VERSUCH 3: ERSTELLEN EINES BLUTBILDES

VERSUCH 3: ERSTELLEN EINES
BLUTBILDES
LERNZIELE:
1) Immunphänotypisierung allergischer vs. naiver Mäuse
2) Auswertung von FACS Daten mittels Cyflogic Software
3) Statistischer Vergleich zwischen den Gruppen
HINTERGRUND:
VORBEMERKUNG:
In diesem Übungsbeispiel erstellen Sie ein detailliertes Blutbild von allergischen Mäusen im
Vergleich zu naiven Mäusen. Jede Gruppe bekommt eine Blutprobe von einer anderen Maus.
Insgesamt werden 4 allergische und 4 naive Mäuse untersucht. Sobald alle Proben gemessen
wurden, tauschen Sie die Daten untereinander aus und erstellen für die einzelnen Blutwerte
Diagramme.
Es folgt eine statistische Auswertung, welche Blutparameter sich zwischen allergischen und
naiven Mäusen statistisch unterscheiden.
BLUTBILD:
Die Analyse des Blutbildes mittels Durchflusszytometrie bietet einen detaillierten Überblick über
die zellulären Bestandteile des Blutes, in unserem Fall die weißen Blutkörperchen (Leukozyten).
Mit Hilfe des Blutbildes können bestimmte Krankheitsbilder diagnostiziert werden. Allerdings
gibt es recht große Schwankungen innerhalb der sogenannten Normalwerte. In Tabelle 1 sehen
Sie die Normalwerte von weiblichen BALB/c Mäusen. BALB/c Mäuse werden in der
Allergieforschung bevorzugt eingesetzt, da sie eine genetische Prädisposition besitzen, Th2
Immunantworten (allergische Immunantworten) zu induzieren. Die Mäuse, deren Blut Sie im
Praktikum untersuchen sollen, sind gegen das Gräserpollenallergen Phl p 5 sensibilisiert worden.
Dazu wurde den Mäusen das rekombinante Allergen gemeinsam mit dem Adjuvans Aluminium
Hydroxid mehrmals subkutan injiziert. Das gleiche Adjuvans wird in vielen Humanimpfstoffen
eingesetzt. Im Falle von BALB/c Mäusen fördert es die Entstehung einer allergischen
Immunantwort, die durch hohe Titer von allergenspezifischen IgE Molekülen charakterisiert ist.
TABELLE 1. NORMALWERTE VON
ERWACHSENEN, WEIBLICHEN BALB/C
MÄUSEN. WBC = white blood cells,
RBC = red blood cells, MCF = mean
corpuscular volume (durchschnittliche
Größe der Erythrozyten, angegeben in
Femtolitern).
Quelle: http://flow.csc.mrc.ac.uk
Generell ist in Allergikern die Zahl der Leukozyten pro mL Blut im Vergleich zu Nichtallergikern
erhöht. In schweren Fällen kann auch der Anteil an eosinophilen Granulozyten erhöht sein. Ob
die Sensibilisierung das Blutbild tatsächlich signifikant verändern kann, werden Sie in diesem
Praktikum untersuchen.
BESTIMMUNG DER ZELLZAHL
Um die genaue Zellzahl in Ihrer Blutprobe zu bestimmen haben Sie zwei Möglichkeiten.
Rückrechnen über das Volumen/min
Da Sie das genaue Volumen ihrer Probe kennen, können Sie über die Aufnahmezeit am Gerät
auf die ursprüngliche Zellzahl zurückrechnen. Nehmen wir an, Sie hatten 10µL Blutprobe und
haben die Zellen nach allen Färbe- und Waschschritten in 150µL FACS-Buffer (FB) gelöst. Das
Gerät hat einen Probendurchsatz von 10µL/min bei „low“, 60µL/min bei „medium“ und
120µL/min bei „high“. Wenn Sie jetzt am Durchflusszytometer in einer Minute auf „high“
100.000 Leukozyten aufnehmen, wissen Sie also, dass in 120µl 100.000 Leukozyten waren. Da
Sie Ihre Probe in 150µL gelöst haben, hatten sie also insgesamt 124.000 Leukozyten in Ihrer
Probe (100.000/120*150). Da Ihre ursprüngliche Probe 10µL Blut war, bedeutet das (wenn man
die Verluste durch die diversen Waschschritte vernachlässigt), dass Sie 12.400µL Leukozyten pro
µL Blut haben.
Allerdings ist diese Methode relativ ungenau, deshalb werden wir im Praktikum noch eine
andere Methode verwenden.
Rückrechnen über Standardbeads
Sie erhalten von uns Probenröhrchen in die wir eine definierte Anzahl an Latexkügelchen
gegeben haben. Zu diesen Standardbeads kommen Ihre Zellen dazu. Alle Färbe- und
Waschschritte werden gemeinsam mit den Standardbeads durchgeführt. Wenn wir davon
ausgehen, dass Sie bei allen Waschschritten prozentuell gleich viele Standardbeads wie Zellen
verlieren, können Sie aus den verbliebenen Standardbeads bei der Auswertung auf die
Zellzahlen in der Blutprobe rückrechnen.
Wenn Sie z.B. im Probenröhrchen 10.000 Standardbeads haben und wir finden in unserer Probe
am Schluss 5.000 Standardbeads und 50.000 Leukozyten, dann wissen wir, dass in der
ursprünglichen Probe 100.000 Leukozyten gewesen sein müssen.
IMMUNPHÄNOTYPISIERUNG
Durch Markierung der Zellen mit verschiedenen Fluorochrom-markierten Antikörpern können
Sie die unterschiedlichen Zelltypen im Blut unterscheiden (siehe auch CD Antigene, Skript vom
Vortag).
Hierfür machen wir eine 6-fach Färbung mit denselben Antikörpern, die Sie am Vortrag zur
Erstellung der Kompensationssettings verwendet haben.
1. Anti-mouse CD45 PerCP/Cy5.5
Alle Leukozyten
2. Anti-mouse CD4 APC/Cy7
CD4 pos. T Zellen (T Helferzellen)
3. Anti-mouse CD8 FITC
CD8 pos. T Zellen (Zytotoxische T Zellen)
4. Anti-mouse CD14 APC
Monozyten
5. Anti-mouse CD19 PE/Cy7
B Zellen
6. Anti-mouse Siglec F PE
eosinophile Granulozyten
IHRE AUFGABEN:
1. Installieren Sie die Cyflogic Auswertesoftware auf Ihrem Laptop (Freeware, steht auf
PLUSOnline zum Download bereit).
2. Bestimmen Sie die Anzahl der Leukozyten, T-Helferzellen, Zytotoxischen Zellen, B-Zellen,
eosinophilen Granulozyten, und der neutrophilen Granulozyten pro µL Blutprobe.
3. Sammeln Sie die Ergebnisse der anderen Gruppen und machen Sie eine statistische
Auswertung. Unterscheiden sich die Blutbilder der allergischen Mäuse von denen der
nicht-allergischen Mäuse?
DURCHFÜHRUNG DES EXPERIMENTS:
Färbung der Blutprobe
1. Nehmen sie ein 1.5mL Reaktionsgefäß mit 10.000 Standardbeads.
a. Das Verwenden von Standardbeads erlaubt später die exakte Bestimmung der
Zellzahl in der Probe.
2. Pipettieren sie 20µL Vollblut (liegt bereits portioniert auf ihrem Platz) zu den
Standardbeads.
3. Pipettieren sie von jedem der 6 Antikörper 4µL zu ihrer Blutprobe. Sie erhalten die
einzelnen Antikörper 1:10 vorverdünnt in FB. Wie hoch ist die Endkonzentration der
Antikörper in ihrer Probe?
4. Stellen Sie Ihre Probe 10min auf Eis. Die Antikörper binden jetzt an die entsprechenden
Oberfächenantigene.
5. Geben sie 500µL FB zu und mischen sie.
a. Durch die Zugabe von FB wird das Volumen erhöht um die Probe zu waschen
(ungebundene Antikörper werden entfernt).
6. Zentrifugieren Sie 10min bei 3000rpm bei RT.
7. Saugen Sie den Überstand vorsichtig ab, ohne das Zellpellet mitzunehmen. Der Puffer
muss so vollständig wie möglich abgehoben werden, ansonsten funktioniert der
anschließende Lysis-Schritt nicht.
ABB.1
ÜBERSTAND
Pipettieren
Sie
ABHEBEN.
vorsichtig
den
Überstand ab, ohne das Pellet
aufzusaugen.
Quelle: http://openwetware.org
8. Resuspendieren sie das Pellet gründlich in 500µL FACS-Lyse. Diese hypotone Salzlösung
lysiert die Erythrozyten. Wenn das Pellet nicht komplett resuspendiert ist funktioniert
die Lyse nicht!
9. Inkubieren Sie 10min bei RT. Die Probe sollte bei erfolgreicher Lyse klar werden (-klar als
Gegenteil von trüb. Die Probe ist trotzdem rot, da das Hämoglobin aus den lysierten
Erythrozyten ja nach wie vor in der Lösung ist.)
10. Geben Sie 500µL FB zu um das FACS-Lyse auszuwaschen.
11. Zentrifugieren Sie 10min bei 3000rpm bei RT.
12. Saugen Sie den Überstand vorsichtig ab.
13. Das Pellet sollte jetzt nicht mehr rot, sondern weiß (und sehr viel kleiner) sein. Wenn Ihr
Pellet noch rot ist, war die Lyse nicht vollständig. Wiederholen Sie Schritt 7 – 11.
14. Resuspendieren Sie Ihr Pellet in 150µL FACS buffer und überführen Sie die Probe in ein
FACS-Tube.
15. Gehen Sie mit Ihrer Probe zum LV-Leiter um sie im FACS zu messen.
16. Speichern Sie ihre Daten auf einen USB Stick.
Auswerten ihrer Ergebnisse mit der Cyflogic Software
Die Cyflogic Software ist eine Freeware Software mit der Sie FACS Daten analysieren können. Sie
können die Software und die Anleitung über PLUSonline herunterladen.
Wir gehen nun Schritt für Schritt die Auswertung Ihrer Probe durch. Die im Skript gezeigten
Daten stehen auch als Demofile.fcs zum Download bereit.
1. Öffnen Sie die Cyflogic Software und fahren Sie mit dem Mauszeiger an den rechten
Rand des Fensters, bis sich ein Panel öffnet. Klicken Sie auf „Freeze the panel“, damit
das Panel dauerhaft eingeblendet bleibt.
2. Gehen Sie auf Files -> Open FCS und machen Sie Ihr File auf. Die Daten werden
entweder im „Fast draw mode“ oder im „Full draw mode“ dargestellt. Diese
unterscheiden sich nur in der Anzahl der Events, die im Plot gleichzeitig dargestellt
werden. Die maximale Anzahl an Events für beide Darstellungsweisen kann man unter
„Edit“ einstellen. Durch Anklicken des Plots mit der rechten Maustaste können Sie die
Ansicht zwischen „Fast draw mode“ und „Full draw mode“ wechseln. Bis auf weiteres
bleiben wir im „Full draw mode“.
3. Auf den Achsen des neu geöffneten Plots wurde automatisch auf der X-Achse der
Foward Scatter (FSC) und auf der Y-Achse der Side Scatter (SSC) aufgetragen. Das „A“
neben FSC und SSC bedeutet Area, d.h. es wurde die Fläche unter der Signalkurve
aufgetragen (siehe Tag 2, Abb. 5). Sie können folgende Populationen erkennen (eine
Population ist eine mehr oder minder klar begrenzte Ansammlung von Events):
a. Standardbeads – Das sind die Latexkügelchen, von denen genau 10.000 Stück in
Ihrem Reaktionsgefäß waren. Mit ihrer Hilfe können wir später die absolute
Zellzahl bestimmen.
b. Debris – Hierbei handelt es sich z.B. um Reste von Zellmembranen, die nach der
Erythrozytenlyse übrig geblieben sind, tote Zellen oder andere
Verunreinigungen.
c. Lymphozyten – Diese Population umfasst zum Großteil die T Zellen (CD4 und
CD8) sowie die B Zellen (CD19).
d. Monozyten – Diese Population ist oft nicht klar von den Lymphozyten
abgegrenzt.
e. Neutrophile und eosinophile Granulozyten – Wie der Name schon sagt, haben
diese Zellen mehr Granula in ihrem Zytoplasma. Deshalb erscheinen sie im SSC
höher als z.B. die Lymphozyten. Auch hier sind die Eosinophilen nicht klar von
den Neutrophilen abgrenzbar.
4. Obwohl wir hier die wichtigsten Zellpopulationen nur anhand von FSC und SSC erkennen
können, ist für eine genaue Analyse die Immunphänotypisierung nötig. Stellen Sie jetzt
auf der X-Achse die Anzeige auf PerCP-Cy5.5 um (rechte Maustaste). Sie können auch
einfach einen weiteren Plot über „Create“ -> Dotplot aufmachen.
5. Wie Sie sich sicher erinnern können, war mit PerCP-Cy5.5 der anti-CD45 Antikörper
markiert. Mit diesem Antikörper wurden also alle Leukozyten gefärbt. Wir werden jetzt
2 verschiedene Regionen definieren. Eine um die Standardbeads und eine um die
Leukozyten:
a. Wählen Sie dazu eine Farbe im rechten Panel aus, klicken Sie auf „Create“ und
zeichnen Sie ein Polygon um die entsprechende Population. Mit „Rename“
können Sie dem Polygon auch einen aussagekräftigen Namen geben (bitte nur
ein einzelnes Wort, ohne Abstände, sonst haben wir später beim „Gaten“
Probleme).
b. Sie werden bemerken, dass jeder Region eine Farbe zugeteilt wird und diese
Farbe in allen anderen Plots ebenfalls verwendet wird. Durch das markieren der
Leukozyten mit Hilfe des CD45 Markers (im unteren Plot) können Sie im oberen
Plot z.B. erkennen, dass es sich bei der Population im linken unteren Eck um
keine Leukozyten handelt (sondern eben um Debris).
6. Nachdem Sie jetzt schon die Standardbeads und die gesamten Leukozyten markiert
haben, können wir uns jetzt die entsprechenden Zellzahlen anzeigen lassen.
a. Durch Anlicken des Plots mit der rechten Maustaste und Anwählen von „open
statistics“ wird ein kleines Fenster geöffnet, in dem die Anzahl aller sichtbaren
Zellen („Visible“) angezeigt wird, sowie die Anzahl der Zellen in den markierten
Regionen. X mean, Y mean, X-geo mean und Y-geo mean gibt die
durchschnittliche Fluoreszenzintensität der entsprechenden Population an,
diese ist für uns aber nicht weiter von Bedeutung (Sie können diese Anzeige
auch ausblenden).
7. In unserem Beispielfile haben wir also 2119 Standardbeads und 41032 Leukozyten. Mit
diesen Angaben können Sie berechnen, wieviele Leukozyten pro µL in der Blutprobe
waren:
a. Im Röhrchen waren 10.000 Standardbeads und 20µL Blut. Also waren in den
20µL Blut 193639 Leukozyten (41032/2119*10000). Pro µL ergibt das 9682
Leukozyten. Dies liegt im unteren Normbereich der in Tabelle 1 angegebenen
Werte.
8. Für alle weiteren Marker können wir auch andere Methoden wählen, um die Zellzahl zu
bestimmen. Diese werden Sie etwas weiter unten im Skriptum kennenlernen.
9. Um die Anzahl der CD4 positiven (T-Helferzellen) und CD8 positiven (Zytotoxische
T-Zellen) Zellen zu bestimmen können Sie z.B. auf den jeweiligen Plots CD45
(PerCp-Cy5.5) gegen CD4 (APC-Cy7) bzw. CD8 (FITC) auftragen.
a. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf den Plot und lassen Sie sich nur die
Leukozyten anzeigen („Show populations“ -> Leukos). Alle anderen Zellen
werden dann ausgeblendet.
b. Legen Sie neue Regionen um die CD4 bzw. CD8 positiven Zellen an und lassen
Sie sich die Zellzahl anzeigen.
10. Wir haben in dieser Auswertung also 4976 CD8 positive Zellen (12.12% der Leukozyten)
und 15328 CD4 positive Zellen (37.35% der Leukozyten). Die % beziehen sich immer auf
die sichtbaren Zellen. Da wir vorher alle Zellen außer den Leukozyten ausgeblendet
haben, bezieht sich die Angabe also direkt auf die 41032 sichtbaren Zellen (d.h. die
Leukozyten).
a. Berechnen Sie wie oben die Anzahl der CD4 und CD8 Zellen pro µL Blut
11. Ist Ihnen aufgefallen, dass im oberen Fenster in der CD8 Region auch einige CD4 positive
Zellen sind? Wie kann das sein?
a. Wählen wir dazu eine andere Darstellungsform. Zeigen Sie auf der X-Achse die
CD4 Zellen und auf der Y-Achse die CD8 Zellen (beachten Sie, dass die Farben
der Regionen aus den anderen Plots, selbst wenn diese nicht aktiv sind,
weiterhin beibehalten werden!)
b. Klicken Sie auf „Show Quadrant“ und unterteilen Sie das Fenster in 4
Quadranten.
12. Sie sehen, dass es nicht nur CD8 positive (upper left) und CD4 positive (lower right)
Zellen gibt, sondern auch eine kleine Population an doppelt positiven Zellen (upper
right) gibt. Dabei handelt es sich um sogenannte extrathymische T-Zellen, eine geringe
Anzahl an doppelt positiven T-Zellen, die der positiven thymischen Selektion entschlüpft
sind (Das sei hier aber nur am Rande erwähnt). Die Anzahl dieser Zellen ist jedoch so
klein, dass sie unsere oben durchgeführte Auswertung nicht entscheidend verfälschen.
Sie können jedoch für Ihre Auswertung auch die Zahlen der mittels Quadranten
erstellten Statistik verwenden und die extrathymischen T-Zellen in ihrem Blutbild mit
angeben.
13. Um die Anzahl der eosinophilen Granuloyzyten zu bestimmen, tragen Sie CD45 gegen
Siglec-F (PE) auf.
a. Bestimmen Sie die Anzahl der Eosinophilen / µL Blut.
14. Neben der Population an Eosinophilen sieht man eine sehr kleine Population an Zellen,
die Siglec-F positiv sind, aber auch CD45 stärker exprimieren (daher weiter rechts
stehen). Hierbei handelt es sich möglicherweise um unreife Zellen der
myelomonozytischen Linie, die auch dafür bekannt sind, Siglec-F zu exprimieren. Für
unsere Auswertung spielen sie keine Rolle.
15. Um die restlichen Zelltypen zu bestimmen, tragen Sie jeweils CD19 (PE-Cy7, B Zellen)
und CD14 (APC, Monozyten) gegen CD45 auf.
16. Wie Sie sehen, lassen sich die B-Zellen (oben) und die Monozyten (unten) nicht so klar
von den anderen Zellen abgrenzen, wie die bisherigen Zellpopulationen.
a. Um diese Population etwas besser markieren zu können, macht es Sinn, erst
einmal alle anderen Zellpopulationen, die wir schon bestimmt haben,
auszublenden.
b. Dazu definieren wir ein sogenanntes „Gate“.
c. Wählen sie eine Farbe unter „Definitions“ im rechten Panel und klicken sie auf
„Define“.
d. Wie wollen alle Leukozyten, außer CD4, CD8, oder Eos sehen. Daher geben Sie
Folgendes ein: „Leukos and not CD4 and not CD8 and not Eos“
e. Klicken Sie mit der rechten Maustaste auf die Plots und lassen Sie sich nur die so
definierten Zellen anzeigen. Sie sehen, jetzt wird das Ganze schon etwas
übersichtlicher und wir können leichter die CD19 positiven B-Zellen und die
CD14 positiven Monozyten markieren.
f.
Bestimmen Sie die Anzahl der CD19 und der CD14 positiven Zellen pro µL Blut.
17. Eine Zellpopulation haben wir noch vergessen: die neutrophilen Granulozyten. Da wir
keine eigene Färbung für die Neutrophilen durchgeführt haben, können wir sie nur
indirekt nachweisen.
a. Wie Sie unter Punkt 2 gesehen haben, kann man die Neutrophilen schon recht
gut im FSC/SSC Diagramm erkennen.
b. Eine ziemlich genaue Bestimmung bekommen wir, wenn wir wieder alle
anderen Zellpopulationen, die wir schon definiert haben, ausblenden.
c. Also definieren wir ein Gate wie folgt: „Leukos and not CD4 and not CD8 and not
CD14 and not CD19 and not Eos“.
d. Diese Zellen lassen wir uns im FSC/SSC Diagramm anzeigen und markieren dann
die (jetzt gut abgegrenzten)Neutrophilen.
e. Berechnen Sie die Anzahl der Neutrophilen / µL Blut.
18. Fällt Ihnen etwas auf? Obwohl wir alle anderen Zelltypen ausgeblendet haben, sind
immer noch einige andere Zellen übrig (im Bereich der Lymphozyten und Monozyten).
Das sind zum Teil Zellen, die wir beim Einzeichnen unserer Regionen „nicht erwischt“
haben und zum Teil andere Zellarten, die keine der von uns verwendeten Marker
exprimieren (z.B. NK Zellen, etc.).
19. Sie sollten jetzt folgende Daten für das Blutbild ihrer Maus haben (vervollständigen Sie
die Tabelle):
Zelltyp
Zellen pro µL Blut
Gesamt Leukozyten
CD4+ Zellen (T-Helferzellen)
CD8+ Zellen (Zytotoxische T-Zellen)
CD14+ Zellen (Monozyten)
CD19+ Zellen (B-Zellen)
Siglec F pos. Zellen (Eosinophile)
Neutrophile
Statistische Auswertung der Ergebnisse
Sie erinnern sich an unsere ursprüngliche Fragestellung: Wir wollten wissen, ob sich das Blutbild
einer allergischen Maus von dem einer naiven Maus unterscheidet. Dazu müssen wir die Daten
von allen Gruppen gemeinsam statistisch auswerten. 4 Gruppen hatten jeweils eine
sensibilisierte Maus und 4 Gruppen hatten jeweils eine naive Maus.
1. Besorgen Sie sich die Ergebnisse der anderen Gruppen
2. Kopieren Sie die Daten in Excel (Microsoft) oder Calc (Open Office). Ein Template liegt
zum Download bereit.
3. Nutzen sie das Template, um für alle Zellarten ein Diagramm zu erstellen und zu
berechnen, ob sich die Gruppen signifikant voneinander unterscheiden. Dazu
verwenden wir einen two-tailed unpaired T-Test. Ein hypothetisches Beispiel sehen sie
unten in der Grafik.
4. Bereiten sie für die Abschlussbesprechung eine Powerpoint-Präsentation vor.
MATERIAL-LISTE:
GERÄTE:
Kolbenhub-Pipetten, einstellbar für Maximal-Volumina von 1000, 200, 20 und 10µL.
1.5mL Reaktionsgefäße
1.5mL Reaktionsgefäße mit 10.000 Standardbeads
Heparinisiertes Mausblut
Verdünnte Antikörperlösungen (Anti-mouse CD4 APC/Cy7, Anti-mouse CD8 FITC, Anti-mouse
CD14 APC, Anti-mouse CD19 PE/Cy7, Anti-mouse CD45, PerCp/Cy5.5, Anti-mouse Siglec-F PE)
jeweils 1:10 in FACS-Buffer
Zentrifuge
FACS Canto II Durchflusszytometer
LÖSUNGEN:
FACS Buffer
1% BSA, 2mM EDTA in PBS