Isolation von humanen CD4+ dendritischen Zellen aus
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Aus der Klinik für Kinder- und Jugendmedizin im St. Josef-Hospital Direktor Prof. Dr. med. C. Rieger Universitätskinderklinik der Ruhr-Universität Bochum Immunologisches Labor, Leiter PD Dr. med. U. Schauer Isolation von humanen CD4+ dendritischen Zellen aus zirkulierendem Blut und ihr Verhalten bei Stimulation INAUGURAL-DISSERTATION zur Erlangung des Doktorgrades der Medizin einer Hohen Medizinischen Fakultät der Ruhr-Universität Bochum vorgelegt von Tobias F. Feuchtinger aus Reutlingen 2000 Dekan: Prof. Dr. med. G. Muhr Referent: PD Dr. med. U. Schauer Koreferent: Tag der mündlichen Prüfung: 5. Juli 2001 „Und hättest Du den Ozean durchschwommen Das Grenzenlose dort geschaut, So sähst du dort doch Well‘ auf Welle kommen, Selbst wenn es dir vorm Untergange graut. Du sähst doch etwas. Sähst wohl in der Grüne Gestillter Meere streichende Delphine,....“ J.W. Goethe, Faust II, Vers 6239 ff. Inhaltsverzeichnis: 1. EINLEITUNG 1.1 Historisches .............................................................................................. 1 1.2 Hintergrund und Problemstellung 1.2.1 Möglichkeiten der Isolation von dendritischen Zellen .................. 2 1.2.2 Ursprung und Differenzierung von dendritischen Zellen ...................................................................... 3 Antigenaufnahme, -prozessierung und -präsentation von dendritischen Zellen ............................................................... 5 1.2.4 Rekrutierung und Migration .......................................................... 6 1.2.5 Dendritische Zellen und Lymphozyten ......................................... 7 1.2.6 Dendritische Zellen und Zytokine ................................................. 8 1.2.7 Dendritische Zellen und Viren ...................................................... 10 1.2.8 Immunologie des atopischen Asthma bronchiale ......................... 11 1.2.3 1.3 Fragestellung ........................................................................................... 12 2. PROBANDEN, MATERIAL UND METHODEN 2.1 Probanden 2.1.1 Blutspender ................................................................................... 16 2.1.2 Asthmatiker und Kontrollgruppe .................................................. 17 2.2 Materialien 2.2.1 Labormaterialien und Geräte ......................................................... 19 2.2.2 Reagenzien .................................................................................... 20 2.2.3 Antikörper ..................................................................................... 22 2.3 Methoden 2.3.1 Trennen der peripheren mononukleären Zellen aus Blut .............. 24 2.3.2 Etablieren der Sortierung von dendritischen Zellen ...................... 25 2.3.3 Reinheitskontrolle im Durchflußzytometer .................................. 26 2.3.4 Kultivieren und Stimulation der angereicherten dendritischen Zellen ...................................................................... 28 2.3.5 RSV Infektion der dendritischen Zellen ....................................... 29 2.3.6 Funktionelle Stimulation mittels Anti-CD40 Antikörper ............. 29 2.3.7 T-Zellproliferationsmessung mit Co-Stimulation dendritischer Zellen und Monozyten in gemischter Lymphozytenkultur ........... 30 Etablieren der durchflußzytometrischen Identifikation von unsortierten dendritischen Zellen in mononukleären Zellen ......... 31 2.3.8 3. ERGEBNISSE 3.1 CD4+ dendritische Zellen sind aus peripherem Blut von Erwachsenen isolierbar ...................................................................... 3.2 3.2.1 34 Verhalten der dendritischen Zellen bei unterschiedlicher infektassoziierter Stimulation Dendritische Zellen aus peripherem Blut vermehren sich in der verwendeten Zellkultur nicht ....................................... 36 3.2.2 Morphologie der dendritischen Zellen .......................................... 36 3.2.3 Sortierte CD4+ dendritische Zellen brauchen in Kultur GM-CSF ........................................................................ 37 Tumornekrosefaktor-α ist der stärkste Reiz für die Expression des Reifemarkers CD83 .................................. 39 3.2.5 Konzentrations-Wirkungsverhältnis von TNF-α .......................... 40 3.2.6 Dendritische Zellen sind mittels CD40-Ligand-Simulation stimulierbar ................................................................................... 41 Infektion dendritischer Zellen mit dem RS-Virus ......................... 42 3.2.4 3.2.7 3.3 3.3.1 3.3.2 3.4 3.5 3.6 In unsortierten mononukleären Zellen aus peripherem Blut können dendritische Zellen isoliert mit Livegate untersucht werden .................... 44 Anzahl der dendritischen Zellen im Livegate bei unterschiedlicher Stimulation .................................................. 44 Expression von CD83 auf dendritischen Zellen im PBMC-Livegate ....................................................................... 46 Nach Stimulation sind verschiedene Reifestadien von dendritischen Zellen zu unterscheiden ...................................................... 51 CD4+ dendritische Zellen stimulieren naive CD45RA+ T-Zellen um ein Vielfaches von Monozyten ............................................ 55 Etablieren der Anwendbarkeit der Methoden auf klinische Studien an Asthmatikern ........................................................................... 57 4. DISKUSSION .......................................................................................... 62 - Die Methode der Isolation entscheidet über die Art der dendritischen Zellen in vitro .................................................................. 63 Wie kann eine Einteilung in myeloide und und lymphoide dendritische Zellen erfolgen? ........................................................ 67 Wieviele dendritische Zellen sind im peripheren Blut zu erwarten und wie können die unterschiedlichen Werte erklärt werden? ............................................................................. 72 Wie unterscheiden sich sortierte von im Durchflußzytometer aus PBMC identifizierten dendritischen Zellen? .......................... 73 Wie verhalten sich dendritische Zellen in Kultur mit mononukleären Zellen?.................................................................. 76 - Stimulierbarkeit – eine Möglichkeit der funktionellen Charakterisierung der dendritischen Zellen ......................................... 79 CD4+ dendritische Zellen des peripheren Blutes und GM-CSF ... 79 CD4+ dendritische Zellen des peripheren Blutes und TNF-α ...... 82 RSV Infektion und CD40 Stimulation, exogener versus endogener Reiz? ................................................. 85 - Ausreifung und Schritte einer Differenzierung der CD4+ dendritischen Zellen aus peripherem Blut ............................................ 87 CD83 als Reifemarker der dendritischen Zellen ........................... 88 Veränderung von Größe und Granularität der CD4+ dendritischen Zellen ........................................................... 90 - Ist es denkbar, daß CD4+ dendritische Zellen in der Pathogenese des atopischen Asthma bronchiale eine Rolle spielen? ........................ 91 - Schlußfolgerung und Ausblick ............................................................. 93 5. ZUSAMMENFASSUNG ........................................................................ 94 6. LITERATURVERZEICHNIS .................................................................. 7. ANHANG ................................................................................................. 108 95 Verzeichnis der im Text verwendeten Abkürzungen∗ : APC antigen presenting cells B71 entspricht CD80, Expression auf B-Lymphozyten und dendritischen Zellen. B72 entspricht CD86, wird exprimiert auf Monozyten, aktivierten B-Lymphozyten und dendritischen Zellen. BSA bovines Serumalbumin CD-.. Cluster of differentiation CD3 T-Zellmarker CD4 Expression auf T-Helferzellen CD8 Expression auf zytotoxischen T-Zellen CD11b αM Untereinheit des Integrins CR3 (mit CD18); bindet an CD54 CD11c αX Untereinheit des Integrins CR4 (mit CD18); bindet Fibrinogen CD13 Expression auf myelomonozytischen Zellen CD14 Expression auf Monozyten CD16 Expression auf NK-Zellen und neutrophilen Granulozyten CD19 Expression auf B-Lymphozyten CD20 Expression auf B-Lymphozyten CD33 Expression auf myeloiden hämatopoetischen Vorläuferzellen CD34 Expression auf hämatopoetischen Stammzellen CD45RA Marker auf naiven T-Zellen CD54 ICAM1 CD56 Expression auf NK-Zellen CD80 B71 CD83 Expression auf dendritischen Zellen CD86 B72 CD95 Fas CD115 M-CSF Rezeptor CD123 IL-3-Rezeptor α-Kette c-fms M-CSF Rezeptor und entspricht CD115 cpm counts per minute ∗ Die Erklärungen der Abkürzungen sind entnommen aus Charles A. Janeway et al. Immunobiology, erschienen in der vierten Auflage bei Current Biology Publications, London 1999. DC dendritische Zellen EDTA ethylene diamine tetraacetic acid FACS Fluoreszent assoziated cell sorter (Durchflußzytometer) FasL entspricht CD95L; TNF-verwandtes Molekül auf zytotoxischen T-Zellen, das Apoptose in CD95+ Zellen auslöst FCS fetal calf serum F-Protein fusion proteine FITC Fluorescein- isothiocyanat FSC Forward scatter (Vorwärtsstreulicht im Durchflußzytometer) G-CSF Granulocyte colony stimulating factor GM-CSF Granulocyte macrophage colony stimulating factor HIV human immundeficiency virus HLA Humanes Leukozyten Antigen HLA-DR entspricht MHC-II ICAM Intercellular adhesion molecule (Interaktion mit LFA1 ), ICAM1 = CD54 IL- Interleukin INF Interferon LFA Lymphocyte function-associated antigens LPS Lipopolysacharid MCM Monocyte-conditioned-medium MCP Membrane cofactor protein, ein Cofaktor bei der Spaltung von C3b M-CSF Macrophage colony stimulating factor MHC Major histocompatibility complex MIP Chemokin, wirkt chemotaktisch auf CD8-T-Lymphozyten mRNA messenger Ribonukleinsäure NK natural killer cells PAF Platelet aggregating factor PBMC Peripheral blood mononuclear cells PE Phycoerythrin PGD2 Prostaglandin D2 PMA Phorbol-Myristat-Acetat Rantes Chemokin, wirkt chemotaktisch auf CD4-T-Gedächtniszellen RSV Respiratory syncytial virus SSC Sideward scatter (Seitwärtsstreulicht im Durchflußzytometer) TCRα/β T cell receptor α/β TGF Transforming growth factor TH1/2 T-Helfer-Lymphozyten TNF-α Tumornekrosefaktor alpha TRAFs TNF receptor associated factors 1. EINLEITUNG 1.1 Historisches Dendritische Zellen haben ihren Namen durch ihre auffallende Morphologie erhalten. Sie sind spezialisierte Zellen für Antigenaufnahme, Antigenprozessierung, Migration und T-Zellstimulation. Sie initiieren die primäre T-zellabhängige Immunantwort. Als Langerhans-Zellen wurden sie schon 1868 von dem Pathologen Paul Langerhans beschrieben. Vor weniger als 30 Jahren begann die Charakterisierung der dendritischen Zellen. 1973 veröffentlichte Ralph M. Steinmann et al. von der Rockefeller University New York die erste von einer ganzen Reihe an grundlegenden Arbeiten über dendritische Zellen (84). Zuvor waren dendritische Zellen, ohne Wissen über ihre Funktion, beispielsweise als Langerhans-Zellen der Haut oder morphologisch in Lymphorganen beschrieben worden. Erst nach und nach wurde die enorme Wichtigkeit der dendritischen Zellen für die Funktion des menschlichen Immunsystems erkannt. Sie gelten als essentiell für eine primäre und sekundäre physiologische Immunantwort. 1991 veröffentlichte R. M. Steinman eine umfassende Zusammenfassung der Funktion von dendritischen Zellen (86). Seitdem wird sowohl an den Grundlagen als auch – besonders in letzter Zeit – an den Möglichkeiten der klinischen Verwendung in den Bereichen der Infektiologie, Allergologie, Transplantationsmedizin und Onkologie geforscht. Mit dem erweiterten Wissen über die dendritischen Zellen zeigt sich immer mehr ihre zentrale Rolle in der Kontrolle der Immunität des menschlichen Körpers, die sich auf vier Funktionen erstreckt (4): • Die Funktion des Immun-Wächters mit Verteilung der dendritischen Zellen im Körper, Antigenaufnahme, folgender Migration in Lymphorgane und Induktion der klonalen Selektion von CD4+ und CD8+ T-Zellen. • Initiatoren der Immunantwort mit Stimulation naiver und Gedächtnis-B- und TZellen. • Verstärker der Immunantwort, durch die Fähigkeit mit wenig Antigen bei wenigen dendritischen Zellen eine starke T-Zellantwort hervorzurufen. • Induktion von immunologischer Toleranz. -1- 1.2 Hintergrund und Problemstellung 1.2.1 Möglichkeiten der Isolation von dendritischen Zellen Es gibt verschiedene Methoden dendritische Zellen zu isolieren. Die Isolation leitet sich von den Grundlagen des Ursprungs und der Differenzierung von dendritischen Zellen ab.1 In der vorliegenden Arbeit sollen dendritische Zellen aus venösem Blut innerhalb weniger Stunden nach Blutentnahme untersucht werden. Die Tatsache, daß dendritische Zellen bzw. deren Vorläufer im peripheren Blut sind, ist noch nicht lange bekannt. O’Doherty und Steinman et al. konnten zeigen, daß dendritische Zellen im peripheren Blut nachweisbar sind (51) und ein spezifisches Antigenmuster besitzen: Sie exprimieren CD4 und HLA-DR (MHC-II) und sind negativ für die spezifischen Marker der anderen Zellreihen wie CD3 für T-Lymphozyten, CD14 für Monozyten, CD19 oder CD20 für B-Lymphozyten und CD56 für NK-Zellen (24). Aus diesen beiden Voraussetzungen ergeben sich die in der vorliegenden Arbeit verwendeten Isolationsmethoden. Zum einen ist dies eine paramagnetische Sortierung und zum anderen eine direkte durchflußzytometrische Identifizierung der dendritischen Zellen. Die Methode, mit monoklonalen paramagnetischen Antikörpern Zellen mittels Sortierung zu isolieren, ist schon seit einiger Zeit bekannt und wird breit angewendet. Sie soll in der vorliegenden Arbeit in Bezug auf dendritische Zellen aus Blut überprüft werden. Die bisher gängigen Isolationsmethoden von dendritischen Zellen aus Blut verwendeten verschiedene Kulturschritte als Teil der Isolation, wodurch der Zustand der dendritischen Zellen zum Zeitpunkt der Blutabnahme unbekannt war, da die Kulturschritte die Zellen verändern. Die lange Zeit klassische Methode zur Gewinnung von dendritischen Zellen war die Depletion von T-Zellen und adhärenten Zellen und folgende Dichtezentrifugation (92). Neuere Methoden versuchen trotz der niedrigen Zellzahlen dendritische Zellen direkt aus peripherem Blut zu isolieren und die Zwischenschritte in Kultur zu reduzieren. Ihnen ist gemeinsam, daß sie auf das Muster der Oberflächenmarker dendritischer Zellen aufbauen (72). Im Vordergrund steht bei 1 siehe Abschnitt 1.2.2 -2- neueren Methoden die klinische Anwendbarkeit. Der Ersatz von fetalem Kälberserum durch humanes Plasma brachte eine klinische Anwendung näher (7), ebenso der Einsatz der Leukopherese (94). Häufig in der Literatur erwähnte Isolationsmethoden generieren dendritische Zellen zum einen aus Vorläuferzellen – z.B. CD34+ Stammzellen aus Nabelschnurblut – durch in vitro Anzüchtung und Differenzierung (91) oder durch Transformation aus Monozyten mittels GM-CSF und IL-4 in Kultur (104). Eine Kombination von Isolation und Differenzierung in Kultur aus Vorläuferzellen des Blutes machte es möglich, dendritische Zellen zu isolieren, die CD83 exprimieren und damit als ausgereift gelten. Es stellt sich nun die Frage, inwieweit die beiden Methoden (Sortierung und durchflußzytometrische Identifizierung) untereinander und mit den in der Literatur verwendeten Methoden vergleichbar sind. Isolieren sie die identischen Zellen? Und welche Zellzahlen von dendritischen Zellen ergeben sich jeweils mit ihnen? 1.2.2 Ursprung und Differenzierung von dendritischen Zellen Dendritische Zellen stammen von hämatopoetischen Zellen aus dem Knochenmark. Sie entwickeln sich in verschiedene Gruppen des dendritischen Zellsystems, das man interstitielle dendritische grob unterteilen Zellen und kann in lymphoide Langerhans-Zellen, dendritische myeloide Zellen. Ihre Vorläuferzellen werden über das Blut ausgeschwemmt und gelangen in nichtlymphatische, periphere Gewebe, wo sie zu den sogenannten „unreifen“ dendritischen Zellen (immature DC) heranreifen. Diese Zellen haben eine geringe Fähigkeit zur TZellstimulation, aber eine hohe Kapazität, Antigene aufzunehmen und zu prozessieren, d.h. Antigene intrazellulär in Lysosomen zu verdauen und mit MHC-II zusammen zur Zelloberfläche zu transportieren. Entzündungsmediatoren fördern nun die Ausreifung und Migration aus dem Gewebe in das Blut oder afferente Lymphbahnen. Diese migratorischen Zellen erreichen sekundäre Lymphorgane, wo sie in T-Zellregionen – also hauptsächlich in der parakortikalen Zone von Lymphknoten – sich ansiedeln. In -3- diesem Stadium werden sie als „reife“ dendritische Zellen bezeichnet. Sie können nur noch in geringem Maße Antigen aufnehmen, haben aber eine stark erhöhte Fähigkeit TZellen zu stimulieren. Reife dendritische Zellen präsentieren naiven T-Zellen oder TGedächtniszellen Antigen, welches sie im peripheren Gewebe aufgenommen haben. Ihnen wird sowohl eine „Filter“- als auch eine „Verstärkerfunktion“ in der Immunantwort zugeschrieben. Sie sind sozusagen sensible Organe des Immunsystems, welche die antigene Integrität der Individualität bewahren. Sie werden daher als „Wächter“ im Immunsystem bezeichnet (86). Eine Unterscheidung zwischen myeloiden und lymphoiden dendritischen Zellen ist nur anhand mehrerer Parameter möglich, wie z.B. Oberflächenmarker und der Fähigkeit, sich in andere Zellreihen umzudifferenzieren. Im Knochenmark und im peripheren Blut wurden proliferierende Vorläuferzellen gefunden, welche zu Granulozyten, Makrophagen und dendritischen Zellen ausdifferenzieren können (33). Humane hämatopoetische CD34+ Stammzellen aus Nabelschnurblut werden in Kultur mit GM-CSF und TNF-α zu einer gemischten Zellpopulation mit verschiedenen Arten dendritischer Zellen der myeloiden Zellreihe (12, 14). Frühzeitig (fünfter Tag der Kultur) können Untergruppen unterschieden werden, die entweder CD1a oder CD14 auf ihrer Zelloberfläche exprimieren. Beide Vorstufen reifen bis zum zwölften Tag aus – erstere zu epidermalen Langerhanszellen (CD1a+, Birbeckgranula+, Lag-antigen+ und E-cadherin+), letztere zu CD14- myeloiden dendritischen Zellen (CD1a+, CD2+, CD9+, CD68+ und Faktor XIIIa+). Die CD14+ Vorstufen können aber auch mit M-CSF noch zu Makrophagen ausdifferenzieren (33, 90). Myeloide dendritische Zellen können sich ebenfalls aus CD14+ Monozyten des peripheren Blutes mit GM-CSF und Interleukin-4 entwickeln. Aus Monozyten entstehen aber nicht verschiedene Untergruppen sondern annähernd homogene Populationen noch unreifer dendritischer Zellen mit der Expression von CD14 niedrig+, CD115(= c-fms)+, CD1+, MHC-II niedrig+, CD86 niedrig+ (entspricht B72 ), CD54 niedrig+ (ICAM-1) und Makropinozytose+. Sie behalten aber die Fähigkeit (M-CSF-Rezeptor) sich zu Makrophagen zu entwickeln. Diese Entzündungsmediatoren wie TNF-α, dendritischen Zellen können, durch Interleukin-1 oder Lipopolysacharid induziert, -4- ausreifen – CD14-, MHC-II hoch+, CD115-, CD86 hoch+, CD54 hoch+, Makropinozytose-negativ(104, 58).2 Dendritische Zellen der lymphoiden Zellreihe bzw. deren Vorstufen können aus dem peripheren Blut (9), dem Thymus (76), Milz oder Lymphgewebe (35) gewonnen werden. Es wird angenommen, daß Lymphozyten und dendritische Zellen ebenfalls eine gemeinsame Vorläuferzelle haben. Im menschlichen Thymus und Knochenmark wurden Zellen identifiziert, die sich sowohl in Lymphozyten als auch in dendritische Zellen (FasL+, CD4+ bei Menschen und CD8+ bei der Maus) entwickeln können (2), sogar ohne die Anwesenheit von GM-CSF in Kultur (76). Diese lymphoiden CD8+ dendritischen Zellen haben, im Gegensatz zu den CD8-, einen suppressiven Effekt auf T-Zellen und können über FasL Apoptose in den korrespondierenden T-Zellen induzieren (89). Reife humane lymphoide dendritische Zellen konnten jedoch bisher in vivo nicht identifiziert werden (6). Um welche Art dendritischer Zellen es sich in der vorliegenden Arbeit handelt, ist bisher nicht klar. Denn es ist noch nicht genau bekannt, welche dendritische Zellen sich im peripheren Blut befinden und in welchen Stadien. Anhand der Unterscheidung zwischen reifen oder unreifen und myeloiden oder lymphoiden dendritischen Zellen stellen sich für die vorliegende Arbeit die Fragen: Was für dendritische Zellen sind nun die CD4+ dendritischen Zellen im peripheren Blut? Wie ist die Expression von Reifemarkern von z.B. CD83? Zu welcher Zellreihe können sie gerechnet werden? 1.2.3 Antigenaufnahme, -prozessierung und -präsentation von dendritischen Zellen Für die vorliegende Arbeit sind der Kontakt und die Präsentation von Antigen von Bedeutung, da sie mit der Entwicklung von dendritischen Zellen zusammenhängen. Unreife dendritische Zellen haben eine hohe endozytotische Aktivität, durch die sie verschiedenste 2 Antigene aufnehmen, prozessieren Siehe auch Abschnitt 1.2.1 -5- und auf MHC-II Molekülen präsentieren können. Sie können unspezifisch mittels Makropinozytose große Mengen Flüssigkeit aufnehmen und konzentrieren und spezifisch mittels Rezeptoren (FcγRI, FcγRII, FcεRI, FcεRII und Manoserezeptor) IgG- und IgE-Immunkomplexe und manosylierte Antigene Antigenprozessierung aufnehmen dendritischer (74). Zellen Eine resultiert andere in der Möglichkeit Aufnahme der exogenen Antigens in das Cytosol und der Präsentation auf MHC-I Molekülen (64). Zwischen der Aufnahme und Präsentation von Antigen wandern dendritische Zellen in T-zellabhängige Areale der Lymphknoten und reifen aus. Ausreifung und Migration werden stimuliert durch Entzündungsmediatoren, Viren und Bakterienprodukte. Systemische Gabe von TNF-α, IL-1 und LPS induziert eine Verminderung von dendritischen Zellen in nichtlymphatischen Geweben und eine Migration in Lymphknoten (68). Währenddessen erhöht sich die Anzahl von Oberflächen-MHC-II-Molekülen in 24 Stunden um ein Vierfaches, adhäsions- und kostimulatorische Moleküle nehmen zu und Endozytose nimmt ab. 1.2.4 Rekrutierung und Migration Die Fähigkeit der Rekrutierung und Migration ist für diese Arbeit von entscheidender Wichtigkeit, da von beiden Prozessen abhängt, welche und wieviele dendritische Zellen sich im peripheren Blut befinden. Entscheidend für die Bewegung innerhalb des Körpers ist der Reifegrad der dendritischen Zellen. So resultiert der Reifungsprozeß zum Beispiel in einer dramatischen Zunahme des Zytoskelettes und der Motilität (100). Rekrutierung dendritischer Zellen aus Blut in Gewebe kann in Lunge und Leber beobachtet werden. Abhängig von der verwendeten Methode und der Lokalisation der Antigenapplikation, sind verschiedene Möglichkeiten der Rekrutierung von dendritischen Zellen bekannt. Zum Beispiel findet nach Inhalation von Bakterien eine schnelle Rekrutierung von Vorstufen dendritischer Zellen in das Bronchialepithel statt, wo sie ausreifen und im folgenden in die regionalen Lymphknoten wandern (47). Nach -6- intravenöser Injektion innerter Partikel können in der Lymphe der Leber partikelbeladene dendritische Zellen gefunden werden (46). Im Magendarmtrakt werden Antigene in die Peyerschen Plaques aufgenommen. Direkt unter den spezialisierten Epithelzellen finden sich unreife dendritische Zellen, welche nach Antigenaufnahme in die T-Zellregionen derselben Peyerschen Plaques oder regionalen Lymphknoten wandern (37). Nicht zuletzt wurden T-zellstimulierende dendritische Zellen in Keimzentren von Lymphknoten gefunden, die aus dem peripheren Blut stammen (28). Im peripheren Blut sind dendritische Zellen übergangsweise und in unbekannter Menge. In der vorliegenden Arbeit soll u.a. bestimmt werden, wieviele der mononukleären Zellen im Blut CD4+ dendritische Zellen sind. 1.2.5 Dendritische Zellen und Lymphozyten Die T-zellvermittelte Immunität nach erstmaligem Antigenkontakt beruht auf der Ausdifferenzierung und Proliferation (klonale Expansion) von naiven T-Zellen zu aktivierten T-Effektorzellen. Dazu benötigen sie professionelle antigenpräsentierende Zellen (APC), deren wichtigste Subpopulation die dendritischen Zellen sind. Antigene (Peptide) werden entweder auf MHC-Klasse-I-Molekülen präsentiert, wo sie von naiven CD8+ T-Zellen erkannt werden, die sich dann in cytotoxische T-Effektorzellen umwandeln, oder auf MHC-II-Molekülen, wo sie von CD4+ T-Zellen erkannt werden, die sich dann entweder zu T-Helfer-1 oder –2 Zellen entwickeln, am häufigsten jedoch zu beiden Zelltypen. Die spezielle Fähigkeit dendritischer Zellen bei der T-Zellaktivierung hängt zusammen mit der Expression einerseits von Adhäsionsmolekülen CD54 (intercellular adhesion molecule 1), CD11a (LFA-1), CD58 (LFA-3) und Neuraminsäure, welche die Clusterbildung unterstützen und die T-Zellrezeptorverbindungen verstärken und andererseits vor allem von den costimulierenden Molekülen B7-Moleküle, entsprechen CD80 und CD86 (82, 97). Diese gehen Verbindung ein mit CD28 auf Seiten der TZellen und sind neben MHC-Molekülen und CD4- oder CD8-Korezeptoren essentiell -7- für die Stimulation von naiven T-Zellen (41). Sie kommen in dieser Kombination nur auf professionellen APC´s vor, das heißt im wesentlichen auf dendritischen Zellen. Dies wird als Grund dafür angenommen, daß dendritische Zellen essentiell für die Entstehung von zellulärem immunologischen Gedächtnis sind. Anhand dieser einzigartigen T-zellstimulierenden Kapazität soll in Zellkulturen mit naiven T-Zellen aus Nabelschnurblut in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden, ob es sich bei den isolierten CD4+ Zellen um typische dendritische Zellen handelt. Eine ganz anders geartete Interaktion ist die Wirkung von T-Zellen auf dendritische Zellen. Indem sie dendritische Zellen aktivieren, erhöhen sie wiederum die T-Zell-Stimulation. Dies geschieht mittels CD40-Ligand, worüber T-Zellen die Lebensfähigkeit dendritischer Zellen (13, 42) erhöhen und ihre Ausreifung induzieren (74). Dendritische Zellen können durch IL-12 Produktion die Bildung von Th1-Zellen induzieren (43); der CD40-Ligand ist ein selektiver und starker Stimulus für die IL-12 Produktion in dendritischen Zellen (15, 38). Inwieweit CD40 auch auf die Expression von Reifemarkern (CD83) Einfluß hat, soll in der vorliegenden Arbeit gezeigt werden. Von den hier beschriebenen dendritischen Zellen unterscheiden sich die follikulären dendritischen Zellen die in den B-Zellregionen der Lymphknoten zu finden sind und dort in Interaktion mit B-Lymphozyten treten (6). 1.2.6 Dendritische Zellen und Zytokine Die beiden wichtigsten Zytokine in den vorliegenden Experimenten sind GMCSF (granulocyte-macrophage-colony stimulating factor) und TNF-α (Tumornekrosefaktor). Beide werden gebildet in Makrophagen und T-Lymphozyten, im wesentlichen in CD4+ Th1 Zellen, also denjenigen T-Helferzellen, welche maßgeblich gegen intrazelluläre Infektionen mit Viren gerichtet sind. GM-CSF wird außerdem noch in Fibroblasten, Mastzellen und einigen Endothelzellen gebildet. Das für die dendritischen Zellen entscheidende GM-CSF wird von Gewebezellen gebildet, da die -8- Aktivierung der dendritischen Zellen durch GM-CSF im Gewebe stattfindet (6, 4). Seine Funktion besteht zum einen in der Aktivierung von Makrophagen, neutrophilenund eosinophilen Granulozyten und der Regulation chronisch entzündlicher Reaktionen. Zum anderen regt er in der Hämatopoese pluripotente Stammzellen an, sich in myeloische Zellen zu differenzieren. In vitro regt GM-CSF u.a. das Wachstum von Granulozyten- und Makrophagenkulturen an (11, 26). Von TNF-α sind unterschiedliche Funktionen bekannt. Die wichtigsten sind Aktivierung von Neutrophilen und Monozyten durch T-Zellen in der akuten Entzündungsreaktion; weitere Funktionen sind Induktion – zusammen mit Interleukin-1 – von Chemotaxis und weiteren Entzündungsmediatoren (INF-γ, TNF-α, Il-1, GM-CSF, Il-6, ) und Akutphaseproteinen (11, 26). Dendritische Zellen selbst können ein breites Spektrum an Zytokinen exprimieren. Die typischen Zytokine sind IL-6 und IL-12 (16). Ruhende CD83+ dendritische Zellen exprimieren mRNA von IL-6, IL-8, IL-10, TNF-α- und TGF-β. Mit PMA aktivierte CD83+ dendritische Zellen exprimierten mRNA für IL-1, IL-9, TNF-β, INF-γ, GM-CSF, M-CSF und G-CSF (103). Daraus sind unterschiedliche Mediatorenwirkungen ersichtlich. Zum einen sind CD83+ dendritische Zellen dadurch wichtige Regulatoren für das Wachstum und die Differenzierung von T-Lymphozyten (IL-1, IL-6, TNF-α, TNF-β und TGF-β) sowie die Ausreifung und Aktivierung von BLymphozyten (u.a. IL-1). Zum anderen sind sie in das Wachstum und die Aktivierung von Monozyten involviert (M-CSF, GM-CSF, IL-1, TNF-α und TNF-β). Zusätzlich können aktivierte und ruhende CD83+ dendritische Zellen eine Reihe von Chemokinen synthetisieren, u.a. IL-8, I-309, MCP-1, MIP-1 und Rantes (103) und damit die Migration neutrophiler Granulozyten und mononukleärer Phagozyten zum Entzündungsort auslösen. Nicht zuletzt stimulieren CD83+ dendritische Zellen sich auch selbst (GM-CSF und TNF-α) und exprimieren dementsprechend Rezeptoren. Besonders stark ist die Expression des GM-CSF-Rezeptors (103). -9- Für diese Arbeit stellen sich die Fragen: Wie ist die Reagibilität der CD4+ dendritischen Zellen auf TNF-α und GM-CSF? Wie reagieren sie im Gegensatz dazu auf LPS, E.coli-DNA oder ds-RNA? Wie verhalten sie sich in Kultur mit mononukleären Zellen und wie unterscheiden diese sich von reinen CD4+ dendritischen Zellen in Kultur? Der Reifemarker CD83 ist die variable Größe zur Beantwortung der Fragen. CD83 ist ein Molekül der Immunglobulinsuperfamilie und ein spezifischer Oberflächenmarker für dendritische Zellen und wird speziell auf reifen dendritischen Zellen exprimiert (102). 1.2.7 Dendritische Zellen und Viren Dendritischen Zellen wird eine zentrale Rolle in der angeborenen unspezifischen Immunantwort auf virale Infektionen zugedacht. Bei Infektionen mit beispielsweise HIV-1 produzieren sie 60 mal so viel INF-α wie Monozyten. T-Lymphozyten und NKZellen produzieren kein INF-α und B-Lymphozyten nur vergleichsweise sehr wenig bei Infektion mit HIV-1 (22), was die Bedeutung der dendritischen Zellen hervorhebt. Es war schon länger bekannt gewesen, daß HLA-DR+ und CD4+ Zellen bei den unterschiedlichsten Virusinfektionen INF-α produzieren, wie z.B. Herpes simplex Virus-1, Cytomegalievirus, u.a. (22, 6) ohne zu wissen, daß es sich um dendritische Zellen handelte. Die meisten Viren induzieren keine MHC-II- und costimulierende Moleküle auf Makrophagen, oft jedoch auf dendritischen Zellen. Diese können, im Gegensatz zu den meisten anderen Zellen, von vielen verschiedenen Viren infiziert werden und virale Peptide auf MHC-I und/oder –II präsentieren. Im Zytosol gebildete virale Proteine werden an MHC-I-Moleküle gebunden zur Oberfläche transportiert. Virale Proteine im endoplasmatischen Retikulum, wie zum Beispiel Hüllproteine, können über Endosomen an MHC-II-Moleküle gebunden zur Zelloberfläche gelangen. Die hier verwendeten RS Viren (respiratory syncytial virus) sind RNA-Viren und gehören zu den Paramyxoviridae. Ihre Replikation ist auf das Zytoplasma - 10 - infizierter Zellen beschränkt. Das Nukleocapsid ist eine symmetrische Helix. Es ist von einer Lipiddoppelmembran umgeben und besteht aus einem nichtsegmentierten, negativen RNA-Strang. Die Oberflächenpikes bestehen aus G-Protein und F-Protein, das eine Fusion der Wirtszellen zu Synzytien verursacht (32). Bei Infektion mit RSV werden zwar neutralisierende Antikörper gebildet, aber erst die zellvermittelte Immunität begrenzt die Infektion. Beispielsweise weiß man schon seit längerem, daß bei Kindern ohne zellvermittelte Immunität RSV noch nach Monaten nach der Infektion über die Lunge ausgeschieden wird – normal wären 1-3 Wochen (23). Ebenfalls schon in mehreren älteren Studien zeigte sich ein erster möglicher Zusammenhang zwischen RSV und Atopie bzw. obstruktiven Lungenerkrankungen. Bei atopischen Kindern wurden IgE Antikörper gegen RSV beschrieben, welche die Infektion in eine allergische Infektion konvertieren (99). Gleichlautende Ergebnisse wurden von anderen Arbeitsgruppen jedoch seitdem nicht veröffentlicht. Eine andere Möglichkeit, wie RSV in die Genese einer bronchialen Hypereagibilität eingreifen kann, wird in einer Th-2-dominierten Immunantwort beschrieben mit einem zugunsten von IL-4 verschobenen IL-4 / INF-γ Verhältnis (70). Ebenfalls wird die Bedeutung von CD8+ T-Lymphozyten (78) und IL-5 (79) für Entwicklung der bronchialen Hyperreagibilität und die Invasion von Eosinophilen in das Lungeninterstitium nach RSV-Infektion hervorgehoben. RSV hat nicht zuletzt immunmodulierende Eigenschaften, wie die Freisetzung von Interleukinen, Leukotrienen und Chemokinen bei einer RSV-Infektion zeigt (31, 81). In der vorliegenden Arbeit soll gezeigt werden, ob die CD4+ dendritischen Zellen des peripheren Blutes überhaupt von RSV infiziert werden können und welche Auswirkungen die in vitro Infektion von dendritischen Zellen mit RSV auf deren Vitalität in Kultur und die Expression von CD83 hat. - 11 - 1.2.8 Immunologie des atopischen Asthma bronchiale Asthma bronchiale ist eine chronische Entzündung der Atemwege auf dem Boden einer Hyperreagibilität. Es ist definiert als eine rezidivierende, vorwiegend anfallsweise auftretende, reversible Atemwegsobstruktion. Die Immunhistopathologie zeigt abgeschilfertes Alveolarepithel, Kollagenablagerung an der Basalmembran und Infiltration mit neutrophilen-, eosinophilen Granulozyten und Th2-ähnlichen Lymphozyten. Als Atopie wird die genetische Prädisposition für die Entwicklung von IgE-vermittelten Hypersensitivitätsreaktionen bezeichnet (50). Die für die Entstehung eines Asthma entscheidenden Antigene werden über den Respirationstrakt aufgenommen. Nach einem Primärkontakt kommt es bei erneutem Allergenkontakt zu einer Ig-E vermittelten Hypersensitivitätsrektion (Typ I). Antigenpräsentation führt zur Stimulation von IL-4, IL-5 und GM-CSF – ein typisches Zytokinmuster für Th2 Zellen – welche die IgE-Produktion und Eosinophilie verstärken (69). Die allergenspezifischen IgE binden sich an Fc-Rezeptoren auf Mastzellen und basophilen Leukozyten. Bei dem erneuten Kontakt mit dem Allergen kommt es zur Vernetzung der IgE-Moleküle auf Mastzellen und es werden eine Reihe von Mediatoren freigesetzt. Davon wirken Histamin, PAF, LTC4 und PGD2 fast unmittelbar (Sekunden), so daß es zu Bronchokonstriktion und Hypersekretion kommt. Nach 3-8 Stunden kommt es zur Spätreaktion mit Bronchusobstruktion, die hauptsächlich durch Schleimhautödem Zellinfiltration und Schleim bedingt ist (8). Zusätzlich nehmen nervale Amplifikationssysteme Einfluß auf die Chronifizierung der Entzündung. Epidemiologische Studien haben gezeigt, daß kindliche Luftwegsinfektionen mit Viren ein Risikofaktor für die spätere Entwicklung eines chronischen Asthma bronchiale sind (31). Die Anzahl der dendritischen Zellen in Luftwegen von Asthmatikern ist signifikant höher als bei Gesunden (96). Sind nun im peripheren Blut von Asthmatikern die CD4+ dendritischen Zellen vermehrt? Und unterscheiden sie sich von denen gesunder Probanden? - 12 - 1.3 Fragestellung Blut wird für dendritische Zellen als Übergangsmedium angenommen. Venöses Blut ist einfach zugänglich und die Methode der paramagnetischen Sortierung von Zellen bietet neue Möglichkeiten der Isolation. Sie soll in der vorliegenden Arbeit auf dendritische Zellen angewendet werden. Angesichts ihrer geringen Anzahl im Blut, stellt sich die Frage, ob die CD4+ dendritischen Zellen aus venösem Blut von Erwachsenen mittels Sortierung direkt isolierbar sind? Und wieviele dendritische Zellen können mit dieser Methode im Blut gefunden werden? Voraussetzung für weitere Experimente ist die Beantwortung der Frage, ob diese Zellen denn auch dendritische Zellen sind? Ob sie der Morphologie von dendritischen Zellen entsprechen und ob sie sich so verhalten, wie man es von dendritischen Zellen erwarten würde. Können sie in einer gemischten Lymphozytenkultur maximal stimulierend auf naive T-Zellen wirken? Bei dem Entstehen von Immunität wird dendritischen Zellen eine essentielle Rolle beigemessen. Die Entwicklung bzw. Reifung des Immunsystems im Kindes- bzw. Säuglingsalter kann nur in kleinen Mengen Blutes untersucht werden. Besonders für die Untersuchung der wenigen dendritischen Zellen im peripheren Blut müssen neue „materialsparende“ Methoden entwickelt werden. Eine in der vorliegenden Arbeit untersuchte Möglichkeit ist, dendritische Zellen durchflußzytometrisch zu identifizieren und zu untersuchen. Damit wird sich die Möglichkeit ergeben, die Bedeutung der dendritischen Zellen bei immunologischen Erkrankungen des Kindesalters zu untersuchen. Dafür ist wichtig, wieviel Blut für die Untersuchung nötig sein wird und wie sich eventuell die so untersuchten Zellen von den sortierten Zellen unterscheiden. Dendritische Zellen werden als komplexes System verstanden. Anhand der Einund Ausschlußkriterien der verwendeten Isolationsmethoden sollen die isolierten Zellen in das dendritische Zellsystem eingeordnet und mit den in der Literatur beschriebenen dendritischen Zellen verglichen werden: Gehören sie also eher zur lymphoiden oder myeloiden Zellreihe? Und können sie eher als reife oder unreife dendritische Zellen gelten? In der Literatur werden für die Reifebestimmung unter anderem die Morphologie, die erwähnte T-zellstimulierende Kapazität, die Endozytosemessung und die Expression von CD83 auf dendritischen Zellen genannt. In der vorliegenden Arbeit wird neben der gemischten Lymphozytenkultur CD83 die häufigste Variable sein. - 13 - Ein nächster Schritt in der Fragestellung ist, was für Eigenschaften diese sortierten dendritischen Zellen haben. Durch die Auswirkungen von Mediatorsubstanzen auf die Zellen kann die Reagibilität und damit Funktionen in der Immunität beschreibbar werden. Dabei sollen bei einem Entzündungsvorgang typischerweise in ihrer Konzentration erhöhte Mediatoren verwendet werden. Die sich nun ergebende Fragestellung ist, wie diese CD4+ dendritischen Zellen aus peripherem Blut auf verschiedene Stimuli reagieren. Die Literatur hebt anhand der spezifischen Rolle der dendritischen Zellen im Immunsystem die besondere Bedeutung von GM-CSF und TNF-α hervor. Welche unterschiedlichen, synergistischen oder gegensätzlichen Wirkungen haben nun insbesondere diese beiden Zytokine auf das Stadium der dendritischen Zellen im peripheren Blut? Im Vergleich dazu ist die Wirkung anderer Immunmediatoren, die für Antigenaufnahme, -prozessierung und –präsentation bei anderen Zellen von Bedeutung sind (wie z.B. LPS oder ds-RNA), zu untersuchen. Ein dritter und vierter Schritt in der Charakterisierung der Reagibilität sind die Reaktion zum einen auf Infektion der Zellen mit Viren und zum anderen auf endogene, sogenannte funktionelle Stimuli, wie z.B. das Antiapoptosesignal der T-Lymphozyten über CD-40-Ligand. Für die Beurteilung der Reagibilität stehen verschiedene variable Parameter zur Verfügung. Als wichtigstes wiederum der Reifemarker CD83 und die oben erwähnten verschiedenen Reifeparameter. Inwieweit Zellgröße und -granularität der dendritischen Zellen mit der Reife von dendritischen Zellen und der Expression von CD83 korrelieren, ist bisher nicht bekannt und soll zusätzlich untersucht werden. Eine über diese Arbeit hinausgehende Fragestellung ist, wie die dendritischen Zellen des peripheren Blutes bei den verschiedenen Krankheiten verändert sind und damit an deren Pathogenese beteiligt sein können. Eine Krankheit, bei der dies nicht unwahrscheinlich sein kann, ist das atopische Asthma bronchiale.3 In dieser Arbeit soll der Versuch unternommen werden in einer Pilotstudie die Untersuchung der dendritischen Zellen anwendbar auf klinische Studien zu machen. Zusammenfassend läßt sich fragen, wie die als Übergangsstadium angenommenen dendritischen Zellen des peripheren Blutes funktionell beschaffen sind, wie man sie schnell isolieren kann und wie sie auf Reize des Immunsystems und infektassoziierte Stimuli reagieren. 3 siehe Abschnitt 1.2.8 - 14 - Aus den formulierten Fragestellungen ergeben sich folgende Themen der Arbeit: 1. Isolierung und Quantifizierung CD4+ dendritischer Zellen aus Blut mittels Sortierung mit monoklonalen paramagnetischen Antikörpern. 2. Isolation bzw. Identifikation dendritischer Zellen aus mononukleären Zellen im Durchflußzytometer. 3. Bestimmung der Stadien und Einordnung der CD4+ dendritischen Zellen in das dendritische Zellsystem. 4. Unterschiedliche Stimulation der dendritischen Zellen aus peripherem Blut in Kultur mit: - Reizen des Immunsystems wie z.B. die Zytokine GM-CSF und TNF-α - Exogenen Reizen von außen wie z.B. LPS, ds-RNA oder E.coli-DNA - Funktionellen intrazellulären Stimuli wie CD40 Stimulation - Infektion der dendritischen Zellen mit RSV 5. Bestimmung einer Kinetik der T-zellstimulierenden Kapazität derCD4+ dendritischen Zellen in einer gemischten Lymphozytenkultur. 6. Untersuchung dendritischer Zellen von Asthmatikern. - 15 - 2. PROBANDEN, MATERIAL UND METHODEN 2.1 Probanden 2.1.1 Blutspender Für die Versuche wurden Zellen vom Institut für Blutspendewesen der Städtischen Kliniken Dortmund verwendet. Dort wurde für Blutspendezwecke den Spendern in Fenwal® Blutbeutel 500ml Vollblut steril abgenommen und mit 2800 U/min für 20 Minuten bei 20°C zentrifugiert (Zentrifuge Typ Rotosilenta/RP der Firma Hettich). Nachdem der Überstand von Plasma nach oben und die Erythrozyten nach unten entfernt worden waren, blieb im Blutbeutel ein mit Leukozyten und Thrombozyten angereichertes Blutkonzentrat zurück (Buffy Coat). Die Spender wurden vor jeder Blutspende mittels Fragebogen befragt und folgende Infektionen oder Medikamenteneinnahme ausgeschlossen: • In den letzten zwei Wochen eine fieberhafte Infektion (Fieber >38°C.) • In den letzten vier Wochen Kontakt mit Infektionskrankheiten (Mumps, Masern, Röteln, Zeckenbiß, etc.) Labortechnisch • In der letzten Woche eine Hautinfektion • In den letzten drei Wochen einen akuten oder anhaltenden Durchfall • In der letzten Woche ein Schmerzmittel wie z.B. Aspirin • Im letzten Monat Roacutan®, Tigason® oder ähnliche • Und andere, Risikogruppen betreffende Fragen wurden Blutsenkungsgeschwindigkeit Titer (Frauen: von <30/60, (<11,3/nl) untersucht. - 16 - HIV, Männer Hepatitis <20/40) B und und C, Leukozyten 2.1.2 Asthmatiker und Kontrollgruppe Eine Gruppe Asthmatikerambulanz von der sechs Asthmatikern Universitätsklinik wurde aus Bergmannsheil dem Klientel der Bochum gebildet. Sie bestand aus Patienten mit Asthma bronchiale, deren FEV1-Wert deutlich erniedrigt war. Als medikamentöse Therapie hatten die Patienten eine Bedarfsmedikation, welche am Tag der Blutentnahme nicht eingenommen worden war. Die Kontrollgruppe bestand aus gesunden Medizinstudenten ohne manifeste allergische Symptome und Unverträglichkeitsreaktionen aller Art, wie saisonale allergische Rhinitis, Hautreaktionen und Nahrungsmittelunverträglichkeiten. Es wurden bei beiden Gruppen Allergenprovokationstest Lungenfunktionsparameter (Prick-Test mit bestimmt ALK-Allergenen, und Scherax ein kutaner Arzneimittel GmbH, Hamburg) durchgeführt. Die Kontrollgruppe wurde nachträglich noch unterteilt in eine Gruppe K1 ohne positive Reaktionen im Prick-Test und eine Gruppe K2 mit einer stark positiven oder mehreren unterschwelligen Reaktionen auf die Provokation mit Allergenen des Pricktestes. Kontrollpersonen mit mehr als einer positiven Reaktion wurden nicht in die Kontrollgruppe aufgenommen. Für die Untersuchung der dendritischen Zellen wurden 100ml venöses Blut mit 10% Heparinnatrium abgenommen. Tabelle 2.1: Daten der Asthmatiker: Name: Geschlecht: Alter : FEV1: 1. S.K. W 27 67% 2. A.M. M 24 79% 3. S.H. M 33 52% 4. U.M. W 38 67% 5. H.S. W 24 47% 6. S.K. M 26 95% Hyperreagibilität unter Provokation Die Gruppe der Asthmatiker hatte ein mittleres Alter von 28,67. - 17 - Tabelle 2.2: Daten der Kontrollgruppe: Name: Geschlecht: Alter: FEV1: 1. M.B. W 24 117% 2. T.M. M 25 108% 3. K.M. W 27 114% 4. S.A. W 25 111% 5. T.R. W 26 110% 6. T.F. M 24 110% Die Kontrollgruppe hatte ein mittleres Alter von 25,17. Tabelle 2.3: Ergebnisse im Pricktest bei der Kontrollgruppe: Name: 1.M.B. 2.T.M. 3.K.M. 4.S.A. 5.T.R. 6.T.F. Allergen: Gräsermischung: - - - - - - Roggen: - - - - - - Birke: - - - - - - Beifuß: - - - - - 10/7 Derm. pteronyssinus: - - 4/5 3/5 - - Derm. farinae: - - 3/5 3/5 - - Hundehaare: - - - 3/5 - - Katzenhaare: - - - 4/5 - - Cladosporium herbarum: - - - - - - Untergruppen: K1 K1 K2 K2 K1 K2 Die Zahlen geben an, wieviel Millimeter Durchmesser die Quaddel des Allergens (erste Zahl), im Vergleich zu der durch Histamin ausgelösten Kontrollreaktion (zweite Zahl) hatte. - 18 - 2.2 Materialien: 2.2.1 Labormaterialien und Geräte: • Fenwal® Blutbeutel (Baxter, Kat.Nr.R1695) mit 70ml CPD Stabilisator (100ml CPD Stabilisator enthalten: -Acid. citric. monohydr. 327mg -Natrium citras 2,63g -Natrium Dihydrogenophosphas dihydr.251mg -Dextrod. monohydr. 2,55g -Aqua ad iniect ad 100ml) • Blue Max™ 50ml Conical Tube (Falcon®, New Jersey USA, Kat.Nr.2070) • Blue Max™ 15ml Conical Tube (Falcon®, New Jersey USA, Kat.Nr.2096) • Gewebskulturflasche TC 250ml (Greiner Labortechnik, Kat.Nr:658170) • Microtest III Gewebekulturplatten, 96 Vertiefungen, Flachboden (Falcon®, New JerseyUSA, Kat.Nr.3072) • Multiwell™ Gewebekulturplatte, 24 Vertiefungen, Flachboden (Falcon®, New JerseyUSA, Kat.Nr.3047) • Cell Strainer Filter100µm Nylon(Falcon®, New JerseyUSA, Kat.Nr.2360) • PPN-Röhrchen, Szintilationsgefäße (Greiner Labortechnik, Kat.Nr:145211) • Filterpapier Titertek™ (Skatron, Lier, Norway Kat.Nr:78-115-05) Materialien zum Sortieren von Zellen: • Vario MACS Magnetic Cell Separator (Kat.Nr.349/05916) • Mini MACS Magnetic Cell Separator (Kat.Nr.695003035) • MACS Separation Column Typ C für 2510? Zellen (Kat.Nr.041105) • MACS Separation Column Typ B2 für 1510 Zellen (Kat.Nr.041104) - 19 - • Mini MACS Separation Column Typ MS für 1510? Zellen (Kat.Nr.42201) • MACS Separation Column Typ VS für 2510? Zellen bzw. max. 1510? markierte Zellen (Kat.Nr.413-06) Alle MACS Produkte von Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach Geräte: • Auflichtmikroskop Olympus CK2 • Begasungsbrutschrank, Heraeus® • Omnifuge® 2.0 RS Zentrifuge Heraeus® Sepatech • Rackbeta® 1209, Liquid Scintilation Counter(LKB Wallace) • Titertek® Cell Harvester, Flow Laboratories (Skatron, Lier, Norway) • FACS-Scann (Becton Dickinson GmbH Heidelberg, bzw. New Jersey, USA) • Olympus Kamera SC 36 2.2.2 Reagenzien (alphabetisch): • Bovines Serum Albumin (Fluka Biochemika, Buchs/Schweiz, Kat.Nr.05480) • Desoxyribonucleinsäure TypVIII von E. Coli Stamm B (Sigma Chemical Co. St. Louis, USA, Kat.Nr:D-2001) • DoppelstrangRNA, Poly d I-C (Boeringer Mannheim GmbH, Kat.Nr.108812) • EDTA Ethylenediaminetetraacetic acid (Fluka Biochemika, Buchs/Schweiz, Kat.Nr.03609) • Ficoll Separating Solution Seromed® (Biochrom KG, Berlin, Kat.Nr.L2045) • FKS, Fetales Kälber Serum Seromed® (Biochrom KG, Berlin, Kat.Nr.S-0115) • GM-CSF, Leucomax®150 (Sandoz/Essex Pharma) • (N)-Glutamin Seromed® (Biochrom KG, Berlin, Kat.Nr:K0282) - 20 - • Haema-Line®, FACS-Puffer (Biochem Immunosystems Inc, Allentown, USA, Kat.Nr:345-3127) • Hanks´ Salt Solution (auch HBSS) Seromed® (Biochrom KG, Berlin, Kat.Nr:L2045) • Heparin-Natrium, Vetren®200 (Byk Gulden, Konstanz) • Hepes Puffer Seromed® (Biochrom KG, Berlin, Kat.Nr:L1613) • Lipopolysacherid von E.coli Serotyp 0127:B8, (Sigma Chemical Co. St. Louis, USA, Kat.Nr:L3129) • Medium 199 Hanks, Seromed®(Biochrom KG, Berlin, Kat.Nr.F0635) • Mitomycin C von Streptomyces caespitosus 0,5mg/ml (Sigma Chemical Co. St. Louis, USA, Kat.Nr.M-0503) • Natriumazid (E. Merck, Darmstadt, Kat.Nr:6688) • Natriumcarbonat (E. Merck, Darmstadt, Kat.Nr:6392) • Natriumhydrogencarbonat (E. Merck, Darmstadt, Kat.Nr:6329) • Natrium Pyruvat Seromed® (Biochrom KG, Berlin, Kat.Nr:L0473) • Nicht-Essentielle-Aminosäuren 1x Seromed® (Biochrom KG, Berlin, Kat.Nr:K0293) • Paraformaldehyd (Riedel de-Haen, Seelze, Kat.Nr:16005) • PBS Dulbecco, Seromed®(Biochrom KG, Berlin, Kat.Nr:L1825) • Penicillin/Streptomycin, Seromed®(Biochrom KG, Berlin, Kat.Nr:A2213) • Poly-L-lysin (Sigma Chemical Co. St. Louis, USA, Kat.Nr:P1524) • Propidium Iodid (Sigma Chemical Co. St. Louis, USA, Kat.Nr:P4170) • RPMI 1640 Medium, Seromed®(Biochrom KG, Berlin, Kat.Nr.F1215) • Rotiszint® ecoplus, Szintilationscocktail (Carl Roth GmbH+Co. Karlsruhe, Kat.Nr:0016.2) • Saponin (Riedel de-Haen, Seelze, Kat.Nr:16109) • Thymidin, Methyl ?H Thymidin (Amersham BuchlerGmbH+Co, Braunschweig, Kat.Nr:TRK418) • TNFα, Humaner rekombinanter Tumornekrosusfaktor (Genzyme Diagnostics, Cambridge, USA, Kat. Nr:TNF-H) • Tuerks Solution (Fluka Chemika, Buchs/Schweiz, Kat.Nr.93770) • Trypanblau-Lösung (Fluka Chemika, Buchs/Schweiz, Kat.Nr.93595) - 21 - 2.2.3 Antikörper: Antikörper für Durchflußzytometrie: Alle nicht extra bezeichneten Antikörper sind von der Firma Becton Dickinson GmbH, New Jersey, USA, bzw. Heidelberg. • Anti-HLA-DR PE (Kat.Nr.7367) • Anti-HLA-DR PerCP (Kat.Nr:347364) • Anti-TCRα/β1 FITC (Kat.Nr.347773) • CD3 FITC (Kat.Nr:349201) • CD14 FITC (Kat.Nr.347493) • CD16 FITC (Kat.Nr:347523) • CD19 FITC (Kat.Nr.347543) • CD20 FITC (Kat.Nr:347673) • CD56 (NCA M 16,2) FITC (Kat.Nr.340410) • CD4 PerCP (Kat.Nr:347324) • CD83 PE (Immunotech, Marseille, France, Kat.Nr:2218) • Gout Anti-Mouse IgG2b FITC, Human adsorbed (Southern Biotechnology Association Inc.; Birmingham, USA, Kat.Nr.1090-02) • Gout anti-Rabit IgG (H+L) FITC, Human/Mouse Adsorbed (Southern Biotechnology Association Inc.; Birmingham, USA, Kat.Nr:4050-02) • Mouse anti-Human CD83 (Serotec, UK, Kat.Nr.MCA1582) • Mouse IgG2b UNLB (Southern Biotechnology Association Inc.; Birmingham, USA, Kat.Nr.104-01) • Mouse IgG1 FITC (Kat.Nr:349041) • Mouse IgG1 PE (Kat.Nr:349043) • Mouse IgG1 PerCP (Kat.Nr:349044) • PE Isotype Control γ2a (Kat.Nr:340459) • Präimmunserum von Kaninchen(Antikörper aus der Virologischen Abteilung, Hygieneinstitut der Ruhr-Universität Bochum) - 22 - • R6, Kaninchen IgG gegen RSV (Antikörper aus der Virologischen Abteilung, Hygieneinstitut der Ruhr-Universität Bochum) Antikörper für Sortierungen und Ansätze : • Anti-Human CD40 (PharMingen, St. Louis, USA, Kat.Nr:33070D) • Anti-Human Leu-M3, CD14 (Becton Dickinson, New Jersey, USA, Kat.Nr.7490) • Gout anti-Mouse IgG H+L (Jackson ImmunoResearch Laboratories, Inc., West Grove, USA, Kat.Nr:115-001-003) • MACS Blood Dendritic Cell Isolation Kid (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Kat.Nr.468-01) • Rat anti-Mouse IgG2a+b (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Kat.Nr.47201) • CD45RA MicroBeads (Miltenyi Biotec GmbH, Bergisch Gladbach, Kat.Nr.459-01) - 23 - 2.3 Methoden: 2.3.1 Trennen der peripheren mononukleären Zellen von Blut Dichtezentrifugation mittels Ficoll®: Der Inhalt des Buffy Coat wurde im 50ml-Röhrchen (blue max™) 1:5 mit Hanks-Puffer verdünnt, gut durchmischt und dann mit 15ml Ficoll® 1,077g/ml unterschichtet und zentrifugiert mit 666g bei 20°C für 20 Minuten. Aus der Interphase wurden die mononukleären Zellen, das heißt hauptsächlich Lymphozyten, Monozyten und Thrombozyten, vorsichtig in ein neues Röhrchen pipettiert. Waschen und Anwendung von entgastem HBSS-BSA-EDTA-Puffer: Nun folgten drei Waschschritte, in denen die Röhrchen jeweils auf 50ml mit Puffer aufgefüllt wurden. Für den ersten Waschschritt wurde Hanks verwendet und bei 300g 10 Minuten zentrifugiert. Nachdem der Überstand vollständig abgegossen und das Zellpellet resuspendiert war, wurden die Zellen einmalig durch ein Zellsieb (cell strainer) gegeben, um Klumpen und groben Debris abzutrennen. Der zweite Waschschritt wurde mit Hanks und 200g 10 Minuten zentrifugieren durchgeführt. Die niedrigere g-Zahl im zweiten und dritten Waschschritt wurde gewählt, um die Thrombozyten auszuwaschen. Für den dritten Waschschritt wurde „HBSS-BSA-EDTAPuffer“ mit 0,5% bovinem Serumalbumin angesetzt, zum Schutz der Zellen im weiteren Procedere und 2mMolar EDTA, um die Zelladhäsion an die Kunststoffröhrchen zu minimieren. In einigen Experimenten wurde statt bovinem Serumalbumin 2% fötales Kälberserum verwendet. Dieser Puffer wurde für alle weiteren Schritte der Sortierung verwendet und dafür steril filtriert und eine halbe Stunde mittels Vakuumpumpe entgast. Die Zellen wurden mit Türks Lösung in der Neubauer-Zählkammer gezählt. Lagerung: Wenn es der Zeitplan erforderte, wurden die mononukleären Zellen über Nacht bei 8°C in 15ml „Lagermedium“ aufbewahrt. Das Lagermedium bestand aus 44,5% - 24 - RPMI 1640, 44,5% Medium 199, 10% autologem Plasma und 1% Penicillin (100 IU/ml) und Streptomycin (100µg/ml). 2.3.2 Etablieren der Sortierung von peripheren dendritischen Zellen Überblick über die Sortierung mittels MACS (magnetic associated cell sorting): Die Mengen dendritischer Zellen im Blut sind sehr gering und bisher sind keine spezifischen Oberflächenmarker für die heterogene, verschiedene Reifestadien umfassende Population dendritischer Zellen bekannt. Sie müssen für die Interaktion mit T-Zellen MHC-II-Moleküle, d.h. HLA-DR an der Zelloberfläche tragen und CD4+ sein. Diese beiden Oberflächenmarker verwendet man für die Sortierung und danach für die Reinheitskontrolle im Durchflußzytometer. Zuerst müssen jedoch alle anderen bekannten Zellen, welche auch diese beiden Oberflächenmarker tragen, entfernt werden. Daraus resultieren zwei Schritte: Zuerst werden die T-Lymphozyten, Monozyten und Natural-killer-cells, kurz NK-Zellen, aussortiert und dann aus den restlichen Zellen die CD4+ Zellen isoliert, so daß auch die B-Lymphozyten abgetrennt sind und eine gemischte Population CD4+Zellen übrig bleibt, von denen angenommen wird, daß es dendritische Zellen sind. Für die magnetische Zellsortierung (MACS) werden Antikörper verwendet, die paramagnetische Eigenschaften haben. Sie werden mit den Zellen inkubiert, so daß eine spezifische Bindung an die Zelloberfläche möglich ist. Läßt man die inkubierten Zellen durch eine mit Stahlwolle gefüllte Säule laufen, welche sich in einem permanenten, starken, magnetischen Feld befindet, so werden die spezifisch markierten Zellen in der Säule zurückgehalten. Durch die kleine Größe der paramagnetischen Antikörper (50nm Durchmesser) werden die Lichtbrechung im Durchflußzytometer laut Herstellerangabe nicht beeinflußt. Aussortieren von T-Lymphozyten, Natural-killler-cells und Monozyten: Wenn im folgenden von „Puffer“ gesprochen wird, ist entgaste HBSS-BSA-EDTA-Puffer gemeint. - 25 - der oben genannte Die mittels Dichtezentrifugation über Ficoll® isolierten, mononukleären Zellen wurden in einer Konzentration von 15108 Zellen in 300µl Puffer resuspendiert. Auf 15108 Zellen wurden 100µl humanes IgG zur Blockade von Fc-Rezeptoren und 100µl haptenisiertes Antikörpergemisch gegen CD3 auf T-Zellen, CD11b auf Monozyten, und CD16 auf NK-Zellen gegeben, gemischt und 10 Minuten bei 6° C inkubiert. Die Zellen wurden in 20fachem Volumen (10ml) mit dem oben genannten Puffer zweimal gewaschen (300g, 10min), in 900µl Puffer/15108 Zellen resuspendiert, 100µl paramagnetische Anti-Hapten-Antikörper zugegeben und 15 Minuten bei 6°C inkubiert. Durch eine C-Säule im Vario-MACS®-Magneten wurden alle markierten Zellen zurückgehalten und die nun angereicherte, nicht magnetische Fraktion bei 300g für 10 Minuten zentrifugiert und in 100µl Puffer resuspendiert. Positive Sortierung von CD4+ dendritischen Zellen: Zu den angereicherten, resuspendierten Zellen wurden 100µl paramagnetische Anti-CD4-Antikörper gegeben, 30 Minuten bei 6°C inkubiert, in 20-fachem Volumen Puffer (4ml) gewaschen, in 500µl Puffer resuspendiert und auf eine MS-Säule in einem Mini-MACS-Magneten gegeben. Nach entfernen der Säule aus dem Magneten wurden die magnetisch markierten Zellen aus der Säule gewaschen, abermals auf eine Säule im magnetischen Feld gegeben und der Vorgang wiederholt. Durch diesen Sortierungsschritt werden die CD4+ dendritischen Zellen von den CD4- Zellen, BZellen, getrennt. Die Säulen wurden nach Herstellerangabe vor den Sortierungen mit entgastem Puffer gewaschen und die C-Säule mit den Zellen, zum Erhöhen der Reinheit, mit 655ml und die MS-Säule mit 35500µl Puffer gespült. 2.3.3 Reinheitskontrolle im Durchflußzytometer: Zur Reinheitskontrolle wurden dreimal im Prozedere 1-25105 Zellen entnommen zur durchflußzytometrischen Messung. Die erste Probe wurde aus den mononukleären Zellen vor der Sortierung entnommen, die zweite nach dem ersten - 26 - Schritt der Anreicherung und die dritte Probe nach der Positivsortierung auf CD4+ Zellen. Die Quantifizierung der dendritischen Zellen im FACS-Scan erfolgte mit Hilfe monoklonaler Antikörper gegen Zelloberflächenproteine mit verschiedenen Fluoreszenzen. In Ermangelung eines spezifischen gemeinsamen Oberflächenmarkers auf den sortierten dendritischen Zellen außer dem MHC II Molekül, d.h. HLA-DR, wurden die Proben mit Phycoerythrin(PE)-markierten Antikörpern gegen HLA-DR gefärbt. Um diejenigen Zellen zu unterscheiden, welche eine Verunreinigung bedeuten, wurden die Proben mit spezifischen, Fluorescein-isothiocyanat(FITC)-markierten Antikörpern gefärbt: Anti-TcRα/β gegen T-Zellen, Anti-CD19 gegen B-Zellen, AntiCD14 gegen Monozyten dendritische Zellen und Anti-CD56 gegen NK-Zellen. Periphere CD4+ müßten also positiv in Fluoreszenz 2 (PE) und negativ in Fluoreszenz 1 (FITC) sein. Die Antikörper wurden in den vom Hersteller empfohlenen Konzentrationen und Inkubationszeiten verwendet. Für die Färbungen wurden die Zellen in HBSS mit 0,1% Natriumazid aufgenommen. Ausgewertet wurden die Messungen auf einem Hewlett/Packard Computer (9153C/340) mit dem Programm Lysys™II der Firma Becton Dickinson GmbH, New Jersey, USA, bzw. Heidelberg. a) b) c) Abbildung 2.1: FACS-Diagramme von der Sortierung dendritischer Zellen aus PBMC mit Prozentangaben, der als dendritische Zellen angenommenen Population. a) Mononukleäre Zellen (PBMC). b) Zellen nach der ersten Anreicherung. c) CD4+ dendritische Zellen nach der zweiten Anreicherung. - 27 - 2.3.4 Kultivieren und Stimulation der angereicherten dendritischen Zellen: Die frisch sortierten CD4+ dendritischen Zellen wurden für 48 Stunden bei 37°C und 8% CO2-Begasung inkubiert. Dafür wurden sie auf eine Konzentration von 1,55105/ml Kulturmedium eingestellt und in Portionen von 200µl in die Vertiefungen von Microtest™III Gewebekulturplatten verteilt. Das Kulturmedium bestand aus RPMI 1640 mit 10% fetalem Kälberserum (FCS Charge 583E) und 4% Zusatzlösung aus folgenden Bestandteilen: Nichtessentielle Aminosäuren 100mmol Natrium Pyruvat 200mmol N Glutamin 100IU/ml Penicillin 100µg/ml Streptomycin Verhältnis: 1:1:1:0,5:0,5 Es wurden die Auswirkungen verschiedener Stimuli als Zusätze zu dem Kulturmedium ausgetestet. Die Konzentrationen waren wie folgt: GM-CSF 100ng/ml TNFα 2,5ng/ml, 5ng/ml, 10ng/ml LPS 50µg/ml E.coli DNA 500µg/ml PolyIC 500µg/ml (10units/ml) (Doppelstrang RNA) Nach den 48 Stunden Inkubationszeit im Begasungsbrutschrank wurden die Zellen im Auflichtmikroskop in den Gewebekulturplatten morphologisch beurteilt und dann aus den Platten geerntet. Die Gewebekulturplatten wurden mit eiskaltem Hanks` Puffer mit 0,1% Natriumazid nachgespült. Die Zellen wurden mit Trypanblau-Lösung gefärbt und lebende und tote Zellen ausgezählt. Um die Ausreifung der dendritischen Zellen zu quantifizieren wurde im Durchflußzytometer die Expression von CD83 und HLA-DR gemessen. - 28 - 2.3.5 RSV-Infektion der dendritischen Zellen Für die Infektion mit RS-Viren wurden die frisch sortierten Zellen in die Virologische Abteilung am Hygieneinstitut der Ruhr-Universität Bochum gebracht und nach der Infektion 24 Stunden bei 37°C und 8% CO2-Begasung inkubiert. Für den intrazellulären Nachweis von Virusprotein wurden die Zellen fixiert und permeabilisiert. Das Fixieren erfolgte mit 0,5-1ml 4% Paraformaldehyd 10 Minuten bei 20°C Dann wurde mit 15ml HBSS gewaschen und bei 300g für 10 Minuten bei 20°C zentrifugiert. Zum Permeabilisieren wurden die 15105 Zellen in 100µl HBSS mit 0,1% Saponin und 0,01% Hepespuffer aufgenommen. Mit der gleichen Pufferzusammensetzung wurden der RSV R6-Antikörper und das Präimmunserum 1:50 verdünnt. Als Zweitantikörper für die indirekte Durchflußzytometrie wurde Gout-antiRabbit FITC markiert in einer Konzentration von 2,5µg/ml/15105 Zellen verwendet. 2.3.6 Funktionelle Stimulation mittels Anti-CD40 Um das Antiapoptosesignal eines CD40-Liganden simulieren zu können, wurden die Gewebekulturplatten zuerst mit Poly-L-lysin 100µg/ml Aqua dest. für 30 Minuten bei 37°C inkubiert. Das Poly-L-lysin dient dem unspezifischen Binden von Antikörpern an die Wände der Platten und wurde in Portionen von 250µl in die Vertiefungen der MicrotestIII®platte pipettiert. Nach dieser Inkubation wurden die Vertiefungen dreimal mit 250µl PBS gewaschen. Eine Stimulation mittels CD40 Antikörpern erfordert eine Vernetzung (coaten). Zum Coaten der Platten wurde der Antikörper Gout-anti-Mouse IgG (H+L) in einer Konzentration von 36,5µg/ml verwendet, mit 250µl pro Vertiefung auf die vorbehandelten Gewebekulturplatten verteilt und 12 Stunden bei 37°C und 8% CO2-Begasung inkubiert. Der Antikörper Gout-anti-Mouse IgG wurde gelöst in Carbonatpuffer. Carbonatpuffer wird auf einen pH von 9,3 eingestellt, indem Natriumhydrogenkarbonat mit Natriumkarbonat titriert wird. - 29 - Es folgte erneutes dreimaliges Waschen der Platten (siehe oben). Zum Absättigen der freien, unspezifischen Bindungsstellen für Antikörper wurden die Platten mit 10% FCS 30 Minuten bei 37°C wieder inkubiert. Die frisch sortierten dendritischen Zellen wurden mit Anti-CD40 20 Minuten bei 6°C inkubiert, gewaschen und in einer Konzentration von 1,55105/ml Kulturmedium in die abgesättigten Gewebekulturplatten pipettiert. Nach 48 Stunden bei 37°C und CO2-Begasung wurden auf den Zellen die Oberflächenmarker CD83 und HLA-DR im Durchflußzytometer gemessen. 2.3.7 T-Zellproliferationsmessung mit Co-Stimulation dendritischer Zellen und Monozyten in gemischter Lymphozytenkultur: Sortieren von Monozyten: Die Sortierung von Monozyten wurde in Ermangelung eines spezifischen, paramagnetisch markierten Antikörpers gegen CD14 über eine indirekte Methode ausgeführt. Aus 15-20ml frischem venösen Blut wurden mittels Dichtezentrifugation über Ficoll die mononukleären Zellen isoliert und gewaschen (s.o.). Zu einer Konzentration von 2,55107 Zellen / 1ml Puffer wurden 50µl Anti-CD14-Antikörper gegeben, 15min bei 6° C inkubiert und in gekühltem Puffer gewaschen (fünffaches Volumen). Die resuspendierten Zellen, auf 15107 /80µl eingestellt, wurden mit 20µl rat-anti-mouse IgG2a+b beads MACS 15107 Zellen versetzt und abermals für 15 Minuten bei 6° C inkubiert und gewaschen. In 500µl wurden die Zellen über eine A2-Säule im magnetischen Feld gegeben, die Säule dreimal mit 500µl Puffer gespült und nach Entfernen aus dem magnetischen Feld die markierten Monozyten mit ca.5ml Puffer aus der Säule gewaschen. Sortieren von naiven T-Zellen: Unter der Annahme, daß die Fraktion der CD45RA+T-Zellen unmittelbar nach der Geburt als nahezu vollständig „naiv“ gelten können, wurde das Blut aus den Nabelvenen von Plazenten abgenommen. Um naive T-Zellen zu erhalten, wurden mononukleäre Zellen aus dem Nabelschnurblut gewonnen und die CD45RA+ Zellen in - 30 - einer Positivsortierung über eine VS-Säule isoliert. Die Antikörperkonzentrationen wurden nach dem Protokoll von Miltenyi Biotec GmbH Bergisch Gladbach gewählt. Gemischte Lymphozytenkultur und Proliferationsmessung: Die sortierten dendritischen Zellen wurden 48 Stunden in Kultur mit GM-CSF alleine oder mit GM-CSF, TNF-α und LPS stimuliert (s.o.). Monozyten und dendritische Zellen wurden jeweils in einer Konzentration von 15107/ ml Kulturmedium mit 25µg/ml Mitomycin C behandelt und damit für 30 Minuten bei 37°C inkubiert und dann mit gekühltem Hanks gewaschen. Dendritische Zellen, Monozyten und CD45RA+T-Zellen Kulturmedium dendritischen wurden eingestellt, Zellen zu 100µl 100µl dann auf eine Zellsuspension der Konzentration von entweder von 15106/ml Monozyten oder T-Zellsuspension in die Vertiefungen einer Microtest®III-Platte gegeben. Nach 72 Stunden bei 37°C und 8% CO2-Begasung wurden die Zellen mit 10µCi/ml 3 H-Thymidin (37MBq entsprechen 1mCi/ml) für 24 Stunden radioaktiv markiert. Über ein Zellerntegerät wurden die zellulären Bestandteile gewonnen und in einem Beta-Counter analysiert. Die Ergebnisse wurden in radioaktiven Zerfällen pro Minute dargestellt (cpm = counts per minute). 2.3.8 Etablieren der durchflußzytometrischen Identifikation von unsortierten dendritischen Zellen in mononukleären Zellen: Überblick über die Methode: Es sollten die dendritischen Zellen untersucht werden, ohne daß sie vorher von den anderen Leukozyten getrennt werden. Dazu wurden mononukleäre Zellen kultiviert mit denselben Kulurmedien und Zusätzen, wie es mit den isolierten dendritischen Zellen gemacht worden war. Gemessen wurden die dendritischen Zellen im Durchflußzytometer mit einem Livegate, das heißt CD3 auf T-Lymphozyten, CD20 auf B-Lymphozyten, CD14 auf Monozyten und CD56 auf NK-Zellen wurden mit einer Farbe (FITC) markiert und HLA-DR auf dendritischen Zellen mit einer anderen - 31 - (PerCP). Dann wurden nur diejenigen Zellen ausgewertet, welche letztere, nicht aber erstere Farbe emittierten. Kultivieren der mononukleären Zellen: Die mononukleären Zellen wurden in einer Suspension von 0,55106 Zellen pro ml Kulturmedium eingestellt und je 1ml in die Vertiefungen der Multiwell™ Gewebekulturplatten gegeben. Die Zellen wurden mit GM-CSF alleine, TNF-α und GM-CSF, oder noch zusätzlich LPS oder überhaupt nicht stimuliert (Konzentrationen s.o.) und 24 und 48 Stunden bei 37°C und 8% CO2-Begasung inkubiert. Livegate dendritischer Zellen im Durchflußzytometer: Zum Färben wurden 15106 mononukleäre Zellen in 100µl aufgenommen und mit zweifacher Menge Antikörper für 20 Minuten inkubiert. Um die peripheren dendritischen Zellen von den anderen mononukleären Zellen im Livegate zu trennen, wurde CD3, CD14, CD20 und CD56 FITC gefärbt, HLA-DR PerCP und als variable, zu messende Größe CD83 PE. Nun wurden im Durchflußzytometer in der Region R1 nur diejenigen Zellen akzeptiert, welche FITC-negativ und PerCP, d.h. HLA-DR positiv waren. Alle anderen Zellen wurden ignoriert (siehe Graph c.) und nur die dritte Fluoreszenz PE als Variable ausgewertet (Graph d.). Die Region R1 wurde anhand der Isotypkontrolle und der Messung aller mononukleären Zellen (Graph a. und b.) gesetzt. - 32 - a.) Isotypkontrolle PBMC b.) PBMC ohne Livegate c.) Livegate auf dendritische Zellen Abbildung 2.2: Durch ein Livegate d.) CD83 Expression auf dendritischen Zellen im Durchflußzytometer werden von allen mononukleären Zellen nur die dendritische Zellen isoliert dargestellt und gemessen: a.)-d.) sind FACS-Diagramme, in denen jeweils ein unterschiedlicher Anteil mononukleärer Zellen von den insgesamt gemessenen Zellen dargestellt ist. In b.) sind alle gemessenen Zellen auch ausgewertet (10000). In c.) und d.) sind von den 500000 gemessenen Zellen nur 10000 in Region R1 und somit ausgewertet worden. Die Zellen aus R1 in c.) sind in Abbildung d.) mit einer neuen Fluoreszenz (in der Horizontalen CD83 als Variable) dargestellt. - 33 - 3. ERGEBNISSE Vorbemerkungen: • Alle im Text und in Abbildungen angegebenen Werte beruhen – wenn nicht anders angegeben – auf mindestens drei unabhängigen Experimenten. 3.1 CD4+ dendritische Zellen sind aus peripherem Blut von Erwachsenen isolierbar: Die Anzahl der dendritischen Zellen, welche HLA-DR positiv und ΤCRα/β, CD14, CD19 und CD56 negativ waren, machten in den mononukleären Zellen aus Buffy-coat vor der Sortierung4 0,5-1,2% aus. Nach der Sortierung waren 94-98% (arithmetischer Mittelwert mit Standardabweichung 96,8%±0,6) der aus Buffy-coat oder Frischblut sortierten Zellen CD4 und HLA-DR positiv und TCRα/β, CD14, CD19 und CD56 negativ. CD83-positiv waren weniger als 2% der dendritischen Zellen. Die Anzahl der dendritischen Zellen unterschied sich je nach verwendeter Isolationsmethode und Material. Aus Frischblut, bei dem zwischen Blutentnahme und Verarbeitungsbeginn nicht mehr als eine halbe Stunde verlief, konnten durchschnittlich 3,9±0,3×105 dendritische Zellen mittels Sortierung aus 2×108 PBMC (entspricht 0,2%±0,02%) isoliert werden. Aus den Buffy-coats, die nicht älter als vier Stunden waren, wurden mononukleären 4 fast doppelt Zellen mit so viele Sortierung dendritische isoliert. Mittels Zellen (7,4±0,7×105) Livegatemessung aus wurden Wenn im folgenden von sortierten dendritischen Zellen die Rede ist, so sind damit Zellen gemeint, die mit der unter 2.3.2 beschriebenen Methode isoliert wurden. Mit Livegate isolierte Zellen oder auch als durchflußzytometrisch identifizierte Zellen bezeichnet, deren Isolations- bzw. Identifikationsmethode unter 2.3.8 beschrieben ist, werden von ersteren Zellen unabhängig ausgewertet. - 34 - dagegen im Frischblut durchschnittlich 1,8±0,2×106 dendritische Zellen in der gleichen Anzahl mononukleärer Zellen gemessen (entspricht 0.9%±0,1%), was fast viermal so viele Zellen sind. Wurden mononukleäre Zellen aus Buffy-coat mittels Livegate auf die Anzahl dendritischer Zellen untersucht, so konnten 2,5±0,15×106 dendritische Zellen auf 25108 PBMC isoliert werden (entspricht 1,2%±0,08%). Diese Daten ergeben im Frischblut signifikant weniger CD4+ dendritische Zellen als in PBMCs aus Buffy-coat, 1000000 0 Buffy coat 0,20% ± 0,02% 2000000 0,37% ± 0,04% Dendritische Zellen pro 2x10 PBMC 8 3000000 0,9% ± 0,1% 1,2% ± 0,08% sowohl bei Sortierung (P=0,002) wie auch im Livegate (P=0,022). Sortierte Zellen PBMC Livegate Frischblut Abbildung 3.1: Anzahl dendritischer Zellen in Buffy-coat und Frischblut. Verglichen sind die unterschiedlichen Methoden zur Isolation der dendritischen Zellen. Dendritische Zellen machen 0,2-1,2% der mononukleären Zellen im peripheren Blut von Erwachsenen aus. Dabei waren in Buffy-coats signifikant mehr CD4+ dendritische Zellen pro PBMCs als in Frischblut, sowohl bei sortierten Zellen (P=0,002) als auch bei im Livegate identifizierten Zellen (P=0,022). Angegeben sind die arithmetischen Mittelwerte mit der Standardabweichung. Die Zahlen beruhen auf mindestens sechs unabhängigen Experimenten pro Wert. - 35 - 3.2 Verhalten der dendritischen Zellen bei unterschiedlicher infektassoziierter Stimulation: 3.2.1 Dendritische Zellen aus peripherem Blut vermehren sich in der verwendeten Zellkultur nicht: Die CD4 positiven dendritischen Zellen aus Buffy-coat wurden nach der Sortierung zum ersten Mal gezählt, das heißt bevor sie in Kultur gegeben wurden, und zum zweiten Mal nach den zwei Tagen Kultur. Unter Berücksichtigung des Zellverlußtes bei den zwei Waschschritten und das Ernten der Zellen aus den Gewebekulturplatten, waren Zellzahlen der dendritischen Zellen vor und nach Kultur konstant. Dies war unabhängig davon, mit welcher Substanz die Zellen in der Kultur stimuliert worden waren. Die dendritischen Zellen aus peripherem Blut proliferieren also in den verwendeten Reagenzien in Kultur nicht, auch wenn sie mit endogenen (GM-CSF, TNF−α) oder exogenen Mediatoren (LPS, E.coli-DNA, d-RNA) stimuliert werden. 3.2.2 Morphologie der dendritischen Zellen: Die sortierten dendritischen Zellen waren im Auflichtmikroskop direkt nach der Sortierung als runde, homogene, relativ zu Monozyten durchschnittlich kleinere Zellen sichtbar. Nach zwei Tagen Stimulation mit GM-CSF zeigten sie über die Oberfläche verteilt multiple, kleine cytoplasmatische dendritische Zellausläufer, welche ein Drittel des Zelldurchmessers nicht übertrafen. Ein kleiner Teil der Zellen zeigte größere Ausläufer. Als Zeichen der Vitalität hatte eine Migration der meisten Zellen zu Zellhaufen stattgefunden. Bei der zusätzlichen Stimulation mit TNF-α oder LPS vermehrte sich sowohl der Anteil der Zellen mit dendritischen Zellausläufern als auch die Größe der Ausläufer. Letzteres geschah besonders bei der Stimulation mit LPS und GM-CSF. - 36 - Abbildung 3.2: Morphologie peripherer dendritischer Zellen nach Stimulation: Mit LPS und GM-CSF stimulierte dendritische Zellen im Auflichtmikroskop nach zwei Tagen Kultur. Die Zellen waren aus Buffy-coat sortiert. 3.2.3 Sortierte CD4+ dendritische Zellen brauchen in Kultur GM-CSF: In den verwendeten Kulturmedien konnten die dendritischen Zellen aus Buffycoat für 48 Stunden in Kultur nur überleben, wenn sie mit GM-CSF stimuliert wurden. Bei nicht stimulierten Zellen blieb beispielsweise eine Migration zu Zellhaufen in der Kultur aus und die Granularität der Zellen nahm zu. Die absolute Anzahl der Zellen verkleinerte sich auf 58% und der Anteil der in der Trypanblaufärbung positiven Zellen, d.h. avitale Zellen, stieg von 2% (mit GM-CSF) auf 45% (ohne GM-CSF) nach 48 - 37 - Stunden in Kultur an. Im Durchflußzytometer zeigten die nicht stimulierten Zellen ein apoptotisches Bild in den Scattereigenschaften mit viel Debris. Eine längere Zeit in Kultur blieben die CD4+ dendritischen Zellen auch mit GM-CSF nicht vital. Waren nach drei Tagen nur 24% der Zellen im Durchflußzytometer Propidium-Iodid positiv und können damit als avital gelten, so waren es am sechsten Tag schon 80% der Zellen. Wurden andere Zusätze allein, ohne GM-CSF, als Stimuli verwendet, so ergab sich ebenfalls ein apoptotisches Bild in den Scattereigenschaften und nur eine minimale Expression von CD83 (siehe Abbildung 3.3 mit Kommentar). % CD83 positiven Zellen 20 Zellen in R1 * Zellen in R2 * 15 10 5 0 GM-CSF Doppelstrang RNA E. Coli DNA CD40 Stimulation Stimuli während zwei Tagen in Kultur Abbildung 3.3: Vergleich verschiedener, als einzige Stimuli verwendeter Agenzien: Nur mit GM-CSF exprimierten 11,2%±5% der dendritischen Zellen CD83. Sowohl exogene Mediatoren wie E.coli DNA oder ds-RNA als auch endogene Stimuli wie CD40-Ligandsimulation ergaben keine wesentliche Ausreifung in den Scattereigenschaften (s.u.) und nur minimale Expression von CD83. Angegeben sind die arithmetischen Mittelwerte mit Standardabweichung. * R1 und R2 sind verschiedene Populationen in den Scattereigenschaften. Siehe dazu Abschnitt 3.4 - 38 - der 3.2.4 TNF-α ist der stärkste Reiz für die Expression von CD83: Aufbauend auf das Ergebnis, daß die dendritischen Zellen aus peripherem Blut als basale Stimulation GM-CSF zum Überleben in vitro brauchen, wurden zusätzlich Lipopolysaccharid von E.coli und Tumornekrosefaktor-α (ΤΝF−α) als Stimuli ausgetestet und die Ausreifung anhand der Expression von CD83 gemessen. Direkt nach der Sortierung war noch auf weniger als 2% der dendritischen Zellen CD83 exprimiert gewesen. Die Stimulation mit Lipopolysaccharid und GM-CSF zeigte etwa gleiche Auswirkung auf die Expression von CD83 auf den dendritischen Zellen wie GM-CSF allein. Demgegenüber konnte der Prozentsatz von CD83-positiven Zellen durch 2,5ng/ml TNF-α (mit GM-CSF) um das 2,5-fache auf 22,4%±3% (arithmetisches Mittel mit Standardabweichung) gesteigert werden. Diese Steigerung ließ sich noch auf das dreifache, das heißt auf 28%±6%, erhöhen durch die Kombination von allen drei Stimuli zusammen, die sich als Maximalstimulation erwies. % der CD83+ Zellen 40 30 20 10 0 GM-CSF GM-CSF+LPS GM-CSF+TNFa GM-CSF+LPS+TNFa Zusätze in Kultur Zellen in R2 * Zellen in R1 * Abbildung 3.4: Expression von CD83 auf dendritischen Zellen bei Stimulation nach zwei Tagen: Die Fraktion der CD83 positiven, dendritischen Zellen nach zwei Tagen in Kultur, stimuliert mit GM-CSF, TNF-α (2,5ng/ml) und LPS, ist in den unterschiedlichen Reifestadien dargestellt. GMCSF ist Voraussetzung einer Ausreifung (s.o.) und TNF-α das stärkste Stimulans zur Expression des Reifemarkers CD83. Angegeben sind die arithmetischen Mittelwerte mit der Standardabweichung. * R1 und R2 sind verschiedene Populationen in den Scattereigenschaften. Siehe dazu Abschnitt 3.4 - 39 - 3.2.5 Konzentrations-Wirkungsverhältnis von TNF-α : Die Wirkung von TNF-α auf die dendritischen Zellen wurde noch in ihrer Abhängigkeit von der Konzentration in den Zellkulturen untersucht. Zu der basalen Stimulation mit GM-CSF wurde 2,5ng/ml, 5ng/ml und 10ng/ml TNF-α hinzugegeben. Die stärkste Expression von CD83 ergab sich bei 5ng/ml, während sie bei 10ng/ml unter % CD83 positiver Zellen an Tag 2 derjenigen der Ausgangskonzentration von 2,5ng/ml lag. 40 30 20 10 0 0.0 2.5 5.0 7.5 10.0 Konzentration von TNF-α in den Kulturen (ng/ml) mit GM-CSF Abbildung 3.5: Konzentration-Wirkungs-Verhältnis von TNF-α auf die Expression von CD83 auf dendritischen Zellen : Konzentrationen von TNF-α in den Zellkulturen von 5ng/ml zeigten die stärkste Steigerung des Prozentsatzes der CD83 positiven dendritischen Zellen. Bei Verdopplung der TNF-α- Konzentration fiel der Prozentsatz wieder unter 20% ab. Die Prozentangaben von CD83 beziehen sich auf Zellen in der Population R2 (siehe auch Abschnitt 3.4). Angegeben sind die arithmetischen Mittelwerte mit der Standardabweichung. - 40 - 3.2.6 Dendritische Zellen sind mittels CD40-Ligand-Simulation stimulierbar: Im Vergleich zu den „exogenen“, infektassoziierten Stimuli wurde ein „endogener“ bzw. funktioneller Stimulus, die Simulation des Antiapoptosesignals der T-Zellen über CD-40-Ligand und seine Auswirkung auf die Expression von CD83 auf dendritischen Zellen ausgetestet. Als einziger Stimulus für die dendritischen Zellen reichte die CD-40-LigandSimulation nicht aus. Die Zellen waren am zweiten Tag apoptotisch und zeigten keine Reifezeichen (siehe auch Abschnitt 3.3 s.o.). Wurde jedoch zusätzlich basal mit GMCSF stimuliert, so ergab sich eine deutliche Wirkung: Unter den Zellen der mittleren Population in den Scattereigenschaften R2 (siehe auch Abschnitt 3.4) wurde der Prozentsatz der CD83-positiven Zellen durch die CD-40Ligand-Simulation um ein Drittel gesteigert im Vergleich zu den nur mit GM-CSF % CD83positiver Zellen stimulierten Zellen. 30 Mittels CD40 und GM-CSF stimuliert Nur mit GM-CSF stimuliert 20 10 0 Zellen in R1 * Zellen in R2 * Abbildung 3.6: Expression von CD83 auf mittels CD40-Ligand-Simulation stimulierten dendritischen Zellen: Durch die Simulation des CD40-Liganden der T-Zellen mit einem monoklonalen Antikörper, konnte bei den ausgereiften Zellen (R2) eine Steigerung der Expression von CD83 um ein Drittel erreicht werden im Vergleich zu den Zellen, welche nur mit GM-CSF stimuliert worden waren. Angegeben sind die arithmetischen Mittelwerte mit der Standardabweichung. * R1 und R2 sind verschiedene Populationen in den Scattereigenschaften. Siehe dazu Abschnitt 3.4 - 41 - 3.2.7 Infektion dendritischer Zellen mit dem RS-Virus: Die mit RS-Virus infizierten dendritischen Zellen wurden am ersten Tag nach der Infektion im Auflichtmikroskop auf Morphologie und im Durchflußzytometer untersucht auf RSV-Proteine der Zelloberfläche und des Intrazellularraums und die Expression von CD83. Die Morphologie der dendritischen Zellen zeigte im Auflichtmikroskop am ersten Tag nach der Infektion mit RSV keine wesentliche Gestaltveränderung. Die Anzahl der Zellen hatte um 40% abgenommen und der Anteil der vitalen Zellen (Trypanblaufärbung) war von über 90% (nach der Sortierung) auf 70% abgesunken. Der Anteil der vitalen Zellen hat sich also effektiv auf 42% im Vergleich zu vor der RSVExposition reduziert. Die Kontrollpopulation ohne Kontakt zu RSV veränderte den Anteil der vitalen Zellen nicht. Der Prozentsatz der Zellen mit nachweisbarem RSV-Protein war niedrig und lag intrazellulär bei 4,4%±1,3% und auf der Zelloberfläche bei 3,2%±0,5%, im Vergleich zu <1% bei nicht infizierten Zellen. Die übrigbleibenden dendritischen Zellen, welche eine RSV-Exposition durchlaufen hatten, exprimierten CD83 zu 24,8%±4%; diejenigen Zellen, die keinen Kontakt zu RSV hatten und zur Kontrolle den gleichen Prozeduren unterworfen waren, exprimierten zu 16%±0,9 CD83. Als Besonderheit fiel folgendes Phänomen auf: In wiederholten Messungen im Durchflußzytometer zeigte sich, daß diejenigen dendritischen Zellen, welche CD83-positiv waren, nicht identisch mit den Zellen mit positivem RSV-Protein waren. Das heißt, das RSV-infizierte dendritische Zellen entweder RSV-Protein oder CD83 exprimieren, nicht aber beides zusammen. - 42 - Abbildung 3.7: CD4+ dendritische Zellen am ersten Tag nach RSV-Infektion: Die RSV-Proteine wurden oberflächlich gefärbt. Abgebildet ist die Messung von CD83 und RSV-Protein (linker Graph) mit der durchflußzytometrischen Kontrollmessung (rechter Graph). Es zeigt sich, daß die CD83 positiven Zellen nicht RSV-Proteine tragen und umgekehrt (Lförmige Konfiguration). Es waren 24,8%±4% der Zellen CD83-positiv und 3,2%±0,5% trugen RSV-Proteine auf der Zelloberfläche. Angegeben sind die arithmetischen Mittelwerte mit der Standardabweichung. - 43 - 3.3 In unsortierten mononukleären Zellen aus peripherem Blut können dendritische Zellen isoliert mit Livegate durchflußzytometrisch untersucht werden: Es wurden die dendritischen Zellen untersucht, ohne daß sie vorher von den anderen mononukleären Zellen getrennt wurden.5 Durch ein Livegate im Durchflußzytometer wurde es möglich, einen Parameter (CD83) als Variable zu messen und mit den anderen Kanälen bzw. Fluoreszenzen die zu messenden Zellen durch bekannte Parameter zu isolieren bzw. identifizieren (siehe Abschnitt 2.3.8 zu den Details der angewendeten Methoden). Zur Kontrolle wurde CD4 auf den Zellen bestimmt, das bei sortierten Zellen ja als Selektionsmarker verwendet wurde, und mit 93,7%±2,5% der dendritischen Zellen im PBMC-Livegate in sechs unabhängigen Experimenten als positiv gewertet werden kann. Im peripheren Blut war die Anzahl der dendritischen Zellen im PBMC-Livegate pro Anzahl PBMC sechs mal so hoch wie bei den durch Sortierung isolierten dendritischen Zellen (siehe Abschnitt 3.1 und Abb.3.1). 3.3.1 Anzahl der dendritischen Zellen im Livegate bei unterschiedlicher Stimulation: Nach einem Tag in Kultur mit PBMCs waren die Prozentzahlen der dendritischen Zellen pro PBMCs zwischen 1,2%±0,08% bei Zellen aus Buffy-coat und 0,9%±0,1% bei Zellen von Frischblut. Am zweiten Tag nahmen die Prozentzahlen abhängig von der Stimulation stark ab. 5 Wenn im folgenden von sortierten dendritischen Zellen die Rede ist, so sind damit Zellen gemeint, die mit der unter 2.3.2 beschriebenen Methode isoliert wurden. Mit Livegate isolierte Zellen, deren Isolations- bzw. Identifikationsmethode unter 2.3.8 beschrieben ist, werden von sortierten Zellen unabhängig ausgewertet. - 44 - Stark stimulierte Kulturen (TNF-α + GM-CSF) behielten einen annähernd gleichen Prozentsatz dendritischer Zellen, während bei leicht stimulierten Zellen (nur GM-CSF) und am stärksten bei nicht stimulierten Zellen der Anteil der dendritischen Zellen an den PBMC stark abfiel (siehe Abb.3.8). In Kulturen, in denen mit Lipopolysaccharid stimuliert wurde, waren schon am ersten Tag nach Stimulation keine dendritischen Zellen mittels Livegate nachweisbar, obwohl die restlichen PBMC der Kultur in Trypanblaufärbung und in den Prozent dendritischer Zellen von PBMC Scattereigenschaften ein normales, vitales Bild ergaben. 1.5 Tag1 Tag2 1.0 0.5 0.0 +TNF+GM-CSF +GM-CSF Ohne Stimulation Zusätze zur Kultur Abbildung 3.8: Anzahl dendritischer Zellen im PBMC-Livegate: Die Zahlen der dendritischen Zellen nahmen vom ersten zum zweiten Tag insgesamt deutlich ab, wenn mononukleäre Zellen in Kultur gegeben wurden. Besonders deutlich war dies bei Ansätzen ohne Stimulation. In stimulierten Kulturen mit GM-CSF +TNF-α blieb die Anzahl der dendritischen Zellen gleich. Angegeben sind Standardabweichung. - 45 - die arithmetischen Mittelwerte mit der 3.3.2 Expression von CD83 auf dendritischen Zellen im PBMCLivegate: In sortierten dendritischen Zellen war der Anteil von CD83+ Zellen nach Stimulation mit GM-CSF und TNF-α 22,4%±3% (siehe auch Abb.3.4). Bei stimulierten PBMC-Kulturen war der arithmetische Mittelwert bei 51,8%±13% der im Livegate untersuchten dendritischen Zellen CD83+ ( siehe auch Abb.3.10), also wesentlich höher. Wenn man mononukleäre Zellen in Kultur gibt, dann scheinen die dendritischen Zellen darin am ersten Tag den Reifemarker CD83 ganz unabhängig von der Art der Stimulation zu exprimieren. Zwischen 50% und 60% der als reif eingestuften dendritischen Zellen tragen dann CD83. Am zweiten Tag waren die Prozente der CD83positiven Zellen in den Kulturen mit 16% (+GM-CSF+TNF-α), 22% (+GM-CSF) und 37% (ohne Stimulation) wesentlich niedriger. Vor allem die stimulierten Kulturen wiesen im Vergleich zu den reinen, sortierten Kulturen dendritischer Zellen (22% CD83; siehe Abschnitt 3.2.4) niedrigere Werte auf. - 46 - a) b) Abbildung 3.9: Expression von CD83 auf dendritischen Zellen im FACS Livegate: In sortierten dendritischen Zellen war der Anteil von CD83+ Zellen nach max. Stimulation 28%±6% (Abbildung 3.9.a). Bei stimulierten PBMC-Kulturen waren 51,8%±13% der im Livegate untersuchten dendritischen Zellen CD83+, im gezeigten Beispiel 87% der Zellen (Abbildung 3.9.b). Die unterschiedliche Impulsdichte der beiden abgebildeten Graphen liegt an der verschiedenen Anzahl gemessener Zellen. Die jeweils rechts abgebildeten Graphen zeigen die durchflußzytometrischen Kontrollmessungen. Angegeben sind die arithmetischen Mittelwerte mit der Standardabweichung. - 47 - Es könnte nun anhand dieser Zahlen (Abb. 3.10) der Eindruck entstehen, als ob in der nichtstimulierten Kultur an Tag 2 verhältnismäßig viele CD83-positive Zellen waren und im Vergleich dazu in der stimulierten Kultur wenige. Dies berücksichtigt jedoch nicht, daß die Zahlen der dendritischen Zellen insgesamt in nichtstimulierten Kulturen niedriger waren als in stimulierten (Abb.3.8). Werden auf diese Information die Prozentzahlen von CD83 angewendet, so ergibt sich, daß die Zahl der CD83positiven dendritischen Zellen an Tag 2 in allen drei Kulturen annähernd gleich war, ganz unabhängig von der Stimulation (siehe Abb. 3.11). An Tag zwei waren nur noch ein Drittel so viele CD83-positive Zellen in der Kultur wie an Tag eins. Dies beinhaltet zwei Ergebnisse: Erstens, daß die Zahl der CD83-positiven Zellen in einer PBMC-Kultur nicht von den zugesetzten Stimulanzien abhängt und zweitens, daß der gemessene Abfall an Tag zwei in der nichtstimulierten Kultur im Vergleich zu den stimulierten Kulturen durch eine Reduktion der CD83-negativen dendritischen Zellen hervorgerufen wurde.6 6 Für die weitere Differenzierung von fraglich reifen oder unreifen dendritischen Zellen sei hier sowohl auf den entsprechenden Teil der Diskussion als auch auf Kapitel 3.4 verwiesen, in dem Zellen nach Scattereigenschaften im Durchflußzytometer unterschieden werden, was zu ähnlichen, nicht aber identischen Zellpopulationen führt. - 48 - % CD83+ Zellen nach Tag1 Nach 24 Stunden in Kultur (Tag1): 75 Zellen in R2 * 50 Zellen in R1 * 25 0 TNF+GM-CSF GM-CSF Ohne Stimulation % CD83+Zellen an Tag2 Zusätze zum Kulturmedium 75 Zellen in R1 * 50 Zellen in R2 * 25 0 TNF+GM-CSF GM-CSF Ohne Stimulation Zusätze zum Kulturmedium Nach 48 Stunden in Kultur (Tag2): Abbildung 3.10: Expression von CD83 auf reifen dendritischen Zellen in PBMC-Kultur: Am ersten Tag der Kultur (obere Abbildung) trugen 47,7%±15% der dendritischen Zellen in der PBMC-Kultur CD83 auf der Zelloberfläche unabhängig davon wie und ob sie stimuliert worden waren. Am zweiten Tag (untere Abbildung) war der Anteil der Zellen mit CD83 unter den dendritischen Zellen der PBMC-Kultur, welche nicht stimuliert worden war, am höchsten. Stimulierte Kulturen wiesen niedrigere Prozentsätze von CD83-positiven Zellen auf. Die Werte lagen zwischen 16% (TNF-α und GM-CSF) und 37% (ohne Stimulation). Angegeben sind die arithmetischen Mittelwerte mit der Standardabweichung. * R1 und R2 sind verschiedene Populationen in den Scattereigenschaften. Siehe dazu Abschnitt 3.4 - 49 - dendritische Zellen pro 10 PBMC 4 Nach 24 Stunden in Kultur (Tag1): 125 Anzahl der dendritischen Zellen insgesamt an Tag1 100 Anteil CD83+Zellen Tag1 75 50 25 0 +TNF+GM-CSF +GM-CSF Ohne Stimulation Stimuli zu den PBMC in Kultur dendritische Zellen pro 10 PBMC 4 Nach 48 Stunden in Kultur (Tag2): 125 100 Anzahl der dendritischen Zellen insgesamt an Tag2 75 Anteil CD83+ Zellen Tag 2 50 25 0 +TNF+GM-CSF +GM-CSF Ohne Stimulation Stimuli zu den PBMC in Kultur Abbildung 3.11: Wie hat sich die Anzahl der CD83+ Zellen im Vergleich zu den CD83negativen dendritischen Zellen in PBMC-Kultur entwickelt: Beide Graphen zeigen (oben Tag 1 und unten Tag 2), daß die Zahl der dendritischen Zellen in PBMC-Kultur abhängig von der Stimulation - und besonders ohne Stimulation - abnimmt. Die Zahl der reifen CD83+ dendritischen ist zwar an Tag 2 auf weniger als ein Drittel von Tag 1 gesunken, verhält sich aber unabhängig von der Art der Stimulation. Der rapide Abfall von dendritischen Zellen in PBMC-Kultur ohne Stimulation (siehe Abb.3.8) ist also verursacht durch eine Reduktion CD83-negativer dendritischer Zellen. Angegeben sind die arithmetischen Mittelwerte mit der Standardabweichung. Die dieser Abbildung zugrundeliegenden Daten sind errechnete Werte aus den Daten der Abbildungen 3.8 und 3.10. Zu beachten ist, daß die Skalierung sich bei verschiedenen Abbildungen ändert. - 50 - 3.4 Nach Stimulation sind verschiedene Populationen von dendritischen Zellen zu unterscheiden: Während der Messungen stimulierter Zellen im Durchflußzytometer stellte sich heraus, daß die dendritischen Zellen in den Scattereigenschaften keine einheitliche homogene Population bildeten, wie sie dies zum Beispiel nach Sortierung taten. Die Scattereigenschaften FSC (vorwärts Streulicht) und SSC (seitwärts Streulicht) werden als relative Zellgröße und relative Dichte bzw. Granularität der Zellen angenommen.7 Es zeigte sich nun, daß Zellen aus den Kulturen drei abgrenzbare Populationen bildeten, die sowohl an Größe, als auch an Granularität zunahmen. Die erste Population (R1) mit den kleinsten Zellen und der niedrigsten Granularität und die zweite Population (R2) waren konstant vorhanden, während die dritte Population (R3) inkonstant war. Dies hängt mit zwei Faktoren zusammen: erstens mit den niedrigen Zellzahlen von R3 (siehe Abbildung 3.14) und zweitens damit, daß sie sich teils nur in FSC oder teils nur in SSC von R2 unterschied (siehe Abbildung 3.12) und damit die Abgrenzung in der Auswertung unpräzise geworden wäre. Deutlich war, daß R2 die größte der drei Populationen ist (siehe auch Abb. 3.12 und 3.14). R1 entspricht nach Scattereigenschaften dem Zustand im peripheren Blut. Zellgranularität und –größe sind weitgehend identisch mit den Zellen direkt nach Sortierung aus peripherem Blut. R3 war am deutlichsten und konstant bei maximaler Stimulation mit GM-CSF und TNF-α vorhanden. Eine Unterscheidung der Zellpopulationen war aber nicht nur nach Scattereigenschaften möglich. Gemessen wurde der Anteil von CD83 auf den Zellen in den verschiedenen Populationen. Der Prozentsatz von CD83-positiven Zellen war größer in den Populationen mit höherem FSC (Zellgröße) und SSC (Granularität). In Kulturen mit TNF-α und GM-CSF war CD83 in allen drei Reifestadien am höchsten, wobei R1 stimulationsunabhängig zwischen fünf und zehn Prozent lag. 7 siehe Literaturverzeichnis Nr.59 - 51 - a.) CD4+ dendritische Zellen nach Sortierung b.) Sortierte dendritische Zellen nach 48 Stunden in Kultur Abbildung 3.12: Verschiedene Stadien der dendritischen Zellen in den Scattereigenschaften: Im Durchflußzytometer (Granularität), nach lassen Stimulation sich drei anhand ansteigender verschiedene FSC Gruppen von (Zellgröße) und dendritischen SSC Zellen unterscheiden (b.). Direkt nach Sortierung, also vor Stimulation, waren keine Reifestadien unterscheidbar (a.). Die Impulshäufung am linken Rand wurde als Debris und nicht als Zellpopulation gewertet. - 52 - In R2, der größten Population, war die Expression von CD83 in Kulturen mit basaler GM-CSF-Stimulation niedriger (11%±5%) als in Kulturen mit zusätzlicher TNF-α (22%±3,4%) oder CD40-Ligand-Simulation (19%±1,8%). In R3 war die Expression von CD83 bei zusätzlicher TNF-α-Stimulation mit 41%±12% am höchsten (siehe Abb. 3.13). Es war bei der Verteilung von CD83 in den verschiedenen Populationen kein Unterschied feststellbar zwischen sortierten dendritischen Zellen und im Livegate gemessenen Zellen. Die Anzahl der dendritischen Zellen in den verschiedenen Reifestadien war nach zwei Tagen Kultur unterschiedlich. Die Mehrheit der dendritischen Zellen befand sich in R2, unabhängig davon, wie sie stimuliert worden waren. Ein Unterschied ergab sich zwischen den Methoden der Isolation mit einem größeren Anteil R2 (85,7%±5,4%) von allen sortierten dendritischen Zellen und einem kleineren Anteil R2 (74,8%±18%) von % CD83positiver Zellen allen im Livegate identifizierten dendritischen Zellen (siehe Abb. 3.14). 50 R1=FSC und SSC niedrig R2=Mittlere FSC und SSC R3=Hohe FSC und SSC 40 30 20 10 0 GM-CSF GM-CSF+TNFa CD40 Stimulation Stimuli während zwei Tagen Kultur Abbildung 3.13: Ausreifung der drei verschiedenen Stadien der dendritischen Zellen bei unterschiedlicher Stimulation: Die in den Scattereigenschaften anhand steigender Zellgröße und Granularität unterscheidbaren drei Populationen R1-R3, zeigten im Vergleich untereinander annähernd eine Verdopplung des Anteils der CD83-positiven Zellen. Es war kein Unterschied in der prozentualen Verteilung zwischen sortierten und im Livegate isolierten dendritischen Zellen. Angegeben sind die arithmetischen Mittelwerte mit der Standardabweichung. - 53 - % von R1+R2+R3 100 R1=FSC und SSC niedrig 75 R2=Mittlere FSC und SSC R3=Hohe FSC und SSC 50 25 0 Sortierte Zellen Livegate Nach zwei Tagen Abbildung 3.14: Verhältnis der Anzahl der dendritischen Zellen in den verschiedenen Populationen R1-R3: Die Mehrheit der dendritischen Zellen befand sich nach zwei Tagen in Kultur im Population R2. Das Verhältnis der Populationen untereinander blieb gleich, unabhängig davon, ob sie mit GMCSF, TNF-α und GM-CSF oder CD40-Ligand-Simulation und GM-CSF stimuliert worden waren. Bei sortierten Zellen war der Anteil von R2 höher (85,7%±5,4%) als bei Zellen, welche im Livegate isoliert wurden (74,8%±18%). Angegeben sind die arithmetischen Mittelwerte mit der Standardabweichung. - 54 - 3.5 CD4+ dendritische Zellen stimulieren naive CD45RA+ T-Zellen um ein Vielfaches von Monozyten: Die sortierten dendritischen Zellen waren lediglich dadurch definiert, daß sie CD4+ sind und dabei aber weder T- oder B-Lymphozyten noch Monozyten oder Natural-killer-cells sind, daß heißt negativ für T-Zellrezeptoren, CD19, CD14 und CD56 sind. Um eine funktionelle Charakterisierung dieser Zellen zu ermöglichen, wurde eine T-Zellproliferationsmessung in gemischter Lymphozytenkultur mit CoStimulation dieser dendritischen Zellen im Vergleich zu Monozyten durchgeführt. Dabei zeigte sich, daß die dendritischen Zellen nicht nur bei maximaler Zellkonzentration ein wesentlich höheres stimulatorisches Potential als Monozyten besitzen (1000 mal so starker Proliferationsstimulus wie Monozyten), sondern auch bei niedrigeren Konzentrationen einen deutlichen Proliferationsreiz auf naive, CD45RA+ T-Zellen besitzen. Selbst bei einer Konzentration von einer einzigen dendritischen Zelle auf 100 naive T-Zellen konnte noch eine deutliche Proliferationszunahme der T-Zellen festgestellt werden (siehe Abb. 3.15). Die Stimulation der dendritischen Zellen in den 48 Stunden Kultur vor der gemischten Lymphozytenkultur veränderte quantitativ nicht den Proliferationsreiz auf die naiven T-Zellen. Mit TNF, LPS und GM-CSF stimulierte dendritische Zellen induzieren eine annähernd gleiche Proliferationszunahme, wie nur mit GM-CSF stimulierte Zellen. - 55 - 30000 nicht vorstimulierte Dendritische Zellen Dendritische Zellen* vorstimuliert 20000 cpm Monozyten 10000 0 1 10 100 1000 10000 100000 Zellkonzentration pro 1x10 5 CD45RA+ T-Zellen Abbildung 3.15: Co-Stimulation dendritischer Zellen in gemischter Lymphozytenkultur: Die dendritischen Zellen bewirkten eine wesentlich stärkere (Faktor 1000) Proliferation der naiven, CD-45RA+ T-Zellen aus Nabelschnurblut als Monozyten. Besonders ist auf den Unterschied in den kleineren der angewendeten Zellkonzentrationen hinzuweisen. Es konnte kein Unterschied festgestellt werden zwischen dendritischen Zellen welche mit TNF-α, LPS und GM-CSF stimuliert wurden oder nur GM-CSF als Kulturzusätze hatten. Gemessen wurde in cpm (counts per minute). Angegeben sind die arithmetischen Mittelwerte mit der Standardabweichung (nach oben angegeben bei nichtstimulierten Zellen und nach unten bei vorstimulierten Zellen*). * „Vorstimulierte Zellen“ wurden zwei Tage mit TNF-α , LPS und GM-CSF inkubiert, während zu „nichtstimulierten Zellen“ nur GM-CSF zugesetzt wurde. - 56 - 3.6 Etablieren der Anwendbarkeit der Methoden auf klinische Studien an Asthmatikern: Dieser Teil der Arbeit beinhaltet erstens den Versuch, die in den vorhergehenden Teilen verwendeten Methoden, auf die Anwendbarkeit in klinischen Studien zu testen. Zweitens sollten anhand von Asthma, einer häufigen atopischen Erkrankung, exemplarisch die dendritischen Zellen in einem veränderten Immunsystem untersucht werden. Wie auch schon in den vorhergehenden Abschnitten bereitete wieder die leicht schwankende und sehr niedrige Anzahl der dendritischen Zellen im peripheren Blut die größte Schwierigkeit. Da aus diesem Grund durchweg an der unteren Grenze der Zellzahlen gearbeitet wurde und den Probanden nicht mehr als 100 ml Blut entnommen werden sollte, sind von einigen Parametern nicht alle sechs Werte vorhanden, was außer bei der Anzahl der dendritischen Zellen eine Bestimmung der Signifikanz nicht möglich und sinnvoll machte. So liegen den Aussagen über die Expression von CD83 nur bei sortierten Zellen immer mindestens sechs Werte zugrunde (Abb. 3.16 und 3.17), während für die Messungen von CD83 im PBMC-Livegate nur bei vier bis fünf Probanden PBMC übrig waren waren (Abb. 3.19 bis 3.21). Anzahl der dendritischen Zellen bei Asthmatikern: Die Zahl der dendritischen Zellen bei den Asthmatikern und der Vergleichsgruppe pro PBMC war unterschiedlich in Abhängigkeit von der Methode. Bei sortierten Zellen war die Anzahl in beiden Gruppen ohne signifikanten Unterschied. Bei den dendritischen Zellen aus der PBMC-Kultur hatten alle Asthmatiker mehr dendritische Zellen pro PBMC (3,8 ± 0,8 × 106 ) als die Probanden aus der Vergleichsgruppe (1,5 ± 0,2 × 106 ), was einen signifikanten Unterschied ergibt (P=0,0223). Dies verdeutlicht, daß nicht nur die Methode unterschiedlich ist, sondern es sich vielmehr um funktionell andere dendritische Zellen handelt ( siehe Abb. 3.16). Expression von CD83 auf dendritischen Zellen von Asthmatikern: Sortierte dendritische Zellen von Asthmatikern weisen nach zwei Tagen Kultur im Vergleich zu der Kontrollgruppe keinen Unterschied in der Expression von CD83 auf. Auch bei verschiedener Stimulation der Kulturen konnte kein Unterschied festgestellt werden (siehe Abb. 3.17 und vergleiche dazu Abb.3.4). - 57 - Dendritische Zellen pro 8 2x10 PBMC 5000000 Asthmatiker 4000000 Vergleichsgruppe 3000000 2000000 1000000 0 Sortierung Livegate Methode der Isolation von dendritischen Zellen Abbildung 3.16: Haben Asthmatiker mehr dendritische Zellen im Blut? Sortierte Zellen weisen statistisch die gleiche Anzahl dendritischer Zellen pro PBMC von Asthmatikern und Vergleichspersonen auf. Wird die Zahl der dendritischen Zellen im Livegate aus PBMC-Kulturen – bestimmt, so konnte bei allen Asthmatikern ein signifikant (P=0,0223) größerer Anteil dendritischer Zellen als bei den Vergleichspersonen im peripheren Blut festgestellt werden. Angegeben sind die arithmetischen Mittelwerte mit der %CD83+ Zellen in R2* Standardabweichung. 40 Asthmatiker Vergleichsgruppe 30 20 10 0 +TNF+GM-CSF +GM-CSF CD40Stimuliert+GM-CSF Stimuli in den Kulturen Abbildung 3.17: Exprimieren bei Asthmatikern mehr dendritische Zellen CD83? Sortierte dendritische Zellen von Asthmatikern exprimieren nach zwei Tagen Kultur gleich häufig den Reifemarker CD83 wie bei der Vergleichsgruppe. Dies war unabhängig davon, wie die Kulturen stimuliert worden waren. Angegeben sind die arithmetischen Mittelwerte mit der Standardabweichung. * R2 ist die mittlere Population in den Scattereigenschaften. Siehe dazu Abschnitt 3.4 - 58 - Die Probanden der Gruppen waren nach klinischen Gesichtspunkten, das heißt, nach der Manifestation von Asthma bronchiale ausgewählt worden. Nimmt man als Unterscheidungsmerkmal die atopische Prädisposition eines Probanden und unterscheidet anhand mindestens einer deutlich positiven Reaktion im Pricktest, so entsteht eine Gruppe aus Vergleichspersonen mit allergischem Reaktionsmuster und eine ohne. In der Annahme, daß alle drei Gruppen unterschiedliche immunologische Reaktionsmuster haben, wird in Abbildung 3.18 die Expression von CD83 der drei Gruppen unterschiedlich dargestellt. Auch wenn die Reduktion der Probanden auf drei pro Gruppe den Aussagewert reduziert, so zeigt sich doch deutlich, daß in beiden Gruppen mit atopischer Prädisposition – Asthmatiker und die Vergleichsgruppe mit positivem Pricktest – bei Stimulation mit GM-CSF und TNF-α der Prozentsatz von CD83 um ein Drittel (18% -30%) höher als bei Probanden mit negativem Pricktest war (Abb. 3.18). Bei Stimulation mit GM-CSF alleine oder mit CD40-Ligandsimulation war kein Unterschied feststellbar. Vergleichend dazu ist die Intensität der Stimulation mit CD40-Ligand-Simulation auf die Expression von CD83 auf dendritischen Zellen CD83 Expression in% dargestellt (siehe auch Abschnitt 3.2.3 und 3.2.4 und Abb. 3.3). 40 30 Vergleichsgruppe 1 mit negativem Pricktest 20 Vergleichsgruppe 2 mit positivem Pricktest 10 0 +TNF+GM-CSF +GM-CSF CD40Stimuliert+GM-CSF Stimuli in Kultur Abbildung 3.18: Atopieabhängige Ausreifung von dendritischen Zellen: Die Vergleichsgruppe wurde unterteilt nach positiver oder ausbleibender Reaktion im Pricktest. Die sortierten dendritischen Zellen von Gesunden mit positiver Reaktion im Pricktest verhalten sich bei Stimulation nach zwei Tagen Kultur gleich in der Expression von CD83, wie dendritische Zellen von Asthmatikern (vergl. Abb.3.17). Im Vergleich dazu tragen stimulierte Zellen von Gesunden ohne allergische Reaktion um ein Drittel weniger CD83. Bei dendritischen Zellen mit basaler GM-CSF-Stimulation oder CD40-Ligandsimulation, war kein deutlicher Unterschied feststellbar (siehe Text). Angegeben sind die arithmetischen Mittelwerte mit der Standardabweichung. - 59 - Die gleichen Messungen wurden an dendritischen Zellen aus den PBMCKulturen im Livegate gemacht. Da mit dieser Methode am zweiten Tag die Zellzahlen erheblich kleiner waren (siehe Abschnitt 3.3) wurden die Messungen am ersten Tag vorgenommen. Bei zwei Probanden, die nicht in den Graphiken erscheinen, wurden die für die Methode erforderlichen Zellzahlen unterschritten. Wieder ergaben sich bei Zellen, die mit GM-CSF und TNF-α stimuliert worden waren, am ehesten deutliche Ergebnisse, die jedoch mangels Probandenzahl keine Signifikanzrechnung zuließ. Im Gegensatz zu den sortierten Zellen war CD83 in der Kontrollgruppe deutlich höher als unter den Asthmatikern (siehe Abb.3.19). Nur mit GM-CSF stimulierte Zellen zeigen die gleiche Tendenz. Bei nicht stimulierten Zellen % CD83 positiver Zellen konnte nur eine große Streubreite der Ergebnisse festgestellt werden. 100 Asthmatiker Kontrolle 75 50 25 0 Asthmatiker Kontrolle Mit TNF-α und GM-CSF stimulierte PBMC Abbildung 3.19: Stimulierte dendritische Zellen aus PBMC-Kultur von Asthmatikern: Im Gegensatz zu sortierten Zellen weisen stimulierte dendritische Zellen aus PBMC-Kultur im Livegate bei Asthmatikern weniger den Reifemarker CD83 auf als die Kontrollgruppe. Die Anzahl der Probanden limitiert zwar die Aussagefähigkeit, doch ist eine deutliche Tendenz sichtbar. Angegeben sind die Meßwerte mit arithmetischem Mittel. - 60 - % CD83 positiver Zellen 100 Asthmatiker Kontrolle 75 50 25 0 Asthmatiker Kontrolle Mit GM-CSF stimulierte PBMC nach Tag 1 Abbildung 3.20: Dendritische Zellen aus PBMC-Kultur von Asthmatikern mit basaler Stimulation: Umgekehrte Ergebnisse in der Expression von CD83 im Vergleich zu sortierten dendritischen % CD83 positiver Zellen Zellen. Siehe auch Text und Abb.3.19. Angegeben sind die Meßwerte mit arithmetischem Mittel. 100 Asthmatiker Kontrolle 75 50 25 0 Asthmatiker Kontrolle PBMC ohne Stimulation nach Tag 1 Abbildung 3.21: Dendritische Zellen aus PBMC-Kultur von Asthmatikern ohne Stimulation: Nicht stimulierte dendritische Zellen in PBMC-Kulturen von Asthmatikern weisen keine Häufung oder Tendenz in der Expression von CD83 auf. Siehe auch Text und Abb.3.19. Angegeben sind die Meßwerte mit arithmetischem Mittel. - 61 - 4. DISKUSSION Dendritische Zellen finden sich in meist sehr kleinen Mengen fast überall im menschlichen Körper. Sie können weder als eine einheitliche Zellpopulation noch eine streng durchlaufene Zellreihe von der Stammzelle zur reifen Zelle verstanden werden. Sie durchlaufen verschiedene Stadien an unterschiedlichen Stellen und bilden ein sich in verschiedene Unterfunktionen differenzierendes System von verschiedenen Zellen ohne ein konstantes, spezifisches Merkmal, das sie durchgängig beibehalten (4). Dadurch gestaltet es sich schwierig, sie zu isolieren und einheitlich eindeutig zu charakterisieren. Zusammenfassend haben die Experimente der vorliegenden Arbeit folgendes gezeigt: Mittels monoklonaler paramagnetischer Antikörper konnten innerhalb weniger Stunden nach Blutentnahme Zellen isoliert werden, die typische Eigenschaften von dendritischen Zellen zeigten. In gemischten Lymphozytenkulturen wirken sie maximal T-zellstimulierend. Sie sind HLA-DR+, CD4+ und CD83- und sind noch nicht ausgereift. Außerdem kann im Durchflußzytometer bei der Messung von PBMCs ein Livegate auf dendritische Zellen so gesetzt werden, daß sie nach den gleichen Ein- und Ausschlußkriterien wie bei der Sortierung untersucht werden können. Bei dieser Methode braucht man für vier durchflußzytometrische Messungen mit zusätzlichen Kontrollmessungen nur 2-3ml Blut im Gegensatz zu 100ml Blut bei einer Sortierung dendritischer Zellen. Die Unterschiede der beiden Methoden werden diskutiert werden. Sortierte dendritische Zellen in Kultur oder dendritische Zellen mit PBMC in Kultur sind grundsätzlich verschieden, unabhängig davon ob die Kulturen stimuliert wurden oder nicht. Sie sind vor allem funktionell anders, das heißt sie reagieren anders auf Stimuli und reifen anders aus. Die sortierten dendritischen Zellen aus peripherem Blut vermehren sich in den verwendeten Medien in Kultur nicht. Sie brauchen GM-CSF, um in Kultur vital zu bleiben und reagieren mit dem Reifemarker CD83 am stärksten auf TNF-α. Funktionelle Stimulation mittels CD40-Ligand-Simulation führt ebenfalls zu erhöhter Expression von CD83. Lipopolysaccharid (LPS) war in seiner Wirkung additiv zu der von GM-CSF und TNF, aber im Vergleich dazu ungleich schwächer. Die „Reize des - 62 - Immunsystems“ GM-CSF und TNF konnten nicht durch „exogene Reize“ wie Doppelstrang-RNA oder E.coli-DNA ersetzt werden. Nach Infektion mit RSV war nur eine minimale Erhöhung von RSV-Protein und CD83 auf den dendritischen Zellen nachweisbar. Die unterschiedlichen Reaktionen der dendritischen Zellen auf Stimulation werden im folgenden diskutiert. Die dendritischen Zellen des peripheren Blutes sind, unabhängig davon wie sie isoliert wurden, in Größe und Zellgranularität im Durchflußzytometer eine annähernd homogene Population. Nach Stimulation in Kultur bilden sich bei diesen Parametern drei verschiedene Populationen aus, die in aufsteigender Reihenfolge Reifestadien mit ansteigender Expression von CD83 entsprechen. Die nachfolgend nochmals zusammenfassend aufgelisteten Problemstellungen bilden den „roten Faden“ für die Kapitel der Diskussion: • Was für dendritische Zellen sind im peripheren Blut? Und wie entscheidet die Methode der Isolation darüber, was für Zellen man in vitro vor sich hat? • Wie können die untersuchten Zellen in das dendritische Zellsystem eingeordnet werden? • Wie ist ihre Reagibilität und darauf folgend ihre weitere Differenzierung? • Können die gewonnenen Ergebnisse am Modell von Asthma bronchiale pathogenetische Zusammenhänge aufklären helfen? Die Methode der Isolation entscheidet über die Art der dendritischen Zellen in vitro: Die Isolationsmethoden der vorliegenden Arbeit haben zur Voraussetzung, daß humane dendritische Zellen keinen spezifischen Oberflächenmarker einheitlich exprimieren. Aus diesem Grund ist die Frage nach der Art der dendritischen Zellen bzw. die Wahl der Isolationsmethode von besonderer Wichtigkeit. Die in dieser Arbeit verwendete Methode der Sortierung von dendritischen Zellen beruht auf spezifischen Ausschlußkriterien und unspezifischen Einschlußkriterien. Ausgeschlossen werden sollen T-Lymphozyten, Monozyten und NK-Zellen mit CD3, CD11b und CD16. Aus - 63 - den restlichen Zellen, die mit dendritischen Zellen angereichert sind, werden alle CD4-, das heißt auch alle B-Lymphozyten, entfernt. Die übrigbleibenden Zellen werden als CD4+ dendritische Zellen angenommen (51). Diese Zellen exprimierten >96% HLADR (24), und so kann man von einer Isolation und nicht nur von einer Anreicherung dendritischer Zellen sprechen.8 Vorteile dieser Methode sind die hohe Reinheit der dendritischen Zellen, daß man in weniger als acht Stunden nach Blutentnahme die Zellen isoliert hat und daß man die Unterscheidung der verschiedenen Zellen mit monoklonalen Antikörpern spezifischer steuern kann als beispielsweise mit Adhärenzmethoden (siehe unten). Ein weiterer Vorteil der Sortierung liegt in der minimalen Veränderung der Zellen durch die Methode. Beispielsweise verwenden viele Arbeiten als ersten Schritt der Isolierung zur Depletion von T-Lymphozyten eine Rosettierung mit Neuraminidase-behandelten Schafserythrozyten, was eine Veränderung der dendritischen Zellen möglich macht. Bei der hier verwendeten Sortierung kann jedoch auch eine artifizielle Veränderungen an den Zellen durch die Mausantikörper nicht ausgeschlossen werden, da Endozytose eine wichtige Funktion des dendritischen Zellsystems ist. Dendritische Zellen tragen verschiedene Fc- Rezeptoren für den Fc-Teil der Immunglobuline, über die sie Immunkomplexe internalisieren können und zur Ausreifung angeregt werden (62). Inwieweit die Blockade der Fc-Rezeptoren zu Beginn der Sortierung eine artifizielle Aktivierung verursacht, bleibt offen, ist jedoch im Vergleich zu xenogenem Kontakt als gering einzuschätzen. Ein Nachteil der Sortierung ist die limitierte Kapazität der Säulen, wodurch die sowieso schon sehr niedrigen Zellzahlen der dendritischen Zellen im peripheren Blut für die Experimente oft grenzwertig niedrig waren. So konnten mit dem verwendeten VarioMACS® jeweils nur 2510? PBMC sortiert werden. Die sortierten dendritischen Zellen waren also nicht durch spezifische Oberflächenmarker definiert, sondern lediglich durch CD4 und HLA-DR und das Fehlen der spezifischen Marker der anderen Zellreihen. Mit CD83 wurde zwar ein spezifischer Oberflächenmarker für reife dendritische Zellen gefunden (102). Jedoch hat er begrenzten Nutzen für die Isolation, da auch in dieser Arbeit gezeigt werden konnte, daß die dendritischen Zellen des peripheren Blutes nicht CD83 exprimieren.8 Die typische funktionelle Charakteristik dendritischer Zellen ist, daß sie so stark wie keine anderen Zellen naive T-Zellen in einer gemischten Lymphozytenkultur zur Proliferation - 64 - anregen können. Die sortierten CD4+ dendritischen Zellen konnten nach 48 Stunden in Kultur im Vergleich zu Monozyten eine 1000-fach gesteigerte Proliferation der Lymphozyten induzieren und zeigten damit die typische T-zellstimulierende Kapazität der dendritischen Zellen. Auch bei niedrigeren Konzentrationen stellten sie einen deutlichen Proliferationsreiz für naive T-Zellen dar. Selbst bei einer Konzentration von einer einzigen dendritischen Zelle auf 100 naive T-Zellen konnte noch eine deutliche Proliferationszunahme der T-Zellen festgestellt werden.9 Dies ist eine schon länger bekannte Zelleigenschaft, welche spezifisch dendritischen Zellen, als der Gruppe der professionellen antigenpräsentierenden Zellen zugehörig, eigen ist (85). Es ist ein Invitro-Modell für eine zelluläre Immunreaktion, bei der ein initialer stimulierender Kontakt der T-Zelle mit Antigen (T-cell priming) stattfindet und eine spezifische Immunreaktion ermöglicht. Diese Proliferationsreaktion findet aufgrund eines breiten Spektrums an Antigenen statt und zwar bakterielle-, virale- und Tumorproteine (4). Erst in den letzten Jahren hat man gefunden, daß in den mononukleären Zellen des peripheren Blutes Zellen sind, von denen vorerst nur bekannt war, daß unter ihnen Vorstufen dendritischer Zellen sind und daß sie nicht die Marker der bekannten Zellreihen exprimieren. Die aus frischem Blut ohne Kulturschritte isolierten dendritischen Zellen, wurden von Thomas et al. als ebenso stark T-zellstimulierend beschrieben wie typische kultivierte, ausgereifte dendritische Zellen (93). O’Doherty, et al. hingegen isolierte frische CD3-, CD14-, CD19- und CD56- dendritische Zellen aus PBMC mit niedriger T-zellstimulierender Aktivität. Diese unreifen dendritischen Zellen hatten die Morphologie von mittelgroßen Lymphozyten und niedrige Expression von MHC und Adhäsionsmolekülen (z.B.CD54). Nach Kultur mit MCM hatten diese Zellen eine dendritische Morphologie, eine hohe Expression von MHC und eine starke Tzellstimulierende Aktivität (51). Ein für diese Arbeit entscheidender Unterschied ist, daß diese dendritischen Zellen CD4 exprimieren, ein Marker, der von T- Helferlymphozyten bekannt ist, also der lymphoiden und nicht der myeloiden Reihe angehört. Diese CD4+ Zellen sind von ihrer Isolation und ihrer funktionellen Beschreibung und Morphologie den in dieser Arbeit beschriebenen dendritischen Zellen annähernd vergleichbar. Unterschiede liegen darin, daß O’Doherty et al. bei der Isolierung die oben erwähnte Rosettierung mit Schafserythrozyten verwendete und zur 8 9 Siehe auch Abschnitt 3.1 Siehe Abbildung 3.15 - 65 - Elimination von Monozyten einen FcR-Adhärenzschritt machte (51). Dadurch werden alle dendritischen Zellen mit Fc-Rezeptoren unspezifisch eliminiert. Ein weiterer Unterschied ist, daß die in der vorliegenden Arbeit isolierten Zellen aus frischem Blut direkt nach Sortierung – also ohne Stimulation – schon HLA-DR+ (MHC-II) waren. Anhand unterschiedlicher Funktion in der T-Zellstimulation wurden dann zwei Untergruppen im Blut beschrieben (beide MHC-II++ und CD3-, CD14- CD16- und CD19-), die sich in der Expression CD45RO und dem β2-Integrin CD11c unterschieden. Dies wurde möglich, indem bei der Isolation die Depletion von Monozyten durch FcR-Adhärenz weggelassen wurde. Eine Gruppe waren reife CD11c+, CD45RO+ und leicht CD4+ dendritische Zellen mit hoher T- zellstimulierender Aktivität und eine unreife CD11c-, CD45RO- und hoch CD4+ Population, die erst Kulturschritte in Monocyte-conditioned-medium benötigte, um sich in dendritische Zellen zu entwickeln (52). O’Doherty, Bhardwaj, und Steinman, et al. stellten die Hypothese auf, daß die unreifen CD11c- dendritischen Zellen aus dem Knochenmark kommen und Vorstufen von Gewebe-dendritischen-Zellen sind, während die CD11c+ Zellen aus den peripheren Geweben kommen, wo sie von Antigen aktiviert wurden und auf dem Weg zu der Milz oder Lymphknoten sind, um dort eine TZellantwort zu stimulieren (52). Zwei wesentliche Methoden zur Isolation von dendritischen Zellen wurden über die letzten Jahre entwickelt, um substantielle Zellzahlen zu erhalten. Die eine geht von CD34+ proliferierenden Vorstufen aus dem Knochenmark (63, 21) oder Blut (12) in Kulturen mit GM-CSF und TNF aus. Diese Methode ist schwierig bei kleinen Blutmengen zu realisieren, da die Häufigkeit von CD34+ Zellen sehr niedrig ist. Sie führt nach dendritischen langen Zellen Kulturschritten und zu verschiedenen Langerhanszellen. Diese Populationen Methode hat von neben CD1a+ ihrer Zeitaufwendigkeit den Nachteil, durch die langen Kulturschritte wenig Aussagen über den Zustand der dendritische Zellen in vivo machen zu können. Sie zeigt jedoch mögliche Entwicklungsschritte der Zellen auf. Ein anderer breit angewendeter Ansatz ist, mit den weniger seltenen CD14+ Vorstufen im Blut (Monozyten) zu beginnen und sie mit einer Kombination von GMCSF und IL-4 zu kultivieren (74, 71). Diese Vorstufen sind CD34- nichtproliferierende - 66 - Zellen (7). Wenn an den ersten Kulturschritt ein zweiter in Monocyte-conditionedmedium (MCM) angeschlossen wird, kann eine Population von reifen, 30%-80% CD83+ dendritischen Zellen erhalten werden, die ohne Stimulation für mindestens drei Tage stabil und vital bleiben (7, 72). Der zweite Kulturschritt kann auch variiert werden und statt MCM entweder 1% autologes Plasma mit TNF-α, IL-1β, IL-6 und Prostaglandin E2 verwendet werden (36) oder nur TNF-α und Prostaglandin E2 als Stimuli (66) oder als Medium RPMI® (94). Darüber, ob nun für den terminalen Ausreifungsschritt MCM überlegen ist (61) oder definierte Zytokinzusammensetzungen (36, 66), bleibt die Literatur uneins. Da MCM weder genau definierte Bestandteile hat, noch deren Anteile festgelegt sind, bleiben die genauen Bedingungen der Ausreifung dieser dendritischen Zellen unklar. Im Bereich dieser Methode ist das Verwenden von Leukophereseprodukten statt Vollblut ein weiterer Fortschritt, um substanzielle Zellmengen von Patienten für die klinische Anwendung dendritischer Zellen als zelluläres Vakzin zu gewinnen (94). Wie kann eine Einteilung in myeloide oder lymphoide dendritische Zellen erfolgen? Wie im vorhergehenden Abschnitt beschrieben, haben Menschen zwei unterschiedliche Arten von Vorläufern dendritischer Zellen. Zum einen Zellen, der myeloiden Reihe, welche die Mehrheit der dendritischen Zellen des Körpers stellen (4) und zum anderen dendritische Zellen der lymphoiden Zellreihe. Die CD4+ dendritischen Zellen des peripheren Blutes können unterteilt werden in CD11c+ und CD11c- Zellen (52). Die in der vorliegenden Arbeit isolierten CD4+ dendritischen Zellen sind von der Methode der Sortierung (HLA-DR+, CD4+, CD3-, CD11b-, CD16- und CD19-) der lymphoiden Zellreihe zuzuordnen.10 Unter den CD4+ dendritischen Zellen des Blutes exprimiert die eher lymphoide CD11c- Population kein CD11b, während die eher myeloiden CD11c+ Zellen auch CD11b+ sind (52) und damit bei der Sortierung eliminiert werden. Es bleiben unter den sortierten Zellen also die CD11c- dendritischen Zellen übrig. Außerdem exprimieren die CD11c- dendritischen Zellen höher CD4 (52) - 67 - und werden dadurch bei dem Schritt der positiven Selektion bevorzugt angereichert. Die Morphologie, die nach der Sortierung als plasmazytoid bezeichnet werden kann, zeichnet sie ebenfalls als lymphoide Zellen aus. Die Unterscheidung zwischen lymphoiden und myeloiden Zellen ist bisher nicht klar definiert und eine eher Summationsentscheidung. Die Zellen der vorliegenden Arbeit unterscheiden sich jedoch unter anderem von den unten aus der Literatur beschriebenen lymphoiden dendritischen Zellen11 dadurch, daß CD4 ein definiertes Auswahlkriterium bei der Sortierung ist und damit alle sortierten Zellen CD4+ sein müssen (von der möglichen Fehlerquote der MACS®-Säulen abgesehen). Außerdem sind sie nicht IL-3-abhängig in Kultur, wie weiter unten diskutiert werden soll. In Vorexperimenten hatte sich gezeigt, daß die Aktivität der Makropinozytose von Dextran bei den sortierten dendritischen Zellen sehr niedrig war und somit nicht als Variable in die Experimente integriert wurde. Rissoan und Soumelis et al. halten diese Eigenschaft sogar für ein besonderes Charakteristikum der lymphoiden dendritischen Zellen des peripheren Blutes (67). In der vorliegenden Arbeit konnten die CD4+ dendritischen Zellen mit zwei verschiedenen Methoden in ihrer Quantität und funktionellen Beschaffenheit untersucht werden. In der vorliegenden Arbeit konnte durchflußzytometrisch gezeigt werden, daß 93,7%±2,5% der HLA-DR+ CD3-, CD14-, CD16- und CD19- Zellen auch CD4+ exprimierten. Von diesen Zellen sind nur mehr als die Hälfte CD11c- dendritische Zellen.12 Sie stellen also eine heterogene Population dar. Bei denjenigen mononukleären Zellen des peripheren Blutes, welche zu keiner der bekannten Zellreihen gehören, ist eine Zuordnung schwierig. Über 90% der CD3-, CD14-, CD16- und CD19- Zellen im peripheren Blut, die zu dendritischen Zellen werden, exprimieren die myeloiden Oberflächenmarker CD13 und CD33 (93). Diese Zahlen beruhen auf Zellen, die mit dem gegen zytolytische Zellen und Monozyten toxischen Stoff L-leucyl-L-leucin-methylesther vorbehandelt waren, wodurch sowohl die häufigsten myeloiden Vorläuferzellen (Monozyten) als auch eventuell lymphatische Zellen fehlen. Dendritische Zellen des peripheren Blutes können sich von CD14Vorstufen entwickeln, die myeloide Oberflächenmarker exprimieren, was sie jedoch noch nicht sicher als myeloide dendritische Zellen festlegt. Vorstufen von eindeutig 10 11 Siehe S. 70ff zur genaueren Definition der lymphoiden dendritischen Zellen. Siehe Literaturstellen 9, 29, 38, 51, 52, und 67. - 68 - lymphoiden dendritischen Zellen (9) exprimieren auch CD13 und CD33, jedoch nur relativ niedrig (29). Auf der anderen Seite ist zwar CD4 ein Marker von lymphatischen Zellen, jedoch können zum Beispiel CD4+ HLA-DR+ CD1a+ Zellen aus dem Knochenmark zu myeloiden dendritischen Zellen differenzieren (63). Die Aussagekraft der einzelnen Unterscheidungsmerkmale ist also eingeschränkt. Die Subpopulation der eher myeloiden CD11c+ dendritischen Zellen im peripheren Blut sind CD13+ und CD33+ und nur niedrig CD4+, während die mehr lymphoiden CD11c- dendritischen Zellen hoch CD4+ und außerdem CD123+ (IL-3 Rezeptor) sind (55). Diese Zellen sind im zirkulierenden Zustand als mittelgroße Lymphozyten beschrieben (51). Daß CD4+ CD3- dendritische Zellen des peripheren Blutes sowohl noch zu T-Lymphozyten als auch zu dendritischen Zellen werden können (9), zeigt ihre lymphoide Natur. Es bleibt also, neben dem Ergebnis, daß dendritische Zellen des peripheren Blutes sicher lymphoider und myeloider Natur sein können, offen, ob die Vorstufen dendritischer Zellen im Blut heterogene Populationen sind oder eine Population, die sich sowohl in lymphoide als auch myeloide dendritische Zellen differenzieren kann und wo die wesentlichen Unterschiede liegen. Zu den myeloiden Zellen werden die dendritischen Zellen gezählt, welche aus Monozyten des Blutes in Kultur mit GM-CSF und IL-4 (74) oder nach Transmigration durch Endothel und Phagozytose (60) zu myeloiden dendritischen Zellen heranreifen. Die in vitro generierten dendritischen Zellen aus CD34+ Stammzellen werden ebenfalls zu den myeloiden dendritischen Zellen gerechnet. Pluripotente hämatopoetische Stammzellen differenzieren sich entweder in Richtung lymphatische Zellen oder myeloische Zellen, die sich dann jeweils weiter differenzieren. Myeloide dendritische Zellen können sich bis weit in der Ausreifung noch umdifferenzieren. Abhängig von der Zytokinumgebung können sowohl dendritische Zellen aus Monozyten (56) als auch aus CD34+ Stammzellen (90) sich in ihrer Reifung wieder umdifferenzieren in Makrophagen und umgekehrt. Ebenso können fast ausgereifte neutrophile Granulozyten in der Zytokinkombination von GM-CSF, IL-4 und TNF-α sich zu dendritischen Zellen entwickeln (53). Myeloide dendritische Zellen können sich also je nach durch die Zytokinzusammensetzung gesteuerten Bedarf aus verschiedenen myeloischen Zellen differenzieren und funktionell und phänotypisch ausreifen. 12 Siehe Diskussion über das Livegate Seite 74ff. - 69 - Die Reihe der lymphoiden dendritischen Zellen ist erst seit kurzem bekannt. Zuerst wurden bei der Maus Zellen im Thymus gefunden, die sich zu T-Lymphozyten und CD8+ dendritischen Zellen entwickeln können (2). Auch bei Menschen gibt es Vorstufen, die zu T-Zellen und dendritischen Zellen werden können (2). Dann wurden aus Blut und Tonsillen plasmazytoide CD4+, CD3-, CD11c- Zellen isoliert, die in Kultur mit IL-3 zu unreifen dendritischen Zellen werden und bei CD40L-Stimulation in eine Population ausreifen, die myeloide Oberflächenmarker wie CD11b, CD11c, CD13 und CD33 nur niedrig exprimieren (29). Wobei trotzdem eine Zuordnung zur lymphatischen Zellreihe möglich ist (siehe unten). Die lymphoiden dendritischen Zellen zeigen, außer der niedrigen Expression von myeloiden Oberflächenmarkern, verschiedene Eigenschaften der lymphatischen Zellreihe: Sie können sich im Gegensatz zu den myeloiden dendritischen Zellen in Kultur mit M-CSF und GM-CSF nicht mehr in Makrophagen differenzieren (29). Myeloide dendritische Zellen haben wie erwähnt als unreife Zellen eine hohe Kapazität an Endozytose, um diese dann wieder zugunsten der T-zellstimulierenden Aktivität zu verlieren. Unreife lymphoide dendritische Zellen haben nur eine sehr niedrige Kapazität an Phagozytose und Makropinozytose von Antigenen in allen Stadien ihrer Ausreifung (29). Die CD4+ CD3- Zellen des Blutes haben eine hohe Expression der α-Kette des prä-T-Zellrezeptors. Damit gehören sie eindeutig der lymphoiden Zellreihe an. Sie können sich auch in CD4+ CD3+ reife TZellen außerhalb des Thymus differenzieren, unterscheiden sich aber von den sich innerhalb des Thymus entwickelnden Vorstufen d.h. CD4+ CD3- CD8- Zellen (9). Damit zeigt sich ein ähnliches Verhältnis der lymphoiden dendritischen Zellen innerhalb der lymphatischen Zellen, wie der myeloiden dendritische Zellen innerhalb der myeloischen Zellreihe. Jedoch konnten bisher in vivo noch keine ausgereiften humanen lymphoiden dendritischen Zellen gefunden werden. Mit IL-10 vorbehandelte dendritische Zellen, unabhängig ob myeloide oder lymphoide dendritische Zellen, können eine alloantigenspezifische Anergie in CD4+ TLymphozyten induzieren (83). Die Tatsache, daß lymphoide dendritische Zellen über FasL in T-Zellen Apoptose auslösen können (89), zeigte, daß dendritische Zellen nicht nur die Immunantwort stimulieren und verstärken sondern auch begrenzen können. Es ist anzunehmen, daß die lymphoiden dendritischen Zellen an der Entstehung der peripheren immunologischen Toleranz beteiligt sind. In T-Zellregionen von Lymphknoten rezirkulieren T-Lymphozyten kontinuierlich. Bei jeder Passage müssen - 70 - sie große dendritische Zellen, auch interdigitierende dendritische Zellen genannt, passieren. Diese Zellen exprimieren auf MHC-II einen sehr hohen Anteil an Eigenpeptiden (35), was eine regulative Funktion in der Selbstreaktivität nahelegt. Lymphoide dendritische Zellen unterscheiden sich auch in ihrem Zytokinmuster. Im Gegensatz zu myeloiden dendritischen Zellen produzieren sie nach CD40LAktivierung kaum IL-12 und wenig IL-1α, IL-1β, IL-6 und IL10, jedoch vergleichbar viel IL-8. Interleukin-8 ist ein breit wirkendes Chemokin, welches chemotaktisch auf neutrophile- und basophile Granulozyten und T-Zellen wirkt. Beide Arten bilden weder IL-4 noch IL-13 (38, 67). Neuere Erkenntnisse zeigen, daß myeloide und lymphoide dendritische Zellen mit ihrer jeweiligen Zytokinmikroumgebung die T- Helferzelldifferenzierung in TH1- oder TH2-Zellen bestimmen. Rissoan, Soumelis et al. bezeichnen entsprechend die myeloiden dendritischen Zellen als DC1 und die lymphoiden dendritischen Zellen als DC2 (67). Die Entscheidung, wie sich eine THelferzelle differenziert, hängt von der Zytokinmikroumgebung während des frühen TDC-Kontaktes ab. IL-12 verstärkt die TH1- und IL-4 die TH2-Differenzierung (54). Rissoan, Soumelis et al. nehmen anhand ihrer Experimente mit gemischten und autologen Lymphozytenkulturen bislang unbekannte Stimuli von DC2 an, welche die TH2-Differenzierung bestimmen – da DC2 kein IL-4 bilden (67). Sie beschreiben für DC1 und DC2 eine gleich hohe T-zellstimulierende Kapazität. Anhand der TZellsekretion während der Lymphozytenkultur postulieren sie einen negativen Rückkopplungsmechanismus der T-Helferzellen auf die dendritischen Zellen. In DC2 – T-Lymphozytenkultur sezernierten die T-Lymphozyten viel IL-4, wenig INF-γ und verhältnismäßig viel IL-5 und IL-10. Wie schon beschrieben, macht IL-4 eine DC1 Ausreifung und induziert in DC2 Apoptose, was durch IL-10 potenziert aber durch CD40 und INF-γ blockiert werden kann. Umgekehrt war in der DC1 - TLymphozytenkultur INF-γ stark sezerniert und IL-4, IL-5 und IL10 niedrig. Durch diesen Feedback-Mechanismus kann selektiv eine prolongierte TH1- oder TH2Immunantwort verhindert werden, indem die Überlebenszeit der entsprechenden dendritischen Zellen reguliert wird. - 71 - Wieviele dendritische Zellen sind im peripheren Blut zu erwarten und wie können die unterschiedlichen Werte erklärt werden? In der vorliegenden Arbeit sind vier verschiedene Häufigkeiten von CD4+ dendritischen Zellen angegeben, je nach verwendetem Material oder Methode.13 Die Daten zeigen, daß im Durchflußzytometer ein wesentlich höherer Prozentsatz an CD4+ dendritischen Zellen pro PBMC‘s gemessen wurde als bei der Sortierung. In Buffy coats sind sie wiederum höher als in Frischblut, sowohl bei der Sortierung (0,37% gegenüber 0,2%) als auch im Durchflußzytometer (1,2% gegenüber 0,9%). Die Unterschiede der beiden Methoden liegen auf der Hand: Bei der Sortierung gehen durch mehrere Waschschritte jedesmal Zellen verloren und in der Stahlmatrix der Säulen bleiben jeweils wenige Zellen unspezifisch hängen und ergeben einen Zellverlust, der im Durchflußzytometer umgangen wird. Dies ist ein naheliegender Grund, der für die unterschiedlichen Werte der Methoden verantwortlich sein könnte. Warum im frischen venösen Blut weniger CD4+ dendritische Zellen nachweisbar sind als in Buffy coat, ist schwieriger abzuwägen. Welches sind maßgebliche Unterschiede? Ein Unterschied ist die Zeit zwischen Blutentnahme und Verarbeitung im Immunologischen Labor. Bei Frischblut verging weniger als eine halbe Stunde, während bei Buffy coats zwischen zwei und drei Stunden vergingen bis das Blut in der Blutbank aufgearbeitet wurde und in das Immunologische Labor kam um verarbeitet zu werden. Dies könnte eine Rolle spielen, weil Prozesse der Zell-Zell-Interaktion der verschiedenen weißen Zellen des Blutes ablaufen können, wie sie bei der PBMC-Kultur weiter unten diskutiert werden. Wieviel diese drei Stunden im Buffy coat für die unterschiedliche Anzahl der dendritischen Zellen ausmachen, muß hier offen bleiben. Ein weiterer wichtiger Unterschied zwischen Frischblut und Buffy coat ist, daß Frischblut in Heparinnatrium aufgenommen wird und Buffy coats in CPD Stabilisator, einer Mischung von Natriumzitrat und Dextro. monohydrat. u.a. An Stammzellen wurden die Auswirkungen der verschiedenen Bestandteile von Kultur- und Konservierungsmedien untersucht. In dem am wenigsten zelltoxischen Medium wurde CPD verwendet (39). Das traditionell in der Immunologie gebräuchliche Heparinblut könnte also auch die Vitalität der dendritischen Zellen beeinträchtigen. Abschließend kann gesagt werden, daß die durchflußzytometrische Messung in mit CPD konservierten Zellen (Buffy coat) mit 13 Hier ist anzumerken, daß Prozentangaben, denen im Durchflußzytometer gemessene Zahlen entsprechen, einer Methoden bedingten Fehlerquote insofern unterliegen, als Prozent der gemessenen Zellen angegeben werden, unter denen auch Debris ist, was die Sensitivität, nicht jedoch die hohe Spezifität der Methode reduziert. - 72 - 1,2%±0,08% CD4+ dendritischer Zellen von PBMC der am wenigsten artifiziell veränderte Wert ist und am aussagekräftigsten für die Häufigkeit CD4+ dendritischer Zellen im zirkulierenden Blut. Die Angaben der Literatur über die Anzahl der dendritischen Zellen im zirkulierenden Blut variieren in nicht unerheblichem Maße, zumal auch kleine Unterschiede ins Gewicht fallen, da die absoluten Zahlen durchweg sehr gering sind. Die Prozentangaben von dendritischen Zellen in mononukleären Zellen hängen von unterschiedlichen Voraussetzungen ab. Die wichtigsten sind die Reinheit der Populationen und die Selektionskriterien der Isolationsmethode, das heißt welche dendritischen Zellen isoliert wurden. In den letzten Jahren konnte vor allem die Reinheit der isolierten dendritischen Zellen verbessert werden. Konnte man vor 1990 nur von einer Anreicherung von dendritischen Zellen sprechen, so konnten Freudenthal und Steinman et al. 1990 eine Reinheit von 80-90% erzielen. Sie geben eine Häufigkeit von 0,1-1% dendritischer Zellen von PBMC an (24). In der Arbeit von O’Doherty et al. werden die HLA-DR+, CD3-, CD14-, CD16-, CD19- Zellen mit einer Häufigkeit von 1% angegeben (52). Wird CD4 als Selektionsmarker hinzu genommen, so erniedrigt sich der Anteil auf 0,6% der mononukleären Zellen des peripheren Blutes; bei einer Reinheit von 96% (22). Wie unterscheiden sich sortierte von im Durchflußzytometer aus PBMC identifizierten dendritischen Zellen? Die Methode, in PBMC dendritische Zellen durchflußzytometrisch zu bestimmen – ein Livegate auf dendritische Zellen zu setzen – beruht auf der Idee, mit wenig Material, d.h. wenig Blut dendritische Zellen untersuchen zu können trotz der niedrigen Zahlen von dendritischen Zellen im peripheren Blut. Wie unterscheiden sich nun in der vorliegenden Arbeit – durch die Isolierung bedingt – die sortierten dendritischen Zellen von im Durchflußzytometer (FACS) - 73 - identifizierten Zellen? Im Durchflußzytometer wird zum Ausschluß von Monozyten CD14 eingesetzt, wohingegen bei der Sortierung CD11b verwendet wurde. Sie sind beide gleichwertig auf Monozyten exprimiert (52), wobei CD11b auch auf NK-Zellen sein kann. Als Selektionskriterien in Durchflußzytometer und Sortierung sind sie also insofern als gleichwertig anzusehen. Ein Unterschied liegt in der differenzierten Selektion von den Subpopulationen der CD4+ dendritischen Zellen des peripheren Blutes. Wie vorhergehend diskutiert wurde,14 ist die CD4+ CD11c+ myeloide Subpopulation auch CD11b+ (52) und wird damit in der negativen Selektion der Sortierung eliminiert. Sie ist jedoch nur zum Teil schwach CD14+ (52) und wird also im Livegate nur teilweise über CD14 ausgeschlossen. Sie macht den kleineren Anteil der CD4+ dendritischen Zellen des peripheren Blutes aus, dadurch ist nur mit einer leichten Heterogenität der im Durchflußzytometer identifizierten dendritischen Zellen zu rechnen. Die sortierten CD4+ dendritischen Zellen sind also demgegenüber als CD11c- Population anzunehmen. Verschieden ist auch, daß B-Lymphozyten bei der Sortierung über eine Positivsortierung ausgeschlossen werden, während im Livegate eine negativ Selektion über CD19 (zusammen mit CD3, CD14 und CD16) praktikabler war, da dann B-, T-, NK-Zellen und Monozyten in einem Schritt über einen Fluoreszenzkanal im Durchflußzytometer erfaßt werden konnten. Die positive Selektion unterschied sich insofern, als sie im Livegate mit HLA-DR gemacht wurde und nicht wie bei der Sortierung über CD4 und dann gesondert HLA-DR zur Reinheitskontrolle gemessen wurde. Zur Kontrolle wurde in sechs unabhängigen Experimenten gezeigt, daß die im Livegate identifizierten dendritischen Zellen mit großer Reinheit auch CD4 positiv waren. Obwohl sich also Einzelheiten in der Methode unterscheiden, kann man sagen, daß die Ein- und Ausschlußkriterien bei der Sortierung und durchflußzytometrischen Identifizierung vergleichbar sind und, da bei den sortierten Zellen durch die hohe Tzellstimulierende Aktivität gezeigt werden konnte, daß es typische dendritische Zellen sind, ist es plausibel, daß es sich bei den im Durchflußzytometer identifizierten Zellen um dendritische Zellen handelt, die mehrheitlich lymphoider Natur sind. Wichtige Unterschiede liegen in den unterschiedlichen Kulturbedingungen (siehe unten). 14 Siehe Abschnitt Myeloide- und lymphoide dendritische Zellen auf Seite 67 - 74 - PBMC PBMC Magnetische Separation von CD3+, CD11b+ und CD16+ Zellen Depletion von T-, NK-Zellen und Monozyten Vorangereicherte dendritische Zellen z.B. FITC CD3-, CD14-, CD16-, CD19- Zellen Alle restlichen CD4- Zellen Positive Selektion von mit CD4 markierten Zellen Ausschluß von T-, B-, NK-Zellen und Monozyten CD4+ dendritische Zellen z.B. PE Einschluß der HLA-DR+ Zellen HLA-DR+ dendritische Zellen a) Sortierung b) Livegate Abbildung 4.1: Vergleich der Isolation von dendritischen Zellen mittels Sortierung und durchflußzytometrischen Identifizierung: Verglichen sind die unterschiedlichen Vorgehensweisen mit den jeweiligen Ein- und Ausschlußkriterien. Die CD4+ Zellen der Sortierung waren zu 96,8%±0,6% HLA-DR+ und die HLA-DR+ Zellen im Durchflußzytometer waren zu 93,7%±2,5% auch CD4+. Zu den Methoden siehe Abschnitt 2.3.2, 2.3.3 und 2.3.8 und zu den Ergebnissen Abschnitt 3.1 und 3.3 Ein Vorteil dieser Methode gegenüber der Sortierung liegt in der Tatsache, daß mit weniger Eingriffen auch weniger Einflüsse und damit Artefakte die Ergebnisse verändern können. Man umgeht mögliche Veränderungen durch die Sortierung. Welche anderen Veränderungen der dendritischen Zellen eine Rolle spielen, steht mehr bei der Kultur der PBMC im Vordergrund als bei der Isolationsmethode und soll dort besprochen werden. Ein Nachteil der Methode besteht darin, daß zum Beispiel die Morphologie der dendritischen Zellen nicht beurteilt werden kann. Der entscheidende Vorteil ist jedoch, daß mit einem Fünfzigstel der für Sortierungen benötigten Blutmenge gearbeitet werden kann, was 2-3 ml venöses Blut bedeutet. Dies erschließt die Untersuchung von dendritischen Zellen aus frischem Blut beispielsweise für die Pädiatrie! - 75 - Ein auf CD4+ durchflußzytometrischen dendritische Messung von Zellen PBMC, gesetztes wie in der Livegate in vorliegenden der Arbeit verwendet, ist bisher in der Literatur nicht erwähnt worden. Ein von Prinzip ähnliches Verfahren wurde angewendet, um die Rolle der Endozytose von dendritischen Zellen bei Kontaktallergenen zu beurteilen (5), indem MHC-II + non-B-Zellen oder MHC-II+ non-Monozyten identifiziert wurden und die Internalisierung von pH-sensitiven fluoreszierenden MHC-II-spezifischen Antikörpern beurteilt. Wie verhalten sich dendritische Zellen in Kultur mit mononukleären Zellen? Zusammenfassend zeigten die Ergebnisse zwei Besonderheiten. Zum einen war die Anzahl der dendritischen Zellen in den PBMC-Populationen auffallend. Die Zellzahlen der dendritischen Zellen nahmen von Tag zu Tag in Kultur deutlich ab. Ohne Stimulation fielen sie jeweils auf die Hälfte von stimulierten Kulturen.15 Zum anderen fiel auf, daß die Zahl der CD83+ Zellen in stimulierten und nicht stimulierten Kulturen gleich war. In einer Kultur, der keinerlei Stimuli zugesetzt wurden, waren also ebenso viele dendritische Zellen ausgereift und CD83+ geworden wie in stimulierten Kulturen. Eine Kultur mononukleärer Zellen ist als ein komplexes System anzunehmen. Eine Vielzahl von Zellen – T- und B-Lymphozyten, Monozyten, NK-Zellen, dendritische Zellen, Basophile u.a. – alle in unterschiedlich aktiven Stadien, in einem interaktiven System. Von außen zugesetzte definierte Reize können sowohl direkt auf Zellen wirken, als auch indirekt, das heißt über andere Zelltypen. Wie reifen CD4+ dendritische Zellen in einer Kultur mit mononukleären Zellen aus und wie werden sie stimuliert? In PBMC-Kulturen ohne zugesetzte Stimulation reifen dendritische Zellen in 24 Stunden aus und exprimieren CD83,16 während in Kulturen nur mit sortierten dendritischen Zellen ohne Stimulation die Zellen nicht ausreifen und apoptotisch werden. 17 In den PBMC-Kulturen war sowohl nach 24 Stunden als auch nach 48 Stunden in Kultur, unabhängig davon welche Stimuli 15 16 Siehe Abbildung 3.8 siehe Abbildung 3.10 - 76 - hinzugegeben wurden, die Zahl der CD83+ Zellen annähernd gleich.18 An Tag zwei waren sie niedriger als an Tag eins. Aus der Tatsache, daß Kulturen mit sortierten CD4+ dendritischen Zellen ohne Stimulation apoptotisch werden, kann man schließen, daß der Stimulus zur Expression von CD83 in PBMC-Kultur nicht von den Zusätzen kam. Naheliegend ist anzunehmen, daß die CD83-Expression auf den dendritischen Zellen durch Stimulation bei Zell-Zell-Kontakt bedingt ist oder durch Reize aus dem Milieu der Mikroumgebung der mononukleären Zellen. Was also die Expression von CD83 bzw. die Ausreifung der dendritischen Zellen betrifft, hatten Zusätze von GM-CSF und TNF-α keine Auswirkung auf die dendritischen Zellen in PBMC-Kultur, wie sie es hingegen in sortierten Zellkulturen hatten. Die CD4+ dendritischen Zellen verhielten sich in der PBMC-Kultur jedoch nicht ganz unabhängig von den zugesetzten Stimuli. Beispielsweise waren nach Zugabe von LPS nach 24 Stunden keine vitalen dendritischen Zellen mehr nachweisbar. Dieser Effekt ist wohl auf eine indirekte Wirkung zurückzuführen, wie zum Beispiel die LPSWirkung auf Monozyten/Makrophagen. Dies überrascht insofern, als LPS auf die CD83 Expression in Kultur von sortierten dendritische Zellen einen geringen Effekt hatte.19 Eine Auswirkung von GM-CSF auf die Kultur mononukleärer Zellen zeigte sich auch insofern, als die Anzahl der dendritischen Zellen gegenüber unstimulierten Kulturen wesentlich geringer abfiel.20 Der Unterschied lag vor allem bei den CD83dendritischen Zellen,21 das bedeutet, daß die Vitalität bzw. Überlebenszeit von CD83+ dendritischen Zellen in PBMC-Kulturen bei Zugabe von GM-CSF höher ist, als bei CD83-negativen dendritischen Zellen. Ein ähnliches Phänomen ist auch bei den aus Monozyten generierten dendritischen Zellen beschrieben. Sie reifen erst nach einem zweiten Kulturschritt aus, exprimieren CD83 und bleiben damit über Tage stabil und vital (7, 72). Man könnte die Hypothese aufstellen: Wenn die Zellen vom Immunsystem gebraucht werden, wird durch die Stimulation die Lebensdauer der Zellen reguliert und damit die Kontrolle der Immunreaktion. 17 siehe Abschnitt 3.2.3 siehe Abschnitt 3.3.2 und Abbildung 3.10. 19 siehe Abbildung 3.4 20 siehe Abbildung 3.8 21 siehe Abbildung 3.11 18 - 77 - Die dendritischen Zellen befinden sich in der PBMC-Kultur, wie oben schon erwähnt, in einer Mikroumgebung von verschiedenen Zellen und/oder in direktem Zellkontakt mit B-, T-Lymphozyten, NK-Zellen, Monozyten, Basophilen u.a. Es ist anzunehmen, daß in diesem komplexen System ein reger gegenseitiger Einfluß stattfindet. Ein Nachteil dieser Methode ist, daß diese Einflüsse auf die dendritischen Zellen nicht direkt nachvollziehbar bzw. kontrollierbar sind, das heißt, man kann die Wirkung von unterschiedlichen, definierten Stimuli auf die dendritischen Zellen nur begrenzt abschätzen. Die Komplexität ist aber nicht nur als Nachteil zu sehen. Die dendritischen Zellen werden in der PBMC-Kultur nicht „unphysiologisch“ angereichert auf eine Zellreinheit und -dichte, wie sie physiologisch im Blut nicht vorkommen würde, sondern sie werden unter den anderen mononukleären Zellen des peripheren Blutes verbleibend untersucht. Sicherlich ist auch eine PBMC-Kultur artifiziell, da die physiologische Ausreifung der dendritischen Zellen in vivo in der spezifischen Zellzusammensetzung des entzündeten Gewebes und/oder der dazugehörigen Lymphorgane stattfindet und meist nicht in der Zusammensetzung der mononukleären Zellen des peripheren Blutes. Doch bedeutet diese Kulturmethode zumindest eine Annäherung an die Bedingungen innerhalb des menschlichen Körpers. Die Ergebnisse der PBMC-Kulturen werfen viele Fragen auf. Welche Zellen unter den mononukleären Zellen wirken auf die CD4+ dendritischen Zellen stimulierend? Was für Zytokine im Überstand haben welche Auswirkungen? In Zukunft könnten zum Beispiel Experimente zum Verständnis der PBMC-Kultur beitragen, die sortierte dendritische Zellen mit definierten anderen mononukleären Zellen in Kultur untersuchen. Dies könnte Aufschluß darüber geben, wie dendritische Zellen nicht nur die primäre und sekundäre Immunantwort kontrollieren, sondern ihrerseits vom Immunsystem kontrolliert werden. - 78 - Stimulierbarkeit – eine Möglichkeit der funktionellen Charakterisierung der dendritischen Zellen: Dendritische Zellen verändern sich entsprechend den Bedingungen und Erfordernissen. Sie haben in den verschiedenen Entwicklungsstadien unterschiedliche Funktionen. Warum oder wodurch sie nun von einem Stadium ins andere gelangen, ist von besonderem Interesse, weil dies über mögliche Funktionen und Interaktionen mit den anderen Zellen des Immunsystems aussagen kann. Die Veränderungen der dendritischen Zellen aus CD34+ Stammzellen 22 oder aus CD14+ Monozyten 23 in Kultur wurden in vielen Veröffentlichungen beschrieben und in den letzten Jahren wurden die Kulturbedingungen maßgeblich verfeinert. Über die Stimulierbarkeit von menschlichen CD4+ dendritischen Zellen weiß man bisher relativ wenig. Sie werden als nichtproliferierende Vorläuferzellen beschrieben (51), was in der vorliegenden Arbeit bestätigt werden konnte. Obwohl GM-CSF und TNF-α sowohl in vivo als auch in vitro Proliferationsstimuli für hämatopoetische Vorläuferzellen sind, änderte sich die Zahl der CD4+ dendritischen Zellen in Kultur nach 48 und 72 Stunden nicht. Um diese Aussage zu verifizieren, hätte man auch noch andere Methoden anwenden können – wie zum Beispiel Proliferationmessung mittels Einbau von radioaktivem Thymidin – doch ergaben die Zellzählungen vor und nach Kultur, abzüglich des Zellverlustes für das Waschen, eindeutig keine Vermehrung der dendritischen Zellen. CD4+ dendritische Zellen des peripheren Blutes und Granulozyten-Makrophagen-koloniestimulierender Faktor: Die CD4+ dendritischen Zellen aus dem peripheren Blut brauchen – wie in dieser Arbeit gezeigt werden konnte – in Kultur GM-CSF, um vital zu bleiben. Ohne GM-CSF wurden die dendritischen Zellen apoptotisch, was mit vier unterschiedlichen Methoden beurteilt wurde (Auflichtmikroskop und Trypanblaufärbung, als auch Scattereigenschaften und Propidium Iodid Färbung im Durchflußzytometer). Weitere 22 23 Zu dendritischen Zellen aus CD34+ Stammzellen siehe Literaturverzeichnis Nr. 12, 21, 63, 90 und 91. Zu dendritischen Zellen aus CD14+Monozyten siehe Literaturverzeichnis Nr. 7, 72 und 94.. - 79 - mögliche empfindliche Apoptoseparameter wären die Beurteilung der DNA- Fragmentierung und Annexin 5 gewesen, doch boten die angewendeten Methoden derart deutliche Ergebnisse,24 daß darauf verzichtet werden konnte. GM-CSF ist sowohl ein hämatogener Wachstumsfaktor als auch ein Mediator von Entzündungsprozessen, das heißt er ist im Körper einerseits ein Proliferationsstimulus für Vorläuferzellen und andererseits aktiviert er ruhende Zellen. Er stimuliert die Myelopoese, aktiviert Makrophagen und dendritische Zellen, hemmt das Wachstum von T-Lymphozyten und wirkt auf die Differenzierung von BLymphozyten ein (1). Ist es vor dem Hintergrund der bisherigen Veröffentlichungen zu CD4+ dendritischen Zellen nun verwunderlich oder eher selbstverständlich, daß GM-CSF in Kultur notwendig für den Erhalt vitaler CD4+ dendritischer Zellen ist? Seit dendritische Zellen bekannt sind, gilt GM-CSF als das wichtigste Zytokin für die Ausreifung der Zellen in vitro. Sowohl die Generierung dendritischer Zellen aus CD34+ Stammzellen als auch die Isolation und Anreicherung aus CD14+ Vorläufern verwenden als bisher nicht ersetzbaren Stimulus GM-CSF. Es ist also für Ausreifung und Aktivierung myeloider dendritischer Zellen als essentiell anzunehmen. Nachdem im Mausthymus die ersten lymphoiden dendritischen Zellen identifiziert werden konnten, wurden die Vorläuferzellen untersucht. Zwei Drittel konnten sich mit IL-3 und IL-7 zu dendritischen Zellen entwickeln, die MHC-I und –II+, CD11c+, CD80+ und CD86+ waren und funktionell in der gemischten Lymphozytenkultur typischen dendritischen Zellen vergleichbar waren. Zusatz von GM-CSF hatte keinen Effekt auf die dendritischen Zellen. Ohne Interleukine war es allerdings ein leichter Stimulus (76). In menschlichen Tonsillen wurden dann plasmazytoide Zellen beschrieben (CD4+, CD45RA+, CD11c-, CD3-), die mit IL-3 und CD40L Stimulation in CD83+ dendritische Zellen ausreifen können (29). Interleukin-3 ist ein breiter hämatopoetischer Wachstumsfaktor, auch multi-CSF genannt. Es wird von TH1-, TH2-Lymphozyten und von einigen zytotoxischen T-Lymphozyten gebildet (1). Die Rezeptoren von GM-CSF und IL-3 bestehen jeweils aus einer β- und einer α-Kette, wobei sich nur die α-Kette unterscheidet. Myeloide dendritische Zellen exprimieren im Gegensatz zur hohen 24 Siehe Abschnitt 3.2.3 - 80 - Expression von α-Ketten des GM-CSF-Rezeptors nur wenig IL-3-Rezeptor, während lymphoide dendritische Zellen aus Tonsillen viel IL-3-Rezeptor und wenig GM-CSFRezeptor exprimieren (67). Dies kann die unterschiedliche Bedeutung von IL-3 und GM-CSF erklären. Einschränkend ist zu sagen, daß Rezeptoren einem funktionellen Turnover unterliegen und im Sinne einer Rückkopplung – bei vorhandenem Stimulus – kann der Rezeptor von der Zelloberfläche reduziert werden. Die Expression eines Rezeptors auf der Zelloberfläche sagt also nur begrenzt etwas über die Bedeutung des Rezeptors für die Zelle aus. Zusammenfassend kann man sagen, daß aus der Literatur nicht eindeutig hervorgeht, wie die funktionellen Eigenschaften der Stimulierbarkeit von humanen CD4+ dendritischen Zellen des peripheren Blutes ist. Da sich dendritische Zellen aus Blut und Lymphgewebe sowohl funktionell (in MLR) als auch phänotypisch (HLA-DR, CD54, CD80 und CD86) unterscheiden (30), sind sie nicht als identisch zu sehen. Von dendritischen Zellen der Maus kann man ebenfalls nur begrenzt auf humane Zellen schließen, da zum Beispiel CD8+ dendritische Zellen bisher nur bei Mäusen nachgewiesen werden konnten (2). Die Daten der vorliegenden Arbeit über GM-CSF widersprechen also nur bedingt den erwähnten Literaturstellen über die Bedeutung von GM-CSF oder IL-3 für lymphoide dendritische Zellen (29, 67, 76). Weiterführende Vergleiche zwischen GM-CSF und IL-3 auf der einen und CD4+ dendritischen Zellen aus Blut oder Tonsillen auf der anderen Seite werden die diskutierten Unterschiede und Ähnlichkeiten klären können. GM-CSF, ein endogener Reiz des Immunsystems, konnte in der vorliegenden Arbeit als alleiniger Stimulus nicht ersetzt werden durch exogene Reize wie Doppelstrang-RNA oder E.coli-DNA. Myeloide dendritische Zellen hingegen können mit ds-RNA aktiviert werden, die T-zellstimulierende Kapazität erhöht und die Interferonproduktion der dendritischen Zellen angeregt werden (17). Dieser Unterschied zeigt, daß die CD4+ dendritischen Zellen von einem kleineren Spektrum an Reizen aktiviert werden und damit die Bedeutung von GM-CSF für diese Zellen hervorgehoben wird. Wie Ribonukleinsäure als Stimulus in Kombinationen wirken kann, bleibt offen. Ebenfalls führte GM-CSF dazu, daß 10% der Zellen nach 48 Stunden CD83 exprimierten, das heißt ausreiften. Auffallend war, daß der Zusatz von LPS zusätzlich - 81 - mit GM-CSF keinen wesentlichen Unterschied in der Expression von CD83 bewirkte. Im Gegensatz zu GM-CSF und TNF-α, die im Wesentlichen von TH1-Lymphozyten und damit bei intrazellulären Infektionen gebildet werden, tritt LPS als Endotoxin bei bakteriellen Infektionen auf. Die Bedeutung von dendritischen Zellen bei bakteriellen Infektionen wird erst nach und nach bekannt (65). So erfolgt bei der Inhalation nicht nur von Viren sondern auch von Bakterien die Migration von dendritischen Zellen in die Epithelien der Luftwege schneller als beispielsweise diejenige der neutrophilen Granulozyten (48). Intravenöse Injektion von LPS verursacht sowohl eine massive Migration von dendritischen Zellen aus Darm (44), Haut, Herz und Niere (68), als auch in der Milz eine Ausreifung und Bewegung von den Randzonen in die T-Zellregionen (20). Diese Untersuchungen in vivo unterscheiden entweder nicht zwischen myeloiden und lymphoiden dendritischen Zellen oder beziehen sich auf erstere. Verwundert es daher, daß die CD4+ dendritischen Zellen nicht auf LPS reagierten? Dafür könnte es verschiedene hypothetische Erklärungen geben. Am wahrscheinlichsten, ist eine Kontamination der GM-CSF-stimulierten Kulturen anzunehmen was bedeuten würde, daß dadurch die Zugabe von LPS keinen verstärkten Reiz darstellte. In unabhängigen Experimenten hatte sich zum Beispiel gezeigt, daß mehrere Chargen des fetalen Kälberserums mit LPS kontaminiert waren. Weiterhin ist zu erwähnen, daß die eminente Wirkung von LPS auf die CD14+ Vorstufen der myeloiden dendritischen Zellen nicht verwundert, da CD14 Rezeptor für den Komplex aus LPS und lipopolysaccharidbindendem Protein ist und lymphoide dendritische Zellen diesen Rezeptor nicht tragen. CD4+ dendritische Zellen des peripheren Blutes und Tumornekrosefaktor alpha: Die Wirkung von TNF-α auf lymphoide dendritische Zellen ist bislang nicht bekannt. Es wurde in der vorliegenden Arbeit in seiner Auswirkung auf CD4+ dendritische Zellen aus Blut in Kultur untersucht. Es stellte sich als starker Reiz für die Expression von CD83 heraus. Der Zusatz von TNF-α zur Kultur verzweieinhalbfachte den Anteil der CD83+ Zellen nach 48 Stunden gegenüber der basalen Stimulation mit GM-CSF. Es führt also – neben seiner Funktion der Aktivierung von Neutrophilen, - 82 - Monozyten und myeloiden dendritischen Zellen bei der akuten Entzündungsreaktion – zur Ausreifung von CD4+ dendritischen reifeinduzierende Wirkung von TNF-α zu- Zellen. Interessanterweise war die und abnehmend dosisabhängig. Bei mittleren Konzentrationen war die Expression von CD83 höher als bei niedrigen und hohen Konzentrationen.25 Damit verhalten sich die CD4+ dendritischen Zellen gegenüber TNF-α nicht anders als myeloide dendritische Zellen, die von CD34+ Stammzellen aus Knochenmark generiert wurden und bei hohen Dosen von TNF-α in ihrer Ausreifung gehemmt werden (63). CD83 ist auf dendritischen Zellen als Reifemarker beschrieben(102); von TNFα konnte gezeigt werden, daß er CD4+ dendritische Zellen diesen Reifemarker exprimieren läßt. Die T-zellstimulierende Aktivität, die bei myeloiden dendritischen Zellen auch ein Reifekriterium ist, konnte jedoch durch TNF-α bei CD4+ dendritischen Zellen nicht erhöht werden. 26 Es bleibt also die Frage offen, welche anderen funktionellen Veränderungen außer CD83-Expression TNF-α bewirkt hat oder auch nicht bewirkt hat. Auf die dendritischen Zellen in der PBMC-Kultur wirkten Stimuli anders als auf die sortierten Zellen. Auf die Expression von CD83 hatte TNF-α keine Auswirkung. Es konnte keine Erhöhung der Expression im Vergleich zu nicht stimulierten Kulturen oder nur mit GM-CSF stimulierten Kulturen bewirken. Bewirkte GM-CSF noch, daß CD83dendritische Zellen in Kultur eine höhere Vitalität hatten, also weniger Zellen apoptotisch wurden, so war durch den Zusatz von TNF-α auch in der Zellzahl keine Auswirkung zu beobachten. Was kann dafür ein Grund gewesen sein? Auch schon ohne Stimulation exprimierten am ersten Tag die Hälfte der dendritischen Zellen CD83, ein Prozentsatz, der mit TNF-α bei sortierten dendritischen Zellen nicht erreicht werden konnte. Es ist also anzunehmen, daß die Zell-Zellinteraktion in der Kultur mononukleärer Zellen eine so starke Stimulation darstellt, daß ihr gegenüber der Zusatz von TNF-α ein zu vernachlässigender Reiz war. 25 26 Siehe Abbildung 3.5 Siehe Abbildung 3.15 und die Diskussion von CD83 auf Seite 88ff. - 83 - Die Tumornekrosefaktorfamilie – zu der außer TNF-α auch TNF-β, FasL und CD40L gehören – sind trimere Proteine und werden im Wesentlichen von THelferzellen gebildet. TNF-α existiert sowohl in gelöster als auch membranassoziierter Form. Er bindet an TNF-Rezeptor I, wodurch Apoptose induziert werden kann (3). TNF-α besitzt jedoch eine ganze Fülle an biologischen Funktionen. Im Rahmen der Akut-Phase-Antwort wird es zusammen mit IL-1 und IL-6 von Makrophagen gebildet und wirkt u.a. als endogenes Pyrogen, bewirkt Mobilisation Neutrophiler aus dem Knochenmark und nicht zuletzt wirkt es auf die Migration dendritischer Zellen in die Lymphe und ihre Ausreifung (siehe unten). TNF-α kann entzündliche Gefäßverschlüsse induzieren, begrenzt lokale Entzündungen, wirkt jedoch fatal bei systemischer Freisetzung (57). Auch bei myeloiden dendritischen Zellen ist TNF-α ein starker Stimulus zur Expression von CD83. Aus CD14+ Vorstufen mit GM-CSF und IL-4 generierte dendritische Zellen exprimieren erst CD83, wenn sie entweder mit TNF-α und PGE-2 (66) oder mit Monozyten-konditioniertem Medium, in dem auch TNF-α ist (61), zusätzlich stimuliert werden. Der Zusatz von TNF-α bewirkt nicht nur eine erhöhte Expression von CD83 im Vergleich zu TNF-α-freien Kulturen, sondern auch von den costimulierenden Molekülen CD80 und CD86 und eine verstärkte T-zellstimulierende Kapazität (18). Für die Methode, dendritische Zellen aus CD34+ Vorläufern zu generieren, ist TNF-α zusammen mit GM-CSF essentiell (12). Nach 14 Tagen Kultur exprimieren diese dendritischen Zellen auch CD83, CD80, CD86 und HLA-DR (14). Als Zytokin der akuten Entzündungsreaktion aktiviert also TNF-α nicht nur myeloide dendritische Zellen, sondern auch die CD4+dendritischen Zellen des peripheren Blutes und induziert eine Ausreifung. - 84 - RSV Infektion und CD40 Stimulation, exogener versus endogener Reiz? Neben den gelösten Stimuli der Zytokin-Zellumgebung GM-CSF und TNF-α wurden in der vorliegenden Arbeit die Auswirkungen von zelleigenen Stimuli (CD40) und einer viralen Infektion (RSV) untersucht. CD40 ist ein membrangebundenes Molekül der TNF-Familie. Es gilt als Antiapoptosesignal und ist verbunden mit den sogenannten TRAFs, den TNF receptor associated factors (42). CD40 aktiviert Makrophagen zur Sekretion von TNF-α und BLymphozyten zum Isotypenwechsel bei der Antikörpersynthese (3). Die in dieser Arbeit sortierten CD4+ dendritischen Zellen wurden durch die Simulation des CD40-Liganden stimuliert und exprimierten ein Drittel mehr CD83 als nur basal mit GM-CSF stimulierte Zellen. Die CD40-Ligand-Simulation reichte jedoch als apoptosehemmendes Signal nicht aus, um die Zellen für zwei Tage vital zu halten. Es konnte das für die Zellvitalität in Kultur notwendige GM-CSF nicht ersetzen. Es stellte einen Reiz für die CD4+ dendritischen Zellen dar, in Kultur auszureifen. CD40Ligand wirkte also additiv zu GM-CSF. Lymphoide Vorstufen CD4+ dendritischer Zellen aus Tonsillen werden ohne IL3 apoptotisch und reifen bei zusätzlicher Stimulation mit CD40-Ligand zu dendritischen Zellen aus (29). Was für die myeloiden dendritischen Zellen der zweite Differenzierungsschritt zu reifen Zellen in Kultur ist (7, 72), scheint für lymphoide dendritische Zellen die Kultur mit CD40-Ligand zu sein. Myeloide dendritische Zellen exprimieren zwar CD83 nach Stimulation mit CD40-Ligand (10), sind in ihrer Ausreifung und Differenzierung aber nicht so essentiell auf CD40-Ligand angewiesen, wie es für lymphoide dendritische Zellen beschrieben ist. Aber auch für myeloide dendritische Zellen scheint CD40 eine nicht unerhebliche Rolle zu spielen. Auf reifen myeloiden dendritischen Zellen ist CD40 um ein Vielfaches höher exprimiert als beispielsweise auf reifen B-Lymphozyten (13). CD40-Ligand ist für myeloide dendritische Zellen der stärkste Reiz zur Produktion von IL-12 und der Expression von CD54, CD80 und CD86 als auch zur Steigerung der T-zellstimulierenden Kapazität (15). Es tritt also in dem Moment an die Oberfläche, wenn die dendritischen Zellen in Kontakt mit T-Zellen treten. - 85 - Zur Methode des CD40 – CD40-Ligand Kontaktes ist zu sagen, daß sie durch den Antikörper-Zellkontakt zu einer leichten Exposition der dendritischen Zellen von CD40-Ligand führt. Neuere Veröffentlichungen über die Wirkung von CD40-Ligand auf dendritische Zellen verwenden einen Zellrasen mit CD40-Ligand exprimierenden Fibroblasten (67). Dies stellt eine außerordentlich starke Exposition von CD40-Ligand dar. Dies könnte eine mögliche Erklärung für die erwähnten Unterschiede in der Quantität der Wirkung von CD40-Ligand sein, daß für die CD4+ Vorstufen lymphoider dendritischer Zellen aus Tonsillen CD40-Ligand als der stärkste Stimulus beschrieben ist und hier für die CD4+ dendritischen Zellen aus peripherem Blut eher einen leichten Reiz darstellt. CD40 wirkt über seinen intrazellulären Anteil und ist somit ein endogener Reiz. Ist eine Virusexposition als exogener Reiz komplementär dazu oder eine Virusinfektion im Sinne der intrazellulären Aktivierung der Zelle mit CD40-Ligand eher vergleichbar? Daß dendritische Zellen bei verschiedenen Viruserkrankungen (Masern, HIV, Herpes) eine Rolle spielen, ist seit einigen Jahren bekannt. Hier wurden die Auswirkungen von RSV auf CD4+ dendritische Zellen untersucht. Nach einer Exposition mit RSV waren von den übrigbleibenden CD4+ dendritischen Zellen 95,6%±1,3% nicht mit RSV infiziert. Durch die Prozedur der Infektion sank sowohl die Anzahl der Zellen insgesamt als auch der Anteil der vitalen Zellen erheblich ab, so daß die vitalen Zellen auf unter 42% reduziert wurden und sie schon nach 24 Stunden und nicht nach 48 Stunden durchflußzytometrisch nennenswerte untersucht Erhöhung der wurden. Expression Infizierte von CD83 Zellen zeigten gegenüber auch nicht keine infizierten dendritischen Zellen. Die Tatsache, daß beide Populationen CD83 exprimierten (16%±0,9 ohne RSV- und 24,8%±4 nach RSV-Exposition), legt eine Kontamination während der Infektion der Zellkulturen nahe, nivelliert aber nicht den Unterschied. Auffallend war jedoch, daß diejenigen dendritischen Zellen, welche CD83 exprimierten, nicht RSV positiv waren und umgekehrt.27 Dies bedeutet, daß nur unreife, CD83dendritische Zellen mit dem RS-Virus infiziert werden konnten, Zellen also, die noch nicht ausdifferenziert sind. Dabei stellt sich die Frage, wie und ob die CD4+ dendritischen Zellen bei der Infektion mit RSV von Bedeutung sind? Durch eine RSV Infektion kann eine nachfolgende Hyperreagibilität des Bronchialsystems induziert werden, bei der IL-5 und Eosinophile eine essentielle Rolle spielen (79). RSV Infektion - 86 - bei Säuglingen ruft eine TH2-dominierte Immunantwort hervor (70). Angesichts dessen, daß TH2-Zellen durch lymphoide CD4+ dendritische Zellen aktiviert werden (67), können diese Zellen in der Pathogenese der RSV Infektion und der durch sie verursachten Hyperreagibilität eine nicht zu unterschätzende Rolle spielen. Die Ergebnisse, daß RSV die CD4+ dendritischen Zellen scheinbar kaum infizieren kann und damit auch keine Ausreifung induziert, spricht vorerst nicht gegen diese Hypothese, da RSV die Vitalität der Zellen erheblich beeinflußte. Der Hinweis, daß ausschließlich CD83- Zellen infiziert wurden, könnte weiteren Aufschluß geben. Ausreifung und Schritte einer Differenzierung der CD4+ dendritischen Zellen aus peripherem Blut: Die CD4+ dendritischen Zellen des peripheren Blutes sind unreife, noch nicht ausdifferenzierte Zellen. Sie haben noch keine dendritische Morphologie. Sie befinden sich im Prozeß der Differenzierung. Um die Bedingungen ihrer Entwicklung kennen zu lernen braucht es Parameter, durch welche die Ausreifung der dendritischen Zellen kenntlich gemacht werden kann. Klassischer Weise ist dies neben der Zellmorphologie die hohe Expression von MHC-II Komplexen und eine starke T-zellstimulierende Potenz. Diese drei Kriterien reifer dendritischer Zellen erfüllen die in dieser Arbeit sortierten CD4+ dendritischen Zellen nach 48 Stunden in Kultur mit GM-CSF. Hier sollen darüber hinaus zwei weitere Möglichkeiten diskutiert werden, die Veränderungen bei der Ausreifung der dendritischen Zellen zu beschreiben. Zum einen der seit einigen Jahren bekannte Oberflächenmarker CD83 und zum anderen ein Phänomen, daß während der Experimente dieser Arbeit in den Scattereigenschaften des Durchflußzytometers aufgefallen ist. Weiterhin werden in der Literatur Kostimulierende Moleküle (CD40, CD80, CD86) und Adhäsionsmoleküle (CD50, CD54, CD58) als Reifezeichen angegeben (6). 27 Siehe Abbildung 3.7 - 87 - CD83 als Reifemarker der dendritischen Zellen: Unter welchen Bedingungen CD4+ dendritische Zellen CD83 exprimieren, war bisher nicht bekannt. Die in dieser Arbeit sortierten CD4+ dendritischen Zellen des peripheren Blutes exprimieren direkt nach Sortierung, also weniger als acht Stunden nach Blutentnahme, kein CD83. Umgekehrt ist auf den CD83+ dendritischen Zellen aus dem Blut kein CD4 (102). Für die Expression von CD83 auf den CD4+ dendritischen Zellen war TNF-α der stärkste Stimulus,28 aber auch LPS, CD40 und das für die Vitalität der CD4+ dendritischen Zellen in Kultur notwendige GM-CSF führten zu einer leichten Expression von CD83. Mit CD83 trat auch die typische, für dendritische Zellen namensgebende Zellmorphologie auf. Dies sind Hinweise darauf, daß CD83 auch bei CD4+ dendritischen Zellen als ein Reifemarker anzunehmen ist. Als das wichtigste Kennzeichen und auch Reifezeichen der dendritischen Zellen gilt jedoch ihre hohe T-zellstimulierende Potenz. Wie verhielt sich nun diese Zelleigenschaft im Vergleich zur Expression von CD83? Die sortierten dendritischen Zellen hatten nach zwei Tagen in Kultur mit GM-CSF eine hohe T-zellstimulierende Aktivität und exprimierten zu 11,2%±5,8% CD83. Von den Zellen, welche auch mit TNF-α stimuliert wurden, exprimierten zwar fast drei mal so viele Zellen CD83, sie unterschieden sich jedoch nicht in ihrer T-zellstimulierenden Aktivität von den nur mit GM-CSF stimulierten dendritischen Zellen Lymphozytenkultur. Zellen. veränderte Eine Eine also erhöhte nicht gemeinsame Expression ihre von Eigenschaft Entwicklung von CD83 in der CD83 unter den gemischten und T- zellstimulierender Aktivität ist jedoch keineswegs zwingend. Außer den zwei schon erwähnten Populationen dendritischer Zellen im Blut – eine CD83- Population, die in Kultur CD83+ werden kann und eine andere, die schon zirkulierend CD83 exprimiert und eine hohe T-zellstimulierende Aktivität hat – ist eine dritte Population beschrieben, die der reifen gleicht, jedoch nur eine niedrige T-zellstimulierende Aktivität besitzt (98). Zhou und Tedder beschreiben, daß die im Blut zirkulierenden CD83+ Zellen schon die höchste T-zellstimulierende Potenz besitzen, aber daß die Expression von CD83 keinen Endpunkt in der Aktivierbarkeit der Zellen darstellt. Die Oberflächendichte sowohl von MHC als auch von kostimulierenden Signalen nahm während der gemischten 28 Siehe Abbildung 3.4 und Diskussion von TNF-α Seite 83ff - 88 - Lymphozytenkultur zu (102). Damit nimmt die Fähigkeit der Stimulation der T-Zellen noch weiter zu. Das CD83-Molekül, auch HB15 genannt, ist ein mittelgroßes (43 kDalton) Glykoprotein der Immunglobulin Superfamilie in Zytoplasma, Zellwand und Zelloberfläche, dessen Funktion bisher nicht bekannt ist. Es ist ein Oberflächenmarker, der im Blut selektiv auf dendritischen Zellen, nicht jedoch auf zirkulierenden B- und TLymphozyten, Monozyten, NK-Zellen und unreifen myeloiden dendritischen Zellen exprimiert wird (102). CD83+ dendritische Zellen im Blut werden als eine phänotypisch homogene Population beschrieben, welche die höchste Expression von MHC-II Komplexen aufweist und außerdem CD40, CD86 und CD11a auf der Zelloberfläche tragen (102). Zusammen mit einer hohen T-zellstimulierenden Kapazität, sind dies Charakteristika reifer dendritischer Zellen, was CD83 zu einem Reifemarker macht. Diese Annahme geht allerdings von myeloiden dendritischen Zellen aus, die im unreifen Stadium T-Zellen noch wenig stimulieren und MHC und kostimulierende Moleküle niedrig exprimieren. Die Angaben über die CD83+ dendritischen Zellen des peripheren Blutes beziehen sich jedoch nicht auf myeloide dendritische Zellen allein. Die Population der CD83+ dendritischen Zellen im Blut exprimieren sowohl lymphatische – CD2, CD5, CD40 und CD78 – als auch myeloische Oberflächenmarker wie CD13, CD33, CD36 und CD63 (102). Wie erwähnt konnte auf myeloiden, aus Monozyten generierten, dendritischen Zellen erst in substanziellen Mengen CD83 gefunden werden, als zu dem üblichen Reifeschritt mit GM-CSF und IL-4 in Kultur ein weiterer Differenzierungsschritt mit MCM angeschlossen wurde (7). Der Prozentsatz der CD83+ Zellen ist mit 30-80% (72) bei dieser Methode dem der CD4+ lymphoiden dendritischen Zellen aus der vorliegenden Arbeit vergleichbar.29 Auf myeloiden dendritischen Zellen kann die Expression von CD83 noch durch Calcium-Ionophor-Behandlung erhöht werden (19). Aus CD34+ Stammzellen generierte dendritische Zellen unterscheiden sich nur insofern in der CD83 Expression von den aus Monozyten kultivierten Zellen, als dafür GM-CSF und TNF-α als Stimuli ausreichen (14). 29 Siehe Abbildung 3.4 und 3.10. - 89 - Interessanterweise kann die Expression von CD83 gehemmt werden durch eine zu hohe Zelldichte in Kultur. Wenn also CD83+ dendritische Zellen, die nur eine äußerst geringe Zelldichte(0,16% / PBMCs) im Blut haben (102), zu dicht in einer Zellkultur sind (>0,5×106 /ml), dann wird die Ausreifung gehemmt (95). Veränderungen von Größe und Granularität der CD4+ dendritischen Zellen: In der vorliegenden Arbeit waren nach der Sortierung und im Livegate frischer PBMC die dendritischen Zellen eine homogene Population kleiner Zellen mit niedriger Granularität. Nach Kultur der Zellen mit den verschiedenen Stimuli konnten deutlich drei verschiedene Populationen in den Scattereigenschaften abgegrenzt werden. 30 Seit Beginn Scattereigenschaften der das Durchflußzytometrie Vorwärtsstreulicht (FSC), ist bekannt, welches die daß Zellen in in den der Meßküvette erzeugen, mit der Größe der Zellen korreliert und das rechtwinklige Seitwärtsstreulicht (SSC) mit der Granularität der Zellen (59). Dies bietet zwar keine absoluten Werte aber relative Vergleichsmöglichkeiten, um eindeutig abgrenzbare Populationen voneinander zu unterscheiden. Es ist beschrieben, daß mit fortschreitender Ausreifung die Größe der dendritischen Zellen zunimmt (86). In der vorliegenden Arbeit konnte gezeigt werden, daß der Anteil der CD83 exprimierenden Zellen mit steigender Größe und Granularität zunimmt. Zusammen mit der Tatsache, daß die Population mit den niedrigsten FSCund SSC-Eigenschaften eine an null grenzende Expression von CD83 hatte und in den Scattereigenschaften mit den Zellen vor der Stimulation in Kultur identisch war, lassen diese Hinweise die Annahme zu, daß die unterscheidbaren Populationen Reifestadien sind. Die drei verschiedenen Populationen können also als Stufenschritte der Ausreifung dendritischer Zellen angenommen werden. Die mittlere Population lag in FSC und SSC zwischen den beiden anderen. Sie wurde für die weitere Auswertung und den Vergleich verschiedener Stimuli auf die CD4+ dendritischen Zellen genommen, da auf die Mengenverteilung der Zellen unter den drei Populationen die verschiedenen Stimuli - 90 - keinen Einfluß hatten. Unabhängig von den Zusätzen waren mehr als 85% der Zellen nach Kultur in der mittleren Population. Ist es denkbar, daß CD4+ dendritische Zellen in der Pathogenese des atopischen Asthma bronchiale eine Rolle spielen? Bei der Entstehung und dem Krankheitsverlauf von Asthma bronchiale stehen Dysregulationen der Immunvorgänge des Respirationstraktes im Vordergrund. Darüber, wie dendritische Zellen an der Pathogenese beteiligt sein können, gibt es verschiedene Hinweise. Die einfachste Möglichkeit, diese zu untersuchen, sind die dendritischen Zellen des peripheren venösen Blutes. In der vorliegenden Arbeit waren im Blut der Asthmatiker signifikant mehr CD4+ dendritische Zellen im Durchflußzytometer identifizierbar als bei gesunden Vergleichspersonen (P=0,022).31 Dieses Ergebnis paßt zu der Hypothese, daß verstärkt lymphoide dendritische Zellen über die Stimulation von TH2-Lymphozyten 32 an der bronchialen Hyperreagibilität beteiligt sind (s.u.). In der Pathogenese von Asthma spielt IgE eine wichtige Rolle. Die Werte von IgE im Serum korrelieren eng mit den klinischen Symptomen und der bronchialen Hyperreagibilität der Asthmatiker (8). IgE bindet an den hochaffinen Zelloberflächenrezeptor FcεRI, der nicht nur auf Mastzellen sondern auch auf CD4+ dendritischen Zellen des peripheren Blutes ist, welche diesen Rezeptor für IgEvermittelte Allergenpräsentation verwenden (49). Dies hebt die mögliche Bedeutung der in dieser Arbeit isolierten CD4+ dendritischen Zellen bei Asthmatikern hervor. Außerdem findet sich FcεRI auf dendritischen Zellen in der Haut (88) und in Bronchialepithel, wo erstens eine höhere Anzahl von CD1a+ dendritischen Zellen bei Asthmatikern zu finden ist und zweitens der Rezeptor auf diesen Zellen im Vergleich zu Gesunden erhöht ist (96). Neben IgE und eosinophilen Granulozyten spielen in der Pathogenese des allergischen Asthma bronchiale T-Lymphozyten eine maßgebliche 30 Siehe Abbildung 3.12 Siehe Abschnitt 3.6 und Abbildung 3.16 32 Siehe Diskussion Myeloide- und lymphoide dendritische Zellen Seite 67ff und Literaturangaben 38 und 67. 31 - 91 - Rolle, welche nach Inhalation von Antigenen die TH2-Zytokine IL-3, IL-4, IL-5 und GM-CSF sezernieren (69). Das Netzwerk der dendritischen Zellen in der Lunge ist vergleichsweise stark entwickelt für die Aufnahme von Antigen (27). Es bildet ein dichtes Netz von CD4+ HLA-DR+ dendritischen Zellen, das bei chronisch eosinophiler oder neutrophiler Entzündung eine erhöhte intraepitheliale Dichte aufweist (77). Nach Inhalation von Bakterien zum Beispiel findet eine schnelle Rekrutierung von Vorstufen dendritischer Zellen in das Bronchialepithel statt, wo sie ausreifen (47). Nach Antigenaufnahme wandern die dendritischen Zellen aus der Lunge in regionäre Lymphknoten und induzieren eine primäre Immunantwort (101). Bei der sekundären Immunantwort sind sie ebenfalls wichtig, indem sie inhalierte Antigene den TH2-Zellen präsentieren, welche schon vorher Antigenkontakt hatten und dann durch den erneuten Kontakt eine chronisch eosinophile Entzündungsreaktion der Luftwege induzieren können (40). Bei der folgenden Diskussion der Expression von CD83 auf den CD4+ dendritischen Zellen von Asthmatikern ist zu beachten, daß die Untersuchungen in Form einer Pilotstudie durchgeführt, Hinweise geben. Die Ergebnisse zeigten jedoch keine wesentlichen signifikanten Unterschiede. Die Kriterien für die Auswahl der gesunden Vergleichspersonen waren, daß sie keine klinischen Symptome von Asthma oder saisonaler Rhinitis etc. hatten. Im Nachhinein wurde anhand der Ergebnisse die Vergleichsgruppe unterteilt in Probanden mit positivem Pricktest gegen gängige Allergene – und damit einer atopischen Prädisposition – und in solche Probanden mit negativem Pricktest. Dadurch waren nur noch drei Probanden in jeder Kontrollgruppe, was eine Signifikanzrechnung nicht sinnvoll macht. Interessanterweise hatten Asthmatiker und die Kontrollgruppe mit atopischer Prädisposition eine hohe Expression von CD83 nach Stimulation mit TNF-α, während die Kontrollgruppe mit negativem Pricktest deutlich niedriger CD83 exprimierte. Dies könnte ein Hinweis sein auf eine erhöhte Reagibilität oder Aktivierbarkeit der CD4+ dendritischen Zellen bei Asthmatikern und Personen mit atopischer Prädisposition. Für signifikante Aussagen über die Reagibilität der CD4+ dendritischen Zellen im peripheren Blut bei Asthmatikern, sind weiterführende Experimente nötig. - 92 - Schlußfolgerung und Ausblick: Die in der vorliegenden Arbeit gemachten Experimente zeigen, daß substanzielle Mengen CD4+ dendritischer Zellen im Blut von gesunden Erwachsenen schnell und mit hoher Reinheit untersucht werden können und sich von den aus CD34+ Stammzellen oder aus CD14+ Monozyten generierten dendritischen Zellen unterscheiden. Sie reifen durch Stimulation in vitro aus und erfüllen die gängigen Kriterien der typischen dendritischen Zellen wie Morphologie, Phänotyp und T-zellstimulierende Aktivität. Für die Zukunft zu wünschen ist eine ausreichend differenzierte und übereinstimmende Nomenklatur des komplexen Systems der dendritischen Zellen, die Phänotyp, Funktion und Lokalisation berücksichtigt. Dafür wäre auf den CD4+ dendritischen Zellen des peripheren Blutes die Verteilung von zum Beispiel CD11c, CD80, CD86, und CD123 zu bestimmen. Für die Methode des PBMC-Livegates wäre eine detaillierte Analyse der ZellZell-Interaktionen in der PBMC-Kultur möglich, um die Funktion der dendritischen Zellen im Blut in vivo konkretisieren zu können. Darauf bietet sich geradezu an, mit der in der vorliegenden Arbeit entwickelten Methode die dendritischen Zellen aus dem peripheren Blut bei Patienten mit immunologischen Erkrankungen, wie es exemplarisch hier in einer Pilotstudie für Asthma begonnen und diskutiert wurde, zu untersuchen. - 93 - 5. ZUSAMMENFASSUNG Dendritische Zellen (DC) sind die wichtigsten antigenpräsentierenden Zellen des menschlichen Körpers. Sie sind für die initiierende-, verstärkende-, und regulierende Kontrolle des Immunsystems essentiell. Es gibt myeloide DC, welche die Mehrheit der DC des menschlichen Körpers ausmachen, denen mehr initiierende Eigenschaften, und lymphatische DC, denen mehr regulierende Eigenschaften zugesprochen werden. Über die CD4+ DC weiß man bisher wenig. Wie kann man sie schnell im leicht zugänglichen Blut isolieren? In welchem Stadium sind sie? Wie sind sie funktionell beschaffen und reagieren auf infektassoziierte Stimuli? In der vorliegenden Arbeit konnten sowohl mittels Sortierung mit monoklonalen paramagnetischen Antikörpern CD4+ DC in wenigen Stunden isoliert als auch in einem Livegate auf DC in PBMC durchflußzytometrisch in Minuten identifiziert werden. Die durch diese beiden Methoden untersuchten Zellen, die mehrheitlich zu den lymphatischen Zellen gerechnet werden können, sind weitgehend identisch. Sortierte Zellen gehören zu den in der Literatur beschriebenen CD11c– DC, während die DC im Livegate CD11c– und CD11c+ sind (CD11c- >> CD11c+). In zirkulierendem Blut sind CD4+ DC und ihre Vorstufen nur in sehr geringen Konzentrationen (0,2-1,2%) vorhanden. Sie sind unreif, haben eine Morphologie wie mittelgroße Lymphozyten und sind MHC-II+ und CD3-, CD14-, CD16-, CD19-. Nach 48 Stunden Kultur mit GM-CSF entwickeln sie eine typische dendritische Zellmorphologie, in der gemischten Lymphozytenkultur eine ebenfalls für dendritische Zellen typisch hohe Tzellstimulierende Aktivität und exprimieren den DC-spezifischen Reifemarker CD83. Ohne GM-CSF wurden die CD4+ DC apoptotisch, was nicht durch ds-RNA oder E.coli-DNA verhindert werden konnte. CD40-Ligand und TNF-α stimulierten die Expression von CD83, wobei TNF-α der stärkste Reiz war. LPS war nur ein schwacher Reiz für die CD4+ DC. Exposition der Zellen mit RSV führte zu einem Verlust von >50% der vitalen Zellen. Von den übrigbleibenden Zellen waren nur 5% infiziert. CD83+ Zellen konnten überhaupt nicht infiziert werden. Anhand steigender Größe und Granularität der Zellen konnten in den Scattereigenschaften des Durchflußzytometers drei verschiedene Populationen abgegrenzt werden, mit ansteigender Expression von CD83. Nach 48 Stunden Kultur waren 85% der Zellen in der mittleren Population. Bei Asthmatikern konnten im Livegate signifikant mehr CD4+ DC identifiziert werden als bei gesunden Vergleichspersonen. Für repräsentative Aussagen über die Expression von CD83, die keine signifikanten Unterschiede bei Asthmatikern aufwies, sind weitere Untersuchungen erforderlich. Diese Arbeit charakterisiert die leicht zugänglichen CD4+ dendritischen Zellen des peripheren Blutes, ihre Isolation, Funktion, Reagibilität und mögliche Krankheitsbedeutung. - 94 - 6. LITERATURVERZEICHNIS Die Literatur ist alphabetisch nach Erstautoren geordnet. Bei Artikeln sind angegeben Autoren, Titel, Zeitschrift, Erscheinungsjahr, Band, Heft (in Klammern) und Seitenzahlen (nach dem Doppelpunkt) entsprechend der National Library of Medicine, Bethesda/USA. Hinweise auf Bücher weichen von dieser Form ab. 1. Arai, K.I., Lee, F., Miyatake, S., Arai, N., Yokota, T.: Cytokines: Coordinators of immun and inflammatory responses. Annu. Rev. Biochem. 1990, 59:783. 2. Ardavin, C., Wu, L., Li, C.L., Shortman, K.: Thymic dendritic cells and T-cells develop simultaneously in the thymus from a common precursor population. Nature 1993, 362:761-763. 3. Armitage, R.J.: Tumor necrosis factor receptor superfamily members and their ligands. Curr. Opin. Immunol. 1994, 6:407-413. 4. Banchereau, J., Steinman, R.M.: Dendritic cells and the control of immunity. Nature 1998, 392:245-252. 5. 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Winzler, C., Rovere, P., Rescigno, M., Granucci, F., Penna, G., Adorini, L., Zimmermann, V.S., Davoust, J., Ricciardi-Castangnoli, P.: Maturation stages of mouse DC´s in GF-dependent long-term cultures. J. Exp. Med. 1997, 185:317-328. 101. Xia, W., Pinto, C.E., Kradin, R.L.: The antigen-presenting activities of Ia+ dendritic cells shift dynamically from lung to lymph node after an airway challenge with soluble antigen. J. Exp. Med. 1995, 181(4):1275-1283. 102. Zhou, L.J., Tedder, T.F.: Human blood dendritic cells selectively express CD83, a member of the immunoglobulin superfamily. J. of Immunology, 1995, 154:38213835. 103. Zhou, L.J., Tedder, T.F.: A distinct pattern of cytokine gene expression by human CD83+ blood dendritic cells. Blood 1995 86 (9):3295-3301. 104. Zhou, L.J., Tedder, T.F.: CD14+ blood monocytes can differentiate into functionally mature CD83+ dendritic cells. Proc. Natl. Acad. Sci. USA 1996, 93:2588-2592. Stand der Literatur 1999 - 107 - 7. ANHANG DANKSAGUNG Mein Dank gilt insbesondere meinem Doktorvater Herrn PD Dr. med. U. Schauer, der mir diese Arbeit ermöglicht hat. Er hatte immer Zeit für meine Fragen und begleitete meine Arbeit mit Wohlwollen, exzellenter fachlicher Unterstützung und konstruktiver Kritik. Sehr herzlich möchte ich mich bedanken für die Unterstützung und die freundliche Aufnahme in der Arbeitsgruppe. Ich danke meiner Frau Manon für die Durchsicht des Manuskriptes. Danken möchte ich auch meinen Eltern, die mich während meines Medizinstudiums großzügig und vorbehaltslos in jeder Hinsicht unterstützt haben. Für die gute Kooperation und das zur Verfügung stellen von Buffy-coats danke ich den Mitarbeitern der Blutbank an den städtischen Kliniken Dortmund sowie Frau Dr. Bartling von der Asthmaambulanz an den Berufsgenossenschaftlichen Kliniken Bergmannsheil in Bochum, die mir Informationen über Asthmatiker zur Verfügung stellte. Außerdem bin ich dem Virologischen Institut der Ruhr-Universität Bochum für die Infektion der dendritischen Zellen mit RSV zu Dank verpflichtet. Nicht zuletzt danke ich herzlich Frau Baumeister und Frau Michels, die als Technische Assistentinnen während vieler Stunden im Labor mit Rat, detailliertem Wissen und Können erheblich zum Gelingen meiner Arbeit beigetragen haben. - 108 - LEBENSLAUF • Geboren am 20. Januar 1973 in Reutlingen. • Schulbesuch für die ersten drei Jahre in Basel/Schweiz und danach bis zum Abitur 1992 in Überlingen-Rengoldshausen/Bodensee. • Vorklinisches Studium der Humanmedizin bis zum Physikum 1995 an der Universität Hamburg. • Klinisches Studium an der Universität Witten/Herdecke. • Zwischenzeitlich Studium an der University of Harare/Zimbabwe und an der Case Western Reserve University Cleveland/Ohio, USA. • Stipendiat der Peter und Ruth Wirts Stiftung. • Drittes Staatsexamen der Medizin im Herbst 1999. • Ich bin verheiratet und habe ein Kind. - 109 - Abstract: Feuchtinger, Tobias Isolation von humanen CD4+ dendritischen Zellen aus zirkulierendem Blut und ihr Verhalten bei Stimulation: Hintergrund: Dendritische Zellen (DC) sind die wichtigsten antigenpräsentierenden Zellen des menschlichen Körpers. Sie sind für die initiierende-, verstärkende-, und regulierende Kontrolle des Immunsystems essentiell. Es gibt myeloide DC, welche die Mehrheit der DC des menschlichen Körpers ausmachen, denen mehr initiierende- und lymphatische DC, denen mehr regulierende Eigenschaften zugesprochen werden. Über die CD4+ DC weiß man bisher wenig. Wie kann man sie schnell aus peripherem Blut isolieren? In welchem Stadium sind sie? Wie sind sie funktionell beschaffen und reagieren auf infektassoziierte Stimuli? Methoden und Ergebnisse: In der vorliegenden Arbeit konnten sowohl mittels Sortierung mit monoklonalen paramagnetischen Antikörpern CD4+ DC in wenigen Stunden isoliert als auch in einem Livegate auf DC in PBMC durchflußzytometrisch in Minuten identifiziert werden. Die durch diese beiden Methoden untersuchten Zellen sind weitgehend identisch. Sortierte Zellen gehören zu den in der Literatur beschriebenen CD11c– DC, während die DC im Livegate CD11c– und CD11c+ sind (CD11c- >> CD11c+). In zirkulierendem Blut von Erwachsenen sind CD4+ DC und ihre Vorstufen nur in sehr geringen Konzentrationen (0,2-1,2%). Sie sind „unreif“, haben eine Morphologie wie mittelgroße Lymphozyten und sind MHC-II+ und CD3-, CD14-, CD16-, CD19-. Nach 48 Stunden Kultur mit GM CSF entwickeln sie eine typische dendritische Zellmorphologie, in der gemischten Lymphozytenkultur eine ebenfalls für dendritische Zellen typisch hohe T-zellstimulierende Aktivität und exprimieren den DC-spezifischen Reifemarker CD83. Ohne GM -CSF wurden die CD4+ DC in Kultur apoptotisch, was nicht durch ds-RNA oder E.coli-DNA verhindert werden konnte. CD40-Ligand und TNF-α stimulierten die Expression von CD83, wobei TNF-α der stärkste Reiz war. LPS war nur ein schwacher Reiz für die CD4+ DC. Exposition der Zellen mit RSV führte zu einem Verlust von >50% der vitalen Zellen. Von den übrigbleibenden Zellen waren nur 5% infiziert. CD83+ Zellen konnten überhaupt nicht infiziert werden. Anhand steigender Größe und Granularität der Zellen konnten in den Scattereigenschaften des Durchflußzytometers drei verschiedene Populationen abgegrenzt werden, mit ansteigender Expression von CD83. Nach 48 Stunden Kultur waren 85% der Zellen in der mittleren Population. Bei Asthmatikern konnten im Livegate signifikant mehr CD4+ DC identifiziert werden als bei gesunden Vergleichspersonen. Die Expression von CD83 zeigte keine signifikanten Unterschiede bei Asthmatikern und Kontrollen. Schlußfolgerung: Diese Arbeit charakterisiert die leicht zugänglichen CD4+ DC des peripheren Blutes, ihre Isolation, Funktion, Reagibilität und mögliche Krankheitsbedeutung. Die CD4+ DC können mehrheitlich zu den lymphoiden Zellen gerechnet werden. Sie brauchen GM -CSF in Kultur und reagieren stark auf TNF-α. Die Methode des Livegate ermöglicht zeit- und blutsparend (2ml) die Zellen zu untersuchen und eröffnet weitere Untersuchungsmöglichkeiten. Für repräsentative Aussagen über die Rolle der CD4+ DC bei RSV-Infektion und bei Asthmatikern sind weitere Untersuchungen erforderlich. - 110 -
