Characterization of TMX4, a Novel ER - ETH E

Diss. ETH No. 17445
Characterization of TMX4, a Novel ER Oxidoreductase with
an unusuallocalization signal
A dissertation submitted to
ETHZURlCH
far the degree of
Doctor of Sciences
presented by
DORIS ROTH
Dip!. Natw. ETH, ETH Zurich
born 27.01.1979
citizen of Germany
accepted on the recommendation of
examiner: Prof. Dr. Ari Helenius
co-examiner: Assoe. Prof. Dr. Lars Ellgaard
co-examiner: Prof. Dr. Hans-Peter Hauri
co-examiner: Prof. Dr. Yves Barral
2007
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Summary
One single enzyme, protein disulfide isomerase (PDI), is able to catalyze both the
introduction of disulfide bonds, their reduction and isomerisation in the cndoplasmic
reticulum (ER). However, almost 20 PDI-like thiol-disulfide oxidoreductases are
known, indicating the complexity of the system that underlies the correct pairing of
two cysteines into a native disulfide bond. To fully understand oxidative protein
folding, it is necessary to elucidate the role of novel PDI-family members. In this
thesis,
we provide a first characterization of a novel
ER thiol-disulfide
oxidoreductase, TMX4 (thioredoxin-like transmembrane protein 4).
Sequence analysis showed that the protein contains a single thioredoxin-like
domain, which holds an unusual CPSC active-site motif. The CPSC active-site
sequence of HA-TMX4 is partially oxidized in the ER of living ceHs. Unlike other
PDI-like family members it is predominantly oxidized, indicating that TMX4 has a
different redox activity than well-known PDIs and that its in vivo redox state is
subject to a different regulation. TMX4 is expressed in a wide variety of human
tissues
and
1S
not
upregulated
by
the
unfolded
protein
response.
By
immunofluorescence, TMX4 was shown to localize to the ER. Furtherrnare, TMX4
was found to be a type I transmembrane protein that contains an Endoglycosidase Hsensitive N-glycan.
Interestingly, TMX4 does not have a classical ER retention signal at the Ctenninus of its cytosolic tail. This region, however, holds an RQR sequence.
Previously, RXR sequences have been found to confer ER localization to type II and
multispanning membrane proteins. When the C-tcrminal tail was removed, HATMX4 partially redistributed to the cell surface. The same result was seen when
mutating the two arginines of the RQR sequence to lysines, indicating that the RQR
sequence contributes to the ER targeting of HA-TMX4. By attaching the RQRhearing C-terminal region to a plasma membrane protein, CD4, we generated
chimeras that remained in the ER. In thc same construct, mutation of the RQR
sequence resulted in cell surface expression. Overall, the results demonstrate that the
RQR sequence in TMX4 is sufficient for ER localization.
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Zusammenfassung
Ein
Enzym,
Proteindisulfidisomerase (PDI), ist ganz alleine in der Lage,
Disulfidbrücken im endoplasmatischen Reticulum (ER) sowohl zu bilden, als auch zu
reduzieren
und
isomerisieren.
Dass
dennoch
beinahe
20
PDI-ähnliche
Thioldisulfidoxidoreduktasen bekannt sind, weist auf die Komplexität hin, die der
korrekten Paarung zweier Cysteine zu einer native Disulfidbindung zugrundeliegt.
Um oxidative Proteinfaltung vollständig zu verstehen, ist es notwendig, die Rolle der
neuen Mitglieder der PDI-Familie zu beleuchten. Im Rahmen dieser Dissertation
legen wir die erste Charakterisierung einer neuen Thioldisulfidoxidoreduktase des
ER, TMX4 (thioredoxin-like transmembrane protein 4), vor.
Die Analyse der Aminosäuresequenz von TMX4 zeigte, dass das Protein eine
einzige Thioredoxin-ähnliche Domäne mit einem ungewöhnlichen CPSC-Motiv im
aktiven Zentrum besitzt. Das ein CPSC-Motiv enthaltende aktive Zentrum von HATMX4 liegt in einem teilweise oxidierten Zustand vor. Anders als andere Mitglieder
der PDI-Familie ist es vorwiegend oxidiert, was darauf hindeutet, dass sich die
Redoxaktivität und die Regulierung des in vivo Redoxzustands von denen bislang
charakterisierten PDI-ähnlichen Proteinen unterscheiden. Die Expression der TMX4mRNA wurde in einer breiten Vielfalt menschlicher Gewebe nachgewiesen und nicht
durch die "unfolded protein response", der zellulären Antwort auf ungefaltete
Proteine, aufreguliert. TMX4 ist ein Typ-I-Transmembranprotein mit einem Nverknüpften Glykan, das sich gegenüber Endoglykosidase H sensitive verhält. Durch
lmmunofluoreszenz wurde gezeigt, dass TMX4 im ER lokalisiert ist.
Interessanterweise besitzt TMX4 kein klassisches ER-Lokalisierungssignal am
C-Terrninus des cytosolischen Schwanzes. Diese Region birgt jedoch eine RQRSequenz. Schon vor der vorliegenden Arbeit war bekannt, dass RXR-Sequenzen die
ER-Lokalisierung von Typ-II-Transmembranproteinen und Proteinen mit mehreren
Transmembrandomänen gewährleistet. Als der C-terminale Schwanz entfernt wurde,
gelangte HA-TMX4 teilweise an die Zelloberfläche. Das gleiche Resultat wurde
erhalten, als die Arginine der RQR-Sequenz zu Lysinen mutiert wurden, was darauf
hindeutet, dass die RQR-Sequenz zum ER-"Targeting" von HA-TMX4 beiträgt.
Durch Anheftung der RQR-beinhaltenden C-terminalen Region von TMX4 an das
Plasmamembranprotein CD4 erzeugten wir Chimären, die im ER verblieben.
Mutation der RQR-Sequenz im gleichen Konstrukt stellte die Zelloberflächen-
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expression wieder her. Insgesamt zeigen die Resultate, dass die RQR-Sequenz von
TMX4 hinreichend für die ER-Lokalisierung ist.