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Masterthemen des FB Molekulare Biologie
Studienjahr 2011/12
Molekulare Tumorbiologie
AG Frischauf:
GLI Transkriptionsfaktoren: Ihre Aktivität, ihre Spezifität und ihre Rolle in Krebs
Der Hedgehog (Hh) -Signaltransduktionsweg ist wichtig in Entwicklung und Tumorgenese
und spielt auch eine Rolle in Stammzellen und Regeneration. Der Hh Ligand aktiviert einen
Signalweg, an dessen Ende die GLI Transkriptionsfaktoren stehen, die dann die
Transkription der Hh-Zielgene aktivieren. Welche Zielgene durch die GLIs aktiviert oder
reprimiert werden hängt vom Zelltyp ab und von den anderen Komponenten und
Signalwegen, die in der Zelle aktiv sind. Das Zusammenspiel aller Faktoren bestimmt den
Ausgang.
In der Arbeitsgruppe Frischauf werden verschiedene Wege eingeschlagen, um die
Regulation der GLI Faktoren und ihrer Zielgene zu untersuchen: in einer internationalen
Zusammenarbeit wird an einer systembiologischen Darstellung des Hedgehogpathways in
verschiedenen Arten von Krebs gearbeitet (MOGLI Projekt, Koordinator H Lehrach , MPI
Molekulare Genetik Berlin, AG W Nietfeld MPI Berlin, AG U Korf DKFZ Heidelberg, AG
Aberger Salzburg; AG Frischauf Salzburg). Dabei werden große Mengen von
Genexpressionsdaten (Illumina Arrays) generiert. Im Mittelpunkt des Interesses steht in der
AG Frischauf die Analyse der Interaktionen des Hh Signalwegs mit anderen Signalwegen im
Hh abhängigen Medulloblastom, einem Kindheitstumor, bei dem in einem Teil der Fälle
Hh/GLI eine entscheidende Rolle spielt. Ein geplantes Masterarbeitsthema betrifft die
genauere Untersuchung von Genen, die sowohl vom Notch als auch vom Hh/GLI Signalweg
reguliert werden können.
Techniken: Zellkultur, Transfektion von Zellen, Einbringen von Genen in Zellen durch virale
Infektion, Expressionsanalyse im kleinen Maßstab (Real-time PCR), Klonierung von
Promotoren und Expressionskonstrukten, Analyse der Promoteraktivität mittels Luciferase
Assays, Mutagenese, Co-Immunpräzipitation und Pulldown von Proteinen, Western Blots,
Anwendung bioinformatischer Methoden.
AG Aberger:
Krebsstammzellen bilden eine kleine Subpopulation der Tumorzellen, die für die Entstehung
und das Wachstum maligner Tumoren sowie für Rückfälle bei behandelten Krebspatienten.
Masterthemen 2010/11
Ein anderer Zugang zur Rolle der GLI Faktoren in Krebs ist die Analyse von Interaktionen
der GLI Faktoren mit anderen Proteinen. Solche Interaktionen können entscheidend zu den
Funktionen der GLIs in der Zelle beitragen. Ein laufendes Projekt beschäftigt sich mit der
Isolierung von solchen Proteinen. In Zusammenarbeit mit der Gruppe von Professor Huber
wurden bereits einige potentielle Interaktionspartner identifiziert, weitere sollen folgen. Im
Rahmen einer Masterarbeit soll die Interaktion eines solchen Proteins verifiziert werden und
seine Einfluß auf die Aktivität von GLI untersucht werden.
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verantwortlich ist. Die gezielte medikamentöse Hemmung von Krebsstammzellen stellt eine
der vielversprechendsten Therapiemöglichkeit dar.
Ein wesentliches Ziel der AG Aberger ist, jene molekularen Mechanismen aufzuklären, die
für das Wachstum, die Selbsterneuerung und das Überleben von Krebs(stamm)zellen
verantwortlich sind. Der Fokus liegt dabei auf der funktionellen Analyse des Hedgehog/GLI
Signalweges, der eine wesentlich Rolle in der Entstehung einer Vielzahl humaner
Krebsformen spielt.
1. Interaktion onkogener Signalwege mit der Hedgehog/GLI Signaltransduktion in der
Entstehung von Hautkrebs
Mit Hilfe transgener Mausmodelle in Kombination mit einer breiten Palette von ergänzenden
in vivo und in vitro Analysen soll untersucht werden, welche Rolle verschiedene Hedgehogmodulierende Signalwege wie EGFR, MEK/ERK oder PI3K/AKT in der Krebs-Entstehung
spielen. Weiters soll in in vivo Tumormodellen untersucht werden, inwieweit die kombinierte
Hemmung der Hedgehog Signaltransduktion und ausgewählter modulierender Signalwege
therapeutische Anwendung finden könnte.
2. Hedgehog Signaltransduktion in Krebsstammzellen: Entwicklung effizienter KombiTherapien in präklinischen Modellen
Das kooperative Zusammenspiel unterschiedlicher Krebsgene und onkogener Signalwege
für zur Etablierung maligner Expressionsprofile. In Vorstudien konnte eine Reihe
sogenannter potentieller „drug targets“ identifiziert werden, deren Funktion eine wichtige
Rolle in tumor-initiierenden Krebsstammzellen verschiedener Krebsarten (zB Pankreas und
Kolonkarzinom) spielt. Durch Kombination geeigneter medikamentöser Krebstherapeutika
sollen synergistisch wirkenden onkogenen Signale gehemmt werden, um tumor-initiierende
Krebszellen möglichst effizient zu attackieren und somit einen deutlich verbesserten
therapeutischen Nutzen zu erzielen
AG Krammer: Photodynamische Therapie und zelluläre Biophysik
Weltweit werden seit über 35 Jahren verschiedene Tumore und nicht-maligne Erkrankungen
auf inneren und äußeren Körperoberflächen mit PDT behandelt.
Unser Schwerpunkt liegt in der Untersuchung der molekularen und zellulären Mechanismen
der Zellschädigung und der verschiedenen Zelltodarten, welche zur Tumorbeseitigung und
Immunität nach PDT führen. Weiters forschen wir u.a. an Verbesserungen der
Photosensibilisator-Anreicherung (drug delivery) in den Zellen, z.B. mittels Nano-Carriern,
und an Verbesserungen der Bestrahlungsmodalitäten.
Themen in Bearbeitung:
Masterthemen 2010/11
Die Photodynamische Therapie (PDT) ist eine effektive, nachhaltige und
nebenwirkungsarme Therapie zur Beseitigung von Tumoren, entzündlichen Erkrankungen
und auch Mikroorganismen und wird in vielen Ländern schon seit Jahren erfolgreich
durchgeführt. Das Wirkprinzip ist die Aktivierung einer nicht-toxischen Substanz, eines
Photosensibilisators, in z.B. einer Tumorzelle oder in einem Blutgefäß durch sichtbares Licht
zu einer hochreaktiven Substanz am Ort der Bestrahlung. Durch Bildung verschiedener
reaktiver Sauerstoffformen wirkt der aktivierte Photosensibilisator letal auf das Target und/
oder stimulierend auf Signalübertragungswege und das Immunsystem.
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Diagnose von Tumorzellen für Tumorzellapherese mittels photodynamischem Prinzip;
Diagnose von Plattenepithelkarzinomen bei EB-Patienten; molekulare Grundlagen von
Hautdefekten (z.B. Epidermolysis bullosa); Ansätze zu neuen Tumortherapien, z. B. mittels
Einsatz
von
Nanopartikeln;
Phototoxizität
neuer,
natürlich
vorkommender
Photosensibilisatoren und deren Modulation von intrazellulären Signalübertragungswegen;
Rotlichteffekte bei Wundheilung und Entzündung, Untersuchung der Heileffekte der
Gasteiner Radontherapie an Zellmodellen.
Wir führen sowohl Grundlagenforschung für die klinische Anwendung gemeinsam mit
medizinischen Einrichtungen und ausländischen Kooperationspartnern, als auch
angewandte Forschung in Kooperation mit Kliniken und Firmen durch.
Neue Diplomthemen:
1) Photodynamische Tumortherapie als Modulator von pro-inflammatorischen Cytokinen
Vorallem eine subletale Anwendung von PDT, wie bei der Diagnose üblich, kann
proinflammatorische Cytokine wie IL-6 heraufregulieren. Wir wollen nach PDT mit den
Photosensibilisatoren Hypericin und dem endogen gebildeten Protoporphyrin IX die
Modulation der Cytokine IL-1beta, IL-6, TNF-alpha, etc. in mehreren Zelllinien untersuchen.
Dazu werden die Zellen im Grundzustand oder nach Stimulation einer proinflammatorischen
Reaktion verwendet. Umgekehrt soll ein möglicher Effekt eines pro-inflammatorisch erhöhten
Zustandes auf die Effizienz der PDT analysiert werden.
2) Photodynamische Tumortherapie zur Induktion einer anti-Tumor Immunantwort: die Rolle
von DAMPs
PDT konnte in vorhergegangenen Maus-Versuchen einen Tumor vollständig beseitigen und
eine effektive anti-Tumor-Immunantwort einleiten. Wir wollen die molekularen Mechanismen
zur Stimulation des Immunsystems über die Analyse der relevanten DAMPs (damageassociated molecular pattern) aufklären. Dazu zählen proinflammatorische Cytokine und
Heatshock Proteine.
3) Nanovehikel für lipophile Photosensibilisatoren
Lipophile Photosensibilisatoren wie die Naturstoffe Hypericin (aus dem Johanniskraut) oder
Curcumin (Cucuma longa) besitzen zwar gute Eigenschaften in der Modulation von
Pathways und Beseitigung von Tumorzellen, werden aber nur schlecht in wässriger Phase
bis zu den Tumorzellen transportiert. Sie müssen daher mit „Transportmitteln“ (z.B.
Nanopartikeln) oder Löslichkeitsverstärkern (z.B. PVP) verbunden werden. Hier sollen
speziell entworfene Nanovehikel zur Aufnahme von Photosensibilisatoren in Tumorzellen
untersucht werden.
Molecular Plant Biophysics and Biochemistry
AG Obermeyer:
Das Hauptinteresse unserer Forschung liegt in der Erforschung der zellulären Prozesse, die
für die Auskeimung und das anschließende Wachstums des Pollenschlauches verantwortlich
sind. Das Pollenschaluchwachstum ist ein fundamentaler Prozeß der pflanzlichen
Masterthemen 2010/11
Weitere Themen werden aktuell bekanntgegeben (z.B. über Aushang).
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Befruchtung. Nur eine erfolgreiche Befruchtung sichert die Produktion von Nahrungsmitteln
für die Ernährung der Weltbevölkerung. Eine zentrale Frage ist, wie kann sich ein
Pollenschlauch im drei-dimensionalen Raum orientieren und wie erfolgt das gerichtete
Wachstum zum Ovarium? Zur Beantwortung dieser Fragen werden molekularbiologische,
biochemische
und
biophysikalische
Techniken
verwendet,
um
die
Funktion
von
unterschiedlichen „Schlüsselproteinen“ zu klären und schließlich diesen Prozess mittels
theoretischer Modelle zu simulieren (systems biology). Dabei wird auch die physiologischen
Funktion von Pollenallergenen untersucht, die auch höchstwahrscheinlich auch bei der
Pollenschlauchkeimung beteiligt sind: was ist ihre ursprüngliche Funktion im Pollen und wie
werden sie hinausgeschleust?
1. Pollen Organelle Membrane Proteome (POMP): Mit Hilfe massenspektrokopischer
Methoden kann die Gesamtheit aller Proteine im Pollen oder spezifischen Pollenorganellen
untersucht werden. Das POMP zeigt eine hohe räumliche sowie zeitliche Dynamik im Laufe
des Keim- und Wachstumsprozesses des Pollenschlauches.
Membranproteine (Ionentransporter) und das Membrane trafficking spielen bei den meisten
zellulären Prozessen eine wichtige und zentrale Rolle. In diesen Prozessen konnten auch die
meisten Schlüsselproteine, die die Polarität induzieren bzw. aufrechterhalten, identifiziert
werden.
die für das Pollenschlauchwachstum essentiell sind, durch Bindung an phosphorylierte
Epitope. Identifizierte 14-3-3 Isoformen aus Lilienpollen sollen in Bakterien exprimiert und
aufgereinigt werden. Die gereinigten, rekombinanten 14-3-3 Proteinen können dann gezielt
für Bindungsexperimente eingesetzt werden. Aufgrund ihres unterschiedlichen pIs und
Molekulargewichtes können die natürlichen 14-3-3 Proteine mit Hilfe der 2-dimensionalen
Gelelektrophorese aufgetrennt und identifiziert werden und somit können mögliche
Veränderungen im Isoformmuster während der Pollenschlauchkeimung beobachtet werden.
Masterthemen 2010/11
2. Molekulare Schalter: 14-3-3 Proteine regulieren die Aktivität unterschiedlicher Proteine,
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3. Transport: Mit Hilfe verschiedener elektrophysiologischer Methoden können Ionenströme
in intakten Pollenkörnern und –schläuchen (2-Elektroden voltage-clamp) aber auch
Einzelkanalströme an Pollenprotoplasten (patch-clamp) gemessen werden. Durch eine
genaue Charakterisierung der Eigenschaften dieser Ströme können Ionenkanäle oder –
pumpen identifiziert werden. Neben dem Transport von Ionen spielt der Transport von
Wasser während der Rehydratisierung des Pollenkorns und des Verlängerung des
Pollenschlauches eine wichtige Rolle. Die Aufnahme des Wassers ist somit sehr eng mit
dem Pollenschlauchwachstum, aber auch mit der Freilassung der Allergene verknüpft.
Funktioniert diese Wasseraufnahme mittels Aquaporine, wie wird der Turgordruck reguliert
und wie kann man den Transport von Wasser überhaupt messen?
5. Pollenallergene: Die Aufgabe von Pollenallergen ist nicht ihre Allergenizität, sondern hat
etwas mit der physiologischen Funktion des Pollen zu tun. Weshalb werden allergene
Proteine aus dem Pollen freigesetzt während andere im Cytosol verbleiben? Mit Hilfe
rekombinanter sowie gereinigten, natürlichen Pollenallergenen soll in unterschiedlichen
Experimenten dieser Frage nachgegangen werden, dabei sind vor allem Art v 1, das
Hauptallergen des Beifußpollen und das Panallergen Polcalcein von Interesse.
Mögliche Themen:
1. Aquaporine im Pollen: Expression und Charakterisierung (Molekularbiologie, Biochemie)
2. Protein-Protein-Interaktion der PM H+ ATPase mit regulatorischen Proteinen (Biophysik,
Biochemie)
3. Turgordruckmessungen an Pollenkörnern (Biophysik)
4. Einzelkanalmessungen an der Plasmamembran von Pollen-Protoplasten (Biophysik)
5. Isolierung von sekretorischen Vesikeln aus Pollenschläuchen (Biochemie, Proteomics)
6. Identifizierung von t-SNARE-Proteinen für die Vesikelfusion mit der Plasmamembran
(Biochemie)
7. CSI Ca2+ ATPase: Charakterisierung, Sequenz und Isolierung (Molekularbiologie,
Biochemie)
8. Herstellung eines rekombinanten Ca2+-Bindeproteins aus Lilienpollen (Molekularbiologie,
Biochemie)
9. Interaktome des K+ Kanals (Biophysik, Zellbiologie)
10. Transformation von Pollenkörnern (Molekularbiologie)
fluoreszenz-markierten
Ionentransportern
in
Pollenkörnern
Chemie und Bioanalytik
AG Huber:
1. Untersuchung der toxischen Auswirkungen potentieller neuer Medikamente auf
humane Zellmodelle auf der Ebene des Proteoms und Metaboloms:
Masterthemen 2010/11
11. Expression von
(Molekularbiologie)
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Die Einführung und behördliche Zulassung eines neuen Medikaments dauert viele Jahre und
erfordert einen immensen Investitionsaufwand. In der Entwicklung neuer therapeutischer
Wirkstoffe werden tausende Substanzen hergestellt und im Hinblick auf ihre Wirkungen und
Nebenwirkungen im Menschen untersucht. Im Zuge dieses Verfahrens ist es besonders
wichtig, toxische Wirkungen von Substanzen möglichst früh festzustellen, um Sie umgehend
aus dem Verfahren ausschließen zu können. In diesem Projekt des 7. EURahmenprogrammes versuchen wir, toxische Wirkungen von neuen Substanzen durch ihre
Auswirkungen auf die Protein- und/oder Metabolitenzusammensetzung in menschlichen
Modellzellen (z. B. Nierenzellen oder Hepatozyten) zu charakterisieren. Dazu sind mit Hilfe
von mehrdimensionalen chromatographischen Trenntechniken und Massenspektrometrie so
genannte Protein-Maps sowie mit der hochaufgelösten Massenspektrometrie MetabolitenProfile zu erzeugen, aus
denen mit Hilfe bioinformatischer Methoden DosisWirkungsbeziehungen und mögliche toxische Wirkungen abgeleitet werden.
2. Massenspektrometrische Charakterisierung von intakten Proteinen:
Aufgrund der leichteren Handhabbarkeit und der einheitlicheren physikalisch-chemischen
Eigenschaften werden Proteine heute vielfach erst nach einem Verdau zu Peptiden
analysiert. Dies hat den Nachteil, dass viele Protein-spezifische Informationen, z. B.
Sequenzvarianten oder posttranslationale Modifikationen, verloren gehen. In diesem Projekt
versuchen wir, die Analysenmethodik auf der Ebene intakter Proteine weiterzuentwickeln.
Dazu werden leistungsfähige chromatographische Trenntechniken in Verbindung mit der
Massenspektrometrie eingesetzt. Für die empfindliche Detektion der Proteine müssen die
experimentellen Parameter sorgfältig optimiert werden. Um einen Nachweis geringster
Mengen an Proteinen (Bruchteile von Picogramm = 10-9 g) zu ermöglichen, müssen die
Analysentechniken auch entsprechend miniaturisiert werden. Anwendung finden die
entwickelten Methoden in der Erstellung von Toxizitätsprofilen (siehe Thema 1) sowie in der
Analyse von Proteinen, die an der Signaltransduktion beteiligt sind.
Rekombinante Allergenprodukte werden zunehmend in der Diagnostik und der spezifischen
Immunotherapie (Hyposensibilisierung) von Allergien eingesetzt. Eine korrekte Diagnose und
maßgeschneiderte Dosierung des Allergens im Zuge der Hyposensibilisierung setzt eine
umfassende Charakterisierung rekombinanter Allergenprodukte voraus. Dies betrifft die
Reinheit des Produkts und die Identifizierung eventueller Verunreinigungen ebenso wie den
Nachweis der korrekten Proteinfaltung und intakter Epitope. Als Alternative zu
Routinemethoden wird die Kapillarelektrophorese (CE) als innovatives Trennverfahren im
Mikromaßstab eingesetzt. Eine Kombination unterschiedlicher Trennmodi der CE sowie eine
Kopplung mit der Massenspektrometrie dient einer Absicherung der Ergebnisse. Der
Nachweis geringster Änderungen in der Aminosäuresequenz, des Faltungszustands sowie
abweichender posttranslationaler Modifikationen der Allergene, erfordert umfassende
Optimierungen der CE-Trennungen. Der aktuellste Ansatz umfasst eine Wechselwirkung
zwischen Allergenen und spezifischen monoklonalen Antikörpern im Zuge der
elektrophoretischen Trennung. Die entwickelten Methoden dienen einer verbesserten
Standardisierung der Allergenprodukte im Zuge der Qualitätssicherung.
Mikrobiologie
AG Weßler:
Stomach cancer is the second leading cause of cancer-related deaths worldwide. Even after
early diagnosis, the prognosis of gastric carcinoma is rather poor due to its high capability to
metastasize, since no treatments to prevent cancer spread are available. Gastric cancer is
Masterthemen 2010/11
3. Kapillarelektrophorese von Allergenen:
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closely linked to persistent Helicobacter pylori infection in humans. Accordingly, the World
Health Organization has defined H. pylori as a class-I carcinogen (comparable to asbestos
and smoking). The model of gastric cancer development involves of a typical series of
sequential processes, initiated by chronic active inflammation in response to H. pylori
infection at the early phase in carcinogenesis followed by loss of gastric glands, atrophy and
hyperproliferation. Finally, there is a progressive loss of differentiation inducing invasive
growth of individual neoplastic cells.
In vitro, infection of gastric epithelial cells with H. pylori induces a drastic cell migration and
changes in cell morphology, cell-cell and cell-matrix adhesions (Fig. 1) that might contribute
to inflammatory processes, wound healing, angiogenesis, invasive growth or metastasis in
vivo. However, the molecular mechanisms are largely unknown.
Fig. 1: The EMT-like phenotype observed in H. pylori-infected
gastric epithelial cells. AGS cells were infected with H. pylori
(right) at a MOI 100 or left untreated (left) for 8 hours followed by
laser scan microscopy to monitor changes of the cellular
morphology and the actin cytoskeleton (red). Nuclei are stained
with DAPI (blue).
Hence, in our project, we investigate these cellular processes which are differentially
regulated by defined pathogenic factors of H. pylori. Those factors are either presented on
the bacterial surface, secreted into the environment or injected into the host cytoplasm where
they interfere with host cell responses. The cytotoxin-associated gene A (CagA) is a well
studied paradigm among pathogenic factors. CagA is injected via a type IV secretion system
(T4SS) from H. pylori directly into the cytoplasm of infected host cells. The T4SS itself and
the injected CagA then behave as ´eukaryotic´ signaling molecules and selectively activate
signal transduction pathways contributing to the H. pylori-associated pathogenesis. Other
important pathogenic factors include the secreted protease HtrA (high temperature
requirement A) that disrupts intercellular adhesions, adhesions that enables H. pylori
attachment or VacA (vaculating cytotoxin A) which induces large vacuoles in cultured
epithelial cells and promotes apoptotic effects.
Working at the interface between microbiology and cell biology, we are interested in the
cellular aspects of pathogen-host interactions. This knowledge will deepen our understanding
of the complex intracellular signal transduction pathways in host cells leading to a strong
inflammatory response and carcinogenesis in the stomach. Available projects are on
following topics:
Analysis of H. pylori-induced signal transduction pathways that selectively
transactivate the promoter of important target genes: Many genes encoding cytokines,
gastrin or other pro-inflammatory factors are tightly controlled by H. pylori. Here, we analyze
the upstream signal transduction pathways (initiated by receptors, involvement of small
GTPases and kinase cascades), activation of transcription factors and promoter of target
genes.
Loss of intercellular adhesions and bacterial proteases: H. pylori secretes the protease
HtrA as a novel pathogenic factor that cleaves the cell adhesion protein E-cadherin on host
cells. Ectodomain shedding of E-cadherin has drastic consequences on the integrity of
Masterthemen 2010/11
The EMT-like phenotype induced by H. pylori: The morphological phenotype of H. pyloriinfected cells (Fig. 1) resembles growth factor-induced EMT (epithelial-mesenchymal
transition) that often occurs during cancer invasion and metastasis. We are investigating
several cancer-associated pathways inducing EMT leading to dedifferentiation of cells to
elucidate how H. pylori stimulates the EMT-like process and which pathways are involved.
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adherence junctions and intracellular signal transduction pathways that control the actin
cytoskeleton.
Methods: microbiological and molecular techniques, culture of tumor cells and pathogens,
infection experiments, Western blotting, kinase assay, protein overexpression and
purification, immunofluorescence analysis, transient transfection, reporter gene experiments,
real-time PCR analysis, ELISA, etc.
Bioinformatik
AG Sippl:
Our main research interest is to understand the rules of protein folding. This requires (1) to
classify all known protein folds in terms of pairwise structure similarities and (2) to find out
how the information contained in the amino acid sequences is translated into threedimensional structures and how these structures endow the proteins with their respective
characteristic chemical functions and biological roles.
At the Division of Bioinformatics we address these problems by two major research projects.
The first is COPS, our Classification of Protein Structures. In the second project we use the
known structures to deduce the atomic and molecular forces that are responsible for the
folding and stability of protein structures and we use the resulting energy functions to find
and correct errors in experimental protein structures and predict and compute protein
structures from their amino acid sequences. There are many interesting problems that need
to be solved and there are many as yet undetected rules and features that need to be
investigated. The research projects below are suitable for a master thesis. Students will
become acquainted with tools and methods of bioinformatics, including (indispensable)
programming skills in Python/C.
Recent publications and further information on COPS and our energy functions can be found
on our web page: http://www.came.sbg.ac.at.
The evolution of sequences and structures
The evolution of protein domains
Proteins can be decomposed into structurally compact subunits called domains. These
domains are generally thought to be independent folding units (i.e. the structure only
depends on the sequence of the respective domain and is independent of other parts of the
protein chain). Moreover, domains frequently duplicate and are exchanged between proteins
by recombination processes. Although the structures of such domains are very similar their
sequences often seem to be unrelated even if they are contained in the same protein. On the
other hand, since the diverged sequences encode for very similar structures there must be
some common information on the sequence level that gives rise to this structural similarity.
Masterthemen 2010/11
The evolution of proteins is driven by changes in amino acid sequences. At present we know
a subset of rules (structure is more conserved than sequence, similar sequences generally
have similar structures, etc.) of protein evolution but the picture is still incomplete. The goal
of this project is to use sequence and structure alignment techniques to quantify the
differences in the conservation of sequences on the one hand and the conservation of
structures on the other. Based on our COPS data base this will allow us to characterize and
quantify how protein structures adapt to changes in amino acid sequences. This is likely to
reveal exciting new insights regarding the relationship between amino acid sequences and
protein structures and as such it will be a significant contribution to the advances in structural
biology and bioinformatics.
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Furthermore, the topic of protein domains is strongly connected to protein function.
Frequently, domains are defined on the level of chains (or tertiary structure). However,
numerous examples show that distinct compact subunits of protein structures can only be
assigned when the physiologically functional protein (quaternary structure, biological
assembly) is considered. There are many intriguing questions that will be addressed in this
project using COPS and the bioinformatics tools we have in our hands:
(1) Why are amino acid sequences changing so quickly after domain duplication?
(2) What is the common sequence information that determines the related structures of
domains whose sequences have strongly diverged?
(3) What can we learn about the evolution of protein structures from domains derived from
biological assemblies?
(4) When building structural domains from biological assemblies, it is crucial that the
underlying data is not erroneous. How can we detect faulty biological assemblies? How can
correct biological assemblies be built? Is it possible to detect faulty domain decompositions
with existing tools?
Fold recognition
The experimental determination of protein structures by X-ray crystallography or Nuclear
Magnetic Resonance (NMR) spectroscopy is still a tedious and time-consuming task. Hence,
a lot of effort has been spent in bioinformatics for the development of algorithms that predict
protein structure from sequence. One principle commonly adopted is to identify a protein of
known structure that is supposed to resemble the structure of the query sequence. The
structure found (the template) is then used to build a model of the unknown structure (the
target). Many algorithms for structure prediction rely on a high sequence similarity between
target and template, but with the growth of protein structure databases it became clear that
there are many similarities amongst protein structures that have only marginal sequence
similarity. Fold recognition techniques try to find template structures that would have been
missed by common sequence search methods. The goal of this master thesis is to integrate
an already existing fold recognition algorithm with the framework of COPS and apply it to the
prediction of various interesting protein structures.
Protein structure and function
COPS and sequence databases
Only a portion of all currently available protein sequences have a known three-dimensional
structure. The topic of this work is to provide a list of sequences that have no significant
sequence similarity to a sequence with known structure using the COPS classification, thus
covering all sequences with no detectable structural relative. The list changes every week
because COPS is concurrent with the Protein Data Bank which is weekly updated. Such a
list provides difficult sequences for computional methods like fold recognition and protein
structure prediction as well as for experiments like Structural Genomics and CASP. A
Masterthemen 2010/11
A basic assumption in protein function prediction is that similar structure implies similar
function. In COPS we have a lot of examples of similar structures at various degree of
sequence similarity. The topic of this work is an analysis of such cases. At what degree of
structural similarity and how often is it possible to derive function? Does sequence similarity
play a major role in this game? One application is the annotation of targets from Structural
Genomics projects. There are many Structural Genomics targets of unknown function that
share structural similarity with already annotated structures. Is it possible to annotate these
proteins of unknown function using structural similarity?
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particularly interesting application is the analysis of the human proteome with respect to how
much structural information can currently be obtained for its sequences.
Peaks and pitfalls in local protein structure
The goal of this master thesis is to identify unrealistic molecular environments in protein
structures (by application of an already implemented method) and *thoroughly* check if these
unrealistic environments are due to errors in the process of protein structure determination,
format errors in the corresponding Protein Data Bank files or are a consequence of seldomly
occurring chemical restraints (non-standard bondings, ligands, experimental conditions like
pH value and temperature, ...). The master student working on this thesis should be strongly
interested in organic chemistry and literature research concerning the analyzed proteins. The
first steps of this work will include a guided introduction to the method that has to be applied
and the selection of a number of unrealistic physico-chemical environments in protein
structures which shall be analyzed in detail.
Strukturbiologie
AG Schwarzenbacher:
1. NLR-proteins in Immunity and Inflammation
Recently a new family of highly conserved, intracellular receptors which follows the TLRparadigm has been discovered and dubbed NLRs. Like TLRs, NLRs recognize foreign
products such as peptidoglycans and initiate host defense pathways, through the activation
of inflammatory caspases and subsequent release of IL-1b and IL-18. Mutations in NOD1, for
example, are implicated in Blau syndrome a form of uveal, skin and joint granulomatous
inflammation, whereas NOD2 mutations are associated with Crohn's disease and ulcerative
colitis, two major forms of inflammatory bowel disease affecting over one million people in
North America and Europe alone. Therefore, our main goal is to identify the structure,
ligands, binding partners and signalling mechanisms of these crucial immune receptors and
their role in innate immunity and inflammation.
2. Alpensalamander
www.alpensalamander.eu
Zelluläre
Passkontrolle:
präsentation
Antigenprozessierung
und
–
Das Immunsystem hat die Aufgabe, äußere Eindringlinge (Viren und
Bakterien) und innere Fehlentwicklungen (Tumoren) zu erkennen
und gegebenenfalls zu bekämpfen. Dazu muss sich jede Zelle dem
Immunsystem gegenüber ausweisen, indem es Peptide aus dem
Zellinneren an der Zelloberfläche präsentiert. Trotz der enormen
Effizienz dieses Fahndungssystems gelingt es einzelnen schädlichen
Zellen unentdeckt zu bleiben, weil unauffällige Peptide präsentiert
werden, und dadurch die Passkontrolle versagt. Wir untersuchen
Masterthemen 2010/11
AG Brandstetter:
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den komplexen Protease-Apparat, der für die Peptidgenerierung verantwortlich ist. Ein
eingehendes
Verständnis
dieser
Prozessierungswege
verspricht
gezielte
Eingreifmöglichkeiten zur Behandlung von Tumor- und Infektionserkrankungen.
Undercover
unterlaufen
Agenten
–
wie
Krankheitserreger
zelluläre
Abwehrmechanismen
Eine klassische Strategie von Pathogenen ist die Imitation
von Proteasen der Immunabwehr. Dadurch werden die
Schutzmechanismen des Wirtsorganismus unterlaufen. Wir
untersuchen in diesem Zusammenhang bakterielle
Kollagenasen, die bei Infektionen einen entscheidenden
Beitrag zur Kolonisation und Infiltration des Wirts leisten.
Allergien
Allergene sind an sich harmlose Fremdproteine, die aber bei rund 20 % der Bevölkerung
eine übermäßige Immunantwort auslösen und zu vielfältigen Symptomen führen, die von
Juckreiz bis zum anaphylaktischen Schock reichen können. Doch was macht ein Protein zu
einem Allergen?
Mithilfe struktureller Untersuchungen konnten wir ein Modell der
molekularen Metamorphose erstellen, das erklärt, warum Allergene eine allergische
Immunantwort auslösen: Allergene wandeln ihre Erscheinungsform durch intramolekulare
Umlagerungen
und
durch
intermolekulare
Komplexbildung
(Oligomerisierung)
um,
wodurch
Schlüsselereignisse wie Endozytose, proteolytische
Prozessierung,
Antigenpräsentation
sowie
Antikörpererkennung und –quervernetzung beeinflusst
werden.
Die Unterdrückung dieser Metamorphose
stabilisiert Allergene in einer Erscheinungsform und stellt
somit einen hochspezifischen Therapieansatz dar.
Weitere Details finden Sie auf www.uni-salzburg.at/xray.
In dem skizzierten Themenkreis bieten sich in unserem Labor Möglichkeiten für folgende
Masterarbeiten:
1. Etablierung eines Aktivitätsassays und enzymkinetische Charakterisierung von (z.B.
antigenprozessierenden) Proteasen
Virologie/Glykobiologie
AG Vlasak
All living cells express large numbers of glycans at their cell surface. Glycans are found as Nglycans and O-glycans on proteins. In addition, they are found as part of
glycosylphosphatidylinisotol (GPI) anchors, on glycolipids, and as glycosaminoglycans. The
biosynthesis of glycans involves numerous enzymes and sugar transporters. Although many
of the key enzymes have been identified, relatively little knowledge on the regulation of their
activity is available. On the other hand it is well documented that glycosylation is species-
Masterthemen 2010/11
2. Klonierung, Expression, Reinigung und Kristallisation eines Zielproteins aus den oben
dargestellten Themenbereichen
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specific, organ-specific, and even cell type-specific. Glycans are involved in self-recognition
(e.g. blood group antigens), and they are important players in the regulation of the immune
system. Furthermore, glycan structures often change during disease. In cancer, several
glycan structures are either over expressed or down regulated.
Many viruses use specific glycans as receptors for docking to the cell surface, thereby
initiating an infection. In our group, we have characterized the binding specificities of the
receptor-binding proteins of influenza viruses, coronaviruses and toroviruses. They
selectively bind to different forms of an acid sugar termed “sialic acid”. Thus, they represent
so called “lectins” (sugar-bindig proteins). In the near future we want to use these proteins as
probes to detect sialic acids on serum glycoproteins. They will be included into “lectin-arrays”
on ELISA plates and used to identify differences in the glycosylation patterns of cancer
patients.
In another project, we have established a protocol to genetically modify influenza C viruses.
Here, we will now further investigate the role of the viral nonstructural protein NS1 in its
interference with the cellular interferon response. Our aim is to knock out this protein without
disturbing its RNA splicing activity, thereby creating an attenuated virus which cannot
replicate in normal tissue, but only in certain types of cancer, e.g. melanoma. Since human
melanoma over express receptors for influenza C viruses, attenuated forms are good
candidates for future use as tumor-destroying (oncolytic) viruses.
Techniques: Cell culture, protein expression and purification, glycan analysis, ELISA assays,
lectin binding assays, site-directed mutagenesis, reverse genetics.
Topics for master thesis:

Expression and purification of viral lectins

Determination of the stability and selectivity of lectins coupled to ELISA plates

Determination of the minimal requirements for splicing activity of the influenza C virus
NS1 protein

Creation of viable influenza C viruses with NS1 deletions which are able to replicate in
human melanoma cells
Allergie und Immunologie
AG Thalhamer:
The research of the AG Thalhamer includes (i) basic science with the goal of
eliciting cellular and molecular mechanisms of the immune responses
triggered by specific protein and gene vaccines, and (ii) translational research
focused on the development of vaccines for the treatment of allergy.
Concerning the former aspect, the group is interested in various triggers which polarize the
immunity or lead to a tolerogenic state. This is of particular interest for both, the
understanding of the nature of allergenic molecules and their possibly inherent allergenicity,
Masterthemen 2010/11
Gene and protein vaccines - prophylactic and therapeutic approaches for the
treatment of allergic diseases
12
as well as for the development of anti-allergic approaches. The primary targets to investigate
these questions are the skin and the mucosal surfaces. A large panel of up-to-date molecular
biological and immunological methods is used thus providing the master students with an
internationally competitive theoretical and practical knowledge.
The translational part of the research programs includes the development of gene-based and
protein vaccines with novel application modes, such as transdermal immunization via laserporated skin or mucosal application to modulate immune responses.
Topics of research include:
1. RNA vaccines for prophylactic vaccination against allergies
We have demonstrated that gene vaccines effectively protect from the induction of allergic
immune responses by inducing a TH1 biased immune milieu. We could show for the first
time that RNA vaccines are as effective in preventing sensitization than their DNA
counterparts and due to their short persistence represent a safe alternative for prophylactic
vaccination.
In collaboration with the Blutbank Linz of the Red Cross Oberösterreich, we are currently
investigating whether TH1 biased immune responses, as they are induced by RNA vaccines,
resemble an immune profile that is found in non-atopic humans who have grown up in a
farming environment.
Today, the majority of vaccines is administered
by the intramuscular route using hypodermic
needles and syringes, even though muscle is
not a highly immunogenic organ. Development
of effective methods for vaccine delivery to the
skin is considered a feasible approach. The skin
represents an important peripheral immune
organ attractive for vaccination as it is rich in
immunocompetent cells including Langerhans
cells, dermal dendritic cells and keratinocytes, and its efficient drainage to lymph nodes. An
ideal skin vaccination method should therefore be reliable, but also eliminate the dangers
and pain associated with hypodermic needles. In collaboration with Pantec Biosolutions, we
established a precise laser epidermal system (P.L.E.A.S.E.) for vaccine application via lasergenerated micropores. We could recently demonstrate that specific immunotherapy via
Masterthemen 2010/11
2. Transcutaneous immunization via laser generated micropores
13
P.L.E.A.S.E. is equally effective compared to subcutaneous injections but induces a more
favourable cytokine profile.
Current research includes the evaluation of different adjuvants for skin immunotherapy and
application of the technology for a broader panel of vaccines, including Hepatitis B,
meningococcal disease, and haemophilus influenzae.
3. Role of Langerhans cells in gene gun induced immune responses
Langerhans cells (LC) are antigen presenting cells (APC) found predominantly in the skin
and mucosal epithelia. Owing to their ideal anatomic location, LC have long been regarded
as a prototypic example of professional APC. Although the role of LC for immune activation
or modulation is now being discussed controversially, other langerin+ dendritic cells (DC)
appear crucial for protective immunity in a growing set of infection and vaccination models. In
knock-in mice that express the human diphtheria toxin receptor under control of the langerin
promoter, langerin+ cells can be specifically ablated by injection of diphtheria toxin allowing
investigating the role of these cells in various immunological settings.
A
B
C
Fluorescent staining of epidermal sheets from LangDTR mice without (A, B) or with (C) diphtheria
toxin. α-I-A/I-E-FITC (A, C); α-CD3-PE (B).
Josef Thalhamer encourages interested candidates to contact him via email
([email protected]) and to make an appointment for the discussion of detailed
projects, applications and employment.
AG Duschl:
The main function of professional antigen presenting cells (APCs) such as dendritic cells
(DCs) is the induction of adaptive cellular immune responses. Upon antigen encounter, DCs
provide specific signals to naïve T-cells and thus promote the differentiation of particular Thelper (Th) cell subsets which are generated to control different types of protective immune
responses. The question how the immune-system decides which type of T-cell mediated
immune-response to launch against particular pathogens or other stimuli still puzzles
immunologists. DCs, the most potent type of antigen presenting cells, seem to play a central
role in this process and are in the focus of our research interest.
Recently, we have identified Interleukin 31 (IL-31) and SOCS2, two molecules that were so
far not associated with DC-biology, to be involved in DC activation. IL-31, one of the lastly
identified cytokines is closely related to the family of IL-6 cytokines and was shown to be
associated with dermatitis and atopic inflammation of the skin. SOCS2 is a member of the
Suppressor Of Cytokine Signalling (SOCS) proteins and was so far mainly thought to
regulate growth hormone dependent signalling pathways. Studies from our own group
provide evidence that both proteins are involved in the regulation of DC activation. To
investigate immune modulatory effects of IL-31 and SOCS2 in DCs in terms of Th cell
Masterthemen 2010/11
1. 1. IL-31 and SOCS2 – novel key regulators of dendritic cell - functions?
14
activation a position would be available for a master student. The main methods involved are
generation of human dendritic cells from peripheral blood, RNA isolation, RT-PCR, western
blotting, ELISA, flow cytometry and siRNA based gene silencing in DCs.
2. Impact of nanoparticles on human immune cells
Nanotechnology is one of the fastest growing technologies in the last years, many
advantages and new products to improve our life are promised. Currently, more than 1000
products containing nanotechnology are already on the market. Thus, there is an increasing
demand to fully understand all possible interaction of these new engineered nano-entities
with biological subjects. We are interested in the interaction of engineered nanoparticles with
human immune cells, which are investigated within EU-funded studies. Master students may
participate in these ongoing projects.
Nanowires and lung cells. Picture by Linda Stöhr
Oxidative stress is often seen as one of the major mechanism in nanoparticles-induced
health effects. Within this thesis, the role of specific nanoparticles parameters like
composition, shape, surface area, surface chemistry on the induction of reactive oxygen
species and the activation of inflammatory pathways will be investigated. Furthermore, the
specific kind of stress response will be examined using FACS measurements, western
blotting, ELISA and luciferase measurements using stably transfected cell lines. Specific
mechanisms of cell-nanoparticle interaction are an interesting subject for a master thesis.
AG Ferreira:
Masterthemen 2010/11
3. Investigation of stress response in immune cells after exposure to engineered
nanoparticles
15
Type I allergies, which comprise a wide range of IgE-mediated disorders such as hay fever,
asthma, atopic dermatitis, affect more than 20% of the population and therefore represents a
major health problem. In an allergic reaction, allergen-specific IgE antibodies bound to the
surface of mast cells and basophils via high-affinity Fcε receptors serve as the receptor for
the allergen on mast cells and basophils. Cross-linking of these cell surface-bound IgE
antibodies by allergen represents the signal for the release of pre-formed and newly
synthesized inflammatory mediators such as histamine, leading to the typical allergic
inflammatory reaction.
Although
allergen-specific
immunetherapy (SIT) is the only curative
approach for type I allergies, in its
present form SIT is performed with
allergen extracts and is accompanied
with risk of IgE-mediated side effects.
Systems for recombinant production of
allergens and techniques for gene
manipulation offer unique tools for the
development of novel molecule-based
products to be used in diagnosis and
SIT. Pure and standardized recombinant
allergens or cocktails prepared thereof
and containing most of the IgE-binding
epitopes of an allergen source can be formulated to replace natural extracts.
The primary interest of our group is the development of new tools for allergy diagnosis and
for safer and more efficient allergen-specific immunotherapy. Presently, we are working on
birch pollen and associated food allergies, allergic reactions to mountain and Japanese
cedar, ragweed, and mugwort pollen allergies. In addition, hypersensitivity reactions against
nonsteroidal anti-inflammatory drugs (like Diclofenac, etc) are investigated with the aim of
development of new diagnostic tools for drug-induced anaphylaxis.
To generate improved tools for allergy diagnosis and therapy, our ongoing projects involve:
Masterthemen 2010/11
• Identification of natural allergens
• Generation of low IgE binding hypoallergenic molecules in bacterial, yeast and plant
expression systems
• Protein purification
• Physicochemical protein characterization (analysis of protein folding and aggregation, mass
spectrometry)
• Immunologic characterization of recombinant proteins in vitro
• Antigen uptake and processing
• Analysis of allergenic molecules in pre-clinical models
• Basophil activation test for detection of drug-induced hypersensitivity by FACS
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Therefore we are constantly looking for diploma students and interns participating in ongoing
research projects.
AG Briza:
With the develpoment of modern tandem
mass spectrometers, proteomic research
became an increasingly important tool to
identify and characterize proteins in
complex
samples.
Basically,
two
complementary approaches are possible.
Proteins are extracted from cells or
organelles, digested with protease and
the resulting peptides are separated by
reverse phase HPLC and analyzed by a
directly
coupled
tandem
mass
spectrometer. The other option is to
separate the extracted proteins by oneor two-dimensional gel electrophoresis,
digest protein spots with protease and
analyze the peptides by MS. Tandem MS
instruments are able to simultaneously
aquire peptide masses and peptide
fragmentation
patterns.
With
this
information,
proteins
can
be
unequivocally identified in protein data
bases. Sequence information obtained
for unknown proteins can be used for cloning the corresponding genes. Our group uses a
Micromass Global Ultima Q-Tof (quadrupole - time-of-flight) mass spectrometer with electro
spray ionizatiion, optionally coupled with a capillary HPLC.
AG Lackner: Immunoinformatik
Den größten Teil der Allergene machen Proteine aus. Von vielen dieser allergenen Proteine
ist mittlerweile die Raumstruktur bekannt. Wo dies nicht der Fall ist, kennt man zumeist die
Struktur eines homologen Proteins. Die Raumstrukturen dienen als Basis um grundlegende
Fragen der Allergieforschung zu beantworten, aber auch um therapeutische, sog.
Hypoallergene zu entwickeln. Diese Forschungsarbeiten werden in enger Zusammenarbeit
mit den experimentellen Gruppen von F. Ferreira und J. Thalhamer durchgeführt.
Masterthemen 2010/11
Using the methodology described above, we try to identify new proteins or protein isoforms
that induce type I allergies in allergic patients. Our main focus are allergens from tree (birch
and selected trees) and weed (mugwort, ragweed) pollen. Our work is done in close
cooperation with the group of Fátima Ferreira.
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Mit bioinformatischen Methoden wird versucht, der Antwort auf die große Frage "Was macht
ein Protein zum Allergen" ein Stück näher zu kommen. Dabei ergeben sich viele Detailfragen
wie: Habe Allergene charakteristische Strukturen?
Habe allergene Proteine
charakteristische Oberflächeneigenschaften? Wie werden allergene Proteine in APCs
prozessiert, welche T-Zell Epitope ergeben sich? Was sind die potentiellen B-Zell Epitope?
Parallel dazu wird aber auch der Frage
nachgegangen, wie kann man ein Allergen
gezielt so verändern, das es (in Form
eines Hypoallergenes) für therapeutische
Zwecke verwendet werden kann. Eine
computerbasierte Methode beruhend auf
der 3D Struktur des Allergens, wurde dazu
bereits
entwickelt
und
erfolgreich
angewandt.
Methodisch steht also die Strukturbioinformatik im Mittelpunkt. Zum einen
werden öffentlich zugängliche Programme
verwendet. So z.B. MODELLER zum Erstellen von 3D Modellen von Proteinen, für die es
bislang keine experimentelle Struktur gibt. Oder Prosa2003 für die Modellevaluierung oder
die Berechung von Hyperallergenen. Chimera, ein mächtiges Molekülgrafikprogramm, dient
als Arbeits-plattform, in welche die genannten Programme integriert werden, um effizient mit
den Daten umgehen zu können.
In Rahmen von Diplomarbeiten besteht nun die Möglichkeit, verschiedenste Detailfragen zu
klären, vorhandene Methoden zu adaptieren und zu optimieren, einzelne Methoden zu einer
Pipeline zu integrieren aber auch an der Entwicklung neuer Lösungen mitzuarbeiten. Bei
Diplomarbeiten kann je nach Interesse und Begabung daher entweder die Anwendung von
BI-Software im Mittelpunkt stehen oder aber auch das Entwickeln von Methoden. Alle
Diplomanden erlernen den Umgang mit verschiedenen Programmen, Linux, und ggf.
Programmiertechniken um dann selbstständig eine konkrete gestellte Aufgabe lösen zu
können.
Einige der verwendeten Methoden/Services werden in den LVAs 'Biologische Datenbanken',
'Anwendungen der Bioinformatik' und 'Immunoinformatik I+II' vorgestellt. Grundkenntnisse
der Programmiersprache Python werden im Kurs 'Programmieren für Biologen' vermittelt. Als
ideale Entscheidungshilfe für eine Diplomarbeit wird eine AG angeboten.
Masterthemen 2010/11
Erwartet wird von Diplomanden: Interesse an der Immunologie und Interesse in Bioinformatik
und Proteinstrukturen, Freude an der Computerarbeit und die Bereitschaft auch nichtbiologische Techniken wie Programmieren in Grundzügen zu erlernen.
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