Die Institute Abteilung Genexpression Institut für Molekulare

Department of Gene Expression
Institute of Molecular Immunology
München / Munich
Die Institute
Abteilung Genexpression
Institut für Molekulare Immunologie
(Leiter / Head: Prof. Dr. Michael Meisterernst)
achstum und Differenzierung
menschlicher Zellen werden durch
Genexpressionsprogramme gesteuert. Viele Krankheiten, wie zum Beispiel
Leukämien, resultieren unmittelbar aus der
Fehlsteuerung von Transkriptionsfaktoren.
In der Abteilung Genexpression werden die
Mechanismen der Genkontrolle mit Schwerpunkt auf dem Transkriptionsprozess in
Tumorzellen biochemisch untersucht. Die
Gruppe hat die Klasse der humanen Cofaktoren zuerst beschrieben. In der Folge gelang es, eine Reihe von generellen Transkriptionscofaktoren erstmals zu isolieren
und ihre molekulare Funktionsweise aufzuklären. Aktuell gilt das Interesse der molekularen Dynamik in Transkriptionsnetzwerken
und Chromatin, welche an ausgewählten
zellulären und viralen Modellen untersucht
wird. Neue Einsicht in die Mechanismen der
Genprogrammierung erwarten wir uns von
Technologien der Genomik (so genannte
Chromatin-Immunpräzipitation auf Mikroarrays) und einer verbesserten Proteinbiochemie. Deren Entwicklung wird mit der Unterstützung des Forschungsministeriums in der
Abteilung vorangetrieben. Hier berichten
wir über einen Aspekt dieser Arbeiten, in
dem es um die Entwicklung einer neuen
Methode zur Beschreibung funktioneller
Kernproteome geht.
Weite Aktivitäten im Programm
Infektion & Immunität
Die Gruppe untersucht strukturell interessante T-Zell-Gene und Aktivatoren, die eine
wichtige Rolle im Immunsystem oder in der
Hämatopoiese spielen. Ein immunologisch
W
oth the cell proliferation and the
differentiation of human cells are
controlled at the level of transcription.
Deregulations in transcription can cause
many diseases, for example leukaemia. In
the Department of Gene Expression, we use
biochemical methods to investigate
mechanisms of gene control, with a focus
on transcription processes. The group were
the first to describe the class of human
cofactors. Following this, we successfully
isolated a series of general transcription
cofactors and elucidated their molecular
function. At present, the focus is on the
molecular dynamics in transcription
networks and chromatin, which are investigated in selected cellular and viral models.
We expect new genome technologies
(so-called chromatin immunoprecipitation
in microarrays) and improved protein
biochemistry to provide new insights into
the mechanisms of gene programming.
The development of these technologies
is supported by the national research
ministry. Here we describe a new aspect
of this work, the development of a new
method to monitor and isolate the nuclear
proteome of mammalian cells.
B
Further activities in the programme on
infection and immunity
The group investigates structurally
interesting T-cell genes and activators that
play an important role in the immune
system or in haematopoesis. Activation of
T-cells is an immunologically relevant
model system.
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relevantes Modellsystem ist die Aktivierung
von T-Zellen.
Die Abteilung umfasste 2005 sechs Doktoranden, 2 Postdoktoranden, einen Gruppenleiter, zwei technische Mitarbeiter und eine
Teilzeit-Verwaltungskraft.
There are 6 postgraduate students,
2 postdoctoral fellows, 1 group head,
2 technicians, and a part-time administrator
in the Department.
Kernregulatoren: Schlüssel zum
Verständnis der Genprogrammierung
netzwerke. Fragen lauten, wie sind diese
zusammengesetzt, was steuert ihre Bildung
und wie entwickeln sie sich während verschiedener Transkriptionsphasen und in
Abhängigkeit von den daran gekoppelten
RNA-Prozessierungsprozessen. Die zu Grunde liegenden Mechanismen wurden in der
Vergangenheit vornehmlich an einzelnen
Modellgenen untersucht. Von großem
Interesse sind aber auch die übergeordneten Prinzipien der Genprogrammierung.
Zugang zu diesen sollen in der Zukunft
genomische Technologien verschaffen. Aus
diesem Grund wurden in jüngerer Zeit
verstärkt Methodenentwicklungen zur Darstellung der Proteome und genomweite
Analysen der Transkriptionsfaktoren vorangetrieben. Hier soll über eine erfolgreiche
Entwicklung zur Darstellung eines funktionellen Anteils des Kernproteoms berichtet
werden.
Das Kernproteom kann als die Summe
aller im Kern zu einem bestimmten Zeitpunkt enthaltenen Proteine definiert werden. Neben den vielen strukturellen Proteinen und den Maschinen der Kernprozesse
enthält der Zellkern vor allem regulatorische
Faktoren. Man könnte vermuten, dass die
meisten eukaryontischen Kernproteine nach
über 30-jähriger biochemischer Analyse
menschlicher Zellen und aus der Kenntnis
des humanen Genoms bekannt sind. Dies
trifft sicher auf viele strukturelle Proteine
und Teile der Maschinen, auf andere Faktoren jedoch nur teilweise zu. Tatsächlich liegt
die Funktion zahlreicher Gene und durch sie
kodierten Proteine ganz allgemein weiter im
Dunkeln. Insbesondere die in die Genprogrammierung involvierten Faktoren sind
schwer identifizierbar und in ihrer Funktion
häufig unerforscht. Gründe hierfür sind das
seltene Vorkommen wie auch der Umstand,
dass sich regulatorische Faktoren letztendlich nur in ihrem biologischen Kontext
funktionell einordnen lassen. Ein gutes
Zellen steuern ihre Entwicklung und andere
spezifische Aufgaben bevorzugt auf der
Ebene der DNA-Transkription, also der
Überschreibung der genetischen Information in mRNA. In den meisten Zellen gibt es
konstitutive Programme, die für die normale
Versorgung der Zelle notwendig sind. Daneben steuern so genannte Masteraktivatoren
spezifische Unterprogramme. Im Immunsystem, welches auf äußere Einflüsse reagieren
muss, steuern Signalkaskaden die Genexpressionsprogramme. Häufig werden dabei
im Zytoplasma lokalisierte Masteraktivatoren unter der Kontrolle von Proteinkinasen
(und anderen Faktoren) in den Kern der
Zelle transportiert. Masteraktivatoren können auch in der Entwicklung über Differenzierungswege angeschaltet werden. Die
hierarchisch hoch angesiedelten Proteine
aktivieren selbst eine Gruppe von Genen
oder aber sie wirken über nachgeschaltete
regulatorische Faktoren. Es ist letztlich eine
Kombination hochspezifischer DNA-bindender Proteine und die durch ihre Bindung an
Gene erzeugte regulatorische Oberfläche,
welche das Chromatin öffnet und die RNAPolymerase II an den Genen aktiviert. Regulatorische Proteine können diesen Prozess
nicht allein bewältigen. Notwendig sind
zusätzlich eine große Anzahl von akzessorischen Proteinen, so genannte Cofaktoren.
Diese organisieren letztendlich die Kommunikation zwischen regulatorischen Modulen
und den Maschinen der RNA-Synthese und
-Prozessierung (Blazek et al., 2005). Durch
Kombination regulatorischer Komponenten
und mit Hilfe der multifunktionellen Cofaktoren gelingt es der Zelle die Anzahl der Regulatoren relativ überschaubar – weit unter der
Zahl der Gene – zu halten.
Ein Schwerpunkt der Abteilung liegt auf
der Charakterisierung der Transkriptions-
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Die Institute
Beispiel hierfür liefert die große Familie der
Zinkfinger Proteine. Von besonderem Interesse sind auch die regulatorischen Faktoren,
die signalabhängig in den Kern transportiert
werden. Beispiele hierfür sind die STATFaktoren die in der Immunanwort der Zelle
auf virale Infektionen eine Rolle spielen,
NFκB welcher Entzündungsprozesse reguliert und NFAT, welcher die T-Zellaktivierung
steuert.
Zugang zur biochemischen Darstellung
der Kernfaktoren liefern zunächst Fraktionierungstechniken. Für die Isolierung der Kerne
nutzt man für gewöhnlich die Instabilität der
äußeren Zellmembran gegenüber Detergentien oder mechanischen Scherkräften. Die
isolierten Kerne können anschließend mit
Salz extrahiert werden. In einem BMBFgeförderten Technologieentwicklungsprogramm wurden solche, bereits vor einiger
Zeit entwickelte Methoden, systematisch
verglichen. Wie andere kamen wir zu dem
Schluss, dass eine saubere Trennung der
Kern- und Zytoplasmaproteome letztlich
nicht möglich ist. Insbesondere kann eine
Diffusion der Faktoren zwischen Kern und
Zytoplasma während der Auftrennung nicht
vollständig verhindert werden.
Gesucht wurde nun nach einem Verfahren, welches es erlaubt, ausschließlich
Kernfaktoren zu detektieren. Kernfaktoren
tragen häufig ein so genanntes Lokalisationssignal (NLS). Gelänge es, dieses spezifisch zu erkennen, hätte man ein neues
biochemisches und diagnostisches Werkzeug zum Nachweis in der Hand. In Zusammenarbeit mit Frau Kremmer wurde
zunächst versucht, monoklonale Antikörper
gegen typische NLS-Peptide herzustellen.
Dieses Unternehmen scheiterte trotz hartnäckigen Versuchen, wohl an den spezifischen
Eigenschaften unseres Immunsystems,
welches negativ auf die Erkennung eigener
Proteine selektiert. Die Detektion NLStragender Proteine gelang schließlich mit
Hilfe eines rekombinanten Proteins, dem so
genannten Importinα, welches an das NLS
bindet.
Importine bestehen aus einer NLS-bindenden Untereinheit und einem Transportfaktor.
Die Bindung an das NLS erfolgt über das
Armadillo-Strukturelement, welches 10-fach
wiederholt im Importinα auftritt. Im Importinα
A
B
Abb. 1: A: Schematische Darstellung von
Importinα1 mit seiner autoinhibitorischen
Domäne (IBB) und der dereprimierten verkürzten Proteine (DIRE und DIRE arm 5-10).
B: Detektion NLS-tragender Proteine durch so
genannten far-Western Blots mit GST-DIRE und
einem gegen GST gerichteten Antikörper. Verglichen wurden zytoplasmatische, Kern- und
Chromatinextrakte aus Jurkat T Zellen (20 µg
Protein pro Spur) mit (von links nach rechts) GST
allein, DIRE, DIRE arm 5-10, DIRE in der Gegenwart von 1 mg/ml SV40 NLS-Peptid, DIRE in der
Gegenwart von 1 mg/ml Kontrollpeptid, DIRE
nach chemischer Modifizierung von Argininresten
(p-Hydroxyphenylglyoxal) und DIRE nach Modifizierung der Lysine mit Maleinsäureanhydrid.
ist allerdings die Bindung NLS-tragender
Faktoren durch eine inhibitorische Domäne
(IBB) blockiert (vergleiche Abb. 1). Um diese
Inhibierung zu überkommen, wurden Nterminal verkürzte Importinα E.coli-Expressionskonstrukte hergestellt und diese mit
dem GST- (Glutathion-S-Transferase) Gen
fusioniert. Nach Expression und Reinigung
der Fusionsproteine (genannt DIRE für
dereprimierte Importin-Rezeptoren) gelang
damit in einem einfachen Verfahren die
Detektion NLS-tragender Proteine (Abb.1).
Die Methode ist spezifisch für Lysine im
NLS wie durch chemische Modifikation und
Kompetitierung mit geeigneten Peptiden
gezeigt werden konnte (Abb. 1). Die Sensitivität ist in der jetzigen Form durch die Affinität des Antikörpers, gerichtet gegen GST,
limitiert und liegt etwas oberhalb einer
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Abb. 2: Silber- (linke Spalte) im Vergleich zur
DIRE-Färbung von Zellextrakten (rechte Spalte).
Gezeigt sind 2-D Geltrennungen von Extrakten
unstimulierter primärer T Lymphozyten,
PMA/PHA stimulierter primärer T Lymphozyten
and transformierter Jurkat T Zellen (von oben
nach unten, primäre Zellen: 100 µg Protein,
Jurkat Zellen 450-500 µg Protein; 3-10 non-linear
IPG Streifen). Mit X oder N gekennzeichnete
Proteine wurden aus Coomassie gefärbten 2-D
Gelen mit Hilfe von MS/MS (Massenspektrometrie) isoliert und identifiziert. Beispiele sind FUBP1
(N11/N12), hnRNP L (N10) und hnRNP C1/C2
(N3/N4).
herkömmlichen Silberproteinfärbung (Blazek und Meisterernst, 2006).
Das Verfahren sollte sich für molekularbiologische- ebenso wie für diagnostische
Anwendungen eignen. So könnten Muster
erkannt werden, oder aber spezifische Kernproteine isoliert und diese durch Massenspektrometrie identifiziert werden. Voraussetzung ist die Erkennung eines spezifischen
Musters in Kernpräparationen oder aber in
Lysaten intakter Zellen. Der Nachweis dafür
erfolgte exemplarisch in dem physiologischen Prozess der T-Zellaktivierung. Wie in
Abbildung 2 dargestellt, detektierte die
DIRE-Methodik in der Tat ein hochspezifisches Muster (rechte Spalte), welches sich
210 " GSF
deutlich von der herkömmlichen Proteinfärbung unterscheidet (linke Spalte). Ein
solches wurde in primären humanen
T-Lymphozyten (obere Reihe) wie auch in
Lysaten transformierter Jurkatzellen beobachtet (unterste Reihe). Aktiviert man primäre Lymphozyten in vitro, dann ändert sich
das Muster dramatisch (mittlere Reihe). Die
Methode ist also grundsätzlich für die Charakterisierung von signalabhängigen Zellzuständen und somit für viele diagnostische
Anwendungen geeignet. Die mit Massenspektrometrie aus Jurkat identifizierten
Proteine bestätigten ferner die Gegenwart
eines NLS in den meisten Proteinen (vgl.
Abb. 2). DIRE detektiert also wie erwartet
eine definierte funktionelle Fraktion des
Kernproteoms. Es ist denkbar, dass durch
direkte Markierung der Importine die Sensitivität weiter erhöht und, eventuell in Kombination mit weiteren funktionellen Filtern,
damit in der Zukunft auch sehr seltene
Faktoren detektiert werden können. Das
Verfahren wurde zum Patent eingereicht und
anschließend in Proteomics publiziert
(Blazek und Meisterernst, im Druck).
"
Zusammenarbeit
• Winship Herr, Universität Lausanne
• Patrick Schulz, IGBMC, Strassburg
• Bernd Rautenstrauss, Uni Erlangen
• Robert Slany, Universität Erlangen
• Christian Buske, Medizinische Fakultät der LMU München
• Jürgen Haas, Pettenkofer Institut der LMU
• Peter Becker, Butenandt Institut der LMU
• Patrick Cramer, Genzentrum der LMU
• Eckhart Wolf, Genzentrum der LMU
• Don Lamb, Physikalische Chemie der LMU
• Genomatix Inc..
• Martin Hrabe de Angelis, Institut für Experimentelle
Genetik der GSF
• Alois Schepers, Abteilung Genvektoren der GSF
"
Ausgewählte Veröffentlichungen
Blazek, E., Mittler, G., Meisterernst, M.: The mediator of
RNA polymerase II. Chromosoma 2005 Mar;113(8):399-408
Gilfillan, S., Stelzer, G., Piaia, E., Hofmann, M.G., Meisterernst, M.: Efficient binding of NC2.TATA-binding protein to
DNA in the absence of TATA. J Biol Chem. 2005 Feb
18;280(7):6222-30