Respiratory Syncytial Virus - Ruhr

Aus der Abteilung für medizinische Mikrobiologie und Virologie
der Ruhr-Universität Bochum
Leitung: Prof. Dr. med. H. Werchau
____________________________________________________
Untersuchung der RSV (Respiratory Syncytial Virus) – spezifischen humoralen
Immunantwort von Mutter und Kind zum Zeitpunkt der Geburt
Inaugural-Dissertation
zur
Erlangung des Doktorgrades der Medizin
einer
Hohen Medizinischen Fakultät
der Ruhr-Universität Bochum
vorgelegt von
Guido Theodor Johannes Holbeck
aus Essen
2004
Dekan:
Prof. Dr. med. G. Muhr
Referent:
Prof. Dr. rer. nat. H.-J. Streckert
Koreferent: Prof. Dr. med. K. Überla
Tag der mündlichen Prüfung: 02. November 2004
Inhaltsverzeichnis
1
Einleitung
5
1.1
Das Respiratory Syncytial Virus
5
1.1.1
Aufbau
5
1.1.2
Genom
5
1.1.3
Untergruppen
6
1.2
Die viralen Proteine
7
1.2.1
G-Protein
9
1.2.2
F-Protein
11
1.2.3
N, P und L-Protein
13
1.2.4
M und M2 bzw. 22k-Protein
13
1.2.5
SH-Protein
14
1.2.6
NS1 und NS2-Protein
14
1.3
Infektion mit dem Respiratory Syncytial Virus
15
1.3.1
Epidemiologie
15
1.3.2
Erkrankung
15
1.3.3
Reinfektionen
16
1.4
Immunreaktion auf das Respiratory Syncytial Virus
17
1.4.1
Immunabwehr gegen RSV
17
1.4.2
Reifung der Immunantwort
17
1.4.3
Spezifische Immunantwort gegen RSV-Proteine
17
1.4.4
Immunglobuline
18
1.4.4.1
IgG-Antikörper
18
1.4.4.2
IgM-Antikörper
19
1.4.4.3
IgA-Antikörper
19
1.4.4.4
IgD- und IgE-Antikörper
20
1.4.5
Plazentaschranke
20
1.4.6
Immunologische Antwort des Feten
20
1.4.7
Passive Immunisierung
20
1.4.8
Aktive Immunisierung mit formalininaktiviertem RSV
21
1.4.9
Aktive Immunisierung mit rekombinant hergestellten Proteinen
21
1.5
Synthetische Peptide
22
1.6
Zielsetzung
23
1
2
Methoden
25
2.1
Materialien
25
2.1.1
Verwendete Zellen und Viren
25
2.1.2
Zellkulturmethoden
26
2.1.3
Virusvermehrung und –aufreinigung
26
2.1.4
Virustitration
27
2.1.5
Herstellung von RSV Lysat
28
2.1.6
Verwendete Seren
28
2.1.7
Verwendete synthetische Peptide
29
2.2
Untersuchungsmethoden
30
2.2.1
Lasernephelometrie
30
2.2.2
RSV-Mikroneutralisationstest
30
2.2.3
RSV spezifischer ELISA
30
2.2.4
Immunoblot
32
2.2.4.1
SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
32
2.2.4.2
Western-Blot
33
2.2.5
Peptid-ELISA
34
2.3
Auswertung der Ergebnisse
36
2.3.1
Lasernephelometrie
36
2.3.2
RSV-Mikroneutralisationstest
36
2.3.3
RSV spezifischer ELISA
36
2.3.4
Immunoblot
37
2.3.5
Peptid-ELISA
37
2.3.6
Testvalidierung
38
2.3.7
Interpretation der Reaktionen der einzelnen Serumpaare über alle Tests 38
2.3.8
Untersuchung der Abhängigkeit der Reaktionsstärken von den 39
Immunglobulinkonzentrationen
2.3.9
Fehlerbetrachtung
39
3
Ergebnisse
40
3.1
Vergleich der IgG- und IgM-Konzentrationen von Mutter und 40
Kind
3.1.1
IgG-Konzentrationen
40
3.1.2
IgM-Konzentrationen
43
3.2
Die neutralisierende Aktivität der Serumantikörper gegen RSV
45
2
3.2.1
Titerstufen RSV-neutralisierender Antikörper
45
3.2.2
Unterschiede in den Titerstufen RSV-neutralisierender Antikörper
46
3.3
Die Immunantwort gegen RSV
47
3.3.1
Signalstärke der einzelnen Serumpaare im RSV-ELISA
47
3.3.2
Unterschiede der Signalstärke zwischen Mutter und Kind im RSV-
50
ELISA
3.3.3
Immunreaktionen der einzelnen Serumpaare mit IgG gegen RSV im
52
Immunoblot
3.3.4
Vergleich der Immunreaktion der einzelnen Serumpaare gegen die
52
einzelnen synthetischen Peptide SP1 bis SP10
3.4
Zusammenfassung
und
Interpretation
der
unterschiedlichen 72
Reaktionen der einzelnen Serumpaare S1 bis S27
3.5
Untersuchung der Abhängigkeit der Antikörperaktivität von den 83
Immunglobulinkonzentrationen
4
Diskussion der Ergebnisse
84
4.1
Wertung der Untersuchungsmethoden
85
4.2
Vergleich der durchgeführten Untersuchungsmethoden
88
4.3
Beurteilung der Auswertungsmethoden
89
4.4
Beurteilung des „Reifegrades“ der Immunreaktion
91
4.4.1
„Reife“ Immunantwort
92
4.4.2
Unterschiedliche Ausprägung der „Reife“ der Immunantwort
93
4.4.3
„Unreife“ Immunantwort
95
4.5
Unterschiedliche
Reaktionsmuster
gegen
die
einzelnen 96
Proteinsequenzen des RSV
4.6
Zusammenfassende Beurteilung der Untersuchungen
98
4.7
Ausblick
100
5
Zusammenfassung
102
6
Anhang
I
6.1
Tabellen- und Abbildungsverzeichnis
I
6.2
Literatur
III
6.3
Meßwerte
XXVI
3
Abkürzungsverzeichnis
DMEM
Dulbecco`s Modified Eagle Medium
ELISA
Enzyme-Linked Immuno Sorbent Assay
FKS
Fetales Kälberserum
h
Stunde
HEp-2
humane Larynxkarzinom-Zellinie
HEPES
N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N`-[2-ethansulfonicacid]
sodium
HIV
Humanes Immunodeficiency Virus
IgA, IgD, IgE, IgG, IgM
Immunglobulin A, D, E, G, M
IgGesamt
Immunglobuline der Gruppen G, M und A
K
Kind
kD
Kilodalton
M
Mutter
mRNA
Messenger-RNA
MW
Molekulargewicht
NS
Nabelschnur
NT
Neutralisationstest
PBS
Phosphate buffered saline
PFU
Plaque Forming Units
Protein F
Fusionsprotein
Protein G
Glykoprotein
Protein L
Largeprotein
Protein M
Matrixprotein
Protein M2/22K
zweites Matrixprotein
Protein N
Nukleoprotein
Protein NS1/2
Nichtstrukturprotein ½
Protein P
Phosphoprotein
Protein SH
Small Hydrophobic Protein
RSV
Respiratory Syncytial Virus
RNA/DNA
Ribonucleid acid/Desoxiribonucleid acid
S1; S2; S3......S27
Serumpaar 1; 2; 3.....27
SP1; SP2; SP3.....SP10
Synthetisches Peptid 1; 2; 3.....10
4
1 Einleitung
1.1 Das Respiratory Syncytial Virus
Das Respiratory Syncytial Virus (RSV) ist der häufigste und am weitesten verbreitete
virale Erreger von Infektionen des unteren Respirationstraktes. Die Assoziation dieses
Erregers mit dem Respirationstrakt sowie der in Gewebekulturen chararakteristische
zytopathogene Effekt von Synzytien mit mehrkernigen Riesenzellen, gab dem Virus den
Namen Respiratory Syncytial Virus (RSV). Es gehört zum Genus Pneumovirus
innerhalb der Familie der Paramyxoviren [1-4]. Erstmals wurde das RS-Virus 1956 aus
einem Schimpansen und ein Jahr später aus zwei an einer Pneumonie erkrankten Kindern
isoliert [5;6].
1.1.1 Aufbau
Das RSV besteht aus pleomorphen Partikeln, die einen Durchmesser von 120 bis 300 nm
aufweisen. Im fixierten Zustand zeigt es sich als ein stabiles, stäbchenförmiges Gebilde mit
einem konstanten Durchmesser von 95 ± 5 nm. Die pleomorphen Formen zeigen sich im
nicht
fixierten
Zustand
und
stellen
eher
zerstörte
Viruspartikel
oder
Zellmembranfragmente dar, die in enger Verbindung zum Viruspartikel stehen [7]. Das
RSV vermehrt sich im Zytoplasma der Wirtszelle ohne Abhängigkeit von der zellulären
DNA-Synthese [8]. Nach der Reifung erhält es beim Austritt aus der Zelle durch
Ausknospung eine Hülle aus der Zytoplasmamembran. Diese doppelschichtige, lipidreiche
Hülle umgibt das Nukleokapsid des RSV [1;9;10].
1.1.2 Genom
Das Genom des RSV ist ein einsträngiges unsegmentiertes RNA-Molekül mit einem
Molekulargewicht von 5
*
106 Dalton [1;11;12]. Zur Replikation des RSV ist eine
zelleigene Substanz notwendig, die als Ribonukleoprotein (RNP) bezeichnet wird.
Aufgereinigtes RSV-Genom läßt sich nicht transkribieren. Erst unter Hinzugabe von
Zytoplasma nicht infizierter HEp-2 Zellen findet wieder eine Replikation statt [13].
Außerdem ist die Anwesenheit von Ribonukleotiden (ATP,GTP), ein- und zweiwertigen
Kationen (K+,Mg2+,Ca2+) und Dithiothreitol (DTT) [13;14] notwendig. Die GenReihenfolge des RSV stellt sich wie folgt dar: 3’ (Starter) - NS1/1C - NS2/1B - N - P - M SH/1A - G - F - 22K/M2 - L - (Stop) 5’ [13;15;16]. Das RNA-Molekül mit negativer
Polarität kann nicht direkt als mRNA fungieren. Es muß erst in eine plus-Strang-RNA
5
überschrieben werden. Dies geschieht anhand einer viralen RNA-assoziierten RNAPolymerase [8;12]. Die mRNA wird am rauhen Endoplasmatischen-Retikulum zu
Proteinen überschrieben und durch den Golgi-Apparat zur Zelloberfläche transportiert
[12]. Während des Transportes werden Proteine glycosiliert [12;27]. Während aller
translationaler Verarbeitungsschritte können neue antigene Varianten gebildet werden, was
die Variationsbreite der antigenen Eigenschaften beim RSV erklärt [12]. Die virale RNA
ist von einem helikal angeordneten Nukleokapsid umgeben, welches einen Durchmesser
von 12 – 15 nm aufweist [1].
1.1.3 Untergruppen
Das RSV läßt sich durch tierische Hyperimmunseren im Neutralisationstest in zwei
Subgruppen einteilen: Gruppe A oder 1 (Prototyp Long, A2, 137 und G-2 [18;19;20]) und
Gruppe B (Prototyp 18537, 9320 und 43 [21]). Infektionen mit RSV der Gruppe A
verlaufen meist schwerer als solche mit RSV der Gruppe B [22;21;23]. Die Subgruppen
treten an unterschiedlichen Orten zu unterschiedlichen Zeiten in unterschiedlichen
Häufigkeiten auf [21;24]. Der antigene Unterschied zwischen den Subgruppen liegt
hauptsächlich auf der Ebene des Glykoproteins und in geringerem Maße auf der Ebene des
F-, des P- und des N-Proteins [1;18;21;24-34]. Impfungen bei Mäusen mit rekombinantem
Vakzinia Virus, die das G-Protein exprimieren, schützen vor RSV-A, solche die das FProtein exprimieren, vor RSV-A und -B [29;35;36]. Die Untergruppen können in weitere
Untergruppen unterteilt werden [18-21;28]. Die neutralisierende Aktivität gegen die
gleiche Untergruppe ist größer als gegen die jeweils andere Gruppe [32].
6
1.2 Die viralen Proteine
Eine Elektronenmikroskopische Aufnahme vom RSV mit der Lokalisation der Proteine
zeigt Abbildung 1. Es werden mindestens zehn virale mRNA synthetisiert, die für zehn
Proteine kodieren [1;11;15-17;37-39], deren Molekulargewichte genau geschätzt werden
können
[37;40-42].
Im
folgenden
Text
sind
die
Molekulargewichte
der
Aminosäuresequenzen angegeben, die durch die Nucleotidsequenzen der geklonten viralen
mRNA determiniert werden.
Im Elektronenmikroskop werden auf der Hülle des Virus membrangebundene Spikes
sichtbar, die den beiden glykolysierten Proteinen G und F entsprechen. Ein Teil der auf der
Oberfläche eines Virions exprimierten G- und F-Proteine ist durch Disulfid-Brücken
miteinander assoziiert [1;60]. Beide Oberflächenproteine sind Angriffsorte für die
humorale Immunabwehr und enthalten neutralisierbare Epitope [12]. Monoklonale
Antikörper gegen einen Bereich nahe dem Fusions-Aktivitäts-Bereich bewirken eine
Hemmung der Fusionsaktivität [12]. Das G-Protein, das F1 und das F2 Protein finden sich
in RSV-infizierten HEp-2 Zellen, aber nur das G-Protein ist auch im Zellkulturüberstand
bei noch intakten Zellen zu finden [47].
7
Das RSV:
Membrangebundene Spikes, die
den Proteinen G und F
entsprechen
Doppelschichtige, lipidreiche Hülle,
die das RSV durch Ausknospung
erhält
Innere Hülle, wo die
Matrixproteine M und M2/22K
lokalisiert sind
Nukleokapsid, welches aus der
RNA, den Proteinen N, P und L
gebildet wird
In RSV-infizierten Zellen: Die
Nichtstrukturproteine NS1/1C und
NS2/1B
Auf infizierten Zellen:
Oberflächlich lokalisiert das SHProtein
Abbildung 1: Elektronenmikroskopische Aufnahme des Respiratory Syncytial Virus (RSV) mit Lokalisation
der Proteine; Vergrößerung 1:110000; Aus der Arbeitsgruppe H.-J. Streckert; H. Werchau, Medizinische
Mikrobiologie und Virologie und S. Philippou, Institut für Pathologie der Ruhr-Universität Bochum
8
1.2.1 G-Protein
Eine Schematische Zeichnung der Primärstruktur des G-Proteins mit der Positon der
synthetischen Peptide zeigt Abbildung 2. Das Glykoprotein (G) ist für die Anheftung des
Virus an die Wirtszelle verantwortlich [1;43;44], es wird als ein Polypeptid mit einem
Molekulargewicht von 32,6 kD synthetisiert und besteht aus 298 Aminosäuren [42;45].
Der Rest des glykosylierten Proteins mit einem Molekulargewicht von 84 bis 90 kD
besteht aus überwiegend O-glykosidisch und einigen N-glykosidisch verknüpften
Kohlenhydrat-Seitenketten [1;7;12;15;27;45]. Das C-terminale Ende des G-Proteins ist
nach extrazellulär, das N-terminale nach intrazellulär gerichtet [27;42]. Hypervariable
Regionen befinden sich zwischen der Position 101 und 133 und zwischen der Position 147
und 207 [50].
Die große hydrophobe Region der Position 41 bis 63 bildet den Membrananker [42;46].
Diese Stelle befindet sich nahe dem N-terminalen Ende des Proteins [27]. Die 71 Nterminalen Aminosäuren des G-Proteins enthalten alle strukturellen Informationen, die zur
Einlagerung in die Membran und zur Präsentation auf der Oberfläche der infizierten Zelle
notwendig sind [27].
In vitro-Studien haben gezeigt, daß etwa 20 % des G-Proteins in löslicher Form vorliegen
[47].
Beim verwendeten
Long
Strain
RSV
ist
das
lösliche
Gs-Protein
des
Zellkulturüberstandes mit 82 kD etwas kleiner als das Gv-Protein im Inneren der Zelle mit
88 kD [47;49]. Ob das lösliche extrazelluläre Gs-Protein eine Rolle bei der Immunabwehr,
z.B.
durch
Absättigung
der
Bindungsstellen
der
Antikörper,
Absorbierung
neutralisierender Antikörper oder durch Immunmodulation spielt, ist unklar [48].
In Impfversuchen mit Ratten mit rekombinant hergestellten Abschnitten des G-Proteins
zeigt sich, daß die Aminosäuresequenz bis 230 ebensogut G-Protein-bindende Antikörper,
RSV-neutralisierende Antikörper und eine schützende Immunität induzieren, wie es das
komplette G-Protein vermag [27].
9
1.2.2 F-Protein
Eine Schematische Zeichnung der Primärstruktur des F-Proteins mit der Positon der
synthetischen Peptide zeigt Abbildung 3. Das Fusionsprotein (F) ist für die Penetration
des Virus und für seine Ausbreitung von Zelle zu Zelle durch Membranverschmelzung
verantwortlich, was auch die Ausbildung der Synzytien bedingt [1;3;12;51;52]. Das FProtein stellt das wichtigste Antigen für die Induktion einer Immunität dar [12;53;54]. Das
F-Protein wird als Vorläufer-Protein (F0) mit einem Molekulargewicht von 63,4 kD
synthetisiert [7;15;37;40;41;55;56]. Es ist ein Polypeptid und besteht aus 574 Aminosäuren
[41;55]. Ein Anteil von 11 kD besteht aus Kohlenhydrat-Seitenketten [40].
Das F-Protein wird als inaktive Form F0 hergestellt und posttranslational im
Endoplasmatischen Retikulum zwischen der Position 136/137 in zwei durch DisulfidBrücken verbundene Untereinheiten F1 und F2 gespalten (MW von F1: 48 kD, von F2: 12,4
kD) [7;12;14;37;40;41;53;57;58]. Durch den Golgiapparat gelangen diese dann auf die
Zelloberfläche [58]. Ohne die vorherige Spaltung von F0 in F1 und F2 sind die
Viruspartikel nicht infektiös [12;40]. Ist die dafür notwendige Protease in einer Zelle nicht
vorhanden, ist das Virus in dieser nicht infektiös [12].
Das F1-Protein ist wenig glycosiliert, aber in der mittleren Region cysteinreich [59]. Es ist
hochkonservativ und relativ hydrophob und erstreckt sich von Position 137 bis 574
[40;59;41]. Das F2-Protein dagegen ist glykosiliert und relativ hydrophil [12]. Es enthält
vier potentielle Kohlenhydrat-Akzeptorstellen und erstreckt sich von Position 1 bis 136
[40;41;59]. Die Glycosilierung scheint für die biologische Aktivität der Glycoproteine
notwendig zu sein [57].
Das F-Protein ist mit dem C-Terminalen Ende in der Virushülle verankert [41;53]. Der
transmembranöse Anker wird von der hydrophoben Region von Position 525 bis 550
gebildet [40;55]. Die Regionen 1 bis 22, 137 bis 154 und 262 bis 268 werden für die
Zellfusion durch direkte Interaktion mit der Zielzellmembran verantwortlich gemacht
[12;40;41;53;55;59]. Diese Fusionseigenschaft kann durch ein Tripeptid (Phe-Phe-Arg)
gehemmt werden [12]. Synthetische Peptide, die diese Region verstecken, können eine
Zellfusion verhindern [40]. Die letzten 24 Aminosäuren des C-terminalen Endes sind
relativ hydrophil und zum Zytoplasma, der Rest des Proteins zum Äußeren der Zelle
gerichtet [40].
11
1.2.3 N, P und L-Protein
Das Nukleokapsid des RSV wird gebildet aus der genomischen RNA, dem Nukleoprotein
(N) (43,5 kD), dem Phosphoprotein (P) (27,1 kD)und dem Largeprotein (L) (250 kD)
[7;12;15;37;56;61;63]. Ihnen wird eine Funktion bei der Transkription der RNA
zugeschrieben [1;64;65]. Das N-Protein ist eng mit der RNA verbunden und hat in erster
Linie eine strukturelle Funktion. Es ist ein Polypeptid, bestehend aus 391 Aminosäuren
[1;61;62;56]. Das P- und das L-Protein sind locker mit dem Nukleokapsid verbunden. Das
P-Protein ist ein Polypeptid aus 241 Aminosäuren und kann nur in Lysaten von infizierten
Zellen nachgewiesen werden [7;56;63]. Eine Immunisierung mit dem P-Protein führt zu
keinem nachweisbaren Schutz vor RSV, mit dem N-Protein führt sie lediglich zu einer
Abschwächung der Infektion [66;67].
1.2.4 M und M2 bzw. 22k-Protein
An der Innenseite der Virushülle aus einer doppelschichtigen Lipidmembran sind die
Matrixproteine (M und M2/22k) lokalisiert. Das M-Protein hat ein Molekulargewicht
von 28,7 kD [68] und besteht aus 256 Aminosäuren [12;68]. Vermutlich spielt es im
Zusammenhang mit dem Nukleokapsid und den Oberflächenproteinen beim Aufbau des
Virus eine Rolle [12;56]. Das M-Protein ist relativ basisch und besitzt zwei hydrophobe
Regionen im C-terminalen Drittel, mit dem es möglicherweise mit der Membran der
infizierten Zelle in Interaktion treten kann [68]. Weitgehend ungeklärt ist die Lokalisation
und Funktion des zweiten Matrixproteins (M2 oder 22k-Protein, MW: 22,2 kD ).
Intrazellulär bindet es vermutlich an die gleichen Strukturen wie das N- und das P-Protein.
Zu einem späten Zeitpunkt des Infektionszyklus wird ein geringer Teil des M2-Proteins
auf der Oberfläche der infizierten Zelle nachgewiesen [1;69]. Im Virion liegt das M2Protein oberflächenassoziiert vor [1;37]. Eine Immunisierung mit dem M-Protein führt zu
keinem nachweisbaren Schutz vor RSV, die mit dem M2-Protein führt lediglich zu einer
Abschwächung der Infektion [66]. Das M- und das 22K-Protein stellen eine gutes Ziel für
die zytotoxischen Lymphozyten dar [67;156-158].
13
1.2.5 SH-Protein
Auf der Oberfläche infizierter Zellen ist ein weiteres virales Protein lokalisiert, das Small
Hydrophobic Protein (SH/1A). Es wird in die Zellmembran eingebaut [70;71]. Es ist
bisher nicht eindeutig geklärt, ob das SH-Protein ein Strukturprotein darstellt [1;15;71;72].
Es ist spezifisch bei RSV-infizierten Zellen nachweisbar [15]. Eine Immunisierung mit
dem SH-Protein führt zu keinem nachweisbaren Schutz vor RSV [66].
1.2.6 NS1 und NS2-Protein
In RSV-infizierten Zellen, aber nicht im gereinigten Virion, lassen sich zwei virale
Nichtstrukturproteine (NS1/1C und NS2/1B) nachweisen (MW von NS1: 15,6 kD, von
NS2: 14,7 kD) [181]. Die Funktion beider Proteine ist bisher ungeklärt. Eine
Immunisierung mit dem NS1- und NS2-Protein führt zu keinem nachweisbaren Schutz vor
RSV [66].
14
1.3 Infektion mit dem Respiratory Syncytial Virus
1.3.1 Epidemiologie
Das Respiratory Syncytial Virus (RSV) ist eine wichtige Ursache für Infektionen des
unteren Respirationstraktes bei Säuglingen und Kleinkindern [1;22;57]. Eine Infektion mit
RSV wird vor allem in der kalten Jahreszeit beobachtet [1;22;57]. Das RSV ist
hochkontagiös. Es wird hauptsächlich durch direkten Kontakt mit Infizierten oder deren
Sekrete übertragen [94]. Die Inkubationszeit beträgt vier bis sechs Tage, die
Virusausscheidung beginnt 24 bis 48 Stunden vor dem Auftreten der ersten Symptome und
persistiert über ein bis sechs Wochen [95;96;143]. Die Durchseuchung mit dem RSV
erfolgt sehr früh. Es finden sich Infektionsraten von 61 % bei Kindern unter drei
Lebenswochen und 87 % bei Kindern unter einem Lebensjahr [22;97-100]. Ein hoher
Anteil der stationären Krankenhausaufenthalte von Säuglingen ist auf Infektionen mit dem
RSV zurückführen [22;57]. Die Letalität bei einer RSV-Infektion, die bei vorher völlig
gesunden Kindern bei unter 1 % liegt, steigt bei Hochrisikopatienten auf etwa 30 bis 70 %
an [57;100-102]. Hochrisikopatienten sind Kinder mit atopischer Diathese, pulmonalen
oder kardialen Erkrankungen, angeborenen oder therapiebedingten Immundefiziten,
geringerem Alter als sechs Monaten sowie Frühgeborene [12;22;99;103-107].
1.3.2 Erkrankung
In den ersten vier bis sechs Lebenswochen besteht ein relativer Nestschutz gegen RSVErkrankungen. Trotz des Vorhandenseins mütterlicher Antikörper ist eine Erstinfektion der
Kinder mit RSV bereits in den ersten Lebenswochen möglich. Neugeborene jünger als drei
Wochen zeigen gegenüber älteren Säuglingen und Kleinkindern eine geringere Beteiligung
der tiefen Atemwege und eine geringere Konzentration an RSV [98]. Klinisch schwere,
insbesondere pneumonische Verlaufsformen, werden in diesem Alter kaum gesehen
[22;98;103;108]. Die Lungen der Neugeborenen zeigen bei einer Infektion mit RSV wenig
Entzündungszeichen [98]. Die passiv übertragenen mütterlichen Antikörper schützen
offensichtlich nicht vor der Infektion, beeinflussen aber den Verlauf der Erkrankung
günstig [99;108]. Die schwere der Erkrankung ist umgekehrt proportional zu der Höhe der
RSV-spezifischen Antikörpertiter und zum Neutralisationstiter [98;99;109-111]. Die
Infekthäufigkeit des Kindes wird durch die Antikörperboosterung bei der Mutter mit
Antikörperanstieg durch eine RSV-Infektion während der Schwangerschaft beeinflußt
[108]. Fünf bis sieben Tage nach Reinfektion lassen sich hohe RSV-spezifische
Antikörpertiter der Klassen IgG, IgM und IgA nachweisen [112;127-138]. In-vitro-Studien
haben gezeigt, daß RSV-infizierte Zellen den alternativen und den klassischen Weg der
15
Komplementkaskade aktivieren [12;48]. Im Alter zwischen sechs Wochen und sechs
Monaten verlaufen die meisten RSV-Infektionen symptomatisch, in 24 bis 40 % der Fälle
im Sinne einer Infektion der unteren Atemwege wie einer Bronchiolitis oder Pneumonie
[22;82;103;108;113-116]. Etwa 80 bis 90 % der obstruktiven Atemwegserkrankungen im
Alter von unter sechs Monaten werden durch RSV verursacht [100]. Beim Erwachsenen
äußert sich die RSV-Infektion meist in Form einer leichten Erkrankung des oberen
Respirationstraktes mit allgemeinen Symptomen wie Schnupfen, Mittelohrentzündung
oder Bindehautentzündung [22]. Schwere Erkrankungen kommen erst wieder bei älteren
Menschen vor [117-119]. Histologisch finden sich peribronchioläre und perivaskuläre
lymphozytäre Infiltrate in Lungen von Kindern mit schweren RSV-Infektionen
[1;57;125;126]. Eine persistierende Infektion von RSV kommt vor [12;143]. Die
symptomatische Therapie steht im Vordergrund [100-102;139-145]. Ein Zusammenhang
zwischen RSV induzierten Erkrankungen der unteren Atemwege im Säuglingsalter und
einem hyperreagiblem Atemsystem, Atemwegesobstruktionen und Beeinträchtigungen der
Lungenfunktion im Kindesalter, wird diskutiert [22;100;146-155].
1.3.3 Reinfektionen
Die Immunabwehr gegen RSV ist in vielen Arbeiten untersucht worden, dennoch sind die
häufigen Reinfektionen nicht hinreichend geklärt [1;22;57;120-123]. Die durch eine
natürliche RSV-Infektion induzierte Immunabwehr ist unvollständig. Nach einer
Erstinfektion mit dem RSV fallen die RSV-spezifischen Antikörpertiter innerhalb eines
Jahres
unter
die
Nachweisgrenze.
Nach
einer
Zweitinfektion
werden
höhere
Antikörpertiter gebildet, welche auch länger nachweisbar sind. Reinfektionen mit RSV
sind bei älteren Kindern und Erwachsenen relativ häufig zu beobachten, führen aber im
allgemeinen zu einem milderen Verlauf in Schwere und Dauer der Erkrankung
[22;57;112;122-124]. Es konnte gezeigt werden, daß gesunde junge Erwachsene innerhalb
von 26 Monaten zu 73 % eine zweite und zu 47 % eine dritte Infektion mit RSV
durchmachen [122]. Die Erkrankungen verlaufen häufig atypisch, so daß sie meist nicht als
eine solche erkannt werden [98].
16
1.4 Immunreaktion auf das Respiratory Syncytial Virus
1.4.1 Immunabwehr gegen RSV
Immunglobuline gegen RSV bewirken einen relativen Schutz vor RSV und eine effektive
Reduktion des Virustiters [48;12]. Schwangere zeigen zu 100 % neutralisierende IgGAntikörper gegen RSV. Beim Neugeborenen erfolgt ein Abfall der neutralisierenden IgGAntikörper bis zur vierten Lebenswoche. Bis zum ersten Lebensjahr lassen sich bei 50 bis
60 Prozent der Kinder erneut RSV-IgG-Antikörper nachweisen, später auch IgMAntikörper. Diese sind überwiegend gegen das G- und das F-Protein gerichtet [12]. Die
Korrelation zwischen der neutralisierenden Aktivität und der Höhe der RSV-spezifischen
IgG-Antikörpertiter ist sehr gut [12;124;159;160]. Im Gegensatz dazu findet sich keine
Korrelation der RSV-spezifischen IgA-Antikörper zur neutralisierenden Aktivität [160].
Neutralisierende mütterliche Antikörper schützen nicht vor einer Infektion durch RSV,
nehmen jedoch Einfluß auf die Schwere der Infektion durch RSV, die umgekehrt
proportional zu den neutralisierenden Antikörpertitern gegen RSV ist [124;159;244]. Bei
bis zum 6. Lebensmonat mit RSV infizierten Kinder sind die neutralisierenden
Antikörpertiter gegen RSV im Nabelschnurblut signifikant niedriger als bei nicht
infizierten [124]. Gestillte Kinder haben ein geringeres Risiko an RSV zu erkranken
[22;161]. Dieser Schutz wird durch übertragene sekretorische RSV-spezifische IgA und
IgG sowie durch gegen RSV sensibilisierte Lymphozyten geleistet [22;57;107;161-163].
Zytotoxische Zellen spielen eine wichtige Rolle bei der Beseitigung des RSV [164], sie
schädigen aber auch das Lungengewebe [66;82;165;166].
1.4.2 Reifung der Immunantwort
Mit zunehmendem Alter des Kindes und zunehmender Anzahl der Reinfektionen findet
eine Reifung der Immunantwort statt [121;167-169]. Erst werden Antikörper gegen einfach
gebaute determinante Gruppen, sogenannte sequentielle Epitope, gebildet, welche noch
nicht neutralisieren. Bis zum sechsten Lebensjahr erfolgt dann ein Reifungsprozeß, wobei
zunehmend komplexe, neutralisierende Antikörper gebildet werden [82;144]. Die
Immunantwort ist ab dem sechsten Lebensjahr zunehmend an das RSV angepaßt und
schützt eher vor RSV-Infektionen [82;100].
1.4.3 Spezifische Immunantwort gegen RSV-Proteine
Die Immunantwort des Kindes ist überwiegend gegen die Proteine F, N, P und M gerichtet
[121]. Bei Erwachsenen und Kindern korrelieren höhere Neutralisationstiter gegen das Fund das G-Protein mit einem besseren Schutz vor Neuinfektionen [12;109;122].
17
Monoklonale Antikörper gegen das F-Protein bewirken eine Neutralisation des Virus bzw.
eine Verhinderung der Synzytienbildung bei bereits infizierten Zellen [43;170].
Monoklonale Antikörper gegen das G-Protein erreichen dieses nicht, sie bewirken eine
Neutralisierung des RSV nur im Beisein von Komplement [43;171;170].
1.4.4 Immunglobuline
1.4.4.1 IgG-Antikörper
IgG-Antikörper sind plazentagängig [172;173]. Das IgG-Immunglobulin stellt bei zum
Termin geborenen Kindern den größte Anteil an passiv von der Mutter erhaltenen
Antikörpern dar. Im letzten Trimenon geschieht die Übertragung größtenteils über einen
aktiven
transplazentaren
Transport
[97;172;193;195-201].
Der
Transfer
der
Immunglobuline ist abhängig von der IgG-Subklasse und vom Gestationsalter des Kindes
[97;174-179;194]. Bis zur Geburt nimmt die Konzentration der Immunglobuline und damit
die Effektivität des Transportes kontinuierlich zu. Zu früh geborene Kinder weisen eine
geringere IgG-Konzentration auf als zum Termin geborene und haben ein höheres Risiko
als diese, eine Infektion durch RSV zu erleiden [97;172]. Der transplazentare Transport
von IgG zum Feten beginnt am 38. Tag [172;173]. Bis zur 17. Woche ist der IgG-Level in
etwa konstant und steigt dann proportional mit dem Gestationsalter an [172;173]. Zur
Geburt liegen die Nabelschnurkonzentrationen der IgG-Antikörper und der IgGSubklassen etwa fünf bis zehn (bis zu 50) Prozent über denen der korrespondierenden
mütterlichen [97;172;173;175;180;181]. Eine eigene IgG-Produktion des Kindes ist ab der
12. Schwangerschaftswoche nachzuweisen [97;182;173;183]. Nach der Entbindung
werden die mütterlichen IgG-Antikörper mit einer Halbwertszeit von 30 Tagen
katabolisiert [177]. Das Kind bildet dann eigene Antikörper, aber erst mit dem 16.
Lebensjahr wird die Konzentration des Erwachsenen erreicht [177]. Die IgGKonzentrationen des Neugeborenen liegen zwischen 636 und 1750 mg/dl [177;184], die
der Erwachsenen zwischen 1000 und 1500 mg/dl [177]. Die Immunabwehr gegen das RSV
ist auch abhängig von den Immunglobulin-Subklassen [36;57;82;98;185-187]. Der Schutz
der tiefen Atemwege vor RSV wird vor allem durch IgG bewerkstelligt. Diese Annahme
wird bestärkt durch die Tatsache, daß Serumantikörper die Lungen vor einer RSVInfektion schützen können, diese auf der Nasenschleimhaut jedoch nur einen geringen
Effekt zeigen [57;110;159]. Vermutlich können in diesem Abschnitt der Lungen die
mütterlichen Antikörper besonders wirksam werden, da hier ein enger Kontakt zwischen
Blutgefäßen und Schleimhautoberfläche besteht [22;120]. Dies läßt auf einen gewissen
Nestschutz durch mütterliche Antikörper des Isotyps IgG schließen. RSV-spezifische IgG18
Antikörpertiter sind bei Erstinfektionen etwa zehn Tage nach Krankheitsbeginn
nachweisbar. Der Gipfel ist nach etwa drei bis vier Wochen überschritten [112;188]. Nach
etwa einem Jahr sind keine, bzw. nur sehr niedrige Antikörpertiter nachweisbar [112].
1.4.4.2 IgM-Antikörper
IgM-Antikörper sind nicht plazentagängig [173]. Ab der 10. Schwangerschaftswoche kann
eine eigene IgM-Antikörperproduktion nachgewiesen werden [97;173;177;180;182;189].
Die IgM-Produktion stellt eine Antwort auf eine intrauterine immunologische Stimulation
dar [97;181;190;191]. Die Konzentration des IgM beim Erwachsenen liegt zwischen 100 125 mg/dl [177]. Das beim Neugeborenen nachweisbare IgM, welches etwa zehn Prozent
des mütterlichen beträgt, wird vom diesem selbst gebildet. Werte über 20 mg/dl im
Nabelschnurblut sind ein Kriterium, welches auf eine intrauterine Infektion hinweist [177].
Die Normwerte beim Neugeborenen liegen zwischen 6 und 25 mg/dl [177;184]. Bei
Erstinfektion finden sich einige Tage nach Krankheitsbeginn ansteigende Antikörpertiter,
die zwei bis zehn Wochen persistieren [112;188].
1.4.4.3 IgA-Antikörper
IgA-Antikörper passieren die Plazenta nicht [97;190]. Ab der 30. Schwangerschaftswoche
können winzige Mengen IgA-Antikörper nachgewiesen werden [173;177]. Diese steigen
einige Tage post partum an [173]. Die Konzentration beim Erwachsenen beträgt 200 bis
250 mg/dl. Neugeborene werden über die Muttermilch mit IgA versorgt, was für die
Beseitigung von Mikroorganismen auf der Schleimhaut sorgt [177]. Die Konzentration
beim Neugeborenen liegt zwischen 1 bis 6 mg/dl [177] bzw. 1,4 bis 3,6 mg/dl [184]. Der
Schutz der hohen Atemwege vor RSV wird durch IgA vermittelt [57]. RSV-spezifische
IgA-Antikörpertiter sind bei Erstinfektion etwa 10 Tage nach Krankheitsbeginn
nachweisbar. Der Gipfel ist nach etwa drei bis vier Wochen überschritten. Nach etwa
einem Jahr sind keine Antikörpertiter mehr nachweisbar [112]. Die Höhe des RSVspezifischen IgA-Antikörpertiters stellt einen sehr sensiblen Indikator einer frischen RSVInfektion in Anwesenheit von mütterlichen IgG-Antikörpern dar [97;167;191], ist aber erst
sieben bis acht Tage nach Beginn der Symptome nachweisbar, mit einem Maximum nach
elf bis zwölf Tagen [160].
19
1.4.4.4 IgD- und IgE-Antikörper
IgD- und IgE-Antikörper sind nicht plazentagängig, sie sind nur in winzigen Mengen beim
Feten nachzuweisen [190;173]. IgD und IgE sind an der fetalen Immunantwort nicht
signifikant beteiligt [97;192].
1.4.5 Plazentaschranke
An den Plazentazotten werden anti-HLA-DR Antikörper abgefangen, so daß sie während
der Schwangerschaft nicht im fetalen Blut nachzuweisen sind [97;179;202;203]. Diese
Tatsache stellt einen Schutz vor Antikörpern gegen fetales Gewebe dar. Es kann gezeigt
werden, daß die Mutter und das Neugeborene die Sensitivität auf unterschiedliche
Antigene teilen, was bedeutet, daß unterschiedliche Antigene von beiden erkannt werden
[97;204;205]. Dafür ist es notwendig, daß Antigene oder andere immunologische
Mediatoren die Plazenta durchqueren, die eine anschließende fetale Immunität induzieren
[204;206]. Aus diesen Fällen läßt sich ableiten, daß die Plazenta die immunologische
Auseinandersetzung des Feten selektiv begrenzt. Die Auswirkung in Bezug auf das RSV
ist bisher unklar. Ob eine präpartale Immunantwort gegen das RSV besteht, ist bisher nicht
untersucht.
1.4.6 Immunologische Antwort des Feten
In der 7. Schwangerschaftswoche kann eine erste Immunreaktion des Embryos festgestellt
werden, durch welche die mütterlichen Zellen, welche die Plazentaschranke überschritten
haben, zerstört werden [97;213]. Ab der 10. Schwangerschaftswoche kann eine
Sensibilisierung von immunkompeten Zellen beim Embryo nachgewiesen werden
[97;173;204;207-209;214]. Ganze Zellen können die plazentare Barriere durchwandern
[97;210-212]. Der Fet könnte dadurch seine passive Immunität erlangen [97;204].
1.4.7 Passive Immunisierung
Die passive Immunisierung mit hochtitrigen neutralisierenden Immunglobulinpräparaten
zeigt, daß die humorale Immunantwort zwar einen Schutz vor Erkrankung, nicht jedoch
vor Infektion bewirken kann. Die Präparate können die Viruslast bei Kindern signifikant
reduzieren und den Krankheitsverlauf abschwächen [22;57;108;110;124;215-218]. Der
Schutz vor Erkrankung korreliert mit dem Titer neutralisierender Antikörper gegen die
Oberflächenproteine F und G [22;122]. Bei Ratten bewirken Antikörper gegen das GProtein eine Neutralisation des RSV, Antikörper gegen das F-Protein eine Neutralisierung
und eine Fusionshemmung des RSV [170;219]. Andere Autoren bestreiten eine
20
Korrelation zwischen der Höhe der Neutralisationstiter und dem Schutz vor Infektion [53].
Eine nachweisbare Korrelation besteht zwischen der Fähigkeit, die Synzytienbildung zu
hemmen, und dem Schutz vor RSV-Infektion [51;53;54].
1.4.8 Aktive Immunisierung mit formalininaktiviertem RSV
In den sechziger Jahren wurde eine Impfung mit durch Formaldehyd inaktiviertem RSV
durchgeführt. In vielen Fällen kam es bei den geimpften Kindern nach Wildvirusexposition
sogar zu einem schwereren Verlauf der Erkrankung als bei den nicht geimpften Kindern
[12;22;57;66;156;220-226]. Es wird bei der Immunisierung mit formalininaktiviertem
RSV ein ähnliches Verhalten wie bei der Impfung mit formalininaktiviertem Masernvirus
angenommen [53;120;156;224].
1.4.9 Aktive Immunisierung mit rekombinant hergestellten Proteinen
In Experimenten kann durch die Immunisierung mit nativem RSV und rekombinant
hergestellten G- oder F-Protein ein kompletter pulmonaler Schutz gegenüber einer RSVInfektion mit Reduzierung der Viruslast aufgebaut werden, bei Mäusen werden
neutralisierende
Antikörper
gebildet
[12;35;66;67;156;218;222;227-231].
Die
Immunisierung mit dem M-Protein führt zu keinem nachweisbaren Schutz vor RSV, mit
dem N-Protein führt sie zu einer Abschwächung der RSV-Erkrankung, nach anderen
Autoren zu einer deutlichen Reduktion [66;232]. Die Nukleokapsidgene des RSV bilden
ein signifikantes Ziel für die zellvermittelte Immunantwort [36].
21
1.5 Synthetische Peptide
Synthetische Peptide stellen lineare Epitope von RSV-Proteinen dar. Antikörper der Seren
von Kindern erkennen diese synthetischen Peptide häufiger als die der Erwachsenen [82].
Sehr kleine Moleküle können antigene Eigenschaften aufweisen [22;73]. Die antigenen
Eigenschaften kleiner Proteine können durch den Einsatz von Peptiden bestätigt werden,
die kleine Bruchstücke der Proteine darstellen [22;74;75]. An einer Antigen-AntikörperReaktion nehmen 16 Aminosäuren auf der Seite des Antigens teil [22;76-78], wobei sechs
bis acht Aminosäuren für den Antigen-Antikörper-Komplex notwendig sind [76-78]. Die
übrigen
Aminosäuren
beeinflussen
wahrscheinlich
nur
die
Affinität
über
Nachbargruppeneffekte [22;79]. Antigen und Antikörper weisen komplementäre
Strukturen auf. Ein sieben Aminosäuren langes Antigenteil paßt in die antigenbindende
Tasche des Antikörpers. Diese eingelagerten Aminosäuren sind für die Komplexbildung
notwendig [22;78]. Diese Wechselwirkung kann durch sehr kleine Peptide gestört werden.
So gelingt es, die Antigen-Antikörper-Komplexierung durch ein Tripeptid zu hemmen
[22;80]. Die antigenen Eigenschaften zeigen sich auch bei synthetisch hergestellten
Peptiden [22;75;81]. Alle Proteine des RSV können als Antigene und Immunogene wirken.
Die wichtigsten stellen aber die Glycoproteine dar [12;66]. Synthetische Peptide
entsprechen linearen Epitopen der Virusproteine [82]. Die synthetischen Peptide können
heutzutage durch vollautomatische Syntheseautomaten hergestellt werden [22;83]. Da
synthetische Peptide quasi die Kopie sehr kleiner Abschnitte aus der Sequenz von
Aminosäuren darstellen, wird es hierdurch möglich, die im Serum vorhandenen Antikörper
gegen ganz bestimmte Sequenzen zu untersuchen. Durch die Reaktion der körpereigenen
Immunglobuline mit den synthetischen Peptiden ließen sich diese zum Nachweis von
Antikörpern (z.B. anti-HIV Antikörpern) nutzen [22;84-86].
Da synthetische Peptide auch immunogen wirken, stellen sie eine Möglichkeit zur
Erzeugung von neutralisierenden Antikörpern gegen bestimmte Epitope dar [22;75;87-93].
Antikörper gegen solche synthetischen Peptide schützen z.B. beim Rind vor der Maul- und
Klauenseuche [89;90]. Das Problem in der Herstellung wirksamer, neutralisierender
Antikörper durch synthetische Peptide ist folgendes: Die Antikörper gegen synthetische
Peptide erkennen nur die lineare Struktur einer Aminosäuresequenz. Bei wirksamen
Antikörpern spielt auch die räumliche Anordnung der Proteine zueinander eine Rolle [75].
22
1.6 Zielsetzung
Die Immunantwort der Säuglinge und Kleinkinder auf eine RSV Infektion ist nicht
ausreichend effektiv, so daß es auffallend häufig zu Reinfektionen kommt. RSVInfektionen finden im Beisein mütterlicher Antikörper statt und können unter diesen
Bedingungen zu Erkrankungen führen. Auf Impfungen mit formalininaktiviertem RSV
findet bei nachfolgender Wildvirusinfektion sogar eine Exazerbation der Erkrankung mit
verstärkter Entzündungsreaktion statt. Die Immunantwort auf das RSV reift im Laufe der
ersten Lebensjahre. Weder die humorale noch die zelluläre Immunantwort bewirken eine
komplette Immunität gegen das RSV, das Zusammenspiel der verschiedenen
Komponenten des Immunsystems sind noch nicht vollständig geklärt. Es finden vielfältige
Modulationen des Immunsystems durch das RSV, aber auch durch gegen RSV gerichtete
Antikörper und immunkompetente Zellen statt. Die Gründe für die unzureichende
Immunantwort sind nicht hinreichend bekannt. Die Plazenta begrenzt die immunologische
Auseinandersetzung des Feten selektiv. Ob eine eigene Immunantwort des Neugeborenen
gegen das RSV besteht, ist bisher nicht untersucht.
Zum besseren Verständnis der RSV-Infektion von Neugeborenen und Kleinkindern stellen
sich hier folgende Fragen:
- Findet eine diaplazentare Übertragung von mütterlichen RSV-spezifischen Antikörpern
statt und nehmen diese Einfluß auf die Immunantwort des Kindes?
- Zeigt das Kind zum Zeitpunkt der Geburt eine eigene Immunantwort gegen das RSV und
wie sieht diese aus?
- Findet eine intrauterine Reifung der Immunantwort statt und wie wirkt diese sich aus?
Aufschluß über diese Fragen soll die Untersuchung der Immunantwort des Neugeborenen
im Vergleich zu der Immunantwort der Mutter geben. Zu diesem Zweck eignen sich
gepaarte Seren von Müttern und Kindern zum Zeitpunkt der Geburt.
Interessant für diese Untersuchungen sind vor allem die synthetischen Peptide der Proteine
G, F und N, da Antikörper gegen diese die Infektiosität des RSV beeinflussen. Obwohl bei
Antikörpern gegen das Protein M kein Schutz gegen das RSV nachweisbar ist, stellt dieses
Protein aber ein gutes Ziel für die zytotoxischen Lymphozyten dar.
Zur Beantwortung der Frage der „Reife“ der Immunantwort soll die Untersuchung der
Immunglobuline der Klassen IgG, IgM und IgA dienen.
23
Zur Beurteilung der Immunitätslage und der Effektivität der Immunabwehr sollen die
Antikörperkonzentrationen IgG und IgM, die Neutralisationsfähigkeit von RSV in vitro,
die Immunantwort gegenüber RSV mit IgG, IgM und IgA und die epitopspezifische
Immunantwort des Neugeborenen mit IgG, IgM und IgA zwischen Müttern und Kindern
und der einzelnen Seren untereinander verglichen werden.
24
2 Methoden [4;8;13;17;18;32;37;39;109;110;233;234]
Im Rahmen dieser Arbeit werden 27 Mutter/Kind-Serumpaare mit verschiedenen Tests
untersucht, um Auskunft über die Qualität und Quantität der diaplazentar übertragenen
RSV-Antikörper zu bekommen. Für diese Untersuchung wird zum Zeitpunkt der Geburt
entnommenes mütterliches Blut und dazugehöriges Nabelschnurblut verwendet.
Bei Müttern und Kindern wird eine Konzentrationsbestimmung von IgG und IgM
durchgeführt. Um die neutralisierende Aktivität der Serumantikörper gegen RSV zu
untersuchen, werden sie anhand eines Neutralisationstestes verglichen. Die Abhängigkeit
der Signalstärke des ELISA von der Serumkonzentration wird bei unterschiedlichen
Serumverdünnungen gegenüber RSV-Antigen untersucht und hieraus die Verdünnung der
weiter durchzuführenden Untersuchungen bestimmt. Um die Aktivität der RSVspezifischen Antikörper zu untersuchen, werden diese im ELISA gegenüber Virusantigen
bestimmt. Hierbei werden die Gesamt-Immunglobuline (IgG, IgA, IgM), IgG und IgM
untersucht. Zum Nachweis RSV-spezifischer Antikörper der Gruppe IgG wird eine SDSPolyacrylamidgelelektrophorese mit anschließendem Western-Blot durchgeführt. Zur
epitopspezifischen Untersuchung der Immunglobuline der 27 Serumpaare werden 10
synthetische Peptide aus den Sequenzen der RSV-Proteine G, F, M und N verwendet.
Hierbei werden die Gesamt-Immunglobuline (IgG, IgA, IgM), IgG und IgM untersucht.
2.1 Materialien
2.1.1 Verwendete Zellen und Viren
Für die folgenden Untersuchungen wird der humane RSV Stamm „Long Strain“ der
American Type Culture Collection (Rockville, Maryland, USA; ATTC VR-26) verwendet.
Dieses Virus kann in Dulbecco`s Modified Eagle Medium (DMEM; D-5536; Gibco BRL,
Karlsruhe) unter Zusatz von 1-5 % fetalem Kälberserum (FKS; Tecnomara, Fernwald) in
der humanen Larynxkarzinom-Zellinie HEp-2 (Flow Laboratories, Meckenheim)
angezüchtet werden. Virustiter und Pathogenität des RSV sind sowohl von der Zellpassage
als auch von der Viruspassage abhängig. Für die verschiedenen immunologischen
Testverfahren werden (von Zellen oder Zelltrümmern befreite) Überstände infizierter
Zellkulturen oder Zellysate infizierter Zellen verwendet.
25
2.1.2 Zellkulturmethoden
Die Kultivierung der permanenten HEp-2 Zellinie erfolgt in 75 cm² Gewebekulturflaschen
von der Firma Greiner (Solingen) bei 37 °C. Als Nährmedium dient DMEM, 4,5 g
Glukose/l und 25 mM HEPES (Sigma H-0763; N-[2-Hydroxyethyl]piperazine-N`-[2ethansulfonic acid] sodium salt). Diesem wird zum Wachstum der Zellen 5 % fetales
Kälberserum und zur Vermeidung von Kontamination 1 % vierfach Antibiotikalösung
hinzugegeben.
Subkultiviert werden die Zellen mit einem Verdünnungsfaktor von eins zu drei nach
Trypsinbehandlung, um die Zellen voneinander und von der Unterfläche zu lösen, ohne
diese zu zerstören oder RSV freizusetzen. Hierzu wird den Zellen einmal kurz bei 37 °C
Trypsin zugesetzt. Bei der zweiten Trypsinierung werden die Zellen abgelöst, in 20 ml
Kulturmedium aufgenommen und für 10 Minuten in einer niedrigtourigen Tischzentrifuge
zentrifugiert (1000 U/min; GPR-Zentrifuge der Firma Beckmann). Der Überstand wird
abgesaugt, die Zellen werden in neues Kulturmedium aufgenommen und auf neue
Gewebekulturflaschen verteilt.
Kulturmedium: DMEM (4,5 g/l Glukose), 5 % FKS, 1 % 4-fach Antibiotikalösung
4-fach
Antibiotikalösung:
Penicillin
G/Benzylpenicillin
(Sigma)
10000
U/ml;
Dihydrostreptomycin (Sigma) 13,3 mg/ml; Neomycinsulfat (Sigma) 7,8 mg/ml; Bacitracin
(Sigma) 125 U/ml
2.1.3 Virusvermehrung und –aufreinigung
Zur Virusvermehrung werden die aus der Zellkultivierung gewonnenen Zellen
abzentrifugiert und in 5 ml Medium aufgenommen (zur besseren Infektion der HEp-2
Zellen wird dem Kulturmedium nur 1 % FKS zugesetzt). Diese Zellsuspension wird für 1 h
bei 37 °C mit 3,4 x 104 PFU (Plaque Forming Units) RSV inkubiert. Nicht adsorbierte
Viren werden abgesaugt, neues Medium zugegeben und die Kulturen bei 37 °C inkubiert.
Nach 24 Stunden wird das Medium gewechselt.
Zeigen 80 % der Zellen den für das RSV typischen zytopathischen Effekt (CPE) in Form
mehrkerniger Riesenzellen, so werden diese zusammen mit dem Überststand bei 2000
U/min für 15 Minuten zentrifugiert, der Überstand portioniert und bei –80 °C eingefroren.
26
Gleichzeitig werden dieselben Schritte ohne Zugabe der Viren durchgeführt, um
Ausgangsmaterial für die Kontrollmessungen zu erhalten.
2.1.4 Virustitration
Zur Bestimmung der infektiösen Einheiten von RSV haltigen Überständen werden diese
auf HEp-2 Zellen titriert. Hierzu werden jeweils 100 µl Zellsuspension mit 2,5 x 104 HEp2 Zellen pro Näpfchen auf einer 96-Depot-Gewebekulturplatte der Firma BecktonDickinson (Heidelberg) ausgesät (zur besseren Infektion der HEp-2 Zellen werden auch
hier dem Kulturmedium nur 1 % FKS zugesetzt). Hierauf wird der Zellsuspension je 100
µl Virussuspension in einer Verdünnungsreihe (1/100, 1/200,... bis 1/6400 in
Kulturmedium) zugegeben und bei 37 °C inkubiert. Nach 48 h Inkubationszeit werden die
Zellen mit in Phosphat gepufferter Salzlösung (PBS) gewaschen, mit 96 %-igem Ethanol (20 °C) für 10 Minuten fixiert und anschließend luftgetrocknet.
Zur enzymatischen Anfärbung der RSV Proteine werden die Zellen mit einem Antikörper
gegen RSV markiert (12E2-C1; monoklonaler-IgG2a-Mausantikörper gegen das G-Protein
des RSV aus vorhergegangenen Arbeiten der Arbeitsgruppe [22]; 1/10 verdünnt in PBS).
Hierzu werden die Zellen kurz mit PBS angefeuchtet und mit je 75 µl
Antikörpersuspension pro Depot für 1 h bei 37 °C inkubiert.
PBS (pH 7,4): NaCl 136,89 mM; KCl 2,68 mM MgCl2 0,49 mM; CaCl2 0,90 mM;
Na2HPO4 8,09 mM; KH2PO4 1,47 mM
Nach Auswaschen nicht-gebundener Antikörper werden die Immunglobulinkomplexe
durch
einen
Antikörper
gegen
Maus-IgG
(Anti-Maus
Polyvalent-Ig(-G,-A,-M)-
Peroxidaseantikörper A-0412; Sigma, Deisenhofen; 1/200 in PBS) enzymatisch markiert
und durch Umsetzung eines geeigneten Substrates (A-5754) sichtbar gemacht werden.
Hierzu werden die Zellen nach einem Waschvorgang mit je 75 µl des Antikörpers für 1 h
bei 37 °C inkubiert. Nach einem weiterem Waschschritt folgt das Auftragen von 100 µl
Substratlösung pro Depot und Inkubation von etwa einer halben Stunde bei 37 °C.
27
Substratlösung: Tris/HCL (0,05 M, pH 7,8) 10 ml; Ethylcarbazollösung 200 µl; H2O2 1,7
µl
Ethylcarbazollösung: 0,1 g 3-Amino-9-Ethylcarbazol (Sigma A-5754) in 10ml Ethanol
Hierauf wird die Reaktion mit H2O gestoppt. Unter dem Mikroskop werden die infektiösen
Einheiten anhand der Anzahl angefärbter Zellen ausgezählt und somit die PFU/ml
ermittelt.
2.1.5 Herstellung von RSV Lysat
Zur Lysierung von RSV infizierten HEp-2 Zellen werden diese mit einem Gummischaber
von der Unterlage gelöst, die pelletierten Zellen mit vierfachem Volumen Lyse-Puffer
aufgeschlossen und nach 10 minütigem Schütteln zentrifugiert. Der Überstand wird
portioniert und bei –80 °C eingefroren.
Lyse-Puffer: Saccharose 250 mM; Tris/HCl (pH 7,2) 10 mM; MgCl2 3 mM; KCl 5 mM;
NaN3 0,01 %; Triton X-100 (Sigma T-6878) 1 %; Natriumdeoxychlat 1 %
2.1.6 Verwendete Seren
Für die Untersuchungen der diaplazentaren Übertragung RSV spezifischer Antikörper
werden 27 Paare von mütterlichen und dazugehörigen kindlichen Seren gesammelt. Hierzu
wird mütterliches Blut im Rahmen von Routineuntersuchungen in der Frauenklinik des
Marienhospitals Herne und in der Frauenklinik des Knappschafts-Krankenhauses Bochum
zum Zeitpunkt der Geburt und entsprechendes kindliches Blut durch Ausstreichen der
Nabelschnur gewonnen. Die Blutproben werden zentrifugiert und abgesert, die so
gewonnenen Seren portioniert und bei –80 °C bis zur weiteren Verwendung eingefroren.
Die Seren werden von S1 bis S27 durchnummeriert. M steht für mütterliches und K für
kindliches Serum.
28
2.1.7 Verwendete synthetische Peptide
Zur epitopspezifischen Untersuchung der Immunglobuline der 27 Serumpaare wird ein
Peptid-ELISA mit zehn unterschiedlichen synthetischen Peptiden aus der Sequenz
verschiedener
RSV
Proteine
durchgeführt.
Die
unterschiedlichen
Teilsequenzen
entsprechen unterschiedlichen Positionen der RSV Proteine G, F, M und N, sie sind in
Tabelle 1 dargestellt (für die Lokalisation der synthetischen Peptide der RSV-Proteine G
und F siehe auch Abbildung 2 und 3). Als Auswahlkriterium für die einzelnen
synthetischen Peptide dient die Aufenthaltswahrscheinlichkeit auf der Virusoberfläche
[22]. Die einzelnen Peptidsequenzen werden im folgenden als SP1-SP10 bezeichnet und
schlüsseln sich wie folgt auf:
Tabelle 1: Synthetische Peptide SP1-SP10 aus der Sequenz der RSV Proteine G, F, M und N
und deren Position im RSV
Peptid Protein Position
Sequenz
SP
1
G
141-149
TQPSKPTTK
SP
2
G
187-201
KRIPNKKPGKKTTTK
SP
3
G
209-214
KTTKKD
SP
4
G
217-224
PQTTKSKE
SP
5
G
289-298
PSSPPNTPRQ
SP
6
F
130-136
SKKRKRR
SP
7
F
221-232
IEFQQKNNRLLE
SP
8
M
25- 28
SP
9
M
247-256
SP 10
N
19- 24
EKDDD
TRFAIKPMED
SSSKYT
Die verwendeten synthetischen Peptide wurden mir aus vorangegangenen
Arbeiten der Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Dr. H.-J. rer. nat. Streckert, Abteilung
für medizinische Mikrobiologie und Virologie der Ruhr-Universität, 44780
Bochum, zur Verfügung gestellt.
29
2.2 Untersuchungsmethoden
2.2.1 Lasernephelometrie
Zum Vergleich der IgG- sowie der IgM-Konzentrationen zwischen Mutter und Kind
werden lasernephelometrische Konzentrationsbestimmungen bei 23 der 27 Serumpaare
durchgeführt. Bei vier der 27 Seren steht nicht genügend Material für diese Untersuchung
zur Verfügung. Die Untersuchungen werden im Institut für klinische Chemie und
Laboratoriumsmedizin der Ruhr-Universität Bochum unter Prof. Dr. med. M. Krieg
durchgeführt. Die Bestimmung erfolgt anhand eines Nephelometer Array 360. Hierzu
werden die Seren in einer Verdünnung von eins zu zwei in isotoner Kochsalzlösung in
Proben von je 1 ml (mit 4 Seren zur Kontrolle) untersucht. Die Konzentrationen werden in
mg/dl angegeben.
2.2.2 RSV-Mikroneutralisationstest
Zum Nachweis der protektiven Aktivität werden die 27 Serumpaare anhand des RSVMikroneutralisationstestes untersucht. Hierzu wird zunächst aus den Serumpaaren eine
Verdünnungsreihe angelegt. Die Seren werden in Kulturmedium auf 1/50, 1/100,... bis
1/6400 verdünnt und je 100 µl pro Napf einer 96-Depot-Gewebekulturplatte der Firma
Beckton-Dickinson (Heidelberg) titriert (zur besseren Infektion der HEp-2 Zellen wird
auch hier dem Kulturmedium nur 1 % FKS zugesetzt). Hierauf wird den Serumproben je
50 µl RSV Suspension in einer Konzentration von 100-200 PFU pro Depot zugesetzt. Zur
Kontrolle dienen nicht infizierte HEp-2 Zellen. Nach einer Reaktionszeit von 90 min bei
37 °C wird den Virus-Antikörpersuspensionen jeweils 100 µl Zellsuspension mit 2,5 x 104
HEp-2 Zellen pro Näpfchen zugegeben. Nach 48 h Inkubationszeit bei 37 °C werden die
Zellkulturen analog zur Virustitration (Kapitel 2.1.4) fixiert und die RSV Proteine durch
enzymatische Anfärbung markiert. Die Titerstufe wird mikroskopisch bestimmt.
2.2.3 RSV spezifischer ELISA
Zum Nachweis RSV-spezifischer Antikörper der Immunglobulinklassen IgG, IgA und IgM
wird bei den 27 Serumpaaren ein RSV-spezifischer ELISA durchgeführt. Es wird ein Lysat
von RSV infizierten HEp-2 Zellen verwendet. Zur Kontrolle dienen nicht infizierte HEp-2
Zellen. Zur Testdurchführung werden die Näpfe der 96-Depot-ELISA-Mikrotiterplatten
(Nunc,
Maxisorp,
Wiesbaden)
mit
je
100
µl
Fängerantikörperlösung
(B
98
Hyperimmunserum vom Schaf gegen das RSV aus vorhergegangenen Arbeiten der
30
Arbeitsgruppe; 1/2000 verdünnt in Carbonatpuffer) beschichtet und über Nacht bei 4 °C
inkubiert.
Carbonatpuffer (pH 9,6): CO32- 0,05 M; Na2CO3 1,59 g/l NaHCO3 2,93 g/l
Nach Auswaschen ungebundener Fängerantikörper mit 200 µl Waschlösung
werden
verbliebene reaktive Zentren mit enzymatisch degradierter Gelatine (200 µl Boehringer
Blockierungsreagenz, Cat. No. 1112589, Boehringer, Mannheim) über 15 Minuten bei
Raumtemperatur abgesättigt. Nach zweimaligem Waschen mit 200 µl Waschlösung
werden 75 µl RSV Lysat je Näpfchen (1/500 verdünnt in Probenpuffer) für 1 h bei 37 °C
aufgegeben. Mit der Kontrolle werden die analogen Schritte durchgeführt.
Waschlösung: NaCl 150 mM; Tween 20 (Sigma P-1379) 0,1 %
Probenpuffer: 0,2 % Magermilchpulver in PBS
Nach drei Waschschritten folgt das Auftragen von je 75 µl der zu untersuchenden
Serumproben pro Depot mit anschließender Inkubation für 1 h bei 37 °C. Dem nächsten
Waschschritt folgt die enzymatische Markierung der gebundenen Serumantikörper mit
einem gegen humane Immunglobuline gerichteten Antikörper (IgGesamt; IgG und IgMAntikörper, verdünnt in Probenpuffer) über 30 Minuten bei 37 °C. Durch Umsetzung der
anschließend aufgebrachten Substratlösung (75 µl je Näpfchen) wird diese Reaktion
sichtbar gemacht. Die enzymatische Reaktion wird nach 30 Minuten durch die Zugabe von
50 µl 1 N H2SO4 abgestoppt. Die Extinktionen der Lösungen werden durch das
Extinktionsmeßgerät „anthos 2001 reader“ von der Firma Anthos Labtec Instruments,
Siegburg bei 492 nm photometrisch detektiert und gegen einen Standard (Refr. Filter 620
nm) ausgewertet.
Antikörper:
IgGesamt (IgG, IgA, IgM): Peroxidasekonjugierter Goat-Anti-Human-Antikörper (Nordic
20-585) 1/2000
IgG: Peroxidasekonjugierte Anti-Human-IgG-Antikörper (Sigma A-8419) 1/1000
IgM: Peroxidasekonjugierte Anti-Human-IgM-Antikörper (Sigma A-6907) 1/1000
31
Substratlösung: 4 Tabletten Orthophenylendiamin-Substrat (OPD; Dako Diagnostik, No. S
2000); 12 ml Phosphat-Citrat-Puffer; 5 µl 30 % H2O2
Phosphat-Citrat-Puffer (pH 5,0): Citronensäure * H2O 7,3 g/l; Na2HPO4 * 12 H2O 23,9 g/l
2.2.4 Immunoblot
Zum Nachweis RSV-spezifischer Antikörper der Gruppe IgG wird eine SDSPolyacrylamidgelelektrophorese mit anschließendem Western-Blot durchgeführt.
2.2.4.1 SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese
Anhand einer Natriumdodecylsulfat-Polyacrylamidgelelektrophorese (SDS-PAGE) werden
unterschiedliche Proben elektrophoretisch aufgetrennt, um die Reaktion der Antikörper der
27 Serumpaare auf unterschiedliche Proteine aus der Struktur des RSV zu untersuchen. Als
Proben dienen hierzu die Lysate von RSV infizierterten HEp-2 Zellen und von nicht
infizierten HEp-2 Zellen (als Kontrolle), sowie biotinylierte Markerproteinlösung (SDS6B; Biotinylated SDS Molekular Weight Srandard Mixture, Serva, Heidelberg) zur
Darstellung standartisierter Banden. Hierbei binden die zu untersuchenden Antikörper an
das zuvor aufgebrachtes Antigen, das elektrophoretisch aufgetrennte RSV. Die zu
untersuchenden Antikörper werden dabei wiederum durch Antikörper markiert. An diese
wird die Peroxidase durch Biotin irreversibel gebunden. Die Stärke der enzymatischen
Reaktion unter Standardbedingungen gibt dann Rückschlüsse auf die Antikörperaktivität.
Verwendet wird hierzu das Minigelsystem (G41) sowie das SDS-PAGE Protein-Set der
Firma Biometra (Göttingen), nach deren Firmenvorschrift die Gele gegossen werden.
Trenngel 10%; Dicke 1 mm (pH 8,8): Stammlösung (FL-P11; Biometra Göttingen) 2,5 ml;
Trenngelpuffer (3-fach konzentriert) 835 µl; H2O 4,03 ml; TEMED (10 %
Tetramethylendiamin-Lösung in H2O) 125 µl; Ammoniumpersulfat, APS (10 % in H2O)
50 µl;
Stammlösung: Acrylamid/Bisacrylamid 30 % zu 0,8 %
Sammelgel 3 % (pH 6,8): Stammlösung 200 µl; Sammelgelpuffer (5-fach konzentriert) 80
µl; H2O 1,68 ml; TEMED (10 % in H2O) 40 µl; Ammoniumpersulfat, APS (10 % in H2O)
12 µl
32
Laufpuffer: Tris 25 mM; Glycin 192 mM; Natriumdodecylsulfat, SDS 0,1 %
Eingesetzt werden pro Gel 250 µl RSV Lysat sowie HEp-2 Lysat Kontrolle (jeweils 1/1
verdünnt in Probeninkubationspuffer (pH 6,8; 2-fach konzentriert); enthalten im
Elektrophorese-Set) sowie 10 µl biotinylierte Markerproteinlösung pro Spur. Zum
Sammeln der Proteine wird eine konstante Stromstärke von 10 mA in den ersten 10 min,
dann zum Trennen eine konstante Stromstärke von 25 mA für weitere 70-90 min angelegt.
2.2.4.2 Western-Blot
Zum Transfer der elektrophoretisch aufgetrennten Proteine auf Nitrozellulosemembran
wird das Fast-Blot System der Firma Biometra (Göttingen) verwendet. Als
Blottingmembran dient die vliesverstärkte Cellulosenitratfolie BA 85/0,45 µm (Ref.-No.
401196) von der Firma Schleicher und Schuell (Dassel). Der Transfer erfolgt bei einer
konstanten Stromstärke von 5 mA/cm2 über 15 min.
Transferpuffer (pH 8,3): Tris 25 mM; Glycin 192 mM; Methanol 10 %
Zur Färbung der Markerspur wird Amidoschwarz verwendet. Hierzu wird diese
gekennzeichnet und von den anderen Poteinspuren getrennt.
Amidoschwarz: Amidoschwarz 10B 0,1 %; Methanol 20 %; CH3COOH 10 %; H2O 70 %
Entfärbelösung: Methanol 20 %; CH3COOH 10 %; H2O 70 %
Zur Verringerung unspezifischer immunologischer Reaktionen wird die Folie vor der
Anfärbung zweimal für 30 Minuten mit Absättigungslösung abgesättigt.
Absättigungslösung: Magermilchpulver 2 % (Proteinmischung, die durch peoteolytische
Spaltung von gereinigter Gelatine erhalten wurde); Tween 20 0,05 % in PBS
Zur Weiterverarbeitung der Nitrozellulosefolie wird diese in einzelne Streifen geschnitten.
Alle nun folgenden Inkubationsschritte werden auf dem Schüttler bei Raumtemperatur
durchgeführt. Zur Reaktion der Serumantikörper mit den aufgetrennten Proteinen werden
die Immunoblotstreifen mit je 750 µl der zu untersuchenden Serumproben (in einer
Verdünnung von 1/100 in Waschpuffer) für 1h inkubiert.
33
Waschlösung: Magermilchpulver 0,1 %; Tween 20 0,05 % in PBS
Zur enzymatischen Anfärbung der gebundenen Serumantikörper werden diese für 1 h mit
einem gegen humanes IgG gerichteten Antikörper (AP-konjugierter Mouse-Anti-HumanIgG Antikörper, Sigma A-2064 Sigma, Deisenhofen; 1/5000 in Waschlösung) markiert und
durch Umsetzung einer Substratlösung sichtbar gemacht.
Substratlösung: Tris/HCl pH 9,6 150 mM; MgCl2 4 mM; NBT (Nitro blue tetrazolium;
Sigma N-6876) 0,1 mg/ml; BCIP (5-Bromo-4-chloro-3-indolylphosphate Sigma B-8503)
0,05 mg/ml
Anschließend wird die Folie in Streifen geschnitten und fotografiert.
2.2.4 Peptid-ELISA
Zur epitopspezifischen Untersuchung der 27 Serumpaare auf Antikörper verschiedener
Immunglobulinklassen gegen einzelne synthetische Peptide aus der Sequenz verschiedener
RSV Proteine wird ein peptidspezifischer ELISA durchgeführt. Als Antikörper werden die
Immunglobulinklassen IgG, IgA und IgM als IgGesamt zusammen und IgG und IgM
jeweils einzeln erfaßt. Zur Testdurchführung werden 96-Depot-ELISA-Mikrotiterplatten
(Nunc, Maxisorp) mit 10 synthetischen Peptiden SP1 - SP10 (20 µg/ml Carbonatpuffer, pH
9,6) mit je 100 µl pro Depot über Nacht bei 4 °C inkubiert. Nach Auswaschen
ungebundener Peptide werden die verbliebenen reaktiven Zentren mit enzymatisch
degradierter Gelantine bei Raumtemperatur über 15 Minuten abgesättigt. Nach
zweimaligem Waschen werden je 75 µl der zu untersuchenden Serumproben (1/500
verdünnt in Probenpuffer) pro Näpfchen aufgegeben und für 1 h bei 37 °C inkubiert.
Waschlösung: NaCl 150 mM; Tween 20 0,05 %
Probenpuffer: 0,1 % Magermilchpulver in PBS
Die
ungebundenen
Serumantikörper
werden
ausgewaschen.
Die
gebundenen
Serumantikörper werden mit den folgenden Antikörpern enzymatisch markiert und durch
Umsetzung der Substratlösung sichtbar gemacht:
34
Antikörper:
IgGesamt (IgG, IgA, IgM): Peroxidasekonjugierter Goat-Anti-Human-Antikörper (Nordic
20-585) 1/2000
IgG: Peroxidasekonjugierte Anti-Human-IgGAntikörper (Sigma A-8419) 1/1000
IgM: Peroxidasekonjugierte Anti-Human-IgM-Antikörper (Sigma A-6907) 1/1000
Substratlösung: 4 Tabletten Orthophenylendiamin-Substrat (OPD; Dako Diagnostik, No. S
2000); 12 ml Phosphat-Citrat-Puffer; 5 µl 30 % H2O2
Die Reaktion wird nach 30min mit 50 µl 1 N H2SO4 abgestoppt und die Extinktion bei 492
nm photometrisch detektiert und gegen einen Standard (Refr. Filter 620 nm) ausgewertet.
35
2.3 Auswertung der Ergebnisse
Zur Auswertung der Ergebnisse werden die Rohdaten in Microsoft Excel eingegeben und
dort berechnet.
2.3.1 Lasernephelometrie
Bei den Konzentrationsbestimmungen handelt es sich um quantitative Bestimmungen in
einem auswärtigen Labor. Die IgG- und IgM-Konzentrationen der einzelnen Seren werden
im Vergleich zur Standardabweichung vom Mittelwert der untersuchten Seren beurteilt.
Die Berechnung erfolgt bei mütterlichen und kindlichen Seren getrennt. Zum Vergleich
der Unterschiede der IgG- und IgM-Konzentrationen zwischen Mutter und Kind werden
die einzelnen Differenzen der korrespondierenden Mutter-Kind-Paare berechnet und diese
im Vergleich zur Standardabweichung vom Mittelwert der Differenzen der untersuchten
Seren bewertet. Zur Berechnung der Signifikanz der Unterschiede der Konzentrationen
zwischen Mutter und Kind wird der T-Test für gepaarte Stichproben angewendet.
2.3.2 RSV-Mikroneutralisationstest
Die neutralisierenden Eigenschaften der einzelnen Seren werden anhand der Titerstufen
dargestellt und miteinander verglichen. Da es sich um Ergebnisse eines Testdurchlaufes
handelt, lassen diese einen direkten Vergleich der Einzelwerte zu. Die anderen Seren
dienen dabei als interne Referenz. Als Negativkontrolle dienen nicht infizierte HEp-2
Zellen.
2.3.3 RSV spezifischer ELISA
Um die spezifische Reaktion der Serumantikörper gegen das RS-Virus zu ermitteln,
werden die gemessenen Extinktionen der Lysate der nicht infizierten HEp-2 Zellen von
denen der RSV infizierterten HEp-2 Zellen abgezogen [276].
Zum Vergleich der Antikörperaktivität der Serumpaare untereinander wird das Abweichen
der Reaktionsstärken vom Mittelwert anhand der Standardabweichung ermittelt und
miteinander verglichen. Die Berechnung erfolgt bei mütterlichen und kindlichen Seren
getrennt. Beim Vergleich der Reaktionsstärken zwischen Mutter und Kind werden die
Differenzen der einzelnen korrespondierenden Paare berechnet und diese im Vergleich zur
Standardabweichung vom Mittelwert bewertet [276]. Zur Berechnung der Signifikanz der
Reaktionsstärke zwischen Mutter und Kind wird der T-Test für gepaarte Stichproben
angewendet.
36
Da im ELISA keine absoluten Werte, sondern Reaktionsstärken bestimmt werden, welche
die Aktivität der Antikörper widerspiegeln kann durch den Vergleich der Reaktionsstärke
mit IgG und IgM zu der mit IgGesamt ein semiquantitativer Rückschluß auf die IgAAktivität gezogen werden. Dabei werden die Unterschiede in den Reaktionen aus dem
gleichen Testdurchlauf zwischen Mutter und Kind in direktem Vergleich zueinander und
die Reaktionen der einzelnen Seren im Vergleich zu den anderern 26 Seren bewertet.
Reagiert ein Serum z.B. deutlich mit IgM, ist diese Reaktion auch beim IgGesamt zu
erkennen, da dieses ja IgG, IgM und IgA enthält. Zeigt das Serum eine deutliche Aktivität
mit IgGesamt ohne Reaktion bei IgM und IgG, so ist von einer IgA-Aktivität auszugehen.
Die 26 anderen Seren dienen dabei als interne Referenz.
2.3.4 Immunoblot
Die abfotografierten Banden der Westernblot-Streifen werden direkt zwischen Mutter und
Kind, mit den 26 anderen Serumpaaren und mit der mitgelaufenen Kontrolle verglichen.
2.3.5 Peptid-ELISA
Anhand der Standardabweichung wird das Abweichen der Reaktionsstärken vom
Mittelwert ermittelt und so die Antikörperaktivität der einzelnen Serumpaare untereinander
und mit den 26 anderen Serumpaaren verglichen. Die Berechnung erfolgt bei mütterlichen
und kindlichen Seren getrennt. Beim Vergleich der Reaktionen zwischen Mutter und Kind
werden die Differenzen der einzelnen korrespondierenden Seren im Vergleich zur
Standardabweichung vom Mittelwert bewertet [276]. Zur Berechnung der Signifikanz der
Reaktionsstärke zwischen Mutter und Kind wird auch hier der T-Test für gepaarte
Stichproben angewendet.
Wie beim RSV-spezifischen ELISA wird ein semiquantitativer Rückschluß vom
Reaktionsmuster der IgGesamt, der IgG und der IgM-Antikörper auf die IgA-Aktivität
gezogen.
37
2.3.6 Testvalidierung
Zur Testdurchführung werden die Versuchsanordnungen und die Materialien der
Arbeitsgruppe von Herrn Prof. Dr. rer. nat. Streckert, Abteilung für medizinische
Mikrobiologie und Virologie der Ruhr-Universität, 44780 Bochum verwendet [169].
Um die Abhängigkeit der Signalstärke im ELISA von der Serumkonzentration zu
untersuchen wird in Voruntersuchungen jeweils ein RSV-spezifischer ELISA mit
IgGesamt-Antikörpern mit der Serumverdünnung 1/100; 1/200; 1/400 und 1/800
durchgeführt. Aus den Ergebnissen wird die Korrelation der Signalstärke zur
Serumkonzentration bestimmt. Es errechnet sich eine Korrelation von im Mittel r = 0,969
(0,868 bis 0,998) bei den Müttern und von im Mittel r = 0,967 (0,839 bis 0,999) bei den
Kindern, die Signalstärke im ELISA korreliert also mit der Konzentration der Seren. Da es
sich hierbei um eine streng lineare Funktion handelt, werden alle Folgeuntersuchungen mit
der Serumverdünnung von 1/500 durchgeführt. Kreuzreaktionen wurden durch den
direkten Vergleich mit der Kontrolle ausgeschlossen (innere Referenz) [276;277].
Zur Validierung der Ergebnisse und Bestimmung der Meßpräzision im Sinne der InterAssay-Variabilität
läßt
sich
aus
Voruntersuchungen
anhand
von
vier
Wiederholungsuntersuchungen beim RSV-spezifischen ELISA mit IgGesamt die relative
Verfahrensabweichung mittels der linearen Kalibrierfunktion errechnen [274;275]. Es
ergibt sich eine mittlere relative Standardabweichung von 7,8 % bei einer mittleren
Standardabweichung von 0,078 und eine mittlere Varianz von 0,0075 bei den 27 Proben
der Mütter und eine mittlere relative Standardabweichung von 5,2 % bei einer mittleren
Standardabweichung von 0,051 und eine mittlere Varianz von 0,004 bei den 27 Proben der
Kinder.
2.3.7 Interpretation der Reaktionen der einzelnen Serumpaare über alle Tests
Um Rückschlüsse auf die Immunitätslage der einzelnen Seren ziehen zu können, wird
jedes einzelne Serum in jedem durchgeführten Test bezüglich der Reaktion des Kindes im
Vergleich zur Mutter und das Serumpaar im Vergleich zum Gesamtkollektiv untersucht
und miteinander verglichen. Die Beurteilung erfolgt anhand des Abweichens der
Reaktionsstärken vom Mittelwert im Vergleich zur Standardabweichung als innere
Referenz. Die Signifikanz der Unterschiede der Reaktionen zwischen Mutter und Kind
werden anhand des T-Testes für gepaarte Stichproben ermittelt.
38
Nach dieser Beurteilung werden die einzelnen Serumpaare bezüglich ihrer Tendenzen im
Reaktionsmuster über alle Untersuchungen im Vergleich zu den anderen 26 Serumpaaren
nach folgenden Kriterien eingeteilt:
Das Serumpaar mit einer „reifen“ Immunantwort erkennt das RSV gut mit IgG, besitzt
gute
neutralisierende
Eigenschaften
gegen RSV und zeigt eine ausgewogene
Immunreaktion gegen RSV [82;98;100;110;111;121;144;159;167-169;237;239;245]. Das
Serumpaar mit einer „unreifen“ Immunantwort erkennt das RSV mit IgG-Antikörpern
schlecht, besitzt schlechte neutralisierende Eigenschaften gegen RSV und zeigt spezifische
IgM- und IgA-Antworten gegen RSV. Alle Serumpaare können zwischen diesen beiden
Polen der Immunantwort in eine Reihenfolge sortiert werden.
2.3.8
Untersuchung
der
Abhängigkeit
der
Reaktionsstärken
von
den
Immunglobulinkonzentrationen
Zur Untersuchung der Abhängigkeit der Aktivität der IgG- und IgM-Antikörper bei Mutter
und Kind von den Immunglobulinkonzentrationen werden die Reaktionsstärken der
einzelnen Seren in den einzelnen Tests zu den IgG- und IgM-Konzentrationen in
Korrelation gesetzt. Zur Berechnung der Signifikanz wird der T-Test für gepaarte
Stichproben angewendet.
2.3.9 Fehlerbetrachtung
Zur Beurteilung ob es sich bei einzelnen Ergebnissen um eine Fehlbestimmung handelt,
wird eine Einzelbetrachtung sämtlicher Ergebnisse durchgeführt. Die einzelnen Werte
werden im Vergleich zu den anderen Seren und die Reaktionen im Vergleich zu den
anderen Tests beurteilt. Es muss sich z.B eine sehr starke IgG-Antwort auch im IgGesamt
wiederspiegeln, da IgG auch im IgGesamt enthalten ist. Eine sehr starke peptidspezifische
IgG-Antwort muss sich auch im RSV-spezifischen IgG-ELISA wiederspiegeln, da die
peptidspezifische Immunreaktion einen speziellen Teil der RSV-spezifischen Antwort
darstellt. Die Signifikanz des Unterschiedes der so aufgefallenen Werte wurden anhand der
Ausreißerwerteberechnung beurteilt [278]. Dabei wurde die Ausreißertabelle nach Gubbs
verwandt.
39
3 Ergebnisse
3.1 Vergleich der IgG- und IgM-Konzentrationen von Mutter und Kind
Zum Vergleich der IgG- und IgM-Konzentration werden diese nephelometrisch bestimmt
und verglichen. Bei vier der 27 Seren steht nicht genügend Material für diese
Untersuchung zur Verfügung.
3.1.1 IgG-Konzentrationen
Vergleicht man die IgG-Konzentrationen der Seren untereinander und berechnet deren
Standardabweichung und den Mittelwert im jeweiligen Teilkollektiv (Mütter und Kinder),
so läßt sich im Vergleich zu den anderen Seren folgendes feststellen: Die IgGKonzentrationen der mütterlichen Seren liegen im Bereich von 412 bis 1236 mg/dl, die der
kindlichen Seren im Bereich von 560 bis 1642 mg/dl. Der Mittelwert der IgGKonzentrationen liegt bei den mütterlichen Seren bei 767 mg/dl mit einer
Standardabweichung von 225 mg/dl und der Mittelwert der kindlichen Seren bei 1047
mg/dl mit einer Standardabweichung von 263 mg/dl. Die kindlichen IgG-Konzentrationen
liegen somit durchschnittlich 36,5 % über denen der mütterlichen. Beim Vergleich der
Gruppen unter Anwendung eines T-Tests für gepaarte Stichproben zeigt sich, daß der
Unterschied signifikant ist (P = 0,0004724).
Die Referenzintervalle werden in der Literatur für IgG bei Erwachsenen mit 1000 bis 1500
mg/dl [177] und bei Kindern mit 636 bis 1606 mg/dl [184] angegeben. Im vorliegenden
Kollektiv weisen 20 von 23 mütterlichen Seren IgG-Konzentrationen auf, die unterhalb des
Referenzintervalles für Erwachsene liegen (= 86,96 %). Bei den dazugehörigen kindlichen
Seren zeigen nur zwei Seren einen Wert unterhalb des Referenzintervalls (S22 und S24).
Oberhalb des Referenzintervalls liegt nur ein kindliches Serum (S18). Dieses liegt mehr als
50 % oberhalb des mütterlichen Wertes und somit über dem Referenzintervall für
Neugeborene.
Abbildung 4 stellt die lasernephelometrisch bestimmten IgG-Konzentrationen bei 23
Mutter/Kind-Serumpaaren dar. Bei S18 und S26 zeigt das Kind und bei S20 und S21 die
Mutter eine sehr starke Erhöhung der IgG-Konzentration, wobei die dazugehörigen Werte
der jeweils korrespondierenden Seren keine Unterschiede größer der Standardabweichung
40
zeigen. Bei S17 zeigen Mutter und Kind eine Erhöhung der IgG-Konzentration größer der
Standardabweichung.
M u t te r
Ig G -N e p h e lo m e tr ie
K in d /N S
1800
1600
Konzentration mg/dl
1400
1200
1000
800
600
400
200
0
2
3
5
6
7
8
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
26
27
S e ru m p a a r
Abb. 4: Lasernephelometrisch bestimmte IgG-Konzentrationen in mg/dl bei 23 Mutter/Kind-Serumpaaren
Im Vergleich der Konzentrationsdifferenzen der einzelnen Seren untereinander kann man
folgendes feststellen: Bei den Vergleichsuntersuchungen zwischen Mutter und Kind zeigt
sich bei 18 von 23 kindlichen Seren (78,3 %) eine höhere IgG-Konzentration als bei den
korrespondierenden mütterlichen Seren.
Vergleicht man die IgG-Konzentrationsdifferenzen der Seren untereinander und berechnet
deren Standardabweichung und die Mittelwerte der Differenzen im jeweiligen
Teilkollektiv, so läßt sich im Vergleich zu den anderen Seren folgendes feststellen:
Die Standardabweichung der Differenz zwischen den mütterlichen und den kindlichen
Seren beträgt 320 mg/dl, die zweifache Standardabweichung 640 mg/dl. Der Mittelwert
der Differenzen beträgt 280 mg/dl. Abbildung 5 stellt die errechneten IgGKonzentrationsdifferenzen durch Abzug der kindlichen IgG-Konzentration von der
mütterlichen dar. Bei den Serumpaaren S13, S18, S26 und S27 sind die kindlichen IgGKonzentrationen um mehr als eine Standardabweichung der Differenz von Mutter und
Kind höher als die der korrespondierenden Mütter. Bei den Serumpaaren S7, S8, S14, S15,
S16, S17 und S23 sind die IgG-Konzentrationen der Kinder größer als die der Mütter,
allerdings weniger als die Standardabweichung der Differenz der Paare. Bei Serumpaar
S20 ist die IgG-Konzentration des Kindes mehr als die zweifache Standardabweichung
41
kleiner als die der korrespondierenden Mutter, bei S19, S21, S22 und S24 ist sie um mehr
als eine Standardabweichung kleiner.
Ig G -N e p h e lo m e tr ie
K - M
1000
Konzentrationsdifferenz mg/dl
800
600
400
200
0
-2 0 0
-4 0 0
-6 0 0
2
3
5
6
7
8
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
26
27
S e ru m p a a r
Abb. 5: Errechnete IgG-Konzentrationsdifferenzen durch Abzug der kindlichen IgG-Konzentration von der
mütterlichen (in mg/dl)
42
3.1.2 IgM-Konzentrationen
Vergleicht man die IgM-Konzentrationen der Seren untereinander und berechnet deren
Standardabweichung und den Mittelwert im jeweiligen Teilkollektiv, so läßt sich im
Vergleich zu den anderen Seren folgendes feststellen:
Die IgM-Konzentrationen der mütterlichen Seren liegen im Bereich von 60 bis 362 mg/dl,
die der kindlichen Seren im Bereich von vier bis 31 mg/dl. Der Mittelwert der IgMKonzentrationen liegt bei den mütterlichen Seren bei 140 mg/dl mit einer
Standardabweichung von 74 mg/dl und der Mittelwert der kindlichen Seren bei 12 mg/dl
mit einer Standardabweichung von 7,5 mg/dl. Die kindlichen IgM-Konzentrationen liegen
im Durchschnitt bei 8,6 % der mütterlichen IgM-Konzentrationen. Beim Vergleich der
IgM-Konzentrationen zeigt sich deutlich, daß die IgM-Konzentrationen der Mütter über
denen der Kinder liegen. Das ist bei allen untersuchten Serumpaaren der Fall. Beim
Vergleich der Gruppen unter Anwendung eines T-Tests für gepaarte Stichproben zeigt
sich, daß der Unterschied signifikant ist (P = 2,3 x 10-8).
Beim vorliegenden Kollektiv von 23 Serumpaaren zeigen neun mütterliche Seren IgMKonzentrationen oberhalb und acht Seren unterhalb des Referenzintervalls für Erwachsene.
Acht kindliche Seren zeigen IgM-Konzentrationen unterhalb und zwei Seren oberhalb des
Referenzintervalls für Neugeborene. Die Referenzintervalle der IgM für Neugeborene
werden in der Literatur mit 6,3 bis 25 mg/dl [184], die der Erwachsenen mit 100 bis 125
mg/dl [177] angegeben. Werte beim Neugeborenen größer als 20 mg/dl weisen
unspezifisch auf eine intrauterine Infektion hin, was bei den Kindern von S8, S10 und S14
der Fall ist. Erhöhte IgM-Konzentrationen der Serumpaare S2, S10, S14, S21 lassen dabei
unspezifisch auf eine akute Infektion bei den Müttern schließen. Die Schwankungen der
Konzentrationen bei den Kindern sind relativ gering, gehen aber teilweise mit der
Erhöhung der mütterlichen Antikörperkonzentrationen einher.
Abbildung 6 stellt die lasernephelometrisch bestimmten IgM-Konzentrationen bei 23
Mutter/Kind-Serumpaaren dar. Bei S10 zeigt die Mutter und bei S8 das Kind eine um mehr
als das zweifache der Standardabweichung höhere IgM-Konzentration als der Mittelwert
des Vergleichskollektives. Dabei finden sich bei S10 auch beim Kind, bei S2 und S21 bei
der Mutter und bei S14 bei Mutter und Kind eine um mehr als das einfache der
Standardabweichung höhere IgM-Konzentration.
43
Betrachtet man hier die Unterschiede der IgM-Konzentration der einzelnen Serumpaare
miteinander, so läßt sich eindeutig feststellen, daß alle IgM-Konzentrationen der Mütter
weit über denen der Kinder liegen. Sehr deutlich zeigt sich dieses bei Serumpaar S10 mit
einem Unterschied in der IgM-Konzentration größer als die zweifache und bei den
Serumpaaren S2, S14 und S21 mit einer Differenz größer als die einfache
Standardabweichung vom Gesamtkollektiv.
M u tt e r
Ig M - N e p h e lo m e t r ie
K in d /N S
400
350
Konzentration mg/dl
300
250
200
150
100
50
0
2
3
5
6
7
8
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
26
27
S e ru m p a a r
Abb. 6: Lasernephelometrisch bestimmte IgM-Konzentrationen in mg/dl bei 23 Mutter/Kind-Serumpaaren
44
3.2 Die neutralisierende Aktivität der Serumantikörper gegen RSV
Zur Untersuchung der 27 Serumpaare auf die neutralisierenden Eigenschaften der
Antikörper gegen RSV wird ein Mikro-Neutralisationstest durchgeführt und die
neutralisierende Aktivität anhand von Titerstufen ermittelt und miteinander verglichen.
3.2.1 Titerstufen RSV-neutralisierender Antikörper
Abbildung 7 stellt die Neutralisationsstufen der 27 Mutter/Kind-Serumpaare gegen RSV
im RSV-Mikroneutralisationstest dar. Es zeigt sich, daß fast alle Seren RSV in vitro
neutralisieren. Nur bei Serum 26 ist bei Mutter und Kind eine schwache neutralisierende
Aktivität gegen RSV auszumachen. Bei S5 zeigen Mutter und Kind und bei S2 das Kind
eine deutliche neutralisierende Aktivität bis größer sechs Titerstufen.
M - T it e r s t u f e
R S V - M ik r o n e u t r a lis a t io n s t e s t
K - T it e r s tu f e
9
8
7
Titerstufen
6
5
4
3
2
1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
S e ru m p a a r
Abb.
7:
Neutralisationstiterstufen
der
27
Mutter/Kind-Serumpaare
Mikroneutralisationstest
45
gegen
RSV
im
RSV-
3.2.2 Unterschiede in den Titerstufen RSV-neutralisierender Antikörper
Abbildung 8 stellt die Unterschiede der Neutralisationstiterstufen zwischen Mutter und
Kind gegen RSV im RSV-Mikroneutralisationstest dar. Es stellen sich in vitro keine
Unterschiede in der Titerstufe von RSV-neutralisierenden Antikörpern dar. Tendentiell
liegen die Werte im Bereich der Meßgenauigkeit, wenn man eine Schwankung von einer
Titerstufe zugrunde legt. Lediglich bei Serum 20 ist die Titerstufe des Kindes um zwei
höher als bei der Mutter.
R S V - M ik r o n e u t r a lis a t io n s t e s t
T it e r s t u f e K - M
2 ,5
2
Titerstufendifferenz
1 ,5
1
0 ,5
0
- 0 ,5
-1
- 1 ,5
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
S eru m p aar
Abb. 8: Unterschiede der Neutralisationstiterstufen zwischen Mutter und Kind gegen RSV im RSVMikroneutralisationstest
46
3.3 Die Immunantwort gegen RSV
Zur Untersuchung der Summe der gegen RSV gerichteten Antikörper der 27 Mutter/KindSerumpaare wird ein RSV-spezifischer ELISA mit Gesamt-Immunglobulin (IgG, IgA und
IgM), IgG und IgM durchgeführt. Zum Vergleich der Reaktionsstärke der Seren von
Mutter und Kind und zu den anderen Seren im Kollektiv werden die Standardabweichung
und die Mittelwerte berechnet. Der Mittelwert beim RSV-spezifischen ELISA mit
IgGesamt liegt bei bei den Müttern bei 0,077 mit einer Standardabweichung von 0,035 und
bei den Kindern bei 0,096 mit einer Standardabweichung von 0,039.
3.3.1 Signalstärke der einzelnen Serumpaare im RSV-ELISA
Abbildung 9 stellt die Signalstärke im RSV-spezifischen ELISA mit Antikörpern der
Gesamt (IgG, IgA, IgM)-, der IgG-, und der IgM-Immunglobulinklassen der Serumpaare
S1-S27 bei der Serumverdünnung 1/500 dar.
Es ist bei allen Serumpaaren eine deutliche Reaktion der Antikörper der GesamtImmunglobulinklassen gegen RSV zu erkennen. Nur das Serumpaar S26 zeigt eine
schwache Reaktion, beim Kind um mehr als zwei und bei der Mutter um mehr als eine
Standardabweichung geringer im Vergleich zum jeweiligen Gesamtkollektiv. Mehr als
eine Standardabweichung geringer im Vergleich zum Kollektiv reagieren auch das
mütterliche Serum 19 und die kindlichen Seren S8, S11 und S15. Eine sehr starke Aktivität
größer als die zweifache Standardabweichung zeigen Mutter und Kind des Serumpaares
S27 und das Kind bei S2, wobei die Mutter ebenfalls eine Reaktion größer der einfachen
Standardabweichung zeigt. Eine starke Aktivität größer einer Standardabweichung zeigt
die Mutter des Serumpaares S4 sowie die Kinder der Serumpaare S3, S5 und S25. Beim
Vergleich der Gruppen unter Anwendung eines T-Tests für gepaarte Stichproben zeigt
sich, daß der Unterschied zwischen Mutter und Kind signifikant ist (P = 3,88 x 10-5).
Bei den Antikörpern der IgG-Immunglobulinklasse liegt der Mittelwert bei den Müttern
bei 0,193 mit einer Standardabweichung von 0,06 und bei den Kindern bei 0,176 mit einer
Standardabweichung von 0,093. Bei den IgG-Immunglobulinklassen erkennt man eine
deutliche Reaktion fast aller Seren gegen RSV. Betrachtet man die Signalstärke im
Vergleich zum jeweiligen Gesamtkollektiv, so zeigt die Mutter bei Serumpaar S11, S14
und S26 und das Kind bei S12, S22, S26 und S27 eine mehr als die Standardabweichung
geringere Reaktion. Bei S27 zeigt die Mutter, bei S5 das Kind und bei S2 und S25 Mutter
und Kind eine stärkere Reaktion. Beim Vergleich der Gruppen unter Anwendung eines T47
Tests für gepaarte Stichproben zeigt sich, daß der Unterschied nicht signifikant ist (P =
0,265).
Bei den Antikörpern der IgM-Immunglobulinklasse liegt der Mittelwert bei den Müttern
bei 0,016 mit einer Standardabweichung von 0,019 und bei den Kindern bei 0,0005 mit
einer Standardabweichung von 0,0008. Beim Auftragen der Signalstärke der Seren mit der
Immunglobulinklasse IgM erkennt man fast keine Reaktion der kindlichen Seren, viele
mütterliche Seren reagieren dagegen sehr stark mit IgM gegen RSV. Mit einer
Abweichung größer der Standardabweichung im Vergleich zum Gesamtkollektiv reagieren
die mütterlichen Seren S7, S21 und S22, schwächer reagieren S4, S12, S13, S18 und S27.
Beim Vergleich der Gruppen unter Anwendung eines T-Tests für gepaarte Stichproben
zeigt sich, daß der Unterschied signifikant ist (P = 0,00029).
48
M u tte r
R S V -E L IS A Ig G e s a m t
K in d /N S
0 ,2
0 ,1 8
Absorption (492nm)
0 ,1 6
0 ,1 4
0 ,1 2
0 ,1
0 ,0 8
0 ,0 6
0 ,0 4
0 ,0 2
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
S eru m p a ar
M u tte r
R S V -E L IS A Ig G
K in d /N S
0 ,5
0 ,4 5
Absorption (492nm)
0 ,4
0 ,3 5
0 ,3
0 ,2 5
0 ,2
0 ,1 5
0 ,1
0 ,0 5
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
S eru m p a ar
M u tte r
R S V -E L IS A Ig M
K in d /N S
0 ,0 9
0 ,0 8
Absorption (492nm)
0 ,0 7
0 ,0 6
0 ,0 5
0 ,0 4
0 ,0 3
0 ,0 2
0 ,0 1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
-0 ,0 1
S e ru m p aa r
Abb. 9: Signalstärke im RSV-spezifischen ELISA mit Antikörpern der IgGesamt (IgG, IgA, IgM)-, IgG-,
und IgM-Immunglobulinklassen von 27 Mutter/Kind-Serumpaaren S1-S27 bei der Serumverdünnung 1/500
(492nm)
49
3.3.2 Unterschiede der Signalstärke zwischen Mutter und Kind im RSV-ELISA
Vergleicht man die IgGesamt-Signalstärke der Seren untereinander und berechnet die
Standardabweichung und den Mittelwert der Differenzen, so läßt sich im Vergleich zu den
anderen Seren folgendes feststellen:
Abbildung 10 stellt die errechneten Signalstärkedifferenzen im RSV-spezifischen ELISA
mit Antikörpern der IgGesamt (IgG, IgA, IgM)-, IgG und IgM-Immunglobulinklassen der
Serumpaare S1-S27 bei der Serumverdünnung 1/500 dar.
Es ist zu erkennen, daß 22 von 27 kindlichen Seren (81,5 %) stärker mit IgGesamtAntikörpern auf RSV reagieren, als die mütterlichen Seren. Der Mittelwert der
Signalstärkedifferenzen mit IgGesamt liegt bei 0,019 mit einer Standardabweichung von
0,02. Sehr starke Unterschiede in der Aktivität der Antikörper gegen RSV findet sich bei
S3 mit einem Unterschied von größer zwei Standardabweichungen zum Mittelwert der
Differenzen zwischen Mutter und Kind und starke Unterschiede größer als eine
Standardabweichung bei S2, S5, S6, S19 und S25 wobei jeweils die Kinder stärker
reagieren und bei S4, S9, S10, S26 und S27 mit einer stärkeren Reaktion der mütterlichen
Seren.
Der Mittelwert der Signalstärkedifferenzen mit IgG liegt bei -0,017 mit einer
Standardabweichung von 0,077. Es zeigt sich eine stärkere Reaktion des Kindes mit einem
Unterschied von größer einer Standardabweichung zum Mittelwert der Differenzen
zwischen Mutter und Kind bei S25 und eine schwächere bei S12, S18 und S22. Bei S27 ist
die Reaktion der Mutter größer drei Standardabweichungen stärker als die des Kindes.
Der Mittelwert der Signalstärkedifferenzen mit IgM liegt bei -0,015 mit einer
Standardabweichung von 0,019. Es läßt sich ein deutliches Überwiegen der mütterlichen
Reaktionen erkennen. Sehr starke Unterschiede in der Aktivität gegen RSV finden sich bei
S7, S21 und S2 mit einem Unterschied von größer einer Standardabweichung zum
Mittelwert der Differenzen zwischen Mutter und Kind mit stärkerer Reaktion der Mutter.
50
R S V -E lis a Ig G e s a m t
K - M
0 ,0 7
Absorptionsdifferenz (492nm)
0 ,0 6
0 ,0 5
0 ,0 4
0 ,0 3
0 ,0 2
0 ,0 1
0
-0 ,0 1
-0 ,0 2
-0 ,0 3
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
S e ru m p aa r
R S V -E L IS A Ig G
K - M
0 ,1 5
Absorptionsdifferenz (492nm)
0 ,1
0 ,0 5
0
-0 ,0 5
-0 ,1
-0 ,1 5
-0 ,2
-0 ,2 5
-0 ,3
-0 ,3 5
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
26
27
S eru m p aar
K - M
R S V -E L IS A Ig M
0
Absorptionsdifferenz (492nm)
-0 ,0 1
-0 ,0 2
-0 ,0 3
-0 ,0 4
-0 ,0 5
-0 ,0 6
-0 ,0 7
-0 ,0 8
-0 ,0 9
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
S eru m p aar
Abb. 10: Errechnete Signalstärkedifferenzen im RSV-spezifischen ELISA mit Antikörpern der IgGesamt
(IgG, IgA, IgM)-, IgG- und IgM-Immunglobulinklassen von 27 Mutter/Kind-Serumpaaren S1-S27 bei der
Serumverdünnung 1/500 (492nm)
51
3.3.3 Immunreaktionen der einzelnen Serumpaare mit IgG gegen RSV im Immunoblot
Die durchgeführte SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese mit anschließendem Western-Blot
zum Nachweis RSV-spezifischer Antikörper der Gruppe IgG zeigt unter Auswertung der
Befunde anhand der mitgelaufenen Negativkontrolle als innere Referenz keine
Unterschiede in der Reaktion zwischen mütterlichen und kindlichen Seren.
3.3.4 Vergleich der Immunreaktion der einzelnen Serumpaare gegen die einzelnen
synthetischen Peptide
Zum Vergleich der Reaktionsstärke der Seren von Mutter und Kind und zu den anderen
Seren im Kollektiv werden die Standardabweichung und die Mittelwerte berechnet. Die
Ergebnisse lassen sich wie folgt darstellen:
SP1
Abbildung 11 stellt die Signalstärke im SP-spezifischen ELISA gegen das synthetische
Peptid SP1 aus der Sequenz des RSV-G-Proteins mit IgGesamt (IgG, IgA, IgM), IgG und
IgM-Antikörpern von 27 Mutter/Kind-Serumpaaren bei der Serumverdünnung 1/500 dar.
Es findet sich beim SP1-spezifischen ELISA bei den Müttern mit IgGesamt ein Mittelwert
von 0,747 mit einer Standardabweichung von 0,776, mit IgG ein Mittelwert von 0,462 mit
einer Standardabweichung von 0,378, und mit IgM ein Mittelwert von 0,414 mit einer
Standardabweichung von 0,361. Bei den Kindern findet sich mit IgGesamt ein Mittelwert
von 0,754 bei einer Standardabweichung von 0,784, mit IgG ein Mittelwert von 0,493 bei
einer Standardabweichung von 0,427, und mit IgM ein Mittelwert von 0,024 bei einer
Standardabweichung von 0,012.
In der Summe über alle Seren zeigen sich relativ starke Reaktionen bei mütterlichen und
kindlichen Seren mit IgG gegen SP1, eine deutliche Reaktion der mütterlichen IgM und
eine leichte Reaktion der kindlichen IgM gegen dieses Peptid. Der Unterschied in der
Reaktion zwischen Mutter und Kind mit IgG ist sehr gering. Lediglich beim IgM liegt ein
signifikanter Unterschied vor. Bei den Serumpaaren S2, S6, S14, S16 und S26 zeigt sich
eine verstärkte IgG-Reaktion von Mutter und Kind gegen SP1. Bei S6 ist die IgG-Aktivität
des Kindes, bei S14 und S16 die der Mutter größer, bei S2 und S6 spielt auch eine IgAAntwort der Mutter eine Rolle. Bei S18 und S19 findet sich eine deutliche IgA-Antwort
des Kindes gegen diese G-Proteinsequenz. S17 fällt durch eine relativ starke Reaktion
durch mütterliches IgM auf.
52
SP1
M u tte r
S P 1 -E L IS A Ig G e s a m t
K in d /N S
3 ,5
Absorption (492nm)
3
2 ,5
2
1 ,5
1
0 ,5
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11 12
13 14 15 16 17
S e ru m p a a r
18
19
20 21
22
23
24
25 26
27
M u tte r
S P 1 -E L IS A Ig G
K in d /N S
1 ,8
1 ,6
Absorption (492nm)
1 ,4
1 ,2
1
0 ,8
0 ,6
0 ,4
0 ,2
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12 13 14 15 16
S e ru m p a a r
17
18 19
20 21
22
23 24
25
26 27
M u tte r
S P 1 -E L IS A Ig M
K in d /N S
1 ,6
Absorption (492nm)
1 ,4
1 ,2
1
0 ,8
0 ,6
0 ,4
0 ,2
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11
12
13 14 15 16
S e ru m p a a r
17 18
19
20
21
22
23
24 25
26
27
Abb. 11: Signalstärke im SP-spezifischen ELISA gegen das synthetische Peptid SP1 aus der Sequenz des
RSV-G-Proteins mit IgGesamt (IgG, IgA, IgM), IgG und IgM-Antikörpern von 27 Mutter/KindSerumpaaren bei der Serumverdünnung 1/500 (492nm)
53
SP2
Abbildung 12 stellt die Signalstärke im SP-spezifischen ELISA gegen das synthetische
Peptid SP2 aus der Sequenz des RSV-G-Proteins mit IgGesamt (IgG, IgA, IgM), IgG und
IgM-Antikörpern von 27 Mutter/Kind-Serumpaaren bei der Serumverdünnung 1/500 dar.
Es findet sich beim SP2-spezifischen ELISA bei den Müttern mit IgGesamt ein Mittelwert
von 0,982 mit einer Standardabweichung von 0,410, mit IgG ein Mittelwert von 0,674 mit
einer Standardabweichung von 0,206, und mit IgM ein Mittelwert von 1,014 mit einer
Standardabweichung von 0,631. Bei den Kindern findet sich mit IgGesamt ein Mittelwert
von 0,875 bei einer Standardabweichung von 0,361, mit IgG ein Mittelwert von 0,659 bei
einer Standardabweichung von 0,252, und mit IgM ein Mittelwert von 0,111 bei einer
Standardabweichung von 0,067.
In den Untersuchungen zeigen die Mütter und Kinder mit IgG und IgM und die Mütter mit
IgM in der Summe eine starke Reaktion gegen dieses Peptid. Die Reaktion der Mütter mit
IgM ist deutlich stärker als beim Kind. Dieser Unterschied ist signifikant. Mütterliche und
kindliche Seren zeigen beim IgG eine gleich starke Reaktion. Auffallend bei SP2 ist die
Reaktion des Serumpaares S19 gegenüber dem Kollektiv, bei dem die Mutter überwiegend
mit IgA und das Kind deutlich stärker mit IgG reagiert. Eine verstärkte IgG-Antwort des
Kindes findet sich bei S19, S2 und S10, eine IgG-Antwort der Mutter bei S16, eine IgAAntwort des Kindes bei S19 und eine IgA-Antwort der Mutter bei S8. Bei S6 und
angedeutet bei S10 liegt eine stärkere Aktivität beim kindlichen IgG vor. Bei der
deutlichen IgM-Antwort der Mutter von S8 ist keine vermehrte Reaktion des Kindes gegen
das SP2 zu erkennen.
54
SP2
M u tte r
S P 2 -E L IS A Ig G e s a m t
K in d /N S
3
Absorption (492nm)
2 ,5
2
1 ,5
1
0 ,5
0
9
7
5
3
1
15
13
S e ru m p a a r
11
23
21
19
17
27
25
M u tte r
S P 2 -E L IS A Ig G
K in d /N S
1 ,4
Absorption (492nm)
1 ,2
1
0 ,8
0 ,6
0 ,4
0 ,2
0
3
2
1
9
8
7
6
5
4
10
11
12
13 14 15 16
S e ru m p a a r
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
M u tte r
S P 2 -E L IS A Ig M
K in d /N S
3
Absorption (492nm)
2 ,5
2
1 ,5
1
0 ,5
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11
12
13 14 15 16
S e ru m p a a r
17 18
19
20
21
22
23
24 25
26
27
Abb. 12: Signalstärke im SP-spezifischen ELISA gegen das synthetische Peptid SP2 aus der Sequenz des
RSV-G-Proteins mit IgGesamt (IgG, IgA, IgM), IgG und IgM-Antikörpern von 27 Mutter/KindSerumpaaren bei der Serumverdünnung 1/500 (492nm)
55
SP3
Abbildung 13 stellt die Signalstärke im SP-spezifischen ELISA gegen das synthetische
Peptid SP3 aus der Sequenz des RSV-G-Proteins mit IgGesamt (IgG, IgA, IgM), IgG und
IgM-Antikörpern von 27 Mutter/Kind-Serumpaaren bei der Serumverdünnung 1/500 dar.
Es findet sich beim SP3-spezifischen ELISA bei den Müttern mit IgGesamt ein Mittelwert
von 0,504 mit einer Standardabweichung von 0,102, mit IgG ein Mittelwert von 0,470 mit
einer Standardabweichung von 0,083, und mit IgM ein Mittelwert von 0,687 mit einer
Standardabweichung von 0,734. Bei den Kindern findet sich mit IgGesamt ein Mittelwert
von 0,445 bei einer Standardabweichung von 0,078, mit IgG ein Mittelwert von 0,444 bei
einer Standardabweichung von 0,086, und mit IgM ein Mittelwert von 0,061 bei einer
Standardabweichung von 0,047.
Es zeigt sich eine deutliche Reaktion der mütterlichen und kindlichen Seren mit IgG,
wobei keine großen Differenzen zwischen Mutter und Kind mit IgG festzustellen sind und
eine deutliche Aktivität der mütterlichen IgM. Mit IgM reagieren die Mütter stärker als die
Kinder. Der Unterschied bei IgM ist signifikant. Auffällig sind beim SP3 die hohen
Aktivitäten der mütterlichen IgM bei S2, S26 und S27, ansonsten finden sich keine
Auffälligkeiten im Vergleich zum Kollektiv.
56
SP3
M u tte r
S P 3 -E L IS A Ig G e s a m t
K in d /N S
0 ,8
Absorption (492nm)
0 ,7
0 ,6
0 ,5
0 ,4
0 ,3
0 ,2
0 ,1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11
12
13 14 15 16
S e ru m p a a r
17 18
19
20
21
22
23
24 25
26
27
M u tte r
S P 3 -E L IS A Ig G
K in d /N S
0 ,7
Absorption (492nm)
0 ,6
0 ,5
0 ,4
0 ,3
0 ,2
0 ,1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13 14 15 16
S e ru m p a a r
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
M u tte r
S P 3 -E L IS A Ig M
K in d /N S
3 ,5
Absorption (492nm)
3
2 ,5
2
1 ,5
1
0 ,5
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11
12
13 14 15 16
S e ru m p a a r
17 18
19
20
21
22
23
24 25
26
27
Abb. 13: Signalstärke im SP-spezifischen ELISA gegen das synthetische Peptid SP3 aus der Sequenz des
RSV-G-Proteins mit IgGesamt (IgG, IgA, IgM), IgG und IgM-Antikörpern von 27 Mutter/KindSerumpaaren bei der Serumverdünnung 1/500 (492nm)
57
SP4
Abbildung 14 stellt die Signalstärke im SP-spezifischen ELISA gegen das synthetische
Peptid SP4 aus der Sequenz des RSV-G-Proteins mit IgGesamt (IgG, IgA, IgM), IgG und
IgM-Antikörpern von 27 Mutter/Kind-Serumpaaren bei der Serumverdünnung 1/500 dar.
Es findet sich beim SP4-spezifischen ELISA bei den Müttern mit IgGesamt ein Mittelwert
von 0,251 mit einer Standardabweichung von 0,097, mit IgG ein Mittelwert von 0,352 mit
einer Standardabweichung von 0,096, und mit IgM ein Mittelwert von 0,642 mit einer
Standardabweichung von 0,489. Bei den Kindern findet sich mit IgGesamt ein Mittelwert
von 0,182 bei einer Standardabweichung von 0,091, mit IgG ein Mittelwert von 0,334 bei
einer Standardabweichung von 0,079, und mit IgM ein Mittelwert von 0,027 bei einer
Standardabweichung von 0,018.
Es zeigt sich eine mäßig starke Reaktion der mütterlichen und kindlichen Seren mit IgG
gegen RSV, wobei keine großen Differenzen zwischen Mutter und Kind mit IgG
festzustellen sind und eine deutliche Aktivität der Mutter mit IgM. Mit IgM reagieren die
Mütter stärker als die Kinder. Der Unterschied bei IgM ist signifikant. Bei SP4 reagieren
einige Seren auffällig. Die Mütter von S2, S4, S14 und S26 zeigen eine recht deutliche
Reaktion mit IgM und bei S4 und S14 auch mit IgG. Eine stärkere Reaktion zeigt die
Mutter von S6 mit IgA und das Kind von S6 mit IgG. Bei S17 zeigt die Mutter im
Vergleich zum Kollektiv und zum Kind eine ausgeprägte Reaktion mit IgM, das Kind
reagiert dazu im Gegensatz ausgeprägt mit IgG. Das Kind von S15 reagiert deutlich mit
IgA gegen SP4. Bei S19 zeigt die Mutter eine starke IgM-Antwort, ohne Auffälligkeiten
beim Kind.
58
SP4
M u tte r
S P 4 -E L IS A Ig G e s a m t
K in d /N S
0 ,5
0 ,4 5
Absorption (492nm)
0 ,4
0 ,3 5
0 ,3
0 ,2 5
0 ,2
0 ,1 5
0 ,1
0 ,0 5
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27
S e ru m p a a r
M u tte r
S P 4 -E L IS A Ig G
K in d /N S
0 ,6
Absorption (492nm)
0 ,5
0 ,4
0 ,3
0 ,2
0 ,1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13 14 15 16
S e ru m p a a r
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
M u tte r
S P 4 -E L IS A Ig M
K in d /N S
2
1 ,8
Absorption (492nm)
1 ,6
1 ,4
1 ,2
1
0 ,8
0 ,6
0 ,4
0 ,2
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16 17 18
S e ru m p a a r
19 20 21 22
23 24 25 26 27
Abb. 14: Signalstärke im SP-spezifischen ELISA gegen das synthetische Peptid SP4 aus der Sequenz des
RSV-G-Proteins mit IgGesamt (IgG, IgA, IgM), IgG und IgM-Antikörpern von 27 Mutter/KindSerumpaaren bei der Serumverdünnung 1/500 (492nm)
59
SP5
Abbildung 15 stellt die Signalstärke im SP-spezifischen ELISA gegen das synthetische
Peptid SP5 aus der Sequenz des RSV-G-Proteins mit IgGesamt (IgG, IgA, IgM), IgG und
IgM-Antikörpern von 27 Mutter/Kind-Serumpaaren bei der Serumverdünnung 1/500 dar.
Es findet sich beim SP5-spezifischen ELISA bei den Müttern mit IgGesamt ein Mittelwert
von 0,315 mit einer Standardabweichung von 0,200, mit IgG ein Mittelwert von 0,309 mit
einer Standardabweichung von 0,108, und mit IgM ein Mittelwert von 0,268 mit einer
Standardabweichung von 0,144. Bei den Kindern findet sich mit IgGesamt ein Mittelwert
von 0,253 bei einer Standardabweichung von 0,142, mit IgG ein Mittelwert von 0,346 bei
einer Standardabweichung von 0,231, und mit IgM ein Mittelwert von 0,028 bei einer
Standardabweichung von 0,026.
Es zeigen sich mässig starke Reaktionen der mütterlichen und der kindlichen IgG
gegenüber diesem Peptid, etwas stärker durch die kindlichen Seren. Es zeigt sich eine
relativ schwache Erkennung durch mütterliche IgM. Auffallend stark im Vergleich zum
Kollektiv reagieren die Mütter und Kinder von S6 und von S26 mit IgA mit deutlichem
Überwiegen der mütterlichen Aktivität, wobei S6 auch eine mässig starke Reaktion mit
IgG bei Mutter und Kind zeigt. Hierbei reagiert die Mutter allerdings etwas stärker als das
Kind. Bei S26 zeigen Mutter und Kind eine deutliche IgA-Antwort, wobei die Mutter auch
mit IgM reagiert. Die Mutter von S21 zeigt eine ausgeprägte IgM-Antwort. Auffallend ist
eine sehr starke Reaktion des Kindes mit IgG bei S12, ohne auch nur eine geringe
Erhöhung der IgGesamt-Aktivität.
60
SP5
M u tte r
S P 5 -E L IS A Ig G e s a m t
K in d /N S
1 ,2
Absorption (492nm)
1
0 ,8
0 ,6
0 ,4
0 ,2
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12
13 14 15 16 17 18
S e ru m p a a r
19 20 21
22 23 24
25 26 27
M u tte r
S P 5 -E L IS A Ig G
K in d /N S
1 ,6
Absorption (492nm)
1 ,4
1 ,2
1
0 ,8
0 ,6
0 ,4
0 ,2
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11
12
13 14 15 16
S e ru m p a a r
17 18
19
20
21
22
23
24 25
26
27
25 26
27
M u tte r
S P 5 -E L IS A Ig M
K in d /N S
0 ,7
Absorption (492nm)
0 ,6
0 ,5
0 ,4
0 ,3
0 ,2
0 ,1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11
12
13 14 15 16
S e ru m p a a r
17 18
19
20
21 22
23
24
Abb. 15: Signalstärke im SP-spezifischen ELISA gegen das synthetische Peptid SP5 aus der Sequenz des
RSV-G-Proteins mit IgGesamt (IgG, IgA, IgM), IgG und IgM-Antikörpern von 27 Mutter/KindSerumpaaren bei der Serumverdünnung 1/500 (492nm)
61
SP6
Abbildung 16 stellt die Signalstärke im SP-spezifischen ELISA gegen das synthetische
Peptid SP6 aus der Sequenz des RSV-F-Proteins mit IgGesamt (IgG, IgA, IgM), IgG und
IgM-Antikörpern von 27 Mutter/Kind-Serumpaaren bei der Serumverdünnung 1/500 dar.
Es findet sich beim SP6-spezifischen ELISA bei den Müttern mit IgGesamt ein Mittelwert
von 0,708 mit einer Standardabweichung von 0,748, mit IgG ein Mittelwert von 0,419 mit
einer Standardabweichung von 0,311, und mit IgM ein Mittelwert von 0,242 mit einer
Standardabweichung von 0,205. Bei den Kindern findet sich mit IgGesamt ein Mittelwert
von 0,716 bei einer Standardabweichung von 0,737, mit IgG ein Mittelwert von 0,443 bei
einer Standardabweichung von 0,357, und mit IgM ein Mittelwert von 0,024 bei einer
Standardabweichung von 0,015.
Es finden sich relativ starke Reaktionen mit IgG in der Summe der mütterlichen und
kindlichen Seren gegen SP6, jedoch kaum ein Unterschied zwischen Müttern und Kindern.
Mit IgM reagieren die mütterlichen Seren etwas stärker als die kindlichen. Auffallend stark
reagieren Mütter und Kinder der Seren S14 und S16 mit IgG, mit einer stärkeren Reaktion
der Mütter. Sehr stark im Vergleich zum Kollektiv und zu den Kindern sind auch die IgMAktivitäten der Mütter gegen SP6, so daß von einer Immunreaktion der Mütter mit IgG
und IgM und der Kinder mit IgG auszugehen ist. Bei den Seren S2 und S26 reagieren die
Kinder deutlich stärker mit IgG im Vergleich zum Kollektiv und die Mütter mit IgG und
IgM. Bei S6, S18 und S19 zeigen die Kinder eine im Vergleich zum Kollektiv deutliche
und die Mütter eine gering erhöhte IgG- und IgA-Antwort. S17 zeigt außer einer
deutlichen IgM-Antwort der Mutter gegen SP6 keine Auffälligkeiten.
62
SP6
M u tte r
S P 6 -E L IS A Ig G e s a m t
K in d /N S
3 ,5
Absorption (492nm)
3
2 ,5
2
1 ,5
1
0 ,5
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11
12
13 14 15 16
S e ru m p a a r
17 18
19
20
21
22
23
24 25
26
27
26
27
26
27
M u tte r
S P 6 -E L IS A Ig G
K in d /N S
1 ,8
1 ,6
Absorption (492nm)
1 ,4
1 ,2
1
0 ,8
0 ,6
0 ,4
0 ,2
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11
12
13 14 15 16
S e ru m p a a r
17 18
19
20
21
22
23
24 25
M u tte r
S P 6 -E L IS A Ig M
K in d /N S
1
0 ,9
Absorption (492nm)
0 ,8
0 ,7
0 ,6
0 ,5
0 ,4
0 ,3
0 ,2
0 ,1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
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11
12
13 14 15 16
S e ru m p a a r
17
18
19
20
21
22
23
24
25
Abb. 16: Signalstärke im SP-spezifischen ELISA gegen das synthetische Peptid SP6 aus der Sequenz des
RSV-F-Proteins mit IgGesamt (IgG, IgA, IgM), IgG und IgM-Antikörpern von 27 Mutter/KindSerumpaaren bei der Serumverdünnung 1/500 (492nm)
63
SP7
Abbildung 17 stellt die Signalstärke im SP-spezifischen ELISA gegen das synthetische
Peptid SP7 aus der Sequenz des RSV-F-Proteins mit IgGesamt (IgG, IgA, IgM), IgG und
IgM-Antikörpern von 27 Mutter/Kind-Serumpaaren bei der Serumverdünnung 1/500 dar.
Es findet sich beim SP7-spezifischen ELISA bei den Müttern mit IgGesamt ein Mittelwert
von 0,219 mit einer Standardabweichung von 0,075, mit IgG ein Mittelwert von 0,336 mit
einer Standardabweichung von 0,284, und mit IgM ein Mittelwert von 0,304 mit einer
Standardabweichung von 0,183. Bei den Kindern findet sich mit IgGesamt ein Mittelwert
von 0,201 bei einer Standardabweichung von 0,077, mit IgG ein Mittelwert von 0,267 bei
einer Standardabweichung von 0,078, und mit IgM ein Mittelwert von 0,035 bei einer
Standardabweichung von 0,020.
Bei den IgG findet sich gegen SP7 eine deutliche, aber im Vergleich zu den anderen SP
noch im unteren Bereich liegende, Antwort von Mutter und Kind. Diese ist bei den
mütterlichen Seren deutlich stärker als bei den kindlichen. Mit IgM zeigen die
mütterlichen Seren eine relativ schwache Reaktion. Auffällig sind hier die Reaktionen von
S6, S7, S23 und S24 mit einer verstärkten IgA-Antwort der Kinder. Auffallend auch S2
mit starker IgM-Antwort der Mutter und einer spezifischen IgA-Antwort des Kindes. Bei
S26 reagiert die Mutter ausgeprägt mit IgA gegen SP7. Die ausgeprägte Antwort der
Mutter von S12 mit IgG gegen SP7 geht ohne Erhöhung der Aktivität mit IgGesamt einher,
was eine Fehlbestimmung nahelegt.
64
SP7
M u tte r
S P 7 -E L IS A Ig G e s a m t
K in d /N S
0 ,5
0 ,4 5
Absorption (492nm)
0 ,4
0 ,3 5
0 ,3
0 ,2 5
0 ,2
0 ,1 5
0 ,1
0 ,0 5
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27
S e ru m p a a r
M u tte r
S P 7 -E L IS A Ig G
K in d /N S
1 ,8
1 ,6
Absorption (492nm)
1 ,4
1 ,2
1
0 ,8
0 ,6
0 ,4
0 ,2
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11
12 13 14 15 16
S e ru m p a a r
17 18
19 20
21 22
23
24 25
26 27
M u tte r
S P 7 -E L IS A Ig M
K in d /N S
1
0 ,9
Absorption (492nm)
0 ,8
0 ,7
0 ,6
0 ,5
0 ,4
0 ,3
0 ,2
0 ,1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11
12
13 14 15 16
S e ru m p a a r
17 18
19
20
21
22
23
24 25
26
27
Abb. 17: Signalstärke im SP-spezifischen ELISA gegen das synthetische Peptid SP7 aus der Sequenz des
RSV-F-Proteins mit IgGesamt (IgG, IgA, IgM), IgG und IgM-Antikörpern von 27 Mutter/KindSerumpaaren bei der Serumverdünnung 1/500 (492nm)
65
SP8
Abbildung 18 stellt die Signalstärke im SP-spezifischen ELISA gegen das synthetische
Peptid SP8 aus der Sequenz des RSV-M-Proteins mit IgGesamt (IgG, IgA, IgM), IgG und
IgM-Antikörpern von 27 Mutter/Kind-Serumpaaren bei der Serumverdünnung 1/500 dar.
Es findet sich beim SP8-spezifischen ELISA bei den Müttern mit IgGesamt ein Mittelwert
von 0,502 mit einer Standardabweichung von 0,405, mit IgG ein Mittelwert von 0,426 mit
einer Standardabweichung von 0,228, und mit IgM ein Mittelwert von 0,318 mit einer
Standardabweichung von 0,245. Bei den Kindern findet sich mit IgGesamt ein Mittelwert
von 0,499 bei einer Standardabweichung von 0,411, mit IgG ein Mittelwert von 0,411 bei
einer Standardabweichung von 0,210, und mit IgM ein Mittelwert von 0,024 bei einer
Standardabweichung von 0,011.
Gegen das Peptid SP8 zeigen mütterliche und kindliche Serumantikörper eine mässig
starke Reaktion. Es finden sich keine Differenzen zwischen Müttern und Kindern, das IgM
der Mütter zeigt eine schwache Reaktion. Eine im Vergleich zum Kollektiv deutliche IgGund IgM-Antwort der Mutter und IgG-Antwort des Kindes zeigen die Serumpaare S14,
S16, S2 und S26. Bei S17 und S18 zeigen die Kinder eine im Vergleich zum Kollektiv und
zu den Müttern deutliche IgA-Antwort und bei S6 die Mutter eine etwas verstärkte und das
Kind eine deutlich verstärkte IgG- und IgA-Antwort.
66
SP8
M u tte r
S P 8 -E L IS A Ig G e s a m t
K in d /N S
2 ,5
Absorption (492nm)
2
1 ,5
1
0 ,5
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11
12
13 14 15 16
S e ru m p a a r
17 18
19
20
21 22
23
24
25 26
27
M u tte r
S P 8 -E L IS A Ig G
K in d /N S
1 ,4
Absorption (492nm)
1 ,2
1
0 ,8
0 ,6
0 ,4
0 ,2
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12 13 14 15 16
S e ru m p a a r
17
18 19
20 21
22
23 24
25
26 27
M u tte r
S P 8 -E L IS A Ig M
K in d /N S
1 ,2
Absorption (492nm)
1
0 ,8
0 ,6
0 ,4
0 ,2
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11
12 13 14 15 16
S e ru m p a a r
17 18
19 20
21 22
23
24 25
26 27
Abb. 18: Signalstärke im SP-spezifischen ELISA gegen das synthetische Peptid SP8 aus der Sequenz des
RSV-M-Proteins mit IgGesamt (IgG, IgA, IgM), IgG und IgM-Antikörpern von 27 Mutter/KindSerumpaaren bei der Serumverdünnung 1/500 (492nm)
67
SP9
Abbildung 19 stellt die Signalstärke im SP-spezifischen ELISA gegen das synthetische
Peptid SP9 aus der Sequenz des RSV-M-Proteins mit IgGesamt (IgG, IgA, IgM), IgG und
IgM-Antikörpern von 27 Mutter/Kind-Serumpaaren bei der Serumverdünnung 1/500 dar.
Es findet sich beim SP9-spezifischen ELISA bei den Müttern mit IgGesamt ein Mittelwert
von 0,238 mit einer Standardabweichung von 0,119, mit IgG ein Mittelwert von 0,377 mit
einer Standardabweichung von 0,092, und mit IgM ein Mittelwert von 0,173 mit einer
Standardabweichung von 0,096. Bei den Kindern findet sich mit IgGesamt ein Mittelwert
von 0,212 bei einer Standardabweichung von 0,150, mit IgG ein Mittelwert von 0,365 bei
einer Standardabweichung von 0,091, und mit IgM ein Mittelwert von 0,026 bei einer
Standardabweichung von 0,015.
Gegen das Peptid SP9 zeigen mütterliche und kindliche Seren in der Summe eine mässig
starke Reaktion im Vergleich zu den anderen synthetische Peptiden. Es finden sich kaum
Differenzen zwischen Mutter und Kind, das IgM der Mütter zeigt eine schwache Reaktion.
Die Mutter von S2 reagiert verstärkt mit IgG und das Kind mit IgA. Bei S26 reagiert die
Mutter stärker mit IgG und IgM und das Kind mit IgG. Ein hohes IgM ist bei der Mutter
von S17 nachzuweisen, ohne Besonderheiten bei den anderen Werten.
68
SP9
M u tte r
S P 9 -E L IS A Ig G e s a m t
K in d /N S
1
0 ,9
Absorption (492nm)
0 ,8
0 ,7
0 ,6
0 ,5
0 ,4
0 ,3
0 ,2
0 ,1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12 13 14 15 16
S e ru m p a a r
17
18 19
20 21
22
23 24
25
26 27
M u tte r
S P 9 -E L IS A Ig G
K in d /N S
0 ,7
Absorption (492nm)
0 ,6
0 ,5
0 ,4
0 ,3
0 ,2
0 ,1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12 13 14 15 16
S e ru m p a a r
17
18 19
20 21
22
23 24
25
26 27
M u tte r
S P 9 -E L IS A Ig M
K in d /N S
0 ,6
Absorption (492nm)
0 ,5
0 ,4
0 ,3
0 ,2
0 ,1
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11
12
13 14 15 16
S e ru m p a a r
17 18
19
20
21 22
23
24
25 26
27
Abb. 19: Signalstärke im SP-spezifischen ELISA gegen das synthetische Peptid SP9 aus der Sequenz des
RSV-M-Proteins mit IgGesamt (IgG, IgA, IgM), IgG und IgM-Antikörpern von 27 Mutter/KindSerumpaaren bei der Serumverdünnung 1/500 (492nm)
69
SP10
Abbildung 20 stellt die Signalstärke im SP-spezifischen ELISA gegen das synthetische
Peptid SP10 aus der Sequenz des RSV-N-Proteins mit IgGesamt (IgG, IgA, IgM), IgG und
IgM-Antikörpern von 27 Mutter/Kind-Serumpaaren bei der Serumverdünnung 1/500 dar.
Es findet sich beim SP10-spezifischen ELISA bei den Müttern mit IgGesamt ein
Mittelwert von 0,303 mit einer Standardabweichung von 0,515, mit IgG ein Mittelwert von
0,302 mit einer Standardabweichung von 0,075, und mit IgM ein Mittelwert von 0,208 mit
einer Standardabweichung von 0,100. Bei den Kindern findet sich mit IgGesamt ein
Mittelwert von 0,171 bei einer Standardabweichung von 0,084, mit IgG ein Mittelwert von
0,266 bei einer Standardabweichung von 0,064, und mit IgM ein Mittelwert von 0,027 bei
einer Standardabweichung von 0,022.
Es zeigt sich eine mässig starke Reaktion der mütterlichen und der kindlichen
Serumantikörper in der Summe im Vergleich zu den anderen Peptiden. Das IgM der
Mütter reagiert stärker als das der Kinder aber relativ schwach im Vergleich zu den
anderen synthetischen Peptiden. Auffällig ist eine im Vergleich zum Kollektiv und zum
Kind sehr starke Reaktion der Mutter von S14 mit IgGesamt. Beim IgG läßt sich diese
verstärkte Reaktion nur ganz schwach nachweisen. Möglicherweise liegt hier zusätzlich
zur IgG- auch eine IgA-Reaktion der Mutter vor, vermutlich handelt es sich aber um eine
Fehlbestimmung.
70
SP10
M u tte r
S P 1 0 -E L IS A Ig G e s a m t
K in d /N S
3 ,5
Absorption (492nm)
3
2 ,5
2
1 ,5
1
0 ,5
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12 13 14 15 16
S e ru m p a a r
S P 1 0 -E L IS A Ig G
17
18 19
20 21
22
23 24
25
26 27
M u tte r
K in d /N S
0 ,5
0 ,4 5
Absorption (492nm)
0 ,4
0 ,3 5
0 ,3
0 ,2 5
0 ,2
0 ,1 5
0 ,1
0 ,0 5
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
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S e ru m p a a r
S P 1 0 -E L IS A Ig M
M u tte r
K in d /N S
0 ,5
0 ,4 5
Absorption (492nm)
0 ,4
0 ,3 5
0 ,3
0 ,2 5
0 ,2
0 ,1 5
0 ,1
0 ,0 5
0
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27
S e ru m p a a r
Abb. 20: Signalstärke im SP-spezifischen ELISA gegen das synthetische Peptid SP10 aus der Sequenz des
RSV-N-Proteins mit IgGesamt (IgG, IgA, IgM), IgG und IgM-Antikörpern von 27 Mutter/KindSerumpaaren bei der Serumverdünnung 1/500 (492nm)
71
3.4 Zusammenfassung und Interpretation der unterschiedlichen Reaktionen der
einzelnen Serumpaare
Im folgenden wird die Frage untersucht, ob die Abweichung der Reaktion des Kindes auf
ein Antigen dem Abweichen der Mutter im Vergleich zueinander und im Vergleich zum
Gesamtkollektiv folgt. Dazu werden die einzelnen Serumpaare bezüglich der einzelnen
Tests anhand der Standardabweichung untersucht und miteinander verglichen. Diese
Reaktionen werden dann über alle durchgeführten Tests beurteilt und nach den in Absatz
2.3.7 definierten Kriterien eingeteilt. Die Signifikanz der Unterschiede der Reaktionen
zwischen Mutter und Kind werden anhand des T-Tests für gepaarte Stichproben ermittelt.
S1
Die Immunglobulinkonzentrationen können bei S1 wegen zu aufgrund geringer
Materialmenge nicht bestimmt werden. Es finden sich relativ geringe Aktivitäten bei
Mutter und Kind mit IgGesamt und IgG gegen RSV und im spezifischen SP-ELISA,
ebenso gegen die einzelnen Peptidsequenzen von SP1 bis SP10. Es zeigt sich eine
ausgeprägte Reaktion der mütterlichen IgM-Antikörper gegen SP8, dem synthetischen
Peptid aus der Sequenz des M-Proteins. Relativ hohe IgM-Aktivität im Vergleich zum
Kollektiv zeigt die Mutter gegen die einzelnen Sequenzen des G-Proteins, des F-Proteins,
des M-Proteins und des N-Proteins von SP1 bis SP10. Gegen die M-Proteinsequenz SP9
reagiert die Mutter mit IgGesamt stärker als das Kind, was einer IgA-Antwort entspricht.
Bei diesem Paar liegt eine relativ spezifische Immunreaktion der Mutter gegen das RSV
und die oben genannten Proteine mit IgM vor, ohne eine verstärkte neutralisierende
Aktivität. Die deutliche Immunreaktion mit IgM ist gegen das M-Protein SP8 gerichtet, die
noch fehlende neutralisierende Aktivität ist möglicherweise durch die niedrige IgGAntwort bedingt. Das Kind zeigt keine verstärkte Immunreaktion.
S2
Bei S2 erkennt man beim Kind eine In-vitro-Neutralisation bis zur Titerstufe drei und bei
der Mutter bis zur Stufe zwei. Das Kind zeigt im Vergleich zu den anderen Seren eine
relativ hohe IgG-Konzentration, die Mutter dagegen eine hohe IgM-Konzentration. Im
Mikroneutralisationstest reagieren beide relativ gut. Auffällig ist eine deutlich grössere
Aktivität des kindlichen Serums im RSV-ELISA mit IgG, wobei das Kind deutlich stärker
reagiert. Die Mutter zeigt eine deutliche IgM-Reaktion gegen die Sequenzen der GProteine SP3 und SP4 und des F-Proteins SP7, wogegen das Kind eher eine IgG-Reaktion
gegen die Sequenz des G-Proteins SP1 und des F-Proteins SP6 zeigt. Für die Erkennung
72
der synthetischen Peptide scheint das IgG besonders wichtig zu sein wobei dieses beim
Kind unabhängig von der Mutter reagiert. Die Höhe der IgG-Konzentration geht mit einer
guten Aktivität im RSV-ELISA einher. Die Höhe der IgM-Konzentration der Mutter
nimmt einen Einfluß auf die Stärke der Erkennung der synthetischen Peptide vor allem aus
den Sequenzen der G- und F-Proteine. Eine deutliche Reaktion im RSV-ELISA geht mit
einer guten Erkennung der synthetischen Peptide einher. Es liegt eine relativ spezifische
Immunreaktion vor mit einer spezifischen IgM-Aktivität bei der Mutter gegen G- und FProteinsequenzen und beim Kind mit einer beginnenden spezifischen IgG-Antwort gegen
Sequenzen der G- und F-Proteine. Die Immunantwort im RSV-ELISA und die
neutralisierende Aktivität vor allem des Kindes sind gut.
S3
Beim Kind liegen relativ hohe IgG-Konzentrationen vor und im Vergleich zur Mutter eine
deutlich ausgeprägte IgG-Aktivität gegen RSV. Diese ist aber nicht besonders ausgeprägt
gegen einzelne SP. Diese Konstellation geht einher mit einer recht guten neutralisierenden
Aktivität bei Mutter und Kind, ansonsten aber unterdurchschnittlichen Reaktionen bei
Mutter und Kind. Bei S3 zeigt sich bei der Mutter im Vergleich zum Kollektiv und zum
Kind eine deutliche Erkennung der Sequenzen des G-Proteins SP4 und des N-Proteins
SP10 mit IgG. Es liegt eine relativ unspezifische, vermutlich diaplazentar übertragene
Antwort des Kindes mit relativ guter neutralisierender Aktivität und Erkennung des RSV
vor. Hierbei spielt möglicherweise auch das IgA eine Rolle.
S4
Die Immunglobulin-Konzentrationsbestimmung kann wegen zu geringer Mengen nicht
durchgeführt werden. Es zeigt sich eine durchschnittliche neutralisierende Aktivität bei
Mutter und Kind. Im RSV-ELISA zeigen Mutter und Kind eine im Vergleich zum
Kollektiv betrachtet deutliche Reaktion mit IgG und möglicherweise auch IgA. Bei allen
untersuchten Peptidsequenzen zeigt die Mutter im Vergleich zum Kollektiv eine etwas
erhöhte IgM-Aktivität und bei der G-Proteinsequenz SP4 eine erhöhte IgG-Aktivität.
Mutter und Kind reagieren stark mit IgG gegen die G-Proteinsequenz SP3. Die
neutralisierende Aktivität könnte durch die IgG-Immunantwort gegen die GProteinsequenz SP3 hervorgerufen werden.
73
S5
Bei S5 erkennt man ohne deutliche IgG- und IgM-Konzentrationserhöhung einen hohen
Neutralisationstiter bei Mutter und Kind. Auch im RSV-ELISA finden sich beim IgG
relativ hohe Aktivitäten, beim Kind ausgeprägter als bei der Mutter. Gegen die FProteinsequenz SP7 zeigt die Mutter eine höhere Aktivität mit IgM als das Kollektiv. Im
Vergleich zu den anderen Serumpaaren zeigen sich sonst keine Auffälligkeiten. Die Stärke
der Erkennung von synthetischen Peptiden hängt nicht direkt mit der RSV-Signalstärke
zusammen, da das Kind eine höhere RSV-ELISA-Aktivität aber eine geringere Erkennung
der synthetischen Peptide zeigt als die Mutter. Die hohe Neutralisationsfähigkeit geht nicht
einher mit einer spezifischen Erkennung einzelner Sequenzen der Proteine. Man kann also
keine Schlüsse von der Konzentration der IgG/IgM-Klassen oder von der RSV-ELISAAktivität auf die spezifische Aktivität gegen einzelne Sequenzen der Proteine G, F, M oder
N ziehen oder von diesen jeweils auf die Neutralisationsfähigkeit und auch nicht
umgekehrt. Bei S5 liegt eine relativ unspezifische „ausgereifte“ Immunantwort bei der
Mutter gegen RSV vor, die fast identisch auch beim Kind nachzuweisen ist und eine gute
Neutralisationsfähigkeit aufweist. Das deutet auf eine übertragene unspezifische
Immunabwehr hin, mit einer lediglich gering stärkeren Aktivität des IgG im RSV-ELISA.
S6
Das Serumpaar 6 zeigt beim Kind eine zum Gesamtkollektiv erhöhte IgG-Konzentration
die deutlich größer ist als die der Mutter. Im RSV-ELISA zeigt das Kind mit IgGesamt
eine höhere Aktivität einmal im Vergleich zur Mutter als auch zum Gesamtkollektiv, beim
IgG ist die Reaktion der Mutter größer und die des Kindes relativ schwach, was auf eine
IgG-Antwort des Kindes und eine IgA-Antwort der Mutter gegen RSV hinweist. Bei der
Erkennung der synthetischen Peptide SP1, SP2, SP4, SP5, SP6 und SP8 zeigen Mutter und
Kind eine deutlich höhere Aktivität im Gegensatz zum Gesamtkollektiv. Mit IgG zeigt das
Kind eine deutlich höhere Aktivität im Gegensatz zum Gesamtkollektiv und zur Mutter.
Bei einer relativ schwachen IgM-Reaktion der Mutter deutet dies auf eine IgG- und IgAReaktion der Mutter und eine deutliche IgG-Reaktion des Kindes hin. Das läßt beim Kind
auf eine spezifische Immunabwehr gegen die einzelnen Sequenzen der G-Proteine SP1,
SP2, SP4 und SP5, des F-Proteins SP6 und des M-Proteins SP8 durch IgG und bei der
Mutter gegen die der gleichen Proteine durch IgG und IgA schließen. Beim SP2 findet sich
dabei eine überwiegende IgG-Antwort des Kindes mit nur geringer Aktivität bei der
Mutter und bei SP5 eine ausgeprägte IgA-Antwort der Mutter. Ob diese kindliche Antwort
von der Mutter selektiv übertragen oder durch das Kind selber produziert und ob ein
74
geringer Anteil der kindlichen Immunantwort auch durch IgA verursacht wird ist unklar.
Es liegt hier eine deutliche Antwort des Kindes mit proteinsequenzspezifischen IgG und
möglicherweise IgA und der Mutter durch IgA und IgG, einem leicht erhöhten IgG-Titer
des Kindes, einer fehlenden IgM-Antwort bei Mutter und Kind, einer durchschnittlichen
Neutralisationsfähigkeit und einer IgA-Antwort des Kindes im RSV-ELISA vor. Diese
Befunde lassen an eine Immunreaktion der Mutter durch RSV denken, bei dem eine
spezifische Immunität des Kindes induziert wird oder dem Kind von der Mutter
spezifische Antikörper selektiv übertragen wird.
S7
Bei der Mutter von S7 findet sich eine deutliche Reaktion mit IgM gegen RSV ohne
erhöhte IgM-Konzentration, eine etwas erhöhte IgM-Aktivität der Mutter gegen die GProteinsequenz SP2, eine gering erhöhte IgA-Aktivität gegen SP3 und eine deutlich
erhöhte IgA-Aktivität von Mutter und Kind gegen die F-Proteinsequenz SP7 mit stärkerer
Reaktion des Kindes. Ansonsten findet sich keine Auffälligkeit im Vergleich zum
Gesamtkollektiv. Es liegt hier eine relativ spezifische RSV-Immunantwort der Mutter mit
beginnender Reaktion der kindlichen Immunabwehr mit IgA gegen das F-Protein vor.
S8
Bei S8 zeigt die Mutter eine relativ hohe IgM-Konzentration, eine hohe Aktivität des IgM
in der Erkennung der G-Proteinsequenzen SP2, SP4 und SP5 und der N-Proteinsequenz
SP10, wobei die Reaktionen gegen SP2 und SP5 sehr deutlich ausfallen. Das Kind zeigt
einen relativ hohen Neutralisationstiter. Es liegt hier eine spezifische IgM-Antwort der
Mutter vor, wobei das Kind eine relativ hohe Neutralisationsfähigkeit zeigt ohne verstärkte
spezifische IgM- oder IgA-Antwort.
S9
Die Konzentration der Immunglobuline von S9 kann wegen zu geringer Menge nicht
bestimmt werden. Bei S9 reagieren Mutter und Kind fast durchweg durchschnittlich.
Lediglich gegen die G-Proteinsequenzen SP2, SP4 und SP5 und der N-Proteinsequenz
SP10 zeigt sich eine gering erhöhte IgM-Aktivität der Mutter im Vergleich zum Kollektiv,
bei SP10 auch gering beim Kind. Bei diesem Serumpaar liegt eine relativ spezifische aber
durchschnittliche Immunitätslage der Mutter mit wenigen spezifischen IgM-Aktivitäten
vor. Spezifische Reaktionen des Kindes sind nicht nachzuweisen.
75
S10
Beim Serumpaar 10 zeigt das Kind eine relativ hohe IgG-Konzentration. Die Mutter zeigt
eine ausgeprägt hohe IgM-Konzentration, eine relativ starke Reaktion mit IgM gegen
RSV. Die Mutter zeigt eine verstärkte IgM-Aktivität gegen die G-Proteinsequenzen SP1,
SP2, SP4 und SP5, gegen die F-Proteinsequenz SP7, und die M-Proteinsequenz SP8, eine
verstärkte IgA-Aktivität gegen die G-Proteinsequenz SP3 und die N-Proteinsequenz SP10
und das Kind eine verstärkte IgG-Aktivität gegen die G-Proteinsequenz SP2. Es liegt hier
eine spezifische IgM-Aktivität der Mutter gegen die Proteine G, F und M, eine spezifische
IgA-Aktivität gegen die Proteine G und N und eine beginnenden spezifische IgG-Aktivität
des Kindes gegen das G-Protein vor.
S11
Bei S11 findet sich eine im Vergleich zum Kollektiv größere IgG-Konzentration beim
Kind als bei der Mutter, ansonsten zeigen sich keine Auffälligkeiten gegenüber dem
Gesamtkollektiv. Mutter und Kind zeigen eine unspezifische und durchschnittliche
Immunitätslage gegenüber RSV, die Übertragung dieser „gereiften“ Immunitätslage auf
das Kind induziert beim Kind keine spezifische Immunreaktion.
S12
Bei S12 zeigt die Mutter mit IgG gegen SP5 und das Kind gegen SP7 eine sehr starke
Aktivität, ohne daß sich dieses im IgGesamt widerspiegelt. Da es sich hier am ehesten um
eine Fehlbestimmung handelt, wird eine Bestimmung der Signifikanz der Unterschiede
anhand der Ausreißerbertebestimmung durchgeführt [278]. Es ergibt sich nach der
Ausreißertabelle nach Gubbs ein Tabellenwert von 99 %, was einer höchst signifikanten
Abweichung entspricht. Ansonsten verhält sich das Serumpaar wie S11 mit einer
„gereiften“ Immunitätslage ohne spezifische Immunreaktion beim Kind.
S13
Eine deutlich höhere IgG-Konzentration beim Kind im Gegensatz zur Mutter zeigt eine
gering bessere Erkennung im RSV-ELISA mit IgG. Es findet sich lediglich eine erhöhte
spezifische
IgM-Aktivität
der
Mutter
in
der
Erkennung
aller
untersuchten
Proteinsequenzen, vor allem der G-Proteinsequenzen SP2 und SP4, der M-Proteinsequenz
SP9 und der N-Proteinsequenz SP10. Es handelt sich hier um eine relativ unspezifische
Immunitätslage der Mutter, ohne Induktion einer spezifischen Immunitätslage beim Kind.
76
S14
Serumpaar 14 zeigt eine hohe IgG-Konzentration beim Kind und eine sehr hohe IgMKonzentration bei der Mutter, die neutralisierende Aktivität ist nicht außergewöhnlich
hoch, das Kind zeigt eine gute Aktivität im RSV-ELISA mit IgGesamt, deutlich größer als
die der Mutter, bei gleicher Reaktion mit IgG bei Mutter und Kind und guter IgM-Antwort
der Mutter. Das spricht für eine IgA-Antwort des Kindes bei einer IgM-Antwort der
Mutter gegen RSV. Die deutliche Reaktion der IgGesamt, IgG und IgM der Mutter und der
IgGesamt und IgG des Kindes gegen SP1, SP6, und SP8 zeigen eine deutliche und
spezifische IgG-, IgM- und mögliche IgA-Aktivität der Mutter und eine deutliche IgG- und
mögliche IgA-Aktivität des Kindes gegen die G-Proteinsequenz SP1, die F-Proteinsequenz
SP6 und die M-Proteinsequenz SP8. Die etwas stärkere Reaktion mit IgG und IgM bei der
Mutter und der IgG des Kindes ohne deutliche Erhöhung bei IgGesamt gegen SP9 spricht
für eine IgM- und IgG-Aktivität der Mutter und eine IgG-Aktivität beim Kind gegen die
M-Proteinsequenz SP9. Die starke Reaktion der Mutter mit IgM, IgG und IgGesamt bei
der Proteinsequenz SP3 ohne Erhöhung der Aktivität beim Kind spricht für eine
spezifische IgG- und IgM-Antwort. Gegen die G-Proteinsequenz SP4 findet sich eine
deutliche IgM-Antwort der Mutter. Bei der ausgeprägten Antwort der Mutter mit IgGesamt
gegen SP10 handelt es sich am ehesten um eine Fehlbestimmung, da sich nach der
Bestimmung der Signifikanz des Unterschieds anhand der Ausreißerbertebestimmung ein
Tabellenwert von 99 % nach der Ausreißertabelle nach Gubbs ergibt [278]. Das entspricht
einer höchst signifikanten Abweichung. Es findet sich zusammenfassend eine IgMKonzentrationserhöhung bei der Mutter, eine IgM-Antwort der Mutter und eine mögliche
IgA-Antwort des Kindes gegen RSV und eine spezifische IgG-, IgM- und mögliche IgAAktivität der Mutter sowie eine deutliche IgG- und mögliche IgA-Aktivität des Kindes
gegen die einzelnen Proteinsequenzen, was einer deutlichen aber noch nicht gereiften
Immunreaktion von Mutter und Kind auf RSV mit einer relativ spezifischen Antwort
entspricht. Diese Immunreaktion geht jedoch ohne eine erhöhte Neutralisationsfähigkeit
einher.
77
S15
Das Kind von S15 zeigt eine deutlich ausgeprägte IgA-Aktivität gegen die GProteinsequenz SP4 und die Mutter mit IgG eine im Vergleich zum Kollektiv erhöhte
Aktivität der G-, M- und N-Proteinsequenzen SP3, SP4, SP9 und SP10. Diese
Konstellation läßt den Schluß zu, daß es sich bei dem Kind sehr spezifische Reaktion
gegen RSV mit IgA und bei der Mutter mit IgG handelt.
S16
Mit einer starken Reaktion der Mutter von S16 mit IgGesamt, IgG und IgM und des
Kindes mit IgGesamt und IgG bei SP1, SP6, und SP8 ist von einer spezifischen IgG- und
IgM-Antwort der Mutter und von einer spezifischen IgG-Antwort des Kindes gegen die GProteinsequenz SP1, die F-Proteinsequenz SP6 und die M-Proteinsequenz SP8
auszugehen. Gegen die G-Proteinsequenz SP2 ist bei der Mutter von einer IgG- und gegen
die G-Proteinsequenzen SP4 und SP5 und die N-Proteinsequenz SP10 von einer IgMAntwort auszugehen. Es zeigte sich eine spezifische Aktivität der Mutter mit IgG und IgM
und gegen andere Proteinsequenzen spezifische Aktivität des Kindes mit IgG.
S17
Bei S17 zeigt sich eine erhöhte Konzentration von IgG und IgM bei Mutter und Kind im
Vergleich zum Kollektiv. Im RSV-ELISA zeigt das Kind eine höhere Aktivität mit
IgGesamt und die Mutter gering höher mit IgG, was beim Kind für eine IgA-Antwort
spricht. Sehr stark reagiert die Mutter mit IgM gegen alle synthetischen Peptide, gegen
SP4 zeigt das Kind eine größere spezifische IgG-Antwort als das Kollektiv und als die
Mutter. Es liegt hier eine relativ spezifische Immunreaktion gegen RSV vor mit erhöhten
IgG- und IgM-Konzentrationen, mit einer IgG-Antwort der Mutter und einer IgA-Antwort
des Kindes gegen RSV, einer deutlichen spezifischen IgM- Antwort der Mutter gegen alle
G-, F-, M- und N-Proteinsequenzen und einer beginnenden spezifischen IgG-Antwort des
Kindes gegen die G-Proteinsequenz SP4.
S18
Bei S18 zeigt sich beim Kind eine viel höhere IgG-Konzentration im Vergleich zum
Kollektiv und zur Mutter. Im RSV-ELISA zeigt die Mutter mit IgGesamt eine höhere und
das Kind mit IgG eine deutlich höhere Aktivität. Daraus ist bei der Mutter auf eine RSVspezifische IgA- und beim Kind auf eine RSV-spezifische IgG-Antwort zu schließen. Das
Kind zeigt mit IgGesamt eine deutlich größere und mit IgG eine gering größere Aktivität
78
gegen SP1 und SP6, was auf eine spezifische IgG- und IgA-Aktivität gegen die GProteinsequenz SP1 und die F-Proteinsequenz SP6 schließen läßt. Beim Kind liegt
überwiegend eine spezifische IgA-Antwort gegen die M-Proteinsequenz SP8 und eine
IgG-Antwort gegen die N-Proteinsequenz SP10 vor. Es liegt hier eine relativ unspezifische
Immunreaktion gegen RSV vor, mit einer IgG-Konzentrationserhöhung des Kindes, einer
IgG-Aktivität des Kindes und einer IgA-Aktivität der Mutter gegen RSV und spezifischen
IgG- und IgA-Aktivitäten des Kindes.
S19
Bei S19 zeigt sich beim Kind eine höhere IgG-Konzentration als bei der Mutter und eine
im Vergleich zum Kollektiv hohe IgM-Konzentration bei der Mutter. Es zeigt sich beim
Kind im RSV-ELISA mit IgGesamt eine höhere Aktivität im Vergleich zur Mutter, was für
eine IgA-Antwort des Kindes spricht und bei der Mutter eine höhere Aktivität mit IgM im
Vergleich zum Kollektiv und zum Kind. Eine stärkere Antwort des Kindes mit IgGesamt
im Vergleich zur Mutter bei nicht höherer IgG-Aktivität des Kindes aber teils deutlich
höherer IgM-Aktivität der Mutter läßt auf eine spezifische Antwort des Kindes mit IgA
und der Mutter mit IgM gegen die G-Proteinsequenzen SP1, SP3 und SP5, gegen die FProteinsequenzen SP6 und SP7 und die M-Proteinsequenz SP8 schließen. Die im
Vergleich zum Kollektiv bei Mutter und Kind deutlich stärkere Aktivität mit IgGesamt und
der deutlichen IgG-Antwort des Kindes im Vergleich zum Kollektiv und zur Mutter mit
geringer Aktivität des IgM der Mutter läßt bei der G-Proteinsequenz SP2 auf eine
spezifische IgG-Antwort des Kindes und eine spezifische IgA-Antwort der Mutter
schließen. Eine erhöhte IgM-Aktivität der Mutter findet sich bei der N-Proteinsequenz
SP10. Zusammenfassend findet sich eine höhere IgG-Konzentration des Kindes mit
höherer IgM-Konzentration der Mutter, eine IgA-Antwort des Kindes und eine IgMAntwort der Mutter gegen RSV, eine spezifische IgA-Antwort des Kindes gegen G-, Fund M-Proteinsequenzen und eine spezifische IgA-Antwort der Mutter und IgG-Antwort
des Kindes gegen eine G-Proteinsequenz. Es handelt sich hier um eine relativ spezifische
Immunreaktion
mit
beginnender
IgG-Antwort
Immunitätslage der Mutter.
79
auf
dem
Boden
einer
„reifen“
S20
Bei Serumpaar 20 zeigt die Mutter eine deutlich höhere IgG-Konzentration im Vergleich
zum Kollektiv und das Kind eine wesentlich geringere IgG-Konzentration als die Mutter.
Beim Neutralisationstest findet sich beim Kind eine deutlich höhere Titerstufe als bei der
Mutter. Die Mutter zeigt eine relativ deutliche IgM-Reaktion gegen RSV und gegen die GProteinsequenzen SP1 und SP3. Es liegt hier eine deutliche IgG-Antwort der Mutter und
eine gute neutralisierende Aktivität besonders des Kindes vor. Die IgM-Antwort der
Mutter gegen RSV und gegen die G-Proteinsequenzen sprechen für eine relativ unreife
Immunantwort.
S21
Bei Serumpaar 21 zeigt die Mutter im Vergleich zum Kollektiv erhöhte IgG und IgMTiter, eine deutliche Reaktion mit IgM gegen RSV und deutliche IgM-Reaktionen gegen
die G-Proteinsequenzen SP4 und SP5 und die M-Proteinsequenz SP9. Das Kind zeigt eine
deutliche Reaktion mit IgG gegen die G-Proteinsequenz SP2 und die N-Proteinsequenz
SP10. Diese Befunde sprechen für eine relativ spezifische IgM-Immunreaktion der Mutter
auf RSV, wobei das Kind eine recht spezifische Immunantwort mit IgG zeigt.
S22
Es findet sich bei S22 eine deutlich verstärkte IgM-Aktivität der Mutter und eine
verminderte IgG-Aktivität des Kindes gegen RSV. Die spezifische IgM-Reaktion der
Mutter und des Kindes sind gegen die G-Proteinsequenzen SP2 und SP5 gerichtet, die des
Kindes aber auch gegen die F-Proteisequenz SP7. Die spezifische IgG-Aktivität des
Kindes richtet sich gegen die N-Proteinsequenz SP10. Es liegt hier eine relativ spezifische
Immunreaktion der Mutter mit IgM und des Kindes mit IgG und IgM gegen RSV vor, ohne
daß eine verstärkte IgA-Aktivität nachzuweisen ist.
S23
Bei S23 zeigt sich eine deutliche IgA-Reaktion des Kindes und eine deutliche IgG- und
IgM-Reaktion der Mutter gegen RSV. Eine spezifische IgM-Reaktion läßt sich bei Mutter
und Kind gegen die G-Proteinsequenz SP5 und beim Kind gegen SP2 nachweisen. Die
spezifische IgA-Reaktion richtet sich beim Kind gegen die F-Proteinsequenz SP7. Hier
liegt eine IgG- und IgM-Aktivität der Mutter und beginnende IgA-Aktivität des Kindes
vor.
80
S24
Bei S24 findet sich bei der Mutter eine größere IgG-Konzentration als beim Kind. Es zeigt
sich eine deutliche IgM-Aktivität der Mutter gegen RSV und eine spezifische IgG- und
IgM-Aktivität der Mutter und IgA- und IgG-Aktivität des Kindes gegen die GProteinsequenz SP2. Gegen die F-Proteinsequenz SP7 zeigt das Kind eine größere IgAAktivität.
S25
Die Immunglobulin-Konzentrationen bei S25 können wegen zu kleiner Serummengen
nicht bestimmt werden. Mutter und Kind zeigen im Vergleich zum Kollektiv eine gute
neutralisierende Aktivität. Beide zeigen eine deutliche IgG-Aktivität gegen RSV, wobei
die des Kindes im Vergleich zur Mutter und zum Kollektiv deutlich überwiegt. Bei der
Mutter ist auch eine IgM-Antwort gegen RSV nachzuweisen. Die Mutter zeigt eine
spezifische Antwort mit IgM gegen die G-, F-, M- und N-Proteinsequenzen SP2, SP5, SP7,
SP8, SP9 und SP10 und das Kind mit IgG gegen die G- und M-Proteinsequenzen SP2, SP4
und SP9. Es liegt hier eine „reife“ Immunitätslage vor mit einer sehr spezifischen
Immunantwort gegen RSV. Die gute neutralisierende Eigenschaft liegt eventuell in der
deutlichen IgG-Antwort gegen RSV und der spezifischen Antwort gegen die einzelnen
Peptidsequenzen begründet.
S26
Bei Serumpaar 26 zeigt das Kind eine deutlich höhere IgG-Konzentration im Vergleich zur
Mutter und auch im Vergleich zum Gesamtkollektiv. Das Serumpaar fällt durch die kaum
ausgeprägte neutralisierende Aktivität und die minimale IgG-Aktivität gegen RSV auf. Nur
die IgM-Aktivität der Mutter gegen RSV ist nachweisbar. Bei der spezifischen
Immunreaktion findet sich eine IgG- und IgM-Aktivität bei der Mutter und eine IgGAktivität beim Kind gegen die G-, F-, M- und N-Proteinsequenzen SP1, SP3, SP6, SP8,
SP9 und SP10. Eine IgG-Antwort findet sich bei der Mutter gegen die G-Proteinsequenz
SP2 und eine IgG- und IgM-Antwort der Mutter und eine mögliche IgA-Antwort des
Kindes gegen die G-Proteinsequenz SP4. Eine IgM- und möglicherweise eine IgA-Antwort
der Mutter und eine IgA-Antwort des Kindes findet sich gegen die G-Proteinsequenz SP5
und ohne deutliche IgA-Antwort des Kindes gegen die F-Proteinsequenz SP7. Diese
Beobachtungen lassen den Schluß zu, daß hier eine sehr spezifische Immunreaktion gegen
RSV vorliegt. Möglicherweise ist die Immunitätslage der Mutter „unreif“, die
Immunreaktion des Kindes uneffektiv oder durch die mütterliche Immunreaktion in utero
81
modifiziert. Möglicherweise ist die wirksame Immunantwort des Kindes durch die
mütterliche unterdrückt.
S27
Bei Serumpaar 27 zeigt das Kind im Vergleich zur Mutter und auch im Vergleich zum
Gesamtkollektiv eine hohe IgG-Konzentration. Mutter und Kind zeigen einen hohen nicht
deutlich voneinander abweichenden Neutralisationstiter. Gegen RSV zeigt das Kind im
Vergleich zum Kollektiv eine sehr hohe IgA-Aktivität und die Mutter eine deutliche IgGAktivität. In der spezifischen Immunantwort zeigen sich keine deutlichen Abweichungen
zum Kollektiv außer einer relativ deutlichen IgM-Antwort der Mutter gegen die GProteinsequenz SP3 und einer IgA-Antwort der Mutter gegen die G-Proteinsequenz SP4.
Es liegt eine relativ unspezifische Immunitätslage vor. Allerdings ist damit die deutliche
IgA-Aktivität des Kindes nicht zu erklären. Möglicherweise liegt hier eine Boosterung
gegen RSV vor.
82
3.5
Untersuchung
der
Abhängigkeit
der
Resktionsstärke
von
den
Immunglobulinkonzentrationen
Bei der Berechnung der Abhängigkeit der Aktivität der IgG- und IgM-Antikörper bei
Mutter und Kind von den Immunglobulinkonzentrationen zeigt sich lediglich beim
Neutralisationstest bei den Müttern mit IgG und IgM eine Abhängigkeit der
Neutralisationsfähigkeit von der Konzentration der Immunglobuline. Es zeigt sich dabei
eine hohe Abhängigkeit beim IgG mit P=0,52 und eine relativ schwachen Abhängigkeit
beim IgM mit P=0,10. Alle anderen Untersuchungen ergeben statistisch signifikante
Unterschiede
zwischen
den
Reaktionsstärken
der
Seren
und
den
Immunglobulinkonzentrationen mit p<<0,05, die Testergebnisse sind also unabhängig von
dem Immunglobulinkonzentrationen.
83
4 Diskussion der Ergebnisse
Bei Säuglingen und Kleinkindern stellt das Respiratory Syncytial Virus (RSV) den
häufigsten Erreger von Infektionen des unteren Respirationstraktes dar [57;235]. Die RSVInfektionen sind durch altersspezifische Erkrankungen geprägt [236]. Bei Neugeborenen
der ersten Lebenswochen finden RSV-Infektionen im Beisein mütterlicher Antikörper
statt. Dieser relative Nestschutz läßt zwar eine Infektion durch RSV zu, beeinflußt die
Schwere der Erkrankung aber günstig [237;239]. Im Alter von wenigen Wochen bis zu
sechs Monaten finden die schwersten Erkrankungen durch RSV mit Beteiligung der
unteren Atemwege statt [82;108;115;116]. Die Immunantwort der Säuglinge und
Kleinkinder auf eine RSV Infektion ist nicht ausreichend effektiv, so daß es auffallend
häufig zu Reinfektionen kommt. Mit zunehmendem Alter und zunehmenden Reinfektionen
kommt es zu milderen Verläufen der RSV-Infektionen, überwiegend der oberen Luftwege,
wobei die Immunreaktion auf das RSV einer „Reifung“ durch den wiederholten Kontakt
mit dem RSV unterliegt [82;236;144]. Schwere Erkrankungen kommen erst wieder bei
älteren Menschen vor [238]. Die Gründe für die unzureichende Immunantwort gegen RSV
sind nicht hinreichend bekannt [236]. Die Plazenta begrenzt die immunologische
Auseinandersetzung des Feten selektiv. Wie sich das in Bezug auf das RSV auswirkt, ist
bisher unklar. Ob eine eigene Immunantwort des Neugeborenen gegen das RSV besteht, ist
bisher nicht untersucht.
Zum besseren Verständnis der Immunantwort auf das RSV von Neugeborenen stellen sich
hier die Fragen, inwieweit eine diaplazentare Übertragung von mütterlichen RSVspezifischen Antikörpern vorliegt, ob sie Einfluß auf die Immunantwort des Kindes nimmt,
wie die eigene Immunantwort des Kindes im Vergleich zur Mutter aussieht und ob eine
Reifung der Immunantwort des Kindes stattfindet.
Zur Beantwortung der Fragen der diaplazentaren Übertragung und der eigenen präpartalen
Immunantwort der Kinder werden 27 korrespondierende Serumpaare von Müttern und
Kindern zum Zeitpunkt der Geburt untersucht.
84
4.1 Wertung der Untersuchungsmethoden
Zur Frage der Abhängigkeit der Untersuchungen von den Immunglobulinkonzentrationen
werden die IgG- und IgM-Konzentrationen bestimmt. Bei der vorliegenden Untersuchung
der IgG-Konzentrationen zeigen die Kinder, wie in der Literatur beschrieben, höhere IgGKonzentrationen im Vergleich zu den Müttern [175;180;240;241]. Dabei bilden die IgGAntikörper beim Kind im Vergleich zu den anderen Antikörperklassen einen größeren
Anteil im Vergleich zur Mutter. Möglicherweise wird das Konzentrationsgefälle der
anderen Immunglobulinklassen durch einen verstärkten Transfer von IgG auf das Kind
ausgeglichen. Eine unterschiedliche Konzentration der Immunglobuline ist auch dadurch
zu erklären, daß die einzelnen Subklassen unterschiedlich stark übertragen werden und
eine unterschiedliche Halbwertszeit besitzen [242]. Die IgG-Konzentrationen bei Mutter
und Kind stehen in einem bestimmten Verhältnis zueinander, sind aber nicht direkt
voneinander abhängig, sie differieren signifikant zwischen Mutter und Kind. Diese
Ergebnisse sprechen für einen gerichteten Transfer von IgG-Antikörpern und eine eigene
Antikörperbildung beim Kind [241;243].
Bei der Untersuchung der IgM-Konzentrationen liegen alle mütterlichen IgMKonzentrationen, wie in der Literatur beschrieben, deutlich über denen der Kinder [240].
Erhöhte IgM-Konzentrationen stellen einen unspezifischen Marker einer Frühantwort des
Körpers oder (mit erhöhten IgG-Konzentrationen zusammen) einer frühen Zweitantwort
auf eine akute Infektion dar, ohne Nachweis des auslösenden Agens. Ob die Ursache der
erhöten IgM-Konzentrationen in einer Infektion mit RSV zu sehen ist, kann nur in
gemeinsamer Beurteilung mit den anderen Tests geschlossen werden. Da IgM nicht
plazentagängig ist, bedeuten erhöhte IgM-Konzentrationen beim Kind, daß eine eigene
intrauterine IgM-Antikörperbildung auf einen Kontakt mit einem unspezifischen Antigen
stattgefunden hat.
Neutralisierende Antikörper und RSV-spezifische IgG-Antikörper spiegeln am besten den
Schutz
vor
RSV-Infektionen
mit
effektiver
Reduktion
des
Virustiters
wider
[12;48;110;111;124;159;160;236;237;239;244;245;259]. Die Korrelation zwischen der
neutralisierenden Aktivität und der Höhe der RSV-spezifischen IgG-Antikörpertiter ist
sehr gut [12;124;159;160]. Zum Nachweis von RSV-IgG-Antikörpern und der höchsten
protektiven Aktivität eignet sich am besten der RSV-Mikroneutralisationstest [110]. In den
vorliegenden Untersuchungen kann ein deutlicher Zusammenhang zwischen der Aktivität
des IgG im RSV-ELISA zum Neutralisationstest bestätigt werden. Zur Beurteilung der
85
Neutralisationsfähigkeit von RSV in vitro wird ein RSV-Mikroneutralisationstest
durchgeführt. Im Neutralisationstest weisen alle Serumpaare außer S26 eine gute
neutralisierende Aktivität gegenüber RSV in vitro auf. Die fast fehlende neutralisierende
Aktivität bei S26 läßt auf eine mangelnde Immunabwehr in vivo schließen [244]. Bei S20
liegt eine eigene Produktion von neutralisierenden Antikörpern durch das Kind vor, was
bedeutet, daß der Fet eine eigene, von der Mutter unabhängige neutralisierende Aktivität
aufbauen kann.
Die Erkennung des gesamten RSV wird in einem RSV-spezifischen ELISA bezüglich der
IgG-, IgM- und IgA-Antikörper untersucht. Im RSV-ELISA zeigen alle Serumpaare außer
S26 eine deutliche Reaktion gegenüber RSV. Bei den IgG-Antikörpern ist eine nur gering
stärkere Reaktion der kindlichen Seren gegen RSV nachzuweisen, was für eine
diaplazentar übertragene IgG-Antwort gegen RSV spricht. Die Unterschiede in der
Reaktion mit IgG zwischen Mutter und Kind lassen aber auch auf eine eigene IgGProduktion des Kindes bei S2, S5 und S25 schließen. Bei einigen Kindern findet sich eine
zusätzliche IgA-Antwort gegen RSV, was für eine Akutreaktion der Kinder bei S3, S6,
S12, S14, S18, S19, S22 und S27 spricht. Bei den IgM-Antikörpern ist eine sehr
unterschiedliche Signalstärke der Mütter im Vergleich untereinander festzustellen, was auf
eine unterschiedliche Infektionslage mit RSV schließen läßt, mit möglicher akuter
Infektion durch RSV bei S7, S21 und S22. Eine Reaktion der Kinder mit IgM spricht
wegen des fehlenden diaplazentaren Transfers für eine eigene IgM-Antwort gegen RSV.
Zusammenfassend kann gesagt werden, daß die RSV-Erkennung durch IgG bei nicht
signifikanten Unterschieden zwischen Müttern und Kindern größtenteils von der Mutter
auf das Kind übertragen worden sind. Bei einigen Serumpaaren kann eine eigene
Immunreaktion des Kindes mit den Immunglobulinklassen IgG, IgM und IgA gegen RSV
nachgewiesen werden.
Zur
genaueren
Beurteilung
der
Erkennung
RSV-spezifischer
Peptide
durch
Serumantikörper der Gruppe IgG wird eine SDS-Polyacrylamidgelelektrophorese mit
anschließendem Western-Blot durchgeführt. Unter Auswertung der Befunde anhand der
mitgelaufenen Negativkontrolle als interne Referenz zeigen sich keine Unterschiede in den
Reaktionen von mütterlichen und kindlichen Seren. In der Versuchsdurchführung werden
Lysate von kompletten RSV infizierten HEp-2 Zellen mit nicht infizierten HEp-2 Zellen
als Kontrolle verwendet. Der Immunoblot stellt zum Nachweis dieser spezifischen
Immunreaktionen gegen RSV in Zellysaten ein zu wenig sensibles Nachweisverfahren dar.
86
Für die Durchführung eines Immunoblottes mit aufgereinigtem RSV und RSVspezifischen Peptiden steht zu wenig Material zu Verfügung.
Zur Beurteilung der epitopspezifischen Immunantwort gegen einzelne Sequenzen des RSV
werden die Reaktionen der IgG-, IgM- und IgA-Serumantikörper gegen 10 synthetische
Peptide untersucht. Von Bedeutung für die Untersuchungen sind vor allem die
synthetischen Peptide der Proteine G, F und N, da Antikörper gegen diese die Infektiosität
des RSV beeinflussen. Aber auch das M-Protein ist von Interesse: Wenn auch bei
Antikörpern gegen das M-Protein kein Schutz gegen das RSV nachweisbar ist, stellt dieses
doch ein gutes Ziel für die zytotoxischen Lymphozyten dar [67;84;156-158;247-251]. Die
Reaktionen gegen die synthetischen Peptide werden als Immunantwort gegen einzelne
Oberflächenproteine gewertet. Aufgrund einer möglicherweise anderen Tertiärstruktur der
synthetischen Peptide als die der Proteinsequenzen im kompletten RSV lassen diese
allerdings nur bedingt Rückschlüsse auf die Reaktionen in vivo zu [246]. Die
Untersuchungen der Unterschiede von Mutter zu Kind behalten jedoch ihre Aussagekraft,
da sie in direkten Vergleich zueinander bewertet werden. Auch die Aussage der
Reaktionen der einzelnen Seren im Vergleich zu den anderen untersuchten Seren kann
beurteilt werden, da diese in gleichen Testreihen direkt miteinander verglichen werden.
Betrachtet man die Reaktionsstärken der einzelnen Serumpaare gegen die Summe der
synthetischen Peptide, so läßt die deutliche Reaktion aller Serumpaare mit IgG gegen die
synthetischen Peptide auf eine diaplazentar übertragene spezifische Immunantwort
schließen. Die unterschiedlichen Reaktionsmuster zwischen Mutter und Kind lassen aber
auch eine eigene Immunantwort des Kindes mit IgG vermuten. Betrachtet man die
Aktivität der IgM-Antikörper so läßt sich ein eindeutiges Überwiegen der mütterlichen
Antikörper erkennen, wobei die hohe Schwankungsbreite auf eine akute spezifische
Immunreaktion bei S8, S14, S17, S21 und S26 gegen RSV hinweist. Bei den Kindern der
Serumpaare S18, S19 und S20 sind IgA-Antikörper an der Immunantwort beteiligt.
87
4.2 Vergleich der durchgeführten Untersuchungsmethoden
Die Korrelation zwischen der neutralisierenden Aktivität und der Höhe der RSVspezifischen IgG-Antikörpertiter ist sehr hoch [12;124;159;160]. In den vorliegenden
Untersuchungen konnte ein deutlicher Zusammenhang zwischen der Konzentration der
IgG-Antikörper und der Aktivität des IgG im RSV-ELISA zum Neutralisationstest gezeigt
werden. Diese Eigenschaften sind entgegengesetzt der spezifischen Aktivität im SPELISA. In den vorliegenden Untersuchungen zeigt sich, daß hohe IgG-Titer lediglich eine
deutliche Erkennung der synthetischen Peptide wahrscheinlich machen. Diese geben aber
keinen Rückschluß auf die Stärke des Neutralisationstests oder des RSV-ELISA und diese
wiederum nicht auf die Stärke der Erkennung der synthetischen Peptide. Umgekehrt läßt
die Stärke der Erkennung der synthetischen Peptide auch nicht auf die Aktivität im
Neutralisationstest oder RSV-ELISA schließen. Bei den IgM-Antikörpern läßt sich zeigen,
daß hohe IgM-Titer mit einer guten spezifischen Erkennung der synthetischen Peptide
einhergehen. Diese lassen sich nicht mit der kindlichen Reaktionen vergleichen, da IgM
hier kaum nachweisbar ist.
88
4.3 Beurteilung der Auswertungsmethoden
Die Ergebnisse erhalten dadurch eine Vergleichbarkeit, daß die Reaktionen der einzelnen
Seren im Vergleich zur inneren Referenz, also der 26 anderen im gleichen Test
untersuchten Seren beurteilt werden. Auch bei den Unterschieden der Reaktionen
zwischen Mutter und Kind findet der Vergleich zur inneren Referenz, also den
Unterschieden der 26 anderen Serumpaare statt (bei den Konzentrationsbestimmungen
liegen nur 23 Serumpaare vor) [276]. Die Reaktion wird nur bei signifikanter Abweichung
als auffällig eingestuft. Bei der Beurteilung der spezifischen Reaktion der Serumantikörper
gegen das RS-Virus läuft bei jedem Serum eine Negativkontrolle mit, um die
unspezifischen Reaktionen gegen die HEp-2 Zellen auszuschließen. Der semiquantitative
Rückschluß beim RSV- und peptidspezifischen ELISA auf die IgA-Aktivität durch den
Vergleich der Reaktionsstärke mit IgG und IgM zu der mit IgGesamt ist möglich, da die
Unterschiede in den Reaktionen zwischen Mutter und Kind in direktem Vergleich
zueinander und die Reaktionen der einzelnen Seren im Vergleich zu den anderern 26 Seren
bewertet werden. Die 26 anderen Seren dienen dabei als innere Referenz. Bei
Voruntersuchungen
zur
Abhängigkeit
der
Signalstärke
im
ELISA
von
der
Serumverdünnung kann eine deutliche Korrelation mit einer streng linearen Funktion
nachgewiesen werden [276;277]. Die Untersuchungen bezüglich der Meßpräzision zeigen
gut reproduzierbare und verläßliche Resultate mit geringen Schwankungen bei der
Mehrfachanalyse
einer
Probe
[275].
Es
zeigt
sich
eine
mittlere
relative
Standardabweichung von 7,8 % bei den Müttern und von 5,2 % bei den Kindern im RSVspezifischen ELISA mit IgGesamt.
Um einen Rückschluss auf die Immunitätslage der einzelnen Seren zu erhalten, wird jedes
einzelne Serum in jedem durchgeführten Test untersucht. Es handelt sich zwar um eine
geringe Anzahl von Proben, aber die Tendenzen sind eindeutig. Die Beurteilung erfolgt
dann anhand des Reaktionsmusters der einzelnen Serumpaare über alle durchgeführten
Tests im Vergleich zu den anderen Serumpaaren. Auf eine Bestimmung der Inter-AssayVariabilität wird verzichtet, da die Beurteilung im direkten Vergleich mit den anderen
Serumpaaren erfolgt und von der Arbeitsgruppe erprobte Verfahren der Testdurchführung
angewendet werden [169].
Bei der Beurteilung der Ergebnisse bezüglich der Fehlbestimmungen finden sich drei
auffällige Testergebnisse, zwei davon bei Serumpaar 12 mit IgG. Beim Kind findet sich
gegen SP5 und bei der Mutter gegen SP7 eine ausgeprägt starke Reaktion. Bei allen
89
anderen Untersuchungen zeigt das Serumpaar eine durchschnittliche Reaktionsstärke.
Lediglich im RSV-ELISA mit IgG ist eine schwächere Aktivität beim Kind im Vergleich
zur Mutter zu beobachten. Das erklärt aber nicht die ausgeprägt starke Reaktion nur beim
IgG, da dann auch Veränderungen beim IgGesamt zu erkennen sein müssten. Die
Beurteilung anhand der Ausreißerwerteberechnung ergibt einen Tabellenwert von 99 %
nach der Ausreißertabelle nach Gubbs, womit die Abweichungen hochsignifikant sind. Das
andere findet sich bei der Mutter von Serumpaar S14, mit einer ausgeprägt starken
Reaktion gegen SP10, einer N-Proteinsequenz mit IgGesamt. Bei S14 findet sich allerdings
auch eine deutlich erhöhte IgM-Konzentration bei der Mutter und eine deutliche Reaktion
mit IgG und IgM gegen SP6, einer F-Proteinsequenz. Eine deutliche IgA-Antwort scheint
also
an
der
IgGesamt-Reaktion
mit
beteiligt
zu
sein.
Trotzdem
zeigt
die
Ausreißerwertberechnung eine hochsignifikante Abweichung mit einem Tabellenwert von
99 %.
Bei der Gewinnung der Blutproben ist es theoretisch denkbar, daß es zu Kontaminationen
des Nabelschnurblutes mit mütterlichem Blut kommt. In der Literatur gilt dabei der
Nachweis von IgA als Hinweis auf eine Kontamination mit mütterlichem Blut [278].
Hierbei handelt es sich allerdings um IgA-Konzentrationen. In der vorliegenden Arbeit
werden sehr spezifische Immunreaktionen untersucht, die gegen fünf bis 15 Aminosäuren
aus den Oberflächenproteinen des RSV gerichtet sind. Diese Immunreaktionen werden
direkt zwischen Mutter und Kind verglichen. Es werden signifikante Unterschiede in den
Reaktionen bei IgG, IgM und IgA nachgewiesen. Bei einer Kontamination müssten die
Unterschiede aber geringer sein. Das interessante daran ist, daß die Unterschiede gerade
zunehmen, je deutlicher eine IgA-Antwort gegen RSV-spezifische Peptide nachzuweisen
ist. Möglicherweise liegt bei den Serumpaaren mit der reifen Immunreaktion ohne große
Differenzen zwischen Mutter und Kind eine solche Kontamination vor. Gegen diese
Annahme spricht aber, daß diese geringen Differenzen durchweg nur bei den Serumpaaren
mit guter neutralisierender Aktivität und ausgeprägter Antwort mit IgG gegen RSV
vorliegen und nicht bei denen ohne diese Eigenschaften.
90
4.4 Beurteilung des „Reifegrades“ der Immunreaktion
In der Literatur wird eine Reifung der Immunantwort gegen RSV bei Kindern nach der
Geburt beschrieben [82;121;144;167;169]. Direkt nach der Geburt existiert noch der
Nestschutz durch die mütterlichen IgG-Antikörper, der vor einer schweren Erkrankung,
nicht aber vor einer Infektion durch RSV schützt. Diese Immunantwort zeigt eine gute
Neutralisationsfähigkeit und eine deutliche IgG-Antwort gegen das komplette RSV. Mit
abnehmendem Nestschutz ist beim Kind eine zunehmend eigene Immunantwort
nachzuweisen. Dabei kann anhand des RSV-spezifischen und des SP-spezifischen ELISA
deutlich zwischen der mütterlichen und der kindlichen Immunantwort unterschieden
werden. Die erste eigene Immunantwort des Kindes ist dabei bevorzugt gegen einzelne
Proteinsequenzen des RSV gerichtet und geht mit einer schlechten Neutralisationsfähigkeit
des RSV und einer schlechten Erkennung des RSV im RSV-spezifischen ELISA einher.
Diese Immunantwort ist als „unreif“ zu beurteilen. Mit steigendem Alter des Kindes ist
eine zunehmend effektivere Immunantwort gegen RSV nachzuweisen, die mit einer
besseren Neutralisationsfähigkeit und einer deutlicheren Erkennung des RSV durch IgG
einhergeht. Diese Antwort ist als „reif“ zu beurteilen [82;121;144;167;169].
Um eine Antwort auf die Frage nach einer „unreifen“ oder einer „reifen“ Immunreaktion
gegen RSV vor der Geburt zu erhalten, werden die Immunreaktionen der IgG-, IgM- und
IgA-Immunglobulinklassen gegen RSV und gegen einzelne Peptidsequenzen des RSV zum
Zeitpunkt der Geburt untersucht. Das IgG stellt bei der Erstinfektion gewöhnlich die
Zweitantikörper (primäre Antikörperantwort) und bei wiederholter Infektion mit dem
gleichen Erreger die Erstantikörper dar (sekundäre Antikörperantwort) [177]. RSVspezifische IgG-Antikörper sind erst nach einer Latenz von Tagen bis Wochen nach RSVKontakt nachzuweisen, eine Induktion von zum Zeitpunkt der Geburt nachzuweisenden
Antikörpern muß also schon weit vorher erfolgt sein. RSV-spezifische IgM- und IgAAntikörper stellen eine Frühantwort des Körpers auf RSV dar, die frühestens einige Tage
nach dem Antigenkontakt nachweisbar werden. Bei nachzuweisenden RSV-spezifischen
IgA- und IgM-Antikörpern zum Zeitpunkt der Geburt muß die Induktion also vor der
Geburt erfolgt sein. Aufgrund der dargestellten Überlegungen ist ein Schluß auf eine
Reifung der Immunantwort vor der Geburt möglich, auch wenn die Serumpaare nur zu
einem Zeitpunkt, und zwar der Geburt, abgenommen werden. Nachweisbare Einflüße auf
die Immunität müssen intrauterin stattgefunden haben.
91
Geht man also davon aus, daß eine IgG-Antwort gegen RSV und einzelne Peptidsequenzen
des RSV sowie eine gute neutralisierende Aktivität einer reiferen Immunantwort oder einer
Spätreaktion zuzuschreiben ist und eine IgM- und IgA-Antwort gegen RSV und einzelne
Peptidsequenzen des RSV sowie eine schlechte neutralisierende Aktivität einer
Frühreaktion im Erstkontakt oder zusammen mit IgG einer frühen Zweitantwort, so kann
man die Serumpaare bezüglich dieser Immunreaktionen sortieren [167;260].
Ob dabei eine diaplazetar übertragene Antwort der Mutter oder eine eigene Immunreaktion
des Feten vorliegt, kann durch den direkten Vergleich der korrespondierenden
mütterlichen und kindlichen Seren herausgefunden werden. Ist die Immunreaktion im
RSV-spezifischen und SP-spezifischen ELISA mit IgG identisch, kann es sich beim Kind
um diaplazentar übertragene Antikörper von der Mutter handeln. Unterscheidet sich die
Immunreaktion aber von der Mutter zum Kind, muß es sich um eine eigene Immunantwort
des jeweils stärker reagierenden handeln. Das gilt für die Immunglobuline der Klassen
IgG, IgM und IgA gleichermaßen [121;144;169].
Bei der Auswertung der durchgeführten Untersuchungen lassen sich die 27 Serumpaare
anhand der Reaktionsmuster in unterschiedliche Reifegrade der Immunreaktionen
einteilen. Die Reaktionen reichen von einer „reifen“ Immunabwehr bei S11 bis zu einer
„unreifen“ Immunabwehr bei S26. Alle anderen Seren zeigen einen Reifegrad
unterschiedlicher Ausprägung zwischen diesen Polen der Immunität. Obwohl die
Gesamtzahl der untersuchten Seren nicht sehr groß ist, sind die Tendenzen in den
Reaktionsmustern doch eindeutig. Es finden sich keine Serumpaare entgegen dieser
Tendenz, also z.B. mit Zeichen einer „reifen“ Immunantwort (also einer deutlichen IgGAntwort gegen RSV mit guter neutralisierender Aktivität) vermischt mit den Zeichen einer
„unreifen“ Immunantwort (also einer spezifischen Immunantwort gegen einzelne
synthetische Peptide mit grossen Unterschieden zwischen Mutter und Kind).
4.4.1 „Reife“ Immunantwort
Eine „reife“ Immunantwort findet sich bei Serumpaar S11. Die Immunantwort von Mutter
und Kind zeigt keinen Unterschied, was auf eine diaplazentar übertragene Immunantwort
schließen läßt. Es zeigt sich eine gute Immunreaktion im RSV-spezifischen ELISA und
gute neutralisierende Eigenschaften im RSV-Mikroneutralisationstest, was auf einen guten
Schutz gegen RSV in vivo hindeutet [12;124;159;160]. Diese Eigenschaften sind
entgegengesetzt der spezifischen Aktivität im SP-ELISA. Im epitopspezifischen ELISA
92
finden sich im Vergleich zu den anderen Seren keine Auffälligkeiten, es findet sich eine
breite Erkennung der untersuchen Proteinsequenzen G, F, M und N mit IgG, ohne
verstärkte IgM- oder IgA-Aktivität. Dieser Befund läßt auch auf eine präpartal übertragene
Immunantwort ohne akute Immunreaktion schließen. Es findet sich keine eigene
spezifischen Immunreaktion des Feten.
4.4.2 Unterschiedliche Ausprägung der „Reife“ der Immunantwort
Bei den Serumpaaren S3, S5, S4, S13, S25 und S15 findet sich zu der deutlichen IgGAntwort gegen RSV und der spezifischen IgG-Antwort gegen einzelne Proteinsequenzen
überwiegend der G- und N- Proteine, aber auch der M-Proteine, eine gute neutralisierende
Aktivität. Zunehmend gewinnt auch die IgM-Aktivität gegen einzelne Proteinsequenzen,
vorwiegend der G- und F-Proteine, an Bedeutung. Bei S5 findet sich eine IgM-Antwort
gegen das F-Protein, bei S15 beim Kind eine IgA-Antwort gegen das G-Protein. Diese
Reaktionsmuster lassen eine relativ „reife“ Immunlage der Mutter vermuten, bei der ein
erneuter RSV-Kontakt stattgefunden hat. Unklar ist, ob diese Reinfektionen der Mütter vor
oder während der Schwangerschaft stattgefunden haben. Eine Infektion vor der
Schwangerschaft müßte eine relativ spezifische Immunreaktion des Kindes auf die
Immunreaktion der Mutter durch Mediatoren, Antikörper oder RSV-Partikel provoziert
haben.
Diese Gedanken werden schon in Vorarbeiten zum RSV in der Arbeitsgruppe von Herrn
Prof. Dr. H.-J. rer. nat. Streckert, Abteilung für medizinische Mikrobiologie und Virologie
der Ruhr-Universität, 44780 Bochum, diskutiert [22]. Das Modell basiert auf den
beobachteten Eigenschaften der Lebewesen, Antikörper gegen die Fc-Struktur der
Antikörper zu bilden, was sich täglich in der Diagnostik (so auch in dieser Arbeit) zu nutze
gemacht wird. Warum sollte es da nicht möglich sein, auch Antikörper gegen die FabStruktur der Antikörper zu bilden, die dann einen „Abdruck“ von winzigen Abschnitten
von der Struktur des RSV darstellen, welche dann wiederum eine Immunreaktion
erzeugen. Diese Hypothese ist sicherlich interessant in weiteren Arbeiten untersucht zu
werden, da sie Einfluß auf eine zu entwickelnde Impfung haben könnte. Möglicherweise
stellt diese Hypothese ja die Ursache für die auf die damals mit formalininaktiviertem RSV
durchgeführte Impfung folgende exazerbierte Immunreaktion auf Wildvirus-RSV dar. Bei
einer Infektion während der Schwangerschaft könnte eine spezifische Immunreaktion des
Kindes auch direkt durch das RSV oder durch RSV-Partikel induziert worden sein [261].
Die zunehmende IgM- und IgA-Antwort gegen mehrere Proteinsequenzen mit teilweise
93
recht spezifischen Reaktionen, bewirken zusammen mit der „reifen“ IgG-Antwort eine
gute Immunreaktion gegen RSV und gute neutralisierende Eigenschaften. Diese
Reaktionen sind relativ gleichgerichtet bei Mutter und Kind und damit vermutlich
diaplazentar übertragen. Auch S12 zeigt eine „reife“ Immunantwort, wobei es sich hier
beim Kind bei deutlicher Aktivität mit IgG ohne IgGesamt-Antwort am ehesten um eine
Fehlbestimmung beim IgG handelt.
Bei den Serumpaaren S2, S16, S9, S8, S20, S17, S21, S22, S27 und S18 gewinnt die IgMAktivität gegen die Proteinsequenzen der Proteine G, F, M aber auch N und die IgGAntwort gegen RSV an Bedeutung. Ausdruck hierfür ist auch die deutliche IgM-Antwort
der Mütter dieser Serumpaare gegen RSV. Einen unspezifischen Marker für eine relativ
„unreife“ Infektion stellt bei der Mutter von S2 und S21 die Erhöhung der IgMKonzentration dar, ohne signifikante Mitreaktion des kindlichen IgM. Es liegen hier
wahrscheinlich Reinfektionen mit RSV auf dem Boden einer „reifen“ Immunitätslage der
Mutter vor. Bei S20 zeigt sich eine „reife“ Immunitätslage der Mutter mit einer
zusätzlichen unreifen Immunreaktion, die sich bei der Mutter in der hohen spezifischen
IgM-Aktivität und bei dem Kind in der deutlichen spezifischen IgA-Aktivität äußert, die
mit einer guten neutralisierenden Eigenschaft vor allem beim Kind einher geht. Dieser
Befund läßt auf eine wirksame neutralisierende Aktivität durch das spezifische IgA beim
Kind schließen, was der Literatur widerspricht [160]. Mit abnehmender Immunreaktion
gegen RSV und schwächerer neutralisierender Aktivität nimmt die spezifische
Immunreaktion gegen die Proteinsequenzen G und M besonders mit IgM und IgA zu.
Mütter und Kinder zeigen größere Unterschiede in der Aktivität, die eigene Immunreaktion
des Kindes tritt in den Vordergrund.
Bei den Serumpaaren S14, S7, S6, S10, S1, S19, S23 und S24 kommt zu der teilweise
ausgeprägten spezifischen IgG- und IgM-Antwort gegen das RSV und einzelne
Proteinsequenzen verstärkt eine IgA-Antwort von Mutter und Kind hinzu. Mutter und
Kind reagieren unterschiedlicher mit IgG, IgM und IgA, je „unreifer“ die Infektion ist. Die
Kinder reagieren bei den „unreifen“ Immunreaktionen mit IgA gegen die F- und GProteinsequenzen. Hervorzuheben ist hierbei die verstärkte Aktivität der Kinder der
Serumpaare S7, S19, S23 und S27 gegen die F-Proteinsequenz SP7 mit IgA. Diese
Sequenz stellt ein Ziel für eine akute Infektionsabwehr des Kindes in utero bei „unreifer“
Immunitätslage der Mutter dar. Ein weiterer Hinweis für eine „unreife“ Infektion stellt die
unspezifische Erhöhung der IgM-Konzentration bei Mutter und Kind von Serumpaar S10
94
und S14 dar. Bei S1 liegt eine „unreife“ Reaktion der Mutter ohne Auffälligkeiten in der
Reaktion des Kindes vor.
4.4.3 „Unreife“ Immunantwort
Das Serumpaar S26 zeigt eine sehr spezifische Reaktion gegen viele der untersuchten
Proteinsequenzen der G-, F-, M- und N-Proteine und diese deutlich unterschiedlich zu den
anderen Serumpaaren im Kollektiv. Die Aktivitäten bei Mutter und Kind sind überwiegend
gegen dieselben Sequenzen gerichtet, aber mit den einzelnen Immunglobulinklassen
unterschiedlich ausgeprägt. Die Reaktionen finden bei der Mutter überwiegend mit IgM,
IgG und auch IgA statt, beim Kind mit IgA und IgG. Es zeigt sich hier eine nicht mehr
ganz akute Immunreaktion auf dem Boden einer „unreifen“ Immunitätslage der Mutter und
daher keine übertragene Abwehrreaktion gegen RSV auf das Kind. Die mütterliche und die
kindliche Immunreaktion sind zwar sehr spezifisch, zeigen aber bei sehr niedriger
neutralisierender Aktivität und geringer Aktivität gegen RSV wenig Effektivität, weshalb
hier von einer mangelhaften Immunabwehr gegen RSV ausgegangen werden muß.
95
4.5 Unterschiedliche Reaktionsmuster gegen die einzelnen Proteinsequenzen des RSV
Betrachtet man die Ziele der unterschiedlich ausgereiften Immunantwort bezüglich der
einzelnen Proteinsequenzen, so zeigt sich folgendes: Die untersuchten Proteinsequenzen
G, F, M und N stellen ein gutes immunologisches Ziel dar. Ziele für eine „reife“,
diaplazentar übertragene Immunantwort von Müttern und Kindern vor allem mit IgG mit
guter Schutzfunktion gegenüber RSV stellen die fünf G-Proteinsequenzen SP1, SP2, SP3,
SP4 und SP5, die M-Proteinsequenzen SP8 und SP9, die F-Proteinsequenz SP6 und die NProteinsequenz SP10 dar. Die F-Proteinsequenz SP7 ist nicht das Ziel einer „reifen“,
übertragenen Immunabwehr. Ziele für eine „unreife“, spezifische, bei Müttern und Kindern
eigenen Immunantwort mit IgG, IgM und IgA ohne ausreichende Schutzfunktion
gegenüber RSV stellen die G-Proteinsequenzen SP1, SP2 und SP4, die MProteinsequenzen SP8 und SP9 und die F-Proteinsequenz SP7 dar. Die GProteinsequenzen SP3 und SP5 und die N-Proteinsequenz SP10 sind kein Ziel einer
spezifischen eigenen Immunreaktion des Kindes gegen RSV. Bei den Müttern findet sich
eine akute, spezifische IgM-Reaktion gegen die G-Proteinsequenzen SP3 und SP5 und
IgA-Reaktion gegen die N-Proteinsequenz SP10.
Das SP1 ist ein synthetisches Peptid aus der Sequenz 141 - 149 des G-Proteins aus dem
Bereich der hypervariablen Region [50]. Die Region 144 - 159 kann neutralisierende
Antikörper induzieren, welche aber nicht vor einer RSV-Infektion schützen [252].
Aufgrund der vorliegenden Untersuchungen baut diese Sequenz bei einer „reifen“
Immunantwort allerdings einen Schutz gegen RSV auf. In den zitierten Arbeiten wurde
vermutlich die „unreife“ Immunreaktion untersucht, wofür das SP1 ja ein Ziel darstellt. Es
ist daher noch keine Schutzfunktion gegenüber RSV nachweisbar. Das SP2 ist ein
synthetisches Peptid aus dem Bereich der hypervariablen Region der Sequenz 187 – 201
des G-Proteins. Hypervariable Regionen befinden sich zwischen der Position 147 und 207
[50]. Die Region 187 - 200 induziert Antikörper, welche mit dem intakten G-Protein
reagieren und die Infektiosität des RSV hemmen, sowie neutralisierende Antikörper im
Kaninchen produzieren [156;252;253]. Diese Aussage kann durch die vorliegende Arbeit
bestätigt werden. Das SP2 ist das längste der untersuchten vier Peptide aus der Sequenz
des G-Proteins. Das könnte erklären, warum die Serumpaare dieses besonders gut mit IgG
erkennen. Das SP3 und SP4 sind synthetische Peptide aus den Sequenzen 209 – 214 und
217 – 224 des G-Proteins. SP5 ist ein synthetisches Peptid vom distalen Ende des GProteins aus der Sequenz 289 – 298. Die vorliegende Arbeit zeigt, daß die drei
Proteinsequenzen SP3 bis SP5 bei einer „reifen“ Immunantwort einen Schutz gegenüber
96
RSV bewirken. SP6 ist ein synthetisches Peptid aus der Sequenz 130 – 136 des F2-Proteins
aus einem Bereich, der für die Fusion verantwortlich gemacht wird und Kontakt zur
Zellmembran aufnimmt (Sequenz 130-150). Dieser Bereich liegt direkt an der
Spaltungsstelle des F-Proteins. In der vorliegenden Arbeit kann gezeigt werden, daß das
SP6 bei einer „reifen“ Immunitätslage einen guten Schutz gegen RSV bewirkt. SP7 ist ein
synthetisches Peptid aus der Sequenz 221 bis 232 des F1-Proteins. Es können im ersten
Drittel des F1 im Bereich des SP7 neutralisierenden Epitope des RSV ausgemacht werden,
die aber nicht unbedingt einen Schutz vor Infektion bewirken [12;54;55;59;233;254-257].
Diese Aussage kann durch die vorliegende Arbeit bestätigt werden, SP7 ist nicht das Ziel
einer „reifen“ Immunantwort und induziert somit keinen Schutz gegen RSV. SP8 und SP9
sind synthetische Peptide aus den Sequenzen 25 bis 28 und 247 bis 256 des M-Proteins,
welche keinen Schutz vor einer Infektion induzieren aber ein gutes Ziel für zytotoxische
Lymphozyten darstellen [68]. In der vorliegenden Arbeit kann gezeigt werden, daß eine
„reife“ Immunantwort gegen diese Proteinsequenzen aber durchaus einen guten Schutz
darstellen. In der zitierten Arbeit wurden vermutlich (wie bei den zitierten Arbeiten über
SP1) die „unreifen“ Immunreaktionen untersucht, die noch keinen ausreichenden Schutz
gegenüber RSV bewirken. SP10 ist ein synthetisches Peptid aus der Sequenz 19 – 24 des
N-Proteins welches ein gutes Ziel für die zellvermittelte Immunität darstellt. Rekombinant
hergestellte Antikörper gegen diese Sequenz können eine RSV-Infektion reduzieren.
Antikörper gegen die hydrophile Region 11 – 30 erkennen das komplette N-Protein [258].
In der vorliegenden Arbeit kann das SP10 als ein Ziel der „reifen“ Immunantwort und
somit eine gute Schutzfunktion der Immunantwort gegen diese Proteinsequenz bestätigt
werden.
97
4.6 Zusammenfassende Beurteilung der Untersuchungen
Insgesamt findet die Immunabwehr des Kindes gegen RSV auf mehreren Ebenen statt,
wobei die unterschiedlichen Untersuchungen immer nur einen Aspekt der Immunantwort
liefern, für sich alleine aber keinen Einblick in die Gesamtabwehr geben. Durch die
vorliegende Arbeit kann gezeigt werden, daß Mutter und Kind unterschiedlich auf das
RSV antworten, daß also eine modulierte oder selbstgebildete Immunantwort des Feten
zum Zeitpunkt der Geburt existiert [243]. Eine wichtige Rolle spielt aber auch die von der
Mutter auf das Kind übertragene Immunreaktion. Das Spektrum der Immunreaktionen auf
RSV reicht von einer „reifen“ Immunitätslage mit guter Erkennung des RSV durch IgG,
guten neutralisierenden Eigenschaften mit recht „breiter“ Immunreaktion überwiegend
durch IgG gegen RSV und die Proteinsequenzen G, F, M und N, mit gleichgerichteter
Reaktionen bei Mutter und Kind mit guter Schutzfunktion vor RSV, bis zu einer
„unreifen“ Immunitätslage mit zunehmend schlechten neutralisierenden Eigenschaften,
schlechter Erkennung des RSV, zunehmend spezifischer IgM- und IgA-Antwort gegen
RSV und einzelne, vor allem G-, F- und M-Proteinsequenzen mit großen Unterschieden
zwischen Mutter und Kind und daher eigener Immunantwort des Kindes mit schlechter
Schutzfunktion gegen RSV. Die Immunitätslage der Mutter übt je nach Intervall bis zur
Reinfektion, nach „Reife“ der mütterlichen Immunitätslage, nach Stärke und nach
Zeitpunkt der Infektion in der Schwangerschaft einen unterschiedlichen Einfluß auf die
kindliche Immunantwort aus. Diese Befunde lassen eine Reifung der Immunantwort des
Kindes schon auf eine RSV-Infektion der Mutter im Mutterleib und durch Modulation der
Immunantwort des Kindes durch mütterliche Faktoren wie Mediatoren, Immunglobuline
oder RSV-Fragmente vermuten [22;82;167;211;212;214;262-264].
Weil die Untersuchungen zum definierten Zeitpunkt der Geburt durchgeführt werden, kann
bei den vorgefundenen unterschiedlichen „Reifegraden“ der Immunantwort von Mutter
und Kind auf eine präpartale Reifung der Immunantwort geschlossen werden. Diese
Ergebnisse sind der in der Literatur beschriebenen postpartalen Reifung ähnlich, wonach
mit der Anzahl der Reinfektionen mit zunehmendem Alter eine Reifung von einer sehr
spezifischen
Immunantwort
gegen
einzelne
Proteinsequenzen
mit
geringer
neutralisierender Aktivität hin zu einer komplexeren Immunantwort mit zunehmender
neutralisierender
Aktivität
erfolgt,
die
besser
vor
RSV-Infektionen
schützt
[82;100;121;168;169;236;264-266;144]. Eine intrauterine Reifung ist in der Literatur nicht
beschrieben. Ob der Einfluß auf das kindliche Immunsystem durch die übertragenen IgG(und in kleinen Mengen auch andere) Immunglobuline, durch spezifische Subklassen,
98
durch direkten Kontakt mit dem RSV, dessen Bestandteile, durch Immunmodulatoren oder
immunkompetente Zellen geschieht, ist unklar und bedarf weiterer Untersuchungen. PCRUntersuchungen aus dem Serum von RSV-Infizierten zeigen, daß bei allen untersuchten
Kindern eine virämische Phase nachzuweisen ist [261]. Ein Kontakt des Feten intrauterin
mit dem RSV und eine daraus folgende Immunantwort des Feten in Wechselwirkung mit
der mütterlichen Immunantwort ist also möglich [100].
Warum letztendlich ein schlechter Nestschutz gegen das RSV existiert, kann hier nicht
geklärt werden, es ist jedoch anzunehmen, daß die Ursache in der eigenen noch nicht
adäquaten Antwort des Kindes zu suchen ist. Ob die Antwort in der noch auszureifenden
Antikörperantwort auf das RSV oder in anderen Bereichen liegt (z.B. der zellulären
Immunität) würde sich durch eine Untersuchung der SP-spezifischen Antikörperantwort im
Verlauf post partum im Zusammenhang mit der Untersuchung klinischer RSV-Infektionen
des Neugeborenen und des Säuglings klären lassen. Hilfreich wäre dazu auch wieder der
Vergleich von korrespondierenden Seren von Mutter und Kind.
99
4.7 Ausblick
Aufgrund der Vorliegenden Arbeit läßt sich sagen, daß eine unterschiedliche
Immunantwort von Mutter und Kind bezüglich des RSV besteht, daß also eine modulierte
oder selbstgebildete Antwort des Feten existiert. Diese Antwort wird spezifischer und
uneffektiver, je „unreifer“ die Immunitätslage ist. Wünschenswert wären hierzu weitere
Studien, inwieweit diese unterschiedlichen Reaktionsmuster einen Einfluß auf eine
folgende RSV-Infektion im Laufe der Neugeborenen- und Säuglingsperiode haben, wie
diese unterschiedlichen Antworten bezüglich der Immunglobulinsubklassen und eventuell
weiterer Epitope weiter differenziert werden können und wie die mütterliche Modulation,
auch bezüglich einer Impfung der Mutter, auf diese Einfluß nimmt [97;204-206].
Vielleicht besteht im Gegensatz zur postpartal angestrebten Impfung die Möglichkeit
durch die Impfung der Mutter, eventuell schon vor der Schwangerschaft, einen
ausreichenden Nestschutz vor RSV-Erkrankungen aufzubauen und einen positiven
modulierenden Effekt auf die Immunantwort des Neugeborenen auszuüben [108;238;267].
Es hat sich gezeigt, daß die Impfung bei Kindern mit formalininaktiviertem RSV aus
unbekanntem Grund zu einer Exazerbation der Wildviruserkrankung führt, transplazentar
übertragene hohe Antikörpertiter gegen das F- und das G-Protein beim Kind aber einen
Schutz vor Erkrankung bieten [268;269].
Um eine möglichst „reife“ Immunantwort zu übertragen, sollte die Abwehr möglichst
gegen die untersuchten Proteinsequenzen G, F, M und N gerichtet sein, mit guter RSVErkennung
vor
allem
durch
das
IgG
und
guter
neutralisierender
Aktivität
[222;229;237;270-273].
Eine Impfung mit einzelnen synthetischen Peptiden aus den beschriebenen Sequenzen des
RSV ist zu diskutieren. Hervorzuheben sind dabei die G-Proteinsequenz 187 – 201 (SP2),
die F2-Proteinsequenz 130 – 136 (SP6) und die N-Proteinsequenz 19 – 24 (SP10) als in der
Literatur
beschriebene
und
in
der
vorliegenden
Arbeit
bestätigte
Ziele
der
„reifen“Immunabwehr mit guter Schutzfunktion gegenüber RSV. Eine Schutzfunktion der
„reifen“ Immunabwehr gegenüber RSV bieten auch die anderen untersuchten GProteinsequenzen 141 bis 149 (SP1), 209 bis 214 (SP3), 217 bis 224 (SP4) und 289 – 298
(SP5), wobei sich die Angaben in der Literatur möglicherweise nur auf die „unreife“
Immunreaktion beziehen.
100
Nicht verwendet werden sollten vorerst die M-Proteinsequenzen 25 bis 28 (SP8) und 247
bis 256 (SP9), da die beschriebenen zytotoxischen Reaktionen eine mögliche Ursache für
die exazerbierte Wildvirusinfektion durch RSV nach formalininaktivierter Impfung
darstellen könnten, wenn die Schutzfunktion der „reifen“ Immunantwort in der
vorliegenden Arbeit auch gut zu sein scheint. Abzulehnen ist auch die F1-Proteinsequenz
221 bis 232 (SP7), da diese in der vorliegenden Arbeit nur das Ziel einer „unreifen“, nicht
jedoch einer „reifen“ Immunreaktion darstellt.
101
5 Zusammenfassung
Das Respiratory Syncytial Virus (RSV) ist der häufigste virale Erreger von Infektionen des
unteren Respirationstraktes bei Säuglingen und Kleinkindern. Die Immunantwort des
Neugeborenen auf das RSV ist ungeklärt. Die RSV-Infektionen sind durch
altersspezifische Erkrankungen gekennzeichnet, wobei der anfängliche Nestschutz
innerhalb der ersten Lebenswochen nachläßt. Die Immunantwort erfährt durch wiederholte
Infektion mit dem RSV eine „Reifung“. Zur Klärung der Immunantwort Neugeborener auf
das RSV werden die Antikörperkonzentrationen IgG und IgM, die Neutralisationsfähigkeit
von RSV in vitro, die Immunantwort gegenüber RSV mit IgG, IgM und IgA und die
epitopspezifische Immunantwort des Neugeborenen mit IgG, IgM und IgA gegen einzelne
Sequenzen der G-, F-, M- und N-Proteine im Vergleich zur Mutter untersucht und
miteinander verglichen.
Die vorliegende Arbeit zeigt, daß eine eigene, spezifische Immunantwort des Feten gegen
RSV zum Zeitpunkt der Geburt existiert. Eine wichtige Rolle spielt aber auch die von der
Mutter auf das Kind übertragene Immunreaktion. Es zeigt sich eine präpartale Reifung der
Immunantwort des Kindes auf eine RSV-Infektion der Mutter während oder vor der
Schwangerschaft. Das Spektrum der Immunreaktionen auf RSV reicht von einer „reifen“
bis hin zu einer „unreifen“ Immunitätslage. Die „reife“ Immunitätslage ist dabei
gekennzeichnet durch eine gute Erkennung des RSV durch IgG und IgM, durch gute
neutralisierenden Eigenschaften, durch Erkennung aller untersuchten Peptidsequenzen und
durch Immunreaktionen gegen die Proteinsequenzen G, F, M und N. Diese
Immunreaktionen sind bei Mutter und Kind gleichgerichtet. Sie läßt eine diaplazentare
Übertragung von der Mutter auf das Kind vermuten, aber auch eine Modulation der
Immunantwort des Kindes durch Immunmediatoren, Immunglobuline oder RSVFragmente. In der vorliegenden Arbeit läßt sich ein deutlicher Zusammenhang zwischen
der neutralisierenden Aktivität und dem RSV-spezifischen ELISA mit IgG zeigen, welcher
auf einen guten Schutz gegen RSV schließen läßt.
Die
„unreife“
Immunitätslage
ist
gekennzeichnet
durch
zunehmend
schlechte
neutralisierende Eigenschaften, durch schlechte Erkennung des RSV, durch zunehmend
spezifische IgM- und IgA-Antwort gegen einzelne, vor allem G-, F- und MProteinsequenzen mit großen Unterschieden zwischen Mutter und Kind und daher eigener
102
Immunantwort des Kindes mit schlechter Schutzfunktion gegen RSV. Die Immunitätslage
der Mutter übt je nach Intervall bis zur Reinfektion, nach „Reife“ der mütterlichen
Immunitätslage, nach Stärke und nach Zeitpunkt der Infektion in der Schwangerschaft
einen unterschiedlichen Einfluß auf die kindliche Immunantwort aus. Diese Befunde lassen
eine Reifung der Immunantwort des Kindes schon auf eine RSV-Infektion der Mutter im
Mutterleib und durch Modulation der Immunantwort des Kindes durch mütterliche
Faktoren wie Mediatoren, Immunglobuline oder RSV-Fragmente vermuten. In der
vorliegenden Untersuchung zeigt sich, daß eine spezifische Immunantwort gegen einzelne
Sequenzen der G- und F-Proteine mit IgG, IgM und IgA, die nicht auf dem Boden einer
„reifen“ Immunitätslage vorliegt, keine wirksame Aktivität gegenüber RSV und somit
wahrscheinlich keinen Schutz vor einer RSV-Infektion aufbaut.
103
6 Anhang
6.1 Tabellen- und Abbildungsverzeichnis
Tabelle 1:
Synthetische Peptide SP1-SP10 aus der Sequenz der RSV Proteine G, F,
M und N und deren Position
Abbildung 1:
Elektronenmikroskopische Aufnahme des Respiratory Syncytial Virus
(RSV) mit Lokalisation der Proteine; Aus der Arbeitsgruppe H.-J.
Streckert; H. Werchau, Medizinische Mikrobiologie und Virologie und
S. Philippou, Institut für Pathologie der Ruhr-Universität Bochum
Abbildung 2:
Primärstruktur des G-Proteins des RSV
Abbildung 3:
Primärstruktur des F-Proteins des RSV
Abbildung 4:
Lasernephelometrisch bestimmte IgG-Konzentrationen
Abbildung 5:
Errechnete IgG-Konzentrationsdifferenzen
Abbildung 6:
Lasernephelometrisch bestimmte IgM-Konzentrationen
Abbildung 7:
Neutralisationstiterstufen im RSV-Mikroneutralisationstest
Abbildung 8:
Unterschiede der Neutralisationstiterstufen zwischen Mutter und Kind
im RSV-Mikroneutralisationstest
Abbildung 9:
Signalstärke im RSV-spezifischen ELISA mit Antikörpern der IgGesamt
(IgG, IgA, IgM)-, IgG-, und IgM-Immunglobulinklassen
Abbildung 10:
Errechnete Signalstärkedifferenzen im RSV-spezifischen ELISA mit
Antikörpern der IgGesamt (IgG, IgA, IgM)-, IgG- und IgMImmunglobulinklassen
Abbildung 11:
Signalstärke im SP-spezifischen ELISA gegen das synthetische Peptid
SP1 aus der Sequenz des RSV-G-Proteins mit IgGesamt (IgG, IgA,
IgM), IgG und IgM-Antikörpern
Abbildung 12:
Signalstärke im SP-spezifischen ELISA gegen das synthetische Peptid
SP2 aus der Sequenz des RSV-G-Proteins mit IgGesamt (IgG, IgA,
IgM), IgG und IgM-Antikörpern
Abbildung 13:
Signalstärke im SP-spezifischen ELISA gegen das synthetische Peptid
SP3 aus der Sequenz des RSV-G-Proteins mit IgGesamt (IgG, IgA,
IgM), IgG und IgM-Antikörpern
Abbildung 14:
Signalstärke im SP-spezifischen ELISA gegen das synthetische Peptid
SP4 aus der Sequenz des RSV-G-Proteins mit IgGesamt (IgG, IgA,
I
IgM), IgG und IgM-Antikörpern
Abbildung 15:
Signalstärke im SP-spezifischen ELISA gegen das synthetische Peptid
SP5 aus der Sequenz des RSV-G-Proteins mit IgGesamt (IgG, IgA,
IgM), IgG und IgM-Antikörpern
Abbildung 16:
Signalstärke im SP-spezifischen ELISA gegen das synthetische Peptid
SP6 aus der Sequenz des RSV-G-Proteins mit IgGesamt (IgG, IgA,
IgM), IgG und IgM-Antikörpern
Abbildung 17:
Signalstärke im SP-spezifischen ELISA gegen das synthetische Peptid
SP7 aus der Sequenz des RSV-G-Proteins mit IgGesamt (IgG, IgA,
IgM), IgG und IgM-Antikörpern
Abbildung 18:
Signalstärke im SP-spezifischen ELISA gegen das synthetische Peptid
SP8 aus der Sequenz des RSV-G-Proteins mit IgGesamt (IgG, IgA,
IgM), IgG und IgM-Antikörpern
Abbildung 19:
Signalstärke im SP-spezifischen ELISA gegen das synthetische Peptid
SP9 aus der Sequenz des RSV-G-Proteins mit IgGesamt (IgG, IgA,
IgM), IgG und IgM-Antikörpern
Abbildung 20:
Signalstärke im SP-spezifischen ELISA gegen das synthetische Peptid
SP10 aus der Sequenz des RSV-G-Proteins mit IgGesamt (IgG, IgA,
IgM), IgG und IgM-Antikörpern
II
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6.3 Meßwerte
Lasernephelometrie
Test
Nephelom.
Array 360
Referenzintervall
mg/dl
1000-1500 636-1750 200-250
Antikörper
IgG
IgG
IgM
Serum
Mutter
Kind/NS Mutter
2
3
5
6
7
8
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
26
27
Mittelw
Stabw
Max
Min
Anzahl
802
762
576
778
512
838
832
412
836
422
892
820
644
1202
950
872
1110
1236
660
754
786
530
412
6-25
IgM
Kind/NS
1220
1198
950
1242
768
1070
1206
944
1194
1070
1184
990
798
1424
1642
772
712
990
578
984
560
1332
1254
238
110
72
124
129
162
362
77
87
90
262
104
91
159
108
190
105
248
109
175
86
63
60
4
12
10
13
12
31
24
4
4
4
26
4
4
13
18
14
4
14
4
10
9
17
13
766,870 1047,043
224,677 263,175
1236,000 1642,000
412,000 560,000
23
23
139,609
74,406
362
60
23
11,652
7,516
31
4
23
XXVI
RSV-Mikroneutralisationstest
Test
Zellen
Antigen
Ag.-Konz
Antikörper
Serum
NT
HEp-2
RSV
50 PFU
Seren
M-Titer
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
Mittelw
Stabw
Max
Min
Anzahl
K-Titer
100
800
800
400
6400
200
200
400
400
200
100
400
200
400
100
400
200
200
400
100
200
400
400
200
800
50
800
200
1600
800
200
3200
400
200
800
200
100
200
200
100
400
100
400
200
400
200
400
200
200
400
400
800
0
400
564,815
1166,017
6400
50
27
470,370
622,310
3200
0
27
XXVII
RSV spezifischer ELISA IgGesamt
Test
Fänger
Fänger-Verd.
Antigen
Ag.-Verd.
Antikörper
Ak.-Verd.
Serum-Verd.
Serum
ELISA-Ig-Gesamt (IgG, IgA, IgM)
B 98
1/2000
RSV-L M
RSV-L K
HEp-L M
1/500
N-G/Hu-Ig/POD
1/2000
1/500
Mutter
Kind/NS
Mutter
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
Mittelw
Stabw
Max
Min
Anzahl
HEp-L K
Kind/NS
0,095
0,162
0,099
0,156
0,117
0,085
0,100
0,072
0,112
0,107
0,056
0,089
0,074
0,082
0,068
0,100
0,068
0,080
0,058
0,072
0,094
0,076
0,119
0,120
0,126
0,044
0,204
0,093
0,204
0,154
0,147
0,163
0,133
0,127
0,081
0,107
0,086
0,072
0,104
0,094
0,117
0,072
0,107
0,085
0,093
0,120
0,090
0,111
0,095
0,143
0,129
0,166
0,033
0,198
0,022
0,028
0,023
0,021
0,017
0,021
0,019
0,027
0,025
0,018
0,017
0,018
0,016
0,020
0,019
0,025
0,024
0,023
0,023
0,018
0,021
0,020
0,020
0,019
0,015
0,026
0,017
0,015
0,024
0,017
0,016
0,016
0,021
0,019
0,028
0,023
0,016
0,019
0,023
0,020
0,018
0,017
0,020
0,020
0,020
0,031
0,014
0,021
0,016
0,018
0,021
0,016
0,021
0,018
0,098
0,035
0,204
0,044
27
0,116
0,038
0,204
0,033
27
0,021
0,003
0,028
0,015
27
0,020
0,004
0,031
0,014
27
XXVIII
RSV spezifischer ELISA IgG
Test
Fänger
F.-Verd.
Antigen
Ag.-Verd.
Antikörper
Ak.-Verd.
Serum-Verd.
Serum
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
Mittelw
Stabw
Max
Min
Anzahl
ELISA-IgG
B 98
1/2000
RSV-L M
RSV-L K
1/500
S-/Hu-IgG/POD
1/1000
1/500
Mutter
Kind/NS
HEp-L M
HEp-L K
Mutter
Kind/NS
0,271
0,520
0,396
0,523
0,454
0,446
0,398
0,281
0,350
0,250
0,206
0,320
0,329
0,241
0,276
0,310
0,285
0,360
0,394
0,420
0,408
0,394
0,327
0,347
0,437
0,241
0,454
0,286
0,570
0,404
0,492
0,568
0,483
0,442
0,287
0,312
0,318
0,265
0,406
0,354
0,318
0,294
0,354
0,320
0,394
0,508
0,470
0,531
0,456
0,343
0,380
0,544
0,169
0,516
0,110
0,167
0,180
0,283
0,224
0,282
0,212
0,122
0,141
0,095
0,082
0,127
0,106
0,120
0,145
0,140
0,136
0,153
0,237
0,214
0,258
0,195
0,110
0,137
0,145
0,168
0,130
0,108
0,136
0,163
0,261
0,281
0,377
0,212
0,134
0,122
0,135
0,126
0,329
0,108
0,210
0,161
0,167
0,220
0,294
0,331
0,288
0,395
0,408
0,177
0,145
0,143
0,120
0,476
0,357
0,084
0,523
0,206
27
0,399
0,104
0,570
0,169
27
0,164
0,055
0,283
0,082
27
0,223
0,104
0,476
0,108
27
XXIX
RSV spezifischer ELISA IgM
Test
Fänger
F.-Verd.
Antigen
Ag.-Verd.
Antikörper
Ak.-Verd.
Serum-Verd.
Serum
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
Mittelw
Stabw
Max
Min
Anzahl
ELISA-IgM
B 98
1/2000
RSV-L M
RSV-L K
1/500
S-/Hu-IgM/POD
1/1000
1/500
Mutter
Kind/NS
HEp-L M
HEp-L K
Mutter
Kind/NS
0,171
0,190
0,058
0,199
0,045
0,119
0,158
0,085
0,126
0,138
0,083
0,044
0,095
0,186
0,053
0,129
0,116
0,084
0,132
0,145
0,139
0,163
0,169
0,103
0,175
0,133
0,041
0,016
0,016
0,016
0,017
0,017
0,016
0,017
0,016
0,016
0,017
0,017
0,019
0,018
0,023
0,020
0,018
0,019
0,019
0,021
0,020
0,021
0,018
0,017
0,019
0,021
0,017
0,018
0,170
0,184
0,053
0,199
0,042
0,100
0,095
0,083
0,117
0,117
0,075
0,042
0,094
0,170
0,046
0,126
0,112
0,083
0,112
0,119
0,099
0,084
0,150
0,078
0,153
0,109
0,039
0,016
0,016
0,015
0,017
0,016
0,017
0,016
0,017
0,016
0,017
0,017
0,018
0,017
0,022
0,019
0,016
0,018
0,019
0,021
0,019
0,020
0,018
0,018
0,018
0,019
0,016
0,018
0,121
0,047
0,199
0,041
27
0,018
0,002
0,023
0,016
27
0,106
0,043
0,199
0,039
27
0,018
0,002
0,022
0,015
27
XXX
Peptid-ELISA IgGesamt
Test
Peptid
Serum
ELISA-Ig-Gesamt
SP 1
Mutter
Kind/NS
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
Mittelw
Stabw
Max
Min
Anzahl
SP 2
Mutter
Kind/NS
0,281
1,631
0,256
0,272
0,196
2,737
0,366
0,499
0,206
0,585
0,440
0,264
0,550
2,376
0,437
2,508
0,580
1,014
0,449
0,239
0,387
0,226
0,285
0,456
0,281
2,265
0,391
0,234
1,040
0,179
0,196
0,184
3,000
0,271
0,254
0,358
0,270
0,425
0,163
0,445
2,204
0,362
2,024
0,458
1,850
1,873
0,700
0,352
0,222
0,188
0,500
0,339
1,873
0,406
0,648
0,833
0,534
0,736
0,440
0,804
0,536
1,116
1,350
0,788
1,016
0,796
1,110
0,973
0,750
1,669
0,825
1,064
2,448
0,826
0,860
1,024
1,074
1,624
0,867
1,201
0,607
0,479
0,819
0,568
0,798
0,440
1,225
0,518
0,832
0,828
0,925
0,753
0,834
1,076
0,789
0,676
0,984
0,608
0,938
2,221
0,769
0,761
1,046
0,933
1,653
0,833
0,845
0,483
0,747
0,776
2,737
0,196
27
0,754
0,784
3,000
0,163
27
0,982
0,410
2,448
0,440
27
0,875
0,361
2,221
0,440
27
XXXI
Peptid-ELISA IgGesamt
Test
Peptid
Serum
ELISA-Ig-Gesamt
SP 3
Mutter
Kind/NS
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
Mittelw
Stabw
Max
Min
Anzahl
SP 4
Mutter
Kind/NS
0,405
0,592
0,421
0,370
0,322
0,397
0,695
0,635
0,417
0,670
0,479
0,429
0,448
0,631
0,466
0,600
0,649
0,629
0,506
0,418
0,532
0,468
0,552
0,416
0,436
0,583
0,437
0,375
0,464
0,381
0,338
0,325
0,500
0,591
0,515
0,429
0,438
0,399
0,360
0,362
0,450
0,428
0,422
0,488
0,615
0,654
0,458
0,492
0,436
0,409
0,409
0,418
0,461
0,402
0,212
0,406
0,294
0,466
0,234
0,385
0,169
0,208
0,094
0,232
0,172
0,162
0,169
0,356
0,227
0,300
0,420
0,271
0,200
0,157
0,243
0,166
0,266
0,130
0,176
0,403
0,269
0,154
0,196
0,204
0,147
0,154
0,418
0,095
0,093
0,102
0,135
0,107
0,086
0,090
0,171
0,462
0,206
0,260
0,243
0,233
0,186
0,185
0,121
0,147
0,151
0,150
0,304
0,120
0,504
0,102
0,695
0,322
27
0,445
0,078
0,654
0,325
27
0,251
0,097
0,466
0,094
27
0,182
0,091
0,462
0,086
27
XXXII
Peptid-ELISA IgGesamt
Test
Peptid
Serum
ELISA-Ig-Gesamt
SP 5
Mutter
Kind/NS
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
Mittelw
Stabw
Max
Min
Anzahl
SP 6
Mutter
Kind/NS
0,347
0,441
0,379
0,507
0,225
1,026
0,167
0,192
0,125
0,170
0,150
0,127
0,137
0,320
0,249
0,413
0,400
0,247
0,188
0,135
0,184
0,275
0,429
0,400
0,294
0,758
0,216
0,151
0,468
0,356
0,228
0,271
0,698
0,101
0,117
0,164
0,126
0,103
0,086
0,094
0,212
0,212
0,278
0,343
0,247
0,362
0,155
0,159
0,270
0,375
0,421
0,251
0,445
0,139
0,269
1,482
0,212
0,245
0,179
2,548
0,256
0,339
0,199
0,436
0,338
0,208
0,320
2,197
0,354
2,229
0,563
1,060
0,461
0,249
0,409
0,227
0,412
0,647
0,386
2,519
0,382
0,243
1,020
0,195
0,232
0,180
3,000
0,168
0,208
0,352
0,280
0,328
0,167
0,273
2,032
0,312
1,707
0,537
1,504
1,368
0,650
0,368
0,272
0,210
0,835
0,416
2,144
0,341
0,315
0,200
1,026
0,125
27
0,253
0,142
0,698
0,086
27
0,708
0,748
2,548
0,179
27
0,716
0,737
3,000
0,167
27
XXXIII
Peptid-ELISA IgGesamt
Test
Peptid
Serum
ELISA-Ig-Gesamt
SP 7
Mutter
Kind/NS
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
Mittelw
Stabw
Max
Min
Anzahl
SP 8
Mutter
Kind/NS
0,189
0,275
0,161
0,183
0,134
0,294
0,343
0,160
0,157
0,182
0,178
0,168
0,160
0,228
0,180
0,275
0,288
0,243
0,155
0,112
0,172
0,235
0,308
0,253
0,250
0,456
0,161
0,137
0,265
0,163
0,122
0,128
0,341
0,381
0,131
0,139
0,174
0,155
0,130
0,123
0,183
0,160
0,212
0,233
0,224
0,220
0,156
0,143
0,249
0,387
0,302
0,235
0,212
0,125
0,322
0,945
0,237
0,208
0,135
0,713
0,255
0,335
0,150
0,314
0,372
0,253
0,283
1,221
0,362
1,947
0,693
0,810
0,388
0,228
0,352
0,218
0,420
0,514
0,250
1,183
0,440
0,201
0,721
0,184
0,143
0,136
1,491
0,163
0,172
0,288
0,183
0,383
0,178
0,234
0,944
0,306
1,441
0,595
1,280
1,036
0,545
0,274
0,251
0,193
0,654
0,222
0,912
0,356
0,219
0,075
0,456
0,112
27
0,201
0,077
0,387
0,122
27
0,502
0,405
1,947
0,135
27
0,499
0,411
1,491
0,136
27
XXXIV
Peptid-ELISA IgGesamt
Test
Peptid
Serum
ELISA-Ig-Gesamt
SP 9
Mutter
Kind/NS
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
Mittelw
Stabw
Max
Min
Anzahl
SP 10
Mutter
Kind/NS
0,356
0,659
0,188
0,132
0,125
0,286
0,204
0,255
0,241
0,231
0,181
0,125
0,135
0,275
0,230
0,281
0,302
0,274
0,175
0,140
0,186
0,241
0,165
0,117
0,155
0,527
0,227
0,192
0,880
0,183
0,104
0,099
0,284
0,180
0,233
0,181
0,283
0,109
0,104
0,094
0,210
0,171
0,212
0,233
0,276
0,237
0,174
0,166
0,126
0,132
0,132
0,147
0,428
0,141
0,281
0,300
0,269
0,220
0,114
0,200
0,172
0,178
0,151
0,153
0,161
0,150
0,218
2,894
0,202
0,283
0,295
0,232
0,151
0,110
0,160
0,140
0,195
0,115
0,123
0,539
0,175
0,153
0,436
0,168
0,150
0,100
0,318
0,103
0,142
0,141
0,154
0,107
0,086
0,093
0,170
0,141
0,189
0,234
0,192
0,212
0,143
0,165
0,141
0,120
0,121
0,119
0,393
0,128
0,238
0,119
0,659
0,117
27
0,212
0,150
0,880
0,094
27
0,303
0,515
2,894
0,110
27
0,171
0,084
0,436
0,086
27
XXXV
Peptid-ELISA IgG
Test
Peptid
Serum
ELISA-Ig-G
SP 1
Mutter
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
Mittelw
Stabw
Max
Min
Anzahl
Kind/NS
SP 2
Mutter
Kind/NS
0,204
0,558
0,390
0,448
0,432
1,235
0,304
0,245
0,216
0,214
0,283
0,132
0,333
1,338
0,498
1,520
0,429
0,536
0,395
0,296
0,216
0,273
0,197
0,220
0,136
1,177
0,241
0,164
0,741
0,376
0,441
0,314
1,681
0,225
0,188
0,203
0,239
0,370
0,142
0,412
1,231
0,333
1,197
0,396
0,603
0,544
0,281
0,350
0,271
0,163
0,386
0,187
1,647
0,218
0,462
0,495
0,912
0,806
0,503
0,655
0,454
0,745
0,641
0,406
0,678
0,516
0,625
0,825
0,898
1,274
0,804
0,744
0,917
0,496
0,379
0,683
0,591
0,957
0,516
0,768
0,441
0,342
0,914
0,694
0,583
0,345
1,256
0,408
0,587
0,452
0,912
0,438
0,448
0,596
0,636
0,599
0,900
0,648
0,623
1,225
0,452
0,997
0,512
0,566
0,803
0,975
0,555
0,324
0,462
0,378
1,520
0,132
27
0,493
0,427
1,681
0,142
27
0,674
0,206
1,274
0,379
27
0,659
0,252
1,256
0,324
27
XXXVI
Peptid-ELISA IgG
Test
Peptid
Serum
ELISA-Ig-G
SP 3
Mutter
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
Mittelw
Stabw
Max
Min
Anzahl
Kind/NS
SP 4
Mutter
Kind/NS
0,408
0,421
0,547
0,603
0,566
0,486
0,475
0,433
0,418
0,394
0,462
0,343
0,362
0,593
0,567
0,536
0,512
0,537
0,605
0,414
0,474
0,421
0,374
0,385
0,352
0,591
0,402
0,360
0,454
0,611
0,616
0,393
0,559
0,508
0,465
0,375
0,425
0,337
0,343
0,384
0,475
0,406
0,507
0,529
0,422
0,508
0,396
0,528
0,471
0,414
0,379
0,274
0,522
0,325
0,245
0,245
0,553
0,520
0,343
0,298
0,314
0,302
0,210
0,328
0,310
0,237
0,266
0,504
0,484
0,426
0,457
0,336
0,466
0,302
0,446
0,326
0,229
0,306
0,314
0,429
0,312
0,196
0,350
0,364
0,350
0,231
0,444
0,310
0,295
0,239
0,291
0,274
0,264
0,261
0,378
0,312
0,458
0,553
0,408
0,354
0,381
0,412
0,288
0,343
0,295
0,420
0,282
0,264
0,470
0,083
0,605
0,343
27
0,444
0,086
0,616
0,274
27
0,352
0,096
0,553
0,210
27
0,334
0,079
0,553
0,196
27
XXXVII
Peptid-ELISA IgG
Test
Peptid
Serum
ELISA-Ig-G
SP 5
Mutter
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
Mittelw
Stabw
Max
Min
Anzahl
Kind/NS
SP 6
Mutter
Kind/NS
0,190
0,206
0,566
0,454
0,255
0,569
0,260
0,261
0,230
0,195
0,203
0,198
0,197
0,389
0,405
0,364
0,405
0,372
0,340
0,229
0,174
0,372
0,296
0,356
0,271
0,364
0,226
0,175
0,271
0,444
0,343
0,284
0,621
0,214
0,271
0,210
0,256
0,270
1,425
0,197
0,314
0,270
0,364
0,432
0,292
0,316
0,169
0,327
0,298
0,322
0,338
0,404
0,318
0,200
0,210
0,518
0,379
0,424
0,364
0,729
0,348
0,218
0,197
0,203
0,206
0,118
0,232
1,149
0,445
1,256
0,502
0,429
0,430
0,208
0,186
0,394
0,197
0,204
0,288
1,237
0,247
0,179
0,722
0,401
0,372
0,302
1,205
0,195
0,182
0,196
0,284
0,294
0,149
0,253
1,106
0,288
0,996
0,432
0,519
0,568
0,239
0,343
0,180
0,149
0,300
0,322
1,554
0,222
0,309
0,108
0,569
0,174
27
0,346
0,231
1,425
0,169
27
0,419
0,311
1,256
0,118
27
0,443
0,357
1,554
0,149
27
XXXVIII
Peptid-ELISA IgG
Test
Peptid
Serum
ELISA-Ig-G
SP 7
Mutter
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
Mittelw
Stabw
Max
Min
Anzahl
Kind/NS
SP 8
Mutter
Kind/NS
0,187
0,208
0,625
0,438
0,200
0,310
0,377
0,202
0,161
0,193
0,188
1,685
0,165
0,386
0,362
0,265
0,320
0,434
0,268
0,232
0,188
0,302
0,257
0,308
0,300
0,282
0,225
0,182
0,267
0,402
0,302
0,164
0,281
0,434
0,227
0,155
0,256
0,187
0,237
0,204
0,276
0,241
0,364
0,362
0,395
0,230
0,164
0,281
0,262
0,316
0,266
0,350
0,252
0,147
0,296
0,479
0,462
0,527
0,247
0,389
0,412
0,348
0,273
0,291
0,381
0,272
0,316
0,812
0,520
1,274
0,643
0,483
0,504
0,188
0,288
0,300
0,245
0,218
0,212
0,748
0,366
0,231
0,584
0,457
0,376
0,243
0,695
0,310
0,237
0,285
0,308
0,358
0,243
0,249
0,661
0,318
1,004
0,637
0,450
0,445
0,352
0,341
0,356
0,222
0,339
0,199
0,950
0,254
0,336
0,284
1,685
0,161
27
0,267
0,078
0,434
0,147
27
0,426
0,228
1,274
0,188
27
0,411
0,210
1,004
0,199
27
XXXIX
Peptid-ELISA IgG
Test
Peptid
Serum
ELISA-Ig-G
SP 9
Mutter
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
Mittelw
Stabw
Max
Min
Anzahl
Kind/NS
SP 10
Mutter
Kind/NS
0,339
0,471
0,567
0,408
0,339
0,265
0,403
0,432
0,267
0,298
0,342
0,247
0,295
0,511
0,520
0,406
0,475
0,421
0,487
0,229
0,394
0,339
0,308
0,310
0,302
0,491
0,314
0,259
0,428
0,343
0,304
0,235
0,336
0,302
0,314
0,277
0,332
0,296
0,286
0,295
0,506
0,306
0,507
0,466
0,600
0,286
0,420
0,475
0,421
0,343
0,326
0,457
0,441
0,290
0,222
0,392
0,472
0,280
0,195
0,231
0,314
0,241
0,222
0,228
0,254
0,192
0,232
0,425
0,368
0,295
0,326
0,390
0,386
0,290
0,239
0,393
0,269
0,356
0,281
0,379
0,281
0,243
0,377
0,239
0,168
0,181
0,247
0,227
0,214
0,199
0,322
0,253
0,228
0,206
0,312
0,208
0,322
0,354
0,322
0,300
0,183
0,412
0,264
0,282
0,314
0,316
0,310
0,192
0,377
0,092
0,567
0,229
27
0,365
0,091
0,600
0,235
27
0,302
0,075
0,472
0,192
27
0,266
0,064
0,412
0,168
27
XL
Peptid-ELISA IgM
Test
Peptid
Serum
ELISA-Ig-M
SP 1
Mutter
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
Mittelw
Stabw
Varianz
Max
Min
Anzahl
Kind/NS
SP 2
Mutter
Kind/NS
0,871
0,653
0,129
0,644
0,068
0,172
0,090
0,702
0,343
0,769
0,095
0,064
0,281
0,897
0,253
0,875
1,475
0,090
0,136
0,661
0,454
0,198
0,103
0,064
0,117
0,783
0,202
0,014
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0,026
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0,024
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0,002
0,007
0,009
0,015
0,017
0,015
0,868
1,189
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0,487
1,122
2,693
1,377
1,122
0,627
1,018
1,118
0,637
0,298
0,663
1,173
0,527
0,704
0,354
0,807
2,059
2,266
1,725
1,745
0,516
0,195
0,031
0,044
0,062
0,082
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0,255
0,130
0,141
0,069
0,206
0,081
0,088
0,076
0,056
0,116
0,077
0,129
0,065
0,151
0,252
0,177
0,210
0,212
0,019
0,042
0,414
0,361
0,130
1,475
0,064
27
0,024
0,012
0,000
0,055
0,002
27
1,014
0,631
0,398
2,693
0,195
27
0,111
0,067
0,004
0,255
0,019
27
XLI
Peptid-ELISA IgM
Test
Peptid
Serum
ELISA-Ig-M
SP 3
Mutter
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
Mittelw
Stabw
Max
Min
Anzahl
Kind/NS
SP 4
Mutter
Kind/NS
1,229
3,000
0,138
0,519
0,086
0,235
0,145
0,482
0,201
0,615
0,129
0,114
0,454
0,890
0,336
0,900
1,477
0,245
0,942
0,595
0,833
0,147
0,212
0,070
0,230
1,925
2,408
0,230
0,090
0,035
0,019
0,030
0,066
0,031
0,035
0,026
0,048
0,023
0,024
0,029
0,105
0,068
0,065
0,079
0,078
0,112
0,053
0,110
0,017
0,018
0,032
0,030
0,149
0,052
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1,233
0,145
0,740
0,094
0,247
0,153
0,911
0,653
0,936
0,138
0,132
0,636
1,649
0,572
1,052
1,754
0,253
1,538
0,628
1,002
0,259
0,245
0,060
0,262
0,906
0,329
0,016
0,030
0,019
0,025
0,018
0,048
0,017
0,008
0,016
0,026
0,016
0,016
0,019
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0,033
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0,007
0,004
0,008
0,018
0,019
0,028
0,687
0,734
3,000
0,070
27
0,061
0,047
0,230
0,017
27
0,642
0,489
1,754
0,060
27
0,027
0,018
0,099
0,004
27
XLII
Peptid-ELISA IgM
Test
Peptid
Serum
ELISA-Ig-M
SP 5
Mutter
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
Mittelw
Stabw
Max
Min
Anzahl
Kind/NS
SP 6
Mutter
Kind/NS
0,462
0,233
0,116
0,377
0,066
0,196
0,155
0,453
0,241
0,320
0,109
0,068
0,172
0,470
0,183
0,318
0,438
0,229
0,462
0,186
0,625
0,257
0,285
0,125
0,375
0,232
0,090
0,008
0,015
0,010
0,010
0,009
0,029
0,005
0,009
0,008
0,019
0,014
0,015
0,017
0,050
0,028
0,029
0,038
0,024
0,036
0,023
0,039
0,119
0,081
0,074
0,021
0,010
0,013
0,507
0,384
0,115
0,354
0,053
0,105
0,109
0,271
0,141
0,218
0,117
0,052
0,264
0,911
0,216
0,600
0,652
0,086
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0,021
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0,021
0,022
0,074
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0,032
0,025
0,033
0,001
0,010
0,015
0,010
0,016
0,019
0,268
0,144
0,625
0,066
27
0,028
0,026
0,119
0,005
27
0,242
0,205
0,911
0,052
27
0,024
0,015
0,074
0,001
27
XLIII
Peptid-ELISA IgM
Test
Peptid
Serum
ELISA-Ig-M
SP 7
Mutter
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
Mittelw
Stabw
Max
Min
Anzahl
Kind/NS
SP 8
Mutter
Kind/NS
0,385
0,872
0,273
0,627
0,576
0,264
0,278
0,352
0,265
0,512
0,230
0,162
0,196
0,241
0,117
0,147
0,504
0,090
0,174
0,151
0,258
0,261
0,294
0,101
0,479
0,288
0,098
0,029
0,026
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0,039
0,030
0,031
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0,024
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0,025
0,046
0,023
0,028
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0,035
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0,093
0,270
0,600
0,257
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0,015
0,023
0,014
0,304
0,183
0,872
0,090
27
0,035
0,020
0,107
0,015
27
0,318
0,245
1,034
0,067
27
0,024
0,011
0,058
0,007
27
XLIV
Peptid-ELISA IgM
Test
Peptid
Serum
ELISA-Ig-M
SP 9
Mutter
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
Mittelw
Stabw
Max
Min
Anzahl
Kind/NS
SP 10
Mutter
Kind/NS
0,235
0,139
0,119
0,235
0,145
0,185
0,145
0,208
0,090
0,160
0,078
0,046
0,298
0,255
0,167
0,204
0,504
0,127
0,214
0,142
0,312
0,094
0,101
0,058
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0,189
0,037
0,016
0,031
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0,002
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0,019
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0,033
0,064
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0,024
0,048
0,007
0,000
0,004
0,002
0,017
0,016
0,173
0,096
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0,037
27
0,026
0,015
0,061
0,002
27
0,208
0,100
0,452
0,062
27
0,027
0,022
0,106
0,000
27
XLV
Testvalidierung Mütter:
Test:
Datum:
Fänger:
F.-Konz.:
Antigen:
Ag.-Verd.:
Antikörper:
Ak.-Verd.:
SerumVerd.:
001M-K/H
002M-K/H
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013M-K/H
001M-K/Bo
002M-K/Bo
003M-K/Bo
004M-K/Bo
005M-K/Bo
006M-K/Bo
007M-K/Bo
008M-K/Bo
009M-K/Bo
010M-K/Bo
011M-K/Bo
012M-K/Bo
013M-K/Bo
014M-K/Bo
ELISA-Ig-Gesamt (IgG, IgA, IgM)
04.06.'93
B 98
1/2000
RSV-L M minus HEp-L M
1/100; 1/200; 1/400; 1/800
N-G/Hu/POD
1/2000
Serum r
a
b
1
2
3
4
5
6
7
8
9
10
11
12
13
14
15
16
17
18
19
20
21
22
23
24
25
26
27
Mittelw
Min
Max
0,9919
0,9961
0,9962
0,9456
0,9708
0,9437
0,9722
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0,9645
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0,9884
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0,9929
0,9849
0,9466
0,9681
0,9274
0,9676
0,9777
0,9923
0,9722
0,9879
0,9857
0,9691
0,8685
0,9976
0,1161
0,3628
0,2048
0,3386
0,2504
0,1807
0,1727
0,0861
0,2049
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0,1751
0,1541
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0,1823
0,3093
0,1589
0,1801
0,1638
0,2524
0,2344
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0,3556
0,3058
0,4140
0,0460
0,6026
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24,5009
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19,9026
29,5722
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20,4035
21,2243
16,4591
15,3878
27,5548
26,4904
27,2139
22,3165
31,6870
21,0435
23,6104
37,1826
14,4974
11,6661
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0,0955
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0,0960
0,1709
0,0794
0,0913
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0,0327
0,0737
0,1251
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0,0351
0,0741
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0,0982
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0,0324
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0,0743
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0,0404
0,0324
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0,0123
0,1724
XLVI
Testvalidierung Kinder:
Test:
Datum:
Fänger:
F.-Konz.:
Antigen:
Ag.-Verd.:
Antikörper:
Ak.-Verd.:
SerumVerd.:
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002M-K/H
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002M-K/Bo
003M-K/Bo
004M-K/Bo
005M-K/Bo
006M-K/Bo
007M-K/Bo
008M-K/Bo
009M-K/Bo
010M-K/Bo
011M-K/Bo
012M-K/Bo
013M-K/Bo
014M-K/Bo
ELISA-Ig-Gesamt (IgG, IgA, IgM)
04.06.'93
B 98
1/2000
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K
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1/2000
Serum r
a
b
1
2
3
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5
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13
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0,9500
0,9683
0,9987
0,9927
Mittelw 0,9671
Min
0,8389
Max
0,9991
0,1751
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43,6522
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Stabw. Varianz rel.Stabw
0,0600
0,0404
0,0190
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0,0384
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0,0487
0,0246
0,0530
0,0862
0,0471
0,0112
0,0904
0,0803
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0,0556
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0,0947
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0,0515
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0,0345
0,0592
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0,0016
0,0004
0,0026
0,0015
0,0005
0,0024
0,0006
0,0028
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0,0022
0,0001
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0,0246
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0,0112
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0,0803
0,0364
0,0557
0,0131
0,0950
0,1439
0,0515
0,0264
0,0797
0,0365
0,0679
0,0345
0,0596
0,0183
0,0515 0,0035
0,0112 0,0001
0,1436 0,0206
0,0516
0,0112
0,1439
XLVII
Guido Theodor Johannes Holbeck
Lebenslauf
Persönliche Angaben
Geburtsdatum:
Geburtsort:
Familienstand:
Konfession:
17.09.1966
Essen
verheiratet, ein Kind
evangelisch
Schulbildung
Einschulung:
Abitur:
01.08.1973
02.06.1987
Ersatzdienst
Johanniter-Unfall-Hilfe e.V. Essen
03.08.1987 – 31.03.1989
Ausbildung
Studienbeginn:
Ärztliche Vorprüfung:
1. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung:
2. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung:
Praktisches Jahr
Innere und Chirurgie
Gynäkologie und Geburtshilfe
3. Abschnitt der Ärztlichen Prüfung:
12.09.1989, Ruhr-Universität Bochum
20.08.1991, Ruhr-Universität Bochum
27.08.1992, Ruhr-Universität Bochum
29.03.1995, Ruhr-Universität Bochum
17.04.1995 – 17.03.1996
Knappschaftkrankenhaus Recklinghausen
Regionalspital Sta Maria Visp, Schweiz
07.05.1996, Recklinghausen
Facharztprüfung für
Kinderheilkunde und Jugendmedizin
28.04.2003, Saarbrücken
Berufliche Laufbahn
Arzt im Praktikum
01.07.1996 – 31.01.1997
Kinderheilkunde, Prof. Dr. med. W. Andler,
Vestische Kinderklinik, Datteln
Arzt im Praktikum
01.02.1997 – 31.12.1997
Kinderheilkunde, Prof. Dr. med. R. Galaske,
Kinderklinik der Städtischen Krankenanstalten, Idar-Oberstein
Assistenzarzt:
01.01.1998 - 31.05.2003
Kinderheilkunde, Dr. med. D. Krämer, seit 01.05.2002 Dr. med. T. Liebner
Kinderabteilung der SHG-Kliniken, Merzig
Oberarzt
seit dem 01.06.2003
Kinderheilkunde, Dr. med. T. Liebner
Kinderabteilung der SHG-Kliniken, Merzig
Auslandsaufenthalte
Zimbabwe:
Schweiz:
Famulatur für zwei Monate, Chimanimani District Hospital, Geburtshilfe,
Allgemein- und Tropenmedizin, 1993
PJ Gynäkologie und Geburtshilfe, Regionalspital Sta Maria Visp, Schweiz, 1995
Nebentätigkeiten während des Studiums
Studentische Hilfskraft:
Aushilfe in der Krankenpflege:
Abteilung für Anatomie und Embryologie, Wintersemester 1991/92
Augusta-Kranken-Anstalt, Bochum