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Mikroskopie
02
Auflösungsvermögen
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1. Was ist das Auflösungsvermögen?
Beispiel aus Google-Earth:
Man kann zwar beliebig vergrößern, jedoch sind die Einzelheiten dann nicht mehr
deutlich zu erkennen. Es treten nur noch „körnige“, kleinste Bildelemente auf, aus
denen das Bild zusammengesetzt ist.
Das Auflösungsvermögen ist bei dieser Vergrößerung nicht ausreichend genug!
Beim Mikroskop: Häufig große Vergrößerung aber zu geringe Auflösung!
Jeweils links:
Normales Bild durch ein Mikroskop mit hoher Vergrößerung aber
geringen Auflösungsvermögens
Jeweils rechts: Gleiches Objekt durch Mikroskop mit großem Auflösungsvermögen.
Auflösungsvermögen: Fähigkeit eines optischen Instruments, auch kleinste
Strukturen des betrachteten Gegenstands deutlich
darzustellen.
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Rolf Piffer
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2. Beugung
Lässt man ebene Wasserwellen
senkrecht auf einen Spalt zulaufen (Abb.
rechts) , dann kann man hinter dem Spalt
auch im „Schattenbereich“ Wellen
erkennen. Der Effekt, dass sich
Wasserwellen auch um Hindernisse
herum ausbreiten können, nennt man
Beugung.
Dieser Effekt wird umso deutlicher, je
kleiner der Spalt wird:
Beugung ist eine typische Wellenerscheinung!
Beleuchtet man eine Schere mit Laserlicht,
tritt anstatt eines scharfen Schattens ein
deutliches Beugungsmuster auf.
(Quelle: D.C. Giancoli: Physik, Pearson
Studium, München 2006, S. 1186)
Dieses Beugungsmuster ist ein deutlicher
Nachweis dafür, dass sich Licht
wellenförmig ausbreitet.
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Durchstrahlt man einen schmalen Spalt mit Laserlicht, kann man das folgende
Beugungsbild hinter dem Spalt auf einem Schirm sehen:
In der Mitte befindet sich das Hauptmaximum der Intensität (Maximum 0. Ordnung),
begrenzt durch schmale Streifen von Dunkelheit (Minima der Intensität). Dann folgen
weitere schwächere Maxima (Maxima 1., 2., 3. etc. Ordnung), jeweils getrennt durch
Minima.
Die Breite des Hauptmaximums ändert sich mit der Spaltbreite b (Quelle:
http://leifi.physik.uni-muenchen.de/web_ph12/versuche/06einfachspalt/spaltbreite.htm
vom 1.10.2008):
=> Je schmaler die Spaltblende, desto breiter das zentrale Beugungsmaximum
Auch an sehr schmalen kreisförmigen Blenden tritt Beugung auf:
Das „Beugungsscheibchen“ in der Mitte (Maximum 0. Ordnung) wird begrenzt durch
einen dunklen Kreis mit sehr kleiner Intensität – das erste Minimum des
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Intensitätsverlaufs. Bei größeren Radien (im eigentlichen Schattenbereich) sind
weitere aber viel schwächere ringförmige Maxima 1., 2. etc. Ordnung zu beobachten.
Derartige „Beugungsmuster“ sind von Fotographien her bekannt. Die Form der
Beugung gibt sogar die Form der verwendeten Blende wieder:
Versuche dazu:
1. In den Laserstrahl wird eine veränderbare Spaltblende immer schmaler gestellt.
=> Auf einem weit entfernten Schirm wird die Beugung durch ein immer
breiteres Maximum sichtbar.
2. Kreisblenden verschiedenen Durchmessers (1,0 mm. 0,3 mm und 0,2 mm)
werden in den Strahl gebracht.
=> Kreisförmige Beugungsmuster sind auf dem Schirm zu beobachten.
3. Mit einer Linse wird ein beleuchtetes Drahtgitter scharf auf einem Schirm
abgebildet. Dann wird vor die Linse ein veränderbarer Spalt gestellt, der
langsam immer enger gestellt wird.
=> Das Gitterbild wird bei Verengung immer unschärfer bis die Konturen der
parallel zum Spalt angeordneten Drähte nicht mehr zu erkennen sind. Die
Drähte senkrecht zum Spalt bleiben scharf abgebildet.
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3. Interferenz
Wie kann man die Minima in den Beugungsbildern
erklären?
Die Wellen, die vom Spalt aus in den Raum hinter
den Spalt gelangen, überlagern sich, ohne dass sich
die einzelnen Wellen dadurch verändern. Trifft aber
ein Wellental auf einen Wellenberg, löschen sich die
Wellen gegenseitig aus. Oder allgemein gesagt:
Treten genau so viele positive wie negative Werte der
Wellen am Ort des Schirms auf, addieren sich diese
Werte zu 0. Ein negativer Wert einer Welle liegt dann
vor, wenn ihre momentane Auslenkung unterhalb der
Nulllinie ist.
Im nebenstehenden Beispiel sind die Werte der
jeweiligen Wellen am Ort des Schirms als grüne
Strecken gekennzeichnet. Es gibt genau so viele
„positive“ wie „negative“ Strecken => Minimum der
Intensität
Diese Überlagerung von Wellen nennt man
Interferenz. Bei einem Minimum liegt eine destruktive Interferenz vor.
Entsprechend zu diesen Überlegungen treten auch
Maxima der Intensität auf, die durch Minima begrenzt
werden.
Am nebenstehenden Beispiel kann man erkennen, dass
sich die grünen Strecken (Werte der Auslenkung am
Schirm) nicht zu Null addieren. Bei diesem Winkel zur
Mittelachse liegt hier bei gleicher Spaltbreite wie oben ein
Nebenmaximum vor. Maximum: konstruktive Interferenz
Der Abstand zwischen benachbarten Maxima
(Wellenberge) bzw. Minima (Wellentälern) der Welle heißt
Wellenlänge λ.
Ändert sich die Wellenlänge des Lichts, entsteht bei
gleichem Spalt ein Minimum unter einem anderen Winkel
als in der obigen Abbildung gezeigt. D.h. dass die Lage
der Minima und Maxima auch von der Wellenlänge
abhängen.
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Das erste Minimum in der Intensitätsverteilung liegt dann vor, wenn die Strecke Δs bei
einem Ablenkungswinkel α
gerade so groß ist wie die
Wellenlänge λ des Lichts.
α
α
2
r
Aus dem rechtwinkligen
Dreieck kann man erkennen,
dass die Gegenkathete zum
Winkel α gerade Δs und die
Hypothenuse die Strecke 2r
ist.
•
Δs
Das Verhältnis von
Gegenkathete zur Hypothenuse ist definiert als der Sinus des Winkels α:
sin α 
Δs
2r
oder als Bedingung für das erste Minimum bei einem Spalt der Breite 2r:
sin α 
λ
λ
 0,5 
2r
r
(1)
Was kann man sich unter der Wellenlänge des Lichts vorstellen?
4. Farbe und Wellenlänge des Lichts
Das weiße Licht besteht aus einem
Gemisch Elektromagnetischer Wellen
verschiedenster Wellenlängen. Rotes
Licht hat Wellenlängen zwischen 0,65 μm
und 0,70 μm (Mikrometer = 1  10-6 m).
Blaues Licht liegt etwa im Bereich
zwischen 0,45 μm bis 0,50 μm.
Die Farbe des Lichts wird durch dessen Wellenlänge festgelegt. Blaues Licht hat eine
kleinere Wellenlänge als rotes Licht.
Lässt man Licht verschiedener Farbe (verschiedene Wellenlängen) durch den
gleichen, sehr engen Spalt treten, kann man verschieden breite Intensitätsverteilungen
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auf dem Schirm hinter dem Spalt erkennen (aus: Metzler: Physik, Schroedel-Verlag,
Braunschweig 2007, S. 306):
Die Breite des zentralen Beugungsbereichs ist auch abhängig von der Farbe des
Lichts:
Blaues Licht mit kleiner Wellenlänge hat ein schmales Hauptmaximum.
Rotes Licht mit größerer Wellenlänge hat ein breiteres Hauptmaximum.
5. Zusammenfassung der Beugung von Licht an Spalten
1. Durch enge Öffnungen in einem Strahlengang verbreitert sich das
Lichtbündel, so dass ein breites Hauptmaximum auf dem Bildschirm
erscheint.
2. Die Minima in der Intensitätsverteilung entstehen durch destruktive
Interferenz der Wellen bei bestimmten Winkeln.
3. Je kleiner die Durchtrittsöffnung ist, desto breiter ist das zentrale
Intensitätsmaximum.
4. Je größer die Wellenlänge des Lichts ist, desto breiter ist das zentrale
Maximum der Intensität.
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6. Beugung an Kreisblenden und Linsen
Licht tritt durch eine Sammellinse mit dem Radius r und der Brennweite f. Das
Beugungsscheibchen hat dann den Radius R (ist gleich dem Radius des 1. dunklen
Rings) und liegt in der Brennebene. Der dunkle Ring mit dem Radius R erscheint unter
dem Winkel αmin mit
λ
sin αmin = 0,61 •
(2)
r
Der Faktor 0,61 tritt hier an die Stelle von 0,5 in der Formel (1) für den Spalt, da hier
eine kreisförmige Blende mit dem Durchmesser 2r vorliegt.
Nach der Zeichnung gilt auch:
sin α min 
R
R2  f 2
Im Allgemeinen ist R << f, so dass näherungsweise gilt:
sin αmin = R/√(f2) = R/f
(3)
Setzt man Gleichung (2) und (3) gleich, folgt:
0,61•λ /r = R/f
oder
R  0,61 
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λf
r
(4)
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Beispiel: Wie groß ist der Radius R eines Beugungsscheibchens, für blaues Licht mit
λ = 400 nm = 4  10-7 m, dem Linsenradius r = 1 cm und der Brennweite
f = 10 cm?
7. Auflösungsvermögen von Linsen und Kreisblenden
Tritt das Licht von zwei benachbarten punktförmigen Objekten (G1 und G2) durch eine
Linse mit dem Radius 2r, so entstehen diesmal 2 Beugungsscheibchen mit gleichen
Radien R in einem Abstand a auf dem Schirm:
Diese Scheibchen können
sich mehr oder weniger
überlappen:
Aus: Metzler: Physik,
Schroedel-Verlag,
Braunschweig 2007, S. 311
Ist der Abstand a der Maxima kleiner als der Radius R der Beugungsscheibchen (Fall
a)), lassen sich die beiden Bilder nicht mehr als getrennte Bilder erkennen.
Dies bestimmt den Mindestwinkel εmin, unter dem G1 und G2 vorliegen müssen, um
noch als zwei getrennte Punkte identifiziert werden zu können. Je kleiner dieser
Winkel werden kann, desto besser lassen sich auch feinste Strukturen des Objekts
erkennen. Daher bestimmt εmin das Auflösungsvermögen einer Linse.
Auflösungsvermögen A der abbildenden Linse (Kreisblende):
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A = 1/ εmin
Der Abstand a ist proportional zum Winkel εmin und zur Brennweite f (Strahlensatz).
Damit ist:
amin = εmin•f
oder umgeformt
εmin = amin / f
(5)
Setzt man (5) in die Gleichung für das Auflösungsvermögen,

A = f / amin = f / R und mit der obigen Formel für den Radius R der
Beugungsscheibchen:
R  0,61 
λf
r
dann folgt für das Auflösungsvermögen:
A
1 r

0,61 λ
(6)
Beispiel.: Wie groß ist das Auflösungsvermögen des menschlichen Auges, wenn der
Pupillenradius 1,5 mm, die Brennweite der Augenlinse 1,7 cm und die
Wellenlänge des Lichts 600 nm beträgt und wie groß darf amin maximal
werden?
(für Fortgeschrittene: Der Brechungsindex des Auges ist n = 1,33)
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8. Auflösungsvermögen beim Mikroskop
Die meisten Objekte, die mit einem Mikroskop
beobachtet werden, leuchten nicht selbst, sondern
werden durch eine Lichtquelle beleuchtet. An den
kleinsten Strukturen des Objekts tritt dadurch
Beugung und Interferenz auf. Jeder Punkt des
Objekts beugt das Licht und es kommt zu
Interferenzen, die die Minima und Nebenmaxima
eines Beugungsbildes hervorrufen.
In der nebenstehenden Abbildung wird ein Objekt von
unten durchleuchtet. An einem beliebigen Punkt des
Objekts wird das Licht wie an einem schmalen Spalt
gebeugt und es entsteht ein Intensitätsmuster mit
einem Hauptmaximum in der Mitte, getrennt durch
einen Bereich verschwindender Intensität vom ersten
Nebenmaximum. Nur ein Teil dieser
Intensitätsverteilung kann in das Objektiv gelangen.
In der Brennebene des Objektivs
entsteht das scharfe
Beugungsbild der (unendlich weit
entfernten) Lichtquelle. Die
Beugungsbilder –B und +B bilden
das „primäre“ Bild.
Das primäre Bild interessiert beim
Mikroskop in der Regel nicht, da
man ja ein Bild des Objekts (hier
ein Strichgitter) haben möchte.
Die Strahlen, die die
Beugungsbilder liefern, bilden in
ihrem weiteren Verlauf das
gewohnte reelle Bild des Objekts
(sekundäres Bild) in der
Bildebene O’.
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Alle Beugungsbilder werden zum Aufbau des reellen Bildes benötigt, um ein
vollkommen ähnliches Bild des Objekts zu erzeugen. Jede Änderung des primären
Bildes (Beugungsbilder) verfälscht das reelle Bild vom Objekt.
Es genügt demnach nicht, nur das zentrale Beugungsscheibchen dieses einen
Objektpunktes durch das Objektiv zu bekommen, sondern es müssen möglichst viele
Maxima durch das Objektiv gelangen, um ein unverfälschtes, hoch aufgelöstes Bild zu
erhalten.
Versuche:
a) In einen Laserstahl wird ein Strichgitter mit g =100/cm gebracht. Das
Beugungsbild wird durch ein Objektiv (hier: f 150) auf eine
Beugungsordnungsblende scharf abgebildet. Durch eine weitere Linse (hier: f
20) wird auf dem weit entfernten Schirm ein Abbild des Strichgitters erzeugt.
Ohne Beugungsordnungsblende erscheint das
Bild des Strichgitters:
(Fotos der Schirmbilder aus: Arbeitsunterlagen
HeNe-Laser 500 N, Firma Spindler & Hoyer KG,
Göttingen;
leider waren die selbst gemachten Fotos zu
schlecht, da die Kamera nicht genügend
Auflösung hatte, so dass man die feine
Strichstruktur auf dem Foto nicht mehr sehen
konnte)
Die Form der Beugungsordnungsblende sieht etwa folgendermaßen aus:
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b) Die Beugungsordnungsblende wird jetzt so justiert, dass nur noch das
Hauptmaximum (0.ter Ordnung) durchgelassen wird:
Das Bild des Strichgitters ist völlig strukturlos und
enthält keine Information über das Objekt mehr.
Das Bild entspricht der Abbildung der Lichtquelle,
da erst durch die Beugungsmaxima höherer Ordnung Information über das
Objekt geliefert wird.
c) Die Beugungsordnungsblende wird jetzt so justiert, dass das Hauptmaximum
(0.ter Ordnung) und die Maxima 1. Ordnung durchgelassen werden:
Das Bild des Strichgitters gibt nun eine weitgehend
identische Abbildung des Strichgitters, was man
gut durch den Vergleich mit der Abbildung ohne Blende erkennen kann.
d) Die Beugungsordnungsblende wird jetzt so justiert, dass nur die Maxima 1.
Ordnung durchgelassen werden:
Auch jetzt erscheint ein Bild mit einer Gitterstruktur,
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jedoch ist dieses Bild nicht mehr identisch mit dem Objekt. Durch diesen Eingriff
in das primäre Bild entsteht ein Abbild des Strichgitters mit größerer Strichzahl,
obwohl dies gar nicht vorhanden ist.
e) Die Beugungsordnungsblende wird jetzt so justiert, dass nur die Maxima 2.
Ordnung durchgelassen werden:
Hier tritt auch auf, dass ein Objekt vorgetäuscht
wird, das wieder so gar nicht vorliegt. Das
Strichgitter hat anscheinend eine noch größere
Strichzahl als im Versuch d) mit ausschließlich den Maxima 1. Ordnung.
Ein Beispiel aus der Praxis: Nur das zentrale Beugungsmaximum wird abgebildet:
Werden zusätzlich die Maxima 1. Ordnung mit zum sekundären Bild verarbeitet,
entsteht ein Bild mit höherer Auflösung:
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9. Numerische Apertur des Mikroskops
Ist D der Abstand der Objektpunkte (zum Beispiel Strichabstand bzw. Gitterkonstante),
dann gilt für die Ordnung m bei fester Wellenlänge λ des Lichts:
sin α(m, D) = m•λ / D
Ist 2u der fest vorgegebene Öffnungswinkel (siehe Zeichnung), unter dem das
Objektiv vom Objekt her erscheint, dann fallen die Beugungsmaxima 1. Ordnung dann
ins Objektiv, wenn gilt:
sin α(1, D) = λ / D ≤ sin u oder
D ≥ λ / sin u = Dmin
D.h. es können nur Strukturen abgebildet werden, deren Abstand größer als Dmin ist.
Die Größe 1/Dmin ist schließlich das Auflösungsvermögen des Mikroskops:
A
1
D
min
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
n  sin u

(7)
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Wird eine Flüssigkeit zwischen Objekt und Objektiv mit dem Brechungsindex n
gebracht (Immersionsflüssigkeit), erhöht sich wegen n>1 die Auflösung. Der Faktor
n•sin u
wird numerische Apertur (NA) genannt.
Dies kann man durch die folgenden Abbildungen verdeutlichen:
Der Öffnungswinkel 2α
hängt von der Entfernung
zwischen Objekt und
Deckglas (über dem
Objekt) ab.
Je kleiner der Abstand
zwischen Objekt
(Deckglas) und Objektiv,
desto größer wird der
Öffnungswinkel und es
können viele
Beugungsmaxima höherer
Ordnung ins Objektiv
gelangen.
Verwendet man dazu noch eine
„Immersionsflüssigkeit“ (z.B. Öl) mit
möglichst hohem Brechnungsindex n
zwischen Deckglas und Objektiv, dann
gelangen gemäß der nebenstehenden
Abbildung weitere höhere Ordnungen von
Maxima ins Objektiv.
Durch diese beiden Effekte wird die
Auflösung des Mikroskops erhöht.
Typische Objektive:
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Billig:
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Apertur 0.1; Auflösung 2,75μm
Hochwertig: Apertur 0,65; Auflösung 0,42μm
Öl:
Apertur 1,4; Auflösung 0,20μm
(beide Abbildungen dieser Seit aus: Dr.H.Schlichting: Mikroskopie in der Biochemie,
Vorlesungsskript)
10. Wellenlängenabhängige Auflösung beim Mikroskop
Nach Gleichung (7) ist die
Auflösung beim Mikroskop umso
größer, je kleiner die
Wellenlänge λ ist. D.h. blaues
Licht ( ca. 450 nm) löst feine
Strukturen besser auf als rotes
(ca. 700 nm). Allerdings ist es
nicht leicht, Objekte wie z.B. die
abgebildete Alge zu finden,
deren Strukturen genau diese
Größen haben, so dass blaues
Licht tatsächlich mehr Strukturen
offenbart als rotes.
Abbildung aus
Unterrichtsmaterialien zum
Testla-Projekt,
Forschungszentrum DESY, Aulis
Verlag 2000, S. 159:
Eine Alge in 1000 facher
Vergrößerung bei 458 nm (blau)
und bei 680 nm /rot).
Eine noch höhere Auflösung würde man erzielen, wenn man Licht noch kürzerer
Wellenlänge wie z.B. Ultraviolett verwenden würde. Noch besser wären
Röntgenstrahlen mit noch wesentlich kleinerer Wellenlänge, jedoch sind bei den
beiden letzten Möglichkeiten die gesundheitlichen Gefährdungen durch die
verwendete Strahlung viel zu groß.
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