beeinflussten Differenzierung boviner Monozyten in Makrophagen

Tierärztliche Hochschule Hannover
Untersuchungen
zur Prostaglandin E2beeinflussten Differenzierung
boviner Monozyten in Makrophagen
INAUGURAL - DISSERTATION
zur Erlangung des Grades einer Doktorin
der Veterinärmedizin
- Doctor medicinae veterinariae (Dr. med. vet.)
vorgelegt von
Anna Düvel
Hameln
Hannover 2010
Wissenschaftliche Betreuung:
Apl. Prof. Dr. med. vet. H.-J. Schuberth
AG Immunologie
PD Dr. med. vet. A. Schnapper
Anatomisches Institut
1. Gutachter:
Apl. Prof. Dr. med. vet. H.-J. Schuberth
2. Gutachter:
Prof.’in Dr. med. vet. M. Hoedemaker
Tag der mündlichen Prüfung: 17.05.2010
Gefördert durch die Firma Pfizer Animal Health durch Personal- und Sachmittel
Inhaltsverzeichnis
1
2
Einleitung und Zielsetzung ........................................................................................9
Literaturübersicht ....................................................................................................12
2.1 Anatomischer Aufbau der Milchdrüse .....................................................................12
2.2 Immunzellen in der bovinen Zitze............................................................................13
2.3 Expression immunrelevanter Gene in der Zitze........................................................15
2.4 Monozyten und Makrophagen .................................................................................16
2.4.1 Makrophagen-Subpopulationen .........................................................................17
2.4.2 Die LPS-Toleranz von Makrophagen.................................................................18
2.4.3 Der Transkriptionsfaktor PPARγ .......................................................................20
2.4.4 Makrophagen im bovinen Euter.........................................................................22
2.4.5 Makrophagen-spezifische Antikörper ................................................................23
2.5 Prostaglandine .........................................................................................................26
2.5.1 Antiinflammatorische Eigenschaften der Prostaglandine....................................27
2.5.2 Prostaglandin E2 und dessen Wirkung auf Immunzellen ....................................28
3
Material und Methoden............................................................................................32
3.1 Versuchstiere...........................................................................................................32
3.2 Probennahme, Fixierung und Einbettung von Gewebeproben ..................................34
3.2.1 Probennahme.....................................................................................................34
3.2.2 Fixierung...........................................................................................................35
3.2.3 Präparation der Zitzen .......................................................................................36
3.2.4 Einbettung in Paraffin........................................................................................36
3.3 Histologische Färbungen .........................................................................................37
3.3.1 Hämatoxylin-Eosin-Färbung .............................................................................37
3.3.2 Trichrom-Färbung nach Masson-Goldner ..........................................................38
3.3.3 Toluidinblau-Färbung........................................................................................39
3.4 Immunhistochemische Nachweise ...........................................................................39
3.5 Dokumentation und Auswertung der histologischen und histochemischen
Befunde...................................................................................................................43
3.6 Kulturmedien, Puffer und Lösungen ........................................................................43
3.7 Immunfluoreszenz an Makrophagen ........................................................................48
3.8 Dokumentation und Auswertung der Immunfluoreszenz an Makrophagen ...............49
3.9 Plasmid für die Herstellung von Standardreihen.......................................................51
3.10 Genspezifische Primer für die quantitative real time PCR ........................................52
3.11 Gewinnung einzelner Leukozytensubpopulationen des Blutes .................................53
3.12 Herstellung und Stimulation von Makrophagen aus Blutmonozyten in vitro ............57
4
5
6
7
8
9
3.13 Durchflusszytometrie...............................................................................................57
3.13.1 Quantifizierung vitaler Zellen mittels Referenzzellmethode...............................58
3.13.2 Bestimmung der Apoptose neutrophiler Granulozyten.......................................59
3.14 Aufbereitung von mRNA aus bovinen Leukozyten für die real time PCR ................63
3.14.1 Herstellung externer Standardreihen für die real time PCR ................................65
3.14.2 Quantitative real time PCR (qrtPCR).................................................................72
3.15 Statistische Auswertung...........................................................................................77
Ergebnisse ...............................................................................................................79
4.1 Semiquantitative histologische Auswertung von Immunzellpopulationen in
der bovinen Zitze.....................................................................................................79
4.2 Semiquantitative Analyse von Makrophagenpopulationen in der bovinen
Zitze mittels Immunhistochemie an adulten, eutergesunden laktierenden
Rindern (K2) ...........................................................................................................90
4.3 Analyse der Makrophagendifferenzierung in vitro ...................................................98
4.3.1 PGE2–vermittelte Effekte während der Differenzierung boviner
Makrophagen in vitro ........................................................................................99
4.3.2 Effekte von PGE2 auf in vitro differenzierte bovine MdM ...............................109
4.3.3 Einfluss sezernierter Produkte in vitro generierter Makrophagen auf die
Vitalitat neutrophiler Granulozyten .................................................................114
Diskussion.............................................................................................................117
5.1 Funktionelle Anatomie des distalen Zitzenabschnittes ...........................................117
5.2 Immunzellpopulationen in der Zitze ......................................................................118
5.3 Differenzierung von Makrophagenpopulationen in der Zitze..................................130
5.4 Modulation von Makrophagen durch PGE2 ............................................................133
5.5 Beeinflussung der Überlebensrate neutrophiler Granulozyten ................................141
5.6 Offene Fragen und Ausblick ..................................................................................142
Zusammenfassung .................................................................................................144
Summary ...............................................................................................................147
Literaturverzeichnis ...............................................................................................150
Anhang..................................................................................................................174
9.1 Tiergruppen...........................................................................................................174
9.2 Geräte....................................................................................................................176
9.3 Klinikbedarf ..........................................................................................................177
9.4 Laborbedarf...........................................................................................................178
9.5 Reagenzien ............................................................................................................179
Verzeichnis der verwendeten Abkürzungen
A
Adenin
Abb.
Abbildung
cAMP
ANOVA
Cyklisches Adenosin-5´-monophosphat
analysis of variance
Aqua dest.
Aqua destillata (destilliertes Wasser)
Aqua tridest.
Aqua tridestillata (dreifach destilliertes Wasser)
ATP
BAL
Adenosin-5′-triphosphat
Bronchio-Alveoläre-Lavage
Bcl-2
B-cell lymphoma 2 (anti-apoptotisches Protein)
bp
base pairs (Basenpaare)
C
C5a
Cytosin
opsonisierendes Fragment der Komplementkomponente C5
CCL
β-Chemokin-Ligand, zwei Cysteinmoleküle in Folge („CC“)
CD
cluster of differentiation
cDNA
CFU
complemetary DNA
colony forming units
CGRP
Calcitonin-gene related peptide
CO2
Kohlenstoffdioxid
ConA
CpG
Concavalin A
Cytosin-Phosphat-Guanosin (unmethylierte DNA-Motive v.a. aus Bakterien)
CRH
Corticotropin-Releasing-Hormon
Ct
cycle threshold
CXCL
CXCL8
DAG
α-Chemokin-Ligand, zwei Cysteinmoleküle werden von beliebiger Aminosäure
(X) getrennt
Interleukin-8
Diacylglycerol
DISC
death inducing signalling complex
DMF
Dimethylformamid
DMSO
DNA
Dimethylsulfoxid
Desoxyribonukleinsäure
dNTPs
Deoxynucleotide Triphosphates
dsDNA
doppelsträngige DNA
E. coli
EDTA
Escherichia coli
ethylendiamine-tetraacetic acid (Ethylendiamintetraacetat)
FABP
FACScan
FCCP
Fatty-acid binding protein
®
fluorescence activated cell scanner (Fluoreszenzaktiviertes Zellmessgerät)
Carbonylcyanid-4-(trifluoromethoxy)-phenylhydrazon
FCM
flow cytometer (Durchflusszytometer)
FCS
fetal calf serum (Fetales Kälberserum)
FITC
FL-1, -2, -3
Fluoresceinisothiocyanat
Messkanäle des Durchflusszytometers für emittierte Fluoreszenz
FL-1 = Grünfluoreszenz, 530 ± 15 nm;
FL-2 = Orangefluoreszenz, 585 ± 21 nm;
FL-3 = Rotfluoreszenz, >650 nm
for
forward
FSC
forward scatter (Vorwärtsstreulicht), Messparameter des FACScan®
G
Guanin
G-CSF
granulocyte-colony stimulating factor (Granulozyten-Wachstumsfaktor)
GM-CSF
HBSS
His
granulocyte-macrophage-colony stimulating factor (Granulozyten-MakrophagenWachstumsfaktor)
Hanks Balanced Salt Solution
Histidin
HETE
Hydroxyeicosatetraenoic Acid
HODE
Hydroxyoctadecadienoic Acid
I0
+
Iscove®-Medium mit L-Glutamin, Antibiotikumzusatz ohne Serum
+
I10F
Iscove®-Medium mit L-Glutamin, Antibiotikumzusatz und 10% fetalem
Kälberserum
ICAM
IFN
intercellular adhesion molecule (interzelluläres Adhäsionsmolekül)
Interferon
Ig
Immunglobulin
IL
iNOS
Interleukin
Induzierbare NO Synthase
IP3
Inositoltriphosphat
IPTG
Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid
JC-1
kB
5, 5´, 6, 6´-Tetrachloro-1, 1´, 3, 3´-Tetraethylbenzimidazol-Carbocyanin Jodid
kilo Basen
kDA
kilo Dalton
LAMPS
Lysosome-associated mucin-like protein
LB
lysogeny broth
LBP
Lipopolysaccharid-binding protein
LFA
Leukocyte function-associated antigen
LPS
Lipopolysaccharid
MACS
magnetic associated cell sorting
mAK
monoklonaler Antikörper
MdM
monocyte derived macrophages
Met
Methionin
MHC
major histocompatibility complex (Haupthistokompatibilitätskomplex)
MIF
Membranimmunfluoreszenz
MMP
Mitochondrienmembranpotential
MNC
mononuclear cells (mononukleäre Zellen)
mRNA
messenger RNA
MW
molecular weight (Molekulargewicht)
n=
die Anzahl der Einzelbeobachtungen bei Berechnung des Mittelwertes
NaCl
Natriumchlorid
NFΚB
nuclear factor-kappa B (Transkriptionsfaktor)
p
Irrtumswahrscheinlichkeit bei der Analyse der Ähnlichkeit zweier Datengruppen
PAMP
pathogen associated molecular pattern (Molekulare Muster von Erregern)
PBS
phosphate buffered saline (phosphatgepufferte Kochsalzlösung)
PCR
polymerase chain reaction
PE
Phycoerythrin
PGD2
Prostaglandin D2
PGE2
PGH2
Prostaglandin E2
Prostaglandin H2
PGJ2
Prostaglandin J2
PJ
PMA
Propidiumjodid
Phorbol-12 Myristate-13 Acetat
PMN
polymorphonuclear leukocytes (polymorphkernige neutrophile Granulozyten)
PRR
pattern recognition receptor
PTX3
qrtPCR
Pentraxin 3
quantitative real time PCR
r
Korrelationskoeffizient
rev
reverse
ROS
rpm
reactive oxygen species (Reaktive Sauerstoffspezies)
rounds per minute
RT
Raumtemperatur
Staph. aureus
Staphylococcus aureus
SEM
SSC
standard error of the mean (Standardfehler des Mittelwertes)
side scatter (Seitwärtsstreulicht), Messparameter des FACScan®
spp.
subspecies (lateinisch: Unterarten)
T
Thymin
Tab.
TBE
Tabelle
Tris Boric Acid EDTA-Puffer
TLR
toll-like-receptor (Toll-ähnlicher-Rezeptor)
TNF
tumor necrosis factor (Tumornekrosefaktor)
TXA2
UV
Thromboxan A2
ultra violett
v/v
Volumen pro Volumen
VCAM
vascular cell adhesion molecule (vaskuläres Zelladhäsionsmolekül)
w/v
xg
Gewicht pro Volumen
multipliziert mit der Gravitationsbeschleunigung (9,81 m/s²)
Xaa
variable Aminosäure
Einleitung und Zielsetzung
1 Einleitung und Zielsetzung
Die Mastitis stellt eine der bedeutendsten Erkrankungen des Rindes dar. Die Konsequenzen
dieser Erkrankung zeigen sich in beträchtlichen ökonomischen Verlusten infolge einer
Verminderung der Milchqualität und –quantität, hohen tierärztlichen Behandlungskosten und
Tierverlusten. Die Erkrankung ist durch eine entzündliche Antwort der Milchdrüse
charakterisiert, verursacht durch metabolische und physiologische Einwirkungen, Traumata,
kontagiöse oder umweltassoziierte Pathogene, die galaktogen aszendieren und sich in der
Milchdrüse vermehren (OVIEDO-BOYSO et al. 2007). In Erwiderung dieser Reize kommt es
zur Aktivierung des Immunsystems mit dem Ziel der Pathogeneliminierung. Die
Abwehrmechanismen des Euters beinhalten dabei das Zusammenwirken anatomischer,
zellulärer und löslicher Faktoren. Die Effizienz der angeborenen und erworbenen
Abwehrmechanismen bestimmt so die Anfälligkeit und Widerstandsfähigkeit des Euters
gegen grampositive und gramnegative Bakterien.
Der peripartale Zeitraum der Kuh stellt eine kritische Phase dar, in dem die Kuh durch
Überbeanspruchung mehrerer Organsysteme in eine Art immunsupprimierten Zustand gerät
und besondere Anfälligkeit für E. coli-verursachte Mastitiden zeigt (BURVENICH et al.
2007).
Zunehmende
Resistenzen
der
Bakterienstämme
sowie
mit
antiinfektiöser
Chemotherapie einhergehende Nebenwirkungen, wie z.B. Wartezeit auf tierische Erzeugnisse,
rücken vermehrt Therapieansätze in den Fokus, die eine Effizienz der endogenen
Erregerbekämpfung zum Ziel haben.
Ausgehend von einer galaktogenen Infektion stellt sich die Frage, inwieweit die Zitze als
distales Kompartiment des Euters am Infektionsgeschehen beteiligt ist, und ob bereits dort die
Weichen für adaptive und angeborene Immunmechanismen gestellt werden, die auch im
Euterparenchym das entzündliche Geschehen beeinflussen. Hier sollte zunächst anatomischhistologisch geprüft werden, welche Leukozytenpopulationen in der Zitze wie verteilt
vorkommen und ob das Alter der Tiere sowie eine vorausgegangene experimentelle Belastung
mit Lipopolysaccharid darauf einen Einfluss hat.
Vor dem Hintergrund einer möglichen intrazisternalen Vakzinierung oder Immunmodulation,
sollten Monozytenabkömmlinge (dendritische Zellen, Makrophagen) im Fokus der
Betrachtungen stehen, finden sich diese Zellen doch als Sensor- und Effektorzellen am
9
Einleitung und Zielsetzung
Beginn einer Vielzahl von Immunprozessen. Insbesondere bietet die bei Mensch und Maus
beschriebene funktionelle Plastizität von Makrophagen (MANTOVANI et al. 2004; MOSSER
u. ZHANG 2008) interessante Ansatzpunkte für immunmodulatorische Strategien.
Makrophagen sind maßgeblich sowohl an der Induktion als auch an der Resolution von
Entzündungen beteiligt.
Zur Entstehung funktionell unterschiedlicher Makrophagen werden zwei wesentliche
Konzepte diskutiert. Das eine besagt, dass Makrophagen, die nach Stimulation mit
bestimmten Zytokinen, Immunkomplexen und/oder bakteriellen Produkten einen ganz
bestimmten
funktionellen
Phänotyp
aufweisen.
So
entsteht
der
klassische,
proinflammatorische Makrophage (M1) durch umgebende Stimuli wie IFN-γ und LPS. Er
zeichnet sich durch Sekretion proinflammatorischer Zytokine, wie z.B. TNF-α und IL-6 aus.
Zur Entwicklung eines alternativen Makrophagen (M2) sind Zytokine wie IL-4, IL-13 oder
IL-10 nötig. Ihre funktionelle Rolle ist u.a. geprägt durch die Sekretion von PTX3 und
Matrixproteinen. M2 Makrophagen phagozytieren Zelldebris, fördern Angiogenese und
Gewebewiederherstellung (MANTOVANI et al. 2004).
Das zweite Konzept besagt, dass Monozyten, die ins Gewebe einwandern, dort einer Reihe
von Wirts- und Pathogenfaktoren ausgesetzt sind, die ihre Entwicklung in eine ganz
bestimmte Richtung lenken. Eindrucksvoll wurde dies kürzlich für humane Monozyten
gezeigt, die unter dem Einfluss von Prostaglandin E2 in stark proinflammatorische
dendritische Zellen differenzierten. Des Weiteren wurde beschrieben, dass PGE2differenzierte dendritische Zellen die T-Zell Differenzierung in Richtung Th17-polarisierte
Zellen fördern (KHAYRULLINA et al. 2008). Th17 Zellen sind, neben Monozyten und
Makrophagen, an entzündlichen Prozessen sowie Autoimmunerkrankungen beteiligt. Beide
Konzepte finden Anwendung auf die hier vorliegende Arbeit. Dabei sollte geprüft werden, ob
auch in der bovinen Zitze unterschiedliche Makrophagenpopulationen vorhanden sind. Dazu
wurden zwei Makrophagen-Antikörper ausgwählt, die unterschiedliche Makrophagenantigene
erkennen, deren Expression eine spezielle Polarisierung anzeigen soll (BRANDTZAEG et al.
1988). Der Vergleich einzelner, zu verschiedenen Populationen zugehörigen Makrophagen,
sollte mittels dieser Antikörper anhand von histologischen Serienschnitten durchgeführt
werden. Ziel war es, Aussagen über eine spezielle Verteilung unterschiedlicher
Makrophagensubtypen in der Zitze treffen zu können.
10
Einleitung und Zielsetzung
Prostaglandine sind potente Metaboliten des Fettsäurestoffwechsels, die Schlüsselfunktionen
immunologischer Reaktionen maßgeblich beeinflussen (HARRIS et al. 2002). Prostaglandin
E2 werden überdies sowohl pro- als auch anti-inflammatorische Eigenschaften zugeschrieben
(KUNKEL et al. 1981). PGE2 greift in die Differenzierung von Monozyten zu dendritischen
Zellen ein, in dem PGE2-differenzierte dendritische Zellen ein proinflammatorisches
Expressionsprofil aufweisen (KHAYRULLINA et al. 2008). Die Polarität von Makrophagen,
die unter dem Einfluss von PGE2 ausdifferenzieren, ist noch ungeklärt. Daher sollte in dieser
Arbeit näher analysiert werden, welchen Phänotyp in vitro differenzierte Makrophagen unter
Einfluss von PGE2 aufweisen. Dabei wurden zwei Ansätze verfolgt: Zum Einen sollte die
Situation eines frisch in das Gewebe rekrutierten Monozyten simuliert werden, der direkt
nach Austritt aus dem Blutgefäß dem Entzündungsmediator PGE2 begegnet und unter dessen
Einfluss Chemokine und Zytokine sezerniert. Zum Anderen sollten Effekte von PGE2 am
Ende der Differenzierung eines Makrophagen untersucht werden. Die Möglichkeit die
Differenzierung von Makrophagen durch bestimmte Faktoren gezielt zu steuern, soll
mittlelfristig die Grundlagen für eine prophylaktische Immunmodulation beim Rind schaffen,
in der die Zitze als erster Ort des Kontaktes mit Erregern so vorbereitet wird, dass funktionell
‚passende‘ Makrophagen als mitentscheidende Sensor- und Effektorzellen adäquat reagieren
können.
11
Literaturübersicht
2 Literaturübersicht
2.1 Anatomischer Aufbau der Milchdrüse
Die Milchdrüse stellt eine modifizierte Hautdrüse dar. Sie ist ein zusammengesetztes Organ,
das aus dem zentralen Drüsenkomplex mit bindegewebiger Lobulierung (Interstititum)
besteht und dessen Ausführungsgangsystem peripher in der Zitze mündet. Entsprechend des
Aufbaus des Ausführungsgangsystem und dessen kugelförmigen Drüseneinheiten handelt es
sich bei der Milchdrüse um eine zusammengesetzte tubuläre Drüse mit verzweigten,
alveolären Endstücken. Das Drüsenparenchym besteht aus den Alveolen (Milchbildung und
Milchabgabe), den Ductus lactiferi (Transport der Milch im Gangsystem) und den Sinus
lactiferi (Milchsammelräume). Die Zitze ist beim Wiederkäuer als Eversionszitze ausgebildet.
Man unterscheidet einen Zitzenteil der Milchzisterne (Zitzenzisterne) und den nach außen
führenden Zitzenkanal (Strichkanal, Ductus papillaris). Im Bereich der Zitzenzisterne ist die
Zitzenwand von einem zweischichtigen isoprismatischen Epithel ausgekleidet, das beim
Wiederkäuer allmählich in das mehrschichtige Plattenepithel des Strichkanals wechselt. In die
Zitzenwand sind kollagene und elastische Fasernetze sowie glatte Muskelzellen eingelagert.
Von innen nach aussen ändert sich die Anordnung dieser Wandschichten in typischer Weise.
Zum Lumen sind glatte Muskelzellen gehäuft und zirkulär orientiert, in den mittleren
Wandabschnitten verlaufen diese vorwiegend längs und strahlen zur Oberfläche in radiärer
Anordnung allmählich aus. Beim Rind formieren die Radiärfasern eine 5-8-fache Rosette, die
sich in das Lumen des Strichkanals einfaltet (Fürstenberg’sche Rosette). An dieser Stelle ist
der Musculus sphincter papillaris als Verschlusseinrichtung der Zitze entwickelt. Im Bereich
des Ostium papillare schlägt die Epidermis in das Zitzenlumen um und bildet eine
mehrschichtiges, verhorntes Plattenepithel (LIEBICH 2010).
Kommt es zu einer Penetration des Strichkanals durch Bakterien, stellt der Strichkanal die
„first line of defense“ dar (OVIEDO-BOYSO et al. 2007). Die Auskleidung des Strichkanals
mit Keratin ist eine zusätzliche physikalische Barriere, um von distal einwandernde Bakterien
zu hemmen (CHANDLER et al. 1969; CAPUCO et al. 1994; SORDILLO u. STREICHER
2002). In Verbindung mit dem Keratin fungieren freie und veresterte Fettsäuren
(Myristinsäure, Palmitolensäure, Linolsäure) als bakteriostatische Komponenten. Weiterhin
12
Literaturübersicht
sind kationische Proteine in Verbindung mit Keratin in der Lage, an Pathogene zu binden und
so deren Empfindlichkeit auf Veränderungen der Osmolarität zu erhöhen (MILLER et al.
1992; PAULRUD 2005).
Die Zitze spielt als Eintrittspforte für galaktogene Infektionen der Milchdrüse eine wichtige
Rolle. Das Epithel des Strichkanals der Fürstenberg’schen Rosette und der Zitzenzisterne mit
dem subepithelialen Gewebe stellen so erste Adhäsionsflächen und korrespondierendes
Gewebe für aszendierende Erreger dar. Im folgenden Abschnitt wird die Situation der
innerhalb des Zitzengewebes lokalisierten Zellen beschrieben.
2.2 Immunzellen in der bovinen Zitze
Lymphoide Zellen
In der bovinen Zitze wurden Lymphozyten und Immunglobulin-produzierende Plasmazellen
beschrieben (NICKERSON 1988). Die Zellen wurden in das distale Zitzenende mittels
intrazisternaler miniosmotischer Interleukin-2-Pumpen (NICKERSON et al. 1989) in
Staph. aureus-positiven und –negativen Vierteln rekrutiert. In gesunden Vierteln fand sich im
distalen Zitzengewebe eine moderate Anzahl an Zellen bis hin zur Infiltration großer Mengen
lymphoider Zellen mit mitotisch aktiven Plasmazellen. In anderen Bereichen zeigten sich sehr
viele, direkt subepithelial gelegene Plasmazellen. Die höchste Anzahl infiltrierter
Lymphozyten wurde in Staph. aureus negativen, IL-2 stimulierten Vierteln gefunden.
Nach dem Kontakt von Zellwandbeständen von Staph. aureus mit immunkompetenten,
lymphoiden Zellen kommt es zu deren Sensibilisierung (TARGOWSKI u. BERMAN 1975).
Nickerson et al. erwägen diese residenten, sensibilisierten, lymphoiden Zellen als
„Instrument“ zur Veranlassung einer unmittelbaren Antigen-induzierten Immunantwort
(NICKERSON u. NONNECKE 1986).
Makrophagen
Makrophagen konnten im distalen Bereich der Zitze nachgewiesen werden (NICKERSON u.
NONNECKE 1986). Nach intrazisternaler Applikation von Mycobacterium bovis zeigten sich
vermehrt Makrophagen im perivaskulären Gewebe kleiner Blutgefäße in der Zitzenzisterne
und im Bindegewebe. Des Weiteren akkumulierten sie zwischen der apikalen und basalen
13
Literaturübersicht
Epithelzellschicht, oft mit phagozytierten Erythrozyten, die aus dicht gefüllten Kapillaren
austraten.
Neutrophile Granulozyten
Neben dem dorsalen Drüsenparenchym nimmt auch die Zitzenzisterne am Influx neutrophiler
Granulozyten während einer inflammatorischen Reaktion teil (NICKERSON et al. 1991).
Hierbei scheint die Infiltration neutrophiler Granulozyten sowohl in Staph. aureus-infizierten
wie auch in gesunden Vierteln zunächst in der Zitzenzisterne, später in der Fürstenberg’schen
Rosette stattzufinden (NICKERSON u. PANKEY 1984).
Die Fürstenberg’schen Rosetten gesunder Viertel waren mit einem zweischichtiges Epithel
ausgekleidet. Darunter befand sich lockeres Bindegewebe, kleine Blutgefäße sowie
lymphoide Zellen. Die Epithelzellen waren säulenartig und mit einem apikalen
Mikrovillisaum versehen. Die basalen Epithelzellen waren von kubischer Form und fest im
umgebenden Bindegewebe verankert. Im Zitzengewebe infizierter Viertel migrierten
neutrophile Granulozyten aus dem Bindegewebe in Richtung Fürstenberg’sche Rosette. In das
subepitheliale Stroma wanderten neutrophile Granulozyten durch Adhäsion und Penetration
epithelnaher Blutgefäße (NICKERSON u. PANKEY 1984). Weiterhin wanderten neutrophile
Granulozyten zielgerichtet in Richtung Epithel und subepitheliales Gewebe, wo sie frei die
Basallamina durchtreten konnten und zwischen basalen Zellen des Epithels lokalisiert waren.
Einmal im Epithel angekommen, scheint eine freie Bewegung der neutrophilen Granulozyten
zwischen dem zweischichtigen Epithel gut möglich. Tendenziell akkumulierten die
neutrophilen Granulozyten eher in der luminalen Schicht des Epithels. In intraepithelialen
Freiräumen in der Nähe degenerierter Epithelzellen waren ebenfalls neutrophile Granulozyten
zu finden, welche neben den Epithelzellen in das Lumen der Zitzenzisterne hineinragten. Oft
waren diese intraepithelial lokalisierten neutrophilen Granulozyten in der Nähe von
Lymphozyten zu finden. Andere neutrophile Granulozyten fanden sich zwischen intakten,
gesunden Epithelzellen mit freiem Zugang zum Lumen der Zitzenzisterne. Der Übertritt in die
Milch auf Höhe der Fürstenberg’schen Rosette geschah durch
zytoplasmatische
Disintegration einzelner Epithelzellen, die somit Raum bilden für übertretende neutrophile
Granulozyten. Nickerson et al. (1984) nannten die Möglichkeit der Interaktion neutrophiler
Granulozyten und Lymphozyten mit intakten Epithelzellen als eine Art „signaling“ zur
Penetration des Epithels. Auch die „Verdrängung“ alternder, ausgedienter Epithelzellen als
14
Literaturübersicht
vornehmliches Ziel zur Durchdringung des Epithels wird angeführt. Eine weitere Möglichkeit
der Migration ist das Durchbrechen von tight junctions zwischen intakten, luminalen Zellen
(HARMON u. HEALD 1982; NICKERSON u. PANKEY 1984). Als dritte Möglichkeit
wurde eine Beteiligung neutrophiler Granulozyten an der metaplastischen Veränderung
basaler Zellschichten genannt, um oberflächliche Zellschichten von tieferen Zellschichten mit
dem Ziel der Abschilferung und Freisetzung neutrophiler Granulozyten zu separieren
(NICKERSON u. HEALD 1982; NICKERSON u. PANKEY 1984). Darüber hinaus konnte
die Migration ins Lumen auch durch epitheliale Spalten, verursacht durch Lysis der
Alveolarzellen, stattfinden (SEELIG u. BEER 1978; HARMON u. HEALD 1982). Generell
wurde gezeigt, dass neutrophile Granulozyten in den infizierten Vierteln vorherrschend im
distalen Gewebe der Fürstenberg’schen Rosette zu finden waren (NICKERSON u. PANKEY
1984; TRINIDAD et al. 1990).
2.3 Expression immunrelevanter Gene in der Zitze
Um signifikant regulierte Gene im Entzündungsgeschehen des Euters nachzuweisen, wurden
in jüngster Zeit holistische Transkriptomanalysen nach experimenteller Inokulation mit Staph.
aureus (LUTZOW et al. 2008a) und E. coli (RINALDI et al. 2009; MITTERHUEMER et al.
2010) durchgeführt. Diese bezogen sich im Wesentlichen auf die Analyse der Genexpression
im Bereich der Drüse. RINALDI et al. (2009) fokussierten sich zum ersten Mal auf die
Lokalisations-spezifische Expression im distalen Kompartiment des Euters. Unter den
hochregulierten Genen in der Fürstenberg’schen Rosette nach 12-stündiger E. coli-Infektion
fanden sich die Chemokine CCL20, CXCL8 sowie das Enzym NOS2. In der Zitzenzisterne
dominierte neben CCL20 und CXCL8 die hochregulierte Expression von IL-1β und
S100A12. Nach 24-stündiger Inokulation mit E. coli waren die genannten Gene in beiden
Lokalisationen wieder deutlich herunterreguliert. CXCL8 und CXCL8-Rezeptor hingegen
wurden nach 24-stündiger Inokulation in der lobulär-alveolären Region des Euters signifikant
hochreguliert. In der Fürstenberg’schen Rosette, der Zitzenzisterne, der Drüsenzisterne und
der lobulär-alveolären Region wurden Gene, verantwortlich für die Inaktivierung von
Prostaglandinen und anderer Lipidmediatoren (Hydroxyprostaglandin-Dehydrogenase und
Lipoprotein-Lipase) signifkant herunterreguliert. Die prominente Regulation der NOS2 in der
Fürstenberg’schen Rosette wurde als wichtiger Aspekt hervorgehoben. Die Produktion von
15
Literaturübersicht
NO und dessen antibakterielle Effekte in Assoziation mit anderen kompetenten Immunzellen
an der Eintrittsstelle für Keime unterstreicht die Bedeutung zellulärer Abwehrmechanismen in
der Frühphase einer Mastitis in jenem distalen Bereich der Zitze. Zu Beginn der Inokulation
wurden frühe Immunmechanismen, wie Leukozytenmigration, Sekretion inflammatorischer
Mediatoren und Aktivierung von Immunzellen reguliert. Nach 12 h wurden Gene, involviert
in Apoptose, antiinflammatorische Zellantworten und verminderte Zellproliferation reguliert.
Nach 24 h wiederum wurden Gene, verantwortlich für Geweberegeneration, Resolution der
Entzündung und hormonelle Signaltransduktion reguliert. Generell zeigten die Gene der
Drüsenzisterne nach 12 h die stärkste Antwort auf die Infektion, die Gene des lobuläralveolären Gewebes wurden am stärksten nach 24 h reguliert, so dass regionale Unterschiede
der Genexpression die funktionelle Erwiderung hinsichtlich des zeitlichen Verlaufs einer
bakterieller Infektion bedeuten. Die somatische Zellzahl stieg erst ab 24 h nach Infektion an.
Bis zu diesem Zeitpunkt existierte nur ein minimaler Influx von Immunzellen in das Gewebe.
Möglicherweise repräsentieren die Daten der regulierten Gene, verantwortlich für die
Chemotaxis in Zitzen- und Drüsenzisterne, eher die Stimulation residenter Immunzellen, denn
den Influx migrierender Immunzellen in das Gewebe. Weiterhin wurde nach 12 h ein Peak in
der Expression von TLR2 und TLR4 in der Zitze gemessen. Jenes beweist nicht nur die
Präsenz der TLR-Rezeptoren während einer E. coli Infektion, sondern beweist auch die
Bedeutung der Pathogenerkennung in allen Bereichen des Euters (RINALDI et al. 2009).
2.4 Monozyten und Makrophagen
Bei Säugetieren sind Makrophagen direkt nach der Geburt in allen Geweben zu finden
(POLLARD 2009). Makrophagen sind 12-20 µm große, meist einkernige Zellen. Sie stellen
die gereifte Form von Monozyten dar, welche im peripheren Blut zirkulieren und zu
Makrophagen differenzieren, sobald sie in Gewebe einwandern. Sie sind Teil der angeborenen
Immunabwehr die den phagozytierenden Zellen angehören. Sie nehmen Krankheitserreger
auf, zerstören sie in intrazellulären Vesikeln und präsentieren zusätzlich Antigene an ihrer
Oberfläche. Eine Besonderheit dieser Zellen ist ihre Plastizität, von der myeloiden
Vorläuferzelle unter verschiedenen Stimuli zur hochdifferenzierten Antigen-präsentierenden
Zelle zu reifen. Bereits im Blut zirkulieren verschiedene Monozyten-Subpopulationen, die
anhand ihrer Oberflächenmoleküle charakterisierbar sind (AUFFRAY et al. 2009). So wurde
16
Literaturübersicht
bei murinen Monozyten eine unterschiedliche Expression der Chemokinrezeptoren CX3CR1
und CCR2 nachgewiesen (GEISSMANN et al. 2003), die je nach Expressionsdichte dieser
Rezeptoren in inflammatorisches und nicht erkranktes Gewebe „homen“ (MANTOVANI et
al. 2004). Zudem scheint der Zeitpunkt, an dem Monozyten das Blutgefäß verlassen und in
Gewebe einwandern, für deren Determinierung von entscheidender Bedeutung zu sein
(MOSSER u. EDWARDS 2008).
2.4.1 Makrophagen-Subpopulationen
Im Gewebe angekommen, differenzieren Monozyten, je nach Stimuli der Mikroumgebung, zu
funktionellen
Effektorzellen,
die
anhand
ihres
Chemokinspektrums
sowie
ihrer
Oberflächenrezeptoren zu unterschiedlichen Phänotypen heranreifen. Dieser physiologische
Prozess ermöglicht eine spezifische und effektive Pathogenbekämpfung (ZHANG u.
MOSSER 2008), der eine Aktivierung des Makrophagen voraussetzt. In der Regel sind dazu
zwei Signale nötig, wobei eines von Zellen des angeborenen Immunsystem bereitgestellt wird
(z.B. IFN von NK-Zellen) und als „priming step“ fungiert (MOSSER u. ZHANG 2008). Das
zweite Signal wird als Pathogen-associated-molecular-pattern vom Pathogen exprimiert und
versetzt den Makrophagen über dessen pattern recognition receptor (z.B. Toll-like receptor) in
einen aktivierten Zustand.
Der klassisch aktivierte Makrophage stellt eine stark proinflammatorisch geprägte und
mikrobizide Zelle dar. Einhergehend mit der Aktivierung sind eine verstärkte Pinozytoserate
sowie ein ausgestreckter Zellkörper und Reduktion der Expression des Fc-Rezeptors für IgG
(FcγR II) (EZEKOWITZ u. GORDON 1984).
Makrophagen lassen sich in M1 und M2-Subtypen einteilen, wobei M2 Makrophagen aus
weiteren drei Subtypen bestehen (MANTOVANI et al. 2004). Der M1 Makrophage
repräsentiert den inflammatorisch polarisierten Zelltyp, der in einem Interferon- und LPSgeprägtem Milieu entzündungsfördernde Zytokine wie IL-1 und TNF-α sezerniert und
intrazellulär phagozytierte Pathogene mittels reaktiver Sauerstoffspezies abtötet. Der
klassisch proinflammatorische M1 Makrophage fördert weiterhin eine Th-1-vermittelte
Zellantwort und ist mit Autoimmunerkrankungen assoziiert (MOSSER 2003), da intrazellulär
synthetisierte toxische Radikale und inflammatorische Mediatoren Gewebeschädigungen zur
Folge haben können. Die M2 Makrophagen hingegen waren durch Stimuli wie IL-4, IL-13
17
Literaturübersicht
sowie Immunkomplexe in Kombination mit TLR-Liganden induzierbar. M2 Makrophagen
zeichnen sich durch eine hohe IL-10 und geringe IL-12 Sekretion aus sowie durch die
Sekretion von TGF-β und des löslichen pattern-recognition receptors PTX3. IL-10 spielt bei
diesem Zelltyp eine entscheidende Rolle, da wichtige antiinflammatorische und zellprotektive
Effekte mit IL-10 assoziiert sind (POLLARD 2009). Die Präsenz des Enzyms Arginase
überwog gegenüber dem M1-charakteristischen Enzym iNOS, welches die Fähigkeit der M2
Makrophagen zur intrazellulären Pathogenbekämpfung limitiert (FAIRWEATHER u.
CIHAKOVA 2009). M2 Makrophagen sind in Th-2 vermittelte Immunantworten,
Allergiegeschehen sowie Geweberegeneration und -erneuerung durch Synthese von
Fibronectin und dem Matrix-assoziierten Protein βIG-H3 involviert (GRATCHEV et al.
2001). Oft wurden die M2 Makrophagen auch als „alternativ-aktivierte“ Makrophagen
beschrieben
(VAN
GINDERACHTER
et
al.
2008),
denen
antiinflammatorische
Eigenschaften zugeschrieben wurden. Der Begriff „alternativ“ geht zurück auf die erhöhte
Expression des Mannose-Rezeptors dieser Zellen (MOSSER u. EDWARDS 2008). Die
hemmende Aktivität der M2 Makrophagen erstreckt sich auch auf T-Zellen, welche in
Anwesenheit von M2 Makrophagen eine signifikant verminderte proliferative und
sekretorische Zellantwort zeigten (SCHEBESCH et al. 1997). Weiterhin gibt es die
Möglichkeit
einer
Änderung
des
Phänotyps
einer
bereits
bestehenden
Makrophagenpopulation (MOSSER u. EDWARDS 2008; FAIRWEATHER u. CIHAKOVA
2009). Es ist unklar, ob es sich bei dieser phänotypischen Abänderung um eine DeDifferenzierung zurück zu ruhenden Zellen handelt oder um einen Ersatz durch ins Gewebe
einwandernde, phänotypisch neue Makrophagen. Die Änderung der Polarisierung einer
Makrophagenpopulation ist dabei eng mit pathologischen Erscheinungen wie z.B. malignen
Neoplasien oder Autoimmunerkrankungen assoziiert.
2.4.2 Die LPS-Toleranz von Makrophagen
Lipopolysaccharide (LPS) als Bestandteil Gram-negativer Bakterien vermitteln über den Tolllike Rezeptor 4 (TLR4) die Induktion einer Entzündung (TAKEDA et al. 2003). Die
inflammatorische Antwort erfordert eine strenge Regulation, um überschießende und
schädigende Einwirkungen einer TLR-vermittelten Entzündung in Ausmaß und Dauer zu
begrenzen. Diese Regulation beinhaltet die Inhibierung des TLR-signalling durch
18
Literaturübersicht
induzierbare, negative Regulatoren, die Produktion antiinflammatorischer Zytokine sowie
Veränderungen in der Struktur des TLR-Komplexes (LIEW et al. 2005). Insgesamt führten
diese Mechanismen zu dem Phänomen der „LPS-Toleranz“, jener Unempfindsamkeit von
Zellen oder Organismen auf wiederholte oder verlängerte Stimuli mit LPS (BEESON 1947a,
b; WEST u. HEAGY 2002; CAVAILLON u. ADIB-CONQUY 2006).
LPS-Toleranz wurde lange als eine Art „hyporesponsive state“ von Makrophagen angesehen,
resultierend aus einer Desensibilisierung des Rezeptors (MEDVEDEV et al. 2000;
DOBROVOLSKAIA u. VOGEL 2002; MEDVEDEV et al. 2002; FUJIHARA et al. 2003).
Bei der Signalübertragung mittels TLR waren jedoch sehr viele verschiedene Gene mit
unterschiedlichen Funktionen beteiligt (HUANG et al. 2001), deren Regulation auf die
diverse Funktionalität abgestimmt sein muss. So sollte z.B. in toleranten Makrophagen die
Möglichkeit bestehen, proinflammatorische Gene vorübergehend zu deaktivieren, um
Gewebeschäden zu begrenzen. Andererseits sollten Gene, die verantwortlich für mikrobizide
Effekte und Proteine sind, auch nach mehrfacher TLR-Stimulation induzierbar sein, um den
Organismus kontinuierlich vor Pathogenen zu schützen (FOSTER et al. 2007). Es wurden
zwei TLR-induzierte Gensätze, basierend auf deren Funktion und regulatorischen Aufgaben,
kategorisiert: Nach wiederholter LPS-Exposition zeigt sich eine Gruppe von TLR-induzierten
Genen in vorübergehend ruhendem Zustand (T-Gene, nicht induzierbare Gene in toleranten
Makrophagen, z.B. das Gen Bpil2). Ziel dieser „Ruhigstellung“ war das Verhindern einer
exzessiven Verschlimmerung einer entzündlichen Reaktion. Die zweite Gruppe beinhaltete
Gene, die auf wiederholten LPS-Stimulus induzierbar blieben und weiterhin mikrobizide
Effekte vermittelten, um den Organismus vor Infektionen zu schützen (NT-Gene,
induzierbare Gene in toleranten Makrophagen, z.B. das Gen Lipg). Nach einer einmalig
verabreichten Dosis LPS kam es zu einer Veränderung der NT-Gene, die daraufhin auf eine
zweite Dosis LPS eine schnellere Kinetik der Ansprechbarkeit zeigten. Dieses Phänomen
wurde als „transkriptionelles Gedächtnis“ bezeichnet und zeichnete sich durch dessen
Effizienz in der schnellen Erregerbekämpfung aus. Weiterhin fand die Regulation eher auf
Gen-spezifischer, denn auf Signal-spezifischer Ebene statt (FOSTER et al. 2007). Im Detail
beinhaltete diese Regulation den Umbau von Histonen und die Neugestaltung von
Nukleosomen (NARLIKAR et al. 2002; CHI 2004).
19
Literaturübersicht
Diese Klassifizierung reflektiert das funktionelle Prinzip der Genregulation: Die
unterschiedliche Ansprechbarkeit eines Gens und dessen codierter Produkte fungiert in
Abhängigkeit der daraus resultierenden Vor- oder Nachteile für den Organismus (FOSTER et
al. 2007).
2.4.3 Der Transkriptionsfaktor PPARγ
PPARγ ist ein Ligand-abhängiger, nukleärer Hormonrezeptor, der eine Vielzahl zellulärer
Prozesse moduliert (CHINETTI et al. 2000). Er spielt eine besondere Rolle in der
Adipogenese, in der Lipid- und Glucose-Homöostase sowie in der Funktion von
Makrophagen (COCK et al. 2004; EVANS et al. 2004; LEHRKE u. LAZAR 2005).
Weiterhin kommt PPARγ eine Rolle im entzündlichen Geschehen zu (YOUSSEF u. BADR
2004). Einige Autoren postulierten die Hemmung proinflammatorischer Mediatoren durch die
Aktivierung von PPARγ (JIANG et al. 1998; RICOTE et al. 1998; RICOTE et al. 1999;
CUZZOCREA et al. 2002). Andere hingegen widerlegten die antiinflammatorische Aktivität
und beschrieben proinflammatorische Wirkungen von PPARγ (TONTONOZ et al. 1998;
THIERINGER et al. 2000; DELERIVE et al. 2001).
Lymphozyten und dendritische Zellen exprimieren PPARγ und unterstreichen so dessen Rolle
in der Regulation einer Immunantwort (STANDIFORD et al. 2005). Auch Makrophagen
enthalten große Mengen an PPARγ, dessen Expression in dem Differenzierungsprozess aus
Monozyten stark induziert wurde (CHINETTI et al. 1998). Bezüglich Makrophagen sind
funktionelle
Zusammenhänge
zwischen
der
Expression
von
PPARγ
und
der
Makrophagenpolarisierung hinsichtlich einer M2 Population beschrieben: Die PPARγ
Expression war mit der Expression von M2-Markern, wie z.B. CCL18, Mannoserezeptor und
IL-10 positiv korreliert, hingegen wurde keine Korrelation zwischen der Expression von
PPARγ und M1-Markern wie CCL2, TNF-α und IL-6 beobachtet (BOUHLEL et al. 2007).
Des Weiteren findet sich die PPARγ-abhängige Unterdrückung inflammatorischer AntwortGene in Makrophagen wie iNOS, COX2 und IL-12 (RICOTE et al. 1998; CHUNG et al.
2000; WELCH et al. 2003). Wurden M1 Makrophagen mit Zellkulturüberständen von M2
Makrophagen inkubiert, so resultierte daraus eine Hemmung der sezernierten, typisch
proinflammatorischen Zytokine wie CCL2 und TNF-α. Dieser hemmende Effekt konnte
durch die Zugabe eines PPARγ-Agonisten noch verstärkt werden und gibt so deutliche
20
Literaturübersicht
Hinweise auf ein PPARγ-abhängiges Priming von Makrophagen in Richtung M2-Population
(BOUHLEL et al. 2007). Der Mechanismus dieser Hemmung der Zytokinausschüttung durch
PPARγ-Agonisten ist noch nicht hinreichend geklärt, jedoch deutet sich an, dass die
prinzipiellen Mechanismen prätranslational in Assoziation mit dem activator-protein AP-1
ablaufen (JIANG et al. 1998). Weiterhin produzierten M2 Makrophagen durch IL-4abhängige Aktivierung der 12/15 Lipoxygenase mehr endogene PPARγ-Liganden als M1
Makrophagen (CONRAD et al. 1992; HEYDECK et al. 1998; HUANG et al. 1999). Die
13/15 Lipoxygenase generiert durch Oxidation von Linolsäure und Arachidonsäure die
PPARγ-Liganden 13-HODE und 15-HETE (COSTE et al. 2003; BERRY et al. 2007).
Weiterhin förderte das M2-assoziierte Zytokin IL-13 Phospholipase A2-abhängig die
Produktion des Liganden 15d-PGJ2 (KUHN 1996; HEYDECK et al. 1998). Die in vivo
Relevanz von PPARγ in Makrophagen zeigte sich an PPARγ-defizienten Mäusen:
Unstimulierte Makrophagen dieser Tiere wiesen eine erhöhte Produktion inflammatorischer
Zytokine auf, was vermuten lässt, dass endogene PPARγ-Liganden Makrophagen unter
„steady-state“-Bedingungen halten (VAN GINDERACHTER et al. 2008). Darüber hinaus
zeigten diese Tiere eine erhöhte Rekrutierung von Makrophagen in inflammatorische Gewebe
sowie eine Überreaktion dieser Zellen in Erwiderung auf inflammatorische Stimuli, welches
eine Verschlimmerung der Entzündung zur Folge hatte (SHAH et al. 2007). Jedoch muss
erwähnt werden, dass auch in PPARγ–defizienten Makrophagen Liganden-vermittelte,
antiinflammatorische Eigenschaften beschrieben wurden, so dass auch PPARγ–unabhängig
antiinflammatorische Effekte vermittelt werden können (CHAWLA et al. 2001). In LPSbelasteten Schweinen zeigte sich nach Gabe eines PPARγ-Agonisten ebenfalls eine verstärkte
proinflammatorische Antwort, einhergehend mit einer stark erhöhten TNF-α- und IL-6Sekretion. Trotzdem steht die Kontrolle der Expression proinflammatorischer Gene durch
PPARγ in einem komplexen Zusammenhang, an dem auch andere Transkriptionsfaktoren wie
NF-κB, STAT-1 und AP-1 beteiligt waren (LIU et al. 2009). Zusammenfassend lässt sich
sagen, dass die Regulation von PPARγ durch pro- oder antiinflammatorische Signale ein
wichtiger Faktor bei der Triggerung der Makrophagenpolarisierung ist. Entscheidend ist
hierbei
jedoch
auch
das
Ursprungsgewebe
der
Makrophagen
sowie
deren
Aktivierungszustand vor PPARγ-Aktivierung. In bovinen, mammären Epithelzellen konnte
mit dem natürlichen PPARγ-Agonist 15d-PGJ2 eine partielle, proinflammatorische Antwort
21
Literaturübersicht
ausgelöst werden, die sich in einer verstärkten Expression von CXCL6 und CXCL8 zeigte
(LUTZOW et al. 2008b).
Zu den PPARγ–regulierten Genen gehört auch Pentraxin 3. Pentraxin 3 gehört zusammen mit
den Akute-Phase Proteinen C-reaktives Protein und Serumamyloid A zur Familie der
Pentraxine und stellt einen löslichen pattern-recognition-receptor dar. Diverse Zelltypen,
unter anderem glatte Muskelzellen (KLOUCHE et al. 2004), Endothelzellen (BREVIARIO et
al. 1992), Monozyten und Makrophagen (DONI et al. 2003) synthetisieren PTX3 in
Erwiderung auf Toll-like Rezeptor Agonisten (LPS) und proinflammatorische Signale wie IL1β und TNF-α (IMAMURA et al. 2007). In ausdifferenzierten Makrophagen war die
Expression von PTX3 durch LPS induzierbar. In unstimulierten Makrophagen war PTX3
jedoch nicht nachweisbar (SALIO et al. 2008). In bovinen, in vitro kultivierten mammären
Epithelzellen war PTX3 durch LPS und LTA induzierbar und LUTZOW et al. (2008)
postulieren so eine Rolle für PTX3 in der initialen Antwort des Eutergewebes auf bakterielle
Infektionen.
2.4.4 Makrophagen im bovinen Euter
Im Euter des Rindes regulierten Makrophagen nach einer Infektion des Euters mit E. coli oder
Staph. aureus die Synthese von Akute Phase Proteinen und förderten den Influx von
Monozyten aus dem peripheren Blut in das Euter (OVIEDO-BOYSO et al. 2007). Darüber
hinaus vollzogen sich von der initialen Phase einer entzündlichen Reaktion im Euter bis zur
Resolution der Entzündung morphologische Veränderungen der Makrophagen. So wiesen
90% der dort ansässigen Makrophagen zu Beginn eines inflammatorischen Geschehens im
Euter morphologische Ähnlichkeiten zu Blut-Monozyten auf. Diese Monozyt-ähnlichen
Makrophagen waren durch einen ovoiden Zellkern, homogenes, fein-granuläres Zytoplasma
mit vielen Mitochondrien sowie durch die Abwesenheit von Lysosomen charakterisiert. Sie
stellten frisch aus dem Blut in das Gewebe migrierte Zellen dar. 48-72 Stunden nach Infektion
wurden Makrophagen mit phagozytierten, apoptotischen neutrophilen Granulozyten im Euter
detektiert (SLADEK et al. 2006). Nach der Phagozytose apoptotischer Neutrophiler kam es zu
keiner Sekretion proinflammatorischer Mediatoren von Seiten des Makrophagen (MEAGHER
et al. 1992). Jedoch wurden postphagozytotische Faktoren sezerniert, welche für die
Migration neutrophiler Granulozyten in das Euter verantwortlich waren (CRAVEN 1983). In
22
Literaturübersicht
der Resolutionsphase der Entzündung fand man hauptsächlich große, vakuolisierte
Makrophagen,
mit
dichten
intrazytoplasmatischen
Phagolysosomen
mit
Resten
vorverdauderten Materials phagozytierter apoptotischer Neutrophiler. Lange Pseudopodien
waren ebenfalls charakteristisch für Makrophagen der Resolutionsphase einer Entzündung
(SLADEK et al. 2006). Die unterschiedlichen Makrophagenformen reflektieren so nicht nur
deren morphologische Vielfalt, sondern auch deren funktionelle Heterogenität und Plastitzität
in den verschiedenen Stadien einer Entzündung.
2.4.5 Makrophagen-spezifische Antikörper
Anti-CD68
Der Nachweis von Makrophagen ist mittels eines anti-CD68-Antikörpers möglich
(CHRISTGAU et al. 1998; WANGOO et al. 2005; OLIVEIRA u. HANSEN 2008). Der
CD68-Antikörper erkennt auf Makrophagen ein Transmembran-Glykoprotein, inklusive
Alveolarmakrophagen, Kupffer Zellen der Leber und Monozyten (WARNKE et al. 1989;
PULFORD et al. 1990; SMITH et al. 1991). Es steht in enger Beziehung zu der Familie der
Lysosomal-assoziierten, Mucin-ähnlichen Peptide (LAMPS) (KUNISCH et al. 2004).
Obwohl CD68 vorwiegend in lysosomalen Membranen vorkommt, ist eine kleine Fraktion
des Proteins auch an der Zelloberfläche gebunden (STROBL et al. 1995; UMINO et al. 1999).
CD68 agiert als scavenger receptor für Lipoproteine niederer Dichte (RAMPRASAD et al.
1996) und ist involviert in Zell-Zell-Interaktionen (STROBL et al. 1995). CD68 ist z.B. auch
auf neoplastischen Zellen, neutrophilen Granulozyten und Endothelzellen vorhanden
(FALINI et al. 1993; KUNISCH et al. 2004) und kann aus diesem Grund nicht als exklusiver
Marker für Monozyten/Makrophagen gesehen werden (LAU et al. 2004).
Antikörper MAC387
Der Antikörper MAC387 erkennt das L1 Protein Calprotectin, ein S100 Protein. Der Name
„Calprotectin“ beschreibt die antimikrobielle Eigenschaft dieses Proteins aufgrund seiner
Calcium-bindenden Eigenschaften (STEINBAKK et al. 1990). S100 Proteine gehören zu den
damage-associated molecular pattern (DAMP), welche von aktivierten oder beschädigten
Zellen unter stressbedingten Umständen als „Alarmine“ freigesetzt werden (OPPENHEIM u.
YANG 2005). Auch in der Folge von Zelltod und Zelldisruption kommt es zur Freisetzung
der S100 Proteine. Diese finden sich auch auf nichtkeratinisierten, mehrschichtigen
23
Literaturübersicht
Plattenepithelien (VOGANATSI et al. 2001). S100A8 (Calgranulin A) und S100A9
(Calgranulin
B)
sind
zytoplasmatischer
Bestandteil
neutrophiler
Granulozyten,
mononukleärer Zellen, aber auch von Epithelzellen (FOELL et al. 2007). S100A8 und A9
liegen intrazellulär vorzugsweise als Heterokomplex vor, genannt „Calprotectin“ (PERERA et
al. 2010). Nach Phagozytose und der damit einhergehenden Zellaktivierung interagiert der
A8-A9-Heterokomplex mit einer Neuanordnung des Zytoskeletts in Assoziation mit
Veränderungen des intrazellulären Calcium-Spiegels, so z.B. nach der transendothelialen
Migration von Leukozyten (PERERA et al. 2010). Des Weiteren kam es über den A8-A9
Heterokomplex in neutrophilen Granulozyten zur Aufnahme ungesättigter Fettsäuren wie z.B.
Arachidonsäure sowie deren anschließender Freisetzung (KLEMPT et al. 1997). Dieser
Arachidonsäure-Calprotectin-Komplex kann von benachbarten Zellen aufgenommen werden,
die wiederum neue Eicosanoide synthetisieren und somit zum inflammatorischen Geschehen
beitragen (NACKEN et al. 2003). Die Sekretion der S100 Proteine findet über das
endoplasmatische Reticulum und den Golgi Apparat der Zelle statt. IL-1β, TNF-α und LPS
förderten eine Sekretion von S100 Proteinen aus neutrophilen Granulozyten (RAMMES et al.
1997; KIDO et al. 2005) und murinen Makrophagen. Weiterhin band S100A8/A9 spezifisch
an Endothelzellen, in denen sie eine inflammatorische Reaktion auslösen. Zusätzlich
induzierten sie die Expression proinflammatorischer Zytokine sowie Adhäsionsmoleküle
(VCAM-1 und ICAM-1). S100-Proteine wurden außerdem stark in lokal inflammatorischem
Gewebe exprimiert (FOELL et al. 2007). Weiterhin ist eine IL-10 abhängige Geninduktion
von S100A8/A9 in murinen Monozyten/Makrophagen möglich. Damit geht ein mögliches
S100A8/A9 Induktionsprofil zu einem regulatorischen Makrophagentyp einher (PERERA et
al. 2010). Hingegen wurde auch Calprotectin als inflammatorischer Marker im Gewebe (z.B.
Lunge) gefunden, dessen Expression mit frisch rekrutierten, Monozyten-ähnlichen
Makrophagen (M1 Makrophagen) genannt wird (STRIZ u. TREBICHAVSKY 2004).
Antikörper AM-3K
Der Antikörper AM-3K erkennt das CD163-Molekül, ein Monozyten/Makrophagen
restringiertes Membranprotein, welches zur Scavenger-Rezeptor Cystein-Superfamilie gehört
(LAW et al. 1993; HOGGER et al. 1998; SCHAER et al. 2001). CD163 fungiert als ein
Hämoglobin Scavenger Rezeptor, der im Blut zirkulierende Hämoglobin-Haptoglobin
Komplexe bindet und beseitigt (KRISTIANSEN et al. 2001). Aufgrund dieser „reinigenden“
24
Literaturübersicht
Funktion
wurde CD163
positiven
Makrophagen
eine Bedeutung in
der
späten
Entzündungsphase zugeschrieben (ZWADLO et al. 1987; TOPOLL et al. 1989). Für die
Stimuli IL-6, IL-10 und Glucocorticoide wurde eine Induktion der CD163 Expression
beschrieben (SULAHIAN et al. 2000; SCHAER et al. 2001), wohingegen durch IFNγ und
LPS eine verringerte CD163 Expression beobachtet wurde (BUECHLER et al. 2000). Auch
die Sekretion antiinflammatorischer Proteine von Makrophagen war mit CD163 assoziiert
(HAMANN et al. 1995). Zunächst wurden mit Hilfe des AM-3K Antikörpers humane
Gewebemakrophagen nachgewiesen (ZENG et al. 1996a), wobei später die breite
Kreuzreaktivität dieses Antikörpers mit verschiedenen Tierspezies (u.a. Ratten, Schweine,
Katzen, Rinder, Ziegen) erkannt wurde (ZENG et al. 1996a; YAMATE et al. 2000;
KAWASHIMA et al. 2004). Das immunhistochemische Detektionsmuster von AM-3K für
tierisches Gewebe ist sehr ähnlich zu dem Detektionsmuster humanen Gewebes (ZENG et al.
1996a). Jedoch zeigte der Antikörper eine unterschiedlich starke Reaktivität in Abhängigkeit
der verwendeten Makrophagen. So zeigten Makrophagen, die mit IL-10 stimuliert wurden,
eine stark positive Reaktion auf AM-3K. Jene hingegen, die mit klassisch-aktivierenden
Stimuli, wie z.B. IFNγ, stimuliert wurden, eine sehr schwach positive Reaktion. Das
Detektionsmuster des Antikörpers zeigt somit in Richtung antiinflammatorisch polarisierter
Makrophagen
und
ermöglicht
Makrophagensubpopulationen
als
daher
eine
herkömmliche
präzisere
Charakterisierung
Makrophagen-spezifische
von
Antikörper
(KOMOHARA et al. 2006). Weiterhin war AM-3K immunhistochemisch negativ für
Blutmonozyten und Populationen von dendritischen Zellen (ZENG et al. 1996b).
Weder Epithelzellen noch Blutmonozyten noch Populationen von dendritischen Zellen waren
immunopositiv. Die Expression des von AM-3K erkannten CD163 erfolgte in Abhängigkeit
des Differenzierungsstadiums der Makrophagen. Bei den AM-3K-positiv gefärbten
Makrophagen soll es sich um Makrophagen im späten Differenzierungsstadium handeln. Des
Weiteren waren die Bedingungen der Mikroumgebung der Makrophagen für die Expression
von CD163 von entscheidender Bedeutung (YAMATE et al. 2000). Wurden unterschiedliche
Makrophagen-Antikörper verwendet, berichten Forschergruppen von selektiv AM-3K positiv
gefärbten Makrophagenpopulationen (IDE et al. 2001; KAWASHIMA et al. 2004;
KOMOHARA et al. 2008).
25
Literaturübersicht
2.5 Prostaglandine
Prostaglandine sind eine Gruppe von Entzündungsmediatoren, die zusammen mit den
Leukotrienen und den Thromboxanen als Eicosanoide bezeichnet werden. Sie werden aus
Eicosatetraensäure (syn. Arachidonsäure) gebildet und sind an wichtigen physiologischen und
pathophysiologischen Prozessen beteiligt. Arachidonsäure liegt in der Zelle nur in geringer
Menge in freier Form vor, der größte Anteil ist Bestandteil der Membran-Phospholipide. Eine
Freisetzung der Arachidonsäure erfolgt über das membrangebundene Enzym Phospholipase
A2. Die Aktivierung dieses Enzyms erfolgt über inflammatorische, hormonelle oder
immunogene Stimuli (MILLER 2006). Die freigesetzte Arachidonsäure ist Substrat und
Ausgangspunkt für die Synthese von Prostaglandinen (Cyclooxygenase) und Leukotrienen
(Lipoxygenase). Die Cyclooxygenase 1 (COX1) wird konstitutiv unter basalen Bedingungen
von den meisten Zellen des Immunsystems exprimiert. Hohe Konzentrationen an COX1
wurden in Gefäßendothelzellen, Thrombozyten sowie in glatten Muskelzellen gefunden. Die
basale Expression dieses Enzyms ist verantwortlich für die Synthese von Prostaglandinen zur
Regulation homöostatischer Zellfunktionen in den meisten Organsystemen. Der fehlende
Nachweis von COX2 in ruhenden Zellen sowie der Nachweis erhöhter COX2 Spiegel in
inflammatorischem Gewebe führten zu der Vermutung, die COX2 sei ein primär unter
inflammatorischen Stimuli induzierbares Enzym. Neuere Untersuchungen zeigten jedoch,
dass auch die COX2 konstitutiv exprimiert wird und ein wichtiger Bestandteil der normalen
Funktion von Organsystemen ist (MILLER 2006). Beide Cyclooxygenasen setzen die
Arachidonsäure zunächst zu Prostaglandin G2 um, welches weiterhin zu PGH2 katalysiert
wird. Die weitere Reaktion von PGH2 in die unterschiedlichen Prostglandinderivate (PGE2,
PGD2 etc.) wird von zellulären Isomerasen und Synthasen katalysiert. Je nach
Zelldifferenzierung und –enzymausstattung kommt es hier zu unterschiedlich hohen
Konzentrationen der synthetisierten Prostaglandine. Unmittelbar nach der Synthese werden
die Prostaglandine in die lokale Mikroumgebung der Zelle freigesetzt.
Prostaglandine wirken auf andere Zellen über die Bindung an spezifischen ZelloberflächenRezeptoren (G-Proteine). Man unterscheidet die G-Protein-gekoppelten Rezeptoren anhand
ihrer selektiven Bindung der Prostaglandinderivate sowie nach dem bindungsinduzierten
Transduktionsweg, der nach Bindung des Liganden aktiviert wird (MCCULLOUGH et al.
2004). Die G-Protein-Zyklen wirken als Vermittler eines Effektorswitch zwischen
26
Literaturübersicht
stimulierenden (Gs) und hemmenden (Gi) Signalwegen. Je nach Aktivierung eines
stimulierenden oder hemmenden G-Proteins kommt es zur Aktivierung oder Hemmung einer
Adenylatzyklase, die für die intrazelluläre Synthese von cyclischem AMP verantwortlich ist
(MILLER 2006). Für PGE2 sind vier unterschiedliche Rezeptorsubtypen beschrieben: EP1,
EP2, EP3, EP4 (HARIZI et al. 2003; MCCULLOUGH et al. 2004).
Bovine
PGE2-Rezeptoren
wurden
mittels
PGE2
Agonisten
und
Antagonisten
in
Chondrozytenkulturen funktionell charakterisiert. Sie weisen ähnliche pharmakologische
Charakteristika des untersuchten Rezeptorsubtypes zu dem human PGE2-Rezeptor EP4 auf
(DE BRUM-FERNANDES et al. 1996). Weiterhin ist PGE2 ein Faktor, der zur selektiven
Differenzierung mononukleärer Zellen führt. Die in vitro Differenzierung dendritischer Zellen
in Anwesenheit von PGE2 beeinflusste die IL-12/IL-23 Balance und förderte die
Differenzierung von Th17-Zellen (KHAYRULLINA et al. 2008). Weiterhin hemmte es in
dendritischen Zellen die Produktion der inflammatorischen Zytokine CCL3 und CCL4 (JING
et al. 2003) und förderte die Produktion von endogenem IL-10, welches Zellfunktionen
dendritischer Zellen abschwächt (HARIZI et al. 2002).
2.5.1 Antiinflammatorische Eigenschaften der Prostaglandine
Bisher ist wenig bekannt über die Mediatoren und Mechanismen, die eine Entzündung
beenden. Es galt lange die Theorie, das Ende einer Entzündung sei ein passiver Prozess
(SERHAN 2004), in dem eine Art „Verbrauch“ an Mediatoren den begrenzenden Faktor
darstelle. Es käme zum „Auslaufen“ der Entzündung, welches eine Wiederherstellung
physiologischer Zustände ermöglicht. LAWRENCE et al. (2002) jedoch zeigten, dass die
Resolution einer Entzündung ein aktiver Prozess ist, der durch die Hemmung
proinflammatorischer Gene, Zellbewegung, Apoptose, Phagozytose sowie durch Synthese
antiinflammatorischer Mediatoren kontrolliert wird (LAWRENCE et al. 2002). Konkret
beschreiben sie einen „switch“ der Prostaglandinsynthese von proinflammatorischen
Prostaglandinen, wie hier erwähnt PGE2, hin zur Synthese antiinflammatorischer
Prostaglandine gegen Ende einer Entzündung. In diesem Zuge synthetisiert die COX2
vornehmlich die antininflammatorischen Cyclopentenon-Prostaglandine wie 15d-PGJ2.
Dieses wurde auch von anderen Arbeitsgruppen beschrieben (LEVY et al. 2001). PGE2
kommt in diesem Zusammenhang eine Doppelrolle zu: Es wird zunächst als klassisches
27
Literaturübersicht
Prostaglandinderivat zu Beginn einer Entzündung synthetisiert und verstärkt so die
klassischen Kennzeichen einer Entzündung (SERHAN 2004). Weiterhin aber induzierte es,
zusammen mit PGD2, die Produktion von Schlüsselenzymen zur Synthese von Lipoxinen
(LEVY et al. 2001), Resolvinen und Protectinen (SERHAN et al. 2000; SERHAN et al. 2002;
HONG et al. 2003). So stimulierten lokales PGE2 und PGD2 die Entwicklung von 15Lipoxygenase-mRNA in Leukozyten zur Produktion von Lipoxinen (LEVY et al. 2001).
Diese endogenen, resolutionsfördernden Moleküle fördern das Abklingen der Entzündung
durch Aktivierung spezifischer Mechanismen zur Herstellung der Homöostase. Zum Beispiel
hemmten sie die Infiltration neutrophiler Granulozyten, förderten die Rekrutierung nichtentzündlicher Monozyten und aktivierten die Phagozytose von Mikroorganismen und
apoptotischen Zellen durch Makrophagen (CANNY et al. 2002; SERHAN et al. 2002;
CAMPBELL et al. 2007; SERHAN et al. 2007). Weiterhin konnten sowohl PGD2 als auch
PGE2 durch Infiltration in Ansammlungen neutrophiler Granulozyten deren Phänotyp hin zu
einem Resolutions-fördernden Phänotyp beeinflussen, genannt „lipid-mediator class
switching“ (LEVY et al. 2001). Auch pharmakologisch verabreicht konnte PGE2, durch
Stimulation von cAMP, antiinflammatorische Eigenschaften haben (KUNKEL et al. 1981).
Als resolutionsfördernder Mediator per se war PGE2 dennoch nicht zu bezeichnen
(HASTURK et al. 2007), so förderte es doch nicht die antiinflammatorischen Eigenschaften
von Makrophagen, wie z.B. Aufnahme und Beseitigung apoptotischer Zellen (SERHAN et al.
2008).
2.5.2 Prostaglandin E2 und dessen Wirkung auf Immunzellen
Für PGE2 sind zahlreiche Effekte auf Zellen des Immunsystems beschrieben. PGE2 hat zum
einen potente, proinflammatorische Eigenschaften: Es induziert Vasodilatation und vestärkt
die Histamin- und Bradykinin-bedingte, inflammatorische Ödematisierung (WILLIAMS
1979; TRANG 1980). Durch Herabsetzung der Schmerzgrenze in Erwiderung auf Histamine
und Kinine ist PGE2 auch für die Schmerzauslösung verantwortlich (ZURIER u.
QUAGLIATA 1971) Zusätzlich förderte PGE2 die Synthese des inflammatorischen Zytokins
IL-6 (ARONOFF et al. 2004). Andererseits hemmte PGE2 die Freisetzung lysosomaler
Enzyme aus Granulozyten, Mastzelldegranulation und Thrombozytenaggregation (TRANG
1980). Auch SERHAN et al. (2008) klassifizierten PGE2 zusammen mit anderen Mediatoren
28
Literaturübersicht
des Fettsäurestoffwechsels als antiinflammatorischen und entzündungsbegrenzenden Faktor.
Im Folgenden werden die Effekte von PGE2 auf unterschiedliche Zellen des Immunsystems
näher betrachtet.
Monozyten und Makrophagen
PGE2 hatte einen ambivalenten Charakter auf die Aktivierung von Tumormakrophagen
(RENZ et al. 1988). So wurde von einem PGE2-bedingten „Shut off“ der Aktivierung
gesprochen (SCHULTZ et al. 1978; SCHULTZ et al. 1979), wobei als Ursache der
hemmenden Effekte erhöhte cAMP Level in Makrophagen und anderen Leukozyten
beschrieben wurden und PGE2 so eine Rolle als suppressives Molekül der Immunantwort
zukommt (GOODWIN u. WEBB 1980; RENZ et al. 1988). In Verbindung mit PGE2 zeigte
sich jedoch eine Stimulation der Tumor-assoziierten Zytotoxizität von Makrophagen
(DRYSDALE u. SHIN 1981). Weiterhin konnte PGE2 in Abhängigkeit des bereits
vorliegenden Aktivierungszustandes eines Makrophagen unterschiedliche Effekte vermitteln
(SNIDER et al. 1982). Die exogene Zugabe von PGE2 auf LPS-stimulierte humane
Makrophagen führte zu einer Hemmung der Sekretion von IL-1β, TNF-α, GM-CSF, IL-10
und CXCL8. Vermehrt sezerniert hingegen wurden TGF-β (FADOK et al. 1998). Außerdem
zeigte sich eine Abnahme der Expression von CXCL8, CCL2, CCL3, CCL4, IP10 und CCL5
in humanen, PGE2-stimulierten Makrophagen. Auch die Phagozytoseleistung muriner, PGE2stimulierter Makrophagen, war, im Vergleich zu unstimulierten Makrophagen, signifikant
herabgesetzt. Mit der PGE2-vermittelten Suppression der Phagozytose ging eine erhöhte
intrazelluläre cAMP Bereitstellung unter Beteiligung des EP2 Rezeptors einher (ARONOFF
et al. 2004). PGE2 und erhöhte cAMP Level waren weiterhin jene Faktoren, die zu einer protoleranten Polarisierung eines LPS-stimulierten Makrophagen beitrugen und zu einem typisch
toleranten Zytokinprofil führten: IL-10 wurde stark exprimiert, während IL-12 jedoch nur in
sehr geringem Maße exprimiert wurde (STRASSMANN et al. 1994; VAN DER POUW
KRAAN et al. 1995). In Monozyten induzierte PGE in Kombination mit GM-CSF ebenfalls
einen Phänotyp, der als pro-tolerant bezeichnet wird (GRANT et al. 2005) und Ähnlichkeiten
zum Zytokinexpressionsprofil alternativ polarisierter Makrophagen aufwies (MANTOVANI
et al. 2002). Des Weiteren förderte PGE2 die Chemokin-induzierte Migration in Monozyten
(PANZER u. UGUCCIONI 2004).
29
Literaturübersicht
Dendritische Zellen
Die Differenzierung dendritischer Zellen unter PGE2 führte zu der Expression eines
proinflammatorischen Zytokinprofils: IL-1β, TNF-α, IL-10, IL-23 sowie IL-6 wurden in
PGE2 differenzierten dendritischen Zellen signifikant stärker exprimiert als in Zellen, die in
Abwesenheit von PGE2 differenziert wurden (KHAYRULLINA et al. 2008). HARIZI et al.
(2003) verzeichneten eine verstärkte IL-10 Expression von PGE2 differenzierten Zellen.
KHAYRULLINA et al. (2008) beschrieben eine Verringerung der Expression von IL-6. In
Erwiderung auf LPS zeigte sich, dass PGE2 die Zellen in Richtung einer starken,
breitgefächerten, proinflammatorisch geprimten Zellantwort beeinflusst. Darüber hinaus
zeigten unter PGE2 gereifte dendritische Zellen nach Stimulation mit spezifischen Antigenen
vorwiegend eine Th17-Antwort. KHAYRULINNA et al. (2008) warfen auch die Frage auf,
wo es in vivo zu einem „primenden Kontakt“ dendritischer Zellen durch PGE2 kommen
könnte. Sie verweisen zum einen auf das Knochenmark aufgrund der PGE2-Syntheseleistung
der dort ansässigen Zellen, wie mesenchymaler Stammzellen, Makrophagen und
Präadipozyten im Stroma. Zusätzlich nennen sie die transendotheliale Migration dendritischer
Zellen in Erwiderung auf inflammatorische Prozesse in benachbarte Gewebe als Möglichkeit,
unter dem Einfluss von PGE2 zu reifen. Weiterhin spielte PGE2 als chemotaktisches Agens
für migrierende dendritische Zellen eine Rolle: EP4-Rezeptor-defiziente Mäuse zeigen eine
reduzierte Migration von dendritischen Zellen zu Lymphknoten (KABASHIMA et al. 2003).
Weiterhin führte die exogene Zugabe von PGE2 bei dendritischen Zellen zu einer
Verringerung der MHCII Expression. Daran beteiligt waren die Rezeptoren EP2 und EP4.
Außerdem wurden gewebeabhängige Effekte für PGE2 auf dendritische Zellen beschrieben
(HARIZI et al. 2003). In peripheren Geweben dominierten stimulierende Effekte, so förderte
es die Aktivierung dendritischer Zellen und deren Migration (LUFT et al. 2002;
SCANDELLA et al. 2002). Waren dendritische Zellen jedoch bereits zu lymphatischen
Organen migriert, traten hemmende Effekte des PGE2 in den Vordergrund, wie
Migrationshemmung und verringerte Antigenpräsentation (HARIZI et al. 2001). Weiterhin
wurden PGE2 modulatorische Eigenschaften hinsichtlich der Apoptose verschiedener
Zelltypen zugeschrieben (BOWOLAKSONO et al. 2008; HOGGATT et al. 2009). In
dendritischen Zellen, die für 72 h mit PGE2 inkubiert wurden, konnte, verglichen zu Zellen,
30
Literaturübersicht
die in Abwesenheit von PGE2 inkubiert wurden, ein dosisabhängiger, signifikanter Anstieg
überlebender Zellen gezeigt werden. Die Zugabe von PGE2 in Kombination mit LPS oder
TNF-α zeigte hingegen keine signifikante Erhöhung der Überlebensrate Dendritischer Zellen
(BARATELLI et al. 2005).
Weiterhin förderte die exogene Zugabe von PGE2, in Kombination mit TNF-α, IL-6 und IL1β, zu in vitro generierten dendritischen Zellen deren Reifung, Migrationsfähigkeit und
immunstimulatorische Kompetenz (JONULEIT et al. 1997; RIESER et al. 1997). In
dendritischen Zellen war PGE2 in der Lage, in Abwesenheit von LPS die IL-12-Produktion zu
stimulieren. PGE2 allein galt jedoch als ein schwacher inflammatorischer Zellstimulus, der
erst in Assoziation mit anderen Mediatoren (z.B. TNF-α) seine inflammatorische Potenz
erreicht. In peripherem Gewebe residierende dendritische Zellen sind unreif. Zur Reifung zu
einer immunkompetenten Zelle war ein Zusammenspiel verschiedener lokaler und
systemischer Stimuli nötig (RIESER et al. 1997). Zusammenfassend zeigte sich PGE2 als ein
wichiger Aktivator humaner dendritischer Zellen.
31
Material und Methoden
3 Material und Methoden
3.1 Versuchstiere
Für die Untersuchungen wurden Tiere verschiedener Rassen und unterschiedlichen Alters
eingesetzt. Im Folgenden sind die einzelnen Tiergruppen dargestellt, welche für die
Untersuchungen ausgewählt wurden. Bei der Auswahl der Tiergruppen wurde auf Aspekte
wie Parität, klinische Allgemeingesundheit und klinische Eutergesundheit innerhalb der
Tiergruppen geachtet. Die Eutergesundheit wurde anhand der Zellzahl pro ml Milch und dem
Nachweis
euterpathogener
Mikroorganismen
(Vierfeldertafel
der
Deutschen
Veterinärmedizinischen Gesellschaft) definiert (KRÖMKER 2007).
Färsen (K1)
Es handelte sich bei den Kontrolltieren um zwei klinisch gesunde Färsen der Rasse DeutschFleckvieh im Alter von 2 Jahren, die im Versuchsschlachthof Grub getötet wurden. Die Tiere
waren zum Zeitpunkt der Tötung noch nicht in Laktation, vorberichtlich Mastitis-frei und
hatten zum Zeitpunkt der Tötung keinerlei Anzeichen einer klinischen Mastitis. Diese
Tiergruppe wurde gewählt, um den Einfluss der Laktation auf die Leukozytenpopulation der
Zitze gegenüber nicht laktierenden Tieren abgrenzen zu können.
Adulte, eutergesunde, laktierende Rinder (K2)
Die Tiere (n=7) stammten aus der Klinik für Rinder der Tierärztlichen Hochschule Hannover
(Holstein-Friesian), dem Veterinär-Anatomischen Institut der Universität Zürich (HolsteinFrisian), der Klinik für Wiederkäuer der Ludwig-Maximilians-Universität München
(Deutsch-Fleckvieh) sowie dem Schlachthof Buchloe (Deutsch-Braunvieh). Das Alter lag
zwischen 2 und 5 Jahren. Alle Tiere waren zum Zeitpunkt der Probenentnahme in Laktation
und hatten keinerlei Anzeichen einer klinischen oder subklinischen Mastitis. Die subklinische
Mastitis war bestimmbar durch den Nachweis euterpathogener Mikroorganismen sowie durch
Bestimmung des Zellgehalts pro ml Milch. Diese Gruppe diente der MakrophagenCharakterisierung durch die Immunhistochemie und gilt neben den Färsen als Kontrollgruppe.
32
Material und Methoden
LPS-geprimte und kontrolliert infizierte Rinder (V1a-V2b)
Der Versuch wurde an der Klinik für Wiederkäuer der Ludwig-Maximilians-Universität
München durchgeführt (nach PFISTER 2009). Er diente der Untersuchung, inwieweit eine
Vorbehandlung mit LPS und anschließender Inokulation der Zitze mit E. coli Bakterien den
Zelleinstrom und deren Verteilung in der Zitze beeinflusst. Das LPS wurde aus dem E. coli
Stamm 1303 im Rahmen eines experimentellen Mastitismodells („Untersuchungen zu frühen
Erreger-Wirts-Interaktionen bei der Mastitis des Rindes“, PETZL 2005) hergestellt.
Die Tiere der Rasse Holstein-Friesian (n=9) waren 27 bis 36 Monate alt, klinisch gesund und
nach Vorbericht noch nie an einer Mastitis erkrankt. Sie befanden sich zwischen dem 2. und
6. Monat der ersten Laktation. Das LPS-Priming erfolgte nach dem Melken durch Applikation
von 5 ml LPS (0,2µg/ml) in steriler, 0,9%iger NaCl-Lösung in die Zitzenzisterne aller 4
Zitzen. Je nach Tiergruppe erfolgte nach 72 h die Infektion mit 250 CFU/ml E. coli Bakterien
desselben Stammes in nur eine Zitze. Die Probennahme geschah unmittelbar nach Tötung,
24 h nach Inokulation.
Tab. 1:
Übersicht über die Tiergruppen zur Entnahme von Gewebeproben
Versuchsgruppe Versuch
K1 (n=2)
Kein Priming, keine Infektion (Färsen)
K2 (n=7)
Kein Priming, keine Infektion (adulte Tiere)
V1a (n=3-4)*
Priming über 72 h
V1b (n=3)
Priming über 72 h, anschließende Infektion mit E. coli für weitere 24 h
V2a (n=4)
Priming über 240 h
V2b (n=4-5)**
Priming über 240 h, anschließende Infektion mit E. coli für weitere 24 h
Intern wurden o.g. Gruppenbezeichnungen für die Versuchsgruppen gewählt, *FR n=4, ZZ
n=3, **FR n=4, ZZ n=5.
Versuchstier zur Transkriptomanalyse nach experimenteller Inokulation mit E. coli
Zur Identifizierung regulierter Gene im Euter des Rindes nach experimenteller E. coli
Infektion wurde auf Daten einer Transkriptomanalyse zurückgegriffen (n=1). Die Daten
wurden in Kooperation mit der LMU-München im Rahmen eines Pilotprojektes zur
Charakterisierung der Immunregulation der initialen Phase der Mastitis erstellt und für die
hier vorliegende Arbeit zur Verfügung gestellt. Die Kuh der Rasse Holstein-Friesian befand
sich in der Mitte der ersten Laktation und war nie an einer klinischen oder subklinischen
33
Material und Methoden
Mastitis erkrankt. Die Infektionsdosis betrug 5x106 CFU/ml E. coli des Stammes 1303. Die
Daten der regulierten Gene wurden 4 h nach Infektion des Euters erhoben. Die
Gewebeentnahme erfolgte im Rahmen der Sektion des Tieres. Dabei wurden zentrale
Gewebestücke
(2x2x2cm)
aus
den
Lokalisationen
Fürstenberg’sche
Rosette
und
Zitzenzisterne herauspräpariert und in Reaktionsgefäße mit RNAlater gegeben. Dieses
verhindert den enzymatischen Abbau von RNA und ermöglicht ihre Konservierung bei
Raumtemperatur.
Im
Anschluss
daran
wurden
die
Gewebestücke
bis
zu
ihrer
Weiterverarbeitung über Nacht im Kühlschrank aufbewahrt. Die weitere Bearbeitung der
Proben wurde wie bei MITTERHUEMER et al. (2010) beschrieben nach dem Affymetrix
Verfahren am Genzentrum der Ludwig-Maximilians-Unversität München durchgeführt.
Spendertiere zur Blutgewinnung
Bei den Tieren, denen Blut zur Zellgewinnung entnommen wurde, handelte es sich
ausschließlich um weibliche, laktierende Tiere der Rasse Holstein-Friesian. Das Alter lag
zwischen 1,5 und 7 Jahren. Alle verwendeten Tiere waren klinisch gesund, nicht
ovarektomiert und stammten aus der Klinik für Rinder der Tierärztlichen Hochschule
Hannover. Die Blutproben wurden durch Punktion der Vena jugularis unter sterilen
Bedingungen nach Stauung des Gefäßes mit einer Staukette nach Witte (9.3) gewonnen. Für
die Gewinnung von Blutleukozyten wurde das Vacutainersystem mit heparinisiertem
(Natrium-Heparin) Vacutainern eingesetzt.
3.2 Probennahme, Fixierung und Einbettung von Gewebeproben
Die Auswertung erfolgte nach einzelnen Vierteln. In einzelnen Fällen waren aufgrund
anatomischer Gegebenheiten sowie artifizieller Veränderungen nicht alle Viertel auswertbar,
die Auswertung wurde dann an den übrigen Vierteln vorgenommen.
3.2.1 Probennahme
Unmittelbar nach der Tötung wurden die Zitzen der Färsen und Rinder gewonnen. Dies
geschah durch Absetzen der gesamten Zitze an der Zitzenbasis am Übergang der unbehaarten
Zitzenhaut zur behaarten Euterhaut mit Hilfe einer Trimming-Klinge (9.2). Daraufhin wurden
die Zitzen auf einem mit Alufolie umwickelten Brett längs gespalten. Beide Hälften wurden
34
Material und Methoden
noch einmal quer in der Mitte der Zitzenhälfte durchteilt, um ein besseres Durchdringen der
Probe durch die Fixierlösung zu gewährleisten. Die Zitzen wurden unmittelbar nach dem
Absetzen und Zerteilen für mindestens 48 h in vorbereitete Gläser mit neutral gepuffertem
Formol nach LILLIE, Bouin’scher Lösung sowie Paraformaldehydlösung gegeben und
beschriftet. Zitzen von 3 Tieren der Gruppe K2 wurden ausschließlich in ParaformaldehydLösung fixiert, Zitzen von 2 Tieren derselben Gruppe wurden in neutral gepuffertem Formol
nach LILLIE und Zitzen von weiteren 2 Tieren in Bouin’scher Lösung fixiert. Zitzen der
Tiere der LPS-Primingversuchsgruppe sowie Zitzen der Gruppe K1 wurden ausschliesslich in
Bouin’scher Lösung fixiert.
3.2.2 Fixierung
Fixierung in BOUIN’scher Lösung nach BÖCK 1989
Zur Herstellung der Lösung wurden folgende Chemikalien miteinander vermengt:
Pikrinsäure
1500
ml
37 %iges Formalin
500
ml
Eisessig
100
ml
Die Zitzen wurden in BOUIN’scher Lösung mindestens 48 h fixiert.
Fixierung in neutral gepuffertem Formol nach LILLIE
Zur Herstellung der Lösung wurden folgende Chemikalien miteinander vermengt:
NaHPO4
3,48
g
Na2HPO4(dehydriert)
6,50
g
Aqua bidest. ad
1000
ml
pH-Wert: 7,0
Beide Chemikalien wurden einzeln gelöst, dann wurde die Phosphatpufferstammlösung wie
folgt zum Formaldehyd gegeben:
37 % Formaldehyd
100
ml
Phosphatpufferstammlösung
900
ml
Die Proben wurden in neutral gepuffertem Formol mindestens 48 h fixiert und anschließend
24 h in fließendem Wasser gespült.
35
Material und Methoden
Fixierung in Paraformaldehydlösung
Zur Herstellung der Lösung wurde 0,2 mol/l Cacodylat-Puffer (pH 7,2) wie folgt angesetzt:
Dimethylarsinsäure Natriumsalz-Trihydrat
10,7
1N Salzsäure
4,15
Aqua dest. (80°C)
g
ml
500
ml
40
g
Darin wurden folgende Chemikalien gelöst:
Paraformaldehyd
Calciumchlorid-Dihydrat
0,735 g
Die Lösung wurde mit 5 ml 1N NaOH versetzt.
In Paraformaldehyd wurden die Proben mindestens 48 h fixiert und anschließend 24 h in
fließendem Wasser gespült.
3.2.3 Präparation der Zitzen
Die Zitzen wurden nach Fixation und Wässerung 48 h mittels einer Trimming-Klinge (9.2)
auf einem Brett zugeschnitten. So wurden Quer- und Längsschnitte der Zitzen auf Höhe des
Strichkanals, der Fürstenberg’scher Rosette und der distalen Zitzenzisterne angefertigt. Dabei
wurde darauf geachtet, das Gewebe nicht durch Schnitte oder Quetschungen zu
beeinträchtigen. Die so zugeschnittenen Proben wurden in beschriftete Einbettungskapseln
gegeben und durchliefen so die Einbettungsreihe (3.2.4).
3.2.4 Einbettung in Paraffin
Die wie unter 3.2.3 beschrieben zerteilten und fixierten Zitzen wurden in Paraffin (spezielles
Paraffin für die Histologie) eingebettet. Sie durchliefen zum Einbetten nacheinander folgende
Lösungen:
70 % Alkohol (mind. 1 Tag)
80 % Alkohol (mind. 1 Tag)
96 % Alkohol (1 ½ h)
Isopropanol (1 ½ h)
Xylol I (1 ½ h)
Xylol II (1 ½ h)
Paraffin I (über Nacht)
Paraffin II (2 h)
36
Material und Methoden
Paraffin III (1 ½ h)
Anschließend wurden die Proben aus der Einbettungskapsel genommen, in eine Metallform
gelegt, welche so dann mit 60°C warmem Paraffin ausgegossen wurde und mit einer Brücke
versehen wurde. Das Aushärten der Blöcke erfolgte auf einer -5°C temperierten Kühlplatte.
Danach wurden sie aus der Metallform gelöst und mit einem Rotationsmikroskop (9.2) 4 µm
dünne Schnitte angefertigt. Die Schnitte für die histologischen Färbungen wurden nach
Streckung im Wasserbad bei ca. 55°C auf Glasobjektträger (9.4) aufgezogen. Für die
immunhistologischen Reaktionen wurden adhäsive Objektträger (HistoBond®, 9.4)
verwendet, da diese eine besonders gute Haftung der Schnitte gewährleisten. Danach wurden
die Schnitte für 12 Stunden zum Trocknen und zur Entfernung des überschüssigen Paraffins
in einem Wärmeschrank bei 60°C aufbewahrt.
3.3 Histologische Färbungen
Zur Betrachtung unterschiedlicher Zellpopulationen und deren Quantifizierung wurden
verschiedene Färbungen angefertigt.
3.3.1 Hämatoxylin-Eosin-Färbung
Bei der Hämatoxylin-Eosin-Färbung handelt es sich um eine dichromatische Färbung, die sich
aus dem basischen Kernfarbstoff Hämatoxylin und dem sauren Zytoplasmafarbstoff Eosin
zusammensetzt (BÖCK 1989).
Entparaffinierung:
1. 2 x Xylol (10 Min.)
2. Isopropanol (2 Min.)
3. 96 % Alkohol (2 Min.)
4. 80 % Alkohol (2 Min.)
5. 70 % Alkohol (2 Min.)
6. Aqua dest. (spülen)
37
Material und Methoden
Färbung:
1. filtriertes Hämalaun nach DELAFIELD (8 Min.)
2. 0,1 % HCl-Alkohol (kurz tauchen)
3. unter fließendem Leitungswasser spülen (15 Min.)
4. Eosin (1 % in 96 %igem Alkohol) + 3-4 Tropfen 100 % Essigsäure (5 Min.)
Entwässerung:
1. 80 % Alkohol (3 Min.)
2. 96 % Alkohol (3 Min.)
3. Isopropanol (3 Min.)
4. 2 x Xylol (5 Min.)
Das Eindecken mit Eukitt (9.5) erfolgte ohne vorheriges Abtrocken direkt aus dem Xylol
heraus.
3.3.2 Trichrom-Färbung nach Masson-Goldner
Diese Färbung erfolgte nach MASSON-GOLDNER (BÖCK 1989) und dient im
Wesentlichen der Darstellung des Bindegewebes (kollagene Fasern grün).
Entparaffinierung siehe 3.3.1
Färbung:
1.
filtriertes Hämalaun nach DELAFIELD (8 Min.)
2.
0,1 % HCl in Aqua dest. (kurz tauchen)
3.
unter fließendem Leitungswasser spülen (15 Min.)
4.
Säurefuchsin-Ponceau (5 Min.)
(0,2 g Ponceau de Xyline + 0,1 g Säurefuchsin + 300 ml Aqua dest. + 0,6 ml Eisessig)
5.
0,1 % Essigsäure (5 Min.)
6.
Phosphorwolframsäure-Orange G (10 Min.)
(10 g Phosphorwolframsäure + 5 g Orange G + 250 ml Aqua dest.)
7.
1 % Essigsäure (5 Min.)
8.
Lichtgrün (5 Min.)
38
Material und Methoden
(0,5 g Lichtgrün + 250 ml Aqua dest. + 0,5 ml Eisessig)
9.
0,1 % Essigsäure (5 Min.)
Anschließend Entwässerung und Eindecken mit Eukitt (siehe 3.3.1)
3.3.3 Toluidinblau-Färbung
Die monochromatische Übersichtsfärbung eignet sich in erster Linie zur Darstellung von
Proteinen. Das Gewebe färbt sich, in Abhängigkeit seines isoelektrischen Punktes,
unterschiedlich stark blau. Im Rahmen dieser Untersuchungen wurde Wert gelegt auf die
Darstellung von Mastzellen, deren Zytoplasma sich in dieser Färbung lila darstellt. Das
Färbegemisch wurde nach RICHARDSON et al. (1960) angesetzt.
Entparaffinierung siehe 3.3.1
Färbung:
1.
Toluidinblau O (20 sec.)
(Stammlösung 1:5 mit Aqua dest. verdünnt)
2.
2 x Aqua dest. (spülen)
Anschließend Entwässerung und Eindecken mit Eukitt (siehe 3.3.1)
3.4 Immunhistochemische Nachweise
Die Immunhistochemie ermöglicht mit Hilfe von primären und sekundären Antikörpern eine
präzise, zelluläre Lokalisierung von Antigenen auf einem histologischen Schnitt. Hier wurden
mittels zweier verschiedener Antikörper Makrophagen in der Zitze (Fürstenberg’sche Rosette,
Zitzenzisterne) detektiert.
39
Material und Methoden
Tab. 2:
Für die Immunhistochemie verwendete Primärantikörper.
Name
(Hersteller)
Spezifität
Donor/Isotyp Kopplung
Konzentration
(µg/ml)
AM-3K3
Humanes
1,2
(Transgenic) CD163
Maus/IgG1
Keine
10
MAC3874
(Biologo)
Humanes
Calprotectin1,2
Maus/IgG1
Keine
0,2
Anti-Maus
IgG
Keine1,
Maus/IgG,
Isotypkontrolle gesamtes
Molekül
Keine
5
1) Die Verdünnung erfolgte in PBS+1%igem BSA. 2) kreuzreaktiv mit dem homologen
bovinen Molekül, die angegebenen Referenzen beschreiben eine Kreuzreaktivität für Rinder.
3) ZENG et al. (1993); 4) BRANDTZEAG et al. (1992); 5) Die Proteinkonzentration wurde auf
die der spezifischen Antikörper (AM-3K, MAC387) eingestellt.
Der immunhistochemische Nachweis von Makrophagen in der Zitze wurde an
Paraffinschnitten (3.2.4) durchgeführt, welche auf Adhäsionsobjektträger aufgezogen worden
waren. Sie unterliefen folgender Behandlung:
Entparaffinierung
1. 2 x Xylol
10
Min.
2. Isopropanol
2
Min.
3. 96 % Alkohol
2
Min.
30
Min.
4. 196 ml 80 % Alkohol + 4 ml 30 % H2O2
Das H2O2 wurde hinzugefügt, um endogene Peroxidase zu inaktivieren, da der verwendete
Farbstoff später durch eine an anti-Maus IgG-gekoppelte Peroxidase oxidiert wurde.
5. 70 % Alkohol
2
Min.
6. 3 x PBS
5
Min.
Aufbereitung mittels Demaskierungslösung P
Die Aufbereitung mit der Demaskierungslösung P (9.5) erfolgte, um das Präparat auf die
Kopplung an den Antikörper vorzubereiten. Die Demaskierungslösung P ist eine gepufferte,
40
Material und Methoden
0,1%ige Pronaselösung, die nach der Entparaffinierung auf den Gewebeschnitt aufgetropft
wurde. Die Inkubationszeit betrug bei dem Antikörper AM-3K 30 Min, bei dem Antikörper
MAC387 15 Min. Die durch die Fixierung entstandene Vernetzung der Proteine wurde auf
diese Weise enzymatisch aufgelockert, so dass der Antikörper besser an diese binden konnte.
Antikörperreaktion
Hierfür wurden die Präparate in eine feuchte Kammer gelegt, die mit nassen (Aqua dest.)
Zellstofftüchern ausgelegt war. Folgende Substanzen wurden mittels einer Pipette in der
genannten Reihenfolge auf das Objekt gegeben, um dann über einen bestimmten Zeitraum in
der feuchten Kammer mit dem Objekt reagieren zu können. Zunächst wurde 0,5 ml
Ziegennormalserum (9.5) in 2 ml PBS gelöst auf den Gewebeschnitt aufgetragen und für
mind. 20 Min. in der feuchten Kammer inkubiert. Ziegennormalserum fungiert als sog.
„Blockserum“ und bindet elektrostatisch freie Proteingruppen, wodurch unspezifische
Bindungen
durch
die
Antikörper
verhindert
werden.
Im
Anschluss
wurde
das
Ziegennormalserum abgeklopft und die monoklonalen Antikörper AM-3K und MAC387,
(Tab. 2) aufgetragen und über Nacht in der feuchten Kammer im Kühlschrank auf dem
Gewebeschnitt belassen. Zur Entfernung des Antikörpers wurden die Gewebeschnitte am
nächsten Tag 3x für 5 Min. in PBS gespült.
Nachweisreaktion
Zur Verstärkung und zum Nachweis der Immunreaktion sowie deren Visualisierung wurde
das
EnVision-System
verwendet.
Dazu
wurde
der
im
EnVision
enthaltene
Sekundärantikörper-Dextran-Peroxidase-Komplex auf den Gewebeschnitt pipettiert und für
45 Min. in der feuchten Kammer inkubiert. Nach einer sich anschließenden Spülung in PBS
(3 x für 5 Min.) wurden die Schnitte mit 3,3’-Diaminobenzidin (DAB, 9.5) für 5 Min.
inkubiert. Um das Substrat DAB nach Ablauf der Inkubationszeit wieder zu entfernen,
wurden die Schnitte ein weiteres Mal in PBS (1x für 10 Min.) sowie in fließendem Wasser
(10 Min.) gespült.
Prinzip der EnVision-Technik zum Nachweis von Antikörpern: Bei der EnVision-Technik
werden zwei verschiedene Antikörper verwendet. Dabei bindet der Primarantikörper (Tab. 2)
am
Schnitt
am
entsprechenden
Antigen.
41
An
den
Primarantikörper
bindet
der
Material und Methoden
Sekundarantikörper,
der
auf
einem
Dextran-Polymer
mit
dem
Enzym
HRP
(Meerrettichperoxidase) gekoppelt ist. Das Enzym HRP setzt das Substrat DAB in ein
braunes, unlösliches Präzipitat um. Durch diese Braunfärbung wurde das Vorhandensein des
Primarantikörpers und damit des entsprechenden Antigens indirekt nachgewiesen. Im
EnVision Detectionssystem sind der HRP-markierte Sekundarantikörper sowie die DABLösung enthalten.
Kerngegenfärbung mit Hämalaun
Zur besseren Darstellung der einzelnen Zellpopulationen wurden die Schnitte nach dem
Spülen für 1-2 sec in filtriertes Hämalaun (Hämatoxylin+Ammoniumalaunsulfat) getaucht.
Daraufhin wurden die Schnitte 10 Min. in fließendem Wasser gespült.
Entwässerung
Die Entwässerung erfolgte in einer aufsteigenden Alkoholreihe (70 %, 80 % 96 %,
Isopropanol) für jeweils 2 Min., sowie 2 x für jeweils 5 Min. Xylol. Anschließend wurden die
Schnitte mit Eukitt direkt aus dem Xylol heraus ohne vorheriges Abtrocknen eingedeckt.
Negativkontrollen
Um falsch positive Ergebnisse auszuschließen, wurden im Zuge der Antikörperreaktionen mit
dem Envision Detectionssystem zusätzliche Präparate mitgeführt. Auf diese wurde anstelle
des Antikörpers nur das Verdünnungsmedium PBS+1% bovines Serumalbumin gegeben. Um
spezifische Bindungen des Primärantikörpers zu prüfen (Isotypkontrolle), wurde ein
irrelevanter, nicht reaktiver Kontrollantikörper (Tab. 2) in den Proteinkonzentrationen der
verwendeten Makrophagen-Antikörper zur Färbung von Kontrollpräparaten eingesetzt.
42
Material und Methoden
3.5 Dokumentation und Auswertung der histologischen und
histochemischen Befunde
Die histologischen und histochemischen Präparate wurden lichtmikroskopisch an einem Zeiss
Photomikroskop (9.2) mit Hilfe einer digitalen Mikroskopkamera (Olympus DP 70) in
Kombination mit der Software Olympus DP Soft mikroskopiert und fotografisch festgehalten.
Die Auswertung der relativen Häufigkeit von Leukozyten erfolgte blind und semiquantitativ.
Dabei wurden folgende Aspekte berücksichtigt:
•
Lokalisation von Makrophagen, Lymphozyten, Plasmazellen, Mastzellen und
neutrophilen Granulozyten innerhalb der Zitze (Strichkanal, Fürstenberg’sche Rosette,
proximale und distale Zitzenzisterne)
•
Zellaufkommen an den Lokalisationen subepitheliales Gewebe, perivaskuläres
Gewebe, peripheres Bindegewebe der Zitze bis zu 0,5 cm in Richtung peripherer
kutaner Haut
Die semiquantitative Auswertung der relativen Häufigkeit der einzelnen Zellpopulationen an
den verschiedenen Lokalisationen erfolgte durch Vergabe von Werten 0 bis 3, wobei 0
keinem Zellaufkommen entspricht und 3 hochgradigem Aufkommen. Dazwischen wurden
Abstufungen in 0,5-Schritten vergeben. Aufgrund der z.T. geringen Gruppengröße erfolgte
die statistische Auswertung der Leukozytenpopulation rein deskriptiv (Mittelwert und
Standardabweichung).
Um das Verhältnis unterschiedlicher Makrophagenpopulationen zu weiteren Zelltypen
charakterisieren zu können, wurde an Serienschnitten der Gruppe K2 (adulte, laktierende,
eutergesunde Rinder) die exakt identische Lokalisation aufgesucht, beurteilt und fotografiert.
Auch hier erfolgte wie oben beschrieben die semiquantitative Auswertung.
3.6 Kulturmedien, Puffer und Lösungen
Alle Medien wurden, wenn nicht anders angegeben, in Aqua tridest. angesetzt. Für die
Kultivierung von Leukozyten wurden die Medien RPMI und Iscove® (9.5) verwendet. Um
Komplementaktivität auszuschließen und eventuell vorhandene Mykoplasmen abzutöten,
wurde das eingesetzte fetale Kälberserum (FCS, 9.5) bei 56°C für eine Stunde inaktiviert. Ein
43
Material und Methoden
mit Penicillin-Streptomycin-Lösung (9.5) versetztes Medium wurde mit einem hochgestellten
‚+‘-Zeichen gekennzeichnet.
Iscove®-Medium mit 10% (v/v) fetalem Kälberserum (I10F+) (s. 9.5):
Iscove® DMEM mit L-Glutamin
500
ml
Fetales Kälberserum (hitzeinaktiviert)
50
ml
Penicillin-Streptomycin
10
mg
RPMI-Medium mit 10% (v/v) fetalem Kälberserum (R10F+) (s. 9.5):
RPMI® liquid mit Hepes und L-Glutamin
500
ml
Fetales Kälberserum (hitzeinaktiviert)
50
ml
Penicillin-Streptomycin
50
mg
Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) mit EDTA (2 mmol/l)
EDTA
292
mg
PBS ad
500
ml
Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) mit Triton (PBS-T)
Triton
0,25
PBS ad
500
ml
ml
Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) mit bovinem Serumalbumin
Bovines Serumalbumin
PBS-T ad
15
g
500
ml
Prostaglandin E2 Stammlösung
Die Stammlösung von PGE2 (2,8 mmol/l) wurde, um es vor Oxidierung zu schützen, nach
Herstellerangaben in Ethanol gelöst und bei 4°C gelagert.
Lipopolysaccharid-Stammlösung
Die LPS-Stammlösung (E. coli O111:B4, 1 mg/ml PBS) wurde bei -20°C aufbewahrt.
44
Material und Methoden
Lymphozytenseparationsmedium
Das Lymphozytenseparationsmedium (9.5) ist eine isotone, wässrige Lösung aus Natriumdiatrizoat und einem hochmolekularen Zucker mit einem Zusatz des Röntgenkontrastmittels
Isopaque. Bei 10°C besitzt das Separationsmedium eine Dichte von 1,077 g/ml. In dieser Arbeit wurde das Lymphozytenseparationsmedium unverdünnt verwendet.
Phosphatgepufferte Salzlösung (PBS) ohne Ethylen-Diamin-Tetra-Acetat (EDTA)
Die PBS-Trockensubstanz (9.5) wurde in Aqua tridest. gelöst. Es wurden folgende Bestandteile eingewogen:
NaCl
8,0
g
KCl
1,24
g
Na2HPO4
0,2
g
KH2PO4
0,2
g
Aqua tridest
1000
ml
Der Puffer hatte einen pH-Wert von 7,4. Die Lagerung erfolgte bei 4°C.
Phosphatpuffer, doppelt konzentriert (2 x PBS)
Zur Herstellung wurde die doppelte Menge an PBS-Trockensubstanz eingesetzt und mit Aqua
tridest auf 1000 ml ergänzt.
Paraformaldehydlösung zum Fixieren von Referenzzellen
Paraformaldehyd
PBS ad
40
mg
1000
ml
Die Lagerung erfolgte bei 4°C.
Paraformaldehydlösung zum Fixieren von Makrophagen
Paraformaldehyd
40
mg
Saccharose
10
mg
1000
ml
PBS ad
Die Lagerung erfolgte bei 4°C.
45
Material und Methoden
Acridin-Orange-Ethidiumbromid-Lösung für die lichtmikroskopische Zellzählung
Acridin-Orange
250
mg
Ethidiumbromid
250
mg
PBS ad
100
ml
Die Lagerung erfolgte bei 4°C.
HOECHST-Kernfarbstoff Stammlösung
Die Stammlösung des HOECHST Kernfarbstoffs (5 mg/ml) wurde bei 4°C gelagert.
Lösungen für die Durchflusszytometrie
Zur Reinigung des Gerätes wurde das Messkanalsystem nach den Messungen mit steril
filtriertem A. tridest. und 1%-iger Natriumhypochlorid-Lösung (9.5) gespült.
Trägerflüssigkeit
Als Trägerflüssigkeit für die durchflusszytometrische Messung wurde steril filtriertes (0,2
µm) PBS mit 0,1 mg/ml NaN3 (Natriumazid) verwendet (9.5).
Propidiumjodid-Stammlösung
Die Stammlösung (100 µg Propidiumjodid/ml Trägerflüssigkeit) wurde in aliquoten Teilen
bei -20°C gelagert. Zum Anfärben toter Zellen wurden der Trägerflüssigkeit entsprechende
Teile der Stammlösung zugesetzt, um eine Endkonzentration von 2 µg/ml zu erreichen.
JC-1-Stammlösung
Der für die Apoptosebestimmung verwendete Farbstoff 5,5´,6,6´-Tetrachloro-1,1´,3,3´Tetraethylbenzimidazol-Carbocyanin Jodid (JC-1) wurde in einer Stockkonzentration von 2
mol/l in DMSO aufgenommen und in aliquoten Teilen von 20 µl bei -20°C eingefroren. JC-1
wurde mit PBS verdünnt und in einer Konzentration von 7 µmol/l eingesetzt.
Wasch- und Verdünnungspuffer für die Membranimmunfluoreszenz (MIF-Puffer)
bovines Serumalbumin
5,0
g
Natriumazid (NaN3)
0,1
g
46
Material und Methoden
PBS ad
1000
ml
Die Lagerung erfolgte bei 4°C.
Puffer und Lösungen für die DNA-Analyse
1x TBE-Puffer, pH 8,4
Der 10-fach konzentrierte TBE-Puffer (9.5) wurde mit Aqua tridest. verdünnt und bei RT
gelagert.
TE-Puffer, pH 7,5
Tris
EDTA
10,0
mmol/l
1,0
mmol/l
Gelöst in Aqua tridest wurde der Puffer 20 Min. bei 123°C und 2,8 bar autoklaviert,
aliquotiert und bei RT gelagert.
Blaumarker
Glycerol
Bromphenolblau
30%
(v/v)
1%
(w/v)
Gelöst in 1x TBE-Puffer, Lagerung bei 4 °C.
Zusätze, Medien und Nährböden für Bakterienkulturen
Ampicillin: 100 mg/ml in Aqua tridest., Lagerung bei -20 °C.
IPTG: 100 mg/ml in Aqua tridest., Lagerung bei -20 °C.
X-Gal: 100 mg/ml in Dimethylformamid (DMF), Lagerung bei -20 °C.
LB-Medium
Jeweils 20 g LB-Trockenpulver wurden in 1 l Aqua tridest. gelöst und für 20 Min. bei 135°C
und 2,8 bar autoklaviert. Nach Abkühlung auf ~55°C erfolgte die Zugabe von Ampicillin in
einer Konzentration von 100 µg/ml. Das Medium wurde bei 4°C bis zu 1 Monat gelagert.
47
Material und Methoden
LB-Agar
Es wurden 32 g LB-Agar-Pulver in 1 l Aqua tridest. gelöst und für 20 Min. bei 135°C und 2,8
bar autoklaviert. Nach Abkühlung auf ~55°C wurden 100 µg/ml Ampicillin, 80 µg/ml X-gal
und 40 µg/ml IPTG zugegeben und das Gemisch unter sterilen Bedingungen zu je 20 ml in
Petrischalen gegossen. Anschließend wurden die Platten an einem sterilen Arbeitsplatz für 15
Min. bei Raumtemperatur ausgehärtet. Die Agarplatten konnten für 1 Monat bei 4°C gelagert
werden.
3.7 Immunfluoreszenz an Makrophagen
Die Immunfluoreszenz wurde an Deckglas-adhärenten Makrophagen durchgeführt.
Deckgläser zur Adhäsion der Makrophagen wurden für 0,5 h in ein Becherglas gegeben und
mit 1molarer HCl überschichtet. Dieses geschah zum Anrauhen der Oberfläche. Daraufhin
wurde die HCl abgegossen und die Deckgläser mit PBS für weitere 0,5 h überschichtet. Auch
dieses wurde abgegossen und die Deckgläser wurden daraufhin mit 96%igem Ethanol für
2 min überschichtet. Danach wurden sie einzeln aus dem Ethanol genommen und auf einer
sauberen Papierunterlage zum Trocknen ausgebreitet. Anschließend wurden die Deckgläser
autoklaviert und unter sterilen Bedingungen in die Vertiefung einer 24-well Platte gegeben.
Monozyten wurden wie unter 3.11 beschrieben separiert und in I10F+ (9.5) auf 1x105
Monozyten/ml eingestellt. Es wurden 5x104 Zellen pro Vertiefung ausgebracht. Die
Ausdifferenzierung zu MdM fand über sieben Tage bei 37°C und 5% CO2 statt. Nach drei
Tagen wurden zu jedem Ansatz 500 µl frisches Medium (I10F+) hinzugefügt, das zuvor auf
37°C vorgewärmt wurde. Die Zellen wurden im Invertmikroskop auf Adhärenz und
Kontamination überprüft. Kontaminierte Zellkulturen wurden verworfen. Um einen Einfluss
von PGE2 auf die Generierung von MdM und deren Expression von S100A8/A9 (Antikörper
MAC387) und CD163 (Antikörper AM-3K) zu prüfen, wurde den Monozyten zu Beginn der
Ausdifferenzierung und bei der Auffrischung des Mediums PGE2 in der finalen Konzentration
1x10-9 mol/l zugesetzt. Am 7. Tag wurde das Medium abgesogen und die Zellen auf den
Deckgläsern durch Zugabe von 500 µl PBS 5 min gewaschen.
Zur Fixierung und Permeabilisierung der Zellen wurde zunächst eiskaltes Methanol für 10
Min. zu den Zellen gegeben. Anschließend wurde das Methanol abgesogen, und die Zellen
48
Material und Methoden
getrocknet. Es folgte ein Waschen der Zellen für 5 Min. mit PBS-T auf einem Plattenrüttler.
Anschließend wurde für 20 Min. eine Paraformaldehydlösung zu den Zellen gegeben.
Die Paraformaldehydlösung wurde abgesogen und die Zellen 3 x für je 5 Min. mit PBS und 1
x für 5 Min. mit PBS-T gewaschen.
Zur Blockierung unspezifischer freier Bindungsstellen wurden die Zellen auf einem
Plattenrüttler für 60 min mit PBS-T+3%igem BSA inkubiert.
Beide Antikörper wurden mit PBS (MAC387 1:500, AM-3K 1:100) verdünnt. Zur
Darstellung des Zytoskeletts wurde zu jeder Antikörperlösung ein anti-pan Zytokeratin
Antikörper (1:800)
gegeben.
Jeweils
30 µl Primärantikörperlösung (inklusive des
Zytokeratinantikörpers) wurden zu den Zellen gegeben. Die Inkubation erfolgte über Nacht
bei 4°C in einer feuchten Kammer. Zum Ausschluss unspezifischer Bindungen wurde je ein
Parallelansatz mit einem unspezifischen Maus-IgG-Antikörper (ganzes Molekül, 9.5) sowie
mit PBS anstelle der Primärantikörper inkubiert.
Am nächsten Tag wurden die Zellen 3 x für 10 Min. mit PBS-T auf einem Plattenrüttler
gewaschen. Anschließend wurde der Sekundärantikörper ALEXA Fluo 488 in der
Verdünnung (1:2000) zu den Zellen gegeben und für 45 Min. in einer dunklen Kammer
inkubiert. Daraufhin wurden die Zellen erneut 3 x für 10 Min. mit PBS-T auf dem
Plattenrüttler gewaschen.
Zur Kernfärbung wurde für 5 min der Kernfarbstoff HOECHST-33342 (1:2000 in 30 µl PBS)
zu den Zellen gegeben. Anschließend wurden die Zellen 2 x für 5 Min. mit PBS-T und 1 x für
5 Min. mit PBS gewaschen. Die Deckgläser wurden mit einer Pinzette vorsichtig aus den
wells genommen und kurz in A. dest. getaucht. Daraufhin wurde ein Tropfen Roti®-Mount
auf einen vorher beschrifteten Objektträger gegeben und das Deckglas darauf gegeben. Roti®Mount verhindert das Ausbleichen der Fluoreszenz.
3.8 Dokumentation und Auswertung der Immunfluoreszenz an
Makrophagen
Die Präparate wurden mikroskopisch an einem Zeiss Axiovert Fluoreszenzmikroskop (9.2)
mit Hilfe einer digitalen Mikroskopkamera (Axiocam MR5) in Kombination mit der Software
Axiovision 4.6 mikroskopiert und fotografisch festgehalten. Die quantitative Auswertung
49
Material und Methoden
erfolgte durch Auszählen von 200 Zellkern-positiven Zellen (blau, Emission bei 450 nm) pro
Ansatz. Innerhalb dieser 200 Zellkern-positiven Zellen wurde die Fluoreszenz der Antigene
CD163 und S100 (grün, Emission bei 488 nm) ausgezählt. Dabei wurde subjektiv zwischen
stark und schwach positiv gefärbten Zellen differenziert.
50
Material und Methoden
3.9 Plasmid für die Herstellung von Standardreihen
Für die Klonierung von Gensequenzen in chemisch kompetenten E. coli wurde das im TOPOCloning-Kit enthaltene Plasmid pCR®2.1-TOPO® verwendet (Abb. 1).
Abb. 1:
Plasmid für die Klonierung von Gensequenzen in E. coli zur Herstellung von
externen Standardreihen für die quantitative real time PCR.
Schematisch dargestellt sind die Ligationsstelle für das PCR-Produkt, AntibiotikaResistenzen und Schnittstellen für Restriktionsenzyme.
51
Material und Methoden
3.10 Genspezifische Primer für die quantitative real time PCR
Die Oligonukleotid-Primer wurden aufgrund von bereits veröffentlichten Sequenzen
ausgewählt und im Fall von PPARγ selbst erstellt. Bezogen wurden alle Primer von der Firma
MGW aus Ebersberg. Die optimale Konzentration der Primer im StepOnePlus-PCR System
(9.2) wurde durch eine vom Hersteller beschriebene Primer-Optimierung (3.14.2) ermittelt.
Die Sequenzen der verwendeten Primer, die eingesetzte Konzentration sowie die Länge des
Amplikons und die Referenzen sind in Tab. 3 dargestellt.
Tab. 3:
Gen
IL1-β
Primer-Sequenzen
Vorwärts- (for) und Rückwärts- (rev) Primer
(5’→ 3’) und Konzentrationen (nmol/l)
for TTCTCTCCAGCCAACCTTCATT (300)
Länge des
Amplikons
Zitat
198
1
156
2
78
3
71
4
170
2
200
5
67
6
rev ATCTGCAGCTGGATGTTTCCAT (300)
TNF-α
for CTTCTGCCTGCTGCACTTCG (300)
rev GAGTTGATGTCGGCTACAACG (300)
CCL5
for CCTGCTGCTTTGCCTATATCT (300)
rev AGCACTTGCTGCTGGTGTAG (300)
CCL20
for GACTGCTGTCTCCGATAACA (300)
rev GCCAGCTGCTGTGTGAAGC (300)
CXCL8
for CCTCTTGTTCAATATGACTTCCA (300)
rev GGCCCACTCTCAATAACTCTC (50)
PPARγ
for AAGAATATCCCCGGCTTTGT (300)
rev TTGGGCTCCATAAAGTCACC (300)
IL-10
for CCTTGTCGGAAATGATCCAGTTTT (300)
rev TCAGGCCCGTGGTT TCA (300)
1) NEUVIANS et al. (2004), 2) YANG et al. (2008), 3) WIDDISON et al. (2008), 4) RADDATZ
(2008), 5) selbst erstellt, 6) ALMAIDA et al. (2007)
52
Material und Methoden
3.11 Gewinnung einzelner Leukozytensubpopulationen des Blutes
Blutproben wurden durch Punktion der Vena jugularis unter sterilen Kautelen nach Stauung
des Gefäßes mit einer Staukette nach Witte (9.3) gewonnen. Eingesetzt wurde das
Vacutainersystem mit heparinisiertem (Natrium-Heparinat) Röhrchen. Das Blut wurde im
Verhältnis 1:2 mit PBS verdünnt und in 50 ml Röhrchen über Lymphozytenseparationsmedium® (9.5) geschichtet. Die anschließende Zentrifugation (30 Min., 4°C) wurde bei
1000 x g ohne Bremse durchgeführt. Während dieser Zentrifugation trennten sich die
einzelnen Zellpopulationen aufgrund ihrer spezifischen Dichte auf. Zwischen dem Blutplasma
und dem Lymphozytenseparationsmedium befand sich die ‚Interphase‘ mit mononukleären
Zellen (MNC; lymphoide Zellen und Monozyten) sowie Anteilen der Thrombozytenfraktion.
Unterhalb des Lymphozytenseparationsmediums® lagen die gepackten Erythrozyten und die
polymorphkernigen Granulozyten (PMN).
Gewinnung von mononukleären Zellen
Die Interphase wurde mit einer weitlumigen Pipette abgesaugt und in ein 50 ml
Zentrifugenröhrchen mit vorgelegtem PBS (10 ml) überführt. Nach Auffüllen mit PBS auf 30
ml schlossen sich drei Waschschritte an (je 10 Min., 4°C; 500 x g, 250 x g und 100 x g), um
die Thrombozyten weitestgehend zu entfernen. Nach dem ersten Waschschritt wurden
kontamierende Erythrozyten im Zellpellet durch hypotone Lyse entfernt: Nach Zugabe von 10
ml Aqua tridest. für 20 Sek. unter ständigem Schwenken wurden 10 ml 2-fach konzentriertes
PBS zugegeben. Zwischen den einzelnen Zentrifugationsschritten wurden die Zellen durch
Aufschütteln aus dem Pellet resuspendiert und in 40 ml PBS aufgenommen. Mit dieser
Methode konnten zwischen 1,5 und 3 x106 MNC/ml Vollblut gewonnen werden.
Gewinnung von Granulozyten
Das Plasma, die Interphase und das Lymphozytenseparationsmedium® wurden mit einer
weitlumigen Pipette abgesaugt und verworfen. Aus der verbleibenden Phase (Erythrozyten
und Granulozyten) wurden die Erythrozyten durch zweimalige hypotone Lyse entfernt: Nach
Zugabe von 20 ml Aqua tridest. für 20 Sek. unter ständigem Schwenken wurden 20 ml 2-fach
konzentriertes PBS zugegeben. Die Zellsuspension wurde für 10 Min. bei 500 x g bei 4°C
zentrifugiert, der Überstand dekantiert, die Zellpellets durch Rütteln der Röhrchen suspendiert
53
Material und Methoden
und nach Zugabe von 10 ml Aqua tridest. (nach 20 Sek. + 10 ml 2x konzentriertes PBS) ein
weiteres Mal hypoton lysiert. Die Zellen wurden zweimal mit 20 ml PBS bei 4°C für 10 Min.
gewaschen (250 x g, 100 x g). Das letzte Zellpellet wurde in Kulturmedium (I10F+)
aufgenommen, die Zellen gezählt und auf die gewünschte Konzentration eingestellt. Durch
dieses Verfahren konnten PMN-Populationen mit einer Reinheit von 90% bis 95% separiert
werden. Lag der Anteil kontaminierender MNC an den kernhaltigen Zellen bei >10%, wurde
die Zellsuspension nicht verwendet.
Gewinnung von Monozyten
Die Gewinnung von Monozyten aus mononukleären Zellen erfolgte über die Positiv-Selektion
von Monozyten anhand ihres CD14 Oberflächenmarkers in einem magnetischen
Separationssystem. Die nach der Dichtegradientenzentrifugation (s.o.) gewonnenen
mononukleären Zellen wurden in 5 ml PBS-EDTA (3.6) aufgenommen und über einen 30 µm
Nylonfilter (9.4) gegeben um Aggregate zu entfernen. Der Filter wurde dreimal mit 5 ml
PBS-EDTA gespült und die filtrierte Zellsuspension bei 100 x g und 4°C für 10 Min.
zentrifugiert. Das Zellpellet wurde in 400 µl PBS-EDTA resuspendiert und 8 µl eines PEkonjugierten mouse-anti-human-CD14 Antikörpers (9.5) hinzugefügt. Nach einer Inkubation
für 30 Min. bei 4°C wurden die Zellen gewaschen (300 x g, 4°C, 10 Min.), um ungebundenen
Antikörper zu entfernen. Die Zellen wurden in 200 µl PBS-EDTA aufgenommen. Ein Aliquot
wurde 1:50 verdünnt und im Durchflusszytometer auf Reinheit, Vitalität und das
Vorhandensein einer CD14-positiven Population überprüft (Abb. 2, A und B). Mittels
Referenzzellverfahren (3.13.1) wurden die vitalen Zellen quantifiziert. Pro 1x107 Zellen
wurden 80 µl PBS-EDTA und 20 µl goat-anti-mouse Micro Beads (9.5) zugegeben. Nach der
Inkubation (15 Min. bei 4°C) wurden die Zellen zentrifugiert (300x g, 4°C, 10 Min.) und in 3
ml PBS-EDTA aufgenommen. Für die magnetische Separation der CD14-positiven Zellen
wurde eine MACS-Säule (9.4) in die Separationseinheit (9.2) eingespannt und mit 3 ml PBSEDTA gespült. Die Zellsuspension wurde nach und nach über die Säule gegeben und der
Durchfluss in einem 15 ml Röhrchen aufgefangen. Anschließend wurde die Säule dreimal mit
jeweils 3 ml PBS-EDTA gespült. Die Spülfraktion wurde in einem gesonderten Gefäß
aufgefangen. Zur Elution der in der Säule befindlichen CD14-positiven Zellen wurde die
Säule aus dem Magnetfeld entfernt und mit 5 ml PBS-EDTA eluiert. Die erhaltenen
54
Material und Methoden
Fraktionen Durchlauf und Eluat wurden am Durchflusszytometer auf Reinheit und Vitalität
überprüft (Abb. 2, C). Die im Eluat enthaltenen Monozyten erreichten einen Reinheitsgrad
von >96% (Abb. 2, D). Die Monozyten wurden bei 300 x g und 4°C für 10 Min. zentrifugiert,
in I10F+ (9.5) aufgenommen und auf 2x105 Monozyten/ml eingestellt. Im weiteren Verlauf
wurden die Monozyten für die Generierung von Makrophagen (s.u.) genutzt.
55
A1024
B 1024
Seitwärtsstreulicht
(SSC)
SSC-H
Seitwärtsstreulicht (SSC)
Material und Methoden
768
512
256
0,26%
768
512
256
62,11%
0
0
0
256
512
FSC-H
768
1024
0
10
D1024
0,18%
768
512
256
0
21,38%
0
78,33%
256
512
FSC-H
768
3
4
10
10
1024
0,11%
1,13%
1,59%
97,17%
768
512
256
0
0
10
1
10
2
10
3
10
4
10
Orangefluoreszenz (FL2)
Vorwärtsstreulicht (FSC)
Abb. 2:
2
10
Orangefluoreszenz (FL2)
Seitwärtsstreulicht (SSC)
SSC-H
Seitwärtsstreulicht
(SSC)
0,11%
37,33%
1
10
Vorwärtsstreulicht (FSC)
C1024
0,30%
Magnet-aktivierte Zellseparation von bovinen Monozyten mit PEkonjugiertem Mouse-anti-human CD14.
Durchflusszytometrische Darstellung von vitalen, bovinen MNC markiert mit Mouse-antiHuman-CD14 vor der magnetischen Separation (A, B) und von vitalen Monoyzten nach der
Positiv-Anreicherung (C, D). Die Punktediagramme A und C zeigen die Morphologie der
Zellen (FSC/SSC), die Punktediagramme B und D zeigen den Anteil CD14-positiver Zellen in
der Orangefluoreszenz (FL2/SSC).
56
Material und Methoden
3.12 Herstellung und Stimulation von Makrophagen aus Blutmonozyten
in vitro
Makrophagen, die aus Blutmonozyten in vitro generiert wurden (bMdM, blood monocyte
derived macrophages), werden im Weiteren als „MdM“ bezeichnet. Die Blutmonozyten
wurden wie oben beschrieben separiert und in I10F+ (9.5) auf eine Zellzahl von 2x105
Monozyten/ml eingestellt. Die Monozyten wurden anschließend auf 24-well Platten (9.4) zu
je 4x105 Zellen pro Vertiefung ausgebracht. Die Ausdifferenzierung zu MdM fand über
sieben Tage bei 37°C und 5% CO2 statt. Nach drei Tagen wurden zu jedem Ansatz 500 µl
frisches Medium (I10F+) hinzugefügt, das zuvor auf 37°C vorgewärmt wurde. Die Zellen
wurden im Invertmikroskop auf Adhärenz und Kontamination überprüft. Kontaminierte
Zellkulturen wurden verworfen. Um einen Einfluss von PGE2 auf die Generierung von MdM
zu prüfen, wurde den Monozyten zu Beginn der Ausdifferenzierung und bei der Auffrischung
des Mediums PGE2 in den finalen Konzentrationen 1x10-6 mol/l, 1x10-9 mol/l und 1x10-12
mol/l zugesetzt. Alle Ansätze wurden in Duplikaten angelegt. Nach sieben Tagen wurden die
MdM mit LPS (5 µg/ml) für 3 h stimuliert. Von einem Duplikatansatz wurden
Zellkulturüberstände gewonnen, um deren Einfluss auf die Apoptose und Nekrose von PMN
zu untersuchen. Der andere Duplikatansatz diente zur Bestimmung der mRNA Expression
ausgewählter Zytokine, Chemokine sowie des Transkriptionsfaktors PPARγ.
3.13 Durchflusszytometrie
Bei der Durchflusszytometrie werden Einzelzellen in einem Probenführungssystem an einem
Laserstrahl vorbei geleitet. Bei dem für diese Versuche verwendeten Durchflusszytometer
handelt es sich um ein FACScan®-Gerät (9.2) mit einem Argonlaser, der Licht einer
Wellenlänge von 488 nm erzeugt. Das Gerät erfasst mit entsprechenden Detektoren
Fluoreszenzlicht-Emissionen in drei verschiedenen Wellenlängenbereichen (FL-1 =
Grünfluoreszenz: 515-545 nm; FL-2 = Orangefluoreszenz: 564-606 nm; FL-3 =
Rotfluoreszenz: >650 nm). Gestreutes Licht wird zudem in Richtung des Strahls als so
genanntes Vorwärtsstreulicht (Forward Scatter, FSC) oder im 90° Winkel dazu, als
Seitwärtsstreulicht (Side Scatter, SSC), erfasst. Durch die Vorwärtsstreuung werden die
Größe des Partikels und dessen Refraktionsindex, durch die Seitwärtsstreuung die
57
Material und Methoden
Komplexität (Oberflächenbeschaffenheit und Granularität) charakterisiert (RADBRUCH
1992). Jedes Messereignis wird damit durch fünf verschiedene Parameter (FSC, SSC, FL-1,
FL-2, FL-3) charakterisiert. Mit Hilfe der Software „WinMDI Version 2.8“ erfolgte die
computergestützte Auswertung der Daten. Ergebnisse wurden mehrparametrisch als
korrelierte Punkte- oder Dichtediagramme dargestellt. Da die Werte einzelner Parameter stark
von den Einstellungen für FSC, SSC und Fluoreszenzdetektoren abhängen, wurden nur solche
Messungen miteinander verglichen, die mit identischen Geräteeinstellungen erfasst wurden.
Zur Definition einzelner Untergruppen der Messereignisse („Events“) wurden nach der
Messung softwaregestützt elektronische „Fenster“ (sog. „Gates“) gesetzt und zum Teil
mehrere Fenster logisch miteinander verknüpft.
3.13.1
Quantifizierung vitaler Zellen mittels Referenzzellmethode
Ein Teil der in vitro eingesetzten Zellen stirbt im Laufe der Inkubation unter dem Einfluss der
Kulturbedingungen und der stimulierenden Signale ab. Daraus resultiert eine unbekannte Zahl
vitaler Zellen in der Suspension, die dadurch bestimmt werden kann, dass der Zellprobe eine
bekannte Anzahl von Zellen zugesetzt wird, die sich in mindestens einem Parameter von den
zu messenden Zellen unterscheidet, aber mit den gleichen Geräteeinstellungen am
Durchflusszytometer gemessen werden kann. Setzt man die Zahl der gemessenen, als
Referenzzellen identifizierten Events mit denen als vitale Zellen identifizierten gemessenen
Events ins Verhältnis, so kann auf den absoluten Gehalt vitaler Zellen geschlossen werden.
Herstellung von Referenzzellen
Zur Färbung wurden jeweils 2 x107 frisch separierte bovine mononukleäre Zellen des Blutes
in ein 15 ml Röhrchen gegeben und bei 80x g für 5 Min. und 4°C zentrifugiert. Nach dem
Abgießen des Überstandes wurde das Zellpellet in 100 µl PBS resuspendiert und mit
demselben Volumen des unverdünnten monoklonalen Antikörpers Bo 1 (9.5) für 15 Min. bei
4°C inkubiert. Anschließend erfolgte ein Waschschritt mit 5 ml MIF-Puffer (3.6) und ein
Zentrifugationsschritt (7 Min., 80 x g, 4°C). Der Überstand wurde verworfen und das
resuspendierte Zellpellet wurde mit 100 µl des 1:40 verdünnten FITC-konjugierten ZiegeAnti-Maus Antikörpers (9.5) versetzt und 20 Min. unter Lichtabschluss bei 4°C inkubiert.
Nach einem weiteren Waschschritt wurden die Zellen in 50 ml PBS resuspendiert und erneut
58
Material und Methoden
zentrifugiert. Zur Fixierung wurden die Zellen in 30 ml einer 4%-igen ParaformaldehydLösung (9.5) resuspendiert. Nach einer Inkubation für 24 h bei 4°C unter Lichtabschluss
wurden sie für 15 Min. bei Raumtemperatur zentrifugiert, dekantiert und ein zweites Mal in
PBS gewaschen. Dieses nun gewonnene Zellpellet wurde in der PJ-haltigen Trägerflüssigkeit
aufgenommen (2 µg/ml PJ) und auf 4x105 Zellen/ml eingestellt. Die Konzentration wurde vor
Einsatz kontrolliert und gegebenenfalls korrigiert. Referenzzellen wurden durch ihre
Morphologie (mononukleäre Zellen) sowie ihre Rot- und Grünfluoreszenz charakterisiert.
Quantifizierung vitaler Zellen am Durchflusszytometer
Die Inhalte einzelner Vertiefungen einer Mikrotiterplatte mit kultivierten Zellen wurden
vollständig entnommen und in ein Durchflusszytometerröhrchen überführt, in dem 100 µl
Trägerflüssigkeit mit PJ (4 µg/ml) vorgelegt war. Dazu wurden 50 µl einer Suspension mit
5x104 Referenzzellen pipettiert. Angestrebt wurde ein Verhältnis von Referenzzellen zu
Kulturzellen von ca. 1:1 bis 1:3. Waren höhere oder niedrigere Zahlen der Kulturzellen zu
erwarten, wurde die Zahl eingesetzter Referenzzellen entsprechend angepasst. Nach
durchflusszytometrischer Erfassung des Zellgemisches (10.000 Ereignisse) wurde die Zahl
der Ereignisse für Referenzzellen (FL1+/PJ+) und für vitale kultivierte Zellen (FL1-/PJ-)
erfasst. Beides erfolgte nach Setzen eines Fensters auf morphologisch identifizierbare Zellen
im FSC/SSC Punktediagramm. Die Absolutzahl vitaler Kulturzellen errechnete sich nach
folgender Formel:
Anzahl Kulturzellen =
3.13.2
Gemessene Ereignisse Kulturzellen x eingesetzte Zahl Referenzzellen
Gemessene Ereignisse Referenzzellen
Bestimmung der Apoptose neutrophiler Granulozyten
Nachweis des intrinsischen Pfads der Apoptose mit JC-1
Die
Bestimmung
des
Mitochondrienmembranpotentials
(MMP)
erfolgte
mit
dem
Fluorochrom 5,5',6,6'-Tetrachloro-1,1',3,3'-Tetraethylbenzimidazol-Carbocyanin Jodid (JC-1)
(FOSSATI et al. 2003). Bei JC-1 handelt es sich um ein metachromatisches Fluorochrom, das
durch seine Eigenschaft als lipophiles Kation durch die Membranen von vitalen Zellen
59
Material und Methoden
diffundieren kann. Das Kation aggregiert in funktionstüchtigen Mitochondrien vitaler Zellen,
da diese ein MMP von -180 mV bis -200 mV aufweisen. Nach Anregung mit Licht einer
Wellenlänge von 488 nm emittiert dieser Farbstoff Licht mit einer Wellenlänge von 590 und
kann somit im Durchflusszytometer in dem Detektor für oranges Licht (FL2-Detektor) erfasst
werden. Fällt das MMP einer Zelle in Folge von Apoptose über den intrinsischen Pfad auf
Werte unter -80 mV bis -100 mV ab, diffundieren die Aggregate von JC-1 in das Zytoplasma
und gehen dort in die monomere Form über. Es verändert sich folglich die Wellenlänge des
emittierten Lichtes auf 527 nm und wird somit von dem FL-1 Detektor für grünes Licht
erfasst. Zur Vereinfachung der Nomenklatur werden Zellen, deren MMP depolarisiert ist, in
den folgenden Ausführungen apoptotische Zellen genannt. Es sei darauf hingewiesen, dass es
sich hierbei um den intrinsischen Pfad der Apoptose handelt.
Testdurchführung
Mit der JC-1-Färbung sollte geprüft werden, ob Überstände aus MdM-Zellkulturen (3.3.1) die
Apoptose von neutrophilen Granulozyten beeinflussen. Dazu wurden bovine PMN wie unter
3.11 beschrieben separiert und in I10F+ resuspendiert (6x106 Zellen pro/ml). Von der
Granulozyten-Zellsuspension wurden pro Vertiefung jeweils 50 µl vorgelegt und
anschließend 50 µl der MdM Zellkulturüberstände dazugegeben, so dass die finale
Verdünnung der Überstände 1:2 betrug. Zur Kontrolle wurden Granulozyten, denen PGE2 in
den Konzentrationen 1x10-6 mol/l und 1x10-12 mol/l direkt zugegeben wurde, angesetzt. Nach
einer Inkubation von 24 h bei 37°C und 5% CO2 wurde die JC-1-Färbung durchgeführt.
Zunächst wurden die Zellkulturplatten zentrifugiert (250 x g, 20°C, 4 Min.) und die
Überstande abgeschlagen. Die Zellen wurden in 100 µl PBS resuspendiert und abermals
zentrifugiert (250 x g, 20°C, 4 Min.) und die Überstande abgeschlagen. Nach dem
Resuspendieren in der Restflüssigkeit wurden 100 µl JC-1-Lösung in einer Konzentration von
7 µmol/l zu den Zellen gegeben und 15 Min. bei 37°C inkubiert. Nach zweimaligem Waschen
wurden die Zellen in 200 µl Trägerflüssigkeit (2 µg/ml PJ) aufgenommen, in FCM-Röhrchen
überführt und durchflusszytometrisch erfasst (10.000 Ereignisse). Alle Ansätze erfolgten in
Triplikaten.
60
Material und Methoden
Auswertung
Bei der Erhebung der Daten wurde in der Darstellung Seitwärtsstreulicht (SSC) gegen
Vorwärtsstreulicht (FSC) ein Fenster auf neutrophile Granulozyten (Abb. 3, A) und im
FL3/SSC Punktediagramm ein zweites Fenster auf PJ-negative Ereignisse gesetzt. Durch eine
Verknüpfung der beiden Fenster wurden für die Auswertung nekrotische Zellen
ausgeschlossen und nur PMN erfasst. Die nicht nekrotischen neutrophilen Granulozyten
wurden in einem Dichtediagramm Grünfluoreszenz (FL1) gegen Rotfluoreszenz (FL3)
dargestellt. Des Weiteren wurde mittels der Darstellung FL1 gegen SSC die reine
Neutrophilenpopulation zur Auswertung herangezogen (D). Für die Auswertung wurden 3
Zustände unter den vitalen Zellen unterschieden: vitale, nicht apoptotische Zellen im linken
unteren Quadranten (Abb. 3, C, 1), apoptotische Zellen, deren MMP depolarisiert ist und die
somit nach JC-1-Färbung im linken oberen Quadranten erscheinen (Abb. 3, C, 2) und
intermediäre Zellen in den beiden rechten Quadranten (Abb. 3, C, 3). Die Membran von
intermediären Zellen ist in ihrer Integrität gestört. Somit kann PJ in die Zelle eindringen und
die JC-1-Moleküle können aus dem Zytosol in den extrazellulären Raum entweichen. Folglich
ist die Grünfluoreszenz herabgesetzt. Außerdem kann der Anteil der nekrotischen Zellen von
der Gesamtheit der Kulturzellen ermittelt werden (Abb. 3, B).
61
A1024
B1024
SSC-H
Seitwärtsstreulicht
(SSC)
SSC-H
Seitwärtsstreulicht
(SSC)
Material und Methoden
768
512
256
768
512
256
0
0
0
256
512
FSC-H
768
0
1024
10
2
SSC-H
Seitwärtsstreulicht
(SSC)
Grünfluoreszenz (FL1)
4
3
10
2
10
1
1
Abb. 3:
4
10
768
512
256
0
0
10
0
10
3
10
D1024
C10
10
2
10
Rotfluoreszenz (FL3)
Vorwärtsstreulicht (FSC)
3
1
10
1
10
2
3
10
10
FL3-H
Rotfluoreszenz
(FL3)
4
0
10
10
1
10
2
10
3
10
4
10
Grünfluoreszenz (FL1)
Darstellung und Auswertung der JC-1-Färbung von bovinen PMN.
Bovine PMN (24 h Kultur) wurden nach JC-1-Färbung durchflusszytometrisch erfasst (A, B,
D Punktediagramm, C Dichtediagramm, jeweils 10.000 Ereignisse). A) Fenster auf
morphologisch als PMN identifizierte Ereignisse; B) Fenster auf PJ-negative, vitale PMN; C)
vitale PMN dargestellt in Rot- gegen Grünfluoreszenz (1 vitale Zellen, 2 apoptotische Zellen,
3 intermediäre Zellen) D) Fenster auf reine Neutrophilenpopulation.
62
Material und Methoden
3.14 Aufbereitung von mRNA aus bovinen Leukozyten für die real time
PCR
Separierte oder in-vitro-kultivierte Zellen wurden im Lyse-Puffer des RNeasy®-Kit (9.5)
aufgenommen. Der Lyse-Puffer wurde zuvor durch Zugabe von Mercaptoethanol zu RLTPuffer im Verhältnis 1:100 hergestellt. Im Fall von adhärenten Makrophagen wurde darauf
geachtet,
durch
mehrmaliges
Auf-
und
Abpipettieren
exakt
alle
Zellen
vom
Kulturplattenboden zu lysieren. Zur weiteren Verarbeitung sowie zur Proteindenaturierung
wurden die so lysierten Zellen bei -95°C gelagert. Anschließend wurde die RNA über ein
System aus Trennsäulen gewaschen und aufgereinigt. Alle Arbeitsschritte wurden bei
Raumtemperatur durchgeführt. Das Medium der Zellkultur wurde zunächst mit einer Pipette
vollständig aus den wells genommen und in jede Vertiefung 350 µl Lyse-Puffer pipettiert.
Nach mehrmaligem Auf- und Abpipettieren wurde der Inhalt der Vertiefung in ein steriles 1,5
ml Eppendorf-Gefäß (9.4) überführt. Zu diesem Lysat wurde nun das equivalente Volumen an
70%igem Ethanol in das 1,5 ml Eppendorf-Gefäß gegeben und der Inhalt durch Schwenken
gemischt. Anschließend wurde das Gemisch auf das im Kit enthaltene Filter-System gegeben
und für 1 Min. bei 16000 x g zentrifugiert. Dabei wurden selektiv RNA-Moleküle mit einer
Länge von über 200 Basen an der Glasfiber-Membran der Filters adsorbiert, während Proteine
und Salze den Filter passierten und in das darunter befindliche Sammelröhrchen gelangten.
Das beigemengte Ethanol begünstigte diesen Vorgang. Es wurden zunächst 350 µl des
Wasch-Puffers RW-1 auf den Filter gegeben und für 15 sec bei 16000 x g zentrifugiert. Der
bei den einzelnen Zentrifugationschritten erzeugte Durchfluss wurde nach jeder
Zentrifugation verworfen. Um die RNA von DNA zu reinigen wurde ein DNA-Verdau mittels
DNAse durchgeführt. Auf den Filter wurden 80 µl DNAse gegeben, die vorher im Verhältnis
von 1:7 mit RDD-Puffer frisch angesetzt wurde. Die DNAse wurde 15 min bei
Raumtemperatur inkubiert. Daraufhin folgte ein weiterer Waschschritt mit RW-1-Puffer (s.o.)
sowie zwei weitere Aufreinigungen mit jeweils 500 µl RPE-Puffer. Dem letzten Waschschritt
mit RPE-Puffer schloss sich eine Zentrifugation von 2 min an. Zum Schluss wurde das FilterSystem in ein neues 1,5 ml Sammelröhrchen eingebracht und die im Filter befindliche RNA
mittels 40 µl RNAse freiem Wasser eluiert. Dazu wurde das RNAse freie Wasser direkt auf
die Glasfieber-Membran pipettiert und für 1 min bei 14000 x g zentrifugiert. Die so
gewonnene Gesamt-RNA wurde direkt nach der letzten Zentrifugation auf Eis gelagert. Die
63
Material und Methoden
Reinheit und Konzentration der gewonnenen RNA wurde im Eppendorf Biophotometer (9.2)
über die Extinktion bei 260 nm und 280 nm ermittelt. Zur Messung im Photometer wurden
die Proben 1:50 in TE-Puffer (3.6) verdünnt und in UltraVetten (8,5 mm, 9.4) pipettiert. Die
Reinheit der RNA-Proben wurde über den Quotienten der optischen Dichte bei 260 nm und
280 nm beurteilt. Als akzeptabel galten Quotienten von 1,9 bis 2,1. Niedrigere Quotienten
wiesen auf eine Verunreinigung mit Proteinen hin. Die Konzentration (C) in µg/ml wurde
anhand der optischen Dichte bei 260 nm (OD260) nach folgender Formel berechnet:
C[µg/ml] = OD260 x 50
Nach der Beurteilung der Reinheit und der Bestimmung der Konzentration wurden die Proben
einheitlich auf 30 ng Gesamt-RNA pro µl eingestellt. Anschließend wurde die RNA entweder
sofort in cDNA umgeschrieben oder bei -95°C gelagert.
Synthese von cDNA durch Reverse Transkription
In der Reversen-Transkriptase-Reaktion wurde die aus den Zellen gewonnene RNA durch das
Enzym Superscript™ II Reverse Transcriptase (9.5) in komplementäre cDNA umgeschrieben.
Um ausschließlich die für die Genexpressionsanalyse relevante mRNA in cDNA
umzuschreiben, wurden Oligo–(dt)12-18–Primer (9.5) verwendet, die sich an das Poly-AEnde der mRNA Moleküle anlagerten und damit als Startregion für die Reverse Transkriptase
dienten. In einem 200 µl Reaktionsgefäß (9.4) wurden 10 µl der RNA, 1 µl Oligo-(dt)1 2-18Primern und 1 µl Trinukleotiden gemischt. Die Komponenten wurden für 5 Min. bei 65°C im
Biometra T-Gradient (9.2) zum Auffalten von Sekundärstrukturen der RNA inkubiert. Im
Anschluss daran wurden die Proben sofort auf Eis gestellt und jeweils 7 µl des in der
Zwischenzeit hergestellten Mastermix (Tab. 4) hinzugefügt. Es folgte eine zweite Inkubation
bei 42°C für 2 Min., um das Temperaturoptimum für die Reverse Transkriptase zu erreichen.
Durch Zugabe von 1 µl (200 U) SuperScriptTM II Reverse Transkriptase in den
Reaktionsansatz und nachfolgender Inkubation bei 42°C für 50 Min. erfolgte die ReverseTranskriptase-Reaktion. Zum Stoppen der Reaktion und um eine Interaktion der bei der
Umschreibung verwendeten Enzyme mit denen der nachfolgenden PCR zu vermeiden, wurde
abschließend eine Enzym-Denaturierung bei 70°C für 15 Min. durchgeführt. Die so
gewonnene einzelsträngige cDNA konnte für 14 Tage im Kühlschrank oder für mehrere
Monate bei -20°C gelagert werden.
64
Material und Methoden
Tab. 4:
Mastermix für die Umschreibung von mRNA in cDNA.
Reagenz
Volumen
Endkonzentration
4,0 µl
5 x First-Strand-Buffer (250 mmol/l Tris-HCl,
375 mmol/l KCl, 15 mmol/l MgCl2)
RNase Inhibitor (RNaseOUTTM)
1,0 µl
40 IU
Reduktionsmittel (DTT, Dithiothriol)
2,0 µl
0,1 mol/l
3.14.1
Herstellung externer Standardreihen für die real time PCR
Im Rahmen dieser Arbeit wurde die Genexpression durch eine absolute Quantifizierung der in
der quantitativen real time PCR (3.14.2) gemessenen Produkte vorgenommen. Dazu wurde
von jeder Zielsequenz ein externer Standard, ein so genanntes Messplasmid hergestellt. Es
wurden Genabschnitte der jeweiligen Zielkomponenten mit spezifischen Primern amplifiziert
und in einen Vektor (3.9) kloniert. Mit dem rekombinanten Plasmid wurde ein chemisch
kompetenter E. coli-Stamm transformiert, in dem das Plasmid vervielfältigt wurde. Nach
Extraktion aus den Bakterien wurden Länge und Sequenz des klonierten Genabschnitts
verifiziert. Standardreihen der linearisierten Messplasmide wurden parallel zu den Proben in
der qrtPCR gemessen und zur Berechnung der Kopienzahl der jeweiligen Gene herangezogen.
Gewinnung der Zielsequenzen
Die für die Klonierung erforderlichen Sequenzen der zu untersuchenden Komponenten
wurden aus cDNA boviner Zellen erhalten. Dazu wurden bovine mononukleäre Zellen
(MNC) und bovine MdM wie in (3.11) beschrieben isoliert und kultiviert. Die Produktion von
Zytokinen und Chemokinen wurde durch die Stimulation der Zellen mit Lipopolysaccharid
(LPS, 5 µg/ml) (9.5) angeregt. Die RNA der Zellen wurde wie unter (3.14) beschrieben
extrahiert und in cDNA umgeschrieben.
65
Material und Methoden
Amplifikation der cDNA mittels konventioneller rtPCR
Die Amplifikation der Zielsequenzen für die nachfolgende Klonierung erfolgte mittels
konventioneller PCR in einem Biometra T-Gradient Gerät (9.2) Für jede Zielsequenz wurde
eine PCR-Reaktion mit 5 µl cDNA und dem in Tab. 5 dargestellten Mastermix in einem
sterilen 200 µl PCR-Röhrchen angesetzt. Zu Beginn der PCR wurde die cDNA für 3 Min. bei
94°C vollständig denaturiert. Danach erfolgten 30 Zyklen, die sich aus einem
Denaturierungsschritt für 45 Sek. bei 94°C, der Primer-Anlagerung für 30 Sek. bei 58°C und
der Verlängerung des Produkts für 1 Min. 30 Sek. bei 72°C zusammensetzten. Abschließend
erfolgte die finale Extension für 10 Min. bei 72°C, um sicherzustellen, dass der für die
nachfolgende Klonierung erforderliche Adeninüberhang am 3`Ende des Amplikons durch die
Taq-Polymerase synthetisiert wird. Die Proben wurden unmittelbar nach Ablauf der PCR für
die Klonierung verwendet.
Tab. 5:
Mastermix für Biometra T-Gradient.
Reagenz
Volumen
Endkonzentration
10x PCR Rxn Puffer minus MgCl2 5 µl
1x
10 mmol/l dNTP Mixtur
1 µL
0,2 mmol/l
50 mmol/l MgCl2
1,5 µl
1,5 mmol/l
Primer Mix (jeweils 10 µmol/l)
2,5 µl
0,5 µmol/l
Taq Polymerase (5 U/µl)
0,25 µl
1U
RNAse/DNAse-freies Wasser
34,75 µl
Klonierung der Zielsequenz in den Vektor
Zur weiteren Vervielfältigung der Zielsequenz wurde diese in ein Plasmid kloniert, das
nachfolgend zur Transformation von Bakterien genutzt wurde. Plasmide sind ringförmige,
doppelsträngige
DNA-Moleküle,
die
in
der
Bakterienzelle
unabhängig
von
der
chromosomalen DNA vermehrt werden. In dieser Arbeit wurde das Plasmid pCR®2.1TOPO® (3.9) mit einer Länge von 3931 Nukleotiden verwendet. Es verfügt sowohl über ein
Gen für Ampicillinresistenz als auch über ein lacZ Gen an der Ligationsstelle. Bei der
TOPO® Cloning Reaktion wurden 3 µl des frischen PCR Produktes, 1 µl Salzlösung, 1 µl
Quantitative Real time PCR (qrtPCR) Wasser (RNase-/DNase-frei) mit 1 µl TOPO® Vektor
66
Material und Methoden
für 15 Min. bei Raumtemperatur inkubiert. Die Reaktion wurde nach Ablauf der
Inkubationszeit umgehend für die Transformation chemisch kompetenter E. coli verwendet.
Transformation chemisch kompetenter E. coli
Nach der Ligation erfolgte die Transformation des Plasmids in chemisch kompetente E. coli
(non-K-12 Wildtyp, W-Stamm, ATCC # 9637, S.A. Waksman). Das Einbringen des Vektors
erfolgte mittels Hitzeschocktransformation. Dazu wurden 2 µl des frischen Ligationsansatzes
mit 50 µl der Bakterien gemischt und für 30 Min. auf Eis inkubiert. Anschließend erfolgt die
Öffnung der Zellwand und Aufnahme der Plasmide durch Hitzeschock bei 42°C im Heizblock
für 30 Sekunden. Nach Zugabe von 250 µl S.O.C. Medium (9.5) wurde der Ansatz für 1
Stunde auf einem Schüttler bei 37°C und 200 rpm inkubiert. In dieser Zeit konnten die
transformierten Bakterien, die das Gen für die Ausbildung einer Ampicillinresistenz mit dem
Vektor erhalten hatten, die Antibiotika-Resistenz ausbilden, bevor sie auf einer vorgewärmten
LB-Agarplatte (9.4) ausplattiert und über Nacht bei 37°C inkubiert wurden. Nur diejenigen
Bakterien, die erfolgreich mit dem Plasmid transformiert wurden, konnten sich zu Kolonien
auf dem Ampicillin-haltigen Agar entwickeln. Um zusätzlich eine Aussage darüber treffen zu
können, ob das transformierte Plasmid rekombinant ist, also die Zielsequenz enthält, besaß
der Vektor ein lacZ-Gen, das für das Enzym β-Galaktosidase kodiert. Innerhalb dieses Genes
lag der Ligationsbereich des Vektors, so dass bei einer erfolgreichen Ligation dieses Gen
nicht mehr funktionsfähig war. Dem Festagar wurden x-Gal (9.5), ein chromogenes Substrat
für ß-Galaktosidase, das bei Umsetzung blau erscheint, sowie IPTG (9.5), ein GalaktoseDerivat, das als künstlicher Induktor des Laktose Operons fungiert und nicht in den
Metabolismus der Bakterien eingeht, beigesetzt. So konnten die Bakterienkolonien mit
erfolgreich ligierten Plasmid das x-Gal nicht umsetzen und erschienen weiß, während die
Kolonien mit intaktem lacZ-Gen durch IPTG Galaktosidaseaktivität entwickelten und durch
die Umsetzung von x-Gal eine blaue Färbung aufwiesen. Dies ermöglicht die Vorselektion
der gewünschten Bakterienkolonien, die dann direkt isoliert und in LB-Flüssigmedium (3.6)
vermehrt wurden.
67
Material und Methoden
Extraktion der Plasmide
Zur Untersuchung des Vorhandenseins rekombinanter Plasmide in den Bakterien wurden
einzelne Kolonien in 3 ml Ampicillin-haltiges Medium überführt und für 12-16 h bei 37°C
und 225 rpm auf dem Schüttler inkubiert. Jeweils 1 ml der Suspension wurde bei 4°C bis zum
Abschluss der Untersuchungen aufbewahrt, um ggf. für die Herstellung eines Glyzerolstocks
zur Verfügung zu stehen. Die verbleibenden 2 ml der Bakteriensuspension wurden für die
Plasmidextraktion mit dem QIAprep Spin Miniprep Kit (9.5) verwendet.
Die Methode basiert auf einer Lyse der Bakterien unter alkalischen Bedingungen
(BIRNBOIM u. DOLY 1979) und der anschließenden Adsorption der DNA auf einer SilicaMembran in einem System aus einer Mini-Säule und einem Auffangbehälter. Die Bakterien
wurden dafür zunächst für 10 Min. bei 8500 x g pelletiert und der Überstand abgenommen.
Das Bakterienpellet wurde in 250 µl Puffer P1 resuspendiert und in ein 1,5 ml EppendorfGefäß überführt. Anschließend wurden 250 µl Puffer P2 hinzugefügt und durch mehrmaliges
Schwenken durchmischt. Zur Kontrolle war dem Puffer P1 Lyse-Blau-Reagenz zugesetzt, die
in P1 präzipitert und sich bei Mischung mit P2 löst und blau erscheint. Die Proben wurden
solange geschwenkt bis sie eine gleichmäßige blaue Färbung aufwiesen. Nach Zugabe von
350 µl Puffer N3 wurde die Probe unter mehrmaligem Schwenken farblos. Danach erfolgte
eine 10-minütige Zentrifugation bei 16000 x g. Der Überstand wurde dann in ein im Kit
enthaltenes Säulen-System pipettiert und nochmals 1 Min. bei 16000 x g zentrifugiert und der
Durchlauf verworfen. Das Säulen-System wurde anschließend einmal mit 500 µl Puffer PB (1
Min., 16000 x g) und ein zweites Mal mit 750 µl Puffer PE (1 Min., 16000 x g) gewaschen,
der Durchlauf wurde jedes Mal verworfen. Zur Entfernung von Waschpufferresten wurde die
Probe einmal leer zentrifugiert. Die Säule wurde dann in ein frisches Eppendorf-Gefäß gesetzt
und mit 50 µl Puffer EB beschickt. Nach einer Inkubation von 1 Min. wurde das Plasmid bei
16000 x g über 1 Min. eluiert. Das Vorhandensein der klonierten Sequenz in den extrahierten
Plasmiden wurde umgehend in der konventionellen PCR und mittels anschließender
Agarosegelelektrophorese
(s.u.)
überprüft.
Bakterienkolonien,
die
das
gewünschte
rekombinante Plasmid enthielten, wurden für die Anlage eines Glyzerolstocks (850 µl
Bakteriensuspension + 50 µl Glyzerol) in 1 ml Kryoröhrchen verwendet. Die Bakterienstocks
wurden bei -95°C eingefroren. Zur Überprüfung der Vollständigkeit der klonierten Sequenz
68
Material und Methoden
wurden 600-700 ng der Plasmid-DNA mit 5 pmol M13 Vorwärtsprimer aus dem TOPO
Cloning Kit zur Sequenzierung (SEQLAB, Göttingen) eingeschickt.
Agarose-Gelelektrophorese
Die amplifizierten DNA-Fragmente wurden mittels Agarose-Gelelektrophorese aufgetrennt
und mit dem Farbstoff DNA Star sichtbar gemacht. Anhand eines mitglaufenen
Größenstandards konnte geprüft werden, ob die Größen der Amplifikate mit denen der
klonierten Zielsequenzen übereinstimmen. Im elektrischen Feld wandern die DNA-Fragmente
abhängig von ihrer Größe, der Stromstärke und der Spannung, den Pufferbedingungen und
der Agarose-Konzentration im Gel unterschiedlich schnell und weit. Je kleiner die
aufzutrennenden Fragmente sind desto schneller bewegen sie sich im elektrischen Feld. Der
dem Gel zugesetzte Farbstoff interkaliert mit der doppelsträngigen DNA, wodurch diese im
UV-Licht sichtbar werden. Das Agarosegel wurde wie unter 3.6 beschrieben hergestellt und
in die Gelelektrophoresekammer, in die ein Kamm für die Probetaschen gesteckt war,
gegossen. Nach Erkalten des Gels wurde der Kamm herausgezogen. Auf einem Stück
Parafilm wurden 10 µl der DNA-Probe mit 4 µl Blaumarker (3.6) gemischt und dann in die
entsprechende Probentasche des Gels gegeben. Der Blaumarker ermöglichte zum einen die
Kontrolle der Lauffront während der Gelelektrophorese, zum anderen wurde durch das in ihm
enthaltene Glycerin die Probe beschwert und sank besser in die Probentasche ab. In eine
Tasche des Gels wurden 3 µl eines 50 bp-DNA-Längenstandards (9.5) zur Bestimmung der
Größe der DNA-Fragmente pipettiert. Die Agarose-Gelelektrophorese wurde in 1x TBE
Laufpuffer bei einer Spannung von 85 V über 45 Min. durchgeführt. Anschließend wurden im
UV-Licht die Banden kontrolliert und mit einem Gel-Imager (9.2) fotografiert (Abb. 4).
69
Material und Methoden
Länge
(bp)
2652
800
350
150
Lä
n
ge
n
sta
nd
ard
PP
AR
γ
IL10
50
Abb. 4:
Kontrolle der Messplasmide im Agarosegel.
Fotografie der Messplasmide nach konventioneller PCR in 3%-igem Agarosegel unter UVLicht. Kontrolle der Produktlänge in Basenpaaren (bp) durch mitgeführten Längenstandard.
Linearisierung der Messplasmide
Aufgrund der physikalisch schlechteren Bindung der Primer an das ringförmige Messplasmid
wird die dsDNA liniarisiert. Es wurden nur Restriktionsenzyme gewählt, deren Schnittstellen
sich nicht in den Zielsequenzen befanden, um eine Fragmentierung der gewünschten Gene zu
vermeiden. Verwendet wurde für die Linearisierung von Messplasmiden mit IL-1ß, IL-10,
PPARγ, PTX3, CCL5 und CCL20 das Restriktionsenzym Hind III, welches zwischen den
Basen 5'- A↓AGCTT-3' und 3'-TTCGA↑A-5'schneidet. Für TNF-α und CXCL 8-enthaltende
Messplasmide wurde das Restriktionsenzym Sca I verwendet (Schnittstellen: 5'-AGT↓ACT-3'
und 3'-TCA↑TGA-5'). Hind III wurde aus Haemophilus influenzae Rd und Sca I aus
Streptomyces caespitosus isoliert. Zusammen mit dem 10-fach konzentrierten Puffer „REact®
2“ (9.5) schneiden die Restriktionsenzyme 1 µg der dsDNA in einer Stunde bei 37°C. Nach
der Linearisierung wurde das Amplikon mit dem QIAquick® PCR Purification Kit (9.5)
70
Material und Methoden
aufgereinigt. Das Kit entfernt über ein System von Wasch- und Trennsäulen enzymatische
Rückstände und adsorbiert die DNA unter alkalischen Bedingungen (pH≥7,5) an eine SilicaMembran. Alle Zentrifugationsschritte fanden über 1 Min. bei 16000 x g und
Raumtemperatur statt. Zunächst wurde die Probe in einem Eppendorf-Gefäß im Verhältnis
1:6 mit Puffer PBI gemischt. Das Einhalten des pH-Werts von ≥7,5 wurde durch die gelbe
Farbe der Lösung angezeigt. Die Probe wurde auf ein mitgeliefertes Säulen-System gegeben
und zentrifugiert. Nach Verwerfen des Durchlaufs wurde die Säule einmal mit 750 µl Puffer
PE gewaschen und einmal leer zentrifugiert. Der Durchlauf wurde jedes Mal verworfen. Für
die Elution der DNA wurde die Säule in ein frisches Eppendorf-Gefäß gesetzt, mit 50 µl
Puffer EB bestückt und zentrifugiert. Von den aufgereinigten Messplasmiden wurden nach
der Prüfung der Reinheit umgehend Verdünnungsreihen hergestellt.
Berechnung der Kopienzahl
Für die Herstellung einer Verdünnungsreihe der Messplasmide musste die Anzahl der Kopien
pro µl bestimmt werden. Durch die Messung der optischen Dichte bei 260 nm (OD260) am
Eppendorf Biophotometer wurde die Konzentration (C) der doppelsträngigen Plasmid-DNA
entsprechend der oben beschriebenen Formel (3.14) berechnet. Mittels dieser Information und
der bekannten Länge der Zielsequenz war es möglich, die genaue Kopienzahl mit folgender
Formel zu errechnen:
MW = P x 660g/mol
S[Kopien/µL] =
MW
P
S
DNA
660 g/mol
6x1023[Kopien/mol] x DNA[g/µL]
MW[g/mol]
= Molekulargewicht des PCR-Produkts
= PCR-Produktlänge in Basenpaaren
= Standardkonzentration
= im Photometer gemessene DNA Konzentration
= Durchschnittliches molekulares Gewicht der Basen
Aus der Stocklösung mit der berechneten Anzahl von Kopien pro µl wurde eine
Verdünnungsreihe hergestellt (109–100 Kopien/µl), die anschließend in der real time PCR
71
Material und Methoden
getestet wurde. Die Standardreihe wurde bei -20°C gelagert. Nach 3-maligem Auftauen
wurden die Verdünnungen verworfen und neu angesetzt.
3.14.2
Quantitative real time PCR (qrtPCR)
Prinzip der qrtPCR
Bei der qrtPCR findet eine Quantifizierung der PCR-Produkte in „Echtzeit“, das heißt
während der Amplifikationszyklen statt. In den Reaktionsansätzen befindet sich der Farbstoff
SYBR Green, der nach der Anlagerung an die kleine Windung doppelsträngiger DNA grün
fluoresziert. Die Fluoreszenz steht dabei in direktem Verhältnis zur Menge der amplifizierten
DNA und wird über die gesamte Laufzeit durch die StepOneTM Software Version 2.0
aufgezeichnet. Wie eine konventionelle PCR besteht auch die qrtPCR aus der Wiederholung
der drei Reaktionsschritte: 1) Aufschmelzen der doppelsträngigen DNA, 2) Anlagerung der
Primer und 3) Verlängerung des Produkts. Der Ablauf der drei Reaktionsschritte wird als
Zyklus bezeichnet. Eine vollständige PCR umfasst 40 bis 50 Zyklen. In den frühen Zyklen der
PCR kommt es lediglich zu einem basalen Fluoreszenzsignal, das auch als Hintergrundsignal
bezeichnet wird. In Abhängigkeit von der initialen Menge an DNA im Reaktionsansatz steigt
nach einer bestimmten Zyklenzahl die Fluoreszenz des PCR-Produkts exponentiell an. Der
Zyklus, an dem die Fluoreszenz aus dem Hintergrundsignal in eine exponentielle Phase
übergeht, wird als Cycle threshold (Ct) (Abb. 5, A) bezeichnet und korreliert direkt mit der
ursprünglichen Kopienzahl der Proben. Die exponentielle Phase geht im weiteren Verlauf der
PCR aufgrund von Inhibition durch Reaktionsprodukte und Enzymlimitierung zunächst in
eine lineare Phase und letztendlich in eine Plateauphase über (Abb. 5, A). Da SYBR Green
unspezifisch an jede doppelsträngige DNA bindet, muss nach den Amplifikationszyklen eine
Schmelzkurvenanalyse durchgeführt werden (Abb. 5, B). Dabei werden die Proben
schrittweise denaturiert. Abhängig von der Größe der Amplifikationsprodukte zerfallen diese
zu einem bestimmten Zeitpunkt und es findet ein schlagartiger Abfall der Fluoreszenz statt.
Befinden sich verschiedene Produkte im Reaktionsansatz, wird dies durch eine mehrgipfelige
Schmelzkurve sichtbar.
72
Material und Methoden
B 3,0
Derivative Reporter (-Rn)
A
∆ Rn
Plateau-Phase
Ct-Wert
2,0
1,5
1,0
0,5
65
75
80
85
90
Temperatur (°C)
Cycle
Abb. 5:
70
Amplifikations-Plot und Schmelzkurve einer qRT-PCR.
A. Amplifikation (Steigung der SYBR Green-Fluoreszenz (∆ Rn)) von Messplasmiden des
Chemokins CCL5 in den Verdünnungen 1x103 Kopien bis 1x107 Kopien über 40 Zyklen.
Eintritt in die exponentielle Phase am Ct-Wert, und Übergang in die Plateau-Phase am Ende
der Amplifikation. B. Exemplarische Darstellung einer Schmelzkurve von CCL5 in der ersten
negativen Ableitung des Reporter-Farbstoffs SYBR Green (Derivative Reporter(-Rn))
aufgetragen gegen die Temperatur mit einem einheitlichen Peak bei 82,3°C.
Primeroptimierung
Die optimale Konzentration von Vorwärts- und Rückwärts-Primern ist je nach Primer und
Gerät unterschiedlich. Daher wurden vor der Messung der Proben die optimalen PrimerKonzentrationen für die zu untersuchenden Gene ermittelt. Entsprechend der Matrix aus Abb.
9 wurde für jede Konzentration ein Duplikat aus der Standardreihe (1000 Kopien/µl,
Positivkontrolle) und ein Duplikat DNase/RNase freies Wasser (Negativkontrolle) eingesetzt.
Ausgewählt wurde diejenige Kombination von Vorwärts- und Rückwärts-PrimerKonzentration, bei der eine höchstmögliche Sensitivität bei niedriger oder fehlender
Amplifikation in der Negativkontrolle vorlag.
73
Material und Methoden
Vorwärts-Primer (nmol/L)
Rückwärts-Primer (nmol/L)
Abb. 6:
50
300
900
300
900
Matrix für die Primeroptimierung.
Kombination der einzelnen Konzentrationen von Vorwärts- und Rückwärts-Primern (nmol/l).
Messung unbekannter Proben
In der qrtPCR wurde die Beeinflussung der Genexpression der Chemokine CXCL 8, CCL 20
und CCL5, der Zytokine TNF-α, IL-1ß und IL-10, sowie des Akute Phase Proteins PTX3 in
bovinen MdM nach Zusatz von PGE2 allein und in Kombination mit LPS untersucht.
Zusätzlich wurde die Expression des Transkriptionsfaktors PPARγ in MdM gemessen. Für die
Durchführung wurde der SYBR Green® PCR Master Mix verwendet. Die Proben wurden wie
in 3.14 beschrieben extrahiert, auf eine Konzentration von 30 ng/µl Gesamt-RNA eingestellt
und in cDNA umgeschrieben. Für jede Messung wurden mindestens fünf Punkte der
Standardreihe (100 Kopien–106 Kopien) und eine Negativkontrolle (Mastermix + Wasser)
eingesetzt. In eine Micro Amp TM Fast 96-well PCRPlatte wurde pro Vertiefung jeweils 1 µl
cDNA und 24 µl des entsprechenden Mastermix (Tab. 6 und Tab. 7) pipettiert. Alle Ansätze
wurden in Duplikaten angelegt. Zu Beginn der PCR wurden die Proben zur vollständigen
Denaturierung der DNA einmalig für 10 Min. auf 95°C erhitzt. Danach erfolgten 40 Zyklen
mit je einer Denaturierung der Proben bei 95°C über 15 Sekunden und der Anlagerung der
Primer und der Verlängerung des Produkts bei 60°C über 1 Min. Nach Ablauf der
Amplifikationszyklen wurde eine Schmelzkurvenanalyse durchgeführt. Dabei wurden die
Proben von 60°C in Schritten von 0,3°C unter ständiger Aufzeichnung der Fluoreszenz auf
95°C erhitzt.
74
Material und Methoden
Tab. 6:
Mastermix für IL-1ß, TNF-α, CCL5, IL-10, PTX3 und PPARγ, Volumen in µl pro
Reaktion.
Reagenz
Volumen (µl)
SYBR Green® PCR Master Mix
12,5
Wasser (RNAse-DNAse-frei)
8,5
Vorwärts-Primer (5 µmol/l)
1,5
Rückwärts-Primer (5 µmol/l)
1,5
Tab. 7:
Mastermix für CXCL8 und CCL20, Volumen in µl pro Reaktion.
Reagenz
Volumen (µl)
SYBR Green® PCR Master Mix
12,5
Wasser (RNAse-DNAse-frei)
9,75
Vorwärts-Primer (5 µmol/l)
1,5
Rückwärts-Primer (5 µmol/l)
0,25
Auswertung
Die StepOneTM Software zeichnete die Fluoreszenz von SYBR Green auf und legte für die
einzelnen Proben die Ct-Werte fest. Für die eingesetzten Punkte des externen Standards mit
bekannter Kopienzahl wurden ebenso die Ct-Werte festgelegt. Durch die logarithmische
Darstellung der ermittelten Ct-Werte (Ct) gegen die Kopienzahl der Standardpunkte entstand
eine Standardkurve (Regressionsgerade) anhand derer die in den Proben enthaltene
Kopienzahl abgeleitet wurde. Zur Validierung der PCR wurden die Parameter Steigung der
Regressionsgraden, Effizienz, Bestimmtheitsmaß (R2) und Güte der Schmelzkurve
herangezogen. Aus der von der Software berechneten Steigung der Gerade lässt sich die
Effizienz der Amplifikation ermitteln. Bei einer Steigung von -3,32 liegt eine 100%ige
Effizienz der Amplifikation vor, das heißt das Produkt verdoppelt sich in jedem Zyklus.
Steigungen von -3,1 bis -3,6 (entspricht einer Effizienz von 90-110%) gelten als auswertbar
75
Material und Methoden
(Abb. 7). Ist die Amplifikation nicht ausreichend effizient, so können die Ausgangsmengen
nicht exakt berechnet werden. Zusätzlich wird von der Software das Bestimmtheitsmaß (R2)
berechnet. So kann der lineare Zusammenhang zwischen Ct-Werten und eingesetzter
Kopienzahl überprüft werden, dabei sollte R2 Werte >0.985 annehmen. Bei der Analyse der
Schmelzkurve durfte lediglich ein einzelner Peak auftreten, um sicherzustellen, dass nur ein
Produkt amplifiziert wurde (Abb. 5, B). Nur wenn die genannten Parameter den
vorgegebenen
Kriterien
entsprachen,
wurden
die
von
der
Software
nach
der
Regressionsgerade berechneten Kopienzahlen der unbekannten Proben für die weitere
Auswertung verwendet.
30
Ct
26
22
18
14
102
103
104
105
106
107
Quantity
Abb. 7:
Regressionsgerade einer Standardreihe in der qrtPCR.
Dargestellt sind Messplasmide des Chemokins CCL5 in den Verdünnungen 1x102 Kopien bis
1x107Kopien. Die Ct-Werte (Cycle threshold) sind gegen die Kopienzahlen aufgetragen und
ergeben die Regressionsgerade mit der Steigung s = -3,429; einer Eiffizienz von 102% und
mit R2 = 0,999.
76
Material und Methoden
3.15 Statistische Auswertung
Die statistische Auswertung wurde mithilfe des Programms SAS 9.1 (SAS Institute Inc.,
Cary/North Carolina, USA, 1988) und Microcal Origin durchgeführt. In der deskriptiven
Statistik wurden die Daten mit dem Shapiro-Wilk-Test sowie mit dem KolmogorowSmirnow-Test auf Normalverteilung geprüft. Normalverteilte Daten wurden durch Mittelwert
und Standardfehler beschrieben und dargestellt. Nicht normalverteilte Daten wurden durch
Minimal- und Maximalwerte, das obere und untere Quartil sowie den Median charakterisiert
und in Boxplots dargestellt (Abb. 8).
40
Messwerte
35
Maximum
30
25
75%
20
15
10
25%
Median
Minimum
5
Parameter
Abb. 8:
Exemplarische Darstellung eines Boxplots.
Exemplarische Darstellung von Messwerten eines Parameters in einem Boxplot. Die
zentralen 50% der Daten befinden sich in der Box, in der der Median durch eine horizontale
gekennzeichnet ist.
Um zu überprüfen, ob sich in voneinander abhängigen Stichproben zwei qualitative
Merkmale bezüglich eines quantitativen Merkmals voneinander unterscheiden, wurde bei
normalverteilten Daten der gepaarte Student´s t-Test angewendet, bei nicht normalverteilten
Daten wurde der Wilcoxon Signed-Rank Test verwendet. Um mehr als zwei qualitative
Merkmale bezüglich eines quantitativen Merkmals untereinander zu vergleichen, wurde bei
den abhängigen Stichproben die 1-faktorielle Varianzanalyse für wiederholte Messungen
durchgeführt (normalverteilte Daten) bzw. der Friedmann ANOVA für nicht normalverteilte
Daten. Wurden bei der Varianzanalyse Unterschiede zwischen den Klassen festgestellt, wurde
77
Material und Methoden
durch multiple Mittelwertsvergleiche nach Bonferroni untersucht, zwischen welchen Klassen
die Unterschiede bestanden.
Die Daten der Analyse der Immunfluoreszenz an Makrophagen wiesen keine stetige
Verteilung auf. Daher wurden die Daten dieses Versuches mit dem Chi Quadrat
Homogenitätstest bezüglich der einzelnen Ansätze auf Signifikanzen überprüft.
Unterschiede zwischen Parameterklassen mit einer Irrtumswahrscheinlichkeit (p) von ≤ 0,05
wurden als signifikant angesehen.
78
Ergebnisse
4 Ergebnisse
4.1 Semiquantitative histologische Auswertung von
Immunzellpopulationen in der bovinen Zitze
Morphologie der Fürstenberg’schen Rosette und Zitzenzisterne
Die Fürstenberg’sche Rosette besaß eine stark gefältelte Schleimhaut mit einem
zweischichtigen, hochprismatischen Epithel (Abb. 9). Während das Epithel bei den
eutergesunden Färsen (Gruppe K1) ein homogenes Aussehen hatte, zeigte es sich bei den
Tieren des Primingversuchs deutlich vakuolisiert (Abb. 13). Das subepitheliale wie auch das
perivaskuläre Bindegewebe war bei der Gruppe K1 ausgesprochen zellreich (Abb. 9, A, C, E).
Diese Gruppe wies unter allen betrachteten Tiergruppen die höchste Dichte an Immunzellen
auf. Dagegen waren nur wenige Kollagenfasern ausgebildet. Bei den laktierenden Tiere
(Gruppen K2 und V) war das Bindegewebe von einer geringeren Anzahl an Immunzellen
infiltriert (Abb. 9, B, D, F). Stattdessen nahm der Kollagenfasergehalt von den Tieren der
Versuchsgruppen (V1a-V2b) zu den pluriparen Kontrolltieren (K2) zu.
In der Zitzenzisterne wies die Schleimhaut eine annähernd glatte Oberfläche auf, die ebenfalls
von einem zweireihigen, hochprismatischen Epithel bedeckt war. Die Morphologie des
Epithels und des Bindegewebes einschließlich der Gruppenunterschiede entsprach den
Verhältnissen in der Fürstenberg’schen Rosette.
In der Zitze des Rindes wurden in der Fürstenberg’schen Rosette und in der Zitzenzisterne
Mastzellen, neutrophile Granulozyten, Makrophagen, Lymphozyten und Plasmazellen
gefunden. Im Folgenden werden die vorkommenden untersuchten Zelltypen einzeln
beschrieben.
Mastzellen
Mastzellen wiesen in der Toluidinblaufärbung metachromatisch violette Granula im
Zytoplasma auf. Die geschlungene Struktur der Fürstenberg’sche Rosette mit einem intakten,
zweireihigen Epithel sowie subepithelial gelegenen Zellinfiltraten, die Mastzellen (lila)
enthalten, zeigt Abbildung 9. Die Zellen waren mit Abstand in größter Zahl bei den Rindern
der Gruppe K1 zu finden (Häufigkeitswerte 2,3 bis 2,5; Tab. 8). In dieser Tiergruppe stellten
79
Ergebnisse
Mastzellen die am häufigsten auftretende Immunzellpopulation dar. Im Vergleich dazu waren
in Gruppe K2 deutlich weniger Mastzellen zu finden (0,9 bis 1,1), noch weniger bei den
Tieren des Primingversuchs (0,0 bis 0,9). Bei allen Gruppen kamen jeweils annähernd gleich
viele Mastzellen in den Bereichen Fürstenberg’sche Rosette und Zitzenzisterne vor.
Subepithelial waren meist etwas mehr Mastzellen vorhanden als perivaskulär (Abb. 9 und
Abb. 10, Tab. 8).
80
Ergebnisse
A
B
C
D
E
F
Abb. 9:
Subepitheliale Mastzellen im Bereich der Fürstenberg’schen Rosette.
A, C, E: Gruppe K1 (Färsen) Tier Nr. 2, Viertel vorne links; (A) und (C), E: Tier Nr. 1, Viertel
vorne links, B: Gruppe V2a (240 h geprimte, nicht infizierte Viertel), Tier Nr. 15, Viertel hinten
rechts, D: Gruppe K2 (adulte, laktierende Rinder) Tier Nr. 9, Viertel vorne rechts; F: Gruppe
K2 (adulte, laktierende Rinder), Tier Nr. 4, Viertel hinten links; alle Toluidinblau-Färbung,
Pfeil: Blutgefäß mit wenig perivaskulären Zellansammlungen.
81
Ergebnisse
A
Abb. 10
B
Perivaskuläre Mastzellen in der Zitzenzisterne.
A: Gruppe K1 (Färsen), Tier Nr. 1, Viertel vorne links; B: Gruppe K2 (adulte, laktierende,
eutergesunde Rinder), Tier Nr. 4, Viertel hinten links; alle Toluidinblau-Färbung, Pfeil:
Blutgefäße ohne perivaskuläre Zellansammlungen.
Tab. 8:
Relative Häufigkeiten von Mastzellen in der bovinen Zitze (Fürstenberg’sche
Rosette und Zitzenzisterne).
Mastzellen
subepithelial
Versuchsgruppe1
perivaskulär
FR
ZZ
FR
ZZ
K1 (n=2)
2,5 ± 0,0
2,5 ± 0,0
2,3 ± 0,4
2,3 ± 0,4
K2 (n=7)
1,1 ± 0,6
1,1 ± 0,6
0,9 ± 0,3
1,1 ± 0,7
V1a (n=3-4)*
0,4 ± 0,3
0,3 ± 0,3
0,3 ± 0,3
0,2 ± 0,3
V1b (n=3)
0,5 ± 0,5
0,5 ± 0,5
0,2 ± 0,3
0,3 ± 0,3
V2a (n=4)
0,4 ± 0,5
0,6 ± 0,3
0,3 ± 0,3
0,4 ± 0,3
V2b (n=4-5)**
0,3 ± 0,3
0,7 ± 0,3
0,0 ± 0,0
0,9 ± 0,4
1
Siehe Tab. 1, Mittelwerte und Standardabweichungen der angebenen Tieranzahl (n) von
Mastzellen in der bovinen Zitze, beprobte Viertel siehe Tab. 16, FR=Fürstenberg’sche
Rosette, ZZ=Zitzenzisterne,*FR n=4, ZZ n=3, **FR n=4, ZZ n=5. Relative Häufigkeiten
wurden subjektiv bestimmt (Skala in 0,5-Schritten von 0 bis 3, 3.5).
82
Ergebnisse
Granulozyten
Neutrophile Granulozyten waren von allen betrachteten Zelltypen im geringsten Maße in der
Fürstenberg’schen Rosette und Zitzenzisterne lokalisiert (Abb. 11, Tab. 9). In den Gruppen
K1, V1a sowie V2a waren keinerlei neutrophile Granulozyten zu finden. Lediglich die
Gruppe K2 und die infizierten Tiere des Primingversuches zeigten ein geringes Aufkommen
an Neutrophilen, wobei in Gruppe V2b mehr neutrophile Granulozyten zu finden waren als in
Gruppe V1b. Die neutrophilen Granulozyten waren immer nur subepithelial anzutreffen, nicht
jedoch perivaskulär.
Eosinophile Granulozyten wurden in keiner der betrachteten Tiergruppen gefunden.
Abb. 11: Subepitheliale neutrophile Granulozyten im Bereich der Zitzenzisterne.
Gruppe V1b (72 h geprimte, infizierte Viertel), Tier Nr. 10, Viertel vorne rechts, MassonGoldner-Färbung, Pfeil: neutrophile Granulozyten mit hantelförmigem Zellkern.
83
Ergebnisse
Tab. 9:
Relative Häufigkeiten von neutrophilen Granulozyten in der bovinen Zitze
(Fürstenberg’sche Rosette und Zitzenzisterne).
Neutrophile Granulozyten
subepithelial
1
Versuchsgruppe
perivaskulär
FR
ZZ
FR
ZZ
K1 (n=2)
0,0 ± 0,0
0,0 ± 0,0
0,0 ± 0,0
0,0 ± 0,0
K2 (n=7)
0,3 ± 0,4
0,2 ± 0,4
0,0 ± 0,0
0,0 ± 0,0
V1a (n=3-4)*
0,0 ± 0,0
0,2 ± 0,3
0,0 ± 0,0
0,0 ± 0,0
V1b (n=3)
0,2 ± 0,3
0,3 ± 0,6
0,0 ± 0,0
0,0 ± 0,0
V2a (n=4)
0,0 ± 0,0
0,0 ± 0,0
0,0 ± 0,0
0,0 ± 0,0
V2b (n=4-5)**
0,6 ± 1,3
0,7 ± 0,4
0,0 ± 0,0
0,0 ± 0,0
1
Siehe Tab. 1, Mittelwerte und Standardabweichungen der angebenen Tieranzahl (n) von
neutrophilen Granulozyten in der bovinen Zitze, beprobte Viertel siehe Tab. 16,
FR=Fürstenberg’sche Rosette, ZZ=Zitzenzisterne, *FR n=4, ZZ n=3, **FR n=4, ZZ n=5.
Relative Häufigkeiten wurden subjektiv bestimmt (Skala in 0,5-Schritten von 0 bis 3, 3.5).
Makrophagen
Zur lichtmikroskopischen Bestimmung wurde bei Makrophagen auf morphologische Aspekte
wie schwach basophiles, schaumig vakuolisiertes Zytoplasma sowie einen großen,
exzentrisch gelegenen, bohnenförmigen Zellkern geachtet. Insbesondere sei hier anhand Abb.
12 auf die morphologische Vielgestaltigkeit der Makrophagen hingewiesen: Makrophagen
mit länglich-ovalem Zellkörper, Makrophagen mit langgezogenem Zellkörper mit
Pseudopodien (Pfeil), Makrophagen mit polygonalem Zellkörper ohne Pseudopodien.
Gruppe K1 zeigte das größte Aufkommen an Makrophagen, gefolgt von den Gruppen des
Primingversuches. Insbesondere Gruppe V2b wies eine hohe Zahl an Makrophagen auf. Die
geringste Häufigkeit an Makrophagen war in Gruppe K2 zu finden.
In Gruppe K1 enthielt die Zitzenzisterne die höchste Makrophagendichte (subepithelial: 3,0;
perivaskulär: 2,8). 72 h geprimte Rinder zeigten im subepithelialen Gewebe eine Differenz im
Makrophagenaufkommen zwischen der Fürstenberg’schen Rosette und der Zitzenzisterne
(FR: V1a 1,3; V1b 1,7 – ZZ: V1a 0,7. V2b 1) mit zahlreicheren Makrophagen im Bereich der
Fürstenberg’schen Rosette. Die Tiere des 240 h-Primingversuches bestätigten diese Situation
jedoch nicht. Makrophagen waren bei diesen Tieren wie auch bei Gruppe K2 subepithelial
etwas häufiger in der Zitzenzisterne lokalisiert.
84
Ergebnisse
Bezüglich der Lokalisationen subepitheliales und perivaskuläres Gewebe erwies sich das
perivaskuläre Gewebe in allen Tiergruppen mit geringgradig mehr Makrophagen durchsetzt
als das subepitheliale Gewebe.
Im bindegewebigen Stroma der Fürstenberg’sche Rosette lokalisierte Makrophagen in der
Nähe von Plasmazellen verdeutlicht Abbildung 12.
Abb. 12: Makrophagen in der Nähe zu Plasmazellen in der Fürstenberg’schen
Rosette.
Gruppe V1a (72 h geprimte Viertel), Tier Nr. 13, Viertel hinten rechts, Masson-GoldnerFärbung, horizontale Pfeile: Makrophagen, senkrechte Pfeile: Plasmazellen.
85
Ergebnisse
Tab. 10: Relative Häufigkeiten von Makrophagen in der bovinen Zitze
(Fürstenberg’sche Rosette und Zitzenzisterne).
Makrophagen
subepithelial
1
Versuchsgruppe
perivaskulär
FR
ZZ
FR
ZZ
K1 (n=2)
2,3 ± 0,4
3,0 ± 0,0
2,5 ± 0,7
2,8 ± 0,4
K2 (n=7)
1,0 ± 0,3
1,3 ± 0,6
1,2 ± 0,6
1,2 ± 0,8
V1a (n=3-4)*
1,3 ± 0,3
0,7 ± 0,6
1,6 ± 0,5
1,2 ± 0,8
V1b (n=3)
1,7 ± 0 ,6
1,0 ± 0,5
1,7 ± 0,6
1,8 ± 0,3
V2a (n=4)
1,4 ± 0,6
1,5 ± 0,6
1,1 ± 0,5
2,0 ± 0,0
V2b (n=4-5)**
1,3 ± 0,6
1,8 ± 0,4
1,8 ± 0,6
1,8 ± 0,4
1
Siehe Tab. 1, Mittelwerte und Standardabweichungen der angebenen Tieranzahl (n) von
Makrophagen in der bovinen Zitze, beprobte Viertel siehe Tab. 16, FR=Fürstenberg’sche
Rosette, ZZ=Zitzenzisterne, *FR n=4, ZZ n=3, **FR n=4, ZZ n=5. Relative Häufigkeiten
wurden subjektiv bestimmt (Skala in 0,5-Schritten von 0 bis 3, 3.5).
Lymphozyten
Bei allen Tieren waren in allen untersuchten Lokalisationen der Zitze diffus im Bindegewebe
verteilte Lymphozyten zu finden (Abb. 13). Lymphfollikel waren bei keinem Tier vorhanden.
Jedoch traten bei den Färsen (Gruppe K1) gelegentlich kleinere Lymphozytenansammlungen
direkt unterhalb des Epithels der Fürstenberg’schen Rosette auf, die häufig von Mastzellen
umgeben waren (Abb. 13 A).
Bezüglich der Lymphozytenpopulation war in Gruppe K1 das größte Zellaufkommen
vorhanden (Abb. 13; Tab. 11). Bei den Tieren der anderen Gruppen fanden sich deutlich
weniger Lymphozyten. Die Häufigkeitswerte von Lymphozyten in Gruppe K2 und den LPSPrimingversuchsgruppen waren annähernd gleich hoch.
Mehr Lymphozyten waren im subepithelialen Gewebe als im perivaskulären Gewebe zu
finden (Tab. 11). Dieser Aspekt zeigte sich in allen untersuchten Tiergruppen sowohl in der
Fürstenberg’schen Rosette, als auch in der Zitzenzisterne.
Für die Lokalisation Zitzenzisterne ließ sich, ähnlich wie bei der betrachteten Population an
Plasmazellen, perivaskulär und subepithelial bei den Priming-Versuchsgruppe sowohl durch
längere Primingdauer als auch durch die E. coli Inokulation eine leichte Zunahme an
Lymphozyten feststellen (ZZ subepithelial: 1-1,7; ZZ perivaskulär: 0,7-1,4, Tab. 11).
86
Ergebnisse
A
B
Abb. 13: Subepitheliale Lymphozyten in Assoziation zu Mastzellen in der
Fürstenberg’schen Rosette
A: Gruppe K1 (Färsen), Tier Nr. 1, Viertel vorne links; B: Gruppe V1a (72 h geprimte Viertel),
Tier Nr. 12, Viertel vorne links, beide Toluidinblau-Färbung, Pfeil: subepitheliale
Lymphozytenaggregate.
87
Ergebnisse
Tab. 11: Relative Häufigkeiten von Lymphozyten in der bovinen Zitze
(Fürstenberg’sche Rosette und Zitzenzisterne).
Lymphozyten
subepithelial
1
Versuchsgruppe
perivaskulär
FR
ZZ
FR
ZZ
K1 (n=2)
2,5 ± 0,7
2,8 ± 0,4
1,8 ± 0,4
2,0 ± 0,0
K2 (n=7)
1,4 ± 0,5
1,3 ± 0,6
0,8 ± 0,3
0,8 ± 0,4
V1a (n=3-4)*
1,8 ± 0,9
1,0 ± 1,0
0,6 ± 0,5
0,7 ± 0,3
V1b (n=3)
1,5 ± 1,0
1,3 ± 0,8
0,3 ± 0,3
0,8 ± 0,3
V2a (n=4)
1,1 ± 0,5
1,5 ± 0,6
0,4 ± 0,5
1,1 ± 0,6
V2b (n=4-5)**
1,5 ± 0,8
1,7 ± 0,7
0,8 ± 1,0
1,4 ± 0,7
1
Siehe Tab. 1, Mittelwerte und Standardabweichungen der angebenen Tieranzahl (n) von
Lymphozyten in der bovinen Zitze, beprobte Viertel siehe Tab. 16, FR=Fürstenberg’sche
Rosette, ZZ=Zitzenzisterne, *FR n=4, ZZ n=3, **FR n=4, ZZ n=5. Relative Häufigkeiten
wurden subjektiv bestimmt (Skala in 0,5-Schritten von 0 bis 3, 3.5).
Plasmazellen
Charakteristika zur morphologischer Bestimmung der Plasmazellen waren Aspekte wie
exzentrisch gelegener Kern („Radspeichenstruktur“), ovaler Zellkörper sowie ungranuliertes,
basophiles Zytoplasma mit perinukleärer Aufhellung (Abb. 14).
Von allen betrachteten Tiergruppen hatte Gruppe K1 die größte Anzahl an Plasmazellen (Tab.
12). Adulte, laktierende Rinder (Gruppe K2) zeigten das geringste Plasmazellaufkommen
(0,8-1). Die Tiere des LPS-Primingversuchs wiesen Häufigkeitswerte an Makrophagen
zwischen Gruppe K1 und K2 auf. Bei diesen Tieren (Gruppen V1 und V2) nahm die
Plasmazellzahl in der Zitzenzisterne durch eine längere Primingdauer, besonders deutlich im
subepithelialen Gewebe, zu. Zusätzlich führte die E. coli Inokulation subepithelial und
perivaskulär zu einer Steigerung der Plasmazelldichte.
88
Ergebnisse
Tab. 12: Relative Häufigkeiten von Plasmazellen in der bovinen Zitze
(Fürstenberg’sche Rosette und Zitzenzisterne).
Plasmazellen
subepithelial
1
Versuchsgruppe
perivaskulär
FR
ZZ
FR
ZZ
K1 (n=2)
2,5 ± 0,0
2,5 ± 0,0
2,0 ± 0,0
2,0 ± 0,0
K2 (n=7)
1,0 ± 0,3
0,9 ± 0,4
0,8 ± 0,3
0,8 ± 0,3
V1a (n=3-4)*
1,3 ± 0,3
0,5 ± 0,5
1,5 ± 0,4
1,3 ± 1,4
V1b (n=3)
1,3 ± 0,3
0,8 ± 0,3
1,2 ± 0,8
1,5 ± 0,9
V2a (n=4)
1,4 ± 0,6
1,1 ± 0,8
3,0 ± 0,8
1,8 ± 0,9
V2b (n=4-5)**
1,4 ± 0,9
2,3 ± 0,4
1,4 ± 0,9
2,0 ± 0,7
1
Siehe Tab. 1, Mittelwerte und Standardabweichungen der angebenen Tieranzahl (n) von
Plasmazellen in der bovinen Zitze, beprobte Viertel siehe Tab. 16, FR=Fürstenberg’sche
Rosette, ZZ=Zitzenzisterne, *FR n=4, ZZ n=3, **FR n=4, ZZ n=5. Relative Häufigkeiten
wurden subjektiv bestimmt (Skala in 0,5-Schritten von 0 bis 3, 3.5).
Abb. 14: Subepitheliale Plasmazellen in der Fürstenberg’schen Rosette.
Gruppe V1a (72 h geprimte, nicht infizierte Viertel), Tier Nr. 11, Viertel hinten rechts,
Masson-Goldner-Färbung, Pfeile: Plasmazellen mit randständigem Heterochromatin
(„Radspeichenstruktur“).
89
Ergebnisse
4.2 Semiquantitative Analyse von Makrophagenpopulationen in der
bovinen Zitze mittels Immunhistochemie an adulten, eutergesunden
laktierenden Rindern (K2)
Zur Darstellung von Makrophagen in der bovinen Zitze wurden histologische Paraffinschnitte
von fünf adulten, laktierenden, eutergesunden Rindern (Gruppe K2) mittels zweier
Makrophagen-spezifischer Antikörper (MAC387 und AM-3K) markiert und die Zahl und
Verteilung der Zellen semiquantitativ ausgewertet.
Bei allen Tieren waren sowohl MAC387 als auch AM-3K positive Makrophagen in den
beiden untersuchten Lokalisationen (Fürstenberg’sche Rosette und Zitzenzisterne) jeweils
subepithelial und perivaskulär nachweisbar.
Serienschnitte von Makrophagen, die direkt unterhalb des Epithels der Fürstenberg’schen
Rosette lokalisiert sind, zeigt Abb. 15 A und B: Stark positve, im Zellkörper klar abgrenzbare
Makrophagen sind in Abb. 15 A zu erkennen. Ausläufer von Epithelzellen in das
subepitheliale Gewebe hinein waren ebenfalls schwach positiv für MAC387. Abbildung 15 B
hingegen zeigt negative Epithelzellen sowie einige positive Makrophagen für AM-3K. Im
Vergleich zu von MAC387 gefärbten Zellen waren die von AM-3K detektierten Zellen in
deutlich geringerer Anzahl zu finden. Des Weiteren wurden von MAC387 Makrophagen
angesprochen, die von AM-3K nicht als solche erkannt werden (Abb. 15 A und B, weiße
Pfeile). Zudem ist eine Population, die von beiden Makrophagen-Antikörpern detektiert
wurde (Schnittmenge) vorhanden (Abb. 15 A und B, schwarze Pfeile).
Hingegen zeigt die Abbildung 15 C-F, dass die Blutgefäße der Fürstenberg’schen Rosette in
größerem
Maße
von
AM-3K-positiven
Makrophagen
Makrophagen flankiert wurden.
90
als
von
MAC387-positiven
Ergebnisse
MAC387-positive Makrophagen
AM-3K-positive Makrophagen
A
B
C
D
E
F
Abb. 15: Serienschnitte zum Vergleich MAC387 und AM-3K positiver Makrophagen in
subepithelialer und perivaskulärer Lokalisation der Fürstenberg’schen
Rosette.
A, B: Tier Nr.6, Viertel hinten links, subepitheliale Lokalisation; C-F: Tier Nr. 3, Viertel vorne
links, perivaskuläre Lokalisation. Schwarze Pfeile: von beiden Antikörpern positiv detektierte
Makrophagen, weiße Pfeile: nur von MAC387 positiv detektierte Makrophagen.
91
Ergebnisse
Die semiquantitative Auswertung der unterschiedlichen Makrophagensubtypen in der
Fürstenberg’schen Rosette bestätigt, dass subepithelial häufiger MAC387 positive
Makrophagen lokalisiert waren. (Mittelwerte MAC387 2,2; AM-3K 1,5). Alle untersuchten
Tiere lagen in dieser Lokalisation im Zellwert für AM-3K positive Zellen unterhalb oder
gleich des Wertes der für MAC387-positiven. Umgekehrt waren perivaskulär mehr AM-3Kals MAC387-positive Makrophagen zu finden (MAC387 1,7; AM-3K 2,7).
Tab. 13: Makrophagensubtypen in der Fürstenberg’schen Rosette.
subepithelial
Tier Nr.
1
perivaskulär
MAC387
AM-3K
MAC387
AM-3K
3
2,5
1,0
1,0
3,0
6
2,5
1,5
1,0
2,5
7
2,0
1,0
2,5
3,0
8
2,0
2,0
2,0
2,5
9
2,0
2,0
2,0
2,5
2,2 ± 0,1
1,5 ± 0,2
1,7 ± 0,3
2,7 ± 0,1
Mittelwert ± STD
1
Siehe Tab. 16, Mittelwerte und Standardabweichungen der semiquantitativ erfassten Anzahl
von bovinen Makrophagen in der Fürstenberg’schen Rosette, Nachweis mittels Antikörper
MAC387 und AM-3K. Relative Häufigkeiten wurden subjektiv bestimmt (Skala in 0,5Schritten von 0 bis 3, 3.5).
In der Zitzenzisterne zeigten sich subepithelial ähnliche Verhältnisse wie in der
Fürstenberg’schen Rosette: auch hier waren MAC387-positive Makrophagen gegenüber AM3K-positiven Makrophagen meist vorherrschend (Abb. 16; Tab. 14). Nur Tier 8 widerspricht
der Tendenz der Gruppe.
Im perivaskulären Gewebe fanden sich keine quantitativen Unterschiede hinsichtlich
unterschiedlicher Makrophagensubtypen.
92
Ergebnisse
MAC387-positive Makrophagen
AM-3K-positive Makrophagen
A
B
C
D
Abb. 16: Serienschnitte zum Vergleich MAC387 und AM-3K positiver Makrophagen in
subepithelialer Lokalisation in der Zitzenzisterne.
A, B: Tier Nr. 3, Viertel hinten links; C, D: Tier Nr 3, Viertel hinten links.
Tab. 14: Makrophagensubtypen in der Zitzenzisterne.
subepithelial
Tier Nr.1
perivaskulär
MAC387
AM-3K
MAC387
AM-3K
3
3,0
1,5
2,5
2,5
6
2,0
1,5
2,0
2,0
7
1,0
1,0
2,0
2,0
8
1,0
1,5
2,0
2,5
9
1,0
1,0
1,5
1,5
1,6 ± 0,4
1,3 ± 0,1
2,0 ± 0,1
2,1 ± 0,2
Mittelwert ± STD
1
Siehe Tab. 16, Mittelwerte und Standardabweichungen der semiquantitativ erfassten Anzahl
von bovinen Makrophagen in der Zitzenzisterne, Nachweis mittels Antikörper MAC387 und
AM-3K. Relative Häufigkeiten wurden subjektiv bestimmt (Skala in 0,5-Schritten von 0 bis 3,
3.5).
93
Ergebnisse
Morphologie MAC387-positiver Makrophagen
Die von den hier verwendeten Antikörpern detektierten Makrophagen wiesen morphologische
Unterschiede auf. Aufnahmen von MAC387-positiven Makrophagen zeigen die Abbildungen
17 und 18. Es handelte sich bei MAC387 um eine zytoplasmatische Färbung, so dass
Zytoplasmaausläufer und Zellkörper gut sichtbar waren. Die von MAC387 detektierten Zellen
waren rund bis spindelförmig und ohne dendritische Zellausläufer. Der Zellkern war
nierenförmig und von mäßig vakuolisiertem Zytoplasma umgeben. Gefäßassoziierte
Makrophagen sind in Abb. 17 A-C zu sehen. Auch intravaskuläre Monozyten des peripheren
Blutes wurden von MAC387 detektiert (Abb. 17, D, Pfeil). Im perivaskulären Gewebe
ähnelte die abgerundete Form der MAC387-positiven Makrophagen der runden, homogenen
Morphologie von Monozyten.
A
B
C
D
Abb. 17: MAC387-positive, gefäßassoziierte Makrophagen in der Fürstenberg’schen
Rosette.
A-D: Tier 3, Viertel hinten links, Pfeil: intravaskulär detektierte Monozyten.
94
Ergebnisse
A
B
C
D
Abb. 18: MAC387-positive, im peripheren Bindegewebe der Zitzenzisterne lokalisierte
Makrophagen.
A-D: Tier Nr 3, Viertel hinten links
Morphologie AM-3K-positiver Makrophagen
Die von AM-3K detektierten Zellen waren im Vergleich zu den oben beschriebenen
MAC387-positiven Makrophagen deutlich größer und vielgestaltiger. Nennenswert sind die
langgestreckten, vom Zellkörper ausgehenden Zellfortsätze sowie ein zentral gelegener,
runder Zellkern. Das Zytoplasma erschien fein granuliert und ohne Vakuolen. Die räumliche
Einbettung und Plastizität von AM-3K-Makrophagen in ihrer Mikroumgebung wird in Abb.
19 deutlich.
Die Präsenz der Zellausläufer bestätigte sich bei Betrachtung eines mit AM-3K gefärbten
Schnittes in geringer Vergrößerung (Abb. 20). Es wurden z.T. kleine, positive Zellbereiche im
Anschnitt getroffen, die angeschnittene Zytoplasmaausläufer darstellen.
95
Ergebnisse
A
B
C
D
E
F
Abb. 19: AM-3K-positive, im peripheren Bindegewebe der Zitzenzisterne lokalisierte
Makrophagen.
A, C: Tier Nr. 3, Viertel vorne rechts; B, D: Tier Nr. 3, Viertel hinten links, E, F: Tier Nr. 6,
Viertel hinten links.
96
Ergebnisse
Abb. 20: AM-3K-positive, perivaskuläre Makrophagen in der Fürstenberg’schen
Rosette.
Tier Nr. 3, Viertel hinten links
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass anhand zweier Makrophagen-Antikörper
unterschiedliche Phänotypen von Makrophagen mit spezifischen Verteilungsmustern sowie
unterschiedlicher Morphologie in der bovinen Zitze detektiert werden konnten. Aufgrund der
besonderen Prominenz dieses Zelltypes in der Zitze und im inflammatorischen Geschehen
wurden Makrophagen als Zelltyp für weitere in vitro Untersuchungen ausgewählt.
97
Ergebnisse
4.3 Analyse der Makrophagendifferenzierung in vitro
In der Zitze waren verschiedene Makrophagenpopulationen lokalisiert, die sich in ihrer
Funktionalität unterscheiden können. Im Folgenden sollte untersucht werden, ob
Arachidonsäuremetaboliten, die im Gefolge der Infektion gebildet werden, diese
Differenzierung steuern können. Um zu prüfen, welche Arachidonsäuremetaboliten nach
Kontakt von E. coli mit der Fürstenberg’schen Rosette und Zitzenzisterne reguliert exprimiert
werden, und um einen Eindruck davon zu gewinnen, welche Faktoren hierbei eine Rolle
spielen können, wurden Transkriptionsdaten aus einem kontrollierten Infektionsversuch (3.1)
zur Analyse herangezogen.
Transkriptomanalyse
Zur näheren Charakterisierung der Regulation inflammatorischer Parameter in der initialen
Phase der Mastitis wurde auf Daten einer Pilotstudie zurückgegriffen (Tab. 1), in der einer
Kuh für 4 h E. coli in die Zitzenzisterne appliziert wurde (3.1). Die Regulation der
Genexpression von Enzymen (induction fold) des Arachidonsäurestoffwechsels zur Synthese
von Entzündungsmediatoren ist in Tab. 15 ersichtlich. Die Werte geben das Vielfache der
Genexpression im Vergleich zur Expression des Kontrollviertels an. Um eine Beteiligung des
Transkriptionsfaktors PPARγ (2.4.3), dessen natürlicher Ligand Prostaglandin J2 ist, und
einige seiner abhängig hochregulierten Gene zu untersuchen, wurde dessen regulierte
Expression sowie die der PPARγ-induzierten Fatty acid-binding proteins erfasst. FABPs sind
überdies an der Bereitstellung endogener PPARγ-Liganden hinsichtlich dessen regulatorischer
Aktivierung beteiligt.
Unter den betrachteten Genen erwiesen sich fünf als signifikant reguliert. Die COX2Genexpression sowohl in der Fürstenberg’schen Rosette als auch in der Zitzenzisterne erwies
sich mit induction folds von 14-41 als am stärksten reguliert. Daher wurde für die folgenden
in vitro Untersuchungen zur Makrophagen-Differenzierung das COX2-abhängig gebildete
Prostaglandin E2 gewählt.
98
Ergebnisse
Tab. 15: Regulierte Enzyme des Arachidonsäurestoffwechsels und PPARγ-abhängig
exprimierte Produkte 4 h nach experimenteller E. coli Inokulation in die
Zitzenzisterne.
Fürstenberg’sche Rosette
Zitzenzisterne
Prostaglandin I Synthase
3
-
ALOX15 (15-Lipoxygenase)
-
2
COX2
14
41
Prostaglandin E Synthase
2
4
FABP4
-2
-2
FABP3
-
-
PPARγ
-
-
Induction fold der Expression regulierter Gene nach experimenteller E.coli Inokulation in die
Zitzenzisterne, ALOX15: Arachidonate 15-Lipoxygenase; FABP3/4: Fatty acid-binding
protein3/4; PPARγ: Peroxisome-proliferator-activated-receptor; COX2: Cyclooxygenase 2; =keine Regulation
4.3.1 PGE2–vermittelte Effekte während der Differenzierung
boviner Makrophagen in vitro
Monozyten wurden über 7 Tage in konstanter Anwesenheit von PGE2 in niedriger (PGE2Low,
1x10-12 mol/l), mittlerer (PGE2Med, 1x10-9 mol/l,) und hoher (PGE2High, 1x10-6 mol/l)
Konzentration in Makrophagen ausdifferenziert (PGE2Low-MdM, PGE2Med-MdM, PGE2HighMdM). Zellen, die nicht unter dem Einfluss von PGE2 ausdifferenzierten (MdM) wurden als
Referenzzellen eingesetzt. Nach Abschluss der Ausdifferenzierung wurden die Zellen am Tag
7 über 3 Stunden mit LPS (5 µg/ml) stimuliert. Es wurden ausgewählte Chemokine, Zytokine
sowie der Transkriptionsfaktor PPARγ und der lösliche Pattern-recognition-receptor PTX3
gemessen.
Chemokine
CCL5 wird unter anderem von T-Zellen zur aktiven Chemotaxis weiterer mononukleärer
Zellen in inflammatorisches Gewebe gebildet. Zur näheren Charakterisierung des
chemotaktischen Potentials der hier generierten MdM wurde es, zusammen mit dem ebenfalls
chemotaktisch bedeutsamen CCL20, für die Messung ausgewählt. CXCL8 ist das klassische
Chemokin, welches die Migration neutrophiler Granulozyten in inflammatorisches Gewebe
99
Ergebnisse
veranlasst. Neutrophile Granulozyten sind als erste einwandernde Zellpopulation durch ihre
antimikrobiellen Effekte wesentlich an der Erregerabwehr beteiligt.
CXCL8 und CCL5 wurden von unstimulierten MdM in geringem Maße exprimiert (102-103
Kopien/200 ng Gesamt-RNA, (Abb. 21 A, C). Die Differenzierung der MdM in Anwesenheit
von PGE2 führte, unanbhängig von der PGE2-Konzentration, weder bei CXCL8 noch bei
CCL5 zu einer statistisch signifikanten Änderung der mRNA-Expression (Abb. 21 A, C).
CCL20 wurde von den MdM nicht exprimert und unter dem Einfluss von PGE2 nicht
induziert (Abb. 21, E). Somit konnte gezeigt werden, dass die Basis-mRNA-Expression der
untersuchten Chemokine in Makrophagen durch die Ausdifferenzierung in Anwesenheit von
PGE2 nicht moduliert wurde.
Eine LPS-Stimulation führte sowohl bei MdM als auch bei PGE2-MdM(Low, Med, High) zu einer
statistisch signifikanten Hochregulation der CCL5 (3 Log-Stufen) und CXCL8 (1 Log-Stufe)
-mRNA-Expression (Abb. 21). Ebenso drastisch wurde in beiden Zelltypen die CCL20
mRNA hochreguliert (Abb. 21). In PGE2Med und PGE2High-MdM führte die LPS Stimulation
zu einer statistisch signifikanten Abnahme der CCL5- und CCL20-mRNA-Expression (Abb.
21, D, F). Interessanterweise blieb die CXCL8-mRNA-Expression nach LPS-Stimulation in
allen PGE2-MdM-Zellpopulationen unbeeinflusst (Abb. 21, B).
A) Keine Stimulation
B) Stimulation mit LPS (5 µg/ml)
5
5
10
4
10
Anzahl Kopien
10
4
10
10
2
10
1
10
10
2
10
10
CXCL8
3
3
1
-
-12
-9
-6
-
-12
-9
PGE2 (mol/l)
PGE2 (mol/l)
Abbildungsbeschriftung und Legende siehe nächste Seite
100
-6
Ergebnisse
C) Keine Stimulation
D) Stimulation mit LPS (5 µg/ml)
7
7
10
6
10
5
10
Anzahl Kopien
10
6
10
10
3
10
2
10
1
10
10
CCL5
2
10
1
-
-12
-9
-6
-
E) Keine Stimulation
5
Anzahl Kopien
-9
-6
F) Stimulation mit LPS (5 µg/ml)
5
10
10
4
10
3
10
a
ab
ab
4
10
c
CCL20
3
10
1
-12
PGE2 (mol/l)
PGE2 (mol/l)
10
d
3
10
2
c
4
4
10
ab
5
10
10
a
Keine Basisexpression
vorhanden
-
-12
2
10
1
-9
-6
10
PGE2 (mol/l)
-
-12
-9
-6
PGE2 (mol/l)
Abb. 21: mRNA-Expression von CXCL8, CCL5 und CCL20 in MdM nach
Ausdifferenzierung unter PGE2 und Stimulation mit Lipopolysaccharid (LPS).
MdM von 6 Tieren wurden über 7 Tage in Ab (-) oder Anwesenheit von PGE2 (1x10-12 mol/l,
1x10-9 mol/l und 1x10-6 mol/l) ausdifferenziert. Am Tag 7 erfolgte eine Stimulation mit LPS
(5 µg/ml, 3 h, B, D, F). Die mRNA-Expression der Chemokine CXCL8 (A, B), CCL5 (C, D)
und CCL20 (E, F) ist als mRNA-Kopienzahl/200 ng Gesamt-RNA angegeben.
Unterschiedliche Buchstaben oberhalb der Boxplots kennzeichnen statistisch signifikante
Unterschiede (p≤0,05).
101
Ergebnisse
Zytokine
IL-10 wurde als Schlüsselzytokin von M2 Makrophagen und IL-12 als kennzeichnendes
Zytokin von M1 Makrophagen analysiert. IL-1β und TNF-α gelten ebenso als assoziiert mit
dem M1-Makrophagensubtyp.
Die Basis-Expression von IL-10 wurde in PGE2High-MdM signifikant herunterreguliert (Abb.
22, A). In unstimulierten MdM und PGE2Low,Med,High-MdM lag die Expression von IL-1β und
TNF-α unterhalb der Nachweisgrenze (Abb. 22, C, E). Die Expression beider Zytokine wurde
durch die Stimulation mit LPS induziert (Abb. 22, D, F). Bei LPS-stimulierten PGE2-MdM
zeigte sich für IL-1β und TNF-α eine PGE2-dosisabhängige Abnahme der mRNA-Expression,
die bei PGE2 High -MdM für beide Zytokine statistisch signifikant war.
In LPS-stimulierten PGE2High-MdM erwies sich die IL-10 mRNA-Expression im Vergleich zu
LPS-stimulierten MdM und PGE2Med,Low-MdM als signifkant geringer (Abb. 22, B).
Die Expression von IL-12 lag in diesem Versuch sowohl in unstimulierten als auch in LPSstimulierten MdM unterhalb der Nachweisgrenze.
102
Ergebnisse
A) Keine Stimulation
B) Stimulation mit LPS (5 µg/ml)
5
5
Anzahl Kopien
10
10
4
10
a
a
3
a
b
d
IL-10
3
10
2
10
1
10
2
1
-
-12
-9
-6
-
PGE2 (mol/l)
5
5
Kopien Anzahl
10
4
10
3
10
a
ab
bc
4
10
-6
d
IL-1β
3
10
1
-9
D) Stimulation mit LPS (5 µg/ml)
10
10
-12
PGE2 (mol/l)
C) Keine Stimulation
2
bc
10
10
10
a
4
10
10
ab
Keine Basisexpression
vorhanden
-
-12
2
10
1
-9
-6
10
PGE2 (mol/l)
-
-12
-9
PGE2 (mol/l)
Abbildungsbeschriftung und Legende siehe nächste Seite
103
-6
Ergebnisse
E) Keine Stimulation
F) Stimulation mit LPS (5 µg/ml)
5
5
Kopien Anzahl
10
10
4
10
1
10
d
Keine Basisexpression
vorhanden
-12
2
10
1
-9
-6
10
-
PGE2 (mol/l)
5
10
Kopien Anzahl
-6
4
10
3
10
5
4
10
IL-12
3
10
10
-9
H) Stimulation mit LPS (5 µg/ml)
10
1
-12
PGE2 (mol/l)
G) Keine Stimulation
2
TNF-α
10
-
10
bc
3
10
2
a
10
3
10
ab
4
Keine Basisexpression
vorhanden
-
-12
2
10
1
-9
-6
10
PGE2 (mol/l)
Nach Stimulation keine
Expression vorhanden
-
-12
-9
-6
PGE2 (mol/l)
Abb. 22: Expression von IL-10, IL-1β, TNF-α und IL-12 in MdM nach
Ausdifferenzierung unter PGE2 und Stimulation mit Lipopolysaccharid (LPS).
MdM von 6 Tieren wurden über 7 Tage in Ab (-) oder Anwesenheit von PGE2 (1x10-12 mol/l,
1x10-9 mol/l und 1x10-6 mol/l) ausdifferenziert. Am Tag 7 erfolgte eine Stimulation mit LPS
(5 µg/ml, 3 h, B, D, F, H). Die mRNA-Expression der Zytokine IL-10 (A, B), IL-1β (C, D), TNFα (E, F) und IL-12 (G, H) ist als mRNA-Kopienzahl/200 ng Gesamt-RNA angegeben.
Unterschiedliche Buchstaben oberhalb der Boxplots kennzeichnen statistisch signifikante
Unterschiede (p≤0,05).
104
Ergebnisse
Peroxisome proliferator activated-receptor γ und Pentraxin 3
PPARγ ist als nukleärer Transkriptionsfaktor maßgeblich an der regulierten Expression pround antiinflammatorischer Gene beteiligt. Es sollte untersucht werden, ob bovine MdM
PPARγ exprimieren, und ob eine Modulation der Expression von PPARγ durch PGE2
möglich ist.
PTX3 spielt als löslicher pattern-recognition receptor bei der Erkennung von PAMPs sowie
apoptotischen Signalen und bei der Geweberegeneration im inflammatorischen Geschehen
eine entscheidende Rolle. Des Weiteren kommt PTX3 als mögliches PPARγ-abhängig
reguliertes Gen im Entzündungsgeschehen eine Bedeutung zu. Die Messung der PTX3
mRNA-Expression soll zur Aufklärung des funktionellen Phänotyps der MdM beitragen.
Die Basis-mRNA-Expression von PPARγ wurde in PGE2Med und PGE2High-MdM signifikant
herunterreguliert (Abb. 23, A). PTX3 wurde weder von unstimulierten MdM noch von PGE2MdM exprimiert (Abb. 23, C).
Eine Stimulation mit LPS führte weder bei MdM noch in PGE2-MdM zu einer signifikant
verstärkten PPARγ mRNA-Expression. Hingegen wurde die PPARγ mRNA-Expression nach
LPS-Stimulation von PGE2High-MdM signifikant reduziert (Abb. 23, B). Eine Stimulation mit
LPS führte zu einer starken Induktion der PTX3 mRNA-Expression. Auch hier waren in
PGE2High-MdM signifikant weniger mRNA-Kopien zu verzeichnen als in den anderen
Ansätzen (Abb. 23, D).
105
Ergebnisse
A) Keine Stimulation
B) Stimulation mit LPS (5 µg/ml)
4
Anzahl Kopien
10
4
a
ab
10
a
bc
3
10
c
3
10
1
10
b
2
-
-12
-9
-6
-
PGE2 (mol/l)
-9
-6
D) Stimulation mit LPS (5 µg/ml)
5
5
10
Anzahl Kopien
-12
PGE2 (mol/l)
C) Keine Stimulation
10
4
ab
bc
4
10
ad
10
3
PTX3
d
3
10
10
Keine Basisexpression
vorhanden
1
10
PPARγ
1
10
2
a
10
2
10
10
a
2
10
1
-
-12
-9
-6
10
PGE2 (mol/l)
-
-12
-9
-6
PGE2 (mol/l)
Abb. 23: Expression von PPARγ und PTX3 in MdM nach Ausdifferenzierung unter
PGE2 und Stimulation mit Lipopolysaccharid (LPS).
MdM von 6 Tieren wurden über 7 Tage in Ab (-) oder Anwesenheit von PGE2 (1x10-12 mol/l,
1x10-9 mol/l und 1x10-6 mol/l) ausdifferenziert. Am Tag 7 erfolgte eine Stimulation mit LPS
(5 µg/ml, 3 h, B, D). Die mRNA-Expression des Transkriptionsfaktors PPARγ (A, B), und
PTX3 (C, D) ist als mRNA-Kopienzahl/200 ng Gesamt-RNA angegeben. Unterschiedliche
Buchstaben oberhalb der Boxplots kennzeichnen statistisch signifikante Unterschiede
(p≤0,05).
106
Ergebnisse
Expression von S100A8/A9 und CD163 in MdM und PGE2-MdM
Um die Effekte des PGE2 auf die Differenzierung von MdM nicht nur auf mRNA-Ebene,
sondern auch auf Produktebene zu überprüfen, wurde eine Immunfluoreszenz mittels der
beiden Antikörper MAC387 und AM-3K an den in vitro generierten MdM durchgeführt. Ziel
des Versuchs war außerdem zu untersuchen, ob PGE2 in der Lage ist, eine spezielle
Subpopulation von Makrophagen zu induzieren, die sich in der Expression oben genannter
Antigene unterscheiden. Dafür wurde bovinen MdM von Kulturbeginn an PGE2 (1x10-9
mol/l) zugegeben. Darüber hinaus sollte überprüft werden, ob die in vitro-generierten MdM
funktionelle Parallelen durch Expression derselben Antigene zu denen in der Zitze
nachgewiesenen Makrophagen aufweisen.
Fast alle MdM exprimierten die Antigene S100A8/A9 sowie CD163. Die Intensität der
Expression pro Zelle unterschied sich, so dass für jedes Antigen zwischen ExpressionHigh und
ExpressionLow (Anteilswerte der Expression des Gesamtansatzes) differenziert wurde. Die
semiquantitative Auswertung ist in Abb. 24 G dargestellt.
Nicht alle Makrophagen waren jeweils für CD163 und AM-3K positiv (Abb. 24 A, B).
S100A8/A9 wurde in MdM und PGE2-MdM stärker exprimiert als CD163 (Summe positiver
MdM für MAC387: 167; Summe positiver Zellen für AM-3K: 76, Abb. 24 G). MdM zeigten
im Vergleich zu PGE2-MdM für beide Antigene den größeren Anteil an positiven Zellen.
Dabei überwog bei beiden Antigenen der Anteil schwach positiver Zellen gegenüber den stark
positiven Zellen (z.B. MAC387Low: 139 von 200, MAC387High: 28 von 200, Abb. 24 G).
PGE2 führte zu einer deutlichen Reduktion der Zahl positiver Zellen (von 167 MAC387positiven Zellen auf 45 positive Zellen und von 76 AM-3K-positiven auf 31 positive Zellen,
Abb. 24 G). Weiterhin verschob sich unter PGE2-Einfluss der Anteil stark positiver Zellen in
Richtung S100A8/A9, während es sich unter den schwach positiven Zellen umgekehrt
verhielt (Abb. 24 H).
107
Ergebnisse
A
B
C
D
E
F
G) MAC387- und AM-3K-Immunfluoreszenz-positive MdM und PGE2-MdM
MAC387Low
MAC387High
AM-3KLow
AM-3KHigh
MdM
139
28
61
15
PGE2-MdM
34
11
28
3
108
Ergebnisse
H) Verhältnis stark- und schwach-positiver Zellen unter MdM und PGE2-MdM.
MAC387High/AM-3KHigh MAC387Low/AM-3KLow
MdM
1,9
2,3
PGE2-MdM
3,7
1,2
Abb. 24: Immunfluoreszenzanalyse der CD163- und S100A8/A9-Expression boviner,
in vitro gereifter Makrophagen.
Monozyten wurden über 7 Tage in vitro zu Makrophagen ausdifferenziert (MdM). Parallelen
Ansätzen wurde während der Ausdifferenzierung 1x10-9 mol/l PGE2 zugesetzt (PGE2-MdM).
Die Zellen wurden fixiert (3.7) und mit einem Antikörper gegen S100A8/A9 (A, B) oder
CD163 (C, D) markiert (indirekte Immunfluoreszenz unter Einsatz eines ALEXA Fluo 488
markierten Sekundärantikörpers). Zur Darstellung der Kerne (blau) wurden Zellen mit dem
HOECHST-33342 inkubiert. Subjektiv konnten stark (A, C) und schwach positve (B, D)
Zellen identifiziert werden (Pfeile). Nach Zugabe eines irrelevanten Antikörpers (Maus-IgG,
E) oder PBS anstelle eines Primärantikörpers (F) erschienen die Zellen Fluoreszenz-negativ.
Von 200 Zellen wurde für jeden Antikörper die Zahl stark und schwach positiver Zellen
erfasst (G) und daraus die Verhältnisse zwischen MAC387- und AM-3K-positiven Zellen
bestimmt (H).
4.3.2 Effekte von PGE2 auf in vitro differenzierte bovine MdM
Im Folgenden wurden direkte Effekte von PGE2 auf in vitro generierte MdM geprüft. Dafür
wurde bovinen MdM am 7. Tag der in vitro Kultur für 3 h PGE2 (1x10-6 mol/l oder 1x10-12
mol/l) zugegeben. Parallel erfolgte eine Stimulation mit LPS (5 µg/ml).
Chemokine
Eine direkte Zugabe von PGE2 (1x10-6 mol/l) führte bei nicht stimulierten MdM zu einer
signifikant stärkeren mRNA-Expression von CXCL8 (Abb. 25, A). CCL5 wurde in nicht
stimulierten Makrophagen nicht exprimiert (Abb. 25, C). Ein Zusatz von PGE2 hatte darauf
keinen Einfluss.
Während die Stimulation mit LPS in Kulturen, die kein PGE2, oder PGE2 in der niedrigeren
Konzentration (1x10-12 mol/l) enthielten, zu einer signifikanten Steigerung der CXCL8
mRNA-Expression führte, war dies in Kulturen mit einem Zusatz von PGE2 (1x10-6 mol/l)
nicht zu verzeichnen (Abb. 25, B). Die LPS-Stimulation führte weiterhin zu einer
signifikanten Steigerung der CCL5 mRNA-Expression (Abb. 25, D). Eine Zugabe von PGE2
109
Ergebnisse
(1x10-6 mol/l) führte-verglichen mit Ansätzen ohne PGE2-Zusatz-zu einer statistisch
signifikant schwächeren CCL5 mRNA-Expression nach LPS-Stimulation.
A) Keine Stimulation
B) Stimulation mit LPS (5 µg/ml)
5
5
Anzahl Kopien
10
bc
4
10
3
10
10
4
10
ab
a
2
10
1
10
2
10
10
CXCL8
3
10
1
-
-12
-6
-
PGE2 (mol/l)
D) Stimulation mit LPS (5 µg/ml)
6
6
Anzahl Kopien
10
10
5
10
4
10
3
10
5
10
1
ab
bc
CCL5
3
10
10
a
4
10
2
-6
PGE2 (mol/l)
C) Keine Stimulation
10
-12
Keine Basisexpression
vorhanden
-
-12
2
10
1
-6
10
PGE2 (mol/l)
-
-12
-6
PGE2 (mol/l)
Abb. 25: Chemokin-Expression in MdM nach Zugabe von PGE2 und Stimulation mit
Lipopolysaccharid (LPS).
MdM von 6 Tieren wurden über 7 Tage in vitro ausdifferenziert. An Tag 7 erfolgte eine
Zugabe von PGE2 (1x10-6 mol/l (-6) und 1x10-12 mol/l (-12)) für 3 h sowie eine Stimulation mit
LPS (5 µg/ml, 3 h, B, D). Kontrollansätze (-) wurden ohne PGE2 belassen. Die mRNAExpression der Chemokine CXCL8 (A, B) und CCL5 (C, D) ist in der Anzahl der Kopien in
200 ng Gesamt-RNA angegeben. Unterschiedliche Buchstaben oberhalb der Boxplots
kennzeichnen statistisch signifikante Unterschiede (p≤0,05).
110
Ergebnisse
Zytokine
IL-10 wurde von unstimulierten MdM in geringem Maße (102 Anzahl mRNA Kopien)
exprimiert (Abb. 26, A). Eine Zugabe von PGE2 (1x10-6 mol/l und 1x10-12mol/l) führte zu
keiner statistisch signifikanten Änderung der Basisexpression. Im LPS-Stimulationsansatz
zeigte sich sowohl in der Kultur ohne PGE2, als auch in den Kulturen mit PGE2 eine
signifikante Steigerung der IL-10 mRNA-Expression um knapp zwei Log-Stufen. Die Zugabe
von PGE2 (1x10-6 mol/l) führte, im Vergleich zum Ansatz ohne PGE2-Zusatz, zu einer
statistisch schwächeren IL-10 mRNA-Expression nach LPS-Stimulation (Abb. 26, B).
IL-12 war weder in unstimulierten noch in LPS-stimulierten Ansätzen messbar und wird
demzufolge von dem hier untersuchten Makrophagentyp nicht exprimiert. PGE2 hatte darauf
keinen Einfluss.
A) Keine Stimulation
B) Stimulation mit LPS (5 µg/ml)
5
10
5
4
Anzahl Kopien
Anzahl Kopien
10
10
3
10
2
10
a
10
b
IL-10
3
10
2
10
1
1
10
a
4
-
-12
-6
10
-
-12
-6
PGE2 (mol/l)
PGE2 (mol/l)
Abb. 26: IL-10 Expression in MdM nach Zugabe von PGE2 und Stimulation mit
Lipopolysaccharid (LPS).
MdM von 6 Tieren wurden über 7 Tage in vitro ausdifferenziert. An Tag 7 erfolgte eine
Zugabe von PGE2 (1x10-6 mol/l (-6) und 1x10-12 mol/l (-12)) für 3 h sowie eine Stimulation mit
LPS (5 µg/ml, 3 h, B). Kontrollansätze (-) wurden ohne PGE2 belassen. Die mRNAExpression des Zytokins IL-10 (A, B) ist in der Anzahl der Kopien in 200 ng Gesamt-RNA
angegeben. Unterschiedliche Buchstaben oberhalb der Boxplots kennzeichnen statistisch
signifikante Unterschiede (p≤0,05).
111
Ergebnisse
PPARγ und PTX3
Eine direkte Zugabe von PGE2 führte im unstimulierten Ansatz zu keiner signifikanten
Veränderung der PPARγ-mRNA Expression. (Abb. 27, A). Unstimulierte MdM exprimierten
kein PTX3 (Abb. 27, C). PGE2 hatte darauf keinen Einfluss.
Die Expression von PPARγ war durch LPS nicht signifikant induzierbar. Jedoch führte PGE2
(1x10-6 mol/l) im LPS-Stimulationsansatz zu einer statistisch signifikanten Verringerung der
PPARγ mRNA-Expression bis an die Nachweisgrenze. Die Stimulation mit LPS führte zu
einer deutlichen Induktion der PTX3 mRNA-Expression, die jedoch nicht statistisch
signifikant war. PGE2 hatte auf die Expression unter LPS-Stimulation keinen Einfluss (Abb.
27, D).
112
Ergebnisse
A) Keine Stimulation
B) Stimulation mit LPS (5 µg/ml)
4
4
10
3
10
Anzahl Kopien
10
3
10
ab
-
-12
10
1
10
-
-12
-6
D) Stimulation mit LPS (5 µg/ml)
5
10
5
4
10
3
10
Anzahl Kopien
10
4
10
PTX3
3
10
Keine Basisexpression
vorhanden
1
10
-6
PGE2 (mol/l)
C) Keine Stimulation
2
PPARγ
1
PGE2 (mol/l)
10
bc
2
2
10
10
a
2
10
1
-
-12
-6
10
PGE2 (mol/l)
-
-12
-6
PGE2 (mol/l)
Abb. 27: Expression von PPARγ und PTX3 in MdM nach Zugabe von PGE2 und
Stimulation mit Lipopolysaccharid (LPS).
MdM von 6 Tieren wurden über 7 Tage in vitro ausdifferenziert. An Tag 7 erfolgte eine
Zugabe von PGE2 (1x10-6 mol/l (-6) und 1x10-12 mol/l (-12)) für 3 h sowie eine Stimulation mit
LPS (5 µg/ml, 3 h, B, D). Kontrollansätze (-) wurden ohne PGE2 belassen. Die mRNAExpression des Transkriptionsfaktors PPARγ (A, B) sowie von PTX3 (C, D) ist in der Anzahl
der Kopien in 200 ng Gesamt-RNA angegeben. Unterschiedliche Buchstaben oberhalb der
Boxplots kennzeichnen statistisch signifikante Unterschiede (p≤0,05).
113
Ergebnisse
4.3.3 Einfluss sezernierter Produkte in vitro generierter
Makrophagen auf die Vitalitat neutrophiler Granulozyten
Die Regulation der mRNA auf zellulärer Ebene lässt nicht automatisch auf Bildung und
Exozytose des biologisch wirksamen Produkts schließen. Um zu überprüfen, ob die
kultivierten MdM biologisch aktive Produkte bilden, wurden Überstände aus den MdMZellkulturen gewonnen und geprüft ob sie die Zellvitalität (Apoptose, Nekrose) neutrophiler
Granulozyten beeinflussen können. Der Anteil von Zellen, die den intrinsischen Pfad der
Apoptose durchlaufen haben, wurde anhand der Bestimmung der MitochondrienDepolarisation durchflusszytometrisch erfasst. Die Anzahl vitaler Zellen wurde mittels
Referenzzellmethode bestimmt (3.13.1).
Die Überstände stammten von MdM, PGE2Low-MdM und PGE2High-MdM. Überstände von
Zellen, die mit LPS stimuliert wurden enthielten noch das LPS (5 µg/ml). Kontrollansätze
beinhalteten Granulozyten, denen PGE2 (1x10-6 mol/l, 1x10-12 mol/l) sowie LPS (5 µg/ml)
direkt zugegeben wurden.
Überstände von PGE2Low-MdM führten zu einem signifikanten Anstieg des Anteils
apoptotischer neutrophiler Granulozyten (Abb. 28, A), während sie die Gesamtzahl vitaler
Neutrophiler nicht beeinflussten (Abb. 28, B). Die Inkubation von Granulozyten mit
Überständen LPS-stimulierter MdM und PGE2-MdM führte zu einem signifikanten Abfall des
Anteils apoptotischer neutrophiler Granulozyten, während PGE2 darauf keinen Einfluss hatte.
Wurden neutrophile Granulozyten für 24 h mit PGE2 inkubiert hatte dies keinen Einfluss auf
den Anteil apoptotischer Zellen (Abb. 29, A), während die Zahl vitaler Granulozyten nach
Inkubation mit 10-6 mol/l PGE2 signifikant gesteigert war (Abb. 29, B). Auf den LPSinduzierten, signifikanten Abfall des Anteils apoptotischer Zellen (Abb. 29, A) und der Zahl
vitaler Zellen (Abb. 29, B) hatte PGE2 keinen Einfluss.
114
Ergebnisse
A
B
20
b
15
140
ab
3
vitale Neutrophile (1x10 )
apoptotische Neutrophile (%)
160
a
10
c
5
c
c
0
120
a
a
a
a
100
b
80
b
60
40
20
0
LPS
-
PGE2
-
-12
10
-6
10
+
-
+
-12
10
+
-6
10
LPS
-
PGE2
-
-12
10
-6
10
+
-
+
-12
10
+
-6
10
Abb. 28: Anteil apoptotischer neutrophiler (A) und Anzahl vitaler neutrophiler
Granulozyten (B) nach Inkubation mit PGE2-differenzierten MakrophagenZellkulturüberständen.
Neutrophile Granulozyten von einem Tier wurden 24 h mit Zellkulturüberständen von MdM
von sechs Tieren in vitro inkubiert. Der Anteil apoptotischer Zellen unter Membran-intakten
Zellen sowie die Zahl vitaler Zellen wurde durchflusszytometrisch quantifiziert. Geprüft
wurden die Überstände von MdM, die nur in Medium ausdifferenzierten (-) und mit 5 µg/ml
LPS (+) stimuliert wurden sowie von MdM, die in Anwesenheit von 1x10-6 mol/l PGE2 (10-6)
und 1x10-12 mol/l PGE2 (10-12) ausdifferenzierten und mit LPS stimuliert wurden (+).
Unterschiedliche Buchstaben oberhalb der Boxplots bezeichen statistisch signifikante
Unterschiede (p≤0,05).
115
Ergebnisse
A
B
30
25
160
a
a
140
a
20
15
10
b
5
b
b
vitale Neutrophile (1x103)
apoptotische Neutrophile (%)
35
PGE2
100
80
a
a
b
c
60
c
c
40
20
0
0
LPS
120
-
-12
10
-6
10
+
-
+
-12
10
+
-6
10
LPS
PGE2
-
-12
10
-6
10
+
-
+
-12
10
+
-6
10
Abb. 29: Anteil apoptotischer neutrophiler (A) und Anzahl vitaler neutrophiler
Granulozyten (B) nach Inkubation mit direktem PGE2
Neutrophile Granulozyten von einem Tier wurden mit PGE2 für 24 h in vitro inkubiert. Der
Anteil apoptotischer Zellen unter Membran-intakten Zellen sowie die Zahl vitaler Zellen
wurde durchflusszytometrisch quantifiziert. Geprüft wurde die Modulation von Apoptose und
Nekrose durch PGE2 in den Konzentrationen 1x10-6 mol/l (10-6), 1x10-12 mol/l (10-12) sowie
mit (+) und ohne (-) LPS-Stimulation (5 µg/ml). Unterschiedliche Buchstaben oberhalb der
Boxplots bezeichen statistisch signifikante Unterschiede (p≤0,05).
116
Diskussion
5 Diskussion
Die Zitze stellt als distales anatomisches Kompartiment des Euters eine wichtige Barriere
gegen galaktogen eindringende Erreger dar. Verfolgt man den Weg aszendierender Erreger,
so kommt dem Gewebe des Strichkanals, der Fürstenberg’schen Rosette und der
Zitzenzisterne eine besondere Bedeutung zu, da hier der erste, direkte Kontakt des Pathogens
mit dem Wirtsgewebe stattfindet. In der Zitzenzisterne und Fürstenberg’schen Rosette wurde
in Abhängigkeit von Alter, Laktation und Parität die Anwesenheit und Verteilung
verschiedener
Leukozytenpopulationen
untersucht.
Makrophagen
sind
als
Antigen
präsentierende Zellen und durch ihre Rolle in der Resolution einer Entzündung von
besonderem Interesse. Im Folgenden soll die funktionelle Relevanz des distalen
Zitzenabschnittes im Hinblick auf einen möglichen Applikationsort für immunmodulatorische
Komponenten diskutiert werden.
5.1 Funktionelle Anatomie des distalen Zitzenabschnittes
Beim Rind formieren die Radiärfasern des Muskelgewebes der Zitzenwand die proximal in
den Strichkanal einstrahlende Fürstenberg’sche Rosette. Zunächst fällt die unter 4.1
beschriebene Struktur der Fürstenberg’schen Rosette auf. Von besonderem Interesse ist hier
die geschlängelte, in Falten liegende Struktur des Gewebes mit einem zweireihigen Epithel
und subepithelialen Zellinfiltraten (Abb. 9). So resultiert aus dieser Fältelung eine
Oberflächenvergrößerung, die für eindringende Bakterien eine mögliche Adhäsionsfläche und
Reservoir für aszendierende Erreger darstellen könnte. Dabei hängt es von der Kompetenz der
dort ansässigen Zellen ab, inwieweit diese Lokalisation zur Infektionsabwehr des Organismus
beitragen kann. Die Anwesenheit von Immunzellen in diesem Abschnitt der Zitze sowie die
antibakteriellen Eigenschaften des Keratins des Strichkanals wurden nachgewiesen
(CHANDLER et al. 1969; NICKERSON u. PANKEY 1983; COLLINS et al. 1986;
CAPUCO et al. 1994; SORDILLO u. STREICHER 2002). Von entscheidender Bedeutung
sind, neben der Anwesenheit von Immunzellen, die von ihnen vermittelte interzellulären
Signalwege nach Pathogenerkennung sowie die dortige Beschaffenheit des Epithels als
Schutzeinrichtung. In den betrachteten Tiergruppen beeindruckten die Tiere aus Gruppe K1
mit einem dichten, geschlossenen Epithel, welches sich in den anderen Tiergruppen in dieser
117
Diskussion
Homogenität und Anordnung so nicht wiederfinden ließ. Es lässt darauf schließen, dass die
Laktation und die damit einhergehenden mechanischen Belastungen des Milchentzugs zu
einer Veränderung der Epithelstruktur und des umliegenden Gewebes führen. Jedoch zeigte
auch Gruppe V1a Befunde wie Inhomogenität, lichtere Struktur des Epithels und gibt so
Auskunft darüber, dass auch intrazisternal appliziertes LPS als Stimulus einen Einfluss auf
die Beschaffenheit des Epithels hat. Möglicherweise hat dieser „Umbau“, hin zu einer
weniger
dichten
Zellstruktur,
funktionelle
Hintergründe.
Die
Beteiligung
der
Fürstenberg’schen Rosette sowie der Zitzenzisterne bei der Migration neutrophiler
Granulozyten vom Gewebe in die Milch wurde nachgewiesen (NICKERSON u. PANKEY
1983). Erwähnenswert ist daher, dass eine Auflockerung des Epithels eine bessere Migration
von Immunzellen in die Milch ermöglichen könnte. Abbildung 16 A zeigt, dass Makrophagen
auch direkt zwischen den Epithelzellen lokalisiert waren und von dort in die Milch übertreten
können. Denkbar wäre allerdings auch eine Art „Patrouille“ von Immunzellen zwischen den
licht gewordenen Epithelzellen, die, rekrutiert durch Zytokine und Chemokine, die zelluläre
Abwehr gegen eindringende Bakterien übernehmen. Möglich wäre aber auch, dass mit dem
Verlust der homogenen Struktur eine mechanische Insuffizienz des Epithels einhergeht und so
Bakterien eine Adhäsion und Aszendenz in proximale Gebiete erleichtert. In der
Fürstenberg’schen Rosette wurden neben Makrophagen auch Epithelzellen durch den
Antikörper MAC387 angefärbt. Dieses zeigt, dass Epithelzellen das S100 ProteinA8/A9
exprimieren und unterstreicht so deren funktionelle Relevanz als zur Abwehr befähigte
Zellen. S100-Proteine gehören zu den damage-associated-proteins, die von Zellen unter
Stressbedingungen als „Alarmine“ exprimiert werden (OPPENHEIM u. YANG 2005). Dieses
zeigt, dass die Epithelzellen auch eine Art „primende“ Funktion übernehmen könnten und so
möglicherweise transmigrierende Zellen in einen „alarmierenden“ Zustand versetzen könnten,
der mit funktionellen Änderungen, wie z.B. vermehrter PRR-Expression, verbunden sein
könnte.
5.2 Immunzellpopulationen in der Zitze
Ziel der durchgeführten Untersuchung war es, einen Überblick über die Anwesenheit, Dichte
und räumliche Verteilung von Leukozyten in Abhängigkeit der Versuchsgruppen zu
bekommen. Zur Darstellung von Mastzellen wurde die Toluidinblau-Färbung angewandt, alle
118
Diskussion
weiteren Leukozyten wurden in der Masson-Goldner und HE-Färbung nachgewiesen.
Aufgrund der z.T. geringen verfügbaren Gruppengröße erfolgte die statistische Auswertung
der Häufigkeitverteilungen der Leukozytenpopulationen rein deskriptiv. Somit dienen die
angegebenen Werte als Orientierung und Häufigkeitsunterschiede zwischen Gruppen oder
Lokalisationen müssen entsprechend vorsichtig interpretiert werden.
In der bovinen Zitze wurden Zellen des angeborenen (Mastzellen, neutrophile Granulozyten,
Makrophagen) und des adaptiven (Lymphozyten, Plasmazellen) Immunsystems gefunden.
Insgesamt stellten Makrophagen den häufigsten Zelltyp dar, gefolgt von Lymphozyten und
Plasmazellen. Abweichend davon waren Mastzellen die häufigste Immunzellpopulation bei
den eutergesunden Färsen (Gruppe K1).
Die größte Zelldichte an Immunzellen insgesamt wies die Gruppe K1 auf, was v.a. auf dem
Reichtum an Mastzellen, Lymphozyten und Plasmazellen beruhte. Zwischen den anderen
Gruppen traten keine deutlichen Unterschiede in der Gesamtzellzahl auf, jedoch differierten
die Anteile der einzelnen Zellpopulationen. Zwischen den betrachteten Lokalisationen
Fürstenberg’sche Rosette und Zitzenzisterne sowie subepithelial und perivaskulär fanden sich
ebenfalls keine auffälligen Unterschiede für die Gesamtzahl der Abwehrzellen
In der Zitze wurden auch von anderen Arbeitsgruppen Makrophagen, Monozyten, neutrophile
und eosinophile Granulozyten, Lymphozyten sowie Plasmazellen gefunden (NICKERSON u.
PANKEY 1983; NICKERSON 1988, 1989; GREENHALGH et al. 1996). In einigen Fällen
wurden intrazisternal Zytokine und Bakterien als Stimulus einer Immunantwort verabreicht
(NICKERSON u. HEALD 1982; NICKERSON et al. 1989). So migrierten neutrophile
Granulozyten nach experimenteller Infektion des Euters mit E. coli aus dem Blutgefäß durch
das Epithel in die Milch (NICKERSON u. PANKEY 1984). Auch gesundes Zitzengewebe
zeigte eine bestimmte Verteilung der Leukozyten: so wanderten z.B. Plasmazellen als
vorherrschende einströmende Zellpopulation vorwiegend in das subepitheliale Bindegewebe
und penetrierten die Epithelzellen der Fürstenberg’schen Rosette hin zum Lumen der Zitze
(NICKERSON u. PANKEY 1983). Weiterhin waren Plasmazellen als Abwehrzellen in der
Zitze vorhanden (NICKERSON et al. 1984).
119
Diskussion
Mastzellen sind vor allem in Geweben, die in Kontakt zur äußeren Umgebung stehen, wie
z.B. in der Haut oder im Darm, zu finden, wo sie als „Wächterzellen“ gegen eindringende
Pathogene agieren (GALLI et al. 1999). Sie sind aufgrund folgender Eigenschaften als
wichtige Abwehrzellen zu berücksichtigen: Zum einen durch ihre Fähigkeit zur schnellen und
selektiven Mediatorsynthese als Beitrag zur Stimulation der angeborenen Immunabwehr. Zum
anderen sind sie durch ihre dichte Lokalisation zu Blutgefäßen in der Lage, die Rekrutierung
von Effektorzellen ins Gewebe, in Abhängigkeit ihrer sezernierten Mediatoren, zu verstärken.
Darüber hinaus können sie durch Antikörper-vermittelte Aktivierung die Immunantwort auf
Infektionen modulieren. Gefäßassoziierte Mastzellen beeinflussen Zytokin-abhängig die
Migration anderer Zellen (MARSHALL 2004).
In dieser Untersuchung wurden bei allen Tieren Mastzellen in allen untersuchten
Kompartimenten
der
Zitze
gefunden.
Mastzellen
zeigten
von
den
untersuchten
Immunzellpopulationen die deutlichsten Unterschiede zwischen den Untersuchungsgruppen.
Während sie bei den eutergesunden Färsen (Gruppe K1) sehr zahlreich vorkamen, waren sie
bei den älteren Kontrolltieren (Gruppe K2) deutlich seltener anzutreffen, noch seltener bei den
Tieren des Primingversuchs.
Mastzellen fanden sich im Euterparenchym vieler Haussäugetiere und Nager (NIELSEN
1975; STERBA et al. 1990; SZEWCZYK et al. 2000; DZODZIKOVA et al. 2005; COLITTI
u. FARINACCI 2009), in der Zitze des Rindes hingegen finden sie in der Literatur keine
Erwähnung.
Die große Zahl von Mastzellen bei den Tieren der Gruppe 1 könnte die Rekrutierung anderer
Zelltypen fördern. Dieses wird untermauert durch den Befund, dass die Gruppe K1 auch die
größte Anzahl an Lymphozyten und Plasmazellen zeigte. Denkbar wäre eine Mastzellvermittelte Stimulierung der Chemotaxis anderer Zelltypen, um eine Präsenz von
Effektorzellen in der Zitze vor der Laktation aufzubauen. Weiterhin wird beschrieben, dass
Mastzellen, die inflammatorischen Stimuli ausgesetzt sind, andere Phänotypen mit
veränderten Eigenschaften darstellen (IRANI et al. 1990; GOTIS-GRAHAM u. MCNEIL
1997). Geht man davon aus, dass die betrachteten Tiergruppen K2-V2b mehr intrazisternalen
Kontakt zu Pathogenen hatten als Gruppe K1, so wäre auch denkbar, dass eine Reduktion der
dort ansässigen Mastzellen mit einer Änderung des Phänotyps einhergehen könnte und jene,
wenigen Mastzellen durch exogene Stimuli effektiv auf Erregerabwehr geprimt wurden.
120
Diskussion
Weiterhin verfügen Mastzellen über ein sehr breites Zytokinspektrum von klassischen, proinflammatorischen Mediatoren wie TNF-α und IL-1β bis hin zu IL-10 und TGF-β, die mit
immunregulatorischen, anti-inflammatorischen Effekten assoziiert sind. Vor diesem
Hintergrund wäre es von Bedeutung, ob jene Mastzellen in noch nicht laktierenden Tieren
andere Subtypen von Mastzellen darstellen, als jene in den Gruppen K2-V2a. Betrachtet man
die Mastzellanzahl im subepithelialen Gewebe der Primingversuchstiere, so scheint eine
Infektion des Euters mit E. coli nach vorangegangenem LPS-Priming keinen Einfluss zu
haben.
Neutrophile Granulozyten erwiesen sich in den betrachteten Tiergruppen als die am
geringsten vertretene Zellpopulation. Sie waren nur in den Gruppen K2, V1b und V2b in
geringgradigem Maße zu finden. Dieses könnte bei den Gruppen V1b und V2b als Effekt in
Erwiderung auf die intrazisternale Applikation von LPS und spätere Infektion der Viertel mit
E. coli gewertet werden. Daraus ergibt sich das Ergebnis, dass die alleinige LPS-Applikation
keinen Effekt auf die Rekrutierung neutrophiler Granulozyten in die Zitzenzisterne und
Fürstenberg’sche Rosette hatte. Weiterhin führt es zu der Annahme, dass LPS, bezogen auf
die Migration neutrophiler Granulozyten in der Zitze, trotz identischer Signaltransduktion
über TLR4 / CD14 / LBP, als Stimulus nicht synonym zu ganzen Bakterien agiert.
Die Abwesenheit neutrophiler Granulozyten beinhaltet jedoch auch die Tatsache, dass so
keinerlei Gewebeschäden durch sezernierte antibakterielle Produkte, wie z.B. reaktive
Sauerstoffspezies, den Organismus schädigen können. Die Frage, inwieweit positive Effekte
einer effektiven Erregerbekämpfung an der Eintrittspforte für Erreger gegen schädigende
Einflüsse von neutrophilen Granulozyten auf Wirtsgewebe überwiegen, kann hier nicht
ausreichend geklärt werden. Jedoch wurde die mangelnde Präsenz neutrophiler Granulozyten
mit einer erhöhten Anfälligkeit für Pathogene assoziiert (BURVENICH et al. 2007).
Eine andere Hypothese zur Erklärung der Abwesenheit bzw. der geringen Anzahl neutrophiler
Granulozyten in diesem Abschnitt des Euters ist die Möglichkeit, dass sich der Hauptteil des
infektiösen Geschehens im dorsalen Bereich des Euters (Drüsenparenchym, Drüsenzisterne)
abspielt und das Zitzengewebe womöglich nach Etablierung einer Infektion eine
untergeordnete Rolle spielt. Nennenswert ist weiterhin, dass in keiner Tiergruppe neutrophile
Granulozyten im perivaskulären Gewebe zu finden waren, sondern nur im subepithelialen
121
Diskussion
Gewebe ansässig waren. Dieses spricht für das Wirken chemotaktischer Faktoren, die die
Zellen schnell in Richtung Epithel migrieren lassen und reflektiert so die zellulären
Wechselwirkungen im distalen Abschnitt der Zitze.
Gruppe V2b zeigte mehr neutrophile Granulozyten als Gruppe V2a (Tab. 9). Dieses könnte
daraufhin deuten, dass das Priming über 240 h einen Reiz ausübt, der zu einem
langanhaltenden Influx neutrophiler Granulozyten führt. Jedoch gilt auch in diesem Fall die
Tatsache, dass das lokale Umfeld von Zellen deren Expressionsmuster beeinflusst. Auch
neutrophile Granulozyten können, z.B. unter Einwirkung von Lipoxin A4, welches gegen
Ende einer Entzündung vermehrt synthetisiert wird, die Synthese von Superoxid Anionen als
antibakterielles Agens vermindern und einstellen (PAPAYIANNI et al. 1996). Sieht man den
Zeitraum von 240 h der LPS-Exposition als „primende Entzündung“ an, wäre nach
LAWRENCE et al. (2002) nach 24 h ein Stop der migrierenden neutrophilen Granulozyten in
das Gewebe zu erwarten gewesen. Nach diesem Zeitrraum findet ein Wechsel der
Zellpopulationen statt, indem resolutionsfördernde Zellen,
wie antiinflammatorisch
polarisierte mononukleäre Zellen, in das Gewebe einwandern und die Migration neutrophiler
Granulozyten in das inflammatorische Gewebe gestoppt wird (LAWRENCE et al. 2002).
Dieses scheint hier jedoch nicht der Fall zu sein, da nach 240 h mehr neutrophile
Granulozyten in der Zitze zu finden waren als nach 72 h.
In den hier untersuchten Geweben der Zitze wurden keine eosinophilen Granulozyten
gefunden. Auch das Priming mit LPS hatte auf die Einwanderung eosinophiler Granulozyten
in die Zitzen keinen Einfluss. Berichte über das Vorkommen eosinophiler Granulozyten in der
Zitze sind selten. In Zitzen Staph. aureus-infizierter Kühe und zusätzlicher IL-2- oder IFNγApplikation kamen eosinophile Granulozyten in größerer Anzahl als neutrophile
Granulozyten vor (QUIROGA et al. 1993). Zudem gibt es Hinweise auf das Vorkommen
eosinophiler Granulozyten in der Zitze in Verbindung mit parasitären Infektionen (BEYTUT
et al. 2005).
Makrophagen stellten bei allen Gruppen, mit Ausnahme der Gruppe V2, den häufigsten
Immunzelltyp in der Zitze dar. Färsen zeigten wiederum die größte Anzahl an Makrophagen.
Verschiedene ortsständige Zellen, wie z.B. Endothelzellen und Lymphozyten, locken mittels
ihrer sezernierten Chemokine andere Zellen in das Gewebe. So ist z.B. CCL2 für die
122
Diskussion
Rekrutierung mononukleärer Zellen in inflammatorisches Gewebe verantwortlich. Die Anzahl
residenter Zellen reflektiert so das im Gewebe vorherrschende Chemokinmilieu. Dieses
würde bedeuten, dass bei Färsen in der Zitze ein anderes Chemokinmilieu vorherrscht als bei
laktierenden, adulten Kühen. Die gewebespezifische Zellzusammensetzung ändert sich, wie
auch beim Schwein beschrieben, in Verbindung mit dem Reproduktionszyklus (BISCHOF et
al. 1994). In diesem Zusammenhang sind auch hormonelle Einflüsse (z.B. Oxytocin während
der Laktation) zu berücksichtigen, die initial als Botenstoffe für Zellen agieren und für einen
physiologischen, zyklusabhängigen Zellinflux in das Gewebe sorgen. Zum Beispiel
beeinflusst auch Östrogen in Endothelzellen die Expression von Enzymen des
Arachidonsäuremetabolismus (SOBRINO et al. 2009) und trägt so zur Polarisierung eines
eher pro-oder antiinflammatorischen Milieus bei. So könnte auch die vermehrte Anzahl von
Makrophagen bei Färsen das Ergebnis eines speziellen Hormonstatus vor der Laktation,
verglichen zu adulten, laktierenden Tieren, sein.
Die Präsenz von Makrophagen im Euter unter inflammatorischen Bedingungen sowie deren
morphologische Vielgestaltigkeit ist beschrieben (NICKERSON et al. 1989; OVIEDOBOYSO et al. 2007). Das Aufkommen an Makrophagen in der Gruppe K2 könnte eine Art
„Normalzustand“ repräsentieren, da die adulten, eutergesunden und laktierenden Rinder zum
Zeitpunkt der Probennahme nicht an Mastitis erkrankt waren, jedoch in Vergleich zu Gruppe
K1 in Laktation waren und aufgrund ihres Alters mit großer Wahrscheinlichkeit bereits
galaktogenen Erregerkontakt hatten.
Gruppe K1 zeigte die höchste relative Häufigkeit an Makrophagen in der Fürstenberg’schen
Rosette. Wie oben bereits genannt, wies diese Gruppe keinerlei neutrophile Granulozyten auf.
Die Migration neutrophiler Granulozyten in die Zitze ist ungeklärt. Möglicherweise verläuft
die Wanderung der Zellen dabei von der Zitzenzisterne nach distal in Richtung
Fürstenberg’sche Rosette (NICKERSON u. PANKEY 1984). Eventuell beeinflusst dabei die
An- oder Abwesenheit jener neutrophilen Granulozyten die Verteilung der einwandernden
Makrophagen. Versteht man die Fürstenberg’sche Rosette mit ihrer gefalteten Struktur als
Adhäsionsfläche für Erreger, könnte die dominierende Makrophagenpopulation in der
Zitzenzisterne der Gruppe K1 als proximale Einrichtung zur Erregerbekämpfung agieren, so
dass es zu einem „Einschluss“ von Keimen erstens durch den distal begrenzenden Strichkanal
und zweitens die proximale Zellpopulation der Zitzenzisterne kommt. Möglicherweise kommt
123
Diskussion
es
dann
erst
durch
die
Invasion
von
Erregern
zu
der
Umverteilung
der
Makrophagenpopulation in die Fürstenberg’sche Rosettte. Vor diesem Hintergrund sind die
dominierenden Makrophagen in 72 h geprimten Vierteln in der Fürstenberg’schen Rosette zu
erklären. Dagegen spricht jedoch, dass die Tiere des 240 h Priming-Versuches wieder
vermehrt Makrophagen in der Zitzenzisterne zeigten (Tab. 10).
Wie Tab. 10 zeigt, waren Makrophagen, im Gegensatz zu neutrophilen Granulozyten, in ganz
entscheidender Anzahl auch perivaskulär zu finden. Blutgefäße in mit Mycobacterium bovis
infizierten Vierteln wiesen Akkumulationen mononukleärer Zellen im perivaskulären Gewebe
auf (NICKERSON u. NONNECKE 1986). Möglicherweise herrscht perivaskulär ein
Zytokinmilieu, welches die frisch migrierten Makrophagen in einen aktivierten Zustand
versetzt und somit ausstattet, um funktionell nach den erforderlichen Bedingungen des
Gewebes zu reifen. Denkbar wäre z.B., dass bestimmt Typen von Makrophagen perivaskulär
lokalisiert sind, die durch die Expression proinflammatorischer Zytokine wie IL-1β und TNFα andere, naive Monozyt-ähnliche Makrophagen in Richtung M1 Makrophagen polarisieren.
Dieses setzt allerdings voraus, dass im umgebenden Gewebe entzündliche Prozesse ablaufen,
die die Rekrutierung weiterer klassisch aktivierter Makrophagen benötigen. Denkbar wäre
auch, dass jene perivaskulär primenden Makrophagen über den Verlauf einer Entzündung
ihren
Phänotyp
ändern,
hin
zu
M2
Makrophagen
mit
regulatorischen
und
entzündungsmodulierenden Eigenschaften. Dieses würde einhergehen mit Beobachtungen,
die eine Veränderung des Phänotyps einer bereits bestehenden Makrophagenpopulation
beschreiben (MOSSER u. EDWARDS 2008; FAIRWEATHER u. CIHAKOVA 2009).
In Abschnitt 4.2 wurden bereits die vielgestaltigen Erscheinungsformen von Makrophagen in
der Fürstenberg’schen Rosette und Zitzenzisterne beschrieben. Bestimmte morphologische
Eigenschaften stehen in Verbindung mit der Ausprägung eines bestimmten funktionellen
Makrophagentyps (OVIEDO-BOYSO et al. 2007). Diese Beobachtung reflektiert die
Plastizität dieses Zelltyps. So gibt ein Schnitt die in vivo Situation in der Zitze wieder und
zeigt unterschiedliche temporäre Zustände von Makrophagen. Runde, mit wenigen
Zellausläufern ausgestattete, homogen erscheinende Makrophagen haben möglicherweise erst
vor kurzem das Blutgefäß verlassen und stehen zu Beginn des Differenzierungsprozesses. So
wurden diese Makrophagen als Monozyt-ähnliche Makrophagen bezeichnet (SLADEK et al.
2006). Größere, vakuolisierte, mit Zellausläufern ausgestattete Makrophagen repräsentieren
124
Diskussion
möglicherweise residente, hochdifferenzierte Gewebemakrophagen. Die Darstellung einer so
heterogenen Zellpopulation reflektiert auch die Vielgestaltigkeit der Mikroumgebung dieser
Zellen. Somit stellt sich die Frage, welchen „primenden Faktoren“ die aus den Blutgefäßen
migrierenden Makrophagen begegnen.
Gruppe K2 zeigte eine homogene Verteilung von Lymphozyten in der Fürstenberg’schen
Rosette und in der Zitzenzisterne. Lymphozyten waren vermehrt im subepithelialen, weniger
im perivaskulären Gewebe der Zitze zu finden (Tab. 11). Allein in Gruppe K1 fanden sich
Ansammlungen von Lymphozyten in der Nähe zu Mastzellen in der Fürstenberg’schen
Rosette (Abb. 13, A). Das intramammäre LPS-Priming führte zu keiner Induktion von
Lymphfollikel oder Lymphozytenaggregaten. Auch Gruppe K2 wies keinerlei lymphoidfollikuläre Strukturen in der Zitze auf. Es gibt Hinweise auf die Bildung von Lymphfollikeln
in der Zitze, allerdings in Zusammenhang mit der Applikation von Mycobacterium bovis. Die
Präsenz einer solch residenten Lymphozytenpopulation stellt ein Ziel zur Auslösung einer
Immunantwort nach Antigen Kontakt dar (NICKERSON u. NONNECKE 1986;
NICKERSON et al. 1989). Lymphfollikel-ähnliche Strukturen nach intrazisternaler
Applikation von Bakterien treten auch in der Zitzenzisterne von Schafen auf (FRAGKOU et
al. 2009). Die Anwesenheit der Follikel wird als protektive Einrichtung gegen aszendierende
Erreger angesehen. Die höhere Inzidenz an Mastitiden mit zunehmendem Alter wird auf die
geringer werdende Immunkompetenz der Lymphozyten zurückgeführt.
Die mögliche protektive Funktion solcher Lymphfollikel stellt die Frage nach einer
möglichen Induktion jener follikulären Strukturen nach intramammärer Applikation diverser
Stimuli. Eine intrazisternale Applikation von Mycobacterium bovis induziert jedoch
möglicherweise eine andere zelluläre Immunantwort, die Erreger-spezifisch zu einer
granulomatösen Entzündung führt. Diese Form der Entzündung gilt nicht für Entzündungen
verursacht durch E. coli oder Staph. aureus. Daher könnte es sich um eine spezifische
Reaktion gegenüber Mycobacterium bovis handeln, die so auf andere Erreger nicht
übertragbar ist. Betrachtet man jedoch die Anwesenheit von Lymphozytenaggregaten wie
allgemein unter dem Aspekt einer möglichen Zielpopulation einer intrazisternalen
Vakzinierung, so wäre nach den hier vorliegenden Ergebnissen der Zeitraum vor der
Laktation mit der anwesenden Zellpopulation zur Stimulation einer Immunantwort am besten
125
Diskussion
dafür geeignet. Interessant ist allerdings auch, dass eine Zunahme an Lymphozyten in der
Zitzenzisterne der Priming-Versuchsgruppen zu verzeichnen war (Tab. 11). Fraglich ist
jedoch, ob diese Zunahme in der Bildung von Lymphfollikeln gipfeln würde. Die oben
erwähnte schwindende Immunkompetenz der Lymphozyten mit zunehmendem Alter des
Tieres ist jedoch, bezogen auf die hier untersuchten Tiergruppen, äußerst spekulativ. Das in
dieser Arbeit beobachtete ‚Verschwinden‘ lymphozellulärer Ansammlungen bei laktierenden
Tieren
mag andere
Gründe haben,
wie z.B.
das
laktationsabhängig
veränderte
Chemokinspektum im Zitzengewebe, welches unmittelbaren Einfluss auf Anlockung und
zelluläre Organisation vor Ort hat. Auch könnte der altersbedingt zunehmende Anteil
kollagener Fasern in der Zitze Einfluss auf die Anwesenheit von Leukozytenpopulationen
haben. Systematische Untersuchungen hierzu liegen in der Literatur -soweit ersichtlich- noch
nicht vor.
Die hier nachgewiesenen Lymphozyten lassen sich in den angewendeten Übersichtsfärbungen
nicht näher charakterisieren. Es kann sich sowohl um verschiedene T-Zell-Subpopulationen
als auch um B-Zell-Subpopultionen mit Ausnahme differenzierter Plasmazellen handeln.
NICKERSON
und
NONNECKE
(1986)
postulieren,
dass
es
sich
bei
jenen
Lymphozytenpopulationen im distalen Bereich der Zitze um spezifisch sensibilisierte TLymphozyten handelt, die in Antigen-exponiertes Gewebe, wie z.B. das Euter, „homen“.
Daraus lässt sich schließen, dass die luminale Seite der Zitzenzisterne und der
Fürstenberg’schen Rosette als Gebiet des Erregerkontaktes in Frage kommt. Weiterhin kann
eine Makrophagen-spezifische Beeinflussung der T-Zell-Proliferation stattfinden. So zeigten
Mitogen-aktivierte T-Zellen in Anwesenheit von M2 Makrophagen eine signifikant
reduzierte, proliferative und sekretorische Zellantwort (SCHEBESCH et al. 1997). Wie in
Abschnitt 4.2 beschrieben, waren in der bovinen Zitze M2 Makrophagen zu finden und
könnten mittels ihrer sezernierten Mediatoren auch die dort anwesenden Lymphozyten
beeinflussen. Mastzellen waren in der Nähe von Lymphozytaggregaten lokalisiert. Sie stellen
weiterhin durch ihre LTB4-Sekretion chemoattraktive Signale zur Rekrutierung von CD8+TZellen bereit (OTT et al. 2003). Zur genaueren Identifikation dieser wichtigen Zellpopulation
in der Zitze würden sich CD4-/CD8- spezifische Lymphozyten-Antikörper anbieten.
126
Diskussion
Gruppe K2 zeigte eine homogene Verteilung von Lymphozyten in der Fürstenberg’schen
Rosette und in der Zitzenzisterne. Hier findet sich eine Parallele zur betrachteten
Makrophagenpopulation der Gruppe K2, die auch keine spezifische Verteilung in den beiden
betrachteten Lokalisationen zeigte. Eventuell ist bei adulten, pluriparen Tieren der distale
Abschnitt der Zitze als einheitliche Struktur mit einer eher konstanten Verteilung an Zellen zu
sehen, wohingegen sich in jungen, uniparen Tieren die Zellpopulationen in verschiedenen
Phasen der Entwicklung des Euters „ausrichten“.
In den hier betrachteten Tiergruppen waren Plasmazellen einheitlich gut charakterisierbar und
stellten keine morphologisch heterogene Population, wie etwa bei den Makrophagen
beschrieben, dar. Die Anwesenheit von Plasmazellen beschränkte sich auf das subepitheliale
und perivaskuläre Gewebe, es wurden keine Plasmazellen zwischen Epithelzellen gefunden.
Die Tiere des Primingversuchs zeigten die größte Häufigkeit subepithelialer Plasmazellen in
der Fürstenberg’schen Rosette (Tab. 12). In einigen betrachteten Tiergruppen fand sich eine
große Anzahl jener Zellen (Tab. 12), wobei z.B. in Gruppe K1 mehr Plasmazellen im
subepithelialen Gewebe zu finden waren, als im perivaskulären Gewebe. Adulte, laktierende,
eutergesunde Rinder wiesen den geringsten Anteil an Plasmazellen auf. Plasmazellen wurden
außerdem in der Nähe zu Makrophagen aufgefunden. Die relative Häufigkeit bei den Tieren
des LPS-Primingversuchs lagen über denen der Gruppe K2.
In Zitzen von infizierten und nicht-infizierten Vierteln waren Plasmazellen als vorherrschende
Zellpopulation zu finden. Auch in Erwiderung auf die intrazisternale Applikation von IL-2
hin wurden verstärkt Plasmazellen in die Zitze rekrutiert. Dieser Rekrutierung wurden
protektive Effekte zugeschrieben (NICKERSON u. PANKEY 1983; NICKERSON et al.
1989). Weiterhin waren Plasmazellen in der Zitze als heterogene Zellpopulation vorhanden,
bedingt durch die Synthese verschiedener Antikörper-Isotypen und anhand morphologischer
Unterschiede (NICKERSON 1988).
Wie schon unter 2.2 erwähnt, verläuft die Infiltration von Zellen von proximal nach distal,
sprich, von der Zitzenzisterne in Richtung Fürstenberg’sche Rosette. Vor diesem Hintergrund
ist es interessant, dass die Tiere des Primingversuchs die größte Anzahl subepithelialer
Plasmazellen in der Fürstenberg’schen Rosette zeigten (Tab. 12). Möglicherweise zeigt dieses
die Endphase der Migration dieser Zellen. Dagegen spricht jedoch die zunehmende Anzahl
127
Diskussion
von Plasmazellen in der Zitzenzisterne mit zunehmener Versuchsausdehnung der
Priminggruppen sowohl im perivaskulären, als auch im subepithelialen Gewebe. Nicht zu
vergessen ist auch die Mikroumgebung der Plasmazellen. So zeigt z.B. Abb. 12 Makrophagen
in dichter Assoziation zu Plasmazellen. Denkbar wäre ein chemotaktischer Einfluss der
Makrophagen auf jene Plasmazellen. Bei alledem erscheint jedoch wichtig, das
Hauptaugenmerk auf die prominente Präsenz dieser Zellen im subepithelialen Gewebe und
damit auf die Nähe zum Antigenkontakt zu legen, stellen Plasmazellen doch aufgrund ihrer
Immunglobulinsynthese eine hocheffektive und kompetente Immunzelle dar. Es muss jedoch
auch erwähnt werden, dass über die hier in situ nachgewiesenen Plasmazellen keinerlei
funktionelle Aussage getroffen werden kann. Ob die hier lokalisierten Plasmazellen in der
Lage wären, z.B. nach Kontakt mit E. coli-Bakterien spezifische, neutralisierende Antikörper
zu sezernieren, kann nur spekuliert werden.
In der Literatur finden sich weiterhin Hinweise, dass Plasmazellen auch direkt zwischen
Epithelzellen der Zitzenzisterne lokalisiert sein können (NICKERSON u. PANKEY 1983),
welches weiterhin deren Bedeutung im distalen Abschnitt der Zitze unterstreicht. In den hier
untersuchten Tiergruppen konnte diese Beobachtung nicht gemacht werden, Plasmazellen
waren lediglich subepithelial und im perivaskulären Gewebe lokalisiert.
Die geringe Anzahl Plasmazellen der Gruppe K2 könnte eine Art „steady state“
repräsentieren, der durch eine gewisse Präsenz von Plasmazellen charakterisiert ist, um gegen
aszendierende Erreger präsent zu sein, jedoch nach Eintritt eines Stimulus erweiterbar ist, so
dass unter akuten, inflammatorischen Bedingungen eine Vielzahl an Plasmazellen am Ort des
Geschehens
vorliegen
könnte.
Dafür
sprechen
die
Werte
der
Tiere
der
Primingversuchsgruppe, die höher lagen als jene von K2. Man muss aber auch erwähnen, dass
es durch die Applikation von LPS und nachfolgender Infektion mit E. coli in der Regel zu
subklinischen Mastitiden kam, die von klinisch manifesten Mastitiden abgegrenzt werden
müssen. Die Dominanz von Gruppe K1 bezüglich der Anzahl der vorliegenden Plasmazellen
stellt möglicherweise eine Art „Ausgangssituation“ der Zellen vor Laktation dar. Dieses
würde bedeuten, dass die bovine Zitze zwar mit vielen Immunzellen ausgestattet ist, die
Laktation jedoch zu einer Verringerung dieser anwesenden Zellen führt. In diesem
Zusammenhang muss auch noch einmal darauf hingewiesen werden, dass der Schwerpunkt
des Mastitisgeschehens mit den einhergegehenden histologischen Veränderungen auf dem
128
Diskussion
dorsalen Drüsenparenchym liegen könnte und die Zitze einerseits in Resonanz des
Mastitistyps ein gewisses Zellbild repräsentieren könnte oder andererseits, vollkommen
autark agieren könnte.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass die Färsen aus Gruppe K1 die größte Anzahl an
Leukozyten in der Zitze zeigten. Auffallend war ebenfalls, dass jene Gruppe über alle
betrachteten Subtypen von Zellen konstant hohe Werte zeigte, mit Ausnahme von
neutrophilen Granulozyten. In diesem Zusammenhang sollte jedoch auch die geringe Tierzahl
der Gruppe K1 erwähnt werden, wodurch die Aussagekraft der Erhebungen an dieser Gruppe
kritischer betrachtet werden sollte als an den anderen Tiergruppen. Vergleicht man die
einzelnen Tiergruppen übergreifend bezüglich der Immunzellpopulationen, so war eine
geringgradig erhöhte Anzahl der meisten Zelltypen (Mastzellen, neutrophile Granulozyten,
Makrophagen, Lymphozyten und Plasmazellen) in der Zitzenzisterne (subepithelial) in den
mit E. coli inokulierten Gruppen des Primingversuchs (V1a vs. V1b; V2a vs. V2b) zu
verzeichnen. Diese Tatsache spricht für einen chemotaktischen Effekt der applizierten E. coli
Infusion in die Zitze und gibt somit Hinweise auf die Ansprechbarkeit des distalen
Zitzenabschnittes auf intrazisternal verabreichte Agentien. Im perivaskulären Gewebe der
verglichenen Tiergruppen zeigte sich dieser Trend nicht, was darauf hindeutet, dass
chemotaktische Signale die einwandernden Zellen rasch in Richtung Epithel fördern. Es sollte
jedoch auch darauf hingewiesen werden, dass die Kontrolltiere (K1 und K2) nicht zu
derselben Versuchsreihe gehörten und andere Bedingungen erfahren haben als jene Tiere der
Primingversuchsreihe. Es sei auch auf die unterschiedlichen Rassen der Tiere hingewiesen,
welche einen Einfluss auf die Zellzusammensetzung haben könnten.
Vergleicht man weiterhin die beiden betrachteten Lokalisationen (Fürstenberg’sche Rosette
und Zitzenzisterne) gruppenübergreifend, so stellt sich eine in etwa gleiche Verteilung der
dort anwesenden Zellen dar. Es zeigte sich keine Zellpopulation, die ausschließlich in dem
einen oder anderen Teil der Zitze vertreten wäre, welches bezüglich unterschiedlicher
Leukozytenpopulationen für ein einheitlich funktionelles Kompartiment des distalen
Zitzenabschnittes spricht.
129
Diskussion
5.3 Differenzierung von Makrophagenpopulationen in der Zitze
Die Makrophagenpopulationen in der bovinen Zitze wurden immunhistochemisch mit Hilfe
der beiden Antikörper MAC387 und AM-3K differenziert. Beide Antikörper reagierten gut
mit Formalin fixiertem, Paraffin eingebettetem Material nach Vorbehandlung mit
Demaskierungslösung P. Beide Antikörper reagierten nicht an mit Bouin’scher Lösung
fixiertem Material. Der klassische Makrophagenantikörper CD68 wurde in dieser
Untersuchung nicht verwendet, da er zu unspezifisch an bovinem Gewebe reagiert
(WANGOO et al. 2005; OLIVEIRA u. HANSEN 2008) und wenig zur Abgrenzung von
Makrophagen-Subpopulationen geeignet ist.
In der bovinen Zitze waren Makrophagen mit Hilfe beider Antikörper darstellbar.
Überwiegend handelte es sich um getrennte Subpopulationen, da in Serienschnitten
unterschiedliche Zellindividuen angefärbt wurden. Darüber hinaus war eine kleine Population
vorhanden, die mit beiden Antikörpern reagierte.
Bei der semiquantitiativen Auswertung der Makrophagenpopulationen zeigte sich in der
gesunden, bovinen Zitze eine spezielle Verteilung: In der Fürstenberg’schen Rosette wie auch
in der Zitzenzisterne dominierten im subepithelialen Gewebe MAC387 positive
Makrophagen. Im perivaskulären Gewebe der Fürstenberg’schen Rosette waren dagegen
vermehrt AM-3K-positive Makrophagen feststellbar. Im perivaskulären Gewebe der
Zitzenzisterne war die Verteilung der beiden Populationen gleich.
Von dem Antikörper MAC387 wird Calprotectin nachgewiesen, ein Heterokomplex aus
S100A8 und A9 (FOELL et al. 2007; PERERA et al. 2010). Bei S100 Proteinen handelt es
sich um „DAMP“-assoziierte Moleküle, für die unter anderem eine starke Expression in
inflammatorischem Gewebe beschrieben wurde (FOELL et al. 2007). Somit ist die
Expression des Proteins von Makrophagen in der Zitze nicht verwunderlich. Im Strichkanal
und in der Fürstenberg’schen Rosette gesunder Rinder wurde auch die Expression weiterer
S100 Proteine (S100A7) mittels quantitativer real-time PCR nachgewiesen (TETENS et al.
2010).
Der Antikörper AM-3K hat als Zielstruktur den Hämoglobin-Haptoglobin-Rezeptor CD163.
Bei der mikroskopischen Auswertung fielen weiterhin morphologische Unterschiede der
Makrophagen auf (Abb.16-20): Wie bereits unter 4.2 beschrieben, zeigten MAC387 positive
Makrophagen eine runde, bis spindelförmige Zellform und waren ohne Zellausläufer. AM-3K
130
Diskussion
positive Makrophagen hingegen waren größer als MAC387-positive, und hatten
langgestreckte Zellausläufer. Unterschiedliche Phänotypen von Makrophagen können mit der
Resolutionsphase einer Entzündung im bovinen Euter in Verbindung stehen (SLADEK et al.
2006). Jedoch entspricht es der Natur des Makrophagen, eine sehr heterogene Population
darzustellen, die je nach Mikroumgebung morphologisch sehr vielgestaltig sein kann.
Zusätzlich fiel in Serienschnitten auf, dass die Population der durch die beiden Antikörper
nachgewiesenen Makrophagen uneinheitlich war (Abb. 15 und Abb. 16). So fanden sich
Makrophagen, die jeweils ausschließlich für den einen, oder für den anderen Antikörper
positiv waren. Zusätzlich gab es Makrophagen, die von beiden Antikörpern positiv detektiert
wurden und eine Art Schnittmenge bildeten. Diese Abgrenzung in der Nachweisbarkeit weist
auf die funktionelle Heterogenität der nachgewiesenen Makrophagen hin. So wurde
beschrieben, dass es sich bei AM-3K positiven Makrophagen um Makrophagen im späten
Differenzierungsstadium handelt (ZENG et al. 1996a; YAMATE et al. 2000), wohingegen
MAC387 positive Makrophagen mit frisch rekrutierten, Monozyt-ähnlichen Makrophagen
genannt wurden (STRIZ u. TREBICHAVSKY 2004). Es kann hier allerdings nicht
vollständig gesichert werden, ob die hier nachgewiesenen Makrophagentypen sich vor Ort
funktionell, wie z.B. durch Sekretion eines anderen Mediatorspektrums auszeichnen.
Die Tatsache, dass MAC387 positive Makrophagen vermehrt subepithelial vorkamen, könnte
auf eine proinflammatorische Polarisierung (M1 Makrophage) hindeuten. Dem natürlichen
Invasionsweg der Erreger zugewandt, flankieren sie die exponierte, luminale Seite der Zitze
als antimikrobielle Zelle. Des Weiteren bindet der S100A8/A9-Komplex an carboxylierte
Endothelproteine, welches einen notwendigen Prozess zur Adhäsion weiterer Leukozyten
darstellt (KERKHOFF et al. 2001). Dieses könnte die Migration neutrophiler Granulozyten
als entzündungsfördernde Zellen ins Gewebe erleichtern. Neuere Veröffentlichungen
beschreiben jedoch die S100A8/A9-abhängige Hemmung des Sauerstoffmetabolismus in
neutrophilen Granulozyten in vitro und schreiben somit dem Protein antioxidative
Eigenschaften zu (SROUSSI et al. 2010). Weiterhin kommt es zur Interaktion von
S100A8/A9
im
Zusammenhang
des
Fettsäurestoffwechsels:
In
Komplexen
mit
Arachidonsäure bindet S100A8/A9 an den Scavenger Rezeptor CD163 auf Endothelzellen,
und fördert so die Aufnahme von Fettsäuren. Wie bereits in Abschnitt 2.5.1 beschrieben,
können Derivate des Fettsäurestoffwechsels antiinflammatorische Eigenschaften haben, wie
131
Diskussion
z.B. Lipoxine und Resolvine. Dieses könnte in Zusammenhang stehen mit den in der
Fürstenberg’schen Rosette vermehrt auftretenden AM-3K positiven Makrophagen, die als
alternativ und antiinflammatorisch polarisiert angesehen werden können (M2 Makrophagen).
So würde sich ergeben, dass die M2 Makrophagen perivaskulär eine antiinflammatorisch
polarisierte
Zone
bilden,
wohingegen
die
MAC387-
Makrophagen
luminal
und
proinflammatorisch orientiert sind und damit eher einem M1 Makrophagentyp entsprechen. In
diesen Zusammenhang passt auch die Beobachtung, dass Monozyten und Makrophagen, die
S100A8/A9 exprimieren, sehr hohe Mengen an TNF-α sezernieren (KERKHOFF et al. 1999)
und die TNF-α Sekretion in humanen und murinen Makrophagen durch S100A8/A9
induzierbar ist (XU u. GECZY 2000; VIEMANN et al. 2005). Darüber hinaus könnte eine
Rolle spielen, dass sich inflammatorische Stimuli wie z.B. IFN+LPS vermutlich eher in
Richtung des luminalen Gewebes anzutreffen sind, als im tieferen, perivaskulären Gewebe.
Da diese Beobachtungen an Tiergruppe K2, d.h. an adulten, eutergesunden Rindern
durchgeführt wurden, ist wahrscheinlich dass die Verteilung der MAC387- und AM-3Kpositiven Makrophagen und die damit postulierte M1-/M2-Verteilung die physiologische,
zelluläre Situation in der Zitze repräsentiert. Es konnte nie ausschließlich eine Population in
einem größeren Gebiet gesehen werden. Die Mischpopulation aus sowohl M1 als auch M2
Makrophagen zeigt, dass es sich immer auch um ein Gleichgewicht des Gewebes aus
Inflammation, Resolution und Regeneration handeln könnte. So wurde nachgewiesen, dass
von alternativen (M2) Makrophagen sezerniertes IL-10 und TGF-β die Sekretion von TLR-4
vermitteltem TNF-α und IL-1β von Makrophagen hemmt (BOGDAN et al. 1992). Dieses
könnte funktionell in Zusammenhang mit den resolutionsfördernden Eigenschaften der M2
Makrophagen zusammenhängen, die als begrenzende Zellen zu einer Beendigung der
Entzündung aktiv beitragen.
Erwähnenswert ist außerdem noch die Beobachtung der „Schnittmenge“ beider Antikörper,
sprich, der positive Nachweis derselben Makrophagen durch beide Antikörper. Wie oben
beschrieben, markierte AM-3K eher Makrophagen im späten Differenzierungsstadium,
wohingegen MAC387 früh differenzierte Makrophagen inklusive Monozyten nachwies. Es
liegt nahe, dass es während des Differenzierungsprozesses zu Veränderungen der
Oberflächenexpression kommt und sich der Nachweis nicht starr auf definierte
Differenzierungsstadien festlegen lässt. Die Frage ist weiterhin, ob es sich bei dieser
132
Diskussion
Mischpopulation um Makrophagen im mittleren Differenzierungsstadium handelt, die jeweils
beide Zielstrukturen der Antikörper exprimieren oder ob es möglicherweise andere
Oberflächenstrukturen gibt, die die Makrophagen in Assoziation mit CD163 und S100A8/A9
vereint. Zur genaueren Bestimmung des Phänotyps dieser Makrophagen wäre es hilfreich,
direkt das Zytokinexpressionsprofil dieser Zellen analysieren zu können.
Die Morphologie der AM-3K positiven Makrophagen mit ihren zahlreichen Zellausläufern
lässt vermuten, dass es sich um dendritische Zellen handeln könnte. In der Literatur wird
jedoch ausdrücklich auf die negative Reaktivität des Antikörpers mit dendritischen Zellen
hingewiesen (ZENG et al. 1996a). Darüber hinaus wurde die negative Reaktivität dieses
Antikörpers für Langerhans Zellen in verschiedenen Tierarten gezeigt (ZENG et al. 1996a;
YAMATE et al. 2000; KAWASHIMA et al. 2004). Es ist jedoch nicht auszuschließen, dass
es sich auch um eine Zwischenpopulation (Makrophagen/dendritische Zellen) handeln könnte,
die z.B. in Richtung Lymphknoten wandern. Der Nachweis spezifischer, dendritischer ZellAntigene mittels Antikörpern, oder auch der Nachweis von Makrophagen mittels AM-3K in
Lymphknoten könnte diese Frage klären.
Zusammenfassend lässt sich sagen, dass sich in eutergesunden, laktierenden Rindern
unterschiedliche Typen von Makrophagen in der Zitze nachweisen ließen. Zur Entstehung
dieser unterschiedlichen Typen können mehrere Faktoren, wie z.B. Laktationstadium,
vorhergegegangener Erregerkontakt und Allgemeingesundheit des Tieres beigetragen haben.
Trotzdem ermöglicht der Nachweis unterschiedlicher Populationen Perspektiven hinsichtlich
der Beeinflussung der zellulären Abwehr im distalen Teil der Zitze.
5.4 Modulation von Makrophagen durch PGE2
Wie in 2.4.1 beschrieben, ist die Makrophagenpopulation von ausserordentlicher
Heterogenität geprägt. Der Nachweis unterschiedlicher Makrophagenpopulationen im Euter
mittels Immunhistochemie bestätigt deren Plastizität und funktionelle Polarität. In diesem
Zusammenhang stellt sich die Frage, welches Differenzierungspotential von bovinen, in vitro
generierten Monozyten ausgeht, bzw. mittels welches Zytokinspektrums sie ihrer
Funktionalität Ausdruck verleihen. Überdies wurde untersucht, inwieweit sich die
Anwesenheit von PGE2 als Immunmodulator auf den Differenzierungsprozess und den
Phänotyp in vitro generierter Makrophagen auswirkt. Dieser Versuch diente der Simulation
133
Diskussion
inflammatorischer in vivo Bedingungen, indem in inflammatorisches Gewebe rekrutierte
Monozyten
im
frühen
Stadium
ihres
Differenzierungsprozesses
zu
Makrophagen
Entzündungsmediatoren wie PGE2 begegnen. Ihre funktionelle Polarität spiegelt sich anhand
ihres Zytokinexpressionsprofils wider und gibt Aufschluss über deren Phänotyp.
Zunächst sollte jedoch folgendes genannt werden: die unterschiedlichen Phänotypen von
Makrophagen werden unter dem Aspekt der sie umgebenden Stimuli, wie z.B. IFN+LPS oder
IL-4 und IL-13 geprägt (MANTOVANI et al. 2004). Zieht man nun Parallelen der in vitro
generierten Makrophagen zu jenen, von Mantovani und anderen Arbeitsgruppen
beschriebenen Zelltypen, so muss gesagt werden, dass in vitro eine frühere Prägung stattfindet
und die Literatur nur bedingt auf die in vitro Versuche anwendbar scheint. So treffen die
eingesetzten Stimuli der Differenzierung (hier PGE2 und LPS) auf mehr oder minder naive
Monozyten des peripheren Blutes, um dann unter deren Einfluss zu Makrophagen zu
differenzieren. MANTOVANI et al. (2004) hingegen beschreiben bereits differenzierte, durch
den Prozess der Reifung polarisierte Makrophagen, die verschiedenen Stimuli exponiert sind.
Dieser zeitliche Faktor der einwirkenden Stimuli ist, ebenso wie Zusammensetzung der
Mikroumgebung und das Zusammenspiel anderer Mediatoren, vor der Interpretation der
Ergebnisse von Bedeutung.
Sowohl Makrophagen, denen PGE2 am Ende des Differenzierungsprozesses zugegeben
wurde, als auch solche, die unter PGE2 ausdifferenzierten, exprimierten in quantifizierbarem
Maße mRNA von CXCL8. Dieses belegt die Einbindung von Makrophagen in die
Rekrutierung neutrophiler Granulozyten im inflammatorischen Geschehen. Die direkte
Zugabe von PGE2 in der Konzentration von 1x10-6 mol/l am Tag 7 der Differenzierung führte
in Makrophagen zu einer signifikant stärkeren CXCL8 mRNA-Expression als in
Makrophagen, denen kein PGE2 zugegeben wurde (Abb. 25). Dieses könnte bedeuten, dass
PGE2 als proinflammatorisches Signal die Makrophagen zu einer vermehrten CXCL8
Sekretion stimuliert, um die Migration neutrophiler Granulozyten und auch T-Zellen in
inflammatorisches Gewebe zu locken. PGE2High-MdM zeigten diese vermehrte Expression
nicht. Es scheint sich hierbei also um einen kurzweiligen Effekt zu handeln, der nicht für
längere Zeit induzierbar scheint. Erwähnenswert ist weiterhin die konstante Expression der
CXCL8 mRNA nach Stimulation mit LPS (Abb. 25), die, im Vergleich zu anderen Zytokinen
134
Diskussion
durch PGE2 nicht beeinflusst wird. Jenes verdeutlicht die Sonderrolle des Chemokins CXCL8
und deren Wirkungen in der Rekrutierung weiterer Effektorzellen.
Die Expression von CCL5 ist ebenfalls vor dem Hintergrund der beiteren zellulären
Chemotaxis (T-Zellen, NK-Zellen, Monozyten) zu werten. Anders als CXCL8 war es jedoch
erst durch LPS-Stimulation in MdM, die in Abwesenheit von PGE2 ausdifferenzierten,
nachweisbar (Abb.
25).
War hingegen PGE2 als kontinuierlicher Reiz in der
Differenzierungsphase vorhanden, wird CCL5 geringgradig basal exprimiert (Abb. 21). Diese
Tatsache könnte die Rolle von PGE2 im Gewebe als entzündungsfördernder Mediator
aufgreifen, der langfristig weiterhin Effektorzellen in das Gewebe rekrutiert. Auch war die
Expression von CCL5 unter LPS Einfluss um ein Vielfaches höher als die basale Expression,
so
dass
PGE2
möglicherweise eine primende,
„prä-inflammatorische“
Rolle der
Zellrekrutierung zugeschrieben werden könnte. Weiterhin lag die CCL5-Expression nach
Stimulation mit LPS in PGE2-differenzierten MdM um eine Log-Stufe höher als jene, denen
PGE2 direkt am Ende der Differenzierung zugegeben wurde. Diese verbesserte
Ansprechbarkeit auf LPS könnte ebenfalls mit den proinflammatorischen Eigenschaften des
PGE2 in Zusammenhang stehen. Nennenswert ist jedoch weiterhin die PGE2-abhängige
Hemmung der CCL5 Expression in den LPS-Ansätzen. Jener Effekt findet sich auch in der
Literatur wieder (XU et al. 2008). Es scheint, als wäre PGE2 für eine primär vermittelte
Ansprechbarkeit von CCL5 verantwortlich, wohingegen höhere Konzentrationen diesen
Effekt wieder begrenzen können. Diese Beobachtung passt in die modulierende Rolle von
Eicosanoiden, die gegen Ende einer Entzündung die Migration neutrophiler Granulozyten und
anderer Effektorzellen ins Gewebe hemmen können (LAWRENCE et al. 2002; SERHAN et
al. 2002). Vor dem physiologischen Hintergrund einer Entzündung reflektiert diese Tatsache
das
empfindliche
Zusammenspiel
einzelner
Entzündungsmediatoren
und
ihrer
Konzentrationen in deren Mikroumgebung.
IL-10 kommt bei der Differenzierung von Makrophagen eine Schlüsselrolle zu. So wird
dessen Expression, zusammen mit IL-12 zur kategorischen M1/M2- Einteilung genutzt.
Klassisch aktivierte, proinflammatorische Makrophagen exprimieren wenig IL-10 und viel
IL-12, „IL-10Low, IL-12High“ (MANTOVANI et al. 2004). Sowohl Makrophagen, die unter
PGE2 ausdifferenzierten, als auch jene, die in Abwesenheit von PGE2 differenzierten, zeigten
eine schwache, aber quantifizierbare Expression dieses Zytokins (Abb. 22 und Abb. 26), die
135
Diskussion
durch LPS verstärkt wurde (104-105 Anzahl Kopien). Es wird berichtet, dass IL-10 in
Verbindung mit LPS in CD4+ Lymphozyten die CXCL13 Produktion und dessen Rezeptor
CXCR5 stimuliert, die daraufhin in follikuläres Gewebe homen und so die Antikörperproduktion fördern. Auch die IL-10-abhängige IL-7-Produktion könnte hier aufgrund der
Assoziation dieser Zytokine mit der Bildung sekundären, lymphatischen Gewebes von
Bedeutung sein (MANTOVANI et al. 2004). Darüber hinaus wird IL-10-abhängig die
Expression antiinflammatorischer Moleküle verstärkt (MOORE et al. 2001b). Des Weiteren
ist IL-10 ein bedeutender Stimulus für NK-Zellen, sowie für zytotoxische T-Zellen
(MOCELLIN et al. 2003). Die basale, wenn auch niedrige Expression von IL-10 in
Abwesenheit von IL-12 deutet im Fall der in vitro generierten MdM auf einen eher
regulatorischen Zelltyp hin. Interessant ist, dass nach LPS-Stimulation, PGE2 zu einer
statistisch signifikanten Abnahme der IL-10 Expression führte (Abb. 22 und Abb. 26). Es ist
bekannt, dass PGE2 zur Expression eines pro-toleranten Zytokinprofils in monozytären
Zelllinien beiträgt, jedoch wird auch eine vermehrte IL-10 Expression durch LPS und PGE2
beschrieben (STRASSMANN et al. 1994). In diesem Zusammenhang könnte das
Zusammenwirken
anderer,
lokaler
Zytokine
für
die
PGE2-vermittelten
Effekte
ausschlaggebend sein. Eventuell agiert hier PGE2 auch im Sinne eines proinflammatorischen
Mediators, der zu einem switch der Makrophagenpopulation in Richtung M1 beiträgt. Wie
bereits in Abschnitt 2.5 beschrieben, ist PGE2 ein Entzündungsmodulator, der sich nicht
eindeutig als pro-oder antiinflammatorisch einordnen lässt.
Wie Abb. 22 zeigt, wurden IL-1β und TNF-α in unstimulierten MdM nicht exprimiert, sind
jedoch durch LPS deutlich induzierbar. Beide, als proinflammatorisch zu bezeichnende
Zytokine zeigten unter PGE2 in hohen Konzentrationen eine statistisch signifikant verringerte
Expression (Abb. 22). Diese hemmenden Effekte für IL-1β und TNF-α wurden beschrieben
(HINZ et al. 2000). Dabei wird diskutiert, ob es sich, in Erwiderung auf von Makrophagen
und dendritischen Zellen synthetisiertes PGE2, um einen autokrinen feedback Mechanismus
handeln könnte (HARRIS et al. 2002). Dieses wäre auch im vorliegenden Versuch eine
mögliche Erklärung der Zytokinhemmung, liegt doch im Medium in großen Mengen PGE2
vor. Erwähnenswert ist weiterhin, dass PGE2 keine Steigerung der mRNA von TNF-α und
IL1-β induzieren konnte. Dieses spricht für hemmende, antiinflammatorische Eigenschaften
des PGE2, die an der Begrenzung der inflammatorischen Antwort beteiligt sind. In diesem
136
Diskussion
Zusammenhang kann auch noch einmal auf die PGE2 vermittelte Stimulation der Generierung
antiinflammatorischer Lipoxine hingewiesen werden (SERHAN et al. 2008). In vivo könnte
sich die Situation jedoch wiederum ganz anders darstellen: so wäre es z.B. möglich, dass erst
in Assoziation zu anderen Zellen PGE2 die Inflammation verstärken kann und beispielsweise
sezernierte Zytokine von Granulozyten als Zellen der ersten Stunde Makrophagen zur
Synthese proinflammatorischer Zytokine veranlassen. Das Phänomen, dass in vitro generierte,
bovine MdM keine basale Expression von IL-1β und TNF-α zeigten, ist jedoch ebenfalls
diskussionswürdig. Fraglich ist, ob in vivo durch Zell- umgebende Einflüsse ein Auftreten
solcher Phänotypen vorkommt. Während des Differenzierungsprozesses sind gewebsständige
Makrophagen einer Vielzahl von Stimuli ausgesetzt, die zu ihrer Prägung beitragen. Im
Hinblick auf den zeitlichen Faktor der Differenzierung muss noch einmal auf die eingangs
erwähnte Abgrenzung zu Mantovani eingegangen werden. Es bleibt unklar, welche Faktoren
vor dem eigentlich prägenden Stimulus auf eine Zelle einwirken. Möglicherweise liegt die
Determinierung eines Makrophagenphänotyps bereits in der Subpopulation von Monozyten,
der anschließend eventuell nur noch über einen Teil seiner ursprünglichen Plastizität verfügt.
Trotzdem unterstreicht die gute Ansprechbarkeit auf LPS die Potenz des Makrophagen per se
als hocheffektive Zelle der Immunabwehr.
PPARγ ist für die Differenzierung von Makrophagen nicht zwingend erforderlich (MOORE et
al. 2001a). Jedoch ist eine Beeinflussung des Differenzierungsprogramms von Makrophagen
durch PPARγ möglich (KOMI u. LASSILA 2000; PIEMONTI et al. 2000). In humanen
Makrophagen führte die Aktivierung von PPARγ zur Hemmung der IL-1β, IL-6 und TNF-α
Expression (JIANG et al. 1998; SHU et al. 2000; MEIER et al. 2002). Auch YOUSSEF et al.
(2004) beschreiben eine Aktivierung von PPARγ in Verbindung mit antiinflammatorischen
Effekten in vivo und postulieren eine regulatorische Funktion für PPARγ in der
Induktionsphase einer Entzündung (YOUSSEF u. BADR 2004). Weiterhin findet ein PPARγabhängiges Priming von Monozyten in Richtung eines M2 Phänotyps statt (BOUHLEL et al.
2007). Dieses deckt sich mit dem hier vorliegenden Ergebnis der fehlenden LPS-Erwiderung:
Eine Stimulation mit LPS führte zu keiner vermehrten mRNA-Expression des
Transkriptionsfaktors (Abb. 27). Jenes Phänomen der fehlenden Wirkung M1 assoziierter
Stimuli beobachteten auch andere Arbeitsgruppen und beschreiben für IL-1β, TNF-α, IFNγ
137
Diskussion
und LPS keine, oder gar hemmende Effekte auf die PPARγ Expression (HUANG et al. 1999;
ZHOU et al. 2008).
Produkte des Arachidonsäurestoffwechsels, wie 15d-Prostaglandin J2, agieren als endogene
PPARγ-Liganden (KLIEWER et al. 1997; KERSTEN u. WAHLI 2000). PPARγ Agonisten
hemmen die vermehrte Expression inflammatorischer Gene in Makrophagen in Erwiderung
auf TLR-Liganden (VAN GINDERACHTER et al. 2008). Es sollte geprüft werden, ob PGE2
als endogener PPARγ Ligand agieren könnte und dessen mRNA- Expression beeinflusst. Die
Zugabe von PGE2 führte zu einer verringerten PPARγ–mRNA-Expression (Abb. 27). Dieses
deutet daraufhin, dass PGE2 in bovinen MdM nicht als PPARγ-Agonist agiert. Die zu
verzeichnende Hemmung der Expression geht konform mit Beobachtungen anderer
Arbeitsgruppen: auch berichten Kapoor et al. (2007) über eine Hemmung und verminderte
Expression von PPARγ in Fibrobasten durch Zugabe von exogenem PGE2. Wiederum führte
die Abwesenheit von PGE2 zu einer vermehrten PPARγ- Expression (KAPOOR et al. 2007).
Weiterhin führte die Abwesenheit des PGE2 synthetisierenden Enzyms mPGES-1 zu erhöhten
Nitirit Leveln (Nitrit als stabilies Produkt des NO-Stoffwechsels). Die Hemmung scheint
cAMP unabhängig, über PI 3-Kinase und Akt-1 vermittelt zu werden (KAPOOR et al. 2006).
All jene Effekte deuten auf eine Beteiligung von PPARγ im antiinflammatorischen
Geschehen hin. Inwieweit PPARγ direkt an der Ausprägung antiinflammatorischer
Makrophagentypen beteiligt ist, erfordert jedoch weitere Untersuchungen.
Interessante Ergebnisse zeigten die Untersuchungen der mRNA-Expression von PTX3: In
vitro generierte, bovine MdM exprimierten in unstimulierten Ansätzen kein PTX3. PGE2
hatte darauf keinen Einfluss. Die PTX3-Expression war jedoch durch LPS stark induzierbar
(Abb. 27). Dieser Effekt der Induktion in Erwiderung auf proinflammatorische Stimuli findet
sich auch in der Literatur wieder (ALLES et al. 1994; LEE et al. 1994; INTRONA et al.
1996). Differenzierten die MdM unter kontinuierlichem Einfluss von PGE2 aus, so führte
PGE2 auch hier zu einer Hemmung der mRNA-Expression (Abb. 23). Wurde PGE2 am Ende
der Differenzierung für 3 h zugegeben, hatte es keinen Einfluss auf die PTX3 mRNAExpression. Dieses zeigt, dass PTX3 möglicherweise einer anderen Regulation unterliegt als
andere Zytokine und Chemokine. Immerhin konnte auch bei IL-10 und CCL5 bereits nach 3 h
eine Hemmung der Expression gezeigt werden, welches kurzzeitig vermittelte Effekte des
PGE2 belegt, die jedoch für PTX3 nicht zuzutreffen scheinen. Generell ist die Expression von
138
Diskussion
PTX3 mit dem Typ der M2 Makrophagen assoziiert. Genauergesagt hat es in der Spätphase
der Entzündung in Verbindung mit einsetzender Wundheilung und Gewebeerneuerung seine
Relevanz (MANTOVANI et al. 2004). Die Tatsache, dass PTX3 durch LPS induzierbar ist,
wirft die Frage auf, inwieweit dessen Expression spezifisch für M2 Makrophagen sein kann.
Möglicherweise handelt es sich um eine Art „basale“ Expression des löslichen patternrecognition-receptors, der per se von MdM exprimiert wird, jedoch funktionell nicht von allen
Typen beansprucht wird. Hier muss auch erwähnt werden, dass die mRNA-Expression nicht
unbedingt Rückschlüsse auf die tatsächlich synthetisierten Produkte geben kann. Jedoch lässt
sich die gute Ansprechbarkeit auf LPS tendenziell als physiologische Reaktion werten: LPS
signalisiert über TLR-4 und NF-κB die Präsenz bakterieller Stimuli und einer
darauffolgenden möglichen Entzündungsreaktion. Im Zuge dessen ist die vermehrte
Expression des PTX3 zur Zirkulation im Blut und Bindung von Komplement sowie zur
Aufnahme apoptotischer Zellen und Zelldebris eine logische Konsequenz. Möglicherweise
verschieben sich auch die Schwerpunkte der PTX3-Expression während einer Entzündung: so
könnte zunächst in der Initialphase die Komplemenaktivierung nach Antigenbindung den
hauptsächlichen
Aspekt
der
PTX3-Funktion
ausmachen,
wohingegen
in
späteren
Entzündungsphasen die Clearance apoptotischer Zellen und Wiederherstellung der normalen
Gewebetextur die wichtigste Rolle spielen könnte. Jene Erwägungen zeigen jedoch auch die
Grenzen der Methode der Messung der mRNA-Expressionsdaten auf: die funktionelle
Aussage der Expression eines Moleküls, z.B. hinsichtlich zeitlicher und räumlicher
Ausdehnung, kann nur im Kontext mit anderen Aspekten getroffen werden. In diesem
Zusammenhang sollte noch einmal erwähnt werden, dass PTX3 als sezerniertes Produkt in
der Milch experimentell infizierter Kühe vorkommt (LUTZOW et al. 2008a). Die Tatsache,
dass PGE2 wiederum zu einer verringerten PTX3 mRNA- Expression führte, stellt jedoch die
bereits beschriebenen antiinflammatorischen Eigenschaften des PGE2 in Frage. So wäre doch,
vor dem Hintergrund der resolutionsfördernden Eigenschaften des PGE2, eine vermehrte,
bzw. konstante Expression des PTX3 zu erwarten. Möglicherweise überwiegen hier jedoch
die in erster Linie proinflammatorisch vermittelten Wirkungen der Prostaglandine und es
wäre denkbar, dass sich erst in Verbindung mit weiteren M2 Stimuli, wie z.B. IL-4, die
Polarisierung des PGE2 in Richtung Antiinflammation ändert.
139
Diskussion
Expression von CD163 und S100A8/A9 von in-vitro generierten MdM und PGE2-MdM
Ziel dieses Versuches war die phänotypische Charakterisierung des in vitro generierten
Makrophagentyps. Darüber hinaus sollte untersucht werden, ob PGE2 in der Lage ist, eine
bestimmte Subpopulation von Makrophagen zu induzieren. Beide in diesem Versuch
detektierten Antigene, die für verschiedene Subpopulationen stehen, wurden bereits
histologisch in Makrophagen in der Zitze nachgewiesen (4.2, 5.3).
Die hier generierten MdM exprimierten in An- und Abwesenheit von PGE2 sowohl CD163
(AM-3K) und S100A8/A9 (MAC387). Nimmt man die Summe aus stark und schwach
positiven Zellen, so liegt diese bei MAC387 höher als bei AM-3K. Nimmt man die Summe
aus AM-3KHigh/Low und MAC387High/Low so lässt sich daraus mit einiger Wahrscheinlichkeit
schließen, dass es Zellen gibt, die gleichzeitig beide Antigene exprimieren. Dieses bedeutet
einerseits, dass in vitro generierte Makrophagen bezogen auf diese beiden Antigene
Mischpopulationen darstellen, und Zellen beide, jeweils eines der untersuchten, oder keines
der untersuchten Antigene exprimieren können. Zum zweiten bedeudet dies, dass es möglich
ist, in vitro MdM zu generieren, die physiologische Expressionsmuster der in vivo
bestimmten Makrophagen zeigen.
Greift man auf die anfangs erwähnte Einteilung der beiden Antigene zurück (S100A8/A9
entspricht M1, CD163 entspricht M2), so scheint zumindest in vitro keine genaue Einteilung
in M1 oder M2 möglich zu sein.
Bezieht man dieses Ergebnis auf die Situation in situ (Zitze), so stellt sich die Frage, ob auch
dort möglicherweise Makrophagen vor Ort waren, die von beiden Antikörpern entweder nicht
als solche erkannt wurden, oder ob es sich eventuell um eine Population handeln könnte, die
in der Zitze nicht vorkommt. Möglicherweise hemmen Wirtsfaktoren im umgebenden
Gewebe
die
Expression
dieses
Phänotyps
und
fördern
die
Expression
anderer
Makrophagentypen. In der Zellkultur hingegen ist zwar auch eine gegenseitige Interaktion der
Makrophagen denkbar, jedoch fehlen Wirtsfaktoren, die in vivo vorhanden sind.
Auch hier konnten Unterschiede in der Expressionsintensität (MAC387/AM-3KHigh/Low)
festgestellt werden. In PGE2-MdM ließen sich deutlich weniger S100A8/A9 oder CD163positive Zellen nachweisen als in MdM (4.3.1).
PGE2 scheint zudem die Expression der beiden Antigene S100A8A/9 und CD163
differenziell zu modulieren, da sich das Verhältnis der Expression von S100A8/A9
140
Diskussion
(MAC387) zu CD163 (AM-3K) in PGE2-MdM zu einem größeren MAC387High/AM-3KHighVerhältnis entwickelte (Abb. 24 H). Dieses kann als Beleg dafür angesehen werden, dass
PGE2 die Expression funktions-relevanter Moleküle oder die Differenzierung funktionell
unterschiedlicher
Makrophagen
mit
steuert.
Jedoch
sind
in
vivo
mit
großer
Wahrscheinlichkeit, andere, co-regulierende Faktoren am Differenzierungsgeschehen
beteiligt. Die Ergebnisse dieser Detailstudie könnten dazu verwendet werden, um anhand des
Expressionsverhaltens von S100A8/A9 und CD163 die differenzierende Rolle weiterer
Wirtsfaktoren zu prüfen.
Die reduzierte Zahl an S100A8/9- und CD163-positiven PGE2-MdM, geht einher mit den
Ergebnissen der quantitativen real-time PCR, indem PGE2 auf mRNA-Ebene die Expression
vieler Chemokine und Zytokine hemmte (Abb. 21, Abb. 22) und es somit keinen klaren
Hinweis darauf gibt, ob PGE2 die Differenzierung von Monozyten in Makrophagen eines
bestimmten funktionellen Phänotyps (M1 oder M2) drängt. Zumindest scheint es nicht so zu
sein, dass PGE2-MdM sog. ‚inaktivierte‘ Makrophagen darstellen, da sie zumindest das
Chemokin CXCL8 in unveränderter Form nach LPS-Stimulation exprimieren. Ebenso ist es
eher unwahrscheinlich, dass die reduzierte Expression der klassischen Zytokine in PGE2MdM auf einer PPARγ- vermitteltelten Hemmung beruht, da bei Bildung von PPARγLiganden es zu einer Hochregulation der PTX3-Expression kommen müsste, die in PGE2MdM nach LPS-Stimulation nicht beobachtet werden konnte (Abb. 23).
5.5 Beeinflussung der Überlebensrate neutrophiler Granulozyten
Die Regulation der Überlebensrate neutrophiler Granulozyten in entzündetem Gewebe ist ein
wichtiger Mechanismus, um die Funktion dieser Zellpopulation zu gewährleisten, aber auch
um Gewebeschäden zu vermeiden und die Homöostase wiederherzustellen. Dabei spielt
neben der konstitutiven Absterberate auch das durch Mediatoren anderer Zellen vermittelte
Sterben von PMN eine wichtige Rolle. Im Rahmen dieser Arbeit wurde der Einfluss von
Überständen PGE2-differenzierter MdM auf die konstitutive Absterberate boviner
neutrophiler Granulozyten untersucht. Zur funktionellen Abgrenzung der von PGE2differenzierten MdM in den Überstand sezernierten Mediatoren gegenüber Effekten, die nicht
durch zelluläre Botenstoffe vermittelt werden, wurden in einem Parallelansatz PMN unter
direkter Zugabe von PGE2 inkubiert. Neutrophile Granulozyten zeigen, nach Inkubation mit
141
Diskussion
PGE2-differenzierten Überständen (1x10-12 mol/l), einen höheren Anteil apoptotischer Zellen
als jene, die mit Überständen in Abwesenheit von PGE2 kultiviert wurden (Abb. 28). Dieses
spricht für einen propaptotischen Effekt des PGE2 in Verbindung mit den sezernierten
Mediatoren der MdM. Jedoch liegt der Anteil apoptotischer, neutrophiler Granulozyten, die
mit direktem PGE2 inkubiert wurden, höher als jene, in denen kein PGE2 vorhanden war
(Abb. 28 und Abb. 29). Dieses steht im Widerspruch zu Angaben in der Literatur, wird PGE2
doch eine anti-apoptotische Rolle in mehreren Zelltypen zugeschrieben (PAPADIMITRIOU
et al. 2007; BOWOLAKSONO et al. 2008; HOGGATT et al. 2009). HOGGATT et al. (2009)
nennen die PGE2-vermittelte, vermehrte Expression des antiapoptotischen Proteins Survivin
als möglichen Mechanismus. Erwähnenswert ist in diesem Zusammenhang eventuell der
direkte Effekt des PGE2 in hoher Konzentration (1x10-6 mol/l) bezüglich vitaler, neutrophiler
Granulozyten, in dem sich eine signifikante Steigerung vitaler Zellen durch PGE2 feststellen
lässt (Abb. 29).
In beiden Ansätzen (Ansatz der PGE2-differenzierten-MdM-Überstände sowie Ansatz der
Zugabe von direktem PGE2) findet sich nach LPS-Stimulation ein signifikanter Abfall vitaler
und apoptotischer Zellen. Dieses reflektiert den LPS-verursachten Zelltod durch Nekrose.
Eine entscheidende Aussage lässt sich jedoch aufgrund der Tatsache treffen, dass neutrophile
Granulozyten unter PGE2-differenzierten-MdM-Überständen eine signifikant höhere Vitalität
zeigten, als jene, die unter direktem PGE2 und ohne Überstände inkubiert wurden (Abb. 28
und Abb. 29). Dieses zeigt einen protektiven Einfluss der MdM-Überstände auf die
Apoptoserate neutrophiler Granulozyten, der jedoch nicht signifikant von PGE2 beeinflusst
wird.
5.6 Offene Fragen und Ausblick
Die
Ergebnisse
zeigen,
dass
Subpopulationen
von
Makrophagen
ein
spezielles
Verteilungsmuster in der Zitze gesunder Tiere aufweisen. Es gilt zu analysieren, wo M1 und
M2 Makrophagen in Zitzen Mastitis-erkrankter Tiere lokalisiert sind und ob, je nach nach
Schweregrad der Erkrankung, das Verhältnis von M1 zu M2 Makrophagen in der Zitze
unterschiedlich ist. Zudem wäre es interessant die beiden Makrophagentypen im dorsalen
Euterparenchym zu analysieren, da entzündliche Prozesse in Zitze und Euterparenchm zeitlich
und quantitativ unterschiedlich ablaufen. Hinsichtlich der funktionellen Bedeutung der
142
Diskussion
phänotypisch verschiedenen Makrophagentypen wäre es wichtig, das Zytokinprofil jener
Zellen in situ, z.B. mittels Lasermicrodissection, präzise zu bestimmen, um auch
gegebenenfalls eine präzisere Abgrenzung von dendritischen Zellen vornehmen zu können.
Langfristig ist auch eine Isolation dendritischer Zellen aus dem Euter von Interesse. Letzteres
berührt auch die Frage nach der Zitze als Induktionsort adaptiver Immunantworten. In welche
differenzierten Formen sich Blutmonozyten nach der Einwanderung ins Gewebe entwickeln
ist z.T. bereits in der Peripherie determinert. Monozyten können sich bereits im Blut
phänotypisch unterscheiden (GEISSMANN et al. 2003; AUFFRAY et al. 2009). Hier wäre es
von Bedeutung, bovine Monozyten, aus denen differenzierte Makrophagen/dendritische
Zellen hervorgehen, hinsichtlich ihres Determinierungspotentials näher zu charakterisieren
und zu prüfen, inwieweit Gewebsfaktoren die Differenzierung dieser Zellen beeinflussen
können.
Insgesamt stellen sich die Monozytenabkömmlinge in der Zitze als hochinteressante
Zellopulationen dar, da sie, wie in dieser Arbeit gezeigt, sowohl in vitro als auch in vivo eine
erhebliche Plastizität aufweisen. Dies könnte pro- und metaphylaktisch genutzt werden, um
den Infektionsverlauf im Euter zu modulieren.
143
Zusammenfassung
6 Zusammenfassung
Anna Düvel: Untersuchungen zur PGE2-beeinflussten Differenzierung boviner
Monozyten in Makrophagen
Da sich Mastitiden nach einer galaktogenen Infektion entwickeln, stellte sich in dieser Arbeit
die Frage, inwieweit die Zitze als distales Kompartiment des Euters am Infektionsgeschehen
maßgeblich beteiligt ist und ob bereits dort die Weichen für adaptive und angeborene
Immunmechanismen gestellt werden, die auch im Euterparenchym das entzündliche
Geschehen beeinflussen. Da diese Mechanismen von Immunzellen initiiert und mit gesteuert
werden und eine genauere Analyse des leukozytärer Zellen in der Zitze bisher nicht vorlag,
sollte zunächst anatomisch-histologisch das Vorkommen und die Verteilung leukozytärer
Zellen in der Zitze geprüft werden. Besonderer Fokus lag dabei auf dem Nachweis von
Makrophagen, die als Sensor- und Effektorzellen eine Vielzahl von Immunprozessen steuern
können. In der Zitze gesunder Färsen und laktierender Kühe konnten Mastzellen, neutrophile
Granulozyten, Lymphozyten, Plasmazellen und Makrophagen in unterschiedlichen relativen
Häufigkeiten im subepithelialen und perivaskulären Gewebe der Fürstenberg’schen Rosette
und Zitzenzisterne erfasst und dargestellt werden. Färsen wiesen gegenüber laktierenden
Tieren generell die größte Häufigkeit von allen identifizierten Leukozytensubpopulationen
auf. Experimentell mit LPS vorbehandelte und 72 Stunden oder 240 Stunden danach mit
E. coli infizierte Tiere zeigten kein apparent anderes Verteilungsmuster und keine veränderte
relative Häufigkeit der Immunzellpopulationen als gesunde laktierende Kühe. Einzige
Ausnahme war die höhere Häufigkeit an neutrophilen Granulozyten bei Tieren, die 240 h
nach einer LPS-Vorbehandlung mit E. coli infiziert wurden. Damit scheint das Einsetzen der
Laktation und nicht der häufigere Keimkontakt ursächlich für ein verändertes, generell
geringeres Vorkommen leukozytärer Zellen im Zitzengewebe zu sein.
Makrophagen wurden bei allen untersuchten Tieren sowohl in der Fürstenberg’schen Rosette,
als auch in der Zitzenzisterne nachgewiesen. Sie konnten vor allem in der Gruppe der adulten,
laktierenden Tiere, in gleicher Häufigkeit in der Fürstenberg’schen Rosette und Zitzenzisterne
dargestellt werden.
144
Zusammenfassung
Um Hinweise auf das Vorliegen funktionell unterschiedlicher Makrophagentypen bei
gesunden, laktierenden Kühen zu gewinnen, wurden Antikörper gegen S100A8/A9
(MAC387) (Indikator für klassische Makrophagen) und CD163 (AM-3K) (Indikator für
alternative Makrophagen) zur immunhistologischen Analyse von Gewebeschnitten eingesetzt.
Durch Serienschnittanalysen gelang der Nachweis von MAC387+/AM3-K-, MAC387-/AM3K+ sowie MAC387+/AM-3K+ Makrophagen. In der Fürstenberg’schen Rosette waren
subepithelial vermehrt MAC387+/AM3-K- Makrophagen nachweisbar, im perivaskulären
Gewebe dominierten hingegen MAC387-/AM-3K+ Makrophagen. In der Zitzenzisterne
kamen beide Makrophagenpopulationen subepithelial und perivaskulär in gleichen relativen
Häufigkeiten vor.
Die phänotypische Heterogenität der Makrophagen ließ vermuten, dass Wirtsfaktoren
maßgeblich an der Differenzierung der einwandernden Monozyten in Makrophagen beteiligt
sind. Nach einer Transkriptomanalyse des Zitzengewebes 4 h nach experimenteller
Inokulation des Euters mit E. coli erwies sich die Cyclooxygenase (COX2) als das am
stärksten regulierte Enzym des Arachidonsäurestoffwechsels. Daher wurde Prostaglandin E2
als Wirtsfaktor ausgewählt, um dessen Rolle in der Makrophagendifferenzierung in vitro zu
analysieren. Nach Magnet-aktivierter Zellseparation (MACS) boviner Blut-Monozyten
wurden diese für 7 Tage in Abwesenheit (MdM) oder unter Zusatz von PGE2 (1x10-12 - 1x10-6
mol/l) (PGE2-MdM) in Makrophagen differenziert und mittels quantitativer RT-PCR vor und
nach 3-stündiger LPS-Stimulation die mRNA-Expression von Zytokinen (TNF-α, IL-1β, IL10, IL-12), Chemokinen (CXCL8, CCL5, CCL20) sowie des Transkriptionsfaktors PPARγ
und des Pentraxin-3 (PTX3) erfasst. In MdM konnte eine Basisexpression von IL-10, CCL5,
CXCL8 und PPARγ nachgeweisen werden. PGE2-MdM (1x10-6 mol/l) zeigten eine
signifikant geringere Expression von IL-10 und PPARγ. Die LPS-Stimulation führte mit
Ausnahme von IL-12 und PPARγ zu einer signifikanten Hochregulation der mRNAExpression aller untersuchten Gene in MdM. In PGE2-MdM fiel die LPS-induzierte
Expressionssteigerung von IL-10, IL-1ß, TNF-α, CCL5, CCL20 und PTX3 signifikant
geringer aus. Interessanterweise blieb selektiv die mRNA-Expression von CXCL8
(Interleukin-8) unbeeinflusst.
Damit konnte gezeigt werden, dass PGE2 als endogener Wirtsfaktor die Expression pro- und
antiinflammatorischer Mediatoren von Makrophagen beeinflusst, und damit in vitro zur
145
Zusammenfassung
funktionellen Polarisierung eines Makrophagentyps beitragen kann. PGE2-MdM erwiesen
sich eher als inhibierte Makrophagen.
Die ebenfalls reduzierte Expression des
Transkriptionsfaktors PPARγ und des PPARγ- abhängig exprimierten PTX3 lasssen nicht den
Schluss zu, dass es sich bei PGE2-MdM um vorwiegend regulatorische, anti-inflammatorische
Makrophagen handelt.
Um zu prüfen, ob PGE2 die Differenzierung eines speziellen Makrophagensubtyps fördert,
wurden mittels Immunfluoreszenz die Expression von S100A8/A9 und CD163 in MdM und
PGE2-MdM nachgewiesen.
Nach Immunfluoreszenzanalyse exprimierten die in vitro generierten MdM zu etwa 80% das
S100A8/A9 (MAC387+) und zu 40% das CD163 (AM-3K+), wobei jeweils klar
differenzierbar stark und schwach-positive Zellen identifiziert werden konnten. Damit
erwiesen sich die in vitro generierten MdM als phänotypisch heterogen. In PGE2–MdM waren
nur noch 23% MAC387+ und 16% AM-3K+ Zellen nachweisbar. In MdM konnte ein
Verhältnis von 1,9 zwischen den stark positiven Zellen (MAC387/AM-3K) ermittelt werden,
in PGE2-MdM lag das Verhältnis bei 3,7.
Damit zeigte das während der Makrophagendifferenzierung in vitro anwesende PGE2 nicht
nur hemmende, sondern auch selektive Effekte auf die Gen- und Produktexpression in
Makrophagen, und es konnte gezeigt werden, dass dieser Wirtsfaktor, der nach
Erregerkontakt von verschiedenen Zellen gebildet wird, die Differenzierung boviner
Monozyten in funktionelle Makrophagen unterschiedlichen Phänotyps steuern kann. Ob und
welche
funktionellen
Eigenschaften
die
immunhistologisch
nachgewiesenen
Makrophagentypen in der Zitze haben, bleibt weiterführenden Untersuchungen vorbehalten.
Die Möglichkeit, die Differenzierung von Makrophagen durch bestimmte Faktoren gezielt zu
steuern, soll mittelfristig die Grundlagen für eine prophylaktische Immunmodulation beim
Rind schaffen, in der die Zitze, als erster Ort des Kontaktes mit Erregern so vorbereitet wird,
dass funktionell ‚passende‘ Makrophagen als mitentscheidende Sensor- und Effektorzellen
adäquat reagieren können.
146
Summary
7 Summary
Anna Düvel: Investigations on the PGE2-mediated differentiation of bovine monocytes
into macrophages
Since mastitis is the consequence of a galactogen infection it was asked whether the teat as
the distal compartment of the udder is mainly involved in the course of the infection, and
whether this region is a prominent checkpoint for adaptive and innate immune mechanisms
affecting the inflammatory process in the udder parenchyma.
Since these mechanisms are initiated and regulated by immune cells and since a deeper
analysis of teat- resident leukocytic cells is lacking, the presence and distribution of cells in
the teat was histologically analysed.
A particular point of interest was the demonstration of macrophages, which control a wide
variety of immune mechanisms being sensor and effector cells.
Mast cells, neutrophilic granulocytes, lymphocytes, plasma cells and macrophages could be
demonstrated in different relative frequencies in subepithelial and perivascular tissue of the
Fürstenberg’s rosette and the teat cistern in teats of healthy heifers and lactating cows.
Regarding all leukocyte subpopulations, heifers showed the highest relative frequencies.
Compared to healthy lactating cows, experimentally E. coli infected animals (72 h or 240 h
after intra-cisternal LPS application) did not show a different distribution or a different
pattern of teat resident immune cell populations except for cows infected with E. coli 240
hours after LPS application where more neutrophils showed up in the tissue.
In summary, it seems that the onset of lactation rather than the more frequent contact with
pathogens is the reason for a changed, in general reduced occurrence of immune cells in the
teat tissue.
In all analyzed animals macrophages could be detected in the Fürstenberg’s Rosette as well as
in the teat cistern. Mainly in adult lactating animals, they were present in equal frequency in
the Fürstenberg’s rosette and the teat cistern.
In order to find evidence for functionally different macrophage types in healthy lactating
cows, immunohistology was performed with antibodies specific for S100A8/A9 (MAC387,
147
Summary
indicating classical macrophages) and specific for CD163 (mAb AM-3K, indicator for
alternative macrophages).
Staining of sequential sections allowed for the detection of MAC387+/AM3-K-, MAC387/AM-3K+ as well as MAC387+/AM-3K+ macrophages. In subepithelial tissue (Fürstenberg’s
Rosette), more MAC387+/AM3-K- macrophages were detectable, while MAC387-/AM-3K+
were predominant in perivascular tissue. In the teat cistern, both populations showed an equal
perivascular and subepithelial distribution.
The phenotypic macrophage heterogeneity suggested that host factors may be significantly
involved in the differentiation of immigrating monocytes to macrophages.
A transcriptome analysis of teat tissue, 4 h after experimental inoculation of the udder with E.
coli, the cyclooxygenase-2 (COX2) revealed as the strongest regulated enzyme of the
arachidonic acid metabolism pathway.
Therefore, prostaglandin E2 was chosen as a host factor in order to analyze its role in the in
vitro differentiation of macrophages.
Bovine blood monocytes were separated by MACS and differentiated in the presence of PGE2
(1x10-12 - 1x10-6 mol/l) (PGE2-MdM) or absence of PGE2 (MdM) for seven days to
macrophages. In unstimulated and LPS-stimulated cells the mRNA-expression of chemokines
(CXCL8, CCL20, CCL5), Cytokines (IL-1β, TNF-α, IL-10, IL-12), the transcription factor
PPARγ and the long pentraxin 3 (PTX3) was quantified by real time PCR.
MdM showed a base line expression of IL-10, CCL5, CXCL8 and PPARγ. PGE2-MdM
(1x10-6 mol/l) showed a significantly lower expression of IL-10, and PPARγ. The LPS
stimulation resulted in a significant upregulation of all tested genes, except for IL-12. PGE2MdM showed a significantly reduced augmentation of the mRNA expression of IL-10, IL-1ß,
TNF-α, CCL5, CCL20 and PTX3. Interestingly, the expression of CXCL8 was not influenced
in PGE2-MdM.
These results show that the endogenous host factor PGE2 affects the expression of pro- and
anti-inflammatory molecules of macrophages and that in vitro PGE2 can contribute to the
functional polarization of macrophages. PGE2-MdM are similar to so-called inhibited
macrophages.
Since the expression of PPARγ and its dependent regulated gene PTX3 was down regulated
also, it is not likely that PGE2 MdM are mainly regulatory, anti-inflammatory macrophages.
148
Summary
To test whether PGE2 supports the differentiation of a special macrophage phenotype, the
expression of S100A8/A9 and CD163 was analyzed by immunofluorescence where 80% of
the macrophages expressed S100A8/A9 (MAC387+) and 40% expressed CD163 (AM-3K+).
High and low stained cells could be clearly discriminated. Thus, the in vitro generated
macrophages turned out to be phenotypically heterogeneous. In PGE2-MdM, only 23%
MAC387+ and 16% AM-3K+ cells were detectable. The relation between MAC387High and
AM-3KHigh MdM was 1.9. PGE2-MdM showed a relation of 3.7.
This showed that PGE2, if present during the differentiation of macrophages, not only has
inhibitory but also selective effects on gene and product expression in macrophages. It could
be demonstrated that this mediator, which is produced by different cells after contact with
pathogens, is able to control the differentiation of monocytes to different macrophage
phenotypes.
Whether the macrophage types found in the teat have different functional capacities has to
proven in future studies.
The possibility to control the differentiation of macrophages with selected factors in a welldirected way is supposed to be the basis for a prophylactic immune modulation regime in
cows. The aim is to prepare the teat in a way that functionally adequate macrophages are
present when bacteria are invading the udder.
149
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173
Anhang
9
Anhang
9.1 Tiergruppen
Tab. 16: Übersicht über die beprobten Tiergruppen (Gewebe)
Versuchsstatus
Beprobte Viertel
nullipar
Versuchs
-gruppe
K1
Kontrolltier
VL,HL,
HR
2
nullipar
K1
Kontrolltier
VL,VR,
HL,HR
3
pluripar
K2
Kontrolltier
4
pluripar
K2
Kontrolltier
5
pluripar
K2
Kontrolltier
6
pluripar
K2
Kontrolltier
7
unbek.
K2
Kontrolltier
8
unbek.
K2
Kontrolltier
VL,VR,
HL, HR
VL,VR,
HL, HR
VL,VR,
HL, HR
VL,VR,
HL, HR
VL,VR,
HL, HR
VL,VR,
HL, HR
Klinische
Eutergesundheit
Klinisch
eutergesund,
vorberichtlich
Mastitis-frei
Klinisch
eutergesund,
vorberichtlich
Mastitis-frei
Klinisch
eutergesund
Klinisch
eutergesund
Klinisch
eutergesund
Klinisch
eutergesund
Klinisch
eutergesund
Klinisch
eutergesund
9
pluripar
K2
Kontrolltier
VL,VR,
HL, HR
Klinisch
eutergesund
10
unipar
V1a
HR, VL, HL
Unspezifische
Mastitis
10
unipar
V1b
VR
Unspezifische
Mastitis
11
unipar
V1a
VR, HR, HL
Unspezifische
Mastitis
11
unipar
V1b
Priming, nach
96 h Schlachtung,
Viertel ohne
Inokulation
Priming, nach
72 h Inokulation,
nach weiteren
24h Schlachtung
Priming, nach
96 h Schlachtung,
Viertel ohne
Inokulation
Priming, nach
72 h Inokulation,
nach weiteren
24 h Schlachtung
VL
Unspezifische
Mastitis
Tier
Parität
1
174
Anhang
12
unipar
V1a
13
unipar
V1a
13
unipar
V1b
14
unipar
V2a
14
unipar
V2b
15
unipar
V2a
15
unipar
V2b
16
unipar
V2a
16
unipar
V2b
17
unipar
V2a
17
unipar
V2b
18
unipar
V2a
Priming, nach
96 h Schlachtung,
Viertel ohne
Inokulation
Priming, nach
96 h Schlachtung,
Viertel ohne
Inokulation
Priming, nach
72 h Inokulation,
nach weiteren
24 h Schlachtung
Priming, nach
264 h
Schlachtung,
Viertel ohne
Inokulation
Priming, nach
240 h Inokulation,
nach weiteren
24 h Schlachtung
Priming, nach
264 h
Schlachtung,
Viertel ohne
Inokulation
Priming, nach
240 h Inokulation,
nach weiteren
24 h Schlachtung
Priming, nach
264 h
Schlachtung,
Viertel ohne
Inokulation
Priming, nach
240 h Inokulation,
nach weiteren
24 h Schlachtung
Priming, nach
264 h
Schlachtung,
Viertel ohne
Inokulation
Priming, nach
240 h Inokulation,
nach weiteren
24 h Schlachtung
Priming, nach
264 h
Schlachtung,
175
VR, VL, HL
Unspezifische
Mastitis
VR, HR, HL
Unspezifische
Mastitis
VL
Unspezifische
Mastitis
VR, HR, HL
Unspezifische
Mastitis
VL
Unspezifische
Mastitis
VR, HR, HL
Unspezifische
Mastitis
VL
Klinische Mastitis
HR, VL, HL
Unspezifische
Mastitis
HR
Unspezifische
Mastitis
VR, VL, HL
Unspezifische
Mastitis
HR
Unspezifische
Mastitis
VR, HR, VL
Unspezifische
Mastitis
Anhang
18
unipar
V2b
Viertel ohne
Inokulation
Priming, nach
240 h Inokulation,
nach weiteren
24 h Schlachtung
HL
Unspezifische
Mastitis
Priming: intrazisternale Applikation von 0,2 µg/ml LPS hergestellt aus E. coli 1303; Infektion:
intrazisternale Applikation von 250 CFU/ml E. coli des Stammes 1303; VL=vorne links,
VR=vorne rechts, HL=hinten links, HR=hinten rechts; K1, K2, V1a, V1b, B2a, V2b: interne
Tiergruppenbezeichnungen
9.2 Geräte
Aqua dest. Aufbereitungsanlage Umkehr-Osmose Anlage,
„Typ RO 50/14SMB Typ I“
(Wasser und Regenerierstation, Barsbüttel)
Aqua tridest. Aufbereitungsanlage „SG Reinstwasser System
Typ SG-RS90-4 UF“
(Wasser- und Regenerierstation, Barsbüttel)
Autoklav Typ GE406
(Getinge AB, Getinge/Schweden)
Biometra T-Gradient
(biomedizinische Analytik GmbH, Göttingen)
BioPhotometer
(Eppendorf, Hamburg)
Brutschrank mit CO2-Begasung, Baureihe 5060
(Heraeus, Hanau)
Bunsenbrenner mit automatischer Zündung
(Wartewig, Göttingen)
Centricon®– Filtrationssystem
(Amicon, Beverly/MA, USA)
CO2-Flasche zur Sterilfiltration
(Kohlensäurewerke Hannover, Hannover)
Digitalkamera Olympus DP70
(Olympus, Hamburg)
Druckbehälter zur Sterilfiltration „stainless steel
pressure vessel“
(Alloy Products Wisconsin, USA)
Eismaschine Typ UBE 30-10
(Ziegra, Isernhagen)
Fluoreszenz-Durchflusszytometer, Modell FACScan®, mit
angeschlossener Computereinheit
(Becton Dickinson, Heidelberg)
Heißluftsterilisator „Typ ST5050“
(Heraeus, Hanau)
Heizblock Techne Dir-Block DB.3
(Thermo Dux, Wertheim)
Invertmikroskop
(Zeiss, Oberkochen)
Kühlschrank mit Gefrierfach (-20°C)
(Einzelhandel)
Kühlzentrifuge Varifuge K mit Tragwinkelrotor,
Hochgeschwindigkeitsaufsatz und
Mikrotiterplattenrotor
(Heraeus Instruments, Osterode)
Laborfeinwaage „B6“
(Mettler, Zürich/Schweiz)
Labor-pH-Meter „766 Calimatic“
(Knick, Berlin)
Laborwaage „BL310“
(Sartorius GmbH, Göttingen)
®
MACS MultiStand Metallständer
(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach)
176
Anhang
Magnetrührer mit Heizplatte
(Janke und Kunkel, Staufen)
Microcomputer Gelelektrophoresis power supply
consort
(Keutz Laborgeräte, Reiskirchen)
MIDI MACSTM Separations-Einheit
(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach)
®
Mini-Sub Cell GT Gelelektrophorese-Kammer
(BioRad Laboratories GmbH, München)
Minizentrifuge
(National Labnet CO., Woodbridge, NJ, USA)
Molecular Imager Gel Doc XR
(BioRad Laboratories GmbH, München)
Pinzette, gebogen, anatomisch
(Eickemeyer, Tuttlingen)
Pipette, einstellbar „Transferpette®“ (2-20 µL)
(Brand, Wertheim)
Pipetten, einstellbar „pipetman“ (1-20 µL,
10-100 µL,20-200 µL, 100-1000 µL)
(Gilson, Villers Le Bel/Frankreich)
Pipettierhilfe „accu-jet®“
(Brand, Wertheim)
Plastikbox mit Gittereinsatz
(Einzelhandel)
Plattenzentrifuge mit Plattenrotor (UJ II KS)
Rotationsmikrotom
(Heraeus-Christ. Osterode)
(Leica Instruments GmbH, Nußloch)
Reinwerkbank Laminair HL2448
(Heraeus-Christ, Hanau)
Rüttler für Mikrotiterplatten „AM69 Microshaker“
(Dynatec, Zug/Schweiz)
Schlauchpumpe zum Absaugen von Flüssigkeiten
„Rumo100“
(Heidolph, Schwabach)
Schüttelinkubator RS 90-4 UF
(SG Barsbüttel)
StepOnePlus® Real-Time PCR System
(Applied Biosystems, Darmstadt)
Tiefkühltruhe -80°C
(Kendro, Hanau)
Tischzentrifuge „Hermle Z230M“
Trimmingklinge
(Hermle, Gosheim)
(Feather Safety Razor CO., LTD, Japan)
Zählkammer nach Bürker
(Brand, Wertheim)
Zeiss Axiovert 200M Fluoreszenzmikroskop
(Zeiss, Oberkochen)
Zeiss Photomikroskop II
(Zeiss, Oberkochen)
Zentrifuge „Megafuge 1.0R“
(Heraeus Instruments, Osterode)
Zentrifuge Multifuge 1 S-R
(Thermo Scientific, Osterode)
9.3 Klinikbedarf
Applikatoren, steril
(Böttger, Bodenmais)
TM
Butterfly-Kanüle „Micro-Flo “ 21G 0,8 mm
(Industria Biomedica, Mailand, Italien
Einmalspritzen 5 ml „Luer steril“
(Terumo, Leuven, Belgien)
Einmalspritzen 2 ml „Luer steril“
(Terumo, Leuven, Belgien)
Einmal-Untersuchungshandschuhe “Gentle skin® sensitive“
(Meditrade, Kiefersfelden)
Kanülen 1,80 x 40 mm, steril „TSK STERIJECT“
(TSK-Supra, Tochigi/Japan)
177
Anhang
Staukette nach Witte
(Eickemeyer, Tuttlingen)
Vacutainer Brand Luer Adapters
(Becton Dickinson, Heidelberg)
Vacutainer® System, Halter
(Becton Dickinson, Heidelberg)
Vacutainerröhrchen, 10 ml, Heparin (170 IU)
(Becton Dickinson, Heidelberg)
9.4 Laborbedarf
Abdeckung für PCR-Platten optical adhesive covers
adhäsive Objektträger "HistoBond®"
(Applied Biosystems, Darmstadt)
(Marienfeld, Lauda-Königshofen)
Combitips, 1,25 ml
(Eppendorf, Hamburg)
Combitips, 2,5 ml
(Eppendorf, Hamburg)
Cryo-Freezing-Container
(Nalgen Co., Rochester,. USA)
Cryotubes 3,5 ml
(Roth, Karlsruhe)
Cryotubes 5 ml
(Roth, Karlsruhe)
Drigalski-Glasspatel
(Roth, Karlsruhe)
Einmal-Filter, Celluloseacetate Membrane, 0,2 µm, steril
(Renner Dannstadt)
Einmal-Küvetten UltraVette 8,5 mm
(Brand Wertheim)
Einmal-Pasteurpipetten aus Pe-Ld
Entsorgungsbeutel
(Merck, Darmstadt)
(Brand Wertheim)
Eppendorf-Reaktionsgefäß, 1,5 ml
(Greiner, Frickenhausen)
Flachboden Zellkulturplatten mit Abdeckung, steril
24 Vertiefungen
(Biochrom, Berlin)
Flachboden–Mikrotiterplatten mit Abdeckung, steril
96 Vertiefungen
(Biochrom, Berlin)
Glasküvetten
(Assistent, Deutschland)
Glasobjektträger
(Marienfeld, Lauda-Königshofen)
Laborflaschen mit Gewinde, 500 ml
(VWR international, Hannover)
MACS Pre-Separation Filters
(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach)
MACS Säulen LS Columns
(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach)
Mikrobank-System Cryobank™
(Mast Diagnostika, Reinfeld)
Parafilm
(American can Company, USA)
PCR-Platten Micro Amp TM Fast 96-well plate
(Applied Biosystems, Darmstadt)
PCR-Reaktionsgefäß 0,2 ml
(Biozym Scientific GmbH, Hess. Oldendorf)
Pipettenspitzen 200 und 1000 µl
(Sarstedt Frickenhausen)
Pipettenspitzen safe seal Tipps 10, 100, 1000 µl
(Biozym Scientific GmbH, Hess. Oldendorf)
Polystyrolröhrchen
(Nerbe Plus, Winsen/Luhe)
Röhrchen für die Durchflusszytometrie, 5 ml
(Becton Dickinson, Heidelberg)
178
Anhang
Rundboden-Mikrotiterplatten mit Abdeckung; steril, 96
Vertiefungen
(Gechno Plastic Products TPP®,
Trasadingen/Schweiz)
Saugpipetten, 10 ml
(Sarstedt, Nürnbrecht)
Zellkulturflaschen, 200 ml
(Nunc, Wiesbaden)
Zellkulturflaschen, 75 ml
(Nunc, Wiesbaden)
Zentrifugenröhrchen, 15 ml aus Polypropylen (steril)
(Sarstedt, Nürmbrecht)
Zentrifugenröhrchen, 50 ml aus Polypropylen (Falcons,
steril)
(Corning, Wiesbaden)
9.5 Reagenzien
Acridin-Orange
(Sigma-Aldrich, Steinheim)
Agarose
(Life Technologies Paisely, Scotland)
Albumin Fraktion V, bovine, pulv. 98%
(Roth, Karlsruhe)
Ampicillin
(Sigma-Aldrich, Steinheim)
AM-3K, Maus MausαHuman CD163
(Transgenic, Japan)
Anti-Maus IgG (gesamtes Molekül)
(Sigma-Aldrich, Steinheim)
BO1, MausαHuman MHCI
SCHUBERTH et al. 1992
Bromphenolblau (3', 3', 5', 5'-Tetrabromhenol-sulfophtalin)
(Severin, Heidelberg)
3,3’-Diaminobenzidin (DAB)
(DAKO BioTek Solutions, Ca, USA)
Demaskierungslösung P
(Biologo, Kronshagen)
Deoxynucleotide Triphosphates (dNTPs)
(Promega, Mannheim)
Dimethylformamid (DMF)
(Sigma-Aldrich, Steinheim)
Dimethylsulfoxid (DMSO)
(Sigma-Aldrich, Steinheim)
Di-Natriumhydrogenphosphat (Na2HPO4)
(Sigma-Aldrich, Steinheim)
EDTA (Ethylendiamine-Tetraacetic Acid)
Edwards-Nährboden mit Schafblut (mod.)
EnVision® Detections System
Edwards-Nährboden mit Schafblut (mod.)
Eosin
(Sigma-Aldrich, Steinheim)
(Oxoid, Wesel)
(DAKO BioTek Solutions, Ca, USA)
(Oxoid, Wesel)
(Merck, Darmstadt)
Ethanol 641, absolut, vergällt
(CG Chemikalien, Laatzen)
Ethidiumbromid
Eukitt®
(Sigma-Aldrich, Steinheim)
(Kindler, Freiburg)
FCCP (Carbonylcyanide-4-(trifluoromethoxy)phenylhydrazone)
(Sigma-Aldrich, Steinheim)
Fetales Kälberserum (FCS), Virus und Mykoplasmen getestet (Biochrom, Berlin)
FITC (Fluoreszein Isothiocyanate)
(Sigma-Aldrich, Steinheim)
Fluo 4 Acetoxymethyl Ester Calcium Indikator
Formaldehyd 37%, p.a., ACS, Rotiuran
(Invitrogen, Karlsruhe)
®
(Roth, Karlsruhe)
179
Anhang
Fura red Acetoxymethyl Ester Calcium Indikator
(Invitrogen, Karlsruhe)
®
Gel Star Nucleic Acid Stain
Giemsa
(Lonza, Rockland, Maine/USA)
(Merck, Darmstadt)
Goat Anti-Mouse IgG MicroBeads
(Miltenyi Biotec, Bergisch Gladbach)
Goat-Anti-Mouse IgG/IgM, FITC-konjugiert
Hämatoxylin
(Dianova, Hamburg)
(Merck, Darmstadt)
Hind III Restriktionsenzym aus Haemophilus influenzae
(Invitrogen, Karlsruhe)
HOECHST-33342
(Invitrogen, Karlsruhe)
IPTG (Isopropyl-ß-D-thiogalactopyranosid)
(Invitrogen, Karlsruhe)
®
Iscove DMEM mit L-Glutamin
(PAA Laboratories, Linz/Österreich)
JC-1 (5'5'6'6' Tetrachloro-1'1'3'3' TetraethylbenzimidazolCarbocyanin Jodid)
(Invitrogen, Karlsruhe)
Kaliumchlorid (KCl), kristallin
(Biochrom, Berlin)
Kaliumhydrogencarbonat reinst (KHCO3)
Kristallviolett-Galle-Lactose-Agar (VRB-Agar)
(Merck, Darmstadt)
(Oxoid, Wesel)
Kupfer(II)-sulfat-5-hydrat
(Roth, Karlsruhe)
L-Arginin
(Sigma-Aldrich, Steinheim)
LB Agar
(Invitrogen, Karlsruhe
LB Base
(Invitrogen, Karlsruhe)
L-Glutamin
(Biochrom, Berlin)
L-Histidin
Lichtgrün
(Sigma-Aldrich, Steinheim)
(Merck, Darmstadt)
Lipopolysaccharid von Escherichia coli Serotyp O55:B5
(Sigma-Aldrich, Steinheim)
Lymphozytenseparationsmedium
(PAA Laboratories, Linz/Österreich)
MAC387, Maus anti Human, S100A8/A9
(Biologo, Kronshagen)
May-Grünwald-Lösung
(Merck, Darmstadt)
MCA1568, MausαHuman CD14, PE konjugiert
(AbD Serotec, Düsseldorf)
Natriumazid (NaN3), 10%ig
(Sigma-Aldrich, Steinheim)
Natriumcarbonat (Na2CO3)
(Sigma-Aldrich, Steinheim)
Natriumchlorid (NaCl)
(Roth, Karlsruhe)
Natriumhydrogencarbonat (NaHCO3)
(Sigma-Aldrich, Steinheim)
Natriumhypochlorid (NaClO)
(Sigma-Aldrich, Steinheim)
Orange-G
(Fluka Chemie AG, Base)l
Oligo (dt) 12-18 Primer
(Invitrogen, Karlsruhe)
Penicillin-Streptomycin-Glutamine-Lösung liquid100fach
konzentriert
(Invitrogen, Karlsruhe)
Phosphatgepufferte Kochsalzlösung (PBS) Dulbecco, ohne
Ca++/Mg++
(Biochrom, Berlin)
180
Anhang
Propidiumiodid (PI)
Prostaglandin E2
(Calbiochem, Bad Soden)
(Sigma-Aldrich, Steinheim)
QIA Gel Extraction Kit
(QIAGEN GmbH, Hilden)
®
QIAquick PCR Purification Kit
(QIAGEN GmbH, Hilden)
Rabbit Anti Pan-Zytokeratin
(DAKO BioTek Solutions, Ca, USA)
®
REact 2, 10-fach konzentriert
(Invitrogen, Karlsruhe)
RNeasy® Kit
(QIAGEN GmbH, Hilden)
RNaseOUT
TM
Ribonuclease Inhibitor
(Invitrogen, Karlsruhe)
®
Roti -Mount
(Roth, Karlsruhe)
RPMI liquid mit Hepes und L-Glutamin
(Calbiochem, Bad Soden)
Säurefuchsin-Ponceau
(Merck, Darmstadt)
ScaI Restriktionsenzym aus Streptomyces caespitosus
(Invitrogen, Karlsruhe)
Staphylokokken-Enterotoxin A (SEA), lyophilisiert
(Sigma-Aldrich, Steinheim)
TM
Superscript
II Reverse Transkriptase
(Invitrogen, Karlsruhe)
SYBR Green® PCR Master Mix
Toluidinblau
(Appiled Biosystems, Darmstadt)
(Merck, Darmstadt)
TOPO TA Cloning® Kit
(Invitrogen Karlsruhe)
TrackitTM50bp DNA Ladder
(Invitrogen, Karlsruhe)
Tri-Natriumcitrat (2 x H2O)
Triton X 100
(Serotec (PBP 005), Oxford/UK)
(Roth, Karlsruhe)
Tris (Trizma Base)
(Sigma-Aldrich, Steinheim)
Tris Boric Acid EDTA-Puffer (TBE) 10-fach konzentriert
Wasserstoffperoxid (H2O2)
(Bio Rad Laboratories GmbH, München)
(SAV, Feldkirchen)
X-Gal (5-Brom-4-chlor-3-indolyl-beta-D-galactopyranosid)
Xylol
Ziegennormalserum
(Invitrogen, Karlsruhe)
(SAV Liquid Production, Flintsbach a. Inn)
hergestellt durch das Anatomische
Institut der Tierärztlichen Hochschule,
Hannover
181
Danksagung
An erster Stelle bedanke ich mich bei Herrn Apl. Prof. Dr. H.-J. Schuberth für das mir
entgegengebrachte Vertrauen und die Überlassung des Themas. Sein Wissen und seine
Begeisterung für die Immunologie vermittelten mir die Lebendigkeit und Faszination der
Forschung. Seine offene, humorvolle und ehrliche Art prägten die Zusammenarbeit in einer
Art und Weise, die mich motivierte und mich in meiner Tätigkeit zu jeder Zeit bestärkt hat.
Danken möchte ich auch Frau PD Dr. Anke Schnapper für ihre kompetente und herzliche
Unterstützung und Begleitung in histologischen Fragestellungen.
Vielen Dank an Frau Dr. Anja Sipka, die mir während der letzten zwei Jahre mit Rat und Tat
zur Seite stand und von deren Erfahrung ich in jederlei Hinsicht profitieren durfte.
Der Firma Pfizer Animal Health danke ich für die Finanzierung des Projekts. Namentlich
möchte ich mich bei Herrn Dr. Leopold Götze bedanken, der mit seinem Engagement diese
Studien erst ermöglicht hat.
Ein besonderer Dank gilt auch den Mitarbeitern der Rinderklinik, insbesondere den
Assistenzärzten für die unkomplizierte Kooperation bei der Probengewinnung.
Ganz herzlich möchte ich mich auch bei allen Mitarbeitern und Doktoranden der
Immunologie, vor allem aber bei Silke Schöneberg und Udo Rabe bedanken, die mir immer
das Gefühl gaben, ich könne jederzeit mit allen Fragen dieser Welt zu ihnen kommen. Durch
die Anwesenheit aller Mitarbeiter ist die Immunologie auch ein Zuhause für mich geworden.
Vielen Dank an die Mitarbeiter des Anatomischen Instituts, Marion Gähle und Doris Walter
für die sehr nette und kompetente Betreuung in der Histologie.
Ganz herzlichen Dank an Marc Dilly und Jan Dirk Häger für ihre schnelle und tatkräftige
Unterstützung bei der Immunfluoreszenz.
Vielen Dank auch an Monique Lind, Wolfram Petzl und Tobias Pfister aus München für die
Bereitstellung von Probenmaterial und ihre Hilfe bei Fragen.
Ein ganz herzliches Dankeschön geht an Klaus und Sigrun und Dietmar und Margret für ihre
jahrelange, fast jahrzehntelange Unterstützung im Privaten wie im Beruflichen.
Vielen Dank an my dearest Stefan Hennigs für sein gewissenhaftes Korrekturlesen und seine
Hilfe bei der summary.
Und außerdem, Danke an Lars und Rebecca für ihre wunderbare Freundschaft.
Vielen Dank an meine Eltern, die mir immer den Freiraum gegeben haben das zu tun, was ich
für richtig halte und ich so meinen Lebensweg mit meinen Pferden im Hintergrund gehen
konnte.