Molekulare und zelluläre Hintergründe

Überblick
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Molekulare und zelluläre Hintergründe rezidivierender
Streptococcus pyogenes-Infektionen
Bernd Kreikemeyer, Andreas Podbielski
Eukaryote Z.
Institut für Medizinische Mikrobiologie, Virologie und Hygiene, Universität Rostock
C
RG
Bakterien-Z.
N
Eu
ka
ry
RGD
ot
e
RGD
Z.
RGD
RGD
RGD
C R
45kDa
U
RGD
C
N
Eukaryote Zelle
Integrine
R
a
Kinasen
(Rak, CDC42,
FAK, SYF)
45
kD
R
45
kD
45
kD
a
N 30kDa
N 30kDa
N 30kDa
N 30kDa
N 30kDa
a
a
45
kD
45
kD
Z.
R
nie
er
kt
a
B
Ca
C
C
C
C
Bakterien-Z.
N 30kDa
U
C
AktinReorganisation
R
R
U
Pino-/Phagozytose
2. Hypothese
N
Das Gram-positive Bakterium Streptococcus pyogenes (Gruppe A-Streptokokken, GAS) benutzt ausschließlich den
Mensch als Wirt. Typischerweise besiedeln
die Bakterien die Schleimhaut (Rachen)
und Haut (Gesicht, Unterschenkel) und
lösen eine lokale eitrige Infektion aus
(Abb. 3). Diese heilt in der Regel von selbst,
kann aber durch eine β-Laktam-Therapie
verkürzt werden. Selten folgt eine lokale
oder systemische Ausbreitung der Bakterien mit lebensbedrohlichen Komplikationen. Die Bakterien benötigen dafür die
Fähigkeit zur Bildung spezieller Zytolysine,
Nekrose- und Apoptose-induzierender
Substanzen sowie Faktoren zur Inhibition
oder Modulation der Wirtsabwehr.
Häufiger ist die tatsächliche oder scheinbare Heilung. Bei letzterer persistieren die
Bakterien asymptomatisch am Ort der
überwundenen Infektion, um rezidivierend
nach Wochen bis Jahren neue lokale oder
systemische Infektionen zu verursachen.
Dabei ist die Fähigkeit der Bakterien zur
Internalisierung in epitheliale Zielzellen
entscheidend. Intrazellulär verbleiben sie
in inaktiven Phagosomen oder im Zytosol,
um nach Einwirkung unbekannter Stimuli
wieder Aggressine zu produzieren, die eine
Apoptose oder Lyse ihrer Wirtszelle
bewirken, und so freigesetzt eine neue
Runde einer Infektion zu starten.
C R
D
Da
45k
N 30kDa
Eukaryote Z.
1. Hypothese
Abb. 1: Die Bedeutung der Fibronektin-Bindung von S. pyogenes für die Internalisierung der Bakterien.
S. pyogenes bindet Fibronektin (Fn) mittels spezifischer Oberflächenproteine. Diese Fn-bindenden
Proteine sind über ihren C-Terminus in der Bakterienzellwand verankert und weisen im C-terminalen
Anteil zwei Fn-Bindungsdomänen (R= Repeat, U= Unique) auf. Entweder durch sukzessive Bindung
beider Domänen an die N-terminal gelegenen 30 kDa- und 45 kDa-Anteile eines Fn-Moleküls (Hypothese 1) oder durch Bindung einzelner Einheiten der Repeat-Domäne an die 30 kDa-Anteile verschiedener Fn-Moleküle (Hypothese 2) wird über die mit dem/den Fn-Molkül/en verbundenen Integrine die
Internalisierungssequenz initiiert. Dafür stimulieren kleine Kinasen eine Aktinfilament-Reorganisation
in der Wirtszelle und bewirken so eine Pino- oder Phagozytose der Bakterien.
S. pyogenes-Adhärenz an Wirtszellen
GAS können mehr als ein Dutzend
verschiedener Adhäsine – in der Mehrzahl
Oberflächen-verankerte Proteine – produzieren. Offenbar kodiert das Genom
einzelner GAS-Stämme in Assoziation zu
deren M-Serotyp nur eine variable
Untermenge dieser Proteine. Die bisher am
besten charakterisierten Adhäsine binden
Fibronektin (Fn), ein maßgebliches Glykoproteine der Interzellulärmatrix. Dieses
bindet wiederum an α5β1- und αvβ3Integrine der Zielzellmembranen. Fn stellt
also eine Bindungsbrücke zwischen Bak-
terien und den epithelialen Wirtszellen dar.
Die Fn-bindenden Proteine der GAS weisen
zum Teil Strukturcharakteristika funktionell
verwandter Oberflächenproteine aus S.
dysgalactiae und Staphylococcus aureus auf.
Dazu gehören eine Stamm-spezifische Nterminale Sequenzvariabilität des reifen
Proteins, eine C-terminale Zellwandverankerung über einen Sortasemechanismus und zwei C-terminale Fn-Bindungsdomänen. Eine Domäne besteht aus
einer variablen Menge von RepeatEinheiten, von denen jede für sich Fn
binden kann; die andere Domäne ist nichtrepetitiv („unique“).
BIOspektrum · 1/05 · 11. Jahrgang
Überblick
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S. pyogenes-Internalisierung in Wirtszellen
Bei mindestens zwei Adhäsinen induziert
die Fn-Bindung auch eine GAS-Internalisierung in den Zielzellen. Dazu werden nach
einem initialen Stimulus kleine Kinasen der
eukaryoten Zelle aktiviert. Dies führt zu einem Umbau der Aktinfilamente und einer
Pino-/Phagozytose der Bakterien (Abb. 1).
Bezüglich des initialen Stimulus zur Internalisierung bestehen zwei Hypothesen: Der
Triggermechanismus ist 1. eine sukzessive
Bindung zunächst zwischen der Repeat-Domäne und der 30 kDa N-terminalen Fn-Domäne und dann zwischen der Unique-Domäne des Fn-bindenden Proteins und der 45
kDa-sub-N-terminalen Fn-Domäne[8]; 2. die
Bindung einzelner Einheiten der RepeatDomäne eines Fn-bindenden Proteins an
die 30 kDa-Domänen verschiedener Fn-Moleküle[7]. Dies führt zu einer lokalen Dichteerhöhung von Integrinen in der Zellmembran, was wiederum die Kinase-Aktivierung
bewirkt (Abb. 1).
Protein F2 – ein maßgebliches Adhäsin
Der Serotyp M49-Stamm gehört zu den
GAS, die gleichermaßen Schleimhaut- und
Hautinfektionen auslösen können. Im von
uns und MWG gemeinsam zu 76 Prozent sequenzierten Genom dieses Stamms finden
sich die Gene für die Fibronektin-bindenden Proteine F2, SOF (Serum-Opazitätsfaktor), SfbX, OrfX/Fba und Fbp54.
Wir untersuchten den Beitrag des Proteins
F2 zum Adhärenz- und Internalisierungsverhalten unseres Stamms[4]. Von der Protein
F2-Repeat- als auch der Unique-Domäne
wurden nach Exposition gegen definierte
Fn-Fragmente nur das 30kDa-Fragment
und alle dieses Fragment enthaltende größeren Fn-Fragmente gebunden. Die übrigen rekombinanten Protein F2-Anteile zeigten keine Fn-Interaktion. Der Assoziationskoeffizient für die Bindung zwischen Repeat-Domäne und 30kDa Fn-Fragment lag
im nanomolaren Bereich. Dies entspricht
dem Wert anderer stark Fn-bindender Proteine, etwa aus Staphylococcus aureus. Die
Unique-Domäne band deutlich schwächer
an das 30kDa Fn-Fragment.
Eine Mutante im prtF2-Gen wies gegenüber dem Wildtyp eine um bis zu 90 Prozent
verminderte Fn-Bindung auf. Übereinstimmend dazu war die Epithelzell-Adhärenz
und -Internalisierung der prtF2-Mutante je
nach Messmethode (Antibiotika-Protektionsassay / Lebendkeimzählung bzw. Doppelimmunfluoreszenz) zwischen 50 und über
90 Prozent vermindert.
Das Protein SOF zeigte eine um eine
Zehnerpotenz schwächere Interaktion ebenfalls nur mit dem 30 kDa Fn-Fragment und
BIOspektrum · 1/05 · 11. Jahrgang
Abb. 2: Die Struktur der FCT-Region in den Genomen verschiedener S. pyogenes M-Serotypstämme. In
S. pyogenes-Stämmen der Serotypen M1, M3, M5, M6, M12, M18 und M49 wird die Genomregion für
Fibronektin- und Collagen-Bindung sowie für T-Antigene durch hochkonservierte Sequenzen für ein
Hitzeschockprotein (hsp33) und ein unbekanntes Offenes Leseraster (136) flankiert. Die FCT-Region
enthält immer ein nra- oder ein zu 70 Prozent homologes rofA-Gen für einen Globalregulator. Ferner
kommen dort immer ein bis zwei zu 30 bis 50 Prozent homologe Gene für Fibronektin-bindende
Proteine (prtF1, prtF2, fbaB) und häufig für ein Kollagen-bindendes Protein (cpa) vor. Ferner kodiert
die Region eine potenzielle Signalpeptidase (127), eine alternative Sortase (129, srtC2) und zwei putative Oberflächenproteine (128, 130). In FCT-Regionen mit einem prtF2 / fbaB-Gen findet sich auch
immer ein msmR-Gen, welches für einen Positivregulator aller FCT-Region-Gene kodiert.
einen entsprechend geringeren Beitrag zur
Interaktion mit eukaryoten Zellen[5]. Damit
ist Protein F2 das maßgebliche Epithelzelladhäsin des M49 GAS-Stamms und
die Interaktion eines Protein F2-Moleküls
mit mehreren Fn-Molekülen der wahrscheinliche Stimulus für die Internalisierung
dieses GAS-Stamms.
Wirtszellreaktionen nach einer GASInternalisierung
Zur Ermittlung des weiteren Schicksals von
internalisierten Bakterien und ihren epithelialen Wirtszellen bei den in vitro-Versuchen führten wir zu mehreren Zeitpunkten
des Bakterien-Zellkontaktes Vitalitätsbestimmungen sowie gesamtgenomische
Transkriptomanalysen der Wirtszellen
durch. Nur von 86 eukaryoten Genen war
die Expression spezifisch verändert. Speziell
die Gene für Zielproteine der bakteriellen
Adhärenz, das Fn- und Integrin-α5-Gen,
wurden induziert. Zusätzlich konnte ein
GAS-Serotypstamm-abhängiger Einfluss auf
die Zytoskelettgene nachgewiesen werden.
Der M49-Serotypstamm aktivierte dafür
GTPasen der Ras-Familie sowie Faktoren
des RhoA-Pfades. Zur Freisetzung aus den
Wirtszellen induzierte der M49-Serotypstamm den bisher nicht in diesem Zusammenhang beschriebenen TNFα-abhängigen Caspase 2-Weg.
Regulation bakterieller Aggressine
Der Erhalt der Lebensfähigkeit ihrer Wirtszellen ist für persistierende GAS überlebensnotwendig. Daher ist zu erwarten, dass
die Bakterien nicht nur ihr Eindringen in die
Zellen, sondern auch die Produktion von
Aggressinen während ihrer Persistenz über
die Funktion von Regulatoren stringent kontrollieren. Als ein zentraler Negativregulator
sowohl der Fibronektin- und Kollagen-Bindung als auch der Hämolysin- und SpeASuperantigen-Produktion wurde das NraProtein ermittelt[6]. Zugehörige Sensoren
und spezifische Stimuli für die Nra-Aktivität
sind unbekannt. Im Rahmen von EMSA-Experimenten für rekombinantes Nra konnten
wir die direkte Interaktion mit den Promotoren abhängiger Gene aufzeigen.
Die FCT-Region des GAS-Genoms
Bei der Analyse der genomischen Umgebung des nra-Gens im M49 GAS-Stamm fan-
Überblick
36
den wir die Gene prtF2 und cpa (Kollagenbindendes Protein) in einem 13 kb großen
Abschnitt. Dieser Genomabschnitt wurde in
bisher sieben Serotyp-Genomen vollständig
sequenziert (Abb. 2)[2; 6]. Zwischen den homologen Rändern (hsp33, Spy0136) sind diese FCT-Regionen („Fibronectin-/Collagenbinding/T-antigen protein genes“) in ihrer
Zusammensetzung und in der Sequenz der
vorhandenen Gene extrem variabel. Der
gegenüber dem restlichen Genom niedrigere GC-Gehalt und die gehäufte Präsenz von
Virulenzgenen in der FCT-Region deuten
den Status einer Pathogenitätsinsel an.
Die FCT-Region beinhaltet immer ein
nra- oder ein zu 70 Prozent homologes rofARegulatorgen sowie Gene für ein oder zwei
Fn-bindende Proteine (Protein F2 / F1) und
mindestens ein Kollagen-bindendes Protein
(Cpa). Das cpa-Gen ist das erste Gen eines
5-Gen-Operons, wobei die anderen Gene
des Operons für je eine alternative Signalpeptidase und Sortase sowie für zwei Oberflächenproteine kodieren. Der sichere Nachweis der Funktionen der von diesem Operon kodierten Proteine (u. a. Kollagenbindung von einem der zwei Oberflächenproteine) ist Inhalt eines derzeit laufenden
DFG-Projektes. Gentechnisch ist das Projekt anspruchsvoll, da alle Mutationen unter
Einschluss des putativen Signalpeptideasegens für die Bakterien letal wirken.
MsmR – ein selektiver Virulenzregulator
In allen FCT-Regionen mit einem Gen vom
prtF2-Typ findet sich auch ein msmR-Gen.
Basierend auf Homologievergleichen sollte
msmR einen AraC-Typ-Regulator kodieren.
MsmR wird genauso wie nra, cpa und prtF2
in der Transitionsphase des bakteriellen
Wachstums maximal exprimiert. Durch eine
zusätzliche msmR-Mutation in LuciferaseReportergenfusionen wurde offenbar, dass
MsmR ein Positivregulator der nra-, cpa- und
prtF2-Gene ist. So band auch rekombinantes MsmR an jede der genannten Promotorregionen. Als Konsequenz dieser Regulation zeigten msmR-Mutanten eine verminderte Fn-Bindung und eine entsprechend
reduzierte Wirtszelladhärenz und -internalisierung.
Die Transkriptomanalyse der nra- als auch
der msmR-Mutanten zeigten, dass Nra zum
Zeitpunkt seiner maximalen Expression bei
mehr als fünf Prozent der Gene des Genoms
die Transkriptmenge um mindestens das
Dreifache verändert. Ein Negativregulator
ist Nra nur für Virulenzgene, ansonsten überwiegen positive Kontrollwege. Die breite
Wirkung erzielt Nra womöglich durch den
Einfluss auf mehr als 20 andere Regulationsfaktoren. MsmR kontrolliert dagegen
nur die Expression von insgesamt ca. 20 Genen, nämlich alle Gene der FCT-Region so-
progrediente
Infektion,
Tod
MsmR ?
Gewebsinvasion
Übertragung
Protein F2
initialer
Kontakt
feste Bindung
Übertragung
Elimination über
nicht-spezifische
und angeborene
Abwehrmechanismen
Verfügbare Nährstoffe,
Bakterielle Virulenz
Mga
lokale Infektion
Nra
Mga
extrazelluläre
Besiedlung
Internalisierung,
intrazelluläre
Persistenz
MsmR ?
Rezidiv,
rekurrente
Infektion
Regulative Netzwerke entscheiden über
den S. pyogenes-Phänotyp und
Infektionsverlauf
Die genannten Daten fügen sich in ein Bild
von regulativen GAS-Netzwerken und deren Bedeutung für den Wechsel zwischen aggressivem und zahmem Phänotyp beziehungsweise zwischen extrazellulärer Virulenz und intrazellulärer Persistenz (Abb. 3).
Am Ort einer frischen Infektion produzieren
die adhärenten GAS lokal wirksame Aggressine, die ihnen den Inhalt von Wirtszellen erschließen und ihnen ein exponentielles Wachstum ermöglichen. Die dazu notwendigen GAS-Faktoren stehen unter der
positiven Kontrolle des Mga-Regulators. Im
Zuge der Nährstoffverknappung und anspringenden Immunabwehr bei einer fortgeschrittenen lokalen Infektion haben die
Bakterien zwei Optionen: auszubrechen und
andere Gewebe und Organe des Wirts zu infizieren oder die verbliebenen intakten Zellen vor Ort als Sanktuarium zu nutzen. Für
die erste Option ergänzen die Bakterien die
Mga-stimulierte Virulenzfaktorproduktion
um MsmR-kontrollierte Faktoren, die ihnen
durch spezifische Adhärenz und Einschleusung einer NADase eine Manipulation eukaryoter Zielzellen erlaubt. Für die zweite
Option internalisieren die Bakterien unter
der Kontrolle eines noch unbekannten Regulators in Wirtszellen. Schon währenddessen und im Status der intrazellulären Persistenz unterdrückt Nra direkt und indirekt
über die Suppression des mga-Gens die Produktion von Aggressinen, die die Vitalität ihrer Wirtszellen beeinträchtigen könnten.
Weitere Regulatoren, deren Interaktion
und die Auswirkungen auf die Bakterienphysiologie und -pathogenität sind in[3] beschrieben.
Stamm-spezifische S. pyogenes-Virulenz
Asymptomatischer
Trägerstatus
Nra
Elimination über
nicht-spezifische
und spezifische
Abwehrmechanismen
wie einige Virulenzgene, die zusammen für
das Typ III-Sekretionssystemäquivalent von
S. pyogenes kodieren.
Heilung,
Elimination
aus dem Wirt
Wirtsabwehr
Abb. 3: Schema für den Verlauf von S. pyogenes-Infektionen und die Bedeutung ausgewählter Virulenzfaktoren/-regulatoren für einzelne Schritte der Infektion. Im Kräftefeld zwischen der veränderlichen bakteriellen Virulenz und Wirtsabwehr kann ein S. pyogenes-Isolat seinen menschlichen Wirt
vorübergehend oder unter Internalisierung in Wirtszellen langwierig besiedeln, sofort oder zu einem
späteren Zeitpunkt eine akute, meist eitrige lokale Infektion hervorrufen und aus dieser Infektion
heraus systemische Komplikationen bis hin zum Tod des Wirts bewirken. Die Übertragung auf andere
Menschen ist sowohl von infizierten als auch von chronisch besiedelten Personen möglich. Das im Text
beschriebene Adhäsin Protein F2 und die „stand alone“-Regulatoren Mga, Nra und MsmR sind wahrscheinlich an den farbig unterlegten Schritten der Bakterien-Wirtszellinteraktion beteiligt.
Nur wenige molekulare Details wie die
intragenomische Präsenz bestimmter Prophagen konnten bisher mit dem Stamm-spezifischen Virulenzverhalten der GAS korreliert werden[1]. Die ebenfalls Stamm-spezifische Variabilität der FCT-Region bezüglich
der Gegenwart oder Abwesenheit einzelner
Virulenzgene sowie die extreme Sequenzvariabilität zwischen homologen Genen verschiedener FCT-Regionen, gepaart mit der
Präsenz einer für die jeweilige FCT-Region
spezifischen Prozessierungsmaschinerie für
Oberflächenproteine, könnten entscheidende Stücke für das Puzzle einer Stammspezifischen Virulenz der GAS darstellen.
BIOspektrum · 1/05 · 11. Jahrgang
Überblick
Sowohl mit der Charakterisierung einzelner Faktoren der FCT-Region als auch mit
einer molekularen Epidemiologie der FCTRegion in unterschiedlich aggressiven GASStämmen werden wir dieser Frage weiter
nachgehen.
Po391/3-3, Po391/6-1 und Po391/8-1 unterstützt. Die M49 GAS-Genomsequenzierung
sowie die Herstellung von gesamtgenomischen DNA-Arrays wurden durch eine Förderung im Rahmen des BMBF-PathoGenoMik Kompetenznetzwerkes ermöglicht.
Danksagung
Literatur
Die Ergebnisse zur Reaktion eukaryoter Zellen bzw. zu den Faktoren der FCT-Region
wurden maßgeblich von Dr. M. Klenk bzw.
Dr. M. Nakata erarbeitet. Beide werden
durch die DFG-Sachbeihilfen Kr1765/2-1
bzw. Po391/12-1 gefördert. Die Arbeiten von
A. P. über die Mga- und Nra-Regulatoren sowie von A. P. und B. K. zum Cpa-Protein
wurden durch die DFG-Sachbeihilfen
[1] Banks, D. J., Beres, S. B., Musser, J. M. (2002):
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[4] Kreikemeyer, B., Oehmcke, S., Nakata, M.,
Horogge, R., Podbielski, A. (2004): Streptococcus
Bernd
Kreikemeyer
geboren 1966; Studium
der Biologie in Braunschweig; 1995 Stipendiat am Microbiol. Dept.,
Trinity College, Dublin,
Irland und am Inst. of
Environmental Sciences,
Porirua, Neuseeland,
1996 Promotion bei
Singh Chhatwal an der
GBF Braunschweig;
1996–1998 DFG-Stipendiat am Center for Extracellular Matrix Biology (Prof. Höök), Inst. of
Biosciences & Technology, Texas A&M University, Houston, Texas, USA;
1999–2000 Wissenschaftlicher Angestellter
in der Abt. f. Med. Mikrobiologie u. Hygiene,
Univ. Ulm; seit 2001
Wissenschaftlicher Assistent und Arbeitsgruppenleiter am Inst. f.
Med. Mikrobiol., Virol.
& Hygiene, Univ. Klinik
Rostock; 2004 Habilitation
pyogenes fibronectin-binding protein F2: expression profile, binding characteristics and impact on eukaryotic cell
interactions. J Biol Chem 279: 15850–15859.
[5] Oehmcke, S., Podbielski, A., Kreikemeyer, B.
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to SfbI protein triggers streptococcal invasion into respiratory epithelial cells. Cell Microbiol 2:521–535.
Andreas
Podbielski
geboren 1955; Studium
der Biologie in Heidelberg; Promotion 1982
am Inst. f. Virologie
(Prof. Kaerner), DKFZ,
Heidelberg; Studium
der Medizin in Heidelberg und Mainz; Promotion 1986 am Inst. f.
Rheumapathologie
(Prof. Fassbender),
Univ. Mainz; 1987–1990
Assistenzarzt am Inst. f.
Med. Mikrobiologie,
RWTH Aachen; 1991
Max-Kade-Stipendiat
am Dept. of Microbiology (Prof. Cleary), Univ.
of Minnesota, Minneapolis; 1992–1996 Wissenschaftlicher Oberassistent am Inst. f. Med.
Mikrobiologie, RWTH
Aachen; 1994 Habilitation; 1996–2000 Professor an der Universität
Ulm; seit 2000 Leiter
der Abt. f. Med. Mikrobiologie und Krankenhaushygiene der Universitätsklinik Rostock
BIOspektrum · 1/05 · 11. Jahrgang
Korrespondenzadresse:
Prof. Dr. Dr. Andreas Podbielski
Dr. Bernd Kreikemeyer
Abt. f. Med. Mikrobiologie und
Krankenhaushygiene
Universitätsklinik Rostock
Schillingallee 70
D-18057 Rostock
Tel.: 0381-494 5900
Fax: 0381-494 5902
[email protected]
[email protected]