Intrazelluläre Maturation von Leishmania major in

Universitätsklinikum Ulm
Institut für Medizinische Mikrobiologie und Hygiene
Prof. Dr. Steffen Stenger
Intrazelluläre Maturation von Leishmania major in humanen
Makrophagen
Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der medizinischen
Fakultät der Universität Ulm
vorgelegt von
Florian Jäckel
aus Göppingen
2012
I
Amtierender Dekan: Prof. Dr. Thomas Wirth
1. Berichterstatter: PD G. Van Zandbergen
2. Berichterstatter: Prof. E. Calzia
Tag der Promotion: 14.11.2013
II
Inhaltsverzeichnis
Abkürzungsverzeichnis........................................................................................V
1. Einleitung.................................................................................................................1
1.1 Leishmaniose..................................................................................................................1
1.2 Lebenszyklus von Leishmania major.............................................................................2
1.3 Makrophagen..................................................................................................................4
1.4 Aufnahmeprozess in den Makrophagen.........................................................................5
1.7 Ziele der Dissertation...................................................................................................11
2.1 Material................................................................................................................12
2.1.1 Protozoen Zell-Linie..................................................................................................12
2.1.2 Reagenzien................................................................................................................12
2.1.3 Kulturmedien, Agars, Buffer.....................................................................................14
2.1.4 Labor Utensilien........................................................................................................15
2.1.5 Geräte........................................................................................................................16
2.1.6 Software.....................................................................................................................17
2.2 Methoden.............................................................................................................18
2.2.1 Konzentrationsbestimmung von Zellen.....................................................................18
2.2.2 Kultivierung von Promastigotenkulturen..................................................................18
2.2.3 Herstellung von Amastigotenkulturen.......................................................................19
2.2.4 Isolation von Monozyten...........................................................................................21
2.2.5 Infektion von Makrophagen mit Promastigoten/Amastigoten..................................22
2.2.6 Intrazelluläre Färbung von Makrophagen.................................................................22
2.2.7 Färbung von toten Leishmanien mit Annexin V.......................................................25
III
2.2.8 Durchflusscytometeranalyse der Makrophagen/Leishmanien..................................25
2.2.9 Präparation und Aufnahme von Fluoreszensbildern.................................................25
2.2.10 Statistische Auswertung..........................................................................................26
3. Ergebnisse.............................................................................................................27
3.1 Veränderung des Anteils an Caveolin1 positiven Zellen bei Infektion mit Lm. ….....27
3.2 Veränderung des Anteils an Clathrin positiven Zellen bei Infektion mit Lm..............31
3.3 Veränderung des Anteils an EEA 1 positiven Zellen bei Infektion mit Lm …...........36
3.4 Einfluss der Infektion von Lm. auf das spätendosomale/lysomale Protein CD63.......41
3.5 Einfluss der Infektion von Lm. auf das spätendosomale/lysomale Protein Rab 7.......47
3.6 Einfluss der Infektion von Lm. auf das lysosomale Protein LAMP 2..........................52
3.7 Einfluss der Infektion von Lm. auf den Autophagieprozess........................................57
3.8 Versuch der Korrelation von toten Promastigoten mit dem Protein LC3b in MF.......63
3.9 Versuch der Korrelation von toten Amastigoten mit dem Protein LC3b in MF..........65
4. Diskussion..............................................................................................................68
4.1 Veränderung der an der Endozytose beteiligten Proteine Caveolin und Clathrin........69
4.2 Frühendosomale Proteine.............................................................................................70
4.3 Späte endosomale / lysosomale Proteine......................................................................71
4.4 Autophagie...................................................................................................................72
5. Zusammenfassung............................................................................................74
6. Literaturangaben..............................................................................................76
7. Danksagung..........................................................................................................86
8. Lebenslauf..............................................................................................................87
IV
Abkürzungsverzeichnis
AK
Antikörper
AnxA5
Annexin A5
CD63
Cluster of Differentiation 63
CR
Komplementrezeptor
Da.
Dalton
EEA 1
Early Endosome Antigen 1
FCS
Fetales Kälberserum
g.
Gramm
GM-CSF
Granulozyten-Makrophagen Kolonie
stimulierender Faktor
h.
Stunde
Il-8
Interleukin-8
k.
Kilo
L.
Leishmania
LC3b
Microtubule associated protein 1
light chain 3
LCF
Leishmania chemotactic factor
Lm.
Leishmania major
M-CSF
Makrophagen Kolonie stimulierender
Faktor
MF
Makrophagen
Min.
Minute
MIP-1b
Makrophagen Inflammatorisches Protein 1b
MOI
Multiplizität der Infektion
V
PFA
Paraformaldehyd
PMN
Polymorphonukleäre Neutrophile
Granulozyten
ROS
Reaktive Sauerstoffspezies
TGF-β
Transforming growth factor beta
TNF-α
Tumor-Nekrosis Faktor-alpha
VI
1. Einleitung
1. Einleitung
1.1 Leishmaniose
Die Leishmaniose ist ein Krankheitsbild, welches durch Leishmanien, einer protozoen Art,
verursacht wird. Leishmanien zählen zur Familie der Trypanosomatidae. Es existieren etwa
15 humanpathogene Arten, welche unterschiedlich schwere Krankheitsbilder verursachen.
Diese reichen von Hautläsionen bis zum Befall von Inneren Organen. Man unterscheidet
den L. Donovani Komplex zu denen L. Donovani, L. Infantum und L. Chagasi zählen, den
L. mexicana Komplex mit L. mexicana, L. amazonensis und L. venezuelensis, sowie den
L. tropica Komplex mit L. tropica, L. aethiopica und der Unterart Viannia mit L.
brazilensis, L. guyanensis, L. panamensis und L. Peruvania. Morphologisch sind die
einzelne Arten nicht zu unterscheiden, jedoch können diese mittels Isoenzym- bzw. DNAAnalyse, monoklonaler Antikörper und unter Berücksichtigung des Krankheitsbildes und
epidemiologischen Gegebenheiten unterschieden werden. Man unterscheidet zwischen
verschiedenen klinischen Formen der Leishmaniose, der kutanen, mukokutanen und der
viszeralen Form. Während sich die kutane Form mit Hautgeschwüren äußert, nach 6
Monaten bis 1 Jahr oft spontan narbig abheilt und eine lebenslange Immunität hinterlässt,
befällt die viszerale Form, auch Kala Aszar genannt, Leber, Milz und Knochenmark. Selbst
mit medizinischer Intervention kann dies tödlich enden. Die mukokutane Form äußert sich
in Geschwüren der Haut und Schleimhaut, die meist nicht von selbst abheilen. Überträger
all dieser Formen sind die Sandmücken. Die einzelnen Arten sind dabei so stark an eine
bestimmte Form der Fliege adaptiert, dass das Ausbreitungsgebiet der Leishmaniose von
dem der Fliege abhängt (Kayser et al, 2005).
1
1. Einleitung
1.2 Lebenszyklus
Die
Überträger
der
Leishmaniose
sind
die
weiblichen
Schmetterlingsmücken
(Phlebotomidae, auch als Sandmücke bezeichnet), die man in die Gattung Phlebotomus
und Lutzomyia einteilen kann (Kayser et al, 2005). Bei einer Blutmahlzeit aufgenommene
infizierte Makrophagen werden im Darmtrakt der Fliege lysiert und die darin enthaltenen
Amastigoten freigesetzt. Diese wandeln sich in die nicht infektiösen prozyklischen
Promastigoten um und beginnen sich zu teilen. Promastigote zeichnen sich durch ein
apikales Flagellum aus und besitzen einen langen schmalen Körper (1,5µm x 15µm)
(Kayser et al, 2005). Im weiteren Verlauf differenzieren sie sich in hoch infektiöse
metazyklische Promastigote, die sich nicht mehr teilen. Anschließend wandern diese in den
Saugapparat der Mücke ein. Diese Entwicklung dauert in tropischen Gebieten ca. 5-8 Tage
(Kayser et al, 2005). Bei einem Stich werden apoptotische, sowie lebende metazyklische
Promastigoten subkutan mit dem Speichel injiziert. Diese werden von den neutrophilen
Granulozyten (PMN), die in das verletzte Gewebe einwandern, phagozytiert. Die
Promastigoten selbst produzieren den Faktor „Leishmania chemotactic factor“ (LCF), ein
Chemokin, welches die Einwanderung von Granulozyten verstärkt. Bei Aufnahme in die
PMN induzieren sie das Chemokin Il-8, welches weitere Granulozyten zum
Entzündungsherd lockt (van Zandbergen, 2002). Die apoptotischen Promastigoten
exprimieren Phospatidylserin (PS) auf ihrer Oberfläche und imitieren somit apoptotische
körpereigene Zellen. Die Bindung von PS an seinen spezifischen Rezeptor führt dazu, dass
eine
proinflammatorische
Immunreaktion
Promastigoten verhindert wird.
inflammatorischen
Zytokines
proinflammatorischem
TNF-α.
durch
die
Aufnahme
von
lebenden
Es kommt zu einer erhöhten Produktion des antiTGF-β
Die
und
damit
zu
einer
verbundene
„Downregulation“
Bildung
von
von
reaktiven
Sauerstoffspezies (ROS) und NO-Radikalen würde so zu einem Absterben der Parasiten
führen (van Zandbergen et al, 2006). Aufgenommene Promastigoten hemmen zusätzlich
die Caspase-3-Aktivität, dies führt dazu, dass die Überlebenszeit der Granulozyten von
durchschnittlich 6-8 Stunden auf 2-3 Tage ansteigt (Aga et al, 2002). Nach dieser Zeit
infiltrieren Makrophagen den Entzündungsherd. Diese stellen die Zielzellen der
Promastigoten dar. Die Einwanderung wird zusätzlich durch eine vermehrte MIP-1b
Sekretion der PMN verstärkt. Aufgenommene Promastigote induzieren dieses Chemokin,
um eine möglichst hohe Zahl an potentiellen Zielzellen anzulocken (van Zandbergen et al,
2
1. Einleitung
2004). Apoptotische Granulozyten werden von Makrophagen aufgenommen. L., die im
Zytoplasma eines Granulozyten liegen, gelangen auf diese Weise wie in einem
trojanischen Pferd unbemerkt in den Makrophagen (Laskay et al, 2003). Im sauren Milieu
des Phagolysosomens wandeln sich die Promastigoten in die Amastigoten um (Peters et al,
1995). Diese zeichnen sich durch einen unbeweglichen, flagellumfreien elliptischen Körper
aus, der die Maße 2µm x 6µm aufweist (Wenzel A, 2009). Sie beginnen sich zu teilen,
werden freigesetzt und infizieren andere Makrophagen. Saugt eine Sandmücke wiederum
bei einem Infizierten Blut, werden damit auch befallene Makrophagen aufgenommen und
der Zyklus beginnt von Neuem.
Abbildung 1:
Schematische Darstellung des Vermehrungszyklus der Leishmanien Arten.
Promastigotenvermehrung in der Mücke, Amastigotenvermehrung und Verbreitung
im Mensch.
3
1. Einleitung
1.3 Makrophagen
Monozyten entwickeln sich aus myeloiden pluripotenten Stammzellen im Knochenmark
über mehrere Differenzierungsschritte (Imhof et al, 2004). Diese zirkulieren 2-3 Tage im
Blutstrom und können bei Entzündungsprozessen analog zu den Granulozyten in das
Gewebe
einwandern.
Dort
differenzieren
sie
sich
in
die
entsprechenden
Gewebsmakrophagen wie z.B. die Alveolarmakrophagen in der Lunge oder der Mikroglia
im Gehirn. Hier nehmen sie u.a. eine Schlüsselrolle in der Vermittlung zwischen der
unspezifischen und spezifischen Immunreaktion ein. So fungieren sie als Fresszelle, als
antigenpräsentierende Zelle und können durch ihr sekretorische Zytokinausschüttung die
Immunantwort modulieren (Hoebe K et al, 2004; Unanue et al, 1968). Man kann 2
Unterarten von Makrophagen unterscheiden: Typ 1 und Typ 2. In vitro kann man
Monozyten durch Inkubation mit GM-CSF in Typ 1 bzw. durch M-CSF in Typ 2
Makrophagen differenzieren (Verreck et al, 2004). Die Typ 1 Makrophagen haben eine
geringere Phagozytosekapazität als die Typ 2 Zellen (Xu W, 2006). Zugleich besitzen Typ
1 Zellen bei Aktivierung eine höhere pro-inflammatorische Zytokinproduktion wie z.B.
TNF-α, IL-12 und IL-23. Sie produzieren große Menge an Reaktiven Sauerstoffspezies
(ROS) sowie an NO Radikalen und durch die Produktion von IL-1β und IL-6 induzieren
sie ebenfalls die TH-1 Antwort (Mantovani A et al, 2004). Die Typ 2 Zellen hingegen
produzieren anti-inflammatorische Zytokine wie z.B. IL- 10 und TGF-β bei Aufnahme von
apoptotischen Zellen (Ehrt SD, 2001). Zusätzlich regulieren sie IL-12 herunter (Krutzik
SR, 2005). Zusammenfassend lassen sich die Typ 1 MF als pro-inflammatorische Zellen
bezeichnen, die Typ 2 Zellen hingegen als anti-inflammatorische Zellen.
4
1. Einleitung
1.4 Aufnahmeprozess in den Makrophagen
Makrophagen (MF) besitzen ein großes Arsenal an Oberflächenrezeptoren mit denen sie
eine Vielzahl von häufig auftretenden Molekülsequenzen erkennen können. Diese Gruppe
wird als „Pattern Recognition Receptors“ (PRR) bezeichnet. Zu diesen Rezeptoren zählen
beispielsweise die Toll like Rezeptoren (TLR), der Mannose Rezeptor, sowie die Klasse A
Scavenger Rezeptoren. Diese erkennen konservierte strukturelle Elemente von
Pathogenen, so genannte „pathogen-associated molecular pattern“ (PAMP), die in der
Regel die körpereigenen Zellen nicht aufweisen. Zu diesen PAMPs zählen unter anderem
Lipopolysaccharide (LPS), formylierte Peptide, Mannane und Lipoteichonsäure u.v.a
(Aderem, 2003). Die L. können die MF nicht nur, wie oben beschrieben, über apoptotische
Granulozyten, sondern auch direkt über Interaktion mit bestimmten MF Rezeptoren
infizieren. Lm. enthalten auf ihrer Oberfläche beispielsweise Lipophosphoglycan, welches
wiederholte Mannose Einheiten enthält. Bei Lm. gibt es Hinweise darauf, dass eine
Bindung an den Mannose Rezeptor (CD206) eine Internalisierung auslöst (Turco et al,
1992). In vitro konnte gezeigt werden, dass eine Hemmung durch Mannose Rezeptor
bindende Liganden eine Abnahme der Infektionsrate in den MF nach sich zog (Palatnik et
al, 1989). Auch eine komplementvermittelte Phagozytose über die Rezeptoren CR 1 und 3
ist möglich (Da Silva, 1989; Laufs et al, 2002; ). Zusätzlich kann eine Aufnahme über
Endozytose erfolgen. Man unterscheidet hier zwei Hauptwege, der über Clathrin und der
über Caveolin vermittelte.
1.4.1
Clathrin vermittelte Endozytose
Clathrin bildet eine nicht kovalente Triskelion Struktur, bestehend aus 3 (192 kDa)
schweren und 3 (23-25kDa) leichten Ketten. Jeder Arm besteht aus einer schweren und
einer leichten Kette. Die 3 schweren Ketten hängen an einem Ende zusammen und bilden
so die Triskelion Struktur wie „Speichen an einem Rad“. Die schwere Kette des Clathrins
besteht aus einer globulären terminalen Domäne, einem distalen Segment, welches für
enzymatische Angriffe empfindlich ist, sowie einem proximalen Segment, welches die
Leichtkettenbindungsstelle enthält (Kirchhausen, 2009). Durch Bindung eines Moleküls an
den extraplasmatischen Teil eines spezifischen Rezeptor der Plasmamembran, kommt es
am zytoplasmatischen Anteil des Rezeptors zur Anlagerung von Clathrin. Durch „self5
1. Einleitung
assembly“ von mehreren Clathrin Einheiten kommt es zur Einziehung der Membran und
zur Formierung der sog. „clathrin coated pits (CCP)“ (Connor and Schmid, 2003; Brodsky
et al, 2001). An diesem Prozess sind neben Clathrin noch Dynamin 1 und 2 (Rappoport et
al, 2008), Aktin (Kirchhausen, 2009) und Regulatorproteine wie z.B. AP-2 (Ehrlich et al,
2004) und weitere beteiligt.
1.4.2
Caveolin 1 vermittelte Endozytose
Caveolae sind flache, cholesterinreiche Plasmamembraneinziehungen, welche als
stabilisierendes Protein Caveolin 1 enthält. Dieses war auch der Namensgeber dafür (Fra et
al, 1995). Caveolin 1 ist ein 21-24 kDa. schweres integrales Membranprotein (Glenney,
1989). Durch Bindung an bestimmte Rezeptoren kommt es zur Internalisierung mittels
Vesikelbildung des aufzunehmenden Moleküls. Diesen Caveolin 1 vermittelten
Mechanismus nutzen auch bestimmte Pathogene wie die Leishmania chagasi (Rodriguez
et al, 2006 ) oder bestimmte Viren, wie z.B. das Humane Influenza A Virus (Sun et al,
2010). Jedoch spielt Caveolin 1 auch eine Rolle in der Signaltransduktion. So konnte
gezeigt werden, dass Stressoren für die Zelle wie z.B. hyperosmolare Umgebung, UVLicht Bestrahlung oder Kontakt mit Wasserstoffperoxid zu einer erhöhten ThyrosinPhosphorilation-14 des Caveolin 1 über die Kinase p38 MAP führt. Es gibt Hinweise
darauf, dass sich diese Phosphorilierung auf die Signalweiterleitung auswirkt (Volonte et
al, 2001). Des weiteren konnte für Lm. gezeigt werden, dass eine Hemmung der Caveolin
vermittelten Endozytose durch das polyene Antibiotika Fillipin 3 die Aufnahme von
Amastigoten in die Zelle hemmt. Auch eine Hemmung der Clathrin vermittelten
Endozytose durch Monodansylcadaverin (MDC) führt ebenfalls zu diesem Effekt.
Eine Hemmung der Phagozytose durch dimethyl amylorid (DMA) dagegen führt zu einer
verminderten Aufnahme von Promastigoten (Wenzel UA, 2012) .
6
1. Einleitung
1.5 Intrazelluläre Kompartimentalisierung von Pathogenen
1.5.1
EEA 1
Alle unter 1.4 beschriebenen Aufnahmemechanismen führen dazu, dass es zur Bildung
eines Vesikels im Zytoplasma kommt, in dem das Pathogen eingeschlossen ist. Man
bezeichnet das Kompartiment, das bei der Phagozytose entsteht als Phagosom, das bei der
Endozytose als Endosom. Da diese keine Enzymausstattung besitzen, um aufgenommene
Moleküle bzw. Pathogene zu degradieren, ist eine „Reifung“ nötig. Dabei kommt es in
mehreren Schritten über Fusionen mit anderen Kompartimenten zum Austausch wichtiger
Membranproteine und Enzyme, sodass das Phagolysosom/Lysosom entstehen kann. Da die
Reifungsschritte für beide Kompartimente analog sind, wird im weiteren nur noch vom
Phagosom gesprochen. Im ersten Schritt fusioniert das Phagosom mit dem sog. Frühen
Endosom, welches das Protein Early Endosome Autoantigen 1 (EEA 1) trägt. Zusätzlich
zu EEA-1 lassen sich noch der Transferrinrezeptor, das Protein Rab 5 u.a. nachweisen. Der
pH der Frühen Endosomen liegt um die 6 (Vieira et al, 2002). EEA 1 ist ein hydrophiles
180 kDa schweres peripheres Membranprotein. Es besitzt eine α-helicale Raumstruktur
und stimmt in etwa 20% mit der Proteinsequenz von Myosin überein. Zusätzlich weist es
eine Calmodulin bindendes IQ Motiv auf, sowie Metall bindende Cysteinfinger Motive
(MU et al, 1995). EEA 1 ist ein Effektormolekül der GTPase Rab 5. Es ist für das
Andocken und, zusammen mit den SNARE´s, für die Fusion mit Endosomen
verantwortlich (Christoforidis et al 1999). An diesem Prozess sind Phosphatidylinositol
3-phosphate auf dem Phagosom, EEA 1 sowie Rab 5 auf dem Endosom beteiligt (Elson et
al, 2001). Ein Ausfall führt dazu, dass Phagosom und Endosom nicht fusionieren, die
Weiterentwicklung zum Phagolysosomen findet nicht statt (Fratti et al,2003).
7
1. Einleitung
1.5.2
Rab 7
Im weiteren Verlauf „reift“ das Frühe Phagoendosom zum späten Phagoendosom. EEA 1
und der Transferrinrezeptor werden ersetzt durch die Oberflächenmarker Rab 7, Rab 9,
Mannose 6-Phosphat Rezeptor u.a.. Der pH Wert dieses Kompartimentes liegt ca. bei 5,5
(Vieira et al, 2002). Ein wichtiges Molekül für dieses Kompartiment ist die GTPase Rab 7.
Rab 7 ist eine GTPase, die zur RAS Superfamilie gehört. In ihrer inaktiven Form liegt es
im Cytoplasma vor und hat GDP gebunden. Durch sog. GDP/GTP exchange factors (GEF)
kann GDP durch GTP ersetzt und somit aktiviert werden. Die Aktivierung führt zu einer
Konformationsänderung des Proteins, sodass eine Membranbindung ermöglicht wird. Hier
kann sie nun spezifische Effektormoleküle wie z.B. Zytoskelettproteine, Enzyme und
Fusionsproteine binden (Stenmark et al, 2001). Dies erklärt auch ihre Funktion in
Transport und Fusion. So ist sie für die „Reifung“ von Frühen zu Späten Endosomen
essentiell (Sun et al, 2010), sowie für den Transport von Phagosomen zu Endosomen
(Harrison et al, 2003). Es ist ein Schlüsselprotein für die Fusion von Späten Endosomen
und Lysosomen (Bucci et al, 2000), sowie an der Entstehung von späten Autophagosomen
beteiligt (Jäger et al, 2004). Die Inaktivierung erfolgt über die Hydrolyse von GTP zu GDP
und wird über das GTPase-activating protein (GAP) katalisiert (Stenmark et al, 2001).
1.5.3
CD63
Ein weiteres Membranprotein des späten Phagoendosomens trägt den Namen CD63. Es
zählt zu der Familie der Tetraspanine, welche mehr als 28 Membranproteine umfasst und
die Membran vier mal durchläuft. Die Tetraspanine teilen spezifische Sequenzhomologien
und strukturelle Eigenschaften und kommen in den Membranen zu einem hohen Anteil vor
(Boucheix et al, 2001). CD63 ist ein glykolisiertes Protein, welches in späten Endosomen,
Lysosomen, aber auch in sekretorischen Vesikeln und in der Plasmamembran vorkommt
und zwischen diesen Kompartimenten zirkuliert (Arribas et al, 2000).
Es enthält ein Thyrosin basiertes Motiv welches unter anderem Clathrin Komplexe binden
kann und somit an der Endozytose und der Zielführung zum Lysosomen beteiligt ist
(Duffield et al, 2003). Zusätzlich hat es noch weitere Interaktionspartner wie z.B. die MHC
2 Moleküle (Hammond et al, 1998), verschiedene Intergrine und der Phosphatidylinositol
4-kinase (Berditchevski et al, 1997). Daraus ergibt sich die Vermutung, dass dieses
8
1. Einleitung
Molekül an mehreren Prozessen, wie z.B. der intrazellulären Signalkaskade der Integrine
und Zielführung im Proteintransport mitverantwortlich ist (Berditchevski et al, 2001) .
1.5.4
LAMP 2
Schlussendlich fusioniert das späte Phagoendosom mit einem Lysosom. Es entsteht das
Phagolysosom. Im Phagolysosom erfolgt durch die vom Lysosomen gelieferten sauren
Hydrolasen eine Degradation des aufgenommen Pathogens. Der tiefe pH von ca. 5 sorgt
hier für eine optimale Aktivität der Hydrolasen. Als „Markerprotein“ dieses
Kompartiments dient das sog. LAMP (lysosomal associated membran protein) 1 und 2.
Diese Proteine sind stark N-glykolisierte Proteine, welche strukturell ähnlich sind und
zwischen denen eine gemeinsame evolutionäre Beziehung besteht (Granger et al., 1990).
LAMP 2 besteht aus einem großen luminalen Anteil, welcher durch eine prolinreiche
Gelenkregion
in
2
Disulphid-Brücken
enthaltende
Domänen,
einem
einzelnen
Transmembranen Segment und einem kurzen zytoplasmatischen Schwanz aus 11
Aminosäuren getrennt ist (Lewis et al, 1985; Fambrough et al, 1988). LAMP 2 ist
essentiell für die Bildung von Phagolysosomen. So konnte gezeigt werden, dass es in
LAMP 2 Knock-out Mäusen zu einer Anreicherung von PMN Zellen kommt, die nicht in
der Lage sind, bakterielle Erreger suffizient abzutöten. In diesen Zellen konnte eine
Anreicherung von Phagosomen beobachtet werden, die die späten endosomalen und
lysosmalen Marker ebenso wenig aufwiesen, wie den niederen PH, der für dieses
Kompartiment normal ist. Ebenso war eine große Anzahl von Autophagosomen erkennbar,
deren Abbau verlangsamt war (Beertsen et al, 2008). Des weiteren gibt es Hinweise
darauf, dass LAMP 2 das Recycling von Mannose-6 Phosphat Rezeptoren beeinträchtigt
und somit zu einer teilweisen falschen Zielführung von lysosomalen Enzymen führt. Dies
könnte die vermehrte Anzahl von Phagosomen und Autophagosomen erklären, deren
Inhalt ohne die lysosomalen Enzyme nicht abgebaut werden kann (Eeva-Liisa Eskelinen et
al, 2002). Auch an einer Präsentation von exogenen Antigenen ist LAMP 2 beteiligt. So
wird die Antigenpräsentation zwischen B Zellen und CD4+ T-Helfer Zellen über MHC II
Moleküle beeinträchtigt (Crotzer et al, 2010). Beim Menschen führt ein Defekt des LAMP
2 zu sog. Danon Erkrankung. Bei den Betroffen äußert sich das in einer Hypertrophie des
Herzens, Skelettmuskelatrophie und mentale Retardierung (Cottinet et al, 2011).
9
1. Einleitung
Histologisch können auch hier eine Akkumulation von Autophagosomen in den
Muskelzellen nachgewiesen werden (Tanaka et al, 2000).
1.6 Autophagie
Die Autophagie ist ein Prozess bei dem die Zelle überschüssige Zellorganellen abbauen
kann, um beispielsweise eine Hungerphase zu überstehen bzw. um die Menge der
Zellorganellen an den Stoffwechselumsatz anzupassen. Eine Induktion dieses Prozesses
kann beispielsweise durch „Aushungern“ der Zellen oder durch Rapamycin ausgelöst
werden. Die entsprechenden Kompartimente werden von einer Doppelmembran, die
zytoplasmatisches Material enthält, umschlossen und als Autophagosomen bezeichnet.
Diese durchlaufen ähnlich zum Phagosomen eine Reifung mit Fusion von Endosomen und
Lysosomen. Dieser Prozess ist streng reguliert durch zahlreiche Kinasen, Phosphatasen
und GTPasen mit Beteiligung an der Kernproteinmaschinerie, eines ubiquitin-ähnlichen
Proteins u.v.a. reguliert (Klionsky et al, 2000; Eskelinen, 2005). Wichtig für die
Entwicklung von Autophagosomen ist das Protein „Microtubule-associated protein 1 light
chain 3“ (LC3b). Dieses existiert in der löslichen zytoplasmatischen Form und kann durch
Hinzufügen von einer Phosphatidylethanolamin-Gruppe in die membrangebundene Form
überführt werden (Sou et al, 2006). Diese „Umwandlung“ führt zur Anreicherung in der
Membran und so zur Formation des Autophagosomens. An der Regulation dieser
Umwandlung spielen De- und Phosphorilierungsprozesse eine Rolle, ebenso wie die
Proteinkinase A und C (Jiang et al, 2010; Cherra et al, 2010).
Auch für mit Mycobakterium Tuberculosis infizierte Makrophagen konnte gezeigt werden,
dass die bei der Maturation der lysosomalen Kompartimente entkommene Erreger durch
die Autophagie eliminiert werden konnten (Cheallaigh et al, 2011). Bei einer Infektion mit
L.
donavani
kann
durch
Behandlung
mit
Amphotericin
B
eine
erhöhte
Autophagieinduktion in den Makrophagen des Knochenmarkes beobachtet werden. Ob
diese Induktion allerdings zu einer erhöhten Abtötungsrate der Lm. beiträgt, steht jedoch
noch nicht fest (Mitroulis et al, 2009).
10
1. Einleitung
1.7 Ziele der Dissertation
Promastigoten und Amastigoten unterscheiden sich morphologisch als auch biochemisch
voneinander. Während Promastigoten für die Primärinfektion verantwortlich sind und sich
nur in der Sandmücke vermehren können, geschieht die weitere Verbreitung über die
amastigote Form, die sich nur in maturierten Lysosomen von Makrophagen vermehren
kann. Deshalb ist davon auszugehen, dass Promastigoten und Amastigoten über
unterschiedliche Mechanismen in Makrophagen aufgenommen werden und zeitabhängig in
unterschiedlichen Kompartimenten gefunden werden können.
1. Um dies nachzuweisen bestand ein erstes Ziel darin die Proteine Clathrin und
Caveolin 1 zu untersuchen. Diese spielen in der Aufnahme und an der anschließenden
Formierung von Phagosomen eine entscheidende Rolle.
2. Nachfolgend wurden die Proteine analysiert, die im frühendosomalen Bereich (EEA-1),
im spätendosomalen Bereich (CD63 und Rab 7) und dem lysosomalen Bereich (LAMP 2)
für die Kompartimententwicklung entscheidend sind. Diese Entwicklung sollte zu
unterschiedlichen Zeiten nach der Infektion beobachtet werden.
3. Als letztes sollte gezeigt werden, dass die Autophagie in Makrophagen bei den beiden
Formen von Lm. eine Rolle spielt. Deshalb wurde das für diesen Prozess essentielle
Protein LC3b nach der Infektion untersucht.
11
2. Material und Methoden
2.1 Material
2.1.1 Protozoen Zell-Linie
Leishmania major Isolate
Aus einer Hautbiopsie eines israelischen
Patienten isoliert.
MHOM/ IL/ 81/ FEBNI
Freundlicherweise bereitgestellt von Dr.
F. Ebert (Bernhard-Nocht-Institut für
Tropische Medizin, Hamburg)
Buffy Coats
Blutspenden - und Transfusionszentrum
Ulm
2.1.2 Reagenzien
4′,6-Diamidin-2-phenylindol (DAPI)
Sigma, Deisenhofen, Deutschland
Adenin
Sigma, Deisenhofen, Deutschland
Annexin V Fluos
Roche Diagnostik, Mannheim,
Deutschland
Anti-Caveolin 1 Maus IgG1 Monoklonaler
BD Transduction Laboratories,
Antikörper
Heidelberg, Deutschland
Anti-CD63 PE Konjugat Maus IgG1
BD Pharmingen, Heidelberg, Deutschland
Monoklonaler Antikörper
Anti-Clathrin Heavy Chain Maus IgG1
BD Transduction Laboratories,
Monoklonaler Antikörper
Heidelberg, Deutschland
Anti-EEA1 FITC Konjugat Maus IgG1
BD Transduction Laboratories,
Monoklonaler Antikörper
Heidelberg, Deutschland
Anti-Kaninchen Alexa Fluor 488 Konjugat
Cell Signalling, Boston, USA
IgG1 Monoklonaler Antikörper
Anti-Kaninchen Alexa Fluor 568 Konjugat
Cell Signalling, Boston, USA
IgG1 Monoklonaler Antikörper
Anti-LAMP 2 Maus IgG1 Monoklonaler
BD Pharmingen, Heidelberg, Deutschland
12
2. Material und Methoden
Antikörper
Anti-LC3b Kaninchen Polyklonaler
Cell Signalling, Boston, USA
Antikörper
Anti-Leishmanien Kaninchen polyklonaler
Freundlicherweise bereitgestellt von Dr.
Antikörper
F. Ebert
Anti-Leishmanien Maus polyklonaler
Freundlicherweise bereitgestellt von Dr.
Antikörper
F. Ebert
Anti-Maus Alexa Fluor 488 Konjugat
Molecular Probes Europe, Poort Gebouw,
IgG1 Monoklonaler Antikörper
Niederlande
Anti-Maus Alexa Fluor 568 Konjugat
Molecular Probes Europe, Poort Gebouw,
IgG1 Monoklonaler Antikörper
Niederlande
Anti-Rab 7 Maus IGG2b monoklonaler
ABCAM, Cambridge, England
Antikörper
Biotin
Sigma, Deisenhofen, Deutschland
Bovines Serum Albumin (BSA)
Carl Roth GmbH, Deutschland
Brain Heart Infusion Agar
Oxoid, Basingstoke, Hampshire, England
Fetales Kälber Serum (FCS)
Sigma, Deisenhofen, Deutschland
Hemin
Sigma, Deisenhofen, Deutschland
HEPES-Buffer
Biochrom, Berlin, Deutschland
Histopaque 1119
Sigma, Deisenhofen, Deutschland
Kaninchenblut, fibrinfrei
Elocin-Lab GmBH, Mülheim Deutschland
Kaninchenserum
Freundlicherweise bereitgestellt von Dr.
(Isotyp Kontrolle)
F. Ebert
Humaner rekombinanter Granulozyten
Bayer Healthcare Pharmaceuticals,
Macrophagen Colony Stimulating Factor
Leverkusen, Deutschland
(GM-CSF)
Immersion Öl
Carl Zeiss, Jena, Deutschland
Isopropanol
Sigma, Deisenhofen, Deutschland
L-Glutamin
Biochrom, Berlin, Deutschland
Lymphozyten Separations Medium 1077
PAA, Pasching, Österreich
(LSM 1077)
M-CSF
PeproTech GmbH,Hamburg, Deutschland
Normales Humanes Serum
Sigma, Deisenhofen, Deutschland
(hitzeinaktiviert)
Paraformaldehyd (PFA)
Sigma, Deisenhofen, Deutschland
13
2. Material und Methoden
Penicillin/ Streptomycin
Biochrom, Berlin, Deutschland
Phosphate Buffered Saline (PBS),
PAA, Pasching, Österreich
ProLong Gold antifade reagent
Invitrogen, Oregon,USA
Ringer Lösung
Braun, Melsungen, Deutschland
Roswell Park Memorial Institute (RPMI) Sigma, Deisenhofen, Deutschland
1640 / 199 Medium
Salzsäure 38%
Merck , Darmstadt, Deutschland
Saponin
Sigma, Deisenhofen, Deutschland
β -Mercaptoethanol
Sigma, Deisenhofen, Deutschland
2.1.3 Kulturmedien, Agars und Buffer
Alex-Amastigote-Medium
RPMI 1640 Medium
(AAM)
10 % (v/v) FCS
100 U / ml Penicillin
100 μg / ml Streptomycin
3 mM L-Glutamin
pH 5.5, eingestellt mit 38 % (v/v) HCl
Steril filtriert mit 0,2 µm Filter
FACS-Buffer
PBS
1 % (v/v) FCS
1 % (m/v) BSA
1 % (v/v) NHS
Fixierungs Buffer
PBS
4 % (v/v) PFA
Flüssig-Medium
RPMI 199 Medium
10% (v/v) FCS
100U / ml Penicillin
100µg / ml Streptomycin
10mM HEPES Buffer
5 ml 10 mM Adenin, in 50 mM Hepes,
pH 7.5
1ml
14
0.25%
Hemin
in
50
%
2. Material und Methoden
Triethanolamin
0.5 ml 0.1% Biotin in 95% Ethanol
Leishmanien - Medium
RPMI 1640 Medium
5 % (v/v) FCS
50 μM β-Mercaptoethanol
2 mM L-Glutamine
10 mM HEPES
100 U / ml Penicillin
100 μg / ml Streptomycin
Novy-Nicolle-McNeal
16.6 % (v/v) Kaninchenblut fibrinfrei
Blutagar-Medium
16.6 % (v/v) 1 x PBS
66.2 % (v/v) Brain Heart Infusion Agar
66.2 U / ml Penicillin
66.2 μg / ml Streptomycin
Saponin-Lösung
PBS
1 % (v/v) FCS
1 % (m/v) BSA
1 % (v/v) NHS
0,5 % (m/v) Saponin
2.1.4 Labor Utensilien
FACS - Röhrchen
BD labware Europe Le Pont de Claix,
Frankreich
Pipetten Filter Spitzen
Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland
(1-10 μl, 10-100μl, 50-200 μl, 100-1000 μl)
Pipetten, Multikanalpipetten
Eppendorf, Hamburg, Germany
(10 µl, 100 µl, 200 µl, 1000 µl)
Safe-Lock Röhrchen
Eppendorf, Hamburg, Germany
(0,5 ml, 1,5 ml, 2,0 ml)
Serologische Glaspipetten, steril
Corning Inc., Corning, New York, USA
(2,5 ml; 5 ml; 10 ml; 25 ml)
15
2. Material und Methoden
Spritze
BD labware Europe Le Pont de Claix,
(10 ml, 50 ml)
Frankreich
Spritzenfilter,
Pall Corporation, UK
0,45 µm ; 0,2 µm Membran
Tissue Culture Dishes,
BD labware Europe Le Pont de Claix,
100 mm x 20 mm
Frankreich
Transfer Pipetten (3,5 ml)
Sarstedt, Nümbrecht, Deutschland
Zellkulturflaschen
BD labware Europe, Le Pont de Claix,
50 ml, 25 cm2
Frankreich
Zellkulturplatten
BD labware Europe Le Pont de Claix,
96 well
Frankreich
Zellschaber
Sarstedt, Newton, USA
16cm
Zentrifugationsröhrchen
BD labware Europe Le Pont de Claix,
(15 ml, 50 ml)
Frankreich
2.1.5 Geräte
CO2-Inkubatoren:
Thermo Forma 3010
Thermo, Dreieich, Deutschland
Heraeus BBD 6220
Thermo, Dreieich, Deutschland
Durchflusscytometer:
FACS-Calibur II
Becton Dickinson, Heidelberg,
Deutschland
Gefrierschränke:
-20°C
Liebherr, Bulle, Schweiz
-80°C Herafreeze
Heraeus Sepatech GmbH, Osterode,
Deutschland
Eismaschine
AF 80
Scottsman, Pogliano, Italien
Mikroskope:
Axio Imager.M2
Carl Zeiss, Jena, Deutschland
Axiovert 40 CF
Carl Zeiss, Jena, Deutschland
Olympus CH2
Olympus, Japan
16
2. Material und Methoden
Sterile Werkbank:
Lamin Air® HBB 2448
Heraus Instruments, Langenselbold,
Deutschland
Zell-Zählkammern:
Leishmanien
Neubauer improved, Marienfeld,
Deutschland
Tiefe 0,02 mm; 0,0025 mm2
Makrophagen
Neubauer improved, Marienfeld,
Deutschland
Tiefe 0,1 mm; 0,0025 mm2
Zentrifugen:
Multifuge 3 S-R
Heraeus, Thermo, Dreieich, Deutschland
Zentrifuge 5471
Eppendorf, Hamburg, Deutschland
Plattenzentrifuge Varifuge 3.OR
Heraeus Sepatech GmbH, Osterode,
Deutschland
Cytospin 3 Zenrtifuge
Shandon, Frankfurt, Deutschland
2.1.6 Software
AxoVision Release 4.8
Carl Zeiss, Jena, Deutschland
CellQuest® Pro
Becton Dickinson, Heidelberg Deutschland
Excel
Microsoft Co-operation, Mountain View,
USA
FlowJo 7.6.3
Tree Star Inc. Oregon, USA
17
2. Material und Methoden
2.2 Methoden
Allgemein wurden die Zellkulturen unter sterilen Bedingungen geführt. Jegliche
Manipulation der Kulturen wurden unter einer sterilen Werkbank mit laminarem Luftabzug
durchgeführt. Die Inkubation erfolgte in Brutschränken mit 5% CO2 Gehalt.
2.2.1 Konzentrationsbestimmung von Zellen:
Die Einstellung der Konzentrationen von Promastigoten bzw. Amastigoten erfolgte in einer
Neubauer Zählkammer mit einer Tiefe von 0,02 mm und 0,0025 mm 2 Fläche. Die Kammer
bestand aus einer 32 mm x 75 mm x 4,5 mm Glasplatte. Auf diese wurde ein Deckglas
gelegt. Die Kammer wurde mit 5µl eines Lm.-haltigem Mediums zwischen Deckglas und
Kammer beladen. Es wurden 16 Großquadrate unter dem Mikroskop ausgezählt und die
erhaltene Anzahl mit 50 000 multipliziert. Dies ergab die Leishmanienanzahl pro ml. Für
die Einstellung von Makrophagen wurde ebenso eine Neubauer Zählkammer verwendet
mit dem Unterschied, dass hier die Tiefe 0,1 mm betrug. Die Beladung erfolgte analog zu
oben mit einem Volumen von 10 µl. Es wurden ebenfalls 16 Großquadrate ausgezählt und
die erhaltene Anzahl mit 10 000 multipliziert. Dies ergab die Anzahl der Zellen pro ml.
2.2.2 Kultivierung von Promastigoten:
Zur Kultivierung von Promastigoten wurde der Stamm Leishmania major (Lm.) verwendet.
Dieser
Stamm
stammte
Promastigotenisolate
dieses
aus
einer
Patienten
Hautbiopsie
wurden
uns
eines
vom
infizierten
Patienten.
Bernhard-Nocht-Institut
bereitgestellt und in flüssigem Stickstoff gelagert. Für die Kultivierung wurden die
Promastigoten bei Raumtemperatur aufgetaut, in 4 ml FCS überführt und bei 2400 g für 8
min. abzentrifugiert. Der Überstand wurde verworfen. Dieser Waschschritt wurde
nochmals mit 5 ml RPMI 1640-Medium, versetzt mit FCS, Mercaptoethanol, L-Glutamin,
HEPES, Penicillin und Streptomycin (Lm.-Medium), wiederholt. Anschließend wurden die
Promastigoten in Lm.-Medium aufgenommen und in eine Blutagarplatte mit 100 000
lebenden Lm. pro Well überführt. Die Blutagarplatte bestand aus einer 96-Well Platte, in
welche eine schräge Blutagarfläche eingegossen worden war. Dadurch entstand ein 2
18
2. Material und Methoden
Promastigoten anschließend in 25 cm² Kulturflaschen überführt mit einer Gesamtzahl von
maximal 100 Mio. Lm. pro Flasche. Die Kultur wurde bei 33°C und 5% CO2 für 7- 14 d
kultiviert. Die genaue Dauer hing davon ab, wie schnell die Umwandlung von der
promastigoten- in die amastigote Form vonstatten ging.
2.2.3.2 Isolation von amastigoten Reinkulturen:
Für die Isolation wurden folgende Konzentrationen mit Histopaque 1119 und AAMMedium hergestellt:
50% (1,0595 g/ml), 70% (1,0833 g/ml), 80% (1,0952 g/ml), 90% (1,1071 g/ml) ,
100% (1119 g/ml) Histopaque 1119.
In einem 15 ml Plastikröhrchen wurde ein nichtkontinuierlicher Gradient hergestellt,
beginnend mit 3 ml 100% gefolgt von 2 ml 90%, 3 ml 80% und 2 ml 70% Histopaque.
Die wie oben beschrieben kultivierten Lm. wurden mit 2400g für 8 min. abzentrifugiert
und der Überstand verworfen. Das Pellet wurde in 2,5 ml 50% Histopaque aufgenommen
und auf den vorbereiteten Gradienten aufgeschichtet. Der gesamte Gradient wurde mit
2400g 35 min. lang mit der geringsten Beschleunigung und Abbremsung zentrifugiert,
wobei sich an den jeweiligen Grenzschichten 4 Banden ausbildeten. Die Banden wurden
einzeln mit dem jeweiligen darüber liegenden Flüssigkeitssaum abgenommen, mit 50 ml
AAM-Medium versetzt, mit 2400 g für 8 min. zentrifugiert und der Überstand verworfen.
Dieser Waschschritt wurde nochmals mit 5 ml AAM-Medium wiederholt. Anschließend
wurden die Amastigoten in 25 cm² Kulturflaschen mit einer maximalen Anzahl von 100
Mio. in AAM-Medium überführt und bei 33°C und 5% CO2 inkubiert. Die größte Reinheit
von Amastigoten erzielte man aus den Grenzschichten zwischen 80% und 90% , sowie aus
den Schichten 90% und 100%. Aus diesem Grund wurden diese auch für die
Infektionsversuche genutzt.
20
2. Material und Methoden
2.2.4 Isolation von Monozyten:
Zur Isolation von humanen Monozyten wurden Buffy Coats verwendet. Diese wurden
einen Tag zuvor durch Zentrifugation aus einer frisch abgenommen Blutkonserve eines
gesunden Blutspenders hergestellt. Zur Vorbereitung wurde das Blut mit PBS auf 100 ml
Gesamtvolumen erhöht. 25 ml Blut wurde auf 15 ml Lymphozytenseparationsmedium
(LSM) 1077 geschichtet und mit 544 G für 30 min. bei niedrigster Beschleunigung und
Abbremsung zentrifugiert. Anschließend wurde die entstandene Bande an der Grenzschicht
abgenommen. Nach einem Waschschritt mit 50 ml Waschpuffer, PBS mit 5% PMNMedium (RPMI 1640-Medium versetzt mit L-Glutamin, HEPES-Buffer, Penicillin,
Streptomycin, FCS und Mercaptoethanol) erfolgte eine Zentrifugation für 8 min. bei 1028
G, wobei der Überstand verworfen wurde. Dieser Waschschritt wurde 2 mal wiederholt,
der eine mit einer Beschleunigung von 544 G und der andere mit 136 G .
Zur Entfernung überschüssiger Erythrozyten wurden die Zellen anschließend für 15 min.
mit 0,15 M Ammoniumchlorid-Lösung behandelt. Es erfolgten 2 weitere Waschschritte in
denen die Zellen jeweils mit Waschpuffer auf 50 ml Gesamtvolumen versetzt und mit
1028 G für 8 min. abzentrifugiert wurden. Die Überstände wurden jeweils verworfen. Die
Zellen (maximal 55 Mio.) wurden anschließend in 25 cm² Plastikzellkulturflaschen
ausgebracht und für 2 h bei 37° und 5% CO2 in PMN-Medium inkubiert, wobei zur
Verbesserung der Adhäsion zusätzlich 1% (v/v) Humanes Serum zugegeben wurde. Nach
der Inkubation wurde das überschüssige Medium verworfen und die nichtadhärenten Zellen
anschließend 2 mal mit 37°C warmen Waschpuffer abgespült. Die Inkubation erfolgte für
7d bei 37°C mit 5% CO2, wobei zur Differenzierung in Typ 1 Makrophagen 10 ng GMCSF/ml PMN-Medium und zur Differenzierung in Typ 2 Makrophagen 10 ng M-CSF/ml
hinzugegeben wurde. Die inkubierten Makrophagen wurden für 15 min. bei 4°C gekühlt.
Anschließend wurden die Zellen vorsichtig mit einem Zellschaber vom Boden der
Zellkulturflasche abgelöst und der Überstand wurde in ein 50 ml Plastikröhrchen überführt.
Zusätzlich wurde der Boden der Zellkulturflaschen 2 mal mit 4°C kalten Waschpuffer
gespült und der Überstand ebenfalls überführt. Es erfolgte ein Zentrifugationsschritt mit
1028 G für 8 min. und der Überstand wurde verworfen.
21
2. Material und Methoden
2.2.5 Infektion von Makrophagen mit Promastigoten/Amastigoten:
Die Infektion erfolgte in 15 ml Plastikröhrchen, wobei MF und Leishmanien in einem
bestimmten Verhältnis (MOI: MF: Lm.) in 1 ml PMN-Medium bei 37°C inkubiert wurden.
Je nach Versuchsansatz wurden 3d prozyklische-, 7d und 9d alte metazyklischen
Promastigote, sowie frisch isolierte, 10d und mehr als 21d alte Amastigoten zur Infektion
verwendet. Als Medium Kontrolle dienten uninfizierte MF. Für die Kurzzeitversuche der
Proteine EEA 1 und CD63 betrug die Infektionszeit 45 min. mit einer MOI von 1:50, für
die Proteine Clathrin und Caveolin 30 min. mit einer MOI von 1:50. Für die
Langzeitversuche mit LAMP 2, Rab 7, CD63 und LC3b wurde 24h mit einer MOI von 1:15
inkubiert, dabei wurde 3 h nach Infektionsbeginn 1 ml PMN–Medium je Mio.
Makrophagen hinzugegeben. Für alle oben beschriebene Versuche wurden 7 d alte
metazyklische Promastigote und frisch isolierte Amastigoten zur Infektion verwendet.
Für die Versuche der Korrelation von Todesraten mit unterschiedlichem LC3b Anteil
wurden 3d alte prozyklische-, 7d und 9d alte metazyklischen Promastigote, sowie 10d und
mehr als 21d alte Amastigote bei einer MOI von 1:15 bei 24h Inkubationszeit verwendet.
Nach erfolgter Inkubation wurden die Zellen 15 min. auf 4°C gekühlt, mit 1028 G für 8
min. abzentrifugiert und mit 4% PFA in PBS für 10 min. bei 4°C fixiert.
2.2.6 Intrazelluläre Färbung der Makrophagen:
Die infizierten und fixierten Makrophagen wurden in eine 96 Well–Platte überführt.
Je Spender, MF Typ und spezifisches Protein wurden 3*10 5 Zellen je Well verwendet.
Anschließend wurden die Makrophagen mit 378 g 4 min. bei 4°C abzentrifugiert und der
Überstand verworfen. Das entstandene Pellet wurde mit 100 µl PBS versetzt mit Saponin,
FCS, NHS und BSA (Saponin - Lösung) aufgelöst und erneut mit 378 g für 4 min. bei 4°C
zentrifugiert. Im nächsten Schritt wurden die Zellen mit 100 µl der jeweiligen
Erstantikörperlösung behandelt (Abb. 2b) und für 30 min. bei 4°C, lichtgeschützt inkubiert.
Anschließend erfolgte ein weiterer Zentrifugationsschritt, analog wie oben beschrieben.
Der Überstand wurde verworfen und das Pellet mit 100 µl Saponin- Lösung gewaschen.
Nach
einem
weiteren
Zentrifugationsschritt
wurde
das
Pellet
in
100
µl
Zweitantikörperlösung gelöst und ebenfalls für 30 min. bei 4°C, lichtgeschützt inkubiert.
Nach erneuter Zentrifugation erfolgte ein Waschschritt mit 100 µl PBS versetzt mit FCS,
22
2. Material und Methoden
NHS und BSA (FACS Puffer). Erneut wurde zentrifugiert und das Pellet in 400 µl FACS Puffer aufgenommen.
Tabelle 1: Antikörperkombinationen bei Färbung der verschiedenen Kompartimente
Intrazelluläre Anfärbung von
Caveolin Kompartimenten
1. Antikörper in Saponin -
2.Antikörper in Saponin -
Lösung(100µl)
Lösung(100µl)
Anti-Caveolin Maus
Anti-Maus Alex Fluor 488
Antikörper
(grün) Konjugat Antikörper
1:100
1:100
Anti-Lm. Kaninchen
Anti-Kaninchen Alexa Fluor
Antikörper
568 (rot) Konjugat
1:1000
Antikörper
1:100
CD63 Kompartimenten
Anti-Lm. Kaninchen
Anti-CD63 Maus Antikörper
Antikörper
PE (rot)
1:1000
(Kurzeitinfektion)
1:160
Anti-Kaninchen Alexa Fluor
488 (grün) Konjugat
Antikörper
1:100
CD63 Kompartimenten
Anti-Lm. Kaninchen
Anti-Kaninchen Alexa Fluor
Antikörper
488 (grün) Konjugat
1:1000
Antikörper
1:100
(Langzeitinfektion)
Anti-CD63 Maus Antikörper
PE (rot)
1:160
Clathrin Kompartimenten
Anti-Clathrin Maus
Anti-Maus Alex Fluor 488
Antikörper
(grün) Konjugat Antikörper
1:100
1:100
Anti-Lm. Kaninchen
Anti-Kaninchen Alexa Fluor
Antikörper
568 (rot) Konjugat
1:1000
Antikörper
23
2. Material und Methoden
1:100
Anti-Lm. Kaninchen
Anti-EEA1 Maus FITC
Antikörper
(grün) Konjugat Antikörper
1:1000
EEA 1 Kompartimenten
1:130
Anti-Kaninchen Alexa Fluor
568 (rot) Konjugat
Antikörper
1:100
LAMP2 Kompartimente
Anti-LAMP2 Maus
Anti-Maus Alex Fluor 488
Antikörper
(grün) Konjugat Antikörper
1:160
1:100
Anti-Lm. Kaninchen
Anti-Kaninchen Alexa Fluor
Antikörper
568 (rot) Konjugat
1:1000
Antikörper
1:100
LC3b Kompartimenten
Anti-LC3B Kaninchen
Anti-Kaninchen Alexa Fluor
Antikörper
568 (rot) Konjugat
1:200
Antikörper
Anti-Lm. Maus
1:100
Antikörper
Anti-Maus Alex Fluor 488
1:600
(grün) Konjugat Antikörper
1:100
Anti Rab 7 Maus
Anti-Maus Alex Fluor 488
Antikörper
(grün) Konjugat Antikörper
1:100
1:100
Rab 7 Kompartimenten
Anti-Kaninchen Alexa Fluor
Anti-Lm. Kaninchen
568 (rot) Konjugat
1:1000
Antikörper
1:100
24
2. Material und Methoden
2.2.7 Färbung der toten Lm. mit Annexin V:
100 µl Ringer Lösung wurde mit Annexin V Fluos Antikörper im Verhältnis 1:100
versetzt. Zu dieser Lösung wurden 1,5*106 Promastigoten bzw. Amastigoten hinzugegeben
und für 20 min. auf Eis inkubiert. Anschließend wurde nochmals 300 µl Ringer Lösung
dazugegeben.
2.2.8 Durchflusscytometeranalyse der Makrophagen / Lm:
Die in FACS Puffer bzw. Ringer Lösung vorliegenden Zellen wurden mit dem
Durchflusscytometer FACSCalibur eingelesen. Je Makrophagen-Probe wurden 10 000, je
Lm. Probe 50 000 Zellen eingelesen. Die Auswertung erfolgte mit dem Softwareprogramm
CellQuestPro und FlowJo 7.6.3.
2.2.9 Präparation und Aufnahme der Fluoreszenzbilder:
Die angefärbten MF wurden für die Fluoreszenzaufnahmen zusätzlich mit 4′,6-Diamidin-2phenylindol (DAPI) in einer Verdünnung von 1:100 in FACS Puffer versetzt. Die Zellen
wurden bei 4°C für 20 min. inkubiert. Anschließend wurden 100 000 Zellen auf einen
Objektträger zentrifugiert. Die Präparate wurden mit dem Eindeckelmedium Pro Long
Gold antifade und einem Deckglas versehen. Die Zellen wurden mittels des
Fluoreszenzmikroskop Axio Imager.M2 aufgenommen und die Bilder mit dem Programm
AxioVision Release 4.8 erstellt.
25
2. Material und Methoden
2.2.10 Statistische Auswertung:
Die Auswertung erfolgte mit dem Rechenprogramm Excel. Es wurde die Differenz aus
dem Anteil der doppelt positiven Zellen (infiziert und Protein) zwischen Probe und
Kontrolle gebildet und der Mittelwert aus den entsprechenden Versuchen berechnet. Die
Kontrolle wurde als Nulllinie im Histogramm definiert und die Änderungen bezüglich
dieser Linie dargestellt. Es wurde außerdem der „standard error of the mean“ (SEM)
berechnet und als Fehlerbalken in die Grafik eingefügt. Die Berechnung der statistischen
Signifikanz zwischen 2 Versuchsansätzen erfolgte mittels des Student T Tests (ungepaart,
zweiseitig) ebenfalls unter Excel. Als statistisch signifikant wurde ein p<0,05
angenommen.
26
3.Ergebnisse
3 Ergebnisse
3.1 Veränderung des Anteils an Caveolin positiven Zellen bei Infektion
mit Lm.
Um eine Beteiligung von Caveolin bei einer Infektion mit Lm. zu untersuchen wurden Typ
1 und 2 Makrophagen entweder mit Promastigoten oder Amastigoten infiziert. Die Lm.
und das Protein Caveolin wurden selektiv angefärbt. Eine quantitative Auswertung erfolgte
über das Durchflusscytometer. Hier wurden die Caveolin positiven und infizierten Zellen
erfasst und gegenüber einer uninfizierten Kontrolle dargestellt.
In der quantitativen FACS Analyse zeigte sich, dass Typ 1 MF einen höheren Caveolin
positiven Anteil nach der Infektion mit Promastigoten zeigten im Vergleich zu
uninfizierten MF (Abb. 3a, A und B). Die Infektion mit Amastigoten wies einen ähnlichen
Anteil mit Caveolin auf (Abb. 3a, C). Zusätzlich wurde Caveolin in ähnlich infizierten Typ
2 MF untersucht. Es zeigte sich, dass die Typ 2 MF einen höheren Caveolin Anteil nach
der Infektion mit Promastigoten aufwiesen im Vergleich zu den Typ 1 MF (Abb. 3a, E).
Trotzdem war dieser Unterschied nicht signifikant (Abb. 3b). Außerdem zeigte sich ein
erniedrigter Caveolin Anteil nach der Infektion mit Amastigoten bei den Typ 2 MF im
Vergleich zu Typ 1 MF (Abb. 3a, F). Wiederum war dies nicht signifikant (Abb. 3b).
Der mittlere Anteil der Caveolin positiven Zellen betrug bei der Infektion mit
Promastigoten bei den Typ 1 MF 4,36% ± 3,83% gegenüber der uninfizierten Kontrolle,
dagegen bei der Infektion mit Amastigoten nur 3,39% ± 2,55% (Abb. 3b). Bei den Typ 2
Makrophagen wurde ein Anteil von 9,94% ± 11,00% bei der Promastigoteninfektion und
5,03% ± 6,07% bei der Amastigoteninfektion gemessen (Abb. 3b).
27
3.Ergebnisse
[%] Anteil der Cav eolin positiv en Zellen
16,00
Promastigoteninf ektion
Amastigoteninf ektion
0,00
Typ 1 MF
Typ 2 MF
Abbildung 3b: Dargestellt ist die Veränderung von Caveolin positiven und infizierten Makrophagen
gegenüber der uninfizierten Kontrolle. Die Kontrolle ist als Nulllinie definiert. Die
Abbildung zeigt die Ergebnisse von 3 unabhängigen Versuchen. Die Balken stellen
die Mittelwerte und den SEM dar. MF 1/2: Makrophagen Typ 1/2
Da das Durchflusscytometer keine morphologischen Aufschlüsse über die einzelnen Zellen
machen kann, wurden noch mikroskopisch Präparate aus den oben beschriebenen
Makrophagen angefertigt. In Abb. 4 sind typische Bilder von Typ 1 MF bei einer Infektion
mit Amastigoten dargestellt. Es zeigte sich, dass es schon bei der Aufnahme von Lm. zu
einer Umlagerung mit Caveolin zu kommen scheint (Abb. 4B, Dicker Pfeil). Auch schon
internalisierte Parasiten wiesen eine Caveolinpositivität auf (Abb. 4B und 4C, dünne
Pfeile). Ähnliches zeigte sich bei den Typ 2 MF, die mit Amastigoten infiziert waren
(Daten nicht dargestellt). Bei der Infektion mit Promastigoten konnte man mikroskopisch
jedoch keine Umlagerung feststellen (Daten nicht dargestellt).
29
3.Ergebnisse
A) MF 1
PHK
B) MF 1
Cav(grün)
D) MF 1
Cav,Ama
E) MF 1
ÜLB
C) MF 1
Ama(rot)
Abbildung 4: Typ 1 Makrophagen wurden mit frisch isolierten Amastigoten (MOI 50,30 min.)
infiziert. Die Lm. wurden mit einem Anti-Lm. polyklonalem Kaninchen AK, Caveolin
mit einem Anti-Caveolin monoklonalem Maus AK., spezifisch markiert. Als
Zweitantikörper diente ein Anti-Maus Alexa Fluor 488 (grün) und ein Anti-Kaninchen
Alexa Fluor 568 (rot) AK.
A-E Die Bilder zeigen einen Typ 1 MF, der im Begriff ist einen Amastigoten
(C, Dicker Pfeil) aufzunehmen. Das zytoplasmatische Protein Caveolin (B, Dicker
Pfeil) umlagert diesen Amastigoten. Zusätzlich sind schon aufgenommene
Amastigoten (C, dünne Pfeile) sichtbar, die ebenfalls mit Caveolin umlagert sind (B,
dünne Pfeile). MF 1: Makrophagen Typ 1; PHK: Phasenkontrast; Cav: Caveolin 1;
Ama: Amastigoten; ÜLB: Überlagerungsbild. Diese Bilder zeigen eine typische
Aufnahme aus 3 unabhängigen Versuchen. Vergrößerung 2400-fach.
30
3.Ergebnisse
3.2 Veränderung des Anteils an Clathrin positiven Zellen bei Infektion
mit Lm.
Um eine mögliche Veränderung des Proteins Clathrin bei Infektion mit Lm. darzustellen,
wurden Typ 1 und 2 Makrophagen entweder mit Promastigoten oder Amastigoten infiziert.
Die Anfärbung von Clathrin und den Lm. erfolgte mit spezifischen Antikörpern. Analog zu
den Versuchen mit Caveolin erfolgte die Auswertung mit dem Duchflusscytometer. Es
wurden wiederum die infizierten und Clathrin positiven Zellen erfasst und gegenüber einer
uninfizierten Kontrolle dargestellt.
In der quantitativen FACS Analyse zeigte sich, dass Typ 1 MF einen höheren Clathrin
positiven Anteil nach der Infektion mit Promastigoten zeigten im Vergleich zu
uninfizierten MF (Abb. 5a, A und B). Die Infektion mit Amastigoten wies einen ähnlichen
Anteil mit Clathrin auf (Abb. 5a, C). Zusätzlich wurde Clathrin in ähnlich infizierten Typ 2
MF untersucht. Es zeigte sich, dass die Typ 2 MF einen deutlich höheren Clathrin Anteil
nach der Infektion mit Promastigoten aufwiesen im Vergleich zu den Typ 1 MF (Abb. 5a,
E). Trotzdem war dieser Unterschied nicht signifikant (Abb. 5b). Außerdem zeigte sich ein
etwas höherer Clathrin Anteil nach der Infektion mit Amastigoten bei den Typ 2 MF im
Vergleich zu Typ 1 MF (Abb. 5a, F). Wiederum war dies nicht signifikant (Abb. 5b).
Der mittlere Anteil der Clathrin positiven Zellen betrug bei der Infektion mit
Promastigoten bei den Typ 1 MF nur 0,6% ± 1,05%, dagegen bei der Amastigoteninfektion
2,24% ± 8,7% gegenüber den uninfizierten Kontrollen (Abb. 5b). Bei den Typ 2 Zellen
kam es zu einem Anteil von 7,06% ± 5,41% bei der Infektion mit Promastigoten und nur
zu einem Anteil von 0,27% ± 3,04% bei der Infektion mit Amastigoten (Abb. 5b).
31
3.Ergebnisse
[%] Anteil der Clathrin positiv en Zellen
10,00
Promastigoteninf ektion
Amastigoteninf ektion
0,00
Typ 1 MF
Typ 2 MF
Abbildung 5b: Dargestellt ist die Veränderung von Clathrin positiven und infizierten Makrophagen
gegenüber der uninfizierten Kontrolle. Die Kontrolle ist als Nulllinie definiert. Die
Abbildung zeigt die Ergebnisse von 3 unabhängigen Versuchen. Die Balken stellen
die Mittelwerte und den SEM dar. MF 1/2: Makrophagen Typ 1/2
Bei der mikroskopischen Betrachtung konnte man feststellen, dass es bei der Infektion mit
Promastigoten zu einer Umlagerung von aufgenommen Parasiten mit Clathrin, sowohl bei
den Typ 1 als auch den Typ 2 MF, kam. Dargestellt ist dies exemplarisch für Typ 2 MF
(Abb. 6a, B und C). Ähnliches zeigte sich bei der Infektion mit den Amastigoten.
Exemplarisch dargestellt für Typ 1 MF (Abb. 6b, H und I, Pfeile).
33
3.Ergebnisse
A) MF 2
PHK
B) MF 2
Cla(grün)
D) MF 2
Cla,Pro
E) MF 2
ÜLB
C) MF 2
Pro(rot)
Abbildung 6a: Typ 1 und 2 Makrophagen wurden mit 7d alten metazyklischen Promastigoten bzw.
frisch isolierten Amastigoten (MOI 50, 30 min.) infiziert. Die Lm. wurden mit einem
Anti-Lm. polyklonalem Kaninchen AK, Clathrin mit einem Anti-Clathrin
monoklonalem Maus AK., spezifisch markiert. Als Zweitantikörper diente ein AntiMaus Alexa Fluor 488 (grün) und ein Anti-Kaninchen Alexa Fluor 568 (rot) AK.
A-E Dargestellt ist ein Typ 2 MF, der intrazellulär einen toten Promastigoten (C)
aufgenommen hat. Clathrin (B) umlagert diese. Extrazellulär erkennt man einen noch
lebenden Promastigoten mit dem charakteristischen langgezogenen Körper und der
langen Geißel (C).
MF2: Typ2 Makrophagen; PHK: Phasenkontrastaufnahme; Cla: Clathrin;Pro:
Promastigoten; ÜLB: Überlagerungsbild. Diese Bilder zeigen typische Aufnahmen
aus 3 unabhängigen Versuchen. Vergrößerung 2400-fach.
34
3.Ergebnisse
F) MF 1
PHK
I) MF 1
Cla,Ama
G) MF 1
Cla(grün)
H) MF 1
Ama(rot)
J) MF 1
ÜLB
Abbildung 6b: F-J Man erkennt einen Typ 1 MF der von Amastigoten (H, Pfeile) umlagert ist.
Gleichzeitig sieht man, dass diese (G, Pfeile) mit Clathrin umlagert sind.
MF1: Typ 1 Makrophagen; PHK: Phasenkontrastaufnahme; Cla: Clathrin;Ama:
Amastigoten; ÜLB: Überlagerungsbild. Diese Bilder zeigen typische Aufnahmen aus
3 unabhängigen Versuchen. Vergrößerung 2400-fach.
35
3.Ergebnisse
3.3 Veränderung des Anteils an EEA 1 positiven Zellen bei Infektion
mit Lm.
Das frühe Endosom trägt in seiner Membran das Protein EEA 1. Deshalb stellte sich die
Frage, ob Promastigote bzw. Amastigote eventuell dieses Molekül beeinflussen und so
Einfluss auf den endosomalen Aufnahmeweg nehmen. Aus diesem Grund wurden Typ 1
und 2 MF mit Amastigoten oder Promastigoten infiziert. Es erfolgte eine Anfärbung des
Proteins EEA 1 und der Lm. mit spezifischen AK. Quantifiziert wurden die Zellen mittels
des Durchflusscytometers. Es wurden die infizierten Zellen und EEA 1 positiven Zellen
erfasst und mit einer uninfizierten Kontrolle verglichen.
In der quantitativen FACS Analyse zeigte sich, dass Typ 1 MF einen höheren EEA 1
positiven Anteil nach der Infektion mit Promastigoten zeigten im Vergleich zu
uninfizierten MF (Abb. 7a, A und B). Die Infektion mit Amastigoten wies dagegen einen
ähnlichen Anteil wie die Kontrolle auf (Abb. 7a, C). Zusätzlich wurde EEA 1 in ähnlich
infizierten Typ 2 MF untersucht. Es zeigte sich, dass die Typ 2 MF einen gering höheren
EEA 1 Anteil nach der Infektion mit Promastigoten aufwiesen im Vergleich zu den Typ 1
MF (Abb. 7a, E). Trotzdem war dieser Unterschied nicht signifikant (Abb. 7b). Außerdem
zeigte sich ein etwas höherer EEA 1 Anteil nach der Infektion mit Amastigoten bei den
Typ 2 MF im Vergleich zu Typ 1 MF (Abb. 7a, F). Wiederum war dies nicht signifikant
(Abb. 7b).
Der mittlere Anteil der EEA 1 positiven Zellen betrug bei der Infektion mit Promastigoten
bei den Typ 1 MF 3,51% ± 4,00% und bei der Infektion mit Amastigoten lediglich 0,45%
± 1,41% gegenüber der Kontrolle (Abb. 7b). Bei den Typ 2 MF betrug der Anteil 2,06% ±
3,83% bei der Infektion mit Promastigoten und 3,25% ± 12,95% bei der Infektion mit
Amastigoten (Abb. 7b).
36
3.Ergebnisse
[%] Anteil v on EEA 1 positiv en Zellen
10,00
Promastigoteninf ektion
Amastigoteninf ektion
0,00
Typ 1 MF
Typ 2 MF
Abbildung 7b: Dargestellt ist die Veränderung von EEA 1 positiven und infizierten Makrophagen
gegenüber der uninfizierten Kontrolle. Die Kontrolle ist als Nulllinie definiert.Die
Abbildung zeigt die Ergebnisse von 5 unabhängigen Versuchen. Die Balken stellen
die Mittelwerte und den SEM dar. MF 1/2: Makrophagen Typ 1/2
Es konnte gezeigt werden, dass es bei den Typ 1 MF mikroskopisch zu keiner
Anreicherung von EEA 1 um aufgenommene Promastigoten kam (Abb. 8a, B und C).
Ebenso wenig konnte man dies bei der Infektion mit Amastigoten bei den Typ 1 MF
nachweisen (Abb. 8b, G und H). Auch für die Typ 2 MF konnte ich weder bei der
Infektion mit Promastigoten als auch mit Amastigoten eine Umlagerung mit EEA 1
feststellen (Daten nicht dargestellt).
38
3.Ergebnisse
A) MF 1
PHK
B) MF 1
EEA1(grün)
D) MF 1
EEA1,Pro
E) MF 1
ÜLB
C) MF 1
Pro(rot)
Abbildung 8a: Typ 1 Makrophagen wurden mit 7d alten metazyklischen Promastigoten bzw. frisch
isolierten Amastigoten (MOI 50, 45 min.) infiziert. Die Lm. wurden mit einem AntiLm. polyklonalem Kaninchen AK, EEA 1 mit einem Anti-EEA 1 monoklonalem
Maus AK., spezifisch markiert. Als Zweitantikörper diente ein Anti-Maus Alexa
Fluor 488 (grün) und ein Anti-Kaninchen Alexa Fluor 568 (rot) AK.
A-E Bei der Infektion mit Promastigoten (C) kann man keine Umlagerung mit EEA 1
(B) ausmachen. MF 1: Typ 1 Makrophagen; PHK: Phasenkontrastaufnahme; Pro:
Promastigoten; ÜLB: Überlagerungsbild. Diese Bilder zeigen typische Aufnahmen
aus 5 unabhängigen Versuchen. Vergrößerung 2400-fach.
39
3.Ergebnisse
F) MF 1
PHK
G) MF 1
EEA1(grün)
I) MF 1
EEA1,Ama
J) MF 1
ÜLB
H) MF 1
Ama(rot)
Abbildung 8b: F-J Ähnlich wie unter Abb. 8a konnte man auch bei der Infektion mit Amastigoten
(H) keine Umlagerung mit EEA 1 (G) ausmachen.
MF 1: Typ 1 Makrophagen; PHK: Phasenkontrastaufnahme;; Ama: Amastigoten;
ÜLB: Überlagerungsbild. Diese Bilder zeigen typische Aufnahmen aus 5
unabhängigen Versuchen. Vergrößerung 2400-fach.
40
3.Ergebnisse
3.4 Einfluss der Infektion von Lm. auf das spätendosomale/lysosomale
Protein CD63
Bisher wurden Proteine untersucht, die entweder im Aufnahmeprozess der Lm. (Clathrin
bzw. Caveolin) oder aber früh nach Aufnahme eine Rolle spielen (EEA 1). Bisher zeigten
sich keine signifikanten Unterschiede in der Verteilung zwischen Promastigoten und
Amastigoten weder bei Typ 1 noch bei Typ 2 MF.
Aus diesem Grund wurden die spätendosomalen/lysosomalen Kompartimenten analysiert,
da Amastigote bekanntermaßen in lysosomalen Kompartimenten zu liegen kommen,
Promastigote dagegen nicht. Als einen „Marker“ des späten Endosomen wurde das Protein
CD63 in MF analysiert. CD63 ist ein Oberflächenmarker von späten Endosomen und
teilweise auch Lysosomen. Da Amastigoten in saurem Medium überleben, stellte sich die
Frage, ob diese deshalb schneller in diesen Kompartimenten zu liegen kommen, da hier der
pH Wert geringer ist. Aus diesem Grund wurde ein früher Zeitpunkt mit einer
Infektionszeit von 45 min. und ein späterer mit einer Infektionszeit von 24h. gewählt. Falls
sich die Vermutung bestätigt, müssten die Amastigoten zu einem höheren Anteil in CD63
positiven Kompartimenten liegen. Es wurden MF entweder mit Promastigoten bzw.
Amastigoten für 45 min. bzw. 24h. infiziert. Die Lm. wurden spezifisch mit AK. markiert.
Quantifiziert wurden die Zellen mittels des Durchflusscytometers. Es wurden CD63
positive und infizierte Zellen erfasst und mit einer uninfizierten Probe verglichen.
In der quantitativen FACS Analyse zeigte sich, hier exemplarisch für die Kurzzeitinfektion
dargestellt (Abb. 9a, A-F), dass bei den Typ 1 MF ein höherer CD63 positiver Anteil nach
der Infektion mit Promastigoten vorhanden war im Vergleich zu uninfizierten MF (Abb.
9a, A und B). Die Infektion mit Amastigoten wies dagegen einen ähnlich hohen Anteil wie
bei der Infektion mit Promastigoten auf (Abb. 9a, C). Zusätzlich wurde CD63 in ähnlich
infizierten Typ 2 MF untersucht. Es zeigte sich, dass die Typ 2 MF einen ähnlich hohen
CD63 Anteil nach der Infektion mit Promastigoten aufwiesen im Vergleich zu den Typ 1
MF (Abb. 9a, E). Dieser Unterschied war nicht signifikant (Abb. 9b, G). Außerdem zeigte
sich ein etwas niederer CD63 Anteil nach der Infektion mit Amastigoten bei den Typ 2 MF
im Vergleich zu Typ 1 MF (Abb. 9a, F). Wiederum war dies nicht signifikant (Abb. 9b, G).
Der mittlere Anteil der CD63 positiven Zellen betrug bei der Infektion mit Promastigoten
bei den Typ 1 MF 5,25% ± 8,17% bei Kurzzeitinfektion (Abb. 9b, G, 1.Säule v. links) und
17,4% ± 19,14% bei Langzeitinfektion (Abb. 9b, H, 1. Säule v. links) gegenüber der
41
3.Ergebnisse
Kontrolle. Bei den Typ 2 MF konnte ein Anteil von 8,69% ± 19,67% bei Kurzzeit- (Abb.
9b, G, 2 Säule v. rechts) und 3,71% ± 3,99% bei Langzeitinfektion mit Promastigoten
festgestellt werden (Abb. 9b, H, 2 Säule v. rechts). Für die Amastigoten ergab sich hier ein
Anteil von 3,86% ± 5,93% für die Kurzzeitinfektion (Abb. 9b, G, 2. Säule v. links) und
6,09% ± 7,50% bei Langzeitinfektion von Typ 1 MF (Abb. 9b, H, 2. Säule v. links). Bei
den Typ 2 MF betrug dieser 7,54% ± 9,07% bei Kurzzeitinfektion (Abb. 9b, G, 1. Säule v.
rechts) und 8,14% ± 10,64% bei Langzeitinfektion mit Amastigoten (Abb. 9b, H, 1. Säule
v. rechts).
42
3.Ergebnisse
35
Promastigoteninf ektion (45min.)
Amastigoteninf ektion (45 min.)
G
[%] Anteil der CD63 positiv en Zellen
[%] Anteil v on CD63 positiv en Zellen
35
Promastigoteninf ektion(24h)
Amastigoteninf ektion(24h)
H
0
0
Typ 1 MF
Typ 1 MF
Typ 2 MF
Typ 2 MF
Abbildung 9b: G-H Dargestellt ist die Veränderung von CD63 positiven und infizierten Makrophagen
gegenüber der uninfizierten Kontrolle. Die Kontrolle ist als Nulllinie definiert.
Links: Infektionsdauer 45 min.; rechts: Infektionsdauer 24 h. Die Abbildungen zeigen
die Ergebnisse von 5 unabhängigen Versuchen. Die Balken stellen die Mittelwerte und
den SEM dar. MF 1/2: Makrophagen Typ 1/2
Bei der Untersuchung unter dem Mikroskop stellte sich heraus, dass es bei den Typ 1 MF
nach 45 min. Infektionszeit zu keiner Umlagerung der aufgenommenen Amastigoten kam.
(Abb. 10a, B und C). Nach 24-stündiger Infektion konnte man jedoch eine Umlagerung
von CD63 um die Amastigoten feststellen (Abb. 10b, G und H). Das gleiche ließ sich für
die Typ 2 MF feststellen (Daten nicht dargestellt). Im Gegensatz dazu konnte dies bei den
Promastigoten sowohl bei Kurzzeit- als auch bei Langzeitinfektion nicht beobachten
(Daten nicht dargestellt).
44
3.Ergebnisse
A) MF 1
PHK
D) MF 1
CD63,Ama
B) MF 1
CD63(rot)
C) MF 1
Ama(grün)
E) MF 1
ÜLB
Abbildung 10a: Typ 1 Makrophagen wurden mit 7d alten metazyklischen Promastigoten bzw. frisch
isolierten Amastigoten (MOI 50, 45 min. bzw. MOI 15, 24h.) infiziert. Die Lm.
wurden mit einem Anti-Lm. polyklonalem Kaninchen AK, CD63 mit einem AntiCD63 PE (rot) monoklonalem Maus AK., spezifisch markiert. Als Zweitantikörper
diente ein Anti-Kaninchen Alexa Fluor 488 (grün) AK.
A-E MF Typ 1 bei einer Infektionsdauer von 45 min. Amastigoten (C) sind hier
nicht mit CD 63 (B) umlagert.
MF1:Typ 1 Makrophagen;ÜLB: Überlagerungsbild; PHK: Phasenkontrastaufnahme;
Ama: Amastigoten; Diese Bilder zeigen typische Aufnahmen von Bildern aus 5
unabhängigen Versuchen. Vergrößerung 2400-fach.
45
3.Ergebnisse
F) MF 1
PHK
G) MF 1
CD63(rot)
I) MF 1
CD63, Ama
J) MF 1
ÜLB
H) MF 1
Ama(grün)
Abbildung 10b: F-J MF Typ 1 bei einer Infektionsdauer von 24h. Es zeigten sich Amastigoten (H),
die mit CD63(G, Pfeil) umlagert sind (I, Pfeil). MF1: Typ 1 Makrophagen; ÜLB:
Überlagerungsbild; PHK: Phasenkontrastaufnahme; Ama: Amastigoten; Diese
Bilder zeigen typische Aufnahmen von Bildern aus 5 unabhängigen Versuchen.
Vergrößerung 2400-fach.
46
3.Ergebnisse
3.5 Einfluss der Infektion von Lm. auf das endosomale/lysosomale
Protein Rab 7
Ähnlich dem Protein CD63 ist das Protein Rab 7 auch an späten endosomalen/
lysosomalen Kompartimenten lokalisiert. Analog wie zu oben, wurden die MF mit den
Parasiten infiziert, angefärbt und mit dem Durchflusscytometer analysiert. Ausgewertet
wurden nur doppelt positive Zellen, also infizierte und Rab 7 positive Zellen.
In der quantitativen FACS Analyse zeigte sich, dass Typ 1 MF einen deutlich höheren Rab
7 positiven Anteil nach der Infektion mit Promastigoten zeigten im Vergleich zu
uninfizierten MF (Abb. 11a, A und B). Die Infektion mit Amastigoten wies dagegen einen
niederen Anteil als die Promastigoten, jedoch einen deutlich höheren als die Kontrolle auf
(Abb. 11a, C). Zusätzlich wurde Rab 7 in ähnlich infizierten Typ 2 MF untersucht. Auch
hier zeigte sich, dass die Typ 2 MF einen ähnlich hohen Rab 7 Anteil nach der Infektion
mit Promastigoten aufwiesen im Vergleich zu den Typ 1 MF (Abb. 11a, E). Trotzdem war
dieser Unterschied nicht signifikant (Abb. 11b). Außerdem zeigte sich ein etwas höherer
Rab 7 Anteil nach der Infektion mit Amastigoten bei den Typ 2 MF im Vergleich zu Typ 1
MF (Abb. 11a, F). Wiederum war dies nicht signifikant (Abb. 11b).
Der mittlere Anteil der Rab 7 positiven Zellen betrug bei der Infektion mit Promastigoten
bei den Typ 1 MF 16,82% ± 10,15%, bei der Infektion mit Amastigoten dagegen nur
9,87% ± 2,75% gegenüber der Kontrolle. Bei den Typ 2 MF betrug der Anteil 15,43% ±
8,45% bei der Infektion mit Promastigoten und 6,84% ± 6,32% bei der Infektion mit
Amastigoten. Ein statistisch signifikanter Unterschied konnte auch hierbei nicht
nachgewiesen werden (Abb. 11b).
47
3.Ergebnisse
[%] Anteil der Rab 7 positiv en Zellen
30,00
Promastigoteninfektion
Amastigoteninfektion
0,00
Typ 1 MF
Typ 2 MF
Abbildung 11b: Dargestellt ist die Veränderung von Rab 7 positiven und infizierten Makrophagen
gegenüber der uninfizierten Kontrolle. Die Kontrolle ist als Nulllinie definiert. Die
Abbildung zeigt die Ergebnisse von 4 unabhängigen Versuchen. Die Balken stellen
die Mittelwerte und den SEM dar. MF 1/2: Makrophagen Typ 1/2
Mikroskopisch zeigte sich eine deutliche Umlagerung der Promastigoten (Abb. 12a, B und
C, Pfeile), als auch der Amastigoten mit Rab 7 bei den Typ 1 MF (Abb. 12b, G und H,
Pfeile), als auch bei den Typ 2 MF (Daten nicht dargestellt).
49
3.Ergebnisse
A) MF 1
PHK
D) MF 1
Rab7,Pro
B) MF 1
Rab7(grün)
C) MF 1
Pro (rot)
E) MF 1
ÜLB
Abbildung 12a: Typ 1 Makrophagen wurden mit 7d alten metazyklischen Promastigoten bzw. frisch
isolierten Amastigoten (MOI 15, 24 h) infiziert. Die Lm. wurden mit einem AntiLm. polyklonalem Kaninchen AK, Rab 7 mit einem Anti-Rab 7 monoklonalem
Maus AK., spezifisch markiert. Als Zweitantikörper diente ein Anti-Maus Alexa
Fluor 488 (grün) und ein Anti-Kaninchen Alexa Fluor 568 (rot) AK.
A-E Man erkennt einen Typ 1 MF, der mehrere Promastigoten aufgenommen hat
(C, Pfeile). Um einige der Parasiten kann man eine deutliche Umlagerung von Rab
7 erkennen (B, Pfeile).
MF 1:Typ 1 Makrophagen;ÜLB:Überlagerungsbild;PHK: Phasenkontrastaufnahme;
Pro: Promastigoten. Diese Bilder zeigen typische Aufnahmen aus 4 unabhängigen
Versuchen. Vergrößerung 2400-fach.
50
3.Ergebnisse
F) MF 1
PHK
I) MF 1
Rab7,Ama
G) MF 1
Rab7(grün)
H) MF 1
Ama(rot)
J) MF 1
ÜLB
Abbildung 12b: F-J Dargestellt ist ein Typ 1 MF, der mehrere Amastigoten aufgenommen hat
(H, Pfeile). Auch hier kann man eine deutliche Umlagerung der Parasiten mit Rab 7
erkennen (G, Pfeile).
MF1:Typ1 Makrophagen;ÜLB: Überlagerungsbild; PHK: Phasenkontrastaufnahme;
Ama: Amastigoten; Diese Bilder zeigen typische Aufnahmen aus 4 unabhängigen
Versuchen. Vergrößerung 2400-fach.
51
3.Ergebnisse
3.6 Einfluss der Infektion von Lm. auf das lysosomale Protein LAMP 2
Lysosomen tragen das lysosomale Protein LAMP 2 in ihrer Membran. Es ist bekannt, dass
Amastigoten im sauren Milieu gut zurecht kommen und sich sogar im Lysosomen teilen
können. Dagegen ist dies für Promastigoten tödlich. Deshalb stellte sich die Frage, ob
hauptsächlich Amastigoten in diesen Kompartimenten zu liegen kommen. Wie oben
beschrieben, wurden die MF mit den Parasiten infiziert, angefärbt und mit dem
Durchflusscytometer analysiert. Ausgewertet wurden nur doppelt positive Zellen, also
infizierte und LAMP 2 positive Zellen.
In der quantitativen FACS Analyse zeigte sich, dass Typ 1 MF einen höheren LAMP 2
positiven Anteil nach der Infektion mit Promastigoten zeigten im Vergleich zu
uninfizierten MF (Abb. 13a, A und B). Die Infektion mit Amastigoten wies einen
ähnlichen Anteil mit LAMP 2 auf (Abb. 13a, C). Zusätzlich wurde LAMP 2 in ähnlich
infizierten Typ 2 MF untersucht. Es zeigte sich, dass die Typ 2 MF einen ähnlich hohen
LAMP 2 Anteil nach der Infektion mit Promastigoten aufwiesen im Vergleich zu den Typ
1 MF (Abb. 13a, E). Dieser Unterschied war nicht signifikant (Abb. 13b). Außerdem zeigte
sich ein erniedrigter LAMP 2 Anteil nach der Infektion mit Amastigoten bei den Typ 2 MF
im Vergleich zu Typ 1 MF (Abb. 13a, F). Wiederum war dies nicht signifikant (Abb. 13b).
Der mittlere Anteil der LAMP 2 positiven Zellen betrug bei der Infektion mit
Promastigoten 4,99% ± 2,94% und bei der Infektion mit Amastigoten 5,31% ± 4,95%
gegenüber der Kontrolle (Abb. 13b). Bei den Typ 2 Zellen betrug der Anteil der LAMP 2
positiven Zellen bei der Infektion mit Promastigoten dagegen 3,87% ± 2,82% und 1,97 %
± 1,65% bei den Amastigoten (Abb. 13b).
52
3.Ergebnisse
[%] Anteil der LAMP 2 positiv en Zellen
10,00
Promastigoteninfekt ion
Amast igoteninfektion
0,00
Typ 1 MF
Typ 2 MF
Abbildung 13b: Dargestellt ist die Veränderung von LAMP 2 positiven und infizierten Makrophagen
gegenüber der uninfizierten Kontrolle. Die Kontrolle ist als Nulllinie definiert. Die
Abbildung zeigt die Ergebnisse von 4 unabhängigen Versuchen. Die Balken stellen
die Mittelwerte und den SEM dar. MF 1/2: Makrophagen Typ 1/2
Trotz der unterschiedlichen Lebensbedingungen der Lm. konnte kein signifikanten
Unterschied zwischen Promastigoten und Amastigoten nachgewiesen werden. Allerdings
zeigte sich in den zusätzlich durchgeführten mikroskopischen Bildaufnahmen, dass es bei
den Typ 1 MF bei der Infektion mit Promastigoten zu einer deutlichen Umlagerung mit
LAMP 2 kommt (Abb. 14a, B und C). Genauso konnte man dies für die Typ 2 MF
beobachten (Daten nicht dargestellt). Bei der Infektion von Typ 1 MF mit Amastigoten
konnte man ähnlich zu den Promastigoten eine deutliche Umlagerung feststellen
(Abb. 14b, G und H), genauso war dies bei den Typ 2 MF möglich (Daten nicht
dargestellt).
54
3.Ergebnisse
A) MF 1
PHK
B) MF 1
LAMP 2(grün)
D) MF 1
LAMP 2,Pro
E) MF 1
ÜLB
C) MF 1
Pro(rot)
Abbildung 14a: Typ 1 und 2 Makrophagen wurden mit 7d alten metazyklischen Promastigoten bzw.
frisch isolierten Amastigoten (MOI 15, 24 h) infiziert. Die Lm. wurden mit einem
Anti-Lm. polyklonalem Kaninchen AK, LAMP 2 mit einem Anti-LAMP 2
monoklonalem Maus AK., spezifisch markiert. Als Zweitantikörper diente ein AntiMaus Alexa Fluor 488 (grün) und ein Anti-Kaninchen Alexa Fluor 568 (rot) AK.
A-E Dargestellt ist ein Typ 1 MF mit 2 intrazellulär aufgenommenen Promastigoten
(C, Pfeile). Man kann eine deutliche Umlagerung mit LAMP 2 um die Parasiten
erkennen (B, Pfeile).
MF1:Typ1 Makrophagen; ÜLB:Überlagerungsbild; PHK:Phasenkontrastaufnahme;
Pro: Promastigoten; Diese Bilder zeigen typische Aufnahmen aus 3 unabhängigen
Versuchen. Vergrößerung 2400-fach.
55
3.Ergebnisse
F) MF 2
PHK
I) MF 2
LAMP2,Ama
G) MF 2
LAMP2(grün)
H) MF 2
Ama(rot)
J) MF 2
ÜLB
Abbildung 14b: F-J Hier erkennt man einen Typ 2 MF, der mehrere Amastigoten (H, Pfeile)
intrazellulär aufgenommen hat. Auch hier sieht man eine deutliche Umlagerung von
LAMP 2 um die Parasiten (G, Pfeile).
MF2:Typ2 Makrophagen; ÜLB: Überlagerungsbild;PHK: Phasenkontrastaufnahme;
Ama: Amastigoten; Diese Bilder zeigen typische Aufnahmen aus 3 unabhängigen
Versuchen. Vergrößerung 2400-fach.
56
3.Ergebnisse
3.7 Einfluss der Infektion von Lm. auf den Autophagieprozess
Bisher zielten die Versuche darauf ab, den Aufnahme- und Verarbeitungsprozess von Lm.
nachzuvollziehen. Das besondere Augenmerk galt hierbei den Unterschieden zwischen den
Promastigoten und den Amastigoten. Trotz der deutlichen Unterschiede in Morphologie
und Stoffwechsel zwischen diesen Typen, zeigten sich bisher keine nachweisbaren
statistischen
Unterschiede
zwischen
Amastigoten
und
Promastigoten
im
Verarbeitungsprozess. Ein weiterer Prozess ist in den letzten Jahren zunehmend in den
Fokus der Wissenschaft gerückt: Die Autophagie.
Diese dient in erster Linie dazu, überschüssige Zellorganellen abzubauen, um sich den
aktuellen Stoffwechselbedingungen anzupassen.
Da die Autophagie als Abwehrmechanismus eingesetzt werden kann, um intrazelluläre
Parasiten abzutöten, interessierte der Aspekt, ob die Infektion mit Leishmania major zu
einem Anstieg der Autophagie in Makrophagen führt. Als „Autophagiemarkerprotein“
diente das LC3b Molekül, welches für die Bildung von Autophagosomen unerlässlich ist.
Dazu wurden Makrophagen Typ 1 und Typ 2 mit Promastigoten bzw. Amastigoten
infiziert. Analog zu den vorigen Versuchen wurden die Lm. entsprechend angefärbt und
die Makrophagen per Duchflusscytometrie analysiert. Es wurden wiederum nur doppelt
positive Zellen erfasst.
In der quantitativen FACS Analyse zeigte sich, dass Typ 1 MF einen höheren LC3b
positiven Anteil nach der Infektion mit Promastigoten zeigten im Vergleich zu
uninfizierten MF (Abb. 15a, D und E). Die Infektion mit Amastigoten wies einen
ähnlichen Anteil mit LC3b auf, wie die uninfizierte Kontrolle (Abb. 15a, F). Zusätzlich
wurde LC3b in ähnlich infizierten Typ 2 MF untersucht. Es zeigte sich, dass die Typ 2 MF
einen ähnlich hohen LC3b Anteil nach der Infektion mit Promastigoten aufwiesen im
Vergleich zu den Typ 1 MF (Abb. 15a, H). Dieser Unterschied war nicht signifikant (Abb.
15b). Außerdem zeigte sich ein erniedrigter LC3b Anteil nach der Infektion mit
Amastigoten bei den Typ 2 MF im Vergleich zu Typ 1 MF (Abb. 15a I). Wiederum war
dies nicht signifikant (Abb. 15b).
Der mittlere Anteil der LC3b positiven Zellen betrug bei den Typ 1 MF bei der Infektion
mit Promastigoten 6,74% ± 3,83% dagegen bei der Infektion mit Amastigoten nur 0,2% ±
1,88% gegenüber der Kontrolle. Hier zeigte sich ein statistisch signifikanter Unterschied
zwischen der Infektion mit Promastigoten und der Infektion der Amastigoten (p< 0,05)
57
3.Ergebnisse
(Abb. 15b). Bei den Typ 2 MF betrug der LC3b positive Anteil 9,74% ± 2,61% bei der
Infektion mit Promastigoten und 0,69% ± 0,77% bei der Infektion mit Amastigoten. Auch
hier konnte man einen statistisch signifikanten Unterschied zwischen der Infektion mit
Promastigoten und der Infektion mit Amastigoten feststellen (p< 0,005) (Abb. 15b). Um
sicherzustellen, dass es sich der Färbung um keine unspezifische Bindung des LC3b
Antikörpers handelte, wurden zusätzlich Isotypkontrollen durchgeführt. Diese zeigten eine
spezifische Bindung für die LC3b Antikörper auf (Abb.15a, A-C).
58
3.Ergebnisse
[%] Anteil der LC3b positiven Zellen
20,00
Promastigoteninfektion
Amastigoteninfektion
p< 0,005
p< 0,05
0,00
Typ 1 MF
Typ 2 MF
Abbildung. 15b: Dargestellt ist die Veränderung von LC3b positiven und infizierten Makrophagen
bzgl. der uninfizierten Kontrolle. Die Kontrolle ist als Nulllinie definiert.
Die Abbildung zeigt die Ergebnisse von 4 unabhängigen Versuchen. Die Balken
stellen die Mittelwerte und den SEM dar. MF 1/2: Makrophagen Typ 1/2
Den im Durchflusscytometer nachgewiesenen Unterschied konnte man auch in der
mikroskopischen Betrachtung ebenfalls bestätigen. So konnte man für die Typ 1 MF, die
mit Promastigoten infiziert waren, eine deutliche Umlagerung mit LC3b feststellen (Abb.
16a, A-C). Für die Typ 2 MF zeigte sich genau dasselbe (Abb. 16a, D-F). Bei der Infektion
mit Amastigoten zeigte sich weder bei den Typ 1 MF noch bei den Typ 2 MF eine
Beteiligung von LC3b (Abb. 16b, G-L).
60
3.Ergebnisse
A) MF 1
Pro(grün)
B) MF 1
LC3b(rot)
C) MF 1
LC3b,Pro
D) MF 2
Pro(grün)
E) MF 2
LC3b(rot)
F) MF 2
LC3b,Pro
Abbildung 16a : Typ 1 und 2 Makrophagen wurden mit 7d alten metazyklischen Promastigoten
(MOI 15, 24 h.) infiziert. Die Lm. wurden mit einem Anti-Lm. polyklonalem Maus
AK, LC3b mit einem Anti-LC3b polyklonalem Kaninchen AK., spezifisch
markiert. Als Zweitantikörper diente ein Anti-Maus Alexa Fluor 488 (grün) und ein
Anti-Kaninchen Alexa Fluor 568 (rot) AK.
A-C Dargestellt ist ein MF Typ 1, der einen Promastigoten internalisiert hat
(A, Pfeil), dieser wird von LC3b umlagert (B, Pfeil).
D-F Ebenso ist dies für einen Typ 2 MF erkennbar. Es zeigt sich ein Promastigot
(D, Pfeil) mit LC3b Umlagerung (E, Pfeil).
Pro: Promastigoten; MF 1/2: Typ 1/2 Makrophagen. Diese Bilder zeigen typische
Aufnahmen aus 4 unabhängigen Versuchen. Vergrößerung 2400-fach.
61
3.Ergebnisse
G) MF 1
Ama(grün)
H) MF 1
LC3b(rot)
I) MF 1
LC3b,Ama
J) MF 2
Ama(grün)
K) MF 2
LC3b(rot)
L) MF 2
LC3b,Ama
Abbildung 16b : G-L Im Vergleich dazu kann man eine Umlagerung mit LC3b bei der Infektion mit
Amastigoten weder bei Typ 1 (H und G) noch bei den Typ 2 MF (K und J)
feststellen.
Ama: Amastigoten; MF 1/2: Typ 1/2 Makrophagen. Diese Bilder zeigen typische
Aufnahmen aus 4 unabhängigen Versuchen. Vergrößerung 2400-fach.
62
3.Ergebnisse
3.8 Versuch der Korrelation von toten Promastigoten mit dem Protein
LC3b in MF
In den unter 3.7 dargestellten mikroskopischen Aufnahmen fiel auf, dass bei vielen
Promastigoten, die in diesen Kompartimenten lagen, eine Aufnahme mit dem Körper voran
erfolgt war und die Geißel noch aus der Zelle ragte (Abb. 16a, D). Aus früheren Versuchen
ist bekannt, dass lebende Promastigoten mit der Geißel voraus in die Zelle gezogen wird.
Es handelt sich also vermutlich um tote Lm., die den Autophagieprozess induzieren. Da die
metazyklische Promastigotenkultur etwa zur Hälfte tote Promastigoten enthält, die für die
Infektion wichtig sind, könnte dies den LC3b Anteil erklären. Die Amastigotenkulturen
dagegen wurden vor der Infektion frisch isoliert und enthielten somit kaum tote Lm. Darin
wurde die Ursache vermutet, dass man dort keinen LC3b Anstieg ausmachen konnte. Um
diese Hypothese zu untermauern, wurden Makrophagen Typ 1 und Typ 2 mit
unterschiedlichen Promastigotenkulturen, entweder 3d, 7d oder 9d alt, infiziert. Durch die
unterschiedliche Rate an toten Lm., sollte der Einfluss toter Promastigoten auf LC3b in MF
untersucht werden. Vor der Infektion wurden die toten Lm. mit Annexin V Fluos angefärbt
und mit dem Durchflusscytometer quantitativ bestimmt (Abb. 17A-C). So konnten die
Todesraten im Bezug auf den Anteil der LC3b positiven Zellen untersucht werden. In der
zusammenfassenden Auswertung ergab sich für die Typ 1 MF infiziert mit 3d alten
Promastigoten (Todesrate 3%, Abb. 17A) ein mittlerer Anteil von LC3b positiven Zellen
von 11,45% ± 4,49%, bei den 7d alten (Todesrate 56%, Abb. 17B) ein Anteil von 15,42%
± 6,97% und bei den 9d alten Promastigoten (Todesrate 64%, Abb. 17C) ein Anteil von
18,66% ± 0,03% gegenüber den uninfizierten Kontrollen (Abb. 17D-F, linke 2 Säulen).
Für die Typ 2 MF ergab dies einen Anteil von LC3b positiven Zellen von 11,03% ± 7,42%
bei den 3d alten Promastigoten, 15,21 % ± 8,04% bei den 7d alten und 23,81% ± 23,27%
bei den 9d alten Promastigoten gegenüber den uninfizierten Kontrollen (Abb. 17D-F,
rechte 2 Säulen). Allerdings konnte im Vergleich der verschieden alten Kulturen kein
statistischer Zusammenhang zwischen dem Anteil der toten Promastigoten und dem Anteil
an LC3b positiven Zellen abgeleitet werden. Ebenso wie im vorherigen Versuch konnte
man mikroskopisch auch wieder LC3b positive Kompartimente mit eingeschlossenen
Promastigoten ausmachen (Daten nicht dargestellt).
63
3.Ergebnisse
3.9 Versuch der Korrelation von toten Amastigoten mit dem Protein
LC3b in MF
Ähnlich zu den Versuchen mit Promastigoten interessierte der Aspekt, ob tote Amastigote
ebenfalls einen Anstieg von LC3b in MF auslösen können. Aus diesem Grund wurden
unterschiedlich alte Amastigotenkulturen (10d, >21d ) genutzt. Diese enthielten einen
größeren Anteil an toten Lm. Der Anteil wurde mit einer Annexin V Fluos Färbung im
Durchflusscytometer bestimmt, bevor MF Typ 1 und 2 damit infiziert wurden.
LC3b und die Amastigoten wurden wie oben schon beschrieben mit spezifischen AK
angefärbt. Die Auswertung der doppelt positiven Zellen erfolgte im Durchflusscytometer.
Als Ergebnis wurde bei den mit 10 d alten Amastigoten infizierten Typ 1 MF (Todesrate
22%, Abb. 18A) ein Anteil mit LC3b positiven Zellen von 0,75% ± 5,79% und bei der
Infektion mit mehr als 21d alten Amastigoten (Todesrate 64%, Abb. 18B) ein Anteil von
10,33% ± 4,12% gegenüber der uninfizierten Kontrolle gemessen (Abb. 18C). Bei den Typ
2 Zellen betrug der Anteil 12,93% ± 10,08% bei den 10d alten Amastigoten und 20,44% ±
5,82% bei den 21 d alten Kulturen (Abb. 18C). Es zeigte sich kein statistisch signifikanter
Unterschied bei Infektion bezüglich der unterschiedlich alten Kulturen. Allerdings fiel auf,
dass es bei der mikroskopischen Betrachtung von Typ 2 MF vereinzelt doch zu einer
Umlagerung der Amastigoten kam (Abb. 19B und 19C).
65
3.Ergebnisse
A) MF 2
PHK
B) MF 2
LC3b(rot)
D) MF 2
LC3b,Ama
E) MF 2
ÜLB
C) MF 2
Ama(grün)
Abbildung 19 : Typ 2 Makrophagen wurden mit >21d alten Amastigoten (MOI 15, 24 h.) infiziert.
Die Lm. wurden mit einem Anti-Lm. polyklonalem Maus AK, LC3b mit einem
Anti-LC3b polyklonalem Kaninchen AK., spezifisch markiert. Als Zweitantikörper
diente ein Anti-Maus Alexa Fluor 488 (grün) und ein Anti-Kaninchen Alexa Fluor
568 (rot) AK.
A-E Dargestellt ist ein Typ 2 MF, der mehrere Amastigote (C, Pfeile) internalisiert
hat und die von LC3b (B, Pfeile) umlagert sind. PHK: Phasenkontrastaufnahme;
Pro: Promastigoten; Ama: Amastigoten; ÜLB:Überlagerungsbild; MF 2: Typ 2
Makrophagen. Diese Bilder zeigen typische Aufnahmen aus 4 unabhängigen
Versuchen. Vergrößerung 2400-fach.
67
4. Diskussion
4 Diskussion
Das Ziel dieser Arbeit war es Unterschiede zwischen Promastigoten und Amastigoten
bezüglich des Aufnahme- und Verarbeitungsprozesses in Typ 1 und 2 MF aufzudecken.
Das erstes Ziel bestand darin die Lm. Formen beim Aufnahmeprozess zu untersuchen.
Hierbei zeigte sich, dass sowohl Clathrin als auch Caveolin 1 an der Aufnahme beteiligt
sind. Ein Nachweis des „Markerproteins“ EEA 1 der gemeinsamen Endstrecke des
Phagosomen bei der Aufnahme von Leishmanien gelang dagegen nicht. Für die Proteine
CD63 und LAMP 2 konnte man nachweisen, dass diese am Aufnahmeprozess von
Amastigoten und Promastigoten gleichermaßen beteiligt sind. Im Gegensatz dazu konnte
man zeigen, dass die Promastigoten in vitro zu einem höheren Anteil in Rab 7 positiven
Kompartimenten verharren, als die Amastigoten. Bei der genaueren Betrachtung der
Autophagie stellte sich heraus, dass die Promastigoten im Vergleich zu den Amastigoten
statistisch signifikant eine Induktion der Autophagie auslösen können und somit teilweise
in LC3b positiven Kompartimenten zu liegen kommen.
68
4. Diskussion
4.1 Veränderung der an der Endozytose beteiligten Proteine Caveolin
und Clathrin
In früheren Versuchen konnte für mit Lm. major infizierte MF gezeigt werden, dass eine
Hemmung der Caveolin vermittelten Endozytose durch das polyene Antibiotika Fillipin 3
die Aufnahme von Amastigoten in die Zelle hemmt. Auch eine Hemmung der Clathrin
vermittelten Endozytose durch Monodansylcadaverin (MDC) führt ebenfalls zu diesem
Effekt. Bei den Promastigoten hingegen führt eine Hemmung der Phagozytose durch
Dimethylamilorid (DMA) zu einer deutlichen Verminderung der Infektionsrate (Wenzel et
al, 2012). Dies deutet darauf hin, dass Amastigoten verstärkt über die Endozytose, die
Promastigoten eher über die Phagozytose aufgenommen werden. Daraus leitet sich ab,
dass es bei Anfärbung der endozytotischen Proteine zu einem Unterschied der Intensität
bei Infektion mit Amastigoten bzw. Promastigoten kommen müsste. Es konnte in den
Versuchen gezeigt werden, dass es bei beiden Proteinen zu einem quantitativen Anstieg
bei der Infektion sowohl mit Pro- als auch mit Amastigoten kommt, sodass es nahe liegt,
dass diese Proteine im Aufnahmeprozess beteiligt sind. Jedoch konnte kein signifikanter
quantitativer Unterschied zwischen der Infektion mit Promastigoten und Amastigoten
gefunden werden. Dies könnte mehrere Möglichkeiten haben:
1. Die Aufnahme von Amastigoten läuft sehr schnell ab, sodass nur transient ein höherer
Anteil von Caveolin bzw. Clathrin nachweisbar ist. Ich bin in unserem Versuch davon
ausgegangen, dass es zu einer kontinuierlichen Aufnahme der Parasiten kommt.
Wahrscheinlich kommt es aber am Anfang der Infektion zu einer starken Aufnahme der
Parasiten, da dann die Parasitendichte am höchsten ist. Im weiteren Verlauf sinkt die
Aufnahmerate der Parasiten und die aufgenommenen Lm. verlieren schnell ihre
umgebenden endozytotischen Proteine. Dies würde dazu führen, dass man in dem
gewählten Infektionszeitraum keinen Unterschied nachweisen kann.
2. Die rekrutierten Mengen an endozytotischen Proteinen sind so gering, dass es bei der
Detektion zu keiner merklichen Intensitätsanhebung im Vergleich zur normalen
uninfizierten Kontrolle kommt.
3. Die Promastigoten nutzen den endozytotischen Aufnahmeweg doch zu einem höheren
Anteil, als es die Vorversuche vermuten lassen. So konnte bei der Infektion mit Lm.
infantum chagasi gezeigt werden, dass die Promastigoten über einen Caveolin vermittelten
Weg aufgenommen werden und die Amastigoten dagegen nicht (Rodríguez et al, 2011).
69
4. Diskussion
Auch in den eigenen Versuchen konnte dies teilweise beobachtet werden. Hier waren die
Raten an Caveolin positiven Kompartimenten für die Promastigoteninfektion höher als die
bei Amastigoteninfektion .
4.2 Frühendosomale Proteine
Unerklärlich ist allerdings die Tatsache, dass bei dem Protein EEA-1, welches für das
frühe Endosom typisch ist, fast keine quantitativen Veränderungen bei der Infektion,
weder mit Promastigoten noch mit Amastigoten, festgestellt wurde. Eventuell ist die
Nachweismethode via Durchflusscytometrie nicht geeignet eine Umverteilung dieses
Proteins in der Zelle aufzuzeigen, da nur die Gesamtintensität pro Zelle gemessen wird.
Dagegen spricht allerdings, dass auch in der mikroskopischen Untersuchung keine
Umverteilung
bzw.
Anreicherung
dieses
Proteins
beobachtet
werden
konnte.
Normalerweise fusionieren Endosomale Vesikel bzw. Phagosomen mit dem frühen
Endosom und reichern so das Protein EEA 1 und andere an (Vieira et al, 2002). Dies stellt
also die gemeinsame Endstrecke des Aufnahmeprozesses dar. Um so verwunderlicher ist
es, dass nur eine sehr geringe Steigerung beobachten konnte, obwohl wie oben beschrieben
die Lm. mehrere Aufnahmewege nutzen. Folglich müsste es in der Summe zu einem
starken Anstieg von EEA 1 kommen. Dies wirft die Frage auf, ob die Lm. die Fusion
verhindern
bzw.
den
Reifungsprozess
sogar
beschleunigen
können.
In
den
mikroskopischen Auswertungen konnte kein Anhaltspunkt dafür gefunden werden, dass
EEA 1 überhaupt an der intrazellulären Reifung beteiligt ist. Von L. infantum chagasi ist
bekannt, dass diese schnell mit späten Endosomen fusionieren, jedoch frühe
endozytotische Marker trotzdem längere Zeit erhalten bleiben (Rodriguez et al, 2011).
Eventuell passiert diese schnelle Fusion auch bei L. major nur ohne Erhalt von EEA 1.
Hinweise auf die schnelle Fusion geben auch eigene mikroskopische Bilder bei denen
schon 2 Stunden nach Infektion eine deutliche Umlagerung des lysosomalen Proteins
LAMP 2 um die Parasiten nachweisbar sind, wobei dies bei den Amastigoten sehr viel
ausgeprägter ist, als bei den Promastigoten.
70
4. Diskussion
4.3 Späte endosomale / lysosomale Proteine
Bei den späten endosomalen Proteinen stellte sich für CD63 heraus, dass es nach der
Infektion mit Lm. in der quantitativen Auswertung zu einer geringen Steigerung des Anteil
an CD63 positiven MF gegenüber der Kontrolle kam. Allerdings war auch bei längerem
Infektionszeitraum von 24 h gegenüber 45 min. keine deutliche Steigerung von positiven
MF feststellbar. Lediglich bei der mikroskopischen Kontrolle konnte man eine
Umlagerung von CD63 um die Parasiten feststellen. Dies deutet auf eine Beteiligung
dieses Proteins bei der Aufnahme hin. Auffällig allerdings ist, dass es bei Rab7, wie unten
beschrieben, zu einer deutlichen Steigerung kommt, bei CD63 jedoch nicht. Beide Proteine
sind nämlich für die selben spätendosomalen bzw. lysosomalen Kompartimente typisch. Es
stellt sich nun die Frage, ob die Lm. Einfluss auf dieses Protein nehmen oder ob dieses
Protein auch bei normalen Aufnahmeprozessen nur schwach vertreten ist.
Bei Rab 7 konnte gezeigt werden, dass es bei Infektion zu einem statistisch signifikanten
Anstieg sowohl bei den Promastigoten als auch bei den Amastigoten gegenüber der
uninfizierten Kontrolle kommt. Zwischen Typ 1 und 2 MF findet sich dagegen quantitativ
kein Unterschied. Auch mikroskopisch konnte gezeigt werden, dass es bei beiden MF
Typen zu einer Umlagerung von sowohl Pro- als auch Amastigoten kommt. Allerdings
liegen bei beiden Typen die Promastigoten zu einem höheren Anteil in späten
endosomalen Kompartimenten, als die Amastigoten.
Wie in anderen Versuchen gezeigt werden konnte, verhindern bei L. donovani die
Promastigoten mittels Lipophosphoglycan (LPG) eine Anreicherung von Syt. V in der
Membran des endosomalen Vesikels. Dies führt dazu, dass es zu einer mangelhaften
Anreicherung von Cathepsin D und der vesikulären Protonen ATPase kommt. Dies führt
zu einer Reifungsverzögerung zum Phagolysosomen (Vinet et al, 2009). Dies ist wichtig,
so dass den Promastigoten genügend Zeit für die Umwandlung in die amastigote Form
bleibt. Amastigoten kommen sehr gut mit den Bedingungen in den lysosomalen
Kompartimenten zurecht, während dies bei Promastigoten zum Tod führt. Es könnte sein,
dass Promastigoten länger in den späten endosomalen Kompartimenten „verharren“, um
ihre Reifung zum Amastigoten zu vollenden. Diese Schlussfolgerung würde auch zu
meiner Beobachtung passen. Hier zeigte sich, dass ein größere Anteil an Lm. in Rab 7
positiven Kompartimenten liegen, als in LAMP 2 positiven bei gleich langem
Infektionszeitraum. Da Rab 7 auf späten endosomalen Kompartimenten, als auch auf
71
4. Diskussion
lysosomalen vorkommt, LAMP 2 eher lysosomal lokalisiert ist, kann man davon ausgehen,
dass der größte Teil an Rab7 positiven Kompartimenten späte Endosomen sind. Dieser
Effekt, konnte auch bei der Infektion von Lm. mit Dendritischen Zellen nachgewiesen
werden. Auch hier blockierten die lebenden Promastigoten die Weiterentwicklung in
Phagolsysosomen. Bei toten Lm. und Amastigoten tritt dieser Block hingegen nicht auf
(Körner et al, 2006). Dieser Mechanismus wird aber nicht nur von den Lm. genutzt. So
beeinflusst auch das Bakterium Burkholderia cenocepacia die Aktivierung von Rab 7,
sodass es auch hier nicht zu einer Fusion mit dem Lysosomen kommt (Huynh et al, 2010).
4.4 Autophagie
Es konnte gezeigt werden, dass Promastigoten statistisch signifikant in größerer Anzahl in
LC3b positiven Kompartimenten zu liegen kommen als frisch isolierte Amastigoten.
Ebenso weisen MF bei Infektion mit älteren (>21d) Amastigotenkulturen einen höheren
Anteil an LC3b auf als jüngere Kulturen. Die erste Vermutung, dass der Anteil der
apoptotischen und somit Phosphatidylserin (PS) positiven Lm. für diesen Effekt
verantwortlich ist, scheint sich nicht zu bestätigen, da bei Infektion mit deutlich
ansteigendem Anteil von PS positiven Promastigoten nur ein geringer Anstieg von LC3b
positiven MF erfolgt. Außerdem weisen selbst 3d alte prozyklischen Promastigote, die eine
sehr geringe apoptotische Rate von ca. 3 % aufweisen, einen ähnlich hohen Anteil an
LC3b in den MF auf, als 7 d alte metazyklische mit einem Apoptoseanteil von ca. 60 % (s.
Abb.17 A). Es stellt sich natürlich die Frage, ob die Durchflusscytometrie die richtige
Methode darstellt, um diese Unterschiede aufzuzeigen. Allerdings zeigte sich in den
anderen Versuchen in denen es makroskopisch zu einer Anreicherung eines Proteins um
einen Parasiten (z.B. Rab 7) kam, dass dies auch zu einer höheren Intensität des
angefärbten Proteins der infizierten Zellen in der Duchflusscytometrie führte. Im direkten
Vergleich der makroskopischen Darstellungen, der mit unterschiedlich alten Parasiten
infizierten MF, fiel jedoch kein Unterschied bzgl. der Verteilung des LC3b Proteins auf,
sodass dies die Daten Durchflusscytometrie zu bestätigen scheint. Dies führt natürlich zu
der Frage, was die Bildung der Autophagosomen auslöst. Induzieren die Promastigoten
selbst die Bildung, um sich einen Überlebensvorteil zu verschaffen bzw. nutzen die MF
diesen Weg, um im Zytoplasma liegende Parasiten zu eliminieren. Die 2. These wird durch
die Beobachtung gestützt, dass eine Behandlung der Leishmaniose mit Amphotericin B zu
72
4. Diskussion
einer Steigerung der Autophagie von L. donovani Parasiten in Knochenmarksmakrophagen
führt (Mitroulis et al, 2009). Dies deutet darauf hin, dass dieser Weg dazu dienen kann, L.
zu eliminieren. Insgesamt muss man aber anmerken, dass es im Bezug auf die Autophagie
von Lm. in MF wenig Daten gibt. So wären weiterführend folgende Fragestellungen
interessant:
- Was löst die Induktion der Autophagie aus?
- Warum liegen Promastigote in LC3b positiven Kompartimenten,
Amastigoten dagegen nicht?
- Können die Promastigote ähnlich wie bei der Phagozytose beschrieben eine
Weiterentwicklung zum Autophagolysosomen verhindern?
- Liegen lebende bzw. apoptotische Lm. in den Autophagosomen?
- Kann eine Entwicklung von Promastigote in Amastigote auch in Autophagosomen
stattfinden?
- Führt eine Autophagieinduktion zu einer verminderten Infektionsrate bzw. zu einer
erhöhten Eliminierung bei den Promastigoten ?
73
5. Zusammenfassung
5. Zusammenfassung
In dieser Arbeit sollte untersucht werden, ob es einen Unterschied zwischen der
promastigoten und der amastigoten Form der Spezies Leishmania major bei der Infektion
von humanen Makrophagen gibt. Beide Formen können Makrophagen infizieren. Die
promastigote Form ist für die Primärinfektion, die amastigote Form für die Verbreitung
verantwortlich. Außerdem können die Amastigoten in lysosomalen Kompartimenten
überleben, die Promastigoten müssen die Bildung dieser hemmen, um nicht abgetötet zu
werden. All diese Unterschiede deuten darauf hin, dass sich diese Formen
höchstwahrscheinlich auch im Aufnahme- und intrazellulären Verarbeitungsprozess
unterscheiden würden. Diese Unterschiede aufzudecken war somit das Ziel dieser Arbeit.
Als Nachweis diente die Durchflusscytometrie, sowie die Fluoreszenzmikroskopie. Es
wurden fluoreszierende gelabelte Antikörper genutzt, um die Leishmania major Formen,
sowie die nachzuweisenden Proteine anzufärben. Trotz der beschriebenen deutlichen
Unterschiede dieser Formen von Lm. konnte bei den meisten an der Aufnahme bzw.
Prozessierung beteiligten Proteinen (Clathrin, Caveolin-1, EEA 1, CD 63 und LAMP 2)
kein Unterschied zwischen den Promastigoten und Amastigoten nachgewiesen werden. Es
scheint, dass beide Formen im intrazellulären Verarbeitungsprozess gleich behandelt
werden. Lediglich für das spätendosomale Protein Rab 7 zeigte sich, dass Promastigoten
zu einem höheren Anteil in diesen Kompartimenten verharren, als die Amastigoten. Dies
deutet darauf hin, dass die Promastigoten diese Weiterentwicklung bremsen, um den
tödlichen Lebensbedingungen in den lysosomalen Kompartimenten zu umgehen. So hätten
sie mehr Zeit für die Umwandlung in die amastigote Form. Der genaue Mechanismus
jedoch müsste in weiteren Untersuchungen entschlüsselt werden. Eine gezielte Störung
dieses Blockes könnte des weiteren dazu führen, dass Promastigoten in die sauren
Lysosomen gelangen und dort zerstört würden.
74
5. Zusammenfassung
Des weiteren konnte gezeigt werden, dass die promastigoten Leishmania major Formen
eine Induktion der Autophagie auslösen können und somit teilweise in LC3b positiven
Kompartimenten zu liegen kommen. Für die amastigote Form konnte dies jedoch nicht
beobachtet
werden.
Die
anfängliche
Vermutung,
dass
tote
Leishmanien
via
Phosphatidylserin diesen Effekt hervorrufen können, bestätigte sich in den Versuchen
allerdings nicht. Der auslösende Faktor dieses Phänomens konnte in dieser Arbeit leider
nicht gefunden werden und bleibt Gegenstand weiterer Forschungen. Ebenso unklar bleibt,
ob die Autophagie ein Schutzmechanismus des Makrophagen darstellt oder ob dieser Weg
für den Promastigoten einen Überlebensvorteil bietet. Falls es sich bei der Autophagie in
diesem Fall um einen Abwehrmechanismus handeln würde, könnte eine gezielte Induktion
dazu beitragen Promastigote und evtl. auch Amastigote aus den Makrophagen zu
eliminieren und wäre somit ein neuer Ansatz der Therapie für infizierte Patienten.
75
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Abbildung 1: http://de.wikipedia.org/w/index.php?
title=Datei:Leishmania_lifecircle_german.png&filetimestamp=2005011006
1451; 06.11.2010, Urheber: Centers for Disease Control and Prevention
1600 Clifton Rd. Atlanta, GA 30333, USA
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7. Danksagung
7.
Danksagung
Hiermit möchte ich besonders meinem Doktorvater Prof. Dr. Ger van Zandbergen danken,
der mir jederzeit mit Rat und Tat zur Seite stand und der es immer geschafft hat, eine sehr
angenehme Arbeitsatmosphäre zu schaffen. Einen besonderen Dank geht auch an Elena
Bank, die selbst in arbeitsintensiven Zeiten immer hilfsbereit war und immer einen guten
Ratschlag auf den Lippen hatte. Auch vielen Dank dem gesamten Laborteam mit allen
Laborantinnen und Doktoranden, die meine Doktorarbeit zu einer schönen und
unvergesslichen Zeit gemacht haben. Einen besonderen Dank gilt auch noch meinen
Eltern, die mich immer unterstützt haben und ohne die mein Medizinstudium und somit
auch diese Arbeit nicht möglich gewesen wäre.
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8. Lebenslauf
Lebenslauf aus Datenschutzgründen entfernt
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8. Lebenslauf
Lebenslauf aus Datenschutzgründen entfernt
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