Entstehung von Tumorzellen aufgrund bestimmter genetischer Elem

Entstehung von
menschlichen Tumorzellen
aufgrund bestimmter
genetischer Elemente
Einleitung und Begriffserklärung
Krebsentstehung:



Zellen ändern normales Entwicklungsprogramm und vermehren sich
unkontrolliert
Krebszellen erwerben einige neue Eigenschaften
⇒ können unter ungünstigen physiologischen Bedingungen proliferieren
⇒ können Gewebe verlassen, in Umgebung eindringen und in anderen
Geweben oder Organen Tochtergeschwulste (Metastasen) bilden
⇒ neoplastischer Phänotyp
Neoplastischer Phänotyp wird weitervererbt und Krebszellen bringen
durch Teilung ausschließlich Krebszellen hervor
Mutationen, die zur Krebsentstehung führen


Spontanmutationen
Umwelteinflüsse
⇒ Karzinogene
⇒ physikalische Mutagene
⇒ chemische Mutagene
⇒ bestimmte Viren
Gene, die für die Veränderung in Krebszellen verantwortlich
sind,
werden Tumorgene genannt. Man unterscheidet dominante
Tumorgene (Onkogene) und rezessive Tumorgene
(Tumorsuppressorgene).
Begriffserklärung
Krebs:
Unkontrolliertes Wachstum von Körperzellen
 Zellen unterliegen nicht der Kontakt-Inhibition

Tumor:
Neubildungen von Körpergewebe durch
Fehlregulation des Zellwachstums
 Kann gutartig oder bösartig sein

Evolution von Tumorzellen

Erste Mutation:
betroffene Zelle kann sich
häufiger vermehren als
Nachbarzelle
⇒ häufigere DNA-Replikation
⇒ höhere Wahrscheinlichkeit für
zusätzliche Mutationen

Zweite Mutation:
steigert zusätzlich den
Wachstumsvorteil

Weitere Mutationen:
Eigenschaft des unregulierten
Wachstums kann sich voll
ausbilden
Gene, die in Tumorzellen verändert sind
Onkogene:





Gene, die ursprünglich in Viren gefunden wurden
Produkt des viralen Gens verursacht Umwandlung der
infizierten Zelle in Tumorzelle
Entsprechende zelluläre Gene, deren Genprodukt normales
Zellwachstum und Zellteilung stimulieren
Zelluläre Onkogene werden Proto-Onkogene genannt
Bsp.: H-ras, large-T
Mechanismen der Onkogenaktivierung
1.
4.
6.
Wanderung von DNA innerhalb des Genoms
⇒ gebrochene Chromosomen, die sich wieder falsch verbinden
⇒ Proto-Onkogen kann hinter aktivem Promotor zu liegen kommen
Amplifikation
⇒ Erhöhung der Zahl der Genkopien ⇒ Überschuss des Proteins
Punktmutation
⇒ hyperaktives Protein
Diese Mutationen führen zur abnormen Stimulation des Zellzyklus.
Tumorsuppressor-Gene:
Codieren Proteine, die folgende unterschiedliche Eigenschaften haben:
5.
7.
8.
Reparieren beschädigter DNA
⇒ verhindert Anhäufung Krebs-erregender Mutationen
Kontrolle von Adhäsion der Zellen untereinander
Sind Komponenten von Signalübertragungswegen
⇒ hemmen den Zellzyklus
Bei Defekt oder Verlust eines Tumorsuppressorgens kommt es zur
Stimulation des Zellwachstums.
Telomerase:




Katalytische Untereinheit: hTERT
Telomere an Enden der Chromosomen
⇒ verhindern, dass Gen-tragende Sequenzen bei DNAReplikation verloren gehen
In Tumorzellen: erhöhte Zellteilungsrate
⇒ schnellere Verkürzung der Telomer-Bereiche
An kritischem Punkt der Telomer-Verkürzung wird
Telomerase reaktiviert
⇒ Stabilisierung der Telomere
Forschungsschritte


Maus-Zellen lassen sich sehr einfach durch
Einbringen von Onkogenen in Tumorzellen
überführen
Menschliche Zellen hingegen nicht
⇒ könnte an Aktivität der Telomerase liegen (in
MausZellen konstitutive Aktivität der Telomerase)
⇒ Welche und wie viele Onkogene in Kombination mit
der Telomerase führen in menschlichen Zellen zur
Tumorentstehung?
Methoden
Retrovirus
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




Befällt nur teilungsaktive eukaryotische Zellen
Erbinformation liegt als RNA vor
durch reverse Transkriptase wird die eingeschleuste RNA im Wirt in
cDNA umgeschrieben und diese fest im Wirtsgenom eingebaut
Genom enhält gap, pol und env Gene die von den long terminal repeats
(LTR) flankiert werden
gag und pol kodieren für das Gag-Pol-Polyprotein und werden erst später
in reverse Transkriptase und eine Integrase, für den Einbau der Virus-DNA
in das Wirtsgenom zerlegt.
env kodiert für die Glykoproteine die sich nach der Herstellung an die
Wirtsmembran binden. Wenn der Virus aus dem Wirt austritt, stülpt sich
dessen Membran um, und umgibt dann den Virus als Lipidhülle, in die
Glykoproteine eingebaut sind
Retrovirale Transduktion
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
Phoenix Zellen ( Verpackungszelllinie) werden durch Kalzium-PhospatPräcipitation mit dem Plasmid pBABE-hygro-hTert transfiziert. Dieses
enthält LTRs.
Eine weitere Zelllinie wird mit dem Plasmid pBABE-puro-ras - V12
transfiziert und aus dem SV 40 enthält man das large-T.
da die Verpackungszelllinie die Gene gag, pol und env schon enthält und
dem entsprechend die Proteine dazu herstellt, können diese Zellen einen
Retrovirus herstellen, der anstatt seiner natürlichen Gene, die Gene des
eingebrachten Plasmids enthält.
Man nimmt nun den Überstand der einzelnen Zellen, der die Viren
(amphotrop) enthält und infiziert damit die HEK (human embryonic
kidney) und die BJ Fibroblasten-Zellen nacheinander
Die Zellen in welche die Viren ihr Genom eingebaut haben, werden mit
den Antibiotika Hygromycin, Puromycin und Neomycin selektiert.
TRAP-Assay
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

telomeric repeat
amplification protocol
Nachweis von
Telomerase-Aktivität
Zugabe von
fluoreszenz TSPrimern, die am 3`Ende der
Telomersequenz
entsprechen,
Nukleotidmix, DNATaq-Polymerase
Telomerase verlängert
TS-Primer
TRAP-Assay

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

Reaktion wird durch
Hitze gestoppt
Durch PCR wird DNA
vervielfältigt
⇒ reverse Primer
lagern sich an und
durch Taq-Polymerase
wird der Strang
repliziert
Alf-Expresses
(Automated Laser
FluorescenceSequencer)
ALF-Sequencer
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
Automated laser fluorescence Sequenzer
mit diesem Gerät erfolgt eine automatische Erkennung
von fluoreszenzmarkierten DNA-Molekülen durch einen
Laser mittels elektrophoretischer Trennung
Länge der DNA-Stücke wird durch den Zeitpunkt
bestimmt, an dem sie den Laser passieren
⇒ d.h. je kürzer die DNA-Fragmente sind, desto eher
werden sie den Laser passieren
PCR
RT-PCR
Western Blot



Proteine werden auf ein SDS-Acrylamidgel
aufgetragen und durch Elektrophorese aufgetrennt
Die Banden des Gels werden mit dem Westernblot
auf eine Nitrozelluloseplatte übertragen
⇒ Immunoblotting
Immunoblotting

Beim Immunoblotting werden Proteine über eine
Antigen-Antikörper-Reaktion nachgewiesen
Tumor – Assay



Mäuse wurden mit 400 rad Gammastrahlung
bestrahlt, die ihre natürlichen Killerzellen
unterdrückten bevor sie mit den Tumorzellen injiziert
wurden.
Tumorzellen wurden den anästhesierten Mäusen unter
die Haut gespritzt und die Tumorgröße alle 2 bis 3
Tage vermessen
Die Zellen können auch wieder re-isoliert werden,
indem die Tumore herausgenommen werden,
gewaschen und in Kultur gelegt werden.
Analysis of retroviral integration
sites

Genomische DNA von parental
und explanted Zellen werden mit
EcoRI und BamHI geschnitten

dadurch erhält man verschieden
große DNA-Stücke

Die Sequenz der hTERT Region
ist bekannt und man kann dort mit
spezifischen radioaktiven Primern
hybridisieren

im Southern-Blot wird so die
Bande mit der radioaktiven Sonde
sichtbar
Southern Blot

Zur Detektion von DNA
Sequenzen durch
Hybridisierung

Die Banden des Gels werden
auf Nitrozelluslose übertragen

in unserem Versuch können
nun die radioaktiv markierten
Sonden mit ihren DNAStücken sichtbar gemacht
werden, so dass man von
jedem integriertem Retrovirus
einen „Fingerabdruck“ erhält
Ergebnisse
Warum kann man nur aus Maus-Zellen TumorZellen machen, nicht aus menschlichen?
Maus

Coexpression von
Onkogenen
⇒ Bildung von Tumorzellen

Konstitutive Telomerase –
Aktivität
⇒ lange Telomere
Mensch

Coexpression von
Onkogenen
⇒ keine Bildung von
Tumorzellen

Keine Telomerase –
Aktivität (Ausnahme
embryonale Zellen)
⇒ Telomere verkürzen sich
⇒ begrenzte Lebensdauer
Telomerase - wichtiger Faktor?


Ekopische Expression des hTERT – Gens
⇒ unkontrollierte Teilung der meisten (nicht aller)
Zelltypen
Telomeraseaktivität in fast allen Tumorzellen
nachgewiesen
⇒ Telomerase ist wichtiger Faktor bei der
Immortalisierung menschlicher Zellen
Versuch




In HEK (human embryonic kidney) – Zellen
und BJ Fibroblasten wurden Gene für large –
T, hTERT und ras in verschiedenen
Kombinationen eingebracht
⇒ large – T wird in jede Zelle eingebracht
⇒ hTERT und ras nicht in jede Zelle
⇒ werden die Gene auch exprimiert?
Ergebnisse





a) large-T wird in allen Zellen
exprimiert
b) ras wird in den induzierten Zellen
vermehrt gebildet
c) RT-PCR ⇒ hTERT wird nur in
den induzierten Zellen exprimiert
GADPH als Kontrolle
d) TRAP-Assay ⇒ Nur in Zellen mit
ektopischer Expression von hTERT
lässt sich eine Telomerase Aktivität
nachweisen (Als Kontrollen wurden
hitzedenaturierte Proben aufgetragen)
⇒ Ist die Telomerase auch aktiv?
Elongation der Telomere

Durch Hybridisierung von
genomischer DNA mit
einem Telomer-spezifischen
Oligonukleotid kann die
Länge der Telomere von
HEK und BJ Zellen
analysiert werden.

⇒ die durch hTERT
hervorgerufene TelomeraseAktivität erwirkt sowohl die
Verlängerung, als auch die
Stabilisierung der Telomere
Stabilisierung der Telomere



nach mehreren Zellteilungen
(PD157 = population
doubling 157
PD93 = population
doubling 93)
nach Implantierung und
Rückgewinnung von Zellen
(aus dem Tumor einer
Nacktmaus = Explant)
⇒ Länge der Telomere
bleibt stabil
Expression von hTERT immortalisiert
large-T exprimierenden Zellen



Quadrate: Expression von hTERT
⇒ Zellen wachsen unendlich ⇒ sind immortalisiert
Kreise: keine Expression von hTERT
⇒ Zellen sterben nach ca. 10 Zellzyklen ab
schwarze Symbole: Expression von ras
Verhalten sich diese Zellen auch wie
Tumor-Zellen?

Wachsen sie unkontrolliert?

Auch in soft agar, in dem sie sich nicht
anheften können?
Positivkontrollen
Calu-1 = Lungenkrebs Zelllinie
293 = Adenovirus-transformierte Zelllinie
Tumorwachstum in
Nacktmäusen



large-T ist konstitutiv
exprimiert
ist entweder hTERT oder ras
oder keines exprimiert
⇒ kein Tumorwachstum
nur wenn alle drei exprimiert
werden
⇒ in allen Fällen
Tumorwachstum
BT649 und SW613 =
menschliche
Brustkrebszelllinien als
Kontrolle
Folgerung

eine menschliche Zelle kann nur zu einer
Tumorzelle werden, wenn large-T, hTERT
und ras gleichzeitig exprimiert werden

Oder: zusätzliche Mutation in der Maus, die
die Zelle letztendlich zu einer Tumor-Zelle
macht?
Keine zusätzliche Mutation
a) explanted oder parental Zellen in Kultur
c) Zellen im Tumor
Kreis: ras wird nicht exprimiert
erfolgt
Quadrat: ras wird exprimiert
Schwarze Symbole: explanted
b)Vergleich von retroviralen Integrationsorten von
parental und explanted Zellen
⇒ keine Veränderung der Banden
⇒ keine zusätzliche Mutation in der Maus
⇒ Zellen waren auch vorher schon fähig, einen
Tumor zu bilden
Schlussfolgerungen

large-T, hTERT und ras werden benötigt, um
eine menschliche Tumor-Zelle zu kreieren
⇒ Störung/Veränderung von 4 Signalwegen

ras ⇒ mitogen-response pathway
hTERT ⇒ telomere maintenance pathway


large-T ⇒ zellulärer Kontrollweg ⇒
inaktiviert Tumor-Supressor Proteine pRB und
p53
Vermutungen
large-T ist auch an anderen Signalwegen
beteiligt ⇒ Störung in ein oder mehreren
anderen Signalwegen notwendig, um
Tumorzelle zu kreieren?
 ⇒ Und nur in Verbindung mit
Expression von hTERT?

Zusammenfassung




Zellen aus Gewebe mit Nährlösung in
Kulturschalen
⇒ Zellen teilen sich, altern und
sterben ab
Zugabe von Telomerase
⇒ keine Veränderung
Kombination mit Tumor-Antigen des
SV40
⇒ Inaktivierung des RB-Proteins
und des p53-Tumorsuppressorgens
⇒ Inaktivierung der Kontrolle des
Zellwachstums
Zugabe eines Onkogens (ras)
⇒ Transformation der Zellen in
Tumorzellen