicin C-Cluster)
Reduktase) *
Thermobifida fusca
?
Streptomyces hygroscopicus LZ35
(Hygrocin-Cluster)
Hgc11 (FAD-abhängige
Pyridinnukleotid-DisulfidOxidoreduktase) *
Pseudomonas fluorescens (Mupirocin-
MupC (NADH/NADPH-
Cluster)
Oxidoreduktase) *
Actinoplanes garbadinensis ATCC 31049
(Actagardin-Cluster)
Rhodococcus jostii TMP1
(Tetramethylpyrazin Biosynthese)
Geobacillus thermodenitrificans NG80-2
SsuD [50]
Escherichia coli
EmoA [51]
Mesorhizobium sp. BNC1
PIIA Synthase [52]
Streptomyces pristinaespiralis
HpaB [53]
Escherichia coli
Adf (F420-abhänige
Methanoculleus thermophilicus
Alkoholdehydrogenase) [54]
Methanofollis liminatans
?
TpdD-Flavinreduktase *
?
SsuE (NAD(P)H-abhängige FMNOxidoreduktase)
EmoB (NADH-abhängige FMNOxidoreduktase)
FMN-Reduktase *
HpaC FAD-abhängige
Flavinreduktase)
?
Mer (F420-abhängige
Methylentetrahydro-
Methanopyrus kandleri
methanopterinreduktase)
Methanothermobacter marburgensis
?
[55]
Cg1848 [56]
Imo [57]
Corynebacterium glutamicum
Mycobacterium avium sub.
paratuberculosis
Cg1850 (FMN-Reduktase) *
?
25
Einleitung
Fortsetzung von Tabelle 2.1 Luciferase-ähnliche Monooxygenasen und deren Reduktase-Partner.
LLM
Organismus
Reduktase-Partner
DmoA [58]
Hyphomicrobium sulfonivorans
MsnO8 [19]
Streptomyces bottropensis
SfnG [59]
Pseudomonas putida DS1
MelF [60]
Mycobacterium marinum
DmoB (NAD(P)H-abhängige
Flavin-Oxidoreduktase)
MsnO3 (Flavinreduktase)
SfnF (NADH-abhängige FMNReduktase).
MelG (NAD(P)H-abhängige
Flavinreduktase).
* Noch nicht experimentell nachgewiesen.
Viele LLM sind an Reaktionen in denen Schwefelgruppen involviert sind beteiligt. MsuD aus
Pseudomonas aeruginosa katalysiert die Desulfonierung aliphatischer Sulfonate, wie z.B. von
Methansulfonat [40], GarO aus Actinoplanes garbadinensis ist für die Einführung des einzigartigen
Sulfoxids in die Struktur von Actagardin [46][47] und SsuD aus Escherichia coli für die Umwandlung
von Alkensulfonaten in das korrespondierende Aldehyd verantwortlich [50]. Weitere Beispiele aus
dieser Gruppe sind SfnG aus Pseudomonas putida DS1, das an der Umsetzung von Dimethylsulfon zu
Methansulfonaten beteiligt ist [59] und DmoA aus Hyphomicrobium sulfonivorans das eine FMNH2abhängige Dimethylsulfid-Monooxygenase darstellt [58]. Bekannt sind zudem mehrere Beispiele für
Baeyer-Villiger und Baeyer-Villiger-ähnlichen Oxidationen. Für das Enzym Hgc3 aus dem Hygrocin
Gencluster aus Streptomyces hygroscopicus LZ35 wurde eine Sauerstoffeinführung zwischen den
Positionen
C5
und
C6
mittels einer
solchen
Oxidation
beschrieben
[43].
Auch
die
Phenylacetatmonooxygenase PAMO in Termobifida fusca weist eine Bayer-Villiger-ähnliche
Reaktivität auf [43]. Einzigartig ist wiederum die für TpdA aus dem TetramethylpyrazinStoffwechselweg in Rhodococcus jostii beschriebene Spaltung einer aromatischen Ringstruktur [48].
Weitere, für Luciferase-ähnliche Proteine bekannte Reaktionen sind FMNH2-gesteuerte Oxidierungen
(MupA aus dem Mupirocin Cluster in Pseudomonas fluorescens [45]), Umsetzungen von langkettigen
Alkanen zu primären Alkoholen (LadA aus Geobacillus thermodenitrificans NG80-2 [49]), EDTA-Abbau
(Emo A aus Mesorhizobium sp.BNC1 [51]) und die 4-Hydroxyphenylacetat-Oxidierungen in
Escherichia coli [53]. Die Umsetzung von Hydroxylgruppen beschränkt sich nicht nur auf langkettige
Alkohole. Bekannt ist auch die Oxidierung von Isopropanol durch Adf in Methanoculleus
thermophilicus [54], sowie von anderen Alkoholgruppen durch MelF in Mycobacterium marinum.
Letzteres spielt eine wichtige Rolle als Abwehrmechanismus gegen RNS und ROS (reaktive Stickstoffund Sauerstoffspezies) [60]. Eine eher ungewöhnliche Funktion hat das Mer-Protein aus
Methanopyrus kandeleri,
das
eine
reversible
Reduktion
von
N5,
N10-
Methylenetetrahydromethanopterin zu N5-Methyltetrahydromethanopterin katalysiert [55]. Auch
das im Rahmen dieser Arbeit untersuchte Mensacarcin-Gencluster enthält drei Gene die für
26
Einleitung
Luciferase-ähnliche Monooxygenasen kodieren – msnO2, msnO4 und msnO8 [3]. MsnO8 ist, in
Zusammenarbeit mit der Flavinreduktase MsnO3 für die oxidative Einführung einer Epoxidgruppe in
die Mensacarcin-Seitenkette verantwortlich [1]. Für das Zweikomponentensystem AbyE/AbyZ aus
dem Abyssomycin-C Cluster aus dem Actinomyceten Verrucosispora maris AB 18-032 wurde eine
ähnliche Epoxidierung innerhalb einer ungesättigten 6-Ring Struktur nachgewiesen [42]. Eine solche
Reaktion wurde auch für MsnO4 postuliert [1]. Als eine mögliche Funktion von MsnO2 wurde zuvor
die Einführung einer Doppelbindung in die Seitenkette von Mensacarcin diskutiert. Eine andere LLM
die eine ähnliche Aktivität aufweist ist die PIIA-Synthase. Diese fügt im Rahmen der Pristinamycin IIBBiosynthese in Streptomyces pristinaespiralis eine Doppelbindung in die Ringstruktur ein [52].
2.2.4 Das FMN-abhängige Zweikomponentensystem LLM/FlavinReduktase
Die bakterielle Luciferase war die erste FMN-abhängige Monooxygenase die als ein
Zweikomponentensystem aus Oxygenase und Reduktase beschrieben wurde [61]. Eine schematische
Darstellung solcher Systeme ist in Abbildung 2.8 gezeigt.
Abbildung 2.8 Allgemeines Schema eines Zweikomponentensystems Monooxygenase/Flavinreduktase.
FMN wird durch die Flavinreduktase, in Abhängigkeit von NADH, zu FMNH2 umgesetzt und anschließend der
Monooxygenase zu Verfügung gestellt. Diese führt dann die Oxygenierung des Substrats R durch, wobei gleichzeitig FMNH 2
wieder zu FMN reduziert wird.
27
Einleitung
In der Gruppe der Luciferasen und Luciferase-ähnlichen Monooxygenasen (LLM) stellt das reduzierte
FMN im Prinzip ein Substrat dar. Dieses wird durch die katalytische Reaktion einer sich separat in der
Zelle befindende Flavinreduktase gebildet und danach an die Luciferase übertragen. 2008 wurde
LuxG, eine Reduktase dieser Gruppe aus Photobacterium leiognathi TH1 erstmals isoliert und
untersucht. Sie wurde der Klasse I der Flavinreduktasen, die keinen gebundenen Cofaktor besitzen
zugeordnet [62]. Die erste kristallisierte Flavinreduktase dieser Art war die aus Vibrio harveyi isolierte
Flavin Reduktase P, die eine hohe Spezifität für NADPH aufweist. Ihre Struktur stellt ein Homodimer
dar, wobei jedes Monomer ein FMN-Molekül binden kann [63]. Jedes Monomer besteht aus zwei
Domänen. Die größere ist aus jeweils vier antiparallel angeordneten β-Faltblättern, die zusätzlich von
α-Helices flankiert werden aufgebaut und ist für die katalytische Funktion verantwortlich [64]. Die
kleinere Untereinheit stellt die Verbindung zum jeweils anderen Monomer dar. Durch diesen Aufbau
besitzt das Homodimer eine Kontaktfläche von 9,352 Å2 zwischen den Monomer-Untereinheiten. In
der Gruppe ähnlich großer, dimerer Proteine ist dies die derzeit größte, bekannte Kontaktfläche
zwischen Monomeren [10][65].
Die von Luciferasen katalysierte Biolumineszenz stellt einen hoch komplizierten Prozess dar. Eine
unkoordinierte Arbeit von Flavinreduktasen und Monooxygenasen wäre deshalb mit einem großen
Energieverlust durch die Zelle verbunden. Des Weiteren haben die oben beschriebenen
Flavinreduktasen viel schnellere Umsatzraten als die korrespondierenden Luciferasen. Ohne eine
gegenseitige Regulation, würde die überschüssige Produktion an NAD(P)H zu einem zusätzlichen
Energieverlust sowie durch Autooxidation zur Bildung von schädlichem H2O2 führen [65]. Es konnte
gezeigt werden, dass der Km-Wert in Flavinreduktase/Luciferase gekoppelten Assays signifikant
kleiner ist, als für eine isolierte Luciferase. Der Grund hierfür könnte die Bildung eines funktionellen
Komplexes zwischen beiden Enzymen sein [66][64]. Außerdem führt die Zusammenarbeit zwischen
Reduktase und Luciferase zu einem veränderten Reaktionsmechanismus. Anstatt des so genannten
„Ping-Pong-Mechanismus“, in dem zwei Substrate in separaten Reaktionsschritten in zwei Produkte
umgesetzt werden, entsteht hier ein fortlaufender Prozess der eine direkte und effiziente Zufuhr von
NADH2 zur Luciferase ermöglicht. Gleichzeitig fungiert das an die Apo-Form der Reduktase
gebundene FMNH2 als Substrat für die Biolumineszenz-Reaktion der Luciferase und wird dieser
kontinuierlich zugeführt (siehe Abbildung 2.9) [65]. Um eine direkte Interaktion von bakterieller
Luciferase und Flavinreduktase nachzuweisen, wurden Fluoreszenz-basierte BRET (BiolumineszenzResonanzenergietransfer) Experimente durchgeführt. Hierbei wird Biolumineszenzenergie (z.B. von
der Luciferase) strahlungsfrei auf einen Fluoreszenzfarbstoff (Akzeptor-Fluorophor) der an das
Zielmolekül (hier die Flavinreduktase) gebunden ist übertragen. Die Intensität des BiolumineszenzResonanzenergietransfers hängt dabei vom Abstand der Biolumineszenzquelle und des Akzeptors ab.
Die Ergebnisse deuteten zwar auf einen kurzlebigen Komplex zwischen Luciferase und Reduktase hin,
28
Einleitung
jedoch war das gemessene BRET-Signal sehr schwach, was durch einen relativ großen räumlichen
Abstand zwischen den Enzymen erklärt werden könnte [67][68]. Aufgrund weiterer Untersuchungen
mit den Zweikomponentensystemen LuxA/LuxG, C2/C1 und ActVA/ActVB (vergleiche Kapitel 2.2.3),
konnte ein direkter Protein-Protein Komplex ausgeschlossen werden. Es wurde kein Einfluss der
Luciferase (-ähnlichen) Komponente auf die Effizienz der FMNH˙-Übertragung festgestellt. Die
Übertragung
von
FMNH˙
zwischen
Reduktase
und
Luciferase
erfolgt
demzufolge
höchstwahrscheinlich über freie Diffusion [69].
Abbildung 2.9 Vergleich des Reaktionsmechanismus einer isolierten Flavinreduktase („Ping-Pong-Mechanismus“) und
eines Zweikomponentensystems Luciferase/Flavinreduktase.
FR=Flavinreduktase; LUX=Luciferase; F=reduziertes Substrat; FH2=oxidiertes Substrat.
Oben: „Ping-Pong“-Mechanismus“ in dem die Reaktion der Reduktase nicht direkt mit der Reaktion der Monooxygenase
gekoppelt ist. Die Umsetzung an der Monooxygenase-Einheit (F zu FH2) stellt einen separaten Prozess dar.
Unten: Der fortlaufende Prozess des Zweikomponentensystems Reduktase/Monooxygenase, der eine direkte und effiziente
Zufuhr von NADH2 zur Luciferase ermöglicht.
2.3 Epoxidierung von Naturstoffen
Epoxidgruppen sind Bestandteil vieler unterschiedlicher Naturstoffe und haben meist einen großen
Einfluss auf die pharmakologische Aktivität dieser Substanzen (siehe Abbildung 2.10). Zu erwähnen
sind z.B. die potenten Zytostatika Dynemicin [70], Azinomycin [71] und Epothilon [72], sowie
Scopolamin das eine dämpfende Wirkung auf das zentrale Nervensystem besitzt [73]. Des Weiteren
entfalten solche Substanzen oft eine stark alkylierende Wirkung [73]. Die Epoxidgruppe des
Epothilons soll zusätzlich auch einen Einfluss auf die Bindung dieser Substanz an ihre biologischen
Zielstrukturen (Mikrotubuli) besitzen [74].
29
Einleitung
Abbildung 2.10 Beispiele epoxidhaltiger, hochpotenter Naturstoffe.
Epoxidgruppen kommen in einer Vielzahl unterschiedlicher Naturstoffe vor. In fast allen Fällen haben sie einen großen
Einfluss auf die pharmakologische oder toxikologische Aktivität dieser Substanzen.
Obwohl Epoxidgruppen eine so wichtige Rolle in der Aktivität und Wirksamkeit von Naturstoffen
spielen, sind die genauen Mechanismen der Entstehung solcher Gruppen, sowie die verantwortlichen
Enzyme nur in den wenigsten Fällen genauer erforscht [73]. Die meisten solcher Proteine benötigen
O2 für die von ihnen katalysierte Reaktion. Dieses muss wiederum zuerst von seinem natürlichen
Triplett- zum reaktiveren Singulett-Zustand umgewandelt werden, damit eine Reaktion mit
organischen Substanzen möglich ist. Dies geschieht in Enzymen mit Hilfe von Redox-aktiven
Übergangsmetallen (Eisen, Kupfer oder Mangan), Cofaktoren, oder Substraten die stabile Radikale
ausbilden können [75][76][2]. Die bisher am besten beschriebene Gruppe von Enzymen die im
30
Einleitung
Stande sind Epoxid Gruppen zu bilden sind die P450-Epoxidasen, die einen Häm-Cofaktor verwenden
um ein Sauerstoffatom aus O2 in die Doppelbindung von Alkenen einzubauen [77]. Zu dieser Gruppe
gehören EpoK aus dem Epothilon-Gencluster aus Myxobacterium Sorangium cellulosum [78], MycG
das an der Biosynthese des Makrolidantibiotikums Mycinamycin aus Micromonospora griseorubida
beteiligt ist [79] und PimD aus dem Biosynthesecluster des antimykotisch wirkenden Polyens
Pimaricin aus Streptomyces natalensis. MycG stellt des Weiteren ein Beispiel eines dual-arbeitenden
Enzyms dar. Es ist nicht nur für die Einführung der Epoxidgruppe, sondern auch für die
Hydroxylierung der α-Position während der Biosynthese verantwortlich [79]. Viele bekannte
Gencluster weisen weitere, hypothetische P450-Epoxidasegene auf, wie z.B. das Griseorhodin ACluster aus Streptomyces sp. JP95 [80]. Erst vor wenigen Jahren wurde eine weitere P450-abhängige
Art der Epoxidierung entdeckt, welche die Umsetzung von Fettsäure-Hydroperoxiden zu Allenoxiden
katalysiert. Fettsäure-Hydroperoxide die von mehrfach ungesättigten Fettsäuren abstammen, stellen
eine wichtige Vorstufe für Signalmoleküle wie Leukotriene, Thromboxane, Prostacycline und
Jasmonate dar [73].
Eine andere wichtige Gruppe sind neben den P450-abhängigen, die Flavin-abhängigen Epoxidasen.
Diese sind im Prinzip Monooxygenasen die ein Sauerstoffatom von O2 auf eine Alkengruppe
übertragen können. Für diese Reaktionen wird derselbe Mechanismus postuliert der bereits in
Kapitel 2.2.1 in Abbildung 2.3 dargestellt wurde [81]. Intensive bioinformatische Studien der letzten
Jahre führten zu einer vermehrten Entdeckung hypothetischer Gene, die wahrscheinlich für Flavinabhängige Epoxidasen kodieren. Vieles deutet darauf hin, dass diese häufiger in Genclustern, welche
für Naturstoffe kodieren vorhanden sind als bis jetzt vermutet. Eine solches Enzym wurde unter
anderem in den Clustern der Zytostatika Neocarzinostatin aus Streptomyces carcinostaticus und
Dynemicin aus Micromonospora chersina entdeckt [82][83]. Ein ungewöhnliches Beispiel ist das
Polyketid Hedamycin, das gleich zwei Epoxidgruppen enthält (siehe Abbildung 2.11).
31
Einleitung
Abbildung 2.11 Das Diepoxid-Antibiotikum Hedamycin und das Polyether-Antibiotikum Monensin.
Im entsprechenden Cluster konnten Gene sowohl für eine P450-abhängige als auch eine Flavinabhängigen Epoxidase identifiziert werden. Es bleibt jedoch unklar ob die beiden Epoxidgruppen von
demselben oder von unterschiedlichen Enzymen eingeführt werden [84]. Im Fall von Monensin aus
Streptomyces cinnamonensis enthält das Gencluster zwar ein für eine Epoxidase kodierendes Gen,
jedoch ist in der Struktur des Naturstoffes kein entsprechendes Epoxid zu finden (siehe Abbildung
2.11). Dies wiederum deutet auf das Vorhandensein einer Epoxid-Zwischenstufe in der Biosynthese
von Monensin hin. Der Knockout des entsprechenden Gens führte zu einer Akkumulation von PolyenIntermediaten. Aufgrund dessen wurde postuliert, dass die entsprechende Flavin-abhängige
Epoxidase MonCI für die Einführung von mehreren Epoxiden in ein Polyen-Intermediat
verantwortlich sein könnte. Aus diesen könnten in weiteren Schritten der Biosynthese die 5- und 6gliedrigen Heterozyklen des Monensins entstehen[85].
Die dritte erwähnenswerte Gruppe an Epoxidasen vereint Enzyme die ohne die Hilfe von Redoxaktiven Metall-Ionen oder Cofaktoren arbeiten können. Das Substrat ist in diesen Fällen immer eine
phenolische Verbindung die leicht in eine stabile Radikalform übergehen kann [73]. Ein Beispiel
stellen die aus Streptomyces cinnamonensis und Streptomyces MPP 3051 isolierten Epoxidasen
DHAE I und DHAE II dar [86][87]. Ein komplett anderer Mechanismus der Epoxidierung wurde für die
Reaktion von (S)-2-Hydroxypropylphosphonat zu Fosfomycin beschrieben. Die daran beteiligte
Epoxidase HppE katalysiert eine Eisen-abhängige und gleichzeitig Häm-unabhängige Reaktion. Mit
Hilfe der Kristallstruktur von HppE in Anwesenheit von (S)-2-Hydroxypropylphosphonat konnte eine
„zweizähnige“ Interaktion des Substrats mit dem eisenhaltigen aktiven Zentrum des Enzyms
bewiesen werden. Diese Interaktion ermöglicht im nächsten Schritt die Bindung von O2 [88][89].
32
Einleitung
2.4 Gencluster Cross-Regulierungen
Die Produktion von Naturstoffen und Antibiotika in Bakterien und darunter speziell auch
Streptomyceten unterliegt einer starken Regulation durch variierende äußere sowie physiologische
Bedingungen. Ein Grund hierfür ist unter anderem eine veränderte Konzentration an Liganden für
hoch konservierte globale Regulatoren. Diese hormonähnlichen Moleküle können zusätzlich auch die
Funktion von clusterspezifischen Regulatoren sowie morphologische Eigenschaften beeinflussen [90].
Ein prominentes Beispiel sind γ-Butyrolakton (GBL). Sie binden an AfsA-ähnliche Autoregulatoren, die
wiederum ubiquitär in Streptomyceten vorkommen. AfsA ist für den ersten Schritt der A-Faktor
(Autoregulationsfaktor)-Biosynthese in Streptomyceten verantwortlich. In Streptomyces virginiae
führte der Knockout des afsA-ähnlichen jadW1-Gens überraschenderweise nur zu einer geringen
Minderung der Jadomycin Produktion. Es wurde eine Cluster-übergreifende Komplementierung der
jadW1 Funktion durch die sich auch im Genom von S. virginiae befindenden homologen Gene
sven4183 und sven5093 postuliert [91]. Auch in Streptomyces coelicolor wurden ähnliche
Zusammenhänge beschrieben. MmfL stellt ein AfsA-Homologon dar, das in Verbindung mit dem
Methylenomycin-Gencluster beschrieben wurde. Es ist an der Biosynthese von MethylenomycinFuranen beteiligt und dort wahrscheinlich im Rahmen des mmfLHP Operons für die
Kondensationsreaktion verantwortlich. Die von diesem Operon kodierten Biosyntheseschritte
können, mit einer geringeren Effizienz auch durch andere Enzyme durchgeführt werden die von
Genen aus dem S. coelicolor Genom codiert werden (ActVA und SCO3558) [92][93]. Zudem zeigte
eine detaillierte Analyse sequenzierter Streptomyces Stämme, dass 7 von 19 dieser Genome für mehr
als ein AfsA-Homologon kodieren. Ein gezielter Knockout der entsprechenden Gene führte in
Streptomyces hygroscopicus 5008 zu einer signifikanten Erhöhung der Produktion von Validamycin,
ohne direkt im Gencluster lokalisiert zu sein [94]. Auch Antibiotika und deren Vorläufersubstanzen
scheinen sowohl in ihrer eigenen Biosynthese, als auch in der Biosynthese von anderen Naturstoffen
im selben Organismus eine regulatorische Rolle zu spielen. Es erfolgt also eine Cross-Regulierung
innerhalb eines Stammes [95]. JadR2 und JadR1 aus S. venezuelae haben eine regulatorische Funktion
innerhalb des Jadomycin (jad)-Genclusters. Des Weiteren sind sie auch im Stande Chloramphenicol,
das Produkt des cml Biosynthese-Genclusters aus demselben Stamm zu binden. In Folge dieser CrossRegulierung wird die Produktion von sowohl Jadomycin als auch Chloramphenicol begünstigt [96].
Weiterführende Experimente zeigten, dass das im jad Cluster lokalisierte jadX Gen unter bestimmten
Bedingungen die Produktion von Jadomycin verhindern und gleichzeitig die von Chloramphenicol
begünstigen kann. Dies ist einer der ersten Beweise für einen Gencluster-übergreifenden
Regulationsmechanismus in den komplett unterschiedliche Endprodukte involviert sind [97][95].
Auch für MbtH-ähnliche Proteine wurde eine dem JadX analoge Funktion postuliert. Bei diesen
33
Einleitung
Enzymen handelt es sich um „hypothetische Proteine“ die in vielen, für die Biosynthese von PeptidAntibiotika und Siderophoren kodierenden NRPS (non-ribosomal peptide)-Genclustern lokalisiert
sind. In Streptomyces coelicolor wurden zwei MbtH-ähnliche Proteine identifiziert – CchK im
Coelichelin- (cch) und CdaX im CDA- (Calcium-abhängiges Antibiotikum) Gencluster [98][99]. Es
konnte gezeigt werden, dass die Gene cdaX und cchk sich in ihrer Funktion ergänzen und somit zu
einer Cross-Regulierung der beiden Gencluster führen [100]. Die regulatorischen Proteine AfsR und
PhoP sind in S. coelicolor für die Kontrolle der Biosynthese von Actinorhodin und Undecylprodigiosin
verantwortlich. Des Weiteren beeinflussen sie sich auch gegenseitig. AfsR ist im Stande mit der
phoRP Promotor Region zu interagieren. PhoP kann wiederum den afsS Promotor und den AfsR
Operator binden [101]. Schlüsselenzyme des Stickstoffmetabolismus sind in phoP-Mutanten
hochreguliert
und
in
afsS-Mutanten
herunter
reguliert.
Dies
deutet
auf
einen
Anpassungsmechanismus hin, der es erlaubt sich schnell an eine wechselnde Nährstoffversorgung
anzupassen [102][103]. Auch in nicht pathogenen E.coli-Stämmen wurde eine direkte
Kommunikation zwischen zwei Adhesin-Genclustern (fim und pap) beschrieben. PapB, ein
Transkriptionsregulator aus dem pap-Operon war im Stande spezifische DNA-Regionen im fimCluster zu binden. Die Cross-Regulierung zwischen unterschiedlichen Adhesin-Genclustern dient
pathogenen Keimen wahrscheinlich der Anpassung an wechselnde äußere Bedingungen. Das
Bakterium kann so, durch die Produktion von ausschließlich der Art an Adhesinen die gerade benötigt
wird um mit den Wirtszellen zu interagieren, Energie sparen [104][105].
34
Einleitung
2.5 Produktion
und
Aufreinigung
von
rekombinanten
Proteinen
Allgemein stellen die erfolgreiche Produktion von löslichem Protein und das Vermeiden von ProteinFehlfaltungen die größten Herausforderungen in strukturbiologischen Projekten dar. Der häufigste
Grund
für
eine
verminderte
Löslichkeit
ist
die
Bildung
von
Proteinagreggaten
bzw.
Einschlusskörperchen [106]. Da der Erfolg einer Proteinproduktion von der AminosäureZusammensetzung des jeweiligen Proteins abhängig ist, kann eine Sequenzanalyse vor den
eigentlichen Experimenten erste Informationen über passende Produktionssysteme liefern [107].
Anschließend können Faktoren wie die Komposition des verwendeten Produktionsmediums, die
Produktions-Temperatur und das Proteinproduktionssystem variiert werden [108]. Eine wichtige
Rolle kann die Zugabe von prosthetischen Gruppen und Cofaktoren zum Medium spielen, wenn diese
notwendig für eine korrekte Faltung des Proteins sind. Auch die Anwesenheit von Polyolen oder
Saccharose kann hilfreich sein. Diese führen zu einer Erhöhung des osmotischen Drucks, was
wiederum in einer vermehrten Produktion von natürlichen Osmolyten resultiert. Für Osmolyte wie
Glycin, Betain und Trehalose konnte eine Proteinstruktur-stabilisierende Wirkung nachgewiesen
werden. Solchen Substanzen können dem Medium direkt zugegeben werden [109]. Die Verwendung
von Protein-Tags wie His-Tags, Strep-Tags, Glutathion-S-Transferase-Tags usw. diente ursprünglich
nur der Detektion und selektiven Aufreinigung von rekombinanten Proteinen. Wie sich in den letzten
Jahren herausgestellt hat, können diese in manchen Fällen aber auch die Ausbeute an löslichem,
korrekt gefaltetem Protein signifikant erhöhen [110]. Eine weitere Möglichkeit die Bildung von
Einschlusskörpern zu verhindern ist die Reduktion oder Verlangsamung der Proteinproduktion. Dies
kann durch eine Veränderung des Induktionszeitpunktes, der Temperatur, der Länge der Produktion
oder der Menge an induzierenden Agentien (z.B. IPTG) erfolgen [108]. Erst kürzlich wurde eine
signifikante Verbesserung der Löslichkeit und Faltung von unterschiedlichen Proteinen nach einer
Produktion bei 6-10 °C von Song et al. dokumentiert [111]. Handelt es sich bei dem aufzureinigenden
Protein um einen Teil eines Multikomponenten-Proteinkomplexes, kann eine Coexpression mit Hilfe
eines polycistronischen Plasmids von Vorteil sein [112]. Nach der erfolgreichen Produktion wird im
Falle eines zytosolischen Proteins das Zellpellet geerntet und chemisch oder mechanisch (Druck,
Ultraschall) aufgeschlossen. Die eigentliche Aufreinigung erfolgt im Normalfall zuerst mittels einer
Affinitätschromatographie bei der mit Hilfe eines spezifischen Tags selektiert wird. Meist folgt darauf
noch eine Größenausschluss-Chromatographie (Gelfiltration) mit deren Hilfe zusätzlich eine
Umpufferung des Systems stattfinden kann (vergleiche Abbildung 2.12) [113].
35
Einleitung
Abbildung 2.12 Allgemeines Schema der Aufreinigung eines zytosolischen Proteins.
Nach erfolgter Zellernte wird das Pellet mechanisch (z.B. mit Hilfe einer French Press) aufgeschlossen. Die eigentliche
Aufreinigung findet danach meist in zwei Schritten statt. Standardmäßig werden zuerst eine Affinitätschromatographie und
danach eine Größenausschlusschromatographie (Gelfiltration) durchgeführt.
Lässt sich eine starke Bildung von Einschlusskörperchen nicht verhindern, können Methoden
angewandt werden mit deren Hilfe eine Wiedergewinnung des nativen Proteins aus dem
Proteinaggregat möglich ist. In E. coli bilden Einschlusskörperchen („inclusion bodies“) typischerweise
Partikel in einer Größenordnung von 0.2-1.5 µm [114]. Meist akkumulieren diese im Zytosol, in
seltenen Fällen allerdings auch im periplasmatischen Raum der Zelle [115]. Generell wird die Bildung
dieser Proteinaggregate durch eine hohe Anzahl an Kopien des korrespondierenden Gens, die
Verwendung von starken Promotor-Systemen und durch eine Erhöhung der Konzentration an
induzierenden Agenzien begünstigt. Des Weiteren sind Proteine mit hohem Anteil an hydrophoben
Aminosäuren öfters betroffen [116]. Da bakterielle Einschlusskörperchen meist das rekombinante
Protein in seiner nativen Sekundärstruktur und in hohem Reinheitsgrad enthalten ist eine
Wiedergewinnung prinzipiell möglich. Außerdem ist eine anschließende chromatographische
Aufreinigung meist nicht mehr nötig oder stark vereinfacht [117]. Die Solubisierung und
Wiedergewinnung des nativen Proteins aus den Einschlusskörperchen wird in den letzten Jahren
bevorzugt mit milderen Methoden durchgeführt um vorhandene Proteinstrukturen nicht zu
beeinflussen. Verwendet werden meist eine Alkalisierung des Puffersystems, erhöhter Druck, sanfte
Detergenzien oder organische Lösungsmittel, sowie niedrig konzentrierte chaotrope Substanzen
[116].
Eine relativ häufig angewandte Methode der Proteinaufreinigung ist die gezielte Verwendung von
Fusionsproteinen die sich an das Zielprotein anlagern und dadurch zu einer Ausbildung von
Einschlusskörpern führen. Sinnvoll ist dies z.B. bei Proteinen die im Produktionsmedium sonst keine
stabile Konformation annehmen würden, sowie um proteolytischen Abbau zu vermeiden. Der
optimale Fusionspartner muss jedoch für jeden Fall individuell bestimmt werden [118]. Essentiell ist
die anschließende richtige Protein-Rückfaltung. Entsprechende Protokolle sind in der REFOLDDatenbank zu finden [119]. Die traditionellen Methoden der Rückfaltung sind meist nicht besonders
36
Einleitung
schonend für das zu isolierende Protein, was zu ungewollten Modifikationen führen kann. Eine
sanftere Alternative die neuerdings immer öfter herangezogen wird ist die Entfernung des
Fusionsproteins mit Hilfe von Palladium- oder Nickel-Verbindungen [120].
Nach wie vor stellen E. coli-Zellen das meist verwendete bakterielle Proteinproduktionssystem dar.
Als größter Nachteil wird dabei oft die nur begrenzte Sekretionsfähigkeit des Protein-Produkts in das
Medium angesehen. Aus diesem Grund wurden in den letzten Jahren vermehrt gentechnologisch
optimierte E. coli-Produktionsstämme zugänglich [121]. Zum einen besteht die Möglichkeit
Autotransporter der Zellen zu verwenden [122]. Weitere Ansätze beruhen auf der Modifizierung der
in E. coli-Zellen natürlich vorhandenen Sekretionssysteme oder deren Zellwand, der Verwendung von
Carrier-Proteinen und der Coproduktion von Lyse-fördernden Proteinen [121]. In manchen Fällen ist
eine Produktion von N-glykosiliertem Protein nötig um dessen physikalische Eigenschaften zu
verbessern. Dies ist mittlerweile in E. coli-Zellen nicht nur mit nativen, sondern auch Fremdproteinen
möglich [123]. Da die Verwendung von Antibiotika in großen Mengen zum einen höhere Kosten
verursacht und zum anderen zu einer Verbreitung von Antibiotikaresistenzen führen kann, wurden in
den letzten Jahren vermehrt Systeme entwickelt in denen die erfolgreiche Plasmid-Replikation
anders gewährleistet wird. Die meist verbreitete Methode ist die Lokalisierung eines für den Stamm
essentiellen Gens auf dem Proteinproduktionsplasmid, womit nur durch dessen Anwesenheit in der
Mutante ein Wachstum möglich ist. Hagg et al. erhielten so ein über mehr als 120 Generationen
stabiles Proteinproduktionssystem [124]. Neben E. coli-basierten, haben auch Lactoccocus lactisbasierte Systeme in den letzten Jahren vermehrt Verwendung gefunden. Im Vergleich zu E. coli haben
diese den Vorteil endotoxinfrei zu sein, was von großem Interesse für pharmazeutische Zwecke ist.
Außerdem besitzen Lactoccocus-Stämme nur eine Zellmembran, was bei der Produktion und
Aufreinigung von Membranproteinen hilfreich sein kann. Andererseits sind sowohl die relativ geringe
Menge an heterolog produzierbarem Protein, als auch die schlechte Sekretion von größeren
Proteinen gravierende Nachteile [125]. Auch Pseudomonas fluorescens, Pseudomonas aeruginosa
und Pseudomonas putida stellen neue, attraktive Produktionssysteme dar. Zu erwähnen ist vor allem
ihr schnelles Wachstum und die sehr große Menge an produzierbarem Protein, die teilweise höher
als in E. coli ist [126]. Des Weiteren ist eine Verwendung von Streptomyceten möglich. Gut geeignet
ist vor allem Streptomyces lividans der keine natürlichen Restriktionssysteme und nur sehr geringe
proteolytische Aktivität aufweist. Für diesen Stamm konnte eine effektive Produktion und
Aufreinigung von Proteinen bis zu einer maximalen Konzentration von 300 mg/L nachgewiesen
werden [127].
37
Zielsetzung der Arbeit
3 Zielsetzung der Arbeit
Im Rahmen dieser Arbeit sollten die Luciferase-ähnlichen Monooxygenasen MsnO4 und MsnO2, die
an der Biosynthese des Naturstoffs Mensacarcin beteiligt sind, heterolog in E. coli-Zellen produziert
und anschließend aufgereinigt werden. Im Fall von MsnO4 sollte das so erhaltene, reine Protein
weiter mittels in vitro Aktivitätsassays untersucht und für Kristallisierungsexperimente verwendet
werden.
Zusätzlich sollte die von einem Gen aus dem Mensacarcin-Gencluster kodierte Flavinreduktase
MsnO3
in
E. coli-Zellen
produziert
und
aufgereinigt
werden.
Auch
diese
sollte
für
Kristallisierungsexperimente verwendet werden und zusätzlich eine potentielle Zusammenarbeit von
MsnO3 und MsnO4 in einem Zweikomponentensystem mit Hilfe von in vitro Assays bewiesen
werden. Der Mechanismus der Zusammenarbeit von MsnO4 und MsnO3 wurde zusätzlich mithilfe
von Fütterungsexperimenten in Streptomyces albus untersucht.
Ein weiterer Schwerpunkt dieser Arbeit sollte in der weiterführenden Aufklärung der MensacarcinBiosynthese liegen. Durch die Einführung von Punktmutationen in den aktiven Zentren der
Ketoreduktasen MsnO10 und MsnO11 sollte ermittelt werden, ob diese nur strukturell an der
Stabilisierung der minimalen PKS sowie der Polyketidkette beteiligt sind, oder auch eine katalytische
Funktion erfüllen. Des Weiteren sollte das Gen msnO2 auf der genomischen DNA des natürlichen
Mensacarcin-Produzenten Streptomyces bottropensis inaktiviert und der Einfluss auf das
Produktionsverhalten bestimmt werden. Da in diesem Stamm zusätzlich auch das für den Naturstoff
Rishirilid kodierende rsl-Biosynthesecluster lokalisiert ist, sollte untersucht werden ob eine CrossRegulierung zwischen den beide Genclustern stattfindet. Hierfür wurden die Flavinreduktasen
MsnO3 und RslO2 ausgesucht. Im Rahmen des Experiments sollten Komplementierungen der
Knockout-Mutante S. albus Cos2∆O3 x pkR1 mit msnO3 und alternativ mit rslO2 durchgeführt und
anschließend das Produktionsprofil untersucht werden.
Zuletzt sollten für die Luciferase-ähnlichen Monooxygenasen MsnO2 und MsnO4, sowie für die
Flavinreduktase MsnO3 bioinformatische Homologiemodelle erstellt, charakterisiert und mit
Strukturen verwandter Proteine aus dem Mensacarcin- und dem Rishirilid-Cluster verglichen werden.
38
Material und Methoden
4 Material und Methoden
4.1 Labor- und Analysengeräte
Tabelle 4.1 Verwendete Labor- und Analysengeräte sowie deren Hersteller und Herstellungsort.
Labor-/Analysengeräte
Hersteller und Herstellungsort
Agarosegel-Elektrophoresekammer mit Zubehör
GE Healthcare, Freiburg (D)
ÄKTA FPLC
GE Healthcare, Freiburg (D)
E.coli PulserTM
BioRad Laboratories GmbH, München (D)
French Press
Thermo Fisher Scientific, Waltham (USA)
HPLC/ESI-MS Agilent 1100 Serie
Automatischer Probengeber G1313A
Säulenofen G1322A
Quaternäre Pumpe G1311A
Agilent, Waldbronn (D)
Diodenarray Detektor (DAD) G1315B
Quadrupol-Massendetektor (MSN) G1946D
ESI Quelle
NanoDrop 1000
Thermo Scientific (D)
Oryx Nano Protein Kristallisierung Roboter
Douglas Instruments Ltd.
PCR-Geräte
Mastercycler Epgradient
GeneAmp® PCR System 9700
pH-Meter
Eppendorf, Hamburg (D)
Applied Biosystems, Darmstadt (D)
Schott Laboratories GmbH, Mainz (D)
Protein Elektrophoresekammer (vertikal)
Mini-PROTEAN mit Zubehör
Biorad Laboratories GmbH, München (D)
und Spannungsgeber PAC3
Rotationsverdampfer
RC600
LABOROTA 4000
Schüttelinkubator Multitron
Sicherheitswerkbank/Reinraumbank
KNF Neuberger GmbH, Freiburg (D)
Heidolph GmbH & Co. KG, Schwabach (D)
Infors, Bottmingen (CH)
BDK Luft- und Reinraum GmbH, SonnenbühlGenkingen (D)
Spektralphotometer UviLine 8100
SI Analytics, Mainz (D)
Spektrometer Ultrospec 2100 pro
Amersham Pharmacia, Oldendorf (D)
UV-Transilluminator Image Master VDS zur
Geldokumentation
Amersham Pharmacia, Oldendorf (D)
Vortexer Reax Top
Heidolph GmbH & Co. KG, Schwabach (D)
Wasserfilteranlage
Millipore, Billerica (USA)
39
Material und Methoden
Fortsetzung von Tabelle 4.1 Verwendete Labor- und Analysengeräte sowie deren Hersteller und Herstellungsort.
Labor-/Analysengeräte
Hersteller und Herstellungsort
Zentrifugen
5415 R, 5417 R (1,5 mL und 2 mL Reaktionsgefäße)
Eppendorf, Hamburg (D)
Rotina 380 R (15 mL und 50 mL Falkon Tubes)
Andreas Hettich GmbH & Co. KG, Tuttlingen (D)
Avanti J-20 XP (50 mL bzw. 500 mL Gefäße)
Beckmann Coulter, Krefeld (D)
4.2 Verbrauchsmaterialien, Kits und Enzyme
Tabelle 4.2 Verwendete Verbrauchsmaterialien sowie deren Hersteller und Herstellungsort.
Bezeichnung
Hersteller und Herstellungsort
Bördelkappen 11mm
Lab Logistics Group GmbH, Meckenheim (D)
Einmalküvetten Rotilab®
Roth, Karlsruhe (D)
Elektroporationsküvetten
Biozym Scientific GmbH, Oldendorf (D)
Filter
Chromafil PVDF-45/15MS
Macherey-Nagel, Düren (D)
Rotilab® Spitzenfilter 0,22 µm
Roth, Karlsruhe (D)
Filterplättchen
Roth, Karlsruhe (D)
HPLC Vial 1,5 mL
Lab Logistics Group GmbH
HPLC-Vial Inserts 9 mm, 0,15 mL
Macherey-Nagel, Düren (D)
Injekt® Einmalspritzen
B. Braun Melsungen AG, Melsungen (D)
Konzentrator Vivaspin 20 (10000 MWCO)
Sartorius AG, Göttingen (D)
Petrischalen Rotilab® Ø 90 mm
Roth, Karlsruhe (D)
Reaktionsgefäße
Safe-Lock Tubes 2 mL
Eppendorf, Hamburg (D)
Tubes 1,5 mL und 2 mL
Roth, Karlsruhe (D)
Pipettenspitzen
Roth, Karlsruhe (D)
Roti®garose-His/Ni Beads
Roth, Karlsruhe (D)
Zahnstocher Hygostar® 8 cm
Roth, Karlsruhe (D)
Zentrifugenröhrchen Rotilabo®
Roth, Karlsruhe (D)
Tabelle 4.3 Verwendete Kits sowie deren Hersteller und Herstellungsort.
Kit
Hersteller und Herstellungsort
innuPREP Plasmid Mini Kit
PureYield
TM
Plasmid Midiprep System Kit
Analytik Jena AG, Jena (D)
Promega, Mannheim (D)
Wizard®Plus SV Miniprep Kit
Promega, Mannheim (D)
Wizard®SV Gel and PCR Clean-up System Kit
Promega, Mannheim (D)
40
Material und Methoden
Tabelle 4.4 Verwendete Enzyme mit Puffern sowie deren Hersteller und Herstellungsort.
Enzym
Hersteller und Herstellungsort
Catalase (from bovine liver)
Sigma-Aldrich, Seelze (D)
DNA-Restriktionsendonukleasen mit zugehörigen
NEB, Ipswich (USA)
10x Puffern
Promega, Mannheim (D)
DNase I
NEB, Ipswich (USA)
Lysozym aus Hühnereiweiß
Fluka, Taufkirchen (D)
MsnO2
diese Arbeit
MsnO3
diese Arbeit
MsnO4
diese Arbeit
Pfu-Polymerase (5U) mit zugehörigem 10x Puffer
Eigenherstellung
Phusion-Polymerase (5U) mit zugehörigem 10x
Puffer
RNase A
Eigenherstellung
Qiagen, Hilden (D)
T4-DNA-Ligase mit zugehörigem 10x Puffer
Taq-Polymerase (5U) mit zugehörigem 10x Puffer
NEB, Ipswich (USA)
Promega, Mannheim (D)
Eigenherstellung
4.3 Chemikalien und Medienbestandteile
Tabelle 4.5 Verwendete Chemikalien- und Medienbestandteile sowie deren Hersteller und Herstellungsort.
Substanz
Hersteller und Herstellungsort
1 kb DNA-Ladder
NEB, Ipswich (USA)
Acrylamid/Bisacrylamid
Roth, Karlsruhe (D)
Agar-Agar
Roth, Karlsruhe (D)
Agarose GTQ
Roth, Karlsruhe (D)
Ammoniumchlorid
Roth, Karlsruhe (D)
Ammoniumperoxodisulfat (APS)
Roth, Karlsruhe (D)
L-Arabinose
Roth, Karlsruhe (D)
Bacto
TM
Malzextrakt
Becton, Dickinson and Company, Sparks (USA)
Bacto
TM
Soyton
Becton, Dickinson and Company, Sparks (USA)
Betain
Sigma-Aldrich, Seelze (D)
Blue Protein Standard
NEB, Ipswich (USA)
Bovine Serumalbumin (BSA)
Promega, Mannheim (D)
Bromphenolblau
Roth, Karlsruhe (D)
Calciumcarbonat
Roth, Karlsruhe (D)
CASO Boullion
Roth, Karlsruhe (D)
Calciumchlorid-Dihydrat
Roth, Karlsruhe (D)
Cobaltchlorid
Merck, Darmstadt (D)
41
Material und Methoden
Fortsetzung von Tabelle 4.5 Verwendete Chemikalien- und Medienbestandteile sowie deren Hersteller und
Herstellungsort.
Substanz
Hersteller und Herstellungsort
Coomassie Brilliant Blue R250
Roth, Karlsruhe (D)
Desoxynukleotide (dNTPs)
Peqlab, Erlangen (D)
Dextrin
Roth, Karlsruhe (D)
1,4-Dihydroanthraquinon
Sigma-Aldrich, Seelze (D)
D-Glukose-Monohydrat
Roth, Karlsruhe (D)
D-Mannitol
Roth, Karlsruhe (D)
Dinatriumhydrogenphosphat
Merck, Darmstadt (D)
Dithiothreitol (DTT)
Roth, Karlsruhe (D)
Eisensulfat-Heptahydrat
Merck, Darmstadt (D)
Essigsäure/Eisessig
Roth, Karlsruhe (D)
Ethylendiamintetraessigsäure (EDTA)
Roth, Karlsruhe (D)
Ethidiumbromid
Roth, Karlsruhe (D)
Flavinmononukleotid (FMN)
Sigma-Aldrich, Seelze (D)
GelRed
TM
Biotium, Hayward (USA)
Glycerin
Roth, Karlsruhe (D)
Glycin
Roth, Karlsruhe (D)
Hefeextrakt
Roth, Karlsruhe (D)
Imidazol
Roth, Karlsruhe (D)
Isopropyl-β-D-Thiogalaktopyranosid (IPTG)
Roth, Karlsruhe (D)
Kaliumacetat
Roth, Karlsruhe (D)
Kaliumdihydrogenphosphat
Merck, Darmstadt (D)
Kupferchlorid-Dihydrat
Merck, Darmstadt (D)
Laktose-Monohydrat
Roth, Karlsruhe (D)
LB-Trockenpulver
Roth, Karlsruhe (D)
Magnesiumchlorid-Hexahydrat
Roth, Karlsruhe (D)
Magnesiumsulfat-Heptahydrat
Merck, Darmstadt (D)
Maltose
Roth, Karlsruhe (D)
Malzextrakt
Roth, Karlsruhe (D)
Manganchlorid
Merck, Darmstadt (D)
Mercaptoethanol
Merck, Darmstadt (D)
1-Methoxy-3-methyl-2-pent-2-enyl-anthraquinon
Sigma-Aldrich, Seelze (D)
Methylenblau
Merck, Darmstadt (D)
3-(N-Morpholino)-Propansulfonsäure (MOPS)
Roth, Karlsruhe (D)
Natriumhydroxid
Roth, Karlsruhe (D)
Natriumchlorid
Roth, Karlsruhe (D)
Natriumcitrat-Dihydrat
Merck, Darmstadt (D)
42
Material und Methoden
Fortsetzung von Tabelle 4.5 Verwendete Chemikalien- und Medienbestandteile sowie deren Hersteller und
Herstellungsort.
Substanz
Hersteller und Herstellungsort
Natriumdodecylsulfat (SDS)
Roth, Karlsruhe (D)
Natriummolybdat
Merck, Darmstadt (D)
Natriumsulfat
Roth, Karlsruhe (D)
Nickelsulfat-Hexahydrat
Merck, Darmstadt (D)
Nicotinamidadenindinukleotid reduziert (NADH)
Roth, Karlsruhe (D)
Nicotinamidadenindinukleotidphosphat reduziert
(NADPH)
Roth, Karlsruhe (D)
Saccharose
Südzucker, Mannheim (D)
Salzsäure 25 %
Roth, Karlsruhe (D)
Schwefelsäure
Roth, Karlsruhe (D)
Sojamehl, vollfett
W. Schoenberger GmbH & Co. KG, Magstadt (D)
N,N,N‘,N‘-Tetramethylethylenediamine (TEMED)
Roth, Karlsruhe (D)
Tris Base
Roth, Karlsruhe (D)
Tris-Hydrochlorid
Roth, Karlsruhe (D)
Trockenhefe ohne Emulgator
Alnatura GmbH, Bickenbach (D)
Trypton
Roth, Karlsruhe (D)
X-Gal (5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-α-DGalactopyranosid)
Roth, Karlsruhe (D)
Xylenblau
Merck, Darmstadt (D)
Zinksulfat-Heptahydrat
Merck Darmstadt (D)
Tabelle 4.6 Verwendete organische Lösungsmittel sowie deren Hersteller und Herstellungsort.
Lösungsmittel
Hersteller und Herstellungsort
Aceton
Roth, Karlsruhe (D)
Acetonitril HPLC grade
Roth, Karlsruhe (D)
Dichlormethan
Roth, Karlsruhe (D)
Dimethylformamid
Roth, Karlsruhe (D)
Dimethylsulfoxid
Roth, Karlsruhe (D)
Essigsäureethylester
Roth, Karlsruhe (D)
Ethanol
Roth, Karlsruhe (D)
Isopropanol
Roth, Karlsruhe (D)
Methanol
Roth, Karlsruhe (D)
43
Material und Methoden
4.4 Antibiotika
Tabelle 4.7 Verwendete Antibiotika sowie deren Hersteller und Herstellungsort.
Antibiotikum
Hersteller und Herstellungsort
Ampicillin-Natriumsalz
Sigma-Aldrich, Seelze (D)
Apramycinsulfat
AppliChem, Darmstadt (D)
Chloramphenicol
Sigma-Aldrich, Seelze (D)
Phosphomycin-Dinatriumsalz
Sigma-Aldrich, Seelze (D)
Hygromycin B
Roth, Karlsruhe (D)
Kanamycin
Roth, Karlsruhe (D)
Spectinomycin
Sigma-Aldrich, Seelze (D)
Streptomycinsulfat
Roth, Karlsruhe (D)
4.5 Puffer und Lösungen
4.5.1 Antibiotika-Lösungen
Für die Herstellung der aufgeführten Antibiotika-Stammlösungen (siehe Tabelle 4.8) wurde das
Antibiotikum eingewogen und im entsprechenden Lösungsmittel gelöst. Danach wurde durch einen
Filter mit der Porengröße 0,22 µm sterilfiltriert. Die Lösungen wurden in 1 mL Aliquots bei -20 °C
gelagert.
Tabelle 4.8 Verwendete Antibiotika-Stammlösungen.
Konzentration der
Endkonzentration im
Stammlösung
Medium
H2Obidest
100 mg/mL
100 µg/mL
Apramycin (Apra)
H2Obidest
100 mg/mL
50 µg/mL
Chloramphenicol (Cam)
EtOH
25 mg/mL
25 µg/mL
Phosphomycin (Phos)
H2Obidest
200 mg/mL
200 µg/mL
Hygromycin B (Hygro)
H2Obidest
50 mg/mL
50 µg/mL
Kanamycin (Kan)
H2Obidest
100 mg/mL
100 µg/mL
Spectinomycin (Spec)
H2Obidest
50 mg/mL
50 µg/mL
Antibiotikum
Lösungsmittel
Ampicillin (Amp)
44
Material und Methoden
4.5.2 Plasmidisolierung aus E. coli
Tabelle 4.9 Puffer zur Plasmidisolierung mittels alkalischer Lyse.
Bezeichnung
P1
Bestandteile
Konzentrationen
Tris-HCl
50 mM
EDTA
10 mM
RNase A
100 µg/mL
Anmerkung
Einstellen auf pH 8;
RNase A vor Gebrauch
zugeben; Lagerung bei
4 °C
NaOH- und SDS-
P2
NaOH
200 mM
Lösungen getrennt
SDS
1 % (m/V)
ansetzten und dann 1:1
mischen
P3
Kaliumacetat
3 M
Einstellen auf pH 5,2
4.5.3 DNA Agarose-Gelelektrophorese
Tabelle 4.10 Puffer und Lösungen für die Agarose-Gelelektrophorese.
Bezeichnung
Bestandteile
Konzentrationen
Agarose-Lösung
Agarose
0,7 % (m/V)
Ethidiumbromid
10 µL/mL
TM
303 µL/L
EthidiumbromidFärbelösung
TM
GelRed -Färbelösung
Ladepuffer
GelRed
Anmerkung
In 1x TAE-Puffer lösen;
Lagerung bei 60 °C
Vor Licht geschützt
lagern
Vor Licht geschützt
lagern
Bromphenolblau
0,25 % (m/V)
In TE-Puffer pH 7,6 lösen;
Saccharose
40 % (m/V)
Lagerung bei 4 °C
Mit Eisessig einstellen
50 x TAE-Puffer
Tris
2 M
auf pH 8,0; vor Gebrauch
EDTA
0,05 mM
auf 1 x Konzentration mit
H2Obidest verdünnen
45
Material und Methoden
4.5.4 Herstellung von kompetenten E. coli-Zellen
Alle in Tabelle 4.11 aufgeführten Lösungen wurden nach der Herstellung autoklaviert und bei 4 °C
gelagert.
Tabelle 4.11 Lösungen zur Herstellung von CaCl2- und elektro-kompetenten E.coli Zellen.
Bezeichnung
Bestandteile
Konzentrationen
MgCl2-Lösung
MgCl2
100 mM
CaCl2-Lösung
CaCl2
100 mM
CaCl2
100 mM
Glycerin
15 % (m/V)
Glycerin
10 % (m/V)
CaCl2-Glycerin-Lösung
Glycerin-Lösung
4.5.5 Herstellung von Dauerkulturen
Tabelle 4.12 Lösungen zur Herstellung von E.coli- und Streptomyces spp.-Dauerkulturen.
Bezeichnung
Bestandteile
Konzentrationen
Anmerkung
Glycerin-Lösung
Glycerin
15 % (V/V)
E.coli Dauerkulturen
Saccharose-Lösung
Saccharose
25 % (m/V)
Streptomyces spp
Dauerkulturen
4.5.6 Blau-Weiß Selektion
Tabelle 4.13 Lösungen zur Durchführung einer Blau-Weiß Selektion.
Bezeichnung
Bestandteile
Konzentrationen
IPTG-Lösung
IPTG
1 M
X-Gal-Lösung
X-Gal
250 mM
Anmerkung
In H2Odemin lösen; pro
Platte 50 µL verwenden
In DMF lösen; pro Platte
75 µL verwenden
4.5.7 SDS-Page Gelelektrophorese
Tabelle 4.14 Puffer für die SDS-Page Gelelektrophorese.
Bezeichnung
Laufpuffer
Sammelgelpuffer
Trenngelpuffer
46
Bestandteile
Konzentrationen
Tris
25 mM
SDS
0,1 % (m/V)
Glycin
19,2 mM
Tris-HCl
0,5 M
SDS
0,4 % (m/V)
Tris-HCl
1,5 M
SDS
0,4 % (m/V)
Anmerkung
Einstellen auf pH 8,3
Einstellen auf pH 6,8
Einstellen auf pH 8,8
Material und Methoden
Fortsetzung von Tabelle 4.14 Puffer für die SDS-Page Gelelektrophorese.
Bezeichnung
Bestandteile
Konzentrationen
APS-Lösung
APS
10 % (m/V)
DTT
100 mM
SDS
5 % (m/V)
Glycerin
10 % (m/V)
Tris
60 mM
Bromphenolblau
Spatelspitze
Coomassie Blau
0,5 % (m/V)
EtOH
50 % (V/V)
Essigsäure
10 % (V/V)
EtOH
25 % (V/V)
Essigsäure
10 % (V/V)
2x Ladepuffer
Coomassie Blau
Färbelösung
Entfärbelösung
Anmerkung
Einstellen auf pH 6,8
Tabelle 4.15 Bestandteile des Trenn- und Sammelgels.
Bezeichnung
Sammelgel 4 %
Trenngel 15 %
Bestandteile
Konzentrationen
Acrylamid-Lösung
0,5 mL
Sammelgelpuffer
0,625 mL
H2O
1,375 mL
APS
25 µL
TEMED
2,5 µL
Acrylamid-Lösung
2,5 mL
Trenngelpuffer
1,25 mL
H2O
1,25 mL
APS
50µL
TEMED
5 µL
Anmerkung
APS und TEMED zuletzt
zugeben
APS und TEMED zuletzt
zugeben
4.5.8 Protein-Aufreinigung
Alle in Tabelle 4.16 und Tabelle 4.17 aufgeführten Puffer wurden nach der Herstellung auf einen pH
von 8,0 eingestellt.
Tabelle 4.16 Puffer für die analytische Affinitätschromatographie.
Bezeichnung
Lysepuffer
Waschpuffer
Bestandteile
Konzentrationen
Tris
50 mM
NaCl
200 mM
Tris
50 mM
NaCl
200 mM
Imidazol
10 mM
47
Material und Methoden
Fortsetzung von Tabelle 4.16 Puffer für die analytische Affinitätschromatographie.
Bezeichnung
Elutionspuffer
Bestandteile
Konzentrationen
Tris
50 mM
NaCl
200 mM
Imidazol
250 mM
Tabelle 4.17 Puffer zur Proteinaufreinigung.
Bezeichnung
Lysepuffer
Elutionspuffer
Gelfiltrationspuffer
Bestandteile
Konzentrationen
Tris
50 mM
NaCl
200 mM
Imidazol
10 mM
Tris
50 mM
NaCl
200 mM
Imidazol
500 mM
Tris
25 mM
NaCl
100 mM
4.5.9 MsnO3/MsnO4 in vitro Aktivitätsassay [1]
Tabelle 4.18 Lösungen für den MsnO3/MsnO4 in vitro Assay.
Bezeichnung
Bestandteile
Konzentrationen
Tris
20 mM
NaCl
150 mM
Catalase-Lösung
Catalase
12000 U/mL
In Assaypuffer lösen
FMN-Lösung
FMN
2 mM
In Assaypuffer lösen
NADH-Lösung
NADH
10 mM
In Assaypuffer lösen
1-Methoxy-3-methyl-2-pent-
1-Methoxy-3-methyl-2-
2-enyl-anthrachinon- / 1,4-
pent-2-enyl-anthrachinon /
12 mM
In MeOH lösen
Dihydroanthrachinon-Lösung
1,4-Dihydroanthrachinon
Assaypuffer
48
Anmerkung
Einstellen auf pH 8,0
Material und Methoden
4.5.10 FGD/MsnO4 in vitro Aktivitätsassay [1]
Tabelle 4.19 Lösungen für den FGD/MsnO4 in vitro Assay.
Bezeichnung
Bestandteile
Konzentrationen
Tris
50 mM
NaCl
200 mM
F420-Lösung
F420
22 mM
In Assaypuffer lösen
FGD-Lösung
FGD
5 mg/mL
[1]
G6P
50 mM
In Assaypuffer lösen
MsnO4-Lösung
MsnO4
3 mg/mL
1-Methoxy-3-methyl-2-pent-2-
1-Methoxy-3-methyl-2-
enyl-anthrachinon- / 1,4-
pent-2-enyl-anthrachinon /
Dihydroanthrachinon-Lösung.
1,4-Dihydroanthrachinon
Assaypuffer
Glukose-6-phosphat-Lösung
(G6P)
Anmerkung
Einstellen auf pH 7,5
12 mM
Im Rahmen dieser
Arbeit hergestellt
In MeOH lösen
4.5.11 Fütterungsexperiment mit potentiellen Substraten von
MsnO4 in S. albus
Tabelle 4.20 Lösungen für Fütterungsexperimente in S. albus.
Bezeichnung
1-Methoxy-3-methyl-2-pent-2enyl-anthrachinon-Lösung
1,4-Dihydroanthrachinon-Lösung
Konzentrationen
Anmerkung
25 mg/mL
In DMSO lösen
25 mg/mL
In DMSO lösen
49
Material und Methoden
4.5.12 Spurenelementlösungen
Für die Herstellung von Autoinduktions- und MYM-Medium wurden Spurenelementlösungen
verwendet. Diese wurden nach Herstellung sterilfiltriert und jeweils dem sterilisierten und
abgekühlten Medium zugegeben.
Tabelle 4.21 Spurenelementlösungen.
Bezeichnung
Bestandteile
Konzentrationen
MgSO4
17 mM
ZnSO4 x 7 H2O
7 mM
FeSO4 x 7 H2O
7 mM
MnCl2 x 4 H2O
10 mM
20x Spurenelementlösung
CaCl2 x 6 H2O
9 mM
In H2OMillipore lösen; von der 1x
nach Hopwood
NaCl
34 mM
konzentrierten Lösung 0,5 mL zu
(Autoinduktionsmedium)
CuCl2 x 2 H2O
2 mM
100 mL Medium zugeben [128]
B(OH)3
7 mM
Na2MoO4
1 mM
CoCl2
2 mM
Natriumcitrat x 2 H2O
17 mM
ZnCl2
3 mM
FeCl3 x 6 H2O
7 mM
CuCl2 x 2 H2O
59 mM
MnCl2 x 4 H2O
51 mM
Na2B4O7 x 10 H2O
26 mM
(NH4)6Mo7O24 x 4 H2O
8 mM
20x Spurenelementlösung
nach Thompson
(MYM-Medium)
Anmerkung
In H2OMillipore lösen; von der 1x
konzentrierten Lösung 0,2 mL zu
100 mL Medium zugeben [129]
4.5.13 HPLC/MS
Tabelle 4.22 Laufmittel für die präparative HPLC/ESI-MS.
Bezeichnung
Laufmittel A
Laufmittel B
Bestandteile
Acetonitril
Essigsäure 0,5 %
H2OMillipore
Essigsäure 0,5 %
Anmerkungen
filtriert
filtriert
Laufmittel C
Acetonitril
filtriert
Laufmittel D
H2OMillipore
filtriert
50
Material und Methoden
4.6 Nähr- und Produktionsmedien
Die folgenden Nähr- und Produktionsmedien wurden nach Herstellung autoklaviert. Hitzelabile
Bestandteile wurden sterilfiltriert und im Nachhinein dem Medium zugegeben. Für die Herstellung
von Festmedien wurde Agar-Agar in einer Konzentration von 21 g/L zugegeben.
4.6.1 Nähr- und Produktions-Medien für E. coli
Tabelle 4.23 Medien zur Kultivierung und Proteinproduktion in E.coli.
Bezeichnung
LB-Medium
Bestandteile
Menge
Anmerkung
LB-Trockenpulver
20 g
Einstellen auf pH 7,2; zur
H2Obidest.
ad 1000 mL
Kultivierung von E. coli [130]
Trypton
2xYT-Medium
Hefeextrakt
NaCl
ZYM-5052
Autoinduktionsmedium
20 g
10 g
Einstellen auf pH 7,2; zur
5 g
Kultivierung von E. coli [130]
ad 1000 mL
Trypton/Pepton
10 g
Hefe-Extrakt
5 g
Na2HPO4
4,4 g
KH2PO4
3,4 NH4Cl
2,7 g
Na2SO4
0,7 g
MgSO4 x 7 H2O
0,5 g
Glycerin
5 g
Glukose
0,5 g
Laktose
2 g
Spurenelementlösung
2 ml
Einstellen auf pH 7,3; für
Proteinproduktionen [128]
(Hopwood, Tabelle 4.21)
H2Obidest.
ad 1000 mL
51
Material und Methoden
4.6.2 Nähr- und Produktions-Medien für Streptomyceten
Tabelle 4.24 Medien zur Kultivierung und Naturstoffproduktion in Streptomyceten.
Bezeichnung
DNPM-Medium
HA-Medium
MS-Medium
MYM-Medium
NL 111-Medium
TSB
52
Bestandteile
Menge
Anmerkung
Dextrin
40 g
Soyton
7,5 g
Bäckerhefe
5 g
MOPS
21 g
H2Obidest.
ad 1000 mL
Hefeextrakt
4 g
Malzextrakt
10 g
Einstellen auf pH 7,2; zur Kultivierung
Glukose
4 g
von Streptomyces spp. [3]
H2Obidest.
ad 1000 mL
D-Mannitol
20 g
Sojamehl
20 g
H2Obidest.
ad 1000 mL
Hefeextrakt
4 g
Malzextrakt
10 g
Maltose
4 g
Spurenelementlösung (1x)
2 ml
H2Obidest.
ad 1000 mL
CaCO3
10 g
Lab Lemco Fleischextrakt
20 g
Malzextrakt
100 g
H2Obidest.
ad 1000 mL
Casso Bouillon
30 g
H2Obidest.
ad 1000 mL
Einstellen auf pH 6,8; zur Produktion von
Naturstoffen in Streptomyces spp. [3]
Einstellen auf pH 7,4; 10 mL einer 1 M
MgCl2-Lösung nach dem Autoklavieren
steril hinzugeben; für intergenerische
Konjugationen in Streptomyces spp.
Einstellen auf pH 7,2; zur Produktion von
Naturstoffen in Streptomyces spp. [131]
Einstellen auf pH 7,5; für
Fütterungsexperimente in Streptomyces
spp. [132]
Zur Kultivierung von Streptomyces spp.
Material und Methoden
4.7 Bakterienstämme
4.7.1 E. coli-Stämme
Tabelle 4.25 Verwendete E.coli Stämme.
Stamm
Verwendung
Genotyp
Referenz
F-, dam-13::Tn9, dcm-6, hsdM, hsdR, zij-202
E.coli ET12567
Intergenerische
::Tn10, recF143, galK2, GalT22, ara-14, lacY1,
Konjugation
xyl-5, leuB6, thi-1, tonA31, rpsL136, HisG4,
[133]
tsx-78, mtl-1, glnV44
E.coli ET12567 x
Intergenerische
E.coli ET12567 mit enthaltenem pUZ8002
pUZ8002
Konjugation
Plasmid
E.coli ET12567 x
Intergenerische
E.coli ET12567 mit enthaltenem pUB307
pUB307
Konjugation
Plasmid
E.coli XL1-Blue
Klonierung
codon plus RP strain
(DE3)
E.coli BL21 (DE3)
pLysS
E.coli Rosetta™ 2
E.coli DH5α
relA1, lac [F´ proAB lacIqZΔM15 Tn10 (Tetr)]
–
–
+
Stratagene
r
F ompT hsdS (rB mB ) dcm Tet galλ(DE3)
Proteinproduktion
endA Hte [argU proL
[137], [138]
r
pL1SL2/pETcoco-2
E.coli BL21 Star™
[135], [136]
recA1, endA1, gyrA96, thi-1, hsdR17, supE44,
–
E.coli BL21 (DE3)
[133], [134]
Cam ] mit L1SL2/pETcoco-2
Proteinproduktion
Proteinproduktion
Proteinproduktion
Klonierung für
Redirect®
-
-
-
-
-
-
F ompT hsdSB (rB mB ) gal dcm rne131 (DE3)
Invitrogen
F ompT hsdSB (rB mB ) gal dcm (DE3) pLysS
Invitrogen
R
(Cam )
F- ompT hsdSB (rB-mB-) gal dcm (DE3)
Novagen
pRARE2 (CamR)
F-, φ80/lacZΔM15, Δ(lacZYAargF)
U169, recA1, endA1 hsdR17(rk-,mk+), phoA,
Invitrogen
supE44, λ-, thi-1, gyrA96, relA1
4.7.2 Streptomyceten-Stämme
Tabelle 4.26 Verwendete Streptomyceten-Stämme.
Stamm
Beschreibung
Referenz
Streptomyces albus J1074
Wirt für Heterologe Expressionen
[139]
Mensacarcin- und Rishirilid-Produzent
[3]
Streptomyces bottropensis
(ehemals Streptomyces Sp.Gö C4/4)
53
Material und Methoden
4.8 Vektoren und Plasmide
4.8.1 In dieser Arbeit verwendete Vektoren und Plasmide
Tabelle 4.27 In dieser Arbeit verwendete Vektoren und Plasmide.
Vektor/Plasmid
Cos2
Cos4
Cos2∆O2 UH
Beschreibung
Cosmid; basiert auf pOJ436; enthält das
Biosynthesegencluster von DDMM
Cosmid; basiert auf pOJ436; enthält das
Biosynthesegencluster von Rishirilid
Cos2 mit inaktiviertem Gen msnO2;
hergestellt von Uwe Hardter
Resistenz
Referenz
Apramycin
[4]
Apramycin
[4]
Apramycin
[9]
Cos2∆O3
Cos2 mit inaktiviertem Gen msnO3
Apramycin
[1]
Cos2∆O4
Cos2 mit inaktiviertem Gen msnO4
Apramycin
[8]
Cos2∆O10
Cos2 mit inaktiviertem Gen msnO10
Apramycin
[1]
Cos2∆O11
Cos2 mit inaktiviertem Gen msnO11
Apramycin
[1]
Cos4∆O2
Cos4 mit inaktiviertem Gen rslO2
Apramycin
[140]
Klonierungsvektor
Ampicillin
Invitrogen
pBlueskriptII SK(-)
(pBSK-)
pUWL-H-tnp
pKR1
pKO3
pKO4R1
Expressions- und Konjugationsvektor;
pUWLoriT mit tnp, hph statt thio
r
Carbenicillin/Ampicillin
Hygromycin
pUWL-H mit enthaltenem Regulatorgen
Carbenicillin/Ampicillin
msnR1
Hygromycin
pUWL-H mit enthaltenem Gen msnO3
Carbenicillin/Ampicillin
Hygromycin
pUWL-H mit enthaltenem Gen msnO4 und
Carbenicillin/Ampicillin
Regulatorgen msnR1
Hygromycin
pKO10
pUWL-H mit enthaltenem Gen msnO10
pKO11
pUWL-H mit enthaltenem Gen msnO11
Carbenicillin/Ampicillin
Hygromycin
Carbenicillin/Ampicillin
Hygromycin
[141]
[8]
[1]
[8]
[1]
[1]
pUWL-H mit enthaltenen Regulatorgenen
Carbenicillin/Ampicillin
rslR1, rslR2 und rslR3
Hygromycin
pOJ436
Integrativer λ-Cosmid-Vektor
Apramycin
[143]
pTESa
Integrativer Vektor (ΦC31)
Apramycin
[144]
pTOS
Integrativer Vektor; ohne Promotor
Apramycin
[145]
Ampicillin
Novagen
pUWL-H-R1R2R3
[142]
Expressionsplasmid zur
pET21a(+)
Proteinproduktion mit C-terminalem
His6-Tag
54
Material und Methoden
Fortsetzung von Tabelle 4.27 In dieser Arbeit verwendete Vektoren und Plasmide.
Vektor/Plasmid
Beschreibung
Resistenz
Referenz
Kanamycin
Novagen
Carbenicillin
Invitrogen
Expressionsplasmid zur
pET28a(+)
Proteinproduktion mit N- und C-terminalem
His6-Tag
pUC19
Klonierungsvektor
4.8.2 In dieser Arbeit erstellte Vektoren und Plasmide
Tabelle 4.28 In dieser Arbeit erstellte Vektoren und Plasmide.
Vektor/Plasmid
Beschreibung
Cos2∆O2
Cos2 mit inaktiviertem msnO2-Gen
Resistenz
Apramycin
Spectinomycin
Apramycin
Cos2∆int∆O2
Cos2 mit inaktiviertem msnO2- und Integrase-Gen
Ampicillin
Spectinomycin
pBSK-/O2
Basiert auf pBSK-; enthält das msnO2-Gen
Ampicillin
pBSK-/O3
Basiert auf pBSK-; enthält das msnO3-Gen
Ampicillin
pUC19/O3
Basiert auf pUC19; enthält das msnO3-Gen
Ampicillin
pBSK-/O4
Basiert auf pBSK-; enthält das msnO4-Gen
Ampicillin
pTESa/O3
pET21a/O2
pET28a/O2
pET21a/O3
pET28a/O3
pET21a/O4
pET28a/O4
pBSK-/O10SA
pBSK-/O11SA
Basiert auf pTESa; enthält das msnO3-Gen; für Produktionen in
S. albus
Basiert auf pET21a; enthält das msnO2-Gen; für Proteinproduktionen
in E. coli
Basiert auf pET28a; enthält das msnO2-Gen; für Proteinproduktionen
in E. coli
Basiert auf pET21a; enthält das msnO3-Gen; für Proteinproduktionen
in E. coli
Basiert auf pET28a; enthält das msnO3-Gen; für Proteinproduktionen
in E. coli
Basiert auf pET21a; enthält das msnO4-Gen; für Proteinproduktionen
in E. coli
Basiert auf pET28a; enthält das msnO4-Gen; für Proteinproduktionen
in E. coli
Basiert auf pBSK-; enthält das msnO10-Gen mit Punktmutation an
Position S136 (Tausch gegen Alanin)
Basiert auf pBSK-; enthält das msnO11-Gen mit Punktmutation an
Position S136 (Tausch gegen Alanin)
Apramycin
Ampicillin
Kanamycin
Ampicillin
Kanamycin
Ampicillin
Kanamycin
Ampicillin
Ampicillin
55
Material und Methoden
Fortsetzung von Tabelle 4.28 In dieser Arbeit erstellte Vektoren und Plasmide.
Vektor/Plasmid
pKO10SA
pKO11SA
pBSK-/O4EA
pBSK-/O4HA
pKO4EA
Beschreibung
Basiert auf pUWL-H; enthält das msnO10-Gen mit Punktmutation an
Position S136 (Tausch gegen Alanin); für Produktionen in S. albus
Basiert auf pUWL-H; enthält das msnO11-Gen mit Punktmutation an
Position S144 (Tausch gegen Alanin); für Produktionen in S. albus
Basiert auf pBSK-; enthält das msnO4-Gen mit Punktmutation an
Position E45 (Tausch gegen Alanin)
Basiert auf pBSK-; enthält das msnO4-Gen mit Punktmutation an
Position H46 (Tausch gegen Alanin)
Basiert auf pUWL-H; enthält das msnO4-Gen mit Punktmutation an
Position E45 (Tausch gegen Alanin); für Produktionen in S. albus.
Resistenz
Ampicillin
Ampicillin
Ampicillin
Ampicillin
Ampicillin
Basiert auf pUWL-H; enthält das msnO4-Gen mit eingeführter
pKO4HA
Punktmutation an Position H46 (Austausch gegen Alanin); für
Produktionen in S. albus.
56
Ampicillin
Material und Methoden
4.9 Software, Datenbanken und Internetservice
Tabelle 4.29 Für diese Arbeit verwendete Software, Datenbanken und Internetservice.
Programm
Hersteller/Anbieter
Quelle
National Center for Biotechnology Information, National Library of
BLAST
Medicine, National Institutes of Health (Bethesda, USA)
[146]
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST.cgi
ChemStation Rev.B.04.03
Agilent Technologies (Waldbronn, D)
Clone Manager Suite 7
Scientific and Educational Software (Cary, USA)
Clustal Omega
Empower® 3
ExPASY
I-TASSER
Jalview Desktop
MarvinScetch
MS Office Paket
European Bioinformatics Institute (Hinxton, UK)
http://www.ebi.ac.uk/Tools/msa/clustalo/
[147]
Waters Corporation (Milford, USA)
Swiss Institute of Bioinformatics (Lausanne, CH)
http://www.expasy.org/
Yang Zhang Lab (Michigan, USA)
http://zhanglab.ccmb.med.umich.edu/
European Bioinformatics Institute (Dundee, SCO)
http:/www.jalview.org
[148]
[149]
[150]
ChemAxon (Budapest, H)
https://www.chemaxon.com/products/marvin/
Microsoft (Redmond, USA)
National Center for Biotechnology Information, U.S. National
Pubchem
Library of Medicine
[151]
https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/
National Center for Biotechnology Information, U.S. National
Pubmed
Library of Medicine
[152]
http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed
PyMOL 1.3
RaptorX
StreptomeDB
UNICORN 4.11
Schroedinger, LLC (Portland, USA)
Jinbo Xu Lab (Chicago, USA)
http://raptorx.uchicago.edu/about/
Pharmazeutische Bioinformatik Universität Freiburg (D)
http://www.pharmaceutical-bioinformatics.de/streptomedb/
[153]
[154]
GE Healthcare UK Ltd (Buckinghamshire, UK)
European Bioinformatics Institute (EMBL-EBI), Swiss Institute of
Uniprot
Bioinformatics (SIB) und Protein Information Resource (PIR)
[155]
http://www.uniprot.org/
WinCoot 0.6
Paul Emsley and Kevin D. Cowtan, Department of Biochemistry
University of Oxford (USA)
[156]
57
Material und Methoden
4.10 Molekularbiologische Methoden
4.10.1 Polymerase-Kettenreaktion (PCR)
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Polymerase-Kettenreaktion zur Amplifizierung von DNA,
Einführung von Punktmutationen sowie für Geninaktivierungen mittels Redirect®-Methode
verwendet. Hierfür wurden standardgemäß die in Tabelle 4.30 aufgelisteten Bestandteile in ein PCRTube pipetiert. Nach Zugabe der Polymerase wurde der Ansatz auf Eis gehalten um eine
unspezifische Primerbindung zu vermeiden. Je nach Ansatz wurde mit der Phu-, Phusion- oder TaqPolymerase gearbeitet. In Abhängigkeit von der Länge des zu amplifizierenden DNA-Fragments und
von der verwendeten Polymerase, wurde die entsprechende Elongationszeit gewählt. Im Fall einer
Quick Change-PCR, einer Einführung von Punktmutationen mittels Overlap Extension sowie um
Geninaktivierungen mittels Redirect®-Methode durchzuführen wurde mit der Phusion-Polymerase
gearbeitet. Das Volumen eines Standard PCR-Ansatzes betrug 50 µL (siehe Tabelle 4.30). Der PCRAnsatz wurde anschließend in einen Thermocycler gegeben und entweder das Temperaturprogramm
aus Tabelle 4.31 oder Tabelle 4.32 durchgeführt. Für Redirect®-Inaktivierungen wurde das in Tabelle
4.33 aufgeführte Programm verwendet.
Tabelle 4.30 Standard-Pipettierschema einer PCR.
Bestandteil
Volumen [µL]
Stoffmenge/Enzymmenge
dNTP-Mix (10 mM)
1 je Nukleotid 10 nmol
Primer forward (10 µM)
1 10 pmol
Primer reverse (10 µM)
1 10 pmol
Polymerase-Puffer (10 x)
5 DMSO
5 DNA-Template
1 H2Obidest
Ad 49 µL
Polymerase
1 58
ca. 5 U
Material und Methoden
Tabelle 4.31 Standardprogramm einer einfachen PCR.
Temperatur
Dauer
Zyklen
Initialdenaturierung
94 °C
5 min
1 x
Denaturierung
94 °C
30 sec
Anlagerung
Schmelztemperatur der Primer -
30 sec
5 °C
Elongation
72 °C
15-30 sec/kb Phusion-Polymerase
30 x
1 min/kb Taq-Polymerase
2 min/kb Pfu-Polymerase
Abschlusselongation
72 °C
10 min
Lagerung
4 °C
∞
1x
Tabelle 4.32 Standardprogramm einer Stepdown-PCR.
Temperatur
Dauer
Zyklen
Initialdenaturierung
94 °C
5 min
1 x
Denaturierung
94 °C
30 sec
Anlagerung
Schmelztemperatur der Primer;
30 sec
die Temperatur wird bei jedem
Zyklus um 1 °C gesenkt
Elongation
72 °C
10 x
15-30 sec/kb Phusion-Polymerase
1 min/kb Taq-Polymerase
2 min/kb Pfu-Polymerase
Denaturierung
94 °C
30 sec
Anlagerung
Schmelztemperatur der Primer -
30 sec
5 °C
Elongation
72 °C
15-30 sec/kb Phusion-Polymerase
20 x
1 min/kb Taq-Polymerase
2 min/kb Pfu-Polymerase
Abschlusselongation
72 °C
10 min
Lagerung
4 °C
∞
1 x
59
Material und Methoden
Tabelle 4.33 Standardprogramm der Redirect®-Methode.
Temperatur
Dauer
Zyklen
Initiation
98 °C
2 min
1 x
Denaturierung
98 °C
10 sec
Anlagerung
55 °C
45 sec
Elongation
72 °C
17 sec
Denaturierung
98 °C
10 sec
Anlagerung
70-74 °C
45 sec
Elongation
72 °C
17 sec
Termination
72 °C
7 min
Lagerung
4 °C
10 x
15 x
1x
∞
4.10.2 Kolonie-PCR
Zur Überprüfung von Ligationen wurde eine Kolonie-PCR durchgeführt. Hierfür wurde zuerst ein
Standard PCR-Ansatz pipettiert (siehe Tabelle 4.30). Dabei wurde, anstatt des DNA-Templates, ein
mit einem sterilen Zahnstocher gepickter E.coli Klon zugegeben und das entsprechende PCRProgramm durchgeführt.
4.10.3 DNA-Sequenzierung
Um eine korrekte Durchführung der Klonierungen zu gewährleisten wurden wichtige
Zwischenschritte sowie alle finalen Plasmide sequenziert. Hierfür wurde die DNA mithilfe des
Wizard®Plus SV Miniprep Kits aufgereinigt (siehe Kapitel 4.10.9) und anschließend die Konzentration
UV-metrisch mit Hilfe des Nanodrop 1000 bestimmt. Nach Verdünnung der Probe wurde diese bei
GATC Biotech, oder Eurofins Genomics sequenziert.
60
Material und Methoden
4.10.4 In dieser Arbeit verwendete Primer
Tabelle 4.34 Verwendete Primer sowie deren Schnittstellen (gekennzeichnet als unterstrichene Sequenzbereiche).
Bezeichnung
Sequenz 5‘3‘
Restriktionsschnittstelle
F-MsnO4
TATACATATGAAATTCGGCATCGTGTTCTT
NdeI
R-MsnO4
TATACTCGAGCCGGCCGTCCGTGAACTC
XhoI
R-MsnO4-Stop
TATACTCGAGTCACCGGCCGTCCGTGAACT
XhoI
F-NdeI-O3
TATTACATATGCCCACCGGCACCACCACC
NdeI
R-XhoI-O3
TTATACTCGAGTCACGACGCGTTCCTCTCG
XhoI
pET-O2-f
GCGCCATATGGTGAAATTCGGCATCAATCTC
NdeI
pET21a-O2-r
TATACTCGAGTGCGAAGCGGGGCAG
XhoI
F-msnO2
TATACATATGGTGAAATTCGGCATCAATCT
NdeI
R-msnO2
TATACTCGAGTCATGCGAAGCGGGG
XhoI
MsnO2-R-nostop
TATACTCGAGTGCGAAGCGGGGCAC
XhoI
pET28a-O2-r
TATACTCGAGTCATGCGAAGCGGGGC
XhoI
O2kontrF
GACAAGTCCTCCCAGACCCTT
O2kontrR
CGGAGTGGAAGAGGTATTTGC
KO3-f
ATCTATCGATGACCCCGTCCACCACATCATCG
KO3-r
TATAAAGCTTGCCGAATTTCACGACGCGTTCCTC
KO4-f
GACTAAGGATCCGACCAGGATCGGCAC
BamHI
KO4-r
CATGTCAAGCTTACCGCCGGGAGGGCAG
HindIII
msnO2Sp-f
O2-red-R-spec
TTCGTACCTGAAGCTCCTTCCCGAGAGGAACGCGTCGTG
AAACATATGGTCCGCAGCGCCCGCCGCAG
AGAACCCGCGAGAGGCCGTGCTCATGCGAAGCGGGGCA
GCATATGCTTGAACGAATTGTTAGAC
NdeI
NdeI
rslT1CHispUWL_Fw
CGCGAAGCTTGCGGATAACAATTC
HindIII
rslT1CHispUWL_Rv
CATAGGATCCGCTTTGTTAGCAGC
BamHI
Int-aatP::amp-f
Int-aatP::amp-r
GGGGCTTCACGTTTTCCCAGGTCAGAAGCGGTTTTCGGG
ATTACAATTTAGGTGGCACTT
GCTGTGCGCCCGTCTCAGCGCCTAACAGGCTTCCCGGGT
GAGGATCTTCACCTAGATCCT
KO10-f
TATATAAGCTTCCTGCTCATCCCATGACCCTGCC
HindIII
KO10-r
TATAGGATCCTTCCCTCCTTGGCCATCTCTTCG
BamHI
KO11-f
TATATAAGCTTATCGTCAACAGGCATTTGTCCATAG
HindIII
KO11-r
TATAGGATCCTACGACATCTCTGTACGGCGTTCCTC
BamHI
MsnO10-5‘
AGCATCATCCACATCGGGGCGATCGCCGCCCACACCCCG
MsnO10-3‘
CGGGGTGTGGGCGGCGATCGCCCCGATGTGGATGATGC
T
61
Material und Methoden
Fortsetzung von Tabelle 4.34 Verwendete Primer sowie deren Schnittstellen (gekennzeichnet als unterstrichene
Sequenzbereiche).
Bezeichnung
Sequenz 5‘3‘
Restriktionsschnittstelle
GGGCGAGTGGTCAACGTCGCTGCGACCGCAGGGAAACA
MsnO11-5‘
GGGG
CCCCTGTTTCCCTGCGGTCGCAGCGACGTTGACCACTCGC
MsnO11-3‘
CC
O4/H47_forw
GGTCAAACTGGTCGAGGCGTACTTCTTCG
O4/H47_rev
CGAAGAAGTACGCCTCGACCAGTTTGACC
O4/E46_forw
GGTCAAACTGGTCGCGCACTACTTCTTCG
O4/E46_rev
CGAAGAAGTAGTGCGCGACCAGTTTGACC
4.10.5 Analyse
und
Isolierung
von
DNA
mittels
Agarose-
Gelelektrophorese
Mithilfe der Agarose-Gelelektrophorese wurde nach einem analytischen Testverdau oder einer
durchgeführten PCR die Größe von DNA-Fragmenten kontrolliert. Des Weiteren diente sie der
Isolierung von DNA nach einem präparativen Verdau. Sowohl analytische als auch präparative Gele
wurden mit 0,7 % (m/V) Agarose-Gel hergestellt. Anschließend wurden die DNA-Proben mit einem 6x
Ladepuffer vermischt und in die Taschen des vorbereiteten Gels pipettiert. In eine separate Tasche
wurde ein 1 kb DNA-Ladder aufgetragen. Die Auftrennung der DNA erfolgte nach Anlegung einer
Spannung von 100 V. Analytische Gele wurden anschließend über 10-15 Minuten in einem
Ethidiumbromid- bzw. GelRed-Bad angefärbt und die Banden mithilfe des UV-Transilluminators
detektiert. Da diese Färbemittel in die DNA interkalieren und sie dadurch schädigen können, wurden
präparative Gele mit Methylenblau-Lösung 0,2 % (m/V) 10 min lang angefärbt, anschließend entfärbt
und die zu isolierenden Banden mithilfe eines Skalpells ausgeschnitten. Nach erfolgter Färbung
konnten die gesuchten DNA-Fragmente ohne Verwendung von UV-Strahlung, wie es im Fall von
Ethidiumbromid und GelRed nötig ist, detektiert werden. Dies wiederum verhinderte eine
Schädigung der DNA durch die UV-Strahlen. Die so gewonnenen Gelstücke wurden mithilfe des
Wizard®SV Gel and PCR Clean-up System Kits (siehe Tabelle 4.3) aus dem Agarosegel isoliert und
aufgereinigt. Hierbei wurde nach den Angaben des Herstellers Promega verfahren.
4.10.6 Restriktion von DNA
Zur Kontrolle der Richtigkeit von erstellten Plasmiden, sowie zur Vorbereitung von DNA-Fragmenten
für eine anschließende Klonierung wurden Restriktionen mit Hilfe von Endonukleasen durchgeführt.
Die benötigten Puffer sowie Inkubationstemperaturen wurden den Herstellerangaben (Promega und
62
Material und Methoden
NEB) entnommen. Die Inkubationszeit betrug 1-2 h. Für den Verdau eines präparativen Ansatzes von
50 µL wurden 3 µL Enzym verwendet, für einen Testverdau von 10 µL entsprechend 1 µL.
Anschließend wurden die Resktriktionsendonukleasen entweder durch Erhitzen inaktiviert oder mit
dem Wizard®SV Gel and PCR Clean-up System Kit entfernt. In den meisten Fällen wurden mithilfe
dieser Enzyme überhängende DNA-Enden (Sticky-Ends) hergestellt. Ausnahme hiervon waren
Klonierungen in die Zwischenvektoren pBSK- und pUC19 (siehe Tabelle 4.27). In diesen Fällen wurden
die Enzyme SmaI oder EcoRV verwendet mit denen gerade DNA-Enden (Blunt-Ends) hergestellt
werden können.
4.10.7 Ligation von DNA
DNA-Ligationen wurden mit Hilfe der T4-DNA- Ligase nach Angaben des Herstellers durchgeführt und
über Nacht bei 4 °C inkubiert. Der Reaktionsansatz hatte im Fall einer Blunt-End Ligation ein Volumen
von 13 µL und bei Sticky-End Ligationen ein Volumen von 10 µL (siehe Tabelle 4.35 und Tabelle 4.36).
Um Klonierungsprodukte nach erfolgter Restriktion mittels Sticky-End Ligation in den Endvektor
einzubauen, wurden die einzusetzenden Mengen an Insert und Vektor mittels NEBioCalculatorTM
v1.3.8 im Verhältnis 3:1 berechnet. Der gesamte Ligationsansatz wurde am darauffolgenden Tag für
eine Hitzeschock-Transformation oder Elektroporation in E.coli Zellen verwendet.
Tabelle 4.35 Reaktionsansatz einer Blunt-End Ligation.
Bestandteile
Menge [µL]
pBSK- / pUC19
2,2
T4-DNA-Ligasepuffer (10-fach)
1,3
Insert
8,5
T4-DNA-Ligase
1,0
Tabelle 4.36 Reaktionsansatz einer Sticky-End Ligation.
Bestandteile
Vektor
T4-DNA-Ligasepuffer (10-fach)
Insert
Menge [µL]
Mit dem NEBioCalculatorTM v1.3.8 berechnet;
Vektor : Insert-Verhältnis 1:3
1,0
Mit dem NEBioCalculatorTM v1.3.8 berechnet;
Vektor : Insert-Verhältnis 1:3
T4-DNA-Ligase
0,5
H2Obidest.
ad 10
63
Material und Methoden
4.10.8 Plasmidisolierung mittels Alkalischer Lyse
Mittels einer alkalischen Lyse konnten, nach erfolgter Klonierung, E. coli Kolonien in einem breiten
Screening aufgereinigt und anschließend über eine Testrestriktion analysiert werden. Die
Zusammensetzung der verwendeten Puffer ist in Tabelle 4.37 aufgeführt.
E. coli Einzelkolonien wurden steril gepickt und über Nacht in 2 mL LB-Medium inkubiert. Die Zellen
wurden abzentrifugiert, das Medium verworfen und das so entstandene Zellpellet in 200 µL P1-Puffer
resuspendiert. Nach 10-minütiger Inkubation bei RT wurden 200 µL P2-Puffer hinzugegeben, der
Ansatz durch vorsichtiges Invertieren gemischt und für weitere 5 Minuten bei RT stehen gelassen. Die
auf diese Weise aufgeschlossenen Zellen wurden mit 200 µL P3-Puffer versetzt, der Ansatz erneut
durch Invertieren gemischt und für 10 Minuten auf Eis inkubiert. Die ausgefallenen Proteine und
Zellbestandteile wurden 20 Minuten bei 4 °C und 13000 rpm abzentrifugiert und der klare Überstand
in ein neues 2 mL Gefäß überführt. Anschließend wurden 400 µL eiskaltes Isopropanol hinzugegeben
und gründlich gemischt um die DNA zu fällen. Nach einem weiteren Zentrifugationsschritt
(25 Minuten bei 4 °C und 13000 rpm) wurde der Überstand verworfen und das Pellet mit 200 µL
eiskaltem EtOH 70% (V/V) gewaschen. Es wurde noch einmal für 5 Minuten bei 4 °C und 13000 rpm
zentrifugiert, der Überstand vorsichtig abgegossen und das Pellet ca. 15-20 Minuten bei 37 °C
getrocknet bis sich der EtOH verflüchtigt hatte. Die Plasmid-DNA wurde in 30 µL H2Obidest.gelöst und
wenn nötig bei –20 °C gelagert.
Tabelle 4.37 Puffer zur Plasmidisolierung mittels alkalischer Lyse.
Bezeichnung
P1-Puffer
P2-Puffer
P3-Puffer
Bestandteile
Konzentration
Anmerkung
Tris-HCl
30 mM
RNase 7000 U/mL verwenden; Puffer auf pH
EDTA
3 mM
8,0 einstellen; RNase vor Gebrauch zugeben
RNase
100 µL/100 mL Puffer
und danach bei 4 °C lagern
NaOH
200 mM
NaOH- und SDS-Lösung separat ansetzen und
SDS
1 % (m/V)
dann 1:1 mischen
Kaliumacetat
3 M
Mit Eisessig auf pH 5,2 einstellen
4.10.9 Plasmid Minipräparation
Die wie in Kapitel 4.10.8 beschrieben, getesteten und als richtig bestätigten E. coli Einzelkolonien
wurden gepickt und über Nacht in 10 mL LB-Medium bei 37 °C und 180 rpm kultiviert. Anschließend
wurde mit Hilfe des Wizard®Plus SV Miniprep Kits die Plasmid-DNA isoliert (vergleiche Tabelle 4.3).
Die verwendeten Säulen wurden, nach erfolgtem Waschschritt mit Ethanol, für ca. 10 Minuten bei
37 °C getrocknet. Zuletzt wurde die DNA mit 30-50 µL 60 °C-warmem, autoklaviertem H2Obidest. von
den Säulen eluiert. Da die durch eine Minipräparation gewonnene Plasmid-DNA einen höheren
64
Material und Methoden
Reinheitsgrad als nach einer alkalischen Lyse aufweist, wurde sie sowohl für Sequenzierungen als
auch für darauffolgende Experimente verwendet.
4.10.10 Plasmid Midipräparation
Wenn eine große Menge an Plasmid-DNA aus E. coli mit hohem Reinheitsgrad hergestellt werden
sollte erfolgte die Aufreinigung mittels einer Midipräparation mit dem PureYieldTM Midiprep System
Kit (vergleiche Tabelle 4.3). Hierfür wurde eine 100 mL E. coli Übernachtkultur verwendet. Die
Durchführung erfolgte nach Angeben des Herstellers, wobei die Säulen zusätzlich nach erfolgtem
Waschschritt mit Ethanol für ca. 10 Minuten bei 37 °C getrocknet wurden. Zuletzt wurde die DNA mit
400-500 µL 60 °C-warmem, autoklaviertem H2Obidest eluiert.
4.11 Erstellung von Plasmiden
4.11.1 Zwischenklonierung in pBSK- und pUC19
Gene die mittels PCR amplifiziert wurden, wurden nicht direkt in den Zielvektor kloniert sondern im
Rahmen einer Zwischenklonierung zuerst in pBSK- oder pUC19 eingebracht (siehe Tabelle 4.27). Der
Vorteil dieses Systems liegt zum einen darin, dass das Gen anschließend in diesem Vektor
vervielfältigt wird und somit sich auch dessen Ausbeute im Vergleich zum PCR-Produkt erhöht. Zum
anderen, kann das Gen anschließend mit Hilfe von Restriktionsenzymen auf korrekte Weise aus dem
Vektor ausgeschnitten werden. Der Vektor pBSK-, bzw. pUC19 wurde hierfür mit einem Blunt-Endschneidenden Restriktionsenzym (im Rahmen dieser Arbeit SmaI oder EcoRV) geöffnet und das PCR
Produkt hinein ligiert. Anschießend erfolgte eine Transformation in E. coli XL1-Blue Zellen (vergleiche
Kapitel 4.12.5) und eine Blau-Weiß-Selektion (vergleiche Kapitel 4.12.7). Die korrekte Orientierung
des Gens im Vektor wurde mittels Testrestriktion sichergestellt (vergleiche Kapitel 4.10.6). Zuletzt
wurde das Gen aus dem Zwischenvektor ausgeschnitten und in den Zielvektor kloniert.
4.11.2 Klonierung von Plasmiden für die Proteinproduktion in E. coli
Für Aktivitätsassays und Kristallisierungsexperimente wurden große Mengen an aufgereinigtem
Protein benötigt. Im Rahmen dieser Arbeit wurden MsnO2, MsnO4 und MsnO3 in E. coliProteinproduktionszelllinien überproduziert und anschließend aufgereinigt. Die entsprechenden
Gene msnO2, msnO4 und msnO3 wurden hierfür in den Proteinexpressionsvektor pET21a(+) oder
pET28a(+) kloniert (siehe Tabelle 4.27). Diese Vektoren ermöglichen es die Proteinproduktion mittels
IPTG zu steuern. Des Weiteren kann so das Protein mit einem His6-Tag produziert werden, was
65
Material und Methoden
wiederum die anschließende Aufreinigung mittels Affinitätschromatographie ermöglicht (vergleiche
Kapitel 4.14.5 und 4.14.6). Die Klonierung in pET21a(+) führte zu einem C-terminalen His6-Tag. Mit
Hilfe von pET28a(+) konnte entweder ein C- oder N-terminaler His6-Tag eingeführt werden.
Im Fall von msnO2 wurde das Gen mit dem Primerpaar F_msnO2/R_msnO2 für pET21a(+) und mit
dem Primerpaar F_msnO2/pET28_O2_r für pET28a(+) sowie jeweils Cos2 als Template mittels PCR
amplifiziert. MsnO4 wurde für pET21a(+) mit den Primern F-MsnO4/R-MsnO4 und für pET28a(+) mit
den Primern F-MsnO4/R-MsnO4_Stop sowie jeweils Cos2 als Template mittels PCR amplifiziert. Im
Fall von msnO3 wurde nur ein N-terminaler His6-Tag mit pET28a(+) eingebracht, da diese Methode
bereits von Sarah Maier im Rahmen ihrer Dissertation beschrieben wurde [1]. Hierfür wurden die
Primer F_NdeI_O3/R_NdeI_O3 und Cos2 als Template verwendet. Alle Primer sind in Tabelle 4.34 zu
finden.
Die fertigen PCR-Produkte wurden zuerst im Rahmen einer Zwischenklonierung in pBSK- oder pUC19
kloniert (vergleiche Kapitel 4.11.1) und mittels Testrestriktion analysiert. Das so erhaltene
Zwischenklonierungskonstrukt sowie der jeweils benötigte pET-Vektor wurden mit NdeI und XhoI
geschnitten. Im nächsten Schritt wurden das Gen und der pET-Vektor über Nacht ligiert. Die fertigen
Proteinexpressionsplasmide wurden dann mittels Testrestriktion und Sequenzierung auf ihre
Richtigkeit überprüft.
4.11.3 Klonierung der Punktmutationsplasmide pKO10SA und
pKO11SA
Ein Experiment im Rahmen dieser Arbeit war es den Einfluss von Punktmutationen im aktiven
Zentrum der Ketoreduktasen MsnO10 und MsnO11 zu untersuchen. Hierfür wurden entsprechende
Mutationen in die kodierenden Gene msnO10 und msnO11 mittels Quick-change, sowie mittels
Overlap Extension-PCR eingebracht (siehe Kapitel 4.15.1 und 4.15.2). Die PCR-Reaktionen wurden für
msnO10 mit den Primer-Paaren KO10-f/KO10-r (flankierende Primer) und MsnO10-5‘/MsnO10-3‘
(enthalten die Punktmutation) durchgeführt. Im Fall von msnO11 wurden entsprechend die Primer
KO11-f/KO11-r und MsnO11-5‘/MsnO11-3‘ verwendet (vergleiche Tabelle 4.34). In allen
Experimenten wurde Cos2 als Template verwendet. Die mutierten DNA-Fragmente wurden im
Rahmen einer Zwischenklonierung in pBSK- kloniert (siehe Kapitel 4.11.1) und mittels Testrestriktion
analysiert. Die so erhaltenen Konstrukte, sowie der Zielvektor pUWL-H wurden mit BamHI und HindIII
geschnitten. Zuletzt wurden die Gene msnO10SA (Mutation an S 136), bzw. msnO11SA (Mutation an
S 144) und pUWL-H über Nacht ligiert. Die Überprüfung der erhaltenen Plasmide erfolgte mittels
Testrestriktion und Sequenzierung.
66
Material und Methoden
4.11.4 Klonierung der Punktmutationsplasmide pKO4E45A und
pKO4H46A
Der Einfluss von Punktmutationen im aktiven Zentrum der Luciferase-ähnlichen Monooxygenase
MsnO4 (siehe Tabelle 4.4) auf das Produktionsverhalten von Streptomyces albus x Cos2 wurde
getestet indem entsprechende Mutationen in das kodierende Gen msnO4 eingebracht wurden. Die
Durchführung erfolgte analog zu dem unter 4.11.3 beschriebenen Experiment. Es wurde sowohl eine
Punktmutation an Position E 46 als auch H 47 vorgenommen. Die PCR-Reaktionen wurden für die
Mutation
an
E 46
mit
den
Primer-Paaren
KO4-f/KO4-r
(flankierende
Primer)
und
O4/E46_forw/O4/E46_rev (enthalten die Punktmutation) durchgeführt. Im Fall der Mutation an H 47
wurden entsprechend die Primer KO4-f/KO4-r und O4/H47_forw/O4/H47_rev verwendet (siehe
Tabelle 4.34). In beiden Experimenten diente Cos2 als Template.
4.12 Mikrobiologische Methoden
4.12.1 Kultivierung von E. coli
E. coli-Zellen wurden in LB- oder 2xYT Medium kultiviert. Hierfür wurden entweder 10 mL Medium in
einem Reagenzglas oder 100 mL Medium in einem 300 mL Erlenmeyerkolben verwendet und mit den
benötigten Antibiotika versetzt. Die Inokulation erfolgte entweder mit einem Abstrich einer E. coli
Kolonie von einer LB-Platte oder mit 50-100 µL einer entsprechenden E. coli Dauerkultur. Zur
weiteren Vermehrung oder um Kontaminationen auszuschließen wurde ein Teil der E. coli-Kultur auf
LB-Platte ausgestrichen. Die Anzucht erfolgte für ca. 16 h bei 37 °C.
4.12.2 Herstellung von E. coli-Dauerkulturen
Für wichtige Mutanten wurde nach erfolgreicher Transformation eine Dauerkultur hergestellt.
Hierfür wurde eine Kolonie von der LB-Platte gepickt und über Nacht in 100 mL LB-Medium bei 37 °C
geschüttelt. Die Kultur wurde am nächsten Tag für 10 Minuten bei 5000 rpm abzentrifugiert und der
Überstand verworfen. Das Zellpellet wurde zweimal mit frischem LB-Medium gewaschen und zuletzt
in eiskalter 10%-iger Glycerin-Lösung resuspendiert. Dauerkulturen wurden bei -20 °C gelagert und
zum Inokulieren von Übernachtkulturen verwendet.
67
Material und Methoden
4.12.3 Herstellung von CaCl2-kompetenten E. coli-Zellen
Mit einem Aliquot kompetenter E. coli-Zellen wurde eine Übernachtkultur angeimpft und für ca. 16 h
bei 37 °C kultiviert. Anschließend wurden drei Kolben, mit jeweils 100 mL LB-Medium, mit 3 mL dieser
Kultur angeimpft und bei 37 °C bis zum Erreichen einer OD600 von 0,5 geschüttelt. Die Zellen wurden
anschließend mittels Zentrifugation (5000 rpm, 4 °C, 10 Minuten) geerntet und der Überstand
verworfen. Alle weiteren Schritte erfolgten auf Eis und mit den Lösungen die in Tabelle 4.11
aufgeführt sind. Zuerst wurde das Zellpellet mit 30 mL eiskalter MgCl2-Lösung gewaschen, der Ansatz
erneut, unter gleichen Bedingungen wie zuvor abzentrifugiert und der Überstand verworfen. Im
nächsten Schritt wurde das Zellpellet in 20 mL eiskalter CaCl2-Lösung resuspendiert, danach
20 Minuten auf Eis inkubiert und erneut abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen und das
Zellpellet in 15 mL eiskalter glycerinhaltiger CaCl2-Lösung aufgenommen. Die Zellsuspension wurde
zügig in vorgekühlte, 1,5 mL Eppendorf-Gefäße zu je 150 µL aliquotiert und bei -80 °C gelagert.
4.12.4 Herstellung von elektrokompetenten E. coli-Zellen
Elektrokompetente E. coli-Zellen wurden direkt vor der Verwendung frisch hergestellt. Zu diesem
Zweck wurde mit einem Aliquot kompetenter Zellen eine Übernachtkultur angeimpft und für ca. 16 h
bei 37 °C geschüttelt. Am nächsten Tag wurden 15 mL 2xYT- oder LB-Medium mit 150 µL der
Übernachtkultur und entsprechenden Antibiotika versetzt. War im Anschluss eine Geninaktivierung
mittels Redirect®-Methode geplant wurden zu dem Ansatz zusätzlich 150 µL einer 1 M L-ArabinoseLösung hinzugefügt. Nach dem Erreichen einer OD600 von 0,4-0,5 wurden die Zellen abzentrifugiert
(10 Minuten, 5000 rpm) und alle weiteren Schritte auf Eis, bzw. bei 4 °C durchgeführt. Das Zellpellet
wurde dreimal mit eiskalter 10%-iger Glycerin-Lösung gewaschen und anschließend mit 100 µL der
gleichen Lösung resuspendiert. Mit den so vorbereiteten Zellen wurde im Anschluss eine
Elektroporation durchgeführt
4.12.5 Hitzeschock Transformation von E. coli-Zellen
Ein Aliquot CaCl2-kompetenter E. coli-Zellen wurde für 20 Minuten auf Eis angetaut. Anschließend
wurden 5-10 µL DNA oder ein ganzer Ligationsansatz zugegeben, gut mit den Zellen vermischt und
für weitere 30 Minuten auf Eis inkubiert. Der darauf folgende Hitzeschock wurde für 2 Minuten bei
42 °C durchgeführt. Danach wurden die Zellen für weitere 2 Minuten auf Eis inkubiert, mit 700 µL LBMedium versetzt und für eine Stunde bei 37 °C geschüttelt. Die Zellsuspension wurde entweder auf
eine LB-Agarplatte ausgestrichen oder in flüssiges LB-Medium pipettiert. Des Weiteren wurden
68
Material und Methoden
entsprechende Antibiotika zugegeben und der Ansatz dann über Nacht für ca. 16 h bei 37 °C
kultiviert.
4.12.6 Elektroporation von E. coli-Zellen
Ein Aliquot elektrokompetenter Zellen wurde mit 3-10 µL DNA versetzt und für 10 Minuten auf Eis
inkubiert.
80 µL
dieses
Ansatzes
wurden
auf
Eis
luftblasenfrei
in
eine
vorgekühlte
Elektroporationsküvette mit einem Elektrodenabstand von 1cm pipettiert. Die Transformation
erfolgte mittels eines E. coli Pulser™ bei 1,8 kV für 5 ms. Danach wurde sofort 1 mL 2xYT-Medium
zugegeben und der Ansatz in einem 1,5 mL Eppendorf Gefäß für 1 h 20 min bei 37 °C inkubiert. Die
Zellsuspension wurde entweder auf eine LB-Agarplatte ausgestrichen oder in flüssiges LB-Medium
pipettiert. Des Weiteren wurden entsprechende Antibiotika zugegeben und der Ansatz dann über
Nacht für ca. 16 h bei 37 °C kultiviert.
4.12.7 Blau-Weiß-Selektion
Die Blau-Weiß-Selektion ermöglicht es rekombinante Vektoren von religierten Vektoren zu
unterscheiden. Hierfür muss die Multiple Cloning Site innerhalb eines lacZ-Gens lokalisiert sein. Wird
ein Insert eingebaut, erfolgt die Zerstörung dieses Gens. Nur ein intaktes lacZ-Gen ist im Stande,
zusammen mit einer β-Galactosidase das Substrat X-Gal umzusetzen, wodurch im nächsten Schritt
ein blauer Farbstoff entsteht. Wurde das lacZ-Gen jedoch durch die erfolgreiche Aufnahme des
Inserts zerstört, kann kein Farbstoff gebildet werden und die transformierten E. coli-Kolonien bleiben
weiß. Für die Durchführung wurde der Vektor mit einem Blunt-End-schneidenden Restriktionsenzym
(SmaI oder EcoRV) linearisiert und mit dem zu klonierenden PCR-Produkt ligiert. Nach erfolgter
Transformation in E. coli Zellen, wurden diese auf eine mit IPTG, X-Gal und den entsprechenden
Selektionsantibiotika überschichtete LB-Agarplatte ausgestrichen. Am nächsten Tag konnte bei
erfolgreicher Transformation eine Blaufärbung der Kolonien beobachtet werden.
4.12.8 Kultivierung von Streptomyces spp
Die Kultivierung von Streptomyceten erfolgte in TSB Flüssigmedium (100-300 mL Kolben) oder auf
TSB-Agarplatten bei 28 °C. Die Wachstumszeit betrug, in Abhängigkeit vom verwendeten Stamm, 3-7
Tage. Flüssigkulturen wurden entweder mit einem von der TSB-Agarplatte steril gepickten Klon, oder
mit 100 µL einer Dauerkultur des entsprechenden Streptomyceten angeimpft. Die Kultivierung auf
69
Material und Methoden
Festmedium erfolgte durch steriles Picken einer Einzelkolonie mit einem Zahnstocher und flächiges
Ausstreichen auf einer TSB-Agarplatte.
4.12.9 Herstellung von Streptomyces spp.-Dauerkulturen
Zur Herstellung einer Streptomyceten Dauerkultur wurden 30 mL TSB-Medium mit einer
Einzelkolonie inokuliert, entsprechende Selektionsantibiotika zugegeben und für ca. 2 Tage in einem
28 °C Schüttler inkubiert. Das Mycel wurde für 10 Minuten bei 4 °C und 5000 rpm abzentrifugiert und
anschließend zweimal mit frischem TSB-Medium gewaschen. Zuletzt wurde das Pellet in 25%-iger
Saccharose-Lösung resuspendiert, aliquotiert und bei -20 °C gelagert.
4.12.10 Kultivierung von Streptomyces spp. zur Produktion von
Naturstoffen
Zur Produktion von Didesmethylmensacarcin, Rishirilid, oder deren Derivaten in Streptomyces albus
wurde DNPM-Medium verwendet. War eine Produktion in Streptomyces bottropensis geplant, wurde
MYM-Medium eingesetzt (vergleiche Tabelle 4.24 4.24). Zuerst wurde eine Vorkultur des
entsprechenden Stamms in TSB-Medium hergestellt. Jeweils 100 mL des Produktionsmediums
wurden in einem 500 mL Kolben mit Schikane und Metallspirale mit 1 mL der Vorkultur angeimpft
und je nach Experiment, drei bis sieben Tage bei 28 °C geschüttelt.
4.12.11 Intergenerische Konjugation
Mithilfe der intergenerischen Konjugation konnten Plasmide und Cosmide in StreptomycetenStämme eingebracht werden. Die Durchführung erfolgte gemäß einem abgewandelten Protokoll
nach Kieser et al. [157]. Sowohl bei Konjugationen in S. albus als auch in S. bottropensis wurde der
methylierungsdefiziente Stamm E. coli ET 12567 als Donor verwendet. Dieser enthielt zusätzlich
entweder das Plasmid pUZ8002 oder pUB307, wodurch eine Übertragung von DNA in artfremde
Organismen möglich war.
Zuerst wurde das Plasmid oder das Cosmid mittels Hitzeschock-Transformation in den Stamm E. coli
ET12567 x pUZ8002, bzw. pUB307 eingebracht, auf eine LB-Agarplatte ausgestrichen und über Nacht
bei 37 °C inkubiert. Die erfolgreiche Übertragung des pUZ8002- oder pUB307-Plasmids wurde mittels
Kanamycin-Selektion gewährleistet. Zusätzlich wurde mit einem weiteren Selektionsantibiotikum die
Aufnahme des zu übertragenden Plasmids oder Cosmids sichergestellt. Mit einer Kolonie von dieser
Platte wurden 50 mL flüssiges LB-Medium angeimpft, über Nacht bei 37 °C geschüttelt und am
70
Material und Methoden
nächsten Tag für 10 Minuten bei 5000 rpm abzentrifugiert. Das Pellet wurde zweimal gewaschen und
zuletzt in 200 µL TSB-Medium resuspendiert.
Eine TSB-Kultur des Rezipienten-Stammes S. albus oder S. bottropensis wurde wie unter Kapitel
4.12.8 beschrieben vorbereitet. Die dicht gewachsene Kultur wurde für 10 Minuten bei 5000 rpm
abzentrifugiert, das Zellpellet zweimal mit frischem TSB gewaschen und anschließend in 300-500 µL
TSB resuspendiert. Pro Konjugation wurde 1-2 mL des so vorbereiteten Rezipienten verwendet. Die
E. coli-Zellen wurden mit dem Rezipienten gründlich vermengt und auf einer MS-Agarplatte
ausgestrichen. Anschließend erfolgte eine Inkubation für 8-9 h bei 28 °C. Nach dieser Zeit wurden die
Platten zur Selektion mit 1,5 mL H2O, 20 µL Phosphomycin und 20 µL eines weiteren
Selektionsantibiotikums überschichtet. Phosphomycin wurde zur Abtötung des E. coli DonorStammes verwendet. Das zusätzlich verwendete Selektionsantibiotikum war spezifisch für das zu
übertragende Plasmid oder Cosmid. Neben den Konjugationsplatten wurden jeweils eine Platte zur
Positiv- und Negativkontrolle hergestellt, indem nur der Rezipienten-Stamm ausplattiert wurde. Die
Negativplatte wurde entsprechend den Konjugationsplatten mit Selektionsantibiotikum und
Phosphomycin überschichtet. Die Positivplatte wurde ohne Überschichtung weiter inkubiert. Bei
erfolgreicher Konjugation konnten nach einer weiteren Kultivierung bei 28 °C für 3-8 Tage
Exkonjuganten gepickt und auf TSB-Agarplatte ausgestrichen werden. Voraussetzung war, dass auf
der Platte der Negativkontrolle kein Wachstum, sowie auf der Positivplatte ein dichter
Streptomyceten-Rasen aufgetreten war. Im nächsten Schritt wurde die TSB-Agarplatte für 2-4 Tage
bei 28 °C inkubiert bis Exkonjuganten angewachsen waren. Diese wurden gepickt und für
Produktionsanalysen verwendet.
4.13 Fütterungsexperimente
Aufgrund von Knockout-Experimenten die von Katharina Probst und Sarah Maier in ihren
Dissertationen durchgeführt wurden, wurde für die Luciferase-ähnliche Monooxygenase MsnO4 eine
Abhängigkeit von der Aktivität der Flavinreduktase MsnO3 postuliert [8][1]. Zur Untersuchung dieser
Hypothese wurden die Gene msnO3, msnO4, sowie das für die Produktion von MensacarcinDerivaten essentielle Regulatorgen msnR1 mittels intergenerischer Konjugation in S. albus
eingebracht. Anschließend wurden mit der entstandenen Mutante S. albus x pkR1 x msnO4 x msnO3
Fütterungsexperimente durchgeführt [158]. Da das natürliche Substrat von MsnO4 nicht isoliert
werden konnte, wurden Anthrachinonderivate gefüttert die diesem Substrat ähnlich sind (vergleiche
Tabelle 4.20). Die Testsubstanzen lagen als 25 mg/mL-Stammlösungen in DMSO vor. Zuerst wurde,
wie unter Kapitel 4.12.8 beschrieben eine Vorkultur der zu untersuchenden Mutante hergestellt.
71
Material und Methoden
Danach wurden 2-3 mL dieser Vorkultur verwendet um jeweils 100 mL Produktionsmedium (DNPM,
oder NL111; siehe Tabelle 4.24) in einem 500 mL Kolben mit Schikane und Metallspirale anzuimpfen.
Dem Medium wurden zusätzlich entsprechende Selektionsantibiotika zugegeben. Die Kultur wurde
24 h bei 28 °C geschüttelt, anschließend wurden 20 µL der jeweiligen Testsubstanz zugesetzt.
Während der weiteren Kultivierung bei 28°C wurde die Fütterung jeweils im Abstand von 12 h
viermal wiederholt. Im Anschluss an die letzte Zugabe wurde noch weitere drei Tage kultiviert. Die
Kulturen wurden auf pH 4 oder 7 eingestellt, abzentrifugiert, der Überstand wie unter Kapitel 4.16
beschrieben extrahiert und zuletzt mittels HPLC/MS analysiert. Als Negativkontrolle wurde das
Experiment gleichzeitig mit dem S. albus WT sowie mit der gleichen Mutante, die allerdings nicht
gefüttert wurde, durchgeführt.
4.14 Proteinbiochemische Methoden
4.14.1 Testproduktionen
Ausgewählte Proteine aus dem Mensacarcin-Gencluster wurden im Rahmen dieser Arbeit heterolog
in E. coli produziert. Um optimale Bedingungen für die Proteinproduktion von MsnO2 und MsnO4 zu
finden, wurden Testproduktionen in verschiedenen E. coli-Stämmen durchgeführt. Getestet wurden
dabei BL21 (DE3) codon plus RP strain pL1SL2/pETcoco-2-, BL21 StarTM (DE3)-, BL (DE3) plysS- und
RosettaTM2-Zellen (vergleiche Tabelle 4.25). Die Induktion der Proteinproduktion erfolgte jeweils mit
1 mM oder 5 mM IPTG. Für die Durchführung der Testexpression wurden zuerst die entsprechenden
E. coli Stämme mit dem Expressionsvektor transformiert und auf einer LB-Platte ausgestrichen. Mit
einem angewachsenen Klon wurden 100 mL LB-Medium angeimpft und über Nacht bei 37 °C
kultiviert. Am nächsten Tag wurde jeweils 100 mL frisches LB-Medium mit 1-2 mL der Vorkultur sowie
den entsprechenden Selektionsantibiotika versetzt und bei 28 °C, bis zum Erreichen einer OD600nm von
0,5-0,6, geschüttelt. Anschließend wurde IPTG zugegeben. Ab diesem Zeitpunkt wurde jede Stunde
eine 1 mL-Probe entnommen, abzentrifugiert und das Zellpellet bei -20 °C gelagert. Zusätzlich wurde
bei jeder Probenentnahme die OD600nm gemessen. Um die Proteinproduktion analysieren zu können
wurde eine Standarisierung der Proben durchgeführt. Hierfür wurden die Pellets in jeweils 20 μL H2O
pro 0,1 OD600nm resuspendiert. Von den so erhaltenen Zellsuspensionen wurden jeweils 10 µL
entnommen, mit derselben Menge SDS-Ladepuffer gemischt, 10 Minuten bei 95 °C inkubiert und zur
Analyse auf ein SDS-PAGE Gel aufgetragen.
72
Material und Methoden
4.14.2 Überproduktion in LB-Medium
Für die Durchführung einer Proteinproduktion im präparativen Maßstab in LB-Medium wurde zuerst
eine 100 mL LB-Vorkultur angeimpft und über Nacht bei 37 °C geschüttelt. Am nächsten Tag wurden
zwölf 500 mL-Kolben mit jeweils 250 mL LB-Medium sowie den entsprechenden Selektionsantibiotika
versetzt. Jeder dieser Ansätze wurde mit 5 mL der Vorkultur inokuliert und bei 28 °C bis zum
Erreichen einer OD600nm von 0,5-0,6 im Schüttelinkubator kultiviert. Im nächsten Schritt wurde durch
IPTG-Zugabe die Proteinproduktion induziert. Nach weiteren 4 h Inkubation bei 28 °C im Schüttler,
wurden die Zellpellets durch Zentrifugation (15 Minuten, 10000 rpm, 4 °C) geerntet und bei -20 °C
gelagert.
4.14.3 Überproduktion in Autoinduktionsmedium
Die Proteinproduktion in Autoinduktionsmedium erfolgt ohne Zugabe eines induzierenden Agens
(z.B. IPTG). Hierbei wird im ersten Schritt die im Medium enthaltene Glucose vom Bakterium als
Nährstoffquelle verwendet. Erst wenn diese verbraucht ist fängt E. coli mit der Verwertung von
Laktose an die auch ein Bestandteil des Mediums ist. Dieser Schritt aktiviert zusätzlich über ein T7Expressionssystem die Proteinproduktion. Durch die Verwendung von Autoinduktionsmedium, in
Kombination mit einer niedrigen Inkubationstemperatur, kann eine übermäßige Bildung von
Proteinaggregaten, die sowohl bei zu schneller Produktion als auch bei zu starker Aktivierung des
Promotors auftreten kann, verhindert werden [128].
Um ein Protein in präparativen Mengen in Autoinduktionsmedium zu produzieren wurde eine 100 mL
LB-Vorkultur angeimpft und über Nacht bei 37 °C geschüttelt. Am nächsten Tag wurden, im Fall der
Produktion von MsnO4, sechs 1 L-Kolben mit jeweils 500 mL Autoinduktionsmedium mit den
entsprechenden Antibiotika versetzt und mit jeweils 6-7 mL der Vorkultur inokuliert. Bei der
Produktion von MsnO3 entsprachen die Ansätze denen, die bereits in Kapitel 4.12.2 beschrieben
wurden. Die Kulturen wurden bei 18 °C über einen Zeitraum von ca. 2,5 Tagen geschüttelt,
anschließend abzentrifugiert (15 Minuten, 10000 rpm, 4 °C), der Überstand verworfen und das
Zellpellet, falls nötig bei -20 °C gelagert.
4.14.4 Zellaufschluss für spätere Proteinaufreinigung
Das bei der Überproduktion erhaltene Zellpellet wurde mit einer vier- bis fünffachen Menge an
Lysepuffer (vergleiche Tabelle 4.17) versetzt, anschließend eine Spatelspitze Lysozym hinzugegeben
und der Ansatz vorsichtig durch Rühren und Schwenken und unter ständigem Kühlen auf Eis
resuspendiert. Die Zellsuspension wurde dann mit Hilfe einer French-Press bei einem Druck von 80073
Material und Methoden
1000 psi zweimal aufgeschlossen und die so erhaltenen Zelltrümmer mittels Zentrifugation
(30 Minuten, 10000 rpm, 4 °C) vom Überstand abgetrennt. Dieser wurde mit 10 µL DNase versetzt,
15 Minuten auf Eis inkubiert und erneut zentrifugiert (30 Minuten, 10000 rpm, 4 °C). Der auf diese
Weise von allen unlöslichen Bestandteilen befreite Überstand der die zytosolischen Proteine enthielt,
wurde weiter mittels Affinitäts- und Größenausschluss-Chromatographie aufgereinigt.
4.14.5 Analytische Affinitätschromatographie
Mithilfe einer Affinitätschromatographie im analytischen Maßstab wurde getestet ob die
Aufreinigung eines Proteins mit dieser Methode prinzipiell möglich ist. Hierfür wurde das Protein in
einem Ansatz von 100 mL, gemäß den Angaben aus Kapitel 4.14.2, produziert und die Kultur
anschließend abzentrifugiert (15 Minuten, 5000 rpm, 4 °C). Das so erhaltene Zellpellet wurde mit 1015 mL Lysepuffer sowie einer Spatelspitze Lysozym versetzt und unter vorsichtigem Rühren und
Schwenken auf Eis aufgeschlossen. Danach wurde für eine weitere halbe Stunde auf Eis inkubiert, bei
4 °C abzentrifugiert und der Überstand mit 2 mL eiskaltem Ni-NTA (in Lysepuffer) versetzt. Der Ansatz
wurde eine Stunde lang vorsichtig im Eisbad gerührt und dann für die Affinitätschromatographie
verwendet. Die Auftrennung der Proteinfraktionen erfolgte durch eine schrittweise Erhöhung der
Konzentration an Imidazol, indem manuell nacheinander mit Puffern unterschiedlicher
Zusammensetzung gespült wurde. Die einzelnen Fraktionen wurden gesammelt und mittels einer
SDS-PAGE analysiert. Konnte ein Protein erfolgreich an das Säulenmaterial binden, wurde es erst in
den letzten Elutionsschritten, bei hoher Imidazol-Konzentration von der Säule gewaschen (siehe
Tabelle 4.16).
4.14.6 Präparative Affinitätschromatographie
Proteine die im Rahmen dieser Arbeit aufgereinigt werden sollten, wurden mit einem His6-Tag
produziert um eine Ni-NTA-basierte Affinitätschromatographie zu ermöglichen. Im präparativen
Maßstab wurde diese mit Hilfe des ÄKTA-FPLC-Systems (Fast Protein Liquid Chromatographie) von GE
Healthcare durchgeführt. Der nach dem Zellaufschluss erhaltene Überstand, der die zytosolischen
Proteine enthielt wurde in einen Superloop gefüllt und von diesem aus mit einem Fluss von
0,5 mL/min auf eine 5 mL HisTrap FF Säule geladen. Mithilfe eines linearen- oder Stufengradienten
des Elutionspuffers (siehe Pufferzusammensetzung Tabelle 4.17), wurden schrittweise erst
unspezifisch und dann spezifisch gebundene Proteine von der Säule eluiert. Das gewünschte Protein
konnte bei einer Konzentration von 50 % des Elutionspuffers bereits in hoher Reinheit isoliert
werden. Die gesammelten Fraktionen wurden mittels einer SDS-PAGE analysiert. Diejenigen
74
Material und Methoden
Fraktionen, die das zu isolierende Protein enthielten, wurden auf 1 mL aufkonzentriert und
anschließend durch eine Größenausschluss-Chromatographie weiter aufgereinigt.
4.14.7 Präparative Größenausschluss-Chromatographie
Mithilfe der Gelfiltration wurden restliche, nach der Affinitätschromatographie noch vorhandene
Verunreinigungen sowie aggregiertes Protein entfernt. Die Aufreinigung erfolgte über eine HiLoad
16/60 Superdex 200 prep grade Gelfiltrationssäule mit einem Säulenvolumen von 120 mL. Die nach
der präparativen Affinitätschromatographie aufkonzentrierte Proteinprobe wurde 15 Minuten bei
4 °C zentrifugiert, um ausgefallenes Protein abzutrennen. Der klare Überstand wurde dann mit einem
Fluss von 0,5 mL/min auf die Säule geladen und über Nacht aufgetrennt. Die dabei gesammelten
Fraktionen wurden im Anschluss mittels SDS-PAGE analysiert. Das auf diese Weise aufgereinigte
gewünschte Protein wurde, je nach geplantem Folgeexperiment, auf 5-11 mg/mL aufkonzentriert
und dann für Kristallisierungen oder in vitro Assays verwendet. Eine Zwischenlagerung erfolgte, nach
Schockgefrierung in flüssigem Stickstoff, bei -80 °C.
4.14.8 Aufkonzentrierung von Proteinlösungen
Falls erforderlich, wurden Proteinlösungen mittels Ultrazentrifugation aufkonzentriert. Hierfür
wurden Vivaspin 20 Konzentratoren von Sartorius AG mit einem Ausschlussvolumen von 10 kDa
verwendet. Die Lösung wurde in den Konzentrator gefüllt und bei 4 °C so lange zentrifugiert bis die
gewünschte Konzentration von 5-11 mg/mL erreicht war.
4.14.9 SDS-PAGE
Eine SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sulfate Polyacrylamide Gel Electrophoresis) wurde durchgeführt, um
den Erfolg von Proteinproduktionen und deren Aufreinigungen zu kontrollieren [159]. SDS-Gele
wurden gemäß den Angaben in Tabelle 4.15 hergestellt. Die Proteinproben wurden im Verhältnis 1:1
mit Ladepuffer gemischt, für 5 Minuten bei 95 °C im Heizblock denaturiert und anschließend in die
Taschen des SDS-Gels pipettiert. Auf die Elektrophorese Kammer wurde eine Spannung von 160 V
angelegt und die Proben ca. 1 h 10 Minuten aufgetrennt. Die Anfärbung der Proteinbanden erfolgte
danach mit Coomassieblau-Lösung. Hierfür wurde das SDS-Gel mit der Färbelösung bedeckt, kurz
aufgekocht und der Ansatz 1 h vorsichtig geschwenkt. Anschließend wurde das SDS-Gel in
Entfärbelösung gelegt und für weitere 1-2 h geschwenkt, um überschüssige Färbung zu entfernen. In
75
Material und Methoden
Tabelle 4.14 sind alle Puffer und Lösungen aufgeführt die für die Durchführung einer SDS-PAGE
benötigt werden.
4.14.10 Konzentrationsbestimmung von Proteinlösungen
Über die Messung der Absorption bei 280 nm konnte die Konzentration von Proteinlösungen
bestimmt werden. Die Berechnung erfolgte mithilfe des Lambert-Beerschen Gesetzes. Die nötigen
Messungen wurden mit dem NanoDrop 1000 von Thermo Scientific durchgeführt.
4.14.11 In vitro Enzym-Aktivitätsassays
Mit Hilfe von in vitro Assays sollte die Aktivität der aufgereinigten Proteine MsnO3 und MsnO4
nachgewiesen werden. Des Weiteren sollte geprüft werden ob die beiden Enzyme im Rahmen eines
Zweikomponentensystems zusammenarbeiten [1]. Die verwendeten Stammlösungen sind in Tabelle
4.18 und Tabelle 4.19 aufgeführt.
Die Aktivität von MsnO3 wurde, mit Hilfe einer von Sarah Maier in ihrer Doktorarbeit beschriebenen
UV-metrischen Methode nachgewiesen [1], indem die Umsetzung von NADH zu NAD + detektiert
wurde. Dies ist aufgrund der unterschiedlichen Absorptionsmaxima beider Komponenten möglich.
Die Zusammensetzung des Assays ist in Tabelle 4.38 aufgeführt. Alle Lösungen wurden in eine
Einmalküvette pipettiert und dann die Veränderung der Absorption bei 340 nm über die Zeit
gemessen. Zusätzlich wurde als Negativkontrolle ein Ansatz ohne MsnO3 vermessen.
Tabelle 4.38 Zusammensetzung des MsnO3-Aktivitätsassays.
Bestandteil
Endkonzentration im Assay
FMN
0,3-0,4 mM
NADH/NADPH
0,1-0,2 mM
MsnO3
0,5 mg/mL
Im Folgeexperiment wurde getestet, ob MsnO4 ein F420-abhängiges Enzym ist. Zuerst wurde F420 mit
FGD unter Verbrauch von Glucose-6-phosphat reduziert. Im nächsten Schritt wurde 1-Methoxy-3methyl-2-pent-2-enyl-anthrachinon oder 1,4-Dihydroanthrachinon, sowie das aufgereinigte MsnO4
zugegeben. Bei den beiden Substraten handelt es sich um Anthrachinon-Derivate, die aufgrund ihrer
Ähnlichkeit zum potentiellen Substrat von MsnO4, von diesem Enzym umgesetzt werden sollten. Die
genaue Zusammensetzung ist in Tabelle 4.39 aufgelistet. Anschließend erfolgte eine Inkubation über
4-16 h bei 37°C. Der Ansatz wurde zweimal mit 300 µL Essigsäureethylester extrahiert, die
76
Material und Methoden
organischen Phasen vereint und mittels Zentrifugation in der Speedvac zur Trockene eingeengt. Der
Extrakt wurde in 200 µL Methanol aufgenommen und mittels HPLC/ESI-MS analysiert.
Tabelle 4.39 Zusammensetzung des Enzymassays mit F420 und FGD.
Bestandteile
Endkonzentration im Assay
F420
15 µM
FGD
2-4 µM
Glucose-6-phosphat
2,5 mM
MsnO4
1-2 µM
Substrat
200-240 µM
Zuletzt wurde getestet, ob MsnO4 ein FMN-abhängiges Enzym ist. Hierfür wurde FMN mit der
aufgereinigten Flavinreduktase MsnO3 unter Verbrauch von NADH reduziert. Im nächsten Schritt
wurden 1-Methoxy-3-methyl-2-pent-2-enyl-anthrachinon oder 1,4-Dihydroanthrachinon sowie das
aufgereinigte MsnO4 zugegeben. Da freies H2O2 die Reaktion stören könnte, wurde zusätzlich
Catalase verwendet. Die genaue Zusammensetzung ist in Tabelle 4.40 aufgeführt. Der Ansatz wurde
analog zum Assay mit F420 und FGD pipettiert, inkubiert, extrahiert und anschließend mittels
HPLC/ESI-MS analysiert.
Tabelle 4.40 Zusammensetzung des Enzymassays mit MsnO3 und MsnO4.
Bestandteile
Endkonzentration im Assay
Catalase
120 U/mL
FMN
20-40 µM
NADH
2,5-5 mM
MsnO3
0,2-0,5 µM
MsnO4
2-4 µM
Substrat
200-300 µM
4.14.12 Kristallisierungsversuche
Mit den aufgereinigten Proteinen MsnO4 und MsnO3 wurden jeweils erste Screeningversuche
durchgeführt um gute Kristallisierungsbedingungen zu finden. Alle Experimente wurden mit der
Sitting-Drop-Methode
Proteinkonzentrationen
und
jeweils
lagen
im
bei
4 °C
Bereich
oder
von
20 °C
durchgeführt.
2-11 mg/mL.
Verwendet
Die
getesteten
wurden
die
Kristallisierungsmikroplatten Morpheus®, Wizard PEG und Stura Footprint Screen von Molecular
Dimensions. Jede dieser Platten enthielt 96 unterschiedliche Kristallisierungspuffer, weshalb die
Zugabe der entsprechenden Proteinmenge zu den Ansäten automatisiert, mit Hilfe des Oryx Nano
Protein Kristallisierung Roboters von Douglas Instruments Ltd erfolgte. 0,3 µL Proteinlösung wurden
in der jeweiligen Mikrokammer mit 0,3 µL des Kristallisierungspuffers gemischt und sofort dicht
77
Material und Methoden
verschlossen. Nach einer Inkubationszeit von 2-5 Wochen konnten bei einigen der getesteten
Bedingungen erste Kristalle detektiert werden. Mit diesen Pufferzusammensetzungen wurden dann
weitere Tests mit leicht veränderten Konzentrationen und pH-Werten durchgeführt.
4.15 Methoden zur Geninaktivierung
4.15.1 Punktmutationen mittels ortsspezifischer Mutagenese (QuickChange)
Bei der Einführung von Punktmutationen mittels ortsspezifischer Mutagenese, handelt es sich um
eine PCR-basierte Methode. Dabei wird das Gen, in das die Mutation eingeführt werden soll, in einen
Vektor kloniert. Das so entstandene Konstrukt wird dann als Template für die Mutagenese-PCR
verwendet [160]. Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Quick-Change Mutagenese mit den für
Ketoreduktasen kodierenden Genen msnO10 und msnO11 aus dem Mensacarcin-Gencluster
durchgeführt. In beiden Fällen sollte ein hochkonserviertes Serin gegen ein Alanin umgetauscht
werden. Das ausgesuchte Serin war dabei jeweils im aktiven Zentrum des korrespondierenden
Proteins (MsnO10 oder MsnO11) lokalisiert. Für die Einführung von Mutationen in msnO10 wurden
die Primer MsnO10-5‘ und MsnO10-3‘ verwendet. Im Fall von msnO11 wurden entsprechend die
Primer MsnO11-5‘ und MsnO11-3‘ benutzt (vergleiche Tabelle 4.34). Die PCR-Ansätze wurden unter
Verwendung der Pfu-Polymerase gemäß den allgemeinen Vorgaben in Tabelle 4.30 pipettiert. Das
verwendete Programm ist in Tabelle 4.41 aufgeführt.
Tabelle 4.41 Für die Quick Change Mutagenese verwendetes PCR Programm.
Temperatur
Dauer
Zyklen
Initialdenaturierung
95 °C
5 min
1 x
Denaturierung
95 °C
30 sec
Anlagerung
55 °C
1 min
Elongation
68 °C
13 sec
Abschlusselongation
68 °C
13 min
Lagerung
4 °C
18 x
1x
∞
Das PCR-Produkt wurde mit dem Wizard®SV Gel and PCR Clean-up System Kit von Promega
aufgereinigt. Danach wurde ein Verdau des Produkts mit DpnI durchgeführt. Da das
Restriktionsenzym DpnI nur an methylierten Positionen schneiden kann, wird im Ansatz der QuickChange Mutagenese ausschließlich das Template, nicht aber das PCR-Produkt abgebaut. Die Effizienz
der anschließenden Transformation in E. coli XL1-Blue Zellen ist für den Template-Vektor, im
Vergleich zum linearen PCR-Produkt, viel höher. Somit wäre ohne den DnpI-Verdau auch die
78
Material und Methoden
Wahrscheinlichkeit Klone mit dem PCR-Produkt zu isolieren sehr gering. Die erfolgreiche Einführung
der Mutation wurde zuletzt mittels Sequenzierung nachgewiesen [161].
4.15.2 Punktmutationen mittels Overlap-Extension-PCR
Um Punktmutationen in msnO10 und msnO11 (analog der Beschreibung in Kapitel 4.15.1)
einzuführen, sowie um spezifische im aktiven Zentrum von MsnO4 lokalisierte Aminosäuren (E46,
H47) gegen Alanin umzutauschen wurde jeweils eine Overlap-Extension-PCR durchgeführt [162]. Eine
graphische Übersicht ist auf Abbildung 4.1 zu finden. In dieser Methode wurden zwei PCR-Schritte
sowie zwei Primer-Paare benötigt [163]. In Folge der ersten PCR-Reaktion wurde separat das 5‘-Ende
und das 3‘-Ende des Gens, jeweils mit bereits enthaltener Mutation, amplifiziert. Diese beiden
mutierten Teile des Gens wurden anschließend, in einer zweiten PCR-Reaktion, vermischt. In Folge
dieses Schrittes erhielt man das komplette Gen mit eingeführter Punktmutation. Ein Vorteil hierbei
war, dass nicht ein ganzes Plasmid sondern nur das Ziel-Gen im Rahmen der PCR amplifiziert werden
musste. Die verwendeten Mutationsprimer waren im Fall von MsnO4 O4/H47_forw, O4/H47_rev,
O4/E46_forw und O4/E46_rev. Für MsnO10 und MsnO11 wurden die bereits unter 4.15.1 erwähnten
Primer verwendet. Zusätzlich wurden die Primer KO10-f, KO10-r, KO11-f, KO11-r, KO4-f und KO4-r
benutzt (siehe Tabelle 4.34). Alle Schritte wurden als Stepdown-PCR, mithilfe der Pfu-Polymerase und
gemäß den Angaben in Tabelle 4.32 durchgeführt. Die finalen PCR-Produkte wurden jeweils in den
Klonierungsvektor pUWL-H-tnp kloniert, in E. coli XL1-Blue-Zellen transformiert und zuletzt mittels
Testrestriktion und Sequenzierung auf Richtigkeit überprüft.
79
Material und Methoden
Abbildung 4.1 Das Prinzip der Punktmutation mittels Overlap-Extension-PCR.
80
Material und Methoden
4.15.3 Geninaktivierung mittels Redirect®-Methode
Die Inaktivierung von msnO2 auf dem Cosmid Cos2 erfolgte mit der Redirect®-Methode in E. coliZellen [164]. Hierfür wurde zuerst eine lineare Spectinomycin-Resistenzkassette mittels PCR
amplifiziert. Diese besteht aus dem Spectinomycin-Gen, das von jeweils einer NdeI-Schnittstelle
flankiert ist. Des Weiteren wird das Spectinomycin-Gen, vor und hinter diesen Schnittstellen, von
homologen Bereichen des zu inaktivierenden Gens umgeben. Für die Amplifizierung der Kassette
wurden Primer verwendet, die sowohl die NdeI-Schnittstelle, als auch die homologen Bereiche
enthielten. Das erhaltene PCR-Produkt wurde isoliert und mit dem Wizard®SV Gel and PCR Clean-up
System Kit aufgereinigt. Das Cosmid Cos2 wurde in spezielle E. coli DH5α-Zellen, die zusätzlich bereits
das Plasmid pBADαβγ enthielten transformiert. Dieses Plasmid enthält neben den λ-Red
Rekombinasen die für die Rekombination benötigt werden (redα, redβ und redγ) auch ein
Tetracyclin-Resistenzgen und ein hitzesensitives Replikon. Mit der erhaltenen E. coli DH5α-Mutante
wurde eine Übernachtkultur angezogen. Am nächsten Tag wurden 15 mL 2xYT Medium mit 150 µL LArabinose-Lösung, 15 µL Apramycin-Stammlösung und 200-400 µL der Übernachtkultur versetzt und
bei 37 °C bis zu einer OD600 von 0,4-0,5 im Schüttelinkubator kultiviert. Die L-Arabinose-Lösung war
nötig um die Expression des λ-Red-Operons zu induzieren. Die Zellen wurden anschließend, wie unter
4.12.4 beschrieben, elektrokompetent gemacht und mittels Elektroporation mit der SpectinomycinResistenzkassette transformiert. Nach der Elektroporation wurde der Ansatz bei 37 °C für
1 h 20 Minuten geschüttelt und anschließend auf eine LB-Platte, die mit Apramycin und
Spectinomycin überschichtet war, ausplattiert. Die angewachsenen Klone wurden am nächsten Tag
gepickt und mittels alkalischer Lyse (vergleiche Kapitel 4.10.8) und Testrestriktion (vergleiche Kapitel
4.10.6) analysiert. Die DNA von richtigen Klonen wurde isoliert, in E. coli XL1-Blue Zellen
transformiert und auf eine LB-Platte, die mit Spectinomycin überschichtet war, nochmals
ausplattiert. Erneut wurden Klone gepickt und mittels alkalischer Lyse und Testrestriktion auf
Richtigkeit untersucht. Das so erhaltene Konstrukt Cos2∆O2 wurde mittels Konjugation (vergleiche
Kapitel 4.12.11) in den Stamm Streptomyces albus eingebracht und das Produktionsverhalten
untersucht.
81
Material und Methoden
4.15.4 Geninaktivierung mittels Double-Crossover
Im Rahmen dieses Experiments wurde das, in der genomischen DNA von Streptomyces bottropensis
lokalisierte, msnO2-Gen mittels eines Double-Crossovers gegen die auf dem Cosmid Cos2∆O2
lokalisierte Spectinomycin-Resistenzkassette ausgetauscht. Da auf Cos2∆O2 eine Integrase lokalisiert
ist, die zu einer einfachen Integration des Cosmids in die genomische DNA von S. bottropensis führen
könnte, wurde diese im ersten Schritt mittels Redirect®-Methode auf Cos2∆O2 inaktiviert (vergleiche
Kapitel 4.15.3). Mithilfe der Primer Int-aaP::amp-f und Int-aatP::amp-r wurde zuerst, mit pBSK- als
Template, eine Ampicillin-Resistenzkassette amplifiziert und diese für den Knockout der Integrase
(int-Gens) verwendet. Nach erfolgter Inaktivierung wurde das so entstandene Konstrukt
Cos2∆O2∆int, das nun sowohl eine Spectinomycin- als auch eine Ampicillin-Resistenzkassette trug in
E. coli XL1-Blue-Zellen transformiert und auf eine LB-Ampicillin Platte ausgestrichen. Die isolierte
DNA der angewachsenen Ampicillin-resistenten Klone wurde mittels einer Testrestriktion mit DraI
untersucht. Dies war möglich da sich auch in der Ampicillin-Resistenzkassette eine DraIRestriktionsschnittstelle
befand.
Das
Inaktivierungskonstrukt
Cos2∆O2∆int
wurde
mittels
intergenerischer Konjugation in den Stamm Streptomyces bottropensis eingebracht. Anschließend
wurde auf Spectinomycin-resistente Klone selektiert. Eine solche Resistenz deutete auf eine
erfolgreiche Aufnahme des Cosmids hin. Danach wurden diese Klone zusätzlich auf AmpicillinSensitivität geprüft. Aufgrund des erfolgreichen Double-Crossovers, sollte das genomische msnO2Gen in S. bottropensis gegen die auf Cos2∆O2∆int lokalisierte Spectinomycin-Resistenzkassette
ausgetauscht worden sein. Die Ampicillin-Resistenzkassette verbleibt dabei auf dem Cosmid. Das
Cosmid, das nun das genomische msnO2-Gen anstatt der Spectinomycin-Resistenzkassette trug,
konnte
aufgrund
der
fehlenden
Integrase
nicht
in
die
genomische
DNA
von
Streptomyces bottropensis integriert werden. Nach einigen Zellgenerationen konnten somit
Mutanten detektiert werden die das Cosmid nicht mehr enthielten. Klone in denen der DoubleCrossover erfolgreich stattgefunden hatte, waren gleichzeitig Spectinomycin-resistent und Ampicillinsensitiv.
82
Material und Methoden
4.16 Analytik von Naturstoffen aus Streptomyces spp.
Sollten Naturstoffe in Streptomyces albus oder dessen Mutanten produziert werden, wurde DNPMMedium zur Anzucht verwendet. Experimente mit Streptomyces bottropensis wurden im Rahmen
dieser Arbeit in DNPM- oder in MYM-Medium durchgeführt. Zuerst wurde eine 30 mL-Vorkultur des
entsprechenden Stamms oder der Mutante in TSB-Medium hergestellt und diese über 2-3 Tage im
Schüttelinkubator bei 28 °C und 180 rpm kultiviert. Danach wurden jeweils 100 mL des
Produktionsmediums in einem 500 mL Kolben mit Schikane und Metallspirale mit 1 mL der Vorkultur
angeimpft und je nach Experiment, fünf bis sieben Tage bei 28 °C weiter inkubiert. Anschließend
wurden die Kulturen für 10 Minuten bei 5000 rpm abzentrifugiert und der Überstand auf einen pH
von 4 oder 7 eingestellt. Der Überstand wurde zweimal mit 100 mL Essigsäureethylester
ausgeschüttelt um die enthaltenen Naturstoffe zu extrahieren. Die organische Phase wurde mithilfe
eines Cellulosefilters filtriert und je nach Volumen des Ansatzes im Rotationsverdampfer oder in der
Speedvac-Zentrifuge bis zur Trockene eingeengt. Die Proben wurden entweder direkt analysiert oder
bei -20 °C gelagert. Im nächsten Schritt wurden die so gewonnenen Extrakte in 0,5-2 mL MeOH HPLC
grade aufgenommen und durch einen 0,45 µm Partikelfilter filtriert um noch enthaltene unlösliche
Partikel zu entfernen. Die Proben wurden mittels HPLC oder HPLC/ESI-MS mit Hilfe des Programms
mensO4 analysiert (vergleiche) [8]. Für die Durchführung wurde eine analytische HPLC/ESI-MS
Anlage (Agilent 1100) mit einem Säulensystem aus einer Vorsäule XBridge™ C18 (20 mm x 4,6 mm;
Partikelgröße 3,5 μm) und einer Hauptsäule XBridge™ C18 (100 mm x 4,6 mm; Partikelgröße 3,5 μm)
verwendet. Die Analyten wurden über einen Diodenarray-Detektor (DAD) und einen Quadrupol
Massendetektor (MSD) erfasst.
Tabelle 4.42 Methode mensO4 zur Analyse von Mensacarcin und dessen Derivaten [8].
Zeit [min]
Laufmittel A [%]
Laufmittel B [%]
0
20
80
6
20
80
7
30
70
25
95
5
28
95
5
30
20
80
35
20
80
Fluss: 0,5 mL/min; Säulenofen: 30 °C
Detektion 230 nm (Ref. 400 nm), 254 nm (Ref.400 nm), 330 nm (Ref. 500 nm), 400 nm (Ref. 600 nm)
Laufmittel A: Acetonitril (0,5 % (V/V) Essigsäure), Laufmittel B: H2Obidest. (0,5 % (V/V) Essigsäure)
83
Ergebnisse
5 Ergebnisse
5.1 Inaktivierungsexperimente
5.1.1 Punktmutationen im aktiven Zentrum der Ketoreduktasen
MsnO10 und MsnO11
Ketoreduktasen spielen eine wichtige Rolle bei der von TypII-Polyketidsynthasen durchgeführten
Bildung von Polyketiden. Sie gehören zur Familie der Short-Chain-Dehydrogenasen und -Reduktasen
(SDR-Familie) und katalysieren die Reduktion einer Ketogruppe zu einem sekundären Alkohol.
Hierbei erfolgt ein stereospezifischer Hydrogentransfer von NAD(P)H auf die Ketogruppe, was
letztendlich zur Ausbildung einer definierten Konfiguration der Alkoholgruppe führt. Ketoreduktasen
sind an den frühen Schritten der PKS II-Biosynthese beteiligt. Dabei katalysieren sie nach dem ersten
Ringschluss zwischen C7/C12 oder C9/C14 die Bildung des Alkohols. Des Weiteren können sie die
sterische Orientierung der Polyketidkette und dadurch das spätere Zyklisierungsmuster des
Polyketids beeinflussen [165]. C9-Ketoreduktasen kommen am häufigsten vor, darüber hinaus
wurden für einige Custer auch andere Ketoreduktasen beschrieben. Ein Beispiel ist die im
Daunomycin-Cluster lokalisierte C17-Ketoreduktase DauE [166]. Erst kürzlich wurde ARX21, eine
ungewöhnliche Ketoreduktase aus dem Biosynthese-Cluster des Arixanthomycins beschrieben, die
sowohl den Kohlenstoff an Position 17 als auch an Position 19 reduziert [167].
Im Mensacarcin-Cluster befinden sich drei Gene, die für Ketoreduktasen kodieren (msnO1, msnO10
und msnO11). MsnO1 wurde als hypothetische C19- und MsnO11 als hypothetische C9Ketoreduktase beschrieben. Für MsnO10 konnte kein homologes Protein gefunden werden [3]. Im
Rahmen der Dissertation von Sarah Maier wurden Geninaktivierungen der drei Ketoreduktasen
mittels Redirekt®-Methode durchgeführt, um die jeweiligen Funktionen aufzuklären [1]. Im Fall von
MsnO11 führte die anschließende Produktion in Streptomyces albus zu einem vollständigen Erliegen
der Biosynthese. Aus diesem Grund wurde geschlussfolgert, dass MsnO11 eine essentielle Rolle bei
der Polyketidkettensynthese einnimmt. Es wäre denkbar, dass das Protein ausschließlich für eine
räumliche Stabilisierung der Polyketidkette verantwortlich ist. Allerdings ließ sich eine zusätzliche
katalytische Funktion nicht ausschließen. Nach der Inaktivierung von MsnO10 kam es zur Produktion
der Shunt-Produkte Msn-SM1 und Msn-SM2. Die Struktur von Msn-SM1 konnte nicht aufgeklärt
werden, Msn-SM2 wiederum zeigte im Vergleich zu Mensacarcin eine stark verkürzte Kettenlänge
sowie eine Veränderung des Faltungsmusters. Aus diesem Grund wurde ein stabilisierender Einfluss
des Proteins auf den Komplex der minimalen PKS vorgeschlagen [1].
84
Ergebnisse
Um nachzuweisen, ob es sich bei MsnO10 und MsnO11 um Proteine mit einer rein stabilisierenden
Funktion handelt, wurden Punktmutationen im katalytischen Zentrum der entsprechenden Gene
msnO10 und msnO11 eingebracht. Hierfür wurden zuerst die Inaktivierungskonstrukte Cos2∆O10
und Cos2∆O11 jeweils mittels intergenerischer Konjugation in den Stamm Streptomyces albus
eingebracht. Im nächsten Schritt wurden die so entstandenen Mutanten mit dem Plasmid pkR1
konjugiert, wodurch das SARP-Regulatorgen msnR1 überexprimiert wurde. Wie in der Dissertation
von Katarina Probst gezeigt werden konnte, ist dieser Regulator essentiell für die Produktion von
nachweisbaren Mengen an Mensacarcin-Biosyntheseintermediaten [8]. Anschließend wurden die
Mutanten S. albus Cos2∆O10 x pKR1 und S. albus Cos2∆O11 x pKR1 mit den Genen, die die
Punktmutation enthielten, komplementiert. Somit wurde gewährleistet, dass die beiden Proteine
zwar weiterhin produziert wurden, allerdings ihre katalytische Funktion, falls vorhanden, unterdrückt
war. Wie unter 4.15.2 beschrieben, wurden hierfür die entsprechenden Punktmutationen in zwei
Schritten mittels Overlap-Extension-PCR in msnO10 und msnO11 eingebracht. Verwendet wurden die
Primer KO10-f, KO10-r, MsnO10-5‘ und MsnO10-3’ sowie KO11-f, KO11-r, MsnO11-5‘ und MsnO113‘. Anhand eines Aminosäuresequenz-Vergleichs mit ähnlichen Ketoreduktasen konnte sowohl für
MsnO10 als auch für MsnO11 ein hochkonserviertes Serin gefunden werden, welches anschließend
jeweils gegen ein Alanin ausgetauscht wurde (entsprechend S136 und S144). Nach durchgeführter
Punktmutation, wurden msnO10 SA und msnO11 SA jeweils in den Konjugationsvektor pUWL-H
kloniert, in E. coli XL1-Blue Zellen transformiert und anschließend das Konstrukt mittels
Testrestriktion mit EcoRI und XhoI sowie Kolonie-PCR der transformierten Klone getestet (siehe
Abbildung 5.1 und Abbildung 5.2.). Die richtige MsnO10-Mutante wurde bei der Testrestriktion
mittels einer Bande bei 920 bp und in der Kolonie-PCR bei 621 bp nachgewiesen. Die korrekte
MsnO11-Mutante wurde durch die Bande bei 2820 bp in der Testrestriktion und bei 650 bp in der
Kolonie-PCR identifiziert. Die Einführung der Punktmutation in die ausgewählten, richtigen
Konstrukte (jeweils blau umrandet) wurde zusätzlich mittels Sequenzierung nachgewiesen.
85
Ergebnisse
Abbildung 5.1 Ergebnisse der Testrestriktion und Kolonie-PCR von ausgewählten E. coli XL1-Blue pUWL-H/msnO10SA
Klonen.
Links: Agarosegel der Testrestriktion, rechts: Agarosegel der Kolonie-PCR der Klone E. coli XL1-Blue pUWL-H/msnO10SA.
M=Marker; C=vollständiges Cos2 Plasmid als Positivkontrolle; P=leerer pUWL-H Vektor. Die Banden 1 und 2 des linken Gels
zeigen das Ergebnis der Testrestriktion des aus ausgewählten E. coli XL1-Blue Klonen isolierten Vektors pUWL-H/msnO10SA
mit EcoRI und XhoI. Rechts sind die Ergebnisse der Kolonie-PCR derselben Klone dargestellt. Die für das korrekte Konstrukt
erwarteten Banden sind blau umrandet.
Abbildung 5.2 Ergebnisse der Testrestriktion und Kolonie-PCR von ausgewählten E. coli XL1-Blue pUWL-H/msnO11SA
Klonen.
Links: Agarosegel der Testrestriktion, rechts: Agarosegel der Kolonie-PCR der Klone E. coli XL1-Blue pUWL-H/msnO11SA.
M=Marker; C=vollständiges Cos2 Plasmid als Positivkontrolle; P=leerer pUWL-H Vektor. Die Bande 1 des linken Gels zeigt
das Ergebnis der Testrestriktion eines richtigen aus E. coli XL1-Blue isolierten Vektors pUWL-H/msnO11SA mit EcoRI und
XhoI. Rechts ist das Ergebnis der Kolonie-PCR desselben Klons dargestellt. Die für das korrekte Konstrukt erwarteten
Banden sind blau umrandet
Anschließend wurden die hergestellten Konstrukte sowie das Plasmid pKR1 mittels intergenerischer
Konjugation in S. albus Cos2∆O10 und S. albus Cos2∆O11 eingebracht. Auf dieselbe Weise wurden als
Kontrolle S. albus Cos2∆O10 und S. albus Cos2∆O11 mit dem nicht mutierten Genen msnO10 und
86
Ergebnisse
msnO11 komplementiert. Auch hier wurde zusätzlich pkR1 in die Mutanten eingebracht. (siehe
Abbildung 5.3). Die so erstellten Stämme S. albus Cos2∆O10 x pKR1, S. albus Cos2∆O10x pKR1
x msnO10,
S. albus Cos2∆O10 x pKR1 x msnO10SA,
S. albus Cos2∆O11 x pKR1,
S. albus Cos2∆O11
x pKR1 x msnO11 und S. albus Cos2∆O11 x pKR1 x msnO11SA wurden 5 Tage lang bei 28 °C in DNPMMedium kultiviert. Der Kulturüberstand wurde mit Essigsäureethylester bei pH 4 oder pH 7 extrahiert
und anschließend mittels HPLC/MS (Methode mensO4) auf entstandene Sekundärstoffe untersucht.
Abbildung 5.3 Schematische Durchführung der Produktion und Extraktion mit den durch Punktmutation inaktivierten
Genen msnO10SA und msnO11SA.
Die Knockoutmutanten S. albus Cos2∆O10 und S. albus Cos2∆O11 wurden entsprechend mit msnO10, msnO10SA, msnO11
oder msnO11SA komplementiert. Zusätzlich wurde in alle Stämme der Vektor pKR1, der das SARP-Regulatorgen msnR1
enthält eingeführt. Nach erfolgter Produktion in DNPM-Medium wurde der Kulturüberstand extrahiert und mittels
HPLC/MS analysiert.
Die entsprechenden Chromatogramme sind in Abbildung 5.4 und Abbildung 5.5 dargestellt. In der
Analyse konnte für die Mutante S. albus Cos2∆O10 x pKR1, wie zuvor von Sarah Maier beschrieben,
keine Produktion von Didesmethylmensacarcin (DDMM) mehr nachgewiesen werden. Des Weiteren
wurden die Intermediate Msn-SM1 und Msn-SM2 detektiert. Eine Komplementierung mit msnO10
führte
zur
Widerherstellung
der
DDMM-Produktion
[1].
Interessanterweise
führte
die
Komplementierung mit msnO10SA zu dem gleichen Ergebnis, welches auch für die Mutante
S. albus Cos2∆O10 x pKR1 beobachtet wurde. Erneut wurden die Intermediate Msn-SM1 und MsnSM2 detektiert. Zudem konnte, obwohl im UV-Absorptionsspektrum ein kleiner Peak bei der
entsprechenden Retentionszeit zu erkennen war, DDMM nicht detektiert werden.
Auch die Mutante S. albus Cos2∆O11 x pKR1 konnte, wie zuvor von Sarah Maier beschrieben kein
Didesmethylmensacarcin (DDMM) mehr produzieren. Des Weiteren wurden keine weiteren, neuen
87
Ergebnisse
Naturstoffe detektiert. Durch die Komplementierung mit msnO11 konnte die Produktion von DDMM
wiederhergestellt werden [1]. Auch hier führte die Komplementierung mit msnO11SA zum gleichen
Resultat wie zuvor im Fall der Knockout-Mutante S. albus Cos2∆O11 x pKR1. Die Produktion von
DDMM wurde komplett unterbrochen und darüber hinaus wurden keine neuen Intermediate
nachgewiesen. Aufgrund dieser Ergebnisse erscheint es wahrscheinlich, dass sowohl MsnO10 als
auch MsnO11 eine katalytische Funktion in der Mensacarcin-Biosynthese einnehmen. Ob dies ihre
einzige Rolle darstellt, konnte somit allerdings nicht aufgeklärt werden.
Abbildung 5.4 HPLC-Chromatogramme (λ = 254 nm) von DNPM-Medium (1) sowie den Rohextrakten aus
S. albus Cos2∆O10 x pKR1 (2), S. albus Cos2∆O10 x pKR1 x msnO10 (3) und S. albus Cos2∆O10 x pKR1 x msnO10 SA (4).
A=Msn-SM1; B=Didesmethylmensacarcin (DDMM); C=Msn-SM2
Im Extrakt des reinen Mediums wurden erwartungsgemäß keine Mensacarcin-Intermediate detektiert (1). Sowohl nach
Inaktivierung des Gens msnO10 mittels Redirect® (2), als auch nach Einführung einer einzelnen Punktmutation im aktiven
Zentrum des Gens (4) konnte keine DDMM-Produktion mehr nachgewiesen werden (violett hinterlegt). Stattdessen wurden
die Intermediate Msn-SM1 und Msn-SM2 gefunden (grün und gelb hinterlegt). Durch die Komplementierung der Mutante
S. albus Cos∆O10 x pKR1 mit msnO10 wurde die DDMM-Produktion wiederhergestellt (3).
88
Ergebnisse
Abbildung 5.5 HPLC-Chromatogramme (λ = 254 nm) von DNPM-Medium(1), sowie den Rohextrakten aus
S. albus Cos∆O11 x pKR1(2), S. albus Cos2∆O11 x pKR1 x msnO11(3) und S. albus Cos2∆O11 x pKR1 x msnO11 SA (4).
A=Didesmethylmensacarcin (DDMM); Im Extrakt des reinen Mediums wurden erwartungsgemäß keine MensacarcinIntermediate detektiert (1). Sowohl nach Inaktivierung des Gens msnO11 mittels Redirect® (2), als auch nach Einführung
einer einzelnen Punktmutation im aktiven Zentrum des Gens (4) konnte keine DDMM-Produktion mehr nachgewiesen
werden (violett hinterlegt). Durch die Komplementierung der Mutante S. albus Cos∆O11 x pKR1 mit msnO11 wurde die
DDMM-Produktion wiederhergestellt (3).
5.1.2 Inaktivierung der Luciferase-ähnlichen Monooxygenase MsnO2
mittels Redirect®
Uwe Hardter führte in seiner Dissertation einen Knockout des für eine Luciferase-ähnliche
Monooxygenase aus dem Mensacarcin-Gencluster kodierenden Gens msnO2 auf dem Cosmid Cos2
mittels Redirect®-Methode durch (siehe 4.15.3). Allerdings kam er dabei zu keinem abschließenden
Ergebnis [9]. Das Experiment wurde im Rahmen dieser Arbeit mit veränderten Primern (msnO2Sp-f
und O2-red-R-spec) zur Amplifizierung der Spectinomycin (Spec)-Resistenzkassette wiederholt. Die
Primer enthielten zusätzlich jeweils eine NdeI-Erkennungssequenz, wodurch der erfolgreiche Tausch
von msnO2 gegen die Spec-Kassette mit Hilfe einer Testrestriktion mit NdeI nachgewiesen werden
konnte. Nach anschließender Agarose-Gelelektrophorese konnte die erfolgreiche Erstellung des
Knockout-Cosmids Cos2∆O2 anhand einer Bande bei 1100 bp (Größe der Spec-Kassette)
nachgewiesen werden (siehe Abbildung 5.6).
89
Ergebnisse
Abbildung 5.6 Das Prinzip des Knockouts von msnO2 auf Cos2 mittels Redirect®-Methode.
Durch den Tausch von msnO2 gegen die Spectinomycin-Resistenzkassette (Spec) konnten richtige Klone anhand ihrer
Spectinomycin-Resistenz identifiziert werden. Zusätzlich wurden mit der Spec-Kassette zwei NdeI-Schnittstellen in Cos2
eingeführt. Die Testrestriktion des Cosmids Cos2∆O2 lieferte im Anschluss eine Bande bei 1100 bp, die der Größe der SpecKassette entspricht.
Anschließend wurde das Cosmid erneut in E. coli XL1-Blue Zellen transformiert und auf eine LB-Platte
mit Spectinomycin ausplattiert. Die daraus resultierenden Klone wurden gepickt und erneut mittels
Testrestriktion, diesmal mit ApoI und darauffolgender Agarose-Gelelektrophorese analysiert. Anhand
einer DNA-Bande bei 2507 bp wurde die erfolgreiche Inaktivierung von msnO2 endgültig
nachgewiesen. Die Ergebnisse der beiden Testrestriktionen sind in Abbildung 5.7 dargestellt, wobei
die gesuchten Banden jeweils blau umrandet sind.
Abbildung 5.7 Agarosegele der Testrestriktionen zum Nachweis der erfolgreichen Inaktivierung vom msnO2 auf Cos2
mittels Redirect®.
Links I) ist das Agarosegel nach Testrestriktion mit NdeI und rechts II) das Agarosegel nach Testrestriktion mit ApoI
dargestellt; M=Marker.
Die Banden 1, 2 und 3 (I) zeigen das Ergebnis der Testrestriktion des aus ausgewählten E. coli XL1-Blue Klonen isolierten
Cosmids Cos2∆O2 mit NdeI. Auf diese Weise identifizierte, korrekte Konstrukte (z.B. I/3) wurden erneut in E. coli
transformiert, angewachsene Klone gepickt und das Cosmid isoliert. Anschließend wurde eine weitere Testrestriktion mit
ApoI durchgeführt. Das unter II gezeigte Ergebnis des entsprechenden Agarosegels konnte die erfolgreiche Einführung des
Knockouts bestätigen.
90
Ergebnisse
Das Inaktivierungskonstrukt wurde zusammen mit dem Plasmid pKR1 mittels intergenerischer
Konjugation in den heterologen Wirt Streptomyces albus eingebracht. Dadurch wurde zusätzlich der
SARP-Regulator msnR1 aus dem msn-Cluster überexprimiert. Dieser ist essentiell für eine hohe
Produktionsrate
von
Mensacarcin-Biosyntheseintermediaten
[8].
Anschließend
wurde
die
Inaktivierungsmutante S. albus Cos2∆O2 x pKR1, wie unter 4.12.10 beschrieben in DNPM-Medium
kultiviert, extrahiert und zuletzt mittels HPLC untersucht. Als Kontrollen wurden DNPM-Medium,
sowie die Mutanten S. albus x pKR1 und S. albus x Cos2∆O2 auf die gleiche Art analysiert. In der
Mutante S. albus x Cos2∆O2 x pKR1 wurde das bereits durch Uwe Hardter identifizierte Intermediat
Msn-UH erneut produziert [9]. Weitere Intermediate der Mensacarcin-Biosynthese konnten nicht
gefunden werden (siehe Abbildung 5.8).
Abbildung 5.8 HPLC-Chromatogramme (λ = 254 nm) von DNPM-Medium (1), den Rohextrakten aus S. albus x pKR1 (2),
S. albus x Cos2∆O2 (3) und S. albus x Cos2∆O2 x pKR1 (4), sowie das UV-Absorptionsspektrum von Msn-UH.
A=Msn-UH
Oben: Sowohl im Extrakt des reinen Mediums (1) als auch der Mutante S. albus x pKR1 (2) wurden erwartungsgemäß keine
Mensacarcin-Intermediate detektiert (1). Auch in S. albus x Cos2∆O2 konnte keine Veränderung des Produktionsprofils im
Vergleich zum Medium festgestellt werden (3). Im Fall der Mutante S. albus x Cos2∆O2 x pKR1 wurde das Intermediat MsnUH produziert (orange hinterlegt) (4) [9].
Unten: UV-Absorptionsspektrum von Msn-UH.
91
Ergebnisse
5.1.3 Inaktivierung der auf Cos2 lokalisierten Integrase mittels
Redirect® und anschließende Inaktivierung von msnO2 in
Streptomyces bottropensis mittels Double-Crossover
Das Intermediat Msn-UH wurde nach Knockoutexperimenten des msnO2-Gens auf dem Cosmid Cos2
gefunden und isoliert. Der Streptomyceten-Stamm S. albus wurde dabei als heterologer Wirt
verwendet. Bei dem Intermediat handelt es sich allerdings nicht um das tatsächliche Substrat der
korrespondierenden Monooxygenase MsnO2, sondern um ein Shuntprodukt der MensacarcinBiosynthese. Um einen möglichen negativen Einfluss des heterologen Wirts auf die Bildung des
eigentlichen Produkts auszuschließen, wurde eine Inaktivierung von msnO2 und eine anschließende
Produktion im nativen Mensacarcin-Produzenten S. bottropensis durchgeführt. Das in der
genomischen DNA von Streptomyces bottropensis lokalisierte msnO2 musste hierfür mittels eines
Double-Crossovers gegen die auf dem Cosmid Cos2∆O2 lokalisierte Spectinomycin-Resistenzkassette
ausgetauscht werden. Da auf Cos2 eine Integrase lokalisiert ist, die zu einer einfachen Integration des
Inaktivierungskonstrukts Cos2∆O2 in die genomische DNA von S. bottropensis führen könnte, wurde
diese mittels Redirect®-Methode auf Cos2∆O2 wie unter 4.15.3 beschrieben inaktiviert. Mit Hilfe der
Primer Int-aaP::amp-f und Int-aatP::amp-r wurde zuerst mit pBSK- als Template eine AmpicillinResistenzkassette amplifiziert und diese für den Knockout auf Cos2∆O2 verwendet (vergleiche
Abbildung 5.6). Nach erfolgter Inaktivierung der Integrase wurde das Konstrukt Cos2∆O2∆int, das
nun sowohl eine Spectinomycin- als auch eine Ampicillin-Resistenzkassette enthielt in E. coli XL1-Blue
Zellen transformiert und auf eine LB-Ampicillin Platte ausplattiert. Die isolierte DNA der
angewachsenen Ampicillin-resistenten Klone wurde mittels einer Testrestriktion mit DraI untersucht.
Dies war möglich da sich auch in der Ampicillin-Resistenzkassette eine DraI-Restriktionsschnittstelle
befand. Durch die Detektion einer Bande bei 2800 bp auf dem Agarosegel wurde der erfolgreiche
Knockout der Integrase auf Cos2∆O2 nachgewiesen (siehe Abbildung 5.9.).
92
Ergebnisse
Abbildung 5.9 Agarosegel der Testrestriktion mit DraI zum Nachweis der erfolgreichen Inaktivierung der Integrase auf
dem Cosmid Cos2∆O2.
Die Bande P (positiv) zeigt das Ergebnis der Testrestriktion nach einer mittels Redirekt®-Methode in E. coli durchgeführten
Inaktivierung der Integrase die auf dem Cosmid Cos2∆O2; M=Marker.
Das Inaktivierungskonstrukt Cos2∆O2∆int wurde mittels intergenerischer Konjugation in den Stamm
Streptomyces bottropensis eingebracht und anschließend auf Spectinomycin-resistente Klone
selektiert. Eine solche Resistenz deutete auf eine erfolgreiche Aufnahme des Cosmids hin. Danach
wurden diese Klone auf Ampicillin-Sensitivität geprüft. Aufgrund des erfolgreichen DoubleCrossovers, sollte das genomische msnO2-Gen in S. bottropensis gegen die auf Cos2∆O2∆int
lokalisierte Spec-Kassette ausgetauscht worden sein. Die Ampicillin-Kassette verblieb dabei auf dem
Cosmid. Das Cosmid, das nun anstatt der Spectinomycin-Kassette das msnO2-Gen enthielt, konnte
aufgrund der fehlenden Integrase nicht in die genomische DNA von Streptomyces bottropensis
integriert werden. Aus diesem Grund konnten, nach einigen Zellgenerationen, Mutanten detektiert
werden die das Cosmid nicht mehr enthielten (vergleiche Abbildung 5.10). Klone in denen der
Double-Crossover erfolgreich stattgefunden hatte, waren somit gleichzeitig Spectinomycin-resistent
und Ampicillin-sensitiv (Abbildung 5.11).
93
Ergebnisse
Abbildung 5.10 Das Prinzip der Inaktivierung von msnO2 auf der genomischen DNA von S. bottropensis mittels DoubleCrossover.
amp = Ampicillin-Resistenzkassette; spec = Spectinomycin-Resistenzkassette
1. In S. bottropensis erfolgt im ersten Schritt, durch einen Double-Crossover, der Tausch des auf der genomischen-DNA
lokalisierten Gens msnO2 gegen die Spectinomycin-Resistenzkassette. Da das Cosmid Cos2∆O2∆int keine Integrase mehr
trägt (ausgetauscht gegen eine Ampicillin-Resistenzkassette) wird das Cosmid nicht in die genomische DNA von
S. bottropensis integriert.
2. Das Cosmid Cos2∆int wird, nach einigen Zellgenerationen, aus der Zelle geschleust, wodurch auch die AmpicillinResistenz verloren geht. Die so entstandene Mutante trägt das spec-Resistenzgen und weist somit immer noch eine
Spectinomycin-Resistenz auf.
Abbildung 5.11 TSB-Agaroseplatten nach erfolgter Inaktivierung von msnO2 in S. bottropensis.
Das auf der genomischen DNA von S. bottropensis lokalisierte Gen msnO2 wurde im Zuge eines erfolgreichen DoubleCrossovers gegen eine Spectinomycin-Resistenzkassette ausgetauscht, woraus eine Spectinomycin-Resistenz der
entsprechenden Klone resultierte. Das für diese Inaktivierung verwendete Cosmid Cos2∆O2∆int enthielt zusätzlich eine
Ampicillin-Resistenzkassette. Da das Cosmid nicht in die genomische DNA von S. bottropensis integriert werden konnte,
wurden nach einigen Zellgenerationen Klone isoliert in denen Cos2∆O2∆int nicht mehr enthalten war. Die resultierende
Mutante war somit gleichzeitig Spectinomycin-resistent (links) und Ampicillin-sensitiv (rechts).
94
Ergebnisse
Nach erfolgreichem Double-Crossover wurde die Inaktivierungsmutante S. bottropensis∆msnO2, wie
unter 4.12.10 beschrieben, in MYM-Medium und zum Vergleich in DNPM-Medium kultiviert,
extrahiert und zuletzt mittels HPLC untersucht. Parallel wurden der S. bottropensis Wildtyp sowie die
Komplementierungsmutante S. bottropensis∆msnO2 x pKO2R1 auf identische Weise kultiviert und
untersucht. Das verwendete Plasmid pkO2R1 enthielt das Gen msnO2 sowie das SARP-Regulatorgen
msnR1, welches für eine detektierbare Produktion von Mensacarcin-Intermediaten notwendig ist [8].
In MYM-Medium zeigte der Wildtyp erwartungsgemäß eine starke Produktion von Mensacarcin.
Gleichzeitig konnte keine Produktion von Rishirilid nachgewiesen werden, obwohl es sich bei
S. bottropensis auch um den natürlichen Produzenten dieses Naturstoffs handelt. Da S. bottropensis,
im Gegensatz zu der Mutante S. albus Cos2 das komplette Mensacarcin-Gencluster inklusive aller
Methyltransferasen enthält, wurde in diesem Fall Mensacarcin und nicht dessen Vorläufersubstanz
DDMM detektiert. In der Knockout-Mutante S. bottropensis∆msnO2 konnte keine MensacarcinProduktion mehr nachgewiesen werden. Somit wurde durch das Ausschalten von msnO2 die
komplette Biosynthese unterdrückt. Gleichzeitig wurde von dieser Mutante Rishirilid B produziert,
was auf eine Aktivierung des Rishirilid-Biosyntheseweges hindeutet. Durch eine Komplementierung
mit dem Plasmid pKO2R1, konnte die Mensacarcin-Produktion wiederhergestellt und die RishirilidProduktion komplett unterbunden werden (siehe Abbildung 5.12). Aufgrund der Ergebnisse erscheint
es plausibel, dass zwischen dem Mensacarcin- und dem Rishirilid-Biosyntheseweg gewisse
clusterübergreifende, regulatorische Interaktionen existieren müssen.
95
Ergebnisse
Abbildung
5.12
HPLC-Chromatogramme
(λ = 254 nm)
der
Rohextrakte
von
S. bottropensis WT(1),
S. bottropensis∆msnO2(2) und S. bottropensis∆msnO2 x pKO2R1(3) nach erfolgter Produktion in MYM-Medium, sowie die
UV-Absorptionsspektren von Mensacarcin und Rishirilid B.
Oben: Der S. bottropensis Wildtyp produziert viel Mensacarcin jedoch keine Rishirilid (1). Aufgrund der Inaktivierung von
msnO2 auf der genomischen DNA von S. bottropensis in der Mutante S. bottropensis∆msnO2, wurde die MensacarcinProduktion (violett unterlegt) komplett unterbunden. Stattdessen wurde Rishirilid B produziert (rot unterlegt) (2). Durch die
anschließende Komplementierung mit dem Plasmid pkO2R1 wurde die Mensacarcin-Produktion wiederhergestellt und die
Rishirilid B-Produktion gestoppt (3). Das Komplementierungsplasmid enthielt das msnO2-Gen und das msnR1-Regulatorgen.
Unten: UV-Absorptionsspektren von Mensacarcin und Rishirilid B.
Für Produktionen die zum Vergleich in DNPM-Medium durchgeführt wurden konnte ein identisches
Verhalten beobachtet werden (siehe Abbildung 5.13).
96
Ergebnisse
Abbildung
5.13
HPLC-Chromatogramme
(λ = 254 nm)
der
Rohextrakte
von
S. bottropensis WT(1),
S. bottropensis∆msnO2(2) und S. bottropensis∆msnO2 x pKO2R1(3) nach erfolgter Produktion in DNPM-Medium.
Der S. bottropensis Wildtyp produziert viel Mensacarcin jedoch kein Rishirilid (1). Aufgrund der Inaktivierung von msnO2 auf
der genomischen DNA von S. bottropensis in der Mutante S. bottropensis∆msnO2, wurde die Mensacarcin-Produktion
(violett unterlegt) komplett unterbunden. Stattdessen wurde Rishirilid B produziert (rot unterlegt) (2). Durch die
anschließende Komplementierung mit dem Plasmid pkO2R1 wurde die Mensacarcin-Produktion wiederhergestellt und die
Rishirilid B-Produktion gestoppt (3). Das Komplementierungsplasmid enthielt das msnO2-Gen und das msnR1-Regulatorgen.
5.2 Die Flavinreduktase MsnO3 aus dem MensacarcinGencluster
Das Mensacarcin-Gencluster enthält drei Flavin-abhängige Luciferase-ähnliche Monooxygenasen
(LLM), allerdings nur eine Flavinreduktase, welche von dem Gen msnO3 kodiert wird. Die
Zusammenarbeit des entsprechenden Enzyms MsnO3 mit der LLM MsnO8 im Rahmen eines
Zweikomponentensystems von Monooxygenase und Reduktase (siehe Kapitel 2.2.4) konnte zuvor
von Sarah Maier in ihrer Dissertation nachgewiesen werden [168]. Des Weiteren wurde eine
vergleichbare Abhängigkeit von der MsnO3-Aktivität auch für die beiden anderen LLM des
Mensacarcin-Genclusters MsnO2 und MsnO4 postuliert [168]. Das Monomer der Flavinreduktase
MsnO3 besteht aus 178 Aminosäuren und besitzt ein Molekulargewicht von 19 kDa. Des Weiteren
besitzt es vermutlich strukturelle Ähnlichkeit mit Gra-orf34, einer Flavinreduktase aus dem
Granaticin Biosynthesecluster [169][3]. Eine BLAST-Analyse ergab eine hohe Ähnlichkeit zu weiteren,
vor allem in Streptomyceten bereits annotierten Flavinreduktasen sowie zu hypothetischen
Proteinen mit potentieller Flavinreduktase-Aktivität. Beispiele sind die Flavoprotein-Oxidoreduktase
aus Streptomyces acidiscabiens und ein hypothetisches Protein aus Streptomyces niveiscabiei
(vergleiche Abbildung 5.14). Die zehn Proteine mit der höchsten Übereinstimmung zu MsnO3 in der
durchgeführten BLAST-Analyse wurden zusätzlich mithilfe der Jalview Software und unter
97
Ergebnisse
Verwendung der BLOSUM62-Substitutionsmatrix in Form eines phylogenetischen Baumes
systematisiert (siehe Abbildung 5.15).
Abbildung 5.14 Ergebniss der BLAST-Analyse für MsnO3.
Die BLAST-Analyse ergab eine hohe Übereinstimmung zu bereits in anderen Streptomyceten annotierten Flavinreduktasen
sowie zu Proteinen mit hypothetischer Flavinreduktase-Aktivität.
Abbildung 5.15 Phylogenetischer Baum von MsnO3.
Zur Erstellung des Baumes wurden die Aminosäuresequenz von MsnO3 sowie die Sequenzen der zehn besten Ergebnisse
der für MsnO3 durchgeführten BLAST-Analyse verwendet. Der Baum wurde mithilfe der BLOSUM62-Substitutionsmatrix
erstellt. Durch die angegebenen Zahlenwerte werden die Ähnlichkeiten der jeweiligen Äste zueinander ausgedrückt. Eine
niedrigere Zahl bedeutet einen geringeren Abstand zum nächsten Knotenpunkt und somit eine engere Verwandtschaft zu in
direkter Nachbarschaft liegenden anderen Ästen.
98
Ergebnisse
Des Weiteren wurde MsnO3 aufgrund der Blast-Analyse zu der Superfamilie der Pyridoxin 5'Phosphat Oxidase-ähnlichen und Flavinreduktase-ähnlichen Proteine zugeordnet. Diesen Enzymen
gemein sind die Bindung von FMN sowie die Katalyse von Redox-Reaktionen im Rahmen eines
Zweikomponentensystems und in Abhängigkeit vom Cofaktor NAD(P)H [170]. In dieser Arbeit sollte
MsnO3 aufgereinigt und für spätere in vitro Aktivitätsassays und Kristallisierungsexperimente
verwendet werden.
5.2.1 Testproduktionen
Die heterologe Expression und Aufreinigung von MsnO3 in E. coli wurde bereits von Sarah Maier im
Rahmen ihrer Doktorarbeit beschrieben [1]. Das von ihr erstellte Expressionsplasmid pET28a/O3
wurde im ersten Schritt in Proteinexpressionszellen transformiert und eine Testproduktion
durchgeführt, wodurch die Stabilität des Plasmids trotz längerer Lagerung nachgewiesen werden
sollte (siehe Kapitel 4.14.1). Die Produktion wurde in E. coli BL21 (DE3) codon plus RP-Zellen
durchgeführt. Wie von Sarah Maier zuvor beschrieben, wurden die Proteinproduktionszellen in LBMedium inokuliert und mit 0,5 mM IPTG induziert. Während der Testproduktionen wurden direkt bei
IPTG-Zugabe, sowie 1, 2 und 3 Stunden danach Proben gezogen und diese mittels SDS-PAGE
analysiert. Die hohe Produktionsrate von MsnO3 unter den oben beschriebenen Bedingungen konnte
bestätigt und reproduziert werden (siehe Abbildung 5.16).
Abbildung 5.16 SDS-PAGE Gel der Testproduktion von MsnO3 (19 kDa) in E. coli BL21 Codon Plus RP x pL1SL2-Zellen.
T0=Probe zum Zeitpunkt der Induktion mit IPTG; T1=Probe 1 h nach Induktion; T2=Probe 2 h nach Induktion; T3=Probe 3 h
nach Induktion; M=Marker
Die Produktion erfolgte in LB-Medium nach Anregung mit 0,5 mM IPTG bei 28 °C. Der Proteinproduktionsvektor pET28a
wurde verwendet. Die Bande bei ca. 19 kDa entspricht dem Protein MsnO3.
99
Ergebnisse
5.2.2 Heterologe Expression und Aufreinigung
Für den Zweck dieser Arbeit wurde die Methode der MsnO3-Aufreinigung aus der Doktorarbeit von
Sarah Maier übernommen [1]. Anstatt einer IPTG-induzierten Produktion in LB-Medium bei 28 °C
wurde jedoch Autoinduktionsmedium bei einer Schütteltemperatur von 18 °C über 56 h verwendet.
Die Verwendung des Autoinduktionsmediums begünstigt eine korrekte Proteinfaltung während der
Produktion [128]. Zuerst wurde das Proteinproduktionsplasmid pET28a/O3 in den Stamm E. coli BL21 Codon Plus RP x pL1SL2
eingebracht
und
die
Zellen
wie
oben
beschrieben
in
3 L
Autoinduktionsmedium kultiviert, wodurch das entsprechende Protein produziert wurde. Die Zellen
wurden geerntet und mittels French-Press und durch Zugabe von Lysozym aufgeschlossen.
Anschließend wurde der die zytosolischen Proteine enthaltende Überstand wie unter 4.14.6
beschrieben mittels Nickel-Affinitätschromatographie aufgereinigt. Zuerst wurden im Durchfluss alle
ungebundenen Proteine von der Säule gespült und anschließend mithilfe eines Waschschrittes mit
10 % Elutionspuffer B (50 mM Imidazol) möglichst alle unspezifisch an das Säulenmaterial
gebundenen Proteine entfernt. Zuletzt wurde mit einer Konzentration von 50 % Elutionspuffer B
(250 mM Imidazol) MsnO3 von der Säule eluiert. Eine anschließende Analyse des 50 %-Peaks mittels
SDS-PAGE zeigte, dass dieser das Protein MsnO3 enthielt (siehe Abbildung 5.17).
Abbildung 5.17 Ergebnis der Nickel-Affinitätschromatographie Aufreinigung von MsnO3.
Links: Elutionschromatogramm; In blau ist der Absorptionsverlauf während der Aufreinigung bei 280 nm dargestellt. Die
prozentuale Konzentration an Elutionspuffer B ist in rot dargestellt. Der bei einer Zugabe von 50 % Puffer B erscheinende
Peak enthält das Protein MsnO3.
Rechts: SDS-PAGE Gel mit der aufgetragenen 50 % Elutionspuffer B-Fraktion. Die Proteinbande bei ca. 19 kDa entspricht
MsnO3.
Im nächsten Schritt wurde der bei Zugabe von 50 % Elutionspuffer B eluierte Peak gesammelt,
aufkonzentriert und mithilfe einer Gelfiltration weiter wie unter 4.14.7 beschrieben aufgereinigt.
Dadurch konnten zusätzlich kleinere Verunreinigungen sowie aggregiertes Protein aus der Probe
entfernt werden. Nach dem Ausschlussvolumen von ca. 40 mL wurde ein Peak detektiert, der dem
100
Ergebnisse
aggregierten Protein entsprach. Ein weiterer Peak bei 84 mL zeigte in der späteren SDS-PAGE Analyse
eine saubere Bande bei einer Größe von etwa 19 kDa und konnte somit als MsnO3 identifiziert
werden (siehe Abbildung 5.18). Aufgrund des hohen Reinheitsgrades konnte die so erhaltene Probe
für spätere in vitro Aktivitätsassays und Kristallisierungsexperimente verwendet werden. Je nach
Experiment wurde die MsnO3-Proteinlösung auf 4-12 mg/mL aufkonzentriert und entweder direkt
verwendet oder mit flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 °C bis zur Verwendung gelagert.
Abbildung 5.18 Ergebnis der Gelfiltrationschromatographie von MsnO3.
Links: Elutionschromatogramm; In blau ist der Absorptionsverlauf während der Aufreinigung bei 280 nm dargestellt.
Rechts: SDS-PAGE Gel mit aufgetragener Fraktion des Peaks bei ca. 84 mL. Die Saubere Bande bei ca. 19 kDa entspricht dem
Protein MsnO3.
5.2.3 In vitro Assay zur Untersuchung der Aktivität von MsnO3
Wie zuvor von Sarah Maier gezeigt wurde, kann MsnO3 FMN reduzieren. Dies kann mittels eines
in vitro Assays nachgewiesen werden [1]. Wird FMN reduziert, erfolgt gleichzeitig eine Oxidation des
sich im Ansatz befindenden NADH. Die Messung der Aktivität erfolgt UV-metrisch bei 340 nm, da bei
dieser Wellenlänge nur die reduzierte aber nicht die oxidierte Form von NADH ein
Absorptionsmaximum besitzt. Eine Abnahme der Absorption beweist, dass MsnO3 aktiv ist. Die
aufgereinigte MsnO3-Proteinlösung (siehe Kapitel 5.2.2) wurde auf eine Konzentration von 4 mg/mL
aufkonzentriert und für den Assay verwendet. Im Vergleich zur Negativkontrolle, die kein MsnO3
enthielt, konnte für die Probe mit zugegebenem Protein eine eindeutige Abnahme der UVAbsorption gemessen werden (siehe Abbildung 5.19). Somit konnte die Aktivität von MsnO3
nachgewiesen werden und das Protein für weiter in vitro Assays in Kombination mit MsnO4
verwendet werden (vergleiche 5.3.4).
101
Ergebnisse
Abbildung 5.19 In vitro Aktivitätsassay mit MsnO3 [1].
+
Wird FMN reduziert kommt es gleichzeitig zur Oxidation des sich auch im Ansatz befindenden NAD zu NADH. Dies
wiederum führt zu einer Abnahme der Absorption bei 340 nm. Im Vergleich zur Negativkontrolle, die kein MsnO3 enthielt,
konnte für den Assay ein eindeutiger Abfall der Absorption festgestellt werden, was wiederum die Aktivität von MsnO3
beweist.
5.2.4 Kristallisierungsexperimente mit MsnO3
Die frisch aufgereinigte MsnO3-Proteinlösung (siehe Kapitel 5.2.2) wurde jeweils zu einer
Konzentration von 5 mg/mL bzw. 8 mg/mL aufkonzentriert und sofort weiter verwendet. Im ersten
Schritt wurden allgemeine Screening-Experimente mit unterschiedlichen Kristallisationspuffern
durchgeführt. Sobald erste Kristallisationskeime detektiert wurden, folgte die Optimierung der
Bedingungen in Fine-Screening-Experimenten (siehe Kapitel 4.14.12). Auf die Weise konnten erste
Proteinkristalle hergestellt werden (siehe Abbildung 5.20). Diese waren für eine Strukturaufklärung
allerdings zu klein.
Abbildung 5.20 Proteinkristalle von MsnO3.
In den Kristallisierungsexperimenten konnten für mehrere Pufferzusammensetzungen Proteinkristalle von MsnO3 isoliert
werden. Für weiterführende Experimente waren diese jedoch nicht groß genug.
102
Ergebnisse
5.2.5 Das bioinformatische Homologiemodell von MsnO3
Mithilfe der Software I-TASSER wurden Homologiemodelle für das an der Biosynthese von
Mensacarcin beteiligte Protein MsnO3 erstellt. Basierend auf der Aminosäuresequenz des Proteins
durchsucht I-TASSER Struktur-Datenbanken auf der Suche nach möglichst ähnlichen, bereits
annotierten Teilstrukturen. Anschließend werden diese zu einem hypothetischen Proteinmodell
zusammengeführt und zuletzt mit bekannten Proteinstrukturen der Protein Datenbank (PDB)
abgeglichen. Die Güte der von I-TASSER vorgeschlagenen Modelle lässt sich anhand der angegebenen
C- und TM-Werte beurteilen. Der C-Wert liegt normalerweise im Bereich von -5 bis 2 und gibt die
statistische Signifikanz an. Je höher der Wert, desto besser ist das vorgeschlagene Model. Der TMWert gibt die relative Ähnlichkeit des erstellten Homologiemodells zu bekannten Templates an und
liegt im Bereich von 0 bis 1. Damit Proteinstrukturen als ähnlich gelten, muss der TM-Wert
mindestens 0,5 oder mehr betragen [171][172][149][173].
Anhand der Aminosäuresequenz von MsnO3 wurde durch I-TASSER die statistisch wahrscheinlichste
Sekundärstruktur des Proteins bestimmt (siehe Abbildung 5.21). Die mit einem H beschrifteten
Aminosäuren sind Teil einer Helix. Können Aminosäuren wiederum zu einem „Sheet“ (Faltblatt)
zugeordnet werden, sind sie mit einem S gekennzeichnet. Ein C deutet auf „Coils“ hin, aus denen
sogenannte Loop-Strukturen in Proteinen aufgebaut sind [174].
Abbildung 5.21 Die von I-TASSER vorgeschlagene Anordnung der Sekundärstruktur von MsnO3.
Für das mithilfe von I-TASSER hergestellte Homologiemodell von MsnO3 (siehe Abbildung 5.22 und
Abbildung 5.23) konnten ein C-Wert von 0,87 und ein TM-Wert von 0,83±0,08 bestimmt werden.
Auffällig ist die ausschließlich aus β-Faltblättern ausgebildete „fassartige“ Struktur, die einen großen
Teil des gesamten Proteins darstellt. Die Übereinstimmung des MsnO3-Modells mit annotierten
Proteinstrukturen war mit einer Teilstruktur der putativen Oxidoreduktase SMa0793 aus
Sinorhizobium meliloti 1021 (PDB-ID: 3RH7), einer putativen Oxidoreduktase aus Rickettsia felis (PDBID: 4L82) der Flavinreduktase-ähnlichen Komponente der Nitrilotriacetat-Monooxygenase aus
Mykobakterium thermoresistibile (PDB-ID: 3NFW) und der NADH:FAD Oxidoreduktase SgcE6 aus
103
Ergebnisse
Streptomyces globisporus C-1027 (PDB-ID: 4HX6) am größten. Anhand der Übereinstimmung mit
bekannten Proteinstrukturen konnte MsnO3 der EC-Klasse der Monooxygenasen/Oxidoreduktasen
zugeordnet werden. Das EC- (engl. Enzyme Commission) Klassifikationssystem ordnet Enzyme
anhand der von ihnen katalysierten Reaktionen unterschiedlichen Gruppen zu. Auch hier konnte die
größte Übereinstimmung mit einer Oxidoreduktase, der CobR aus Brucella melitensis (PDB-ID: 3CB0)
festgestellt werden. Zusätzlich erfolgte eine Zuordnung des vorgeschlagenen Homologiemodells nach
GO- (Gene Ontology) Normen. Die Gene Ontology ist eine internationale Initiative zur
Vereinheitlichung der Nomenklatur in den Biowissenschaften unter anderem bemüht Proteinen
spezielle, universelle GO-Termini zu vergeben. Jede Zuordnung wird dann mit einem GO-Wert
versehen, welcher zwischen 0 und 1 liegt. Ein höherer Wert entspricht einer genaueren Zuordnung.
[175]. Dem Protein MsnO3 wurden mit diesem System die molekulare Funktion einer FMNbindenden Flavinreduktase (GO-Wert 0,98) und der biologische Prozess der Oxidoreduktion (GOWert 0,64) zugeordnet.
Abbildung 5.22 Homologiemodell der Flavinreduktase MsnO3 (Ansicht von oben).
Das Modell wurde mithilfe der Software I-TASSER erstellt und anschließend in Pymol bearbeitet. Die β-Faltblätter sind dabei
in rot und die α-Helices in blau dargestellt.
104
Ergebnisse
Abbildung 5.23 Homologiemodell der Flavinreduktase MsnO3 (Seitenansicht).
Das Modell wurde mit Hilfe der Software I-TASSER erstellt und anschließend in Pymol bearbeitet. Die β-Faltblätter sind
dabei in rot und die α-Helices in blau dargestellt. Die β-Faltblätter bilden im zentralen Teil des Models eine „fassartige“
Struktur aus.
Durch einen Vergleich mit ähnlichen, bereits annotierten Proteinen konnten die AminosäurePositionen bestimmt werden, die höchstwahrscheinlich an der Bindung des Cofaktors FMN beteiligt
sind (siehe Tabelle 5.1.). Dieselben sind in Abbildung 5.24 rot markiert. Die Cofaktor-Bindetasche
scheint peripher zu der „fassartig“ angeordneten β-Faltblatt-Struktur zu liegen.
Abbildung 5.24 Aminosäuren die an der Cofaktor-Bindung in MsnO3 beteiligt sein könnten.
Durch den Vergleich mit ähnlichen, bereits annotierten Proteinen konnten die Aminosäure-Positionen bestimmt werden,
die höchstwahrscheinlich an der Bindung von FMN beteiligt sind. Diese sind in der Abbildung rot markiert und in Tabelle 5.1
aufgelistet.
105
Ergebnisse
Tabelle 5.1 Höchstwahrscheinlich an der Cofaktor-Bindung beteiligte Aminosäuren des Proteins MsnO3.
Position
Aminosäure
Position
Aminosäure
39
Lysin (K)
65
Glutamin (Q)
41
Leucin (L)
66
Threonin (T)
42
Threonin (T)
90
Arginin (R)
43
Serin (S)
92
Phenylalanin (F)
44
Serin (S)
93
Alanin (A)
45
Alanin (A)
94
Threonin (T)
59
Cystein (C)
95
Lysin (K)
60
Valin (V)
99
Lysin (K)
61
Asparaginsäure (D)
158
Tyrosin (Y)
64
Serin (S)
163
Tyrosin (Y)
5.3 MsnO4-eine Luciferase-ähnliche Monooxygenase aus dem
Mensacarcin-Gencluster
Im Biosynthese Gencluster von Mensacarcin konnten drei Gene gefunden werden die für Luciferaseähnliche Monooxygenasen kodieren (msnO2, msnO4 und msnO8). Für das korrespondierende
Protein MsnO4 wurden multiple Funktionen vorgeschlagen. Es könnte für die Einführung der
Epoxidgruppe im Ringsystem des Naturstoffs verantwortlich sein. Des Weiteren wäre die Einführung
von einer oder zwei Hydroxylgruppen am Ring möglich (vergleiche die postulierte Biosynthese von
Mensacarcin, Abbildung 2.2) [168]. Darüber hinaus wurde für MsnO4 eine Abhängigkeit von der an
der Mensacarcin-Biosynthese beteiligten Flavinreduktase MsnO3 postuliert [1]. Das Monomer der
Luciferase-ähnlichen Monooxygenase MsnO4 hat eine Größe von 359 Aminosäuren und eine
Molekularmasse von 39,4 kDa. Des Weiteren besitzt es vermutlich große strukturelle Ähnlichkeit zur
A-Kette der Luciferase aus Vibrio harveyi [3]. Die Durchführung einer BLAST-Analyse ergab eine hohe
Similarität zu anderen, vor allem in Streptomyceten bereits annotierten Luciferasen und Luciferaseähnlichen
Proteinen,
wie
zum
Beispiel
den
Luciferasen
aus
Streptomyces nivieiscabiei,
Streptomyces acidiscabies und Streptomyces griseus (sieheAbbildung 5.25). Die zehn Proteine mit der
höchsten Übereinstimmung zu MsnO4 in der durchgeführten BLAST-Analyse wurden zusätzlich in
Form eines phylogenetischen Baumes mithilfe der Jalview Software unter Verwendung der
BLOSUM62-Substitutionsmatrix systematisiert (siehe Abbildung 5.26). Des Weiteren wurde MsnO4
aufgrund der Blast-Analyse der Superfamilie der Flavin-abhängigen Monooxygenasen zugeordnet. Zu
dieser
Gruppe
gehören
außerdem
Alkansulfonat-Monooxygenasen,
Nitrilotriacetat-
Monooxygenasen, Alkanal-Monooxygenasen und Tatrahydromethanopterin-Reduktasen [170]. Im
106
Ergebnisse
Rahmen dieser Arbeit sollte MsnO4 aufgereinigt und für spätere in vitro Aktivitätsassays und
Kristallisierungsexperimente verwendet werden.
Abbildung 5.25 Ergebnisse der BLAST-Suche für MsnO4.
Das Ergebnis der BLAST-Suche ergab eine hohe Ähnlichkeit von MsnO4 zu unterschiedlichen, vor allem aus Streptomyceten
bekannten Luciferasen.
Abbildung 5.26 Phylogenetischer Baum von MsnO4.
Zur Erstellung des Baumes wurden die Aminosäuresequenz von MsnO4 sowie die Sequenzen der zehn besten Ergebnisse
der für MsnO4 durchgeführten BLAST-Suche verwendet. Der Baum wurde mit Hilfe der BLOSUM62-Substitutionsmatrix
erstellt. Durch die angegebenen Zahlenwerte werden die Ähnlichkeiten der jeweiligen Äste zueinander ausgedrückt. Eine
niedrigere Zahl bedeutet einen geringeren Abstand zum nächsten Knotenpunkt und somit eine engere Verwandtschaft zu in
direkter Nachbarschaft liegenden, anderen Ästen.
107
Ergebnisse
5.3.1 Testexpressionen und Methodenoptimierung
Mit dem Ziel MsnO4 aufzureinigen wurde das korrespondierende Gen msnO4 in die
Proteinproduktionsvektoren pET21a und pET28a kloniert und anschließend in die Stämme
E. coli BL21 (DE3) pLysS, E. coli BL21Star™ (DE3), E. coli BL21 (DE3) codon plus RP strain und E. coli
Rosetta™ 2 transformiert. Im nächsten Schritt wurden Testproduktionen in den verschiedenen
Zelllinien durchgeführt (siehe Kapitel 4.14.1) um optimale Bedingungen für die MsnO4-Produktion zu
finden. Hierfür wurde LB-Medium verwendet und die Produktion jeweils durch Zugabe von 0,1 mM
oder 0,5 mM IPTG induziert. Während den Testproduktionen wurden direkt bei IPTG-Zugabe sowie 1,
2, 3 und 4 Stunden später Proben gezogen und diese mittels SDS-PAGE analysiert. Die beste
Produktion wurde bei 28 °C in pET21a E. coli Rosetta TM Zellen nach einer Induktion mit 0,1 mM IPTG
erzielt (siehe Abbildung 5.27).
Abbildung 5.27 SDS-PAGE Gel der Testproduktion von MsnO4 (39,4 kDa) in E. coli Rosetta TM Zellen.
T0 = Probe zum Zeitpunkt der Induktion mit IPTG; T1 = Probe 1 h nach Induktion; T2 = Probe 2 h nach Induktion; T3 = Probe 3 h
nach Induktion; T4 = Probe 4 h nach Induktion; M=Marker.
Die Produktion wurde in LB-Medium nach Anregung mit 0,1 mM IPTG bei 28 °C durchgeführt. Der Proteinproduktionsvektor
pET21a wurde verwendet. Die Bande bei ca. 40 kDa entspricht dem Protein MsnO4.
Nach erfolgreicher Testproduktion wurde MsnO4 auf dieselbe Art in einem 1L Ansatz produziert und
anschließend aufgereinigt (siehe 4.14.6 und 4.14.7). Mit den Standardmethoden konnte keine
ausreichende Proteinmenge isoliert werden, da MsnO4 unlösliche Aggregate bildete. Zur Erhöhung
der Ausbeute wurde eine Methodenoptimierung vorgenommen. Hierbei wurden verschiedene
zusätzliche Pufferbestandteile, Produktionstemperaturen, pH-Werte und Medien verwendet. Des
Weiteren wurde die Zugabe von Betain, Dithiothreitol, und Octylgucosid zu den Puffern getestet,
wodurch jedoch die Bildung von unlöslichen Proteinaggregaten nicht verhindert werden konnte. Die
beste Produktion und Aufreinigung von MsnO4 wurde bei Verwendung von Autoinduktionsmedium
bei 18 °C mit einer NaCl-Konzentration von 100 mM und einem Puffer pH-Wert von 8,0 erzielt. Die
während der Methodenoptimierung getesteten Parameter sind in Tabelle 5.2 aufgelistet.
108
Ergebnisse
Tabelle 5.2 Methodenoptimierung der Aufreinigung von MsnO4.
Modifikation
Beschreibung
Zugabe von Betain [176]
Osmolyt; kann zu verbesserter Proteinfaltung führen
Zugabe von Dithiothreitol (DTT) [113]
Reduktionsmittel; verhindert Bildung von Disulfidbrücken
Zugabe von Octylglucosid [177]
pH-Wert-Optimierung der Puffer (6,8-8,0)
[113]
Produktionstemperatur 28 °C  18 °C [113]
NaCl-Konzentration 1 M-100 mM [176]
LB-Medium  Autoinduktionsmedium [128]
Nicht-denaturierende Detergenz; kann Proteinlöslichkeit
verbessern
Die Stabilität der Proteinfaltung ist pH-abhängig
Proteinaggregation kann durch eine tiefere
Produktionstemperatur vermindert werden
Die Ionenkonzentration der Puffer kann die Proteinstabilität
beeinflussen
Die Art der Induktion der Proteinproduktion kann Einfluss auf
die korrekte Proteinfaltung haben
5.3.2 Heterologe Produktion und Aufreinigung
Nach erfolgreicher Methodenoptimierung wurde für die finalen Experimente das Gen msnO4 in den
Vektor pET21a kloniert und die Produktion in E. coli Rosetta TM Zellen bei 18 °C über 56 h
durchgeführt. Dabei wurden jeweils 3 L-Ansätze von ZYM-5052 Autoinduktionsmedium verwendet
(siehe Tabelle 4.23). Für die Proteinaufreinigung wurden die Zellen geerntet und mittels French-Press
und durch Zugabe von Lysozym-Zugabe aufgeschlossen. Anschließend wurde der die freien
zytosolischen Proteine enthaltende Überstand mittels Nickel-Affinitätschromatographie aufgereinigt
(siehe 4.14.6). Zuerst wurden im Durchfluss alle ungebundenen Proteine von der Säule gespült und
anschließend durch einen Waschschritt mit 10 % Elutionspuffer B (50 mM Imidazol) möglichst alle
unspezifisch an das Säulenmaterial gebundenen Proteine entfernt. Zuletzt wurde mit einer
Konzentration von 50 % Elutionspuffer B (250 mM Imidazol) MsnO4 von der Säule eluiert. Eine
anschließende Analyse des 50 %-Peaks mittels SDS-PAGE zeigte, dass dieser das Protein MsnO4
enthielt (siehe Abbildung 5.28).
109
Ergebnisse
Abbildung 5.28 Ergebnis der Nickel-Affinitätschromatographie-Aufreinigung von MsnO4.
Links: Elutionschromatogramm; In blau ist der Absorptionsverlauf während der Aufreinigung bei 280 nm dargestellt. Die
prozentuale Konzentration an Elutionspuffer B ist in rot dargestellt. Der bei einer Zugabe von 50 % Puffer B erscheinende
Peak (*) enthält das Protein MsnO4.
Rechts: P = Pellet nach dem Zellaufschluss; DF = Durchfluss-Fraktion; 10 % = Waschschritt mit 10 % Puffer B;
Ergebnis des SDS-PAGE Gels nach durchgeführter Nickel-Affinitätschromatographie. Die mit * markierte Bande entspricht
dem Peak bei einer Konzentration von 50 % Elutionspuffer B im Chromatogramm. Die Proteinbande bei ca. 40 kDa ist auf
MsnO4 zurückzuführen.
Im nächsten Schritt wurde die 50 % Elutionspuffer B-Fraktion aufkonzentriert und mithilfe einer
Gelfiltration weiter aufgereinigt (siehe 4.14.7). Dadurch konnten noch in der Probe enthaltene
Verunreinigungen sowie aggregiertes Protein aus der Probe entfernt werden. Nach dem
Ausschlussvolumen von ca. 40 mL wurde ein Peak detektiert, der dem aggregierten Protein
entsprach. Ein weiterer Peak bei 78 mL zeigte in der späteren SDS-PAGE Analyse eine saubere Bande
bei einer Größe von etwa 40 kDa und konnte somit als MsnO4 identifiziert werden (siehe Abbildung
5.29). Aufgrund des hohen Reinheitsgrades konnte die so erhaltene Probe für spätere in vitro
Aktivitätsassays und Kristallisierungsexperimente verwendet werden. Je nach Experiment wurde die
MsnO4-Proteinlösung auf 4-10 mg/mL aufkonzentriert und entweder direkt verwendet oder mit
flüssigem Stickstoff eingefroren und bei -80 °C bis zur Verwendung gelagert.
110
Ergebnisse
Abbildung 5.29 Ergebnis der Gelfiltrationschromatographie von MsnO4.
Links: Elutionschromatogramm; In blau ist der Absorptionsverlauf während der Aufreinigung bei 280 nm dargestellt. Der
Peak bei ca. 78 mL entspricht dem Protein MsnO4.
Rechts: SDS-PAGE Gel mit aufgetragener MsnO4-Probe nach erfolgter Gelfiltration. Bei einer Größe von ca. 40 kDa ist die
Proteinbande von MsnO4 zu erkennen.
5.3.3 In vitro Assay mit MsnO4 und FGD/F420
Nach dem Knockout von msnO4, welcher von Katharina Probst in ihrer Doktorarbeit durchgeführt
wurde, konnte das native Substrat des korrespondierenden Proteins MsnO4 nicht hergestellt
werden. Stattdessen wurde in der Mutante ein mit einem Mycothiol-Rest substituiertes stabiles
Biosynthese-Zwischenprodukt (Msn-KP3) isoliert [8]. Solche Mycothiol-Addukte können häufig,
aufgrund von Entgiftungsmechanismen die in Streptomyceten vorkommen, beobachtet werden [1].
Da sich auch bei weiteren Versuchen das natürliche Substrat von MsnO4 nicht produzieren lies,
wurden die anschließend beschriebenen in vitro Assays mit den strukturell ähnlichen Substanzen 1Methoxy-3-methyl-2-pent-2-enyl-anthraquinon und 1,4-Dihydroanthraquinon durchgeführt. Für den
Assay mit FGD/F420 wurde das zuvor von Sarah Maier aufgereinigte aktive FGD-Protein (F420abhängige Glucose-6-phosphat Dehydrogenase) verwendet [1]. Die Durchführung erfolgte gemäß der
Beschreibung in Kapitel 4.14.11. Glucose-6-phosphat wird durch das Enzym FGD zu 6Phosphogluconolacton umgesetzt, wodurch F420 zu F420H2 reduziert und MsnO4 somit zur Verfügung
gestellt wird. Wenn MsnO4 ein F420-abhängiges Enzym wäre, müsste es nun zur Umsetzung des
jeweils zugegebenen Substrats kommen. Die hergestellten Reaktionsansätze (siehe 4.5.10) wurden
bei 37 °C inkubiert und anschließend mittels HPLC/MS analysiert (Methode msnO4). Es wurde für
keines der beiden verwendeten potentiellen Substrate von MsnO4 eine Umsetzung detektiert. In
Abbildung 5.30 ist das HPLC-Chromatogramm nach Zugabe von 1,4-Dihydroantrachinon dargestellt.
Als Vergleich wurde der Assay ohne Zugabe von MsnO4, sowie zusätzlich die in MeOH gelöste
Reinsubstanz analysiert. Ein Grund für das Ergebnis könnte sein, dass die ausgewählten Substrate
111
Ergebnisse
nicht von MsnO4 umgesetzt werden konnten. Des Weiteren könnte auch F420 nicht der tatsächliche
Cofaktor von MsnO4 sein.
Abbildung 5.30 HPLC Chromatogramme der Extrakte des Enzymassays mit MsnO4, FGD und 1,4-Dihydroantrachinon als
Substrat, λ = 254 nm.
1) Assay mit MsnO4, FGD und 1,4-Dihydroanthrachinon; 2) Assay ohne MsnO4-Zugabe; 3) Reinsubstanz 1,4Dihydroantrachinon.
Sowohl der Assay als auch die Negativkontrolle ohne MsnO4 (2) zeigten in allen Fällen dasselbe HPLC-Ergebnis wie die in
MeOH gelöste Reinsubstanz (3). 1,4-Dihydroantrachinon konnte im Assay somit nicht umgesetzt werden.
5.3.4 In vitro Assay mit MsnO4, MsnO3 und FMN
Bei dem zuvor beschriebenen Enzym MsnO8 handelt es sich um eine Luciferase-ähnlich
Monooxygenase aus dem Mensacarcin-Gencluster. Es ist in seiner Aktivität sowohl vom Cofaktor
FMN als auch von der Flavinreduktase MsnO3 abhängig [19]. Aufgrund der strukturellen Ähnlichkeit
zu MsnO8 wurde für MsnO4 ein vergleichbarer, FMN-abhängiger Mechanismus postuliert. Auch in
diesem Fall wurde angenommen, dass das Protein MsnO3 als Reaktionspartner vonnöten ist, da es
die einzige Flavinreduktase des Clusters darstellt [168]. In vitro Assays wurden mit den frisch
aufgereinigten Proteinen MsnO3 und MsnO4, sowie den in Tabelle 4.40 aufgelisteten alternativen
Substraten von MsnO4 durchgeführt. Die Aktivität von MsnO3 wurde zuvor, wie in Kapitel 5.2.3
beschrieben in einem separaten in vitro Assay nachgewiesen. Die Reaktionsansätze des in vitro Assays
wurden bei 37 °C inkubiert und danach mittels HPLC/MS analysiert (Methode msnO4). Das
Experiment wurde dreifach wiederholt. Für keines der beiden verwendeten potentiellen Substrate
von MsnO4 konnte eine Umsetzung nachgewiesen werden. Zum Vergleich wurden Ansätze, denen
entweder nur MsnO3 oder MsnO4 zugegeben wurde sowie Proben die kein Substrat enthielten,
vermessen. Auch in diesem Fall könnte das Ergebnis dadurch zu Stande gekommen sein, dass die
ausgewählten Substrate nicht von MsnO4 umgesetzt werden können oder weil FMN und MsnO3
nicht für die Aktivität von MsnO4 benötigt werden. Die Ergebnisse der Assays mit 1,4Dihydroantrachinon und 1-Methoxy-3-methyl-2-pent-2-enylantrachinon sind in Abbildung 5.31 und
Abbildung 5.32 dargestellt. Im Fall des Assays mit 1,4-Dihydroantrachinon konnten die Peaks bei 24
und 25 Minuten dem Substrat sowie einem Abbauprodukt zugeordnet werden. Auch der Peak bei
31 Minuten in den Ergebnissen des Assays mit 1-Methoxy-3-methyl-2-pent-2-enylantrachinon
entsprach dem Substrat. In beiden Experimenten konnte zusätzlich ein weiterer Peak bei knapp
112
Ergebnisse
23 Minuten detektiert werden, der allerdings auch vorhanden war wenn kein Substrat zugegeben
wurde. Unterschiede in dessen Höhe resultieren ausschließlich aus einer Abweichung der Skala in
den entsprechenden Chromatogrammen.
Abbildung 5.31 HPLC Diagramme der Extrakte des Enzymassays mit MsnO4, MsnO3 und 1,4-Dihydroantrachinon als
Substrat, λ = 254 nm.
1) Assay mit MsnO4, MsnO3 und 1,4-Dihydroanthrachinon; 2) Assay ohne MsnO4; 3) Reinsubstanz 1,4-Dihydroantrachinon;
4) Assay ohne MsnO3; 5) Assay ohne 1,4-Dihydroanthrachinon.
Die Assays wurden wie unter 5.3.4 beschrieben durchgeführt. Es konnte keine Umsetzung des Substrats festgestellt
werden. Die Banden die der Reinsubstanz entsprechen sind blau hinterlegt. Der Peak bei knapp 23 Minuten steht nicht im
Zusammenhang mit einer Umsetzung des Substrats.
Abbildung 5.32 HPLC Diagramme der Extrakte des Enzymassays mit MsnO4, MsnO3 und 1-Methoxy-3-methyl-2-pent-2enylantrachinon als Substrat, λ = 254 nm.
1) Assay mit MsnO4, MsnO3 und 1-Methoxy-3-methyl-2-pent-2-enylanthrachinon; 2) Assay ohne MsnO4; 3) Reinsubstanz
1-Methoxy-3-methyl-2-pent-2-enylantrachinon; 4) Assay ohne MsnO3
5) Assay ohne 1-Methoxy-3-methyl-2-pent-2-enylanthrachinon.
Die Assays wurden wie unter 5.3.4 beschrieben durchgeführt. Es konnte keine Umsetzung des Substrats festgestellt
werden. Die Bande, die der Reinsubstanz entspricht ist grün hinterlegt. Der Peak bei knapp 23 Minuten steht nicht im
Zusammenhang mit einer Umsetzung des Substrats.
113
Ergebnisse
5.3.5 Kristallisierungsexperimente mit MsnO4
Die aufgereinigte MsnO4-Proteinlösung (siehe Kapitel 5.3.2) wurde jeweils zu einer Konzentration
von 5 mg/mL und 10 mg/mL aufkonzentriert und sofort weiterverwendet. Zuerst wurden allgemeine
Screening-Experimente durchgeführt (vergleiche Kapitel 4.14.12). Darauffolgend wurden die
Bedingungen der Kristallisierung weiter in Fine-Screening-Experimenten optimiert. Es konnten so
erste Proteinkristalle detektiert werden (siehe Abbildung 5.33). Diese waren allerdings für eine
weitere Strukturaufklärung nicht groß genug.
Abbildung 5.33 Proteinkristalle von MsnO4.
In den Kristallisierungsexperimenten konnten erste MsnO4-Kristalle isoliert werden. Für weiterführende Experimente
waren diese allerdings nicht groß genug.
5.3.6 Das bioinformatische Homologiemodell von MsnO4
Mit Hilfe der der Software I-TASSER wurden Homologiemodelle für das an der Biosynthese von
Mensacarcin beteiligte Protein MsnO4 erstellt. Basierend auf der Aminosäuresequenz des Proteins
durchsucht I-TASSER Struktur-Datenbanken auf der Such nach möglichst ähnlichen, bereits
annotierten Teilstrukturen. Anschließend werden diese zu einem wahrscheinlichen, hypothetischen
Proteinmodell zusammengeführt und zuletzt mit bekannten Proteinstrukturen der Protein
Datenbank (PDB) abgeglichen. Die Güte der von I-TASSER vorgeschlagenen Modelle lässt sich anhand
der angegebenen C- und TM-Werte beurteilen. Deren Bedeutung wurde bereits in Kapitel 5.2.5.
genauer erläutert [171][172][149][173].
Anhand der Aminosäuresequenz von MsnO4 wurde durch I-TASSER im ersten Schritt die statistisch
wahrscheinlichste Sekundärstruktur des Proteins bestimmt (siehe Abbildung 5.34). Ein hoher Conf.
Score (engl. „confidence score“) deutet dabei auf eine sicherere Vorhersage der jeweiligen Position
hin.
114
Ergebnisse
Abbildung 5.34 Die von I-TASSER vorgeschlagene Anordnung der Sekundärstruktur von MsnO4.
Das im Rahmen der I-TASSER Auswertung erstellte Homologiemodell der Luciferase-ähnlichen
Monooxygenase MsnO4 ist in Abbildung 5.35 dargestellt. Für die Struktur wurden ein C-Wert von
0,01 und ein TM-Wert von 0,71±0,11 ermittelt. Es ist eine TIM-Barrel-ähnliche Anordnung der αHelices und der β-Faltblätter zu erkennen. Ein solches TIM-Barrel besteht normalerweise aus acht
parallelen β-Faltblättern die über acht α-Helices miteinander verbunden sind [178]. Allerdings sind
im Fall des Modells von MsnO4 nur sechs und nicht acht β-Faltblätter zu finden. Die größte
strukturelle Ähnlichkeit zeigte MsnO4 zu der bakteriellen Luciferase aus Vibrio harveyi (PDB-ID: 3FGC,
1LUC), der Alkanal-Monooxygenase aus Vibrio harveyi (PDB-ID: 1BSL), der Monooxygenase aus
Agrobacterium tumefaciens
(PDB-ID:
2I7G)
und
der
Alkan-Monooxygenase
LadA
aus
Geobacillus thermodenitrificans. Anhand der Übereinstimmung mit bekannten Proteinstrukturen
konnte MsnO4 der EC Klasse der FMN-abhängigen Alkanal-Monooxygenasen zugeordnet werden
(vergleiche Kapitel 5.2.5.). Auch in diesem Fall wurde die größte Übereinstimmung mit der
bakteriellen Luciferase aus Vibrio harveyi (PDB-ID: 1XKJ) festgestellt. Dem Homologiemodell von
MsnO4 wurde im Rahmen der I-Tasser Analyse zusätzlich die molekulare Funktion einer FMNgekoppelten Alkanal-Monooxygenase (GO-Wert 0,7), der biologische Prozess der Biolumineszenz
(GO-Wert 0,7) und die zelluläre Lokalisation im Zytoplasma (GO-Wert 0,43) zugeordnet. Die
Bedeutung der GO-Werte wurde zuvor bereits in Kapitel 5.2.5 genauer erläutert.
115
Ergebnisse
Abbildung 5.35 Homologiemodell der Luciferase-ähnlichen Monooxygenase MsnO4.
Das Modell wurde mithilfe der Software I-TASSER erstellt und anschließend in Pymol bearbeitet. Die β-Faltblätter sind in rot
und die α-Helices in blau dargestellt. Es ist eine TIM-Barrel-ähnliche Anordnung der α-Helices und der β-Faltblätter zu
erkennen.
Des Weiteren wurde mit Hilfe der Software I-TASSER eine Vorhersage getroffen welche Aminosäuren
höchstwahrscheinlich eine Interaktion mit dem Cofaktor F420 oder FMN eingehen könnten. Hierfür
wurde die hypothetische Struktur von MsnO4 mit verwandten Proteinstrukturen verglichen, von
denen Kristallstrukturen mit gebundenem Cofaktor zugänglich sind. Die entsprechenden
Aminosäuren sind in Abbildung 5.36 rot gekennzeichnet und in Tabelle 5.3 aufgelistet.
Abbildung 5.36 Homologiemodell von MsnO4 mit gekennzeichneten Aminosäuren die wahrscheinlich an der CofaktorBindung beteiligt sind.
Durch den Vergleich mit ähnlichen bereits annotierten Proteinen konnten die Aminosäure-Positionen bestimmt werden, die
wahrscheinlich an der Bindung des Cofaktors beteiligt sind. Diese sind in der Abbildung rot markiert und zusätzlich in
Tabelle 5.3 aufgelistet.
116
Ergebnisse
Tabelle 5.3 Aminosäuren, die wahrscheinlich in MsnO4 an der Cofaktor-Bindung beteiligt sind.
Position
Aminosäure
Position
Aminosäure
45
Valin (V)
177
Alanin (A)
46
Glutaminsäure (E)
178
Serin (S)
47
Histidin (H)
180
Glycin (G)
78
Glycin (G)
181
Asparagin (N)
79
Alanin (A)
182
Leucin (L)
81
Isoleucin (I)
183
Asparaginsäure (D)
110
Glycin (G)
184
Serin (S)
111
Arginin (R)
196
Glutamin (Q)
112
Alanin (A)
198
Isoleucin (I)
113
Phenylalanin (F)
233
Threonin (T)
5.4 MsnO2 - eine Luciferase-ähnliche Monooxygenase aus
dem Mensacarcin-Gencluster
Das Protein MsnO2 ist neben MsnO4 und MsnO8 die dritte an der Biosynthese von Mensacarcin
beteiligte Luciferase-ähnliche Monooxygenase. Aufgrund der von Uwe Hardter durchgeführten
Inaktivierung des entsprechenden Gens msnO2 wurde als Funktion die Einführung einer
Doppelbindung in der Seitenkette von Mensacarcin postuliert. In einem weiteren Schritt könnte
diese dann von MsnO8 zu einer Epoxidgruppe oxidiert werden (siehe Abbildung 2.2). Da keine
vollständige Komplementierung der von Uwe Hardter hergestellten Inaktivierungsmutante Cos2∆O2
möglich war könnte das Protein aber auch eine andere, unbekannte Rolle in der MensacarcinBiosynthese spielen [9][1]. Des Weiteren wurde für MsnO2 eine potentielle Zusammenarbeit mit
MsnO3, der einzigen Flavinreduktase des Genclusters in einem Monooxygenase/ReduktaseZweikomponentensystem postuliert (siehe Kapitel 2.2.4) [168]. Ähnlich wie im Fall von MsnO4
besteht eine große strukturelle Ähnlichkeit zur A-Kette der Luciferase aus Vibrio harveyi. Das
Monomer von MsnO2 hat eine Größe von 351 Aminosäuren und ein Molekulargewicht von 39,1 kDa.
Die Durchführung einer BLAST-Analyse ergab für MsnO2 eine hohe Similarität zu den Luciferasen aus
Streptomyces acidiscabies, Streptomyces niveiscabiei und Amycolatopsis sp.MJM2582, sowie zu der
Alkansulfonat-Monooxygenase SsuD und der Methylen-Tetrahydromethanopterin-Reduktase aus
Actinoplanes derwentensis (siehe Abbildung 5.37).
117
Ergebnisse
Abbildung 5.37 Die Ergebnisse der BLAST-Analyse für MsnO2.
Das Ergebnis der BLAST-Suche ergab eine hohe Ähnlichkeit von MsnO2 zu unterschiedlichen, bekannten Luciferasen.
Die zehn Proteine, die in der BLAST-Analyse die größte Übereinstimmung zu MsnO2 hatten wurden
zusätzlich in Form eines phylogenetischen Baumes mit Hilfe der Jalview Software unter Verwendung
der BLOSUM62-Substitutionsmatrix systematisiert (Abbildung 5.38).
Abbildung 5.38 Phylogenetischer Baum von MsnO2.
Zur Erstellung des Baumes wurden die Aminosäuresequenz von MsnO2 sowie die Sequenzen der zehn Proteine die in der
BLAS-Analyse die größte Übereinstimmung mit MsnO2 hatten verwendet. Der Baum wurde mit Hilfe der BLOSUM62Substitutionsmatrix erstellt. Durch die angegebenen Zahlenwerte werden die Ähnlichkeiten der jeweiligen Äste zueinander
ausgedrückt. Eine niedrigere Zahl bedeutet einen geringeren Abstand zum nächsten Knotenpunkt und somit eine engere
Verwandtschaft zu in direkter Nachbarschaft liegenden, anderen Ästen.
118
Ergebnisse
Des Weiteren wurde das Protein aufgrund der BLAST-Analyse der Superfamilie der Flavin-abhängigen
Monooxygenasen zugeordnet. Zu dieser Gruppe gehören außer den bereits erwähnten MsnO2ähnlichen Enzymen auch Nitrilotriacetat-Monooxygenasen und Alkanal-Monooxygenasen [170]. Ein
Ziel dieser Arbeit war die Aufreinigung von MsnO2 und dessen anschließende Verwendung in
weiterführenden Experimenten.
5.4.1 Heterologe Produktion und Aufreinigung von MsnO2 sowie
Methodenoptimierung
Es wurden, mit dem Ziel optimale Produktionsbedingungen für MsnO2 herauszufinden,
Testproduktionen
mit
verschiedenen
Zelllinien,
Expressionsplasmiden,
Medien
und
Produktionstemperaturen durchgeführt (vergleiche Kapitel 4.14.1). Die Produktion in LB-Medium
nach Anregung mit IPTG führte sowohl bei 28 °C als auch bei 21 °C zur Entstehung von unlöslichen
Proteinaggregaten. Bei Verwendung von ZYM 5052 Autoinduktionsmedium und einer Durchführung
bei 18 °C über 56 h konnten mit E. coli BL21 Codon Plus RP x pL1SL2-Zellen die besten Ergebnisse
erzielt werden. Sowohl die niedrige Temperatur als auch das Medium könnten einen Einfluss auf die
langsamere und dadurch bessere Proteinfaltung gehabt haben [128]. Des Weiteren enthält der
verwendete Produktionsstamm ein Helferplasmid, welches für Chaperone (Helferproteine) kodiert.
Diese wiederum begünstigen die Ausbildung einer korrekten Protein-Tertiärstruktur [137]. Das
Ergebnis dieses Experiments mit erfolgreicher MsnO2-Produkton ist in Abbildung 5.39 gezeigt.
Abbildung 5.39 SDS-PAGE-Gel der Testproduktion von MsnO2 (39,1 kDa) in Codon Plus RP x pL1SL2-Zellen.
1 = Probe direkt nach dem Inokulieren der Kultur; 2 = Probe nach 56 h Produktion; M = Marker;
Das Protein wurde in Autoinduktionsmedium bei 18 °C produziert. Der Proteinexpressionsvektor pET21a wurde verwendet.
Die Bande bei ca. 40 kDa in Probe 2 entspricht dem Protein MsnO2.
Die darauffolgende Großproduktion erfolgte in einem 3 L-Ansatz ZYM-5052 Autoinduktionsmedium
(siehe Tabelle 4.23). Für die Proteinaufreinigung wurden die Zellen geerntet und mittels French-Press
119
Ergebnisse
und durch Zugabe von Lysozym aufgeschlossen. Anschließend wurde der die zytosolischen Proteine
enthaltende Überstand mittels Nickel-Affinitätschromatographie aufgereinigt (siehe 4.14.6). Zuerst
wurden im Durchfluss alle ungebundenen Proteine von der Säule gespült und anschließend mithilfe
eines Waschschrittes mit 10 % Elutionspuffer B (50 mM Imidazol) möglichst alle unspezifisch an das
Säulenmaterial gebundene Proteine entfernt. Zuletzt wurde mit einer Konzentration von 50 %
Elutionspuffer B (250 mM Imidazol) MsnO2 von der Säule eluiert. Eine anschließende SDS-PAGEAnalyse des Peaks, welcher bei einer Konzentration von 50 % Puffer B eluiert wurde, zeigte dass
dieser dem Protein MsnO2 entspricht (siehe Abbildung 5.40). Die Ausbeute an isoliertem MsnO2 war
jedoch vergleichsweise gering.
Abbildung 5.40 Ergebnis der Nickel-Affinitätschromatographie-Aufreinigung von MsnO2.
Links: Elutionschromatogramm; Der Absorptionsverlauf während der Aufreinigung bei 280 nm ist in blau dargestellt. Die
prozentuale Konzentration an Elutionspuffer B ist in rot abgebildet.
Rechts: SDS-PAGE-Gel; M = Marker; P = Pellet; DF = Durchfluss-Fraktion; 10 % = Waschschritt mit 10 % Elutionspuffer B;
Die 50 % Elutionspuffer B-Fraktion ist mit * gekennzeichnet. Die in dieser Fraktion sichtbare schwache Proteinbande bei ca.
40 kDa entspricht dem Protein MsnO2.
Im nächsten Schritt wurde die 50 % Elutionspuffer B-Fraktion aufkonzentriert und mithilfe einer
Gelfiltration weiter aufgereinigt (siehe Kapitel 4.14.7). Dadurch sollten Verunreinigungen, die noch in
der Probe enthalten sein könnten sowie aggregiertes Protein, aus der Probe entfernt werden. Nach
dem Ausschlussvolumen von ca. 40 mL wurde ein Peak detektiert, der dem aggregierten Protein
entspricht. Bei einem Durchfluss-Volumen von 81-85 mL konnte ein weiterer Peak isoliert werden. Da
es sich bei diesem um einen Doppelpeak handelt, wurde vermutet, dass dieser ähnlich wie für
MsnO8 zuvor beschrieben, dem Dimer und Monomer des Proteins entspricht. Diese könnten mithilfe
einer Größenausschlusschromatographie getrennt eluiert werden [1]. Eine darauffolgende SDS-PAGE
Analyse stellte beide Teile des Doppelpeaks in einer sauberen Bande bei einer Größe von etwa
40 kDa dar, sodass diese als MsnO2 identifiziert werden konnten (siehe Abbildung 5.41.).
120
Ergebnisse
Abbildung 5.41 Ergebnis der Gelfiltrationschromatographie von MsnO2.
Links: Elutionschromatogramm; Der Absorptionsverlauf während der Aufreinigung bei 280 nm ist in blau dargestellt. Der
Doppelpeak bei 81 und 84 mL entspricht vermutlich dem Dimer und Monomer des Proteins.
Rechts: SDS-PAGE Gel mit aufgetragener MsnO2-Probe nach erfolgter Gelfiltration (mit * gekennzeichnet). Die Schwachen
Banden bei ca. 40 kDa entsprechen dem Protein MsnO2.
Die Menge an isolierbarem Protein war auch hier nur gering (< 1mg/mL). Zusätzlich erwies sich die
isolierte Probe als sehr instabil, wodurch schon nach wenigen Stunden sowohl bei einer Lagerung bei
4 °C als auch bei - 80 °C eine Fällung sichtbar wurde. Ein Versuch, die Stabilität des Proteins durch
Zugabe von Betain zum Produktionsmedium zu erhöhen, blieb ohne Erfolg [176]. Des Weiteren
wurde das nicht-denaturierende Detergenz Octylglucosid bei der Herstellung der zur Aufreinigung
verwendeten Puffer zugegeben. Dieses soll die Bildung von Proteinaggregaten vermindern und eine
bessere Trennung des heterolog produzierten Proteins von den Zelltrümmern während der
Aufreinigung ermöglichen [177]. Die Stabilität von MsnO2 konnte auch so nicht verbessert werden,
sodass
im
Rahmen
dieser
Arbeit
keine
weiterführenden
Aktivitätsassays
oder
Kristallisierungsexperimente möglich waren.
5.4.2 Bioinformatisches Homologiemodell von MsnO2
Mithilfe der der Software I-TASSER wurden Homologiemodelle für das an der Biosynthese von
Mensacarcin beteiligte Protein MsnO2 erstellt. Die Software durchsucht hierbei StrukturDatenbanken auf der Suche nach möglichst ähnlichen, bereits annotierten Teilstrukturen. Zusätzlich
erfolgt ein Abgleich mit bekannten Proteinstrukturen der Protein Datenbank (PDB). Die Güte der von
I-TASSER vorgeschlagenen Modelle lässt sich anhand der angegebenen C- und TM-Werte beurteilen.
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Methode zuvor bereits genauer erläutert (siehe 5.2.5)
[171][172][149][173].
121
Ergebnisse
Anhand der Aminosäuresequenz von MsnO2 wurde durch I-TASSER die statistisch wahrscheinlichste
Sekundärstruktur des Proteins bestimmt (siehe Abbildung 5.42). Die mit einem H beschrifteten
Aminosäuren sind Teil einer Helix. Können Aminosäuren wiederum zu einem „Sheet“ (Faltblatt)
zugeordnet werden, sind sie mit einem S gekennzeichnet. Ein C deutet auf „Coils“ hin, aus denen
sogenannte Loop-Strukturen in Proteinen aufgebaut sind[174].
Abbildung 5.42 Die von I-TASSER vorgeschlagenen Anordnung der Sekundärstruktur von MsnO2.
Das in Abbildung 5.43 dargestellte Homologiemodell von MsnO2 weist einen C-Wert von 0,99 und
einen TM-Wert von 0,85±0,08 auf. Eine TIM-Barrel-ähnliche Anordnung der α-Helices und der βFaltblätter ist deutlich zu erkennen. Allerdings sind, genau wie im MsnO4-Homologiemodell, nur
sechs, anstatt den normalerweise in einer solchen Struktur vorhandenen acht β-Faltblättern zu
finden (siehe Abbildung 5.35). Die Übereinstimmung des MsnO2-Modells mit annotierten
Proteinstrukturen war mit der Luciferase aus Vibrio harveyi (PDB-ID: 3FGCA, 1LUC, 1BRL) und der
Monooxygenase aus Agrobacterium tumefaciens (PDB-ID: 2I7G) am höchsten. Zusätzlich konnte
MsnO2 der EC Klasse der Redoxreaktionen-katalysierenden Monooxygenasen zugeordnet werden
(vergleiche Kapitel 5.2.5). Auch in diesem Fall wurde die größte Übereinstimmung in Vergleich mit
der bakteriellen Luciferase aus Vibrio harveyi (PDB-ID: 1XKJ) gefunden. Im Rahmen der I-TASSER
Ergebnisse wurde des Weiteren eine Zuordnung des vorgeschlagenen Homologiemodells nach GO(Gene Ontology) Normen vorgenommen (siehe Kapitel 5.2.5.) [175]. Dem Protein MsnO2 wurden mit
diesem System die molekulare Funktion einer FMN-gekoppelten Monooxygenase (GO-Wert 0,8), der
biologische Prozess der Biolumineszenz (GO-Wert 0,8) und die zelluläre Lokalisation im Zytoplasma
(GO-Wert 0,51) zugeordnet.
122
Ergebnisse
Abbildung 5.43 Homologiemodell der Luciferase-ähnlichen Monooxygenase MsnO2.
Das Modell wurde mithilfe der Software I-TASSER erstellt und anschließend in Pymol bearbeitet. Die β-Faltblätter sind in rot
und die α-Helices in blau dargestellt. Es ist eine TIM-Barrel-ähnliche Anordnung der α-Helices und der β-Faltblätter zu
erkennen.
Zuletzt wurde anhand von Vergleichen mit ähnlichen Proteinen durch I-TASSER eine Vorhersage
getroffen, welche Aminosäuren wahrscheinlich eine Interaktion mit dem Cofaktor F420 oder FMN
ausbilden. In Abbildung 5.44 sind die entsprechenden Positionen rot markiert und in Tabelle 5.4
aufgelistet.
Tabelle 5.4 Höchstwahrscheinlich an der Cofaktor-Bindung in MsnO2 beteiligte Aminosäuren.
Position
Aminosäure
Position
Aminosäure
43
Valin (V)
175
Alanin (A)
44
Glutaminsäure (E)
176
Threonin (T)
45
Histidin (H)
178
Isoleucin (I)
76
Glycin (G)
179
Threonin (T)
77
Alanin (A)
180
Prolin (P)
79
Prolin (P)
181
Glutaminsäure (E)
108
Glycin (G)
182
Serin (S)
109
Arginin (R)
194
Methionin (M)
110
Glycin (G)
196
Valin (V)
111
Phenylalanin (F)
231
Serin (S)
123
Ergebnisse
Abbildung 5.44 Die höchstwahrscheinlich an der Cofaktor-Bindung in MsnO2 beteiligten Aminosäuren.
Durch den Vergleich mit ähnlichen, bereits annotierten Proteinen konnten die Aminosäure-Positionen bestimmt werden,
die wahrscheinlich an der Bindung des Cofaktors beteiligt sind. Diese sind in der Abbildung rot markiert und in Tabelle 5.4
aufgelistet.
5.5 Fütterungsexperimente mit potentiellen AnthrachinonSubstraten von MsnO4
Die von Katharina Probst im Rahmen ihrer Doktorarbeit durchgeführten Knockout-Experimente von
msnO4 führten nicht zur Isolierung des nativen Substrates des korrespondierenden Proteins MsnO4.
Stattdessen
wurde
ein
mit
einem
Mycothiol-Rest
substituiertes
stabiles
Biosynthese-
Zwischenprodukt (Msn-KP3) gefunden [8]. Solche Mycothiol-Addukte können häufig, aufgrund von
Entgiftungsmechanismen die in Streptomyceten vorkommen, beobachtet werden [1]. Anhand dieses
Ergebnisses konnte keine eindeutige Aussage bezüglich des wahren Reaktionsmechanismus von
MsnO4 gemacht werden, jedoch wurde die Einführung einer Epoxidgruppe im Ringsystem von
Mensacarcin als am wahrscheinlichsten postuliert (siehe Abbildung 5.45). Des Weiteren wurde eine
Zusammenarbeit mit der Flavinreduktase MsnO3 vorgeschlagen [1].
124
Ergebnisse
Abbildung 5.45 Die hypothetische Reaktion der Luciferase-ähnlichen Monooxygenase MsnO4.
Für MsnO4 wird eine Abhängigkeit von der Flavinreduktase MsnO3 postuliert. Wahrscheinlich sind die beiden Enzyme für
die Oxidierung einer Doppelbindung im Ringsystem von Mensacarcin verantwortlich, woraufhin eine stabile Epoxidgruppe
entsteht.
Da gleichzeitig aber der Mechanismus der Einführung der einzelnen Hydroxylgruppen innerhalb des
Ringsystems nicht komplett aufgeklärt ist, kann eine andere Funktion im Fall von MsnO4 nicht
ausgeschlossen werden. Um die Rolle von MsnO4 in der Mensacarcin-Biosynthese aufzuklären
wurden Fütterungsexperimente im heterologen Produktionsstamm Streptomyces albus durchgeführt.
Hierfür wurden zwei Anthrachinon-Derivate, 1,4-Dihydroantrachinon und 1-Methoxy-3-methyl-2pent-2-enylantrachinon verwendet (siehe Abbildung 5.46).
Abbildung 5.46 Für die Fütterungsexperimente mit MsnO4 und MnO3 in Streptomyces albus verwendete AnthrachinonDerivate.
A) 1,4-Dihydroantrachinon; B) 1-Methoxy-3-methyl-2-pent-2-enylantrachinon.
Die Gene msnO4 und msnO3 wurden mittels intergenerischer Konjugation in den Stamm
Streptomyces albus eingebracht (siehe Kapitel 4.12.11). Gleichzeitig wurde die Mutante auch mit
dem Plasmid pKR1 konjugiert. Dadurch wurde zusätzlich der SARP-Regulator msnR1 aus dem msnCluster überexprimiert. Wie zuvor gezeigt wurde, ist dieser essentiell für eine hohe Produktionsrate
von Mensacarcin-Biosyntheseintermediaten [8]. Im Rahmen des Experiments wurde angenommen,
dass er auch für die Umsetzung der gefütterten Substrate von Bedeutung sein könnte. Die
darauffolgende Fütterung wurde wie in Kapitel 4.5.11 beschrieben durchgeführt, wobei
Stammlösungen der beiden Testsubstanzen mit einer Konzentration von 25 mg/mL in DMSO
verwendet wurden. Nach einer fünftägigen Produktion wurde der Kulturüberstand mit
125
Ergebnisse
Essigsäureethylester extrahiert und anschließend mittels HPLC/MS (Methode: mensO4) analysiert.
Die Fütterungsexperimente mit den beiden Substanzen wurden dreifach wiederholt, wobei jeweils
mehrere Klone getestet wurden. Gleichzeitig wurden dieselben Klone ohne Zugabe der zu testenden
Substanz analysiert, sowie die Reinsubstanz in Methanol vermessen. Im Fall von 1,4Dihydroanthrachinon konnten keine neuen Peaks im Vergleich zu den Negativkontrollen gefunden
werden. Es erfolgte also keine Umsetzung des zugegebenen Substrats (siehe Abbildung 5.47). Auch
für die Fütterung mit 1-Methoxy-3-methyl-2-pent-2-enylantrachinon wurden im Vergleich zu den
Negativkontrollen keine neuen Substanzen gefunden. Wie in Abbildung 5.48 zu sehen ist, erfolgte
keine Umsetzung des Anthrachinon-Derivats. Ein möglicher Grund für das Ergebnis der Fütterungen
könnte sein, dass die verwendeten Substrate für MsnO4 nicht spezifisch genug waren. Nicht
auszuschließen ist auch, dass weitere Enzyme aus der Mensacarcin Biosynthese oder aus dem
natürlichen Produzenten Streptomyces bottropensis für eine Umsetzung notwendig wären.
Abbildung 5.47 HPLC-Chromatogramme der Extrakte des Fütterungsexperiments mit MsnO4, MsnO3 und 1,4Dihydroanthrachinon als Substrat; λ = 254 nm.
1) Reinsubstanz 1,4-Dihydroanthrachinon; 2) S. albus x pKR1 x msnO4 x msnO3; 3) S. albus x pKR1 x msnO4 x msnO3
gefüttert mit 1,4-Dihydroanthrachinon.
Das Produktionsprofil der gefütterten Mutante S. albus x pKR1 x msnO4 x msnO3 (3) entspricht zum Großteil dem der nicht
gefütterten Mutante (2). Den einzigen Unterschied stellen die in blau hinterlegten Peaks bei 24 und 25 Minuten dar. Diese
konnten allerdings der nicht umgesetzten Reinsubstanz sowie einem Abbauprodukt zugeordnet werden (siehe auch Kapitel
5.3.4).
126
Ergebnisse
Abbildung 5.48 HPLC-Diagramme der Extrakte des Fütterungsexperiments mit MsnO4, MsnO3 und 1-Methoxy-3-Methyl2-Pent-2-Enylanthrachinon als Substrat; λ = 254 nm.
1) Reinsubstanz 1-Methoxy-3-Methyl-2-Pent-2-Enylanthrachinon; 2) S. albus x pKR1 x msnO4 x msnO3; 3) S. albus x pKR1 x
msnO4 x msnO3 gefüttert mit 1-Methoxy-3-Methyl-2-Pent-2-Enylanthrachinon.
Das Produktionsprofil der gefütterten Mutante S. albus x pKR1 x msnO4 x msnO3 (3) entspricht zum Großteil dem der nicht
gefütterten Mutante (2). Den einzigen Unterschied stellt der in rot hinterlegten Peak bei 31 Minuten dar. Dieser konnte
allerdings der nicht umgesetzten Reinsubstanz zugeordnet werden (siehe auch Kapitel 5.3.4).
5.6 Einfluss
der
kombinatorischen
Substitution
der
Flavinreduktasen MsnO3 und RslO2 aus dem Mensacarcinund dem Rishirilid-Gencluster
In den letzten Jahren konnte vermehrt gezeigt werden, dass die Produktion von Naturstoffen und
Antibiotika in Bakterien und darunter speziell auch Streptomyceten einer starken Regulation durch
variierende äußere sowie physiologische Bedingungen unterliegt. Ein Grund hierfür stellen hoch
konservierte globale Regulatoren dar, die clusterübergreifend für zentrale Steuermechanismen in
den Zellen verantwortlich sind [90]. Andererseits wurden auch Gene beschrieben, die innerhalb eines
Genclusters lokalisiert sind, deren regulatorische Funktion aber auch Cluster anderer Naturstoffe im
gleichen Stamm beeinflussen kann. Ein Beispiel einer solchen Cross-Regulierung stellen JadR2 und
JadR1 dar, die in Streptomyces venezuelae an der Jadomycin-Biosynthese beteiligt sind. Diese können
zusätzlich neben der Jadomycin- auch die Chloramphenicol-Produktion in derselben Mutante
begünstigen [96].
Die in Streptomyces bottropensis identifizierten Mensacarcin- und Rishirilid-Gencluster enthalten
jeweils nur ein für eine Flavinreduktase kodierendes Gen (entsprechend msnO3 und rslO2). Wie
127
Ergebnisse
zuvor beschrieben ist das Protein MsnO3 essentiell für die Funktion der Luciferase-ähnlichen
Monooxygenase MsnO8. Eine ähnliche Kooperation mit der Flavinreduktase wurde für MsnO2 und
MsnO4 postuliert [1]. Auch für die Rishirilid-Biosynthese wurde das Vorkommen von
Zweikomponentensystemen von Luciferase-ähnlichen Monooxygenasen (RslO1 und RslO6) und
Flavinreduktase (MsnO2) beschrieben. Die Inaktivierungsmutanten S. albus cos4ΔrslO2 x pUWL-HrslR1R2R3 und S. albus cos4ΔrslO1 x pUWL-H-rslR1R2R3 zeigten weitgehend ein identisches
Produktionsprofil, was die Hypothese einer Zusammenarbeit beider Proteine verstärkt. Der in den
Experimenten zusätzlich verwendete Vektor pUWL-H-rslR1R2R3 enthielt die für die RishirilidProduktion benötigten Regulatorgene rslR1, rslR2 und rslR3 [142][6]. Die von Jana Derochefort in
ihrer
Doktorarbeit
durchgeführte
Aufreinigung
von
RslO6
führte
anschließend
zur
kristallographischen Strukturaufklärung des Proteins. Da eine große Ähnlichkeit zu der zuvor
beschriebenen Struktur von MsnO8 bestand, wurde auch ein analoger Reaktionsmechanismus
postuliert. Somit scheint auch ein Zweikomponentensystem RslO6/RslO2 wahrscheinlich [6].
Da jeweils nur eine Flavinreduktase in den msn- und rsl-Genclustern zu finden ist, sollte die
Austauschbarkeit der entsprechenden Gene msnO3 und rslO2 in der Mensacarcin-Biosynthese
untersucht werden. Es wurden Experimente durchgeführt, in denen die Knockoutmutante S. albus
Cos2∆O3 jeweils mit msnO3 oder rslO2 komplementiert wurde. Für die Durchführung wurde das von
Sarah Maier hergestellte Konstrukt Cos2∆O3 mittels intergenerischer Konjugation in den heterologen
Wirt Streptomyces albus eingebracht (siehe Kapitel 4.12.11) [1]. Zusätzlich wurde mit der gleichen
Methode die Mutante S. albus Cos2∆O3 x pKR1 hergestellt. Dadurch wurde der SARP-Regulator
msnR1 aus dem msn-Cluster überexprimiert, welcher essentiell für eine hohe Produktionsrate von
Mensacarcin-Biosyntheseintermediaten ist [8]. Die so hergestellten Mutanten wurden über 5 Tage in
DNPM-Medium kultiviert, abzentrifugiert, der Überstand mit Essigsäureethylester bei pH 4 extrahiert
und mittels HPLC/MS analysiert (siehe Kapitel 4.16). Anschließend wurden die Mutanten mit msnO3
oder rslO2 mittels intergenerischer Konjugation komplementiert und erneut Produktionen in DNPMMedium durchgeführt. Nach erfolgter Extraktion der erhaltenen Überstände wurden auch diese
mittels HPLC/MS untersucht. Als Kontrollen wurden S. albus Wildtyp und S. albus Cos2 auf dieselbe
Art analysiert.
128
Ergebnisse
5.6.1 Produktionsverhalten der Mutante S. albus Cos2∆O3 und
S. albus Cos2∆O3 x pKR1
Das HPLC-Ergebnis der Produktion von S. albus Cos2∆O3 und S. albus Cos2∆O3 x pKR1 ist in Abbildung
5.49 dargestellt.
Abbildung 5.49 HPLC-Chromatogramme der Extrakte nach Produktionen mit der Knockoutmutante S. albus Cos2∆O3 [1];
λ = 254 nm.
1) S. albus Wildtyp; 2) S. albus Cos2; 3) S. albus Cos2∆O3; 4) S. albus Cos2∆O3 x pKR1.
Im Produktionsprofil des S.albus Wildtyp (1) konnten erwartungsgemäß keine Mensacarcin-Biosyntheseintermediate
detektiert werden. Nach Konjugation mit Cos2 war eine starke DDMM-Produktion (in violett hinterlegt) nachweisbar (2).
Sowohl nach Konjugation mit Cos2∆O3 (3) als auch mit Cos2∆O3 x pKR1(4) konnten die von Sarah Maier in ihrer
Dissertation bereits beschriebenen Intermediate Msn-SM3 (grün), Msn-SM4 (orange) und Msn-SM5 (blau) detektiert
werden. Des Weiteren wurde die DDMM-Produktion komplett unterbrochen.
Die Negativkontrolle S. albus Wildtyp (1) zeigte erwartungsgemäß keine Produktion von
Didesmethylmensacarcin (DDMM) oder anderen Mensacarcin Biosynthese-Intermediaten. Nach
Einführung von Cos2 war ein eindeutiger, starker DDMM-Peak detektierbar (2). Im Überstand der
Mutanten S. albus Cos2∆O3 (3) und S. albus Cos2∆O3 x pKR1 (4) wurde, wie erwartet, kein
Didesmethylmensacarcin mehr detektiert. Die zuvor von Sarah Maier für diese Mutanten
beschriebenen Intermediate Msn-SM3, Msn-SM4 und Msn-SM5 waren in beiden Fällen nachweisbar
[1]. Aufgrund der Überexpression des SARP-Regulators msnR1 fand eine eindeutig stärkere
129
Ergebnisse
Produktion von Msn-SM5 statt. Auch die Menge an produziertem Msn-SM4 war leicht erhöht. Ein
signifikanter Einfluss auf Msn-SM3 wurde nicht beobachtet.
5.6.2 Produktionsverhalten nach Komplementierung mit msnO3
oder rslO2
Abbildung 5.50 HPLC-Chromatogramme der Extrakte nach durchgeführten Komplementierungen den Knockoutmutanten
S. albus Cos2∆O3 [1] und S. albus Cos2∆O3 x pKR1 mit msnO3; λ = 254 nm.
1) S. albus Wildtyp; 2) S. albus Cos2; 3) S. albus Cos2∆O3 x pKR1; 4) S. albus Cos2∆O3 x msnO3;5) S. albus Cos2∆O3 x msnO3
x pKR1.
Im Produktionsprofil des S. albus Wildtyp (1) konnten erwartungsgemäß keine Mensacarcin-Biosyntheseintermediate
detektiert werden. Nach Konjugation mit Cos2 war eine starke DDMM-Produktion (in violett hinterlegt) nachweisbar (2).
Nach Konjugation mit Cos2∆O3 x pKR1(3) konnten die von Sarah Maier in ihrer Dissertation bereits beschriebenen
Intermediate Msn-SM3 (grün), Msn-SM4 (orange) und Msn-SM5 (blau) detektiert werden [1]. Des Weiteren wurde die
DDMM-Produktion komplett unterbrochen. Sowohl die Produktion nach Komplementierung mit msnO3 (4) als auch mit
msnO3 in Kombination mit pKR1 (5) führte zur Wiederherstellung der DDMM-Produktion. Andere Intermediate konnten
nicht mehr detektiert werden.
130
Ergebnisse
Abbildung 5.51 HPLC-Chromatogramme der Extrakte nach durchgeführten Komplementierungen den Knockoutmutanten
S. albus Cos2∆O3 [1] und S. albus Cos2∆O3 x pKR1 mit rslO2; λ = 254 nm.
1) S. albus Wildtyp; 2) S. albus Cos2; 3) S. albus Cos2∆O3 x pKR1; 4) S. albus Cos2∆O3 x rslO2;
5) S. albus Cos2∆O3 x rslO2 x pKR1
Im Produktionsprofil des S. albus Wildtyp (1) konnten erwartungsgemäß keine Mensacarcin-Biosyntheseintermediate
detektiert werden. Nach Konjugation mit Cos2 war eine starke DDMM-Produktion (in violett hinterlegt) nachweisbar (2).
Nach Konjugation mit Cos2∆O3 x pKR1(3) konnten die von Sarah Maier in ihrer Dissertation bereits beschriebenen
Intermediate Msn-SM3 (grün), Msn-SM4 (orange) und Msn-SM5 (blau) detektiert werden [1]. Des Weiteren wurde die
DDMM-Produktion komplett unterbrochen. Sowohl die Produktion nach Komplementierung mit rslO2 (4) als auch mit rslO2
in Kombination mit pKR1 (5) führte zur Wiederherstellung der DDMM-Produktion. Andere Intermediate konnten nicht mehr
detektiert werden.
In Abbildung 5.50 ist das HPLC-Ergebnis der Produktion von S. albus Cos2∆O3 und S. albus
Cos2∆O3 x pKR1 nach Komplementierung mit msnO3 dargestellt. In der Negativkontrolle S. albus
Wildtyp (1) wurde kein Didesmethylmensacarcin (DDMM) oder andere Mensacarcin BiosyntheseIntermediate gefunden. S. albus Cos2 zeigte eine eindeutige DDMM-Produktion (2). Im Vergleich zur
Knockoutmutante S. albus Cos2∆O3 x pKR1 (3), die anstatt DDMM nur noch die Intermediate MsnSM3, Msn-SM4 und Msn-SM5 produzierte, konnte nach der Komplementierung mit msnO3 die
Didesmethylmensacarcin-Synthese
wiederhergestellt
werden.
Die
Mutante
S. albus
131
Ergebnisse
Cos2∆O3 x msnO3
(4)
zeigte
eine
geringere
DDMM-Produktionsrate
als
S. albus
Cos2∆O3 x msnO3 x pKR1. Dies kann auf den Einfluss des überexprimierten SARP-Regulators msnR1
zurückgeführt werden [8].
In Abbildung 5.51 ist das HPLC-Ergebnis der Produktion von S. albus Cos2∆O3 und S. albus
Cos2∆O3 x pKR1 nach Komplementierung mit rslO2 dargestellt. Die Negativkontrolle S. albus Wildtyp
(1) produzierte kein Didesmethylmensacarcin (DDMM) oder andere Mensacarcin BiosyntheseIntermediate. S. albus Cos2 wiederum zeigte eine eindeutige DDMM-Produktion (2). In der
Knockoutmutante S. albus Cos2∆O3 x pKR1 (3) konnten anstatt DDMM nur noch die Intermediate
Msn-SM3, Msn-SM4 und Msn-SM5 detektiert werden. Überraschenderweise konnte nach der
Komplementierung mit rslO2 die Didesmethylmensacarcin-Synthese wiederhergestellt werden. Die
Flavinreduktasen des msn- und des rsl-Clusters scheinen untereinander austauschbar zu sein. Dies
könnte, neben den Ergebnissen der Inaktivierung von msnO2 in Streptomyces bottropensis (siehe
Kapitel 5.1.3), ein weiteres Indiz für eine gewisse Cross-Regulierung zwischen den beiden
Biosynthese-Clustern
sein.
Die
Mutanten
S. albus
Cos2∆O3 x rslO2
(4)
und
S. albus
Cos2∆O3 x rslO2 x pKR1 zeigten keinen signifikanten Unterschied in der Menge an produziertem
DDMM. Die Überexpression des SARP-Regulators msnR1 schien in dem Fall keinen größeren Einfluss
auf das Verhalten der Mutanten zu haben.
5.7 Bioinformatische Untersuchungen
Ein Ziel im Rahmen dieser Arbeit war es bioinformatische Vergleiche der an der Biosynthese von
Mensacarcin und Rishirilid beteiligten Flavinreduktasen und Luciferase-ähnlichen Monooxygenasen
durchzuführen. Des Weiteren wurden die LLM MsnO2 und MsnO4 mit der bakteriellen Luciferase aus
Vibrio harveyi verglichen. In den folgenden Teilen dieses Kapitels sind Untersuchungen sowohl auf
Ebene der Primär- als auch Sekundärstruktur dargestellt.
5.7.1 Untersuchungen auf Ebene der Primärstruktur
Sowohl im Mensacarcin- als auch im Rishirilid-Gencluster von Streptomyces bottropensis ist jeweils
nur ein für eine Flavinreduktase kodierendes Gen lokalisiert (msnO3 und rslO2) [3]. Zusätzlich konnte
in dieser Arbeit gezeigt werden, dass die Funktion des msn-Clusters nach erfolgtem Knockout von
msnO3 durch eine Komplementierung sowohl mit msnO3 also auch mit rslO2 wiederhergestellt wird
(siehe Kapitel 5.6). Ein Clustal Omega Alignment der Aminosäuresequenz der beiden
korrespondierenden Proteine MsnO3 und RslO2 ist in Abbildung 5.52 dargestellt. Konservierte
Aminosäuren sind mit einem Stern (*) markiert. Ein Doppelpunkt (:) deutet auf stark ähnliche
132
Ergebnisse
Eigenschaften, trotz fehlender absoluter Übereinstimmung hin. Mit einem Punkt (.) sind Gruppen mit
geringer Ähnlichkeit markiert. Das Alignment von MsnO3 und RslO2 zeigt einen relativ hohen Anteil
an konservierten sowie funktionell ähnlichen Aminosäuren. Dies deutet auf eine nahe
Verwandtschaft hin und könnte teilweise eine Erklärung für die Austauschbarkeit der beiden Enzyme
in der Mensacarcin Biosynthese sein.
Abbildung 5.52 Das Custal Omega Alignment der Aminosäuresequenz der Flavinreduktasen MsnO3 und RslO2.
* = konservierte Aminosäuren; : = Aminosäuren mit sehr ähnlichen Eigenschaften, trotz fehlender absoluter
Übereinstimmung; . = Aminosäuren mit geringer Ähnlichkeit.
Darüber hinaus wurden die Luciferase-ähnlichen Monooxygenasen MsnO2, MsnO4, MsnO8, RslO1
und RslO6 miteinander verglichen. Somit wurden alle an der Biosynthese von Mensacarcin und
Rishirilid beteiligten Enzyme dieser Klasse erfasst [3]. Außerdem wurde auch die bakterielle
Luciferase aus Vibrio harveyi, die die „Modellstruktur“ dieser Proteinklasse darstellt, miteinbezogen
[29]. Das Ergebnis ist in Abbildung 5.53 dargestellt. Auffällig ist die relativ geringe Menge an in dieser
Gruppe durchgehend konservierten Aminosäuren (20 bei einer Sequenzlänge von ca. 360). Das zuvor
für MsnO8 und RslO6 beschriebene Serin 170, dem eine wichtige Rolle in der Cofaktor-Bindung
zugeschrieben wurde, konnte in RslO1, MsnO2 und MsnO4 nicht wiedergefunden werden. Zwei
weitere Aminosäuren, denen eine ähnliche Funktion in MsnO8 und RslO6 zugeschrieben wurde (E43
und H44), konnten in dem dargestellten Vergleich als durchgehend konserviert bestätigt werden. Die
im Mensacarcin- und Rishirilid-Biosynthesecluster lokalisierten LLM zeigten insgesamt eine nur
moderate Ähnlichkeit im Aufbau ihrer Primärstruktur. Um ihren Verwandtschaftsgrad zu
verdeutlichen wurde mit dem Ergebnis des Multiplen Alignments zusätzlich ein phylogenetischer
Baum erstellt (siehe Abbildung 5.54). Die beiden Proteine MsnO8 und RslO6 konnten als separate
Untergruppe identifiziert werden, die zusätzlich auch nah mit der Luciferase aus Vibrio harveyi
verwandt ist. Für MsnO4 konnte zu keinem der anderen untersuchten Enzyme eine nennenswerte
Ähnlichkeit gefunden werden. Darüber hinaus zeigten die verbleibenden LLM RslO1 und MsnO2 auch
einen relativ hohen Verwandtschaftsgrad.
133
Ergebnisse
Abbildung 5.53 Custal Omega Alignment der Aminosäuresequenzen der LLM aus dem Mensacarcin- und dem RishirilidGencluster sowie der bakteriellen Luciferase aus Vibrio harveyi.
* = konservierte Aminosäuren; : = Aminosäuren mit sehr ähnlichen Eigenschaften, trotz fehlender absoluter
Übereinstimmung; . = Aminosäuren mit geringer Ähnlichkeit.
Die Aminosäuren E43 und H44 weisen eine durchgehende Konservierung in der gesamten Gruppe auf. Die Position 170 ist
nur in MsnO8, RslO6 und der bakteriellen Luciferase eindeutig konserviert (Serin).
134
Ergebnisse
Abbildung 5.54 Phylogenetischer Baum des Verwandtschaftsgrades der LLM aus dem Mensacarcin- und dem RishirilidGencluster sowie der bakteriellen Luciferase aus Vibrio harveyi (basierend auf dem Clustal Omega Alignment von
Abbildung 5.53.).
Eine engere Verwandtschaft besteht zwischen MsnO8 und RslO6 sowie zwischen MsnO2 und RslO1.
Für die Proteine MsnO2 und RslO1 wurde ein zusätzlicher Aminosäuresequenzvergleich durchgeführt
(siehe Abbildung 5.55). In diesem konnte das Ergebnis aus Abbildung 5.54 betätigt werden. Die
Anzahl an konservierten, identischen Aminosäuren betrug über 60 % der Gesamtsequenz. Zusätzlich
wurden viele Positionen mit ähnlichen Eigenschaften, trotz fehlender absoluter Übereinstimmung,
gefunden. Das Ergebnis könnte ein erstes Indiz für eine kombinatorische Austauschbarkeit, ähnlich
wie zuvor für MsnO3 und RslO2 beschrieben wurde, sein.
Abbildung 5.55 Custal Omega Alignment der Aminosäuresequenzen der Luciferase-ähnlichen Monooxygenasen MsnO2
und RslO1.
* = konservierte Aminosäuren; : = Aminosäuren mit sehr ähnlichen Eigenschaften, trotz fehlender absoluter
Übereinstimmung; . = Aminosäuren mit geringer Ähnlichkeit.
135
Ergebnisse
5.7.2 Homologiemodell-Vergleich
Im Rahmen dieser Arbeit wurden mithilfe der Software I-Tasser Homologiemodelle der
Flavinreduktasen MsnO3 und RslO2 sowie der Luciferase-ähnlichen Monooxygenasen MsnO2,
MsnO4 und RslO1 erstellt. Für die im Fokus dieser Arbeit stehenden Proteine MsnO2, MsnO4 und
MsnO3 wurden anschließend mithilfe der Pymol-Software Strukturvergleiche mit den anderen in
Kapitel 5.7.1 beschriebenen Flavinreduktasen und LLM durchgeführt.
In Abbildung 5.56 ist das strukturelle Alignment von MsnO4 (blau) und der Kristallstrukturstruktur
des Monomers der Luciferase LUX A aus Vibrio harveyi (PDB ID: 3FGC; orange) dargestellt [29]. Der
TIM-Barrel-artige Aufbau der Luciferase konnte auch in MsnO4 wiedergefunden werden (siehe
Kapitel 5.3.6.). Das Modell des Enzyms aus der Mensacarcin-Biosynthese enthielt allerdings weniger
β-Faltblatt Strukturen. Diese fehlten sowohl im zentralen als auch im äußeren Bereich des Proteins.
Stattdessen waren vermehrt Bereiche ohne erkennbare Sekundärstruktur zu erkennen (siehe
Abbildung 5.57).
Abbildung 5.56 Strukturalignment der I-Tasser Modelle von MsnO4 (blau) und der bakteriellen Luciferase LUX A aus
Vibrio harveyi (orange) [29].
136
Ergebnisse
Abbildung 5.57 Detail des Strukturalignments des I-Tasser Modells von MsnO4 (blau) und der bakteriellen Luciferase
LUX A aus Vibrio harveyi (orange) [29].
In MsnO4 sind viele der in der Luciferase vorkommenden β-Faltblätter durch Bereiche ohne erkennbare Sekundärstruktur
ersetzt.
Auch
für
das
Homologiemodell
von
MsnO2
wurde
ein
Strukturvergleich
mit
der
Kristallstrukturstruktur des Monomers der Luciferase LUX A aus Vibrio harveyi (PDB-ID: 3FGC)
durchgeführt [29]. Das Ergebnis ist mit dem von MsnO4 vergleichbar, wobei die Abweichungen der
räumlichen Anordnung im Fall von MsnO2 geringfügig weniger ausgeprägt waren. Auch hier ließ sich
die fassartige TIM-Barrel Struktur deutlich erkennen (siehe Abbildung 5.58). Ähnlich wie bei MsnO4
waren auch im zentralen Teil von MsnO2, verglichen mit der Luciferase aus Vibrio harveyi, einige βFaltblätter gegen Bereiche ohne erkennbare Sekundärstruktur ausgetauscht (siehe Abbildung 5.59).
Dies könnte die Stabilität der potentiellen Cofaktor-Bindung beeinflussen, da sich das aktive Zentrum
wahrscheinlich im Bereich der veränderten Struktur befindet (siehe Abbildung 5.43).
Abbildung 5.58 Strukturalignment der I-Tasser Modelle von MsnO2 (grün) und der bakteriellen Luciferase LUX A aus
Vibrio harveyi (orange) [29].
137
Ergebnisse
Abbildung 5.59 Unterschiede in der Sekundärstruktur des TIM-Barrels von MsnO2 (grün) und der Luciferase LUX A aus
Vibrio harveyi (orange).
Einige der in der Luciferase aus Vibrio harveyi vorkommenden β-Faltblätter sind in MsnO2 durch Bereiche ohne definierte
Sekundärstruktur ausgetauscht.
Da sowohl in MsnO2 als auch in MsnO4 weniger β-Faltblatt Strukturen vorkommen, wurde im
nächsten Schritt ein direkter Vergleich der beiden Proteine durchgeführt. Es konnte gezeigt werden,
dass die fehlenden Sekundärstrukturen an unterschiedlichen Positionen im TIM-Barrel lokalisiert sind
(siehe Abbildung 5.60). Gleichzeitig stellte die zum Vergleich verwendete Luciferase (PDB-ID: 3FGC)
sowohl für MsnO4 als auch für MsnO2 laut I-Tasser Analyse die ähnlichste, bekannte
Vergleichsstruktur dar. Aufgrund dessen könnte es sich bei den beiden Enzymen um eine, von den
bereits bekannten Luciferase-ähnlichen Proteinen unterschiedliche, LLM-Variante handeln. Die
beiden eng miteinander verwandten LLM MsnO8 und RslO6 zeigten hingegen eine vollständige,
unveränderte Anordnung der zentralen β-Faltblätter (siehe Abbildung 5.61 und Abbildung 5.64).
Abbildung 5.60 Unterschiede in der Sekundärstruktur des TIM-Barrels von MsnO4 (blau) und MsnO2 (grün).
In einem weiteren Schritt wurden sowohl MsnO4 als auch MsnO2 mit der von Sarah Maier im
Rahmen ihrer Doktorarbeit aufgeklärten Struktur von MsnO8 verglichen (siehe Abbildung 5.61 und
Abbildung 5.63) [1]. Erwartungsgemäß konnten für beide Fälle relativ starke Abweichungen sowohl in
der räumlichen Ausrichtung der α-Helices und β-Faltblätter, als auch in der Menge an insgesamt im
TIM-Barrel vorhandenen β-Faltblättern beobachtet werden (siehe Abbildung 5.62). In der
138
Ergebnisse
potentiellen Struktur von MsnO2 und MsnO4 wurden verglichen mit MsnO8 weniger definierte
Sekundärstrukturen vorhergesagt.
Abbildung 5.61 Strukturalignment der I-Tasser Modelle von MsnO4 (blau) und MsnO8 (rot) [1].
Abbildung 5.62 Unterschiede in der Sekundärstruktur der TIM-Barrels von MsnO4 (blau) und MsnO8 (rot) [1].
139
Ergebnisse
Abbildung 5.63 Strukturalignment der I-Tasser Modelle von MsnO2 (grün) und MsnO8 (rot) [1].
Da
die
in
Streptomyceten
vergleichsweise
selten
vorkommenden
Luciferase-ähnlichen
Monooxygenasen sowohl im Mensacarcin- als auch im Rishirilid-Gencluster vermehrt auftreten,
wurden zusätzlich die Strukturen dieser LLM clusterübergreifend miteinander verglichen. Gemäß der
in Kapitel 5.7.1 beschriebenen Verwandtschaftsverhältnisse wurden im Alignment von MsnO4 mit
RslO6 relativ große strukturelle Unterschiede beobachtet (siehe Abbildung 5.64). RslO6 weist ähnlich,
wie MsnO8, ein vollständig ausgebildetes TIM-Barrel mit acht β-Faltblättern auf. Der detaillierte
Vergleich dieses Bereichs zeigt, dass im Gegensatz dazu in MsnO4 Teile der Proteinstruktur fehlen
oder verschoben sind (siehe Abbildung 5.65). Womöglich könnte dieser veränderte Aufbau von
MsnO4 auch einen negativen Einfluss auf die in vitro Proteinstabilität haben. Ein sehr ähnliches
Ergebnis wurde auch für den Strukturvergleich von MsnO2 mit RslO6 erzielt (siehe Abbildung 5.66).
140
Ergebnisse
Abbildung 5.64 Strukturalignment der I-Tasser Modelle von MsnO4 (blau) und RslO6 (violett) [6].
Abbildung 5.65 Unterschiede in der Sekundärstruktur der TIM-Barrel von MsnO4 (blau) und RslO6 (violett) [6].
Abbildung 5.66 Strukturalignment der I-Tasser Modelle von MsnO2 (grün) und RslO6 (violett) [6].
141
Ergebnisse
Ein weiterer Vergleich der beiden Luciferase-ähnlichen Monooxygenasen MsnO4 und MsnO2 wurde
mit der LLM RslO1 aus dem Rishirilid Cluster durchgeführt (siehe Abbildung 5.67 und Abbildung 5.68).
Das Protein RslO1 wurde zuvor von Chijian Zuo in seiner Dissertation aufgereinigt und kristallisiert.
Eine anschließende kristallographische Strukturaufklärung war jedoch nicht möglich [7]. Aus diesem
Grund wurde für RslO1 im Rahmen dieser Arbeit ein Strukturmodell mit I-Tasser erstellt und dieses
für die hier dargestellten Vergleiche verwendet. Im Unterschied zu den zuvor dargestellten
Strukturalignments wurde für die Gegenüberstellung von MsnO4 sowie MsnO2 mit RslO1 das beste
Ergebnis erzielt. Dies war im Fall von MsnO2 zu erwarten, da bereits das zuvor durchgeführte
Sequenzalignment mit RslO1 eine sehr hohe Übereinstimmung ergab (siehe Abbildung 5.53). Wie aus
Abbildung 5.67 und Abbildung 5.68 ersichtlich ist, zeigen die Proteine eine fast identische räumliche
Anordnung der α-Helices und β-Faltblätter. Erstaunlicherweise sind selbst Regionen ohne definierte
Sekundärstruktur (Loops) in einem hohen Grad konserviert.
Abbildung 5.67 Strukturalignment der I-Tasser Modelle von MsnO4 (hellblau) und RslO1 (dunkelblau).
142
Ergebnisse
Abbildung 5.68 Strukturalignment der I-Tasser Modelle von MsnO2 (grün) und RslO1 (dunkelblau).
Aufgrund der hohen Übereinstimmung der Aminosäuresequenz der Flavinreduktasen MsnO3 und
RslO2 wurde zuvor eine kombinatorische Austauschbarkeit der beiden Enzyme postuliert (siehe
5.7.1). Das anschließend mit der Pymol Software durchgeführte Alignment bestätigte diese
Ergebnisse. Da es sich bei den hier verglichenen Strukturen nur um bioinformatische
Homologiemodelle handelte können die erhaltenen Resultate nicht als sicher angenommen werden.
Eindeutig sichtbar ist jedoch die Tendenz einer sehr ähnlichen räumlichen Anordnung (siehe
Abbildung 5.69). Den einzigen tatsächlichen Unterschied stellt eine in der Struktur von MsnO3
vorhandene α-Helix dar. Da sich diese wahrscheinlich aber außerhalb der potentiellen CofaktorBindetasche befindet, sollte sie keine wichtige Rolle in der Aktivität des Proteins spielen (siehe hierzu
auch Abbildung 5.24).
143
Ergebnisse
Abbildung 5.69 Strukturalignment der I-Tasser Modelle der Flavinreduktasen MsnO3 (rot) und RslO2 (blau).
Den einzigen größeren Unterschied zwischen den Strukturen stellt eine zusätzlich in MnO3 vorhandene α-Helix dar (in rot).
Diese befindet sich allerdings außerhalb der potentiellen Cofaktor-Bindetasche und sollte somit keine wichtige Rolle in der
Aktivität des Proteins spielen.
144
Diskussion
6 Diskussion
6.1 Inaktivierungsexperimente zur weiteren Aufklärung der
Biosynthese von Didesmethylmensacarcin
Aufgrund von zuvor durch Katharina Probst [8], Uwe Hardter [9], Sarah Maier [1] und Tanja Heitzler
[179] im Rahmen ihrer Dissertationen durchgeführten Inaktivierungen von Genen aus dem
Mensacarcin-Cluster, konnten im Vorfeld dieser Arbeit bereits große Teile der Biosynthese aufgeklärt
werden [168]. Die Standardmethode mittels Redirect® lieferte im Fall der Ketoreduktasen MsnO10
und MsnO11, sowie der Luciferase-ähnlichen Monooxygenase MsnO2 nicht die eigentlichen
Substrate dieser Enzyme. Aus diesem Grund wurden weiterführende Experimente durchgeführt, die
in den folgenden Teilen dieses Kapitels nochmals im Detail beschrieben und die jeweiligen Ergebnisse
diskutiert werden.
6.1.1 Die Ketoreduktasen MsnO10 und MsnO11
Ketoreduktasen sind Enzyme die im Stande sind stereospezifisch ein Wasserstoffatom von NAD(P)H
auf eine Ketogruppe zu übertragen, wodurch ein sekundärer Alkohol entsteht. Sie können Einfluss
auf die Orientierung der Polyketidkette oder auf die Konfiguration von einzelnen Alkoholgruppen
haben. In PKS II-Genclustern sind sie an den frühen Schritten der Biosynthese beteiligt. Während der
Ketoreduktion kommt es zum Übergang von einer sp2 zu einer sp3 Hybridisierung, was in einer
erhöhten Flexibilität der Kette resultiert und dadurch schon im frühen Stadium der
Naturstoffproduktion Einfluss auf die finale Struktur haben kann [180]. Weiterhin konnte gezeigt
werden, dass Ketoreduktasen direkt oder indirekt an der Zyklisierung der Polyketidkette beteiligt sind
sowie Einfluss auf die Regiospezifität dieses Schrittes haben können. Dies konnte durch
Inaktivierungsexperimente mit Genen aus dem Mithramycin-, Nogalamycin- und der AclacinomycinCluster bestätigt werden [181]. Interessanterweise sind alle Polyketide vom PKS II Typ, unabhängig
von ihrer Kettenlänge und der zugrunde liegenden Startereinheit, am C 9-Atom reduziert. Zu der
Gruppe der sogenannten C 9-Ketoreduktasen gehört das am besten untersuchte Enzym dieser Klasse,
die Act-KR aus dem Actinorhodin-Gencluster [182]. Neben Act-KR wurde auch die Hed-KR, eine
ähnliche Ketoreduktase aus dem Hedamycin-Cluster kristallisiert und detailliert untersucht. Javidpour
et al. postulierten aufgrund dieser Ergebnisse ein definiertes Gleichgewicht zwischen
Kettenverlängerung, Zyklisierung und Ketoreduktion als Voraussetzung für die C 9-Regiospezifität der
Enzyme [183]. Das an der Biosynthese von Mensacarcin beteiligte MsnO11 besitzt eine dem ActKR
145
Diskussion
signifikant ähnliche Aminosäuresequenz und wurde deswegen auch den C 9-Ketoreduktasen
zugeordnet. Die von Sarah Maier durchgeführte Inaktivierung von MsnO11 führte zum kompletten
erliegen der Didesmethylmensacarcin-Biosynthese. Da die Mutante S. albus Cos2∆O11 x pKR1 nicht
mehr im Stande war Mensacarcin-Intermediate zu produzieren, wurde postuliert, dass MsnO11 auf
katalytische oder strukturelle Weise essentiell für die Bildung der Polyketidkette sein muss [1]. Auch
für die Enterocin-Biosynthese wurde eine minimale PKS vom Typ II beschrieben, die ohne die
entsprechende Ketoreduktase aus dem Cluster nicht funktionsfähig wäre [184]. Um festzustellen ob
MsnO11 eine rein sterische oder auch eine katalytische Rolle spielt, wurde eine Punktmutation im
aktiven Zentrum des Enzyms eingeführt. Hierfür wurde mithilfe einer Overlap-Extension PCR ein
hochkonserviertes Serin aus der katalytischen Tetrade des Enzyms (siehe Abbildung 6.1) gegen ein
Alanin ausgetauscht und die Mutante S. albus Cos2∆O11 x pKR1 anschließend mit dem so
veränderten Gen msnO11SA komplementiert. Als Kontrolle wurde parallel eine Komplementierung
mit dem nicht mutierten msnO11 durchgeführt. Durch die Anwesenheit des Plasmids pKR1 wurde
zusätzlich der SARP-Regulator msnR1 überexprimiert. Dieser ist essentiell für eine detektierbare
Produktion von Mensacarcin Intermediaten [8]. Erwartungsgemäß wurde durch die Einführung von
msnO11
die
Didesmethylmensacarcin-Biosynthese
wiederhergestellt.
Die
Mutante
S.albus Cos2∆O11 x pKR1 x msnO11SA war nach wie vor nicht imstande Didesmethylmensacarcin
oder andere Biosynthese-Intermediate zu produzieren.
146
Diskussion
Abbildung 6.1 Clustal Omega Alignment der Aminosäuresequenzen der Ketoreduktasen MsnO10 und MsnO11 aus dem
Mensacarcin-Gencluster sowie anderer bekannter Ketoreduktasen.
Die Aminosäuren der Katalytischen Tetrade sind rot markiert.
Somit konnte gezeigt werden, dass MsnO11 eine katalytische Funktion besitzt. Des Weiteren findet
die von ihr eingeleitete Ketoreduktion sehr wahrscheinlich schon während der PolyketidKettenverlängerung statt. Auch für den Fall der Ketoreduktase EncD aus dem EnterocinBiosyntheseweg konnten nach Einführung einer identischen Punktmutation keine PolyketidIntermediate isoliert werden. Die Komplementierung mit der funktionsfähigen actKR führte immer
noch zu demselben Ergebnis. Somit wurde die Hypothese erstellt, dass es in PKS II-Systemen zwei
unterschiedliche Wege der Ketoreduktion geben könnte, entweder während der Bildung der
Polyketidkette (EncD), oder danach (ActKR) [184]. MsnO11 könnte ein neues Mitglied der ersten
Gruppe sein. Zur weiteren Systematisierung wäre es sinnvoll Komplementierungen der
S. albus Cos2∆O11 x pKR1
Mutante
mit
encD
aus
dem
Enterocin-Biosynthesecluster
aus
Streptomyces maritimus, sowie den anderen Ketoreduktase-Genen aus dem Mensacarcin-Cluster
(msnO10 und msnO1) durchzuführen. Eine funktionell gleiche Ketoreduktase müsste imstande sein
die Didesmethylmensacarcin-Produktion wiederherzustellen.
147
Diskussion
Der Knockout von msnO10 führte in S. albus zur Produktion zweier neuer Intermediate, Msn-SM1
und Msn-SM2. Das aufgereinigte Msn-SM2 besaß eine stark verkürzte Kettenlänge und wies eine
veränderte Faltung der Polyketidkette auf (siehe Abbildung 6.2). Aus diesem Grund wurde von Sarah
Maier für die Ketoreduktase MsnO10 ein stabilisierender Einfluss auf die minimale PKS postuliert [1].
Da das Muster der Zyklisierung von Msn-SM2 im Vergleich zu Mensacarcin verändert war, könnte
dies auch ein Hinweis auf eine Zusammenarbeit mit einer oder mehreren Zyklasen sein. Das
Ketoreduktasen nicht unbedingt immer selbstständig arbeiten müssen wurde bereits, unter anderem
für die Biosynthese von Griseorhodin, gezeigt in der das bifunktionelle Enzym GrhT aus einer Zyklaseund einer Reduktase-Einheit besteht [80].
Abbildung 6.2 Die Strukturen von Didesmethylmensacarcin und Msn-SM2 [1].
Auch in diesem Fall wurde eine Punktmutation im aktiven Zentrum von MsnO10 eingeführt um
festzustellen ob das Protein eine rein sterische oder auch eine katalytische Rolle in der MensacarcinBiosynthese spielen könnte. Wie im Fall von MsnO11 wurde mithilfe einer Overlap-Extension PCR ein
hochkonserviertes Serin aus der katalytischen Tetrade des Enzyms (siehe Abbildung 6.1) gegen ein
Alanin ausgetauscht und die Mutante S. albus Cos2∆O10 x pKR1 anschließend mit dem so
veränderten Gen msnO10SA komplementiert. Als Kontrolle wurde eine Komplementierung mit dem
nicht mutierten msnO10 durchgeführt. Die Verwendung von msnO10 führte zur Wiederherstellung
der Didesmethylmensacarcin-Produktion, die Komplementierung mit msnO10SA wiederum zur
erneuten Isolierung von Msn-SM2. Das Ergebnis beweist zum einen, dass MsnO10 nicht nur eine
sterische, sondern auch eine katalytische Funktion im Gencluster hat. Zum anderen, könnte es
aufgrund der veränderten Zyklisierung ein Hinweis auf die Existenz eines funktionellen Komplexes
mit einer oder mehreren Zyklasen sein. Des Weiteren könnte MsnO10 neben ihrer bisher
postulierten Funktion als Ketoreduktase, auch selbst einen wichtigen Einfluss auf die korrekte Faltung
der Mensacarcin-Struktur haben. Letzteres konnte bereits für GrhT aus der Griseorhodin-Biosynthese
148
Diskussion
gezeigt werden [185]. Außerdem wurde schon seit längerem vermutet, dass viele Enzyme im Rahmen
von PKS-Clustern nicht ausschließlich eine Funktion haben, sondern abhängig von den anderen
Komponenten des Clusters vielseitig zum Einsatz kommen können [186]. Die Existenz eines
Funktionellen Komplexes der Zyklasen gemeinsam mit anderen Enzymen der MensacarcinBiosynthese wurde zuvor bereits von Tanja Heitzler im Rahmen ihrer Dissertation postuliert [179]. Ein
solcher Multienzymkomplex könnte viel effektiver unerwünschte Zyklisierungsreaktionen verhindern
und zudem an mehreren Stellen der Polyketidkette gleichzeitig verschiedenen Reaktionen
katalysieren. Somit könnte er auch zur Steigerung der Effizienz der gesamten Biosynthese beitragen
[187].
6.1.2 Die Funktion der Luciferase-ähnlichen Monooxygenase (LLM)
MsnO2
Luciferase-ähnliche Monooxygenasen bilden, zusammen mit den eigentlichen Luciferasen eine
eigenständige Untergruppe der Flavoprotein Monooxygenasen (Klasse C) [2]. Sowohl Luciferasen, als
auch LLM sind aus zwei heterodimeren Untereinheiten aufgebaut und zeigen in ihrer
Aminosäuresequenz und in ihrer Struktur eine große Ähnlichkeit zur Modellstruktur der bakteriellen
Luciferase aus Vibrio harveyi [29][34][35]. Trotz dieser relativ großen strukturellen Verwandtschaft
werden viele unterschiedliche Reaktionen von Enzymen dieser Klasse katalysiert. Bakterielle
Luciferasen (LuxA/LuxB) führen eine Oxidation von langkettigen Alkanen unter gleichzeitiger Emission
von blau-grünem Licht durch [188]. Des Weiteren wurden Reaktionen wie die Desulfonierung von
Alkansulfonaten, die Hydroxylierung von p-Hydroxyphenylacetat, der Abbau von EDTA sowie
Nitrilotriessigsäure, die Oxidation von langkettigen Alkanen ohne Emission von Licht und der Abbau
von Dibenzothiophen beschrieben [39].
Die Luciferase-ähnliche Monooxygenase MsnO2 wurde zuvor von Uwe Hardter im Rahmen seiner
Dissertation mittels Redirect® auf dem Cosmid Cos2 inaktiviert. Bei der anschließenden
Produktionsanalyse in Streptomyces albus konnte ein neues Biosyntheseintermediat, das Msn-UH
genannt wurde, isoliert werden (siehe Abbildung 6.3). Basierend auf diesem Ergebnis wurde die
Hypothese aufgestellt, dass MsnO2 die Didesmethylmensacarcin-Seitenkette reduziert und
gleichzeitig eine Doppelbindung einführt. Diese könnte im Anschluss darauf zu der in Mensacarcin
nachweisbaren Epoxidgruppe weiterreagieren [9]. Die Komplementierung der Knockout-Mutante
führte zwar zur Wiederherstellung der DDMM-Produktion, jedoch konnte auch Msn-UH immer noch
nachgewiesen werden [1]. Dadurch konnte das Ergebnis nicht sicher bestätigt werden.
149
Diskussion
Abbildung 6.3 Die bisher postulierte Funktion von MsnO2 [9].
Aufgrund von Inaktivierungsexperimenten in S. albus wurde von U. Hardter die Reduktion einer OH-Gruppe und Einführung
einer Doppelbindung in der Seitenkette des Moleküls als die von MsnO2 katalysierte Reaktion angenommen. Im Laufe der
weiteren DDMM-Biosynthese könnte anschließend die Doppelbindung zu einer Epoxidgruppe oxidiert werden.
Streptomyces albus ist einer der Aktinomyceten-Stämme die am häufigsten zur heterologen
Produktion von Polyketid-Naturstoffen eingesetzt werden. Bereits seine erste Verwendung zur
Synthese von Steffimycin führte zu einer relativ hohen Ausbeute von 10 mg/mL [189]. Durch die
Verwendung von starken, konstitutiven Promotoren wie ermEp* und die Coexpression von
Regulator-Genen konnten signifikant größere Naturstoff-Ausbeuten erzielt werden. Ein Beispiel ist
das Fredericamycin aus Streptomyces griseus. Dieses konnte aus S. albus-Kulturen in einer
Konzentration von 120 mg/L isoliert werden [190]. Unter gewissen Umständen kann die Verwendung
eines
heterologen
Streptomyceten
Wirtes
das
Produktionsprofil
jedoch
verfälschen.
Streptomyces coelicolor ist der natürliche Produzent des Actinorhodins, eines Polyketids das aus
intrazellulären Acetyl- und Malonyl-CoA Einheiten aufgebaut wird. Aus diesem Grund werden diese
Grundbausteine auch bevorzugt im Stamm gebildet und der Synthese von Naturstoffen zur
Verfügung gestellt. Die heterologe Produktion von Komponenten die andere Grundbausteine für
ihren Aufbau benötigen kann aus diesem Grund oft nicht optimal von S. coelicolor unterstützt
werden [191]. Auch in Streptomyces albus kann es in seltenen Fällen zu solch einem Effekt kommen,
da dieser natürlicherweise vor allem auf die Produktion seiner eigenen Metaboliten, wie dem
Polyether-Antibiotikum Salinomycin eingestellt ist [192]. Um einen verfälschenden Einfluss des
heterologen Wirts auszuschließen, wurde das Gen msnO2 im natürlichen Mensacarcin-Produzenten
Streptomyces bottropensis ausgeschaltet. Zuerst wurde ein neuer Knockout von msnO2 auf Cos2
durchgeführt und die Produktion in S. albus getestet. Es konnte dabei erneut Msn-UH nachgewiesen
150
Diskussion
werden. Anschließend wurde zusätzlich die auf Cos2 lokalisierte Integrase mittels Redirect® gegen
eine Ampicillin-Resistenzkassette getauscht. Mit dem Konstrukt Cos2∆O2∆Int wurde das auf der
genomischen
DNA
von
S. bottropensis
ausgeschaltet
und die so
lokalisierte
erhaltene Mutante
msnO2-Gen
mittels
Double-Crossover
S. bottropensis∆msnO2 für anschließende
Produktionsanalysen in DNPM- und MYM-Medium verwendet. In beiden Medien konnten weder
Mensacarcin noch dessen Intermediate gefunden werden. Stattdessen resultierte die Mutation in
einer starken Produktion von Rishirilid B. Da die Biosynthese der Rishirilide normalerweise in
S. bottropensis von einem separaten Gencluster gesteuert wird, war dieses Ergebnis sehr
überraschend. Durch die anschließend durchgeführte Komplementierung mit dem Plasmid pkR1O2
konnte die Mensacarcin-Produktion komplett wiederhergestellt werden, wodurch Polare Effekte als
Grund für das Ergebnis ausgeschlossen werden konnten.
Abbildung 6.4 Die Struktur von Rishirilid B [6].
Rishirilid wird wie Mensacarcin natürlicherweise von Streptomyces bottropensis produziert. Die Biosynthese wird dabei
normalerweise von einem separaten PKS II Gencuster (dem rsl Cluster) gesteuert.
Ein Fehlen jeglicher Mensacarcin-Intermediate im Produktionsprofil der Mutante lässt darauf
schließen, dass MsnO2 anders als bisher vermutet bereits am Anfang der Biosynthese eine wichtige
Rolle spielen muss. Es wäre denkbar, dass das Protein Teil eines größeren Multienzym-Komplexes ist,
in dem die jeweiligen Komponenten separat nicht funktionsfähig sind. Ähnliches wurde für den
Pradimicin A-Biosyntheseweg in Actinomadura hibisca bewiesen. Die beiden Zyklasen PdmK und
PdmL waren nur in Anwesenheit der Monooxygenase PdmH aktiv. Diese wiederum benötigte die
beiden Zyklasen für die Oxidierungsreaktion [187][193]. Die Aktivierung der Rishirilid B Produktion
aufgrund der Inaktivierung von msnO2 lässt desweiteren vermuten, dass es eine Cross-Regulierung
zwischen dem msn- und dem rsl-Cluster in S. bottropensis geben könnte. Die Koordinierung der
Jadomycin-Biosynthese in Streptomyces venezuelae ist eines der wenigen Beispiele für einen solchen
„Gencluster-übergreifenden“ Mechanismus. Mittels kombinatorischer Experimente konnte gezeigt
werden, dass das im jad-Cluster lokalisierte jadX Gen unter bestimmten Bedingungen die Produktion
von Jadomycin verhindern und gleichzeitig die von Chloramphenicol begünstigen kann [97][95]. Des
151
Diskussion
Weiteren ist hier Streptomyces coelicolor zu nennen in dem die regulatorischen Proteine AfsR und
PhoP für die Kontrolle der Biosynthese von Actinorhodin und Undecylprodigiosin verantwortlich sind.
Interessanterweise ist AfsR imstande mit der phoRP Promotor Region zu interagieren. PhoP kann
wiederum den afsS Promotor und den AfsR Operator binden [101]. Schlüsselenzyme des
Stickstoffmetabolismus sind in phoP-Mutanten hochreguliert und in afsS-Mutanten herunter
reguliert. Dies deutet auf einen Anpassungsmechanismus hin, der es erlaubt sich schnell an eine
wechselnde Nährstoffversorgung anzupassen [102][103]. Auch in nicht pathogenen E. coli Stämmen
wurde eine direkte Kommunikation zwischen zwei Adhesin Genclustern (fim und pap) beschrieben.
PapB, ein Transkriptionsregulator aus dem pap-Operon war imstande spezifische DNA-Regionen im
fim Cluster zu binden. Die Cross-Regulierung zwischen unterschiedlichen Adhesin-Genclustern dient
pathogenen Keimen wahrscheinlich der Anpassung an wechselnde äußere Bedingungen. Das
Bakterium kann so, durch die Produktion von nur der Art an Adhesinen die gerade benötigt wird um
mit den Wirtszellen zu interagieren, Energie sparen [104][105]. Womöglich deutet das veränderte
Produktionsprofil von S. bottropensis nach dem Knockout von msnO2 auch auf einen solchen
Anpassungsmechanismus hin. Durch weitere gezielte Inaktivierungsexperimente von Genen aus dem
Mensacarcin- und Rishirilid-Gencluster könnte die Hypothese einer Cross-Regulierung weiter
verifiziert werden (siehe hierzu auch Kapitel 6.3).
6.2 Untersuchungen der LLM MsnO4 und MsnO2 auf
Proteinebene
Im Mensacarcin-Gencluster wurden drei Gene gefunden die für Proteine kodieren die der Gruppe der
Luciferase-ähnlichen Monooxygenasen zugehören - msnO2, msnO4 und msnO8 [3]. Enzyme dieser
Art sind strukturell stark mit den Luciferasen verwandt und bilden zusammen mit diesen eine
separate Untergruppe der Flavoprotein Monooxygenasen [2]. Als erste Kristallstruktur dieser Familie
mit gebundenem FMN-Cofaktor wurde 2009 die Luciferase aus Vibrio harveyi veröffentlicht [29]. Die
Monomere des Proteins sind jeweils in einem TIM (β/α)8 Barrel angeordnet. Der Cofaktor FMN ist
komplett in der α-Untereinheit der heterodimeren Struktur lokalisiert. Er befindet sich in einem
relativ großen Hohlraum von dem aus ein direkter Zugang zum Lösungsmittel besteht. Innerhalb der
α-Untereinheit, in Nähe der FMN-Bindetasche, befindet sich auch die am höchsten konservierte
Region der Luciferase-Sequenz [29]. Sie stellt eine flexible Region (Loop) dar, die erst durch die
Bindung von FMN oder eines polyvalenten Anions vor proteolytischer Inaktivierung geschützt
werden kann [30]. Gleichzeitig scheint dieser Bereich von großer Bedeutung für die Stabilisierung des
Dimers, sowie für die Interaktion von α- und β-Untereinheit zu sein. Das planare FMN ist komplett
152
Diskussion
nicht kovalent gebunden und wird nur über Wasserstoffbrücken innerhalb der Bindetasche
stabilisiert [31]. Die Kristallstruktur von Apo-MsnO8 wurde von Sarah Maier im Rahmen ihrer
Dissertation aufgeklärt [1]. Eine Co-Kristallisierung mit dem Cofaktor FMN war nicht möglich,
allerdings konnten drei hochkonservierte Aminosäuren identifiziert werden (E43, H44 und S170) die
wahrscheinlich einen wichtigen Einfluss auf die Wechselwirkung mit FMN haben [19]. Im Rahmen der
vorliegenden Arbeit wurde eine weitere Luciferase-ähnliche Monooxygenase, MsnO4 aufgereinigt
und für Kristallisierungsexperimente, sowie in vitro Aktivitätsassays verwendet. Zum Vergleich
erfolgten
Fütterungsexperimente
in
Streptomyces albus.
Zuletzt
wurden
bioinformatische
Strukturvergleiche mit anderen Luciferasen sowie LLM, die an der Biosynthese von Mensacarcin und
Rishirilid beteiligt sind, durchgeführt.
6.2.1 Produktion und Aufreinigung von MsnO4
Für die Durchführung von in vitro Proteinassays und Kristallisierungsexperimenten mit MsnO4,
musste das Protein in hoher Reinheit und in relativ großen Mengen zur Verfügung gestellt werden.
Eine effektive Produktion in E. coli war trotz des potenziell problematisch hohen GC-Gehalts in dem
ursprünglich aus dem Aktinomyceten S. bottropensis stammenden Gen msnO4 möglich [194]. Die
besten Ergebnisse wurden bei Verwendung des ZYM-5052 Autoinduktionsmediums bei 18 °C erzielt.
Durch die relativ niedrige Produktionstemperatur und die durch das Medium bedingte langsame
Induktion der Produktion, konnte eine hohe Ausbeute an nicht aggregiertem Protein erzielt werden
[195]. Die Aufreinigung erfolgte in zwei Etappen, zuerst mittels His-Trap Affinitätschromatographie
und anschließend durch Größenausschlusschromatographie. Durch den zweiten Schritt konnten die
letzten aggregierten Anteile von MsnO4 effektiv abgetrennt werden. Die Kombination von mehreren
chromatographischen Methoden ermöglicht zudem generell eine präzisere Aufreinigung und ist
einem Einschrittverfahren vorzuziehen wenn als Folgeexperiment eine Kristallisierung geplant ist
[177].
6.2.2 Fütterungsexperimente und Enzymassays mit MsnO4
Die genaue Funktion von MsnO4 konnte bis jetzt nicht geklärt werden. Knockout-Experimente mit
msnO4 die zuvor von Katharina Probst im Rahmen ihrer Dissertation durchgeführt wurden, führten
nicht zur Isolierung des nativen Substrates, sondern eines mit einem Mycothiol-Rest substituierten
stabilen Biosynthese-Zwischenprodukts (Msn-KP3). Als wahrscheinlichste Funktion von MsnO4
wurde daraufhin die Einführung der Epoxidgruppe im Ringsystem des Naturstoffes postuliert [8].
Unbekannt bleibt jedoch auch die Herkunft der Hydroxylgruppen an Position C2 und C4 (siehe
153
Diskussion
Abbildung 6.5). Diese könnten allerdings auch aus der Aktivität einer der im Gencluster enthaltenen
Ketoreduktasen resultieren. Für einige Polyketid-Synthesewege, wie zum Beispiel den des
Doxorubicins aus Streptomyces peucetius wurde eine solche Ketoreduktase-Reaktion bereits
beschrieben. Im Endprodukt der Biosynthese waren entsprechende, chirale Hydroxylgruppen an
Position C7 und an der Seitenkette nachweisbar [196]. Die Lokalisation der chiralen Hydroxylgruppen
C2 und C4 im Didesmethylmensacarcin könnte auf einen, der Doxorubicin-Biosynthese ähnlichen,
Mechanismus hinweisen (siehe Abbildung 6.5). Weitere Beispiele solcher Ketoreduktase-Aktivität
wurden für die Gene snoaF aus dem Nogalamycin Cluster [197] und chaL aus dem ChartreusinCluster [198] beschrieben.
Abbildung 6.5 Die Strukturen von Didesmethylmensacarcin und Doxorubicin im Vergleich.
Die chiralen Hydroxylgruppen, die durch die Aktivität von Ketoreduktasen entstanden sein könnten sind in rot nummeriert.
Aufgrund dieser Beobachtungen wurde auch im Rahmen dieser Arbeit die Einführung der
Epoxidgruppe als wahrscheinliche MsnO4-Funktion angenommen. Für die Durchführung späterer
Fütterungsexperimente und in vitro Assays wurden basierend auf dieser Annahme entsprechende
Anthrachinon-Derivate, die dem natürlichen MsnO4-Substrat ähnlich sein könnten ausgesucht (siehe
Abbildung 6.6).
154
Diskussion
Abbildung 6.6 Die in den Fütterungsexperimenten mit MsnO4 und MnO3 in Streptomyces albus verwendeten
Anthrachinon-Derivate.
A) 1,4-Dihydroantrachinon; B) 1-Methoxy-3-methyl-2-pent-2-enylantrachinon
Von Sarah Maier wurde in ihrer Dissertation ein Zweikomponentensystem der Luciferase-ähnlichen
Monooxygenase MsnO8 und der Flavinreduktase MsnO3 aus dem Mensacarcin Biosyntheseweg
beschrieben [1]. Für MsnO4, das dem MsnO8 sehr ähnlich ist, kann mit großer Wahrscheinlichkeit
auch eine solche Abhängigkeit von der MsnO3-Aktivität angenommen werden. Ein weiteres Beispiel
für einen vergleichbaren Mechanismus stellt die Epoxidierungsreaktion des ungesättigten 6-Rings
während der Abyssomycin C-Biosynthese im Actinomyceten Verrucosispora maris AB 18-032 dar. In
diesem Fall wurde die Reaktion von der LLM AbyE und der Flavinreduktase AbyZ katalysiert. Anders
als in Mensacarcin konnte das Epoxid jedoch nicht isoliert werden. Als Grund wurde eine
anschließende, für das System energetisch vorteilhafte Ringöffnung, die zur Entstehung von AtropAbyssomycin führt, postuliert [42].
Für die Durchführung der Fütterungsexperimente wurden die Gene msnO4 und msnO3 in
Streptomyces albus eingebracht, der Stamm über mehrere Tage in DNPM-Produktionsmedium
kultiviert und dann das Substrat 1,4-Dihydroantrachinon oder 1-Methoxy-3-methyl-2-pent-2enylantrachinon zugegeben. Das Experiment führte allerdings zu keiner Umsetzung der
angewendeten Substanzen. Dies könnte zum einen an einer nicht ausreichenden Aufnahme in die
Zellen, oder anderen störenden Faktoren des Produktionssystems gelegen haben. Womöglich waren
aber auch die beiden ausgewählten Anthrachinon-Derivate dem natürlichen Substrat von MsnO4
nicht ausreichend ähnlich.
Um mögliche äußere Einflüsse ausschließen zu können, wurden dieselben Substanzen nochmals in
einem in vitro Aktivitätsassay getestet. Dieser wurde analog zu dem von Sarah Maier zuvor für
MsnO8 entwickeltem Assay durchgeführt [1]. Hierfür wurden die aufgereinigten Proteine MsnO4 und
MsnO3 mit FMN und NADH versetzt und anschließend die künstlichen Substrate zugegeben. In der
anschließenden HPLC-Analytik konnte auch in diesem Fall keine Umsetzung festgestellt werden. Eine
155
Diskussion
wahrscheinliche Erklärung könnte sein, dass die ausgewählten Substanzen nicht spezifisch genug
waren. Auch für die Oxidierung von Aldehyden durch bakterielle Luciferasen wurde ein solches
Verhalten beschrieben. Selbst bei kleinen Veränderungen der Kettenlänge des Aldehyds, konnten
hier nur sehr geringe bis gar keine Umsetzungsraten festgestellt werden [199]. Einige Luciferaseähnlichen Monooxygenasen, wie zum Beispiel die aus Archaebakterien isolierte AlkoholDehydrogenase Adf, benötigen nicht FMN sondern F420 als Cofaktor [54]. Um auszuschließen, dass es
sich bei FMN nicht um den wahren Cofaktor von MsnO4 handeln könnte, wurden zusätzlich in vitro
Assays mit F420 durchgeführt [1]. Diese führten allerdings erneut zu demselben Resultat.
Abbildung 6.7 Clustal Omega Alignment der Aminosäuresequenzen von MsnO8, MsnO4 und der Luciferase aus
Vibrio harveyi.
Die wahrscheinlich an der Cofaktor-Bindung beteiligten, hochkonservierten Aminosäuren E44 und H45 sind in rot markiert.
Die in diesem Kapitel dargestellten Ergebnisse deuten darauf hin, dass für einen eindeutigen
Nachweis der Aktivität von MsnO4 das natürliche Substrat benötigt wird. Da nicht ausgeschlossen
werden kann, dass das Enzym zusätzlich zu seiner katalytischen Funktion auch einen stabilisierenden
Einfluss auf das gesuchte Biosyntheseintermediat haben könnte, wäre womöglich eine gezielte
Einführung von Punktmutationen in das msnO4 Gen sinnvoll. Auf die Art könnte anschließend eine
156
Diskussion
Produktion von katalytisch inaktivem MsnO4, sowie womöglich die Isolierung dessen Substrats
erzielt werden. Anbieten würde sich die Mutation einer der hochkonservierten Aminosäuren E43
oder H44. (Abbildung 6.7) [19][200]. Des Weiteren könnte auch ein Knockout von msnO4 auf der
genomischen DNA des natürlichen Mensacarcin-Produzenten S. bottropensis weitere Einblicke in
dessen Funktion liefern. Ähnliches wurde im Rahmen dieser Arbeit bereits für die LLM MsnO2
beschrieben (vergleiche Kapitel 6.1.2). Zu bedenken ist auch, dass MsnO4 womöglich nicht nur für
die Epoxidierung im Ringsystem von Mensacarcin, sondern auch für die Einführung von einer oder
mehrerer Hydroxid-Gruppen verantwortlich sein könnte. Ein solches Verhalten ist für die Epoxidase
MycG aus dem Gencluster des Makrolidantibiotikums Mycinamycin in Micromonospora griseorubida
bekannt. Diese ist nicht nur für die Einführung einer Epoxidgruppe, sondern auch für die
Hydroxylierung an α-Position während der Biosynthese verantwortlich [79]. Könnte zukünftig ein
Zweikomponentensystem bestehend aus der LLM MsnO4 und der Flavinreduktase MsnO3
nachgewiesen werden, bliebe dennoch die Frage nach dem Nutzen eines solchen Systems für das
Bakterium. Ein möglicher, plausibler Grund könnte die Fixierung und der effektivere Transport von
ansonsten instabilen Metaboliten, bzw. Biosyntheseintermediaten innerhalb der Zelle sein [69].
6.2.3 Kristallisierungsexperimente
Im Anschluss an die Aufreinigung von MsnO4 wurden Kristallisierungsexperimente durchgeführt.
Zuerst wurde ein breites Screening von möglichen Pufferzusammensetzungen durchgeführt und nach
Bedingungen gesucht, in denen erste MsnO4-Kristalle detektiert werden konnten. Die Versuche
waren für manche Kristallisierungsbedingungen erfolgreich, jedoch blieb die Größe der erhaltenen
Kristalle zu klein für eine Strukturaufklärung. Auch die anschließende Optimierung der verwendeten
Pufferzusammensetzungen
konnte
das
Ergebnis
nicht
verbessern.
Da
die
optimalen
Kristallisierungsbedingungen für jedes Protein sehr individuell und häufig auch nicht intuitiv sind,
kann auch im Fall von MsnO4 keine eindeutige Vorhersage getroffen werden, wie das Experiment
optimiert werden könnte. Im Folgenden werden kurz einige Verbesserungsmöglichkeiten diskutiert.
Denkbar wäre, dass die ausgewählte Methode der „Sitting-drop“ Kristallisierung für die spätere
Optimierung der Kristallgröße nicht geeignet war und ein anderes Verfahren getestet werden sollten
[201]. Die Zugabe von Salzen zu den Kristallisierungspuffern kann einen wichtigen Einfluss auf die
Ionenstärke und dadurch auch auf die Stabilität der sich formenden Strukturen haben. Ein Tausch des
verwendeten Salzes gegen ähnliche ionische Substanzen könnte zu besseren Ergebnissen führen
[202]. Werden Polymere, wie beispielhaft Polyethylenglycol im Puffer verwendet, können bereits
kleine Abweichungen von 1-2 % von der optimalen Konzentration zu einer fehlenden Kristallisierung
oder zu amorphen Niederschlägen führen. Veränderungen der Polymerkonzentration sollten daher
157
Diskussion
bei der Methodenoptimierung womöglich engmaschiger durchgeführt werden [203]. Im Rahmen
dieser Arbeit wurden für die Kristallisierungen Standard-Proteinkonzentrationen von 5-10 mg/mL
verwendet.
In
der
Literatur
sind
allerdings
Experimente
die
einen
viel
größeren
Konzentrationsbereich (zwischen 2 und 100 mg/mL) abdecken beschrieben. Eine stärkere
Veränderung der MsnO4-Konzentration könnte vielleicht zu einem besseren Ergebnis führen [201].
Obwohl der Einfluss der Kristallisierungsbedingungen sehr wichtig ist, kann die Ausbildung von
kleinen oder veränderten Kristallen auch am Protein selber liegen. So können Aminosäuren wie z.B.
Lysin und Glutaminsäure, wenn sie an der Oberfläche eines Proteins lokalisiert sind, die Bildung von
Kristallkeimen unterdrücken. In solchen Fällen kann die gezielte Einführung von einer oder mehreren
Punktmutationen zu einer verbesserten Kristallisierbarkeit führen [204].
6.2.4 Bioinformatische Untersuchungen von MsnO4
Anhand der bekannten Aminosäuresequenz von MsnO4 wurde mithilfe der Software I-TASSER ein
Strukturmodell des Proteins erstellt. Ähnlich wie die zuvor von Sarah Maier und Jana Derochefort in
ihren Dissertationen aufgeklärten Strukturen der Luciferase-ähnlichen Monooxygenasen (LLM)
MsnO8 und RslO6, zeigte MsnO4 eine große Ähnlichkeit zur Luciferase aus Vibrio harveyi (Lux A)
[1][6][29]. Außerdem besaß die vorhergesagte Struktur von MsnO4, so wie andere LLM, eine
charakteristische TIM-Barrel-ähnliche Anordnung der α-Helices und der β-Faltblätter. Mithilfe der
Software I-TASSER wurde eine Vorhersage getroffen, welche Aminosäuren wahrscheinlich an der
Bindung des Cofaktors beteiligt sein könnten. Ähnlich wie in MsnO8 und anderen Enzymen mit einer
TIM-Barrel Struktur, befand sich auch hier das katalytische Zentrum auf der C-terminalen Seite des βBarrels [205]. Allerdings waren in MsnO4, im Gegensatz zu MsnO8, RslO6 und Lux A nur sechs,
anstatt der normalerweise in einer solchen Struktur acht β-Faltblätter vorhanden. Abweichungen von
der normalen TIM-Barrel Struktur sind auch für andere Proteine bekannt. Eine Domäne der βGalaktosidase wird von einem Barrel mit acht β-Faltblättern aber nur sieben α-Helices gebildet. Auch
eine verminderte Anzahl an Faltblättern wurde bereits für das FMN-abhängige LuxF Protein aus
Photobacterium leiognathi, das ein (β/α)7 Barrel bildet beschrieben [206]. Eine Kombination von acht
α-Helices und sechs β-Faltblättern, wie sie anscheinend in MsnO4 vorkommt, ist bis jetzt allerdings
für keine der 21 bekannten TIM-Barrel enthaltenden Protein-Familien bekannt [207]. Da auch für
MsnO2, eine andere LLM aus dem Mensacarcin- und RslO1, eine LLM aus dem Rishirilid-Gencluster,
eine identische Struktur vorhergesagt wurde, könnte es sich um eine separate, bisher nicht
beschriebene Strukturfamilie handeln (siehe Kapitel 5.7.2). Die Ergebnisse der bioinformatischen
Modelle müssten allerdings im nächsten Schritt experimentell verifiziert und bestätigt werden. Ob
die Veränderung der Anzahl der β-Faltblätter einen negativen Einfluss auf die Stabilität der Cofaktor158
Diskussion
Bindung haben könnte bleibt unklar. Ein Vergleich der Lokalisierung der hypothetischen FMNBindetasche in MsnO4 mit dessen Position in der Luciferase aus Vibrio harveyi lässt jedoch vermuten,
dass dies nicht der Fall sein sollte. In beiden Fällen befindet sich das aktive Zentrum nicht zentral im
Protein, sondern seitlich, außerhalb des β-Barrels (siehe Abbildung 6.8) [29].
Abbildung 6.8 Die Lokalisierung der Cofaktor-Bindetasche in der Luciferase aus Vibrio harveyi und im bioinformatischen
Modell von MsnO4 [29].
Links: In der Luciferase aus Vibrio harveyi befindet sich der Cofaktor FMN nicht in direkter Interaktion mit der Struktur des
β-Barrels; Rechts: Auch in MsnO4 befinden sich die wahrscheinlich an der Cofaktor-Bindung beteiligten Aminosäuren (rot
markiert) außerhalb des β-Barrels.
Für das erstellte MsnO4-Modell wurden Strukturvergleiche mit den LLM MsnO2 und MsnO8 aus dem
Mensacarcin- sowie RslO1 und RslO6 aus dem Rishirilid-Biosyntheseweg erstellt. Die größte
Übereinstimmung konnte im Alignment mit RslO1 beobachtet werden. Die Protein-Modelle besitzen
eine fast identische räumliche Anordnung der α-Helices und β-Faltblätter. Selbst Regionen ohne
definierte Sekundärstruktur (Loops) sind in einem hohen Grad identisch (siehe Abbildung 6.9).
159
Diskussion
Abbildung 6.9 Das Struktur Alignment der I-TASSER Modelle von MsnO4 (hellblau) und RslO1 (dunkelblau).
Die Struktur der I-TASSER Modelle von MsnO4 und RsO1 zeigen eine hohe Übereinstimmung sowohl in der räumlichen
Anordnung der α-Helices und der β-Faltblätter, als auch in Bereichen die keine definierte Sekundärstruktur aufweisen
(Loops).
6.2.5 Produktion und Aufreinigung von MsnO2
Eine Aufgabe im Rahmen dieser Arbeit war die Aufreinigung und Charakterisierung der Luciferaseähnlichen Monooxygenase MsnO2. Da die Produktion in LB-Medium nach Anregung mit IPTG sowohl
bei 28 °C als auch bei 21 °C zur Entstehung von unlöslichen Proteinaggregaten führte, wurde
ZYM 5052 Autoinduktionsmedium für weitere Experimente verwendet. Für Produktionen in E. coli BL21 Codon Plus RP x pL1SL2 Zellen bei 18 °C über 56 h konnten die besten Ergebnisse erzielt werden.
Dank der relativ niedrigen Temperatur und der durch das Medium bedingten langsamen Induktion
der Proteinproduktion, konnte die Ausbeute an nicht aggregiertem Protein erhöht werden [195]. Die
anschließende
Aufreinigung
erfolgte
in
zwei
Etappen,
zuerst
mittels
His-Trap
Affinitätschromatographie und anschließend durch Größenausschlusschromatographie. Durch den
zweiten Schritt konnten restliche aggregierte Anteile von MsnO2 abgetrennt werden. Eine solche
Kombination von mehreren chromatographischen Methoden wird standartgemäß verwendet um
eine präzisere Aufreinigung zu erzielen [177]. Selbst nach erfolgter Methodenoptimierung war die
Proteinausbeute jedoch sehr gering. Zudem waren die Proben, selbst bei einer Lagerung bei -20 °C,
instabil und bereits nach kurzer Zeit konnte Proteinpräzipitation beobachtet werden. Im Vergleich zu
allen anderen bisher beschriebenen Luciferase-ähnlichen Monooxygenasen aus dem Mensacarcinund dem Rishirilid Biosyntheseweg (MsnO4, MsnO8, RslO1 und RslO6), stellte sich die Aufreinigung
von MsnO2 als besonders kompliziert heraus [1][6][7]. Hierfür könnte es viele Gründe geben. Zum
einen wurde angenommen, dass es sich bei MsnO2 ähnlich wie bei den anderen LLM um ein
160
Diskussion
lösliches, zytosolisches Enzym handelt. Bei der Aufreinigung konnte jedoch während des
Zellaufschlusses nur ein Teil des produzierten Proteins vom Zellpellet abgetrennt werden. Dies
könnte auf eine stärker als erwartete Interaktion mit der Zellmembran hindeuten. Aufgrund des mit
I-TASSER erstellten Homologiemodells von MsnO2 wurden dem Protein zusätzlich spezielle GO (Gene
Ontology)-Termini zugeordnet. Die Gene Ontology ist eine internationale Initiative zur
Vereinheitlichung der Nomenklatur in den Biowissenschaften und unter anderem bemüht Proteine
mit speziellen, universellen GO-Termini zu annotieren. Jede Zuordnung wird dann mit einem GOWert versehen welcher zwischen 0 und 1 liegt. Ein höherer Wert entspricht einer genaueren
Zuordnung [175]. In der GO-Kategorie „Zelluläre Komponente“ wurde MsnO2 mit fast derselben
Wahrscheinlichkeit als zytosolisches- und als Membran-Protein annotiert. Womöglich könnte es sich
bei dieser LLM um ein peripheres Membranprotein handeln. Enzyme dieser Gruppe assoziieren mit
der Oberfläche der Zellmembran, wobei die Bindung oftmals nur durch eine elektrostatische oder
hydrophobe Interaktion mit integralen Membranproteinen stattfindet. Dies könnte die nur begrenzte
Löslichkeit und Stabilität des isolierten MsnO2 erklären [208]. Andererseits konnte im Rahmen dieser
Arbeit mittels Geninaktivierung von msnO2 in Streptomyces bottropensis gezeigt werden, dass das
MsnO2-Protein wahrscheinlich schon am Anfang der Mensacarcin-Biosynthese eine wichtige Rolle
spielt (siehe Kapitel 6.1.2). Es erscheint plausibel, dass MsnO2 mit anderen Proteinen, die an den
ersten Schritten der Mensacarcin-Biosynthese beteiligt sind einen Multienzym-Komplex bilden
könnte. Proteine die Teil eines solchen Komplexes sind separat aufzureinigen ist meistens sehr
schwer. Hilfreich kann die Verwendung eines polycistronischen Proteinexpressionsplasmids sein. Mit
einem solchen Plasmid ist es möglich mehrere, für Proteine kodierende Gene, zu klonieren und
anschließend eine gleichzeitige Produktion der entsprechenden Enzyme durchzuführen [112][209].
Ob MsnO2 Bestandteil eines solchen Multienzym-Komplexes ist und mit welchen Proteinen eine
Wechselwirkung stattfindet, könnte mithilfe eines Pulldown-Assays geklärt werden. Bei einem
solchen Assay wird das zu testende Protein mithilfe eines speziellen Affinitäts-Tags zuerst an eine
geeignete Matrix gebunden (meist quervernetztes Dextran oder Agarose). Nach der Zugabe
möglicher Interaktionspartner, z.B. in Form eines Zelllysats und darauffolgenden Waschschritten,
verbleiben die Interaktionspartner an das Zielprotein und somit an die Matrix gebunden.
Anschließend können sie eluiert und analysiert werden. Auf diese Weise konnte zum Beispiel die
Interaktion der beiden Nitroreduktasen GINR1 und GINR2 im Parasiten Giardia lamblia nachgewiesen
werden [210].
161
Diskussion
6.2.6 Bioinformatische Untersuchungen von MsnO2
Basierend auf der Aminosäuresequenz von MsnO2 wurde mithilfe der Software I-TASSER ein
bioinformatisches Modell des Proteins erstellt (siehe Kapitel 5.4.2). Wie die zuvor von Sarah Maier
und Jana Derochefort in ihren Dissertationen aufgeklärten Strukturen der Luciferase-ähnlichen
Monooxygenasen (LLM) MsnO8 und RslO6, besitzt auch MsnO2 eine große Ähnlichkeit zur Luciferase
aus Vibrio harveyi [1][6][29].
Abbildung 6.10 Das Homologiemodell von MsnO2.
Die vorhergesagte Struktur zeigt einen TIM-Barrel-artigen Aufbau. Das Barrel scheint allerdings nicht vollständig zu sein, da
nur sechs der normalerweise acht enthaltenen β-Faltblätter zu erkennen sind.
Genau wie in der Modellstruktur von MsnO4, konnte auch in MsnO2 eine charakteristische TIMBarrel-ähnliche Anordnung der α-Helices und der β-Faltblätter identifiziert werden. Des Weiteren
wurden auch in diesem Fall nur sechs und nicht wie normalerweise in einem solchen Barrel
vorhanden acht Faltblätter identifiziert (siehe Abbildung 6.10). Das katalytische Zentrum befand sich,
erwartungsgemäß, auf der C-terminalen Seite des β-Barrels [205]. Mithilfe der Software I-TASSER
wurde eine Vorhersage getroffen welche Aminosäuren an der Bindung des Cofaktors beteiligt sein
könnten.
162
Diskussion
Tabelle 6.1 Vergleich der Aminosäuren die in den Modellstrukturen von MsnO2 und MsnO4 jeweils an der Bindung des
Cofaktors beteiligt sind.
Aminosäure in
Aminosäure in
Aminosäure in
Aminosäure in
MsnO2
MsnO4
MsnO2
MsnO4
43
Valin (V)
-
113
-
Phenylalanin (F)
44
Glutaminsäure (E)
-
175
Alanin (A)
-
45
Histidin (H)
Valin (V)
176
Threonin (T)
-
46
-
Glutaminsäure (E)
177
-
Alanin (A)
47
-
Histidin
178
Isoleucin (I)
Serin (S)
76
Glycin
179
Threonin (T)
-
77
Alanin (A)
-
180
Prolin (P)
Glycin (G)
78
-
Glycin (G)
181
Glutaminsäure (E)
Asparagin (N)
79
Prolin (P)
Alanin (A)
182
Serin (S)
Leucin (L)
81
-
Isoleucin (I)
183
-
Asparaginsäure (D)
108
Glycin (G)
-
184
-
Serin (S)
109
Arginin (R)
-
194
Methionin (M)
-
110
Glycin (G)
Glycin (G)
196
Valin (V)
Glutamin (Q)
111
Phenylalanin (F)
Arginin (R)
231
Serin (S)
-
112
-
Alanin (A)
233
-
Threonin (T)
Position
Position
Eine Zusammenstallung der vermutlich an der Ausbildung der Cofaktor-Bindetaschen in MsnO2 und
MsnO4 beteiligten Aminosäuren ist in Tabelle 6.1 gezeigt. Allgemein ist eine relativ hohe
Übereinstimmung zu sehen, allerdings sind die entsprechenden Aminosäuren in MsnO4 relativ zu
MsnO2 gesehen jeweils um zwei Positionen nach hinten verschoben. Wenn man diese Verschiebung
berücksichtigt wird ersichtlich, dass neun der zwanzig aufgelisteten Gruppen identisch sind (in
Tabelle 6.1 fett hervorgehoben). Des Weiteren befinden sich auch die anderen, nicht in beiden
Proteinen identischen Aminosäuren an ähnlichen Positionen in den Peptidketten. Zuletzt wurde die
Struktur von MsnO2 mithilfe der Software Pymol jeweils mit den anderen, an der Biosynthese von
Mensacarcin und Rishirilid beteiligten, LLM (MsnO4, MsnO8, RslO1 und RslO6) verglichen. Die
genaueste Überlagerung und somit auch höchste strukturelle Übereinstimmung konnte identisch wie
zuvor für MsnO4 beschrieben (siehe Kapitel 6.2.4), auch hier mit RslO1 beobachtet werden (siehe
Abbildung 6.11). In Angesicht dieser Ergebnisse und des zuvor beschriebenen Einflusses des MsnO2Knockouts in Streptomyces bottropensis auf die Rishirilid-Produktion (siehe Kapitel 5.1.3) könnte eine
Austauschbarkeit der Gene msnO2 und rslO1 sowie msnO4 und rslO1 prinzipiell denkbar sein. Um
diese Vermutungen zu verifizieren wären Komplementierungen der Knockout-Cosmide Cos2∆O2 und
Cos2∆O4 mit rslO1, sowie von Cos4∆O1 mit msnO2 und msnO4 sinnvoll.
163
Diskussion
Abbildung 6.11 Das Struktur Alignment der I-TASSER Modelle von MsnO2 (grün) und RslO1 (blau).
Die Struktur der I-TASSER Modelle von MsnO2 und RslO1 zeigen, wie im Fall von MsnO4, eine hohe Übereinstimmung
sowohl in der räumlichen Anordnung der α-Helices und der β-Faltblätter, als auch in Bereichen der dazwischen lokalisierten
Loops.
Zudem wurde von Chijian Zuo in seiner Dissertation gezeigt, dass ein Knockout von rslO1 in
Streptomyces albus zwar zur Produktion von Galvaquinon A führt, dieses aber nicht das Substrat von
RslO1, sondern nur ein Shunt Produkt der Biosynthese darstellt [7]. Die Struktur des Galvaquinons A
ähnelt interessanterweise sehr der des nach dem Knockout von msnO2 in Streptomyces albus
isoliertem Shunt Produkts Msn-UH (siehe Abbildung 6.12) [9]. Eine Inaktivierung von rslO1 auf der
genomischen DNA von Streptomyces bottropensis mit anschließender Produktionsanalyse könnte
weitere Informationen liefern. Wenn MsnO2 und RslO1 eine ähnliche Funktion besitzen, könnte
dieser Knockout von rslO1 einen detektierbaren Einfluss auf die Biosynthese von Mensacarcin oder
von dessen Intermediaten haben (siehe Kapitel 6.1.2). Im Fall der Jadomycin-Produktion in
Streptomyces virginiae wurde bereits eine ähnliche Komplementierung der Funktion des jadW1-Gens
durch homologe Gene, die an der A-Faktor Biosynthese beteiligt sind, (sven 4183 und sven 5093)
berichtet [91].
164
Diskussion
Abbildung 6.12 Vergleich der Strukturen von Galvaquinon A und Msn-UH.
Galvaquinon A wurde nach dem Knockout von rslO1 in S. albus isoliert. Eine sehr ähnliche Substanz, Msn-UH wurde nach
der Inaktivierung von msnO2 in S. albus produziert.
6.3 Die Flavinreduktasen MsnO3 und RslO2 aus dem
Mensacarcin- und dem Rishirilid-Gencluster
Im Gencluster von Mensacarcin stellt msnO3 das einzige Gen das für eine Flavinreduktase kodiert
dar. Eine erste Aufreinigung des korrespondierenden Proteins MsnO3 wurde von Sarah Maier im
Rahmen ihrer Dissertation durchgeführt [1]. Zusätzlich konnte von ihr die Zusammenarbeit von
MsnO3 mit der Luciferase-ähnlichen Monooxygenase MsnO8 in einem Zweikomponentensystem
nachgewiesen werden (siehe Kapitel 2.2.4.). Eine ähnliche Kooperation mit der Flavinreduktase
wurde auch für MsnO2 und MsnO4 postuliert [168]. Ein anderes, prominentes Beispiel ist LuxA aus
Vibrio harveyi, das am besten untersuchte Protein in der Gruppe der Luciferasen und LLM, welches
in vivo und in vitro einen funktionellen Komplex mit der sogenannten Flavinreduktase P ausbilden
kann [67].
6.3.1 Aufreinigungs- und Kristallisierungsexperimente mit MsnO3
Eines der Ziele dieser Arbeit war es die Aufreinigung von MsnO3 zu wiederholen, eine Kristallisierung
durchzuführen
und
die
Kristallstruktur
anschließend
aufzuklären.
Hierfür
wurde
eine
Proteinproduktion in E. coli BL21 Codon Plus RP x pL1SL2 bei 18 °C über 56 h und unter Verwendung
von Autoinduktionsmedium durchgeführt. Der hohe GC-Gehalt in dem ursprünglich aus dem
Aktinomyceten
S. bottropensis
stammenden
Gen
msnO3
stellte,
ähnlich
wie
bei
den
Proteinproduktionen von MsnO4 und MsnO2, auch hier kein Problem dar [194]. Die Aufreinigung
erfolgte in zwei Schritten, zuerst mittels His-Trap Affinitätschromatographie und anschließend durch
Größenausschlusschromatographie, mit dessen Hilfe letzte aggregierte Anteile von MsnO3 effektiv
abgetrennt werden konnten. Im Anschluss wurden Kristallisierungsexperimente durchgeführt. Durch
ein erstes breites Screening von möglichen Pufferzusammensetzungen konnten Bedingungen, in
165
Diskussion
denen erste MsnO3-Kristalle detektierbar waren, gefunden werden. Trotz anschließender
Optimierung der verwendeten Pufferzusammensetzungen blieben die erhaltenen Kristalle allerdings
zu klein für eine Strukturaufklärung. Mögliche Ursachen für ein solches Verhalten wurden bereits in
Kapitel 6.2.3 diskutiert.
6.3.2 Die Austauschbarkeit von MsnO3 und RslO2
Genau wie im Fall von Mensacarcin, kodiert auch im Rishirilid-Gencluster nur ein Gen (rslO2) für eine
Flavinreduktase. Das korrespondierende Protein RslO2 scheint dort, ähnlich wie für MsnO3 zuvor
beschrieben wurde, an Zweikomponentensystemen mit Luciferase-ähnlichen Monooxygenasen des
Clusters beteiligt zu sein [7]. Im Rahmen dieses Experimentes sollte geprüft werden, ob die beiden
Flavinreduktasen msnO3 und rslO2 austauschbar sind. Hierfür wurde der Stamm Streptomyces albus
mit dem Cosmid Cos2 auf dem das Gen msnO3 inaktiviert war (Cos2∆O3) konjugiert (siehe Kapitel
4.12.11) und anschließend eine Produktionsanalyse durchgeführt. Zusätzlich wurde mit derselben
Methode die Mutante S. albus Cos2∆O3 x pKR1 hergestellt und untersucht. Dadurch wurde der auf
dem Plasmid pKR1 lokalisierte SARP-Regulator msnR1 aus dem msn-Cluster überexprimiert. Wie
zuvor gezeigt werden konnte, ist dieser essentiell für eine hohe Produktionsrate von MensacarcinBiosyntheseintermediaten [8]. Zuletzt wurden die so hergestellten Mutanten jeweils mit msnO3 oder
rslO2 komplementiert. In beiden Fällen konnte die durch die Inaktivierung komplett unterbrochene
Produktion von Didesmethylmensacarcin (DDMM) wiederhergestellt werden. Gleichzeitig waren die
zuvor in der Knockout-Mutante identifizierten Biosyntheseintermediate Msn-SM3, Msn-SM4 und
Msn-SM5 nach beiden Komplementierungen nicht mehr vorhanden [1]. Die zusätzliche Einführung
von pKR1 hatte nur im Fall der Komplementierung mit msnO3 einen positiven Einfluss auf die Menge
an produziertem DDMM. Für das Experiment mit rslO2 konnte insgesamt nur eine unvollständige
Wiederherstellung der DDMM-Produktion festgestellt werden. Dies blieb auch nach Zugabe von
pKR1 fast unverändert. Aufgrund der Ergebnisse lässt sich feststellen, dass die Funktion von MsnO3
in der Mensacarcin-Biosynthese auch teilweise von RslO2 übernommen werden kann.
Interessanterweise wurde für gramnegative Bakterien ein Transportersystem beschrieben, dass
imstande ist spezifisch das antibakteriell wirkende Colicin V aus den Zellen zu transportieren. Wurden
Teile dieses Systems mutiert, konnte kein Export mehr sattfinden. Durch eine anschließende
Komplementierung mit ähnlichen Proteinen aus dem α-Hemolysin- oder dem Erwinia ProteaseTransportersystem konnte Colicin V wieder erkannt und ausgeschieden werden. Ähnlich wie im Fall
von MsnO3 und RslO2 war auch hier die Aktivität nach Komplementierung mit clusterfremden Genen
geringer [211]. In Abbildung 6.13 ist eine Zusammenfassung der im Rahmen dieser Arbeit
166
Diskussion
identifizierten
Mechanismen
der
„Gencluster-übergreifenden“
Regulierung
zwischen
dem
Mensacarcin- und dem Rishirilid-Biosyntheseluster in Streptomyces bottropensis dargestellt.
Abbildung 6.13 Die Cross-Regulierung zwischen dem Mensacarcin- und dem Rishirilid-Gencluster in
Streptomyces bottropensis.
msn=Mensacarcin-Gencluster; rsl=Rishirilid-Gencluster
Die beiden für Flavinreduktasen kodierenden Gene msnO3 und rslO2 scheinen in ihrer Funktion austauschbar zu sein. Das
im msn-Cluster lokalisierte Gen msnO2, das für eine Luciferase-ähnliche Monooxygenase kodiert, spielt wahrscheinlich eine
wichtige Rolle in der Kontrolle des Produktionsverhaltens von S. bottropensis. Ist es aktiv wird Mensacarcin normal
produziert. Wird es jedoch ausgeschaltet, kommt die gesamte Mensacarcin-Biosynthese zum Erliegen und stattdessen
erfolgt eine starke Produktion von Rishirilid B.
6.3.3 Bioinformatische Untersuchungen von MsnO3 und RslO2
Von den beiden Flavinreduktasen MsnO3 und RslO2 wurden mithilfe der Software I-TASSER
Homologiemodelle angefertigt. Auffällig war, dass diese fast komplett aus einer aus β-Faltblättern
ausgebildeten „fassartigen“ Struktur bestanden (siehe Abbildung 6.14). Im Gegensatz hierzu wurde
für das Monomer der Flavinreduktase P aus Vibrio harveyi, die zusammen mit der Lux A Luciferase
aus demselben Organismus ein Zweikomponentensystem bildet, nur ein kleiner Anteil an βFaltblättern berichtet (PDB-ID: 1BKJ). In allen Fällen gleich war die antiparallele Anordnung der βFaltblätter in direkter Nachbarschaft der Cofaktor-Bindetasche [63]. Die wahrscheinliche
Lokalisierung der Cofaktor-Bindetasche in MsnO3 konnte, wie in der Flavinreduktase P, peripher zu
der „fassartig“ angeordneten β-Faltblatt Struktur festgelegt werden (siehe Abbildung 5.24). Ein
anschließend mit der Software Pymol durchgeführtes Alignment von MsnO3 und RslO2 zeigte eine
167
Diskussion
sehr hohe strukturelle Übereinstimmung der beiden Proteine (siehe Abbildung 6.15). Da es sich bei
den hier verglichenen Strukturen allerdings nur um bioinformatische Modelle handelt, können die
erhaltenen Resultate nicht als sicher angenommen werden. Allerdings deuten sie mit hoher
Wahrscheinlichkeit auf eine nahe Verwandtschaft der beiden Flavinreduktasen hin. Den einzigen
größeren Unterschied stellte eine ausschließlich in der Struktur von MsnO3 vorhandene α-Helix dar.
Diese befindet sich allerdings außerhalb der potentiellen Cofaktor-Bindetasche.
Abbildung 6.14 Das Homologiemodell von MsnO3.
Das erstellte Modell der Flavinreduktase MsnO3 enthält, anders als die Flavinreduktase P aus Vibrio harveyi, einen
ungewöhnlich hohen Anteil an β-Faltblättern. Beiden Strukturen gemein sind die großen, antiparallel angeordneten βFaltblätter im zentralen Teil des Proteins [63].
Abbildung 6.15 Strukturvergleich der Flavinreduktasen MsnO3 und RslO2.
Rot=MsnO3; blau=RslO2
Die beiden Modelle zeigen eine große strukturelle Übereinstimmung. Die einzige größere Abweichung stellt eine α-Helix im
peripheren Bereich von MsnO3 dar, die in RslO2 nicht vorhanden ist.
168
Literaturverzeichnis
7 Literaturverzeichnis
[1]
[2]
[3]
[4]
[5]
[6]
[7]
[8]
[9]
[10]
[11]
[12]
[13]
[14]
[15]
[16]
[17]
[18]
[19]
[20]
[21]
S. Maier, Untersuchungen zur Didesmethylmensacarcin-Biosynthese unter besonderer
Berücksichtigung der Funktion von MsnO8. 2014.
W. J. H. van Berkel, N. M. Kamerbeek, and M. W. Fraaije, “Flavoprotein monooxygenases, a
diverse class of oxidative biocatalysts.,” J. Biotechnol., vol. 124, no. 4, pp. 670–89, Aug. 2006.
X. Yan et al., “Cloning and heterologous expression of three type II PKS gene clusters from
Streptomyces bottropensis.,” Chembiochem, vol. 13, no. 2, pp. 224–30, Jan. 2012.
A. Linnenbrink, Gewinnung glykosylierter Naturstoffe durch Biotransformation in. 2009.
S. Lösgen, Isolierung und Strukturaufklärung neuer Naturstoffe aus endophytischen Pilzen
mariner Habitate sowie Arbeiten zum cytotoxischen Polyketid Mensacarcin. 2007.
J. Derochefort, Untersuchungen zur Biosynthese der Rishirilide. 2016.
C. Zuo, Investigations on the Biosynthesis Rishirilides. 2016.
K. Probst, Untersuchungen zur Biosynthese von Didesmethylmensacarcin. 2011.
U. Hardter, Ethanolproduktion in Streptomyceten Untersuchungen zur Biosynthese von
Didesmethylmensacarcin Expression einer Saccharose-Synthase in Streptomyceten
Inauguraldissertation, no. November. 2012.
S. Tu, “Reduced Flavin : Donor and Acceptor Enzymes and Mechanisms of Channeling,”
Antioxid. Redox Signal., vol. 3, no. 5, 2001.
V. Massey, “The chemical and biological versatility of riboflavin.,” Biochem. Soc. Trans., vol.
28, no. 4, pp. 283–96, 2000.
D. E. Torres Pazmiño, M. Winkler, A. Glieder, and M. W. Fraaije, “Monooxygenases as
biocatalysts: Classification, mechanistic aspects and biotechnological applications,” J.
Biotechnol., vol. 146, no. 1–2, pp. 9–24, 2010.
G. deGonzalo and M. W. Fraaije, “Recent Developments in Flavin-based Catalysis,”
ChemCatChem, vol. 5, no. 2, pp. 403–415, 2013.
A. Baeyer and V. Villiger, “Einwirkung des Caro’schen Reagens auf Ketone.,” Ber. Dtsch. Chem.
Ges., vol. 32, pp. 3625–3633, 1899.
D. E. Torres Pazmiño, H. M. Dudek, and M. W. Fraaije, “Baeyer-Villiger monooxygenases:
recent advances and future challenges,” Curr. Opin. Chem. Biol., vol. 14, no. 2, pp. 138–144,
2010.
B. J. Yachnin, T. Sprules, M. B. McEvoy, P. Lau, and A. M. Berghuis, “The Substrate-Bound
Crystal Structure of a Baeyer − Villiger Monooxygenase Exhibits a Criegee-like Conformation,”
J. Am. Chem. Soc., vol. 134, no. 18, pp. 7788–7795, 2012.
M. Kadow, K. Loschinski, S. Saß, M. Schmidt, and U. T. Bornscheuer, “Completing the series of
BVMOs involved in camphor metabolism of Pseudomonas putida NCIMB 10007 by
identification of the two missing genes, their functional expression in E. coli, and biochemical
characterization,” Appl. Microbiol. Biotechnol., vol. 96, no. 2, pp. 419–429, 2012.
U. E. Ukaegbu, A. Kantz, M. Beaton, G. T. Gassner, and A. C. Rosenzweig, “Structure and ligand
binding properties of the epoxidase component of styrene monooxygenase,” Biochemistry,
vol. 49, no. 8, pp. 1678–1688, 2010.
S. Maier et al., “Insights into the bioactivity of mensacarcin and epoxide formation by
MsnO8.,” Chembiochem, vol. 15, no. 5, pp. 749–56, 2014.
J. Olucha, K. M. Meneely, A. S. Chilton, and A. L. Lamb, “Two structures of an N-hydroxylating
flavoprotein monooxygenase: Ornithine hydroxylase from Pseudomonas aeruginosa,” J. Biol.
Chem., vol. 286, no. 36, pp. 31789–31798, 2011.
R. D. Ceccoli, D. A. Bianchi, and D. V. Rial, “Flavoprotein monooxygenases for oxidative
biocatalysis: Recombinant expression in microbial hosts and applications,” Front. Microbiol.,
vol. 5, no. FEB, pp. 1–14, 2014.
169
Literaturverzeichnis
[22]
[23]
[24]
[25]
[26]
[27]
[28]
[29]
[30]
[31]
[32]
[33]
[34]
[35]
[36]
[37]
[38]
[39]
[40]
[41]
170
S. Montersino et al., “Crystal structure of 3-hydroxybenzoate 6-hydroxylase uncovers lipidassisted flavoprotein strategy for regioselective aromatic hydroxylation,” J. Biol. Chem., vol.
288, no. 36, pp. 26235–26245, 2013.
J. Lee, “Invited Review Perspectives on Bioluminescence Mechanisms.,” Photochem.
Photobiol., 2016.
J. Lee, BIOLUMINESCENCE, the NATURE of the LIGHT. University of Georgia Libraries, Athens,
GA, 2016.
I. B. Matheson, J. Lee, and F. Müller, “Bacterial bioluminescence: Spectral study of the
emitters in the in vitro reaction.,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 78, no. 2, pp. 948–52,
1981.
J. Lee, “Lumazine protein and the excitation mechanism in bacterial bioluminescence,”
Biophys. Chem., vol. 48, no. 2, pp. 149–158, 1993.
V. Massey, “Activation of Molecular Oxygen by Flavins and Flavoproteins.,” J. Biol. Chem., pp.
22459–22462, 1994.
E. V Nemtseva and N. S. Kudryasheva, “The mechanism of electronic excitation in the bacterial
bioluminescent reaction,” Russ. Chem. Rev., vol. 76, no. February 2017, pp. 91–100, 2007.
Z. T. Campbell, A. Weichsel, W. R. Montfort, and T. O. Baldwin, “Crystal structure of the
bacterial luciferase/flavin complex provides insight into the function of the beta subunit.,”
Biochemistry, vol. 48, no. 26, pp. 6085–6094, 2009.
T. F. Holzman and T. O. Baldwin, “Proteolytic inactivation of luciferases from three species of
luminous marine bacteria, Beneckea harveyi, Photobacterium fischeri, and Photobacterium
phosphoreum: evidence of a conserved structural feature.,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol.
77, no. 11, pp. 6363–7, 1980.
J. Vervoort, F. Muller, D. J. O’Kane, J. Lee, and A. Bacher, “Bacterial luciferase: a carbon-13,
nitrogen-15, and phosphorus-31 nuclear magnetic resonance investigation,” Biochemistry,
vol. 25, no. 24, pp. 8067–8075, 1986.
D. M. Mofford, G. R. Reddy, and S. C. Miller, “Latent luciferase activity in the fruit fly revealed
by a synthetic luciferin.,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 111, no. 12, pp. 4443–8, Mar.
2014.
V. R. Viviani, R. A. Prado, F. C. G. Arnoldi, and F. C. Abdalla, “An ancestral luciferase in the
Malpighi tubules of a non-bioluminescent beetle!,” Photochem. Photobiol. Sci., vol. 8, no. 1,
pp. 57–61, Jan. 2009.
A. J. Fisher, F. M. Raushel, T. O. Baldwin, and I. Rayment, “Three-dimensional structure of
bacterial luciferase from Vibrio harveyi at 2.4 A resolution.,” Biochemistry, vol. 34, no. 20, pp.
6581–6, May 1995.
T. O. Baldwin et al., “Structure of bacterial luciferase.,” Curr. Opin. Struct. Biol., vol. 5, no. 6,
pp. 798–809, Dec. 1995.
R. K. Wierenga, “The TIM-barrel fold: a versatile framework for efficient enzymes.,” FEBS Lett.,
vol. 492, no. 3, pp. 193–8, Mar. 2001.
R. Villa and A. Willetts, “Oxidations by microbial NADH plus FMN-dependent luciferases from
Photobacterium phosphoreum and Vibrio fischeri,” J. Mol. Catal. B Enzym., vol. 2, no. 4–5, pp.
193–197, Feb. 1997.
J. W. Eckstein, J. W. Hastings, and S. Ghisla, “Mechanism of bacterial bioluminescence: 4a,5dihydroflavin analogs as models for luciferase hydroperoxide intermediates and the effect of
substituents at the 8-position of flavin on luciferase kinetics.,” Biochemistry, vol. 32, no. 2, pp.
404–11, Jan. 1993.
H. R. Ellis, “The FMN-dependent two-component monooxygenase systems,” Arch. Biochem.
Biophys., vol. 497, no. 1–2, pp. 1–12, May 2010.
M. A. Kertesz, K. Schmidt-Larbig, and T. Wüest, “A novel reduced flavin mononucleotidedependent methanesulfonate sulfonatase encoded by the sulfur-regulated msu operon of
Pseudomonas aeruginosa.,” J. Bacteriol., vol. 181, no. 5, pp. 1464–73, Mar. 1999.
P. Chaiyen, C. Suadee, and P. Wilairat, “A novel two-protein component flavoprotein
hydroxylase.,” Eur. J. Biochem., vol. 268, no. 21, pp. 5550–61, Nov. 2001.
Literaturverzeichnis
[42]
[43]
[44]
[45]
[46]
[47]
[48]
[49]
[50]
[51]
[52]
[53]
[54]
[55]
[56]
[57]
[58]
E. M. Gottardi et al., “Abyssomicin biosynthesis: formation of an unusual polyketide,
antibiotic-feeding studies and genetic analysis.,” Chembiochem, vol. 12, no. 9, pp. 1401–10,
Jun. 2011.
M. W. Fraaije, J. Wu, D. P. H. M. Heuts, E. W. van Hellemond, J. H. L. Spelberg, and D. B.
Janssen, “Discovery of a thermostable Baeyer-Villiger monooxygenase by genome mining.,”
Appl. Microbiol. Biotechnol., vol. 66, no. 4, pp. 393–400, Jan. 2005.
Y. Shen et al., “Biosynthesis of hygrocins, antitumor naphthoquinone ansamycins produced by
streptomyces sp. LZ35,” ChemBioChem, vol. 15, no. 1, pp. 94–102, 2014.
A. K. El-Sayed, J. Hothersall, S. M. Cooper, E. Stephens, T. J. Simpson, and C. M. Thomas,
“Characterization of the mupirocin biosynthesis gene cluster from Pseudomonas fluorescens
NCIMB 10586.,” Chem. Biol., vol. 10, no. 5, pp. 419–30, May 2003.
Y. Shi, A. Bueno, and W. A. van der Donk, “Heterologous production of the lantibiotic
Ala(0)actagardine in Escherichia coli.,” Chem. Commun. (Camb)., vol. 48, no. 89, pp. 10966–8,
Nov. 2012.
S. Boakes, J. Cortés, A. N. Appleyard, B. A. M. Rudd, and M. J. Dawson, “Organization of the
genes encoding the biosynthesis of actagardine and engineering of a variant generation
system.,” Mol. Microbiol., vol. 72, no. 5, pp. 1126–36, Jun. 2009.
S. Kutanovas, J. Stankeviciute, G. Urbelis, D. Tauraite, R. Rutkiene, and R. Meskys,
“Identification and characterization of a tetramethylpyrazine catabolic pathway in
Rhodococcus jostii TMP1.,” Appl. Environ. Microbiol., vol. 79, no. 12, pp. 3649–57, Jun. 2013.
L. Li et al., “Crystal structure of long-chain alkane monooxygenase (LadA) in complex with
coenzyme FMN: unveiling the long-chain alkane hydroxylase.,” J. Mol. Biol., vol. 376, no. 2, pp.
453–65, Feb. 2008.
E. Eichhorn, C. A. Davey, D. F. Sargent, T. Leisinger, and T. J. Richmond, “Crystal structure of
Escherichia coli alkanesulfonate monooxygenase SsuD.,” J. Mol. Biol., vol. 324, no. 3, pp. 457–
68, Nov. 2002.
M. S. Nissen et al., “Crystal structures of NADH:FMN oxidoreductase (EmoB) at different
stages of catalysis.,” J. Biol. Chem., vol. 283, no. 42, pp. 28710–20, Oct. 2008.
D. Thibaut, N. Ratet, D. Bisch, D. Faucher, L. Debussche, and F. Blanche, “Purification of the
two-enzyme system catalyzing the oxidation of the D-proline residue of pristinamycin IIB
during the last step of pristinamycin IIA biosynthesis.,” J. Bacteriol., vol. 177, no. 18, pp. 5199–
205, Sep. 1995.
L. Xun and E. R. Sandvik, “Characterization of 4-hydroxyphenylacetate 3-hydroxylase (HpaB) of
Escherichia coli as a reduced flavin adenine dinucleotide-utilizing monooxygenase.,” Appl.
Environ. Microbiol., vol. 66, no. 2, pp. 481–6, Feb. 2000.
S. W. Aufhammer, E. Warkentin, H. Berk, S. Shima, R. K. Thauer, and U. Ermler, “Coenzyme
binding in F420-dependent secondary alcohol dehydrogenase, a member of the bacterial
luciferase family.,” Structure, vol. 12, no. 3, pp. 361–70, Mar. 2004.
S. W. Aufhammer, E. Warkentin, U. Ermler, C. H. Hagemeier, R. K. Thauer, and S. Shima,
“Crystal structure of methylenetetrahydromethanopterin reductase (Mer) in complex with
coenzyme F420: Architecture of the F420/FMN binding site of enzymes within the nonprolyl
cis-peptide containing bacterial luciferase family.,” Protein Sci., vol. 14, no. 7, pp. 1840–9, Jul.
2005.
M. Bussmann, M. Baumgart, and M. Bott, “RosR (Cg1324), a hydrogen peroxide-sensitive
MarR-type transcriptional regulator of Corynebacterium glutamicum,” J. Biol. Chem., vol. 285,
no. 38, pp. 29305–29318, 2010.
V. Hughes, S. Smith, A. Garcia-Sanchez, J. Sales, and K. Stevenson, “Proteomic comparison of
Mycobacterium avium subspecies paratuberculosis grown in vitro and isolated from clinical
cases of ovine paratuberculosis,” Microbiology, vol. 153, no. 1, pp. 196–205, 2007.
R. Boden, E. Borodina, A. P. Wood, D. P. Kelly, J. C. Murrell, and H. Schäfer, “Purification and
characterization of dimethylsulfide monooxygenase from Hyphomicrobium sulfonivorans.,” J.
Bacteriol., vol. 193, no. 5, pp. 1250–8, Mar. 2011.
171
Literaturverzeichnis
[59]
[60]
[61]
[62]
[63]
[64]
[65]
[66]
[67]
[68]
[69]
[70]
[71]
[72]
[73]
[74]
[75]
[76]
[77]
[78]
172
T. Endoh, H. Habe, H. Nojiri, H. Yamane, and T. Omori, “The sigma54-dependent
transcriptional activator SfnR regulates the expression of the Pseudomonas putida sfnFG
operon responsible for dimethyl sulphone utilization.,” Mol. Microbiol., vol. 55, no. 3, pp.
897–911, Feb. 2005.
S. Subbian, P. K. Mehta, S. L. Cirillo, and J. D. Cirillo, “The Mycobacterium marinum mel2 locus
displays similarity to bacterial bioluminescence systems and plays a role in defense against
reactive oxygen and nitrogen species.,” BMC Microbiol., vol. 7, no. 4, 2007.
J. W. Hastings and Q. H. Gibson, “Intermediates in the Bioluminescent Oxidation of Reduced
Flavin Intermediates in the Bioluminescent Oxidation of Reduced Flavin Mononucleotide,” J.
Biol. Chem., vol. 238, no. 7, pp. 2537–2554, 1963.
S. Nijvipakul, J. Wongratana, C. Suadee, B. Entsch, D. P. Ballou, and P. Chaiyen, “LuxG is a
functioning flavin reductase for bacterial luminescence,” J. Bacteriol., vol. 190, no. 5, pp.
1531–1538, 2008.
J. J. Tanner, B. Lei, S. C. Tu, and K. L. Krause, “Flavin reductase P: Structure of a dimeric
enzyme that reduces flavin,” Biochemistry, vol. 35, no. 42, pp. 13531–13539, 1996.
B. Lei and S. C. Tu, “Mechanism of reduced flavin transfer from Vibrio harveyi NADPH-FMN
oxidoreductase to luciferase,” Biochemistry, vol. 37, no. 41, pp. 14623–14629, 1998.
S.-C. Tu, “Activity coupling and complex formation between bacterial luciferase and flavin
reductases,” Photochem. Photobiol. Sci., vol. 7, no. 2, pp. 183–188, 2008.
C. K. Tang, C. E. Jeffers, J. C. Nichols, and S. C. Tu, “Flavin specificity and subunit interaction of
Vibrio fischeri general NAD(P)H-flavin oxidoreductase FRG/FRase I.,” Arch. Biochem. Biophys.,
vol. 392, no. 1, pp. 110–116, 2001.
J. C. Low and S.-C. Tu, “Energy transfer evidence for in vitro and in vivo complexes of Vibrio
harveyi flavin reductase P and luciferase.,” Photochem. Photobiol., vol. 77, no. 4, pp. 446–452,
2003.
K. D. G. Pfleger and K. A. Eidne, “Illuminating insights into protein-protein interactions using
bioluminescence resonance energy transfer (BRET).,” Nat. Methods, vol. 3, no. 3, pp. 165–
174, 2006.
J. Sucharitakul, R. Tinikul, and P. Chaiyen, “Mechanisms of reduced flavin transfer in the twocomponent flavin-dependent monooxygenases,” Arch. Biochem. Biophys., vol. 555–556, pp.
33–46, 2014.
M. Konishi et al., “Dynemicin A, a novel antibiotic with the anthraquinone and 1,5-diyn-3-ene
subunit.,” J. Antibiot. (Tokyo)., vol. 42, no. 9, pp. 1449–1452, 1989.
R. S. Coleman, J. S. Kong, and T. E. Richardson, “Synthesis of naturally occurring antitumor
agents: Stereocontrolled synthesis of the azabicyclic ring system of the azinomycins,” J. Am.
Chem. Soc., vol. 121, no. 39, pp. 9088–9095, 1999.
S. C. Sinha, C. F. Barbas, and R. a Lerner, “The antibody catalysis route to the total synthesis of
epothilones.,” Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 95, no. 25, pp. 14603–14608, 1998.
C. J. Thibodeaux, W. C. Chang, and H. W. Liu, “Enzymatic chemistry of cyclopropane, epoxide,
and aziridine biosynthesis,” Chem. Rev., vol. 112, no. 3, pp. 1681–1709, 2012.
D. M. Bollag et al., “Epothilones, a New Class of Microtubule-stabilizing Agents with a Taxollike Mechanism of Action,” Cancer Res., vol. 55, no. 11, pp. 2325–2333, 1995.
M. Sono, M. P. Roach, E. D. Coulter, and J. H. Dawson, “Heme-Containing Oxygenases,” Chem.
Rev., vol. 96, no. 7, pp. 2841–2888, 1996.
T. D. H. Bugg, “Dioxygenase enzymes: Catalytic mechanisms and chemical models,”
Tetrahedron, vol. 59, no. 36, pp. 7075–7101, 2003.
a D. Vaz, D. F. McGinnity, and M. J. Coon, “Epoxidation of olefins by cytochrome P450:
evidence from site-specific mutagenesis for hydroperoxo-iron as an electrophilic oxidant.,”
Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A., vol. 95, no. 7, pp. 3555–3560, 1998.
G. Höfle and N. Bedorf, “Epothilone A and B—Novel 16‐Membered Macrolides with Cytotoxic
Activity: Isolation, Crystal Structure, and Conformation in Solution,” Angew. Chemie, pp.
1986–1988, 1996.
Literaturverzeichnis
[79]
[80]
[81]
[82]
[83]
[84]
[85]
[86]
[87]
[88]
[89]
[90]
[91]
[92]
[93]
[94]
[95]
[96]
[97]
Y. Anzai et al., “Functional analysis of MycCI and MycG, cytochrome P450 enzymes involved in
biosynthesis of mycinamicin macrolide antibiotics.,” Chem. Biol., vol. 15, no. 9, pp. 950–959,
2008.
A. Li and J. Piel, “A gene cluster from a marine Streptomyces encoding the biosynthesis of the
aromatic spiroketal polyketide griseorhodin A,” Chem. Biol., vol. 9, no. 9, pp. 1017–1026,
2002.
B. A. Palfey and C. A. McDonald, “Control of catalysis in flavin-dependent monooxygenases,”
Arch. Biochem. Biophys., vol. 493, no. 1, pp. 26–36, 2010.
W. Liu et al., “The neocarzinostatin biosynthetic gene cluster from Streptomyces
carzinostaticus ATCC 15944 involving two iterative type I polyketide synthases,” Chem. Biol.,
vol. 12, no. 3, pp. 293–302, 2005.
Q. Gao and J. S. Thorson, “The biosynthetic genes encoding for the production of the
dynemicin enediyne core in Micromonospora chersina ATCC53710,” FEMS Microbiol. Lett.,
vol. 282, no. 1, pp. 105–114, 2008.
T. Bililign, H. Chang-Gu, J. Williams, A. M. Czisny, and J. S. Thorson, “The Hedamycin locus
implicates a novel aromatic PKS priming mechanism.,” Chem. Biol., vol. 11, pp. 959–969, 2004.
A. Bhatt et al., “Accumulation of an E,E,E-triene by the monensin-producing polyketide
synthase when oxidative cyclization is blocked,” Angew. Chemie - Int. Ed., vol. 44, no. 43, pp.
7075–7078, 2005.
S. J. Gould, M. J. Kirchmeier, and R. E. LaFever, “Incorporation of two oxygens from 18O2 in
the epoxyquinone from the dihydroxyacetanilide epoxidase reaction: Evidence for a
dioxygenase mechanism,” J. Am. Chem. Soc., vol. 118, no. 33, pp. 7663–7666, 1996.
B. Shen and S. J. Gould, “Opposite Facial Specificity for Two Hydroquinone Epoxidases: (3-si,4re)-2,5-Dihydroxyacetanilide Epoxidase from Streptomyces LL-C 10037 and (3-re,4-si)-2,5Dihydroxyacetanilide Epoxidase from Streptomyces MPP 305 1,” Biochemistry, vol. 30, pp.
8936–8944, 1991.
L. J. Higgins, F. Yan, P. Liu, H. W. Liu, and C. L. Drennan, “Structural insight into antibiotic
fosfomycin biosynthesis by a mononuclear iron enzyme,” Nature, vol. 437, no. 7060, pp. 838–
844, 2005.
W. W. Metcalf and W. A. van der Donk, “Biosynthesis of phosphonic and phosphinic acid
natural products.,” Annu. Rev. Biochem., vol. 78, pp. 65–94, 2009.
J. D. Sidda and C. Corre, Gamma-butyrolactone and furan signaling systems in streptomyces,
1st ed., vol. 517. Elsevier Inc., 2012.
Z. Zou, D. Du, Y. Zhang, J. Zhang, G. Niu, and H. Tan, “A γ-butyrolactone-sensing
activator/repressor, JadR3, controls a regulatory mini-network for jadomycin biosynthesis,”
Mol. Microbiol., vol. 94, no. 3, pp. 490–505, 2014.
C. Corre, L. Song, S. O’Rourke, K. F. Chater, and G. L. Challis, “2-Alkyl-4-hydroxymethylfuran-3carboxylic acids, antibiotic production inducers discovered by Streptomyces coelicolor
genome mining,” Proc. Natl. Acad. Sci., vol. 105, no. 45, pp. 17510–17515, 2008.
S. O’Rourke, A. Wietzorrek, K. Fowler, C. Corre, G. L. Challis, and K. F. Chater, “Extracellular
signalling, translational control, two repressors and an activator all contribute to the
regulation of methylenomycin production in Streptomyces coelicolor,” Mol. Microbiol., vol.
71, no. 3, pp. 763–778, 2009.
G. Tan, Y. Peng, C. Lu, L. Bai, and J. Zhong, “Engineering validamycin production by tandem
deletion of γ -butyrolactone receptor genes in Streptomyces hygroscopicus 5008,” Metab.
Eng., vol. 28, pp. 74–81, 2015.
G. Niu, K. F. Chater, Y. Tian, J. Zhang, and H. Tan, “Specialised metabolites regulating antibiotic
biosynthesis in Streptomyces spp .,” FEMS Microbiol, no. May, pp. 554–573, 2016.
G. Xu et al., “‘Pseudo’ γ-butyrolactone receptors respond to antibiotic signals to coordinate
antibiotic biosynthesis,” J. Biol. Chem., vol. 285, no. 35, pp. 27440–27448, 2010.
A. W. Robertson, S. M. Forget, C. F. Martinez-Farina, N. E. McCormick, R. T. Syvitski, and D. L.
Jakeman, “JadX is a Disparate Natural Product Binding Protein,” J. Am. Chem. Soc., vol. 138,
no. 7, pp. 2200–2208, 2016.
173
Literaturverzeichnis
[98]
[99]
[100]
[101]
[102]
[103]
[104]
[105]
[106]
[107]
[108]
[109]
[110]
[111]
[112]
[113]
[114]
[115]
[116]
[117]
174
S. Lautru, R. J. Deeth, L. M. Bailey, and G. L. Challis, “Discovery of a new peptide natural
product by Streptomyces coelicolor genome mining,” Nat. Chem. Biol., vol. 1, no. 5, pp. 265–
269, 2005.
Z. Hojati et al., “Structure, biosynthetic origin, and engineered biosynthesis of calciumdependent antibiotics from Streptomyces coelicolor,” Chem. Biol., vol. 9, no. 11, pp. 1175–
1187, 2002.
S. Lautru, D. Oves-Costales, J. L. Pernodet, and G. L. Challis, “MbtH-like protein-mediated
cross-talk between non-ribosomal peptide antibiotic and siderophore biosynthetic pathways
in Streptomyces coelicolor M145,” Microbiology, vol. 153, no. 5, pp. 1405–1412, 2007.
F. Santos-Beneit, A. Rodríguez-García, A. Sola-Landa, and J. F. Martín, “Cross-talk between two
global regulators in Streptomyces: PhoP and AfsR interact in the control of afsS, pstS and
phoRP transcription,” Mol. Microbiol., vol. 72, no. 1, pp. 53–68, 2009.
W. Lian et al., “Genome-wide transcriptome analysis reveals that a pleiotropic antibiotic
regulator, AfsS, modulates nutritional stress response in Streptomyces coelicolor A3(2).,” BMC
Genomics, vol. 9, no. 1, p. 56, 2008.
A. Rodríguez-García, C. Barreiro, F. Santos-Beneit, A. Sola-Landa, and J. F. Martín, “Genomewide transcriptomic and proteomic analysis of the primary response to phosphate limitation
in Streptomyces coelicolor M145 and in a ΔphoP mutant,” Proteomics, vol. 7, no. 14, pp.
2410–2429, 2007.
Y. Xia, D. Gally, K. Forsman-Semb, and B. E. Uhlin, “Regulatory cross-talk between adhesin
operons in Escherichia coli: inhibition of type 1 fimbriae expression by the PapB protein.,”
EMBO J., vol. 19, no. 7, pp. 1450–1457, 2000.
H. Connell, W. Agace, P. Klemm, M. Schembri, S. Mărild, and C. Svanborg, “Type 1 fimbrial
expression enhances Escherichia coli virulence for the urinary tract.,” Proc. Natl. Acad. Sci.
United States Am., vol. 93, no. 18, pp. 9827–9832, 1996.
A. Malhotra, Chapter 16 Tagging for Protein Expression, 1st ed., vol. 463. Elsevier Inc., 2009.
Y. Benita, M. J. Wise, M. C. Lok, I. Humphery-Smith, R. S. Oosting, and I. Humphery-smithʈ,
“Analysis of High Throughput Protein Expression in Escherichia coli,” Mol. Cell. proteomics,
vol. 5, no. 9, pp. 1567–1580, 2006.
C. P. Papaneophytou and G. Kontopidis, “Statistical approaches to maximize recombinant
protein expression in Escherichia coli: A general review,” Protein Expr. Purif., vol. 94, pp. 22–
32, 2014.
G. Georgiou and P. Valax, “Expression of correctly folded proteins in Escherichia coli,” Curr.
Opin. Biotechnol., vol. 7, no. 2, pp. 190–197, 1996.
S. Nallamsetty and D. S. Waugh, “A generic protocol for the expression and purification of
recombinant proteins in Escherichia coli using a combinatorial His6-maltose binding protein
fusion tag.,” Nat. Protoc., vol. 2, no. 2, pp. 383–91, 2007.
J. M. Song, Y. J. An, M. H. Kang, Y. H. Lee, and S. S. Cha, “Cultivation at 6-10 °C is an effective
strategy to overcome the insolubility of recombinant proteins in Escherichia coli,” Protein
Expr. Purif., vol. 82, no. 2, pp. 297–301, 2012.
H. P. Sørensen and K. K. Mortensen, “Advanced genetic strategies for recombinant protein
expression in Escherichia coli,” J. Biotechnol., vol. 115, no. 2, pp. 113–128, 2005.
Structural Genomics Consortium et al., “Protein production and purification,” Nat. Methods,
vol. 5, no. 2, pp. 135–146, 2008.
G. Taylor, M. Hoare, D. R. Gray, and F. A. O. Marston, “Size and Density of Protein Inclusion
Bodies.,” Nat. Biotechnol., vol. 4, pp. 553–557, 1986.
J. P. Arié, M. Miot, N. Sassoon, and J. M. Betton, “Formation of active inclusion bodies in the
periplasm of Escherichia coli,” Mol. Microbiol., vol. 62, no. 2, pp. 427–437, 2006.
A. Singh, V. Upadhyay, A. K. Upadhyay, S. M. Singh, and A. K. Panda, “Protein recovery from
inclusion bodies of Escherichia coli using mild solubilization process,” Microb. Cell Fact., vol.
14, no. 41, pp. 1–10, 2015.
S. Ventura and A. Villaverde, “Protein quality in bacterial inclusion bodies,” Trends
Biotechnol., vol. 24, no. 4, pp. 179–185, 2006.
Literaturverzeichnis
[118] P. M. Hwang, J. S. Pan, and B. D. Sykes, “Targeted expression, purification, and cleavage of
fusion proteins from inclusion bodies in Escherichia coli,” FEBS Lett., vol. 588, no. 2, pp. 247–
252, 2014.
[119] M. K. M. Chow et al., “The REFOLD database: a tool for the optimization of protein expression
and refolding.,” Nucleic Acids Res., vol. 34, no. Database issue, pp. D207-12, 2006.
[120] E. Kopera, A. Belczyk-Ciesielska, and W. Bal, “Application of Ni(II)-assisted peptide bond
hydrolysis to non-enzymatic affinity tag removal,” PLoS One, vol. 7, no. 5, 2012.
[121] Y. Ni and R. Chen, “Extracellular recombinant protein production from Escherichia coli,”
Biotechnol. Lett., vol. 31, no. 11, pp. 1661–1670, 2009.
[122] W. S. Jong, A. Saurí, and J. Luirink, “Extracellular production of recombinant proteins using
bacterial autotransporters,” Curr. Opin. Biotechnol., vol. 21, no. 5, pp. 646–652, 2010.
[123] A. C. Fisher et al., “Production of secretory and extracellular N-linked glycoproteins in
Escherichia coli,” Appl. Environ. Microbiol., vol. 77, no. 3, pp. 871–881, 2011.
[124] P. Hägg, J. W. De Pohl, F. Abdulkarim, and L. A. Isaksson, “A host/plasmid system that is not
dependent on antibiotics and antibiotic resistance genes for stable plasmid maintenance in
Escherichia coli,” J. Biotechnol., vol. 111, no. 1, pp. 17–30, 2004.
[125] R. Chen, “Bacterial expression systems for recombinant protein production: E. coli and
beyond,” Biotechnol. Adv., vol. 30, no. 5, pp. 1102–1107, 2012.
[126] J. Krzeslak, P. Braun, R. Voulhoux, R. H. Cool, and W. J. Quax, “Heterologous production of
Escherichia coli penicillin G acylase in Pseudomonas aeruginosa,” J. Biotechnol., vol. 142, no.
3–4, pp. 250–258, 2009.
[127] S. Noda, Y. Ito, N. Shimizu, T. Tanaka, C. Ogino, and A. Kondo, “Over-production of various
secretory-form proteins in Streptomyces lividans,” Protein Expr. Purif., vol. 73, no. 2, pp. 198–
202, 2010.
[128] F. W. Studier, “Protein production by auto-induction in high-density shaking cultures,” vol. 41,
pp. 207–234, 2005.
[129] C. J. Thompson, J. M. Ward, and D. A. Hopwood, “DNA cloning in Streptomyces: resistance
genes from antibiotic-producing species.,” Nature, vol. 286, pp. 525–527, 1980.
[130] Molecular Cloning, vol. 1. 2012.
[131] T. Gverzdys, M. K. Hart, S. Pimentel-elardo, G. Tranmer, and J. R. Nodwell, “13Deoxytetrodecamycin , a new tetronate ring-containing antibiotic that is active against
multidrug-resistant Staphylococcus aureus,” vol. 68, no. 11, pp. 698–702, 2015.
[132] C. Du et al., “Biosynthesis of the Terpene Phenalinolactone ¨ 6071 : Analysis of the Gene in
Streptomyces sp . Tu Cluster and Generation of Derivatives,” no. April, pp. 365–377, 2006.
[133] D. J. Macneil, K. M. Gewain, C. L. Ruby, G. Dezeny, P. H. Gibbons, and T. Maeneil,
“Streptomyces avermitilis,” vol. 111, pp. 61–68, 1992.
[134] M. S. B. Paget, L. Chamberlin, A. Atrih, S. J. Foster, and M. J. Buttner, “Evidence that the
Extracytoplasmic Function Sigma Factor ␴ E Is Required for Normal Cell Wall Structure in
Streptomyces coelicolor A3 ( 2 ),” vol. 181, no. 1, pp. 204–211, 1999.
[135] J. Grinsted, P. M. Bennett, S. Higginson, and M. H. Richmond, “Regional Preference of
Insertion of Tn501 and Tn802 Into RP1 and Its Derivatives,” vol. 320, pp. 313–320, 1978.
[136] P. Smith, “High efficiency intergeneric conjugal transfer of plasmid DNA from Esc ’ herichia coli
to methyl DNA-restricting streptomycetes,” vol. 155, 1997.
[137] L. Betancor, K. J. Weissman, and P. F. Leadlay, “Improved Catalytic Activity of a Purified
Multienzyme from a Modular Polyketide Synthase after Coexpression with Streptomyces
Chaperonins in Escherichia coli .,” vol. 3, pp. 2962–2966, 2008.
[138] M. C. Moncrieffe et al., “Structure of the Glycosyltransferase EryCIII in Complex with its
Activating P450 Homologue EryCII,” J. Mol. Biol., vol. 415, no. 1, pp. 92–101, 2012.
[139] K. F. Chater and L. C. Wilde, “Restriction of a Bacteriophage of Streptomyces albus G Involving
Endonuclease SalI,” vol. 128, no. 2, pp. 644–650, 1976.
[140] J. Wunsch-palasis, In silico und in vitro Untersuchungen zum Sekundärstoffwechsel in
Aktinomyceten unter besonderer Berücksichtigung der Biosynthese der Rishirilide aus
Streptomyces bottropensis. 2013.
175
Literaturverzeichnis
[141] L. Petzke, “Transgenese in Streptomyceten : Transposons , Rekombinasen und
Meganukleasen,” 2010.
[142] X. Yan, “Investigation of the Biosynthesis of Ganefromycins and Rishirilides,” 2012.
[143] P. Matsushima and R. H. Baltz, “A gene cloning system for ’Streptomyces toyocaensis ’,” no.
1996, pp. 261–267, 2016.
[144] T. Siegl, Erstellung und Charakterisierung neuer molekularbiologischer Werkzeuge für
Aktinomyceten einschließlich einer synthetischen Promotorbibliothek. 2013.
[145] S. Herrmann et al., “Site-Specific Recombination Strategies for Engineering Actinomycete
Genomes,” Appl. Environ. Microbiol., pp. 1804–1812, 2012.
[146] S. F. Altschup, W. Gish, T. Pennsylvania, and U. Park, “Basic Local Alignment Search Tool
2Department of Computer Science,” J Mol. Biol., pp. 403–410, 1990.
[147] R. Chenna et al., “Multiple sequence alignment with the Clustal series of programs,” Nucleic
Acids Res., vol. 31, no. 13, pp. 3497–3500, 2003.
[148] E. Gasteiger et al., “ExPASy : the proteomics server for in-depth protein knowledge and
analysis,” Nucleic Acids Res., vol. 31, no. 13, pp. 3784–3788, 2003.
[149] A. Roy, A. Kucukural, and Y. Zhang, “I-TASSER: a unified platform for automated protein
structure and function prediction.,” Nat. Protoc., vol. 5, no. 4, pp. 725–738, 2011.
[150] A. M. Waterhouse, J. B. Procter, D. M. A. Martin, M. Clamp, and G. J. Barton, “Jalview Version
2-A multiple sequence alignment editor and analysis workbench,” Bioinformatics, vol. 25, no.
9, pp. 1189–1191, 2009.
[151] S. Kim et al., “Literature information in PubChem : associations between PubChem records
and scientific articles,” J. Cheminform, pp. 1–15, 2016.
[152] J. Mcentyre and D. Lipman, “PubMed : bridging the information gap,” CMAJ, vol. 164, no. 9,
pp. 1317–1319, 2001.
[153] J. Peng and J. Xu, “RaptorX: exploiting structure information for protein alignment by
statistical inference.,” Proteins, vol. 79, no. Suppl 10, pp. 161–171, 2012.
[154] D. Klementz et al., “StreptomeDB 2 . 0 –– an extended resource of natural products produced
by streptomycetes,” Nucleic Acids Res., vol. 44, no. November 2015, pp. 509–514, 2016.
[155] T. U. Consortium, “Ongoing and future developments at the Universal Protein Resource,”
Nucleic Acids Res., vol. 39, no. November 2010, pp. 214–219, 2011.
[156] P. Emsley and B. Lohkamp, “research papers Features and development of Coot research
papers,” Acta Crystallogr, pp. 486–501, 2010.
[157] T. Kieser, M. J. Bibb, M. J. Buttner, K. F. Chater, and D. A. Hopwood, Genetic manipulation of
streptomyces-a laboratory manual. Cold Spring Harbor Laboratory Press, 2000.
[158] T.
Strobel,
Genomische
und
molekularbiologische
Untersuchungen
zum
Biotransformationswirt Saccharothrix espanaensis. 2013.
[159] U. K. Laemmli, “Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of
bacteriophage T4.,” Nature, pp. 680–685, 1970.
[160] P. Carter, “Site-directed mutagenesis,” vol. 237, pp. 1–7, 1986.
[161] Agilent Technologies, “QuikChange II Site-Directed Mutagenesis Kit. Instruction manual.,”
2015.
[162] S. N. Ho, H. D. Hunt, R. M. Horton, J. K. Pullen, and L. R. Peasea, “Site-directed mutagenesis by
overlap extension using the polymerase chain reaction,” Gene, vol. 77, pp. 51–59, 1989.
[163] R. D. Kirsch and E. Joly, “An improved PCR-mutagenesis strategy for two-site mutagenesis or
sequence swapping between related genes,” Nucleic Acids Res., vol. 26, no. 7, pp. 1848–1850,
1998.
[164] R. Heermann, T. Zeppenfeld, and K. Jung, “Escherichia coli chromosome using Red ® / ET ®
Recombination,” Microb. Cell Fact., vol. 3, no. Atcc 33694, pp. 1–8, 2008.
[165] B. J. Rawlings, “Biosynthesis of polyketides (other than actinomycete macrolides).,” Nat. Prod.
Rep., vol. 16, pp. 425–484, 1999.
[166] M. L. Dickens, J. Ye, and W. R. Strohl, “Cloning, sequencing, and analysis of aklaviketone
reductase from Streptomyces sp. strain C5,” J. Bacteriol., vol. 178, no. 11, pp. 3384–3388,
1996.
176
Literaturverzeichnis
[167] T. R. Valentic, D. R. Jackson, S. F. Brady, and S.-C. S. Tsai, “Comprehensive Analysis of a Novel
Ketoreductase for Pentangular Polyphenol Biosynthesis.,” ACS Chem. Biol., 2016.
[168] S. Maier et al., “Functional characterization of different ORFs including luciferase-like
monooxygenase genes from the mensacarcin gene cluster.,” Chembiochem, vol. 16, no. 8, pp.
1175–82, May 2015.
[169] K. Ichinose et al., “The granaticin biosynthetic gene cluster of Streptomyces violaceoruber
Tü22: sequence analysis and expression in a heterologous host,” Chem. Biol., vol. 5, no. 11,
pp. 647–659, 1998.
[170] A. Marchler-Bauer et al., “CDD/SPARCLE: functional classification of proteins via subfamily
domain architectures.,” Nucleic Acids Res., vol. 45, no. November 2016, p. gkw1129, 2016.
[171] J. Yang, R. Yan, A. Roy, D. Xu, P. J, and Y. Zhang, “The I-TASSER Suite: Protein structure and
function prediction,” Nat Methods, vol. 12, no. 1, pp. 7–8, 2015.
[172] J. Yang and Y. Zhang, “I-TASSER server: New development for protein structure and function
predictions,” Nucleic Acids Res., vol. 43, no. W1, pp. W174–W181, 2015.
[173] Y. Zhang, “I-TASSER server for protein 3D structure prediction.,” BMC Bioinformatics, vol. 9, p.
40, 2008.
[174] N. Krishna and K. Guruprasad, “Certain heptapeptide and large sequences representing an
entire helix, strand or coil conformation in proteins are associated as chameleon sequences,”
Int. J. Biol. Macromol., vol. 49, no. 2, pp. 218–222, 2011.
[175] M. Ashburner, “Gene ontologie: Tool for the unification of biology,” Nat. Genet., vol. 25, no. 1,
pp. 25–29, 2000.
[176] N. Oganesyan, I. Ankoudinova, S.-H. Kim, and R. Kim, “Effect of osmotic stress and heat shock
in recombinant protein overexpression and crystallization.,” Protein Expr. Purif., vol. 52, no. 2,
pp. 280–285, 2007.
[177] N. K. Tripathi, “Production and Purification of Recombinant Proteins from Escherichia coli,”
ChemBioEng Rev., vol. 3, no. 3, pp. 116–133, 2016.
[178] D. Nagarajan, G. Deka, and M. Rao, “Design of symmetric TIM barrel proteins from first
principles,” BMC Biochem., pp. 1–22, 2015.
[179] T. Heitzler, Sekundärstoffe aus Aktinomyceten: Untersuchungen zur Biosynthese und
Regulation sowie Verifizierung eines Clustom-Sequencing-Verfahrens. 2015.
[180] C. Hertweck, A. Luzhetskyy, Y. Rebets, and A. Bechthold, “Type II polyketide synthases: gaining
a deeper insight into enzymatic teamwork.,” Nat. Prod. Rep., vol. 24, no. 1, pp. 162–190,
2007.
[181] J. Kantola et al., “Folding of the polyketide chain is not dictated by minimal polyketide
synthase in the biosynthesis of mithramycin and anthracycline.,” Chem. Biol., pp. 751–755,
1997.
[182] A. T. Hadfield, C. Limpkin, W. Teartasin, T. J. Simpson, J. Crosby, and M. P. Crump, “The crystal
structure of the actIII actinorhodin polyketide reductase: Proposed mechanism for ACP and
polyketide binding,” Structure, vol. 12, no. 10, pp. 1865–1875, 2004.
[183] P. Javidpour, A. Das, C. Khosla, and S. C. Tsai, “Structural and biochemical studies of the
hedamycin type II polyketide ketoreductase (Hed KR): Molecular basis of stereo- and
regiospecificities,” Biochemistry, vol. 50, no. 34, pp. 7426–7439, 2011.
[184] C. Hertweck, L. Xiang, J. A. Kalaitzis, Q. Cheng, M. Palzer, and B. S. Moore, “ContextDependent Behavior of the Enterocin Iterative Polyketide Synthase: A New Model for
Ketoreduction,” Chem. Biol., vol. 11, pp. 461–468, 2004.
[185] M. L. Eklund, “Investigations on the early biosynthetic steps of griseorhodin A,” 2011.
[186] J. Staunton and K. J. Weissman, “Polyketide biosynthesis: a millennium review,” Nat. Prod.
Rep., vol. 18, no. 4, pp. 380–416, 2001.
[187] J. Zhan, K. Watanabe, and Y. Tang, “Synergistic actions of a monooxygenase and cyclases in
aromatic polyketide biosynthesis,” ChemBioChem, vol. 9, no. 11, pp. 1710–1715, 2008.
[188] S. Hosseinkhani, R. Szittner, and E. A. Meighen, “Random mutagenesis of bacterial luciferase :
critical role of Glu 175 in the control of luminescence decay,” Biochem. J., vol. 580, pp. 575–
580, 2005.
177
Literaturverzeichnis
[189] S. Gullón et al., “Isolation, characterization, and heterologous expression of the biosynthesis
gene cluster for the antitumor anthracycline steffimycin,” Appl. Environ. Microbiol., vol. 72,
no. 6, pp. 4172–4183, 2006.
[190] R. H. Baltz, “Streptomyces and Saccharopolyspora hosts for heterologous expression of
secondary metabolite gene clusters,” J. Ind. Microbiol. Biotechnol., vol. 37, no. 8, pp. 759–772,
2010.
[191] H. Zhang, Y. Wang, and B. A. Pfeifer, “Bacterial hosts for natural product production,” Mol.
Pharm., vol. 5, no. 2, pp. 212–225, 2008.
[192] N. Tamehiro, T. Hosaka, J. Xu, H. Hu, N. Otake, and K. Ochi, “Innovative Approach for
Improvement of an Antibiotic-Overproducing Industrial Strain of Streptomyces albus
Innovative Approach for Improvement of an Antibiotic-Overproducing Industrial Strain of
Streptomyces albus,” Appl. Environ. Microbiol., vol. 69, no. 11, pp. 6412–6417, 2003.
[193] A. K. umar Jha, S. Paudel, D. Dhakal, P. T. hi T. Van, G. P. rasad Ghimire, and J. K. yung Sohng,
“Genetic evidence for the involvement of glycosyltransferase PdmQ and PdmS in biosynthesis
of pradimicin from Actinomadura hibisca,” Microbiol. Res., vol. 174, pp. 9–16, 2015.
[194] F. Wright and M. J. Bibb, “Codon usage in the G+C-rich Streptomyces genome,” Gene, vol.
113, no. 1, pp. 55–65, 1992.
[195] S. Makino, E. T. Beebe, J. L. Markley, and B. G. Fox, “Stable Expression Clones and AutoInduction for Protein Production in E . coli,” Methods Mol. Biol., vol. 1091, pp. 17–32, 2014.
[196] M. L. Dickens, J. Ye, and W. R. Strohl, “Analysis of clustered genes encoding both early and
late steps in daunomycin biosynthesis by Streptomyces sp . strain C5 . These include : Analysis
of Clustered Genes Encoding Both Early and Late Steps in Daunomycin Biosynthesis by
Streptomyces sp . Strai,” vol. 177, no. 3, pp. 536–543, 1995.
[197] S. Torkkell, T. Kunnari, K. Palmu, P. Mäntsälä, J. Hakala, and K. Ylihonko, “The entire
nogalamycin biosynthetic gene cluster of Streptomyces nogalater: characterization of a 20-kb
DNA region and generation of hybrid structures,” Mol. Genet. genomics, vol. 266, no. 2, pp.
276–288, 2001.
[198] Z. Xu, K. Jakobi, K. Welzel, and C. Hertweck, “Biosynthesis of the antitumor agent chartreusin
involves the oxidative rearrangement of an anthracyclic polyketide,” Chem. Biol., vol. 12, no.
5, pp. 579–588, 2005.
[199] W. A. Francisco, H. M. Abu-Soud, T. O. Baldwin, and F. M. Raushel, “Interaction of bacterial
luciferase with aldehyde substrates and inhibitors,” J. Biol. Chem., vol. 268, no. 33, pp. 24734–
24741, 1993.
[200] J. C. Low and S. C. Tu, “Functional roles of conserved residues in the unstructured loop of
Vibrio harveyi bacterial luciferase,” Biochemistry, vol. 41, no. 6, pp. 1724–1731, 2002.
[201] A. McPherson and J. A. Gavira, “Introduction to protein crystallization,” Acta Crystallogr. Sect.
FStructural Biol. Commun., vol. 70, no. 1, pp. 2–20, 2014.
[202] A. McPherson, “A comparison of salts for the crystallization of macromolecules,” Protein Sci,
vol. 10, no. 2, pp. 418–422, 2001.
[203] A. McPherson, “Introduction to protein crystallization,” Methods, vol. 70, no. 1, pp. 354–365,
2004.
[204] Z. S. Derewenda and P. G. Vekilov, “Entropy and surface engineering in protein
crystallization,” Acta Crystallogr. Sect. D Biol. Crystallogr., vol. 62, no. 1, pp. 116–124, 2005.
[205] J. A. Gerlt and F. M. Raushel, “Evolution of function in (β/α)8-barrel enzymes,” Curr. Opin.
Chem. Biol., vol. 7, no. 2, pp. 252–264, 2003.
[206] D. Reardon and G. K. Farber, “The structure and evolution of alfa/beta barrel proteins,” FASEB
J., vol. 9, no. 7, pp. 497–503, 1995.
[207] N. Nagano, C. A. Orengo, and J. M. Thornton, “One fold with many functions: The evolutionary
relationships between TIM barrel families based on their sequences, structures and
functions,” J. Mol. Biol., vol. 321, no. 5, pp. 741–765, 2002.
[208] A. M. Whited and A. Johs, “The interactions of peripheral membrane proteins with biological
membranes,” Chem. Phys. Lipids, vol. 192, pp. 51–59, 2015.
178
Literaturverzeichnis
[209] S. Tan, “A modular polycistronic expression system for overexpressing protein complexes in
Escherichia coli.,” Protein Expr. Purif., vol. 21, no. 1, pp. 224–234, 2001.
[210] J. Müller, S. Rout, D. Leitsch, J. Vaithilingam, A. Hehl, and N. Müller, “Comparative
characterisation of two nitroreductases from Giardia lamblia as potential activators of nitro
compounds,” Int. J. Parasitol. Drugs Drug Resist., vol. 5, no. 2, pp. 37–43, 2015.
[211] M. J. Fath, R. C. Skvirsky, and R. Kolter, “Functional complementation between bacterial MDRlike export systems: Colicin V, alpha-hemolysin, and Erwinia protease,” J. Bacteriol., vol. 173,
no. 23, pp. 7549–7556, 1991.
179
Abkürzungsverzeichnis
8 Abkürzungsverzeichnis
8.1 Einheiten
Å
Ångström
Da
Dalton
%
Prozent
°C
Grad Celsius
h
Stunde(n)
min
Minute(n)
s
Sekunde(n)
g
Gramm
L
Liter
m
Meter
M
molar
mol
Einheit der Stoffmenge
Hz
Herz
V
Volt
Au
absorption units (Absorptionseinheiten)
Ppm
parts per million
rpm
revolutions per minute (Umdrehungen pro Minute)
bp
Basenpaar(e)
Pa
Paskal
Ω
Ohm
u
unit (Enzymmenge, die ein µmol Substrat pro Minute umsetzt)
8.2 Nukleotide
A
Adenin
T
Thymin
C
Cytosin
G
Guanin
180
Abkürzungsverzeichnis
8.3 Physikalische Größen
A
Absorption
Mr
Molare Masse
m
Masse
t
Zeit
V
Volumen
λ
Wellenlänge
OD600
optische Dichte bei λ = 600 nm
RT
retention time (Retentionszeit)
m/z
Masse/Ladungs-Verhältnis
J
Kopplungskonstante
δ
chemische Verschiebung
8.4 Vorsilben
G
Giga
109
M
Mega
106
k
kilo
103
c
zenti
10-2
m
mili
10-3
µ
micro
10-6
n
nano
10-9
p
pico
10-12
8.5 Aminosäuren
Alanin
Ala
A
Arginin
Arg
R
Asparagin
Asn
N
Asparaginsäure
Asp
D
Cystein
Cys
C
Glutamin
Gln
Q
Glutaminsäure
Glu
E
181
Abkürzungsverzeichnis
Glycin
Gly
G
Histidin
His
H
Isoleucin
Ile
I
Leucin
Leu
L
Lysin
Lys
K
Methionin
Met
M
Phenylalanin
Phe
F
Prolin
Pro
P
Serin
Ser
S
Threonin
Thr
T
Tryptophan
Trp
W
Tyrosin
Tyr
Y
Valin
Val
V
8.6 Sonstige Abkürzungen
∆
Kennzeichnung einer Geninaktivierung
SA
Kennzeichnung einer Punktmutation (Tausch von Serin gegen Alanin)
aby
Gen aus dem Abyssomcin-Biosynthesegencluster
ACP
Acyl-Carrier-Protein
act
Gen aus dem Actinorhodin-Biosynthesegencluster
afs
Gen aus dem Aflatoxin-Biosynthesegencluster
Amp
Ampicillin
Apra
Apramycin
APS
Ammonium-Persulfat
AT
Acyltransferase
ATP
Adenosintriphosphat
AUC
area under the curve
bidest
bidestilliert
bla
β-Lactamresistenzgen
BLAST
basic local alignment search tool
BRET
Biolumineszenz-Resonanz Energietransfer
BSA
Bovines Serumalbumin
182
Abkürzungsverzeichnis
BVMO
Bayer-Villiger Monooxygenase
bzw.
beziehungsweise
ca.
circa
CDA
Calcium-abhängiges (-dependent) Antibiotikum
cha
Gen aus dem Chartreusin Gencluster
CLF
chain length factor
Chlor
Chloramphenicol
CoA
Coenzym A
Cos
Cosmid
CSRs
cluster situated regulators
CYC
Zyklase
CYP450
Cytochrom-P450 Oxygenasen
DAD
Diodenarray-Detektor
DDMM
Didesmethylmensacarcin
ddmsn
Didesmethylmensacarcin-Biosynthesegencluster
DHAE
Dihydroacetanilid-Epoxidase
DKCMO
Diketocamphan-Monooxygenase
DMF
Dimethylformamid
DMO
Dimethylsulfid-Monooxygenase
DMSO
Dimethylsulfoxid
DNA
deoxyribonucleic acid (Desoxyribonukleinsäure)
dNTPs
Desoxynukleotide
DTT
Dithiothreitol
EDTA
Dinatriummethylendiamintetraessigsäure
emo
Gen aus dem Emodin-Biosynthesegencluster
end
Gen aus dem Enterocin-Biosynthesegencluster
Epo
Gen aus dem Epothilon-Gencluster
ESI
Elektrospray-Ionisierung
et al.
et alii (und andere)
EtOH
Ethanol
E-value
Expect-Value
FAD
Flavin-Adenin-Dinukleotid
FASs
fatty acid synthases (Fettsäuresynthasen)
183
Abkürzungsverzeichnis
FGD
F420-abhängige Glucose-6-phosphat Dehydrogenase
FMN
Flavinmononucleotid, oxidierte Form
FMO
Flavin-Monooxygenase
FR
Flavinreduktase
G6P
Glucose-6-phosphat
gar
Gen aus dem Actagardin-Biosynthesegencluster
GBL
γ-Butyrolacton
GFP
green fluorescent protein
grk
Gen aus dem Griseorhodin-Biosynthesegencluster
Goe
Goettingensis
GSH
Glutathion
H2O2
Wasserstoffperoxid
HCl
Salzsäure
hed
Gen aus dem Hedamycin-Gencluster
hgc
Gen aus dem Hygrocin-Biosynthesegencluster
His-Tag
Histidin-Affinitätstag zur Proteinaufreinigung
hpa
Gen aus dem 4-Hydroxyphenylessigsäure-Biosynthesegencluster
HPLC
high performance liquid chromatography
(Hochleistungsflüssigchromatographie)
HppE
Hydroxypyropylphosphonatsäure-Epoxidase
Hygro
Hygromycin
IC50
mittlere inhibitorische Konzentration
IPTG
Isopropyl-β-D-thiogalactopyranosid
jad
Gen aus dem Jadomycin-Biosynthesegencluster
Kan
Kanamycin
KR
Ketoreduktase
LH2
Luciferin
LLM
Luciferase-like monooxygenase (Luciferase-ähnliche Monooxygenase)
LumP
Lumazin Protein
mel
Gen aus der Biosynthese von Mannosylerythritol-Lipiden
MeOH
Methanol
mon
Gen aus dem Monensin-Gencluster
MOPS
3-(N-Morpholino)-Propansulfonsäure
184
Abkürzungsverzeichnis
MSD
Quadrupol-Massendetektor
MSH
Mycothiol
msn
Gen aus dem Mensacarcin-Biosynthesegencluster
mup
Gen aus dem Mupirocin-Biosynthesegencluster
myc
Gen aus dem Mycinamycin-Gencluster
NaCl
Natriumchlorid
NAD(P)+
Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid-(Phosphat), oxidierte Form
NAD(P)H
Nicotinsäureamid-Adenin-Dinukleotid-(Phosphat), reduzierte Form
NaOH
Natriumhydroxid
NCBI
National Center for Biotechnology Information
NMR
nuclear magnetic resonance (Kernspinresonanz)
nta
Gen aus dem Nitrilotriacetat-Biosynthesegencluster
O2
Sauerstoff
OD
Optische Dichte
OH-Gruppe
Hydroxylgruppe
ORF
open resding frame (Offenes Leseraster)
oriT
origin of transfer
PCR
polymerase chain reaction (Polymerase-Kettenreaktion)
PDB
Protein Datenbank
PDB-ID
Protein Datenbank-Identifikationsnumer
Phos
Phosphomycin
Pim
Gen aus dem Pimaricin-Gencluster
PKS
Polyketidsynthase
PNP
Pyridoxin-5‘-phosphat
RNA
ribonucleic acid (Ribonukleinsäure)
rsl
Gen aus dem Rishirilid-Biosynthesegencluster
RT
Raumtemperatur
SAM
S-Adenosyl-L-Methionin
SARP
streptomyces antibiotic regulatory protein
SDR
short-chain Dehydrogenasen/Reduktasen
SDS
sodium dodecyl sulfate
sp(p).
Species; Art(en)
Spec
Spectinomycin-Resistenzkassette
185
Abkürzungsverzeichnis
ssu
gen aus dem small-subunit (SSU) ribosomal DNA-Gencluster
Strep-Tag
Streptavidin-Affinitätstag zur Proteinaufreinigung
TEMED
N,N,N',N'-Tetramethylethylendiamin
TIM
Triosephosphat-Isomerase
tpd
Gen aus dem Tetramethylpyrazin-Biosynthesegencluster
TRIS
Tris(hydroxymethyl)aminomethan
UV
Ultraviolett
X-Gal
5-Brom-4-Chlor-3-Indolyl-α-D-Galactopyranosid
z.B.
zum Beispiel
186
Anhang
9 Anhang
9.1 Proteinsequenz von MsnO2
MKFGINLFPTVGPEDKSGVQFFDDCLALAERAEQLGFHHVKTVEHYFSAYGGYSPDPVTFLAAAAARTSRVRLITGA
ALPAFSHPVKLAGKLAMLDHLSHGRLDVGFGRGFLPEEFWAYQIPMDESRARFNEGVESCLRLWTEEETTFEGRFH
SFGPLTLLPRPFQSPHPRVLVATAITPESGEAAGAAGHGVMMVPSINKQEKLQEMLARYRDTRTAAGLASTDEDIH
FSYNCYLAEDRDKAHRLGQVYSERTNRLLAAAVSSWQHNRSADYAGYERIVARVNSGDFGKQLRDNKVLVGDPQE
VADRVELIRDLYGETTISLQIVSGNMPFEESVRTLELFAEHVLPRFA
9.2 Proteinsequenz von MsnO3
MPTGTTTGTVDASLFRDAFASLPTSVAVITTTDAQGMPKGLTSSAVCAVSMDPPLLLICVDKSSQTLPALQQANGF
VVNFLSAGSEQVSRQFATKSADKFAGVQHRTSSRAAGSPILFADSVAYLECAAESRIEAGDHWILLGRVLGGEVHDK
GALLYHRRSYLKLLPERNAS
9.3 Proteinsequenz von MsnO4
MKFGIVFFPTVGGANGEVTPTQYYDDGLHIAELADELGYFQVKLVEHYFFDYGGYSPDPTTFLAAVAARTSRLRIAT
GAVIPAFTHPVKLSGQLAMLDNISGGRLDVGFGRAFLPDEFTAFGIPLNESRARFEEGVEACVRLWTEDDLEWNGT
FHQFGPVTMLPKPAQQPHPPVFVASTGNLDSCRTAGELGHHLQLIASVATREKVQEALSVYRRAWADAGHRAGT
ERIDLTFPCFVDEDREAAYRQGEYVERRMSEKMAAAVSAWATVKSDQYPGYDRMAAAAVGNGAAFDERVKENK
VLAGTPDDVRGQLAEIADWYGDDIAIGLSVHSGHVPRVDVERGLRLFAERVAPEFTDGR
9.4 Proteinsequenz von MsnO8
MKLSVVEQAPVVEGLTPAHSLQHSIELARLADRLGYERFWVAEHHAEIFNAVPAPEILIARIAAETSGIRVGSGGVLLS
LYSPLKVAEVFRTLHALYPDRIDLGIGRANRVKLPVFAALRDDTAGKEPSSDDLWRRLEQLRAYLDPDSGLPFTVSPR
MPGGPALWLLGASVSSAEAAARLGLPYAYAHFITPQFTREAMDTYRAAFVPGPDTPSPRPILSVVVCCAETDAEAQ
RVYATHRLFHRRMSQGDVRLLPPADLAVAEMDKPGPDPLAEESFEWPRYVVGSPDRVRDQLTKMADATGAEELG
VVSMIHDQRDRLRSYRLLAEAFELTPR
187
Anhang
9.5 Proteinsequenz von RslO1
MKFGINLFPTVGPAEKSAGQHFEESLRLAELADELGFHHVKTVEHYFHEYGGYSPDPVTFLAAAAARTRRVRLVTGA
VLPVFTHPLKLAGKLAMLDNISQGRLDVGFGRAFLPDEFTAFEISMDESRARFDEGVEAVRRLWAEEDVVWEGTFH
RFGPVTMLPRTWQRPHPRILVATAKTPASAEAAARAGHGVMLVPSINPREQVQKTLSLYRDAASAAGFKPTEEDIH
MSYNCYLAEDGQEARQKGGQASERANRALASAVSAWRETRSADYPGYEKIVEKAGRGDFDRAVAERKALVGTPD
EVRAAIDDIRGWFGDFTISLQVISGAMPFEESARTMRLFAEHLLPHYAAND
9.6 Proteinsequenz von RslO6
MKLSVLDQSVVPEGSTPATALHNSLNLARLADRLGYHRYWFAEHHATPSFAGPAPEIMAARVAAETRRIRVGSGG
VLLPHYSPLKVAEVFRVLGALSPGRIDLGVGRGIGAGSIEAHALAPGTSGGGDDGDFPGKLAELLAFLHGGFPDGHP
YGRIQLMPTAGAPEVWLLVASPQSAELAARLGLPVSIAHFGRPQVTRSVVEAYRGAFDSHDGSRPRVQIGIGVYCG
PTEEEARRVFASQRLFRLRMGRGLLLPLPSPEAALDGLRGEVEPLADEVAEWPRCVVGDPDHVHKELTSMTEALEID
EFMVLSTIHAPRDRMRSYELLARRFGLTGEGGGDSAA
9.7 Proteinsequenz von RslO2
MGSSSSGLVPRGSHMAIDDELFRAMFSAHPAAVCVVTAAGPDGRPSGLTTSAVTSVSMDPPLLVCVGTGSRTLAA
IRHSGGFAVNFLAVHNERLSERFAGKSTQKFDGLDWRPSGRAAQAPLLPAHHLSAVAECLVHQEVPAGDHSVFLG
RIEGAVVHGRAPMLYHERDYIHLPVPALSGTVTAD
188
Anhang
9.8 Plasmide zur heterologen Produktion von Proteinen in
E. coli
Abbildung 9.1 Plasmidkarte des Proteinproduktionsplasmids pET21a/msnO4.
Abbildung 9.2 Plasmidkarte des Proteinproduktionsplasmids pET21a/msnO2.
189
Anhang
Abbildung 9.3 Plasmidkarte des Proteinproduktionsplasmids pET28a/msnO2.
Abbildung 9.4 Plasmidkarte des Proteinproduktionsplasmids pET28a/msnO3.
190
Anhang
9.9 Plasmide
zur
Komplementierung
mit
enthaltener
Punktmutation
Abbildung 9.5 Plasmidkarte des Komplementierungsplasmids puwl-H/msnO10SA.
Abbildung 9.6 Plasmidkarte des Komplementierungsplasmids puwl-H/msnO11SA.
191
Danksagung
10 Danksagung
An dieser Stelle möchte ich mich bei allen herzlich bedanken, ohne die die Anfertigung dieser
Dissertation nicht möglich gewesen wäre. Mein besonderer Dank gilt:
Prof. Dr. Andreas Bechthold für die Möglichkeit meine Doktorarbeit in seiner Arbeitsgruppe
anfertigen zu können sowie für das Überlassen des interessanten Themas. Zudem möchte ich mich
für die gewährte wissenschaftliche Freiheit und die Unterstützung in der schweren Anfangszeit
meiner Arbeit bedanken.
Prof. Dr. Oliver Einsle für sein Interesse an meiner Arbeit und die Übernahme des Korreferats, sowie
Prof. Dr. Stefan Günther für seine Bereitschaft an meinem Rigorosum als Drittprüfer teilzunehmen.
Prof. Dr. Susana Andrade und Prachi Dabhade für die gute Zusammenarbeit und die Durchführung
der Kristallisationsexperimente. Danke für die stets hilfsbereite und verlässliche Kooperation.
Mehrosh Pervaiz für die Unterstützung bei der Anfertigung von Proteinmodellen im Rahmen dieser
Arbeit.
Dr. Kersten Döring und Dennis Klementz für die Möglichkeit der Beteiligung am Projekt StreptomeDB
2.0 und das dadurch gewonnene Wissen, das meine Arbeit zusätzlich bereichert hat.
Elisabeth Welle für die große Hilfsbereitschaft, die vielen wertvollen Ratschläge und die schönen
Gespräche in unserem Büro.
Marcus Essing und Sandra Groß für ihre Unterstützung im Labor, sowie für das Bestellen aller Sachen
ohne die meine praktische Arbeit nicht möglich gewesen wäre.
Allen meinen Kollegen und Freunden aus der AG Bechthold und der AG Merfort für die kollegiale
Arbeitsatmosphäre, die produktiven Diskussionen und den wertvollen Wissensaustausch im Alltag.
Meinen Korrekturlesern Mirjam Bernhardt, Stefanie Hackl, Philipp Schwarzer und Dr. Tanja Heitzler
für die gründliche Fehlersuche und die vielen hilfreichen Vorschläge und Kommentare zu meiner
Arbeit.
Stefanie Hackl, Dr. Christoph Nikolaus, Dr. Tanja Heitzler, Regina Dornhof, Katharina Hesselbach,
Mirjam Bernhardt und Sören Hammelmann für die entspannten Mittagspausen in der Mensa, die
gemeinsamen Kaffepausen und die vielen schönen Momente während und nach der Arbeit.
Meinen Eltern, deren Liebe, Unterstützung und uneingeschränktes Vertrauen mich zu dem
Menschen gemacht haben der ich heute bin.
192
Danksagung
Meinem Freund Dominic (Dosn). Danke für deine Liebe, dein Verständnis und deine Gelassenheit die
alle Probleme des Alltags viel kleiner und unwichtiger erscheinen lassen.
193
Bildungsgang
11 Bildungsgang
Name
Astrid Maria Erber
Geburtsdatum
04. März 1988
Geburtsort
Balingen
07/2013 – 06/2017
Anfertigung der vorliegenden Dissertation im Arbeitskreis von
Prof. Dr. Andreas Bechthold
Lehrstuhl für Pharmazeutische Biologie und Biotechnologie
Institut für Pharmazeutische Wissenschaften
Albert-Ludwigs-Universität Freiburg
06/2013
Approbation als Apothekerin
10/2007 - 06/2013
Studium der Pharmazie, Albert-Ludwigs-Universität Freiburg
Abschluss: Staatsexamen
11/2012 – 04/2013
Zweite Hälfte des Praktischen Jahres
Rieselfeldapotheke, Freiburg
05/2012 – 10/2012
Erste Hälfte des Praktischen Jahres im Arbeitskreis von
Prof. Dr. Natasa Skalko – Basnet
Drug Transport and Delivery Research Group
Department of Pharmacy
University of Tromsø (Norwegen)
Abschluss: Diplom - Pharmazeutin
10/2006 – 04/2007
Studium der Rechtswissenschaften, Albert-Ludwigs-Universität
Freiburg
09/2003 – 07/2006
Stefan Żeromski Lyzeum, Bielsko-Biała (Polen)
Abschluss: Abitur
194