vts_9707_14724. - OPARU
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Universitätsklinikum Ulm, Klinik für Anästhesiologie Prof. Dr. med. Dr. med. h.c. Michael Georgieff Sektion Experimentelle Anästhesiologie Prof. Dr. rer. nat. Marion Schneider Immunphänotypisierung von natürlichen Killerzellen bei Fibromyalgie im Vergleich zu anderen Schmerzsyndromen, Tumoren und Übertrainingssyndrom Dissertation zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin der Medizinischen Fakultät der Universität Ulm von Caroline Schmidt geboren in Herrenberg 2014 Amtierender Dekan: Prof. Dr. Thomas Wirth Erster Berichterstatter: Prof. Dr. Marion Schneider Zweiter Berichterstatter: Prof. Dr. Jürgen Steinacker Tag der Promotion: 21. Mai 2015 Für meine Eltern Inhaltsverzeichnis 1 Einleitung ........................................................................................................1 1.1 1.1.1 Das angeborene ≡ unspezifische Immunsystem ................................ 2 1.1.2 Das adaptive ≡ spezifische Immunsystem .......................................... 2 1.2 Zellen der Immunabwehr........................................................................... 2 1.2.1 Natürliche Killerzellen ......................................................................... 2 1.2.2 Makrophagen ...................................................................................... 3 1.2.3 T-Zellen .............................................................................................. 4 1.2.4 B-Zellen .............................................................................................. 5 1.3 Apoptose ................................................................................................... 5 1.4 Untersuchung der Zelloberflächen ............................................................ 6 1.4.1 Cluster of Differentiation (CD) ............................................................. 6 1.4.2 Annexin V ......................................................................................... 11 1.5 Krankheitsbilder der Patientenkollektive .................................................. 11 1.5.1 Das Fibromyalgie-Syndrom (FMS) ................................................... 11 1.5.2 Das komplexe regionale Schmerzsyndrom (CRPS) ......................... 13 1.5.3 Die Langerhanszell-Histiozytose (LCH) ............................................ 14 1.5.4 Das Übertrainingssyndrom (OTS)..................................................... 15 1.6 2 Einführung ................................................................................................. 1 Fragestellung .......................................................................................... 15 Material und Methoden .................................................................................17 2.1 Patientenkollektiv .................................................................................... 17 2.1.1 Gruppeneinteilung ............................................................................ 17 2.1.2 Ausschlusskriterien ........................................................................... 17 2.2 Verwendete Materialien, Geräte und Software ........................................ 17 2.2.1 Geräte ............................................................................................... 17 2.2.2 Materialien ........................................................................................ 18 2.3 Computer-Software ................................................................................. 20 2.4 Typisierung .............................................................................................. 20 2.4.1 FACS-Typisierung von EDTA- Frischblutproben .............................. 20 2.4.2 FACS-Typisierungen von PBMC (peripheral blood mononuclear cells) aus flüssigem Stickstoff aufgetaut ................................................................. 20 2.4.3 2.5 Durchflusszytometrie – Messprinzip und Durchführung.................... 21 Analyse und Darstellung ......................................................................... 22 2.5.1 Darstellungsformen und Statistik ...................................................... 22 2.5.2 Beurteilung der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) ...................... 22 2.5.3 Statistik der durchflusszytometrischen Daten ................................... 23 2.5.4 Kruskal-Wallis-Test ........................................................................... 23 III 3 2.5.5 p-Wert ............................................................................................... 24 2.5.6 Dunn’s-Post-Test .............................................................................. 24 Ergebnisse ....................................................................................................25 3.1 Unterschiede zwischen PBMC und EDTA Blutproben ............................ 25 3.2 Ausreißer, Extremwerte, sowie der Kruskal-Wallis- und Dunn’s-Test ..... 29 3.3 FACS- Typisierungsergebnisse von T-Zellsubpopulationen.................... 30 3.3.1 Vergleichende Analyse CD4 positiver T-Zellen ................................ 30 3.3.2 Vergleichende Analyse CD8 positiver T-Zellen ................................ 35 3.3.3 Vergleichende Analyse CD25 positiver T-Zellen .............................. 39 3.3.4 Vergleichende Analyse CD4/CD25 doppelt positiver T-Lymphozyten .. .......................................................................................................... 42 3.4 FACS-Typisierungsergebnisse der NK- Zellen........................................ 46 3.4.1 Vergleichende Analyse CD16 positiver Zellen .................................. 46 3.4.2 CD56 positive Zellen......................................................................... 51 3.4.2.1 Vergleichende Analyse CD56dim positiver Zellen .....................................51 3.4.2.2 Vergleichende Analyse CD56bright positiver Zellen ...................................55 3.4.3 3.5 Annexin V und Degranulationsversuche ................................................. 64 3.5.1 Annexin V ......................................................................................... 64 3.5.2 CD63 Expression .............................................................................. 65 3.5.3 CD107a Expression .......................................................................... 65 3.6 4 Vergleichende Analyse CD16/CD56 doppelt positiver NK-Zellen ..... 59 Auswirkungen der Medikation auf den Immunstatus ............................... 67 Diskussion.....................................................................................................73 4.1 Methodische Aspekte .............................................................................. 73 4.1.1 Statistik ............................................................................................. 73 4.1.2 Interpretation des MFI....................................................................... 74 4.2 Untersuchte Oberflächenmarker und Interpretation des Immunstatus .... 74 4.2.1 T-Zellsubpopulationen ...................................................................... 75 4.2.2 NK-Zellmarker - Beeinflussung durch Inflammation.......................... 77 4.3 Weitere Überlegungen / Zusätzliche Fragestellung ................................. 79 4.3.1 Beeinflussung der Oberflächenmarkerexpression von CD Antigenen durch Einfrieren und Auftauen aus flüssigem Stickstoff ................................ 79 4.3.2 4.4 Beeinflussung des Immunstatus durch Medikamente ....................... 80 Schlussfolgerung und Ausblick ............................................................... 81 5 Zusammenfassung .......................................................................................82 6 Literaturverzeichnis ......................................................................................84 7 Anhang ..........................................................................................................96 IV Abkürzungsverzeichnis ADCC AK ATP CD CGRP CRPS CRP CTL CTLA4 DAMP DNA EDTA FACS FCS FITC FMS FOXP3 GM-CSF Gp120 GPI HIV HLDA IFN Ig IL ITAMs ITIMs KIR KHK LAMP1 LCH Lck Ly M. MFI MHC MS NCAM NK-Zellen OTS PAMP PBMC PI PE RPMI SS SSC TCR antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität Antikörper Adenosintriphosphat cluster of differentiation calcitonin gene related peptide complex regional pain syndrome C-reaktives Protein cytotoxic T-lymphocyte cytotoxic T-lymphocyte antigen 4 danger oderdamage associated molecular patterns desoxyribonucleic acid ethylenediaminetetraacetic acid fluorescence activated cell sorting forwardscatter fluorescein isothiocyanate Fibromyalgiesyndrom forkhead box P3 granulocyte-macrophage colony-stimulating factor Glykoprotein 120 Glykosylphosphatidylinositol Humanes Immundefizienz Virus human leucocyte differentiation antigens workshops Interferon Immunglobulin Interleukin immunoreceptor tyrosine-based activation motifs immunoreceptor tyrosine-based inhibition motifs killer cell immunglobulin-like receptors Koronare Herzerkrankung lysosomal-associated membrane protein 1 Langerhans cell histiocytosis lymphocyte-specific protein tyrosine kinase Lymphozyten Morbus mittlere Fluoreszenzintensität Major Histocompatibility Complex Multiple Sklerose neural cell adhesion molecule natürliche Killerzellen Overtrainingsyndrome pathogen-associated molecular pattern peripheral blood mononuclear cells Propidiumiodid Phycoerythrin Roswell Park Memorial Institute symptome severity sideward scatter T-cell receptor V TNF Treg Tsup WPI Tumornekrosefaktor regulatorische T-Zelle suppressor T-Zelle widespread pain index VI 1 Einleitung Einführung 1.1 Zum Schutz gegen Pathogene besitzt der menschliche Körper ein gut funktionierendes immunologisches Abwehrsystem, welches in einem Netzwerk aus zellulären und löslichen/molekularen Komponenten funktioniert. Man unterscheidet die angeborene (Synonym: unspezifische) von der erworbenen (Synonym: adaptierten/spezifischen) Immunabwehr, um die Abwehr von Krankheitserregern, Pathogenen und entarteten Zellen zu gewährleisten. (Murphy et al. 2009a) Pathogene aktivieren das Immunsystem durch sogenannte PAMP (pathogenassociated molecular pattern) und induzieren eine Entzündungsreaktion, welche den ersten Schritt einer induzierten Immunantwort darstellt. Nach neuesten Vorstellungen können aber auch nicht-pathogene Mechanismen eine Entzündungsreaktion auslösen, die als DAMP (danger oder damage associated molecular patterns) zusammengefasst werden und den ersten Schritt einer induzierten Immunantwort darstellen. Hierbei handelt es sich um körpereigene oder auch körperfremde Substanzen, die nicht in Zusammenhang mit Infektionen stehen. (Mills 2011) Bei Erkrankungen, die sich mit einem akuten oder chronischen Schmerzsyndrom manifestieren, diskutiert man sowohl eine PAMP, also auch eine DAMP vermittelte Entzündung (Liu et al. 2012). Damit erhält Schmerz einen selbstständigen Krankheitswert, der über die zu erwartende Zeitdauer zur Heilung anhält. (Turk et al. 2001) In dieser Arbeit soll untersucht werden, ob sich eine in vivo erfolgte Veränderung des Immunstatus eignet, um die Ursache einer akuten oder chronischen Schmerzerkrankung zurückzuverfolgen. Der größte Anteil der untersuchten Patienten litt unter der chronischen Schmerzerkrankung Fibromyalgie (FMS), aber auch andere Schmerzsyndrome wie das chronische regionale Schmerzsyndrom (CRPS) wurden in die Untersuchungen vergleichend eingeschlossen. Mit Hilfe der Durchflusszytometrie wurde eine Immunphänotypisierung durch Überprüfung der Expression verschiedener Differenzierungsantigene (CD, cluster of differentiation) auf der Oberfläche von Zellen untersucht und anschließend analysiert. Durch die Expressionsmuster lassen sich Subpopulationen von Lymphozyten, Monozyten und anderen myeloischen Zellen identifizieren, sowie 1 deren Differenzierungsgrad beurteilen (Schütt et al. 2009e). Ein Schwerpunkt der Untersuchungen waren die natürlichen Killer-(NK)-Zellen. Durch die Erforschung dieses Elements des angeborenen Immunsystems (Murphy et al. 2009b) erhofft man sich Hinweise auf die Genese von Schmerzsyndromen, welche eine verbesserte Diagnose- und eventuell auch therapeutische Möglichkeiten der schmerzassoziierten Krankheitsbilder eröffnen. 1.1.1 Das angeborene ≡ unspezifische Immunsystem Für das angeborene Immunsystem spielen PRR (pattern recognition receptos) eine wichtige Rolle; diese Pathogen-assoziierten molekulare Muster (PAMP) werden von Mikroorganismen jedoch nicht von körpereigenen Zellen exprimiert. Zu den Erkennungsrezeptoren für PAMP gehören die TLR (toll-like receptors), welche auf myeloischen Zellen, aber auch Lymphozyten exprimiert sind. NKZellen erkennen ihr Antigen über 2 Rezeptoren KIR und CD94/NKG2 Heteromere. (Murphy et al. 2009a, LaBonte 2001) 1.1.2 Das adaptive ≡ spezifische Immunsystem Die einzigartige Eigenschaft der spezifischen Immunantwort, ist das Erkennen eines bestimmten Krankheitserregers und die Entwicklung von klonal exprimierten, spezifischen Rezeptoren (T-Zellrezeptoren und membran-assoziiertes Immunglobulin auf B-Zellen) durch somatische Mutation und Rekombination, gefolgt von der spezifischen Selektion des jeweils höchst affinen Rezeptors durch den Kontakt mit Antigenpräsentierenden Zellen (dendritischen Zellen). Nach Interaktion mit Antigen entstehen Gedächtniszellen aus der T- und B-Zellreihe, welche lebenslang verfügbar sind und bei erneutem Antigenkontakt reaktiviert werden und dann klonal proliferieren.(Murphy et al. 2009a) 1.2 Zellen der Immunabwehr 1.2.1 Natürliche Killerzellen NK-Zellen sind für das angeborene Immunsystem enorm wichtig und machen 15% der zirkulierenden Lymphozyten aus. Sie strukturieren ihre Gene für Immunglobuline zwar nicht um, besitzen aber ein breites Spektrum an invarianten aktivierenden und inhibitorischen Rezeptoren. Sie spielen eine wichtige Rolle bei 2 der Bekämpfung intrazellulärer Krankheitserreger und der antikörperabhängigen zellvermittelten Zytotoxizität (ADCC). (Murphy et al. 2009b) NK-Zellen exprimieren mindestens einen inhibitorischen Rezeptor, welcher an mindestens ein MHC-I-Allel des Organismus binden kann. Durch fehlende Bindung werden die Killerzellen enthemmt (missing-self-Prinzip) und lytisch aktiv. Die Erkennung der MHC-I-Moleküle, erfolgt durch sogenannte KIRs (killer cell immunglobulin-like receptors), die sowohl inhibierende, als auch aktivierende Signalwege vermitteln (ITIMs (immunoreceptor tyrosine-based inhibition motifs) beziehungsweise ITAMs (immunoreceptor tyrosine-based activation motifs)). (Schütt et al. 2009c) Nicht alle NK-Zellen exprimieren CD3, besitzen aber das Oberflächenantigen CD56 und fakultativ den FcRezeptor Typ III, CD16. Über die Expressionsdichte von CD56 unterscheidet man CD56dim und CD56bright, welche unterschiedliche Eigenschaften besitzen. Die CD56dim Gruppe (90%) ist zytotoxischer und exprimiert mehr CD16. CD56bright positive NK-Zellen (10%) sezernieren große Mengen an Zytokinen wie IFN-, TNF-, IL-10, IL-13 sowie GM-CSF (granulocyte– macrophage colony-stimulating factor) produzieren und wirken damit eher immunmodulatorisch. CD56 ist eine Isoform von N-CAM (neural cell adhesion molecule) und interagiert mit homologem N-CAM. (Cooper et al. 2001, Dosiou et al. 2005) 1.2.2 Makrophagen Das unter anderem von den Killerzellen produzierte IFN- stimuliert nicht nur ihre eigene Zytotoxizität, Makrophagen sind sondern Fresszellen ist der und potenteste nehmen Makrophagenaktivator. Erreger in intrazellulären Phagosomen auf, töten sie durch die Fusion mit Lysosomen ab und verdauen sie. Neben der Phagozytose sowie intra- und extrazellulärem Killing, können sie auch Antigene für T-Helferzellen exprimieren. (Schütt et al. 2009b) Bei der Entzündungsreaktion (= Inflammation) haben Makrophagen drei Hauptfunktionen: Antigenpräsentation, Phagozytose und Immunmodulation durch Zytokin- und Wachstumsfaktorproduktion. Sie spielen eine wichtige Rolle, bei dem Beginn, der Aufrechterhaltung und dem Beenden einer Inflammation. Durch dieses breite Funktionsspektrum könnten Makrophagen zu zukünftigen Zielzellen 3 der Kontrolle inflammatorischer Krankheiten, wie chronische Schmerzen, werden. (Fujiwara et al. 2005) 1.2.3 T-Zellen T-Lymphozyten reifen im Thymus heran. Gemeinsam mit den B-Lymphozyten stellen sie die erworbene Immunantwort dar. Sie haben die lebenswichtige Funktion den Organismus vor externen Angriffen und vor einer überschießenden Immunantwort zu schützen. Man kann zwei Hauptpopulationen unterscheiden: zytotoxische T-Zellen (cytotoxic T-lymphocytes = CTLs) und T-Helferzellen. Ihre Antigene erkennen die T-Zellen durch die klonal verteilten T-Zell-Rezeptoren (Tcell receptors, TCRs, CD3 positiv). (Schütt et al. 2009e) Anders als bei Antikörpern kommen die TCRs nur membrangebunden vor. 95% der T-Zellen im Blut sind αβ-T-Zellen (besitzen also eine α- und eine β- Kette), die restlichen 5% sind γδ-T-Zellen. Beide sezernieren nach ihrer Aktivierung Zytokine und sind potente Killerzellen. (Schütt et al. 2009d) 1.2.3.1 Regulatorische T-Zellen (Treg) Tregs, früher auch als Suppressorzellen bezeichnet, unterdrücken die Antwort des Immunsystems und erhalten so die Immuntoleranz.(Fontenot et al. 2005) Bislang ist es nicht möglich regulatorische T-Zellen durch Phänotypisierung im Humansystem zweifelsfrei zu identifizieren, da noch kein spezifischer Cluster gefunden wurde. (Schütt et al. 2009a) Tregs können sowohl CD4, CD8 und CD25 positiv sein. CD4+/CD25+ T-Zellen können durch das Exprimieren von CTLA4 (cytotoxic T-lymphocyte Antigen 4) die T-Zell Aktivierung stark unterdrücken. (Shevach 2002) Diese doppelt positiven T-Zellen aktivieren den Transkriptionsfaktor FOXP3 (forkhead box P3), ein für die Immunantwort wichtiges Protein und können auch so nachgewiesen werden (Min Wang et al. 2009). Sie gehen dabei eine effektivere Bindung mit MHC-II ein, als FoxP3 negative CD4+/CD25- T- Zellen (Hsieh et al. 2004). Neben seiner hemmenden Wirkung für CD8 T-Zellen, ist es auch ein Ligand für den inhibitorischen Rezeptor NKG2A auf NK-Zellen. Es kann also sowohl die NKZell Lyse der T-Zellen hemmen, als auch zur CD8 Treg Inhibition der T-Zellen führen. (Min Wang et al. 2009) 4 γδ-T-Zellen 1.2.3.2 Ihre höchste Aufkommensdichte scheint in den intraepithelialen Lymphozyten (IEL) des Dünndarms zu liegen (Nüssler 2001). Auf einer große Anzahl der γδ-TZell-Oberflächen werden einzelne oder mehrere KIR (killer cell immunglobulin-like receptor) Moleküle, die erstmals auf der Oberfläche von NK-Zellen als Liganden für bestimmte MHC Klasse I Allele entdeckt wurden, exprimiert. Ihre Arbeitsweise ist das missing self-Prinzip, d.h. sie vermitteln den Zell-Zell-Kontakt und schützen somit körpereigene Zellen vor einer Zytolyse durch zytotoxische T-Zellen oder NKZellen. (Rupp 2005) Studien belegen erhöhte γδ-T-Zellzahlen in systemisch entzündlichen Erkrankungen wie rheumatoider Arthritis (Rupp 2005, Hoshino et al. 1996) und der aktiven Phase des Morbus Still (Hoshino et al. 1996), was auf ein starkes immunmodulatorisches Potential hinweist. (Rupp 2005) 1.2.4 B-Zellen B-Lymphozyten sind membranverankerte Immunglobuline oder Antikörper. Nach ihrer Aktivierung, differenzieren sie zu Plasmazellen, die darauf spezialisiert sind große Mengen an Immunglobulinen zu synthetisieren und in löslicher Form zu sezernieren (bis zu 2000 pro Sekunde).(Schütt et al. 2009e) 1.3 Apoptose Der programmierte Zelltod oder Apoptose ist ein wichtiger Bestandteil der Entwicklung und Homöostase mehrzelliger Organismen. Er erleichtert den Abbau beschädigter, infizierter oder gefährlicher Zellen ohne eine entzündliche Reaktion wie bei der Nekrose auszulösen, indem durch die Freisetzung von Mediatoren wie TGF-β, IL-10 und PDE2 ein anti-inflammatorisches Milieu gebildet wird.(Wickman et al. 2012, Ferraro-Peyret et al. 2002) Apoptotische Zellen unterlaufen starken morphologischen Veränderungen: Schrumpfung, Zellblebbing und durch die blebs Bildung apoptotischer Körperchen. Diese Vesikel werden schließlich von phagozytierender Zellen beseitigt. (Wickman et al. 2012) Blebs sind kugelige Zellvorwölbungen und kommen neben Apoptose auch bei Zellteilung und Migration vor. (Charras et al. 2008) 5 Die charakteristischste Oberflächenveränderung während der Apoptose ist die Asymmetrie der zweilagigen Phospholipidmembran mit der Exposition von Phosphatidylserin an der äußeren Lipiddoppelschicht durch eine ATP-abhängige Translokase. Letzteres wird zwingend für die Erkennung der apoptotischen Zellen durch Makrophagen benötigt. (Ferraro-Peyret et al. 2002) 1.4 Untersuchung der Zelloberflächen 1.4.1 Cluster of Differentiation (CD) Alle CD müssen über zwei unterschiedlich Klone monoklonaler Antikörper definiert sein, die im Western Blot eine Bindung zu einem Molekül derselben molekularen Masse zeigen.(Erber 1990) Lymphozyten lassen sich zwar morphologisch nicht voneinander unterscheiden, aber sie exprimieren ein charakteristischen Profil von Oberflächenmolekülen, abhängig von ihrem Differenzierungs- oder Aktivierungszustand. Die Oberflächenmoleküle werden daher auch Differenzierungsmarker genannt, die unter anderem mit der hier verwendeten Durchflusszytometrie durch Bindung fluoreszierender monoklonaler Antikörper sichtbar gemacht werden. Diese Antikörper wurden jeweils zu einem Cluster zusammengefasst und bekamen laufende Nummern. Ein Molekül ist als cluster of differentiation definiert, wenn es von mindestens 2 monoklonalen Antikörpern biochemisch und funktional gebunden wird. (Schütt et al. 2009e) In den Human Leucocyte Differentiation Antigens Workshops (HLDA) 2006 wurden über 350 Cluster bestimmt, die teilweise noch weiter unterteilt werden. (Zola et al. 2007) Nachfolgend werden die in dieser Arbeit analysierten Oberflächenmarker näher erläutert: 1.4.1.1 Isotyp Kombination: Mouse IgG1 und Mouse IgG2a Der Maus IgG1 FITC-markierte Antikörper erkennt KLH (keyhole limpet hemocyanin), was auf keiner menschlichen Zelle exprimiert wird, und es daher möglich macht spezifische von unspezifischen Bindungen zu unterscheiden (Miltenyi Biotec 2012). Dasselbe Prinzip gilt für Maus IgG2a, das spezifisch für Hapten NP (4-Hydroxy-3-Nitro-Phenyl) Acetyl ist (Miltenyi Biotec 2012). Die 6 Antikörperkombination dient als Negativkontrolle in der Durchflusszytometrie und alle Leukozyten sollten nach Inkubation mit dieser Negativkontrolle im unteren linken Quadranten (lower left = LL) liegen. 1.4.1.2 Leukogate Kombination: CD45 und CD14 Diese Kombination wird verwendet um die untersuchten Zellen in die Gruppen Lymphozyten, Monozyten und Granulozyten zu unterteilen und von nicht kernhaltigen oder nicht hämatopoetischen Zellen zu trennen. CD45 (Klon: LCA, T200) bindet an das sogenannte leukocyte-common-antigen. Hierbei handelt es sich um einen Pan-Leukozytenantigen, der mit einer Tyrosinphosphatase (lck) assoziiert ist. Anti-CD45 markiert alle hämatopoetischen Zellen außer Erythrozyten und Blutplättchen. CD14 (Klon: LPS-R) erkennt ein Protein, das auf myelomonozytären Zellen und LPS-aktivierten Granulozyten zu finden ist. (Luttmann et al. 2009a) CD14 ist ein Korezeptor für Endotoxin, das an den Toll-like receptor 4 (TLR4) bindet. Nach Leukogatemarkierung Lymphozyten können voneinander gut Granulozyten getrennt von Monozyten (gegated) werden, da sich und die Leukozytensubpopulationen in der Expressionsdichte von CD45, bzw. der CD14Expression unterscheiden Antikörperkombinationen für (s. Abb. Zellen 1A, im 1B). Die Lymphozyten-, Analyse weiterer Monozyten- und Granulozytengate kann so selektiv beurteilt werden. A B Abbildung 1: Leukogatemarkierung von Blutzellen eines gesunden Probanden (#13118): R1 (rot) = Lymphozyten, R2 (grün) = Monozyten; R3 (blau) = Granulozyten. A:Die CD45-Expression ist auf der x-Achse, die CD14-Expression auf der y-Achse aufgetragen. CD = cluster of differentiation; PE= Phycoerythrin; FITC= Fluorescein isothiocyanate B: Scatteranalyse derLeukozytensubpopulationen: x-Achse = Vorwärtsstreulicht (FSC); y-Achse = 90°-Streulicht (SSC). 7 1.4.1.3 CD4 CD4 ist durch die beiden Klone L3T4 und W3/25 definiert. Beim Menschen ist CD4 auf T-Zellen, Monozyten und Makrophagen positiv. Es ist Korezeptor des T-ZellRezeptors und erkennt mit seiner extrazellulären Domäne invariante Regionen von MHC-II-Moleküle. Seine zytoplasmatische Domäne bindet an lck (lymphocytespecific protein tyrosine kinase), die durch Zytokinbildung Signalkaskaden der Lymphozyten auslöst und so für eine maximale Kostimulation sorgt. Ist CD4 unabhängig von TCRs gebunden (Bsp.: der CD4-Ligand IL-16), werden hingegen T-Zell-inhibierende Signale ausgesendet. Diese negativen Signale laufen vermutlich über das intrazellulär gebundene ACP33 (acidic clusterprotein 33). Seine Rezeptoreigenschaft für gp120 macht ihn zusätzlich für die HIV-Diagnose und -Verlaufskontrolle wichtig. (Luttmann et al. 2009a)(Browning et al. 1997)(Zeitlmann et al. 2001) 1.4.1.4 CD8 CD8 ist ein zweikettiges Glykoprotein. Es existiert als Homodimer (αα, auf TZellen; Klon: Leu2, T8) und als Heterodimer (αβ, auf T- und NK-Zellen, Synonyme: CD8, Leu2, Lyt3). Dieses Cluster fungiert als Korezeptor für MHC-I-Moleküle und bindet die Phosphatase lck mit seiner intrazellulären Domäne. (Luttmann et al. 2009a) Zytotoxisch wirksame CD8 Zellen produzieren große Mengen an IFN-γ, CD8 positive Regulatorische T-Zellen (Treg), früher Suppressor-T-Zellen genannt, hingegen IL-4. Ein weiterer Unterschied ist, dass zytotoxische T-Zellen durch MHC-I, T-Supressorzellen auf MHC-II restringiert sind. (Salgame et al. 1991) 1.4.1.5 CD16 CD 16 wird in die zwei Gruppen CD16a (FcγRIIIa) und CD16b (FcγRIIIb) unterteilt. (Luttmann et al. 2009a) Der transmembranöse Anker CD16a befindet sich auf Makrophagen, NK-Zellen sowie auf Untergruppen von Monozyten und T-Zellen. Der GPI-Anker (Glykosylphosphatidylinositol) CD16b wird nur auf Neutrophilen exprimiert. Wird CD16a mit der γ-Kette von Fc-Rezeptoren oder der ζ- Kette der TZell-Rezeptoren quervernetzt, können eine Reihe von Immunfunktionen wie Phagozytose, ADCC oder Freigabe inflammatorischer Mediatoren getriggert werden (Chesla et al. 2000). Der Fc-Rezeptor erkennt dabei die IgG1- und IgG38 Subklassen der gebundenen Antikörper und ermöglich so einen antigenspezifischen Angriff einer Effektorzelle, die selbst keine Antigenspezifität besitzt (Murphy et al. 2009d). CD16 besitzt hingegen keine auszureichend zytotoxische Wirkung. In HIV-Patienten konnten erhöhte CD56-/CD16+ NKZellwerte nachgewiesen werden, die als mögliche Ursache der reduzierten Fähigkeit Zellen abzutöten, gewertet werden. (Mavilio et al. 2005) 1.4.1.6 CD25 CD25 (Klone: Tac Antigen, IL-2Rα) ist die α-Kette des IL-2 Rezeptors und auf aktivierten T-, B-Zellen, Makrophagen und Tregs zu finden. (Luttmann et al. 2009a)(Miltenyi Biotec 2011) Interleukin-2 wirkt regulatorisch auf den Zellzyklus ein und fördert die Differenzierung der B- und T-Zellreihen. Mehrere Untergruppen aktivierter CD4+-Zellen produzieren ihn, auf die Immunantwort wirkt er allerdings sowohl fördernd, als auch hemmend. Von seinen 3 Ketten werden die β- und γKette fortwährend auf ruhenden Lymphozyten exprimiert. Die α-Kette hingegen nur nach Aktivierung. In IL-2α-Rezeptor defizienten Mäusen zeigte sich kein Effekt auf die T- und B-Entwicklung, wohingegen es zu einer polyklonalen Vermehrung des Lymphgewebes kam. Im gesunden Organismus bleibt das Lymphgewebe trotz ständiger Stimulation konstant, was auf ein Gleichgewicht zwischen Proliferation und Apoptose schließen lässt. Ist der IL-2α-Rezeptor defekt, scheint es zu einer verminderten Abtötung aktivierter Zellen zu kommen. (WilIerford et al. 1995) 1.4.1.7 CD40 Ein weiterer Name für CD40 ist Bp50. Er kommt auf B-, NK-Zellen, dendritischen Zellen, Makrophagen, Endothel-, sowie Epithelzellen vor. Der Rezeptor für CD40L fördert Wachstum und Differenzierung von B-Zellen, sowie deren Isotypenwechsel. Außerdem fördert er die Zytokinproduktion bei Makrophagen und dendritischen Zellen. (Luttmann et al. 2009a) 9 1.4.1.8 CD56 CD 56 (andere Namen: NCAM1, NKH1, Leu-19) ist ein Oberflächenmarker NKZellen und in seiner Funktion eine Isoform des Zelladhäsionsmoleküls NCAM(neural cell adhesion molecule). (Luttmann et al. 2009a) Durch ihn können die menschlichen Killerzellen in die Gruppen CD56dim und CD56bright unterteilt werden. CD56dim-Killerzellen besitzen zytotoxische, CD56brightKillerzellen hingegen immunmodulatorische Fähigkeiten. Die Untergruppen werden durch unterschiedliche Stimuli aktiviert. (Harlin et al. 2007) Ausdauertraining scheint zu einer verminderten Zytotoxität der NK-Zellen zu führen, ohne jedoch die Anzahl der CD56dim-Killerzellen zu verändern. Die Konzentration der CD56bright-NK-Zellen ist bei Sportlern jedoch erhöht. (Suzui et al. 2004) Für die hier untersuchten chronisch Erkrankten ist besonders interessant, dass Stresssituationen das genaue Gegenteil bewirken. CD56 dim-NK- Zellkonzentrationen verdreifachten sich in Studien, nachdem die Probanden akut Stress ausgesetzt wurden. Wahrscheinlich beruht dies auf einer durch Katecholamine gesteigerten Mobilisation. Die immunmodulatorischen Killerzellen blieben hingegen unverändert. (Bosch et al. 2005) Der Zusammenhang zwischen Stress und Erkrankungen ist mittlerweile bei vielen Krankheiten, wie Depression oder kardiovaskulären Erkrankungen, erwiesen. (Cohen et al. 2007) Zusätzlich findet man CD56 auf kleinzelligen Lungenkarzinomen, Tumoren neuronalen Ursprungs, Myelomen und myeloischen Leukämien. (Miltenyi Biotec 2012) 1.4.1.9 CD63 CD63 (weitere Namen: LIMP, MLA1, gp55) ist ein Granulamembranprotein (Luttmann et al. 2009a) und Teil der Transmembran-4-Superfamilie. Diese Oberflächenproteine besitzen meistens vier hydrophobische Domänen und regulieren durch Signaltransduktion Zellentwicklung, -aktivierung, -wachstum und –motilität. (NCBI 2012) Außerdem ist es ein Degranulationsmarker basophiler Granulozyten, was zur Bestimmung und Verlaufskontrolle von Ig-E vermittelten allergischen Reaktionen ausgenutzt wird. (Schäfer et al. 2010) 10 1.4.1.10 CD107a CD107a (weiterer Name: Lysosomal-associated membrane protein 1 (LAMP1)) LAMP1 befindet sich normalerweise intrazellulär, wird aber bei Stimulation vorübergehend an der Oberfläche exprimiert und kann dann als Degranulationsmarker für Lymphozyten wie CD8+-T-Zellen und NK-Zellen verwendet werden. (Miltenyi Biotec 2012) 1.4.2 Annexin V Im Frühstadium der Apoptose wird Phosphatidylserin durch das Enzym Flippase von der zytoplasmatischen Seite der Zellmembran an deren Außenseite transloziert. Es wird angenommen, dass dieser Prozess wichtig für die Makrophagenerkennung ist, und damit für die Einleitung der Phagozytose (Trevigen Instructions, 2010). Das Protein Annexin V (35-36kDa) bindet spezifisch an Phosphatidylserin, lässt sich leicht mit diversen Fluoreszenzfarbstoffen markieren und kann daher fluoreszenzmikroskopische oder durchflusszytometrisch zur Detektion apoptotischer Zellen benutzt werden. Auch bei nekrotischen Zellen bindet Annexin V an Phosphatidylserin, da hier die Plasmamembran permeabel ist. Daher sollte gleichzeitig eine Vitalitätsfärbung mit Propidiumiodid (PI) bei FITC-markiertem Annexin erfolgen. Frühapoptotische Zellen erscheinen nur Annexin positiv, wohingegen nekrotische und spätapoptotische Zellen doppelt positiv für Annexin V und den verwendeten DNA-Farbstoff (PI) sind. (Luttmann et al. 2009c) 1.5 Krankheitsbilder der Patientenkollektive 1.5.1 Das Fibromyalgie-Syndrom (FMS) Hench benutzte den Begriff Fibromyalgie (FM, Faser-Muskel-Schmerz) 1976 zum ersten Mal (Häuser et al. 2009a), aber das klinische Bild von Schmerzen in mehreren Körperregionen wurde bereits 1904 als „Fibrositis“ beschrieben (Herold et al. 2012). Die 2010 festgelegten Kriterien des Amerikanischen Kollegiums für Rheumatologie (ACR) definieren Fibromyalgie wie folgt: Die Schmerzen persistieren in ähnlicher Form für mindestens 3 Monate 11 Die Schmerzen haben einen widespread pain index (WPI, deutsch: regionale Schmerzskala) ≥ 7 und eine symptome severity (SS) scale score ≥5 oder einen WPI 3-6 und SS scale score ≥9: WPI: o Schmerzen vorderer des Achsenskeletts Brustkorb oder (Halswirbelsäule Brustwirbelsäule oder oder Lendenwirbelsäule) PLUS o Schmerzen der rechten und linken Körperhälfte PLUS o Schmerzen oberhalb und unterhalb der Taille (Häuser et al. 2009a) o Der WPI Wert lässt sich durch addieren der 19 verschiedenen Schmerzgebiete berechnen (der Endwert liegt zwischen 0 und 19) Der SS scale score setzt sich aus den 3 Symptomen Müdigkeit, Unausgeruhtheit nach dem Aufwachen und kognitiven Symptomen zusammen. Dabei werden die Symptome von 0 (keine Probleme) bis 3 (große Probleme) bewertet. Zusätzlich wird eine positive Anamnese somatischer Symptome (wie Muskelschwäche, Reizdarmsyndrom, etc., s. Tabelle 1) ebenfalls von 0–3 bewertet, wodurch ein Patient ein Endergebnis von 0–12 Punkten erreichen kann. (Häuser et al. 2009b)(Stephens et al. 2008) Der Patient hat keine Erkrankung, die den Schmerz anderweitig erklären könnte Das 1990 festgelegte Kriterium der Tenderpoints fand sich in der ACR Leitlinie von 2010 hingegen nicht mehr. (Alten et al. 27/04/2012), (Wolfe et al. 2010) Dabei handelte es sich um lokale Hyperalgesie an Muskel-Sehnenansätzen (Tenderpoints) von mindestens 11 der 18 Punkte. (Häuser et al. 2009a) Im Anhang findet sich die Tabelle 31 mit Ergebnissen von zu 2 Zeitpunkten durchgeführten Tenderpoint-Untersuchungen und die dazu gehörigen Werte des Entzündungsmarkers CRP (C-reaktives Protein). 12 Tabelle 1: Fibromyalgie (FM) -Symptome (Wolfe et al. 1990) Erscheinungsbild % der FMS Symptome Muskelschmerz 100 Müdigkeit 96 Schlaflosigkeit 86 Gelenkschmerz 72 Kopfschmerzen 60 Restless Leg Syndrome 56 Taubheit und Kribbeln 52 Gedächtnisstörungen 46 Beinkrämpfe 42 Konzentrationsminderung 41 Nervosität 32 Depression (Major Depression) 20 Die Prävalenz der FM in Deutschland beträgt ca. 3% der Bevölkerung, wobei Frauen zwischen dem 30. und 60. Lebensjahr vermehrt betroffen sind (w:m=9:1). Außerdem tritt das FMS bei rheumatologischen Erkrankungen (bis 50%) und familiär gehäuft auf. Die Ätiologie ist jedoch unbekannt (Herold et al. 2012). Gesicherte Risikoindikatoren für die Entwicklung eines FMS sind physische und psychische Stressoren am Arbeitsplatz sowie vermehrte Depressivität. (Häuser et al. 2009a) 1.5.2 Das komplexe regionale Schmerzsyndrom (CRPS) CRPS (complex regional pain syndrome) betrifft eher junge Erwachsene (w:m=2,3-3:1). Es ist durch einen auf bestimmte Regionen begrenzten, spontanen, chronischen Schmerz charakterisiert, der nach Traumen, langer Ruhigstellung oder Eingriffen wie intramuskuläre Injektionen oder Operationen entstehen kann. Zwischen der Schwere der ursprünglichen Verletzung und dem nachfolgenden Schmerzsyndrom besteht kein Zusammenhang. Die Verletzung kann sogar so unbedeutend gewesen sein, dass der Patient sich nicht mehr daran erinnert. Ein allgemeiner prädisponierender Faktor konnte noch nicht bestimmt werden, aber auch hier ist psychischer Stress ein Risikofaktor. (Raja et al. 2002)(Albrecht et al. 2006)(Goebel et al. 2010) CRPS kann in zwei Typen unterteilt werden. Bei CRPS Typ I (M. Sudeck) kann, anders als bei Typ II, keine Nervenläsion nachgewiesen werden. Ansonsten besitzen beide dieselben klinischen Zeichen (Albrecht et al. 2006) 13 Vorangegangenes Trauma oder Immobilisation Bestehender Schmerz (dumpf, stechend oder brennend), Allodynie oder Hyperalgesie Ödeme, veränderter Blutfluss oder abnorme sudomotorische Aktivitäten (extremes Schwitzen bis zu trockener Haut) in der Schmerzregion Andere Erkrankungen, die die Symptomatik erklären würden, können ausgeschlossen werden (Raja et al. 2002)(Albrecht et al. 2006) Die Pathogenese der Krankheit ist noch nicht verstanden. CGRP (calcitonin gene related peptide), ein Neuropeptid und Modulator der Nozizeption, das auch für die Entstehung von Migräne mitverantwortlich ist (Fischer 2010), wurde in erhöhten Konzentrationen bei CRPS Patienten gefunden. Eine der Hypothesen vermutet eine gesteigerte posttraumatische Inflammationsreaktion, und es konnten erhöhte pro-inflammatorische (TNF, IL-2) und erniedrigte anti-inflammatorische Zytokinkonzentrationen (IL-4, IL-10) in CRPS Patienten nachgewiesen werden. (Üceyler et al. 2007) 1.5.3 Die Langerhanszell-Histiozytose (LCH) LCH (langerhans cell histiocytosis; Synonyme: Histiozytose X, Abt-Letter-SiweSyndrom, Morbus Hand-Schüller-Christian, eosinophiles Granulom) ist eine seltene Erkrankung unbekannter Ätiologie bei einer jährlichen Inzidenz von 0,4/100.000 Kindern unter 15 Jahren mit einem Altersgipfel in den ersten drei Lebensjahren (m:w=1,3:1). Vermutet wird ein Kommunikationsdefekt mit Zytokinungleichgewicht zwischen T-Zellen und Langerhanszellen (Grois et al. 2008a). Es kommt zu einer abnormen Proliferation dieser Makrophagen-ähnlichen epidermalen Histiozyten, die 1868 von Paul Langerhans entdeckt worden waren. Bisher gibt es trotz des klonalen Ursprungs keinen eindeutigen Beweis für Malignität. (Windebank et al. 2009) Da fast alle Organe oder Systeme - einzeln oder in Kombination - betroffen sein können, variieren die klinischen Symptome und der Verlauf stark (Grois et al. 2008b). Es wird zwischen zwei großen Gruppen unterschieden: monosystemischer LCH (single-system LCH; SS-LCH) und multisystemischer LCH (multi-system LCH: MS-LCH), bei Befall von ≥2 Organen und Systemen, 14 unabhängig davon ob Risikoorgane wie das hämatopoetische System, Lunge, Leber oder Milz betroffen sind (Grois et al. 2008a). Die Beteiligung dieser Risikoorgane ist mit einer schlechteren Prognose verbunden (Windebank et al. 2009). Mit 80% sind am häufigsten die Knochen (34% Schädel) und mit 60% die Haut befallen. Das Spektrum der klinischen Anzeichen reicht von keinen bis zu generalisierten Symptomen wie Gedeihstörungen, Fieber, Unruhe und Gewichtsverlust. Je nach Lokalisation und Ausbreitung der erkrankten Gewebe, und unter Berücksichtigung des Allgemeinzustandes des Patienten, werden lokale oder systemische Therapien angewandt. (Grois et al. 2008a) 1.5.4 Das Übertrainingssyndrom (OTS) Als Übertrainingsyndrom (Overtrainingsyndrome, OTS) wird die systemische Erschöpfung eines Sportlers bezeichnet, was durch einen unerwarteten Leistungseinbruch gekennzeichnet ist. Es ist ein durch verschiedenste Stressoren (physisch, emotional, psychologisch und/oder sozial) ausgelöstes Phänomen. Zwei Theorien, ob ein (Ein-Stressor-Model mit einem Ungleichgewicht zwischen Belastung und Ruhephasen) oder mehrere Faktoren (Multi-Stressoren-Modell) Ursache der Erkrankung sind, versuchen den Krankheitsursprung zu erklären. Pathophysiologische Hypothesen sind unter anderem die GlykogenmangelHypothese, die BCAA-Hypothese (branched chain amino acids, verzweigtkettige Aminosäuren, die unter anderem in Serotonin umgewandelt werden, was zur zentralen Ermüdung führt), die Hypothese der zentralen Schutzhemmung, die Hypothese der Neuro-Endokrinen Dysbalance und die Zytokin-Hypothese. (Roose et al. 2009, Vogel 2001) 1.6 Fragestellung Es ist davon auszugehen, dass die interne Pathogenese einer Krankheit direkt durch das Immunsystem bedingt sein kann (Murphy et al. 2009c) oder sich als Veränderung des Immunstatus darstellt. Aus der vorangegangenen Darstellung des Immunsystems lassen sich folgende Fragestellungen ableiten: 1) Gibt es Hinweise auf Veränderungen des Immunphänotyps durch spezifische Oberflächenrezeptoren 15 der natürlichen Killerzellen bei chronischen Schmerzpatienten im Vergleich zu OTS-, LCH-Patienten oder gesunden Probanden, die auf eine Inflammation hindeuten? 2) Welche Rolle spielen NK-Zellsubpopulationen oder CD4- bzw. CD8-positive T-Zellen? 3) Lassen sich immunphänotypische Untersuchungen vergleichen, welche aus EDTA-Vollblut und aufgetauten Ficoll-separierten PBMC angefertigt werden? Zur Bearbeitung dieser Fragen wurden Blutproben einer Immunphänotypisierung unterzogen und analysiert, nachdem sie, der Diagnose-entsprechend, einer der fünf Testgruppen („Gesund“, „LCH“, „OTS“, „Fibromyalgie“, „CRPS & andere Schmerzen“) zugeordnet werden konnten. 16 2 Material und Methoden 2.1 Patientenkollektiv Blutproben von 168 Patienten und Kontrollpersonen wurden für die hier vorliegende Arbeit bearbeitet und untersucht, welche der Sektion Experimentelle Anästhesiologie Ulm von verschiedenen Kliniken/Ärzten zugesandt wurden. 2.1.1 Gruppeneinteilung Abhängig von ihrer vorherigen Diagnose und der FACS Analyse wurde das 168 Personen große Kollektiv in die 4 Hauptgruppen „Panel“ (=gesund), „chronische Schmerzpatienten“, „LCH“ und „OTS“ eingeteilt. Die chronischen Schmerzpatienten konnten weiter in die Subgruppen „Fibromyalgie“, „CRPS“ und „andere“ unterteilt werden. Außerdem wurden in jeder Hauptgruppe die Unterschiede zwischen frischen und aufgetauten Blutproben untersucht. 2.1.2 Ausschlusskriterien Ausschlusskriterien waren auffällige FACS Analysen, die beispielsweise auf Allergien oder sonstige werteveränderte Nebenerkrankungen hinwiesen. 2 weitere Patienten wurden auf Grund ihrer Bisphosphonatmedikation ausgeschlossen, da es unter ihre Einnahme zu einer selektiven Vermehrung der natürlichen Killerzellen kommt. (Griffe et al. 2007). Das letztendlich verwendete Patientenkollektiv war 147 Personen groß, der Kruskal-Wallis-Test wurde jedoch nur an den 114 EDTA-Blutproben durchgeführt. Eine Tabelle der Patienten mit ihrer Diagnose, Geschlecht, sowie Alter findet sich im Anhang (Tabelle 23). 2.2 Verwendete Materialien, Geräte und Software 2.2.1 Geräte - Pipettierhilfe: “Pipetman“ Gilson - Sample Mixer Dynal - MS1 Minishaker IKA - Zentrifuge GS-6R Coulter - Durchflusszytometer FACSCalibur Becton Dickinson 17 2.2.2 Materialien - 5ml Rundbodenröhrchen, Polystyrol Falcon (REF: 352052) - Pipettenspitzen Greiner bio-one - FCS Biochrom - Kaninchenserum Dako (REF: x0902) - DPBS life technologies - FACS Lysing Solution BD (REF: 349202) - Cellfix BD (REF: 340181) - RPMI 1640 Medium life technologies - Antikörper: siehe Tabellen 2.2 und 2.3 18 Tabelle 2: alle standardmäßig zur Typisierung verwendeten Antikörper gemäß ihrer Spezifität, ihrer Markierung, ihrem Klon (soweit bekannt) und dem verwendeten Anbieter. CD= cluster of differentiation; FITC= Fluorescein isothiocyanate; PE= Phycoerythrin; IgG= Immunglobulin G Spezifität Markierung Anbieter Isotyp Klon Spezifität Markierung Anbieter Isotyp Isotyp: Mouse FITC BD IgG1 X40 Leucogate: CD45 Anti-TCR α/β1 CD57 FITC BD IgG1 - FITC BD IgG1 B1 FITC BD IgM9 CD80 FITC Immunotech IgG1 CD86 FITC DIACLONE IgG1 Mouse (Kombi) CD14 (Kombi) CD3 PE BD IgG2a X39 PE BD IgG2a - PE BD IgG1 B-B11 HNK1 L307. 4 B-T7 CD56 PE Dako IgG1 CD2 PE IgG1 CD2 PE UCHT 1 UCHT 1 B-E16 A1 CD244 PE IgG1 CD56 PE Beckman Coulter Beckman Coulter Beckman Coulter Dako MOC1 39C1. 5 39C1. 5 C1.7 CD3 FITC Immunotech IgG1 CD3 FITC Immunotech IgG1 IgG1 B159 CD16 CD39 (1:10) FITC FITC BD Serotec IgG2a IgG1 CD56 CD127 (IL7R) CD83 PE PE IgG1 IgG1 B159 40131 IgG2b PE PE IgG1 IgG1 HB15 a DX2 9F5 C15 IgG2b 95C3 IgG2a TL2.1 CD284 PE Beckman Coulter Beckman Coulter Serotec IgG1 IgG1 5C6FAT B1 CD95 CD123 (1:20) TCR V Alpha 24 CD117 Dako R&D Systems Beckman Coulter BD BD CD1a FITC Dako IgG2a CD63 Anti-HLA-DR FITC FITC Caltag BD IgG1 IgG2a CD163 (1:10) FITC Acris GmbH IgG1 Anti-TCR α/β1 CD282 FITC BD FITC InvivoGen IgG2a IgG1 AC14 4 PE eBioscien ce IgG2a Serotec IgG2b YTH9 13.12 PE eBioscien ce IgG2a MIH 1 IgG1 Miltenyi Biotec BD IgG1 CD19 FITC DIACLONE IgG1 13361 7 B6H1 2 B-C3 PE FITC R&D Systems BD CD273 (1:10) (PDL2+) CD274 (1:10) (PDL1) CD304 (BDCA4) CD88 HTA1 25 MIH 18 CD303 (BDCA2) FITC CD28 FITC CDw217 (IL 17RA) CD47 FITC CD40 PE IgG1 CD64 FITC IgG1 22 CD11b PE IgG1 M1/70 CD66b FITC Beckman Coulter BD IgM CD33 PE IgG1 WM53 CD4 FITC BD IgG1 CD25 PE BD IgG1 CD25 FITC BD IgG1 G10F 5 RPAT4 MA251 Beckman Coulter eBioscien ce Dako AD517F6 CD854124 B-B20 CD8 PE Beckman Coulter IgG1 MA251 B9.11 Miltenyi Biotec IgG1 NA1/3 4 L243 PE PE PE PE IgG1 IgG1 Klon Tabelle 3: nicht standardmäßig verwendet (gemäß ihrer Spezifität, ihrer Markierung, ihrem Klon (soweit bekannt) und dem verwendeten Anbieter) wurden: CD= cluster of differentiation; FITC= Fluorescein isothiocyanate; PE= Phycoerythrin; IgG= Immunglobulin G Spezifität Markierung Anbieter Isotyp Anti TCR γ/δ Annexin V FITC FITC BD TACS IgG1 CD63 FITC Caltag IgG1 CD107a FITC BD IgG1 Klon Spezifität Markierung Anbieter Isotyp Klon PE PE Dako TACS IgG1 B159 - CD56 Propidium Iodid CD40 PE IgG1 B-B20 CD40 PE Beckman Coulter Beckman Coulter IgG1 B-B20 19 2.3 2.4 Computer-Software - CellQuest Version 3.3 - Graph Pad Prism 5 - Microsoft Word 2010 Typisierung 2.4.1 FACS-Typisierung von EDTA- Frischblutproben Bis zur Weiterverarbeitung wurde das periphervenöse Patientenblut in EDTARöhrchen bei Kühlschranktemperaturen aufbewahrt. Die Proben wurden mit Hilfe eines Sample Mixers 5 Minuten auf niedriger Stufe durchmischt. Mindestens 75μl des Patientenblutes wurden jeweils in beschriftete Röhrchen pipettiert und auf Eis gestellt. Anschließend wurden je Röhrchen 3μl PE und 3μl FITC markierte monoklonale Antikörper entsprechend ihrer Kombination hinzugegeben. Unter Lichtausschluss inkubierten die Proben auf Eis für 25 Minuten. Durch die Zugabe von 2,0ml FACS Lysing Solution wurden die Erythrozyten innerhalb weiterer 10 Minuten lysiert und die Bindung der Antikörper durch Formalin (in der lysing solution enthalten) fixiert, um eine bessere Detektion der Lymphozyten zu gewährleisten (Romeu et al. 1992). Anschließend wurden die Proben abzentrifugiert (5 Minuten, 980RPM, 10°C), der Überstand wurde abgegossen und noch 2mal mit dem Waschpuffer PBS gewaschen (resuspendiert, zentrifugiert, abgegossen). Das Waschen soll nicht gebundene Antikörper entfernen, um störende Hintergrundemissionen zu minimieren. PBS dient außerdem als Trägerflüssigkeit. (Luttmann et al. 2009b) Um die Zellen für eine längere Lagerung zu fixieren, wurden im letzten Schritt zu jeder Probe 50μl Cellfix 1:10 pipettiert. (Lanier et al. 1981) 2.4.2 FACS-Typisierungen von PBMC (peripheral blood mononuclear cells) aus flüssigem Stickstoff aufgetaut Die eingefrorenen PBMCs wurden in einem 40°C warmen Wasserbad aufgetaut und in 10% FCS in RPMI1640 (im Roswell Park Memorial Institute entwickelt und vor allem für die Lymphozytenzüchtung von Tier und Mensch verwendet (Lindl et 20 al. 2008) 1+1 resuspendiert, nach 5 min bei RT mit weiteren 4ml 10 % FCS/RPMI verdünnt und abzentrifugiert (850rpm, 5‘). Die sedimentierten Zellen wurden auf Eis gestellt und mit 20µl Kaninchenserum versetzt, um Fc-Rezeptoren zu blockieren. Danach erfolgte die Verdünnung mit sogenanntem Waschpuffer (PBS (0,1%NaN3 und 0,5% FCS), so dass für jede Antikörpermarkierung 30-70µl Zellsuspension eingesetzt werden konnten. Natriumazid (NaN3) verhindert die Zellatmung und damit Clusterbildung (capping) von Antigenen auf der Zelloberfläche, und hilft außerdem, die Endozytose zu unterdrücken. (Luttmann et al. 2009b) Nach 25 minütiger Inkubation mit den spezifischen Antikörpern (5µl der Antikörpersuspension mit 10µg/ml, wie schon für die Vollblutproben beschrieben (siehe Kapitel 2.4.1)) wurden die Zellen 1mal mit Waschpuffer bei +10°C gewaschen und vor der FACS-Analyse mit je 50µl Cellfix fixiert. 2.4.3 Durchflusszytometrie – Messprinzip und Durchführung Die Durchflusszytometrie (Akronym: FACS = fluorescence activated cell sorting) ermöglicht die Identifizierung und das Sortieren von Zellen, basierend auf einer fluoreszierenden Antigen-Antikörper-Reaktion. (Janeway et al. 2002) Innerhalb weniger Sekunden bis Minuten werden tausende Zellen durch eine Kapillare gedrückt und im laminaren Probenstrom im 90° Winkel einzeln von einem Laser erfasst. (Luttmann et al. 2009b) Das hier verwendete FACSCalibur von BD, ist mit einem Argonlaser (488 nm) und einem roten Diodenlaser (635 nm) ausgestattet. (BD Biosciences 2012) Die Lichtstreuung, welche als Maß für die Größe (Vorwärtsstreulicht = Forwardscatter (FSC)) und Granularität (Seitwärtsstreulicht = Sidescatter (SSC)) der Zellen dient, sowie die Emission der verschiedenen Fluoreszenzfarbstoffe werden von Fotodetektoren (Fotomultipliern) gemessen. Die Fluoreszenzfarbstoffe Fluorescein-Isothiocyanat (FITC, gelbgrüner Farbstoff, Absorptionsmaximum: 495nm, Emissionsmaximum: 519nm) und Phycoerythrin (PE, roter Farbstoff, Absorptionsmaximum: 480nm, Emissionsmaximum: 578nm) können wegen ihrer unterschiedlichen Emissionswellenlängen zeitgleich verwendet werden. (Luttmann et al. 2009b) Aufgrund der hohen Zellzahl, lassen sich bestimmte Eigenschaften genau ermitteln und zudem die Expressionsrate verschiedener Moleküle auf der Zelloberfläche messen. (Janeway et al. 2002)(Murphy 2012a) 21 2.5 Analyse und Darstellung 2.5.1 Darstellungsformen und Statistik Die Darstellungsformen und statistischen Auswertungen erfolgten über das Computerprogramm Cellquest®. Im zweidimensionalen Standard-Punktdiagramm „Dotplot“ (Abbildungen 2A und 2B) wird für jede gemessene Zelle ein Punkt gesetzt. So kann man Zellen isolieren, die außerhalb der Haupttypen liegen, wobei die Ansammlung von Punkten im linken unteren Bereich den Zellen entspricht, die keines der beiden Antigene besitzen. Die auszuwertenden Zellen können durch das Setzen sogenannter regions of interests („gaten“) genau eingegrenzt werden. Die Beziehung zweier verschiedenen Fluoreszenzen auf eine Zelle kann dadurch besonders gutgezeigt werden. Wird nur eine Molekülart untersucht, wählt man die Darstellungsform eines Histogramms (Abbildung 2C). Hierbei handelt es sich um eine einfache Häufigkeitsverteilung, bei der die Stärke eines Fluoreszenzsignals gegen die Anzahl der Ereignisse aufgetragen wird. (Luttmann et al. 2009b)(Janeway et al. 2002) A B C Abbildung 2: Durchflusszytometrie des Probanden #11790; FITC= fluorescein isothiocyanate; PE= Phycoerythrin; CD= cluster of differentiation A: Dotplotdiagramm des Isotyps B: Dotplotdiagramm der Antikörper CD56 PE und CD16 FITC C: Histogramm des Antikörpers CD56 PE 2.5.2 Beurteilung der mittleren Fluoreszenzintensität (MFI) Eine weitere Beurteilung der antikörpermarkierten Zellen ermöglicht die mittlere Fluoreszenzintensität. Sie ist Maß für die Anzahl der gebundenen Antikörper, die proportional der Anzahl der erkannten Oberflächenmoleküle ist. Berechnungsgrundlage, der verwendeten Antikörperkonstellationen: 22 Tabelle 4: Berechnungsgrundlagen der mittleren Fluoreszenzintensität Abkürzungen: Ly=Lymphozyten; UR=oben rechts, LR=unten rechts, UL=oben links (bezogen auf die im Dotplot entstandenen Quadranten); %G = der im Cellquest ausgerechnete prozentual gegatete Zellanteil in Bezug auf die Gesamtzellzahl; XMean bzw. YMean = im Cellquest ausgerechnete Durchschnittswerte bezogen auf die jeweilige Achse; CD=cluster of differentiation CD4 und CD8 + Ly CD4 FITC (IgG1) + Ly CD8 PE (IgG1) + + Ly CD4 und CD8 (UR%G+LR%G)*LR XMean - Isotyp(LR%G*LR XMean) (UL%G+UR%G)*UL YMean - Isotyp(LR%G*LR XMean) (UR%G+LR%G)*LR XMean - Isotyp(UR%G+LR%G)*LR XMean CD4 und CD25 + Ly CD4 FITC (IgG1) + Ly CD25 PE (IgG1) + + Ly CD4 und CD25 (UR%G+LR%G)*LR XMean - Isotyp(LR%G*LR XMean) (UL%G+UR%G)*UL YMean - Isotyp(LR%G*LR XMean) (UR%G+LR%G)*LR XMean - Isotyp(UR%G+LR%G)*LR XMean CD25 und CD8 + Ly CD25 FITC (IgG1) + Ly CD8 PE (IgG1) + + Ly CD25 und CD8 (UR%G+LR%G)*LR XMean - Isotyp(LR%G*LR XMean) (UL%G+UR%G)*UL YMean - Isotyp(LR%G*LR XMean) (UR%G+LR%G)*LR XMean - Isotyp(UR%G+LR%G)*LR XMean Killerzellmarker CD16 und CD56 + Ly CD16 FITC (IgG2a) + Ly CD56 PE (IgG1) + + Ly CD16 und CD56 (UR%G+LR%G)*LR XMean - Isotyp(UL%G*LR YMean) UL%G*UL YMean - Isotyp(LR%G*LR XMean) UR%G*UR XMean – Isotyp(UL%G*UL YMean) 2.5.3 Statistik der durchflusszytometrischen Daten Die angeführten Methoden und Test wurden mithilfe des Computer-Programms CellQuest Version 3.3 durchgeführt. 2.5.4 Kruskal-Wallis-Test Dieser Test (auch H-Test genannt) ist ein nicht-parametrischer Mehr- Stichprobentest. Es soll geprüft werden, ob k unabhängige Stichproben aus der gleichen Grundgesamtheit stammen (k ≥ 3). Die Messwerte werden über alle Vergleichsgruppen der Größe nach sortiert und jeder wird die entsprechende Rangzahl zugewiesen (kleinste R(1) = 1 bis zur größten R(n) = n). Die Nullhypothese H0 lautet: Die unabhängigen Stichproben gehören der gleichen Grundgesamtheit an, ihre Verteilungsfunktionen sind gleich. Als Prüfgröße des Kruskal-Wallis-Tests wird ein sogenannter H-Wert berechnet: 𝑘 H= 12 𝑅(𝑖)2 ∑ − 3(𝑛 + 1) 𝑛(𝑛 + 1) 𝑛(𝑖) 𝑖=1 R(i) steht für die Rangsummen der einzelnen Gruppen. (Fassl 1999a). In dieser Arbeit wurde das Resultat des H-Wertes als statistisch signifikant 23 bewertet, wenn der Signifikanzwert p<0,05 war.(Kruskal et al. 1952) 2.5.5 p-Wert Der p-Wert (Signifikanzwert = p-value) nimmt Werte zwischen 0 und 1 an. Die Wahrscheinlichkeit, dass H0 wahr ist, entspricht diesem oder einem höheren Wert (hier p = 0,05). Ist der Wert hingegen < p, wird die Nullhypothese abgelehnt und das Ergebnis als statistisch signifikant bezeichnet. (Patz et al. 2013, Köhler 2004) 2.5.6 Dunn’s-Post-Test Zeigt sich im Kruskal-Wallis-Test ein signifikantes Ergebnis, können die Gruppen mit Hilfe eines Post-hoc-Tests im Einzelnen miteinander verglichen werden. Auf Grund der unterschiedlichen Gruppengrößen wurde der Dunn’s Test ausgewählt, der die Rangsummen ausgewählter Gruppen vergleicht. = √( N(N + 1) 1 1 )( + ) 12 𝑛(𝐵) 𝑛(𝐴) N ist die Summe aller Datenpunkte, n(A) und n(B) die zu vergleichenden Gruppen. (Dunn 1964) 24 3 Ergebnisse 3.1 Unterschiede zwischen PBMC und EDTA Blutproben Während den ersten Auswertungen fielen Unterschiede zwischen den aufgetauten und frischen Blutproben auf. Die vermuteten Differenzen wurden an 7 gesunden Probanden überprüft und ließen sich graphisch darstellen. CD16 CD16 30 4000 M FI 20 3000 M B E B P P B M T D E A A 0 T 10 D 1000 C 15 C 2000 A G a te d % 25 Abbildung 3: Darstellung CD16 positiver Lymphozyten aus EDTA-Vollblut im Vergleich zu aufgetauten PBMC aus Heparinblut. Die Farben entsprechen folgenden Probandennummern: rot=#12342, grün=#12545, schwarz=#12347, blau=#12547, rosa=#12018, lila=#12546, gelb=#12014. MFI=mittlere Fluoreszenzintensität; EDTA=Ethylendiamintetraessigsäure; PBMC=mononukleäre Zellen des peripheren Blutes; CD=cluster of differentiation A: Darstellung des prozentualen Anteils des Markers B: Darstellung der MFI des Markers Diese einfache graphische Darstellung zeigte eine Erhöhung der Messwerte, sowohl Prozentual (Gated %), als auch in der mittleren Expressionsdichte (MFI), nachdem eine Blutprobe durch Ficoll separiert, eingefroren und wieder aufgetaut worden war. 25 CD4 CD4 60 20000 15000 40 M FI 10000 30 M T B P E P E B D A C B M T A A C 5000 20 D G a te d % 50 Abbildung 4: Darstellung CD4 positiver Lymphozyten aus EDTA-Vollblut im Vergleich zu aufgetauten PBMC aus Heparinblut. Die Farben entsprechen folgenden Probandennummern: rot=#12342, grün=#12545, schwarz=#12347, blau=#12547, rosa=#12018, lila=#12546, gelb=#12014. MFI=mittlere Fluoreszenzintensität; EDTA=Ethylendiamintetraessigsäure; PBMC=mononukleäre Zellen des peripheren Blutes; CD=cluster of differentiation A: Darstellung des prozentualen Anteils des Markers B: Darstellung der MFI des Markers Im prozentualen Bereich liegen die Werte des PBMC Blutes über denen der EDTA Blutproben, die MFI-Werte des PBMC Blutes sogar noch stärker, wobei es einen Ausreißer zu geben scheint: #12347 (schwarz). CD8 CD8 80000 M FI 40 20 60000 M B P E B D M A C B P E D T A A C 40000 T G a te d % 60 Abbildung 5: Darstellung CD8 positiver Lymphozyten aus EDTA-Vollblut im Vergleich zu aufgetauten PBMC aus Heparinblut. Die Farben entsprechen folgenden Probandennummern: rot=#12342, grün=#12545, schwarz=#12347, blau=#12547, rosa=#12018, lila=#12546, gelb=#12014. MFI=mittlere Fluoreszenzintensität; EDTA=Ethylendiamintetraessigsäure; PBMC=mononukleäre Zellen des peripheren Blutes; CD=cluster of differentiation A: Darstellung des prozentualen Anteils des Markers B: Darstellung der MFI des Markers 26 Für den Antikörper CD8 nehmen die prozentual gegateten Werte im PBMC-Blut ab, wobei für Patient #12342 (rot) eher der PBMC-Wert stimmen dürfte, da die Probe schon >50% CD4 positive Zellen hat und man mit circa 62% CD8 positiven Zellen über 100% liegt. Die PBMC Probe von Patient #12347 (schwarz) ist wahrscheinlich zu hoch, da dieser Patient schon 50% CD4 positive, 25% CD16 positive, 18% CD56 positive und 40% CD56/CD16 doppelt positive Zellen aufzeigt. Für MFI nehmen die Werte im aufgetauten PBMC-Blut tendenziell zu. CD25 CD25 30 1000 M FI G a te d % 800 20 600 400 10 200 0 C A M B D P P E B D E T B M T A A C 0 Abbildung 6: Darstellung CD25 positiver Lymphozyten aus EDTA-Vollblut im Vergleich zu aufgetauten PBMC aus Heparinblut. Die Farben entsprechen folgenden Probandennummern: rot=#12342, grün=#12545, schwarz=#12347, blau=#12547, rosa=#12018, lila=#12546, gelb=#12014. MFI=mittlere Fluoreszenzintensität; EDTA=Ethylendiamintetraessigsäure; PBMC=mononukleäre Zellen des peripheren Blutes; CD=cluster of differentiation A: Darstellung des prozentualen Anteils des Markers B: Darstellung der MFI des Markers Die Abbildung 6B zeigt kleinere Werte der PBMC-Blutproben im Vergleich zum EDTA-Blut für CD25. Einziger Ausreißer ist Patient #12018 (rosa), dessen MFI Werte bei der aufgetauten 27 Probe stark ansteigen. CD56 b r ig h t CD56 b r ig h t 6 4 M FI G a te d % 600 400 2 200 A M B D E P M B B P E T C A T D A C 0 Abbildung 7: Darstellung CD56bright positiver Lymphozyten aus EDTA-Vollblut im Vergleich zu aufgetauten PBMC aus Heparinblut. Die Farben entsprechen folgenden Probandennummern: rot=#12342, grün=#12545, schwarz=#12347, blau=#12547, rosa=#12018, lila=#12546, gelb=#12014. MFI=mittlere Fluoreszenzintensität; EDTA=Ethylendiamintetraessigsäure; PBMC=mononukleäre Zellen des peripheren Blutes; CD=cluster of differentiation A: Darstellung des prozentualen Anteils des Markers B: Darstellung der MFI des Markers Für den NK-Zellmarker CD56bright nehmen die prozentual gegateten Werte bei den PBMC-Blutproben ab, die MFI-Werte zeigen sowohl verminderte, als auch höhere Werte an. CD56 d im CD56 30 d im 1000 20 M FI G a te d % 800 600 400 10 200 0 C A M T D P E P B M B B D E A T A C 0 Abbildung 8: Darstellung CD56dim positiver Lymphozyten aus EDTA-Vollblut im Vergleich zu aufgetauten PBMC aus Heparinblut. Die Farben entsprechen folgenden Probandennummern: rot=#12342, grün=#12545, schwarz=#12347, blau=#12547, rosa=#12018, EDTA=Ethylendiamintetraessigsäure; lila=#12546, gelb=#12014. PBMC=mononukleäre Zellen MFI=mittlere des peripheren Fluoreszenzintensität; Blutes; CD=cluster of differentiation A: Darstellung des prozentualen Anteils des Markers B: Darstellung der MFI des Markers Bei der Auswertung von CD56dim nehmen die prozentual gegateten Werte für PBMC-Blutproben ab, wobei der Patient #12014 (gelb) einen leicht steigenden 28 Wert besitzt. Die MFI Werte steigen bis auf die Patienten #12347 (schwarz) und #12342 (rot) an, wobei die Werte dieser beiden Patienten schon bei anderen Antikörpern auffällig waren und eventuell als Ausreißer betrachtet werden müssen. Zusammenfassend zeigen die untersuchten Antikörper unterschiedliche Ergebnisse in EDTA- und PBMC-Blutproben, sodass wir uns gegen eine geminsame Auswertung entschieden haben. Diese Ergebnisse sind allerdings kritisch zu betrachten, da sie auch auf Grund der geringen Fallzahl zustande kommen könnten. Betrachtet man die prozentual ausgewerteten Ergebnisse, scheinen aufgetaute PBMC eine höhere Expression von CD16 und eine niedrigere Expression von CD25 aufzuweisen. Bei der vergleichenden Berechnung der MFI-Werte lässt sich in den aufgetauten PBMC auch eine erhöhte CD8-Expression erkennen, die bei der prozentualen Auswertung nicht auffällt. Für die NK-Zellmarker haben die hier aufgetauten PBMC-Proben sowohl prozentual, als auch in der mittleren Fluoreszenz eine verstärkte Expression des Markers CD16. CD56 zeigt im prozentual gegateten Bereich niedrigere PBMCErgebnisse, wohingegen die MFI-Werte tendenziell eher höhere Expressionsraten aufweisen. 3.2 Ausreißer, Extremwerte, sowie der Kruskal-Wallis- und Dunn’sTest Konnten auffällig hohe oder niedrige Messwerte in den einzelnen Gruppen der Frischblutproben weder durch Mess- oder Dokumentationsfehler bzw. besondere pathologische Hintergründe des entsprechenden Patienten erklärt werden, wurden sie als Extremwerte und nicht als Ausreißer betrachtet und somit nicht ausgeschlossen. Die zentralen Tendenzen der Stichproben wurden mit dem Kruskal-Wallis-Test auf ihre Signifikanz überprüft. Dabei konnten die einzelnen Gruppen auf Unterschiede in ihren „Gated“- und „MFI“-Werten geprüft werden: „Gated“-Werte bezeichnen den prozentualen Anteil von beispielsweise CD56 positiven Zellen von allen Zellen in dem jeweiligen Fenster. „MFI“-Werte geben Aufschluss über die Expressionsdichte der gebunden Antikörper. 29 Auf Grund ihrer Gesamtzahl wurden die Gruppen „CRPS“ und „anderen Schmerzen“ zusammengefasst ausgewertet und das Kollektiv „OTS“ aus der Statistik ausgeschlossen. War der p-Wert <0,05, wurde anschließen eine Posthoc-Analyse mit Hilfe des Dunn’s-Test durchgeführt. 3.3 FACS- Typisierungsergebnisse von T-Zellsubpopulationen Die folgenden Abbildungen zeigen die Expression der untersuchten TZellsubpopulationen aus EDTA und PBMC-Blutproben. Die Messpunkte stammen von unterschiedlichen Patienten mit Ausnahme einzelner wieder aufgetauter Patientenproben, die sich dann sowohl in den EDTA- und PBMC-Werten wieder finden. Die Statistik wurde an den ausreichend großen Patientengruppen „Fibromyalgie“, „CRPS & andere Schmerzen“, „Gesund“ und „LCH“ durchgeführt. Patienten mit der Diagnose Übertrainingssyndrom („OTS“) wurden auf Grund des zu kleinen Kollektivs nur in den Abbildungen mit aufgeführt. Für die Gruppe „LCH“ waren keine PBMC-Blutproben aufgetaut worden. 30 3.3.1 Vergleichende Analyse CD4 positiver T-Zellen Abbildung 9A zeigt die CD4-Expression bei den untersuchten Patienten und Kontrollen aus EDTA-Blut im Vergleich zu aufgetauten PBMC (Abb.: 9B). 80 60 G a te d % 40 40 20 20 ib S O s e c h G e m T d n u e rz a y m ro G h c re e d & S P R C C R P S & a a n n d e re F S ib F n ie lg S T O L u e s rz e m C d n n e lg a y m ro H 0 ie 0 S G a te d % 60 E D T A - B lu t p r o b e n A P B M C - B lu t p r o b e n B Abbildung 9: Scatterdiagramm mit Einzelmesswerten des prozentualen Anteils CD4 positiv gegateter Lymphozyten. X-Achse: Hauptdiagnosen des Probandenkollektivs. Y-Achse: Prozentwert der Lymphozyten; horizontale Balken: oberer Balken=75%-Perzentile, mittlerer Balken=Median, unterer Balken=25%-Perzentile; CRPS=chronisches regionales Schmerzsyndrom; LCH= Langerhanszell-Histiozytose; OTS=Übertrainingssyndrom, CD=cluster of differentiation. A: Werte des EDTA (=Ethylendiamintetraessigsäure)-Blutes B: Werte der PBMC (=mononukleäre Zellen des peripheren Blutes)-Proben 31 Tabelle 4: Ergebnisse nach Durchführung des Kruskal-Wallis-Tests für die prozentual CD4 positiven Lymphozyten unter Angabe der Messwertanzahl, des Minimalwertes, der 25%-Perzentile, des Median-Wertes, der 75%-Perzentile, des Maximalwertes sowie der Standardabweichung für die einzelnen Gruppen. Anschließend wird der analysierte p-Wert inkl. Eruierung des Signifikanzniveaus unter Angabe des H-Wertes dargestellt. Wenn p<0,05 erfolgt die Auflistung deutlicher Unterschiede EDTA=Ethylendiamintetraessigsäure; beim Gruppenvergleich CD=cluster of nach Dunn's differentiation; Multiple Comparison-Test. CRPS=chronisches regionales Schmerzsyndrom; LCH= Langerhans- Zell- Histiozytose EDTA- Blut Fibromyalgie Anzahl der Werte 39 Minimum 32,42 25%-Perzentile 37,67 Median 45,87 75%-Perzentile 54,63 Maximum 71,76 Standard Abweichung 9.96 CRPS & andere Schmerzen 16 13,61 32,54 39,92 44,51 63,30 13,44 Gesund 32 27,66 36,64 41,52 45,67 51,01 6,09 LCH 27 5,97 38,14 46,73 51,79 65,71 12,97 Kruskal-Wallis-Test p-Wert H-Wert (Kruskal-Wallis Statistik) 0,0259 9,268 Dunn's Multiple Comparison-Test Gesund vs. Fibromyalgie Gesund vs. CRPS & andere Schmerzen Gesund vs. LCH p<0,05 nein nein nein Wie man dem Scatterdiagramm entnehmen kann, liegen die prozentual gegateten Werte der gesunden Patientengruppe mit einer Standardabweichung von 6,09 am nächsten zusammen. Die Streuung ist in den 3 anderen Gruppen annähernd gleich, wobei dies in der Fibromyalgiegruppe bis auf einen Ausreißer nach unten, weniger stark auffällig scheint. Die „CRPS & andere Schmerzen“-Gruppe hat mit 39,92 den niedrigsten Medianwert, die LCH-Patienten mit 46,73 den höchsten. Der Kruskal-Wallis-Test ist mit p<0,05 signifikant. Das bedeutet, dass die Verteilung der Messwerte (CD4-positive Lymphozyten bei den unterschiedlichen Gruppen) verschieden ist. So ist ein statistischer Hinweis gegeben, dass die untersuchten Patientengruppen unterschiedlichen Grundgesamtheiten angehören. Der Dunn’s-Multiple-Comparison-Test Patientengruppen nicht von der zeigt, der unterscheiden. 32 dass des sich gesunden die untersuchten Kontrollkollektivs Das PBMC-Blut zeigt dieselben Tendenzen auf. 30000 30000 20000 O T d u re e d n a & S R C C R P P S & a n d e re F S ib c h G e m s rz a y m ro G h c S n n e lg S T O L u e s rz e m C d n n e lg a y m ro ib F e 0 ie 0 H 10000 ie 10000 S M FI M FI 20000 E D T A - B lu t p r o b e n A P B M C - B lu t p r o b e n B Abbildung 10: Scatterdiagramm mit Einzelmesswerten des MFI-Wertes CD4 positiv gegateter Lymphozyten. X-Achse: Hauptdiagnosen des Probandenkollektivs. Y-Achse: Prozentwert der Lymphozyten; horizontale Balken: oberer Balken=75%-Perzentile, mittlerer Balken=Median, unterer Balken=25%-Perzentile; CRPS=chronisches regionales Schmerzsyndrom; LCH= Langerhanszell-Histiozytose; OTS=Übertrainingssyndrom, CD=cluster of differentiation; MFI=mittlere Fluoreszenzintensität; A: Werte des EDTA (=Ethylendiamintetraessigsäure)-Blutes B: Werte der PBMC (=mononukleäre Zellen des peripheren Blutes)-Proben 33 Tabelle 5: Ergebnisse nach Durchführung des Kruskal-Wallis-Tests für CD4 positive Lymphozyten unter Angabe der Messwertanzahl, des Minimalwertes, der 25%-Perzentile, des Median-Wertes, der 75%-Perzentile, des Maximalwertes sowie der Standardabweichung für die einzelnen Gruppen. Anschließend wird der analysierte pWert inkl. Eruierung des Signifikanzniveaus unter Angabe des H-Wertes dargestellt. Wenn p<0,05 erfolgt die Auflistung deutlicher Unterschiede EDTA=Ethylendiamintetraessigsäure; beim Gruppenvergleich CD=cluster of nach Dunn's differentiation; Multiple Comparison-Test. CRPS=chronisches regionales Schmerzsyndrom; LCH= Langerhans- Zell- Histiozytose EDTA- Blut Fibromyalgie Anzahl der Werte 39 Minimum 1243 25%-Perzentile 6626 Median 9472 75%-Perzentile 13161 Maximum 28612 Standard Abweichung 5633 CRPS & andere Schmerzen 16 2402 5332 11516 16773 24441 6548 Gesund 32 1947 8385 10711 12070 24277 4101 Kruskal-Wallis-Test p-Wert H-Wert (Kruskal-Wallis Statistik) 0,0423 8,188 Dunn's Multiple Comparison-Test Gesund vs. Fibromyalgie Gesund vs. CRPS & andere Schmerzen Gesund vs. LCH p<0,05 nein nein ja LCH 27 1766 5336 7633 10143 18274 3597 Die Expressionsdichte der CD4-positiven Zellen hat in allen untersuchten Gruppen eine breite Streuung. Die größte Spanne findet sich bei den Fibromyalgiepatienten (1243 – 28612 Gated %), wobei die Werte der „CRPS und andere Schmerzen“Gruppe, sowohl eine Extremwertegruppe nach unten, sowie nach oben beschreiben. Den niedrigsten Medianwert, sowie die niedrigste Standardabweichung finden sich bei den LCH Patienten. Wie bei den gegateten Werten, ist auch bei den MFI Werten des CD4 FITC Antikörpers, p<0,05. Der direkte Vergleich der einzelnen Gruppen gegen das gesunde Panel ergab nur bei „Gesund“ gegen „LCH“ einen signifikanten Wert. Die aufgetauten Blutproben zeigen in Abbildung 10B eine verstärkte Expression der MFI-Werte der FMS-Patienten im Vergleich zu den Frischblutproben. 34 3.3.2 Vergleichende Analyse CD8 positiver T-Zellen Abbildung 11A zeigt die CD8-Expression bei den untersuchten Patienten und Kontrollen aus EDTA-Blut im Vergleich zu aufgetauten PBMC (Abb.: 11B). 60 G a te d % G a te d % 40 40 20 20 S O s e re e d & S P R C C R P S & a a n n d e re F S ib c h G e m T d n u e rz a y m ro G h c S ib F n ie lg S T O L u e s rz e m C d n n e lg a y m ro H 0 ie 0 E D T A - B lu t p r o b e n P B M C - B lu t p r o b e n Abbildung 11: Scatterdiagramm mit Einzelmesswerten des prozentualen Anteils CD8 positiv gegateter Lymphozyten. X-Achse: Hauptdiagnosen des Probandenkollektivs. Y-Achse: Prozentwert der Lymphozyten; horizontale Balken: oberer Balken=75%-Perzentile, mittlerer Balken=Median, unterer Balken=25%-Perzentile; CRPS=chronisches regionales Schmerzsyndrom; LCH= Langerhanszell-Histiozytose; OTS=Übertrainingssyndrom, CD=cluster of differentiation. A: Werte des EDTA (=Ethylendiamintetraessigsäure)-Blutes B: Werte der PBMC (=mononukleäre Zellen des peripheren Blutes)-Proben 35 Tabelle 6: Ergebnisse nach Durchführung des Kruskal-Wallis-Tests für die prozentual CD8 positiven Lymphozyten unter Angabe der Messwertanzahl, des Minimalwertes, der 25%-Perzentile, des Median-Wertes, der 75%-Perzentile, des Maximalwertes sowie der Standardabweichung für die einzelnen Gruppen. Anschließend wird der analysierte p-Wert inkl. Eruierung des Signifikanzniveaus unter Angabe des H-Wertes dargestellt. Wenn p<0,05 erfolgt die Auflistung deutlicher Unterschiede EDTA=Ethylendiamintetraessigsäure; beim Gruppenvergleich CD=cluster of nach Dunn's differentiation; Multiple Comparison-Test. CRPS=chronisches regionales Schmerzsyndrom; LCH= Langerhans- Zell- Histiozytose EDTA- Blut Fibromyalgie Anzahl der Werte 39 Minimum 8,52 25%-Perzentile 24,36 Median 31,06 75%-Perzentile 37,82 Maximum 63,47 Standard Abweichung 10,36 CRPS & andere Schmerzen 16 16,38 24,94 28,60 37,11 42,21 7,31 Gesund 32 20,04 29,53 35,53 39,04 47,98 6,98 Kruskal-Wallis-Test p-Wert H-Wert (Kruskal-Wallis Statistik) 0,0465 7,976 Dunn's Multiple Comparison-Test Gesund vs. Fibromyalgie Gesund vs. CRPS & andere Schmerzen Gesund vs. LCH p<0,05 nein nein ja LCH 27 12,31 20,70 27,28 36,59 46,49 9,43 Die Gruppen der „Gesunden“ und der „CRPS und andere Schmerzen“ haben keinen extremen Ausreißer und sind mit einer geringen Standardabweichung kugelförmig um ihre Medianwerte verteilt. In den beiden anderen Gruppen ist die Standardabweichung um circa 50% höher, wobei die Gruppe „Fibromyalgie“ mit 10,63 die höchste hat. Auch ihre Minimal- und Maximalwerte sind am extremsten. Die Lymphozyten der LCH-Patienten haben den geringsten Medianwert. Der p-Wert ist mit 0,05 signifikant, was auf unterschiedliche Grundgesamtheiten hindeutet. Der daraufhin durchgeführte Dunn’s-Test ist allein für die Gruppe „LCH“ im direkten Vergleich mit dem Panel signifikant. Das PBMC-Blut zeigt in der Abbildung 11B in den Medianen niedrigere Werte, als das EDTA-Blut (Abb. 11A). 36 150000 200000 150000 M FI M FI 100000 100000 50000 50000 S O s e re d n a & S P R C C R P S & a n d e e re F S ib c h G e m T d n u e rz a y m ro G h c S ib F n ie lg S T O L u e s rz e m C d n n e lg a y m ro H 0 ie 0 E D T A - B lu t p r o b e n P B M C - B lu t p r o b e n Abbildung 12: Scatterdiagramm mit Einzelmesswerten des MFI-Wertes CD8 positiv gegateter Lymphozyten. X-Achse: Hauptdiagnosen des Probandenkollektivs. Y-Achse: Prozentwert der Lymphozyten; horizontale Balken: oberer Balken=75%-Perzentile, mittlerer Balken=Median, unterer Balken=25%-Perzentile; CRPS=chronisches regionales Schmerzsyndrom; LCH= Langerhanszell-Histiozytose; OTS=Übertrainingssyndrom, CD=cluster of differentiation; MFI=mittlere Fluoreszenzintensität; A: Werte des EDTA (=Ethylendiamintetraessigsäure)-Blutes B: Werte der PBMC (=mononukleäre Zellen des peripheren Blutes)-Proben 37 Tabelle 7: Ergebnisse nach Durchführung des Kruskal-Wallis-Tests für CD8 positive Lymphozyten unter Angabe der Messwertanzahl, des Minimalwertes, der 25%-Perzentile, des Median-Wertes, der 75%-Perzentile, des Maximalwertes sowie der Standardabweichung für die einzelnen Gruppen. Anschließend wird der analysierte pWert inkl. Eruierung des Signifikanzniveaus unter Angabe des H-Wertes dargestellt. Wenn p<0,05 erfolgt die Auflistung deutlicher Unterschiede EDTA=Ethylendiamintetraessigsäure; beim Gruppenvergleich CD=cluster of nach Dunn's differentiation; Multiple Comparison-Test. CRPS=chronisches regionales Schmerzsyndrom; LCH= Langerhans- Zell- Histiozytose EDTA- Blut Fibromyalgie Anzahl der Werte 39 Minimum 16162 25%-Perzentile 26344 Median 37668 75%-Perzentile 59528 Maximum 130250 Standard Abweichung 28239 CRPS & andere Schmerzen 16 6375 17807 36965 41523 57127 16336 Gesund 32 22299 50359 61540 76199 146310 27290 LCH 27 1144 17433 28081 46559 88189 22325 Kruskal-Wallis-Test p-Wert H-Wert (Kruskal-Wallis Statistik) < 0,0001 24,73 Dunn's Multiple Comparison-Test Gesund vs. Fibromyalgie Gesund vs. CRPS & andere Schmerzen Gesund vs. LCH p<0,05 ja ja ja Die MFI-Werte der 16 Proben der „CRPS und andere Schmerzen“-Gruppe haben die geringste Standardabweichung. Die höchsten Streuungs- und Medianwerte finden sich in den Gruppen „Gesund“ und „Fibromyalgie“. Den geringsten Median- und Minimalwert finden sich bei den „LCH“-Patienten, obwohl die höheren Werte eine Art zweite Wolke bilden. In der Gruppe „Fibromyalgie“ kommt es zu einer Verdichtung der Punktewolke um die 25%-Perzentile. Die Gruppe der Extremwerte gleicht der, der gesunden Probanden. Der p-Wert gibt einen statistischen Hinweis auf unterschiedliche Grundgesamtheiten, und auch der Dunn’s-Test deutet darauf hin, dass sich die untersuchten Gruppen vom Panel unterscheiden. Das PBMC-Blut zeigt in Abbildung 12B ähnliche Tendenzen, wie die oben 38 beschriebenen EDTA-Werte. Die Median- und Maximalwerten sind jedoch deutlich höher. 3.3.3 Vergleichende Analyse CD25 positiver T-Zellen Abbildung 13A zeigt die CD25-Expression bei den untersuchten Patienten und Kontrollen aus EDTA-Blut im Vergleich zu aufgetauten PBMC (Abb.: 13B). Die standardmäßige HLH Typisierung der untersuchten Proben beinhaltet CD25 FITC und PE Antikörper. Da die Ergebnisse der beiden Antikörper vergleichbar waren, sind jeweils 2 Werte pro Patient in den nachfolgenden Diagrammen dargestellt. 60 15 G a te d % 20 10 5 ib S O s e c h G e m T d n u e rz a y m ro G h c re e d & S P R C C R P S & a a n n d e re F S ib F n ie lg S T O L u e s rz e m C d n n e lg a y m ro H 0 ie 0 S G a te d % 40 E D T A - B lu t p r o b e n A P B M C - B lu t p r o b e n B Abbildung 13: Scatterdiagramm mit Einzelmesswerten des prozentualen Anteils CD25 positiv gegateter Lymphozyten. X-Achse: Hauptdiagnosen des Probandenkollektivs. Y-Achse: Prozentwert der Lymphozyten; horizontale Balken: oberer Balken=75%-Perzentile, mittlerer Balken=Median, unterer Balken=25%-Perzentile; CRPS=chronisches regionales Schmerzsyndrom; LCH= Langerhanszell-Histiozytose; OTS=Übertrainingssyndrom, CD=cluster of differentiation. A: Werte des EDTA (=Ethylendiamintetraessigsäure)-Blutes B: Werte der PBMC (=mononukleäre Zellen des peripheren Blutes)-Proben 39 Tabelle 8: Ergebnisse nach Durchführung des Kruskal-Wallis-Tests für die prozentual CD25 positiven Lymphozyten unter Angabe der Messwertanzahl, des Minimalwertes, der 25%-Perzentile, des Median-Wertes, der 75%-Perzentile, des Maximalwertes sowie der Standardabweichung für die einzelnen Gruppen. Anschließend wird der analysierte p-Wert inkl. Eruierung des Signifikanzniveaus unter Angabe des H-Wertes dargestellt. Wenn p<0,05 erfolgt die Auflistung deutlicher Unterschiede EDTA=Ethylendiamintetraessigsäure; beim Gruppenvergleich CD=cluster of nach Dunn's differentiation; Multiple Comparison-Test. CRPS=chronisches regionales Schmerzsyndrom; LCH= Langerhans- Zell- Histiozytose EDTA- Blut Fibromyalgie Anzahl der Werte 46 Minimum 1,51 25%-Perzentile 15,41 Median 22,28 75%-Perzentile 30,97 Maximum 52,51 Standard Abweichung 11,32 CRPS & andere Schmerzen 26 3,51 10,11 21,19 28,69 41,02 11,18 Gesund 38 1,42 10,57 16,18 25,24 53,82 11,44 Kruskal-Wallis-Test p-Wert H-Wert (Kruskal-Wallis statistic) 0,0249 9,357 Dunn's Multiple Comparison-Test Gesund vs. Fibromyalgie Gesund vs. CRPS & andere Schmerzen Gesund vs. LCH p<0,05 nein nein nein LCH 32 1,66 7,28 15,06 23,80 47,50 11,04 In allen 4 Gruppen zeigt sich eine ähnlich breite Streuung der prozentual gegateten Werte. Die Standardabweichungen liegen alle zwischen 11 und 11,5 %. Im Median haben die beiden Gruppen der chronischen Schmerzpatienten den höheren Wert. Im Kruskal-Wallis-Test ist p mit 0,02 < 0,05 und weist damit auf unterschiedliche Grundgesamtheiten hin. Im Dunn’s-Test finden sich hingegen keine Hinweise, dass sich die Vergleichsgruppen vom Panel unterscheiden. Das PBMC-Blut hat in Abbildung 13B, wie auch schon beim direkten Vergleich der Blutproben in Kapitel 3.1 auffiel, bei CD25 viel niedrigere Werte, als die EDTABlutproben (Abb.: 13A). 40 4000 3000 3000 M FI M FI 2000 2000 1000 1000 S d T n m G e e s O u e rz a y m re e d a & P R C C R P S S & a n n d e re F S ib c h ro G h c S ib F n ie lg S T O L u e s rz e m C d n n e lg a y m ro H 0 ie 0 E D T A - B lu t p r o b e n P B M C - B lu t p r o b e n A B Abbildung 14: Scatterdiagramm mit Einzelmesswerten des MFI-Wertes CD25 positiv gegateter Lymphozyten. X-Achse: Hauptdiagnosen des Probandenkollektivs. Y-Achse: Prozentwert der Lymphozyten; horizontale Balken: oberer Balken=75%-Perzentile, mittlerer Balken=Median, unterer Balken=25%-Perzentile; CRPS=chronisches regionales Schmerzsyndrom; LCH= Langerhanszell-Histiozytose; OTS=Übertrainingssyndrom, CD=cluster of differentiation; MFI=mittlere Fluoreszenzintensität; A: Werte des EDTA (=Ethylendiamintetraessigsäure)-Blutes B: Werte der PBMC (=mononukleäre Zellen des peripheren Blutes)-Proben Tabelle 9: Ergebnisse nach Durchführung des Kruskal-Wallis-Tests für CD25 positive Lymphozyten unter Angabe der Messwertanzahl, des Minimalwertes, der 25%-Perzentile, des Median-Wertes, der 75%-Perzentile, des Maximalwertes sowie der Standardabweichung für die einzelnen Gruppen. Anschließend wird der analysierte pWert inkl. Eruierung des Signifikanzniveaus unter Angabe des H-Wertes dargestellt. Wenn p<0,05 erfolgt die Auflistung deutlicher Unterschiede EDTA=Ethylendiamintetraessigsäure; beim Gruppenvergleich CD=cluster of nach Dunn's differentiation; Multiple Comparison-Test. CRPS=chronisches regionales Schmerzsyndrom; LCH= Langerhans- Zell- Histiozytose EDTA- Blut Fibromyalgie Anzahl der Werte 46 Minimum 31,16 25%-Perzentile 508,93 Median 980,85 75%-Perzentile 1182,68 Maximum 2797,79 Standard Abweichung 639,96 CRPS & andere Schmerzen 26 47,37 398,41 887,33 1316,52 2498,34 724,76 Kruskal-Wallis-Test p-Wert H-Wert (Kruskal-Wallis StatistiK) 41 Gesund 38 29,05 465,41 711,04 1217,67 3009,80 767,55 0,2779 3,852 LCH 32 69,21 345,72 654,73 1010,58 2080,88 510,64 Wie bei den prozentual gegateten Werten zeigt sich auch in der mittleren Fluoreszenzintensität eine breite Streuung in allen untersuchten Gruppen. „LCH“ hat die geringste Standardabweichung um den kleinsten Medianwert. Die Gruppe „Fibromyalgie“ den höchsten Medianwert. Beide Gruppen der chronischen Schmerzpatienten haben eine zweite, kleinere Punktewolke oberhalb der 75%-Perzentile. Der im Kruskal-Wallis-Test ermittelte p-Wert liegt über den geforderten 0,05; weshalb der Dunn’s-Test nicht durchgeführt wurde. Auch die MFI-Werte des PBMC-Blutes sind im Vergleich zum EDTA-Blut in den Abbildungen 14A und 14B niedriger. 3.3.4 Vergleichende Analyse CD4/CD25 doppelt positiver T-Lymphozyten 20 G a te d % 20 10 m T O s e G e S d n u e rz a y m ib c h ro h c e d & S R C C R P P S & a a n n d e re re F S ib F n ie lg S T O L u m G e e s rz C d n n e lg a y m ro H 0 ie 0 S G a te d % 40 E D T A - B lu t p r o b e n P B M C - B lu t p r o b e n A B Abbildung 15: Scatterdiagramm mit Einzelmesswerten des prozentualen Anteils CD4/CD25 doppelt positiv gegateter Lymphozyten. X-Achse: Hauptdiagnosen des Probandenkollektivs. Y-Achse: Prozentwert der Lymphozyten; horizontale Balken: oberer Balken=75%-Perzentile, mittlerer Balken=Median, unterer Balken=25%Perzentile; CRPS=chronisches regionales Schmerzsyndrom; OTS=Übertrainingssyndrom, CD=cluster of differentiation. A: Werte des EDTA (=Ethylendiamintetraessigsäure)-Blutes B: Werte der PBMC (=mononukleäre Zellen des peripheren Blutes)-Proben 42 LCH= Langerhanszell-Histiozytose; Tabelle 10: Ergebnisse nach Durchführung des Kruskal-Wallis-Tests für die prozentual CD4/CD25 doppelt positiven Lymphozyten unter Angabe der Messwertanzahl, des Minimalwertes, der 25%-Perzentile, des Median-Wertes, der 75%-Perzentile, des Maximalwertes sowie der Standardabweichung für die einzelnen Gruppen. Anschließend wird der analysierte p-Wert inkl. Eruierung des Signifikanzniveaus unter Angabe des H-Wertes dargestellt. Wenn p<0,05 erfolgt die Auflistung deutlicher Unterschiede beim Gruppenvergleich nach Dunn's Multiple Comparison-Test. EDTA=Ethylendiamintetraessigsäure; CD=cluster of differentiation; CRPS=chronisches regionales Schmerzsyndrom; LCH= Langerhans- Zell- Histiozytose EDTA- Blut Fibromyalgie Anzahl der Werte 23 Minimum 1,69 25%-Perzentile 15,70 Median 22,87 75%-Perzentile 26,31 Maximum 41,29 Standard Abweichung 9,67 CRPS & andere Schmerzen 13 2,84 7,62 18,23 24,59 36,26 10,35 Gesund 19 1,17 8,78 14,21 21,32 26,29 8,11 Kruskal-Wallis-Test p-Wert H-Wert (Kruskal-Wallis Statistik) LCH 15 4,89 6,50 14,14 20,34 33,16 8,13 0,0966 6,329 Alle EDTA-Vollblutproben der FM-Patienten und OTS zeigen eine homogene Verteilung. FM-Patienten haben zusätzlich wenige Extremwerte im oberen und unteren Bereich. Die übrigen Patienten und die gesunden Kontrollen streuen in einem weiteren Bereich Die Standardabweichungen der beiden Schmerzgruppen sind die höheren, wobei die Gruppe „Fibromyalgie“ den höchsten Medianwert besitzt. Die Gruppen „Gesund“ und „LCH“ haben sehr ähnliche Medianwerte und Standardabweichungen. Der Kruskal-Wallis-Test ermittelt einen p-Wert >0,05, was für eine gemeinsame Grundgesamtheit spricht, weshalb von der Durchführung des Dunn’s-MultipleComparison-Tests abgesehen wurde. Die Ergebnisse des PBMC-Blutes stellen sich in Abbildung 15B um ≥50% kleiner dar, was zu den Werten der CD25 positiven Zellen passt. 43 30000 30000 M FI M FI 20000 10000 20000 10000 S O s e re d n a & S P R C C R P S & a n d e e re F S ib c h G e m T d n u e rz a y m ro G h c S ib F n ie lg S T O L u e s rz e m C d n n e lg a y m ro H 0 ie 0 E D T A - B lu t p r o b e n P B M C - B lu t p r o b e n Abbildung 16: Scatterdiagramm mit Einzelmesswerten des MFI-Wertes CD4/CD25 doppelt positiv gegateter Lymphozyten. X-Achse: Hauptdiagnosen des Probandenkollektivs. Y-Achse: Prozentwert der Lymphozyten; horizontale Balken: oberer Balken=75%-Perzentile, mittlerer Balken=Median, unterer Balken=25%-Perzentile; CRPS=chronisches regionales Schmerzsyndrom; LCH= Langerhanszell-Histiozytose; OTS=Übertrainingssyndrom, CD=cluster of differentiation; MFI=mittlere Fluoreszenzintensität; A: Werte des EDTA (=Ethylendiamintetraessigsäure)-Blutes B: Werte der PBMC (=mononukleäre Zellen des peripheren Blutes)-Proben. 44 Tabelle 11: Ergebnisse nach Durchführung des Kruskal-Wallis-Tests für CD25 und CD4 doppelt positive Lymphozyten unter Angabe der Messwertanzahl, des Minimalwertes, der 25%-Perzentile, des Median-Wertes, der 75%-Perzentile, des Maximalwertes sowie der Standardabweichung für die einzelnen Gruppen. Anschließend wird der analysierte p-Wert inkl. Eruierung des Signifikanzniveaus unter Angabe des H-Wertes dargestellt. Wenn p<0,05 erfolgt die Auflistung deutlicher Unterschiede beim Gruppenvergleich nach Dunn's Multiple Comparison-Test. EDTA=Ethylendiamintetraessigsäure; CD=cluster of differentiation; CRPS=chronisches regionales Schmerzsyndrom; LCH= Langerhans- Zell- Histiozytose EDTA- Blut Fibromyalgie Anzahl der Werte 23 Minimum 1239 25%-Perzentile 6131 Median 11144 75%-Perzentile 14803 Maximum 28604 Standard Abweichung 6664 CRPS & andere Schmerzen 13 2398 8816 12448 18330 24437 6503 Gesund 19 1947 8762 10619 12205 18696 3667 Kruskal-Wallis-Test p-Wert H-Wert (Kruskal-Wallis Statistik) 0,0201 9,826 Dunn's Multiple Comparison-Test Gesund vs. Fibromyalgie Gesund vs. CRPS & andere Schmerzen Gesund vs. LCH p<0,05 nein nein nein LCH 15 1654 4969 7463 9755 18267 4009 Die mittlere Fluoreszenzintensität der Gruppen „Gesund“ und „LCH“ ist bis auf einzelne Werte punktförmig konzentriert. Sie zeigen auch die niedrigeren Medianund Maximalwerte, wobei „LCH“ jeweils, den kleineren hat. Die Werte der chronischen Schmerzpatienten liegen weit gestreut.Es zeigen sich mehrere Werteanhäufungen in beiden Gruppen. „Fibromyalgie“ hat den niedrigsten Minimal- und den höchsten Maximalwert. „CRPS und andere Schmerzen“-Patienten den höheren Medianwert. Der p-Wert ist mit 0,0201 deutlich kleiner als 0,05, doch im daraufhin durchgeführten Dunn’s-Test ergaben sich keine Hinweise auf Unterschiede zur Gruppe „Gesund“. Die PBMC-Werte sind in der FMS-Gruppe deutlich höher, als in der EDTAMessung (siehe Abb. 16A und 16B). 45 3.4 FACS-Typisierungsergebnisse der NK- Zellen Die folgenden Abbildungen zeigen die Expression der untersuchten NK-Zellen aus EDTA- und PBMC-Blutproben. Die Messpunkte stammen von unterschiedlichen Patienten mit Ausnahme einzelner wieder aufgetauter Patientenproben, die sich dann sowohl in den EDTA- und PBMC-Werten wieder finden. Die Statistik wurde an den ausreichend großen Patientengruppen „Fibromyalgie“, „CRPS & andere Schmerzen“, „Gesund“ und „LCH“ durchgeführt. Patienten mit der Diagnose Übertrainingssyndrom („OTS“) wurden auf Grund des zu kleinen Kollektivs nur in den Abbildungen mit aufgeführt. Für die Gruppe „LCH“ waren keine PBMCBlutproben aufgetaut worden. 3.4.1 Vergleichende Analyse CD16 positiver Zellen Die Abbildung 18A zeigt die CD16-Expression bei den untersuchten Patienten und Kontrollen aus EDTA-Blut im Vergleich zu aufgetauten PBMC (Abb.: 18B). Außerdem gibt der transmembranösen Anker CD16(Chesla et al. 2000)besonders deutlich, wodurch die veränderten Werte bei PBMC-Blutproben auch bedingt sein könnten: die normalerweise durch den Isotyp (Kombination Mouse IgG1 und IgG2a) aussortierten Zellen befinden sich nicht im linken unteren Quadranten, sondern sind nach rechts verschoben. A B Abbildung 17: Scatterdiagramme des Probanden #12342. Auf der x-Achse wurde CD16 FITC (=fluorescein isothiocyanate), auf der y-Achse CD56 PE (=Phycoerythrin) gemessen. CD=cluster of differentiation. A: Scatterdiagramm des EDTA (=Ethylendiamintetraessigsäure)-Blutes B: Scatterdiagramm der PBMC (=mononukleäre Zellen des peripheren Blutes)-Proben 46 60 G a te d % G a te d % 40 40 20 20 S O s e re e d n a & S P R C C R P S & a n d e re F S ib c h G e m T d n u e rz a y m ro G h c S ib F n ie lg S T O L u e s rz e m C d n n e lg a y m ro H 0 ie 0 E D T A - B lu t p r o b e n A P B M C - B lu t p r o b e n B Abbildung 18: Scatterdiagramm mit Einzelmesswerten des prozentualen Anteils CD16 positiv gegateter Lymphozyten. X-Achse: Hauptdiagnosen des Probandenkollektivs. Y-Achse: Prozentwert der Lymphozyten; horizontale Balken: oberer Balken=75%-Perzentile, mittlerer Balken=Median, unterer Balken=25%-Perzentile; CRPS=chronisches regionales Schmerzsyndrom; LCH= Langerhanszell-Histiozytose; OTS=Übertrainingssyndrom, CD=cluster of differentiation. A: Werte des EDTA (=Ethylendiamintetraessigsäure)-Blutes B: Werte der PBMC (=mononukleäre Zellen des peripheren Blutes)-Proben 47 Tabelle 12: Ergebnisse nach Durchführung des Kruskal-Wallis-Tests für die prozentual CD16 positiven Lymphozyten unter Angabe der Messwertanzahl, des Minimalwertes, der 25%-Perzentile, des Median-Wertes, der 75%-Perzentile, des Maximalwertes sowie der Standardabweichung für die einzelnen Gruppen. Anschließend wird der analysierte p-Wert inkl. Eruierung des Signifikanzniveaus unter Angabe des H-Wertes dargestellt. Wenn p<0,05 erfolgt die Auflistung deutlicher Unterschiede beim Gruppenvergleich nach Dunn's Multiple Comparison-Test. EDTA=Ethylendiamintetraessigsäure; CD=cluster of differentiation; CRPS=chronisches regionales Schmerzsyndrom; LCH= Langerhans- Zell- Histiozytose EDTA- Blut Fibromyalgie Anzahl der Werte 39 Minimum 6,40 25%-Perzentile 15,23 Median 21,08 75%-Perzentile 29,91 Maximum 41,37 Standard Abweichung 10,44 CRPS & andere Schmerzen 16 6,14 19,83 28,05 36,15 63,18 13,98 Gesund 32 2,79 10,96 14,22 21,87 41,19 10,09 LCH 27 1,85 11,91 21,14 28,79 59,91 13,32 Kruskal-Wallis-Test p-Wert H-Wert (Kruskal-Wallis Statistik) 0,0365 8,515 Dunn's Multiple Comparison-Test Gesund vs. Fibromyalgie Gesund vs. CRPS & andere Schmerzen Gesund vs. LCH p<0,05 nein ja nein Die CD16 positiv gegateten Lymphozyten haben die geringste Standardabweichung in den Gruppen „Fibromyalgie“ und „Gesund“, wobei letztere den geringsten Medianwert besitzen. Man erkennt keine einzelnen Extremwerte. In den beiden anderen Gruppen gibt es vor allem nach oben einzelne Extremwerte. Den höchsten Maximalwert findet sich in der Gruppe „CRPS und andere Schmerzen“, ebenso wie den höchsten Medianwert der CD16 positiven Zellen. Der ermittelte p-Wert weist mit 0,03 auf unterschiedliche Grundgesamtheiten hin. Im direkten Vergleich der Gruppen (Dunn’s-Test) ergab sich außerdem ein deutlicher Unterschied bei „Gesund“ gegen „CRPS & andere Schmerzen“. Das PBMC-Blut zeigt in Abbildung 18B bei den FMS-Patienten kleinere, bei den Gesunden hingegen höhere Werte. 48 8000 3000 6000 M FI M FI 2000 4000 1000 2000 d T n O s e G h c S ib C C R R P P S S & & a a n n d d e e re re F S u e rz m m e y a O L n ie T lg S H C d e c h ro m G e s rz u e n n ie lg a y m ro ib F S 0 0 P B M C - B lu t p r o b e n E D T A - B lu t p r o b e n A B Abbildung 19: Scatterdiagramm mit Einzelmesswerten des MFI-Wertes CD16 positiv gegateter Lymphozyten. X-Achse: Hauptdiagnosen des Probandenkollektivs. Y-Achse: Prozentwert der Lymphozyten; horizontale Balken: oberer Balken=75%-Perzentile, mittlerer Balken=Median, unterer Balken=25%-Perzentile; CRPS=chronisches regionales Schmerzsyndrom; LCH= Langerhanszell-Histiozytose; OTS=Übertrainingssyndrom, CD=cluster of differentiation; MFI=mittlere Fluoreszenzintensität; A: Werte des EDTA (=Ethylendiamintetraessigsäure)-Blutes B: Werte der PBMC (=mononukleäre 49 Zellen des peripheren Blutes)-Proben Tabelle 13: Ergebnisse nach Durchführung des Kruskal-Wallis-Tests für CD16 positive Lymphozyten unter Angabe der Messwertanzahl, des Minimalwertes, der 25%-Perzentile, des Median-Wertes, der 75%-Perzentile, des Maximalwertes sowie der Standardabweichung für die einzelnen Gruppen. Anschließend wird der analysierte pWert inkl. Eruierung des Signifikanzniveaus unter Angabe des H-Wertes dargestellt. Wenn p<0,05 erfolgt die Auflistung deutlicher Unterschiede EDTA=Ethylendiamintetraessigsäure; beim Gruppenvergleich CD=cluster of nach Dunn's differentiation; Multiple Comparison-Test. CRPS=chronisches regionales Schmerzsyndrom; LCH= Langerhans- Zell- Histiozytose EDTA- Blut Fibromyalgie Anzahl der Werte 39 Minimum 55,92 25%-Perzentile 343,68 Median 509,61 75%-Perzentile 1042,17 Maximum 2547,58 Standard Abweichung 563,45 CRPS & andere Schmerzen 16 35,98 291,93 640,49 1435,72 2008,19 625,40 Gesund 32 70,03 239,49 360,77 598,99 1296,54 276,56 LCH 27 31,79 447,94 639,27 1297,73 2944,94 816,37 Kruskal-Wallis-Test p-Wert H-Wert (Kruskal-Wallis Statistik) 0,0179 10,07 Dunn's Multiple Comparison-Test Gesund vs. Fibromyalgie Gesund vs. CRPS & andere Schmerzen Gesund vs. LCH p<0,05 nein nein ja Die Gruppe „Gesund“ liegt in der mittleren Fluoreszenzintensität am dichtesten zusammen und Maximalwerte, hat die niedrigsten sowie die niedrigste Median-, Perzentil-, Standardabweichung. MinimalDen und höchsten Medianwert hat die Gruppe „CRPS und andere Schmerzen“. Die Gruppe „LCH“ hat einen ähnlich hohen Medianwert, was jedoch an einzelnen Extremwerten liegen könnte. Die „Fibromyalgie“-Werte zentrieren sich eher auf den Bereich zwischen dem Bereich der 25%-Perzentile und dem Medianwert, haben aber eine breite Streuung. Der p-Wert ist <0,05 und damit signifikant, genau wie der Vergleich zwischen dem „Panel“ und den „LCH-Patienten“ im Dunn’s-Test. Das PBMC-Blut weist in der Abbildung 19B viel höhere Werte im MFI-Bereich der CD16 positiven Zellen auf. 50 CD16 CD16 50 40 1500 50 1000 40 3000 2000 500 30 30 1000 50 20 20 40 30 10 10 20 40 10 0 A 0 G a te d % G e s u n d M F I G esund 0 0 G a te d % F M B M FI FM Abbildung 20: Vergleich der prozentual gegateten und MFI-Einzelmesswerten (y-Achse) des Antikörpers CD16 aus EDTA-Blut. X- Achse: Links die mit einem Dreieckssymbol gekennzeichneten %-Werte, rechts die mit einem Kreis gekennzeichneten MFI-Werte. EDTA=Ethylendiamintetraessigsäure; MFI=mittlere Fluoreszenzintensität; CD=cluster of differentiation. A: Vergleich der gesunden Probanden y y a a lg lg ie ie d n u s e G G e s u n d B: Vergleich der Fibromyalgiepatienten (FM) ib F F ib ro ro m m Abbildung 20B fasst die Erhöhung der CD16-Expression bei FMS im Vergleich der prozentualen und MFI-Auswertung zusammen. Es wird deutlich, dass die verbundenen Wertelinien parallel verlaufen und damit keine Verfälschung durch Ausreißer repräsentieren. Ebenso verhalten sich die Messergebnisse der gesunden Probanden (Abb. 20A). 3.4.2 CD56 positive Zellen CD 56 ist ein Oberflächenmarker der T-Lymphozyten und NK-Zellen(Luttmann et al. 2009a). Durch ihn können die menschlichen Killerzellen in die Gruppen CD56dim und CD56bright unterteilt werden. (Harlin et al. 2007) 3.4.2.1 Vergleichende Analyse CD56dim positiver Zellen Abbildung 21A zeigt die CD56dim-Expression bei den untersuchten Patienten und Kontrollen aus EDTA-Blut im Vergleich zu aufgetauten PBMC (Abb.: 21B). 51 30 20 G a te d % 20 10 T O s e G e m ib c h ro S d n u e rz a y m e G e m h c e d n a & S P R C C R P S & a n d e re re F S ib F n ie lg S O C L u s rz T d n n e lg a y m ro H 0 ie 0 S G a te d % 40 E D T A - B lu t p r o b e n P B M C - B lu t p r o b e n Abbildung 21: Scatterdiagramm mit Einzelmesswerten des prozentualen Anteils CD56dim positiv gegateter Lymphozyten. X-Achse: Hauptdiagnosen des Probandenkollektivs. Y-Achse: Prozentwert der Lymphozyten; horizontale Balken: oberer Balken=75%-Perzentile, mittlerer Balken=Median, unterer Balken=25%-Perzentile; CRPS=chronisches regionales Schmerzsyndrom; LCH= Langerhanszell-Histiozytose; OTS=Übertrainingssyndrom, CD=cluster of differentiation. A: Werte des EDTA (=Ethylendiamintetraessigsäure)-Blutes B: Werte der PBMC (=mononukleäre Zellen des peripheren Blutes)-Proben Tabelle 14: Ergebnisse nach Durchführung des Kruskal-Wallis-Tests für die prozentual CD56dim positiven Lymphozyten unter Angabe der Messwertanzahl, des Minimalwertes, der 25%-Perzentile, des Median-Wertes, der 75%-Perzentile, des Maximalwertes sowie der Standardabweichung für die einzelnen Gruppen. Anschließend wird der analysierte p-Wert inkl. Eruierung des Signifikanzniveaus unter Angabe des H-Wertes dargestellt. Wenn p<0,05 erfolgt die Auflistung deutlicher Unterschiede beim Gruppenvergleich nach Dunn's Multiple Comparison-Test. EDTA=Ethylendiamintetraessigsäure; CD=cluster of differentiation; CRPS=chronisches regionales Schmerzsyndrom; LCH= Langerhans- Zell- Histiozytose EDTA- Blut Anzahl der Werte Minimum 25%-Perzentile Median 75%-Perzentile Maximum Standard Abweichung Fibromyalgie 39 1,14 8,64 14,23 19,83 52,03 9,93 CRPS & andere Schmerzen 16 6,00 9,48 14,24 16,81 24,01 4,986 Kruskal-Wallis-Test p-Wert H-Wert (Kruskal-Wallis Statistik) 52 Gesund 32 1,99 7,85 11,91 17,19 30,82 6,35 0,3554 3,245 LCH 27 5,68 8,03 11,38 15,62 41,93 7,60 Bis auf einzelne nach oben ausgerissene Werte liegt die Punkteverteilung aller Gruppen dicht beieinander. Trotz der unterschiedlichen Standardabweichungen ist der Medianwert der beiden Schmerzgruppen ähnlich groß. In der „LCH“-Gruppe bewegen sich die Punkte mit der geringsten Standardabweichung um den kleinsten Medianwert der 4 Gruppen. Im Kruskal-Wallis-Test war p>0,05, was eine Durchführung des Dunn’s-Tests überflüssig macht. Die PBMC-Werte liegen in Abbildung 21B für FM und “Gesund“ deutlich unter denen, der EDTA-Blutproben. 1500 O d & S R C C R P P S & a a n n d e e re re F S ib c h G e m T d rz a y m ro G h c S n n e lg S T O L u e s rz e m C d n n e lg a y m ro ib F u 0 s 0 ie 500 H 500 S 1000 e M FI 1000 ie M FI 1500 E D T A - B lu t p r o b e n P B M C - B lu t p r o b e n Abbildung 22: Scatterdiagramm mit Einzelmesswerten des MFI-Wertes CD56dim positiv gegateter Lymphozyten. X-Achse: Hauptdiagnosen des Probandenkollektivs. Y-Achse: Prozentwert der Lymphozyten; horizontale Balken: oberer Balken=75%-Perzentile, mittlerer Balken=Median, unterer Balken=25%-Perzentile; CRPS=chronisches regionales Schmerzsyndrom; LCH= Langerhanszell-Histiozytose; OTS=Übertrainingssyndrom, CD=cluster of differentiation; MFI=mittlere Fluoreszenzintensität; A: Werte des EDTA (=Ethylendiamintetraessigsäure)-Blutes B: Werte der PBMC (=mononukleäre Zellen des peripheren Blutes)-Proben 53 Tabelle 15: Ergebnisse nach Durchführung des Kruskal-Wallis-Tests für CD56dim positive Lymphozyten unter Angabe der Messwertanzahl, des Minimalwertes, der 25%-Perzentile, des Median-Wertes, der 75%-Perzentile, des Maximalwertes sowie der Standardabweichung für die einzelnen Gruppen. Anschließend wird der analysierte pWert inkl. Eruierung des Signifikanzniveaus unter Angabe des H-Wertes dargestellt. Wenn p<0,05 erfolgt die Auflistung deutlicher Unterschiede EDTA=Ethylendiamintetraessigsäure; beim Gruppenvergleich CD=cluster of nach Dunn's differentiation; Multiple Comparison-Test. CRPS=chronisches regionales Schmerzsyndrom; LCH= Langerhans- Zell- Histiozytose EDTA- Blut Fibromyalgie Anzahl der Werte 39 Minimum 28,27 25%-Perzentile 114,03 Median 306,97 75%-Perzentile 589,77 Maximum 1092,87 Standard Abweichung 313,11 CRPS & andere Schmerzen 16 20,53 105,66 189,66 281,22 920,23 285,41 Kruskal-Wallis-Test p-Wert H-Wert (Kruskal-Wallis Statistik) Gesund 32 9,82 79,11 166,25 246,05 1579,38 385,33 LCH 27 14,24 80,14 260,64 744,62 1312,39 398,46 0,2591 4,022 Der Medianwert der FM Gruppe ist etwa doppelt so hoch wie in den Gruppen „CRPS und andere Schmerzen“ und „Gesund“. Die Gruppe „CRPS und andere Schmerzen“ hat 2 einzelne Extremwerte nach oben, bei den beiden nicht-Schmerz-Gruppen sind es mehrere. Der p-Wert ist wie schon bei Gated % CD56dim nicht signifikant. Da man von einer Grundgesamtheit ausgehen kann ist der Dunn’s-Test überflüssig. Die Mediane aller 4 Gruppen liegen in Abbildung 21B bei den PBMC- deutlich über denen, der EDTA-Proben. 54 CD56 CD56 d im d im 60 25 2000 1000 1500 20 1000 40 500 15 500 20 10 20 10 5 0 A 0 0 G a te d % G e s u n d 20 10 0 M F I G esund M FI FM G a te d % F M B Abbildung 23: Vergleich der prozentual gegateten und MFI-Einzelmesswerten (y-Achse) des Antikörpers CD56dim aus EDTA-Blut. X- Achse: Links die mit einem Dreieckssymbol gekennzeichneten %-Werte, rechts die mit einem Kreis gekennzeichneten MFI-Werte. EDTA=Ethylendiamintetraessigsäure; MFI=mittlere Fluoreszenzintensität; CD=cluster of differentiation. A: Vergleich der gesunden Probanden m m ya lg ya lg ie ie d u s e G G e s u n n d B: Vergleich der Fibromyalgiepatienten (FM) ro ib F F ib ro Die verbundenen Wertelinien zwischen den prozentualen und MFI-Werten des Oberflächenmarkers CD56dim bei gesunden Probanden, sowie bei FM-Patienten, weisen weniger Parallelität auf, was Ausreißer in dieser Untersuchung nicht ausschließen kann. 3.4.2.2 Vergleichende Analyse CD56bright positiver Zellen Die CD56bright -Expression bei den untersuchten Patienten und Kontrollen aus EDTA-Blut wird in Abb. 24A im Vergleich zu aufgetauten PBMC (Abb.: 24B) gezeigt. 55 6 12 4 G a te d % G a te d % 9 6 2 3 O G e s T d u e rz e m c h ro S F C C R R P P S S & & a n a d n e d e re re S n n ie lg m O y a T S H L C d c h ib m G e e s rz u e n n ie lg a y m ro ib F S 0 0 P B M C - B lu t p r o b e n E D T A - B lu t p r o b e n A B Abbildung 24: Scatterdiagramm mit Einzelmesswerten des prozentualen Anteils CD56bright positiv gegateter Lymphozyten. X-Achse: Hauptdiagnosen des Probandenkollektivs. Y-Achse: Prozentwert der Lymphozyten; horizontale Balken: oberer Balken=75%-Perzentile, mittlerer Balken=Median, unterer Balken=25%-Perzentile; CRPS=chronisches regionales Schmerzsyndrom; LCH= Langerhanszell-Histiozytose; OTS=Übertrainingssyndrom, CD=cluster of differentiation. A: Werte des EDTA (=Ethylendiamintetraessigsäure)-Blutes B: Werte der PBMC (=mononukleäre Zellen des peripheren Blutes)-Proben 56 Tabelle 16: Ergebnisse nach Durchführung des Kruskal-Wallis-Tests für die prozentual CD56bright positiven Lymphozyten unter Angabe der Messwertanzahl, des Minimalwertes, der 25%-Perzentile, des Median-Wertes, der 75%-Perzentile, des Maximalwertes sowie der Standardabweichung für die einzelnen Gruppen. Anschließend wird der analysierte p-Wert inkl. Eruierung des Signifikanzniveaus unter Angabe des H-Wertes dargestellt. Wenn p<0,05 erfolgt die Auflistung deutlicher Unterschiede beim Gruppenvergleich nach Dunn's Multiple Comparison-Test. EDTA=Ethylendiamintetraessigsäure; CD=cluster of differentiation; CRPS=chronisches regionales Schmerzsyndrom; LCH= Langerhans- Zell- Histiozytose EDTA- Blut Fibromyalgie Anzahl der Werte 39 Minimum 0,21 25%-Perzentile 1,67 Median 2,72 75%-Perzentile 3,01 Maximum 7,14 Standard Abweichung 1,52 CRPS & andere Schmerzen 16 0,09 1,96 3,76 5,31 11,20 2,69 Gesund 32 0,71 1,41 2,18 2,74 4,89 2,29 Kruskal-Wallis-Test p-Wert H-Wert (Kruskal-Wallis Statistik) 0,0322 8,794 Dunn's Multiple Comparison-Test Gesund vs. Fibromyalgie Gesund vs. CRPS & andere Schmerzen Gesund vs. LCH p<0,05 nein nein nein LCH 27 0,76 1,19 1,93 2,32 7,90 1,80 Die größte Streuung mit der größten Standardabweichung der CD56 bright prozentual gegateten Werte findet sich in der Gruppe „CRPS und andere Schmerzen“. In den übrigen Gruppen finden sich einzelne Werte, die nach oben ausreißen. Der höchste Medianwert findet sich ebenfalls in der Gruppe „CRPS und andere Schmerzen“, der fast doppelt so hoch wie der kleinste in der Gruppe „LCH“ ist. Der p-Wert des Kruskal-Wallis-Test ist <0,05, was auf unterschiedliche Grungesamtheiten hinweist. Im daraufhin durchgeführten Dunn’s-Test zeigen sich keine signifikanten Unterschiede zur Gruppe „Gesund“. Das PBMC-Blut hat niedrigere Messergebnisse, als die EDTA-Gruppen (siehe Abb. 24A und 24B). 57 1500 M FI M FI 2000 1000 1000 500 S d T n m G e e s O u e rz a y m d n & S R C C R P P S & a a n d e e re re F S ib c h ro G h c S ib F n ie lg S T O L u e s rz e m C d n n e lg a y m ro H 0 ie 0 E D T A - B lu t p r o b e n P B M C - B lu t p r o b e n Abbildung 25: Scatterdiagramm mit Einzelmesswerten des MFI-Wertes CD56bright positiv gegateter Lymphozyten. X-Achse: Hauptdiagnosen des Probandenkollektivs. Y-Achse: Prozentwert der Lymphozyten; horizontale Balken: oberer Balken=75%-Perzentile, mittlerer Balken=Median, unterer Balken=25%-Perzentile; CRPS=chronisches regionales Schmerzsyndrom; LCH= Langerhanszell-Histiozytose; OTS=Übertrainingssyndrom, CD=cluster of differentiation; MFI=mittlere Fluoreszenzintensität; A: Werte des EDTA (=Ethylendiamintetraessigsäure)-Blutes B: Werte der PBMC (=mononukleäre Zellen des peripheren Blutes)-Proben Tabelle 17: Ergebnisse nach Durchführung des Kruskal-Wallis-Tests für CD56bright positive Lymphozyten unter Angabe der Messwertanzahl, des Minimalwertes, der 25%-Perzentile, des Median-Wertes, der 75%-Perzentile, des Maximalwertes sowie der Standardabweichung für die einzelnen Gruppen. Anschließend wird der analysierte pWert inkl. Eruierung des Signifikanzniveaus unter Angabe des H-Wertes dargestellt. Wenn p<0,05 erfolgt die Auflistung deutlicher Unterschiede EDTA=Ethylendiamintetraessigsäure; beim Gruppenvergleich CD=cluster of nach Dunn's differentiation; Multiple Comparison-Test. CRPS=chronisches regionales Schmerzsyndrom; LCH= Langerhans- Zell- Histiozytose EDTA- Blut Fibromyalgie Anzahl der Werte 39 Minimum 8,68 25%-Perzentile 172,04 Median 266,03 75%-Perzentile 448,22 Maximum 1123,56 Standard Abweichung 240,33 CRPS & andere Schmerzen 16 56,39 175,31 290,34 384,62 607,81 152,89 Kruskal-Wallis-Test p-Wert H-Wert (Kruskal-Wallis Statistik) 58 Gesund 32 46,41 167,10 287,35 573,16 1505,97 378,17 0,7191 1,342 LCH 27 103,56 208,25 288,34 670,15 2482,42 617,51 Die Punktwolken der beiden Schmerzgruppen liegen dicht beieinander, wobei bei Fibromyalgie ein einzelner nach oben ausreißender Wert auffällt. Trotzdem findet sich in dieser Gruppe der geringste Medianwert. Die geringste Standardabweichung findet sich demnach in der Gruppe „CRPS & andere Schmerzen“. Die übrigen Gruppen „Gesund“ und „LCH“ haben einige Werte oberhalb ihrer Hauptpunktewolke. Bei „LCH“ sind es die meisten, und diese Gruppe besitzt auch den höchsten Medianwert. P ist bei der mittleren Fluoreszenzintensität von CD56 bright >0,05, was statistisch auf eine gemeinsame Grundgesamtheit hindeutet. Das PBMC-Blut hat höhere MFI-Werte, als das EDTA-Blut, mit besonders auffälligen Veränderungen in der FMS Gruppe durch die breite Streuung der PBMC-Werte (Abb.: 25B). CD56 CD56 b r ig h t b r ig h t 8 6 1500 1000 1000 6 500 4 40 4 20 2 0 0 500 2 10 0 A G a te d % G e s u n d M F I G esund 0 G a te d % F M B M FI FM Abbildung 26: Vergleich der prozentual gegateten und MFI-Einzelmesswerten (y-Achse) des Antikörpers CD56bright aus EDTA-Blut. X- Achse: Links die mit einem Dreieckssymbol gekennzeichneten %-Werte, rechts die mit einem Kreis gekennzeichneten MFI-Werte. EDTA=Ethylendiamintetraessigsäure; MFI=mittlere Fluoreszenzintensität; CD=cluster of differentiation. A: Vergleich der gesunden Probanden B: Vergleich der Fibromyalgiepatienten (FM) lg lg ie ie n u u n d d Die weitgehend parallel verlaufenden Linien des prozentualen Anteils und der F ro ib Ausreißerwahrscheinlichkeit hin. F ib ro m m y y a a s e G G e s mittleren Fluoreszenzidentität des Markers CD56bright deuten auf eine niedrige 3.4.3 Vergleichende Analyse CD16/CD56 doppelt positiver NK-Zellen Die Expression der doppelt positiven NK-Zellmarker bei den untersuchten Patienten und Kontrollen aus EDTA-Blut wird in Abb. 27A im Vergleich zu aufgetauten PBMC- Blutproben (Abb.: 27B) gezeigt. 59 30 40 20 G a te d % G a te d % 30 20 10 10 d T G e s O u e rz e m m C h c C R R P P S S & & a a n n d d e e re re F S ib c S n n ie y O a T lg S H L C d h ro m G e e s rz u e n n ie lg a y m ro ib F S 0 0 P B M C - B lu t p r o b e n E D T A - B lu t p r o b e n A B Abbildung 27: Scatterdiagramm mit Einzelmesswerten des prozentualen Anteils CD16/CD56 doppelt positiv gegateter Lymphozyten. X-Achse: Hauptdiagnosen des Probandenkollektivs. Y-Achse: Prozentwert der Lymphozyten; horizontale Balken: oberer Balken=75%-Perzentile, mittlerer Balken=Median, unterer Balken=25%Perzentile; CRPS=chronisches regionales Schmerzsyndrom; OTS=Übertrainingssyndrom, CD=cluster of differentiation. A: Werte des EDTA (=Ethylendiamintetraessigsäure)-Blutes B: Werte der PBMC (=mononukleäre Zellen des peripheren Blutes)-Proben 60 LCH= Langerhanszell-Histiozytose; Tabelle 18: Ergebnisse nach Durchführung des Kruskal-Wallis-Tests für die prozentual CD16/CD56 doppelt positiven Lymphozyten unter Angabe der Messwertanzahl, des Minimalwertes, der 25%-Perzentile, des MedianWertes, der 75%-Perzentile, des Maximalwertes sowie der Standardabweichung für die einzelnen Gruppen. Anschließend wird der analysierte p-Wert inkl. Eruierung des Signifikanzniveaus unter Angabe des H-Wertes dargestellt. Wenn p<0,05 erfolgt die Auflistung deutlicher Unterschiede beim Gruppenvergleich nach Dunn's Multiple Comparison-Test. EDTA=Ethylendiamintetraessigsäure; CD=cluster of differentiation; CRPS=chronisches regionales Schmerzsyndrom; LCH= Langerhans- Zell- Histiozytose EDTA- Blut Fibromyalgie Anzahl der Werte 39 Minimum 3,16 25%-Perzentile 5,78 Median 8,82 75%-Perzentile 14,20 Maximum 33,58 Standard Abweichung 6,54 CRPS & andere Schmerzen 16 2,39 10,85 13,73 19,27 26,65 6,45 Gesund 32 1,21 6,08 9,44 13,96 22,49 5,60 Kruskal-Wallis-Test p-Wert H-Wert (Kruskal-Wallis Statistik) 0,0213 9,703 Dunn's Multiple Comparison-Test Gesund vs. Fibromyalgie Gesund vs. CRPS & andere Schmerzen Gesund vs. LCH p<0,05 nein nein nein LCH 27 1,70 4,37 6,80 11,32 40,53 8,12 Die geringste Standardabweichung findet sich in der Gruppe gesunder Probanden. Die Gruppe „LCH“ besitzt den größten Maximalwert, wobei es sich aber um einen Ausreißer handelt, da sie den niedrigsten Medianwert besitzt. Die Werte der Gruppe „CRPS & andere Schmerzen“ ergaben den höchsten Medianwert. Im Kruskal-Wallis-Test wurde ein p-Wert <0,05 ausgerechnet, der Dunn’s Test ergab keine signifikanten Werte. Der Median der CD56/CD16 doppelte positiven Zellen war in den Messungen mit PBMC- deutlich höher als im EDTA-Blut (siehe Abb.: 27A und 27B). Dies gilt für das FMS, gesunde Kontrollen, Patienten mit Übertrainingssyndrom und die zwei untersuchten Patientenproben der CRPS-Gruppe. 61 10000 S d T O u rz a m G e y m c h ro C C R R P P S S & & a a n n d d e e re re F S ib h c S n n e lg S O C L u m G e e s rz T d n n e lg a y m ro ib F s 0 ie 0 H 5000 ie 2000 e M FI M FI 4000 P B M C - B lu t p r o b e n E D T A - B lu t p r o b e n Abbildung 28: Scatterdiagramm mit Einzelmesswerten des MFI-Wertes CD16/56 doppelt positiv gegateter Lymphozyten. X-Achse: Hauptdiagnosen des Probandenkollektivs. Y-Achse: Prozentwert der Lymphozyten; horizontale Balken: oberer Balken=75%-Perzentile, mittlerer Balken=Median, unterer Balken=25%-Perzentile; CRPS=chronisches regionales Schmerzsyndrom; LCH= Langerhanszell-Histiozytose; OTS=Übertrainingssyndrom, CD=cluster of differentiation; MFI=mittlere Fluoreszenzintensität; A: Werte des EDTA (=Ethylendiamintetraessigsäure)-Blutes B: Werte der PBMC (=mononukleäre Zellen des peripheren Blutes)-Proben Tabelle 19: Ergebnisse nach Durchführung des Kruskal-Wallis-Tests für CD16/CD56 doppelt positive Lymphozyten unter Angabe der Messwertanzahl, des Minimalwertes, der 25%-Perzentile, des Median-Wertes, der 75%-Perzentile, des Maximalwertes sowie der Standardabweichung für die einzelnen Gruppen. Anschließend wird der analysierte p-Wert inkl. Eruierung des Signifikanzniveaus unter Angabe des H-Wertes dargestellt. Wenn p<0,05 erfolgt die Auflistung deutlicher Unterschiede EDTA=Ethylendiamintetraessigsäure; beim Gruppenvergleich CD=cluster of nach Dunn's differentiation; Multiple Comparison-Test. CRPS=chronisches regionales Schmerzsyndrom; LCH= Langerhans- Zell- Histiozytose EDTA- Blut Fibromyalgie Anzahl der Werte 39 Minimum 5,34 25%-Perzentile 28735 Median 425,62 75%-Perzentile 915,46 Maximum 1885,71 Standard Abweichung 427,61 CRPS & andere Schmerzen 16 74,96 407,29 1154,55 2025,36 4143,41 1181,61 Kruskal-Wallis-Test p-Wert H-Wert (Kruskal-Wallis Statistik) 62 Gesund 32 31,12 217,65 690,01 1092,99 2554,85 616,55 0,1438 5,415 LCH 27 34,18 295,09 415,70 989,10 4693,23 1051,36 Der mit Abstand kleinste Medianwert findet sich in der Gruppe „FM“. Der größte Median findet sich bei der zweiten Schmerzgruppe. Die Gruppe „Gesund“ hat eine enge Punkteverteilung. Die meisten Werte der „LCH“-Patienten sind, wie auch bei Fibromyalgie, um ihren niedrigen Medianwert verteilt. Einzelne Werte sind oberhalb der Hauptwolke sichtbar. Der geforderte p-Wert <0,05 wurde nicht erreicht, was statistisch für eine gemeinsame Grundgesamtheit spricht. Daher konnte auf den Dunn’s-Test verzichtet werden. Die MFI-Werte der CD56/CD16 doppelt positiven PBMC-Proben liegen deutlich über denen, des EDTA-Blutes (siehe Abb.: 28A und 28B), wobei besonders die starke Steigerung der wenigen „OTS“-Patienten auffällig scheint. Zusammenfassend sieht man in den jeweiligen Abbildungspaaren nochmals die Werteveränderungen zwischen PBMC- und EDTA-Blutproben, wie auch schon im Kapitel 3.1 beschrieben wurde: Die T-Zellsubpopulationen CD4 und CD8 steigen in den aufgetauten Proben an, CD25 sinkt. Für die NK-Zellmarker zeigen sich für CD16 und CD56 höhere Werte in den aufgetauten PBMC-Blutproben. Fibromyalgiepatienten hatten im Median höhere Werte im Vergleich zu „Gesund“ für die Oberflächenmarker CD4 (prozentual), CD25 und CD4/CD25 doppelt positiv, aber kleinere im Vergleich zu MFI CD4 und CD8. Die NK-Zellmarkerwerte sind für CD16, CD56dim und den prozentualen CD56bright für Patienten mit der Diagnose Fibromyalgie höher, als für das gesunde Panel. Die übrigen chronischen Schmerzpatienten zeigten im Vergleich bis auf die prozentual gegateten Marker CD4 und CD8 immer höhere Werte als die Gruppe „Gesund“ an. Sie zeigten eine besonders starke Expressionsstärke für CD16 und CD56/CD16 positive Zellen, die für ADCC zuständig sind. Die LCH-Tumorpatienten zeigten verminderte Werte im Vergleich zum Panel für die T-Zellsubpopulationen MFI CD4, CD8, CD25, CD4/CD25. Für die NKZellmarker CD16, MFI CD56dim und MFI CD56bright, wobei die CD56 Werte wegen der Ausreißer kritisch zu betrachten sind. Der bei einem p<0,05 durchgeführte Dunn’s-Test wies nur signifikante Unterschiede zum Panel für MFI CD4 vs. LCH, % CD8 vs. LCH und für MFI CD8 vs. „Fibromyalgie“, „CRPS & andere Schmerzen“, sowie vs. „LCH“ auf. 63 3.5 Annexin V und Degranulationsversuche 3.5.1 Annexin V Das Protein Annexin V bindet spezifisch an Phosphatidylserin, lässt sich leicht mit diversen Fluoreszenzfarbstoffen fluoreszenzmikroskopisch oder markieren und durchflusszytometrisch kann zur daher Detektion apoptotischer Zellen benutzt werden. (Luttmann et al. 2009c) A B Abbildung 29: Dotplotdiagramme nach FACS-Analyse der aufgetauten Blutprobe des Patienten #13614. A: Annexin V FITC (x-Achse) und DNA Farbstoff Propidiumiodid (PI) (y-Achse). B: Mit Natrium-Chlorid (Anstelle der Blutprobe) durchgeführten Negativkontrolle. FITC (=fluorescein isothiocyanate); FACS (=fluorescence activated cell sorting) Tabelle 20: Ergebnisse der prozentual durchflusszytometrisch erfassten Lymphozyten, nach Abzug des Isotyps, für Annexin V / PI (Propidiumiodid) der aufgetauten Blutprobe und der Negativkontrolle. UR = „upper right“, oberer rechter Quadrant; LR = „lower right“, unterer, rechter Quadrant. Annexin V / PI UR: LR: Negativkontrolle UR: LR: 7,24% 27,91% 0,08% 0,23% Frühapoptotische Zellen erscheinen nur Annexin positiv (rechter, unterer Quadrant: LR), wohingegen nekrotische und spätapoptotische Zellen doppelt positiv für Annexin V und den verwendeten DNA-Farbstoff (PI) sind (rechter, oberer Quadrant: UR). (Luttmann et al. 2009c) Die Werte der Negativkontrolle entsprechen gerundet dem Wert 0 und sind somit erwartungsgemäß negativ. 64 3.5.2 CD63 Expression CD63 ist ein Granulamembranprotein und dient als Degranulationsmarker für Antigene, welche den Endosom-Phago-Lysosomprozess durchlaufen haben (Schäfer et al. 2010) CD40 wird auf T-Zellen, B-Zellen, Monozyten und NK-Zellen exprimiert und bindet an CD40-L. (Luttmann et al. 2009a) A B Abbildung 30: Dotplotdiagramm nach FACS-Analyse von CD63 FITC (x-Achse) und CD40 PE (y-Achse). A: EDTA-Blutprobe des Patienten #13614. B: PBMC-Blutprobe des Patienten #13614. EDTA=Ethylendiamintetraessigsäure; PBMC=mononukleäre Zellen des peripheren Blutes; CD=cluster of differentiation; FITC (=fluorescein isothiocyanate); FACS (=fluorescence activated cell sorting); PE=Phycoerythrin. Tabelle 21: Ergebnisse der prozentual durchflusszytometrisch erfassten Lymphozyten, nach Abzug des Isotyps, für CD63/CD40 der sofort gemessenen frischen (% EDTA= Ethylendiamintetraessigsäure) und der aufgetauten Blutprobe (% PBMC= mononukleäre Zellen des peripheren Blutes). UR=„upper right“, oberer rechter Quadrant; LR=„lower right“, unterer, rechter Quadrant; UL=„upper left“, oberer, linker Quadrant; CD=cluster of differentiation. CD63/CD40 UR (CD63+/CD40+) LR (CD63+/CD40-) UL (CD63-/CD40+) % EDTA 10,67 52,15 1,35 % PBMC 38,54 43,37 4,94 Sowohl die gegateten Werte des Degranulationsmarkers CD63 (gesamt: EDTA: 62,8%; PBMC: 81,9%), als auch die von CD40 (EDTA: 12%; PBMC: 43.5%) sind in der aufgetauten PBMC-Blutprobe angestiegen 3.5.3 CD107a Expression CD107a befindet sich normalerweise intrazellulär, wird aber bei Stimulation vorübergehend an der Oberfläche exprimiert und kann dann als Degranulationsmarker für Lymphozyten wie CD8+-T-Zellen und NK-Zellen 65 verwendet werden. (Miltenyi Biotec 2012) CD40 kommt unter anderem auf NK-Zellen vor. (Luttmann et al. 2009a) Abbildung 31: Dotplotdiagramm nach FACS-Analyse von CD107a FITC (x-Achse) und CD40 PE (y-Achse). A: EDTA-Blutprobe des Patienten #13614. B: PBMC-Blutprobe des Patienten #13614. EDTA=Ethylendiamintetraessigsäure; PBMC=mononukleäre Zellen des peripheren Blutes; CD=cluster of differentiation; FITC (=fluorescein isothiocyanate); FACS (=fluorescence activated cell sorting); PE=Phycoerythrin. Tabelle 22: Ergebnisse der prozentual durchflusszytometrisch erfassten Lymphozyten, nach Abzug des Isotyps, für CD107a/CD40 der sofort gemessenen frischen (% EDTA= Ethylendiamintetraessigsäure) und der aufgetauten Blutprobe (% PBMC= mononukleäre Zellen des peripheren Blutes). UR=„upper right“, oberer rechter Quadrant; LR=„lower right“, unterer, rechter Quadrant; UL=„upper left“, oberer, linker Quadrant; CD=cluster of differentiation. CD107a/CD40 UR (CD107a+/CD40+) LR (CD107a+/CD40-) UL (CD107a-/CD40+) % EDTA 1,27 1,75 11,55 % PBMC 9,62 5,49 22,05 Sowohl die gegateten Werte des Degranulationsmarkers CD107a, als auch die von CD40 sind in der aufgetauten PBMC-Blutprobe angestiegen. Bei CD107a (UR+LR) von 3,02% auf 15,11% und bei CD40 (UL+UR) von 12,82% auf 31,67%. Zusammenfassend kann man sagen, dass viele CD-Marker in der PBMC-Probe prozentual höher positiv waren, als in der EDTA-Blutprobe. Die untersuchten Degranulationsmarker stiegen unterschiedlich stark an: 66 CD107a um das 5,00-fache, CD63 um das 1,30-fache, CD40 um das 2,47 bzw. 3,62-fache. 3.6 Auswirkungen der Medikation auf den Immunstatus Um herauszufinden, ob veränderte Werte der NK-Zellen mit der Einnahme bestimmter Medikamentengruppen korrelieren, wurden sie den Messwerten der EDTA-Blutproben der Fibromyalgiepatienten zugeordnet. Eine Veränderung der Ergebnisse könnte bei den beiden Medikamenten Lithium und Cortison vorliegen, da sie zum Blutabnahmezeitpunkt nur von einzelnen Patienten eingenommen wurden. Außerdem sind andere vermutete Einflussfaktoren, wie beispielsweise der Raucherstatus, nicht erhoben worden. Eine erweiterte Liste der eingenommenen Medikamente findet sich im Anhang, aus der sich auch die Mehrfachmedikation der einzelnen FM-Patienten entnehmen lässt, die ebenfalls einen Einfluss auf die Messergebnisse haben könnte. Die genauen Zahlenwerte finden sich in tabellarischer Form nach den untersuchten Antikörpern geordnet im Anhang. CD56 b r ig h t 8 G a te d % 6 4 2 A T I, R N S A S id p R I, io X n ic h t S S O O C Z I R S io p O lg n a N id k ti e y L h L it e a a c ri iu re o it ib h In 2 zo n e B m n n o is rt o C d ia ze p a in ll e e 0 Abbildung 32: Verteilungstendenzen der CD56bright (CD= cluster of differentiation) positiven Werte in Prozent (Gated %) aller Fibromyalgiepatienten (soweit Daten über deren Medikation vorhanden waren=“alle“) der EDTA (=Ethylendiamintetraessigsäure)- Blutproben, sowie unter Medikamenteneinnahme von Benzodiazepinen, Cortison, COX (=Cyclooxygenase)- 2 Inhibitoren, Lithium, Lyrika, nicht Opioid Analgetika, SSRI (=selektive SerotoninWiederaufnahmehemmer), SSNRI (=selektive Serotonin- und Noradrenalin-Wiederaufnahmehemmer), SNRI (=selektive Noradrenalin-Wiederaufnahmehemmer) und Zahlenwerte finden sich im Anhang in Tabelle 25. 67 TZA (=trizyklische Antidepressiva). Die genauen Hier scheint eine ähnliche Verteilung vorzuliegen, wobei bei der Einnahme von Cortison, Lithium und den trizyklischen Antidepressiva ein etwas niedrigerer Median vorliegt. CD56 b r ig h t M FI 1000 500 A T I, R N S A S id p R I, io X n ic h t S S O O C Z R N S io p O lg n a I e id k ti e y L h it L h In 2 zo n e B a a ri iu re o it ib c m n n o is rt o C d ia ze p a in ll e e 0 Abbildung 33: Verteilungstendenzen der CD56bright (CD= cluster of differentiation) positiven MFI-Werte aller Fibromyalgiepatienten (soweit Daten über deren Medikation vorhanden waren=“alle“) der EDTA (=Ethylendiamintetraessigsäure)- Blutproben, sowie unter Medikamenteneinnahme von Benzodiazepinen, Cortison, COX (=Cyclooxygenase)- 2 Inhibitoren, Lithium, Lyrika, nicht Opioid Analgetika, SSRI (=selektive SerotoninWiederaufnahmehemmer), SSNRI (=selektive Serotonin- und Noradrenalin-Wiederaufnahmehemmer), SNRI (=selektive Noradrenalin-Wiederaufnahmehemmer) und TZA (=trizyklische Antidepressiva); MFI=mittlere Fluoreszenzintensität. Die genauen Zahlenwerte finden sich im Anhang in Tabelle 26. Die MFI-Werte der CD56bright positiven Zellen zeigen schon deutlichere Unterschiede in den einzelnen Medikamentengruppen auf. Bei Patienten, deren Blutabnahme unter der Einnahme von Lithium, COX-2 Inhibitoren, Cortison oder den trizyklischen Antidepressiva erfolgte, wurden niedrigere Werte dokumentiert. Bei Patienten mit Benzodiazepinen, Opioiden, nicht-Opioid Analgetika, sowie Wiederaufnahmehemmern war der Median für CD56bright NK-Zellen erhöht. 68 CD56 d im 60 G a te d % 40 20 Z T I, R N S A S id p R I, io X n ic h t S S O O C A I R S io p O lg n a N id k ti e y L h L it e a a c ri iu re o it ib h In 2 zo n e B m n n o is rt o C d ia ze p a in ll e e 0 Abbildung 34: Verteilungstendenzen der CD56dim (CD= cluster of differentiation) positiven Werte in Prozent (Gated %) aller Fibromyalgiepatienten (soweit Daten über deren Medikation vorhanden waren=“alle“) der EDTA (=Ethylendiamintetraessigsäure)- Blutproben, sowie unter Medikamenteneinnahme von Benzodiazepinen, Cortison, COX (=Cyclooxygenase)- 2 Inhibitoren, Lithium, Lyrika, nicht Opioid Analgetika, SSRI (=selektive SerotoninWiederaufnahmehemmer), SSNRI (=selektive Serotonin- und Noradrenalin-Wiederaufnahmehemmer), SNRI (=selektive Noradrenalin-Wiederaufnahmehemmer) und TZA (=trizyklische Antidepressiva). Die genauen Zahlenwerte finden sich im Anhang in Tabelle 27. Cortison-, Lithium- und/oder Lyrikaeinnahmen scheinen die Anzahl der CD56 dim positiven Zellen bei Fibromyalgiepatienten zu vermindern. 69 CD56 d im M FI 4200 1000 500 N A Z S I, R N S S id p R I, io X n ic h t S S O O C T R I e io p O lg a n A h In 2 zo n e B id k ti e y L h it L ib a a ri iu re o it c m n n o is rt o C d ia ze p a in ll e e 0 Abbildung 35: Verteilungstendenzen der CD56dim (CD= cluster of differentiation) positiven MFI-Werte aller Fibromyalgiepatienten (soweit Daten über deren Medikation vorhanden waren=“alle“) der EDTA (=Ethylendiamintetraessigsäure)- Blutproben, sowie unter Medikamenteneinnahme von Benzodiazepinen, Cortison, COX (=Cyclooxygenase)- 2 Inhibitoren, Lithium, Lyrika, nicht Opioid Analgetika, SSRI (=selektive SerotoninWiederaufnahmehemmer), SSNRI (=selektive Serotonin- und Noradrenalin-Wiederaufnahmehemmer), SNRI (=selektive Noradrenalin-Wiederaufnahmehemmer) und TZA (=trizyklische Antidepressiva); MFI=mittlere Fluoreszenzintensität. Die genauen Zahlenwerte finden sich im Anhang in Tabelle 28. Hier ist auffällig, dass der Cortisonwert deutlich über dem Medianwert aller Fibromyalgiepatienten liegt, welcher wiederum mit dem Median unter Einnahme trizyklischer Antidepressiva identisch ist. 70 CD16 50 G a te d % 40 30 20 10 A T N S io I, p R O N S S id p R I, io X n ic h t S S O O C Z R I e id k ti e lg a n A h In 2 zo n e B a a ri y L L ib it it h o iu re c m n n o is rt o C d ia ze p a in ll e e 0 Abbildung 36: Verteilungstendenzen der CD16 (CD= cluster of differentiation) positiven Werte in Prozent (Gated %) aller Fibromyalgiepatienten (soweit Daten über deren Medikation vorhanden waren=“alle“) der EDTA (=Ethylendiamintetraessigsäure)- Blutproben, sowie unter Medikamenteneinnahme von Benzodiazepinen, Cortison, COX (=Cyclooxygenase)- 2 Inhibitoren, Lithium, Lyrika, nicht Opioid Analgetika, SSRI (=selektive SerotoninWiederaufnahmehemmer), SSNRI (=selektive Serotonin- und Noradrenalin-Wiederaufnahmehemmer), SNRI (=selektive Noradrenalin-Wiederaufnahmehemmer) und TZA (=trizyklische Antidepressiva). Die genauen Zahlenwerte finden sich im Anhang in Tabelle 29. Cortison und Lithium zeigen wieder die niedrigsten Mediane auf. Patienten, die mit Benzodiazepinen, nicht-Opioid Analgetika und Opioiden behandelt wurden hingegen die höheren. 71 CD16 3000 M FI 2000 1000 Z T N S S id p R I, io X n ic h t S S O O C A I R R O I, p S io N id k ti e lg a n A h In 2 zo n e B e a a ri y L L ib it it h o iu re c m n n o is rt o C d ia ze p a in ll e e 0 Abbildung 37: Verteilungstendenzen der CD16 (CD= cluster of differentiation) positiven MFI-Werte aller Fibromyalgiepatienten (soweit Daten über deren Medikation vorhanden waren=“alle“) der EDTA (=Ethylendiamintetraessigsäure)- Blutproben, sowie unter Medikamenteneinnahme von Benzodiazepinen, Cortison, COX (=Cyclooxygenase)- 2 Inhibitoren, Lithium, Lyrika, nicht Opioid Analgetika, SSRI (=selektive SerotoninWiederaufnahmehemmer), SSNRI (=selektive Serotonin- und Noradrenalin-Wiederaufnahmehemmer), SNRI (=selektive Noradrenalin-Wiederaufnahmehemmer) und TZA (=trizyklische Antidepressiva); MFI=mittlere Fluoreszenzintensität. Die genauen Zahlenwerte finden sich im Anhang in Tabelle 30. Der Cortisonwert liegt hier, wie auch schon bei CD56dim, deutlich über dem Medianwert aller Fibromyalgiepatienten. Die Gruppen der Lyrica, der Opioide, der Wiederaufnahmehemmern und der trizyklischen Antidepressiva scheinen jeweils eine zweite, kleinere Punktewolke zu besitzen, die höhere Werte aufweist. Insgesamt zeigten die NK-Zellzahlen insbesondere bei mit Lithium und Cortison medizierten Patienten verminderte Werte, wobei diese nur von einzelnen Personen eingenommen wurden. Ebenso waren die Ergebnisse der trizyklischen Antidepressiva einnehmenden Patienten eher niedrig. Die Messwerte bei den Fibromyalgiepatienten, die mit selektiven Serotoninund/oder Noradrenalin-Wiederaufnahmehemmern und/oder Benzodiazepinen zum Blutabnahmezeitpunkt medizinisch behandelt wurden, zeigten hingegen erhöhte Anteile der natürlichen Killerzellen. 72 4 4.1 Diskussion Methodische Aspekte 4.1.1 Statistik In dieser Arbeit wurden 147 Blutprobensätze der ursprünglichen 168 Patienten in die Bewertung mit einbezogen. Die chronischen Schmerzpatienten wurden in 2 Gruppen unterteilt: „Fibromyalgie“ und „CRPS und andere Schmerzen“ waren genau wie die beiden übrigen Gruppen „LCH“ und „Gesund“ für eine explorative Datenanalyse ausreichend groß. Da die Analyse nicht auf eine beweisende statistische Auswertung abzielt, konnte auf die Anwendung exakter Tests verzichtet werden. Des Weiteren wurden 2 Proben ausgeschlossen, bei welchen gesichert war, dass NK Zellveränderte Medikamente (Bisphosphonate) eingenommen worden waren. (Griffe et al. 2007) Auch aufgetaute Blutproben wurden in die endgültige Statistik nicht mit aufgenommen. Da die erste Voraussetzung des konfirmatorischen Testens nicht erfüllt war (Die Fragestellung wurde nicht vorab formuliert), wurden die Ergebnisse orientierend interpretiert. Eine Signifikanz zeigt in dieser Arbeit also eine Tendenz und nicht mehr auf. Der verwendete Kruskal-Wallis-Test ist ein parameterfreier Test, der in der Lage ist mehr als 2 unabhängige Stichproben zu untersuchen, was ihn vom Mann Whitney-U-Test unterscheidet. Parameterfrei (=nichtparametrisch) bedeutet nicht, dass keine Parameter vorhanden sind, sondern, dass diese nicht von Vorneherein festgelegt werden. Der Test fordert außerdem eine Ordinalskalierung. (Trampisch et al. 2000b)(Fassl 1999a) Die absoluten Werte werden hierbei charakteristischerweise der Größe nach sortiert und durch Rangzahlen ersetzt. Da nicht die absoluten Beobachtungswerte, sondern nur Rangzahlen verwendet werden besitzt dieser Test eine verminderte Testpower, da nicht die gesamten Dateninformationen genutzt werden. Damit besteht die Gefahr, dass fälschlicherweise die Nullhypothese (H0: Es gibt keinen Unterschied) angenommen wird. Dies wird als Fehler 2. Art bezeichnet. (Trampisch et al. 2000a) 73 Je kleiner eine Gruppe ist, umso größer ist die Gefahr, dass die Ergebnisse durch Ausreißer (extrem hohe oder niedrige Messwerte) verzerrt werden. Die Ursache solcher Ausreißer können Messfehler sein, aber auch besondere Pathologien des Patienten, die auf Grund der Anonymität der einzelnen Proben nicht abgesichert werden konnten. Daher war es schwer zu entscheiden, ob ein extremer Wert aus dem Kollektiv ausgeschlossen werden kann, da er die Messwerte verzerrt, oder ob gerade das Herausnehmen dieses extremen Wertes eine Ergebnisverzerrung herbeiführt. Um diese Problematik zu umgehen, wurde der Median gebildet, der durch Extremwerte nicht beeinflusst wird. (Fassl 1999b) 4.1.2 Interpretation des MFI MFI steht für die mittlere Fluoreszenzintensität. Da Daten im Allgemeinen, und auch hier, nicht Normalverteilt sind, kann der MFI durch Ausreißer leicht verändert werden. Daher ist die Interpretation dieser Daten immer im Vergleich zu den prozentual gegateten Werten, insbesondere des Medians, zu sehen. (Fassl 1999b, Best 2013) 4.2 Untersuchte Oberflächenmarker und Interpretation des Immunstatus Der Begriff System bedeutet aus mehreren Teilen zusammengesetztes und gegliedertes Ganzes (Wahrig et al. 2007). Man ist auch heute noch weit davon entfernt, die Gesamtheit des Immunsystems zu verstehen, und damit auch Krankheiten, deren Entstehung auf dessen fehlerhafter Arbeit zugeschrieben werden (z.Bsp.: Allergien) (Schütt et al. 2011). Besonderes Interesse galt in dieser Arbeit Zellen der angeborenen Immunabwehr und Hinweisen auf Inflammation und Infektion. Mithilfe der Immunfluoreszenz wurde nach Abweichungen dieses Abwehrmechanismus bei chronischen Schmerzpatienten im Vergleich zur gesunden Population gesucht. Denn bis auf eine angenommene genetische Prädisposition mit psychosozialen Aspekten bleibt die Ätiologie der Ursachenentstehung des FibromyalgieSyndroms weiterhin ungeklärt. (Herold et al. 2012) Einen Einblick in unser Immunsystem erlaubt die Durchflusszytometrie. Durch sie können Antikörper-markierte Zellen von einem Laserstrahl erfasst werden und je nach ihrem Fluoreszenzfarbstoff ein spezifisches Signal absondern. Außerdem 74 erlaubt die Zytometrie eine Aussage über die Größe der Zelle und deren Granularität. (Luttmann et al. 2009d) Die Immunphänotypisierung von Blutzellen bietet die Möglichkeit, einen Hinweis auf mögliche infektiöse Agenzien zu interpretieren, da beispielsweise durch virale Infektionen spezifisch NK-Zellen und CD8-positive CTL aktiviert und subsequent vermehrt werden (Iannacone et al. 2006). Bei bakteriellen Infektionen würde man hingegen eine Erhöhung von CD14 auf Monozyten und TLR erwarten (Kelley et al. 2013). Tumorerkrankungen gehen mit einer Erhöhung der CD4/CD25 doppelt positiven regulatorischen T-Zellen einher und Autoimmunerkrankungen sind mit einer Verminderung der regulatorischen T-Zellen assoziiert. (Sakaguchi 2005) Im Folgenden werden die untersuchten Oberflächenmarker und ihre Rolle im Immunsystem und mögliche Interpretationen der Ergebnisse diskutiert: 4.2.1 T-Zellsubpopulationen Bei der FM sind CD4-positive T-Zellen sowohl prozentual aber nicht in der Expressionsdichte erhöht. Ebenso sind die CD4/CD25-positive T-Zellen erhöht. Diese Konstellation spricht gegen eine Verdachtsdiagnose eines Autoimmungeschehens. Die CD25-positive Lymphozyten verhalten sich gleich und sind ebenfalls vermehrt. CD4 variiert über einen größeren Bereich als in der gesunden Kontrolle. Interessanterweise sind CD4 positive Zellen bei CRPS gegenüber der Kontrolle vermindert, die CD4/CD25-doppelt positiven T-Zellen sind hingegen ebenso wie bei FMS erhöht. Es gibt eine Untergruppe der T-Helferzellen, die als Mediatoren mehrerer Autoimmunerkrankungen, wie EAE (experimental autoimmune encephalitis) und rheumatoider Arthritis, angesehen werden, hierbei handelt es sich um TH17Zellen. Sie produzieren Interleukin 17A, IL-17F, TNF und IL-6 als Antwort auf IL23. (Stumhofer et al. 2006) In unserem Kollektiv wurden TH17-Zellen nicht untersucht, aber die CD4-positiven Lymphozytenzahlen Zusammenhang liegen zwischen tatsächlich dieser höher als in T-Zell-Untergruppe der Kontrolle. und Der chronischen Erkrankungen ist bis heute wenig verstanden, aber so beschreibt u.a. Dönmez, dass FM-Patienten häufiger an Autoimmunerkrankungen leiden (Dönmez et al. 2012). Diese Beobachtung konnte anhand der bestimmten CD25 und CD4/CD25positiven Zellen nicht bestätigt werden, da die beiden Schmerz assoziierten 75 Gruppen tendenziell höhere Prozent- und MFI-Werte, als die gesunden Kontrollpopulation besaßen. CD25, die α-Kette des IL-2-Rezeptors (Janeway et al. 2005), vermittelt die Stimulation von IL-2. Die Konsequenz einer CD25 Verlusts wurde zuerst von Roifman et al an einem Patienten beschrieben, der an chronischen Infektionen und schweren Autoimmunstörungen litt. (Goudy et al. 2013)(Létourneau et al. 2009) 5-10% der CD4+ T-Zellen sind ebenfalls CD25 positiv und gehören damit zu den regulatorischen T-Zellen, die der Entwicklung von Autoimmunerkrankungen entgegen wirken. Sie unterdrücken sowohl Proliferation, als auch IFN-γ Sezernierung von CD8+ T-Zellen. (Piccirillo et al. 2001) Diese Zellpopulation ist sowohl bei FMS und auch CRPS erhöht und stellt einen neuen Befund der hier durchgeführten Arbeit dar. Die Markerkonstellationen CD4, CD8, CD4/25 und CD25 zeigten hingegen bei LCH-Patienten ein zu erwartendes Ergebnis. Hier handelt es sich um eine Tumorerkrankung mit im Vergleich zu den anderen Gruppen erniedrigten CD4/25 doppelt postitiven (wahrscheinlich) regulatorischen T-Zellen, was insofern interessant ist, da diese Zellen unter anderem für Hyperreagibilität gegenüber Tumorantigenen verantwortlich sind. (Sakaguchi 2005) FMS und CRPS unterscheiden sich sowohl in der relativen Menge und als auch in der Expressionsdichte von CD8-positiven Lymphozyten, die bei CRPS auch im Vergleich zur gesunden Kontrolle erhöht sind. Zellen mit dem Korezeptor für MHC-I-Moleküle CD8 sind entweder zytotoxisch und schwach CD8-positiv oder suppressiv und stark CD8 positiv. (Schütt et al. 2009h), (Luttmann et al. 2009a) Die CD8-positiven T-Zellen sind bei FMS prozentual deutlich vermindert, und nach Analyse der Expressionsdichte zeigt sich eine noch deutlichere Verminderung, was auf einen relativen Verlust CD8-schwach positiver zytotoxischer TLymphozyten hindeutet. Dies spiegelt sich auch in ihren MFI-Werten wieder, bei denen ein um 50% kleinerer Median, als in der gesunden Population nachgewiesen wurde. Eine Erklärung könnte die den CD25/CD4 76 doppelt positiven T-Zellen zugeschriebene Fähigkeit sein, durch Sekretion der Zytokine IL-10 und TGF-β die CD8+-T-Zell-Proliferation zu inhibieren. (Murphy 2012b) 4.2.2 NK-Zellmarker - Beeinflussung durch Inflammation Die CD56bright positive Subpopulation der natürlichen Killerzellen ist für die Zytokinsynthese (bevorzugt Interferon-γ) verantwortlich, wohingegen CD56dimpositive NK-Zellen die zelluläre Zytotoxizität vermitteln (Poli et al. 2009). 5-10% der Killerzellen im peripheren Blut sind CD56 bright positiv. (Harlin et al. 2007) In unserer Analyse wurden bei gesunden Kontrollen im Schnitt 2,18% CD56bright Zellen positiv markiert. Im Vergleich der unterschiedlichen Patientengruppen zeigten sich mehr CD56 dim positive NK-Zellen bei FMS im Vergleich zur Kontrolle. Der Effekt ist bei CRPS weniger stark als bei FMS ausgeprägt und kann auch in der PBMC-Analyse beobachtet werden (s. Abb.: 21 und 22). Auch die CD16-positiven Lymphozyten sind in beiden Krankheitsgruppen: FMS und CRPS vermehrt. Dahingegen sind aktivierte CD56/CD16 doppelt positive NK-Zellen weder bei FMS noch bei CRPS im Vergleich zur gesunden Kontrolle erhöht. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, Schmerzsyndromen dass keine die Rolle Zytokin-sezernierenden spielen, wohl aber die CD56dim nicht bei Zytokin- sezernierenden CD56bright NK-Zellen. Das Leitzytokin der NK-Zellen ist Interferon-γ, welches nach Kontakt mit Virusinfizierten Targetzellen von CD56bright NK-Zellen sezerniert wird. Im Rahmen einer effizienten Virus-spezifischen Immunantwort erfolgen die spezifische Aktivierung von CD8-positiven zytolytischen Zellen und die der Immunglobulin-sezernierender B-Zellen nach der NK-Zellaktivierung. Da Patienten mit FMS im fortgeschrittenen Erkrankungsstadium untersucht wurden, ist es relativ unwahrscheinlich, dass alle Patienten in einer identischen Virusinfektionsphase zum Blutabnahmezeitpunkt befanden. Viel eher ist es wahrscheinlicher, dass bei FMS und CRPS-Patienten eine Aktivierung der schwach CD56-positiven NK-Zellen auf einen anderen Stimulus hin erfolgt ist, zumal CD16 zwar isoliert erhöht ist, sich aber nicht als CD56/16 doppelt positive Zellpopulation statistisch signifikant herausstellt (s. Abb.: 27 und 28). Der Zusammenhang zwischen einer Virusinfektionen oder deren Reaktivierung und Fibromyalgie konnte gilt mittlerweile als unwahrscheinlich, wird aber nicht 77 ausgeschlossen und weiterhin untersucht. (Narváez et al. 2005, Buskila et al. 2008) In unserer Versuchsreihe zeigten sich leicht vermehrte CD56 bright positiv gegatete Zellen bei allen chronischen Schmerzpatienten. Dies kann als Hinweis auf ein chronisch inflammatorisches Geschehen bei Fibromyalgie und CRPS sein, denn es gibt mehrere Berichte über erhöhte CD56bright/CD56dim Verhältnisse bei chronisch inflammatorischen Krankheiten wie rheumatoider Arthritis, Tuberkulose und Lungensarkoidose. (Harlin et al. 2007) Es wäre falsch, diese Erhöhung als Fehlregulation zu interpretieren, denn durch Vermehrung der CD56 bright-positiven NK-Zellen ist der Körper in der Lage inflammatorische Prozesse zu bekämpfen (Bielekova et al. 2006). Prozentual betrachtet, besaß die Tumorgruppe tendenziell die niedrigsten CD56dim Werte. Dies ist interessant, da Bauernhofer et al von verminderten CD56 dim- NKZellzahlen bei Tumorpatienten berichten, die sie auf spontane Apoptose zurückführen (Bauernhofer et al. 2003). Patienten mit der Diagnose OTS hatten die höchsten Ergebnisse CD56 dim positiver Zellen (sowohl bei EDTA-, als auch bei PBMC-Blut). Dies ist ungewöhnlich, da Sport mit reduzierten CD56dim und einem Anstieg der CD56bright-Werte einhergehen (Rama et al. 2013). Letztere waren bei OTS im EDTA-Blut nur leicht höher und bei PBMC Proben sogar niedriger als die der gesunden Vergleichspopulation. Letztendlich könnten die höheren NK-Zellzahlen der chronischen Schmerzpatienten neben einem inflammatorischen Geschehen (eventuell Virusassoziiert) auch auf die Medikation zurückzuführen sein. Hinweise hierfür finden sich evtl. durch Wiederaufnahmehemmer (SSRI, SSNRI, SNRI) und Benzodiazepine (s. Abb.: 32-37). (Evans et al. 2008, Irwin et al. 1993) Außerdem stellt sich die Frage ob Komorbiditäten die hier gemessenen Werte beeinflusst haben. Da viele der Patienten mit Betablockern zum Blutabnahmezeitpunkt behandelt wurden könnte eine KHK vorliegen, welche Killerzellen, insbesondere die zytotoxischen, vermindert (Hak et al. 2007). 78 4.3 Weitere Überlegungen / Zusätzliche Fragestellung 4.3.1 Beeinflussung der Oberflächenmarkerexpression von CD Antigenen durch Einfrieren und Auftauen aus flüssigem Stickstoff In der Literatur finden sich Hinweise, aber keine definitiven Angaben zur Beeinflussung der prozentual gegateten und mittleren Fluoreszenzintensität-Level durch Einfrieren von Blutproben. Pinto et al kamen zwar bei eingefrorenen PBMC Proben, die zuvor fixiert worden waren zu vergleichbaren Ergebnissen,allerdings waren die Blutproben für maximal 10 Tage eingefroren worden. (Pinto et al. 2004) Im Kapitel 3.1 wurden diese Bedenken graphisch aufgearbeitet. In den Abbildungennehmen CD56, CD16, sowie CD8 insbesondere im gemessenen MFIBereich tendenziell zu, wohingegen CD25 abnimmt. Bei der Testung von Degranulationsmarkern (CD63, CD107a) wurde eine deutlich stärkere Expressionsinduktion von CD40 als von CD63 festgestellt. Daher ist es unwahrscheinlich, dass es sich bei den Unterschieden von EDTA und aufgetauten PBMC um einen Degranulationseffekt handelt (siehe Kapitel 3.5.2 und 3.5.3). 4.3.1.1 Theorie zum beobachteten Auftaueffekt Zum Einfrieren werden den Blutproben 11% DMSO zugesetzt, damit der Austausch von Wasser aus dem intra- und extrazellulärem Milieu ungehindert erfolgen kann. Dadurch läuft die Eiskristallisation während des Einfriervorgangs sowohl in der Zelle als auch außerhalb gleich insgesamt vermindert ab. Beim Einfrieren muss auch sichergestellt werden, dass nur kubische und keine spitzen Eiskristalle entstehen, die die Plasmamembran beim Auftauen verletzen würden. Neben der Verminderung der Eiskristallbildung und seiner Wirkung als Frostschutzmittel hat DMSO auch wichtige anti-oxidante Eigenschaften. (Biochrom 2013)(Xing et al. 2007) Der im Abschnitt 3.5.1 aufgeführte Annexin V Test zeigt, dass 7,24% der gegateten Zellen sowohl für Propidiumiodid als auch für Annexin V positiv sind. Diese Zellen sind entweder spätapoptotisch oder nekrotisch, da Propidiumiodid die perforierte Membranen toter Zellen durchdringt, nicht jedoch die lebendiger. In dem hier beschriebenen Versuch waren 27,9% der Zellen nach dem Auftauprozess allein Annexin V positiv und damit im frühapoptotischen Stadium, da sich dieses Protein spezifisch an Phosphatidylserin bindet, welches im Apoptoseprozess durch Flippasen von der inneren Zellmembran an die äußere 79 umgelagert wird. Zellen, die für keine der beiden Markierstoffe positiv sind, können als vitale Zellen gewertet werden. (Trevigen Instructions 2010, Luttmann et al. 2009c) Damit scheint sich der Verdacht zu bestätigen, dass der Auftauprozess eine Stresssituation für Zellen darstellt, unter der sie die Asymmetrie der Plasmamembran kurzfristig aufheben. Die Expression von Phosphatidylserin wurde mit Hilfe der Annexin V-Bindung in dieser Arbeit dokumentiert. Die beiden mitgemessenen Degranulationsmarker reagierten hingegen unterschiedlich. Da die Expressionsinduktion von CD40 aber deutlich stärker ist als die von CD63, ist es unwahrscheinlich, dass es sich bei den Unterschieden von EDTA und aufgetauten PBMC um einen Degranulationseffekt handelt (siehe Kapitel 3.5.2 und 3.5.3). Die veränderte Oberflächenstruktur durch das membrane blebbing, sowie die weitere Eigenschaft der Apoptose Teile der inneren Zellmembran durch Flippasen nach außen zu kehren, würden die gesteigerten prozentual gegateten Antikörper auf den Lymphozyten und ihre erhöhte mittlere Fluoreszenzintensität erklären. 4.3.2 Beeinflussung des Immunstatus durch Medikamente Die Anzahl und Aktivität von natürlichen Killerzellen hängt von vielen Faktoren ab, die noch nicht genau bekannt sind. Endorphine, Substanz P und Histamine scheinen ihre Zytotoxizität zu steigern, Noradrenalin hingegen zu vermindern. (Lang et al. 2003) Schizophrene Patienten zeigten allgemein erhöhte Killerzellaktivitäten. Unter Nikotineinnahme oder medikamentöser Therapie, wie mit Benzodiazepinen, Lithium Antikonvulsiva oder Neuroleptika, war ihre Aktivität im Patientengut allerdings geringer. (Yovel et al. 2000) Frauen mit mehrfachen Aborten werden gegen ihre erhöhten CD56 + NK-Zellen unter anderem mit Cortison behandelt, um präeklamptische Veränderungen zu verhindern (Han et al. 2012). Auch Patienten, die mit Cortison gegen ihre Depressionen behandelt wurden zeigten verringerte CD3, CD4 und CD16 positive Zellzahlen. (Ivanova et al. 2006) Mit Phenytoin (Antikonvulsivum) behandelte Mäuse zeigten verminderte NK-ZellAktivität und IFN-γ-Produktion. (Okada et al. 2001) 80 Ob, ab welcher Dosis und in welchem Ausmaß Medikamente natürliche Killerzellen beeinflussen bleibt eine offene Frage. 4.4 Schlussfolgerung und Ausblick Das Bundesministerium für Bildung und Forschung gab 2001 eine vorsichtige Schätzung heraus, wonach circa 4 Millionen Menschen in Deutschland unter chronischen Schmerzen leiden, was diese Krankheit zu einer der häufigsten und belastenden macht. Ein tieferes Verständnis der Reaktionen des Immunsystems könnte die Therapie der Schmerzen effektiver machen und eventuell sogar durch frühzeitiges Erkennen die Ausbildung eines sogenannten Schmerzgedächtnisses, und damit eine Chronifizierung verhindern. (Kürten 2001) Die Analyse der verschiedenen Expressionsmuster von Oberflächenrezeptoren durch Durchflusszytometrie hat durchaus Hinweise auf Veränderungen in der Immunsystemkaskade bei Fibromyalgie, anderen chronischen Schmerzpatienten, sowie Tumorpatienten gegeben. Es bleibt zu klären inwiefern die Veränderungen durch die Krankheit an sich oder eventuell auch durch die Einnahme von Medikamenten beeinflusst werden. 81 5 Zusammenfassung Natürliche Killer (NK-)Zellen sind für die Immunität gegen virale Infektionen und Tumorzellen verantwortlich, wenn polymorphe Transplantationsantigene nur schwach oder gar nicht exprimiert werden. Eine erworbene oder auch Medikamenten-induzierte Immunsuppression geht darum möglicherweise auch mit veränderten NK-Zellzahlen oder NK-Zellsubpopulationen einher. Uns stellten sich die Fragen, ob sich 1) durch spezifische Oberflächenrezeptoren der NK-Zellen Veränderungen des Immunphänotyps nachweisen lassen würden, 2) welche Rolle Subpopulationen der NK Zellen und CD(cluster of differentiation) 4- bzw. CD8- positive T-Zellen spielen und ob sich 3) die Ergebnisse der EDTA(Ethylendiamintetraessigsäure)- Vollblutproben mit denen der aufgetauten Ficoll-separierten PBMC (Peripheral Blood Mononuclear Cell) vergleichen lassen. Die Immunphänotypisierung mit Hilfe der Durchflusszytometrie wurde zur Beurteilung der NK-Immunität bei Patienten mit Schmerzsyndromen (Fibromyalgie (FM), chronisches regionales Schmerzsyndrom (CRPS)), Langerhans-ZellHistiozytose (LCH), Übertrainingssyndrom (OTS), sowie einer gesunden Vergleichspopulation angewendet. Bei FM fanden sich im Vergleich zu CRPS, OTS und der gesunden Kontrollgruppe vermehrte Anteile CD4 positiver Lymphozyten (p=0,026) der prozentualen Ergebnisse (Gated %). Der mittlere Fluoreszensintesitäts-(MFI) Wert von CD4 war für FM hingegen kleiner (p=0,042). Bei der gesunden Population fanden sich mehr CD8 positive Lymphozyten sowohl für die Gated %-, als auch für die MFI-Werte (p=0,047 und p=<0,001) im Vergleich zu FM, CRPS, LCH sowie OTS. Für CD25 positive Lymphozyten ergaben sich keine signifikanten Werte. Der MFI-Anteil für CD25/CD4 doppelt positive Lymphozyten war für die beiden chronischen Schmerzgruppen (FM, CRPS) höher (p=0,02) als für LCH; OTS oder der gesunden Population. Der NK-Marker CD16 zeigte höhere Prozent- und MFIAnteile für FM, CRPS, LCH und OTS im Vergleich zur gesunden Vergleichsgruppe (p=0,037, p=0,018). Für den CD56bright Anteil positiver Lymphozyten zeigte sich ein höherer prozentual gegateter Anteil der chronischen Schmerzpatienten (p=0,032). Für die an CRPS erkrankten Patienten setzte sich dies für CD56/CD16 doppelt positive Lymphozyten für den prozentual gegateten Anteil fort (p=0,021). 82 1) Die Zytokin produzierenden CD56+/CD16- NK-Zellen waren bei allen chronischen Schmerzpatienten im Vergleich zu LCH, OTS und der gesunden Vergleichsgruppe relativ vermehrt. Bezüglich der reifen CD56+/CD16+ NK-Zellen, welche weniger Zytokine sezernieren und dafür zytotoxisch sind, ergab sich hingegen kein Unterschied. Diese Befunde unterstützen die Annahme chronisch entzündlicher Prozesse bei chronischen Schmerzpatienten. Eine Aktivierung durch CD16 erscheint unwahrscheinlich, da sich die CD56/CD16 doppelt positiven Lymphozyten als statistisch nicht signifikant erwiesen. Außerdem fiel ein Zusammenhang zwischen dem veränderten Anteil Zytokin-produzierenden CD56+/16- NKZellen und der Einnahme von Wiederaufnahmehemmern und Benzodiazepinen auf, was auf eine Beeinflussung der Killerzellen durch die Medikamenteneinnahme der Patienten rückschließen lässt. 2) In der Gruppe an FM erkrankter Patienten könnte der verminderte Anteil CD4 positiver Lymphozyten auf ein Autoimmungeschehen hinweisen. Die Erhöhung der CD25, sowie der CD25/CD4 doppelt positiven Zellen der Fibromyalgiegruppe gegenüber denen, der gesunden Probanden unterstützen diese Theorie nicht, könnten aber deren Verlust der CD8 positiven Zellen erklären. 3) Im Vergleich der Immunophänotypisierungsdaten fiel auf, dass CD56+/CD16+ und CD56+/CD16- Lymphozyten eine stärkere Expression in den Vollblutproben (EDTA), als im Ficoll separiertem peripherem Blut mononukleärer Zellen (PBMC). Ihre MFI-Anteile waren hingegen für die PBMC-Messung deutlich höher, ebenso verhielten sich CD16 und CD4 positive Lymphozyten und der MFI Anteil der CD8 positiven Zellen. Dies konnte nicht mit einer vermehrten Degranulation erklärt werden, aber es fanden sich vermehrt frühapoptotische Zellen in der PBMC-Messung, was auf eine Veränderung der Oberflächenstruktur hindeutet. Weitere Untersuchungen wären erforderlich, um die Markierungsunterschiede von EDTA- und PBMC-Proben zu erklären. 83 6 Literaturverzeichnis 1. 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Zola H, Swart B, Banham A, Barry S, Beare A, Bensussan A, Boumsell L, Buckley C, Bühring H, Clark G, Engel P, Fox D, Jin B, Macardle P, Malavasi F, Mason D, Stockinger H, Yang X: CD molecules 2006 - Human cell differentiation molecules. J Immunol Methods, 319: 1-5 (2007) 95 7 Anhang Tabelle 23: Gruppeneinteilung der gemessenen Blutproben entsprechend der Haupt-Diagnosen (Patientengruppe mit Angabe der Probenanzahl: Panel = gesund, chronische Schmerzen (mit den weiteren Differenzierungen: Fibromyalgie, CRPS (chronisches regionales Schmerzsyndrom) und andere chronische Schmerzen), LCH (Langerhanszell-Histiozytose), Overtrained), unter Angabe der Patientennummern (Pat.Nr.), des Geschlechts=Sex (m = männlich, w = weiblich), des Patientenalters (Alter in Jahren beim Zeitpunkt der Blutentnahme) und der Diagnose. Patientengruppe (Anzahl) Pat.Nr. Sex Alter #8066 #8164 #8291 #8357 #8527 #9686 #10121 #10341 #10343 #10346 #10347 #10451 #10470 #10493 #10494 #12168 #12169 #12170 #12171 #12200 #12201 #12332 #12342 #12347 #12540 #12541 #12542 #12543 #12544 #12545 #12546 #12547 #13118 #13119 w w m m w m w m m m w m w m w m w w m m w w m w m w w m w m m m w w 52 48 20 20 28 25 25 20 32 30 26 61 43 42 22 27 25 20 19 24 25 22 15 17 18 16 17 12 18 18 23 21 gesund gesund gesund gesund gesund gesund gesund gesund gesund gesund gesund gesund gesund gesund gesund gesund gesund gesund gesund gesund gesund gesund gesund gesund gesund gesund gesund gesund gesund gesund gesund gesund gesund gesund #6629 #6635 #6650 w w w 48 24 51 Fibromyalgie Fibromyalgie Fibromyalgie Diagnose Panel (34) chron. Schmerzen (75) 96 Fortsetzung von Tabelle 23 Patientengruppe (Anzahl) Pat.Nr. #6671 #6863 #6910 #7129 #7410 #7435 #7515 #7879 #7987 #8063 #8198 #8218 #8260 #8997 #9108 #9149 #9418 #9515 #9702 #9812 #10099 #10404 #10566 #10593 #10596 #10629 #10658 #10670 #10730 #10766 #10832 #10840 #10850 #10859 #10878 #10879 #10917 #10957 #10976 #11039 #11112 #11291 #11343 #11518 #11579 #11748 Sex w w w w w m w m w w w w w w w w w w w w m w w w w w w m w m w w w w w w w w w w w w w w w w Alter 65 55 56 55 47 46 63 57 54 52 62 53 57 65 63 45 51 47 63 44 55 46 57 42 50 47 60 48 51 54 45 13 49 14 46 43 37 41 62 40 59 55 54 47 56 54 97 Diagnose Fibromyalgie Fibromyalgie Fibromyalgie Fibromyalgie Fibromyalgie Fibromyalgie Fibromyalgie Fibromyalgie Fibromyalgie Fibromyalgie Fibromyalgie Fibromyalgie Fibromyalgie Fibromyalgie Fibromyalgie Fibromyalgie Fibromyalgie Fibromyalgie Fibromyalgie Fibromyalgie andere: arthroseartige Schmerzen Fibromyalgie Fibromyalgie Fibromyalgie Fibromyalgie Fibromyalgie Fibromyalgie Fibromyalgie Fibromyalgie andere: unklare Kopfschmerzen Fibromyalgie CRPS Fibromyalgie CRPS Fibromyalgie Fibromyalgie CRPS Fibromyalgie Fibromyalgie Fibromyalgie Fibromyalgie Fibromyalgie Fibromyalgie Fibromyalgie CRPS andere: Cluster-Kopfschmerzen Fortsetzung von Tabelle 23 Patientengruppe (Anzahl) Alter Diagnose #11749 #11790 #11861 #11873 #11884 #11970 #11978 #12006 #12021 #12043 Sex w w w w w w w w w w 57 37 56 35 53 57 67 56 65 42 #12059 #12060 #12067 #12112 #12113 #12149 #12158 #12163 #12202 #12259 #12267 #12271 #12297 w m w w w w w w w w m m w 40 40 21 49 57 54 67 49 45 60 44 44 71 #12355 #12363 #12372 w w w 40 57 67 Fibromyalgie Fibromyalgie CRPS CRPS Fibromyalgie CRPS CRPS Fibromyalgie Fibromyalgie Fibromyalgie andere: Makrophagenaktivierungssyndrom Fibromyalgie Fibromyalgie Fibromyalgie Fibromyalgie Fibromyalgie CRPS Fibromyalgie Fibromyalgie CRPS Fibromyalgie andere: muskuloskeletaler Schmerz CRPS andere: Makrophagenaktivierungssyndrom Fibromyalgie Fibromyalgie #10671 #10679 #10680 #10715 #10717 #10725 #10732 #10835 #10839 #10841 #10880 #10923 #10984 #10989 #11055 #11176 #11177 w w w m m m w w m w w w w w m w w 45 48 50 38 41 17 43 30 52 45 36 26 53 56 20 54 32 LCH LCH LCH LCH LCH LCH LCH LCH LCH LCH LCH LCH LCH LCH LCH LCH LCH Pat.Nr. LCH (32) 98 Fortsetzung von Tabelle 23 Patientengruppe (Anzahl) Pat.Nr. Sex Alter #11236 #11404 #11452 #11453 #11455 #11456 #11724 #11739 #11796 #11836 #12022 #12073 #12074 #12079 #12114 w w m m w w w w m m m m m m w 44 42 19 45 39 42 45 30 21 48 36 21 1 20 40 LCH LCH LCH LCH LCH LCH LCH LCH LCH LCH LCH LCH LCH LCH LCH #12012 #12014 #12018 #12037 #12365 #12534 m m m m m w 15 25 28 25 22 24 Overtrained Overtrained Overtrained Overtrained Overtrained Overtrained Diagnose Overtrained (6) Tabelle 24: Liste der Medikamenteneinnahme der chronischen Schmerzpatienten zum Zeitpunkt der Blutentnahme, falls vorhanden. Abkürzungen: Pat.Nr.=Patientennummer; TZA=trizyklische Antidepressiva; SSRI=selektive Serotonin- Wiederaufnahmehemmer; SSNRI= selektive Serotonin- und Noradrenalin-Wiederaufnahmehemmer; SNRI=selektive Noradrenalin-Wiederaufnahmehemmer; COX=Cyclooxygenase Wenn weitere Medikamente aufgeführt wurden (in der Spalte „Info“ als u.a. (unter anderem) gekennzeichnet), handelte es sich meist um Protonenpumpeninhibitoren und Betablocker. Pat. Nr. #6629 #6635 #6650 #6671 #6863 #6910 #7129 #7410 #7435 #7515 #7879 #7987 #8063 #8198 Lithium Lyrica TZA ja ja SSRI/ SSNRI/ SNRI ja ja COX- 2 Nicht InhibiOpioid Benzodia toren Analgetika zepine ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja Opioide ja ja ja ja ja ja ja 99 ja ja ja ja ja Cortison Info u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. Alles Alles u.a. u.a. Alles u.a. u.a. Fortsetzun g von Tabelle 24 Pat. Nr. #8218 #8260 #8997 #9108 #9149 #9418 #9515 #9702 #9812 #10099 #10404 #10566 #10593 #10596 #10629 #10658 #10670 #10730 #10766 #10832 #10840 #10850 #10859 #10878 #10879 #10917 #10957 #10976 #11039 #11112 #11291 #11343 #11518 #11579 #11748 #11749 #11790 #11861 #11873 #11884 #11970 #11978 #12006 #12021 Lithium Lyrica TZA ja ja ja ja ja SSRI/ SSNRI/ SNRI COX- 2 Nicht InhibiOpioid Benzodia toren Analgetika zepine ja ja ja ja ja ja Opioide Cortison Info ja ja ja ja ja u.a. u.a. Alles Alles u.a. u.a. Keine Daten Keine Daten Alles u.a. Keine Daten u.a. u.a. u.a. Alles Alles u.a. Alles u.a. u.a. u.a. u.a. u.a. Alles u.a. u.a. Alles u.a. Alles Alles u.a. u.a. u.a. u.a. Alles Keine Daten u.a. u.a. Keine Daten Alles Keine Daten Keine Daten u.a. u.a. Keine Therapie ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja ja #12043 100 ja ja Fortsetzun g von Tabelle 24 Pat. Nr. Lithium Lyrica #12059 #12060 TZA COX- 2 Nicht InhibiOpioid Benzodia toren Analgetika zepine ja ja ja #12067 #12112 #12113 #12149 #12158 #12163 #12202 #12259 SSRI/ SSNRI/ SNRI ja ja Opioide Cortison ja ja ja u.a. u.a. Keine Therapie Alles u.a. Alles Keine Daten u.a. u.a. Keine Daten Keine Therapie u.a. Keine Daten Alles Alles u.a. ja ja ja ja ja #12267 #12271 #12297 #12355 #12363 #12372 SUMME ja ja ja ja 2 25 28 ja 24 ja ja 36 10 ja ja ja 25 ja ja 9 Info 2 Tabelle 25: Zahlenwerte der Verteilungstendenzen der CD56bright (CD= cluster of differentiation) positiven Werte der Fibromyalgiepatienten zu Abbildung 32. COX=Cyclooxygenase; SSRI=selektive Serotonin- Wiederaufnahmehemmer; SSNRI=selektive Serotonin- und Noradrenalin- Wiederaufnahmehemmer; SNRI= selektive Noradrenalin-Wiederaufnahmehemmer; TZA=trizyklische Antidepressiva. bright % CD56 alle Anzahl COXBenzo2 diazeInhibpine Cortison itoren Lithium Lyrica nicht Opioid Analgetika SSRI, SSNRI, Opioide SNRI TZA 40 7 1 6 2 15 17 9 15 16 Minimum 0,21 2,07 1,82 0,94 0,94 0,21 0,21 0,72 0,21 0,21 25%-Perzentile 1,67 2,65 1,82 1,46 0,94 1,51 1,74 2,64 1,23 1,29 Median 2,69 2,99 1,82 2,38 2,07 2,72 2,74 2,92 2,96 2,09 75%-Perzentile 3,01 5,45 1,82 3,51 3,19 2,81 3,09 4,22 3,19 3,11 Maximum 7,14 7,12 1,82 4,62 3,19 3,17 7,12 7,12 5,45 4,69 Standardabweichung 1,50 1,82 0,00 1,33 1,59 0,95 1,63 1,85 1,42 1,28 101 Tabelle 26: Zahlenwerte der Verteilungstendenzen der CD56bright (CD= cluster of differentiation) positiven Werte der Fibromyalgiepatienten zu Abbildung 33. COX=Cyclooxygenase; SSRI=selektive Serotonin- Wiederaufnahmehemmer; SSNRI=selektive Serotonin- und Noradrenalin- Wiederaufnahmehemmer; SNRI= selektive Noradrenalin-Wiederaufnahmehemmer; TZA=trizyklische Antidepressiva; MFI=mittlere Fluoreszenzintensität. bright MFI CD56 alle Anzahl COXBenzo2 nicht SSRI, diazeInhibOpioid SSNRI, pine Cortison itoren Lithium Lyrica Analgetika Opioide SNRI TZA 40 7 1 6 2 15 17 9 15 16 8,68 270,50 200,50 22,75 119,60 124,2 8,68 8,68 119,60 8,68 25%-Perzentile 172,0 323,40 200,50 98,81 119,60 181,5 264,70 268,30 210,10 78,00 Median 266,0 448,20 200,50 182,3 121,90 244,2 409,80 414,30 410,90 210,3 75%-Perzentile 448,2 712,30 200,50 483,2 124,20 379,5 623,20 682,00 677,20 420,6 Maximum 1124 722 200,5 642,1 124,2 1124 1124 1124 1124 712,3 Standardabweichung 240,3 184,10 0,00 229,1 3,20 283,9 279,60 327,80 291,70 204,2 Minimum Tabelle 27: Zahlenwerte der Verteilungstendenzen der CD56dim (CD= cluster of differentiation) positiven Werte der Fibromyalgiepatienten zu Abbildung 34. COX=Cyclooxygenase; SSRI=selektive Serotonin- Wiederaufnahmehemmer; SSNRI=selektive Serotonin- und Noradrenalin- Wiederaufnahmehemmer; SNRI= selektive Noradrenalin-Wiederaufnahmehemmer; TZA=trizyklische Antidepressiva. dim % CD56 alle Anzahl COXBenzo2 nicht SSRI, diazeInhibOpioid SSNRI, pine Cortison itoren Lithium Lyrica Analgetika Opioide SNRI TZA 40 7 1 6 2 15 17 9 15 16 Minimum 1,14 1,36 9,10 5,72 5,72 1,79 1,36 1,36 3,95 1,79 25% Perzentile 8,13 14,29 9,10 8,10 5,72 5,72 6,07 9,26 12,87 5,66 Median 13,53 19,04 9,10 14,23 6,11 10,67 18,26 19,78 17,43 15,95 75% Perzentile 19,79 19,96 9,10 20,75 6,50 20,55 20,45 25,97 19,96 18,85 Maximum 52,03 52,03 9,10 23,64 6,50 34,18 52,03 52,03 34,18 23,64 9,97 15,31 0,00 6,69 0,55 11,44 12,79 14,84 7,98 7,73 Standardabweichung 102 Tabelle 28: Zahlenwerte der Verteilungstendenzen der CD56dim (CD= cluster of differentiation) positiven Werte der Fibromyalgiepatienten zu Abbildung 35. COX=Cyclooxygenase; SSRI=selektive Serotonin- Wiederaufnahmehemmer; SSNRI=selektive Serotonin- und Noradrenalin- Wiederaufnahmehemmer; SNRI= selektive Noradrenalin-Wiederaufnahmehemmer; TZA=trizyklische Antidepressiva; MFI=mittlere Fluoreszenzintensität. dim MFI CD56 alle Anzahl COXBenzo2 diazeInhibpine Cortison itoren Lithium Lyrica nicht SSRI, Opioid SSNRI, Analgetika Opioide SNRI TZA 40 7 1 6 2 15 17 9 15 16 Minimum 28,27 49,43 912,7 71,84 224,1 49,43 49,43 49,43 50,23 28,27 25%-Perzentile 114,5 321,0 912,7 132,8 224,1 89,38 236,5 196,1 285,8 153,1 Median 321,0 557,0 912,7 464,8 265,5 296,4 423,7 557,0 543,5 321,0 75%-Perzentile 760,0 1049,0 912,7 811,1 307,0 438,4 884,9 1071,0 838,9 543,5 4202,0 1093,0 912,7 910,3 307,0 4202,0 4202,0 4202,0 4202 912,1 685,4 408,4 0 345,7 58,61 1071,0 990,1 1281,0 995,6 288,6 Maximum Standardabweichung Tabelle 29: Zahlenwerte der Verteilungstendenzen der CD16 (CD= cluster of differentiation) positiven Werte der Fibromyalgiepatienten zu Abbildung 36. COX=Cyclooxygenase; SSRI=selektive Serotonin- Wiederaufnahmehemmer; SSNRI=selektive Serotonin- und Noradrenalin- Wiederaufnahmehemmer; SNRI= selektive Noradrenalin-Wiederaufnahmehemmer; TZA=trizyklische Antidepressiva. % CD16 alle Anzahl COXBenzo2 nicht SSRI, diazeInhibOpioid SSNRI, pine Cortison itoren Lithium Lyrica Analgetika Opioide SNRI TZA 40 7 1 6 2 15 17 9 15 16 6,14 16,10 6,14 8,90 11,98 7,41 6,40 6,40 7,41 6,40 25%-Perzentile 14,98 16,59 6,14 11,21 11,98 14,48 9,37 8,16 12,14 15,31 Median 20,64 25,30 6,14 19,75 12,06 18,51 23,41 25,30 16,59 21,52 75%-Perzentile 28,98 33,70 6,14 29,29 12,14 25,91 33,45 34,85 27,35 27,35 Maximum 41,37 41,37 6,14 33,67 12,14 36,00 41,37 41,37 33,67 37,35 Standardabweichung 10,14 9,23 0,00 9,81 0,11 8,71 12,03 13,35 8,87 8,87 Minimum 103 Tabelle 30: Zahlenwerte der Verteilungstendenzen der CD16 (CD= cluster of differentiation) positiven Werte der Fibromyalgiepatienten zu Abbildung 37. COX=Cyclooxygenase; SSRI=selektive Serotonin- Wiederaufnahmehemmer; SSNRI=selektive Serotonin- und Noradrenalin- Wiederaufnahmehemmer; SNRI= selektive Noradrenalin-Wiederaufnahmehemmer; TZA=trizyklische Antidepressiva; MFI=mittlere Fluoreszenzintensität. MFI CD16 alle Anzahl Benzodiazepine Cortison COX2 Inhibitoren Lithium Lyrica nicht SSRI, Opioid SSNRI, Analgetika Opioide SNRI TZA 40 7 1 6 2 15 17 9 15 16 55,9 374,8 1211,0 237,8 308,1 129,5 55,9 199,2 154,4 154,4 25% Perzentile 348,7 491,4 1211,0 296,9 308,1 343,7 325,9 306,3 343,7 342,9 Median 514,6 556,3 1211,0 376,9 325,4 519,6 496,6 496,6 491,4 494,0 75% Perzentile 1043,0 1528,0 1211,0 683,8 342,7 771,8 1450,0 1450,0 718,3 1043,0 Maximum 2548,0 1694,0 1211,0 1324,0 342,7 1853,0 1853,0 1694,0 1696,0 1853,0 561,6 549,0 622,6 591,0 Minimum Standardabweichung 0,0 403,3 24,4 534,1 426,5 479,7 Tabelle 31: Liste der untersuchten Patienten mit der Diagnose Fibromyalgie (FM). Pat. Nr.=Patientennummer; w=weiblich; m=männlich; BMI=Body Mass Index (Körpergewicht in kg/ Körpergröße in Metern im Quadrat; Adipositas Grad 1: BMI 30-34,9, Grad 2: BMI 35-39,9, Grad 3: BMI ≥40); CRP=C-reaktives Protein zu 2 Zeitpunkten aus EDTA-Blut (=Ethylendiamintetraessigsäure) bestimmt. Die erhöhten Werte sind rot hinterlegt (Einheit in mg/l; Norm <5,0 mg/l); TENDER=Anzahl der lokalen Hyperalgesie an den 18 definierten Tenderpoints zu zwei Zeitpunkten bestimmt. Pat. Nr. #6629 #6635 #6650 #6671 #6863 #6910 #7129 #7410 #7435 #7515 #7879 #7987 #8063 #8198 #8218 #8260 #8997 #9108 #9149 #9418 Diagnose FM FM FM FM FM FM FM FM FM FM FM FM FM FM FM FM FM FM FM FM Alter Sex 48 24 51 65 55 56 55 47 46 63 57 54 52 62 53 57 65 63 45 51 w w w w w w w w m w m w w w w w w w w w BMI CRP_1 CRP_2 TENDER_1 TENDER_2 8,5 5,4 7,8 1,3 8,3 3,9 2,3 0,6 0,0 3,9 2,5 2,1 14,9 3,4 11,1 1,6 2,5 3,6 1,2 1,0 8,2 1,8 6,9 0,8 8,2 18 18 18 8 17 18 7 16 13 14 15 14 9 12 18 10 14 8 17 9 18 6 7 14 15 12 14 18 18 18 15 17 13 16 12 8 11 7 17 16 39,45 38,28 19,47 33,15 39,06 33,87 29,41 26,93 27,16 30,82 28,37 22,76 37,34 28,91 43,77 27,66 29,20 34,68 23,23 19,53 104 5,1 1,5 1,1 0,0 15,0 2,2 1,9 14,7 5,3 11,7 1,3 2,5 7,5 1,7 1,5 Fortsetzung von Tabelle 31 Pat. Nr. Diagnose #9515 #9702 #9812 #10404 #10566 FM FM FM FM FM #10593 #10596 #10629 #10658 FM FM FM FM #10670 #10730 #10878 #10879 #10957 #10976 #11039 #11112 #11291 #11343 #11518 #11749 #11790 FM FM FM FM FM FM FM FM FM FM FM FM FM #11884 #12060 #12067 #12113 #12202 #12267 #12372 FM FM FM FM FM FM FM Alter Sex 47 63 44 46 57 42 50 47 60 48 51 46 43 41 62 40 59 55 54 47 57 37 53 56 21 57 45 44 67 w w w w w w w w w m w w w w w w w w w w w w w w w w w m w BMI CRP_1 CRP_2 TENDER_1 TENDER_2 1,5 2,1 4,6 5,6 1,7 1,4 2,5 3,5 3,5 5,1 2,4 2,8 4,9 1,9 2,8 1,0 0,9 5,5 4,1 2,1 0,5 0,5 10,1 7,5 0,5 2,2 1,1 3,0 2,0 0,7 0,5 0,9 0,6 2,1 0,5 16 16 9 14 12 16 15 5 14 9 15 18 5 12 14 16 12 18 12 16 4 16 12 13 18 18 7 9 14 18 17 9 3 18 18 18 18 9 8 22,31 23,88 33,46 29,76 29,64 23,88 18,75 30,11 36,36 27,76 28,91 24,54 35,16 32,87 21,77 19,10 27,82 26,56 31,23 26,04 30,42 24,34 25,91 17,36 38,75 24,62 22,92 22,01 105 0,5 0,5 17,0 9,8 0,8 0,9 1,1 3,6 9,8 0,5 0,9 0,9 0,9 1,5 0,5 8,4 0,5 1,1 1,1 0,6 1,4 17 18 12 4 14 17 13 18 2 15 15 17 16 13 2
