Durchflusszytometrie (Flow cytometry)
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Durchflusszytometrie (Flow cytometry) Institut für Immunologie und Biotechnologie, Medizinische Fakultät Universität Pécs Das Prinzip und Bedeutung der Durchflusszytometrie „Flowcytometrie” „Flowcytometrie” ist eine laboratorische Methode für die schnelle multiparametrische Analyse einzelner Zellen. Damit ist es möglich, gemischte Zellpopulationen nach ihrem Immunphenotyp oder funktionellen Zustand zu unterscheiden oder voneinander zu trennen. Durchflusszytometers, die bei Routineuntersuchungen angewendet werden, sind ausser der Detektierung der Zellgröße und Granularität auch für die Messung 2-4 Fluoreszensfarben geeignet. So können wir gleichzeitig 4-6 verschiedene Parameter von einer enzelnen Zelle messen. Untersuchungsrichtungen, Möglichkeiten 1. Detektierung des Immunphenotyps: • Diagnostik und Differentialdiagnostik der malignen hämatologischen Krankheitsbilder • Diagnostik und Differentialdiagnostik der Immundefizienzien • Nachbeobachtung der Aktivität der Autoimmunkrankheiten • Nachbeobachtung die Prä-und Posttransplantationszustände • HLA-Typisierung • Analyse der Tumorzellen: Untersuchung der Proliferationsantigene Exprimierung von Adhäsionsmolekülen • Diagnostik und Nachbeobachtung von Infektionskrankheiten 2. Möglichkeiten für quantitative Messungen: • Quantitative Bestimmung der Zahl von markierten Zellen und Zelloberflächenmolekülen 3. Messung von DNA und RNA Gehalt • Zellzyklusanalyse • Apoptose Messung 4. Funktionelle Messungen: • Detektion der Phagozytierungsfähigkeit, Chemotaxis • Bestimmung intrazellulärer Ca++ Konzentration, pH Bestimmung, • Enzymmenge, -Aktivität -und Lokalisationsmessung 5. Zellseparation CD-Marker (Cluster of Differentiation) ¾ Zelllinien Marker: zB. CD3+ T-Zellen; CD56+ NK Zellen ¾ Entwicklungsmarker: CD1+ Thymozyten ¾ Aktivierungsmarker: T-Helferzellen CD25+ (IL-2Rα), T-Zytotoxische: HLA-DR, CD11a(LFA-1) Monozyten Direkte Analysis des menschlichen Blutes bei Durchflusszytometrie 1. 2. 3. 4. 5. 6. 50 µl Blut wird dem früher erstellten Antikörpergemisch zugegeben. Inkubation: 30 Minuten Inkubation 10 Minuten lang mit 1 ml Rotblutkörperchen Lysispuffer Waschen mit 2 ml PBS Zentrifugierung des Röhrchens, 1000 rpm, 5 Min. Der Überstand wird entfernt, und das Pellet wird in 0,5 ml FACSFix (0.5 % PFA - PBS) aufgelöst. Messung mit FACSCalibur Durchflusszytometer. Analysis wird mit dem CellQuest Program gemacht Antikörpergemisch (Proben) im heutigen Praktikum 1. 2. 3. 4. 5. Autofluoreszierende Probe anti-CD3-FITC + anti-CD4-PE anti-CD3-FITC + anti-CD8-PE anti-CD3-FITC + anti-CD56-CyC anti-CD19-FITC + anti-CD5-PE Über das Gerät Verschiedene Eigenschaften (Größe und Granularität) von Zellen oder anderen Teilchen werden untersucht, während diese Zellen hintereinander, durch eine dünne Messkammer fließen. ¾ Die zu untersuchenden Zellen werden beim Durchfließen von der Seite von einem Laserlicht ¾ angestrahlt. Das Streulicht Eine Eigenschaft einer Zelle, die in der Durchflusszytometrie gemessen wird, ist das Streulicht. ¾ Je größer eine Zelle ist und je mehr Strukturen in ihrem Inneren sind, desto größer ist das entstehende Streulicht. ¾ ¾ Streulichtmessung Solange der Laserstrahl ungehindert durch die Flusszelle geht, entsteht kein Streulicht. Quert hingegen eine Zelle den Strahl, wird das Licht in verschiedenste Richtungen gestreut. ¾ Gemessen wird das Streulicht meist an 2 Stellen: a) Vorwärtsstreulicht: in Richtung des ursprünglichen Strahls b) Seitwärtsstreulicht: etwa im 90° Winkel zum ursprünglichen Strahl Das Vorwärtsstreulicht Das Vorwärtsstreulicht hängt vor allem von der Größe einer Zelle ab Das heißt, kleine Zellen verursachen ein kleines Vorwärtsstreulichtsignal, große Zellen ein großes Das Seitwärtsstreulicht Das Seitwärtsstreulicht hängt neben der Größe auch sehr stark vom Inhalt einer Zelle ab. Finden sich in der Zelle sehr viele Lysosomen (das sind kleine, Enzymspeichernde Bläschen), dann hat sie ein großes Seitwärtsstreulicht. . Streulicht-Dot-Plot Die Zellen werden in einer Graphik, einem sog. Dot-Plot aufgetragen • auf der x-Achse das Vorwärts• auf der y-Achse das Seitwärtsstreulicht Granulo Ly Mono Man erkennt Anhäufungen von Zellen, die offenbar ähnliche Streulichteigenschaften haben: Grüne Ansammlung: entspricht den Lymphozyten (klein, kaum Granula) Blaue: den Monozyten (groß, kaum Granula), Rosa: den Neutrophilen Granulozyten (groß, viel Granula). Das Fluoreszenzsignal ¾ Das Durchflusszytometer kann: durch Auswertung des Streulichts die Granulozyten, Monozyten und Lymphozyten unterscheiden auch Fluoreszenzlicht messen und erlaubt dadurch, eine Vielzahl von Merkmalen auf den Blutzellen zu untersuchen Es gibt eine bestimmtes, zu untersuchendes Merkmal einer Zelle Man muss dieses Merkmal mit einem Antikörper markieren, der dagegen gerichtet ist. Dieser Antikörper ist mit einem fluoreszierenden Molekül konjugiert. Markierung ¾ An einem Lymphozyten sieht man im Mikroskop (meist) nicht, ob er ein B- oder T-Lymphozyt ist oder ob er eine Helper-Zelle, eine Natural-KillerZelle oder eine zytotoxische Zelle ist. Die Durchflusszytometrie kann dies abklären. ¾ Dazu braucht man verschiedene Antikörper, der die T- und B-Lymphozyten markiert z.B.: einen Antikörper gegen CD3 (T-Lymphozyten), an den ein Fluoreszenzmolekül (z.B.:FITC) gekoppelt ist. einen Antikörper gegen CD19 (BLymphozyten), an den ein anderes Fluoreszenzmolekül (z.B.:PE) gekoppelt ist. Markierung der T- und B-Lymphozyten Messung der T- und B-Lymphozyten Fluoreszent- Dot-Plot ¾ Dot-Plot Graphik der Ergebnisse der Fluoreszenzmessung: Jeder Punkt entspricht einer Zelle. FITC-Fluoreszenz (grün) → X-Achse → T-Zellen PE-Fluoreszenz (gelbrot) → Y-Achse → B-Zellen Die Punkte sind nur der Anschaulichkeit wegen grün oder rot gefärbt. Das hat direkt nichts mit der Fluoreszenzfarbe zu tun. Aufbau des Zytometers Fluoreszenz Anregungslaser und ihre Wellenlängen: Argon-ion (488 nm) - blau ¾ HeNe (633 nm) – rot ¾ UV ¾ Dye-lasers – z. B. grün ¾ Emission – Detektorgeräte: ¾ ¾ ¾ ¾ FL1: 515-545 nm FL2: 560-600 nm FL3: 610-660 nm FL4: 670 nm < Das Fluoreszenzspektrum Emission I1 I2 I3 I4 FL1 FL2 FL3 FL4 488 nm Erregung Wellenlänge α12∗I1 α32∗I3 Helfer- und zytotoxische T-Zellen (menschliches Blut) CD8-PE I. CD4 PE II. II. CD3 FITC I. I. CD3 FITC - CD8+ zytotoxische T- Lymphozyten II. - CD4+ T-Helferzellen CD56-CyC NK- Zellen (menschliches Blut) T-Lymphozyten CD3 FITC IL2R a-Ketten (CD25) - expression (menschliches Blut) CD25 PE Aktivierte Lymphozyten CD3 FITC CD5 PE T-Zellen CD5+ B-Zellen B-Zellen CD19 FITC Separation der Mäusethymozyten nach CD4/CD8 Markierung CD8CyC CD4 einfach positiv (SP) CD8CyC CD4PE CD4PE Ganzer Thymus CD4PE doppelt positiv (DP) doppelt negativ (DN) CD8 einfach positiv (SP) Reinheit: 90%< CD8CyC CD4PE CD4PE CD8CyC CD8CyC
