IMMUNOLOGIE SEMINARE

IMMUNOLOGIE SEMINARE
IMMUNOLOGIE SEMINARE
Editor
Erna Pap
Herausgegeben von
Éva Pállinger
Edit Buzás
András Falus
György Nagy
Marianna Csilla Holub
Sára Tóth
László Kőhidai
Zsuzsanna Pál
Übersetzt von
Erna Pap
Zoltán Pós
Viktor Molnár
Ottó Dobozy
Fachliche Korrektur
Edit Buzás
András Falus
Sprachliche Korrektur
Andreas Christian Reichelt
Semmelweis Universität • Budapest, 2012
© Erna Pap, 2012
2
Manuskript vertig gestellt: 31 Mai 2012
ISBN 978-963-9129-83-2
Semmelweis Universität
Verantwortlicher für die Gestaltung des Manuskripts: Semmelweis Universität
Verantwortlicher Editor: Erna Pap
Technischer Redakteur: Adrienn Ádám
Länge des Manuskripts: 238 Seiten
3
INHALTSVERZEICHNIS
1. IMMUNOLOGISCHE GRUNDBEGRIFFE. DER AUFBAU DES IMMUNSYSTEMS (ÉVA PÁLLINGER) ..... 10
1.1.
1.2.
1.3.
1.3.1.
1.3.2.
1.3.2.1.
1.3.2.2.
1.3.2.3.
1.3.3.
1.4.
1.5.
1.5.1.
1.5.1.1.
1.6.
1.6.1.
1.6.1.1.
1.6.1.2.
1.6.2.
1.6.3.
1.6.4.
1.6.5.
1.7.
1.7.1.
1.7.1.1.
1.7.1.2.
1.7.1.2.1.
1.7.1.2.2.
1.7.1.3.
1.7.1.4.
1.7.1.5.
1.8.
Einführung: die Aufgabe und die Eigenschaften des Immunsystems.............................................. 10
Die angeborene und die erworbene Immunität ............................................................................... 10
Immunologische Grundbegriffe ....................................................................................................... 11
Was erkennt das Immunsystem? .................................................................................................... 11
Durch welche Strukturen werden die Antigene erkannt? ................................................................ 11
Mustererkennungsrezeptoren (PRR) .............................................................................................. 12
T-Zell Rezeptor (TZR) ..................................................................................................................... 12
B-Zell Rezeptor (BZR)..................................................................................................................... 12
Was sind die Folgen der Antigenerkennung? ................................................................................. 12
Lokale Immunantwort ...................................................................................................................... 13
Das Treffen ist die Bedingung der Erkennung und der Antwort. ..................................................... 14
Lymphozyten-Rezirkulation ............................................................................................................. 14
Extravasation .................................................................................................................................. 15
Die Organe des Immunsystems ...................................................................................................... 15
Lymphknoten .................................................................................................................................. 16
Die Zellen der Lymphknoten ........................................................................................................... 16
Wachposten-Lymphknoten (Sentinel) ............................................................................................. 17
Knochenmark .................................................................................................................................. 17
Milz.................................................................................................................................................. 18
Thymus ........................................................................................................................................... 19
Mukosaassozierte lymphatische Gewebe: MALT ........................................................................... 19
Die Zellen des Immunsystems ........................................................................................................ 20
Die Untersuchung der Zellen des Immunsystems ........................................................................... 21
Blutbild und Knochenmarkausstrich Untersuchungen ..................................................................... 21
Zytochemische Reaktionen ............................................................................................................. 22
PAS Reaktion .................................................................................................................................. 22
Nicht-spezifische Esterase Reaktion ............................................................................................... 22
Flusszytometrie ............................................................................................................................... 22
Immunhistochemie .......................................................................................................................... 23
Genetische Untersuchungen ........................................................................................................... 23
Kommunikationen zwischen den Zellen des Immunsystems .......................................................... 23
2. DIE AUF DER ANTIGEN-ANTIKÖRPER WECHSELWIRKUNG BERUHENDEN METHODEN I. (EDIT
BUZÁS) ............................................................................................................................................................ 25
2.1.
2.1.1.1.
2.1.2.
2.2.
2.2.1.
2.2.2.
2.2.2.1.
2.2.2.2.
2.2.2.3.
2.2.2.4.
2.2.3.
2.2.4.
2.2.5.
2.2.6.
Die Eigenschaften der in der Diagnostik verwendeten Antikörper .................................................. 25
Grundbegriffe .................................................................................................................................. 26
Die Möglichkeiten die Antikörper zu markieren ............................................................................... 27
Methoden ........................................................................................................................................ 28
Flusszytometrie ............................................................................................................................... 28
ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay) ............................................................................. 29
Die indirekte ELISA Reaktion .......................................................................................................... 30
Sandwich ELISA ............................................................................................................................. 30
Kompetitive ELISA .......................................................................................................................... 31
Was ist zu beachten, bei der Durchführung von ELISA ? Was kann Probleme verursachen?........ 32
ELFA (Enzyme Linked Immunofluorescent Assay) ......................................................................... 33
ELISPOT ......................................................................................................................................... 33
Immuno blot (Western blot) ............................................................................................................. 34
Auf radioaktiven Markierungen basierende Methoden .................................................................... 36
4
2.2.6.1.
2.2.6.2.
2.2.7.
2.2.7.1.
2.2.7.2.
2.2.7.3.
2.2.7.4.
2.2.7.5.
2.2.7.6.
2.2.8.
2.2.8.1.
2.3.
Radioimmunoassay (RIA) ............................................................................................................... 36
Immunoradiometric assay (IRMA) ................................................................................................... 37
Immuncytochemie (Immunhistochemie) .......................................................................................... 38
Direkte Methode .............................................................................................................................. 39
Indirekte Methode ........................................................................................................................... 39
Kontrollen ........................................................................................................................................ 40
PAP Methode (Peroxidase anti-Peroxidase Verfahren) .................................................................. 40
Avidin-Biotin Komplex (ABK) Methode ............................................................................................ 40
Fluorescens-Mikroscopie und Laser konfokale Mikroskopie .......................................................... 40
Lateral flow Tests ............................................................................................................................ 41
Multiplex Immunoassay Systeme .................................................................................................... 42
Welche Immunoassay ist zu verwenden? ....................................................................................... 43
3. AUF ANTIGEN-ANTIKÖRPER INTERAKTION BERUHENDE METHODEN II: DIE IMMUNSEROLOGIE
(ANDRÁS FALUS, GYÖRGY NAGY) .............................................................................................................. 45
3.1.
3.2.
3.3.
3.4.
3.5.
3.6.
3.7.
3.8.
3.9.
Immunkomplex und Immunpräzipitat .............................................................................................. 45
2D Immundiffusion (2D Einfach- oder 2D Doppeldiffusion) ............................................................. 50
Serumelektrophorese ...................................................................................................................... 51
Immunelektrophorese und Immunfixierung ..................................................................................... 54
Raketenelektrophorese ................................................................................................................... 55
2D Immunelektrophorese ................................................................................................................ 56
Turbidimetrie und Nephelometrie .................................................................................................... 56
Klinische Anwendungen von serologischen Methoden ................................................................... 57
Typen der Agglutination und ihre klinische Anwendungen .............................................................. 58
4. DIE PRAKTISCHE BEZÜGE DES KOMPLEMENTSYSTEMS (EDIT BUZÁS)............................................. 64
4.1.
4.2.
4.3.
4.3.1.
4.3.1.1.
4.3.1.2.
4.3.2.
4.3.3.
4.3.4.
4.3.5.
4.3.6.
4.4.
4.4.1.
4.5.
Das Komplementsystem ................................................................................................................. 64
Die Funktionen des Komplementsystems ....................................................................................... 65
Untersuchung der Aktivität des Komplementsystems ..................................................................... 67
Bestimmung den CH50 Wert des Blutserums ................................................................................. 67
Schafserythrozyten Immunoassay .................................................................................................. 68
Liposom Immunoassay ................................................................................................................... 69
Untersuchung der alternativen Komplementaktivation .................................................................... 70
Untersuchung des lektinabhängigen Weges ................................................................................... 70
Komplement Konvertase-Assay (CCA) ........................................................................................... 70
Weitere Verfahren zum Nachweis von Komplementproteinen ........................................................ 71
Sonstige, mit dem Komplementsystem verbundene Verfahren ...................................................... 73
Untersuchung einzelner Komplement-Elemente in verschiedenen pathologischen Zuständen ...... 74
Falldarstell....................................................................................................................................... 74
Aufgaben......................................................................................................................................... 76
5. DIE DURCHFLUSSZYTOMETRIE (ÉVA PÁLLINGER)................................................................................. 77
5.1.
5.2.
5.2.1.
5.2.1.1.
5.2.1.2.
5.2.1.3.
5.3.
5.3.1.
5.3.2.
Einleitung ........................................................................................................................................ 77
Das Durchflusszytometer ................................................................................................................ 78
Bildliche Darstellung (data display) ................................................................................................. 81
Histogramm ..................................................................................................................................... 81
Dot plot/Punktwolkendiagramm ...................................................................................................... 82
Kinetische Messungen (time-based collection) ............................................................................... 84
Die Auswertung der FACS-Messdaten ........................................................................................... 84
Grösse und Granularität .................................................................................................................. 84
Fluoreszenz .................................................................................................................................... 85
5
5.4.
5.4.1.
5.4.2.
5.4.3.
5.4.3.1.
5.4.3.2.
5.5.
5.5.1.
5.5.1.1.
5.5.1.2.
5.5.1.3.
5.5.1.4.
5.5.1.5.
5.5.1.6.
5.5.1.7.
5.5.1.8.
5.5.1.9.
5.5.1.10.
5.5.2.
5.5.2.1.
5.5.2.1.1.
5.5.2.1.2.
5.5.2.1.3.
5.5.2.1.4.
5.5.2.2.
5.5.2.2.1.
5.5.2.3.
5.5.2.3.1.
5.5.2.3.2.
5.5.2.4.
5.5.2.4.1.
5.5.2.5.
5.6.
5.7.
Probenvorbereitungen für diagnostische Messungen ..................................................................... 88
Herstellung einer Zellsuspension .................................................................................................... 88
Erythrolyse ...................................................................................................................................... 88
Fluoreszenz-markierung ................................................................................................................. 89
Direkte Färbung .............................................................................................................................. 89
Immunphänotypisierung .................................................................................................................. 90
Die Anwendungsgebiete der Durchflusszytometrie ......................................................................... 91
Auf der Methodik beruhende Verteilung .......................................................................................... 91
Proteinnachweisverfahren ............................................................................................................... 91
Untersuchungen der Synthese ........................................................................................................ 92
Enzymaktivität-Messungen ............................................................................................................. 93
Untersuchung der Nukleinsäure ...................................................................................................... 93
Untersuchung der Zellorganellen .................................................................................................... 94
Funktionelle Untersuchungen ......................................................................................................... 94
Bestimmung des relativen Abstandes zwischen Molekülen (FRET) ............................................... 94
Untersuchung löslicher Moleküle (Flow Cytometry Based Fluorescent Bead Immunoassay) ......... 95
Bestimmung der absoluten Zellzahl ................................................................................................ 96
Zellsortierung .................................................................................................................................. 97
Verteilung nach Krankheiten ........................................................................................................... 97
Maligne hämatologische Erkrankungen .......................................................................................... 97
Diagnostik und Differentialdiagnostik .............................................................................................. 97
Diagnostik der Minimal-Resterkrankung ......................................................................................... 98
Nachweis der rezivierenden hämatologischen Erkrankungen ......................................................... 98
Untersuchung der Empfindlichkeit auf die Terapie (MDR = multidrug resistance) .......................... 99
Immundefizienz-Syndrom ............................................................................................................. 100
Phänotyp-Untersuchungen und Nachfolge in der Diagnostik von Immundefekten ....................... 100
Autoimmunerkrankungen .............................................................................................................. 100
Die Diagnostik der Autoimmunerkrankungen ................................................................................ 100
Die Bestimmung der Aktivität von Autoimmunerkrankungen ........................................................ 101
Die Organtransplantation .............................................................................................................. 101
HLA-Assoziation............................................................................................................................ 101
Infektionen .................................................................................................................................... 102
Qualitätskontrolle (quality control) ................................................................................................. 103
Laboratorische Normalbefunde ..................................................................................................... 104
6. IMMUNISIERUNG UND VAKZINATION (EDIT BUZÁS) ............................................................................. 105
6.1.
6.2.
6.3.
6.4.
6.5.
Ziel der Immunisierung und ihre praktische Durchführung ............................................................ 105
Die Adjuvantien, ihre Rolle und Gestaltungen ............................................................................... 105
Faktoren, welche die Wirksamkeit der Immunisierung beeinflussen ............................................. 107
Funktionelle Gruppeneinteilung der Antigene und Epitopen ......................................................... 107
Ausführungsmöglichkeiten der Immunisierung ............................................................................. 108
7. VAKZINATION (MARIANNA CSILLA HOLUB)............................................................................................ 109
7.1.
7.1.1.
7.1.1.1.
7.1.2.
7.1.3.
7.2.
7.2.1.
7.2.2.
7.3.
Aktive Vakzination ......................................................................................................................... 110
Aktive Vakzination erzeugt starke primäre Antikörper-Antworten ................................................. 110
T-Zell Gedächtnis ist eine der wichtigsten Voraussetzungen einer wirksamen TD B-Zell-Antwort 114
Neben der Antikörper-Produktion kann auch eine zellulären Immunantwort Ziel der Vakzination
sein ............................................................................................................................................... 115
Typen der T-Gedächtniszellen ...................................................................................................... 117
Lebensalter-abhängige Impfung-Strategien .................................................................................. 119
Welche Probleme muss die Vakzination in Kleinkindern überwinden? ......................................... 120
Impfung-Strategien für Kleinkinder und Personen in hohem Alter ................................................ 121
Arten von Impfstoffen .................................................................................................................... 122
6
7.4.
7.4.1.
7.4.2.
7.4.3.
Neue Wege in der Impfstoffentwicklung ........................................................................................ 123
Verbesserung von gängigen Vakzinen.......................................................................................... 123
Biotechnologische Impfstoffentwicklung........................................................................................ 125
Entwicklung von neuen Vakzinationsverfahren ............................................................................. 129
8. ZELLKULTUREN (SÁRA TÓTH) ................................................................................................................ 130
8.1.
8.2.
8.3.
8.4.
8.5.
8.5.1.
8.5.2.
8.5.3.
8.5.4.
8.6.
8.7.
8.8.
Definition der Zell- und Gewebekultivierung, Typen und Formen der Kulturen ............................. 130
Für eine Zellkultur notwendigen Voraussetzungen ....................................................................... 132
Zellzahlveränderungen und unterschiedliche Zellzählungsmethoden ........................................... 134
Separations- und Selektionsverfahren der Zellen ......................................................................... 136
Einige Verwendungsarten der Zellkulturen ................................................................................... 139
Bestimmung der Plating-Effizienz ................................................................................................. 140
Bestimmung der Proliferation und der Vermehrungsfähigkeit der Zellen ...................................... 140
Abmessung der Zytotoxizität ......................................................................................................... 142
Herstellung der monoklonalen Antikörper ..................................................................................... 142
Spezielle Kultivierungsverfahren ................................................................................................... 143
Untersuchungsmöglichkeiten der Zellen in einer Suspensionskultur ............................................ 145
Anwendungsbereiche der Zellkultivierung ..................................................................................... 146
9. DIE HOMING, DIE GEZIELTE MIGRATION VON IMMUNZELLEN. EXTRAVASATION IN
ENTZÜNDUNGEN (LÁSZLÓ KŐHIDAI) ...................................................................................................... 148
9.1.
9.2.
9.3.
9.4.
9.5.
9.6.
9.6.1.
9.6.2.
9.7.
9.7.1.
9.7.2.
9.7.3.
9.7.4.
9.7.5.
Einführung..................................................................................................................................... 148
Die Hauptformen der Zellmigration ............................................................................................... 148
Die die Chemotaxis auslösenden Moleküle .................................................................................. 149
Chemotaxis Rezeptoren................................................................................................................ 150
Die sich bewegenden Zellen des menschlichen Körpers und ihre Bewegungsformen ................. 152
Zellmotilität und Immunantwort ..................................................................................................... 152
Transendotheliale Migration der Lymphozyten ............................................................................. 153
Migrationswege der dendritischen Zellen ...................................................................................... 154
Die Methoden der Messung der Zellmotilität (Chemotaxis) ........................................................... 156
Reversible Systeme ...................................................................................................................... 157
Irreverzible Systeme ..................................................................................................................... 158
In vivo Techniken .......................................................................................................................... 158
Die neusten Techniken ................................................................................................................. 159
Weitere Methode zur Migrationsanalyse ....................................................................................... 161
10. ANALYSEMETHODEN DER AUTOANTIKÖRPER, HLA-TYPISIERUNG (GYÖRGY NAGY,
ZSUZSANNA PÁL) ........................................................................................................................................ 163
10.1.
10.1.1.
10.1.2.
10.1.2.1.
10.1.2.2.
10.1.2.3.
10.1.2.4.
10.1.2.5.
10.2.
10.2.1.
10.2.2.
10.2.2.1.
10.2.2.2.
Die Autoantikörper und ihre analytische Methoden ....................................................................... 163
Die Entstehung und allgemeine Eigenschaften der Autoantikörper .............................................. 163
Die wichtigsten Charakteristika von Autoimmunerkrankungen ..................................................... 165
Lupus erythematodes (SLE) ......................................................................................................... 166
ANA (antinukleäre Antikörper) ...................................................................................................... 167
Kryoglobuline ................................................................................................................................ 168
Rheumatoide Arthritis.................................................................................................................... 169
Organspezifische Autoimmunitäten............................................................................................... 170
Die HLA-Typisierung ..................................................................................................................... 172
Die Nomenklatur des HLA-Systems .............................................................................................. 172
Methoden der HLA-Typisierung .................................................................................................... 173
Serologische Methoden: ............................................................................................................... 173
Molekulare Methoden (DNA Sequenzanalyse) ............................................................................. 174
7
10.2.3.
10.2.4.
10.2.5.
Gewebe- und Organtransplantation .............................................................................................. 175
HLA Assoziation mit Rheumatoider Arthritis ................................................................................. 177
HLA Assoziation mit Spondylitis ankylosans (SPA, Morbus Bechterew) ....................................... 177
11. ÜBEREMPFINDLICHKEIT TYP I.: ALLERGIE (MARIANNA CSILLA HOLUB) .......................................... 180
11.1.
11.2.
11.3.
11.3.1.
11.3.2.
11.3.2.1.
11.3.2.2.
11.3.3.
11.3.4.
11.3.5.
11.3.5.1.
11.3.5.2.
11.3.5.3.
11.3.6.
11.4.
11.5.
11.5.1.
11.5.2.
Die Gruppierung der Überempfindlichkeitsreaktionen ................................................................... 180
Die Entstehung der allergischen Reaktionen ................................................................................ 181
Die Symptome der Allergie ........................................................................................................... 183
Die Type der Allergene ................................................................................................................. 183
Wie entstehen die allergischen Symptome? ................................................................................. 184
Die aus den Mastzellen freigesetzenden Stoffe ............................................................................ 185
Rezeptoren ................................................................................................................................... 185
Allergische Kreuzreaktion ............................................................................................................. 186
Nahrungsmittelintoleranz und Nahrungsmittelallergie ................................................................... 187
Anaphyilaktoide Reaktion / Pseudoallergie ................................................................................... 187
Arzneimittel - ausgelöste Pseudoallergie ...................................................................................... 188
Nahrungsmittel - ausgelöste Pseudoallergie ................................................................................. 188
Physikalische Faktoren – und psychologische Stress-vermittelte Pseudoallergie ........................ 189
Sonnenallergie .............................................................................................................................. 189
Die Diagnose Der Allergie ............................................................................................................. 190
Die Therapie der Allergie .............................................................................................................. 192
Medikamentöse Behandlung ......................................................................................................... 192
Immuntherapie: (Hyposensitisierung/Desensitisierung) ................................................................ 194
12. HYPERSENSITIVITY REACTIONS II: TYPE II-IV HYPERSENSITIVITY REACTIONS (MARIANNA
CSILLA HOLUB) ............................................................................................................................................ 196
12.1.
12.1.1.
12.1.1.1.
12.1.1.2.
12.1.1.3.
12.1.2.
12.1.2.1.
12.1.2.2.
12.1.2.3.
12.1.3.
12.1.4.
12.2.
12.2.1.
12.2.2.
12.2.3.
12.2.4.
12.3.
12.3.1.
12.3.2.
12.3.3.
12.3.4.
Überempfindlichkeitsreaktion vom Typ II ...................................................................................... 196
Beispiele für eine Typ II Reaktion, die von extrinsischen Antigenen ausgelöst werden ................ 197
Erythroblastosis fetalis (Morbus haemolyticus neonatorum, Immunhämolytische Krankheit bei
Feten und Neugeborenen) ............................................................................................................ 197
Typ II Überempfindlichkeit bei der Organtransplantation .............................................................. 197
Medikamenten-induzierten Typ II Reaktionen ............................................................................... 197
Intrinsches Antigen – Beispiele für die von einem Autoantikörper ausgelöste Krankheit .............. 198
Goodpasture-Syndrom (Hauptsächlich wegen den Autoantikörper gegen Kollagen Typ IV in den
Nieren) .......................................................................................................................................... 198
Myasthenia gravis (MG) ................................................................................................................ 198
Basedow-Krankheit ....................................................................................................................... 199
Diagnose ....................................................................................................................................... 199
Therapie ........................................................................................................................................ 199
Typ III Überempfindlichkeitsreaktion ............................................................................................. 200
Eine typische Krankheit für den lokalen Typ III ............................................................................. 201
Akute systemische Typ III Hypersensitivitätsreaktion.................................................................... 202
Chronische systemische Typ III Hypersensitivitätsreaktion ........................................................... 202
Therapie ........................................................................................................................................ 202
Überempfindlichkeitsreaktion vom Typ IV oder verzögerter Typ (DTH=delayed type
hypersensitivity) ............................................................................................................................ 203
DTH-Hauttests .............................................................................................................................. 203
Kontakthypersensitivität / Kontaktdermatitis.................................................................................. 204
Zöliakie (glutensensitive oder gluteninduzierte Enteropathie) ....................................................... 205
Terapie .......................................................................................................................................... 206
8
13. IMMUNOLOGICAL THERAPIES (GYÖRGY NAGY, ÉVA PÁLLINGER, ZSUZSANNA PÁL) ..................... 207
13.1.
13.2.
13.2.1.
13.2.2.
13.2.2.1.
13.2.2.2.
13.2.2.3.
13.2.2.4.
13.3.
13.3.1.
13.3.2.
13.3.3.
13.3.3.1.
13.3.3.1.1.
13.3.3.1.2.
13.3.3.1.3.
13.3.3.2.
13.3.3.3.
13.3.3.4.
13.3.3.4.1.
13.3.3.4.2.
13.3.3.4.3.
13.4.
13.4.1.
13.4.1.1.
13.4.1.2.
13.4.1.3.
13.4.1.3.1.
13.4.1.3.2.
13.4.1.3.3.
13.4.1.3.4.
13.4.1.3.5.
13.4.1.3.6.
13.4.1.3.7.
Grundbegriffe ................................................................................................................................ 207
Gezielte molekulare Therapie (targeted molecular therapy, TMT) ................................................ 208
Biologika oder Biopharmazeutika (biologics) ................................................................................ 208
Targeting ....................................................................................................................................... 208
Targeting mit Nanotechnologie ..................................................................................................... 209
Targeting mit monoklonalen Antikörpern....................................................................................... 209
Targeting mit Peptiden .................................................................................................................. 212
Chemotaktisches targeting (chemotactic drug targeting) .............................................................. 212
Immuntherapie .............................................................................................................................. 212
Aktive Immuntherapie ................................................................................................................... 212
Präventive (prophylaktische) Impfungen ....................................................................................... 213
Therapeutische Impfungen ........................................................................................................... 213
Weiterentwicklung der gängigen Impfungen ................................................................................. 214
Anwendung von Adjuvanzien ........................................................................................................ 214
Unterstützung der Antigenpräsentierung....................................................................................... 215
Verstärkung der Aktivität von T Zellen .......................................................................................... 215
Zytokine in der aktiven Immuntherapie ......................................................................................... 215
Manipulation der Immuntoleranz ................................................................................................... 215
Zelluläre Immuntherapien ............................................................................................................. 216
Induktion der antitumoralen Immunantwort ................................................................................... 216
Anlockung von tumorspezifischen Immunzellen zum Tumor ........................................................ 217
Neutralisierung der tumorvermittelten Immuntoleranz................................................................... 217
Passive Immuntherapie................................................................................................................. 218
Monoklonale Antikörper in der Therapie ....................................................................................... 218
Herstellung der monoklonalen Antikörper ..................................................................................... 218
Risiken und Nebenwirkungen der monoklonalen Antikörper-Therapien ....................................... 220
Therapeutische monoklonale Antikörper in der Rheumatologie .................................................... 220
Der Pathomechanismus der rheumatoiden Arthritis: die Rolle der proinflammatorischen
Zytokine ........................................................................................................................................ 221
Die zentrale Rolle des TNFs in der RA ......................................................................................... 221
Gängige Methoden der TNF Blockade .......................................................................................... 222
Nebenwirkungen von TNF-blockierenden Medikamenten............................................................. 222
TNF-Blockade in anderen rheumatologischen Erkrankungen ....................................................... 223
Entzug von B-Zellen mit Hilfe von anti-CD20 monoklonalen Antikörpern...................................... 223
Hemmung der T-Zell-Aktivierung mit CTLA-4 Immunglobulin Fusionsproteinen ........................... 223
14. EINIGE IMMUNOLOGISCHE ANWENDLUNGSMÖGLICHKEITEN DER INFORMATIK (EDIT BUZÁS) .. 226
ABKÜRZUNGEN ................................................................................................................................................ 236
9
1. IMMUNOLOGISCHE GRUNDBEGRIFFE.
DER AUFBAU DES IMMUNSYSTEMS
(ÉVA PÁLLINGER)
1.1. Einführung: die Aufgabe und die Eigenschaften des
Immunsystems
Die Aufgabe des Immunsystems ist die Aufrechterhaltung der Identität des Organismus. Das
Immunsystem besitzt die Fähigkeit, die eigenen Stoffe von den fremden, und die für den Organismus
gefährlichen von den ungefährlichen Stoffen zu unterscheiden. Die Erkennung des Fremdstoffes löst
eine Immunantwort aus, die je nach der Natur der Stoffe, den aktuellen Einflüssen aus der Umgebung
und den physiologischen Wirkungen entweder als Effektorantwort (Eliminierung des Fremdstoffes),
Immuntoleranz oder Ignoranz (immunologische Stummheit) ausgeprägt wird.
Die wesentlichsten Eigenschaften des Immunsystems sind: Spezifität, Empfindlichkeit, Selektivität und
immunologisches Gedächtnis.
1.2. Die angeborene und die erworbene Immunität
Die Funktion des Immunsystems ruht auf zwei Pfeilern: auf der angeborenen und der erworbenen
Immunität. Die angeborene (natürliche; nicht-spezifische) Immunantwort ist schnell, sie tritt sofort
nach dem Eintreten der Krankheitserreger auf. Sie ist keine antigen-spezifische Reaktion: die
Erkennung der Pathogene geschieht durch die Mustererkennungsrezeptoren (PRR), die eine Vielzahl
von
pathogenassozierten
molekularen
Mustern
(PAMP)
erkennen.
Die
Fremdstoffe
und
Krankheitserreger phagozytierenden Makrophagen, Granulozyten, die dendritischen Zellen und die
natürlichen Killerzellen spielen eine wichtige Rolle bei der Entstehung der angeborenen
Immunantwort. Die Funktion des Komplementsystems ist auch bedeutend: die Komponenten des
Komplementsystems sind in den körperlichen Flüssigkeiten vorhanden. Der Ablauf der Immunantwort
ist unabhängig vom Immunologischen Gedächtnis, da die angeborenen immunologischen Antworten
kein Gedächtnis entstehen lassen können.
Im Gegensatz dazu, kommt die erworbene (adaptive, spezifische) Immunität erst verzögert zum Zug.
Die Antwortreaktion kann erst nach Tagen oder Wochen nach dem Erscheinen der Erreger
nachgewiesen werden. Die antigenspezifische Reaktion wird durch spezifische Antigenrezeptoren
ausgelöst. Der Ablauf der Antwort wird vom Immunologischen Gedächtnis bestimmt. T und B
Lymphozyten sind ihre wesentlichsten zellulären Komponenten .
10
1.3. Immunologische Grundbegriffe
Die Immunantwort bedeutet die Erkennung des Fremdstoffes (Zelle / Erreger) und die darauf
gegebene Antwortreaktion.
Die drei wichtigsten Fragen können so gestellt werden:
1. Was erkennt das Immunsystem?
2. Durch welche Strukturen werden die gefährlichen Strukturen / Antigene erkannt?
3. Was sind die Folgen der Erkennung von Antigenen?
1.3.1.
Was erkennt das Immunsystem?
Das Immunsystem erkennt Antigene. Irgendwelche Moleküle /Strukturen, die eine Immunantwort
auslösen, heißen Antigene. Die Immunogenität
ist
die
Fähigkeit
eines
Antigens
eine
Immunantwort auszulösen.
Den kleinen Bereich (Molekülabschnitt) des
Antigens, der von dem T- oder B-Rezeptor
erkannt wird, nennt man Antigendeterminante
oder Epitop. Ein einziges Antigen kann mehr
Epitope besitzen. Das Mapping der Epitope hat
Abbildung 1. Ein einziges Antigen kann
mehr Epitope besitzen
diagnostische und therapeutische Bedeutung
(Abbildung 1.).
Man unterscheidet Auto, - Allo – und Xenoantigene.
Autoantigen ist ein Antigen, das dem eigenen Körper entstammt, jedoch von dessen Immunsystem
nicht als solches erkannt wird. Antikörper können gegen sie produziert werden.
Alloantigen ist ein Antigen von der gleichen Spezies aber von einem genetisch unterschiedlichen,
anderen Körper, welches eine Immunantwort ( während Transplantation ) hervorruft.
Xenoantigen ist ein Antigen einer anderen Spezies, das eine Immunantwort hervorruft.
1.3.2.
Durch welche Strukturen werden die Antigene erkannt?
Die Antigen-erkennenden Rezeptoren sind in zwei Gruppen aufgeteilt. 1) Rezeptoren, die eine
Vielzahl des pathogenassozierten molekularen Mustern – eine allgemeine Struktur auf der Oberfläche
der Pathogene -
erkennen. Sie sind die Mustererkennungsrezeptoren (PRR). Diese Rezeptoren
befinden sich meistens auf den Zellen des nicht-spezifischen Immunsystems. 2) Spezifische
Rezeptoren, die die Fähigkeit haben, eine Vielzahl von unterschiedlichen Antigenen zu erkennen.
Diese Rezeptoren befinden sich auf der Oberfläche der T- Zellen (TZR) und B-Zellen (BZR).
Es ist zu betonen, dass jeder Lymphozyt nur einen Typ von Rezeptor exprimiert, womit er nur ein
Epitop des bestimmten Antigens erkennen kann.
11
1.3.2.1.
Mustererkennungsrezeptoren (PRR)
Die Mustererkennungsrezeptoren erkennen die auf den Pathogenen charakteristischen allgemeinen
Strukturen, (PAMP – „pathogen associated molecular pattern” - pathogenassoziertes Molekülmuster)
und das veränderte Muster, welches durch den auf die Zelle einwirkenden Stress, umgewandelt
wurde. (DAMP - „danger-associated molecular pattern” – gefahrenassoziertes Molekülmuster).
Mikrobiale Nukleinsäuren, Peptide und LPS
auf der Zellwand der Gram - negativen Pathogene
können den pathogenassozierten Strukturen dienen.
Intrazelluläre Proteine wie Hitzeschockproteine, HMGB1 (chromatin-associated protein high-mobility
group box 1), Proteine der extrazellulären Matrix, Harnsäure, freigesetzte DNS, usw. stellen
eingefahreninduziertes Signal (DAMP) dar. Eine Vielzahl von Molekülen können sich als DAMP
verhalten, abhängig von der Zusammensetzung der lokalen Zellen.
1.3.2.2.
T-Zell Rezeptor (TZR)
Die T- Zell Rezeptoren werden auf der Oberfläche der T-Zellen exprimiert, sie erkennen einen
Peptidepitop
eines
Antigens
mit
großer
Spezifität.
Die
Antigenbearbeitung
und
die
Antigenpräsentierung mit dem MHC Molekül sind Voraussetzungen für die Erkennung durch TZR. Die
Zellen, die die Fähigkeit haben Fremdstoffe aufzunehmen, zu bearbeiten und den T-Zellen zu
präsentieren, nennt man professionelle antigenpräsentierende Zellen.
Die dendritischen Zellen (DZ), die Makrophagen (Mph) und die B Lymphozyten sind die
professionellen
APZ.
Es
existieren
auch
nicht-professionelle
APZ,
welche
die
für
die
Antigenpräsentierung unerlässlichen MHC Moleküle auf ihrer Oberfläche erst nach Zellaktivierung
aufweisen. Hierzu gehören die Fibroblasten, einige Epithelzellen (z.B. die Epithelzellen des Thymus
und der Schilddrüse), die beta-Zellen der Bauchspeicheldrüse und die Endothelzellen.
1.3.2.3.
B-Zell Rezeptor (BZR)
Die aus den B Lymphozyten differenzierenden Plasmazellen sezernieren größere Glykoproteine, die
Antikörper oder Immunglobulin genannt werden. Die Antikörper sind sowohl im Blut als auch in den
biologischen Flüssigkeiten zu finden. Ihre Aufgabe ist es, bakterielle oder virale Antigene zu binden.
Der BZR- Komplex besteht aus einem Zelloberfächenimmunglobulin mit jeweils einem Heterodimer
(Igα-Igβ). Das Immunglobulin dient als signalerkennender Teil auf den B-Lymphozyten und bindet an
das Antigen. Dieses Immunglobulin ist identisch mit einem sezernierten monomeren Immunoglobulin,
außer ist es mit einem Heterodimer verbunden. Das Heterodimer kann Signale in das Innere der BZellen weiterleiten.
1.3.3.
Was sind die Folgen der Antigenerkennung?
Wie es schon im Subkapitel 2. zusammengefasst wurde, reagiert das Immunsystem über zwei Wege:
durch die schnell entstehenden natürlichen und durch die langsamer entstehenden spezifischen
Immunantworten.
12
Die spezifische Immunantwort unterteilt sich in die so genannte antikörpervermittelte humorale
Immunität und die zellgetragene zelluläre Immunität. Die Aktivierung der B Zellen beginnt mit der
Erkennung eines Antigens. Darauf folgt die klonale Proliferation, die Entstehung der Zentroblasten,
eine Zellteilung mit vielen Mutationen und schließlich die Selektion jener B Zellen, welche Rezeptoren
mit großer Affinität besitzen. Danach entstehen die Plasmazellen und die Gedächtniszellen.
Treffen T Zellen auf Antigene, kommt es ebenso zur klonalen Proliferation und der Entwicklung von
Gedächtniszellen. Durch die Zellaktivierung kommt es zusätzlich zur Sekretion von regulatorischen
Proteinen (Cytokine) und es werden die Effektorfunktionen ausgelöst. Es ist zu betonen, dass B und T
Zellen so zusagen „eng zusammenarbeiten“: wie auch die dendritischen Zellen, präsentieren auch die
B Zellen ihre erkannten, aufgenommenen und abgebauten Antigene den T Zellen durch die MHC-II
Expression. Diese Zellen heißen professionelle APZ. Weiters stellen die T aktivierten T Zellen solche
Cytokine her, die zur Differenzierung der B Lymphozyten unerlässlich sind.
Aus klinischer Sicht, sind die Begriffe der aktiven und passiven Immunität wichtig.
Eine aktive
Immunität entsteht, wenn Immunogene (Pathogene, Infektion, Schutzimpfungen) in den Körper
eintreten. Passive Immunität kann hervorgerufen werden, indem immunologisch bereits kompetente
Zellen oder/und Antikörper (Serum) einer immunisierten Person auf einen anderen Körper übertragen
werden.
1.4. Lokale Immunantwort
Die Erkenntnis der Vielzahl der Immunzellen und ihrer eng miteinander verknüpften Funktionsweise ist
bedeutend für die Entwicklung eines medizinischen Modells. Es soll hier durch den Ablauf der lokalen
Immunantwort dargestellt werden.
Unterschiedliche Erreger und irritierende Stoffe treten den Organismus am Ort der Gewebeverletzung
ein. Die Frage ist: wer und wie wird auf diese Fremdstoffe reagiert. In meisten Fällen sind auch
Gefäße durch die Verletzung des Gewebes betroffen, oder zumindest erhöht sich ihre Durchlässigkeit.
Folglich gelangen Plasma und zelluläre Komponente des Blutes ins Gewebe. Die Extravasation wirkt
auf die Funktion sowohl der zellulären als auch der löslichen Komponenten.
Die ins Gewebe gelangten Blutplättchen aktivieren sich bereits am Anfang. Ihre Aktivierung fördert
die Induktion des Gerinnungssystems. Einerseits entsteht dadurch ein undurchlässiges und
unlösliches Fibrinnetz, welches ein mechanisches Hindernis für die Erreger darstellt. Andererseits
formt dieses Fibrinnetz, zusammen mit den aktivierten Blutplättchen, den Grund des Thrombus, der
dem Verschluss der verletzten Ader dient. Gleichzeitig werden aus den Thrombozyten viele biologisch
aktive Stoffe freigesetzt, die auf die benachbarten Zellen wirken, dabei spielen sie eine regulatorische
Rolle.
Im Blutplasma befinden sich auch die Komponenten des Komplementsystems. Das aktivierende
Komplementsystem spielt eine Vielzahl von Rollen. Die Fragmente C3a und C5a üben auf die
neutrophilen Granulozyten eine chemotaktische Wirkung aus. C3b opsonisiert die Bakterien und
fördert dadurch ihre Eliminierung. Auch dendritischen Zellen, Makrophagen, Mastzellen und
13
Granulozyten besitzen C3b-Rezeptoren, deswegen beeinflussen C3b Fragmente auch die Funktion
dieser Zellen. Der membranangreifende Komplex, am Ende des Weges der Komplementaktivierung,
hat direkt zytolitische Wirkung.
Die ins Gewebe gelangenden neutrophilen Granulozyten haben meistens eine Effektorfunktion. Sie
haben die Fähigkeit die Erreger zu fressen. Außerdem bilden sie reaktive Sauerstoffintermediäre
(ROI) und proteolytische Enzyme, die nach ihrer Freisetzung die Bakterien extrazellulär zerstören.
Dieser Prozess wird jedoch auch von Gewebeverletzungen begleitet. Der Geweberest wird von
Makrophagen abtransportiert. Die Makrophagen und die dendritischen Zellen haben die Fähigkeit, die
aufgenommenen Stoffe den anderen Zellen zu präsentieren. Mit anderen Wörtern, sind sie
professionelle antigenpräsentierende Zellen. Hier treten die Lymphozyten in den Prozess ein, weil sie
präsentierte Antigene erkennen können.
Die von Makrophagen präsentierten Antigene aktivieren meistens die Th und Tc Zellen,
währenddessen aktivieren die von dendritischen Zellen präsentierten Antigene die NKT Zellen.
Dadurch werden die natürlichen und spezifischen Immunantworten miteinander verbunden.
1.5. Das Treffen ist die Bedingung der Erkennung und der Antwort.
Voraussetzung für die Entwicklung einer spezifischen Immunantwort, ist das Aufeinandertreffen der
Lymphozyten mit Antigenen. Deshalb bewachen die T und B Lymphozyten unseren Körper: sie
zirkulieren um ihre Ziele zu finden. (T, B Zell Rezirkulation, (Homing)).
1.5.1.
Lymphozyten-Rezirkulation
Abbildung 2. Lymphozyten-Rezirkulation
14
Während der Lymphozyten-Rezirkulation wandern die naiven Lymphozyten (die, die noch auf kein
Antigen getroffen sind)
über das Blut von den primären Lymphorganen in die sekundären
Lymphorgane/Gewebe ein. Im Falle dass sie auf kein Antigen treffen, treten sie durch die Lymphe
wieder in den Blutfluss ein und patrouillieren dort weiter.
Die Lymphozyten verlassen den Blutfluss meistens am Ort der „hochendothelialen Venolen“ (HEV),
wobei sie dies aber auch wo anders tun könnten.
Wenn die Lymphozyten in den sekundären Lymphgeweben auf die für sie geeigneten, spezifischen
Antigene treffen, aktivieren sie sich. Durch ihre Aktivierung proliferieren sie sich und sie differenzieren
sich zu Effektorzellen. Es ändert sich dadurch das Expressionsmuster der Adhesionsmoleküle an ihrer
Zelloberfläche und folglich auch ihre Fähigkeit zu wandern. So ist es ihnen nämlich möglich, unter der
Leitung der Chemokine, in das extra-lymphoide Gewebe auszuwandern und direkt am Ort des
Angriffes zu wirken (Abbildung 2.).
1.5.1.1.
Die
Extravasation
Wechselwirkung
zwischen
den
Lymphozyten und den Endothelzellen ereignet
sich in 4 Schritten. Es wird gewöhnlich
„Adhesionskaskade“ genannt. Am Anfang rollen
die Lymphozyten auf der Oberfläche des
Endothels, wobei sie sich nur an einem Punkt
berühren. Selektine leiten den Prozess. Die
Bindung wird stärker im dritten und vierten
Schritt. Der Prozess wird von Chemokinen,
Chemokinrezeptoren und Integrinen gesteuert.
Am Ende findet die Transmigration statt, indem
die
Zellen durch das Endothel hindurch wandern.
Die
Transmigration
wird
meistens
Abbildung 3. Extravasation
von
Integrinen reguliert (Abbildung 3.).
1.6. Die Organe des Immunsystems
Das Immunsystem – früher Lymphsystem genannt – besteht aus primären (zentralen) und
sekundären (peripheren) Lymphorganen. Das Knochenmark und der Thymus gehören zu den
zentralen Organen. Die Zellen des Immunsystems entstehen hier und ihre Differenzierung findet hier
teilweise statt. Die Umlagerung der Immunglobulingene und der TZR Gene findet hier statt. Mit
anderen Wörtern, es entstehen die reifen Klone der B und T Lymphozyten, die spezifische Rezeptoren
besitzen und die Fähigkeit haben Antigene zu erkennen.
Die sekundären Lymphorgane sind überall im Körper verteilt. Dies ist Sinnvoll, da die Erreger an
vielen verschiedenen Stellen in den Körper eintreten können. Die Milz, der Appendix, die Mandeln und
15
die Lymphknoten sind abgrenzt von den übrigen Geweben, im Gegensatz zu den Lymphgewebe der
Schleimhaut des Magen-Darm-Trakts, des Luftwegs, des Urogenitalsystems und der Haut. Alle
gehören jedoch zu den sekundären Lymphorganen. Diese Organe sind miteinander durch die
Lymphgefäße
verknüpft.
Die
Lymphgefäße
aus
der
Peripherie
sammeln
sich
in
den
Hauptlymphgefässen (truncus lymphaticus dexter und ductus thoracicus), und münden in den
Blutfuss. Eigentlich gehören auch die patrouillierenden Lymphozyten und die Antikörper
zu den
sekundären Lymphorganen.
Eine kurze Zusammenfassung: die Rolle der primären Lymphorgane ist die „Herstellung” der Zellen
des Immunsystems, währenddessen sichern die sekundären Lymphorgane den Ort des Treffens der
Antigene und der Lymphozyten.
1.6.1.
Lymphknoten
1.6.1.1.
Die Zellen der Lymphknoten
Die Lymphknoten sind kleine Strukturen, die sich praktisch überall im Körper befinden. An einigen
Orten des Körpers sind sie in größeren Mengen zu finden, z.B. in den Achselhöhlen, in den Lenden, in
der submandibularen Regionen und um die Aorta. Die Untersuchung dieser Regionen gehört zur
Routine in der physikalischen Untersuchung durch den Arzt.
Die Lymphknoten haben
zwei wesentliche Aufgaben: 1)
Mikroorganismen
den
und
in
Körper
gelangte
ihre Phagozyten entfernen die
korpuskuläre
Partikel
2)
hier
findet
die
Antigenpräsentierung statt.
Die Lymphknoten bestehen aus einem äußeren Cortex (Rinde) und einer inneren Medulla (Abbildung
4.). In den anatomisch unterschiedlichen Regionen der Lymphknoten befinden sich unterschiedliche
Zellen.
Abbildung 4. Lymphknote
16
Die B Lymphozyten und die Makrophagen befinden sich im Cortex. Die B-Zellen wandern in die
Lymphknoten durch die HEV ein, wo sie sich in den Folliculi organisieren.
Die von Antigenen
aktivierten B- Zellen bleiben in den Lymphknoten und beginnen sich zu teilen. Die nicht-stimulierten BZellen gehen in den Kreislauf zurück. Die aktivierten B-Zellen liegen im Zentrum des Folliculus und
formen das Keimzentrum (centrum germinativum). Es wird von der marginalen Zone umgeben, in
welcher sich naive B-Zellen und wenige T-Zellen befinden. Nach der Blasten-Transformation
verlassen die aktivierten B-Zellen den Folliculus und treten in die paracorticalen und medullären
Sinusse ein. Aus diesen Zellen entwickeln sich die Antikörper herstellenden Plasmazellen und die B
Gedächtniszellen.
Die paracorticale und interlobulare Region ist der Treffpunkt der T-Zellen mit dendritischen Zellen.
Hier kommen die dendritischen Zellen aus der Peripherie an und präsentieren ihre aufgenommenen
Antigene den spezifischen T-Zellen.
Die Medulla ist reich in Plasmazellen. Die von Plasmazellen hergestellten Antikörper verlassen die
Lymphknoten durch die efferenten Lymphgefäße.
1.6.1.2.
Wachposten-Lymphknoten (Sentinel)
Da sich Als die ersten Metastasen häufig in den Lymphknoten der Achselhöhlen bilden, kann man seit
den 1990-er Jahren eine sogenannte Sentinel-(Wachposten) Lymphknoten-Biopsie durchführen. Das
heißt, dass der Fluss der Lymphe von dem Tumor während der Operation beobachtet wird, und man
den Lymphknoten, an dem die Lymphe als erstes ankommt – der so genannte Sentinel-Lymphknoten
– entfernt. Die pathologische Untersuchung dieses Knoten ergibt das Tumorstadium der Region und
erlaubt es so die Region selektiv zu entfernen und mit Bestrahlung zu behandeln.
1.6.2.
Knochenmark
Abbildung 5. Die Reifung der Immunzellen im Knochenmark.
17
Das rote Knochenmark ist der Ort der Hämatopoese.
Die Hämatopoese geht von einer einzelnen hämatopoetischen Stammzelle aus. (Die gemeinsamen
hämatopoetischen Stammzellen heißen pluripotente Stammzellen oder aus dem englischen Begriff
„hematopietic stem cell” (HSC), aber in einigen Anatomie Bücher werden sie Hämozytoblasten
genannt.)
Um den Prozess zu vereinfachen, kann man sagen dass sich die hämatopoetischen Stammzellen zu
lymphatischen und myeloiden Vorläuferzellen (Progenitorzellen) differenzieren. Die Reifung der
myeloiden Zellen und der B Lymphozyten findet im Knochenmark statt, währenddessen wandern die T
Progenitorzellen in Thymus ein und differenzieren sich dort. Die endliche Reifung der mononuklearen
Phagozyten findet in den peripheren Geweben statt (Abbildung 5.).
1.6.3.
Milz
Das größte Lymphorgan unseres Körpers liegt in der Bauchhöhle in der Nähe des Magens, im linken
Oberbauch unterhalb des Zwerchfells und oberhalb der linken Niere. Die Milz wird von einer
bindegewebig bedeckten Kapsel umgeben, von der ein trabekuläres Bindegewebsgerüst in das
Parenchym zieht. Das Parenchym besteht aus roter und weißer Pulpa.
Die rote Pulpa enthält Blut aus dem die Phagozyten schädliche Partikel entfernen und gealterte rote
Erythrozyten abbauen.
Die weiße Pulpa ist für die immunologischen Aufgaben verantwortlich. Sie enthält Lymphfollikel,
bestehend aus lymphatischem Gewebe mit B-Lymphozyten. Die um die Gefäße angeordneten
„periarteriellen lymphatischen Scheiden“ (PALS) mit T-Lymphozyten gehören zur weißen Pulpa. Die B
Zellen lagern sich in den Follikeln der weißen Pulpa ab. Die dendritischen Zellen und die größeren,
aktivierten Lymphozyten sind die typischen Zellen der um den Follikeln liegenden marginalen Zone
(Abbildung 6.).
Abbildung 6. Die Milz
18
1.6.4.
Thymus
Der Thymus des Menschen ist ein zweilappiges Organ im Mediastinum. Seine Größe ist in
Erwachsenen geringer, trotzdem funktioniert er unser ganzes Leben. Der Thymus ist der Ort der
Differenzierung der T Zellen. Hier lernen die unreifen T Zellen die einzelnen Strukturen zu erkennen.
Weiters werden die spezifischen T-Zell Rezeptoren und die CD4, CD8 Moleküle hier exprimiert Die
Differenzierung der T Zellen wird von einer großartigen Zellzerstörung begleitet: nur 1-2% der
differenzierten Zellen gelangen als T Lymphozyten in die Peripherie.
Die Proliferation der aus dem Knochenmark ankommenden T Vorläuferzellen beginnt im Cortex, in
dem subkapsulären Bereich. Hier entstehen die CD4- / CD8- doppelt negativen (DN) T Zellen, die die
sogenannte positive Selektion durchgehen, während sie zur Medulla wandern. Sie erreichen die
cortico-medullare Grenze als CD4+/CD8+ doppelt positive (DP) Zellen. Die sogenannte negative
Selektion passiert in der Medulla. Während der Reifung verlieren die Thymozyten entweder ihre CD4,
oder ihre CD8 Moleküle und entwickeln sich zu reifen, einfach positiven Th und Tc Zellen (Abbildung
7.).
Abbildung 7. Die Selektion der T-Zellen im Thymus.
1.6.5.
Mukosaassozierte lymphatische Gewebe: MALT
Die Schleimhäute des Mundes, des Respirations – des Darms -und des Geschlechtstrakts haben ihre
spezialisierten Immunsysteme, die man unter der Bezeichnung schleimassozierte lymphatische
Gewebe zusammenfasst.
In den Schleimhäuten des Darms
befinden sich die sogenannten Peyer-Plaques, welche
lymphatische Follikeln sind. Ihr Epithel besitzt viele intraepitheliale Lymphzyten (IEL), dessen größter
Teil sich zu M Zellen entwickelt. Die M Zellen spielen eine besondere Rolle beim Schutz gegen
Erreger. Sie nehmen die Antigene aus dem Lumen des Darms auf und befördern sie zu den
Immunzellen der Peyer-Plaques. Infolge des Treffens mit den Antigenen, aktivieren sich die naiven
und die Gedächtnis B Zellen. Der Prozess setzt sich in den mesenterialen Lymphknoten fort und
spezifische Adhesionsmoleküle erscheinen auf der Oberfläche der aktivierten B Zellen (E7). Nach
19
ihrer Wanderung durch den Ductus Thoracicus und das Blut gelangen sie wieder in die Darmmukosa.
Mit Hilfe der Adhäsionsmoleküle können sie nun durch die HEV (high endothel venule) Zellen des
Darms aus dem Blutfluss auswandern und in der Mukosa ihre Wirkung entfalten (Abbildung 8.).
Abbildung 8. Mukosaassozierte lymphatische Gewebe: MALT
1.7. Die Zellen des Immunsystems
Die Zusammensetzung der Zellen des Immunsystems entsteht in den primären Immunorganen – im
Knochenmark und Thymus –, aber ihre endliche reife Form erhalten sie erst
in den peripheren
Lymphorganen oder genau am Ort der Immunantwort. Sie werden eher nach ihren funktionellen
Eigenschaften als ihrer Morphologie kategorisiert. Eine Verminderte Anzahl oder funktionelle
Störungen von Immunzellen führt zu Immundefekten.
Die Zellen des Immunsystems entstammen aus einer einfachen Knochenmark-Stammzelle. Diese
Zelle hat die Fähigkeit sich zu erneuern und zu differenzieren. Die Differenzierung geht in zwei
Richtungen: beide myeloide und lymphoide Linien entstehen. Aus der myeloiden Linie entwickeln sich
im Knochenmark granulozyten – erythrozyten – monozyten und – megakaryozyten Kolonie-formende
Einheiten. Die lymphoiden Vorläuferzellen differenzieren sich in drei Richtungen. Ein Teil der Zellen
bleibt im Knochenmark, aus denen sich die B Zellen entwickeln. Der zweite Teil wandert in den
Thymus. Aus diesen Zellen wiederum entwickeln sich die T und NKT Zellen. Aus dem dritten Teil
entwickeln sich die NK Zellen. Der genaue Ort dieses Prozesses ist jedoch noch nicht geklärt.
Direkte
Zell-Zellinteraktionen
zwischen
den
Stromazellen
des
Knochenmarks
und
den
hämopoetischen Zellen, Cytokine, Wachstumsfaktoren und biogene Amine, spielen eine Rolle bei der
Regulation der Hämatopoese.
20
In den letzten Jahren sind zahlreiche neue Gesichtspunkte bezüglich der Hämatopoese aufgetaucht.
Es sieht so aus, als ob die strikten Kategorien verschwinden würden. Das könnte bedeuten, dass aus
Progenitorenzellen nicht zur eine Zelllinie entsteht, (unidirektionell), sondern es ihnen möglich ist, sich
je nach der aktuellen physiologischen Lage multidirektionell zu differenzieren.
Neben den morphologischen und zytochemischen Eigenschaften, ist die Identifizierung der
hämopoetischen Zellen
meistens durch das Expressionsmuster ihrer zytoplazmatischen und
Oberflächenproteine möglich. In den 1980 Jahren wurde die Nomenklatur der auf die Leukozyten
charakteristischen Differenzierungsmarker/Antigene von einem internationalen Treffen vereinheitlicht.
Sie wurde als „Cluster of Differentiation” genannt. (sieh Kapitel 3.)
1.7.1.
Die Untersuchung der Zellen des Immunsystems
Die Untersuchung der Zellen des Immunsystems besteht aus mehreren Schritten. Die Mengen und
die Zusammensetzung der zirkulierenden weißen Blutzellen können durch ein qualitatives oder ein
quantitatives Blutbild bestimmt werden. In einigen Fällen können auch Zellen mit pathologischer
Morphologie wahrgenommen werden.
Knochenmarkaspiration oder Biopsien sind stärker invasive Eingriffe, die in erster Linie durchgeführt
werden, um bösartige Tumoren zu beweisen oder auszuschließen.
Die genaue Identifizierung der abnormal funktionierenden Zellen ist eine grundlegende Bedingung, um
Erkrankungen der Immunzellen zu behandeln und eine Prognose zu erstellen. Zytochemische
Untersuchungen, Flusszytometrie und Immunhistochemie werden dazu verwendet. Besonders für den
Nachweis der Malignität der Immunzellen und der Prognose bedarf es zytogenetische und
molekulargenetische Untersuchungen.
1.7.1.1.
Blutbild und Knochenmarkausstrich Untersuchungen
Bei der Bewertung eines quantitativen Blutbilds gibt es zwei Gesichtspunkte zu beachten: 1) im Fall
fehlender Abweichungen im quantitativen Blutbild, kann man die Gegenwart eines Immundefekts oder
einer bösartigen hämatologischen Krankheit noch nicht ausschließen. 2) Im quantitativen Blutbild
können Abweichungen auftreten, die nicht die Folgen eines pathologischen Prozesses sind. Z.B.
Während einer Schwangerschaft ist eine starke physiologische Leukozytose zu bemerken, bei der
kein hämatologisches Krankheitsbild im Hintergrund steht.
Bei der Bewertung eines qualitativen Blutbildes gibt es auch zwei ähnliche Gesichtspunkte zu
beachten: 1) im Fall fehlender Abweichungen im qualitativen Blutbild, kann man die Gegenwart eines
Immundefekts oder einer bösartigen hämatologischen Krankheit noch nicht ausschließen.
2)
Abweichungen im qualitativen Blutbild können auftreten, die keine Folge eines pathologischen
Prozesses sind. Z.B. Infolge akuten hohen Blutverlustes, oder bei einer Entzündung, erhöht sich die
Zellauswanderung aus dem Knochenmark um den Verlust zu kompensieren. Damit gelangen unreife
Zellformen in die Peripherie.
Bei der Bewertung der Knochenmarkausstriche gibt es drei Gesichtspunkte zu beachten
1. Sind die Zellformen aller Zell-Linien und aller Reifungszustände in der Probe vorhanden?
2. Was ist das Verhältnis der mit einander verglichenen Zell-Linien und Reifeformen.
21
3. Sind abnormale Zellformen in der Probe zu finden?
1.7.1.2.
Zytochemische Reaktionen
Um die Zell- Linien zu identifizieren, verwendet man häufig zytochemische Reaktionen, da sie auch
billig sind. Aus den zahlreichen zytochemischen Reaktionen (Sudan schwarz B Färbung, MPO
Nachweis, nicht-spezifische Esterase Reaktion, PAS Reaktion, usw.) beschreiben wir hier zwei
Methoden.
1.7.1.2.1. PAS Reaktion
Die PAS Reaktion ist nicht spezifisch, weil das Glykogen im Zytoplasma von beiden myeloiden und
lymphoiden Zellen nachgewiesen werden kann. Trotzdem können diese Zellen unterschieden werden,
da das Zytoplasma der myeloiden Zellen und der reifen Lymphozyten mit PAS homogen gefärbt wird,
währenddessen Lymphoblasten eine raue Granularität zeigen.
1.7.1.2.2. Nicht-spezifische Esterase Reaktion
Die nicht-spezifische Esterase Reaktion läuft auf Grund von solchen Esterasen Enzymen ab, die sich
im Zytoplasma der myeloiden Zellen befinden. Dadurch kann man die myeloiden und die lymphoiden
Zellen unterscheiden. Die Funktion der Enzyme im Zytoplasma der Monozyten kann mit Natriumfluorid
(NaF) gehemmt werden, nicht aber jene der Granulozyten. Wenn man die Esterase Reaktion mit und
ohne NaF durchführt, können die zwei Arten von myeloiden Populationen – Monozyten und
Granulozyten – unterschieden werden.
1.7.1.3.
Flusszytometrie
Flusszytometrie wird für die Immunophenotypisierung der Immunzellen verwendet, wodurch die
Stadien
der
Differenzierung
und
die
Aktivität
der
Zellen
bestimmt
werden
können.
Immunophenotypisierung bedeutet die Identifizierung der Zelloberflächen und der zytoplasmatischen
Proteine. Die detaillierte Beschreibung dieser Methode ist im Kapitel 3 zu finden (Abbildung 9.).
Abbildung 9. Immunophenotypisierung: die Identifizierung der Zelloberflächen und der
zytoplasmatischen Proteine
22
1.7.1.4.
Immunhistochemie
Immunhistochemische Methoden werden für die Immunophenotypisierung der soliden Gewebe
verwendet.
1.7.1.5.
Genetische Untersuchungen
Die pathologische Funktion der Zellen des Immunsystems kann mit genetischen Methoden untersucht
werden. Die funktionellen Störungen der Immunzellen können in den Krankheitsbilden der
Immundefekte
und
in
den
bösartigen
Formen
der
Zellen
ausgeprägt
werden.
Die
molekulargenetischen Diagnostik-Methoden, wie Zytogenetik, FISH, PCR oder die für das Mapping
des
vollen
Genexpressionsmuster
fähigen
„Chip”
Techniken
gehören
heutzutage
zur
Routinediagnostik des Immunsystems. (Die detaillierte Beschreibung dieser Techniken sind in den
Lehrbüchern der Genetik zu finden.)
1.8. Kommunikationen zwischen den Zellen des Immunsystems
Das Immunsystem ist eine funktionelle Einheit, deren Wirken von dem „harmonisierten”
Zusammenspiel der überall im Körper anwesenden Immunzellen, Gewebe und Organe abhängt.
Dieses Zusammenspiel kann nur durch kontinuierliche Kommunikation verwirklicht werden.
Bis jetzt glaubte man, dass Kommunikation zwischen den Zellen nur auf zwei verschiedene Arten
passieren
kann.
Die
benachbarten
Zellen
gehen
Wechselwirkungen
mit
ihren
Zelloberflächenstrukturen ein. Das nennt man direkte Zell-Zell Interaktion. (Im Immunsystem ist die
Verknüpfung der T Lymphozyten und der APZ ein Beispiel dazu) Die andere Möglichkeit ist die durch
von Zellen sekretierte Molekülen vermittelte Signalübertragung. Die sekretierten Moleküle gelangen zu
den fernen Zielzellen durch Diffusion, über die Lymphe oder mit dem Blut. (Cytokine stellen eine
wesentliche Gruppe der löslichen Signalmoleküle im Immunsystem dar.)
Heutzutage ist bereits bekannt, dass auch eine dritte Art von Kommunikation zwischen den Zellen
existiert: nämlich, Mikrovesikel vermittelte Signalübertragung. Mikrovesikel sind von den Zellen
verschickte membranumgebene Päckchen. Sie können sich an die Rezeptoren der Zielzellen
anbinden und dort eine Signalwirkung auslösen, oder sie können ihren Inhalt in die Zielzellen
gelangen lassen und die Eigenschaften der Zelle modifizieren. Wenn die Membran der Vesikel mit der
Membran der Zielzelle verschmilzt, wird ein neues Membranproteinmuster ausgeprägt, also der
„Phenotyp” der Zelle wird verändert.
Mikrovesikel sind 30-1000 nm große, von einer Lipiddoppelschicht umgebene Partikel, mit einem auf
die Donorzelle charakteristischen Proteinmuster an der Zelloberfläche. Der Inhalt besteht aus
Zytoplasma mit Proteinen, Nukleinsäuren und anderen Molekülen. Nach unserer derzeitigen
Erkenntnis, haben alle Zellen die Fähigkeit, Mikrovesikel zu verschicken. Dies passiert meistens nach
Aktivierung, obwohl es auch in Ruhe vorkommen kann. Mikrovesikel können mit Flusszytometer und
Elektronenmikroskopen untersucht werden.
23
Die wichtigsten Eigenschaften der von Mikrovesikeln vermittelten Signalübertragung:
1. Sie wirken mit einem komplexen Proteinmuster, da sie in ihrer Membran verschiedene
Proteine tragen.
2. Die Wirkung dauert länger, weil die Proteine membrangebunden sind. (Die Zeitdauer der
Wirkung hat eine wichtige regulatorische Rolle.)
3. Solche Stoffe können in Mikrovesikeln von einer Zelle in die anderen gelangen, die unter
physiologischen Umständen in der extrazellulären Matrix niemals freigesetzt werden könnten, weil
diese Moleküle sofort als Antigene identifiziert wären. (z.B. Nukleinsäuren)
Übersetzt von Erna Pap
24
2. DIE AUF DER ANTIGEN-ANTIKÖRPER
WECHSELWIRKUNG BERUHENDEN METHODEN I.
(EDIT BUZÁS)
Eine Reihe von Methoden werden zusammenfassend als Immunassays bezeichnet. Ihr gemeinsames
Grundprinzip ist die Erkennung und damit der Nachweis eines Partikels als Antigen durch die Bindung
an einen Antikörper.
Derzeit beruht der grosse Teil der Untersuchungen in der klinischen Labordiagnostik auf der AntigenAntikörper Wechselwirkung, deswegen werden diese Methoden in diesem Kapitel diskutiert.
Die in den Untersuchungen verwendeten Antikörper sind im Handel erhältlich, genau wie die
chemischen Reagenzien. Eine Vielzahl von polyklonalen und monoklonalen Antikörpern mit
unterschiedlicher Spezifizität stehen zur Verfügung bei den Firmen.
2.1. Die Eigenschaften der in der Diagnostik verwendeten
Antikörper
Die polyklonalen Antikörper stammen aus dem Serum von immunisierten Tieren; nach der
Immunisierung mit speziesfremden Proteinen entstehen grosse Mengen von Antikörpern im Blutserum
des
immunisierten
Organismus.
Antikörper
Diese
reagieren
mit
unterschiedlichen
Konformationsepitopen des Antigens, sie sind polyklonale Antikörper. Die polyklonalen Antikörper
werden von vielfaltigen B Zellen/Plasmazellen hergestellt. Die aus dem Serum isolierten Antikörper
gehören zu verschiedenen Antikörperklassen. Sie haben verschiedene Affinitätspezifizität, zudem sind
sie heterogen bezüglich ihrer Antigenspezifizität, d.h. sie reagieren mit mehreren Antigenen. Nach
IgM Typ Antikörper (primäre Immunantwort),
einer einzigen Impfung entstehen meistens
währenddessen nach wiederholten Impfungen, IgG die dominante Antikörperklasse im Serum ist. Die
polyklonalen Antikörper werden meistens als sekundäre Antikörper verwendet. Es ist zweckmässig
grössere Tiere (Schwein, Ziege, Kaninchen) für die Herstellung polyklonaler Antikörper zu verwenden,
weil grosse Mengen von polyklonalen Antikörpern auf diesem Weg hergestellt werden können. Nur
zum Vergleich: vom Kaninchen können 15 ml, von der Maus 0,3 ml, von der Ratte 2 ml, vom
Meerschweinchen 5 ml, vom Schaf 200-600 ml, von der Ziege 150-400 ml und vom Pferd 500-7000
ml Serum gewonnen werden. Bei der Auswahl der zu immunisierenden Spezies ist ein weiterer
wichtiger
Gesichtspunkt
der
phylogenetische
Abstand
zwischen
dem
Antigen
und
dem
immunisierenden Körper. Die Herstellung der polyklonalen Antikörper ist relativ billig und braucht 4-8
Wochen. Das Kaninchen ist die am häufigsten immunisierte Spezies um polyklonale Antikörper
herzustellen. Man kann aus ihnen ungefähr 250 mg Antikörper durch Ausbluten gewinnen. Die im
Kaninchen hergestellten polyklonalen Antikörper können als sekundäre Antikörper mit monoklonalen
Maus-Antikörpern erfolgreich verwendet werden. (Abbildung 2.1.)
25
Abbildung 2.1. Monoklonale und poliklonale Antikörper
Die monoklonalen Antikörper werden mit der Hybridom-Technik in Zellkulturen hergestellt, durch
somatische Fusion der Tumor- und Plasmazellen. Mit der Fusion entstehen immortalisierte
Hybridomzellen, die alle den gleichen monoklonalen Antikörper herstellen. Die Herstellung der
monoklonalen Antikörper benötigt im allgemeinen 3-6 Monate. Die im Handel erhältlichen
monoklonalen Antikörper gehören zum gleichen Immunglobulin Isotyp. Sie reagieren mit dem gleichen
Epitop, das die Firmen in den gewünschten Mengen aus Hybridomzellen herstellen können. Der
Vorteil der monoklonalen Antikörper ist nicht nur ihre Herstellung nach Bedarf, sondern auch, dass die
hergestellten Antikörper gleich sind, was besonders wichtig ist im Fall der standardisierten klinischen
diagnostischen Tests und der Antikörpertherapie. Eine riesige Auswahl von im Handel befindlichen
Antikörpern ist unter der Web Adresse http://www.antibodyresource.com/onlinecomp.html zu finden.
2.1.1.1.
Grundbegriffe
Antigen-Antikörper Bindung: reversibel und beruht auf nicht-kovalenten Wechselwirkungen
Affinität: Die Bindungsstärke zwischen einem einzigen Antigenepitop und einer einzigen
Bindungsstelle eines Antikörpers, die der Betrag der anziehenden und abstoßenden Kräfte zwischen
dem Epitop und dem Antikörper ist. Die Affinität ist die Gleichgewichtskonstante die die AntigenAntikörper Reaktion auszeichnet. Die meisten Antikörper besitzen eine grosse Affinität.
Avidität: der Betrag der an mehreren Bindungsstellen gemessenen Bindungsstärken, d.h. die totale
Bindungsstärke zwischen multivalenten Antigenen und Antikörpern. (Abbildung 2.2.).
26
Abbildung 2.2. Affinität und Avidität.
Spezifizität: die Fähigkeit des Antikörpers nur mit einem einzigen Antigenepitop zu reagieren. Die
Antikörper können die verschiedenen Antigene
1) nach ihrer primären Struktur 2) nach ihren
Isomerformen und 3) nach ihrer sekundären und tertiären Struktur unterscheiden.
Kreuzreaktivität: Ein gegebener Antikörper kann mit mehr als einem Antigen reagieren. Die Ursache
kann sein, dass das kreuzreagierende Antigen solche Epitope besitzt, die den Epitopen von anderen
Antigenen ähnlich sind.
Antikörper Titer: die letzte Verdünnung einer Antikörperlösung, mit der die Antigen-Antikörper
Wechselwirkung gemessen werden kann.
Sensitivität: sie bezeichnet die Sensitivität des diagnostischen Antikörpers, d.h. wie viel Prozent der
Kranken als positiv erkannt werden.
Spezifität: sie bezeichnet, wie viel Prozent der Gesunden als negativ (also als gesund) durch den
diagnostischen Antikörper erkannt werden.
2.1.2.
Die Möglichkeiten die Antikörper zu markieren
Um die Lokalisation und/oder die Menge der Antigene festzustellen, muss man die Antigene sichtbar
machen. Dazu werden verschiedene Markermoleküle angewendet. (Abbildung 2.3., Tabelle 2.1.und
Tabelle 2.2.)
Abbildung 2.3. Unterschiedlich markierte Antikörper.
27
Markierung
Beispiel
Anwendung
FITC (fluorescein izotiocianat)
PE (Fikoeritrin)
Flourokrom
Immuncytochemie
Rhodamin
Texas rot
Peroxidase (HRPO)
Enzym
Alkalische Phosphatase (ALP)
ELISA [kolorimetric or chemiluminescent
(CLIA)] und ELISPOT, Immunoblot
Biotin
Biotin
Indirekte Immuncytochemie (Detektierung
mit Avidin oder Sterptavidin –gekoppeltem
Enzym)
Goldkolloid
Goldkolloid
Elektronenmikroskopische
Immuncytochemie
Radioaktive
Markierung
125
I
RIA und IRMA
Tabelle 2.1. Einige häufige an den Antikörpern gebundene Markermoleküle.
Enzym
Substrat
DAB (diaminobenzidin): braun
AEC (aminoetil-karbazol): rot
Peroxidase (HRPO)
True Blue: blau
Luminol: lumineszent
NBT (nitroblue tetrazolium): blau
Alkalische Phosphatase
(ALP)
BCIP (bromo-kloro-indoil phosphate):
blau
Dioxietán Produkte: lumineszent
Tabelle 2.2. Einige häufige Enzym-Substrat Systeme
2.2. Methoden
2.2.1.
Flusszytometrie
Derzeit ein der am häufigsten im klinischen Laborpraktikum verwendeten Immunoassays, der auf
Antigen-Antikörper Wechselwirkung beruht. Die detaillierte Beschreibung dieser Methode ist im
Kapitel 3. zu finden.
28
2.2.2.
ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay)
ELISA ist der am häufigsten verwendete, auf Antigen-Antikörper Wechselwirkung beruhende nichtradioaktive Immunoassay. Polystiren Platten mit 96 (8x12) Löchern (ELISA plate) werden verwendet.
Proteine werden an den Löchern und an der Wand der Löcher der ELISA adsobiert. Die Adsorption
wird durch van der Waals Kräfte, hydrophobe- und elektrostatische Wechselwirkungen durchgeführt.
Diese Proteine sind indifferent und sind so nicht an der Immunreaktion beteiligt. Es handelt sich um
Proteine, die kein Antigen oder keine Antikörper besitzen und deshalb in der ELISA-Reaktion
teilnehmen können. Für diesen Zweck verwendet man Krächzen (bovine) Serum Albumin oder
Gelatine.
Die immunologischen Nachweismethoden können aufgeteilt werden, abhängig davon, mit welchen
Verfahren die eigentliche Antigen-Antikörper Reaktion visualisiert wird.
Die im ELISA-System verwendeten Antikörper können markiert oder mit einem Enzym und Biotin
gekoppelt werden. Für die Markierung der Antikörper wird am häufigsten Horse raddish peroxidase
(HRP) oder alkalische Phosphatase (AP) als Enzymmarkierung verwendet. Das Enzym selbst ist nicht
sichtbar (z.B. HRP). Es wird dadurch sichtbar, dass es den Elektontransfer zwischen H 2O2 und einem
kolorimetrischen Indikator katalysiert. Dadurch verändert sich die Farbe des oxidierten kromogenen
Substrats. (TMB, DAB, ABTS) Die Menge des veränderten Kromogenstoffs kann über die optische
Densität gemessen werden. Sie ist proportional zur Enzymaktivität. Anstatt kromogener Substrate
kann man auch fluorogene Substrate verwenden.
Die Biotin Markierung basiert auf der grösseren Affinität zwischen Biotin und Avidin, oder zwischen
Biotin und Streptavidin. Die Biotin-Avidin Bindung ist eine der am besten bekannten nicht-kovalenten
Protein-Ligand Bindungen. Avidin stammt aus Eiweiß. Es ist ein basisches Glykoprotein dessen
Sequenz 30% mit Streptavidin von Streptomyces avidnii gleich ist, aber ihre sekundäre, terziäre und
quaternäre Struktur ist fast völlig gleich. Avidin und Streptavidin haben tetramere Struktur, alle
Untereinheiten haben die Fähigkeit ein Biotin zu binden. Mehrere Biotin Moleküle können an ein
einziges Biotin-markiertes Protein binden, dadurch kann sich das Biotin-gebundene Protein
gleichzeitig mit mehreren Avidin Molekülen verkoppeln. (Abbildung 2.4.). Die Avidität des Biotins zu
Avidin ist noch größer als die zu Streptavidin.
Abbildung 2.4. Biotin Markierung.
29
Im Gegensatz zu Streptavidin, ist Avidin glykolisiert (deswegen kann es auch an Lektine binden),
besitzt positive Ladungen (bindet auch an den Zellkern) und ist in der Lage aspezifische Bindungen
herzustellen.
Im Allgemeinen werden 2-3 parallele Messungen durchgeführt, deren Durchschnitt als Wert
genommen wird.
Drei Grundtypen der ELISA Methoden sind bekannt:
1. indirekte ELISA
2. Sandwich ELISA
3. kompetitive ELISA
2.2.2.1.
Die indirekte ELISA Reaktion
Ein bestimmtes Protein (z.B. Virus Antigen) wird an der Oberfläche der Platte adsorbiert. Diesen
Schritt nennt man coating. Danach wird die Platte mit einem indifferenten Protein (z.B. bovin serum
albumin) blockiert, dazu wird die biologische Probe (Blutserum) zugegeben. Auf die Inkubation folgt
das Waschen, danach kommt eine weitere Inkubation mit den gegen die primären Antikörper
markierten sekundären Antikörpern. (Die primären Antikörper sind die aus der biologischen Probe
nachzuweisenden Antikörper). (Der Marker kann z.B. HRP gekoppelter anti-human Immunglobulin
sein.) Nach einem weiteren Waschen werden H2O2 und kromogene in die Löcher eingeführt. Die
Farbereaktion wird mit einem Spektrophotometer bei gegebenen Wellenlängen gemessen. Es gibt
zweckdienlich eine negative Kontrolle (biologische Probe sicher ohne Antikörper) und eine positive
Kontrolle (biologische Probe sicher mit Antikörpern) zu testen. Eine Verdünnungsreihe von Proteinen
mit bekannter Konzentration soll auch auf die ELISA Platte als Referenz aufgebracht werden. Dadurch
kann eine Kalibrationskurve aufgezeichnet werden, womit die Adsorbenzwerte der unbekannten
Proben verglichen werden können.
2.2.2.2.
Sandwich ELISA
„Capture” Antikörper werden auf der Oberfläche der Platte adsorbiert (diesen Schritt nennt man
coating). Nach Blockieren („blocking“) mit indifferenten Proteinen folgt die Inkubation mit dem zum
Antikörper passenden Antigen (z.B. Cytokine aus dem Blutserum). Nach dem Waschen kommt die
Inkubation mit HRP-markierten Antikörpern, die spezifisch für die selben Antigene sind, aber die mit
einem anderen Epitop reagieren. Nach der Zugabe von H 2O2 und Kromogenen wird die Farbereaktion
mit einem Spektrophotometer gemessen. (Abbildung 2.5.). In diesem Fall wird die Kalibrationskurve
aus den Werten der Verdünnungsreihe der Antigene gezeichnet. (Abbildung 2.6.).
30
Abbildung 2. 5. ELISA Methoden
Abbildung 2.6. Kalibrationskurve - ELISA
2.2.2.3.
Kompetitive ELISA
Im ersten Schritt werden die unmarkierten Antikörper mit den Antigen-enthaltenden biologischen
Proben inkubiert. Antigen-Antikörper Komplexe entstehen in den Proben. Diese „präinkubierten”
Proben werden auf die Oberfläche der ELISA Platte aufgetragen. Je mehr Antigene in der
biologischen Probe vorhanden sind, desto weniger Antikörpermoleküle bleiben frei, um an die auf der
ELISA Platte-adsorbierten Antikörper zu binden. Enzym-markierte (HRP) sekundäre Antikörper und
kromogene Substrate werden verwendet um die ELISA Reaktion anzuhalten. (Abbildung 2.7.). Der
Vorteil der kompetitiven Reaktion ist die Möglichkeit auch kleine Mengen von unmarkierten Antigenen
nachzuweisen.
31
Abbildung 2.7. Das Prinzip der kompetitiven ELISA
2.2.2.4.
Was ist zu beachten, bei der Durchführung von ELISA ? Was kann
Probleme verursachen?
1. Das Waschen der Löcher (genügende Menge der Lösung, genaue Entfernung der Lösung)
2. Austausch der Pipettenspitzen.
3. Parallele Untersuchungen
Im Falle einer schwachen oder keiner Farbreaktion, mischen wir zur Kontrolle die enzymmarkierten
Antikörper mit der Substrat im 1:1 Verhältnis. Wenn keine Farbreaktion auch in dieser Aufstellung
entsteht, können dies die möglichen Ursachen sein: 1. die Substratlösung wurde nicht im Dunkel
gelagert, 2. die HRP Lösung ist alt und hat sich teilweise abgebaut.
C-Anca P-Anca Anti-Cardiolipin IgG
Anti-Cardiolipin IgM
ss/DNA ds/DNA Jo-1
Histone Complex
AutoimmunDiagnostik
Immune Complex
Anti-Thyroid Microsomal
Anti-Mitochrondrial SSa SSb ANA, SM
Sm/RNP Thyroglobulin Anti Thyroglobulin
Gliadin IgG, IgA, IgM
Androstenedione
FSH, HCG, HGH, LH, Estradiol, Estriol Progesterone 17-OH Progesterone
Endokrinologie
Free-Testosterone
Testosterone
Cortisol, TSH, T3, T4, T uptake, free-T3, free-T4, TPA
Mikrobiologische
Untersuchungen
Anti-HBsAg ; Anti-HCV; Anti-HIV; Anti-HEV IgM; Anti-HAV IgM, IgG;
Anti-tuberculosis IgG; Anti-syphilis; anti-EBV; Anti-Rotavirus
AFP, CEA, ferritin
Tumordiagnostik
HCG, b-HCG, PAP,
PSA, Free PSA
Tabelle 2.3. Beispiele für ELISA diagnostische Tests.
32
2.2.3.
ELFA (Enzyme Linked Immunofluorescent Assay)
Ein ultraempfindliches System, das ein fluorogenes Substrat (z.B. 4 Methyl umbilliferyl phosphate
(MUP)) verwendet. Da fluoreszierende Moleküle bereits in pikomolaren Mengen detektiert werden
können, kann die Empfindlichkeit des Essays mit fluoreszierenden Substraten stark erhöht werden
(z.B. der Nachweis der Rotaviren ist hundertmal grösser als mit ELISA). (Abbildung 2.8.).
Abbildung 2.8. ELFA (Enzyme Linked Immunofluorescent Assay)
2.2.4.
ELISPOT
ELISPOT ist ein indirekter Immunoassay, der für den Nachweis für von einzelnen Zellen sekretierten
Molekülen (am häufigsten Cytokine) verwendet wird. Die ELISPOT Platte enthält 96 Löcher, die eine
spezifische Membran (Nitrocellulose oder PVDF (Polyvinylidenfluorid)) besitzen. Unter sterilen
Umständen wird die Membran mit „capture” Antikörpern bedeckt (coating), dann kommt das Blocking
mit indifferenten Proteinen (z.B. bovin serum albumin) enthaltendem Puffer. Bekannte Mengen
lebender Zellen (aus Lymphozyten 1-300 000 Zellen) werden in die Löcher mit Nährstofflösung
o
eingelegt, die in CO2 Termostat, auf 37 C für einige Tage kultiviert werden. Danach werden die Zellen
ausgewaschen. Ihre sekretierten Moleküle werden durch die Capture Antikörper gebunden. An diese
Cytokine binden die markierten Antikörper, die mit bestimmten Substraten unlösbare Komplexe
herstellen und damit sichtbar werden. (Abbildung 2.9.).
33
Abbildung 2.9. ELISPOT
Nach dem Trocknen können die farbigen Flecken in den Löchern durch Scannen mit einer
bildanalysierenden Software ausgewertet werden.
ELISPOT ist eine sehr empfindliche Methode, sie bietet die Möglichkeit die positiven Zellen auch in
einem 1/300 000 Verhältnis zu bestimmen.
2.2.5.
Immuno blot (Western blot)
Die relative Menge eines Proteins kann durch einen gegebenen primären Antikörper in den
biologischen Proben bestimmt werden. Wir stellen ein Lysat/Homogenisat aus Zellen oder Gewebe
her. Der Puffer enthält Protease-Inhibitoren. Die Proben werden auf ein Polyacrylamid Gel
aufgetragen und die Proteine werden nach ihrer Grösse mit Gelelektrophorese getrennt. Das
eigentliche Blotting ist die Übertragung der Proteine auf einen geeigneten Träger, z.B. Nitrocellulose
Membran. Die Lage – die Anordnung – der Proteine bleibt gleich wie sie ursprünglich im Trenngel war.
Die freie proteinbindende Oberfläche der Membran wird mit indifferenten Proteinen blockiert. Im
nächsten Schritt wird die Membran mit primären Antikörpern inkubiert, diese Antikörper sind fähig das
34
gesuchte Protein zu binden. Dazu werden die sekundären Antikörper zugegeben, welche eigentlich
Antikörper-Enzym-Komplexe sind und binden an die primären Antikörper. So wird die Lage sichtbar,
an der sich die primären Antikörper gebunden haben. (Abbildung 2.10-11.).
Abbildung 2. 10. Gelelektrophorese
Abbildung 2.11. Immunoblotting
35
Der am häufigsten verwendete sekundäre Antikörper ist mit HRP gekoppelt. HRP katalysiert die
Reaktion, welche mit der Oxydation des Luminols eine 428nm Lichtemission ergibt, welche mit einem
lichtempfindlichen Film sichtbar gemacht wird. (Abbildung 2.12.). Die Ergebnisse können auf das
Produkt eines housekeeping Gens standardisiert und danach analysiert werden (Beta-Aktin kann
einem solchen housekeeping Protein dienen.) Die Ergebnisse informieren über die relative Menge und
die Molekularmasse des Proteins in der Probe.
Abbildung 2.12. Auswertung mit einem lichtempfindlichen Film.
2.2.6.
Auf radioaktiven Markierungen basierende Methoden
2.2.6.1.
Radioimmunoassay (RIA)
Die Methode ist spezifisch, sehr billig und hat eine grosse Empfindlichkeit. Man kann damit die
Konzentration der Antigene, z.B. Hormone messen. Der Nachteil ist, dass man für die Methode
spezifisches Equipment (z.B. Gamma Messer) braucht und wegen der Verwendung eines radioaktiven
Stoffes, benötigt man eine spezifische Erlaubnis. Des weiteren erfordert die Arbeit besondere
Vorsichtsmaßnahmen. Eine Art der Assays ist RAST Test (radioallergosorbent Test).
Das Isotop I
125
ist oft an die Aminosäure Tyrosin gebunden. Das radioaktive Antigen wird mit
Antikörpern mit einer bekannten Menge gemischt. Danach wird die biologische Probe, mit
unbekannten Mengen der zu bestimmenden Antigene, zugegeben. Dadurch tritt das (unmarkierte,
kalte) Antigen der Probe mit dem markierten Antigen in Kompetition, um an den Antikörper zu binden.
(Abbildung 2.13-14.).
Das „S. aureus Protein A (Zysorbin)” ist ein Stoff der Zellwand, der Antikörper binden kann. Dies oder
anti-Immunglobulin-Antikörper können die markierten von den unmarkierten Antikörpern trennen.
Danach können die markierten Moleküle gemessen werden.
36
Abbildung 2.13. IRMA und RIA
Abbildung 2.14. RIA
2.2.6.2.
Immunoradiometric assay (IRMA)
In diesem System werden monoklonale Antikörper verwendet, die an die innere Oberfläche der
polystyren Tuben gebunden sind. Die Proben der Patienten werden mit I
125
-markierten Antikörpern
inkubiert. Die unmarkierten, immobilisierten (auf der Wand befestigten) und die in der Lösung
vorhandenen markierten Antikörper binden gleichzeitig an die in den Proben vorhandenen Antigene.
Da entsteht eigentlich ein Komplex, der auf der soliden Phase angeheftet wird. Die sich nicht
bindenden markierten Antikörper werden durch Waschen getrennt. Die gemessene Radioaktivität ist
37
im Verhältnis mit dem Antigengehalt der Probe. Die quantitative Auswertung geschieht mit einer
Standardkurve, die mit der Anwendung von Antigenen mit bekannten Mengen gemacht wurde.
2.2.7.
Immuncytochemie (Immunhistochemie)
Mit diesem Verfahren kann man spezifische Proteine in den Zellen/Geweben mit markierten
Antikörpern nachweisen. Schnitte, Blutausstriche, kultivierte angeheftete Zellen und auf Objektträger
zentrifugierte Zellsuspensionen (Cytospin Präparate) können untersucht werden.
Die Antigen/Antikörper - Bindung kann entweder mit fluoreszierenden Farben, mit Metalkolloiden, mit
radioaktiver Markierung oder mit Enzymen sichtbar gemacht werden.
Der Antikörper muss die biologische Membran passieren können, um an der die Reaktion in der Zelle
oder im Zellkern teilzunehmen. Die Anwendung von Detergenzien (0.25% Triton X-100 oder 0.5%
Saponin) kann auch nötig werden, um die Membran durchlässiger zu machen. Wenn Aceton,
Methanol oder Ethanol als Fixierungsmittel verwendet wird, ist keine weitere Permeabilisierung nötig.
Wenn man Membranantigene nachweisen möchte, ist die Anwendung von Triton zu vermeiden, da
Triton die Membran zerstört.
Aldehyde, als Fixierungsmittel, stellen inter- und intramolekulare Querverbindungen (Methylenbrücke)
in und zwischen bestimmten Strukturproteinen her, die die zellulären/gewebe Antigene maskieren
können. Die Wirkung der Maskierung ist von der Dauer und Temperatur der Fixierung, von der
Konzentration des Fixierungsmittels und von der Menge der lokalen Proteine abhängig. Um die
zellulären/gewebe Antigene zu demaskieren, kann man die Probe mit Proteasen (z.B. mit Trypsin)
verdauen oder für eine kurze Zeit im Mikrowellenherd erhitzen.
Also werden die gefrorenen oder fixierten Schnitte/Präparate nach Bedarf permeabilisiert. Danach
kommt die Blockierung der aspezifischen Bindungsstellen (mit bovine serum albumin, 1% Gelatine
oder 10% normales Serum, das aus der gleichen Spezies stammt, wie die sekundären Antikörper).
Die
Präparate
werden
zuerst
mit
primären,
danach
mit
sekundären
Antikörpern
–
mit
zwischenzeitlichem Waschen – inkubiert. Es wird empfohlen, die Zellkerne für die HintergrundFärbung auch zu färben (z.B. 0.1-1 μg/ml Hoechst oder DAPI (DNS-Farbe)). Aspezifische Färbung
kann infolge der hydrophoben oder elektrostatischen Wechselwirkungen entstehen. Die aspezifische
Färbung ist meistens gleichförmig und kann mit Präinkubation mit normalem Serum abgeschwächt
werden. Viele Gewebe enthalten endogene Peroxydase-Aktivität. Vor der Anwendung des primären
Antikörpers hilft die Präinkubation des Schnittes mit H 2O2 die endogene Peroxidase-Aktivität
abzuschaffen. In Bezug auf die endogene alkalische Phosphatase-Aktivität – auch charakteristisch für
zahlreiche Gewebe -, kann sie mit Präinkubation mit Levamisole beseitigt werden. Einige Gewebe
(z.B. Leber und Nieren) enthalten endogenes Biotin, weswegen in diesen Fällen eine Präinkubation
mit nicht-konjugiertem Avidin empfohlen wird (Abbildung 2.15.).
38
Abbildung 2.15. Immuncytochemie (indirekte Methode)
2.2.7.1.
Direkte Methode
Die Probe wird in einem einzigen Schritt mit markierten (z.B. FITC- markierten) Antikörpern inkubiert.
Die Methode ist schnell, kurz und spezifisch, aber wenig empfindlich.
2.2.7.2.
Indirekte Methode
Ein unmarkierter primärer Antikörper reagiert mit dem Antigen des Gewebes. Danach wird ein
markierter sekundärer Antikörper verwendet, der mit dem Immunglobulin der Spezies des primären
Antikörpers reagiert.
Diese Methode ist empfindlicher. (Das Signal verstärkt sich, da zahlreiche
sekundäre Antiköper Moleküle auf den unterschiedlichen Epitopen des primären Antikörpers reagieren
können.). Die Methode ist auch billig, weil ein einziger sekundärer Antikörper verwendet werden kann,
um an viele unterschiedliche primäre Antikörper anzubinden. In der Immunofluoreszens Markierung
wird FITC, Rhodamin oder Texas-Rot für Markierung verwendet, währenddessen Peroxidase oder
alkalische Phosphatase in der immunenzymatischen Markierungen üblich ist (Abbildung 2.16.).
Abbildung 2.16. Direkte und indirekte Methode, den Antikörper zu markieren
39
2.2.7.3.
Kontrollen
Positive Kontrollen werden angewendet um zu entscheiden, ob das Protokoll überhaupt funktioniert.
Am besten sollte solches Gewebe als Kontrolle verwendet in dem die Reaktion sicher abläuft.
Negative Kontrollen werden verwendet, um die Spezifizität des Antikörpers zu bestimmen. Der
primäre Antikörper kann ausgelassen werden, indem er mit einem Isotyp Kontroll-Antikörper oder mit
normalem Serum der gleichen Spezies ersetzt wird.
Wenn die Antikörper neu sind, soll die Reaktion gehemmt werden. Dies kann man auch durch
Präinkubation der primären Antikörper mit gereinigtem Antigenen machen.
2.2.7.4.
PAP Methode (Peroxidase anti-Peroxidase Verfahren)
Diese Methode ist eine indirekte Technik, die aus drei „Schichten” aufgebaut ist: unmarkierte primäre
Antikörper, unmarkierte sekundäre Antikörper und ein stabiler Peroxidase- Antiperoxidase Komplex.
Die sekundären Antikörper reagieren einerseits mit den primären Antikörpern, andererseits mit der
dritten Schicht. Die Empfindlichkeit der Methode ist zirka 100-1000 fach höher, weil die Peroxidase
immunologisch und nicht chemisch gebunden ist Deswegen kann man eine viel höhere
Primärantikörper Verdünnung verwenden, womit die aspezifischen Bindungen abgeschwächt werden.
2.2.7.5.
Avidin-Biotin Komplex (ABK) Methode
Es gibt drei „Schichten” auch in dieser Methode. Der ersten „Schicht” entsprechen die unmarkierten
primären Antikörper, der zweiten die biotinierten sekundären Antikörper und der dritten der AvidinBiotin-Peroxidase Komplex.
2.2.7.6.
Fluorescens-Mikroscopie und Laser konfokale Mikroskopie
Ein Fluoreszens-Mikroskop wird gebraucht, um die fluoreszierenden (immuncytochemischen) Proben
sichtbar zu machen.
Das anregende Licht mit kleinerer Wellenlänge
(im Allgemeinen UV, das die Augen schädigen
könnte), kommend aus dem optischen System und wird im Fluoreszens-Mikroskop von dem FarbFilter zwischen dem Objektiv und dem Okular absorbiert. So erreicht nur das Licht mit längerer
Wellenlänge die Augen oder den farbempfindlichen Film. Damit werden die im Präparat vorhandenen
fluoreszierenden Strukturen sichtbar gemacht.
Die Fluoreszens kann aus natürlichen Zellkomponenten (Autofluoreszens z.B. aus Vitamin A.) oder
aus mit fluorochrom-gefärbten Zellkomponenten stammen. Einige Fluorochrome ändern die
Wellenlänge (die Farbe) des emittierten Lichts, abhängig von dem pH Wert oder von der Ca++
Konzentration. Mit Hilfe dieser Fluorochrome können der intrazelluläre pH Wert oder die intrazelluläre
Ca++ Konzentration gemessen werden.
Das Laser Konfokale Mikroskop ist auch mit einer Fluoreszens-Optik ausgestattet. In diesem
Instrument ein dünner Laserstrahl das Präparat ab. Der Fokuspunkt des Laserstrahls kann auch in der
Tiefe des Präparats geändert werden. Die aus den Schichten des Präparates gewonnene Information
kann im Computer gespeichert und zusammengefasst werden. (Abbildung 2.17.). Auf diese Weise
40
können auch dichtere Präparate untersucht werden, ohne den Verlust der Informationen der dritten
Dimension. Das von dem Computer rekonstruierte Bild erscheint auf einem Fernsehmonitor. Mit
dieser Methode kann man sich das viel Zeit und Arbeit brauchende Schneiden und die 3DRekonstruktion ersparen.
Abbildung 2.17. Das laser konfokale Mikroskop.
2.2.8.
Lateral flow Tests
Derzeit sind diese Schnelltests weitverbreitet. Sie beruhen auf Immunoassay/Immunkromatographie.
Ihre Herstellung ist billig und die Ausführung braucht nur einige Minuten, (im Gegensatz zu den
Stunden in den vorgestellten Assays), sie erfordern keine Fachkenntnisse, können zu Hause gemacht
werden und es ist einfach, die Ergebnisse zu archivieren.
Obwohl die Grundlagentechnologie schon in den 1960er Jahren entwickelt wurde, wurde der erste
lateral flow Schwangerschafttest erst in 1988 kommerziell in den Umlauf gebracht. Seitdem sind diese
lateral flow Tests in Kliniken, in der Tierheilkunde, in der Agrikultur, in der Lebensmittelindustrie und im
Umweltschutz weitverbreitet.
Das Prinzip der Methode ist das folgende: der Teststrich wird in die biologische Probe eingetaucht und
die Flüssigkeit wandert in dem Teststrich nach dem Prinzip der Kapillarität. Die Probe mischt sich mit
gefärbten Mikrogranuli (z.B. Latex), die mit dem für das zu untersuchende (nachzuweisende) Antigen
spezifischen Antikörpern bedeckt sind. Die Antigene der Probe binden an die bunten Mikrogranuli und
wandern entlang des Teststriches (Abbildung 2.18-19.). An einer bestimmten Position des
Teststriches wurde ein anderer Antikörper aufgetragen, der für ein unterschiedliches Epitop des
gleichen gegebenen Antigens spezifisch ist. Dort sammeln sich die gefärbten Mikrogranuli, falls das
nachzuweisende Antigen (z.B. anti-hCG, LH oder HIV) in der biologischen Probe vorhanden ist. Die
41
weiterwandernden bunten Mikrogranuli sammeln sich noch ein Mal an einer Lage des Teststriches, an
der anti-Immunglobulin aufgetragen wurde. Infolgedessen binden alle Mikrogranuli an diese
Oberfläche, unabhängig davon, ob irgendein Antigen an die Mikrogranuli gebunden hatte. Diese
zweite bunte Linie dient einer inneren Kontrolle des Tests.
Abbildung 2.18. Das Prinzip der „lateral flow test“ Methode I.
Abbildung 2.19. Das Prinzip der „lateral flow test Methode“ II.
Hier folgen einige Beispiele für lateral flow Tests, die kommerziell im Umlauf gebracht sind: H. pylori
IgG,
H
pylori
Antigen
(aus
Stuhl),
Schwangerschaftstest,
Rotavirus,
Adenovirus,
Stuhlhemoglobin, Sterptococcus, Morfin, E. coli O157.
2.2.8.1.
Multiplex Immunoassay Systeme
Die Anwendung der Immunoassays hat sich in jüngster Vergangenheit mehr und mehr verbreitet.
42
RSV,
Die Vorteile der multiplex Systeme sind die folgenden:

Sie stellen Untersuchungssysteme mit grosser Durchlässigkeit dar.

Wenn verwendet, ist nur ein kleineres Volumen der Probe nötig.

Sie sind zeit-und kosteneffizient.

Mit ihnen hat man die Möglichkeit die Konzentration von mehreren unterschiedlichen
Molekülen gleichzeitig zu messen.

Sie bieten die Möglichkeit viele unterschiedliche Proteine zu messen.
Es gibt solche multiplex Systeme (z.B. Proteome Profiler Arrays) in kommerziellem Umlauf, welche
Membranen mit angekoppelten spezifischen capture Antikörpern haben. Diese Systeme ruhen auf
dem Prinzip des Nachweises der Chemolumineszenz.
Es
existieren „96Antibody
Array”
Systeme,
die
den
parallelen
Nachweis
unterschiedlichen Molekülen in einer 96 Lücken Mikroplatte ( Mosaic™
von
mehreren
ELISAs) erlauben
(Abbildung 2.20.). In diesen ELISA Systemen können sogar 8-16 Antikörper in jeder Lücke an die
Oberfläche in Flecken gebunden werden. Weiterhin ist es auch möglich, eine 384 Lücken Platte mit
25-25 unterschiedlichen capture Antikörpern herzustellen und Untersuchungen auszuführen. Jeder
Fleck vertretet unterschiedliche capture Antikörper oder Proteinpopulationen. Auch in diesen
Systemen wird das chemolumineszente Signal detektiert und die Auswertung passiert von dem Bild,
welches mit der digitalen Kamera gemacht wurde.
Abbildung 2.20. Mozaik ELISA Platte
2.3. Welche Immunoassay ist zu verwenden?

Die einfachsten und billigsten Untersuchungen sind die, die mit lateral flow Schnelltests gemacht
werden können. Wenn der gewünschte Schnelltest (z.B. Schwangerschaftstest) erhältlich ist kann
man auch ohne Fachkenntnis
auf „ja-nein Typ” Fragen eine Antwort in einigen Minuten
bekommen.

Wenn die Konzentration der Antigene oder Antikörper im Serum/Blutserum zu bestimmen ist, aber
es in kommerziellem Umlauf keinen Schnelltest gibt, ist die ebenfalls relativ schnelle und billige
43
ELISA die Wahl. Es kann nötig sein, die Konzentration der Antikörper (und Antikörperisotypen) in
Immundefizienzen, in Entzündungen, in allergischen und Autoimmunkrankheiten zu bestimmen.
Außerdem kann man die Immunsuppression durch das Messen der Antikörper verfolgen. Man
kann auch ELISA Systeme selbst zusammenstellen. In diesem Fall muss man sich außer der
Probe, die Platten, das Antigen, den sekundären Antikörper-Komplex (das Konjugat) und
Serum/Plasma
als positive und negative Kontrolle besorgen. Die im kommerziellen Umlauf
erreichbaren ELISA Kits sind viel kostspieliger als die selbst zusammengestellten. In diesem
letzten Fall ist es möglich, standardisierte und optimierte ELISA Reaktionen nach dem Protokoll
des Herstellers durchzuführen. Die kommerziellen Kits garantieren das standardisierte und
reproduzierbare Messen der routinediagnostischen Testen.

Im Fall dass die Empfindlichkeit der ELISA nicht ausreichend ist, ist RIA empfohlen. (z.B. um
Hormonkonzentrationen zu bestimmen.) RIA ist eine ziemlich billige Methode, aber wegen der
verwendeten radioaktiven Stoffe braucht man spezifisches Equipment (Gamma Messer) und
besondere Vorsicht ist geboten.

In der Autoimmundiagnostik ist die indirekte Immuncytochemie unverzichtbar, um antinukleäre,
gewebespezifische Autoantikörper oder z.B. ANCA (anti-neutrophil, zytoplasmatischer Antikörper)
nachzuweisen.

Für das Messen der Zellen in Zellsuspensionen, soll man die Flusszytometrie anwenden. In der
Routine
durch
die
Identifizierung
der
Zelloberflächen-Antigene
(CD
Antigene)
können
Lymphozytenpopulationen identifiziert werden. Die Methode wird in einem anderen Kapitel
beschrieben.

Die Western-Blot Methoden werden in der Routindiagnostik nicht verwendet, weil sie zeit-und
arbeitsaufwendig sind. Sie dienen die bereits aufgestellte Diagnose weiter zu bestätigen und sie
werden auch für die Forschungen verwendet.

Das ELFA System wird in der laboratorischen Routinediagnostik verwendet. Es ist eine sensible,
standardisierte Technik, die spezifisches Equipment erfordert.

Im Vergleich mit den oberen Methoden ist die Verwendung der ELISPOT Untersuchungen relativ
wenig verbreitet. Sie werden für einige zellulären immunologischen Untersuchungen angewandt,
wenn man die Zahl der (in erster Linie) Zytokin-sezernierenden Zellen bestimmen möchte. Wenn
man diese Methode in der Forschung verwendet, bekommt man
Ergebnisse über die
Immunantwort in Entzündungen, in Tumoren, in allergischen und in Autoimmunkrankheiten. Ein
sehr wichtiges Feld der Anwendung der ELISPOT Methode ist die Impfstoffentwicklung, wenn
Impfstoffe gegen Viren und Tumoren entwickelt werden. Auch werden die T Zellen mit ELISPOT
in der spezifischen Immuntherapie beobachtet.

Die multiplex Untersuchungen sind sehr kostspielig, deswegen werden sie meistens nur in der
Grundlagenforschung verwendet.
Übersetzt von Erna Pap
44
3. AUF ANTIGEN-ANTIKÖRPER INTERAKTION
BERUHENDE METHODEN II: DIE IMMUNSEROLOGIE
(ANDRÁS FALUS, GYÖRGY NAGY)
Unter dem Begriff ”Serologie” verstand man ursprünglich die Analyse des Blutserums, bzw. deren
Methodik. Heute wird dieser Begriff etwas ausgedehnter benutzt, insofern dass es auch Methoden
hierher geordnet werden welche die Analyse von anderen Körperflüssigkeiten, z.B. Urin, Liquor, usw.
ermöglichen. Mit den unterschiedlichen Methoden welche für die Analyse von löslichen Proteinen
geeignet
sind
(ELISA,
RIA,
Immunoblotting),
haben
wir
uns
in
dem
vorigen
Kapitel
auseinandergesetzt. In diesem Kapitel fokussieren wir auf Immunkomplexe und Immunpräzipitate.
3.1. Immunkomplex und Immunpräzipitat
Die meisten Antigene verfügen über nicht nur ein Epitop (antigene Determinante), sondern eine
Vielzahl von ihnen, die meisten von denen nicht uniform, sondern recht unterschiedlich aufgebaut
sind. Dazu kommt, dass bestimmte Antikörper (vor allem die pentameren IgM Antikörper) gleichzeitig
auch zu mehreren Antigenen binden können, wodurch bei einer Immunreaktion komplizierte
Komplexe von Antigenen und Antikörpern, sog. Immunkomplexe entstehen können.
Clemens von Pirquet und Béla Schick haben in 1906 als erste beschrieben, dass eine passive
intravenöse Immunisierung von Kindern gegen Diphterie mit einem Pferde-anti-Diphterietoxin-Serum
als Nebenwirkung innerhalb von 7-14 Tagen zum Auftauchen von extrem großen Mengen von
Immunkomplexen in dem Serum der Kinder, eine sog. Immunkomplexkrankheit führen kann. Pirquet
und Schick nahmen an, dass man die Symptome darauf zurückführen konnte, dass die immunisierten
Kinder gegen das Pferdeserum Antikörper entwickelt haben, welche mit den erkannten körperfremden
Pferde-Antigenen verbunden Immunkomplexe gebildet und sich in verschiedenen Organen abgelagert
haben. Jahrzehnte später haben Gertmuth und Dixon die Hypothese von Pirquet und Schick zuerst
eindeutig beweisen können als sie die Serumkrankheit in Kaninchen untersucht haben. In den
Experimenten von Gertmuth und Dixon wurden Kaninchen körperfremde Sera, z.B. Rinde-Serum
intravenös verabreicht. Sie haben beobachtet, dass die Konzentration von fremden Antigenen zuerst
nur langsam gesunken ist, bis 10-12 Tage nach der Immunisierung ihre Konzentration auf einmal
stark abgenommen hat, dass die freien Antigene aus dem Serum fast völlig verschwunden sind.
Heute weiß man
genau, dass diese 10-12 Tage dem Zeitraum entsprechen, in dem das
Immunsystem eines serumkranken Rezipienten beginnt, Antikörper gegen die Fremdantigene zu
bilden. Diese bilden schließlich Immunkomplexe welche sich am Ende in verschiedenen Organen,
typischerweise in den Nieren, ablagern und die typischen Symptome der Serumkrankheit (siehe
später) verursachen. Die Symptome werden milder sobald die Menge der Immunkomplexe abnimmt,
aber mit erneuter Antigen-Exposition kehren sie sofort zurück. Durch Messung der Menge des
Fremdantigens, des Antikörpers und der Immunkomplexe, können drei Phasen der Serumkrankheit
45
voneinander unterschieden werden: zuerst Antigen Überfluss, dann Äquivalenz und zuletzt Antiköper
Überfluss. In der ersten Phase werden kaum Immunkomplexe gebildet da spezifische Antikörper noch
praktisch nicht vorhanden sind. In der zweiten Phase werden freie Antikörper und Antigene kaum
nachweisbar, weil sie beide fast vollkommen in Immunkomplexe umgewandelt werden. In der dritten
Phase
werden
Immunkomplexe von
immer
kompliziertere
Struktur
und immer
größerem
Molekulargewicht gebildet, jedoch in immer geringerer Konzentration, bis sie eventuell aus dem
Kreislauf völlig verschwinden. In der Serumkrankheit ist die gut bekannte proinflammatorische
Wirkung der Immunkomplexe, und dadurch die meisten Symptome, vor allem auf ihre
Komplementaktivierungskapazität zurückzuführen (das Komplementsystem ist Teil des natürlichen
Immunsystems, siehe später in Kapitel 4). Deshalb ist es nicht überraschend, dass in experimentell
induzierter Serumkrankheit, parallel zu einer starken Komplementaktivierung, die Menge der freien,
noch nicht aktivierten C3 und C4 Komplementproteine massiv abnimmt.
Abbildung 3.1. Zusammenhang zwischen der relativen Menge von Antigenen vs. Antikörpern, und
die Struktur und Größe der Immunkomplexe
Nach den ursprünglichen Beobachtungen von Schick und Pirquet sind die typischen Symptome der
Serumkrankheit in Menschen in erster Linie Fieber, Lymphadenopathie, Polyarthritis, Proteinurie und
Nesselsucht (Utrikaria). In der Regel erreicht die stets zunehmende Konzentration der Antikörper und
die senkende Konzentration der Antigene binnen 7-14 Tage nach Antigenexposition den
Äquivalenzpunkt, und demzufolge erscheinen die Symptome auch in diesem Zeitraum. Die in dieser
Phase gebildeten Immunkomplexe sind lösliche molekulare Komplexe von Antigenen und
Antikörpern. Die absolute Menge dessen hängt von dem stöchiometrischen Verhältnis zwischen
Antigen und Antikörper ab. Jederlei Verschiebung dieses chemischen Gleichgewichts aus dem
Äquivalenzpunkt, also selbst die kleinste Änderungen in dem Antigen-Antikörper Verhältnis
46
destabilisiert die Immunkomplexe und reduziert ihre Konzentration im Serum (Abbildung 3.1), obwohl
die Entstehung und Stabilität des Immunkomplexes natürlich auch von anderen Faktoren beeinflusst
wird: dem pH, der Temperatur, der Salzkonzentration, oder der Struktur (Valenz) des Antikörpers
(Monomer, Dimer, Pentamer).
Falls eine Fällung des Immunkomplexes stattfindet, redet man über die Herausbildung eines
Präzipitats, welches auch mit
bloßem Auge sichtbar sein kann,
und
welches
nicht
mehr
wasserlöslich ist. Drittens, die
Präzipitat-Bildung
von
Antigenen deren Größe mit
intakten Zellen vergleichbar ist
wird
als
Agglutination
bezeichnet.
Abbildung 3.2. Agglutination und Präzipitation
Die Bindung von Antigenen und Antikörpern selber bleibt aber in allen Fällen eine schnelle und
reversible Reaktion, weil sie auf nicht-kovalenten Bindungen, wie den ionischen Bindungen, den van
der
Waals
Bindungen
und
H-Brücken
beruht
(Abbildung
3.3.).
Viele
klinische-
und
Forschungsmethoden basieren auf Antigen/Antikörper Interaktionen, mit denen wir uns in diesem
Kapitel in Detail auseinander setzen werden.
Abbildung 3.3. Bindung von Antigenen und Antikörpern
Die biologische Wirkung von Immunkomplexen wird streng beeinflusst von einer Reihe von Faktoren,
unter anderem von der Affinität mit der sie sich zu Zelloberflächenrezeptoren binden können, (z.B. zu
Fc Rezeptoren der Phagozyten), wie schnell sie sich in den verschiedenen Geweben bzw. Organen
ablagern
(Immunkomplexe
mit
positiver
Ladung
47
lagern
sich
zum
Beispiel
mit
höherer
Wahrscheinlichkeit in den Nierenkörperchen ab), oder der Effizienz womit sie das Komplementsystem
aktiveren können.
Die Entfernung von Immunkomplexen aus dem Kreislauf erfolgt hauptsächlich mit Hilfe der
Komplementrezeptoren der Zelloberfläche von Erythrozyten. Wie wir darauf schon hingedeutet haben,
sind die Immunkomplexe in der Lage das Komplementsystem zu aktivieren und demzufolge sind sie
häufig auch mit aktivierten Komplementproteinen (C3b, C4b) verbunden. Diese Partikel werden
deswegen von den CR1 Komplementrezeptoren der Erythrozyten erkannt und gebunden. Sobald die
Erythrozyten später den Leberkreislauf passieren, werden die Komplexe abgegeben und auf die Fc
Rezeptoren der leberständigen Makrophagen, den sogenannten Kupffer’sche Zellen, transferiert. Dies
geschieht, da der Antikörper-Teil zu FC Rezeptoren mit einer höheren Affinität binden kann als der
Komplement-Teil zur CR1. Die übertragenen Immunkomplexe werden von den Kupffer’schen Zellen
phagozytiert und vernichtet. Die Erythrozyten bleiben intakt und werden verschont, damit sie erneut in
den Kreislauf zurückkehren um Immunkomplexe zu binden und wiederum in die Leber transportieren
zu können.
Abnormale Mengen von Immunkomplexen können auch in bestimmten Autoimmunerkrankungen
diagnostiziert werden, wofür Lupus erythematodes (SLE) ein Paradebeispiel ist. SLE ist eine
systemische
Autoimmunerkrankung, in der ein
breites
Repertoire
Autoantikörper
Viele
von
vorhanden
von ihnen sind
Komponente
gerichtet
des
ist.
gegen
Zellkerns
(anti-DNA,
ANA),
welche unter anderem auch als
wichtige diagnostische Merkmale
dienen
können.
erythematodes
alle
Der
Lupus
kann
praktisch
menschlichen
Organe
angreifen, klinisch jedoch sind
die wichtigsten der Befall der
Niere
und
des
zentralen
Nervensystems (Abbildung 3.4.).
Abbildung 3.4. Organe typischerweise betroffen im
Systemischen Lupus erythematodes (SLE)
Die von diesen Autoantikörpern gebildeten Immunkomplexe häufen sich in den betroffenen Organen
massiv an, und spielen damit eine zentrale Rolle in den typischen Symptomen des SLE, welcher
dadurch häufig als der Archetyp aller Immunkomplexerkrankungen bezeichnet wird. In Patienten mit
SLE kann häufig eine extrem niedrige Konzentration der inaktiven Komplementproteine C3 und C4
nachgewiesen werden, wofür der Grund die kontinuierliche Aktivierung des Komplementsystems
durch die Immunkomplexe sein kann. Im Einklang mit dieser Beobachtung sind dagegen die Mengen
der gespaltenen, aktiven Komplementproteine (z.B. C4a, ein solubles Proteinfragment) in SLE
48
deutlich höher als normal. In der Tat ist die Serumkonzentration der zirkulierenden Immunkomplexe in
den meisten SLE Patienten abnormal hoch, und eine beschleunigte Aktivierung des klassischen und
alternativen Komplementweges ist auch typisch für sie. Interessanterweise jedoch, obwohl die Menge
der Immunkomplexe mit dem Aktivierungszustand des Komplementsystems in SLE gut korreliert, hat
keiner von diesen zwei Markern großen diagnostischen Wert, insofern dass keiner von ihnen eine
Verbindung mit der zeitlich stark wechselnden Aktivität der Krankheit selber zeigt. Bezüglich SLE wird
angenommen, dass eine genetisch bedingte abnormal niedrige Produktion von den oben erwähnten
CR1 Rezeptoren, stark auf dieses Krankheitsbild prädisponiert. Auch der eigentlich seltene, völlige
Mangel des Komplementproteins C1q, kann mit nahezu 90 prozentiger Wahrscheinlichkeit zu SLE
führen. Weniger selten ist der Mangel an C2 und C4, in dessen Fällen die Chance auf die Entwicklung
von SLE im Verlauf des Lebens ca. 33-75 Prozent beträgt. Weil die Immunkomplexe aus dem
Kreislauf hauptsächlich durch die auf den leberständigen Makrophagen vorhandenen Fc Rezeptoren
eliminiert werden, können genetische Polymorphismen dieser Gene (z.B. FcγRII und FcγRIII) die eine
ineffiziente Bindung der Immunkomplexe auf diesen Rezeptoren erzeugen, das Risiko von SLE auch
erhöhen (Abbildung 3.5.).
Abbildung 3.5. Genetische Polymorphismen welche die Entfernung von Immunkomplexen ändern,
und ihr Einfluss auf SLE
Es ist auch wichtig zu wissen, dass zusätzlich zu der Exposition auf artfremdes Serum und SLE bzw.
manchen gekoppelten Genpolymorphismen, auch bestimmte therapeutische Eingriffe zur Entwicklung
einer Serumkrankheit führen können. Zum Beispiel führt die Verabreichung von Beta-LaktamAntibiotika, Sulfonamiden und Thiaziddiuretika, zu einer erhöhten Produktion von Immunkomplexen.
Dies kann auch in einer Reihe von anderen immunvermittelten Krankheitsbildern beobachtet werden:
z.B. in Kryoglobulinämie, Rheumatoide Arthritis oder leukozytoklastische Angiitis.
Die genaue diagnostische Bestimmung der Menge von Immunkomplexen ist stets eine große
technische Herausforderung. Obwohl viele solche Methoden existieren, steht zur Zeit keine Methode
zur Verfügung, welche gleichzeitig die Konzentration von Immunkomplexen verschiedener Größe und
ihre chemische Zusammensetzung bestimmen könnte.
Aus dem therapeutischen Gesichtspunkt betrachtet bleibt in Immunkomplexerkrankungen die
effizienteste Behandlungsstrategie die Immunsuppression (meistens Steroide).
49
3.2. 2D Immundiffusion (2D Einfach- oder 2D Doppeldiffusion)
Abbildung 3.6. 2D Immundiffusion
Beide Methoden beruhen auf der Präzipitationsreaktion von Antigenen und spezifischen Antikörpern in
einem Agarosegel. Das Ziel ist es, in beiden Fällen die Anwesenheit eines bestimmten Antigens oder
Antikörpers in einer flüssigen Probe (z.B. Serum) durch das Erscheinen des Präzipitats im Gel, zu
bestätigen bzw. seine Menge semiquantitativ zu bestimmen.
2D Einfachdiffusion (Mancini-Test) Aufgelöste Antikörper werden mit warmen (nicht heißem)
flüssigen Agarosegel vermischt. Die Mischung wird auf ein Objektglas gegossen und liegen gelassen
bis sie erstarrt. In das harte Gel werden zuerst mit einem Korkbohrer Vertiefungen gebohrt und die zu
untersuchenden Lösungen, die möglicherweise das nachzuweisende Antigen beinhalten, in die
Vertiefungen pipettiert. Als nächstes wird das Gel 2-3 Tage lang in einer Nasskammer inkubiert, damit
das Antigen, falls vorhanden, aus den Vertiefungen in das Gel reindiffundieren kann. Sobald ein
Gleichgewicht beim Erreichen des Äquivalenzpunktes entsteht, wird zirkulär um die Vertiefungen auch
ein Präzipitat-Ring entstehen. Danach erfolgt die Fixierung: das Gel wird getrocknet und das
50
Präzipitat, falls vorhanden, mit einer aspezifischen Proteinfärbung (z.B. Coomassie) sichtbar gemacht.
Je mehr Antigen in der zu analysierenden Probe vorhanden war, desto größer ist der Abstand vom
Mittelpunkt des Loches bis zum zirkulären Präzipitat-Ring in dem Gel (Abbildung 3.6.).
Selbstverständlich kann die Methode auch umgekehrt benutzt, d.h. zur Analyse von Antikörpern
angewandt werden. In diesem Fall werden Antikörper in die Vertiefungen eingetragen, und Antigene
bzw. gegen den gesuchten Antikörper gerichtete sekundäre Antikörper zum Gel zugemischt.
2D Doppeldiffusion (Ouchterlony-Test) Bei der 2D Doppeldiffusion werden Antikörper und das
nachzuweisende Antigen in zwei separierte Vertiefungen bzw. Kanälchen des selben Agarosegels
pipettiert, und dann solange im Gel diffundieren gelassen bis sie im Gel aufeinander treffen. Falls auf
diese Weise zwischen den zwei Vertiefungen / Kanälchen im Gel ein Präzipitat entsteht, wird die
Präsenz des gesuchten Antigens in der untersuchten Lösung (z.B: Serum) als bewiesen betrachtet.
2D Doppeldiffusion wird auch oft benutzt um den Titer eines Antigens zu bestimmen: dazu werden um
eine zentrale, die Antikörper beinhaltende Vertiefung herum mehrere andere Vertiefungen platziert,
welche
eine
Verdünnungsreihe
des
gesuchten
Antigens
beinhalten
(Abbildung
3.6.).
Als
Präzipitationstiter wird die größte Verdünnung des Antigens genannt, bei der noch ein sichtbares
Präzipitat entstehen kann.
3.3. Serumelektrophorese
Die Bestimmung der Gesamtkonzentration aller Serumproteine ist ein wichtiges, täglich ausgeführtes
klinisches Routineverfahren. Die Normalwerte der Serumprotein-Konzentration eines gesunden
Menschen betragen 60-80 g/l, dessen Mehrheit (35-50g/l) vom Serum-Albumin kommt. Falls sich die
Konzentration der Serumproteine unter- oder oberhalb der gesunden Grenzwerte befindet, wird am
häufigsten eine Serumelektrophorese gemacht um eine genauere Beschreibung des abnormalen
Serumprotein-Profils und die exakte Identifizierung der verantwortlichen Proteinfraktion zu
ermöglichen. Die Serumelektrophorese beruht auf Unterschieden in der Ladung und Masse der
verschiedenen Serumproteine, welche ihre Auftrennung in einem elektrischen Feld bzw. Gel
ermöglichen. Nach der Elektrophorese werden die Proteinfraktionen mit unterschiedlichen Motilität
mittels einem geeigneten Farbstoff (z.B. Coomassie Brilliant Blue) gefärbt, dadurch sichtbar gemacht,
und basierend auf ihrer Lage im Gel einzeln identifiziert.
Im menschlichen Serum ist die am schnellsten wandernde Proteinfraktion die des Thyroxin bindendes
Präalbumin, am langsamsten hingegen sind die unterschiedlichen Immunglobuline. In der
Serumelektrophorese ist die Präalbumin Fraktion normalerweise kaum oder überhaupt nicht sichtbar.
Sie ist auch in dem gezeigten Beispiel (Abbildung 3.7.) nicht zu sehen, weswegen die größten
sichtbaren Fraktionen die Fraktion des Albumins, der  Globuline (z.B. Coeruloplasmin, -1Antitrypsin, Lipoproteine), der  Globuline (z.B. Transferrin, -2- Mikroglobulin) und der  Globuline
(Immunglobuline) sind. Die Ergebnisse der Serumelektrophorese werden meistens densitometrisch
ausgewertet (Abbildung 3.7.).
51
Abbildung 3.7. Serum-elektrophorese
Abbildung 3.8. Typische Ergebnisse der Serumelektrophorese in verschiedenen Krankheitsbildern.
52
Abweichungen vom normalen Verhältnis der Serumproteine haben natürlich eine diagnostische
Bedeutung (Abbildung 3.8.), z.B. eine verminderte Albumin-Produktion kann auf ein nephrotisches
Syndrom, Leberzirrhose, oder chronisch-entzündlichen Darmerkrankungen hinweisen.
Erhöhte Mengen von monoklonalen Globulinen können ein Hinweis auf maligne hämatologische
Krankheiten bedeuten. Zum Beispiel im Falle von Multiplen Myelomen, wo alle bösartigen Zellen von
einer gemeinsamen Vorläuferzelle abstammen, sezernieren alle Krebszellen den selben Antikörper,
also identische Immunglobulin Proteine. Aus diesem Grunde werden sowohl die Konzentration der
Immunglobuline, als auch die Gesamtkonzentration der Serumproteine erhöht sein, obwohl andere
Serumproteine, z.B. Albumin, oft nicht beeinträchtigt sind. Ein anderes Zeichen für Multiples Myelom
ist die Blutsenkung, welche bei Patienten mit MM in der Regel auch deutlich höher als normal ist
(durchschnittlich
über
100
mm/Stunde),
wogegen
die
Konzentration
des
klassischen
Entzündungsmarkers CRP sehr oft in dem gesunden Referenzbereich bleibt. In dieser Situation ist die
erhöhte Blutsenkung nicht einer Entzündung zu verdanken, sondern der hohen Mengen von
Immunglobulinen, die indirekt auch die Blutsenkung beeinflussen. Deswegen muss man bei
gleichzeitiger Diagnose von hoher Blutsenkung und normalen CRP Werten die Möglichkeit eines
Multiplen Myleoms immer in Erwägung ziehen.
Eine spezielle Variante der Methode ist die 2D Serumelektrophorese. In der 2D Serumelektrophorese
werden die Komponente des Serums in zwei Dimensionen, sowohl nach ihrem isoelektrischen Punkt
(Dimension Nr. 1) als auch nach ihrer molekularen Größe (Dimension Nr. 2) auf die Oberfläche eines
Gels aufgetrennt (Abbildung
3.9.). Dies ermöglicht eine
extrem genaue Bestimmung
der einzelnen Serumproteine
und
eine
Analyse
viel
als
konventionellen
genauere
die
der
Serum-
elektrophorese bzw. Western
blot. Da aber die Auswertung
von
2D
Elektrophoresen
zurzeit eine große technische
Herausforderung
darstellt,
wird diese Technologie heute
noch eher in der Forschung,
und
nur
selten
in
der
klinischen Praxis angewandt.
Abbildung 3.9. 2D Elektrophorese
53
3.4. Immunelektrophorese und Immunfixierung
Die Immunelektrophorese ist ein weiterer Typ der elektrophoretischen Techniken der Serologie,
welche in der Lage ist die verschiedenen Immunglobulinketten voneinander zu unterscheiden und ihre
relativen Mengen semiquantitativ zu bestimmen. Sie beginnt mit einer Serumelektrophorese (siehe
oben). Danach lässt man aber die aufgetrennten Serumprotein-Fraktionen in dem Gel frei
diffundieren, und mit einem polyvalentem, tierischen anti-human Serum, welche alle menschlichen
Serumproteine erkennen kann, in der Form einer 2D Immundiffusion (siehe vorher) reagieren. In der
Immunelektrophorese reagiert also das zu untersuchende Serum des Patienten mit dem tierischen
Serum,
anti-human
wodurch
ein
charakteristisches
Präzipitat-Muster
aller
menschlichen
Serumproteine erzeugt wird. Die typischen Lage und Form der Präzipitat-Kurven der einzelnen
Immunglobulin-Klassen ermöglichen ihre Identifikation und eine mehr oder weniger genaue
Bestimmung ihrer relativen Mengen (Abbildung 3.10.). Änderungen in der Form, oder Stärke von
einzelnen
Kurven
mag
von
diagnostischem Wert sein, und die
Methode ermöglicht auch die genaue
Identifikation
von
nicht
nur
den
schweren sondern auch den leichten
Immunglobulinketten.
Identifizierung
von
Auch
die
Antikörpern
mit
pathologisch erhöhter Expression kann
durch
starke
Verdünnung
analysierenden
der
zu
Serumproben
erleichtert werden. So werden nämlich
die
Antikörper
langsam
im
Referenzbereich
verschwinden,
wogegen
abnormal stark exprimierte Antikörper
selbst
bei
starken
sichtbar bleiben.
Verdünnungen
Abbildung 3.10. Immun-elektrophorese
Die Immunfixierung ist teilweise ähnlich einer Immunelektrophorese, indem sie auch mit einer
Serumelektrophorese beginnt. Danach werden aber die einzelnen Immunglobuline nicht durch eine
2D Immundiffusion, sondern mit Hilfe einer Zellulosemembran, worauf ein polyvalentes tierisches antihuman Serum aufgetragen worden ist, präzipitiert. Diese Membran wird sofort nach der
Elektrophorese auf die Oberfläche des Gels gedrückt, wodurch das tierische Serum die
Immunglobuline des Patienten an der Stelle, ohne Diffusion, ausfällen lässt (präzipitiert). Im Vergleich
mit der Immunelektrophorese ist die Immunfixierung schneller auszuführen, besser reproduzierbar,
empfindlicher, einfacher auszuwerten und teilweise auch automatisierbar (Abbildung 3.11).
Abbildung 3.11. Serum und Urin Immunfixierung
3.5. Raketenelektrophorese
Ähnlich der 2D Einfachdiffusion wird in der Raketenelektrophorese eine Lösung welche
möglicherweise die nachzuweisenden Antigene beinhaltet, in eine kleine Vertiefung eines
Agarosegels gelegt. Auch diesmal enthält das Agarosegel gegen das Antigen gerichtete Antikörper.
Im Gegensatz zu der 2D Einfachdiffusion werden aber hier die Antigene nicht zirkulär, also in alle
mögliche Richtungen, frei diffundieren, sondern mit Hilfe einer Elektrophorese nur in eine gewisse
Richtung in dem Gel bewegt. Folglich werden auf
einer
Seite
der
Vertiefung
spitzen-
oder
raketenförmige Präzipitate entstehen, falls das
Antigen in der Tat in der Lösung vorhanden war.
Die Entfernung der Spitze der “Raketen“ von
dem Mittelpunkt der Vertiefung ist auch hier
proportional
zu
der
Menge
des
Antigens
(Abbildung 3.12.).
Abbildung 3.12. Raketenelektrophorese
55
3.6. 2D Immunelektrophorese
Bei der 2D Immunelektrophorese wird zuerst eine Serumelektrophorese in eine Richtung ausgeführt
(Dimension Nr. 1), indem Proteine abhängig von Grösse aufgeteilt werden. In einem zweiten Schritt
werden die Komponenten des Serums mit Hilfe eines zweiten Gels (Dimension Nr. 2), welches ein
polyvalentes tierisches anti-human
Serum beinhaltet, wiederholt, jedoch
in eine senkrechte Richtung, erneut
aufgelöst.
Dies
führt
zu
der
Entstehung eines sehr komplizierten
Gel-Bildes von einer extrem guten
Auflösung, dessen Auswertung aber
zu
kompliziert
ist
um
Technologie
in
benutzen
können
zu
3.13.).
der
diese
Routine
(Abbildung
Abbildung 3.13. 2D Immunelektrophorese
3.7. Turbidimetrie und Nephelometrie
Turbidimetrie und Nephelometrie sind beide klinische Routineverfahren mit dem Ziel die quantitative
Messung einer Antigen-Antikörper Interaktion zu ermöglichen. Das Prinzip beider Verfahren ist das die
Intensität des Lichtes welches durch eine Kolloidlösung geht, durch die Lichtstreuung der
Kolloidpartikel vermindert wird. Die Schwächung der Lichtintensität ist proportional zur Trübheit
(Turbidität) der Lösung, welche eigentlich gemessen wird. Im Verlauf beider Verfahren werden in einer
wasserklaren Pufferlösung das zu bestimmende Antigen und die damit vermischten spezifischen
Antikörper (monoklonal oder polyklonal) Immunkomplexe bilden, die als Kolloidpartikel die Trübheit
der Lösung erhöhen.
Bei der Turbidimetrie wird die Schwächung eines durchgehenden Lichtstrahls bestimmt. Für die
quantitative Analyse wird die Probe mit einer Standardreihe verglichen, welche neben einer stabilen
Antikörperkonzentration immer größere Mengen des Antigens beinhaltet bzw. immer stärkere Trübheit
vorweist. Dies ermöglicht die Herstellung einer Standardkurve mit dessen Hilfe die Konzentration des
Antigens in der Probe bestimmt werden kann. Die Empfindlichkeitsgrenze der Turbidimetrie liegt bei
ca. 50 μg/ml.
Im Gegensatz zur Turbidimetrie wird in der Nephelometrie nicht die Schwächung eines
durchgehenden Lichtstrahls gemessen, sondern die Lichtstreuung in einer Richtung seitlich des
eigentlichen Lichtstrahls. Die Empfindlichkeit der konventionellen Turbidimetrie beträgt ungefähr 1
μg/ml. Die Nephelometrie aber kann sowohl gewöhnliches Licht- als auch Laserstrahlen benutzen,
wobei die Lasernephelometrie deutlich empfindlicher ist als die konventionelle Methode.
Nephelometrie und Turbidimetrie werden häufig benutzt um die Konzentration von Serumproteinen zu
bestimmen, u.a. für die quantitative Analyse von Albumin, Immunglobulinen, Transferrin, Lipo- oder
Komplementproteine. Die Turbidimetrie wird zusätzlich auch in bestimmten Analysen, welche keine
Antigen-Antikörper Interaktion benötigen, angewandt: Zum Beispiel in der Analyse des Wachstums
von Bakterien und dadurch der Analyse bakterieller Sensibilität bzw. Resistenz auf bestimmte
Antibiotika. Aber auch in der Analyse des Aktivierungszustandes des Gerinnungssystems durch die
Bestimmung der Zeit die für die Blutgerinnung benötigt wird.
Abbildung 3.14. Turbidimetrie und Nephelometrie
3.8. Klinische Anwendungen von serologischen Methoden
Immundiffusion: z.B. für die Identifizierung und Beschreibung von bakteriellen, viralen oder pilzAntigenen
- 2D Einfachdiffusion (Mancini-Methode): Vergleichende quantitative Analysen von verschiedenen
Antigenen, Serumproteinen (Immunoglobulin Isotypen [IgM, IgG, IgA], Akute-Phase-Proteine,
Transferrin, Komplement Komponenten) und Antikörpern von bestimmter Spezifizität in
unterschiedlichen Körperflüssigkeiten (Blut, Urin, Speichel usw.)
- 2D Doppeldiffusion (Ouchterlony-Methode): Bestimmung des Äquivalenzpunktes in einer
bestimmten Antigen-Antikörper Interaktion, Bestimmung der relativen Menge des präzipitierenden
Antikörpers (Titer), oder die des Antigens.
Elektrophorese:
- Immunelektrophorese: Aufteilung der Serumproteine auf einzelne Fraktionen, Diagnose von
Abnormitäten der Plasmazellen (z.B. Multyples Myelom, primär Amyloidose) durch den Nachweis
von abnormalen Mengen von monoklonalen oder polyklonalen Antikörpern
- Raketenelektrophorese: Bestimmung der Konzentration eines Antigens/Antikörpers
57
- 2D Immunelektrophorese: high-throughput, vergleichende qualitative und quantitative Analyse
von allen Komponenten von Serum-, Urin-, Zerebrospinalflüssigkeiten.
3.9. Typen der Agglutination und ihre klinische Anwendungen
Eine spezifische Wechselwirkung von Partikeln in der Größe von Zellen, und gegen sie gerichtete
Antikörper wird als
Agglutination bezeichnet. Dieses Phänomen wird in der Diagnostik häufig
angewandt um eine spezifische Antigen-Antikörper Interaktion nachzuweisen (Abbildung 3.15.)
Abbildung 3.15. Klinischer Nachweis von Agglutination durch geänderte Sedimentation
von partikulären Antigenen
Agglutination kann von praktisch allen Antikörper-Isotypen erzeugt werden, aber di- oder pentamere
Antikörper (z.B. IgM) sind effizienter als monomere Antikörper (z.B. IgG). Ähnlich den klassischen
Immunkomplex-Reaktionen benötigt auch die Agglutination ein optimales stöchiometrisches Verhältnis
zwischen Antikörper und Antigen. Man redet über direkte Agglutination wenn der Antikörper die
Antigene an sich, ohne zusätzliche Hilfe quervernetzen und agglutinieren kann.
Abbildung 3.16. Direkte und indirekte Agglutination
58
Direkte Agglutination findet statt z.B. in dem direkten Coombs Test, weil die Antikörper Antigene auf
der Zelloberfläche der zur Analyse benutzten Erythrozyten erkennen, und die Agglutination erfolgt
durch die Quervernetzung der Erythrozyten durch die Antikörper. (Abbildung 3.17.)
Abbildung 3.17. Coombs-test.
Verdünnung Nr. 3 in der
Verdünnungsreihe gibt den Titer an,
also die größte Verdünnung, wobei
noch eine Agglutination stattfindet.
Die Zellmembran der Erythrozyten beinhaltet eine Vielzahl von bekannten Autoantigenen, von denen
die bekanntesten die Agglutinogene A und B sind (Abbildung 3.18.).
Abbildung 3.18. Die AB0 Blutgruppenantigene
59
Abhängig von ihrer An- oder Abwesenheit auf Erythrozyten werden die 4 wichtigsten Blutgruppen
voneinander unterschieden, d.h. die Blutgruppen A, B, AB und 0 definiert. Die eigentliche Entstehung
der Blutgruppen wird von kodominant vererbten Enzymen kontrolliert, welche die Zusammensetzung
der Zuckergruppen der Agglutinine, und dadurch die Blutgruppe der jeweiligen Person bestimmen. Die
Erkennung der nicht körpereigenen AB0 Blutgruppen-Antigene, also die Immunität gegen nicht
kompatiblen Blutgruppen entsteht dadurch, dass viele Bakterien der normalen Darmflora über
Antigene ähnlich der AB Antigene verfügen, weswegen alle Personen gegen nicht körpereigene AB
Antigene praktisch vom Geburt an immunisiert sind. Zum Beispiel Personen mit Blutgruppe 0 sind
immun gegen das A und B Antigen, ihre anti-A und anti-B Antikörper erkennen, agglutinieren und
lysieren fremde Erythrozyten welche die entsprechenden Agglutinogene vorweisen (Abbildung 3.19.).
Abbildung 3.19. Die AB0 Inkompatibilität.
Ein “+“ bedeutet Immunreaktion vom Seiten des Empfängers und eine Agglutination des gegebenen
Blutes, “-“ bedeutet keine Immunreaktion.
Neben den AB0 Antigenen sind klinisch noch wichtig die Rh Antigene (der Name stammt von Rhesus
Affen). Viele Antigene gehören in diese Gruppe, unter ihnen die stärkste Immunogenität dem D
Antigen zuzuordnen ist (Abbildung 3.20.).
60
Abbildung 3.20. Das Rh Blutgruppenantigen
Im Gegensatz zur AB Immunität, sind die Rh negativen Individuen nicht vom Geburt an immun gegen
das D Antigen, sie produzieren nur anti-D Antikörper falls sie irgendwie mit D+ Blut transfundiert und
dadurch immunisiert werden. Wenn eine Rh negative Mutter mit einem Rh positives Kind schwanger
wird, kann die Mutter während der Geburt, da fetales Blut mit mütterlichem Blut in Kontakt kommt,
gegen das D Antigen immunisiert werden.
Da der anti-D Antikörper vom Typ IgG ist, ist er plazentagängig, also bei einer erneuten
Schwangerschaft mit einem Rh positives Kind können die mütterlichen Antikörper die D Antigene der
Erythrozyten des Fetus erkennen, sie agglutinieren, und fetale Erythroblastose verursachen
(Abbildung 3.21.).
61
Abbildung 3.21. Die Rh-Inkompatibilität
Dies kann prophylaktisch vermieden werden, indem man der gefährdeten Mütter binnen 72 Stunden
nach der Geburt, Anti-D Antikörper verabreicht: ein Eingriff der als Rh Prophylaxe bezeichnet wird.
In vivo Konsequenzen der Agglutination
ABO Inkompatibilität:
intravaskuläre Hämolyse
(komplementvermittelte Hämolyse)
Rh Inkompatibilität:
fetale Erythroblastose
(Opsonisierung der Erythrozyten, und dann Phagozytose durch
Makrophagen)
Tabelle 3.1. Die häufigsten Formen der immunvermittelten Erythrozyten-Agglutination
.
Indirekte Agglutination findet statt, wenn die Antikörper welche das Antigen erkennen selber keine
Quervernetzung erzeugen können, nur mit Hilfe eines zweiten Antikörpers, welche den Fc Teil des
ersten Antikörpers erkennt, ähnlich wie primäre und sekundäre Antikörper interagieren z.B. in den
62
indirekten
immunhistochemischen Verfahren. Des Weiteren handelt es sich um eine passive
Agglutination, wenn die zu agglutinierenden Partikel (z.B. Latexperle, Schaf Erythrozyten) das
immunogene Antigen in ihrem natürlichen Form nicht vorweisen, das Antigen wird nur künstlich mit
ihnen Verbunden, damit eine Agglutination überhaupt stattfinden kann. Passive Agglutination wird in
vielen diagnostischen Techniken benutzt um Antigen-Antikörper Interaktion zu visualisieren bzw.
quantitativ auszuwerten.
Beispielsweise wird der Nachweis des Rheumafaktors (RF, solche Autoantikörper die andere
körpereigene Antikörper an ihrem Fc Teil binden können), ein diagnostischer Marker der
rheumatoiden Arthritis, Lupus erythematodes, manche Infektionen, usw., oft mit passiver Agglutination
ausgeführt. In diesen Tests wird immer der Fc Teil von menschlichen Antikörpern zu Latexperlen, oder
mit Hämolysin behandelten Schaf-Erythrozyten (Rose-Waaler Test) gebunden, die danach auf das
Serum des Patienten exponiert werden. Falls im Serum des Patienten Rheumafaktoren vorhanden
waren, führt dies zu eine sichtbare Agglutination der Latexperle / Erythrozyten. Heute werden Tests
dieser Art jedoch immer seltener benutzt, da ELISA, Nephelometrie oder Turbidimetrie ihnen etwas
überlegen sind.
Als letztes ist es wichtig zu bemerken dass Agglutination von Erythrozyten auch in der völligen
Abwesenheit von Antikörpern erfolgen kann (dies ist die nicht-immunvermittelte Hämagglutination),
weil bestimmte virale Proteine (Influenza, Mumps) auch in der Lage sind, menschliche Erythrozyten zu
verklumpen. Ein nicht-immunvermittelter Mechanismus der Hämagglutination kann aber nur bewiesen
werden wenn man zeigen kann, dass antivirale Antikörper das Phänomen hemmen können.
Typen der Agglutination, und ihre klinische Anwendungen
Direkte
Bestimmung der ABO Blutgruppen
Agglutination:
Widal-Test (Nachweis von Typhuserregern)
Indirekte Agglutinat.:
Coombs-Test (Nachweis von anti-D Antikörpern)
Passive
Nachweis des Rheumafaktors
Agglutination:
Tabelle 3.2. Praktische Anwendungsmöglichkeiten der Agglutination
Übersetzt von Zoltán Pós
63
4. DIE PRAKTISCHE BEZÜGE DES
KOMPLEMENTSYSTEMS
(EDIT BUZÁS)
4.1. Das Komplementsystem
Dazu, dass die Einwirkung von Antikörpern zur Lyse von Bakterien oder von anderen Zellen führe, ist
nur die Anbindung der Antikörper zu den Zelloberflächenantigenen noch ungenügend, es ist auch
irgendeine „ergänzende” (komplementäre) Wirkung des Blutserums (genauer: in ihm befindliche
bestimmte Faktoren) notwendig.
Die Funktion des Komplementsystems kann am einfachsten durch die Untersuchung der
Erythrozyten-Lyse als Einwirkung von Antikörpern nachgewiesen werden. (Abbildung 4.1.)
Abbildung 4.1. Komplement-vermittelte Hämolyse

Wenn Schafserythrozyten mit polyklonalen Anti-Schafs-Erythrozytenantikörpern inkubiert
werden, binden sich Antikörper an die Erythrozytenoberflächen; es erfolgt aber keine Lyse
(durch Wirkung der Inkubation findet keine sichtbare Veränderung statt). (Um polyklonale
Antikörper zu gewinnen, werden Kaninchen oder Ziegen mit Schafserythrozyten immunisiert;
die Antikörper werden aus dem Blutserum des immunisierten Tieres gewonnen.)
64

Wenn zu Schafserythrozyten neben Anti-Schafs-Erythrozytonantikörpern noch humanes
Blutserum gegeben wird, entsteht eine gut sichtbare Hämolyse: die Erythrozyten platzen,
wodurch Hämoglobin aus den Zellen austritt, und die gebrauchte Pufferlösung anfärbt.

Wenn Schafserythrozyten mit Anti-Schafs-Erythrozytenantikörpern und (vorher noch) mit
hitzebehandelten
(56
o
C,
für
30
min)
Blutserum
inkubiert
wurden,
würde
keine
Erythrozytenlyse (Hämolyse) stattfinden. Dieses lässt schlussfolgern, dass die sich im Serum
befindlichen, für die Zell-Lyse notwendigen Faktoren hitzeempfindlich sind. (Unter solchen
Umständen werden keine anderen Proteine im Blutserum inaktiviert.)
Während der alltäglichen Gewebezüchtung wird als Ergänzung der Nährmedien fetales Kalb-Serum
verwendet; bevor das Serum der Nährlösung zugegeben wird, werden die Komplementproteine im
Kalb-Serum durch Hitze inaktiviert. Damit wird in der Zellkultur die durch das Komplementsystem
ausgelöste Zell-Lyse und/oder Opsonisierung verhindert.
Es ist heute schon bekannt, dass die Bestandteile des Komplementsystems verschiedene,
hauptsächlich von Leberzellen produzierte Proteine sind. Ihre Menge beträgt um 12 – 15% der SerumGlobuline; dass heisst, diese Proteine liegen im Serum in sehr grossen Mengen vor. Die
Konzentration des C3-Proteins, welches der zentrale Bestandteil des Komplementsystems ist, beträgt
1 g/l.
Mitglieder
des
Komplementsystems
sind
im
Allgemeinen
Proenzyme (inaktive Form
von
proteinspaltenden Enzymen), die im gesunden Organismus funktionell inaktiv vorliegen und nur durch
entsprechende Spaltung (Proteolyse) aktiviert werden. Die Aktivierung des Komplementsystems ist
ein durch einen entsprechenden Reiz ausgelöster, kettenreaktionsartig ablaufender Vorgang. Die
Aktivierung des Komplementsystems führt zur wirksamen Beseitigung von Bakterien, Pilzen oder
Viren, bzw. zur Eliminierung von Immunkomplexen.
Die einzelnen Elemente des Komplementsystems werden mit grossem C und mit der darauf
folgenden Nummer bezeichnet (z.B. C3). Die durch die Spaltung des gegebenen Komplementproteins
entstandenen Fragmente werden mit zur Bezeichnung des gegebenen Komplementproteins
hinzufügten kleinen a und b bezeichnet. (Durch die Spaltung des C3 Proteins entstandene Fragmente
sind C3a und C3b.)
4.2. Die Funktionen des Komplementsystems
Heutzutage, ein Jahrhundert nach der Entdeckung des Komplementsystems, ist es eindeutig
geworden, dass das Komplementsystem nicht nur in der Eliminierung der Krankheitserreger bzw. der
vernichteten Zellen eine Rolle spielt, sondern harmonisiert auch mit den verschiedenen Vorgängen
des Immunsystems und gibt Notsignale ab. Damit leistet es einen wichtigen Beitrag für das
Aufrechterhalten der Immunhomöstase.
Das Komplementsystem kann durch zahlreichen Einwirkungen aktiviert werden. Die Aktivierung des
Komplementsystems hat man früher als eine Reihe von linearen, nacheinander kaskadenartig
ablaufende Vorgänge gehalten. Nach heutigen Kenntnissen sind die verschiedenen Wege der
65
Komplementaktivierung eher als Netzwerke vorgestellt, in der die Elemente des Komplementsystems
sowohl miteinander als auch mit anderen Systemen eng zusammenwirken.
Drei Wege der Komplementaktivierung sind bekannt.
I. Die Aktivierung des sog. klassischen Weges wird durch den mustererkennenden C1q-Teil des C1
Komplementproteins ausgelöst. Der C1q-Abschnitt eines C1-Proteins bindet sich einerseits an
Immunkomplexe (z.B. an IgG- oder an IgM-Kluster), anderseits an Oberflächenkomponenten von
Mikroorganismen und von apoptotischen Zellen. (Das C1q kann sich an der Oberfläche der zellulären
Elementen
sowohl
direkt
als
auch
auf
indirekte
Weise
–
über
den
endogenen
Mustererkennungsrezeptor – binden.) Durch die Anbindung des C1q entsteht die aktive Konformation
des C1-Proteins; dieses spaltet das C4-Protein in zwei Fragmente, in C4a und C4b. Das grössere
Fragment, das C4b bindet ein weiteres Komplementprotein, das C2 an. Das derart aktivierte C2 wird
von aktivem C1 in zwei Fragmente, in C2a und C2b gespaltet. Das enstandene C2a bleibt auch weiter
an C4b gebunden; der enstandene C4b2a-Komplex ist die sog. C3-Konvertase. Die C3-Konvertase
bindet ein C3-Komplementprotein an und spaltet es in zwei Fragmente, in C3a und C3b. C3b bleibt an
der C3-Konvertase (C4b2a) gebunden; dadurch entsteht ein Heterotrimer, das C4b2a3b, die sog. C5Konvertase.
II. Bei der Aktivierung des sog, lektinabhängigen Weges spielen Mannose-bindende Lektine (MBL)
und Phykoline (endogene Mustererkennungsrezeptoren, die hauptsächlich Kohlenhydrat-Muster
erkennen) die Schlüsselrolle, Am Lektinweg entsteht durch die Spaltung von C4-Komplementprotein
das C4b Fragment; von hier an stimmen die Abläufe des lektinabhängigen Weges und des
klassischen Weges überein.
III. Der sog. alternative Weg ist phylogenetisch der älteste Aktivierungsmechanismus des
Komplementsystems. Dabei spielt eine wichtige Rolle die kleingradige aber ständig vorhandene
spontane Spaltung von C3-Proteinen im Blutplasma. Dabei entstehen – ohne äussere Einwirkungen –
die C3a- und C3b-Fragmente. Wenn das C3b-Proteinfragment an Mikoorganismenoberflächen
gebunden wird, wird der alternative Weg aktiviert. Das C3b spaltet mit Hilfe vom im Blutplasma
vorhandenen Faktor D, den Faktor B in zwei Fragmente, in Ba und Bb. Der entstandene C3bBbKomplex ist die sog. alternative C3-Konvertase. Diese wird von einem weiteren Faktor, von Properidin
(P) stabilisiert. Der stabile Komplex spaltet ein neues C3-Protein; das entstandene C3b-Fragment,
bleibt an der C3-Konvertase gebunden: dieser C3bBbP3b-Komplex ist die alternative C5-Konvertase.
Alle drei Wege der Komplementaktivierung führen zur Entstehung der C5-Konvertase, die ein
proteolytischer Enzymkomplex ist. Der danach folgende Abschnitt, die sog. terminale lytische
Phase, ist in allen drei Reaktionswege gleich. Der C3b-Komponent der C5-Konvertase erkennt und
bindet das C5-Protein, und spaltet es in zwei Fragmente, in C5a und C5b. C5b verbindet sich mit
weiteren Komplementproteinen, mit C6 und C7, und bilden zusammen eine trimere Struktur,(C5b67).
Dieser Komplex ist stark hydrophob und kann leicht an der Lipiddoppelschicht der Plasmamembran
gebunden werden. Nachdem sich dieser Komplex in der Plasmamembran befestigt hat, bindet an den
Trimer ein C8-, später 10-14 C9-Proteine. Der entstandene sog. Membran-angreifende Komplex
(MAK) bildet Poren in der Zellmembran. Diese grossen Poren führen zur Lyse der Zelle.
66
In der Komplementkaskade nehmen zahlreiche mustererkennende Moleküle teil. Das C1q bindet an
oberflächengebundene IgG-s und IgMs, daneben aber auch an C-reaktive Proteine (CRP) und an mit
Pathogenen-assoziierte molekulare Muster (PAMPs). Das Mannose bindende Lektin (MBL) erkennt
gewisse Kohlenhydratmuster, Phykoline (1, 2 und 3) sind ebenfalls Kohlenhydratmuster-erkennende
Moleküle. Von dem Properidin werden auch PAMPs, und mit Gewebsschädigung-assoziierte
molekulare Muster (demage associated molekular pattern, DAMPs) erkannt. Das CRP ist fähig
PAMPs und DAMPs an apoptotischen und mikrobiellen Zellen zu erkennen. Das Komplementfaktor-H
related Protein (CFHR) befördert monomere CRPs auf nekrotischen Zelloberflächen.
Obwohl
auch
die
Oberflächenstrukturen
der
apoptotischen
Zellen
von
den
Mustererkennungsproteinen erkannt werden können, sind gewisse Regulatorproteine in der Lage die
Komplementaktivierung zu verhindern. Die opsonierende Wirkung der Komplementproteine trägt zur
„stillen” Eliminierung der apoptotischen Zellen bei.
4.3. Untersuchung der Aktivität des Komplementsystems
In der Labormedizinischen Praxis kann die Bestimmung der Komplementaktivität vom Blutserum
notwendig sein. Es soll aber berücksichtigt werden, dass die Komplementprotein-Konzentrationen im
Blutserum einerseits von der Geschwindigkeit deren Synthese, anderseits von der Aktivität des
Komplementverbrauches beeinflussen ist.
Wie das schon erwähnt war, sind Komplementproteine hitzeempfindlich. Aus diesem Grund dürfen
Seren nach Musterabnahme nur für einen minimalen Zeitraum auf Zimmertemperatur sein, vielmehr
müssen sie auf Dauer bei -70 °C gelagert werden.
4.3.1.
Bestimmung den CH50 Wert des Blutserums
Zur Charakrerisierung der klassischen Komplementaktivierung wird am häufigsten der sog.CH50 Wert
des untersuchten Blutserums bestimmt. Dieser Wert spiegelt die Komplemenaktivität des Blutserums
wieder, und zeigt an, ob und in welchem Maß die mit polyklonalen Antikörpern bedeckten
Schafserythrozyten durch das Blutserum lysiert werden. Der CH50 Wert ist der reziproke Wert solcher
Serumverdünnung, bei der (unter standardisierten Bedingungen) 50% der mit Antikörpern bedeckten
Schafserythrozyten lysiert werden. Nach Vereinbarung enthält 1 CH50 Komplementeinheit diejenige
Serummenge, welche zur Lyse von 50% der, mit Antikörpern bedeckten Schafserythrozyten benötigt
wird.
Serum CH50
In Körperflüssigkeiten
C1-Gehalt
C3-Gehalt
C4-Gehalt
Normalwerte von CH50
142-279 CH50 Einheit/mL
1/3, 1/4 vom Vorherigen
16-33 mg/dL
Mann: 88-252 mg/dL
Frau: 88-206 mg/dL
Mann: 12-72 mg/dL
Frau: 13- 75 mg/dL
Tabelle 4.1. Normalwerte von CH50
67
In den meisten Fallen einer Abweichungen der CH50-Werte wird beobachtet, dass der gemessene
Wert höher ist als der normale; dies lässt sich damit erklären, dass die meisten Komplementproteine
gleichzeitig auch Akutphasenproteine sind. Der CH50-Wert des Serums sinkt, wenn einige
Komplementproteine fehlen oder verbraucht wurden (z.B.bei Komplementdefizienzen und bei
bestimmten Vaskulitiden). Ein signifikant niedriger Wert der CH50 kann auch gemessen werden,
jedoch
lässt
sich
in
einem
solchen
Fall
eine
immunologische
Erkrankung
vermuten
(Immunkomplexerkrankung, SLE). Der niedrige CH50 Wert prädisponiert auf ständig wiederkehrenden
bakteriellen sinopulmonalen Erkrankungen, durch Neisseria verursachte Meningitis oder Sepsis. Der
normale CH50 Wert beweist jedoch nur die Anwesenheit aller Komplementkomponenten, da die
Menge einzelner Komplementfaktoren ohne Veränderung der CH50 Aktivität stark gesenkt werden
können. Da bei Entzündungen die Synthese der Komplementproteine gesteigert ist, zeigen
Normalwerte nicht an, ob eine komplementvermittelte Gewebeschädigung vorliegt. In der
Synovialflüssigkeit der betroffenen Gelenke von Patienten, die an verschiedenen entzündlichen
Arthritiden (z.B. an rheumatoider Arthritis oder durch Gonokokken verursachten Arthritis) erkrankt
sind, werden die Komplementfaktoren lokal verbraucht, dem zu Folge findet man in der
Synovialflüssigkeit verringerte CH50 Aktivität, bzw. Komplementproteinkonzentration während im
Blutserum der Komplementanteil Normalwerte zeigt.
4.3.1.1.
Schafserythrozyten Immunoassay
Für die Bestimmung des CH50 Wertes wird das menschliche Komplementsystem durch mit
Antikörpern bedeckten Schafserythrozyten aktiviert: mit von einem immunisierten Kaninchen
produzierten Anti-Schafserythrozyten Antikörpern, werden Schafserythrozyten behandelt, und die
dadurch
mit
Antikörpern
bedeckten
Schafserythrozyten
werden
mit
verschiedenen
Verdünnungskonzentrationen (sog. Verdünnungsreihe) des zu untersuchenden Blutserums inkubiert.
Das
Ausmaß
der
Hämolyse
wird
bei
den
unterschiedlichen
Serumverdünnungen
durch
spektrophotometrische Bestimmung des (bei der Zell-Lyse aus den Erythrozyten freigewordenen)
Hämoglobins kalkuliert.
Der Zusammenhang zwischen der, zu den mit Antikörpern bedeckten Schafserythrozyten gegebenen
Serummenge und dem Ausmass der Hämolyse ergibt sich eine sigmoidale Kurve (van Krogh
Gleichung). Mit Hilfe von der logarithmischen Transformation wird ein linearer Zusammenhang
abgeleitet (Abbildung 4.2.):
Y=EM-ERK/ELK
wobei
E = Extinktion
M = Serumprobe
RK = Reagenz-Kontrolle (ohne Serum)
LK = Kontrolle der Zell-Lyse (Lyse der gesamten Erythrozyten im destillierten Wasser)
Yx100 = Menge der lysierten Erythrozyten (in % ausgedrückt)
Angesichts dessen, dass die CH50 Kurve keine lineare Steigung zeigt, müssen für die bedeutenden
CH50 Abweichungen grosse Mengen Komplementproteine verbraucht werden.
68
Abbildung 4.2. Bestimmung den CH50-Wert des Blutserums
4.3.1.2.
Liposom Immunoassay
Abbildung 4.3. Die Bestimmung den CH50-Wert des Blutserums mit unterschiedlichen Verfahren
69
In diesem alternativen Verfahren für die Bestimmung des CH50 Wertes des Blutserums werden
Liposomen mit DNP (Dinitrophenol)-Hapten bedeckten Oberflächen verwendet. In Hohlräumen der
Liposomen ist das Enzym, die Glucose-6-Phosphat-Dehydrogenase (G6PDH), eingeschlossen. Mit
Zugabe von Anti-DNP-Antikörpern entstehen an Liposomenoberflächen Antigen-Antikörperkomplexe.
Sobald das Komplementsystem aktiviert wird, öffnet sich die Liposomenmembran, und das Enzym
G6PDH wird dabei freigesetzt. Durch die Aktivität des Enzyms wird die NAD zu NADH reduziert. Die
Menge des gebildeten NADH wird spektrophotometrisch aus der Lichtabsorption bei 340 nm
bestimmt. Die Menge des entstandenen NADH ist mit der Komplementaktivität proportional (Abbildung
4.3.).
4.3.2.
Untersuchung der alternativen Komplementaktivation
2+
2+
Wenn man mit Ca -Chelatoren (z.B.EDTA) die Ca -Ionen entzieht, lässt sich der alternative Weg
2+
selektiv untersuchen (Ca -Ionen sind nämlich für den klassischen Weg notwendig). Gleichzeitig
2+
müssen Mg -Ionen unbedingt vorhanden sein, denn sie sind für die Funktionsfähigkeit des Faktors
“B” erforderlich.
Für die Untersuchung des alternativen Weges können auch (ohne sog. Sensibilisierung, d.h. ohne
Antikörper Inkubation) abgewaschene Kaninchenerythrozyten benutzt werden. In diesem System sind
die sog. AP50 Werte bestimmbar.
4.3.3.
Untersuchung des lektinabhängigen Weges
Für Untersuchung des lektinabhängigen Weges soll als erstes verhindert werden, dass die sich im
Serum befindenden Mannose-spezifischen Antikörper, den klassischen Weg aktivieren. Geeignet ist
dafür z.B. ein C1q-erkennender und -blockierender monoklonaler Antikörper (Mab 2204). Bei
Hemmung des klassischen Weges können sowohl der lektinabhängige- als auch der alternative Weg
aktiviert
werden,
jedoch
ist
die
Aktivierung
des
alternativen
Weges
nur
bei
höherer
Serumkonzentration (über 1%) möglich, im Gegensatz zum lektinabhängigen Weg, wobei die
notwendige Serumkonzentration 0,1-1% betragen soll. Auf dieser Weise sind der lektinabhängige und
der alternative Weg unterscheidbar.
4.3.4.
Komplement Konvertase-Assay (CCA)
Das Komplementsystem kann auch durch Inkubation des Blutes mit gewissen Arzneimitteln,
medizinischen Substanzen bzw. mit Materialien der Instrumente aktiviert werden. Der natürliche
Regulator der Enzymkaskade (des Komplementsystems) ist die Instabilität der beteiligten Enzyme.
Diese
Regulatormechanismen
können
unzureichend
werden,
wenn
Mittel
mit
komplementaktivierenden Oberflächen verwendet sind. Deshalb – wegen der “Hämokompatibilität” –
ist es notwendig die Komplement-Konvertaseaktivität an Arznei-Hilfsmitteloberflächen zu prüfen. Für
diese Untersuchung wird chromogenes Substrat verwendet, um kolorometrische Messungen
durchzuführen.
70
4.3.5.
Weitere Verfahren zum Nachweis von Komplementproteinen
1. Komplementproteine (z.B. C3) können mit der (C3-)ELISA nachgewiesen werden. Für die
Untersuchung der in vivo Komplementaktivierung benutzt man selektive Antikörper welche
fähig sind entweder die Aktivationsprodukte oder die gebildeten Komplexe zu erkennen.
2. Die Produktion vom C3-Protein bzw. von weiteren Komplementproteinen können mit Hilfe von
RT PCR untersucht werden.
3. Weiterhin können die auf den Zelloberflächen abgelagerten (dazu kovalent gebundenen) C3
mit Durchflusszytometrie (FACS) bestimmt werden.
4. Daneben besteht die Möglichkeit zur Untersuchung der Rezeptoren für die unterschiedlichen
Komplementproteine (indirekter Weise) durch Bestimmung der entsprechenden mRNAs oder
direkt durch die Untersuchung der Rezeptorproteine
5. Für
den
Immunkomplexnachweis
ist
die
sog.
Komplementbindungsreaktion
(Komplementkonsumptionstest. KBR) verwendbar. Wenn in der zu untersuchenden Probe
Antigen-Antikörperkomplexe (sog.Immunkomplexe) vorhanden sind, binden sie die zur Probe
gegebenen Komplementproteine, d.h. bleibt in der Probe kein freies Komplementprotein übrig.
Wenn im Komplement-Untersuchungsverfahren oft verwendete mit Antikörpern bedeckte
6. Schafserythrozyten
zur
Probe
gegeben
werden,
erfolgt
Hämolyse
in
Fall,
dem
die
wenn
ursprünglich wenige Immunkomplexe
vorhanden
waren,
freigebliebene
komplex
so,
(nicht
dass
an
gebundene)
das
Immun-
Komplement
sich zum mit Antikörpern bedeckten
Schafserythrozyten
bindet
und
dadurch deren Lyse verursacht.
Sofern im zu untersuchenden Muster
bedeutende
Mengen
von
Immun-
komplexen vorhanden waren, wurde
das gesamte Komplement gebunden,
d.h. es bleibt kein freies Komplement
mehr übrig, es erfolgt auch keine
Hämolyse (Abbildung 4.4.).
Abbildung 4.4.
Das Prinzip der Komplementbindungsreaktion (Komplementkonsumptionstest)
71
7. Komplementaktivations-ELISA. Es wurde beobachtet, dass zahlreiche Komplementproteine
fähig sind, sich an einer entsprechenden Kunststoffoberläche anzukoppeln. Auf dieser
Erscheinung
basierend
wurden
ELISA-Systeme
entwickelt
um
die
unterchiedlichen
Komplementaktivationswege zu untersuchen. Mit Hilfe von IgM bedeckten Oberflächen ist der
klassische Aktivierungsweg, mit Hilfe von Lipoplysacchariden (LPS) von Salmonella Typhi
behandelten Oberflächen ist der alternative Weg ist untersuchbar. In diesen Fällen wird die
Komplementaktivierung entweder mit C9-Neoepitop oder mit Properdin reagierenden
monoklonalen Antikörpern nachgewiesen. Die Untersuchung des lektinabhängigen Weges ist
einfach mit Mannose vorbehandelten Mikroplattenoberflächen durchzuführen, sofern der
klassische Weg mit Anti-C1q Antikörpern blockiert wird (Abbildung 4.5.).
Abbildung 4.5. Komplementaktivations-ELISA
®
Das sog. Wielisa -Verfahren ist eine Kombination von drei ELISA Systemen, wodurch alle
Komplementwege
untersucht
werden
können.
®
Im Wielisa -System
wird
auf
entsprechend
vorbehandelten Mikroplatten die Aktivierung des Komplementsystems induziert, anschließend werden
die terminalen Komplexe detektiert. Die Steuerung der Komplementaktivierung (d.h. die Bestimmung,
welcher Komplementweg aktiviert – und dadurch untersucht – werden soll) ist durch die
Zusammensetzung der verwendeten Pufferlösung bzw. durch den Verdünnungsgrad des Blutserums
2+
2+
möglich (Ca - und Mg -Ionen sind für die molekularen Vorgänge des Klassischen- und des
Lektinweges erforderlich sowie für den terminalen Abschnitt der Komplementaktivierung; die
2+
2+
Anwesenheit von Mg -Ionen (neben EDTA, d.h. Fehlen von Ca -Ionen) ist ausreichend für die
Aktivierung des alternativen Weges; der klassische- und der lektinabhängige Weg sind bei 1:100 oder
bei noch stärkerer Serum-Verdünnung aktiv, der alternative Weg braucht Verdünnungswerte unter
®
1:20). Vorteil des Wielisa -Systems ist, dass keine Schafserythrozyten benötigt werden und alle drei
Komplementaktivationswege messbar sind.
72
4.3.6.
Sonstige, mit dem Komplementsystem verbundene Verfahren
1. Zum Nachweis von Immunkomplexen mit ELISA-Verfahren werden Anti-C3- oder Anti-C1qAntikörper an ELISA-Mikroplattenoberflächen gebunden. Die angebundene Immunkomplexe
werden mit markierten Anti-Immunglobulin-Antikörpern detektiert (Abbildung 4.6.).
Abbildung 4.6. Auf ELISA basierende Nachweisemethoden von Immunkomplexen im Blutserum
2. Für die HLA-Typisierung findet der Mikrolymphozytotoxizitäts-Test Verwendung. Dieses
Verfahren gehört zu den sog. serologischen Methoden der HLA-Typisierung, welches damals
den
"Goldstandard"
in
der
HLA-Typisierung
bedeutete.
Heute
werden
vielmehr
molekularbiologische Methoden zur HLA-Typisierung angewandt.
Bei dem Mikrolymphozytotoxitäts-Test werden die sog. Terasaki Platten verwendet. In den
Wells (Vertiefungen) dieser Platte werden die (am Ficoll-Gradient) aus dem Blut der zu
typisierenden Personen) isolierten Lymphozyten pipettiert. Im Fall der Antigenerkennung
bindet der entsprechende
HLA-spezifische Antikörper an die Zellen. Die zur Typisierung
verwendeten Seren stammen häufig von schwangeren Frauen ab, oder von Personen die
mehrmals eine Bluttransfusion erhalten haben. Kaninchenserum
kann als Komplement –
Quelle benutzt werden, das aktiviert wird, sofern die Antikörper an das HLA-Antigen an
Zelloberflächen angebunden sind. Daraufhin, als Resultat der Komplementaktivierung, erfolgt
die Zellyse und die Zellmemebran wird für vitale Farbstoffe permeabel. Aufgrund des
73
hineingelangten Farbstoffs, Ethidium-Bromid, oder Tripanblau, ist die bereits erfolgte Zellyse
gut detektierbar.
4.4. Untersuchung
einzelner
Komplement-Elemente
verschiedenen pathologischen Zuständen
in
1. HANO Typ I.: Die Aktivität des C1-Inhibitors und Antikörpers sind niedrig, C4 niedrig, CH50
niedrig, C3 und C1q liegen im Referenzbereich.
2. AANO-C1-INH (Angioneurotisches Ödem mit Autoimmunursprung): die C1-Inhibitoraktivität ist
erniedrigt, Anti-C1-INH-Antikörper positiv, CH50 niedrig, C4 und C1q niedrig, C3 liegt im
Referenzbereich.
3. Hämolytisch-urämisches Syndrom (HUS) (mit atypischem Verlauf), im Hintergrund steht die
Störung des alternativen Aktivierungswegs.
4.4.1.
Falldarstell
Die 19-jährige Patientin kommt zur Notdienstaufnahmestelle mit Beschwerden wie leichte
Benommenheit, schwere Bauchschmerzen und seit 12 Stunden bestehender Übelkeit mit Erbrechen.
Sie berichtet über frühere Bauchschmerzen und über Schwellungen an Händen und Beinen. Man
vermutete eine Lebensmittelallergie dabei zu haben. Man vermutete eine Kombination mit einer
Lebensmittelallergie. Derartige Beschwerden traten in letzter Zeit jedoch immer häufiger auf. Urtikaria
war mit den Symptomen nicht vergesellschaftet. Die Patientin gab an, dass auch ihr Vater ähnliche
Beschwerden gehabt haben sollte. Fieber war nicht vorhanden, der Blutdruck beträgt 75/40 mmHg,
Puls 120/min.
Dieses Krankheitsbild wurde erstmal im Jahre 1888 von Osler beschrieben, als Hereditäres
Angioneurotisches Ödem. Es handelt sich dabei um eine Erkrankung mit autosomal dominantem
Erbgang und C1-Defizienz. Als Rekurrent-Episoden treten nicht juckende subcutane oder
submocosale Ödeme auf. Typische Orte der Ödembildung: Arme, Beine, Oberfuss, Darm, Genitalien,
Stamm, Gesicht, Zunge, oder Kehlkopf. Die Häufigkeit der Erkrankung in der Bevölkerung liegt bei
1/50 0000. Die Symptome treten typischerweise im Kindesalter auf, der Gesundheitszustand
verschlechtert sich um die Pubertät, die Krankheit besteht bis zum Lebensende.
Im
Hintergrund der Symptome stehen C1-Inhibitor-Genmutationen (bis heute sind etwa 150
verschiedene Mutationen in HANO Erkrankungen identifiziert).
Der C1-Inhibitor hemmt folgende Proteasen: die zwei Untereinheiten vom C1-Komplex (C1r, C1s),
gehemmt werden ebenfalls: Kallikrein, Plasmin, der aktivierte Faktor XII (FXIIa) und der aktivierte
Faktor XI (FXIa).
Obwohl der Typ I. (85% der Fällen) und der Typ II. (15%) der HANO-Krankheiten klinisch voneinander
nicht zu unterscheiden sind, stehen im Hintergrund beider Erkrankungen verschiedene Mutationen.
Die beim Typ I. mutiert produzierten Proteine werden nicht mit entsprechender Wirksamkeit
sezerniert. Aus diesem Grund senkt das C1-Inhibitorniveau sowohl seine Antigenität, als auch seine
Aktivität. Im Fall des HANO Typ II. wird das produzierte Protein zwar richtig sezerniert, jedoch ist
74
seine Funktion betroffen. Daher ist zwar die Antigenität des C1-Inhibitors normal, jedoch ist seine
Aktivität (Funktion) bedeutend gesenkt.
Auf Grund des Mangels an C1-Inhibitor werden während HANO-Anfällen die proteolytischen
Kaskaden des Blutplasmas aktiviert, und in erster Linie ist das Bradikinin für die erhöhte
Gefässwandpermeabilität verantwortlich.
Die Diagnose HANO kommt erst in Verdacht, wenn wiederholt auftretende angioödematöse
Krankheitsschübe, in Begleitung mit Bauchschmerzen und ohne Urtikaria, auftreten. Typisch für diese
Erkrankung ist der niedrige C4 Antigentiter, jedoch zeigen die C1 und C3 Proteine Normalwerte.
Die Therapie besteht aus
rekombiniertem
C1
der Gabe von intravenösem C1-Inhibitors (500-2000 Units) oder
Inhibitor.
Wirkungen:
Hemmung
des
Plasmakallikrein,
Hemmung
von
Gerinnungsfaktoren XIIa und XIa sowie C1s, C1r, MASP-1 und MASP-2 und Plasmin wird ebenfalls
gehemmt.
Abbildung 4.7. Pathomechanismus der HANO-Krankheit und in der Ödembildung beteiligten
Faktoren
75
4.5. Aufgaben
Beantworten Sie bitte die folgende Fragen
1) Welche CH50 Werte kommen am häufigsten vor: die erhöhten oder die erniedrigten? Was ist
die Ursache? Worauf lässt der erniedrigte CH50 Wert hinweisen?
2) Was können wir mit voller Sicherheit aussagen wenn der Gesamtkomplementwert (CH50) im
Normberich liegt?
3) Welches Komplementprotein liegt im Serum in höchster Konzentration vor?
1) Worauf weisen die gemeinsam verringerten Werte der C3 und C4 Proteine hin?
2) Worauf weist es hin, wenn der C3 Gehalt sinkt, C4 jedoch im Normbereich liegt?
3) Verringerter CH50 Titer und erniedrigte Konzentration der Komplementproteine sind Typisch
für Synovial-Flüssigkeits-Muster bei rheumatoider Arthritis oder Gonokokken Arthritis. In
welchem Bereich können die Serumwerte von C3 u.C4 bzw. von der CH50 Wert liegen?
Literatur:
Farkas H. A herediter angioneuroticus oedema patomechanizmusa és az oedema kiváltásában
szerepet játszó provokáló tényezők. (Pathomechanismus der HANO-Krankheit und in der
Ödembildung beteiligten Faktoren) Magyar Immunológia 2002;1 (1): 5-11.
Zuraw BL. Hereditary Angioedema. New England Journal of Medicine 2008; 359:1027-103.
Übersetzt von Ottó Dobozy
76
5. DIE DURCHFLUSSZYTOMETRIE
(ÉVA PÁLLINGER)
Durch die Entwicklung der laboratorischen Verfahren, die sich aus den Fragestellungen der Proteomik
entwickelt haben (wie immunanalytische Verfahren, Massenspektroskopie und monoklonale
Antikörperherstellung usw.), haben sich beispiellose Möglichkeiten für die medizinischen Diagnostik
eröffnet. Allerdings muss man während der Auswertung von Ergebnisse den Tatsachen ins Auge
sehen, weil die Proteinzusammensetzung nicht nur unter den Zelltypen, sondern auch in denselben
Zellen von Zeit zu Zeit abweichen kann. Abhängig von dem aktuellen Zustand oder der Umwelt kann
sie sich selbst auch ändern. Die biologische Interpretation des detektierten Datesatzes erfordert also
molekulare
und
zellbiologische,
sogenannte
cytomische
(cytomics)
Vorkenntnisse.
Die
Durchflusszytometrie ist eigentlich eine Kombination von Proteomik mit Cytomik, durch die die
gleichzeitige Charakterisierung einzelner Zellen nach funktionellen und morphologischen Aspekten
möglich ist.
Die Durchflusszytometrie gehört zu den Hochdurchsatzverfahren (High throughput screening method
= HTS), weil sie während einer sehr kurzen Zeit (wenige Minuten) mehrere tausende Zelle auf
multiparametrische Weise detektieren kann. Solche Untersuchungen sind, auf Grund des
Paradigmenwechsels auf personalisierte Medizin, nötig geworden. Die HTS –Methoden können die
Biomarker-Forschung (die Entdeckung von neuen diagnostischen und prognostischen Parametern)
beschleunigen, eine Medikamentenwirkung personalisiert überwachen (individuelle Sensitivität und
Leistungsfähigkeit) und eine genauere Zuordnung der molekularen Pathogenese von Krankheiten
aufklären.
5.1. Einleitung
Die Durchflusszytometrie beschreibt ein laboratorisches Messverfahren, das die quantitative und
multiparametrische Analyse von einzelnen Zellen (von physikalischen und/oder chemischen
Eigenschaften) in einem außergewöhnlich hohen Tempo erlaubt. Eine fluoreszierende Markierung
lässt sich auch verwenden, um die zu analysierende Zelle morphologisch und funktionell zu
differenzieren. Die richtig vorbereiteten Zellen werden von einem Laserstrahl beleuchtet und die von
dem Laser induzierten optischen Signale werden von dem Gerät detektiert und weiter verarbeitet. Die
Anwendung der Durchflusszytomerie ermöglicht die Identifizierung und Separierung (sorting)
unterschiedlicher Zellpopulationen aufgrund ihres Immunphänotyps oder auch dem funktionellen
Zustand.
Seit ihrer in den 40er Jahren begonnenen Geschichte, hat die Durchflusszytometrie signifikante
Veränderungen erfahren. Anfangs waren die Instrumente nur einfache Zählgeräte gewesen, die auf
dem Prinzip der Messung von Lichtstreuung und von der elektrischen Impedanz funktionierten. Sie
77
wurden dann weiterentwickelt, um die Fluoreszenzsignale auch detektieren zu können. Die Geräte,
die schon später routinemäßig angewendet wurden, beinhalteten im Allgemeinen eine einzelne
Laserlichtquelle, die 2-6 unterschiedliche Fluoreszenzfarbstoffe (außer der Zellgrösse und
Granularität) gleichzeitig differenzieren konnte. Insgesamt waren dies 4-8 gemessene Parameter pro
Zelle. Die Durchflusszytometrie war schon damals in der medizinischen Diagnostik weit verbreitet.
Hauptsächlich wurde sie für die Immuntypisierung der im Blut zirkulierenden Leukozyten mit 1 oder 2
Farben verwendet. Heutzutage stehen weitere Möglichkeiten zur Verfügung, wie z.B. die auf
Mikroperlen basierenden Detektionssysteme für flüssige Moleküle (Cytometric Bead Array =CBA;
microsphere-based flow cytometric assay), oder mit der Anwendung von dem FRET-Phänomen
(FRET = fluorescence resonance energy transfer) können die intermolekularen Wechselwirkungen
(Protein-protein
Interaktionen)
charakterisiert
werden.
Mit
Antikörpern,
die
phosphorylierte
(modifizierte) Proteine erkennen, lassen sich die intrazellulären Signalübertragungs- und metabolische
Wege identifizieren. Die erhöhte Anzahl von gleichzeitig detektierbaren Farben (10-17 Farben in
einem Experiment) hat es möglich gemacht, dass die Immunphänotypisierung sogar mit der
Detektierung von intrazellulären Zytokinen ergänzt/kombiniert werden kann, d.h. können auch
proteomische Untersuchungen auf Zellebene durchgeführt werden. Die Durchflusszytometrie ist
dadurch unverzichtbar in dem diagnostischen Arsenal geworden.
Neben der morphologischen und funktionellen Charakterisierung der Zelle ist sie auch einzigartig im
Bezug auf die Fähigkeit, dass sie gut definierte Zellpopulationen (z. B. mit der Expression von
Differentiationsantigenen identifizierte Zellen) mit hoher Geschwindigkeit und Reinheit voneinander
separieren kann (Zellseparation, cell sorting).
Mit durchflusszytometrischen Verfahren werden folgende Fragestellungen am häuigsten beantwortet:
1. Sind die gesuchten Zellen (z. B. aufgrund ihres Zelloberflächen-Molekül Musters,
Immunphänotyp, definierter Population) in dem Untersuchungsmaterial anwesend?
2. Zu welchem Anteil (oder absolute Menge) können die gefragten Zellen nachgewiesen
werden?
3. Wie
viele
unterschiedliche
Zellpopulationen
(aufgrund
z.
B.
Grösse,
Granularität,
Immunphänotyp oder funktioneller Zustand) können in der Probe identifiziert werden?
4. In welchem derzeitigen funktionellen Zustand sind die Zellen?
5.2. Das Durchflusszytometer
Ein Durchflusszytometer besteht aus 1) dem Flüssigkeitssytem,
2) einem optischen System,
3) elektrischem System,
4) einer Einheit für die Analyse (Computer),
5) Zellsorter (optional).
(Abbildung 5.1.)
78
Abbildung 5.1. Genereller
Aufbau eines
Durchflusszytometers (Ref
1.) Die Detektoren
(Photomultiplierröhren)
werden mit zunehmendem
spektralen Abstand vom
Anregungslicht aufsteigend
nummeriert (FL1, FL2, FL3
usw.)
1) Von dem Flüssigkeitssystem wird ein Probenstrom in der Messküvette des Leitungssystems in dem
Durchflusszytometer erzeugt, in dem die Zellen in einem Flüssigkeitsstrahl aus der Probensuspension
einzeln hintereinander („im Gänsemarsch“) durch den Messbereich bewegt werden. Dies erfolgt durch
die
sog.
hydrodynamische
Fokussierung,
die
durch
zwei
Flüssigkeitsströme, dem Hüll- (sheath
fluid) und dem Probenstrom erzielt wird
(laminare Strömungsverhältnisse).
der
Messküvette
werden
In
die
nacheinander kommenden, wie in einer
Perlenkette aufgereihten Zellen von
einem
fokussierten
beleuchtet.
Laserstrahl
(Abbildung
Flüssigkeitssystem
geschlossenes
5.2.)
ist
System,
Das
ein
da
das
aufgesaugte Probenmaterial mit der
zirkulierenden
Flüssigkeit
nach
der
Messung durch einen Schlauch in
einem Abfallbehälter (waste container)
aufgefangen wird.
Abbildung 5.2. Das Funktionsprinzip der Durchflusszelle
2) Das optische System besteht aus einer (oder mehreren) (1) Lichtquelle(n), die für die Beleuchtung
der Zellen und Anregung fluoreszierender Farbstoffe geeignet ist (monochromatisches kohärentes
Licht: Laser), aus (2) den Laserstrahl fokussierenden Linsen, aus (3) Photomultiplierröhren, die für die
Detektion von emittiertem Licht verantwortlich sind und aus (4) einem Spiegelsystem, das das
emittierte Licht nach Wellenlängen auftrennt (filtert) und steuert.
3) Die Elektronik konvertiert die detektierten Lichtsignale in digitale Signale für die ComputerVerarbeitung (ADC=Analog-Digital-Umsetzer).
4) Ein Analysesystem (Computer) kümmert sich um die Datensammlung und Speicherung, bildliche
Darstellung und die Möglichkeit der Software-beruhenden Verarbeitung.
5) Zellseparator („sorter”) (Die Durchflusszytometrie wird oft als FACS bezeichnet, wobei FACS für
"fluorescence activated cell sorting" steht, obwohl noch nicht alle Geräte für die physikalische
Trennung der Zellen geeignet sind). Aus technischen Aspekten können die FACS-Instrumente auf
zwei Gruppen verteilt werden, abhängig davon, ob sie nach 1) mechanischem oder (2)
elektrostatischem Prinzip funktionieren (Abbildung 5.3.).
Abbildung 5.3a. Mechanische Separierung der Zellen
Die Regel der Trennung kann jeder von
dem Gerät detektierender Parameter sein:
Zellgrösse, Granularität (FSC und SSC),
oder
durch
identifizierte
Fluoreszenzmarkierung
Eigenschaften
(und
irgendeine Kombination von ihnen).
Abbildung 5.3b. Elektromechanische
Separierung der Zellen
5.2.1.
Die
Bildliche Darstellung (data display)
detektierten
Signale
können
in
Histogrammen
(Häufigkeit
über
Intensität)
oder
für
Parameterkombinationen in Punktwolkendiagrammen (dot plot/scatterplot) dargestellt werden. Die an
die verschiedenen Fragestellungen angepasste bildliche Darstellung, wird von der zeitlichen Trennung
der Messung und der Auswertung ermöglicht, da die Messdaten von allen detektierten Parameter
zuerst für jede Zelle einzeln in einen Datenspeicher gespeichert werden, die nach der Messung
analysiert werden können.
5.2.1.1.
Histogramm
Ein einzelner Parameter, im Allgemeinen die Intensität eines Fluoreszenz-Signals, wird in der
Funktion der Zellanzahl dargestellt. Mit der Auswertung von Histogrammen kann man über intra- oder
extrazelluläre Marker von definierten Zellpopulationen, qualitative bzw. quantitative Informationen
erhalten (z. B. die Anwesenheit oder die Stärke der Exprimierung eines Membranproteins). (Abbildung
5.4.)
Abbildung 5.4. Histogramm. Auf der y-Achse wird die Zahl von Zellen aufgetragen, die mit einer
bestimmten Intensität (entsprechend einer bestimmten Intensitätsstufe oder „Kanäle“) analysiert
wurden.
Der
Vergleich
verschiedener
Histogramme
kann
auf
spektakulärer
Weise
durch
Überlagerungsdarstellungen (histogram overlay) ermöglicht werden. In diesem Fall werden die MessErgebnisse von den gleichen fluoreszierenden Markierungen unterschiedlicher Proben in dem
gleichen Koordinatensystem visualisiert, so dass die Signalintensitätsabweichungen (d.h. die
Veränderungen auf Ebene der Protein-Expression) auf den ersten Blick erkannt werden können.
(Abbildung 5.5.)
Abbildung 5.5. Überlagerungsdarstellung (histogram overlay)
Die dreidimensionale Abbildung von „overlay” Histogrammen machen einen ganz kleinen Unterschied
auch sichtbar. (Abbildung 5.6.)
Abbildung 5.6. 3D-overlay Histogramm
5.2.1.2.
Dot plot/Punktwolkendiagramm
Im Punktwolkendiagramm können zwei detektierte Parameter (Parameter-Kombination) von
denselben einzelnen Zellen dargestellt werden. Durch Auftragung z. B. der Streulichtarten zu einem
spezifischen Parameter (ggf. einem Zelloberflächenmarker) auf eine Ordinate und eine Abszisse,
können diese Parameter dargestellt und voneinander differenziert werden.
82
Das Bild zeigt die einzelne Zelle als getrennten Punkt. Die Verwendung der Punktwolkendiagramme
ermöglicht den gleichzeitigen Nachweis verschiedener Parameter (z. B. Co-Expression) und dadurch
können verschiedene Populationen und Untergruppen präziser gefunden werden. (Abbildung 5.7.)
Abbildung 5.7. Dot plot
Die Differenzierung der schwer zu trennenden Populationen wird mit der Höhenliniendarstellung
(contour plot) oder den Dichtediagrammen (density plot) erleichtert, die die spezielle Darstellung von
den zwei Parametern sind. (Abbildung 5.8.)
Abbildung 5.8. Dot plot, density plot und contour plot
83
5.2.1.3.
Kinetische Messungen (time-based collection)
Die Zeit, als detektiertes Parameter, kann für kinetische Messungen, wie Enzymaktivität oder für die
Charakterisierung der Dynamik eines biologischen Vorganges, wie z.B. die Bindung fluoreszierender
Liganden eingesetzt werden. Da die Fluoreszenz-Intensität bei den kinetischen Messungen wesentlich
von der verstrichenen Zeit nach der Stimulation beeinflusst wird, wurde die sog. time-window Analyse
(oder fixed time flow cytometry) wegen der Vergleichbarkeit eingeführt. Dementsprechend muss die
Messung sehr genau, nach der Stimulation oder Behandlung, durchgeführt werden. Insbesondere,
wenn man eine schnelle Zellantwort detektiert. Die Dauer der Messungen ist dabei auch definiert. Bei
der Darstellung kinetischer Messungen wird die Zeit auf der Ordinatenachse, die FluoreszenzIntensität auf der Abszissenachse repräsentiert.
5.3. Die Auswertung der FACS-Messdaten
5.3.1.
Grösse und Granularität
Über die Morphologie, Grösse und Granuleninhalt, enthält das auf der Zelloberfläche und auf den
Zellkomponenten streuende Licht Informationen. Die Lichtstreuung wird in der Verlängerung der
Richtung des Laserstrahls mit einer Fotodiode gemessen. Die in flachem Winkel streuende
Lichtstrahlen (Vorwärtsstreulicht, engl. forward scatter [FSC]; FALS = forward angle light scatter) sind
mit der Zellgrösse proportional. Das in höheren Winkel streuende Licht, das von den Zellorganellen
gestreut wird, wird mit einem Photoelektronenvervielfacher im rechten Winkel zur Achse des
Laserstrahls (bei 90° zum einfallenden Licht) (PMT = photomultiplier tube) detektiert und
Seitwärtsstreulicht (SS = SSC = side scatter; RALS = right angle light scatter) genannt.
Das FSC/SSC-Dotplot (oder Streuungsbild) ist die Abbildung von dem Vorwärtsstreulicht und dem
Seitwärtsstreulicht, mit dem man über jede einzelne Zelle Informationen über ihre Zellgröße in der
Funktion der Granularität erhält. Bei der Analyse einer FSC/SSC-Dotplot können nicht nur die
Zusammensetzung der Zellsuspension (Heterogenität) und die Anteile verschiedener Populationen
(Leukozytenpopulationen in dem
peripheren
Blut)
bestimmt
werden, sondern auch morphologische
Veränderungen
der
Zelle welche Informationen über
ihren
funktionellen
Zustand
geben (z.B, Viabilität, Zelltod,
Aktivierung, Zellteilung). Es kann
sogar pathologische Vorgänge
beweisen, wie zum Beispiel die
Präsenz von Blasten im Blut.
(Abbildung 5.9.)
Abbildung 5.9. Die Bedeutung des Streuungsbildes (FSC/SSC
dot plot) in pathologischen Zustände. Gesundes (A) und
leukämisches (B) Knochenmark.
84
Punktwolkendiagramme sind auch die Grundlage für weitere Untersuchungen, da sie für die
morphologische Definition von Populationen und für das Gating (die Anwendung vordefinierter
Regionen zur Auswahl von Zellen in einer erneuten Darstellung) verwendet werden. (Abbildung 5.10.)
In dieser Region bzw. dem durch diese Region definierten logischen Gate können die gefragten Zellen
fokussiert untersucht werden.
Abbildung 5.10. Gating. Die detektierten Partikeln werden entsprechend des „R1 gate“ Bereiches auf
dem rechten Bild dargestellt. Die Verteilungsmuster von Zellen können durch Gating aufgrund ihrer
Eigenschaften aus verschiedenen Populationen definiert werden.
5.3.2.
Fluoreszenz
Informationen über Zellen können durch Fluoreszenz-Markierung vervielfältigt werden. Die
Fluoreszenz, als Phänomen bedeutet, dass ein Stoff nach Anregung bzw. beim Übergang eines
elektronisch angeregten Systems in einen Zustand niedrigerer Energie, Licht emittiert. Die
Fluorophore (oder Fluoreszenzfarbstoffe) sind solche Moleküle, die die Fähigkeit haben, Licht einer
gegebenen Wellenlänge zu absorbieren und dadurch angeregt werden und nach der Beleuchtung
(Exzitation) Licht emittieren (Emission). In der Regel ist das emittierte Licht immer energieärmer als
das vorher absorbierte und dementsprechend mit längerer Wellenlänge charakterisiert (Stokessche
Regel, s. Biophysik).
Viele Fluoreszenzfarbstoffe können eingesetzt werden von denen ein Teil direkt und spezifisch an
bestimmte Zellkomponente bzw. Moleküle bindet, andere in Antikörper-gekoppeltem Zustand für
Immunfärbung. Die Anzahl von Fluoreszenzfarbstoffen wird sich durch Erweiterung mit eingebauten
Laserlichtquellen (die Möglichkeit der Anregung auf mehreren Wellenlängen) und durch Entwicklung
von neuen, z.B. aus zwei Fluorophormoleküle zusammengesetzten Tandem-Farbstoffe (TandemKonjugate) ständig steigern. Das Prinzip dieser Konjugate ist es, zunächst den ersten Farbstoff (sog.
Donor; z. B. PE, APC) des Tandems durch den entsprechenden Laser anzuregen. Das anschließend
emittierte Licht regt wiederum den zweiten Farbstoff (Akzeptor) an, dessen emittiertes Licht dann erst
detektiert wird. Diese Konjugate ermöglichen die Erweiterung des Farbstoff-Spektrums und deshalb
die Analyse von mehr als vier Farben pro Färbung. (Tabelle 1.)
Anregungslicht: Blauer Laser (488 nm)
FITC (Fluoresceinisothiocyanat)
Alex Fluor 488
PE (Phycoerythrin)
PI (Propidium-Iodid)
PE-TX red (ECD; Phycoerythrin –Texasrot Tandem)
PE-Cy5((Phycoerythrin-Cy5 Tandem)
PerCP (Peridinin-chlorophyll-protein complex)
PerCP-Cy5.5 (Tandem)
PE-Cy7 (Tandem)
Anregungslicht: roter Laser (633 nm)
APC (Allophycocyanin)
APC-Cy7 (Tandem)
Anregungslicht: UV/violetter Laser (633 nm)
Hoechst 33258
Hoechst 33342
Indo-1
Alexa Fluor 405
Pacific Blue
Tabelle 1. Die häufigsten verwendeten Fluoreszenzmoleküle in Durchflusszytometrie
Bei den diagnostischen Messungen ist das Ziel hauptsächlich, die Anwesenheit und die Menge
(Anteil) von verschiedenen Zellpopulationen nachzuweisen, oder seltener den funktionellen Zustand
zu charakterisieren. Im Allgemeinen wird dies durch Immunphänotypisierung, d. h. durch
zelloberflächen-Markierung oder intrazelluläre Markierung, die auf der Verwendung von Fluorophorkonjugierten monoklonalen Antikörpern, derer Spezifizität auf den Antigen-Antikörper Reaktionsprinzip
beruht, durchgeführt.
86
Bei der Anwendung eines Fluorophors werden die detektierten Signale in einem Histogramm
zusammengefasst. Aufgrund der Fluoreszenz-Intensität kann abgelesen werden, ob an die gefragten
Zellen ein zugegebener Antikörper gebunden hat. Dies liefert wichtige biologische Informationen und
ob die Zellen ein bestimmtes Antigen exprimieren (ja oder nein Antwort; z.B. Differenzierungs- oder
Aktivierungsmarkern). Die nummerische Auswertung (Berechnung von Flächeninhalten unter Kurven)
reflektiert den prozentualen Anteil (%) von positiven (das gefragte Protein exprimierenden) und
negativen (nicht-exprimierenden) Populationen. Das Intensitätsmaximum hängt von der Menge
gebundener Fluoreszenzfarbstoffe und indirekterweise von der Menge gebundener Antikörper ab. Das
bedeutet, dass je höher das detektierte Fluoreszenzsignal ist, desto mehr gefragte Antigene werden
von den Zellen exprimiert. Durch die Anwendung von Kalibrierungsperlen mit bekannter Menge von
Fluoreszenzstoffen, kann die Proteinexprimierung quantifiziert werden. (Abbildung 5.11.)
Abbildung 5.11. Absolut Quantifizierung mit einer Kalibrierungskurve.
Da die richtige Identifizierung bestimmter Zellgruppen nur durch die Messung mehrerer Parameter
(mehrere Marker: Protein-Expressionsmuster) erfolgen kann, wird die einfarbige Markierung immer
öfter
durch
die
parallele
Verwendung
von
Fluoreszenzmolekülen
welche
unterschiedliche
Wellenlängen emittierenden, ersetzt. Bei der mehrfarbigen Markierung werden die detektierten
Fluoreszenzsignale in einem Punktwolkendiagramm dargestellt. Auf den Punktwolkendiagrammen
können, ähnlich zu den Histogrammen, die Anwesenheit der Exprimierung (ja oder nein Antwort) und
der prozentuale Anteil an Zellen, die auf die gefragten Antigen positiv sind, sichtbar gemacht werden.
Mit der Bestimmung der Fluoreszenzintensität wird das Expressionsniveau und dadurch die CoExpression aufgeklärt (Abbildung 5.12.).
Da die Fluorophoren kein Licht einer diskreten Wellenlänge, sondern in einem breiten Band
emittieren, muss man mit spektralen Überlappungen rechnen. Solche Überlappungen der Farbstoffe
müssen nach dem Messvorgang durch Kompensation korrigiert werden.
87
Abbildung 5.12. Immunphenotypisierung. Neben der Co-Expression muss man mit der Stärke der
Expression einer bestimmten Marker rechnen.
5.4. Probenvorbereitungen für diagnostische Messungen
5.4.1.
Herstellung einer Zellsuspension
Da mit einem Durchflusszytometer in einem Flüssigkeitsstrahl vereinzelte Partikel gemessen werden,
muss man im Allgemeinen aus jeder biologischen Probe die eingesetzt werden soll, eine Suspension
gewinnen. (natürlich nicht aus Zellen, die sich schon in einer Suspension befinden, wie z. B. im
peripheren Blut, dem Knochenmark-Aspirat, Liquor, Urin). Bei einem soliden Gewebe ist der erste
Schritt die Vorbereitung der Zellen die in Suspension gebracht werden sollen (Vereinzelung). Dafür
sind viele Verfahren bekannt; von der mechanischen Separierung bis zur enzymatischen Verdauung.
Es hängt von der Sensitivität der Zellen, der Struktur des Gewebes usw. ab, welches Verfahren
angewandt wird. Während der Isolation muss man jedoch berücksichtigen, dass die gewonnenen
Zellen in einem verhältnismäßig intakten Zustand zu bewahren sind. (Vor allem ist Vorsicht geboten,
die Epitope der Zelloberflächenproteine nicht zu zerstören und die Struktur, evtl. die korrekte Funktion
der Zellen, zu bewahren.)
5.4.2.
Erythrolyse
Bei der Vorbereitung der Proben aus dem peripheren Blut oder aus Knochenmark-Aspirat es ist
erforderlich, die in der grössten Menge vorkommenden Blutkörperchen durch Lyse zu eliminieren.
88
Zahlreiche Verfahren sind bekannt: Behandlung mit einer hypotonischen Lösung oder mit
Ammoniumchlorid.
5.4.3.
Fluoreszenz-markierung
Die Markierung mit einem Fluoreszenzmolekül kann auf zwei technisch möglichen Weisen erfolgen: 1)
direkte Färbung: wenn das fluoreszierende Molekül an einer Zellorganelle oder an einem Molekül
spezifisch bindet, oder 2) Immunphänotypisierung: wenn eine Struktur (ein Antigen) mit einem
Fluoreszenzmolekül-gekoppelten Antikörper detektiert wird.
5.4.3.1.
Direkte Färbung
In der klinischen Praxis ist das meist verbreitete direkte Verfahren die Propidiumiodid (PI)-Markierung
des DNA-Gehaltes. PI wirkt wie Ethidiumbromid als Nukleinsäureinterkalator und es kann
stöchiometrisch (1PI pro 5 Basenpaaren) an die doppelsträngigen DNA und RNA Moleküle binden.
Auf diese Weise (nach RNase-Behandlung) kann der DNA-Gehalt quantitativ bestimmt werden und
dadurch eine Zellzyklusanalyse durchgeführt werden (Abbildung 5.13.).
Abbildung 5.13. Zellzyklusanalyze mit Propidiumiodide
Durch die direkte Markierung kann der funktionelle Zustand der Zellen auch in vielen Fällen
charakterisiert werden, wie z.B. die Enzym-Aktivität mit fluoreszierenden Substratmolekülen, die
Apoptose durch die Detektierung von veränderten Lipidzusammensetzungen der Plasmamembran,
oder die ROI (reaktive Sauerstoff Arten) Produktion von Granulozyten welche mit der Hilfe von auf
Sauerstoffradikale empfindlichen Fluorophoren bestimmt werden kann.
89
5.4.3.2.
Immunphänotypisierung
Bei der Färbung der Zelle mit Fluorophor konjugierten Antikörpern ist die Spezifizität durch die
Antigen-Antikörper Reaktion gesichert. Aufgrund der Eigenschaften der Fluorophore und durch die
Spezifizität gebenden monoklonalen (selten polyklonale) Antikörper, können direkte und indirekte
Techniken unterschieden werden. Im Fall der direkten Technik wird ein Fluorophor an den gegen das
Antigen spezifischen (primäre) Antikörper, gebunden. Bei der indirekten Technik wird der primäre
Antikörper nicht markiert, weswegen die Anwendung eines weiteren, markierten (sekundären)
Antikörpers erforderlich ist. Dieser richtet sich gegen den ersten Antikörper, um die Bindung zu
visualisieren. Eine spezielle Möglichkeit ist die Verwendung eines mit Biotin-verbundenen primären
Antikörpers wobei ein Fluorophor-konjugiertes Streptavidin für die Sichtbarmachung zugegeben wird.
(Abbildung 5.14.)
Abbildung 5.14. Direkte und Biotin/Streptavidin vermittelte Markierung.
Beide Anwendungen haben Vorteile: bei dem direkten Verfahren gibt es eine geringere
Wahrscheinlichkeit für unspezifische Bindungen, aber das Signal ist stärker bei der indirekten
Färbung, da an einem antigenspezifischen Antikörper mehrere sekundäre gleichzeitig binden können.
In der klinischen Praxis trifft man am öftesten auf die Immunphänotypisierung, bei der die Zellen
aufgrund des Proteinmusters auf den Zelloberflächen und auch dem innerhalb der Zellen, identifiziert
und charakterisiert werden.
Die während Untersuchungen der weißen Blutzellen entdeckten Antigene werden anlässlich der
„Internationalen Arbeitsgemeinschaften“ seit den 1980er Jahren (International Workshops on Human
Leukocyte Differentiation Antigens) verglichen und kategorisiert. Die eingeordneten Antigene
bekommen wegen der leichteren Identifizierung eine Nummer, die mit der Abkürzung für „Cluster of
Differentiation” gekoppelt wird. Der neunte Workshop wurde in Barcelona 2010 veranstaltet, nachdem
die Anzahl von derzeitig identifizierten und eingeordneten Antigenen 363 beträgt (CD363=S1PR1
[sphingosine-1-phosphate receptor 1]). (Tabelle 2.)
90
Myeloidische Zelle
Stammzelle-Marker
Granulozyt
Monozyt
Megakariozyt
Lymphozyten
Erytrozyt
TZelle
B- Zelle
CD34
intrazell.
MPO
CD14
CD41
Glycophorin
A
CD2
CD19
CD117
CD13
HLA-DR
CD61
CD71
CD3
CD20
CD133
CD33
CD4
CD42a
CD4
CD22
CD15
CD13
CD33
CD8
HLA-DR
CD11b
CD33
CD13
CD5
CD79a
CD7
(CD10)
CD16
Tabelle 2. Die wichtigste CD Markern
5.5. Die Anwendungsgebiete der Durchflusszytometrie
Im Folgenden werden die Anwendungsgebiete nach zwei Annäherungen präsentiert: 1) auf der
Methodik beruhende Verteilung und 2) klinische Anwendungen.
5.5.1.
Auf der Methodik beruhende Verteilung
(bei der aufgereihten Verteilung wurde keinen Anspruch auf Vollständigkeit erhoben.)
5.5.1.1.
Proteinnachweisverfahren
Mit der FACS-Methodik ist es also möglich, Proteine direkt oder indirekt nachzuweisen. Die
spezifische Detektierung beruht auf Antigen-Antikörper-Bindungsprinzip, weil die Proteine (als
Antigene) mit Fluoreszenzstoff markierten Antikörpern markiert werden (Immunphänotypisierung). Ein
unspezifischer Nachweis lässt sich mit der in situ Detektierung von Amino- und Thiol-Gruppen
erzielen, die nur über die Anwesenheit, Menge und Lokalisierung von Proteinen informativ ist, aber
nicht über die Zusammensetzung. Die beiden Verfahren sind auch für die Charakterisierung von
Rezeptor-Ligand-Wechselwirkungen geignet bzw. die Thiol-reaktiven Stoffe sind verwendbar für die
Feststellung der Konformationsveränderungen der Proteine.
Spezielle Möglichkeiten wurden durch die Entdeckung des grün fluoreszierenden Proteins (Abkürzung
GFP; engl. green fluorescent protein) erreicht, das sich auch bei der Überprüfung des
Transfektionswirkungsgrades bewährt hat. Bei der Transfektion (das Einbringen von Fremd-DNA oder
RNA in eukaryotische Zellen) wird das GFP-kodierende gfp Gen direkt vor dem Stop-Kodon gefragter
Proteine eingebaut und auf diese Weise wird das transkribierte Gen mit dem gfp-Gen zusammen
exprimiert (GFP-Fusionsproteine) und erscheint als fluoreszierendes Protein in der Zelle. Die
Anwesenheit der Fluoreszenz beweist eine erfolgreiche Expression gefragter Proteine. Wird die gfpcDNA nach einem Promotor-Bereich eingebaut, wird das GFP immer sichtbar, sobald der Promotor
aktiviert wird und dadurch die Steuerung der GenExpression untersucht werden kann. Die Co-
91
Transfektion mit GFP-Reporterplasmid hat noch einen weiteren Vorteil, nämlich dass die erfolgreich
transfektierten Zellen sortiert werden können.
Für die Diagnosestellung oder der prognostischen Beurteilung von einigen pathologischen Zuständen
muss das Zelloberflächen-Expressionsniveau bestimmter Proteine aufgeklärt werden. In bestimmten
Fällen es ist genug, wenn man die Unterschiede zwischen den pathologischen und gesunden Zellen
findet, wie z.B. bei dem Leukozyten-Adhäsionsdefekt Typ I. (LAD-I; Mutationen im ITGB2-Gen
(21q22.3), das für das Beta-2-Integrin/CD18 kodiert, das mit CD11a bildet LFA-1) eine verringerte
Expression von CD11b und CD18, bei dem Typ II. (extrem selten) das Sialyl-Lewis XBlutgruppenantigen ist nicht auf den neutrophile Granulozyten nachgewiesen werden können.
Bei der Spondylitis ankylosans (Bechterewsche Krankheit) im Gegenteil, wurde eine enge Assoziation
mit der Präsenz von HLA-B27 gefunden. Es sind auch klinische Zustände bekannt, in denen die
absolute Menge eines Proteins maßgebend ist, z.B. in Sepsis hat die quantitative Bestimmung von
HLA-DR auf den Monozyten und CD64 (FcγRI) auf den Granulozyten eine Bedeutung in der
Beurteilung
des
Verlaufs.
Bei
der
quantitativen
Bestimmung
werden
fluoreszierende
Kalibrierungsperlen bekannter Menge benutzt.
5.5.1.2.
Untersuchungen der Synthese
Die fluoreszierenden Bausteine (z.B. Nukleotide, Monosaccharide, Lipidsäure, usw.) oder in den
Zellen physiologischerweise fehlende Stoffe können für die Beobachtung der Bildung neuer Moleküle
verwendet werden. Dazu gehört z. B. die Inkorporierung von Timidin-Analoga (wie BrdU =
Bromdesoxyuridin, EdU = 5-ethynyl-2´-deoxyuridin) mit denen eine Zellzyklusanalyse durchgeführt
werden kann. (Abbildung 5.15.)
Abbildung 5.15 Darstellung des Zellzyklus mittels BrdU-Färbung. Vor (blau) und nach (grün) der
Stimulation. In dem vordefinierten Lymphozyten-Bereich (R1 Gate) werden die CD4 und CD8
positiven Zellen dargestellt. Die Histogramme (unten) zeigen die BrdU-Inkorporierung von den
entsprechenden positiven Zellen (in R3 und R2 weitergeführt).
92
5.5.1.3.
Enzymaktivität-Messungen
In lebenden Zellen, kann die Enzymaktivität mit fluoreszierenden Substratmolekülen in situ
durchgeführt werden. Wenn man mehrere Parameter gleichzeitig in Betracht zieht, kann mit der
Identifizierung einer bestimmten Zellpopulation, die Enzymaktivität Zelltyp-spezifisch bestimmt
werden. Heutzutage stehen solche Fluoreszenzproben zur Verfügung für Glykosidase, Phosphatase,
Peptidase, Protease und Oxidase. Diese Messungen ermöglichen die umfassende Charakterisierung
der Zellfunktion (metabolische Wege, Signalübertragung, Aktivierung usw.) (Abbildung 5.16).
Abbildung 5.16. Ein Bespiel für eine Enzymaktivität-detektierende Fluoreszent-Probe: Ein
Karboxyderivat von Fluoreszein, das Karboxy-H2DCFDA. Damit lassen sich die reaktiven
Sauerstoffradikale quantitativ messen.
(http://probes.invitrogen.com/media/pis/mp36103.pdf)
5.5.1.4.
Untersuchung der Nukleinsäure
Der DNA- und RNA-Gehalt wird mit fluoreszierenden Nukleinsäure-Farbstoffen (anlässlich des
Zellzyklus oder Apoptose) bestimmt. Die nicht-permeablen Farbstoffe können auch die Viabilität
(Lebensfähigkeit; s. 3.19.) kennzeichnen, weil sie nur in den sterbenden Zellen ins Zytoplasma
gelangen können. In der Diagnostik wird die Bestimmung des DNA-Gehaltes am häufigsten für die
Schätzung der Teilungsfähigkeit von Tumorzellen oder ihrer Zelltodrate nach der Behandlung
angewandt. Die Retikulozyten lassen sich aufgrund ihres RNA-Gehaltes im Blut identifizieren. Der
93
Nachweis der Nukleinsäuren hat eine mikrobiologische Bedeutung, einerseits weil die Kenntnisse
über die Viabilität von Erregern auf die Prognose hinweist, anderseits weil der Tod der infizierten
Zellen (durch Apoptose oder Nekrose) auch detektiert werden kann.
5.5.1.5.
Untersuchung der Zellorganellen
Viele unterschiedliche, für Durchflusszytometrie adaptierte und spezifische Nachweisverfahren von
Zellorganellen sind bekannt, z. B. wird mit Fluoreszenzmarkierung die in vivo Umgestaltung der
Zytoskelette untersucht und mit fluoreszierenden Lipid-Analoga wird die Arbeitsweise von
Plasmamembran- und zytoplasmatischen Membransystemen beobachtet. Mit Fluoreszenzstoffmarkierten Fettsäuren können auch die Signalübertragungswege und Zellaktivierung untersucht
werden.
5.5.1.6.
Funktionelle Untersuchungen
Wegen der Vielfältigkeit der funktionellen Untersuchungen werden hier die Möglichkeiten nur
aufgereiht. Die detailierten Erklärungen unterschiedlicher Methoden können in der Fachliteratur
gefunden werden. Gezielte Lebensvorgänge:
 Viabilität
 Zellteilung/Zellzyklus
 Apoptose (Kaspase-Aktivität, Messung des mitochondrialen Membranpotentials, TUNEL =
Terminal DeoxynucleotideTransferase dUTP Nick End Labeling Method)
 Proteinsynthese (z.B. Zytokineproduktion)
 Phagozytose/Endozytose
 Signalübertragung (z.b. fluoreszierende Fettsäure, anti-Phosphoprotein Antikörpern, usw.)
 zytoplasmatische Ionenkonzentration (ionenempfindliche fluoreszierende Farbstoffe)
 Funktionsfähigkeit der Transportproteine (mittels fluoreszierender Substrate z.B. MultidrugRezistenz = MDR)
 Reaktive Sauerstoffradikale (ROI) und Stickstoff-monoxide (NO)
2+
2+
2+
 Messung von Metallionen (Ca , Mg , Zn
Indikatoren)
 pH- Messung
 Messung des Membranpotentials
 Kinetische Messungen (z.B. zeitliche Bestimmung der Enzymaktivität)
 Bestimmung des Redoxzustandes (Quantifizierung der Thiol-Gruppen und DisulfideBindungen)
5.5.1.7.
Bestimmung des relativen Abstandes zwischen Molekülen (FRET)
Um den Abstand zwischen Moleküle oder zwischen intramolekularen Domains zu messen, werden
zwei Fluoreszenzstoffe gleichzeitig verwendet. Im Rahmen des Förster-Resonanzenergietransfers
(FRET) wird die Energie eines angeregten Farbstoffs, auch Donor (für die Wellenlänge des
anregenden Lichtes empfindlich) genannt, auf einen zweiten Farbstoff, auch Akzeptor (für die
94
Wellenlänge des emittierten Lichtes des Donors empfindlich) genannt, übertragen. Wenn die zwei
Fluoreszenzstoffe nahe genug zu einander liegen und der Donor angeregt wird, wird das
Fluoreszenzlicht des Akzeptors erscheinen. Wenn die zwei Moleküle voneinander entfernt sind, kann
nur dem Donor entsprechendes Licht detektiert werden. (Abbildung 5.17.)
Abbildung 5.17. Prinzip der durchflußzytometrischen Messung von Rezeptorinteraktion mittels FRET.
5.5.1.8.
Untersuchung löslicher Moleküle (Flow Cytometry Based Fluorescent
Bead Immunoassay)
An Moleküle (Proteine, Oligonukleotide, Lipide oder KGGohlenhydrate), die auf die Oberfläche
synthetischer Mikroperlen gebunden werden, können verschiedene lösliche Analyte spezifisch binden.
Aufgrund der Grösse der Mikroperlen und der Detektionsantikörper mit Fluoreszenzfarbstoffen
unterschiedlicher Farben, können die gefragten löslichen Antigene quantifiziert werden. Der Vorteil
des Verfahren ist, dass man mehrere Analyte gleichzeitig aus sehr geringen Mengen Probenmaterials,
quantitativ messen kann (mehr als 10 Zytokine aus weniger als 25µl Serum). Die Empfindlichkeit ist
ähnlich zu dem ultrasensitiven ELISA Verfahren (in pg/ml Bereich). (Abbildung 5.18)
Abbildung 5.18a. Grundsätze der Mikroperle-Methoden
95
Abbildung 5.18b. Ein Beispiel für ein fluoreszierendes Bead-Immunoassay und eine
Multiparameteranwendungen (englisch: Multiplexing).
5.5.1.9.
Bestimmung der absoluten Zellzahl
Durch Anwendung von Referenzperlen (als innere Kontrolle) aus Polystiren in einer bekannten
Konzentration, kann die absolute Zellzahl bestimmt werden. (Abbildung 5.19.)
96
Abbildung 5.19. Die
Verwendung der
Referenzpartikel
ermöglicht eine
volumenbezogene
Zählung (Absolutzählung).
In diesem Experiment
wurden die apoptotischen
und lebenden Zellen
zusätzlich getrennt (FL1:
annexinV-FITC, FL2:
propidium-iodide).
5.5.1.10. Zellsortierung
Die Sortierung mit dem Durchflusszytometer hat viele Vorteile im Vergleich zu anderen Verfahren:

Die Trennung von Zellpopulationen kann mit der Berücksichtigung von mehreren
(multiparametrischen) Kriterien erfolgen. (FS/SS; Fluoreszenz).

Die Geschwindigkeit der Separierung ist sehr hoch: mehr als 100000 Zelle können pro
Sekunden sortiert werden und zugleich ist der Wirkungsgrad (Reinheit) höher als 95%.
Die modernen Geräte können schon eine sichere Sortierung solcher Zellen durchführen,
die in einer nur sehr geringe Menge vorhanden sind (<0.1% pro Untersuchungsmaterial):
(„rare event sorting”). Diese Möglichkeit hat eine sehr grosse Bedeutung z.B. in der
Nachsorge einer Minimal-Resterkrankung (minimal residual disease) oder in der
Isolierung von für die autologe Stammzelletransplantation nötigen Stammzellen oder
Vorläuferzellen.

Die Sortierung kann unter sterilen Umständen durchgeführt werden und die Zellen können
auf diese Weise weiter gezüchtet oder klonal vervielfältigt werden.
5.5.2.
5.5.2.1.
Verteilung nach Krankheiten
Maligne hämatologische Erkrankungen
5.5.2.1.1. Diagnostik und Differentialdiagnostik
Die Aspekte der Durchflusszytometrie für die Diagnose und Differentialdiagnose von malignen
hämatologischen Erkrankungen, beruhen auf der Feststellung der zellulären Herkunft und der
Reifungsstadien, die durch die Messung der Zelloberflächen- und zytoplasmatischen Antigene (CD
Markern) bestimmt werden. Da die Mehrheit der Oberflächen-Antigene in mehreren Stadien einer
Zellreihe, ggf. in mehreren Zellreihen exprimiert werden, sollen für diagnostische Zwecke fast immer
multiparametrische Messungen durchgeführt werden. Die Methodik der Verfahren, die eine
entsprechende diagnostische und differentialdiagnostische Aussagekraft haben, soll möglicherweise
auch kostengünstig sein, und unter den verschiedenen Laboratorien vergleichbare Ergebnisse
erzielen. Sie werden in Konsens- Protokollen zusammengefasst.
Mehrere Typen von Konsens-Protokollen werden benutzt:

Das Ziel des sog. „Grundpanel” ist die Bestätigung von festgestellten Diagnosen, die mit dem
klinischen
Bild
und
zytochemischen
genetischen
ergänzt
und
mit
ggf.
Untersuchungen
werden.
Immuntypisierung
Für
die
werden
relative wenige Oberflächenund zytoplasmatische Marker
benötigt.
Hauptsächlich
die
Trennung der myeloiden und
lymphoiden Stämme und die
Untersuchung der Expression
der
grundsätzlichen
prognostischen
dabei
Marker
wichtig.
CD10=CALLA)
ist
(z.B.
(Abbildung
Abbildung 5.20. Diagnostisches Workflow für die LeukämieDiagnostik
5.20.).

Die ergänzten Konsens-Protokolle wurden für die Feststellung einer richtigen Stadiumeinteilung
(staging)
ausgearbeitet.
Bei
der
Immuntypisierung
sind
die
für
Zellreihe
spezifische
Differenzierungsmarker und andere Antigene, die für die Reifungsstadien bestimmter Zelltypen
charakteristische, oder wichtige Prognose-Faktoren sind, wichtig. Wegen der besseren
Kenntnisse über den Immunphänotyp des malignes Klons, wird die Durchflusszytometrie neben
der Diagnosestellung für die Nachsorge von bösartigen hämatologischen Erkrankungen, auch für
die Erhebung der therapeutischen Wirksamkeit und der frühen Entdeckung von Rezidiven
angewendet.
5.5.2.1.2. Diagnostik der Minimal-Resterkrankung
Die Minimal-Resterkrankung (minimal residual disease) ist ein trotz der Therapie verbliebener Zustand
ohne klinische Symptome. Der Vorteil der Durchflusszytometrie ist ihre Geschwindigkeit und die sehr
grosse Anzahl untersuchter Zellen (500.000 – 1.000.000 / Untersuchung). Ihr Nachteil ist die
geringere Empfindlichkeit im Vergleich zu genetischen Verfahren.
5.5.2.1.3. Nachweis der rezivierenden hämatologischen Erkrankungen
Obwohl die molekularbiologischen Methoden für den Nachweis eines Rezidivs einer Leukämie
wichtigere
Rollen
spielen,
ist
die
multiparametrische
Immunphänotypisierung
vernachlässigen. Ihre Vor- und Nachteile darin sind die gleichen wie vorher.
98
nicht
zu
5.5.2.1.4. Untersuchung der Empfindlichkeit auf die Terapie (MDR = multidrug
resistance)
Es gibt mehrere Möglichkeiten, wenn man die Wirksamkeit einer Behandlung beurteilen möchte.
Folgendes kann man untersuchen: 1) die Menge von malignen Zellen, auf denen die Diagnose beruht
und die
Proportion der
bösartigen und gesunden
Zellen (durch Immuntypisierung), 2) die Präsenz
der
mit
Medikamenten-
Resistenz
zusammen-
hängenden
proteine
Membran-
(durch
Immun-
typisierung), oder 3) die
Beurteilung
der
Pump-
funktion von Proteinen, die
für den Resistenz verant-
Abbildung 5.21a. MDR Membranprotein Immuntypisierung.
wortlich sind. (Abbildung
5.21.)
Abbildung 5.21b-c. Funktionelle Charakterisierung eines MDR-Proteins.
99
5.5.2.2.
Immundefizienz-Syndrom
Die Immundefekte die sind durch quantitative und/oder funktionelle Störungen einer oder mehrerer
Zelltypen des Immunsystems entwickelt haben, sind durch eine vorübergehende oder irreversible
Schwächung der Abwehrfunktion gekennzeichnet. Je nach ihrem Entstehen gibt es angeborene und
erworbene
Formen.
Die
Symptome
werden
von
morphologischen
oder/und
funktionellen
Veränderungen der Immunzellen verursacht. Als Folgen treten Infektionskrankheiten häufiger auf,
oder sie verlaufen erschwert. Die Ziele der Untersuchung des Immunsystems:
1. Diagnosestellung (Nachweis der Immunkrankheit)
2.
Charakterisierung der Erkrankung
3.
Der Verlauf der Krankheitsaktivität
4.
Die Monitorisierung der therapeutischen Antwort
5.5.2.2.1. Phänotyp-Untersuchungen und Nachfolge in der Diagnostik von
Immundefekten

Die Bestimmung der relativen Anteile von zirkulierenden Lymphozyten-Subpopulationen
(T- bzw. B-Zelle, CD4:CD8 Anteil, usw.)

Die
Charakterisierung
Anwesenheit
der
von
zirkulierenden
Gedächtniszellen,
Lymphozyten-Subpopulationen
Identifizierung
von
aktivierten
(z.B.
Lymphozyten,
Anwesenheit der Antigen-spezifischen Lymphozyten, usw.)

Verlaufsmonitorisierung einer HIV-Infektion (die absolute Anzahl CD4-positiver Zellen bei
HIV Infizierten hat eine therapeutische Bedeutung. Die antivirale Behandlung von einem,
an einer HIV-Infektion leidenden Patienen, muss nach den WHO-Richtwerten (World
Health Organisation) von 2010, dann beginnen, wenn die absolute Menge der CD4+
Lymphozyten auf unter 350 Zelle/mm3 abgefallen ist.)

Die Funktionstests der Phagozyten

Die Messung der ROI (reaktive Sauerstoff-Radikalen)-Produktion

Die Untersuchung der Fähigkeit der Zytokine-Produktion

Die Untersuchung der zytotoxischen Aktivität von natürlichen Killerzellen (NK-Zellen) usw.
5.5.2.3.
Autoimmunerkrankungen
Die Durchflusszytometrie kann für die Untersuchung pathologischer Autoimmunität, die durch eine
gegen die körpereigenen Antigene gerichtete und zur Zellschädigung leitende Immunantwort
gekennzeichnet ist, mehrfach angewendet werden. Durch die Präsenz zirkulierender Autoantikörper,
der Anzahl und des funktionellen Zustandes von den Zellen, die an dem Autoimmunprozess
teilnehmen und auch durch deren Aktivität, kann der Verlauf beurteilt und monitorisiert werden.
5.5.2.3.1. Die Diagnostik der Autoimmunerkrankungen
Eine mögliche Methode den zirkulierenden Autoantikörper nachzuweisen, ist die Detektierung mit Hilfe
von Mikroperlen. Die Autoantikörper in dem Serum von dem Patienten werden auf die Oberfläche von
mit
Autoantigen-bedeckten
fluoreszierenden
Kunststoff-Mikroperlen,
100
gebunden
und
mit
auf
unterschiedlichen Wellenlängen emittierenden Fluorophor konjugierten anti-human IgG-Antikörpern,
sichtbar gemacht. Da die fluoreszierenden Partikel je nach Fluoreszenzintensität unterschieden
werden, ist die Messung mehrerer Autoantikörpern gleichzeitig möglich (pl. dsDNA, SS-A, SS-B, Sm,
Sm/RNP, Scl70, Jo-1, usw.). Die Vorteile sind 1) ihre Geschwindigkeit (es ist nicht nötig, auf mehrere
Patientenproben zu warten, wie bei den ELISA-Systemen), 2) die notwendige Menge der Proben ist
gering (~25-30 µl) und 3) es gibt die Möglichkeit, mehrere Autoantikörper simultan (bis hin mehr als
10) nachzuweisen.
Eine spezielle Möglichkeit, die zirkulierenden Antikörper zu untersuchen ist es, die Antikörper aus dem
Patientenserum auf die aus gesunden Individuellen isolierte Zellen zu binden und sie dann mit
Fluorophor
konjugierten
anti-human
Immunglobulinen
zu
visualisieren.
In
Autoimmunthrombozytopenie (ITP) wird dieses Verfahren für den Nachweis von Autoantikörpern, die
auf den Thrombozyten spezifisch gebunden sind, verwendet.
5.5.2.3.2. Die Bestimmung der Aktivität von Autoimmunerkrankungen
Die Bestimmung von bestimmten Zellpopulationen (Anteil, Absolutwerte und funktioneller Zustand),
die in einem Autoimmunprozess beteiligt sind (wie regulatorische T-Zellen, Th17-Lymphozyten, usw.),
kann bei der Beurteilung der Prognose helfen. Es muss aber betont werden, dass die
Charakterisierung von Lymphozyt-Subpopulationen im Blut nicht immer die typische Lokalisierung
einer Krankheit reflektiert. Deswegen ist es sinnvoll, die Zellzusammensetzung der Gelenkflüssigkeit
bei rheumatischer Arthritis und von Liquorproben bei Multiple Sklerose zu untersuchen.
Heutzutage beginnt man die Bedeutung von den aus aktivierten und sterbenden Zellen freigesetzten
Partikeln, die sogenannten Mikrovesikeln, zu erkennen. (Durch ihre Oberflächenproteine kann man
auf ihren Ursprung rückschließen) Mehrere Publikationen deuten darauf hin, dass sich ihre Menge in
aktiven Autoimmunprozessen erhöht, und ihre Präsenz auch als Biomarker verwendet werden kann.
Das meist verbreitete Untersuchungsverfahren dafür ist auch die Durchflusszytometrie.
5.5.2.4.
Die Organtransplantation
Eine grundsätzliche Voraussetzung einer erfolgreichen Organtransplantation ist die Verhinderung
einer immunologischen Abstoßungsreaktion (Rejektion). Die immunsuppressive Behandlung macht
den Patienten für Infektionen empfindlich. Mit Hilfe der Durchflusszytometrie können die
immunologischen Abwehrreaktionen der transplantierten Patienten auf mehreren Stufen beurteilt
werden: 1) die alloreaktiven Antikörper können nachgewiesen und klassifiziert werden. Auch können
Donor-Rezipient Paare, mit erhöhtem Risiko für eine Abstoßungsreaktion, identifiziert werden; 2) die
Komponenten der zellulären Immunantwort (Rejektion versus Infektion: Differenzialdiagnose) können
aufgeklärt werden; 3) der Erfolg der Transplantation durch eine TZR-Analyse kann bestimmt werden.
5.5.2.4.1. HLA-Assoziation
Da eine enge Assoziation zwischen einigen Erkrankungen und HLA-Haplotypen bekannt ist, hat die
Bestimmung der Oberflächen-Expression von HLA-Haplotypen eine klinische Bedeutung. In der
alltäglichen Praxis ist die FACS-Analyse der HLA-B27 Expression auf den Lymphozyten am meisten
101
verbreitet. Sie wird hauptsächlich bei der familiären Vermehrung der Bechterewschen Krankheit
(Spondylitis ankylosans) verwendet.
5.5.2.5.
Infektionen
Die Methoden, die auf dem Nachweis von Nukleinsäure beruhen, bilden heute einen wichtigen Teil
der alltäglichen mikrobiologischen Diagnostik. Neben ihren Vorteilen (sie beschleunigen die
Feststellung der Diagnose, erhöhen die Spezifizität und ermöglichen die Identifizierung jener
Pathogene, die gar nicht oder nur ganz schwierig vermehrt werden, wie z.B. Mycobacterium
tuberculosis, Chlamydia trachomatis) darf man nicht vergessen, dass einerseits der Nachweis der
Nukleinsäure nicht gleichzusetzen mit der Anwesenheit der replikationsfähigen Keime ist, anderseits
ermöglichen diese Verfahren keine rasche Orientierung über das Immunsystem des Wirtes!
Gerade wegen des Ersatzes von diesen Funktionen ist die Durchflusszytometrie ein nützliches
Werkzeug
der
mikrobiologischen
Diagnosestellung
geworden.
Der
grösste
Vorteil
von
Durchflusszytometrie ist im Vergleich mit anderen auf Nukleisäure-nachweis beruhenden Techniken
die individuelle, auf der Stufe der Zelle erfolgte Detektierung. Wegen ihrer Schnelligkeit (die Probe
kann 2 Stunden nach dem Empfang Ergebnisse liefern) hat sie große Bedeutung für den Nachweis
von langsam wachsenden Mikroben, wie Mycobakterien und Pilzen. Mit der entsprechenden Methode
(Probenvorbereitung) werden die Erregern genau identifiziert, womit sie besonders erfolgreich ist in
der Diagnostik von gemischten Infektionen. Nicht zuletzt kann man weitere Informationen über das
Immunsystem des Wirtes (durch den Nachweis spezifischer Antikörpern oder durch die Detektierung
einer zytotoxische Immunantwort) und von der anti-mikrobiellen Behandlung erhalten.
Anwendungsmöglichkeiten der Durchflusszytometrie:

Identifizierung der Erreger:
1. Heterogenitätsuntersuchungen
(Lichtstreuung;
spezifische
Fluorophore,
fluoreszierende Gram Färbung)
2. Monoklonale Antikörper in der mikrobiologischen Diagnostik: Immunphänotypisierung
3. Die Untersuchung der Wechselwirkung zwischen den Mikroorganismen und dem Wirt
4. Identifizierung mit Hilfe von Fluoreszenzfarbstoff-konjugierten Oligonukleotiden bzw.
mit dem auf die Nukleinsäure bindende Fluorophoren.

Die Untersuchung des physiologischen Zustandes von Mikroorganismen
1. Viabilitätsuntersuchungen
2. Funktionelle Untersuchung der Mikroben (Messung des Membranpotentials oder der
Enzymaktivität usw.)

Serologische Untersuchungen

Empfindlichkeitstestung für Antibiotiken

Separierung von Mikroorganismen (Sortierung)

Beurteilung des Immunstatus
102
Absolute Indikationen
Relative Indikationen
Diagnostik und Differentialdiagnostik von malignen
Nachfolge
hämatologischen Erkrankungen
Autoimmunerkrankungen
MDR-Testung
Nachfolge von Infektionszustände
Nachfolge einer HIV-Infektion
Nachweis von HLA-Assoziation
Vorbereitung und Nachfolge einer Transplantation
Tumorprognostik (DNA-Gehalt/Zellzyklus)
Nachfolge der Immundefekten
Bestimmung der Retikulozyt-Anzahl
PNH
Diagnostik
(CD55,
CD59
Expression;
der
Aktivität
von
Untersuchung der Thrombozyt-Funktion
paroxysmalen nächtlichen Hämoglobinurie; PIG-AGen,
das
kodiert
für
das
Enzym
N-
Acetylglukosaminyltransferase, welches für die
Bildung sog. GPI-Anker verantwortlich ist)
Tabelle 3. Die klinische Indikationsbereiche der Durchflusszytometrie
5.6. Qualitätskontrolle (quality control)
Die in der Durchflusszytometrie erforderliche Qualitätskontrolle muss auf der Überprüfung der
Arbeitsvorgänge von nicht nur dem Gerät sondern auch den Proben beruhen. Zusätzlich zu den
Kontrollen während bzw. über den Arbeitsablauf, gibt es auch solche Kontrollmaßnahmen, die die
Instrument betreffen und mit täglicher oder monatlicher Regelmäßigkeit durchgeführt werden müssen.
Die Ergebnisse geben Informationen über die Empfindlichkeit und Stabilität des Gerätes. Für den
klinischen Aspekt ist es am wichtigsten die Probenvorbereitungen zu validieren.
Während der Immunphänotypisierung kann das Immunglobulinmolekül auch mit ihrem Fc-Teil auf die
Zellen binden, wenn sich Fc-Rezeptoren auf der Oberfläche der untersuchten Zellen (Granulozyten,
NK-Zelle usw.) befinden. Um diese unspezifische Bindungen nachzuweisen, werden IsotypKontrollantikörper benutzt. Der Isotyp-Kontrollantikörper ist für ein irrelevantes Antigen (im
Allgemeinen ein Antigen aus einer anderen Tierart) spezifisch, das in den untersuchten Zellen
sicherlich nicht exprimiert wird. Deshalb kann er nur durch seinen Fc-Teil binden. In einem
Parallelansatz kann ein Isotyp-Kontrollantikörper zur Kontrolle neben dem spezifischen Antikörper, der
gegen die zu analysierenden Antigene gerichtet ist, verwendet werden. In identischer Konzentration
zeigen sie die gleiche Affinität zu Fc-Rezeptoren, wie die spezifischen Antikörper des gleichen Isotyps.
Damit er kann als Maß für die unspezifische Bindung und Eigenfluoreszenz der Zellen dienen
(Hintergrundsignal). (Abbildung 5.23.)
103
Abbildung 5.22. Isotyp-Kontrollantikörper Kennzeichnung
5.7. Laboratorische Normalbefunde
Die Normalbereiche von zirkulierenden Lymphozyt-Populationen der Erwachsenen wird in Tabelle 5.4.
dargestellt.
x1000
/mikroliter
%
CD19+
B Zelle
CD3+/CD4+
Th Zelle
CD8+/CD4+
Tc Zelle
CD4 :
CD8
Ratio
CD3/CD56+
NK Zelle
0,78-2,24
0,080.49
0,49-1,64
0,17-0,88
0,95,0
0,08-0,69
53-83
5-21
30-59
10-40
Lympho
cyt
CD3+
Zelle
1,143,38
T
5-32
Tabelle 5.4. Referenz
Übersetzt von Viktor Molnár
Literatur
Rothe G: Technische und methodische Grundlagen der Durchflusszytometrie. In: Sack U, Tárnok A,
Rothe G (Hrsg): Zelluläre Diagnostik. Grundlagen, Methoden und klinische Anwendungen der
Durchflusszytometrie. Basel, Karger, 2007, pp 27–70 (Ref1)
104
6. IMMUNISIERUNG UND VAKZINATION
(EDIT BUZÁS)
6.1. Ziel der Immunisierung und ihre praktische Durchführung
Unter Immunisierung versteht sich eine - durch beabsichtigtes Einbringen eines bestimmten Antigens
ausgelöste - Immunantwort. Mit der Immunisierung können bestimmte Ziele erreicht werden:
a.) In verschiedenen Immunoassays verwendet man als sekundäre Antikörper sog. polyklonale
Antikörper, welche durch Immunisierung von Versuchstieren mit artfremden Antigenen gewonnen
wurden. Ebenso können polyklonale Antikörper hergestellt werden, indem man Kaninchen oder
Schweine mit Schafserythrozyten immunisiert. Die entstandenen Anti-Schafs-Erythrozyten-Antikörper
finden weitläufige Verwendung für Untersuchung des Komplementsystems (siehe Kapitel 4.).
b.) Die Immunisierung ist auch für die Herstellung monoklonaler Antikörper der grundlegende Schritt.
Dafür werden vorwiegend Mäuse verwendet. Wenn im Blutserum des immunisierten Organismus der
antigenspezifische Antikörper in großen Mengen (hohen Titer) vorhanden ist, werden aus der Milz der
immunisierten Maus Plasmazellen isoliert. Durch somatische (Zell)fusion von den auf diese Weise
gewonnenen Plasmazellen, mit Zellen einer Maus-Lymphom-Zellinie (Sp2/0), entstehen die
monoklonalen Antikörper produzierenden sog. Hybridom-Zellen (siehe Kapitel 7.).
c.) Bei Nagetieren, die genetische Anfälligkeit für Autoimmunerkrankungen zeigen (in erster Linie sind
es Mäuse und Ratten), können durch Immunisierung Autoimmunkrankheiten induziert werden. Diese
Tierversuchsmodelle geben uns die Möglichkeit den Pathomechanismus der gegebenen Erkrankung
unter standardisierten und kontrollierten Bedingungen zu untersuchen. Auf diese Weise werden
verschiedene Arthritis-Modelle (z.B. adjuvante Arthritis – AA, Kollagen induzierte Arthritis – CIA,
Proteoglykan induzierte Arthritis – PGIA, etc.) konstruiert. Für Sclerosis Multiplex (SM) ist z.B. ein oft
untersuchtes Mausmodell die experimentelle allergische Encephalomyelitis (EAE).
d.) In der alltäglichen ärztlichen Praxis sind die häufigsten und wichtigsten Immunisierungen die
Schutzimpfungen (die sog. Vakzination). Ein sehr wichtiger Anwendungsbereich der Immunisierung ist
die Vakzine-Herstellung, besonders in seiner präklinischen Tierversuchsphase.
6.2. Die Adjuvantien, ihre Rolle und Gestaltungen
Adjuvantien (wirkungssteigernde Substanzen) die zusammen mit Antigenen verwendet werden,
begünstigen durch ihre kostimulatorischen Wirkung die Ausbildung der Immunantwort. Die in der
Praxis häufig verwendeten Adjuvantien sind Gemische verschiedener Substanzen.
Wenn zur Immunisierung neben dem Antigen auch Adjuvantien verwendet werden, wirken sie auf
zwei unterschiedliche Arten und Weisen. Erstens, Adjuvantien erstellen oft ein Antigen-Depot, aus
105
dem das Antigen langsamer, kontinuierlicher und gleichmäßiger freigesetzt wird. Damit steigt die
Wahrscheinlichkeit,
dass
die
Antigenmoleküle
auf
die
mit
spezifischen
Antigenrezeptoren
ausgestatteten Lymphozyten treffen. Anderseits, Adjuvantien, welche die Liganden für Musterund/oder Notsignalerkennungsrezeptoren (PAMP oder DAMP Rezeptoren) der natürlichen Immunität
enthalten, steigern die Wirksamkeit der Antigenpräsentation (durch Steigerung der Expression von
MHC- und kostimulatorischen Molekülen in antigenpräsentierenden Zellen).
Das sog. inkomplette Freundsche-Adjuvans (Incomplete Freund Adjuvant, IFA) ist eine Wasser-in-Öl
Emulsion (außer Wasser und Öl beinhaltet es keine andere Substanzen, wie z.B. abgetötete
Mykobakterien). Am häufigsten verwendet man jedoch das Komplette Freundsche Adjuvans
(Complete Freund Adjuvant, CFA). Dieses ist ebenfalls eine Wasser-in-Öl Emulsion, welche aber
auch abgetötete und getrocknete Mykobakterien enthält (im Allg. Mycobakterium tuberculosis). Die
Mykobakterien in dem CFA induzieren die Kostimulationsmoleküle der Makrophagen extrem effizient:
So stark, dass das CFA beim Mensch als Adjuvans wegen dessen ausgeprägten Immunogenität gar
nicht verwendet werden darf.
In der klinischen Praxis, also der menschlichen Immunisierung, gehören zu den am häufigsten
verwendeten Adjuvantien andere Adjuvantien. Zum Beispiel das Aluminium-Phosphat und das
Aluminium-Hydroxid (Alum). Diese Adjuvantien stellen einerseits ein Antigen-Depot dar, anderseits
steigern sie die Antigenaufnahme der Makrophagen. Zu weiteren Adjuvantien gehören noch die
Liposomen und das ISCOM (immunostimulating complex). Die ISCOM sind kleine Partikel von 40 nm
Durchmesser, welche beim
Vermischen im
entsprechenden Verhältnis
von Cholesterinen,
Phospholipiden und Saponinen, spontan entstehen. Durch ihre Wirkung gelangen die Antigene
unmittelbar ins Zytosol, wodurch T-Zellen induziert werden.
Abbildung 6.1. Die wichtigsten Arten von Adjuvantien und ihr Wirkungsmechanismus
Mit diesen zur Immunisierung verwendeten Adjuvantien ist es möglich verschiedene Rezeptoren der
antigenpräsentierenden Zellen gezielt zu erreichen. Alle einzelnen Zelltypen die Antigene
präsentieren,
besitzen
einen
für
sie
spezifischen
Rezeptorbestand.
Durch
intrazelluläre
Kommunikation – sog. crosstalk – beeinflussen sich die Signalwege der einzelnen Rezeptoren
gegenseitig. Die Agonisten der Mustererkennungsrezeptoren sind wichtige Komponenten der
Adjuvantien.
Diese
Substanzen
sind
in
der
106
Lage
mit
gezielter
Einwirkung
auf
die
plasmamembranständigen und/oder endosomalen Mustererkennungsrezeptoren die TH1- und/oder
die TH2-Immunantwort zu begünstigen. Im Zytosol befindliche NOD-like Rezeptoren (NLR) und die
RIG-like Helikasen (RLHs) sind fähig die intrazellulären bakteriellen und viralen Signale zu erkennen.
Über die Wirkung solcher Agonisten stehen noch wenige Kenntnisse zur Verfügung; bestimmte
Agonisten (wie z.B. der MDP) werden jedoch in der Veterinärmedizin bereits mit Erfolg verwendet. Die
C-Typ Lektin-Rezeptoren (CLR) und die Scavenger Rezeptoren steigern die Antigen-bindung und Präsentation, auf diese Weise können sie zur Immuntoleranz vermeidenden stimulierenden
Wirkungen beitragen.
6.3. Faktoren, welche die Wirksamkeit der Immunisierung
beeinflussen
Die Wirksamkeit der Immunisierung kann auf zahlreiche Weise gesteigert werden:
1. Mit Verwendung von Adjuvantien.
2. Es wird ein, vom Wirtsorganismus (aus welchem das Antigen stammt) phylogenetisch weit
entferntes Lebewesen immunisiert, wobei eine niedrigere Immuntoleranz, gegenüber dem zur
Immunisierung verwendeten Antigen zu erwarten ist.
3. Der Wirkungsgrad der Immunisierung wird gesteigert, indem die Immunisierung aufgrund der
strukturellen Eigenschaften des Antigens (z.B. aufgrund der zu erwartenden MHC-Bindung)
mit den prädiktierten, „stärksten” (immundominanten) Epitopen des Antigens durchgeführt
wird.
4. Die optimale Dosis des Antigens wird bestimmt und verwendet.
5. Die optimale Art der Immunisierung wird ausgewählt.
6.4. Funktionelle Gruppeneinteilung der Antigene und Epitopen
Die T-Zellen erkennen kurze, lineare Peptid-Epitope. Demgegenüber sind die von den Antikörpern
erkannten B-Zellen-Epitope überwiegend dreidimensionale Strukturen (sog. Konformationsepitope).
Diese Epitope gehen durch Denaturierung wegen Veränderung der Raumstruktur verloren. Nur ein
kleiner Teil der B-Zell-Epitopen sind lineare Peptid-Epitope.
Nach Denaturierung von proteinartigen Antigenen können solche Antikörper entstehen, die nur
denaturierte, lineare Peptid-Sequenzen (des Antigens) erkennen können, die sich mit nativen
Antigenmolekülen nicht verbinden. Es können aber auch solche Antikörper produziert werden, welche
sowohl im nativen als auch im denaturierten Protein eine lineare Peptid-Sequenz erkennen.
Durch Enzymwirkung entstandene Strukturveränderung des Antigens, kann es zur Ausbildung von
neuen Epitopen kommen. Enzyme, wie z.B. Proteasen oder Glykosidasen, rufen NeuepitopStrukturen hervor.
Ein
komplexes
Antigen
löst
eine
polyklonale
Immunantwort
aus,
verschiedenartigen Antikörpern mit unterschiedlicher Epitopen-Spezifität führt.
107
welche
zur
Bildung
6.5. Ausführungsmöglichkeiten der Immunisierung
Intravenöse Impfung
Mit der intravenösen Impfung gelangt das Antigen primär direkt in die Milz, sekundär in den
Lymphknoten. Bei ölhaltigen Emulsionen besteht unmittelbare Emboliegefahr. Ferner wird kein
Antigen-Depot gebildet. Erhöhtes Risiko besteht dabei für die Ausbildung der Immuntoleranz oder
einer Anaphylaxie. Deshalb ist die intravenöse Impfung nur mit Liposomen oder mit Alum geeignet.
Häufiger wird die intravenöse Impfung für booster (Auffrischimpfung), welche kein Adjuvans enthält,
verwendet. Dabei werden Gedächtniszellen aktiviert; es braucht keine (oder kaum) Kostimulation.
Intradermale Impfung
Die intradermale Injektion als Impfung wird häufig verwendet. Dabei gelangt das Antigen langsam in
die Blutbahn, anderseits aber werden die Antigene (Impfstoffe) von den Langerhans Zellen der Haut
schnell aufgenommen und in die regionalen Lymphknoten transportiert. Ein Nachteil der intradermalen
Impfungen ist die häufige Geschwürbildung an der Impfstelle (Ulzeration).
Subkutane Impfung
Ihr Vorteil ist die leichte Durchführbarkeit; wahrscheinlich wird aus diesem Grund wird dieser Weg am
häufigsten zur Immunisierung gewählt. Auf dieser Weise ist es möglich gleichzeitig größere Mengen
vom Impfstoff zu verabreichen. Der Impfstoff (das Antigen) wird langsam resorbiert (in erster Linie
entlang der Lymphbahnen); die Resorptionsgeschwindigkeit hängt sehr stark von der Blutversorgung
des Impfortes ab. In gewissen Fällen soll man in Betracht ziehen, dass der Impfstoff im
Unterhautsraum (subcutanen Raum) auch „abwandern” kann. Bei anamnestisch bereits bestehender
großer Anaphilaxiegefahr ist unbedingt dieser Immunisierungsweg erforderlich.
Die intramuskuläre Impfung
Impfungen dieser Art sichern eine schnelle Antigenresorbtion in den Blut- und Lymphbahnen, die
Resorption hängt aber von der Menge des Antigens (Impfstoffes) ab. Das ist der richtige Weg zur
Impfung von Molekülen mit kleineren Molekulargewicht und/oder mit potenziell irritierender Wirkung;
jedoch werden größere Moleküle wahrscheinlich eher durch die Lymphbahnen entlang der Faszien
abtransportiert. Es können zwar größere Mengen des Impfstoffes auf diese Weise verabreicht werden,
ein Nachteil ist aber die verschleppende Resorption entlang der Faszien, als dessen Folge
Entzündungen und Nervenlesionen auftreten können. Bedeutenden Nachteil stellt die nicht
monitorisierbare (untersuchbare) Stelle der Impfung dar.
Die intraperitoneale Impfung
Diese Art Impfung findet bei Nagetieren am häufigsten Verwendung. Dabei gelangt das Antigen über
Lymphbahnen schnell in die Lymphknoten. Es können größere Mengen von Impfstoffen und
verschiedenartigen Adjuvantien gegeben werden. Bei Auffrischimpfungen (booster) besteht große
Gefahr, wegen der raschen Resorption des Impfstoffes in die Blutbahn
und
die dadurch
hervorgerufene Anaphylaxie.
Übersetzt von Ottó Dobozy
108
7. VAKZINATION
(MARIANNA CSILLA HOLUB)
Vakzination kann entweder mit therapeutischem oder mit präventivem Ziel ausgeführt werden.
Als Therapie wird der Impfstoff nach der Infektion bzw. Erkrankung verabreicht:
 nach Infektion
- passive Immunisierung
In der passiven Immunisierung beinhaltet der Impfstoff präformierte Antikörper (IgG) gegen
ein bestimmtes Antigen, und gibt dadurch passiv, (fast) ohne Beteiligung des Immunsystems,
den Patienten einen fertiggestellten Schutz. Antikörper für solche Impfstoffe werden aus einem, mit
dem fraglichen Antigen oder Pathogen hyperimmunisierten Tier, oder aus Menschen nach
Antigenexposition, gewonnen. Passive Immunisierung wird meistens in akut lebensbedrohlichen
Situationen angewandt, wo es keine Zeit oder Möglichkeit gibt, dass der Patient durch aktive
Immunisierung selber eine Immunität aufbaut.
Vorteile:
-
Verleiht einen schnellen Schutz gegen das Antigen
Nachteile:
-
Der Schutz ist nur vorübergehend, ein immunologisches Gedächtnis wird nicht entstehen (die
Halbwertszeit von IgG ist ca. 7-23 Tage im menschlichen Körper)
-
Eine Elimination bzw. Neutralisierung des Antikörpers kann auch schneller erfolgen,
-
nicht-menschliche Antikörper können Hypersensitivität oder eine art-spezifische Immunantwort
gegen tierischen IgG Epitope erzeugen,
Indikation:
-
Rabies
-
Tetanus
-
Botulismus
-
Schlangengifte verschiedenster Art
-
Hepatitis-A (als Schutzmaßnahme für Neugeborene und immunsupprimierte Personen welche
in der Umgebung von mit Hepatitis A-infizierten Patienten leben)
 nach Erkrankung
- Vakzination mit antigen-beladenen dendritischen Zellen: bei manchen chronischen
Krankheitsbildern, z.B. manche experimentelle Tumorvakzine
- adoptiver Zell-Transfer: aus dem fraglichen Patienten selbst, bzw. aus einem histokompatiblen
Donor werden antigenspezifische immunkompetente Zellen selektiert bzw. gentechnologisch
hergestellt, (Knochenmark, Tyhmus oder Blut-Lymphozyten) und in den Körper des Patienten
zurück-, bzw. eingeführt.
z.B. bei Kindern mit angeborenen Immundefizienzen, manche experimentelle Tumorvakzine.
109
Als Präventivmaßnahme wird der Impfstoff noch vor einer wahrscheinlichen, zukünftigen Infektion
angewandt:
 aktive Vakzination
In der aktiven Immunisierung beinhaltet der Impfstoff das Antigen, wogegen die Immunisierung
wirken soll. Dadurch wird aktiv, also mit der aktiven Beteiligung des Immunsystems der geimpften
Person, Immunität aufgebaut. Aktive Immunisierung wirkt nur in immunkompetenten Personen,
welche nicht akut von dem fraglichen Antigen bedroht sind. Das Ziel ist es den Anteil der
spezifischen antigenerkennenden Zellen zu erhöhen und ein immunologisches Gedächtnis gegen
das Antigen zu erzeugen.
Ideale Eigenschaften eines wirksamen Impfstoffes
Sicher
Hat keine seriösen Nebenwirkungen, das Risiko von
potentiell erzeugten Erkrankungen oder Tod ist
minimal
Protektiv
Gibt sicheren Schutz gegen Infektion mit dem
aktiven, lebenden Krankheitserreger
Stabil
Wirkt über mehrere Jahre oder Jahrzehnte hinaus
Ruft die Produktion von neutralisierenden
Antikörpern hervor
Manche Erreger (z.B. Poliovirus) infizieren solche
Zellen, (z.B. Neuronen), welche unersetzbar sind.
Neutralisierende Antikörper können die Infektion
und Zerstörung von solchen Zellen verhindern.
Induziert eine protektive Antwort von T-Zellen
Bestimmte Pathogene (vor allem die intrazellulär
aktiven Erreger) können mit Hilfe einer
zellvermittelten Immunantwort besser eliminiert
werden.
Praktische Überlegungen
Biologische Stabilität, einfache Verabreichung,
billige Herstellung
Tabelle 7.1. Ideale Eigenschaften eines wirksamen Impfstoffes
7.1. Aktive Vakzination
7.1.1.
Aktive Vakzination erzeugt starke primäre AntikörperAntworten
Zur Entstehung einer Immunantwort bzw. bis zum Beginn der Antikörperproduktion, wird nach einer
Antigenexposition oder Vakzination, ein relativ langer Zeitraum benötigt (ungefähr 5-10 Tage). In
dieser, sog. primären Immunantwort werden nur vergleichsweise geringe Mengen von typischerweise
IgM-Typ Antikörpern gebildet. Die Affinität dieser Antikörper bleibt relativ niedrig, weil sie von schnell
reagierenden Plasmazellen in den Primär-Foci der Lymphknoten produziert werden. Da diese BZellen sich außerhalb der Keimzentren befinden, sind sie nicht in der Lage die Affinität ihrer Antikörper
durch gezielte Mutationen und Selektion (Affinitätsreifung) zu steigern.
Mit der Zeit wird aber ein Teil der aktivierten B-Zellen in das Keimzentrum der Sekundärfollikel
einwandern. Hier gehen sie durch den Prozess der Affinitätsreifung, wodurch der Anteil der
110
hochaffinen Antikörper im Serum der auf das Antigen exponierten / geimpften Person, schrittweise
aber deutlich erhöht wird. Weil die meisten von diesen B-Zellen in den Keimzentren auch den IgKlassenwechsel ausführen, werden mit der Zeit nicht nur mehr hochaffine Antikörper, sondern auch
mehr Antikörper vom nicht-IgM-Typ (IgG, IgA, usw) gebildet. Letztlich wird sich eine kleine Minderheit
der auf diese Weise entstandenen B-Zellen, in B-Gedächtniszellen umwandeln, welche bei erneuter
Exposition auf das Antigen oder bei einer Auffrischimpfung die erneute Immunantwort auslösen.
Bei
einer
sekundären
aus
den
solchen,
Antwort
oben
sog.
werden
genannten
Gründen hochaffine Antikörper,
meistens vom Typ IgG, viel
schneller (innerhalb von 1-3
Tagen) und in deutlich höheren
Mengen sezerniert, als nach
der
ersten
Antigenexposition
(Abbildungen 7.1 und 7.2).
Abbildung 7.1. Typischer Ablauf einer primären und sekundären
humoralen Immunantwort
Abbildung 7.2. Aufbau, Aktivierung und Verstärkung des humoralen Gedächtnisses durch widerholte
Infektionen.
111
Latenz
nach
der
Antigenexposition
Stärke der Antwort
Isotyp der Antikörper
Affinität der Antikörper
Variabilität in der
Spezifizität der Ak.
Primäre humorale Antwort
5-10 Tage
Sekundäre humorale Antwort
1-3 Tage
schwächer
IgM >> IgG
stärker
vor allem IgG
(dank der Klassenwechsel, in
manchen Fällen auch IgA, IgE)
durchschnittlich hoch
(dank der Affinitätsreifung)
relativ niedrig
(dank der Affinitätsreifung)
durchschnittlich niedrig
relativ groß
Tabelle 7.2. Vergleich einer primären und sekundären humoralen Antwort.
Antigene, die für eine aktive Vakzination angewandt werden können, müssen einer Vielzahl von
Kriterien entsprechen. Als erstes müssen sie solche Antigene des gezielten Pathogenes sein, die im
menschlichen Körper nicht vorkommen. Also klassische Fremdantigene, wogegen eine Immunantwort
keine Kreuzreaktionen gegen menschliche Autoantigene hervorrufen könnte. Zweitens ist es wichtig,
dass Antigene nicht nur eine Vielzahl von Epitopen vorweisen, sondern auch dass für eine aktive
Vakzination auch sog. protektive Epitope unter ihnen vorkommen. Protektive Epitope sind nicht nur
spezifisch für das das fragliche Pathogen, sondern sie sind auch stark immunogen. Sie werden als
protektiv bezeichnet, weil durch ihre Erkennung alleine, unabhängig von anderen Epitopen des
Antigens ist das Immunsystem in der Lage, einen vollen Schutz gegen eine produktive Infektion zu
sichern.
Solche Epitope können sowohl zu den T-abhängigen (TD, T-dependent) als auch T-unabhängigen (TI,
T-independent) Antigenen gehören. Also wird für eine B-Zell-Antwort gegen sie T-Zell Hilfe benötigt
(TD) oder nicht (TI). Erzeugung einer T-Zell Antwort durch die Vakzination ist selbstverständlich
kritischer bei TD Antigenen, schadet aber nie, oder kann wichtig sein bei TI Antigenen auch, z.B. im
Falle von TI Antigenen von intrazellulären Pathogenen, welche letzten Endes nur mit Hilfe von
aktivierten Th und/oder Tc Zellen eliminiert werden können. Letztlich ist es extrem wichtig, dass die
Induktion der Immunantwort stark genug sein muss, um ein langfristiges spezifisches Gedächtnis zu
erzeugen, ohne das der eigentliche Sinn der aktiven Immunisierung nicht gesichert wäre.
Antikörper, die durch die Erkennung und Bindung des Krankheitserregers seine weitere Verbreitung
im Körper vollständig hemmen können, werden als neutralisierende Antikörper bezeichnet. Die
Erzeugung von neutralisierenden Antikörpern ist selbstverständlich das wichtigste Kriterium für allerlei
Vakzinationen. Neutralisierende Antikörper müssen fähig sein die
wichtigsten pathogenen
Mechanismen des Erregers zu blockieren. Zum Beispiel im Falle von Viren, müssen sie selbst die
Bindung des Virus zu den Virusrezeptoren der Zielzellen vorbeugen können. Andererseits gibt es
unter den neutralisierenden Antikörpern auch solche, welche die effektive Bekämpfung des
Krankheitserregers durch andere Mechanismen ermöglichen: Zum Beispiel indem sie
-
die Entfernung des Pathogenes oder der infizierten körpereigenen Zellen unterstützen (z.B.
durch FcR-vermittelte Phagozytose des Antikörper-gebundenen Erregers)
112
-
die Replikation des Erregers in dem Wirtsorganismus oder Wirtszellen verhindern (z.B. durch
Modifizierung von inter- oder intrazellulären Signalübermittlungswegen)
-
die Freisetzung des Erregers aus den Wirtszellen, bzw. den interzellulären Transfer des
Erregers und so seine weitere Verbreitung unterdrücken (z.B. durch Modifizierung der
räumlichen Anordnung von viralen Hüllenproteinen in der Membran).
Abbildung 7.3. Effekte von Antikörpern auf virusinfizierten Zellen
Die infolge der ersten Antigenexposition entstehende primäre Immunantwort führt schleunigst zur
Bildung von spezifischen Antikörpern im Blutserum. Die Abwesenheit von bestimmten Antikörpern im
Serum nennt man generell Seronegativität, hingegen die Präsenz von bestimmten Antikörpern gegen
ein Antigen, Seropositivität. Bei allen Vakzinationsverfahren ist es selbstverständlich ein wichtiges
Kriterium, dass das Verfahren in der Lage sein muss, die Produktion von Antikörpern hervorzurufen.
Mit andern Worten, dass die geimpfte Person durch die Vakzination vom ursprünglichen,
seronegativen Status ins seropositive konvertiert wird. Diese Änderung in dem immunologischen
Status des Patienten wird als Serokonversion bezeichnet, weil das Gegenteil davon, also ein
mögliches Verschwinden der Antikörper Seroreversion heißt.
Ein wirksamer Impfstoff sichert aber nicht nur die Produktion von Antikörpern, sondern sorgt auch
dafür, dass die Antikörper in solchen Mengen sezerniert werden, dass die geimpfte Person einen
aktiven Schutz vor dem Antigen erhält. Das ist die Seroprotektion. Die exakte Menge der Antikörper
benötigt für einen kompletten Schutz vor dem Antigen ist abhängig vom Erreger bzw. Impfstoff selbst,
113
z.B. bei Hepatitis A beträgt sie 20 mlU/ml Antikörper; bei Hepatitis B 10 mlU/ml Antikörper, usw.
(mIU/ml = milli-international units per milliliter)
7.1.1.1.
T-Zell Gedächtnis ist eine der wichtigsten Voraussetzungen einer
wirksamen TD B-Zell-Antwort
Künstlich auslösbare T-unabhängige B-Zell-Antwort
In der Auslösung einer konventionellen, T-abhängigen B-Zell-Antwort spielt die T-B Zell
Wechselwirkung, und insbesondere die CD40-CD40L Interaktion eine Schlüsselrolle.
Abbildung 7.4. Die CD40-CD40L Interaktion
Eine mögliche Alternative der Vakzin-Entwicklung für T-abhängige Antigene (also die überwiegende
Mehrheit aller Antigene) ist es solche Vakzine zu entwickeln, welche selbst für T-abhängige Antigene
eine T-unabhängige B-Zell-Antwort auslösen, und damit den Immunisierungsprozess stark
vereinfachen bzw. abkürzen. Dies wird erreicht indem man T-Zellen durch den Impfstoff absichtlich
nicht aktiviert, sondern ihre Anwesenheit den B-Zellen nur vortäuscht. Dazu werden aktivierende antiCD40 Antikörper zum Impfstoff gemischt, welche die CD40 Moleküle auf B-Zellen genauso aktivieren
können, wie ein CD40L Molekül einer aktivierten T Zelle. Auf diese Weise kann man auch Impfstoffe
herstellen, die nutzlos wären, da ihre Schlüsselantigene T-Zellen einfach nicht effizient genug
aktivieren könnten. Zweitens, da der relativ lange Prozess der T-Zell-Aktivierung mit dieser Strategie
aus dem Spiel ist, kann man auf diese Weise auch schneller eine Antikörperproduktion durch
Vakzination hervorrufen. Nachteile der Strategie sind die Gefahr einer unabsichtlichen polyklonalen BZell-Antwort, und im extremen Fällen Autoimmunität oder Beschädigung des T-Zell-Gedächtnis.
114
7.1.2.
Neben der Antikörper-Produktion kann auch eine zellulären
Immunantwort Ziel der Vakzination sein
Um die durch Vakzination erzeugte T Zell Antworten zu verstehen, müssen wir uns zuerst mit den drei
Phasen der T-Zell-Antwort auseinandersetzen. Diese sind:

eine klonale Expansion von reaktiven T Zellen in der Präsenz des Antigens

nach Beseitigung des Antigens kommt es zu einer Kontraktion der Immunantwort

und letztlich, parallel zu der letzteren Phase, beginnt der Aufbau des immunologischen
Gedächtnis
An dieser Stelle ist es wichtig zu sehen, dass es einige Unterschiede zwischen den Reaktionen der
CD8+ Zellen und der CD4+ in den oben genannten drei Phasen gibt.
Abbildung 7.5. Antivirale CD8+ und CD4+ T-Zell-Antwort.
Im Falle der CD8+ T Zellen laufen die drei Phasen der T-Zell-Antwort folgendermaßen ab:
Abbildung 7.6. CD8+ T-Zell-Antwort auf eine Infektion.
115
1. Nach einer Infektion bzw. Impfung erfolgt die Aktivierung der naiven CD8+ T Zellen mit Hilfe
von dendritischen Zellen. Die Aktivierung von naiven CD8+ T Zellen läuft meistens schneller
ab als die der naiven CD4+ T Zellen, (manchmal innerhalb von 2 Stunden nach
Antigenexposition, wogegen CD4+ T Zellen mindestens 6 Stunden brauchen), benötigt
niedrigere Antigen-Konzentrationen und ist weniger abhängig von Kostimulation.
2. In der Phase der Expansion entsteht die primäre T-Zell-Antwort. Nur 24 Stunden nach der
Antigenexposition sind die antigenspezifischen CD8+ T Zellen in der aktiven Proliferation (im
Falle der CD4+ T Zellen findet dies schon wieder viel langsamer statt). Funktionell gesehen ist
die durch klonale Expansion entstandene Zellmenge recht heterogen: die meisten Zellen sind
IFN- produzierende oder TNF- sezernierende zytotoxische T Zellen.
3. In der darauf folgenden Phase der Kontraktion stirbt dann ungefähr 90-95 % aller primär
aktivierten CD8+ T-Zellen durch Apoptose ab.
4. Die Zellen welche der Apoptose entgehen, bilden das Repertoir der frühen primären CD8+ T
Gedächtniszellen. Die Anzahl der Gedächtniszellen hängt von der Anzahl der ursprünglichen
Effektorzellen ab; je mehr Effektorzellen entstanden sind, desto mehr Gedächtniszellen
werden gebildet: meistens ist die Anzahl der Gedächtniszellen ungefähr 5-10% der
Effektorzellen. Auf ihrer Zelloberfläche exprimieren sie noch bestimmte CD Marker, die auch
noch auf den naiven CD8+ T Zellen zu sehen waren. Im Gegensatz zu naiven Zellen
sezernieren sie aber schon mehrere Zytokine wie, z.B. IFN- und TNF- gleichzeitig.
5. CD8+ T Gedächtniszellen, welche die Kontraktionsphase überleben, und neben IFN- und
TNF- auch IL-2-t sezernieren, haben die Kapazität sich zu erneuern, und sie bilden die
Mehrheit der langfristige CD8+ T Gedächtniszellen. Ihre Fähigkeit zur Selbsterneuerung
gibt die Erklärung darauf, warum am meisten antigenspezifischen CD8+ T Gedächtniszellen
2-3 Tage nach der Beseitigung des Antigens im menschlichen Körper zu finden sind.
Der Unterschied in der Menge der antigenspezifischen, reagierenden T Zellen in sekundären vs.
primären Immunantworten ist generell ähnlich zum Unterschied der Antikörper unter den selben
Umständen. Nach einer erneuten Antigenexposition, also in einer sekundären Immunantwort nimmt
die Menge der reaktiven T Effektorzellen zu, und dasselbe gilt für die T Gedächtniszellen.
Nachdem also bei einer gewöhnlichen Impfung mit der ersten Impfung eine Grundimmunisierung
stattgefunden hat, werden durch die wiederholten Impfungen, die sog. Auffrischimpfungen (manchmal
als Boosterimpfung bezeichnet), eigentlich sekundäre Immunantworten ausgelöst. In diesen
Antworten werden die Phasen der Kontraktion der T-Zell-Antwort immer länger, und nach jeder neuen
Antigenexposition entstehen neue T-Gedächtniszellen in immer größere Mengen. Andererseits
interessant ist auch die Tatsache, dass nach jeder solchen neuen Antigenexposition, ein immer
kleinerer Anteil der neulich gebildeten Gedächtniszellen in der Lage sein wird, IL-2 zu produzieren und
sich selber zu erneuern. Weil nur sie sich aber, im Gegensatz zu den primären Gedächtniszellen,
effektiv erneuern können, werden sie über die Jahre - früher oder später - die Mehrheit der
überlebenden Gedächtniszellen und dadurch die Hauptkomponente des Gedächtnis bilden.
116
Abbildung 7.7. Kinetik von primären und sekundären CD8+ T Zell-Antworten.
7.1.3.
Typen der T-Gedächtniszellen
Aus den in der primären Immunantwort aktivierten T Zellen differenzieren sich zwei Typen von TGedächtniszellen,
welche
voneinander
durch
ihre
funktionellen
Eigenschaften
und
ihre
Oberflächenmarker, wie z.B. Homing-Rezeptoren relativ einfach unterschieden werden können.

TCM: Zentrale T-Gedächtniszellen

Sowohl CD4+, als auch CD8+ T Zellen können sich zu TCM entwickeln

Ihre
Oberflächenmarker
ermöglichen
ihre
Migration
zu
und
zwischen
sekundären
Lymphorganen (z.B. die, auf naiven T Zellen auch exprimierten CCR7 und CD62L/L-Selektin)
– weswegen TCM Zellen meistens in den Lymphknoten, Tonsillen, Milz und in der
Blutzirkulation zu finden sind.

Sie sind empfindlicher für das Antigen als naive T Zellen

Benötigen auch weniger Kostimulation für ihre Aktivierung, als naive T Zellen.

Nach Aktivierung exprimieren sie CD40L stärker als naive T Zellen (dieses Feedback ist ein
wichtiges Signal für die APZ, z.B. B-Zellen oder dendritische Zellen).

Nach Aktivierung sezernieren sie IL-2, wodurch sie autokrin ihre eigene Teilung fördern und
letzten Endes ihre Selbsterneuerung ermöglichen können. Infolge einer Antigen-Aktivierung
führen sie oft assymetrische Teilungen aus: ungefähr die Hälfte der Tochterzellen wandelt
sich in TEM (oder durch TEM in T-Effektorzellen) um, die andere Hälfte bleibt aber eine TCM
Zelle, damit das Gedächtnis gegen das jeweilige Antigen erhalten bleibt.

TEM: Effektor T-Gedächtniszellen

Sowohl CD4+, als auch CD8+ T Zellen können sich zu TEM entwickeln

Im Gegensatz zu TCM Zellen exprimieren sie weder CCR7 noch CD62L/L-Selektin, dafür aber
solche Chemokinrezeptoren und Integrin-Typ Adhesionsmoleküle, welche ihre schnelle
Auswanderung in die Antigen-exponierten, entzündeten Geweben ermöglichen. Aus diesem
117
Grund sind sie in sekundären Lymphorganen (bis auf die Milz) kaum, jedoch in anderen
Geweben wie in den Lungen, Leber, Darmtrakt oder im Blut in relativ hohen Anzahl
nachweisbar.

Sie reagieren auf einen Antigenstimulus extrem schnell, und wandeln sich in vollständig
aktivierte Effektrozellen binnen Stunden um, welche je nach Funktion der ursprünglichen TEM
Zelle (CD4+, oder CD8+ TEM) IFN- / IL-4 produzierende Th Effektorzellen, oder
Perforin/Granzym positive Tc Effektorzellen sein können.
Abbildung 7.8.
Zentrale T
Gedächtniszellen
(TCM) und Effektor T
Gedächtniszellen
(TEM).
Da die Entwicklung des T-Zell-Gedächtnis vor allem von den Umständen der primären
Antigenexposition abhängt und danach relativ schwer zu beeinflussen ist, werden die schon einmal
aktivierten T-Zellen die Phasen der Expansion, Kontraktion und den Aufbau der Gedächtniszellen
quasi vorprogrammiert ausführen. Die Anzahl der Gedächtniszellen bleibt über eine längere Zeit,
jedoch mindestens über Monate, erhalten. Dies ist auch ziemlich unabhängig von äußeren
Einwirkungen. Aus diesem Grund dürfen die vom STIKO (vom Ständigen Impfkommission)
empfohlene Zeiträume im Impfkalender, die der Arzt zwischen den einzelnen Impfungen eines
jeweiligen Impfungsprotokolls einhalten soll, nur als Minimum interpretiert werden. Eine unabsichtliche
Verlängerung von diesen Pausen (z.B. die Person reist im Mitte des Protokolls unerwartet ab, wird
krank, und kann nicht rechtzeitig geimpft werden), wird auf die Effektivität des Impfungsprogramms
normalerweise keine relevante Einwirkung haben. Dies aus dem einfachen Grund, da die Mengen der
langzeitigen T Gedächtniszellen in der Regel von solchen Unterbrechungen bzw. Abweichungen vom
Standardprogramm nicht beeinflusst werden. Mit anderen Worten, selbst wenn die empfohlenen
Pausen zwischen wiederholten Impfungen aus jeglichen, nicht voraussehbaren Gründen
verlängert werden müssen, gibt es keinen Grund das Impfungsprogramm umzustrukturieren
oder neu zu starten. Selbstverständlich ist das Gegenteil, also eine Verkürzung des empfohlenen
Zeitraums zwischen zwei Impfungen definitiv nicht zu empfehlen, weil in diesem Fall das
Immunsystem nicht genügend Zeit hat, die Antwort abzuschließen, was die Effektivität der
kommenden Vakzination deutlich kompromittieren würde.
118
Weiters ist auch Fieber generell eine Kontraindikation bei Impfungen. Bei solchen akuten, nicht
banalen Infektionen bzw. Krankheitsbildern, wo hohes Fieber (es gibt unterschiedliche Empfehlungen
diesbezüglich, das Robert Koch Institut empfehlt >+38.5C) gemessen wird, darf die Impfung nur nach
einer kompletten Heilung des Patienten verabreicht werden. Dies kann man dadurch erklären, dass
Fieber bei vielen Impfungen eine mögliche Nebenwirkung ist, und zusätzliche Erhöhung eines bereits
vorhandenen Fiebers durch die Impfung nicht sinnvoll ist bzw. eine unnötige Belastung der Patienten
darstellt. Hinzu kommt auch, dass Fieber verursacht durch eine Infektion, kann eines der wichtigeren
Symptome einer schiefgelaufenen Impfung, d.h. Fieber als Nebenwirkung der Vakzination, für den
Arzt praktisch unsichtbar machen kann.
Letztlich gibt es auch einige Publikationen in der Literatur die besagen, dass akute Entzündungen
die Umwandlung von aktivierten naiven CD8+ T Zellen in CD8+ T-Gedächtniszellen
beeinflussen können. Bei akuten Infektionen spielen die inflammatorischen Zytokine eine wichtige
Rolle in der Unterstützung der Aktivierung, Reifung, und Antigenpräsentierung der dendritischen
Zellen (DC). Die meisten DC-aktivierten CD8+ T Zellen, welche in der Phase der Expansion
entstanden sind, werden in der Phase der Kontraktion verschwinden, damit die überlebenden T Zellen
praktisch nur aus T-Gedächtniszellen bestehen, und die T-Effektorzellen nur als eine stets
schrumpfende Minderheit der überlebenden Zellen zurück bleiben.
Falls aber in einer geimpften Person, parallel zu der Impfung auch eine schwere Infektion oder starke
Entzündung vorhanden ist, werden wegen der starken, ständigen Aktivierung die T-Effektorzellen in
einer höheren Anzahl am Leben bleiben, als normal. Sie teilen sich sehr intensiv, wodurch die, von
dem Vakzin induzierten, T-Gedächtniszellen die Minderheit in der T-Zell-Fraktion bilden werden, und
nicht umgekehrt. Dazu kommt, dass die homöostatischen Zytokine, welche für das Überleben der TGedächtniszellen kritisch sind, während einer starken Infektion, im Vergleich mit inflammatorischen
Zytokinen, in nur relativ geringen Mengen produziert werden. In so einem Zytokin-Millieu, also im
Millieu einer aktiven Infektion können deswegen die Gedächtniszellen nicht stabilisiert werden. Sie
erleiden verschieden funktionelle Schäden und letzten Endes sterben viele unter ihnen durch
Apoptose ab. Dies kann selbstverständlich ernsthafte Konsequenzen in Bezug auf die langfristige
Wirksamkeit des Vakzins haben.
7.2. Lebensalter-abhängige Impfung-Strategien
Sowohl Kleinkinder, als auch Personen im hohen Alter (über 65 Jahren) geben typischerweise
schwache Immunantworten auf neue Fremdantigene. In ähnlicher Weise reagieren sie nur schwach
und ineffizient auf Impfungen. Aus diesem Grunde ist es sehr wichtig, dass sehr junge und sehr alte
Personen spezielle Impfungen erhalten, welche eine starke Produktion von neutralisierenden
Antikörpern auch in diesen gefährdeten Lebensalter-Kategorien ermöglichen.
Im Säuglingsalter stellt das Knochenmark noch extrem große Mengen von naiven B-Zellen
unterschiedlicher Spezifizität her. Mit der Zeit wird aber ein immer größerer Anteil des hämatopoetisch
aktiven Knochenmarks mit Fettzellen ersetzt, wodurch die Bildung von neuen B-Zellen mit
zunehmendem Alter immer geringer wird. Die Menge der homöostatischen Zytokine, welche B-Zellen
119
am Leben erhalten ist auch limitiert. Deshalb werden mit zunehmendem Alter die bereits vorhandenen
B-Gedächtniszellen und reifen Plasmazellen im Kampf um homöostatische Überlebenssignale auch
immer weniger Platz den neugebildeten B-Zellen übrig lassen. Dadurch verringern sie ihre
Halbwertszeit und Überlebenschancen. Dies ist einer der Gründe, warum die Kapazität auf neue BZell-Antworten mit zunehmendem Alter stets geringer wird.
Da die Halbwertszeit von IgG im Blutserum nur 21-30 Tage beträgt, wird der Schutz der Kleinkinder
durch die mütterlichen Antikörper nach der Geburt bzw. nach dem Abstillen rapid verringert. Die
transplazentalen bzw. durch die Muttermilch transferierten mütterliche Antikörper werden innerhalb
von Monaten praktisch verschwinden. Das eigene B-Zell-Repertoir dagegen ist aber noch nicht immer
schon reif genug um allerlei Infektionen effizient bekämpfen zu können. Typische Infektionen in
Kleinkindern, die häufig kritische Situationen auslösen, sind Hib, Rotavirus, oder Salmonella, welche
bei Erwachsenen praktisch nie oder nur in extremen Fällen fatale Auswirkungen haben können.
In der Evolution der Säugetiere bzw. Menschen mussten also Jungtiere oder kleine Kinder, über eine
längere Zeit nach der Geburt, mit einem noch nicht vollkommen reifen Immunsystem zum Überleben
auskommen. Durch die Aufnahme von mütterlichen IgG und IgA Antikörpern über die Muttermilch sind
sie nur passiv gegen eine Vielzahl von Krankheitserregern immunisiert. Dies kann aber aus der
Perspektive der Vakzination ernsthafte Probleme verursachen.
In älteren Personen ist die Situation letzten Endes ähnlich. Natürlich nicht wegen des unreifen Status,
sondern auf Grund der Alterung des Körpers und seinem Immunsystem: Die
Rückbildung des
Thymus bzw. des Knochenmarks, und die Degeneration des T- und B-Zell Gedächtnisses. Deswegen
werden Infektionen im hohen Alter manchmal erneut deutliche Herausforderungen darstellen, welchen
aber das Immunsystem des Patienten schon ein oder mehrmals in seinem Leben schon erfolgreich
entgegnet ist. Die Symptome werden stärker, Heilung erfolgt langsamer, und die Chance auf fatale
Komplikationen ist höher, wie z.B. das im Falle von Influenza-infizierten alten Personen häufig zu
sehen ist. Letzten Endes führen aber diese Ursachen auch zu ineffizienten Antworten in der
Vakzination.
7.2.1.
Welche Probleme muss die Vakzination in Kleinkindern
überwinden?
Eine erfolgreiche Vakzination in Kleinkindern ist technisch schwer, aber natürlich nicht unmöglich zu
erreichen. Aus mehreren Gründen: Erstens, in den sekundären Lymphorganen der Kleinkinder gibt es
noch sehr wenig oder kaum Marginal Zonen- (MZ-) B-Zellen, welche auf Polysacharid-artige TI–
Antigene (T-unabhängige Antigene) reagieren und durch Umwandlung in Plasmazellen gegen sie
Antikörper erzeugen könnten. Aus diesem Grund sind Impfungen welche TI-Antworten benötigen (z.B.
Hib Vakzin) in jungen Kindern ineffizient.
Zweitens werden Kostimulationsmoleküle kaum, oder nur in suboptimalen Mengen auf den B-Zellen
von Kleinkindern exprimiert, weswegen auch die dendritische Zelle – T-Zelle – B-Zelle
Wechselwirkung bei TD-Antigenen (T-abhängige Antigene) weniger wirksam sein wird. Dies
beeinflusst wie die meisten Peptidantigene präsentiert werden und verringert dadurch die Wirksamkeit
vieler Peptidvakzine (z.B. Masern- / Morbilli-Vakzin).
120
Drittens, weil die follikulären dendritischen Zellen auch noch unreif sind und in den Keimzentren der
Lymphknoten die Affinitätsreifung, somatische Hypermutation und Isotyp-Klassenwechsel anders
ablaufen als bei Erwachsenen. Die aktivierten B-Zellen reifen meistens zu Gedächtniszellen und nur
seltener zu Plasmazellen, wodurch die Antikörperproduktion nach Antigenexposition ziemlich begrenzt
bleibt.
Viertens werden in kleinen Kindern nach Antigenexposition viel weniger Plasmazellen aus den
sekundären Lymphorganen in das Knochenmark wandern. Auch ihre Chancen aufs langfristige
Überleben im Zytokin-Millieu eines jungen Knochenmarks sind deutlich geringer.
Also ist in Kleinkindern die Umwandlung von mit hochaffinen BZR ausgestatteten B-Zellen in
entsprechenden Plasmazellen, aus den oben genannten Gründen, limitiert. Eine langfristige Immunität
könnte jedoch immer noch, durch B-Zellen mit niedrigaffinen BZR, bzw. ihren Gedächtniszellen
gesichert werden. Interessanterweise aber, aus Gründen die bis heute noch nicht vollkommen geklärt
worden sind, dies ist nicht der Fall. Gedächtniszellen welche in Kleinkindern erzeugt werden haben
eine begrenzte Lebensdauer, und bleiben nie ein Leben lang erhalten. Zum Beispiel in Erwachsenen,
welche als Säuglinge eine Hepatitis B-Infektion überstanden haben, kann man HepB-spezifischen BGedächtniszellen bzw. Schutz gegen das Virus nicht mehr nachweisen.
7.2.2.

Impfung-Strategien für Kleinkinder und Personen in hohem
Alter
Verbesserte Aktivierung von naiven B-Zellen: neue Adjuvantien sind in der Lage durch
spezielle Immunomodulation die Erreichbarkeit des Vakzins zu erhöhen: z.B. in dem neuesten
Hib Vakzin wird nicht mehr das reine Hib Kapselpolysaccharid als Impfstoff benutzt, sondern
es wird zu einem Dyphterietoxoid Protein als Träger gekoppelt, und der dabei entstandene
sog. Konjugat-Impfstoff wird angewandt.

Beschleunigung der Wanderung von naiven B-Zellen in die sekundären Lymphorgane, und
der Aufbau von reifen Keimzentren: mit höherer Antigendosis, oder mit Hilfe eines VakzinDepots (z.B. in der Fluval-P Vakzin wird das Antigen in ein Aluminium-Phosphat Gel
eingebettet, welches das Antigen nur langsam, über eine längere Zeit gleichmäßig verteilt,
freisetzt), oder damit, dass die Grundimmunisierung selbst auch aus mehreren Impfungen
besteht, welche dafür sorgen, dass das Antigen kontinuierlich im Körper erhalten bleibt. Nur
später, in weiteren unabhängigen Schritten erfolgen die Auffrischimpfungen. Beispielsweise in
der
Diphtherie-Keuchhusten-Wundstarrkrampf-Kombinationsimpfungen
wird
die
Grund-
immunisierung selbst aus drei Schnitten bestehen (I/a, I/b, I/c) die für Kinder im Alter von 2, 3
und 4 Monaten verabreicht werden müssen.

Verstärkung der Aktivierung der naiven B-Zellen: dies wird erreicht mit höheren Antigendosen
und mit wirksameren Adjuvantien.

Unterstützung der Differenzierung von Plasmazellen: dies kann man in erster Linie mit
besseren Adjuvantien erreichen.
121

Stabilisierung des Gedächtnis für mehrere Jahrzehnte: durch Auffrischimpfungen, also
wiederholte Exposition auf niedrige Dosen des Antigens: z.B. die Tetanusimpfung muss alle
10 Jahre wiederholt werden.
7.3. Arten von Impfstoffen
Impfstoffe werden auf die unterschiedlichsten Arten und Weisen klassifiziert. Eine mögliche,
praktische Einteilung ist wie folgt:
Ganzpartikelimpfstoffe/Vollvakzine:

Attenuierter Lebendimpfstoff

Totimpfstoff / inaktivierter Impfstoff

Lebender rekombinanter Impfstoff
Untereinheitimpfstoffe/Spaltvakzine:

Proteinimpstoffe

syntetische Peptidimpstoffe

DNA (RNA) - Vakzine
Gegen den selben Erreger werden oft mehrere Impfstoffe von den unterschiedlichsten Typen
entwickelt. Eines der besten Beispiele für diese Tatsache war vielleicht die große Auswahl von
Influenzavakzine, welche alle gegen das 2009-2010 H1N1 Influenzavirus entwickelt und für die
klinische Anwendung irgendwo in der Welt zugelassen worden sind.
Ganzpartikelimpfstoff
mit inaktivierten
(zerstörten) Viren
Spaltvakzin mit durch
Detergentien
aufgelösten und
inaktivierten Partikeln
Spaltvakzin
bestehend aus, von
inaktivierten Viren
gereinigten
Hemagglutinin und
Neuraminidase
(Oberflächenantigene
des Virus)
Ganzpartikelimpfs
toffe mit
attenuierter
Lebendimpfstoff,
kälte-adaptierte
Virusstämme, also
mit nicht
pathogenischen
ganzen lebenden
Viren
Baxter (EMEA),
8 Hersteller in China,
Novartis (USA)
Medimmune (USA)
Omninvest + AlPhosphat Adjuvans
(Ungarn),
CSL (Australien, USA)
Novartis + M59
Adjuvans (EMEA)
Microgen
(Russland
Cantacuzino
(Rumänien)
Sanofi Pasteur (USA),
Green Cross (Korea),
GSK+ASO3 Adjuvans
(EMEA, Kanada)
Tabelle 7.3. Arten der zugelassenen monovalenten Impfstoffe gegen das 2009-2010 Influenza
(Quelle: WHO).
122
7.4. Neue Wege in der Impfstoffentwicklung
1. Weiterentwicklung von gängigen Vakzinen
2. Entwicklung von neuen Vakzinen
3. Experimentelle Methoden  biotechnologische Entwicklung von Vakzinen
Die wichtigsten Ziele in der weiteren Verbesserung der heutigen Vakzine sind immer die Steigerung
der Immunogenität, und die Verminderung der Toxizität der Impfung. Um die Immunogenität der
Impfung zu steigern muss nicht nur das bestmögliche Epitop, sondern auch ein geeignetes Adjuvans,
und der wirksamste Weg der Verabreichung des Impfstoffes ausgewählt werden. Um dagegen die
Toxizität möglichst minimalisieren zu können, also die Sicherheit des Impfstoffes soweit wie möglich
zu erhöhen, muss gesichert werden dass

das angewandte Adjuvans die kritischen Eigenschaften einer protektiven Immunantwort nicht
kompromittiert (z.B. Th1/Th2 Gleichgewicht, idealer Isotyp der produzierten Antikörper, usw.)

der Impfstoff durch Ähnlichkeit zu menschlichen Antigenen keine Autoimmunreaktionen auslöst
(Molekulare Mimikry)

der Impfstoff in einer reinen Form bereitgestellt werden kann (keine Kontamination mit aktiven
Erregern, Bestandteile von anderen Mikroorganismen, Prionen, toxische Derivate des Impfstoffes
oder Chemikalien angewandt in der industriellen Prozessieren, usw.),

der Impfstoff möglichst keine stabilen oder auf gar keinen Fall vererbbaren Änderungen im Genom
des Patienten hervorruft (dies gilt in erster Linie für DNA und RNA-Vakzine).
7.4.1.
Verbesserung von gängigen Vakzinen
Im Falle der attenuierten Lebendimpfstoffe wird Immunität gegen ein, im Großen und Ganzen
intaktes, lebendes Pathogen erzeugt, dessen Virulenz aber künstlich vermindert worden ist. Dieses
attenuierte Pathogen kann entweder eine modifizierte, weniger virulente Form, oder ein eng
verwandter nicht oder weniger virulenter Stamm oder Variante des eigentlichen Pathogenes sein. So
oder so, erzeugt das attenuierte Pathogen zwar Immunität gegen das eigentliche Pathogen durch die
Ähnlichkeit ihrer Antigene (also durch Kreuzreaktion), es verfügt aber über keine nennenswerte
Virulenzfaktoren, weswegen es relativ harmlos ist, es in den Körper eines naiven Menschen
einzuführen.
Zum Beispiel zur Impfung gegen Influenza werden oft solche Influenzaviren benutzt, die über eine
längere Zeit nicht in menschlichen Zellen, sondern in den Zellen eines anderen Tieres kultiviert
worden sind (oft in Affenzellen). Im Laufe der Kultivierung in einem fremden Wirtsorganismus adaptiert
sich das Virus mit einer Reihe von Mutationen an die neue Umgebung. Dabei entstehen, unter
anderem, auch solche Viren, welche die Zellen des ursprünglichen Wirtes immer noch infizieren
können, sich in dieser alten Umgebung aber nicht mehr vermehren können. Diese Variante wird als
Impfstoff benutzt, wodurch eine limitierte Infektion und eine volle Immunantwort gegen das
ursprüngliche pathogene Virus ausgelöst wird, ohne aber eine produktive, also potentiell gefährliche
Infektion zu riskieren. (Abbildung 7.9.)
123
Abbildung 7.9. Attenuierung von menschlichen Viren durch Kultivierung in tierischen Zellen.
Attenuierung kann auch durch künstliche
Mutagenese
werden.
oder
Zum
Gendeletion
Beispiel
im
erreicht
Falle
von
Influenzaviren ist der häufigste Virusstamm
von Jahr zu Jahr anders. Deswegen werden
die saisonalen Influenzaimpfungen jedes Jahr
in
der
Industrie
durch
Mutagenese
so
verändert, dass sie gegen die, im jeweiligen
Jahr am wahrscheinlichsten auftauchende
neue Varianten, Immunität sichern. Natürlich
müssen
solche
Verfahren
strengstens
überwacht werden, damit das attenuierte, mit
der Impfung verabreichte Virus weder durch
neue Mutationen noch durch Rekombination,
seine Virulenz zurückgewinnen kann.
Ein gutes Beispiel für attenuierte Vakzine,
deren
Weiterentwicklung
ein
dringendes
Problem ist, ist das BCG Vakzin. Der gegen
Tuberkulose
(Mycobacterium
tuberculosis)
eingesetzte Impfstoff beinhaltet ein durch
gezielte
Züchtung
Bakterium,
das
erzeugtes
Bacillus
verwandtes
Calmette-Guérin
(BCG). Dies ist ein Mycobacterium bovis
Stamm,
dessen
Genom
mehrere
Gendeletionen beinhaltet und deswegen stark
attenuiert ist, aber wegen gemeinsamen
Antigenen eine Kreuzreaktion gegen das M.
Abbildung 7.10. Entwicklung von inaktivierten, nicht
pathogenen Mutanten eines Erregers.
124
tuberculosis auslöst. In vielen Ländern ist zwar die Bevölkerung virtuell vollständig mit BCG geimpft
worden, dennoch kehrt Tuberkulose in den letzten Jahrzehnten fast überall in der Welt zurück. Heute
steht schon fest, dass trotz dem anfänglichen Erfolg, die Wirksamkeit der Impfung über die Jahrzehnte
ständig nachgelassen hat. Heute schon gibt sie keinen vollen Schutz mehr gegen TBC. Andererseits
ist sie immer noch effizient genug gegen die schwersten und lebensbedrohlichen Formen von TBC:
der Miliartuberkulose und der tuberkulösen Meningitis. Wegen der verminderten Wirksamkeit haben
mehrere Länder (z.B. Deutschland) die BCG-Impfung aus dem Impfkalender gestrichen, weil andere
(z.B. Ungarn) die Impfung immer noch anwenden. Eine vergleichende Genomanalyse der BCG
Stämme der Vakzin und der heute häufigsten M. tuberculosis hat bewiesen, dass durch die ständige
künstliche Kultivierung der BCG, Mutationen entstanden sind. Durch diese Mutationen ist der BCG
Impfstoff in dem menschlichen Wirtsorganismus nicht mehr so aktiv wie seine ursprünglichen Formen
vor Jahrzehnten, als die Impfung eingeführt worden ist. Dies ist der Grund, warum die heutigen BCG
Vakzine das Immunsystem nicht mehr so wirksam aktivieren, wie vor einigen Jahrzehnten.
Im Falle der Untereinheitimpfstoffe beinhaltet das Vakzin nur ein Teil des Krankheitserregers, ein
Molekül oder ein molekulares Fragment welches das protektive Epitop trägt. Zum Beispiel beinhalten
manche Influenza Vakzine nur gereinigtes Hemagglutinin und Neuraminidase Proteine. Also nur die
wichtigsten Oberflächenantigen des Virus und alle anderen Komponente des Virus werden während
der Herstellung des Vakzins entfernt.
Für die Weiterentwicklung der Untereinheitimpfstoffe ist das beste Beispiel vielleicht die neueste
Generation des Hib (Haemophilus influenzae B) Vakzins für Kleinkinder, welche Hib-verursachte
Meningitis und Epiglottitis vorbeugen. Die ursprüngliche Form des Vakzins beinhaltete nur gereinigtes
H. influenzae Kapsel-polysaccharid. Es hat sich aber herausgestellt, dass dieses Vakzin in der Praxis
nicht immunogen genug war. In der heute benutzten Form des Anti-Hib Vakzins ist deswegen das
Kapselpolysaccharid zu einem Carrier-Protein gebunden. Da dieser Konjugatimpfstoff sowohl aus
einem TI Polysacharid-, als auch aus einem TD Peptidantigen besteht, ist das Vakzin in der Lage
beide (TD und TI) Antigenantworten auszulösen. Das Carrier-Protein PRP-D (Polyribosil-RibitolPhosphat-Diphtherietoxoid) regt spezifische T-Zellen an, die durch Ihre Zytokinsekretion so ein
Zytokin-Milieu kreieren, welches auch die Aktivierung von B-Zellen unterstützt. Diese erkennen nicht
das Protein, sondern die Zuckerkomponente des Impfstoffs. (Das PRP-D Toxoid ist ein Exotoxin,
dessen Toxizität durch Formaldehydbehandlung eliminiert wurde, ohne dabei seine Immunogenität zu
verringern).
7.4.2.
Biotechnologische Impfstoffentwicklung
Rekombinate Proteinvakzine werden hergestellt indem Gene von bestimmten immunogenen
Proteinen eines Krankheitserregers kloniert, in eine Zellkultur (oft Hefezellen) transgenenetisch
eingeführt, und exprimiert werden. Auf diese Weise wird zum Beispiel das heutige Vakzin gegen
Hepatitis B industriell hergestellt. Dazu werden Hefezellen verwendet, welche ein Kapsidprotein des
Virus in industriellen Mengen sekretieren.
Neulich wird aber neben Bakterien, Hefe und ähnliche Einzeller, oder menschliche Zellen auch mit
pflanzlichen Zellen experimentiert. Dies verspricht neue Wege der Verabreichung von Impfstoffen:
Falls essbare Pflanzen auch Proteine von Krankheitserreger transgenisch exprimieren könnten, wäre
es möglich, Vakzine einfach als Essen zu verabreichen. Beispielsweise wurde das Choleratoxin B-t
schon erfolgreich transgenetisch in Kartoffeln eingeführt und exprimiert. In Mausexperimenten konnte
so sowohl lokal, als auch systemisch die Bildung von Antikörpern hervorgerufen werden.
Bei der neuesten Generation des Vakzins wird das Ziel der verbesserten Immunogenität häufig
durch eine vorsichtige Selektion des besten Epitops bzw. Adjuvans erreicht. Vor allem bei
experimentellen synthetischen Peptidvakzinen liegt der Schwerpunkt in der Identifizierung oder
Erzeugung von den bestmöglichen T- und B-Zell-Epitopen. Herstellung von solchen Vakzinen kann
entweder mittels konventioneller Laborstrategien oder durch die sogenannte in silico (durch
Computer-basierte) Epitop-Analyse erreicht werden.
Konventionelle (wet lab) Strategie:

Der
Krankheitserreger
Komponente
werden
konventioneller
bzw.
mit
seine
Hilfe
von
Labortechnologie
vermehrt oder einzeln kloniert,

überlappende Peptide dieser Antigenproteine werden einzeln synthetisiert,

und letztlich wird ihre Immunogenität
einzeln
ausgewertet
um
die
besten
Epitope für das Vakzin zu finden.
Reverse (in silico) Strategie:

Die Analyse geht nicht, wie gewöhnlich,
von
dem
Pathogen
oder
ihren
Komponenten aus, sondern aus seinem
Genom, also der Sequenz welche diese
Eigenschaften
bestimmt
(reverse
Strategie).

Die
genomische
Sequenz
bioinformatischen
Techniken
wird
mit
analysiert
(Computer-basierende, also “in silico“
Analyse), um die bestmöglichen Epitope
zu finden, ohne dabei alle Komponente
des Pathogens manuell in einem Labor
analysieren zu müssen. Nur die Antigene
oder Epitope, welche in der ComputerAnalyse am vielversprechendsten waren,
werden kloniert oder synthetisiert,

und letztlich wird ihre Immunogenität
ausgewertet um die besten Epitope für
das Vakzin zu finden.
Abbildung 7.11. Die Entwicklung von einem Vakzin
gegen Malaria.
126
Weil wir uns mit der Epitop-Prädiktion in einem anderen Kapitel im Detail beschäftigen, werden wir sie
hier nur kurz, am Beispiel der Entwicklung eines zukünftigen Malaria-Vakzins erklären.
Populationsgenetische Untersuchungen haben ergeben, dass eine allelische Variante des MHCI,
nämlich HLA-B53, stark mit einem genetisch bedingten Schutz vor Malariainfektion assoziiert ist. Als
antigenpräsentierendes Protein bindet das MHCI Variante HLA-B53 solche Nonapeptide, in denen in
der zweiten Aminosäure-Position ein Prolin steht. Da die genomische Sequenz und dadurch alle
Proteine des Erregers schon seit Jahren bekannt sind, kann man aus der genomischen Bibliothek
auch eine Peptidbibliothek von Malaria erzeugen. Aus so einem Katalog aller möglichen
Peptidfragmente der Proteine von Malaria, kann man auch alle Nonapeptide mit einem Prolin als
zweite Aminosäure auswählen. In der Entwicklung eines zukünftigen Malaria-Vakzins werden diese
Peptide künstlich synthetisiert, und es wird getestet, ob sie 1) tatsächlich zum HLA-B53 binden
können 2) wenn ja, dann ob sie in mit Malaria infizierten Personen eine T-Zell-Antwort auslösen
können 3) wenn ja, ob sie protektiv wirken und als Vakzin anwendbar sind. Dieses Vakzin sollte
theoretisch effizient wirken, aber natürlich nur in solchen Personen, welche HLA-B53 tragen. Aus
diesem Grunde muss man ein Vakzin herstellen, welche nicht nur aus diesem Peptid, sondern aus
einer Mischung von Peptiden besteht, welche die häufigsten MHC-Varianten binden können, und
dadurch der Mehrheit der Population Schutz vor Malaria verleihen.
Eine alternative Lösung für dieses Problem wäre die sogenannte Epitop Affinität-Steigerung (epitopenhancement). Dies kann man mit zwei möglichen Strategien erreichen:
MHC Affinität-Steigerung: Von den häufigsten Allelvarianten der MHC Proteine ist es meistens
bekannt, Peptide welcher Länge sie bevorzugt binden, bzw. was für welche Aminosäure(n) und
welcher Abschnitt genau in der gebundenen Peptidsequenz am wichtigsten für eine starke Bindung
ist. Mit Hilfe dieser Information ist es möglich die Peptide eines Vakzins so zu modifizieren, dass sie
an dieser kritischen Stelle(n) die Aminosäure(n) mit höchster Affinität zum häufigsten MHC Moleküle
beinhalten, während die immunogenen Aminosäuren, also diejenigen, die nicht zum MHC, sondern
vor allem zum TZR binden, unverändert bleiben. Mit anderen Worten, durch gezielte Manipulation der
Peptidsequenz ist es möglich die Bindung zum MHC zu verstärken ohne dabei die Bindung zum TZR
zu vermindern.
TZR Affinität-Steigerung: Bei vielen Tumorvakzinen ist es ein Ziel die Anzahl der T Zellen, welche die
Tumor-Epitope erkennen, auf ein mögliches Maximum zu steigern. Durch Manipulation der
Peptidsequenz ist es machbar, dass bestimmte TZRs und dadurch bestimmte T Zell Populationen
aktiviert werden, während andere gar nicht. Oder dass z.B nur. hochaffine T-Zell-Klone, nicht aber
niedrigaffine Klonen induziert werden. Auf ähnlicher Weise werden bei manchen neuen
experimentellen Virusvakzinen solche Peptide angewandt, welche gegen nicht nur einen, sondern
gleichzeitig mehreren Stämmen des Virus protektiv wirken. Sie beinhalten ein bioinformatisch
bestimmtes und synthetisch hergestelltes Peptid (ein sog. Peptidchimäre), welches in keinem der
natürlichen Virusvarianten vorkommt, jedoch durch seine überlappenden Teile gegen eine Vielzahl der
natürlichen Virusvarianten eine Immunantwort auslöst.
Bezüglich der synthetischen Peptid-Vakzine muss letztlich auch bemerkt werden, dass reine Peptide
von dieser Größe meistens kaum immunogen sind. Ihre Aufnahme durch APZs und die Reifung der
APZ muss künstlich, durch die Impfung unterstützt werden. Bei Peptid-Vakzinen werden hierzu oft
ISCOMs (immune stimulatory complex) benutzt, welche Liposom-ähnliche Lipidkomplexe sind. Sie
dienen nicht nur als Carrier für die Peptide, sondern durch Membranfusion mit der APZ sorgen sie
auch für ihre intrazelluläre Aufnahme und gleichzeitig üben sie eine immunstimulierende Wirkung auf
die APZ aus. Ein weiterer Vorteil der ISCOMs in der Virusvakzination ist, dass mittels ISCOMs
gelieferte exogen zugegebene Peptide wegen der Membranfusion in dem intrazellulären Raum der
APZ gelangen. Deswegen werden sie als endogene Peptide bearbeitet, und in erster Linie auf MHCI
präsentiert, So können antivirale CD8+ T Zellen stark induzieren werden.
Das DNA–Vakzin ist eine durch Genmanipulation hergestellte rekombinante DNA-Sequenz.
In der einfachsten Form besteht ein DNA-Vakzin aus einem Vektor mit einem eingebauten Gen,
welches für das für die Vakzinierung verwendete Antigen kodiert. Der Vektor sorgt dafür, dass das
Gen in die Zellen des Patienten eingeführt und exprimiert wird, wodurch eine Immunantwort gegen
das Antigen aufgebaut werden kann. Auf ähnlicher Weise werden in manchen experimentellen
Vakzinierungsversuchen auch Immunisierungen gegen Gen-Bibliotheken, also praktisch alle Gene
eines Erregers, versucht.
Nackte DNA Vakzine, in denen das Vektor einfach ein bakterielles Plasmid ist, sind in einer reinen
Form relativ einfach herstellbar, weswegen sie in Vergleich mit anderen Vakzin-Arten als sehr sicher
gelten. Dazu kommt, dass ein Plasmid, als bakterielle, also unmethylierte CpG DNA, durch die
Aktivierung von TLR9 auch immunstimulatorisch auf das Immunsystem wirkt. Obwohl diese
Technologie für menschliche Behandlung noch nicht zugelassen ist, ist sie definitiv vielversprechend
und wirkt oft gut in Tiermodellen, wo das Plasmid häufig mit einer sog. “gene gun“ in den Körper
eingeführt wird. Dies ist ein Kanonen-ähnliches Instrument welches mit Hilfe von komprimiertem
Heliumgas mikroskopische Gold oder Platinpartikel in die Haut, und dadurch auch in die unterhalb
gelegenen Muskelzellen schießt. Die Partikel tragen das Plasmidvektor auf ihrer Oberfläche, wodurch
der Vektor in die Zellkerne von Haut- und Muskelzellen gleichzeitig eindringt.
Dennoch ist ihre
Effizienz unter in vivo Umständen relativ niedrig, weswegen intensive Forschung getrieben wird um
andere mögliche, z.B. virale Vektoren auszuprobieren. Mit den Arten, Eigenschaften, Vor- und
Nachteilen, und Anwendungsbereichen der unterschiedlichen gentechnologischen Vektoren werden
wir uns im Detail im Fach Genetik beschäftigen.
Abbildung 7.12. DNA-Vakzin.
128
7.4.3.
Entwicklung von neuen Vakzinationsverfahren
Für allerlei Vakzinationen stellt die gezielte Verabreichung des Antigens eine Herausforderung von
kritischer Bedeutung dar. In experimentellen Vakzinen wird deswegen häufig die Immunisierung mit
dendritischen Zellen: ausprobiert. Theoretisch soll sie einer der besten Wege sein, um ein Antigen
sicher und gezielt in die sekundären Lymphorgane einzuführen.
Diese Technologie beruht auf körpereigenen Monozyten, welche aus dem Blut der zu impfenden
Person einfach isoliert werden und mit Hilfe von geeigneten Zytokinen in vitro in dendritische Zellen
(DC) umgewandelt werden können (siehe Kapitel über Zellkultur). Solche DC sind dann relativ einfach
mit Antigenen aufzuladen und in den Körper zurückzuführen. Mit Antigenen geladene DC lösen
schnell antigenspezifische T-Zell-Antworten aus, und weil sie ohne Entzündung, also ohne eine
parallel erscheinende Welle von inflammatorischen Zytokinen in den Lymphknoten auftauchen,
werden sie relative wenig T-Effektor-, dagegen viel T-Gedächtniszellen erzeugen. Weil die
Technologie für einfache Impfungen heute noch relativ umständlich und kostspielig ist, wird die
Vakzination mit DC in erster Linie für Tumorvakzine entwickelt. Auch da bei diesen Krankheitsbildern
die Erzeugung einer starken T-Zell-Antwort absolut essentiell ist.
Übersetzt von Zoltán Pós
129
8. ZELLKULTUREN
(SÁRA TÓTH)
8.1. Definition der Zell- und Gewebekultivierung, Typen und Formen
der Kulturen
Bei der Zell- und Gewebekultivierung werden die tierischen oder pflanzlichen Gewebemuster in vitro
(d.h. in Reagenzglas in Laboratoriumsumständen) entweder zur Erhaltung oder zur Zellvermehrung
gezüchtet. Im weiteren fassen wir die Informationen für die tierischen/humanen Gewebeproben
zusammen.
Für die Kultivierung vorgesehenen Gewebemuster können entweder durch eine Biopsie, durch eine
Operation oder unmittelbar nach dem Tod entnommen werden. Abhängig von der Grösse und
Beschaffenheit der, aus dem Körper entnommenen Gewebeprobe, sind drei Hauptsorten der
Kultivierung unterschieden: Organkultur, Gewebekultur und die Zellkultur

Unter Organkultur versteht man im wahren Sinne des Wortes keine eigentliche Züchtung des
Organs, sondern es wird lediglich das Überleben der organbildenden Zellen gesichert, wodurch das
gegebene Organ und dessen Funktionen aufrechterhalten wird. Im Grunde genommen werden die
Organe zwischen der Organentnahme bis zur Transplantation (einige Stunden dauernde Zeitspanne)
in einer Organkultur (Organaufrechterhaltung) aufbehalten. Für die Herstellung einer Organkultur
verwendet man am häufigsten entsprechend kleine, embryonale Organe, wobei auch eine begrenzte
Zellvermehrung und -Differenzierung stattfinden kann.

Im Fall der Herstellung einer Gewebekultur wird vom Körper eine entsprechend kleine
Gewebeprobe entfernt, und ihre ursprüngliche histologische Struktur behaltend wird das Gewebestück
unter künstlichen Umständen erhalten. Während der Kultivierung vermehren sich die Zellen der Probe
jedoch nur in begrenzter Anzahl.

Am häufigsten verwendetes Kultivierungsverfahren ist die sog. Zellkultur, wobei Zellen eines
aus dem Körper entfernten (gesundes oder tumoriges) Gewebestückes (meistens mit Hilfe bestimmter
proteolytischer Enzyme) isoliert werden. Die derartig gewonnenen, miteinander nicht in der
gewöhnlichen Gewebearchitektur vorhandenen Zellen bleiben erhalten und vermehren sich sogar.
Die drei Sorten der Zellkulturen sind die primäre Zellkultur, der Zellstamm und die Zellinie.

Eine primäre Kultur ist der eigentliche Beginn jeglicher Kulturen, wobei die Zellen aus direkt
aus dem Körper entnommenen Gewebe stammen: die Zellen des Gewebestückes werden so
voneinander und auch von der extrazellulären Matrix isoliert, dass nur ein einziger Zelltyp für
das Kultivierungsverfahren übrig bleibt. Wenn, die in vitro Umstände entsprechend sind,
werden die Zellen nicht nur überleben, sondern beginnen sich auch zu vermehren, und für
den Zelltyp charakteristische physiologische Parameter zeigen.
130
In dem Fall, indem die Zellen sich vermehren und weiterhin züchtbar sind, entstehen für uns
zwei Möglichkeiten:
 Entweder es entsteht ein sog. Zellstamm, der nur für begrenzte Zeit (einige Wochen,
Maximum einige Monate) aufrechterhalten werden kann, aber alle physiologischen Parameter,
dem Zelltyp entsprechend, zeigt. Die Chromosomenzahl der Zellen bleibt der Art
entsprechend auch normal.
 Oder es entsteht eine sog. Zellinie, die aus sog. transformierten Zellen besteht. Diese Zellen
sind am häufigsten aneuploide, d.h. ihre Chromosomenzahlen weichen von arttypischen
Chromosomenzahlen ab, werden aber unsterblich, sozusagen für unbegrenzte Zeit (Jahren,
Jahrzehnten lang) haltbar. Sie zeigen weder die arttypischen physiologischen, noch die
Gewebeeigenschaften, oder es sind nicht alle Eigenschaften/Funktionen vorhanden. Die
Zelltransformation kann spontan während der in vitro Kultivierung entstehen, oder schon vor
der
Entnahme
im
Gewebe
vorhanden
gewesen
sein
(z.B.
bei
Tumorgeweben).
Wahrscheinlich ist die bekannteste humane Zellinie die HeLa-Zellinie. Diese Kultur wurde von
Gebärmutterkrebs (cervicales Adenocarcinom) Frau Henrietta Lachs in USA im Jahre 1951
entnommen, und wird seit dem kultiviert, und diese Zellinie ist bis heute erhalten geblieben!
Die Zellen der Zellstämme und Zellinien werden in einem speziellen Nährmedium, welches 10%
krioprotektive Substanz (in allg. Dimethylsulphoxide /DMSO/ oder Glyzerin) enthält, gefroren und in
flüssigen N2, bei -196 °C in sog. Zellbänken langzeitig erhalten. Grosse internationale Zellbänke
(www.atcc.org und www.hpacultures.org.uk) geben uns die Möglichkeit, bestimmte Untersuchungen
(wie z.B. eine Arzneimitteltestung) in unterschiedlichen Zeitpunkten und geographischen Orten an
denselben biologischen Objekten durchführen zu können. Dieses bewirkt eine ausserordentliche
Reproduzierbarkeit und Vergleichbarkeit der Versuchsergebnisse.
Die Zellkulturen – Abhängig von den Ausgangsproben – sind

entweder monolayer (einschichtige) Zellkulturen,

oder Suspensionskulturen.
In einer sog. monolayer (einschichtige, anhaftende) Zellkultur haften die Zellen an eine bestimmte
Unterlage (an Boden der Kulivierungsschale), breiten sich aus und bilden so eine einzige Zellschicht.
Die Zellen benötigen enge Zell-Matrix und oft auch enge Zell-Zell Beziehung, d.h, man soll für
Kultivierung haftungsfähiger Zellen einen entsprechenden Nährboden und Matrix anbieten.
Eine Suspensionszellkultur ist für Zellkulturen, die aus hämatopoetischen Zellen stammen
charakteristisch; diese Zellen benötigen während der Kultivierung keine Matrix, Zell-Zell Kontakte sind
nicht charakteristisch. Seltener, jedoch möglich ist auch die stark transformierten Zellen in
Suspensionskulturen zu erhalten, da diese Zellen für die normalen Zellen charakteristische
Fähigkeiten wie die sog. Kontakthemmung (d.h. die Vermehrungsfähigkeit der Zellen ist von
Zelldichte abhängig) oft schon früher verloren haben. In einer monolayer Zellkultur (Zellkultur
angehafteten Zellen) werden die Zellen durch Vermehrung früher oder später einander erreichen, so
kommt eine Zelle mit Zahlreichen anderen Zellen in Berührung, und wegen dieses Kontaktes wird die
Vermehrung der normalen (nicht transformierten) Zellen gehemmt. Sonstige Funktionen werden
131
jedoch nicht geschädigt. Für transformierte Zellen ist die Kontakthemmung nicht typisch; sie teilen sich
weiter, wachsen aufeinander zu und gestalten damit eine mehrreihige Zellkultur, im extremsten Fall
können sie sich sogar auch in einer Zellsuspension weiter vermehren.
8.2. Für eine Zellkultur notwendigen Voraussetzungen
Für die Zellkulturen (für das Aufrechterhalten ihrer Funktionen und um die Zellvermehrungsfähigkeiten
zu sichern) müssen die im lebenden Organismus vorhandenen Zustände ziemlich genau nachgeahmt
werden. Physikalische Parameter (z.B. Temperatur, osmotischer Druck), chemische Parameter (z.B.
pH, CO2-Konzentration, entsprechende Konzentration der Nährstoffe usw.) sowie die biologischen
Parameter (z.B. extrazellulärer Matrix) müssen dem lebendigen Organismus entsprechende Werte
erreichen oder annähern.
Gelöste
Substanzen
Zell – Zell-
Zell – MatrixWechselwirkungen
Wechselwirkungen
Physikalische
Parameter
Nährmedium
Zellwechselwirkungen:
Kultivierungsoberfläche z.B.
Temperatur
Blutserum
Homologe =:Zell-Densität
Kunststoff,
pH (Indikator + Puffer)
Hormone
Heterologe = gemeinsame
Kultivierung (coculture)
Glas,
Membrane,
Oxygen-/KohlendioxidKonzentration
Metaboliten und Produkte
Mikroperlen
Wasserdampfgehalt
Autokrine und Parakrine
Wirkung
Überzug (coat) z.B.
Osmolarität
Kollagen,
Statische oder
dynamische Kultur
Wachstumsfaktoren
Haftungsfaktoren
Stoffwechselrate
Gelatine,
feeder layer (nährende
Zellschicht)
Matrixgel, Biomatrix
Tabelle 8.1. Notwendige Umstände der Zellkulturen
Für Kultivierung tierischer Zellen braucht man irgendwelche flüssigen oder seltener (in erster Linie im
Fall der Kultivierung der hämatopoetischen Zellen) halb-flüssige (semi-soliden) Mittel, sog.
Kultivierungsmedium
(Nährmedium).
Diese
sind
synthetische
Medien,
d.h.
ist
ihre
Zusammensetzung bekannt, und sie beinhalten die notwendigen Salze, Aminosäuren, Kohlenhydrate,
Nukleotiden und Vitamine.
Das energiesichernde Kohlenhydrat ist am häufigsten Glukose, seltener benutzt man Fruktose oder
Galaktose. Der durchschnittliche Zuckergehalt beträgt vom 1,0 g/l bis 4,5 g/l. Höheren Zuckergehalt
benötigen die sich schnell teilenden embryonalen und die Tumorzellen, oder die Glukose schnell
verbrauchenden (metabolisierende) glykolytisch sehr aktiven Zellen.
Die Nährmedien beinhalten auch einen Puffer (z.B. Phosphat oder HEPES) und einen Indikator (am
häufigsten
Phenolrot),
welche
ermöglichen
sowohl
die
Verminderung
der,
wegen
der
Stoffwechselvorgänge erfolgenden pH-Veränderungen, als auch die Nachfolgerungen einer pHÄnderung. Für die meisten Zellkulturen beträgt der optimale pH-Wert 6,8 - 7,2.
132
Weil die Zellen für normale Funktionen auch bestimmte Proteine (wie z.B. Wachstumsfaktoren, usw.)
und Lipide benötigen, müssen auch diese Substanzen gesichert werden, am häufigsten durch Zugabe
von tierischem Blutserum. Für die meisten menschlichen und tierischen Zellen entspricht das 5 - 10%ige fetale Kalbserum (FKS, fetal calb serum, FCS) enthaltende Nährmedien. Es wird kein humanes
Blutserum benutzt, weil einerseits dessen Zugänglichkeit begrenzt ist, anderseits dessen
Sicherheitsrisiko (Infektionsgefahr) grösser ist. Weiterhin ist der Antikörpergehalt des fetalen
Blutserums sehr gering und mit Hitzebehandlung ist auch die Aktivierung des Komplementsystems
leicht eliminierbar. Das Blutserum ist kein synthetisches Zuschlagsmaterial, seine genaue
Zusammensetzung ändert sich von Charge zu Charge, deshalb können sich auch die Konzentrationen
der sich im Blutserum befindlichen wachstumsfördernden und wachstumshemmenden Faktoren stark
unterscheiden. (Zweckmässigerweise werden die Proben der einzelnen Chargen an den verwendeten
Zellkulturen vorgetestet.) Obwohl das Serum von kontrollierten, für die Abnahme gezüchteten Herden
gewonnen wird, wo das Vermeiden der mikrobiellen Kontamination (Bakterien, Mycoplasmen, Viren,
Prionen, Pilze) strengstes kontrolliert ist, wird für die sehr empfindlichen Zellkulturen Blutserum aus
Südamerika (wo BSE noch nicht vorgekommen war) empfohlen.
Wegen dieser eigenartigen Problematik werden zur Zeit, immer intensiver, synthetische, mit bekannter
Zusammensetzung Serumersatzmittel benutzt. Ihre breite Verwendung ist jedoch wegen des hohen
Preises begrenzt. In vielen Fällen wird sog. konditioniertes Medium verwendet, das jedoch nicht
anders ist als ein von anderen Zellkultur weggenommenes, „gebrauchtes“ Nährmedium, in dem die
gezüchteten Zellen verschiedene, sogar chemisch noch nicht definierte Substanzen abgegeben
haben. Dieses wird als Ergänzung zum frischen synthetischen Nährmedium der Zellkulturen von
gleicher oder von anderer Zellart gegeben, um eine sehr erfolgreiche Kultur zu erhalten
.Während der Kultivierung verbrauchen die Zellen die zur Verfügung stehenden Nährstoffe, und geben
gleichzeitig ihre Stoffwechselprodukte in das Nährmedium ab. Die Nährflüssigkeit wird dadurch nach
2-3 Tagen verbraucht und muss entfernt und mit frischer ersetzt werden (Nährmediumsaustausch).
Die Oben genannten Umstände entsprechen den Bedürfnissen auch der prokariotischen Bakterien
sehr gut, weshalb eine bakterielle Kontamination (Infektion) unbedingt verhindert werden soll. Zu einer
erfolgreichen Kultivierung sind strenggenommene eine sterile Umgebung (durch sterile Kabinen, sog.
Laminäre Boxen gesicherter Arbeitsplatz) und sterile Lösungen und Instrumente unbedingt
erforderlich.
Bezüglich der physikalischen Parameter sind für die meisten Zellarten 37 °C und 5% CO 2-Gehalt bei
80 – 90 % Luftfeuchtigkeit die besten Voraussetzungen. Dieses kann durch die sog. CO 2-Thermostate
(Blutschranke) gesichert werden. Die O2-Konzentration ist kein limitierender Parameter, denn die
atmosphärische O2-Konzentration ist den meisten Zellen vollkommen ausreichend. Gleichzeitig aber,
ist die im Körper vorkommende (d.h. für die Zellen notwendige) ca. 5% CO 2-Konzentration ein
Vielflaches der für die Atmosphäre typischen Konzentration (d.h. 0,035%). In bestimmten Fällen z.B.
bei den in der Molekularbiologie vorkommenden Transfektionsverfahren (Ca-Präzipitation) ist aber
eine niedrigere CO2-Konzentration erforderlich.
Für das Bebrüten der Zellen werden heute schon einweg-Kunststoff-Gefässe, sog. Petri-Schalen und
verschiedene Flaschen benutzt. Ihre Oberflächenstruktur und Fassungsvermögen (im Fall der
133
monolayer Zellkulturen) können abhängig der Versuchsanordnung unterschiedlich sein, von ganz
kleinen von 200—800 μl Volumen bis mehrere Liter betragene sog. „Zellfabriken“. Im Handel
angebotene Gefässe können von der Fabrik derart oberflächenbehandelt werden, dass die meisten
Zelltypen für ihre Haftung eine günstige adhäsive Oberfläche besitzen. Bestimmte Zellen werden
jedoch beim Vorhandensein einer entsprechenden extrazellulären Matrix empfindlich reagieren. Aus
diesem Grund bietet der Handel mit verschiedenen Matrix Komponenten (z.B. mit Kollagen, Laminin,
Ornithin, usw.) beschichtete Kultivierungsschalen an.
In gut proliferierenden adhesiven (monolayer) Zellkulturen kann die Schalenoberfläche limitierend
wirken, da diese einfach verbraucht wird. Deshalb müssen die Zellkulturen durch Aufteilung der
Zellkultur, die sog. Subkultivierung (Passagieren), auf neue Oberflächen übertragen werden. Dabei
müssen die Zellen enzymatisch (z.B. mit Trypsin oder mit Trypsin-EDTA) von der Gefässoberfläche
entfernt werden.
In einigen primären Zellkulturen die nicht aus einem embryonalen sondern aus einem erwachsenen
Organismus stammen, kann deren extrazellulärer Matrix, die von den Zellen produziert wird, reich an
Kollagen sein. In diesem Fall benutzt man für die Subkultivierung der Zellen solche Enzymgemische,
welche Kollagenase und/oder evtl. DNA-se enthalten. Die letzte ist wichtig für den Abbau evtl. aus
zugrundegegangenen Zellen freigewordene DNA. Es sind schnellwachsende Zellkulturen, deren
Zellen aus Tumorgewebe stammen; für ihre Passage ist eine 0,02%-ige EDTA Lösung, d.h. eine
2+
einfache Anbindung der Ca -Ionen genügend.
Wenn durch die enzymatische Behandlung der Kulturen die Zellen sich von der Oberfläche ablösen, –
wir überzeugen uns davon durch mikroskopische Untersuchung –, werden die Verdauungsprozesse
abgestellt. Dieses kann mittels spezifischer aber teuer Trypsin-Inhibitor oder durch die preisgünstigere
Variante, zum gegebenen Zelltyp verwendbare, protein- (d,h. Blutserum-)haltigen
Nährmedium
erreicht werden. Die dadurch entstehene Zellsuspension wird abzentrifugiert, und durch das
Abgiessen des Überstandes werden nicht nur die überschüssigen Enzyme, sondern auch die
Bruchstücke der Zellen entfernt. Wenn man nun zu denen, sich im Pelett befindlichen Zellen, neues
Medium zugibt, kann man eine neue Kultur anlegen.
Für empfindlichstere Zellen oder wenn das Ziel der Untersuchung die, in kleinen Mengen
vorkommenden Zelloberflächenmoleküle sind, können vom Handel angebotene verschiedene, nicht
enzymatische Systeme benutzt werden.
8.3. Zellzahlveränderungen und unterschiedliche
Zellzählungsmethoden
Bei verschiedenen Untersuchungsanordungen müssen Zellen mit gleicher Anzahl in Parallelkulturen
verwendet werden, nur
dadurch wird gesichert statistisch zuverlässige, auswertbare und
verlässlicherweise vergleichbare Ergebnisse zu erhalten. Dazu muss die Zellzahl der gegebenen
Zellkulturen bestimmt werden. Für die Zellzählung wird eine Zellsuspension benötigt (entweder sind
die Zellen von Anfang an in einer Zellsuspension kultiviert, oder im Fall einer monolayer Zellkultur
sollen - während der Subkultivierung - in Suspension gebracht werden).
134
Üblicherweise geschieht die Zellzählung m.H. von sog. Hämozytometer (Zählkammer nach Bürker).
Auf Grund, der mit einem Hämoztometer bestimmten Zellzahl ist die Anzahl der Zellen in 1 ml
Suspension kalkulierbar (Abbildung 8.1.). Neuerdings werden auch verschiedene Zählautomaten
verwendet.
Abbildung 8.1. Anwendung der Zählkammer nach Bürker
Aus der Sicht des Kultivierungsverfahrens ist die Anzahl der lebendigen Zellen viel wichtiger, als die
Gesamtzellzahl der Kultur, d.h. die Bestimmung der Anzahl der lebendigen Zellen spielt eine
ausserordentlich wichtige Rolle. Am häufigsten wird für die Bestimmung der Anzahl von lebendigen
Zellen die sog. Trypanblau Exclusions(Verdrängungs)methode benutzt. Die Zellen werden mit 0.04 %iger
Trypanblau-Lösung
gefärbt
(Zellsuspension/Farbstoffproportion
ist
1:10,
d.h.
für
die
Zellsuspension bedeutet es eine 10-malige Verdünnung), wobei nur die abgestorbenen Zellen
135
angefärbt werden. Lebendige Zellen lassen kein Farbstoff durch ihre Plasmamembran. (Im solchen
Fall wird in der zur Bestimmung der Gesamtzellzahl benutzten Formel noch der Faktor 10x – die
Verdünnung der Zellsuspension von Farbstofflösung – als Multiplikator aufgenommen.
Die Anzahl der lebendigen Zellen in 1ml Zellsuspension = die Anzahl im Hämozytometer über mit drei
2
Linien begrenzten Quadrant (deren Oberfläche 1 mm beträgt) betreffende mit Trypanblau nicht
4
angefärbten Zellen (keine blaue Zellen) x10 x10.
Die Zellzählung mit Hämozytometer ist zeitaufwendig, braucht Erfahrung, jedoch lässt grösseren
Raum für die individuelle Beurteilung – im Fall z.B. wenn der Zelltyp zur Klumpung neigt, was
ausgewertet werden soll und ob die einzelnen Zellen von kleineren Zellgruppen separiert werden
können. Zugleich arbeiten aber die Zellzählerautomaten (entweder anhand der elektrischen
Leitfähigkeit oder Lichtstreuung) im streng begrenzten Aussenmassenbereich; jede, von der Grösse
abweichende kleinere oder grössere Zellen, z.B. in der Anaphase sich befindende, elongierte oder
durch Mutation zu aneuploid oder polyploid gewordene Zelle, sowie durch Zellaggregation
entstandenen Zellgruppen werden von der Zählung ausgeschlossen, dadurch könnte eine heterogene
Zellpopulation als homogene behandelt werden. Andererseits besteht bei den Automaten keine
Möglichkeit für die Beobachtung der für den gegebenen Zelltyp charakteristischen morphologischen
Veränderungen/Abweichungen. Zweckmässigerweise soll die Art der Zellzählung nach Erfordernissen
des Laboratoriums, nach Erfahrung des Personals, nach den verwendeten Zelltypen (z.B. die
Bestimmung der Anzahl der Zellen in einem Suspensionskultur von hämatopoetischen Zellen ist
besser automatisierbar), und entsprechend der Versuchsrichtungen der Untersuchungen ausgewählt
werden.
8.4. Separations- und Selektionsverfahren der Zellen
Öfters ist die Ausgangskultur (primäre Zellkultur) noch heterogen, sie besteht aus unterschiedlichen
Zellen, da das Ursprungsgewebe verschiedene Zelltypen enthält; für die Untersuchung kann jedoch
nur ein bestimmter Typ von Zellen benötigt werden. Für Herstellung von einer homogenen
Zellsuspension, die nur einen einzigen Zelltyp beinhaltet, verwendet man entweder spezifische
Antikörper gegen den auf den gegebenen
Zelltyp charakteristischen Zelloberflächenmarker, oder die verschiedenen Zelltypen
können nach deren Grösse m.H. durch
Dichtegradientenzentrifugation
separiert
werden. In diesem Fall wird für die
Herstellung des Dichtegradientes FICOLL
(ein Gemisch von neutralen,
®
wasser-
löslichen, verzweigten Polysacchariden mit
grosser
Molekularmasse)
verwendet
(Abbildung 8.2.).
Abbildung 8.2. Mit Hilfe von Dichtegradientenzentrifugation erfolgte Leukozytenseparation
136
Heutzutage wird von den auf Antikörperbildung beruhenden Zellseparationsverfahren am häufigsten
das negative oder positive Selektionsverfahren m.H. von MACS-Mikroperlen benutzt (Abbildung
8.3.). Dem zu Folge werden Antikörper gegen charakteristische (d.h. in anderen Zellen nicht
vorhandenen) Oberflächenantigenen auf den zu selektionierenden Zelltyp an Oberflächen von
magnetische Nanoteilchen (Mikroperle) gebunden. Wenn die Zellsuspension über eine bestimmte Zeit
lang mit den magnetisierten (magnetmarkierten) Antikörpermolekülen inkubiert wird, werden die
Magnetteilchen durch auf ihren Oberflächen befindlichen Antikörpermolekülen zu den entsprechenden
Zellen,
die
den
Oberflächenmarker
tragen,
gebunden.
Auf
dieser
Weise
werden
die
oberflächenmarkertragenden Zellen magnetisch markiert, und die anderen Zellen, die die gegebenen
Oberflächenmarker nicht tragen, werden nicht markiert. Die magnetische Oberflächenmarkierung der
Zellen (d.h. die Anbindung der magnetisierten Antikörpermoleküle an den Oberflächenantigenen)
verändert weder die Zellstruktur, noch die Zellfunktion oder die Aktivität der Zelle.
Abbildung 8.3. Prinzip der magnetischen Selektion der Zellen
Die Zellsuspension, die aus einer Mischung von unmarkierten und markierten Zellen besteht, wird in
einer Säule (d.h. in einem Rohr) in einen sog. MACS Magnetseparator gestellt. Durch das im Gerät
herrschende magnetischen Kraftfeld werden die magnetisch markierten Zellen in der Säule
zurückgehalten, jedoch die unmarkierten Zellen nicht, die durch die Säule abfliessen und verlassen
das Gerät.
137
Bei dem sog. negativen Selektionsverfahren finden, die vom magnetischen Kraftfeld zurückgehaltenen
Zellen, kein Gebrauch mehr, nur die in der Durchflussfraktion vorhandenen unmarkierten Zellen. Auf
dieser Art wurde die Probe (d.h. die Zellsuspension) von den unerwünschten, die Untersuchung
störenden Zellen gereinigt.
Im sog. positiven Selektionsverfahren werden die jenige Zellen benötigt, die im Magnetseparator
zurückgehalten worden sind (d.h. welche markiert sind). Die durchfliessende Fraktion wird
abgegossen, die Säule wird vom Separator entfernt, ausserhalb des magnetischen Kraftfeldes
fliessen die magnetisch markierten Zellen durch die Säule; diese Zellfraktion kann für weitere
Untersuchungen aufgefangen und benutzt werden.
Im Fall der Untersuchung von Knockenmark- oder peripheren Blutzellen ist für die Separation des
gewünschten Zelltypes auch ein anderes, ebenso ein antikörperverbrauchendes, auf der
Rosettenbildung basierendes Verfahren geeignet (Abbildung 8.4.). Es wird ein spezifischer tetramer
Antikörperkomplex
verwendet
(z.B.
®
RosettaSep )
der
Kreuzverbindungen
zwischen
den
unerwünschten Zellen und Erythrozyten bildet. Diese kreuzverbundenen Zellgruppen sind als
„Rosetten“ (daher der Name des Verfahrens) im Lichtmikroskop erkennbar. Der nächste Schritt ist die
Dichtegradientenzentrifugation. Dabei werden sich die Rosetten am Boden der Zentrifugenröhre als
Pellett absetzen, im Gegensatz dazu werden sich die unmarkierten, sich nicht in Rosetten
befindenden Zellen, entsprechend deren Dichte, in dem oberen Teil der Zentrifugenröhre, in der
Flüssigkeit (in der Supernatant) befinden. Aus dieser Position können die Zellen für weitere
Untersuchung gesammelt werden. Auf ähnlicher Weise funktioniert das auch markierte Antikörper
benutzende FACS-Verfahren, welches für die Separation der gewünschten Zellen geeignet ist (siehe
separates Kapitel).
Abbildung 8.4. Zellseparationsverfahren auf Grund der Rosettenbildung
138
Von den Leukozyten ist die selektive Vermehrung der verschiedenen Lymphozyten auch möglich. Da
die Lymphozyten im peripheren Blut, sich in der G 0-Phase befinden, können mit entsprechenden
Induktionsmitteln (z.B. mit ConA oder mit LPS) entweder die T- oder die B-Lymphozyten zur
Lymphoblasten umgewandelt werden (sog. Blast-Transformation), d.h. von G0 zur G1-Phase, und so
zur Vermehrung gebracht werden (Tabelle 8.2.); damit ist es möglich deren Anhäufung zu erreichen.
Mitogene Substanz
Zielzelle
Concanaralin A (ConA)
Phytohämagglutinin (PHA)
Kermesbeeren (Pokeweed, PWM)
T-Zellen
Lypopolysaccharide (LPS)
B-Zellen
T- und B-Zellen
Tabelle 2. Mitogene Substanze
Dieses Verfahren sogar zu der, durch ein Antigen ausgelöste T-Zell Proliferation sich ähnelt, ist aber
aspezifisch, in diesem Fall werden alle T- und/oder B-Zellen das Blast-Stadium erreichen, nicht nur
die antigenspezifische. Zur Routine Chromosomenuntersuchungen wird auch die lymphoblastische
Transformation durch pflanzliche Lektine (Phytohämagglutinin, PHA) erreicht, denn durch eine
einfache Blutabnahme vom peripheren Blut nach 48–72 Stunden dauernde Kultivierung viele teilende
Lymphoblasten
gewonnen
werden
können.
Zur
Karyotypisierung
notwendige
Menge
den
Methaphasenzellen stehen schnell zur Verfügung.
Für die Separation von Zellpopulationen mit Knochenmarksursprung, steht ein einfaches Verfahren
zur Verfügung, wobei die Adhesionsunterschiede der einzelnen Zellpopulationen ausgenutzt werden.
Die aus dem Knochenmark frisch isolierte Monozyten/Makraphagenpopulation haftet relativ rasch an
den Boden des Kultivierungsgefässes, bis die Lymphozyten und Granulozyten sich gar nicht anhaften.
Nach einigen Stunden Inkubation wird das Nährmedium abgegossen, so dass auch die nicht
anheftenden Zellen entfernt werden und die angereicherte Monozyten/Makrophagenfraktion weiter
kultiviert werden kann.
8.5. Einige Verwendungsarten der Zellkulturen
Die Bedeutung des Zellkulturverfahrens liegt vor allem darin, dass mit seiner Hilfe ein Teil von
Tierversuchen, bzw. solche Versuche die aus ethischen, moralischen oder juristischen Gründen an
Menschen nicht ausführbar sind, in Laborverhältnissen ersetzt werden können. Diese Versuche sind
genau planbar und reproduzierbar. Das Zellkulturverfahren bietet Möglichkeiten für Untersuchungen
der meisten Funktion von zahlreichen Zell- und Gewebearten, die von der komplizierten
Wechselwirkung des Körpers entrissen wurden, sogar spezielle Lebensfunktionen differnzierter Zellen
können auch studiert werden. Gleichzeitig aber kann die Tatsache, dass die kultivierten Zellen aus
dem Körper isoliert sind, ein Hindernis des in vitro Zuchtverfahrens darstellen; die Funktion von Zellen
139
und ihr Verhalten im Organismus sind noch von zahlreichen anderen Zelltypen beeinflusst, weshalb
die erhaltenen Daten nicht auf die in vivo-Zustände direkt bezogen werden können. Dies
auszuschliessen, werden immer häufiger die sog. Kokultivierungssysteme verwendet, in denen
verschiedene Zelltypen in gemeinsamer Nährlösung gezüchtet werden, so dass die einzelnen
Zelltypen voneinander mit Hilfe von Membran-Insert getrennt sind. Auf dieser Weise sind die durch die
löslichen Molekülen vermittelten Wechselwirkungen zwischen den einzelnen Zellarten nachweisbar
und nachvollziehbar.
Weitere Überlegungen fordert die Tatsache, dass besonders während einer längeren Kultivierungszeit
von Zellinien, bedeutende Anhäufung von Mutationen, und Selektionen auftreten können. Heute kann
man behaupten, dass die Zell-Linien unter in vitro Umständen an einem spontanen Evolutionsvorgang
teilnehmen. Folglich bedeutet die Anwendung der gleichen Zellinie nicht unbedingt ein StandardSystem. Bekanntlich besitzen Zellen breitbasig verwedeter Zellinien eine für die Zellkultur typische
sog. modale-Chromosomenanzahl, die von der Chromosomenzahl der gegebenen Art auch
abweichen kann. Diese Zahl beträgt im Fall der CHO-Zellinie 20 (jedoch ist diefür den chinesischen
Hamster charakteristische Chromosomenzahl: 2n=22), bzw. bei der Hela-Zellen 56 (welche von der
normalen humanen Chromosomenzahl 2n=46 weit enfernt liegt). Deshalb schenkt man heutzutage
erhöhte Aufmerksamkeit den primären Zellkulturen und Zellstämmen. Heute lagern und vertreiben die
Zellbanken immer mehr solche Zellen oder Zellstämme, die mit ihren Eigenschaften annähernd bei
der Norm liegen.
8.5.1.
Bestimmung der Plating-Effizienz
Die Plating-Effizienz (PE) ist diejenige Indexzahl, die die Wirksamkeit der Explantierung bestimmt.
Diese Zahl gibt an, wieviel Prozent der explantierten Zellen in der Zellkultur Zellkolonien zustande
bringen werden können (anders ausgedrückt: wieviele Zellkolonien aus einer einzelnen Zelle
entspringen);
PE = Anzahl der Zellkolonien/Anzahl der explantierten Zellen X 100.
Mit Hilfe der Empfindlichkeit dieses Verfahrens kann man den Nährstoffbedarf unterschiedlicher
Zelltypen bestimmen, bzw. ist es so auch möglich herauszufinden, welche Serum-Chargen sich für die
Kultur am besten eignen oder auch die Zytotoxizität zu bestimmen.
8.5.2.
Bestimmung der Proliferation und der Vermehrungsfähigkeit
der Zellen
Die Proliferationsfähigkeit von Zellen wird vor allem mit den zugegebenen verschiedenen
Wachstumsfaktoren / Zytokinen gemessen, bzw. üblicherweise, in den Versuchssystemen wegen
unterschiedlichen Testsubstanzen bestimmt. Für die Bestimmung der Proliferation, bzw. dem
Gegenteil: der Zytotoxizität, stehen zahlreiche Methoden zur Verfügung.

Im sog. direkten Verfahren mit irgendwelchem – bereits früher erwähnten – Verfahren (z.B.
mit Hämozytometer oder mit Hilfe von automatischen Zellzählern) kann die Zellzahl (Zellzahländerung
in Abhängigkeit der Zeit) unmittelbar bestimmt werden.
140

Mit dem sog. indirekten Verfahrenwerden irgendwelche, sich mit der Zellzahl (mit Änderung
der Zellzahl) proportional ändernde Parameter (z.B. der Einbau eines radioaktives Isotopes, oder die
metabolische Aktivitätsänderung eines Enzyms der Zelle) bestimmt.
Vom indirekten Verfahren ist die älteste und zugleich die bekannteste Methode das Thymidin3
3
Inkorporations-Assay. In dieser Methode wird mit Tritium ( H) markiertes Thymidin ( H-Thymidin)
verwendet. Das markierte Thymidin wird während der DNA-Replikation in den neu synthetisierten
DNA-Strang eingebaut. So ist das Mass der Inkorporation mit der Anzahl der DNA Replikationen und
damit auch mit der Zahl der Zellteilungen proportional. Mit Hilfe von einem Szintillations-β-Zähler wird
die Radioaktivität das Lysatum von behandelten und unbehandelten Zellen gemessen, und daraus
kann auf die Auswirkung der Testsubstanz auf die Zellproliferation geschlossen werden.
In letzter Zeit bestrebt man immer öfters anstatt von radioaktiven Isotopen, viel mehr nicht-radioaktive
Substanzen zu verwenden. Aus diesem Grund sind mehrere solche Proliferations-Assays
ausgearbeitet worden, welche auf anderen Grundprinzipien basiert sind. Eine von diesen ist das auf 5Brom-Desoxyuridin (BrdU)-Inkorporation basierte Verfahren. Der BrdU ist ein (nicht strahlendes)
Thymin-Analog, welcher bei der DNA-Replikation in die neu synthetisierten Ketten (als Basenpaare
von Adenin) anstatt Thymin-Basen eingebaut wird. Darauffolgend können - mit Anwendung Anti-BrdUAntikörper (ohne Zellyse) mit einer immunzytochemischen Reaktion - die Zellen, welche während der
Behandlung BrdU eingebaut haben (das heisst, solche Zellen, welche während dieser Zeit in Teilung
– in der S-Phase des Zellzykluses – waren) nachgewiesen werden. Dementsprechend kann die
Proportion der BrdU-beinhaltenden (markierten) und der nicht BrdU-haltigen (unmarkierten) Zellen,
und somit auch die Wirkung einer Testsubstanz auf der Proliferationsrate bestimmt werden.
Neuerdings wird ein mit einem Fluorochrom (5-Ethynilil -2 Desoxyuridin) markiertes Nucleosid
verwendet und somit braucht man keine Antikörper für die unmittelbare Verfolgung der
Zellproliferationsänderungen.
Andere grosse Gruppen der indirekten Proliferations-Assays messen die Aktivitätsänderungen der
mitochondrialen Enzyme. Bei dem sog. MTT-Assay wandelt sich in lebendigen Zellen das
wasserlösliche MTT (ein Tetrasolium-Salz) durch die Wirkung von mitochondrialen Enzymen
(Dehydrogenasen) in unlösbare braun-lila Formasan um. Diese Substanz wird erst solubilisiert, dann
kann die Formasan Konzentration bei 570 nm photometrisch bestimmt werden. Die FormasanKonzentration ist mit der Anzahl lebendiger Zellen proportional.
Es ist empfohlen, Zellzahlbestimmungen die auf metabolischen Veränderungen beruhen, mit einem
direkten oder auf Basisanalogen beruhende indirektem Verfahren zu kontrollieren, denn es könnte
vorkommen, dass die Testsubstanz unmittelbar auf mitochondiale Enzyme wirkend, die FormasanMenge senkt, ohne dass sich die Zellzahl dabei verringern würde. Gleichzeitig soll jedoch betont
werden, dass die Zellzahl auch deshalb sinken könnte, weil die Testsubstanz einfach toxisch war. In
diesem Fall ist die Zellzahl-Verringerung nicht als Resultat der Proliferationsratenrückganges
anzusehen, sondern als Folge von Zelluntergang.
141
8.5.3.
Abmessung der Zytotoxizität
Obwohl die Zellproliferation und der Zelluntergang zusammengehörende Erscheinungen sind,
während des Assays – jedoch vom Versuchszweck und Testsubstanz abhängig – sind, haben
entweder die Anzahl lebendigen Zellen oder sogar die Absterberate von Zellen eine Bedeutung. In
einen Teil des oben erwähnten Zellproliferationsverfahrens kann ausgehend von einer bekannten
Zellzahl gleichzeitig auf die proliferierenden (d.h. auf die lebendigen) Zellen und auch auf den
Zelluntergang (z.B. die plating Effizienz oder der MTT Assays) geschlossen werden.
Ein
anderer
Bereich
der
Zytotoxizitätsbestimmung
beruht
auf
der
Untersuchung
der
Plasmamembranintegrität. Eine solche Methode ist, die bei der Zellzahlbestimmung früher erwähnte
Trypanbau-Färbung, wobei nur die Zellen mit nicht intakten Zellmembranen (d.h. Zellen die nicht
mehr lebendig sind) den Farbstoff aufnehmen, oder die bei der Durchflusszytometrie (FACS)
besprochene Propidium-Jodid-Färbung, wobei der Farbstoff ebenfalls nur durch Zellmembranen
von abgestorbenen Zellen in das Zellinnere gelangen kann. Mit anderen Verfahren zur
Zytotoxizitätsbestimmung können Membrantransporte solcher Substanzen untersucht werden, die
innerhalb der Zelle nicht aktiv sind, jedoch aus den Zellen aktiv befördert werden oder umgekehrt.
Solche Substanzen sind einerseits die Laktose-Dehydrogenase, anderseits auch für die lebendigen
oder für die abgestorbenen Zellen charakteristischen Proteasen.
Im Falle der anhaftungsfähigen Zellen gehören zu den neuesten Methoden Messungen,, welche auf
dem Prinzip der elektrischen Impedanz basieren (z.B. ECIS. siehe im Kapitel, Migration der Zellen),
wobei durch die Erhöhung der abgestorbenen, nicht mehr anhaftungsfähigen Zellen sich die
elektrische Impedanz verringert, d.h. eher die Kinetik wird als Endergebnis des Zellunterganges
untersucht.
8.5.4.
Herstellung der monoklonalen Antikörper
Abbildung 8.5. Selektionsverfahren der Hybridomzellen
142
Eine hervorragende Bedeutung des Anwendungsbereichs der Zellsuspensionskulturen hat die
Herstellung von sog. monoklonalen Antikörpern. In diesem Verfahren werden erst von der Milz mit
entsprechendem Antigen immunisierte Tiere antikörperproduzierende B-Zellen isoliert, diese werden
mit Hilfe von einem die Zellmembran destabilisierendem Faktor (z.B. Poliethylen-Glykol oder SendaiVirus) mit unbegrenzt teilungsfähigen Myelomzellen (B-Zellinie) fusioniert. Diese Myelomzellen
produzieren in sich keine Antikörper gegen das Antigen, und es fehlt von denen entweder die HGPRT
(Hypoxanthyn-Guanin-Phosphorybosil-Transferase) oder das Enzym TK (Thymidin-Kinase). Ein Teil
der auf diese Weise entstandenen Zellen hat die Fähigkeit zur unbegrenzten Zellvermehrung bzw. die
Fähigkeit Antikörper zu produzieren (Hybiddom). Diese Hybridom-Zellen, werden durch das sog.
HAT-Selektionsverfahren (Abbildung 8.5.) von den nicht hydbrid Zellen separiert und anschliessend
zur Vermehrung (Mitose) angeregt. Während der Selektionsmethode
liegen
die Zellen in
Hypoxantin-Aminopterin-Thymidin (HAT) Medium. Im Selektionsmedium sterben die Partnerzellen der
Hybridisierung (d.h. die nicht hybridisierten Zellen) ab, weil:
1. Die aus der Milz isolierten intakten B-Zellen, als primäre Zellkultur nur zu einer begrenzten Anzahl
an Teilungen (Replikationen) fähig sind;
2. In mutierten Zellen mit Myelomursprung hemmt das Aminopterin den klassischen Weg der DNASynthese. bzw. funktioniert der alternative DNA-Syntese-Weg auch nicht wegen Mangel an TK
oder HGPRT.
Auf diese Weise werden im HAT-Medium nur die Hybridomzellen überleben, weil die Heterozygoten,
und deswegen sowohl auf HGPRT, als auch auf das TK betreffend sind, und so fähig sind für die
alternative DNA-Synthese somit auch für Zellprolieration.
Von diesen Hybridom-Zellen können mit Zell-Klonierung und darauffolgend mit einem ELISAVerfahren die sog. monospezifischen antikörperproduzierenden Zellen ausgewählt werden, d.h. diese
Zellen, nur auf eine einzige Bindestelle des Antigens (Epitop) spezifische Antikörper herstellen.
Anschliessend werden die isolierten Zellen im Bioreaktor massenhaft zur Vermehrung angeregt, was
zweckmässig ist für die Herstellung von grösseren Mengen von monoklonen Antikörpern.
8.6. Spezielle Kultivierungsverfahren
Am häufigsten wird die übliche Petri- oder die einfache Kultivierungsschale für Laboranalyse-oder
Versuchszwecke verwendet. Es kommen jedoch oft Fälle vor, wobei von einzelnen Zelltypen grössere
Mengen benötigt werden. Für solche Fälle – abhängig vom Zelltyp (angehaftete oder suspensions
Zellkultur) – entwickelte man verschiedene finanziell relevante Laborgeräte, mit denen bei Zugabe von
verhältnissmässig geringen Mengen Serum, Nährmedium und sonstigen Adjuvanten mehrere
Millionen von Zellen gleichzeitig erhalten werden können.
Im Fall der Suspensionszellkulturen verwendet man z.B. die "Spinner Flasche", bei adherenten
(anhaftenden, monolayer) Zellkulturen verwendet man die rotierende Flasche (roller bottle). Im ersten
Fall befindet sich in dem Flascheninneren ein Dreharm, der in die Zellsuspension hineinreichend,
ständig und gleichmässig Zellen und Nährmedium umrührt so, dass für jede einzelne Zelle die gleiche
und gleichmässige Nährstoffzufuhr gesichert ist.
143
Im zweiten Fall sind die Zellen in grossflächigen zylindrischen Gefässen an der Innenseite angehaftet,
unddie Zellen wachsen unter einer dünnen Nährmediumsschicht. Im Gerät wird durch die
gleichmässige Drehbewegungen des Kultivierungsgefässes die gleichmässige und notwendige Menge
der Nährmediumszufuhr ermöglicht, wodurch das Austrocknen der Zellen verhindert wird. In beiden
Fällen der Zellvermehrungen ergeben sich günstige Zell/Nährlösungsverhältnisse.
Ein spezielles Verfahren ist für die Zellvermehrung (scale up) im Fall der adhesiven (ahgehafteten)
®
Zellkulturen, wenn die Zellen auf den Oberflächen von Mikroperlen (Cytodex ) in einer "Spinner
Flasche" kultiviert sind. Zum Nährmedium werden Mikroperlen-Partikel zugegeben, wodurch ein
extreme Oberflächenvergrösserung erreicht wird. Die Mikroperlen-Partikel werden bald von Zellen
besiedelt. Durch Strömung des Nährmediums können die auf die Mikroperlen angesiedelten Zellen
gleichmässig Nährstoffe aufnehmen und Stoffe abgeben.
Auf ähnlichem Prinzip basieren die Techniken der statischen und dynamischen Zellfabriken. In
diesen ist auch der Atemgasaustausch gesichert. Bioreaktoren werden für die Herstellung grosser
Mengen von monoklonalen Antikörpern, bzw. für die durch Vermehrung von genetisch modifizierten
Eukariotenzellen rekombinant produzierte Proteine (z.B. Insulin, Wachstumsfaktoren) benutzt. Im
medizinischen Heilverfahren könnten die Leberzell-Reaktoren eine bedeutende Rolle spielen, diese
dynamischen Kulturen sind bis zur Ankunft des Donororgans fähig das Blut des Patienten zu
detoxieren / entgiften, und damit sein Leben zu verlängern.
Die Methylzellulose enthaltenden sog. semisoliden (halbflüssige) Medien verhindern das Anheften
von Zellen am Gefässboden zusätzlich aber sind die Nährstoffe gesichert. Weil diese Medien die
Knochenmarksverhältnisse imitieren; wird dieses Verfahren hauptsächlich für die Kultivierung
hämatopoetischer Stammzellen angewandt.
Ausgehend von Hämatopoetischen Stammzellen in einem mit Zytokinen angereicherten semisoliden
Medium erscheinen die differenzierenden Hämatopoetische Zellen in einer stark bestimmten
Reihenfolge.
Zuerst
erscheinen
die
erythroiden
Progenitorzellen,
dann
der
CFU-GEMM
(Granulozyten, Erythrozyten, Monozyten, Makrophagen, d.h. die multipotenten) Progenitorkolonien,
letztlich die Unipotenten, nur einen einzigen Zelltyp beinhaltenden Kolonien (z.B.Makrophagen oder
Monozyten).
Bei Kultivierung von embryonalen Stammzellen benötigt man ein anderes spezielles Verfahren. In
diesem Fall werden die Zellen auf eine andere Zellschicht, welche durch vorherige Behandlung mit
Mitomycin C (MM) oder durch Bestrahlung in seinem Wachstum gehemmt ist, zerstreut. Die auf diese
Weise konstruierte sog. nährende Zellschicht oder feeder layer produziert Faktoren (Zytokine,
Wachstumsfaktoren) die für die Erhaltung des undifferenzierten pluripotenten Zustandes der
Stammzellen nötig ist, ohne dasdie zur Vermehrung erwünschten Stammzellen (von den nährenden
Zellen) überwuchert werden. Grösstes Problem dieses Verfahrens bedeutete, dass sowohl die Maus
als auch die humanen Embryonalen Stammzellen auf Maus-Fibroblast feeder gezüchtet wurden. Das
daraus folgende Risiko der artfremden Kontamination ergab das grösste Hinderniss den
therapeutischen Einsatz von Humanen Embryonalen Stammzellen. Aus diesem Grund verwendet
man heute anstatt von aus Maus stammenden nährenden Zellschichten (feeder layer) synthetische
extrazelluläre Matrix mit genau definierter Zusammensetzung.
144
8.7. Untersuchungsmöglichkeiten der Zellen in einer
Suspensionskultur
Als Anschluss der Subkultivierung teilt
man die Zellvermehrung in einer
Zellkultur auf mehrere Abschnitte auf
(Abbildung 8.6.). Nach Abfertigung
der Zellkultur ist die Kultur in der
sog.lag-(oder verzögerte)-Phase; die
Zellen regenerieren sich, wachsen,
dann beginnen sie sich zu teilen, ihre
Anzahl wächst nur langsam. In der
darauffolgender sog. log-Phase, die
Abbildung 8.6. Wachstumsphasen einer Zellkultur
(Abschnitte der Zellzahlsänderungen)
Zellen vermehren sich intensiv, ihre
Zahl
wächst
exponentiell.
In der (log Phase) folgenden Plateauphase sinkt der Nährstoffgehalt (und im Falle von adhesiven
Zellen auch der freie Oberfläche) immer mehr, die Zellvermehrung wird verlangsamt, schliesslich hört
sie auf, die Zellzahl bleibt für kürzere Zeit konstant. Wenn in diesem Zustand das Nährmedium nicht
gewechselt wird oder die Zellen nicht in mehreren Kulturschalen subkultiviert werden, dann beginnen
in der letzten, sog. Untergangsphase die Zellen abzusterben, die Zellzahl sinkt stetig.
Am besten geeigneter Zeitpunkt zur Untersuchung der gezüchteten Zellen, ist die intensive
Wachstumsphase, die log Phase
Die adherenten (angehafteten) Zellen werden nach irgendwelcher zytologischen Färbung bzw. nach
einer immunzytochemischen Reaktion im Lichtmikroskop in situ untersucht. Für Untersuchung der
lebendigen adherenten Zellkulturen verwendet man eine Invers-Lichtmikroskop (Abbildung 8.7.)
bzw. eine Videomikroskop.
Abbildung 8.7. Prinzip des Inversmikroskopes
145
Zellen der Suspensionszellkulturen müssen erst mit entsprechender Technik auf einen Objektträger
gebracht werden, um untersuchbar zu sein. Eine solche Methode ist z.B. die Herstellung eines
Ausstrichpräparates, eines Dicktropfpräparates und das Zytozentrifugieren.
Die Herstellung des Ausstrichs (Abbildung 8.8.)
geht aus einer hochzelligen Zellsuspension, ein
kleines Tröpfchen dieser Suspension wird auf den
Objektträger gelegt, welche mit der Kante eines
anderen Objektträgers auf eine einzige Zellschicht
erweitert wird.
Im
Fall
des
Dicktropfpräparates
ist
die
Ausgangszellsuspension dünn (deren Zellzahl ist
niedrig), aus dieser Suspension wird ein kleines
Volumen auf einen Objektträger pipettiert.
Während dem Zytozentrifugieren wird, abhängig
von der Zelldichte der Ausgangssuspension, eine
Muster mit kleinerem oder grösserem Volumen in
spezielle L-Förmige Trichter gebracht, woraus alle
Zellen
durch
die
Zentrifugalkraft
auf
einen
Oberflächenteil mit 0.5 cm Durchmesser von
einem
dahinter
befestigten
Objektträger
aufgefangen werden. Mit jedem des Obigen
Verfahrens
können
Objektträger
mit
der
Zellen,
die
auf
gewünschten
den
Verfahren
gebracht wurden, nach trocknen und fixieren als
Präparate im Mikroskop untersucht werden.
Abbildung 8.8. Herstellung eines
Ausstrichpräparates aus einer Zellsuspension
8.8. Anwendungsbereiche der Zellkultivierung
Zellen von Zellkulturen können auf verschiedenster Weise untersucht werden (Tabelle 8.3.). Von den
üblichen licht- oder elektronenmikroskopischen bis zu den modernen molekularbiologischen (wie z.B.
Genexpressionsuntersuchungen)
Techniken.
Die
Zellkultivierungsverfahren
ermöglichen
die
Untersuchungen sowohl mit den (embryronalen, erwachsenen und/oder induzierten) pluripotenten
Stammzellen als auch mit differenzierten Zellen. Mit Hilfe von in Zellkulturen in grossen Menge
hergestellten
hoffnungsvolle
normalen
oder
Aussichten
in
gerade
der
genetisch
gewöhnlichen
menschlichen Erkrankungen.
146
eröffneten
modifizierten/korrigierten
Zellen,
oder
verschiedenartigen
Gentherapie
von
Umweltwechselwirkungen

Infektionen (Viren, Bakterien, Parasiten)

Toxikologie

Immunologie

Karzinogenese

Biotransformation der Xenobiotica
Genetik
 Transformation
 Zellfusion
 Zellzyklus
Zellbiologie
 Zell - Zell und Zell - Matrix Wechselwirkungen
 Genexpression
 Zellproliferation
 Differentierung
 Zellmigration, -Invasion
Intrazelluläre Aktivität
 Replikaton, Transkription
 RNS Metabolismus
 Proteinbiosynthese
 Intermediäres Stoffwechsel
Biotechnologie/Tissue engineering
 Zytokine/Wachstumsfaktoren, Hormone, Antikörperproduktion
 Künstliche Gewebe
Tabelle 8.3. Anwendungsmöglichkeiten von der Zellkultivierung
Übersetzt von Ottó Dobozy
147
9. DIE HOMING, DIE GEZIELTE MIGRATION VON
IMMUNZELLEN. EXTRAVASATION IN ENTZÜNDUNGEN
(LÁSZLÓ KŐHIDAI)
9.1. Einführung
Die
Fähigkeit
der
Zellen
zu
wandern
ist
ein
grundlegender
Prozess.
In
den
frühen
Entwicklungsphasen der Phylogenese entwickelte sich schon diese Fähigkeit, da es für die primitiven
einzelligen Organismen immer ein bedeutender Vorteil war, die schädlichen (toxischen) Stoffe von
den günstigen Nahrstoffen zu unterscheiden.
Zellmigration ist eine der grundlegenden zellphysiologischen Prozesse, indem sie
solche
physiologischen Prozesse, wie die Befruchtung oder die Angiogenese, beeinflusst. Zellmigration ist
auch an pathologischen Prozessen beteiligt, wie der Entstehung von Entzündungen, von Metastase
der Tumoren oder der Entstehung der Atherosklerose. Die Migration ist der Fokus einiger Therapien,
in denen die Arzneimittel das Ziel selektiv erreichen sollen.
9.2. Die Hauptformen der Zellmigration
Die Migration der Zellen kann nach verschiedenen Ansichten gruppiert werden. Nach einem häufig
verwendeten Prinzip unterscheidet man (i) Kinesen, bei denen die Richtung der Bewegung von der
Konzentration der die Bewegung auslösenden Moleküle nicht abhängt, so dass die Bewegung random
ist und (ii) Taxis, bei denen der Konzentrationsgradient bedeutend ist und die Richtung der Bewegung
vektoriell ist (Abbildung 9.1.)
Abbildung 9.1. Die Hauptformen der Zellbewegungen
Bei den Kinesen spricht man auch über die Geschwindigkeit der Bewegung (Ortokinese), über die
Frequenz (Klinokinese) und über die ad hoc Richtung (Chemokinese).
148
Lösliche Moleküle aus der Umgebung lösen Chemotaxis aus, der Lockstoffgradient an der
Zelloberfläche drückt sich als Haptotaxis aus. Die aus den abgestorbenen Zellen freigesetzten Stoffe
induzieren Nekrotaxis (Abbildung 9.2.).
Abbildung 9.2. Die von chemischen Stoffen ausgelöste Motilität der Zellen
9.3. Die die Chemotaxis auslösenden Moleküle
Diese Stoffe werden nach ihrer Wirkung in zwei Hauptgruppen unterteilt.
(i)
Chemoattractante
Stoffe
beeinflussen
Stoffkonzentrationsgradienten,
die
die
Zellen
Fortbewegungsrichtung
wandern
in
der
der
Zellen
durch
Richtung
des
Konzentrationsgradienten.
(ii) Chemorepellente Stoffe verursachen die Bewegung in die umgekehrte Richtung, in Richtung
des niedrigeren Konzentrationsgradienten.
Als Chemokine fungieren unterschiedliche Substanzgruppen. Stark chemoattractante oder repellente
Stoffe können ebenso einfache Ionen und relativ kleine Moleküle (z.B. Aminosäuren) als auch relativ
grosse Moleküle (z.B. Chemokine, syntetische Artzneimittel) sein.
In der Biologie, Physiologie, Pathophysiologie und Immunologie existieren so genannte professionelle
chemoattractante Moleküle (z.B. formil-Met-Leu-Phe, Chemokine, Komplement 5a).
149
Andererseits können weitere Moleküle (z.B. Hormone), deren primäre Aufgabe keine ChemotaxisAuslösung ist, auch als Chemoattractante / Chemorepellente fungieren.
Die Klassifizierung der vier Subgruppen der Chemokine beruht auf der Lokalisation der die
Peptidstruktur beeinflussenden Disulfidbrücken und auf dem Abstand zwischen den zentralen Cistein
Aminosäuren.
Aus dem Grund der Funktion sind die Moleküle der CX3C Gruppe sehr bedeutend. Die Mitglieder
dieser Gruppe können sich durch die hydrophobe Domäne des C-Endes in der Membran verankern,
wodurch sie praktisch Haptotaxis auslösende Liganden werden (Abbildung 9.3.)
Abbildung 9.3. Die Grundlage der Gruppierung der Chemokine nach ihrer Struktur
9.4. Chemotaxis Rezeptoren
Während der Evolution wurden verschiedene Ligand-Rezeptor Interaktionen für die Auslösung der
Chemotaxis selektioniert. In Prokaryonten dienen solche Transmembranproteine den chemotaxis
Rezeptoren, die relativ einfache Moleküle (z.B. einfache Saccharide, Aminosären und ihre Dimere,
Trimere) binden können (z.B. Asparaginsäure-Tar Rezeptor). Ihre Struktur wird von vier Domänen
ausgebildet, deren Funktion unterschiedlich ist: (i) extrazelluläre, ligandbindende Region, (ii) die
sogenannte „coiled coil” Domäne, (iii) die Methylgruppe-bindende Region, die für Rezeptoraktivierung
150
und Signalübertragung verantwortlich ist und schließlich (iv) die zytoplasmatische Domäne, die durch
die Phosphorilierung der chemotaktischen Proteine eine signalisierende Funktion besitzt. Es ist zu
betonen, dass die Dimerisierung der Rezeptoren bereits in diesen früh entwickelten Organismen
auftritt und eine höhere Aktivität aufweisen.
In der Membran der Zellen der höheren Lebewesen (ebenso der Menschen als auch der Tiere)
befinden sich auch die chemotaxis Rezeptoren, die die Fähigkeit haben, die kurzen Formil-Methionin
(formil-Met-Leu-Phe) besitzenden, während einer Infektionen freigesetzten bakteriellen Peptide zu
binden. Diese Rezeptoren gehören schon zur Familie der 7TM
Rezeptoren, und extrazelluläre
glykosilierte Sequenzen spielen eine Rolle bei der Bindung der Liganden.
Der das C5a Peptid bindende Rezeptor ist genauso ein 7TM Rezeptor.
Die Signalübertragung dieser zwei chemotaxis Rezeptoren ist an ein trimeres G-Protein gekoppelt.
Weitere intrazelluläre Signalübertragungsnetzwerke? sind in der Signalvermittlung beteiligt (z.B.. PLC2+
PIP2-IP3-Ca ; Ras/Raf-MEK1/MEK2-ERK1/ERK2; MEKK-MEK3-p38-MAPK)
Die Chemokinrezeptoren gehören auch zur Familie der 7TM Rezeptoren. Hier bindet auch der Ligand
an das extrazelluläre N-Ende des Rezeptors.
Die intrazelluläre Signalisierung(Signalübertragung) wird von der Interaktion des trimeren G-Proteins
und des Rezeptors ausgelöst. Eine DRY Sequenz liegt auf der 2ten Schleife des Rezeptors, diese
Region ist für die Interaktion verantwortlich. Das C-Ende des Rezeptors aktiviert das G-Protein. Die
Phosphorilierung dieser Region erlaubt die Bindung an Beta-Arrestin, wodurch weitere Signale
generiert werden (Abbildung 9.4.). Ausser diesen Interaktionen ist bei mehreren Chemokinen (z.B.
IL8) beschrieben, dass auch die GAG Moleküle auf der extrazellulären Oberfläche der Membran, in
der Nachbarschaft der Chemokinrezeptoren eine wichtige Rolle bei der Stabilisierung des LigandRezeptor Komplexes spielen.
M. O'Hayre, C.L. Salanga,T.M. Handel, and S.J. Allen. (2008) Biochemical J. 409:635-49
Abbildung 9.4. Signalübertragungsmechanismen von Chemokinrezeptoren
151
9.5. Die sich bewegenden Zellen des menschlichen Körpers und
ihre Bewegungsformen
Viele Arten von Zellen sind Zielzellen der Chemokine in höheren Lebewesen. Aus physiologischen
und klinischen Gründen sind die neutrophilen Granulozyten, die Monozyten, die Lymphozyten, die
eosinophilen Granulozyten und die Endothelzellen der Gefässe die wichtigsten.
In der so genannten mesenchymalen Form der Migrationsmechanismen in höheren Lebewesen wird
die Polarisation der Zellen von den Integrinen und der Aktivität der extrazellulär wirkenden Proteasen
determiniert. Die klassische amöboide Migration unterscheidet sich darin, dass der Abbau der
extrazellulären Umgebung keine wichtige Rolle spielt. In den letzten Jahren wurde eine neue
Bewegungsform beschrieben, die so genannte kollektive Migration. In dieser Form wandern
Zellgruppen zusammen, die durch Zelladhäsionsstrukturen miteinander gekoppelt sind. Diese
Migration ist während der Morphogenese der embryonalen Gewebe und bei dem Wachsen einigen
Tumoren zu finden (Abbildung 9.5.).
Abbildung 9.5. Bewegungsformen der menschlichen Zellen
9.6. Zellmotilität und Immunantwort
Die Komplexität des Proczsses der Migration und ihrer zelluläre Regulation kann durch die Migration
der Lymphozyten und dendritischen Zellen (DZ) erfolgreich untersucht werden.
Auf diese Weise kann der Weg der DZ – Progenitor - unreife DZ – reife antigenpräsentierende DZ
aus dem Knochenmark durch die nicht-lymphoiden Gewebe zu den Immunorganen aufgezeichnet
152
werden Abbildung 9.6. zeigt den Prozess, dessen bedeutender Teil die Migration und Zirkulation
zwischen den Organen ist.
Abbildung 9.6. Die Migration der Lymphozyten und der dendritischen Zellen
9.6.1.
Transendotheliale Migration der Lymphozyten
Der oben dargestellte Prozess zeigt ein nuanciertes Bild in den Räumen der Gewebe. Das Endothel
der Gefässe ist die wichtigste Oberfläche
für die Migration aus immunologischer/pathologischer
Gesichtsweise. Die gerichtete Migration (Homing, Entzündungsprozesse) von vielen Zellpopulationen
erschieht? (entstand/erschien?) durch diese riesige Oberfläche. Die Zellpopulationen verlassen das
Kapillarsystem oder gelangen zurück, – Prozesse die von der Expression von bestimmten
Membranadhäsionsproteinen und löslichen Faktoren (Chemokine, bakteriell Peptide) induziert und
gerichtet werden.
Die Entstehung der Phasen wird in den postkapillären Venulen (?) während der Transmigration der
Lymphozyten von den hier erklärten Mechanismen ermöglicht Abbildung 9.7:
1. Rolling - Selektin-Sialomucin Verbindung (oder Integrin alfa4beta1 und alfa4beta7)
2. Aktivierung – die Chemokine des Endothels binden an die Chemokinrezeptoren der
Lymphozyten, wodurch die Lymphozyten aktiviert werden. Die Chemokine befinden sich auf
den Proteoglykanen des Heparansulphat.
3. Adhäsion – als Folge der Aktivierung anscheinen Integrine mit erhöhter Affinität und Avidität
auf der Oberfläche der Lymphozyten. Sie binden an ihre Liganden (ICAM, VCAM usw) auf
den Endothelzellen.
153
4. Diapedesis – die Bindung mit den junktionalen Adhäsionsmolekülen (JAM, PECAM-1=CD31)
ergibt die Öffnung der Breschen (vllt. Zellzwischenräume) zwischen den Endothelzellen und
ermöglicht die Transmigration der Lymphozyten.
Die Migration der Lymphozyten ist von Adhäsionsmolekülen, Chemokinen und Chemokinrezeptoren
stark reguliert.
Abbildung 9.7. Die transendotheliale Migration der Lymphozyten
Das Homing der naiven T Zellen und ihre Rezirkulierung zwischen den sekundären Immunorganen
wird von der Expression des Integrins alfa4beta7-t (Mucosa) und L-Selektins (Lymphknoten)
ermöglicht. Die Migration der aktivierten T Zellen zum Ort der Entzündung schließt die Bindung von
mehreren Ligand-Rezeptor Paaren ein. Selektin-Sialomucin, Integrin alfa4beta1-VCAM-1, Integrin
alfa4beta1-CS-1 und CD44-Hialuronsäure. Im Falle der T Gedächtniszellen ist die „homing signature”
ein spezifisches Adhäsions-und Chemokinrezeptorprofil,
welches ihnen die Fähigkeit zu einer
selektiven und gewebespezifischen Migration verleiht.
Die naiven B Zellen ko-exprimieren L-Selektin und alfa5beta7 Integrin, die es ihnen erlauben in die
Mucosa und in die periphären Lymphknoten einzutreten. Die im germinalen Zentrum der PeyerPlaques
abläufenden
Reaktionen
rufen
die
Expression
des
alfa4beta7
Integrins
der
B
Gedächtniszellen hervor. Diese Zellen differenzieren sich zu IgA sekretierenden Plasmazellen. Der
grosse Teil der B Gedächtniszellen stammen aus den Lymphknoten und sie differenzieren sich zu IgG
sekretierenden Plasmazellen. Diese Zellen exprimieren CXCR4, alfa4beta1 Integrin und LFA-1, die
für das Homing ins Knochenmark nötig sind. Im Knochenmark entwickeln sich diese Zellen zu
langlebigen Plasmazellen.
9.6.2.
Migrationswege der dendritischen Zellen
Die das Knochenmark verlassenden dendritischen Zellen erreichen ihre bestimmten Zielorgane /
Zielgewebe durch den Blutkreislauf. Der Thymus, die Lymphknoten, die Milz und die Haut sind von
der höchsten Wichtigkeit. Während plasmazytoide dendritische Zellen in allen vier Zielorganen zu
finden sind, kommen konventionelle DZ Zellen im Thymus und in der Milz auch vor. In der Haut und in
154
den Lymphknoten treten dazu präkursor DZ Zellen auch auf. Unterschiedliche Rezeptor-Ligand
Bindungen sichern die Ankunft der DZ Zellen in die jeweiligen Zielorgane. Im Falle der Lymphknoten
und des Thymus sind die VLA4-VCAM1 und die PSLG-1 – CD62 (E/P) Verbindungen von grosser
Bedeutung. In den Follikuli der Milz ist die CXCR5-CXCL13 Verbindung, in den periarteriolen Räumen
der weissen Pulpa ist die CCR7-CCL19/CCL21 Interaktion charakteristisch. Zahlreiche Interaktionen
wurden in der Haut und in den Entzündungsreaktionen beschrieben, in den PSLG-1 – CD62 (E/P),
CXCR1-Fraktalkin, CCR6-CCL20 und CCR2-CCL2 typisch sind.
Schöne Beispiele sind im Falle der Lymphknoten und der Haut für die molekulare Regulation der
Zellmigration zu finden (Abbildung 9.8.).
Abbildung 9.8. Die Migration der dendritischen Zellen in den Lymphknoten.
Im Falle der Zellmigration ist in Menschen die Haut ein sehr interessantes „System”. Die in den oberen
Epithelschichten, nah zur Körperoberfläche patrouillierenden DZ Zellen können relativ schnell zu den
zentralen Komponenten des lymphatischen Systems gelangen. Damit wird es möglich diese Zellen für
experimentelle und therapeutische Ziele zu verwenden.
Die sich im Epithelgewebe befindenden DZ Zellen können einige aus den von Mikroben angegriffenen
Zellen freigesetzten Stoffe (TNFa, IL-1b, PAMP) detektieren. Diese Moleküle wirken auf die DZ Zellen
als Migrationssignale. Die DZ Zellen bauen ihre E-Cadherin Verbindungen ab, wodurch sie sich
mobilisieren lassen. Der nächste Schritt der Migration ist der Abbau der basalen Membran, oder der
155
dazu assoziierten Komponenten der extrazellulären Matrix (EZM). Dieser Prozess wird von
Matrixmetalloproteinasen (MMP2, MMP9) durchgeführt. Gleichzeitig erscheinen Chemokinrezeptoren
(CXCR4, CCR7, CCR8) auf der frontalen Oberfläche der Zellen. Sie können bestimmte Chemokine
(CXCL12, CCL21, CCL1) in sehr kleinen Konzentrationen wahrnehmen, das hilft in der Wahl der
Richtung der Migration. Die DZ Zellen adhärieren sich an das Endothel der afferenten Lymphgefässe
im Raum des Bindegewebes unter der Haut. In diesem Prozess sind die CCR7-CCL21, VLA-4 –
VCAM-1, LFA-1-ICAM-1 und Sphingosin 1-Phosphat Signale und der promiskuide Chemokinrezeptor
(D6) des Endothels beteiligt. Der letzte Schritt ist die Internalisierung der DZ Zellen in die
Lymphgefässe, wo das Signal CCL21 der Wanderung hilft.
9.7. Die Methoden der Messung der Zellmotilität (Chemotaxis)
Die
Messung
der
Zellmotilität
ermöglicht
die
Analyse
von
vielen
immunologischen
und
zellphysiologischen Zuständen. (i) Verschiedene Zellpopulationen können (? getrennt gemessen /
unterschieden) werden, (ii) die Migrationsaktivität von Zellgruppen können mit Hilfe von
Referenzliganden (z.B. fMLF, IL-8) bestimmt werden, (iii) die chemotaktischen Wirkungen von einigen
Körperflüssigkeiten oder von aus ihnen isolierte Stoffe können analysiert werden und schließlich (iv)
die Wirkungsmechanismen von neuen, aus pharmakologischen Gründen wichtige Stoffe oder
späteren Arzneimittelmolekülen können untersucht werden. Die Wahl der geeigneten Modelzellen und
Untersuchungstechniken braucht besondere Sorgfalt.
Abbildung 9.9. zeigt zwei verschiedene Systeme bei der Messung der Chemotaxis. Die Methoden
werden abhängig davon verwendet,
ob sich die Zellen in 3 oder 2
Dimensionen bewegen.
Im reversiblen System sind die
Zellen in freiem Raum, jedoch in
einem filter-getrennten System ist
die Chance minimal, dass die Zellen
zurückwandern würden. In diesen
Systemen
entscheidet
der
Kon-
zentrationsgradient, wie lange die
Untersuchung dauert. Wenn der
Konzentration-gradient ausgeglichen
wird, misst man keine Chemotaxis,
aber chemokinetische Aktivität.
Abbildung 9.9. Hauptformen Zellmigration zu messen
Die Aktivität der chemotaktischen Zellen und die Induzierbarkeit der Chemotaxis können durch
mehreren Methoden gemessen werden. Die Menge der erhaltenen Informationen steht nicht im
Verhältnis mit der Zuverlässigkeit der Methoden. Einerseits erlaubt die Dunn-Kammer z.B. – eine der
die meisten Informationen gebenden Methoden – die Messung von relativ wenigen Zellen.
156
6
Andererseits ergeben die Rezeptorbindungs-Untersuchungen nur eine Angabe, obwohl 10 Zellen
gemessen werden.
Die besten Methoden sind jene, die mehr Parameter untersuchen, und zahlreiche Methoden werden
endlich analysiert. Unten folgen nur einige der vielen Anwendungstechniken.
9.7.1.
Reversible Systeme
Die zu diesen Gruppe gehörenden Methoden ermöglichen die Untersuchung der Zellen, die sich mit
amöboiden Bewegung oder mit Zilien/Geisseln bewegen.
Die Technik mit dem am längste (24 Stunden) fortbestehenden Konzentrationsgradient wird DunnKammer genannt (Abbildung 9.10.). Das Bild zeigt den Durchschnitt des Systems, mit zwei
konzentrischen
ringartigen
Kam-
mern. Die Migration der
Zellen
erfolgt unter der Abdeckungsplatte,
auf dem Bereich zwischen den
Kammern.
Der
Konzentrations-
gradient entsteht auf diesem dünnen
Flüssigkeitsfilm,
welcher
kontinuierliche,
Bewegung
die
vektorielle
der
Zellen
Abbildung 9.10. Prinzip der Dunn-Kammer
aufrechterhaltet.
Eine seit langem verwendete Technik ist die Agarplatten-Methode, die die Bewegung auf einer
Oberfläche misst (Abbildung 9.11.). Zusätzlich gibt es viele weitere Chemotaxis Assays. Die
Agarplatten-Methode
ist
ähnlich
dem
zelluläre
Assay,
dessen
Grundprinzip
ähnlich
der
immunologischen Technik der Messung von Antigen-Antikörper Interaktionen ist. Die qualitativen
Eigenschaften der Methode können mit der Messung der Abstände zwischen dA und dK in
quantitative umgewandelt werden.
Abbildung 9.11. Messung der Zellmigration mit Agarplatte Technik
157
9.7.2.
Irreverzible Systeme
Der Boyden-Kammer (Abbildung 9.12.) ist die am häufigsten verbreitete Technik, um Chemotaxis zu
messen. Die Technik wurde 1962 von Stephen Boyden beschrieben. Ihr Prinzip ist ein zwei-Kammer
System, wo die Kammern mit einem Filter voneinander getrennt sind. Der Filter ist nur für jene Zellen
durchlässig, die sich mit aktiver Bewegung bewegen. Die Zellen werden in die obere Kammer
eingegeben, die untersuchende Probe ist in der unteren Kammer. Während der Inkubationszeit
wandern die Zellen durch die Poren des Filters entlang des Konzentrationsgradienten in die untere
Kammer. Die Migration der Zellen kann durch die Messung der Zellzahl ausgewertet werden, oder
durch den Nachweis von einigen spezifischen Enzymen oder durch die Bestimmung der ATP
Moleküle
in
den
Zellen.
Der
Nachteil der Methode ist, dass
eine
Kammer
nur
einem
Messpunkt entspricht, also viele
Kammern
müssen
gleichzeitig
verwendet werden. Um
dieses
Problem zu lösen, wurde eine
Form von 96-Well-Multititerplatte
auch entwickelt, wodurch viele
Abbildung 9.12. Struktur und Prinzip der Boyden- Kammer –
Rechts: wandernde Zellen durch die Poren des Filters
parallele Experimenten gleichzeitig
durchgeführt werden können.
9.7.3.
In vivo Techniken
Wachstumsfaktor
Konzentration in Matrigel
Konzentration in GFR- Matrigel
EGF
0.5-1.3 ng/ml
< 0.5 ng/ml
bFGF
< 0.1-0.2 pg/ml
n.d.
NGF
< 0.2 ng/ml
< 0.2 ng/ml
PDGF
5-48 pg/ml
< 5 pg/ml
IGF-1
11-24 ng/ml
5 ng/ml
TGF-b
1.7-4.7 ng/ml
1.7 ng/ml
GFR – Spiegel vermindert; n.d. – kann nicht detektiert werden
Tabelle 9.1. Der Inhalt der Wachstumsfaktoren in Matrigel Präparaten
Wenn ein lebendes Tier verwendet wird um die Experimenten durchzuführen, wird oft ein aus dem
Tumorgewebe gewonnenes EZM (extrazelluläre Matrix) Konzentrat, das Matrigel, verwendet. Matrigel
ist ein Netzwerk, das eine künstliche Umgebung für die wandernden Zellen darstellt. Dieses Material
wird in den Scheiben-Assays verwendet, wenn man mit Filtern bedeckte Scheiben in ein Versuchstier
implantiert. Darin enthalten ist Matrigel und der zu untersuchende Stoff. Nach einigen Tagen nimmt
158
man die Scheiben heraus. Die Anzahl der eingewanderten Zellen und das Verhältnis der
unterschiedlichen Zellpopulationen können dann bestimmt werden. Tabelle 9.1. zeigt die Grenzen der
Verwendbarkeit der Matrigel-EZM Mischung. Die Mischung besitzt einige Wachstumsfaktoren in viel
grösseren Konzentrationen als physiologisch benötigt wäre, und das kann in einigen Experimenten
auch oft ein Nachteil sein. Eine Lösung ist die Einführung von solchen Matrigel Systemen, die
niedrigere Mengen von Wachstumsfaktoren enthalten. (GFR = growth factor reduced)
Eine weitere geistreiche Methode gehört zu den in vivo Assays, die Sephadex Perlen in den
intraperitonealen Raum des Versuchstiers bringt. Die Perlen lösen eine starke Zellmigration aus. Sie
ziehen die Zellen in den Raum an. Verschiedene Stoffe können an die Perlen gebunden werden,
wodurch.ihre Chemotaxis-induzierende Wirkung studiert werden kann. Die Auswertung erfolgt nach 648 Stunden durch das Absaugen der peritonealen Flüssigkeit.
Die Wundheilung oder ‘wound healing’ Assays werden auch zusammen mit diesen Techniken
diskutiert. Die aus Epithelzellen geformten konfluenten Schichten werden beschädigt. Dann wird
beobachtet, wie schnell sich die zwei verletzten Oberflächen annähern. Eine verlässliche Methode
Wunden herzustellen ist die Anwendung von einer Platte mit 24-48-96 Spitzen, die sich unter gut
kontrolliertem Druck bewegen und die Epitheloberfläche beschädigen.
9.7.4.
Die neusten Techniken
Abbildung 9.13. Prinzip der ECIS Technik
Das Prinzip der auf der Impedanz liegenden Messungen wurde von dem Nobelpreis Gewinner für
Physik, Ivar Giaver, beschrieben. Diese Messungen können bei dem ersten Schritt der Chemotaxis,
159
der Zelladhäsion verwendet werden und auch für die Untersuchung der Migration selbst. Nach dem
Prinzip adhärieren sich die Zellen auf der Elektrode die in den Stromkreis des Wechselstroms
eingeschaltet wird. Da die Zellen gute Isolationsmittel sind, ergeben sie steigende Ohm Resistenz (R)
und Impedanz (Z) Werte. Die Induzierbarkeit und die Hemmbarkeit der Zellen sich zu adhärieren
können erfolgreich gemessen werden. Der Wert der Methode ist dass die Prozesse mehrere Tage in
real-time – in wirklicher Zeit – verfolgt werden können (Abbildung 9.13.).
Eine weitere Methode welche das Prinzip der Boyden-Kammer und der Impedanz-Messung
(xCELLigence – Roche) vereint, wurde auch entwickelt. Der Filter ist mit Elektroden zwischen den
zwei Kammern bedeckt, also die wandernden Zellen generieren ein elektrisches Signal und die
addierten Signale stellen die Impedanz her. Die steigende Impedanz ist proportional mit der Anzahl
der positiven (der wandernden) Zellen.
Elektroden können auch der pünktlicheren und genaueren Messung der Wundheilung dienen. Diese
Methode ist die so weit am objektivsten ausgearbeitete Technik um die Wundheilung zu studieren.
Die sogenannte intravitale Mikroskopie kann auch für die Untersuchung der Zellmigration verwendet
werden. Lebende Tiere oder grössere Organe können ohne Fixierungsmittel analysiert werden. Die
Kamera funktioniert mit einer extrem schnellen Verschlusszeit, damit vaskuläre Prozesse, wie die
Adhärenz der Zellen zur Gefässwand und Transmigration, monitorisiert werden können.
„traction force microscopy” (TFM)
Diese Technik ist die empfindlichste Methode um sich bewegende Zellen zu untersuchen. (Abbildung
9.14.). Ihr grundsätzliches Prinzip beruht auf den entstehenden Kräften zwischen den sich
bewegenden Zellen und der unterliegenden Oberfläche bei den fokalen Kontakten während der
amöboiden Bewegung. Die Kräfte sind mit Hilfe von Mikronadeln messbar. Die Grösse der Kraft ist in
nN (nanoNewton).
Abbildung 9.14. Kräfte bei der Anwendung der „traction force microscopy”
160
9.7.5.
Weitere Methode zur Migrationsanalyse
Die Untersuchung der Zellmigration hat nicht nur mit der Untersuchung der sich bewegenden Zellen
zu tun, aber bedeutet auch der molekuläre Nachweis der Rezeptoren, der Liganden und der
Expression ihrer Gene. Die gesuchte RNA wird erst mit ihrem markierten, antisens- Paar hybridisiert,
nachdem eine nur die einsträngige RNA Moleküle verdauende RN-ase verwendet wird. Die
zweisträngigen
markierten
Moleküle
können
getrennt
werden.
Es
existieren
viele
Chemokin/Chemokinrezeptor Kits.
Übersetzt von Erna Pap
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162
10. ANALYSEMETHODEN DER AUTOANTIKÖRPER, HLATYPISIERUNG
(GYÖRGY NAGY, ZSUZSANNA PÁL)
10.1. Die Autoantikörper und ihre analytische Methoden
10.1.1. Die Entstehung und allgemeine Eigenschaften der
Autoantikörper
Die Vielfalt der Antikörper der B-Zellen verleiht dem menschlichen Körper einen wirksamen Schutz vor
den unzähligen Pathogenen welche unseren Organismus alltäglich angreifen. Im Verlauf der
wiederholten Aktivierung von B-Zellen entstehen, dank der Affinitätsreifung, Antikörper mit immer
höher Bindungskraft und, dank des Isotypenwechsel, Antikörper vom Typ IgG, IgA, IgE, usw., die
verschiedene immunologische Funktionen ausüben können. Andererseits ist ein wirksamer Schutz vor
diesen Pathogenen auch mit gewissen Risiken verbunden, weil die Prozesse, welche die Vielfalt der
Antikörper herstellen, manchmal auch zur Bildung von potentiell gefährlichen Autoantikörpern führen
können.
Autoantikörper kommen in allen Menschen vor. Eine wahre Autoimmunerkrankung entsteht jedoch nur
in ca. 5% der menschlichen Population. Die Entstehung von solchen Krankheiten ist ein langer
Prozess mit vielen, unter anderen genetischen, hormonellen, epigenetischen und umweltbeeinflussten Faktoren, die alle die Pathogenese beeinflussen können. Die Autoantikörper selber
können dementsprechend in zwei größeren Kategorien eingeteilt werden: in den natürlichen, also in
allen gesunden Menschen vorkommenden, und in den pathologischen Autoantikörper, die für
Autoimmunerkrankungen typisch sind.
Natürliche Autoantikörper sind vor allem von den B1 Zellen (CD5+ B Zellen) sezernierte polyreaktive
Antikörper, welche in dem menschlichen Serum in einer relativ hohen Konzentration vorkommen, und
vor allem gegen vitale, konservierte Antigene gerichtet sind. Sie bauen den immunologischen
Homunculus auf, schützen aktiv körpereigene Strukturen, aber nehmen auch an dem primären Schutz
teil, auch in der ersten Linie der Verteidigung gegen manche Pathogene. In den meisten Fällen sind
sie Antikörper vom Typ IgM oder IgA, und sind nur selten eine somatische Hypermutation
durchgegangen. Meistens werden sie von den B-1a Zellen gebildet, welche aus der embryonalen
Leber nach der Geburt in das Peritoneum und in die Pleura einwandern. Hier haben sie einen
langsamen Turnover, vermehren sich sehr langsam, nur damit die abgestorbenen B-1a Zellen
kontinuierlich ersetzt bleiben, und ihre Antikörperproduktion ein Leben lang aufrechterhalten bleibt.
Pathologische Autoantikörper hingegen werden vorwiegend von B2 Zellen gebildet, und eine Reihe
von Beweisen existieren, die besagen dass sie meistens lokal, an oder nahe zur Stelle der
Autoimmunreaktion gebildet werden. In der Rheumatoiden Arthritis erscheinen in der synovialen
Membran, in Myasthenia gravis im Thymus, autoantikörper-produzierende ektopische Keimzentren,
163
also solche atypischen Keimzentren die außerhalb ihrer regulären Lage, also außerhalb der
sekundären Lymphorgane entstehen. Ähnlicher Weise, in der Multiplen Sklerose kann man z.B.
intrathecal IgG Produktion in der Rückenmarksflüssigkeit nachweisen. Pathologische Autoantikörper
haben eine hohe Affinität, sind entweder vom IgG, IgA oder IgM Typ, und können auch eine hohe
Konzentration im Serum erreichen. Generell kann man sagen, dass zwischen dem Beginn der
Produktion der ersten Autoantikörper, und der Beschädigung eines jeweiligen Zielorgans in einer
Autoimmunerkrankung, immer eine gewisse Zeit vergeht.
Mit anderen Worten, um die klinisch nachweisbaren Symptome zu erreichen, muss ein bedeutender
Teil der Zellen des Zielorgans schon beschädigt oder vernichtet worden sein (z.B. müssen in Diabetes
mellitus die Anzahl der b-Zellen der Bauchspeicheldrüse schon deutlich vermindert sein). Aus diesen
Gründen sind Autoantikörper im Serum oft früher nachweisbar als sich die ersten Symptome der
Krankheit manifestieren könnten. Demzufolge kann der Nachweis von pathologischen Autoantikörpern
im Serum nicht nur als diagnostischer, sondern auch als prognostischer Marker benutzt werden.
Hierzu kommt, dass man eine Vielzahl von ihnen auch in der Einschätzung der Effizienz einer
bestimmten möglichen Therapie benutzen kann. Sie können also auch als prädiktive Marker
angewandt werden, und viele von ihnen sind aussagekräftig was die Effizienz einer gewählten
Therapie betrifft.
Pathologische Autoantikörper können durch viele unabhängige Mechanismen entstehen. Infektionen
können ihre Produktion durch mehrere Wege auslösen:
1. Durch die molekulare Mimikry, also Ähnlichkeiten zwischen Antigenen des Pathogens auf die
das Immunsystem reagiert und Antigenen des menschlichen Körpers, welche durch
Kreuzreaktion eine Autoimmunerkrankung erzeugen. Ein Beispiel dafür ist die, nach Infektion
mit Campylobacter jejuni entstehende Polyneuropathie, das Guillain-Barre Syndrom.
2. Infektionen können zu einer verstärkten MHCII Expression führen, oder einer erheblich
gesteigerten Expression von kostimulatorischen Molekülen. Dies kann dann dazu führen, dass
auch körpereigene Antigene (die zwar von der derselben APZ wie die Pathogen-Antigene
präsentiert werden, aber normalerweise toleriert werden) eine Immunantwort induzieren.
3. Manche Erreger, z.B. das Epstein-Barr Virus können eine polyklonale Aktivierung von BZellen, oder manche Superantigene eine polyklonale Induktion von T-Zellen erzeugen. Durch
die folglich starke Proliferation der Zellen können sich unter ihnen auch autoreaktive Klone
befinden, welche von der peripheren Toleranz nicht mehr kontrolliert werden können, und eine
Autoimmunität hervorrufen.
Neben Infektionen können Autoimmunerkrankungen auch von verschiedenen Fehlern in der
Regulation der Immunhomeostase erzeugt werden:
1. Pathologische Abnormitäten der Antigenprozessierung können Autoimmunerkrankungen erzeugen,
zum Beispiel im Falle des Morbus bechterews (siehe später).
2. Myasthenia gravis ist eine Autoimmunerkrankung in der die neuromuskuläre Endplatte
beeinträchtigt ist, indem Antikörper gegen verschiedene Komponenten der quergestreiften
Muskelzellen gebildet werden, welche mit der neuromuskulären Transmission interferieren, und
164
dadurch die für die Krankheit typische Muskelschwäche erzeugen. In dieser Krankheit spielt eine
Dysfunktion des Thymus eine wichtige Rolle. Die Mehrheit der jungen Patienten weist eine Thymus
Hyperplasie vor, und 8-10% aller Patienten leiden an einem Thymom. In den Patienten mit Thymus
Hyperplasie wird ein Autoantikörper gegen den nikotinergen AChR induziert. In den ThymomPatienten versagen die Selektionsmechanismen der T-Zellen, weswegen hohe Mengen von
autoreaktiven T-Zellen mit unterschiedlicher Spezifizität dem Thymus entkommen, und die Peripherie
erreichen.
3. Genetisch bedingte Fehler in der Differenzierung von T-Zellen im Thymus können auch zur
Produktion von Autoantikörpern führen: eine rezessive Mutation des AIRE Gens bedingt z.B. das
APECED Syndrom.
4. Eine ungenügende Effizienz der Entfernung von apoptotischen Zellen kann zur Freilassung von
großen Mengen von intrazellulären Antigenen führen, wie zum Beispiel im SLE, wo z.B. anti-dsDNA
Autoantikörper gegen sie gebildet werden.
5. Therapeutische Anwendung von manchen Medikamenten, wie die des Procainamids oder
Hydralazins können durch die Beeinflussung der Genexpression der DNA Methylasen wirken. Sie
beeinflussen letzten Endes die DNA-Methylierung, üben epigenetische Einwirkungen auf Gene welche
in
dem
Pathomechanismus
der
Krankheit
eine
Rolle
spielen
aus,
und
rufen
so
eine
Autoantikörperproduktion hervor.
6. Die Freilassung von Antigenen aus den für das Immunsystem normalerweise unzugänglichen
Bereichen des Körpers, also den Zonen des sog. Immunprivilegs, kann auch die Sekretion von
Autoantikörpern fördern, wie es im Falle der sympathischen Ophtalmopathie z.B. zu sehen ist.
7. Auch funktionelle Abnormitäten in den regulatorischen T-Zellen können die Autoantiköperproduktion
fördern. Mutation des typischerweise in Treg Zellen exprimierten Foxp3 Gens ist stark gekoppelt zum
IPEX Syndrom.
8. Eine Mutation des AID Gens, das in der Entwicklung des B-Zell-Repertoirs unumgänglich ist,
verursacht nicht nur Hyper-IgM Syndrom in AID knockout Mäusen, sondern steigert auch ihre
Empfindlichkeit für Autoimmunerkrankungen.
10.1.2.
Die wichtigsten Charakteristika von Autoimmunerkrankungen
Autoimmunerkrankungen sind in systemische und organspezifische Kategorien einzuteilen. Von den
systemischen Autoimmunkrankheiten sind die häufigsten das Sjögren Syndrom, die Rheumatoide
Arthritis, und SLE, in denen eine Autoimmunität gegen eine Reihe von herkömmlichen häufigen
körpereigenen Antigenen entwickelt wird.
Bei den organspezifischen Autoimmunitäten gibt es dagegen eine Immunantwort gegen spezifische,
auf bestimmte Organe beschränkte Antigene, wie z.B. anti-TSHR Antikörper, welche die Schilddrüse,
oder anti-nikotinerg AChR Antikörper, welche Funktionen der quergestreiften Muskelzellen
beschädigen. Diese zwei Antikörper zeigen auch, wie Autoantikörper die Zielorgane beeinflussen
können. Die anti-AChR Antikörper interferieren mit der Signalübermittlung des nACh-Rezeptors, die
anti-TSHR Antikörper können die TSH Rezeptoren überstimulieren, und durch unkontrolliertes
Wachstum eine Hyperthyreose und Morbus Basedow verursachen. Drittens, in der Hashimoto
165
Thyreoiditis fördern gegen die Schilddrüsen gerichtete Antikörper die immunvermittelte Zerstörung der
Schilddrüse und erzeugen eine Hypothyreose.
Abhängig vom Isotyp der sezernierten Autoantikörper kann der Mechanismus der Erzeugung der
Gewebeschäden auch unterschiedlich sein. In der MG sind die produzierten Anti-AchR Antikörper
meistens IgG1 und IgG3 Typ Antikörper, welche neben der induzierten Internalisierung der
Rezeptoren auch Komplementaktivierung und ADCC auslösen können. In einem anderen Subtyp der
MG, in dem anti-MuSK Antikörper typisch sind, sind die Antikörper vor allem vom Typ IgG4, und
infolge einer posttranslationellen Modifizierung sind sie nicht in der Lage das Komplement zu
aktivieren. In diesem Fall sind die Gewebeschäden wahrscheinlich von einem durch AK
beschleunigten Abbau von MuSK verursacht.
Generell muss man sehen dass in den systemischen Autoimmunerkrankungen eine Vielzahl von
Autoantikörpern gleichzeitig vorhanden sein können, wogegen Autoantikörper auch infolge von
Infektionen gebildet werden können, die aber später meistens keinerlei klinischen Konsequenzen
haben werden.
Wenn ein Verdacht auf eine Autoimmunerkrankung in der klinischen Praxis besteht, wird am öftesten
ein Nachweis der in der jeweiligen Krankheit am häufigsten vorkommenden Autoantikörper verlangt.
Trotzdem ist die Präsenz von diesen Antikörpern an sich noch kein spezifischer Beweis für eine
gewisse Autoimmunerkrankung, also dürfen die Autoantikörper-Werte nur zusammen mit dem
klinischen Bild interpretiert werden.
Auf
den
nächsten
Seiten
werden
wir
anhand
von
zwei
Beispielen
von
systemischen
Autoimmunerkrankungen (SLE und RA) die verschiedenen Methoden der klinischen Analyse von
Autoantikörpern erklären. Von den organspezifischen Autoimmunitäten und ihre Autoantikörper
werden wir uns nur mit der Myasthenia gravis im Detail auseinandersetzen.
10.1.2.1. Lupus erythematodes (SLE)
Der Lupus erythematodes ist typischerweise die Erkrankung von jungen, 20-50 Jahre alten Frauen.
Obwohl Autoimmunkrankheiten generell öfter in Frauen als Männern vorkommen, ist der SLE das
Paradebeispiel für diesen Unterschied, da das Verhältnis von kranken Frauen vs. Männern bei SLE
ca. 9:1 beträgt. Die Prävalenz in Frauen ist zurzeit 1:800-1000, Tendenz steigend. Der SLE ist der
Archetyp von komplexen Autoimmunkrankheiten. Je nach beeinträchtigtem Organ können die
Symptome recht variabel sein: z.B. Arthritis, Pleuritis (Brustfellentzündung) und Pleuraerguss,
Herzrhythmusstörung, Fieber, Ermüdung, Schwäche, Schmetterlingserythem am Gesicht, Nephritis,
Anämie, Raynaud-Syndrom, neuronale Probleme, Vaskulitis, usw. Eine Vielzahl von Autoantikörpern
werden gebildet, wie z.B. antinukleärer Antikörper (ANA), Rheumafaktor (RF), anti-C1q (Komplement),
anti-Erythrozyten Antikörper, anti-doppelsträngige DNA Antikörper (anti-ds-DNA), und oft sind
Kryoglobuline auch zu sehen, also aus Immunglobulinen bestehende Komplexe, die bei niedrigeren
Temperaturen im Serum Präzipitate bilden.
166
Abbildung 10.1. Zusammenhang zwischen Aktivität von SLE und Konzentration der Serum anti-DNA
Antikörper bzw. Komplement-Aktivierung
10.1.2.2. ANA (antinukleäre Antikörper)
ANA ist ein Sammelbegriff von Antikörpern die verschiedene Zellkern-Komponente erkennen. ANAs
tauchen in vielerlei autoimmunen und infektiösen Krankheiten auf. Zum Beispiel in SLE sind ANA
Antikörper vom Typ anti-Chromatin, anti-dsDNA, anti-Histon, anti-Sm (=anti-Smith, gegen ein snRNP),
in der Sklerodermie anti-U1RNP (auch gegen ein snRNP), anti-Scl-70 (gegen Topoisomerase 1), antiCentromer, im Sjögren Syndrom die SS-A und SS-B Antikörper, in Polymyositis die anti-Jo1 (HistidintRNA Synthetase) Antikörper typisch.
Diese Antikörper werden normalerweise mit Immunhistochemie nachgewiesen, und danach wird ihr
Titer genauer, mit ELISA bestimmt. Ein screening test für ANAs ist die Analyse von ANA-erzeugte
Immunfluoreszenz an der HEP2 Zellinie (ein menschliches epidermoides Karzinom). Das verdünnte,
zu analysierende Serum wird zu den Hep2 Zellen gegeben, und dann, falls ANA vorhanden ist, wird
ihre Bindung nachgewiesen bzw. ihr Bindungsmuster im Zellkernen wird mit Fluoreszenz-markiertem
anti-human IgG, mittels indirekter Immunhistochemie analysiert. Bei solchen Analysen wird als
diagnostisches Endergebnis sowohl die angewandte Verdünnung, als auch das Muster der
Antikörperbindung im Zellkern (nukleolär, granular, homogen, peripher), angegeben. Falls möglich,
muss man jedoch auch bestimmen und angeben, gegen welche Kernkomponente genau die ANAs
gerichtet sind. Diese sind alles wichtige Informationen, weil z.B. unter 1:40 Serumverdünnung eine
Positivität auch bei gesunden Menschen vollkommen normal ist. Der Labortest ist eigentlich so
eingestellt worden, dass es bei einer Verdünnung von 1:160 in 5% der gesunden Population ein
positives Resultat gibt. Mit anderen Worten, die Spezifizität des Tests beträgt 95%, d.h. 5% ist der
erwartete Anteil der falsch positiven. Falsch positiv ist eine Testperson ohne klinischen Symptome,
aber mit granulärer Zellkernfärbung (nur dieses Muster kann in gesunden Menschen vorkommen).
Pathologische, z.B. homogene Kernfärbung geben Patienten mit anti-dsDNA Antikörper in SLE,
periphere Kernfärbung ist typisch z.B. bei anti-Histon Antikörpern in SLE und Sklerodermie, nukleoläre
Kernfärbung ist charakteristisch im Falle von anti-Topoisomerase Antikörpern in Sklerodermie,
167
granuläre Kernfärbung kann man bei z.B. anti-RNPs sehen (SLE, Sklerodermie, Mischkollagenose,
Sjögren), obwohl sie auch in gesunden Personen, nach bestimmten viralen oder anderen Infektionen,
vorkommen können. Indirekte Immunfluoreszenz wird auch angewandt wenn man Immunkomplexe in
beeinträchtigten Organen (Niere oder Haut), in entsprechenden Gewebe-Biopsien, nachweisen
möchte.
Wenn der Screening-test ein positives Ergebnis zeigt, dann folgen spezifische Testverfahren um
festzustellen, um welchen Antikörper unter dem Sammelbegriff ANA es sich in dem jeweiligen Fall
eigentlich handelt. Dies zu bestimmen ist durch spezifische ELISAs, Immundiffusion, oder Western
blot möglich. Da wir diese Techniken schon in anderen Kapiteln besprochen haben, werden wir in
diesem Bereich hier nicht in weitere Details gehen.
Bestimmung der Präsenz und Titer von Autoantikörpern ist nicht nur diagnostisch, sondern es ist auch
prognostisch und prädiktiv wichtig. Zum Beispiel wenn in SLE der Titer von anti-dsDNA Antikörpern
sinkt, und parallel dazu die Serumkomplement-Konzentration steigt, dann geht die Krankheit in eine
Remission, bzw. die Therapie wirkt gut.
Die Präsenz von bestimmten anderen Autoantikörpern z.B. die der anti-Chromatin AKs, ist häufiger in
Lupus Nephritis, also kann prognostisch auf eine Nieren-Beschädigung in SLE hindeuten. Unter den
Autoantikörpern mit prognostischem Wert in SLE können z.B. die anti-Ro (=SSA) Antikörper, die 10
Jahre vor dem Ausbruch der Krankheit schon detektierbar sind, erwähnt werden, die anti-dsDNA
Antikörper, die 2.5 Jahre und letztlich die anti-Sm Antikörper, die einige Monate vor den ersten
Symptome im Blut erscheinen.
10.1.2.3. Kryoglobuline
Kryoglobuline sind Serum Immunglobuline welche bei Temperaturen unter +37°C ein Präzipitat bilden,
aber erneut aufgewärmt gehen sie schon wieder in die Lösung. An dieser Stelle ist es wichtig
klarzumachen, dass Kryoglobuline zwar in der Autoimmunität oft vorkommen, sie sind aber nicht
spezifisch für Autoimmunerkrankungen, weil sie auch in anderen Krankheitsbildern, wie z.B. in
manchen malignen hämatologischen Krankheiten und auch in der Hepatitis C Infektion ziemlich
typisch sind.
Sie zeigen mehrere Untergruppen: Typ I: isolierte monoklonale Immunglobuline (wie monoklonales
IgG oder IgM, selten andere Isotypen), Typ II: monoklonales IgM welches als Rheumafaktor
polyklonale IgG Antikörper an ihren Fc Teil bindet, und Typ III: ähnlich wie Typ II, bloß das IgM
Rheumafaktor polyklonal ist.
Der Nachweis von Kryoglobulinen war früher eine umständliche und lange Prozedur, in der zuerst
Serum bei +37°C isoliert, und danach 2-7 Tage lang bei +4°C gelagert worden ist. Falls ein Präzipitat
in der Lösung zu sehen war, wurden die Proben zentrifugiert, nach Entfernung des Überstands mit
physiologischer Salzlösung vermischt und wieder auf +37°C erwärmt. Wenn das Präzipitat wieder
löslich geworden ist, wurde es als ein Kryoglobulin identifiziert.
Heute werden Kryoglobuline mit Immunelektrophorese oder Immunfixierung nachgewiesen, welche
nicht nur den Isotyp der Kryoglobuline verraten, sondern auch viel schneller auszuführen sind, als die
klassische Methode.
168
10.1.2.4. Rheumatoide Arthritis
Die Rheumatoide Arthitis ist eine autoimmun Entzündung welche eine Destruktion der knorpel- und
synovialen Membranen hervorruft. Ihre Häufigkeit beträgt 1:100 in der nord-amerikanischen und
europäischen Population. Die Krankheit ist systemisch, und sie hat auch extra-aurikulare
Manifestationen, welche vor allem in den Personen zu beobachten sind, die für die Krankheit typische
Autoantikörper produzieren. Systemische Symptome können z.B. Perikarditis, Lungenfibrose,
trockene Augen, und Polyneuropathie sein. ANAs sind oft vorhanden, und auch anti-zyklisches
citrulliniertes Peptid (anti-CCP) Antikörper sind häufig. Neulich hat man in RA auch Antikörper gegen
citrulliniertes Vimentin und citrullinierte alpha-Enolase entdeckt, mit anderen Worten, die citrullinierten
Proteine bzw. Autoantikörper gegen sie scheinen in der Pathogenese von immer grösserer Bedeutung
zu sein.
Citrullin ist eine proteinogene Aminosäure, Citrullinierung, also das Erscheinen von Citrullin in
Proteinen kann jedoch nur infolge einer posttranslationellen Modifizierung entstehen, weil das Genom
keine Citrullin-spezifische DNA oder RNA Codons beinhaltet. Citrullin entsteht deshalb aus Arginin
Aminosäuren die bereits in einer Peptidkette eingebaut sind: der Prozess wird von einem Enzym
namens Peptidyl-Arginil-Deiminase (PAD) katalysiert.
Abbildung 10.2. Die Biosynthese von Citrullin
Viele Tierexperimente haben gezeigt, dass citrullinierte Antigene Arthritis verursachen können, obwohl
der genaue Mechanismus dahinter noch unbekannt ist. Interessanterweise hat man auch bewiesen,
dass das Rauchen die Citrullinierung generell verstärkt, und weil es auch bekannt ist, dass Rauchen
ein wichtiger Risikofaktor bei RA ist, es ist möglich dass die zwei miteinander kausativ gekoppelt sind.
Die anti-CCP Antikörper sind in der RA vor allem diagnostisch wichtig, weil ihr Niveau nicht mit der
Aktivität der Krankheit korreliert. Die anti-CCP Antikörper kommen in 65% der Patienten vor
(Sensitivität des Markers ist 65%) und ungefähr 95% der anti-CCP positiven Personen haben
tatsächlich RA (Spezifizität des Markers beträgt 95%). Anti-CCP Antikörper werden in der Regel mit
ELISA nachgewiesen.
169
Der Rheumafaktor (RF) ist auch ein typischer Autoantikörper in RA. Dies ist ein Antikörper welcher
gegen andere Immunglobuline produziert wird. Ungefähr 80% der RA Patienten sind Rheumafaktor
positiv, obwohl seine Serumkonzentration in anderen Autoimmunitäten und nach manchen Infektionen
auch erhöht wird. Dementsprechend
weisen ungefähr 10% der gesunden
Erwachsenen
auch
detektierbare
Mengen von Rheumafaktoren vor. In
den RA Patienten prognostiziert ein
höherer Spiegel von Rheumafaktoren
immer einen destruktiveren Ablauf der
Krankheit.
Abbildung 10.3.
Der Rheumafaktor
Der RF wird normalerweise mit zwei Methoden nachgewiesen (es gibt eine Vielzahl von solchen
Methoden, wie Z.B. ELISA, aber in der klinischen Praxis sind diese zwei am weitesten verbreitet):
1. Latex Agglutinationstest: Die zu analysierende Serumprobe wird mit zu menschlichen IgG
gekoppelten Latex Mikroperlen vermischt. Wenn RF in der Serumprobe ist, quervernetzen
sich die Perlen durch die IgG und es bildet sich dadurch ein sichtbares Präzipitat. Dieser Test
ist für Screening geeignet. Ähnlich war früher der sog. Rose-Waaler Test, in dem anstatt
Latexperlen Schaf Erythrozyten benutzt wurden, aber dieser Test ist heute aus praktischen
Gründen nicht mehr so populär, als er einmal war.
2. Nephelometrie: Sie freut sich einer etwas höheren Popularität als der Latex Agglutinationstest,
weil sie etwas sensitiver ist. In der Nephelometrie wird zur Serumprobe eine sehr hohe
Konzentration von menschlichen IgG gegeben. Falls RF vorhanden ist, entstehen kleine
Immunkomplexe im Serum, welche die Lichtstreuung der Probe erhöhen und auf dieser Weise
mit einem Laser-Nephelometer nachweisbar sind. Die Menge der Komplexe ist direkt
proportional zur Stärke der Lichtstreuung.
Genauso wie in dem SLE können der Rheumafaktor und die anti-CCP Antikörper auch in der RA viele
Jahre vor den ersten Symptomen erscheinen. Wenn die zwei Antikörper gleichzeitig ausgewertet
werden, kann der Arzt einen ausgezeichnet sensitiven und spezifischen prognostischer Test
benutzen.
10.1.2.5. Organspezifische Autoimmunitäten
Organspezifische Autoimmunerkrankungen sind unter anderem: autoimmun Thyreoiditis, Pemphigus
vulgaris, autoimmun Myasthenia gravis, usw. In der Myasthenia gravis zeigen mehr als 80% aller
Patienten anti-AchR Antikörper.
Diese Antikörper werden meistens mit einem Radio-Immunassay (RIA) nachgewiesen. In solchen
Testverfahren wird zur Serumprobe des Patienten ein radioaktiv markiertes Antigen, meistens
125
I
alpha-Bungarotoxin-markiertes AchR gegeben. Wenn AchR-spezifische Antikörper im Serum sind,
170
bilden sie Immunkomplexe mit dem markierten AchR. Diese Immunkomplexe werden dann mit der
Zugabe von Anti-human IgG quervernetzt und präzipitiert. Das Präzipitat wird durch Zentrifugierung
von der Lösung getrennt, und seine Radioaktivität, welche direkt proportional zur Konzentration der
Autoantikörper ist, wird mit einer Gamma-Zähler gemessen.
Im Falle der, für die Hashimoto thyreoditis charakteristischen anti-TSHR Antikörper wird eher das
Radio Rezeptor Assay (RRA) benutzt. RRA ist ein kompetitives Assay, in dem bekannte Mengen von
radioaktiv markierten TSH Molekülen in eine Kompetition treten mit einer unbekannten Menge von
Anti-TSHR Autoantikörpern des Patienten. Im Test versuchen diese zwei Moleküle kompetititv zu
einer begrenzten Menge von Bindungsstellen an TSH Rezeptoren zu binden. Je mehr Anti-TSHR
Autoantikörpern vorhanden sind im Serum des Patienten, desto weniger radioaktiv markierte TSH
Moleküle könne zu den Rezeptoren binden, und vice versa. Die Stärke der Radioaktivität des
Präzipitats wird also hier, im Gegensatz zu RIA, umgekehrt proportional zur Menge des
nachzuweisenden Autoantikörpers sein.
Abbildung 10.4. Das Radio Rezeptor Assay (RRA)
Neben diesen Testverfahren wird neulich auch sehr viel mit Antigen-Arrays experimentiert um die
ganze Komplexität der autoimmunen humoralen Immunantwort erfassen zu können. Diese
Technologie beruht auf einer katalogisierten Sammlung verschiedener Autoantigene, welche von
Autoantikörpern in Autoimmunerkrankungen oft erkannt werden. Diese Antigene werden rekombinant
hergestellt, und in einer bestimmten räumlichen Ordnung, in Reihen und Kolumnen, zu einer
speziellen Glas- oder Kunststoff-Oberfläche gebunden (Antigenarray). Nachdem die aspezifische
Proteinbindung zur Oberfläche blockiert wird, wird das Serum des Patienten auf das Array
aufgetragen. Nach einer gewissen Inkubationszeit werden die Autoantikörper des Patienten, falls
vorhanden, zu ihrem erkannten Autoantigen binden. Diese Antikörper werden in dem nächsten Schritt
171
mit Fluoreszenz-markiertem anti-human IgG nachgewiesen, und mit Hilfe eines speziellen ArrayScanners, basierend auf ihrer räumlichen Position und emittierten Lichtintensität, auf dem Array
identifiziert bzw. ihre relative Menge gemessen. Der Vorteil dieser Technologie ist die Vielzahl von
Autoantikörpern die gleichzeitig analysiert werden können. Auf diese Weise könnten auf einem Array
praktisch alle bekannten Autoantikörper aller Autoimmunkrankheiten
in ein und demselben Test
ausgewertet werden. Neben diesen klassischen Antigenarrays gibt es auch solche in Entwicklung, mit
denen die komplementaktivierende Wirkung von Autoantikörpern auch bestimmt werden kann, also
ihre Funktionen auch beschrieben werden können.
10.2. Die HLA-Typisierung
Die menschlichen HLA Gene die für die MHC Proteine kodieren, befinden sich auf dem kurzen Arm
des menschlichen Chromosoms 6. Die Aufgabe der von ihnen kodierten MHC Proteine ist
die
Regulation der Erkennung von körpereigenen und fremden Antigenen. Die MHC Proteine haben zwei
wichtigere Untergruppen. Die MHC I Proteine werden von den HLA A, B und C Genen kodiert. Sie
werden auf der Oberfläche von allen kernhaltigen Zellen exprimiert, wirken nur im Komplex mit einem
zusätzlichen Protein namens beta2-Mikroglobulin, welches von Chromosom 15 kodiert ist, und
präsentieren endogene Antigene für CD8+ Tcit Zellen. Die MHC II Proteine werden dagegen von fünf
HLA Gengruppen kodiert, von denen die letzten zwei nicht so bedeutend sind: HLA DP, DQ, DR, und
DM, DO. MHC II Proteine erscheinen vor allem auf antigenpräsentierenden Zellen, wirken in Form
eines alpha-beta Heterodimers, und präsentieren exogene Antigene für CD4+ Th Zellen.
10.2.1.
Die Nomenklatur des HLA-Systems
Die Nomenklatur des HLA Systems, also die diagnostische Beschreibung der einzelnen, von Person
zu Person meist unterschiedlichen HLA Typen musste mit der Zeit kontinuierlich geändert werden,
weil mit den neueren Methoden eine immer genauere Identifizierung der HLA Typen ermöglicht
wurde. Vor zwei Jahrzehnten waren für die HLA Typisierung nur serologische Methoden erhältlich,
mit der Entwicklung neuer Technologien benutzt man heute aber eher molekulargenetische
Untersuchungsmethoden.
Die Nomenklatur:
HLA-A: HLA-A Gen Lokus
HLA-A1: Serologisch definiertes Antigen. Serologische Methoden ermöglichen nur eine
begrenzte Auflösung. Dies wurde mit der Verbreitung der Techniken der Molekulargenetik
erheblich verbessert.
HLA-A1*: Der “*” markiert Ergebnisse von Typisierungs-Analysen welche mit einer
molekulargenetischen Untersuchung ausgeführt wurden.
HLA-A1*0101 – 4 Nummern Auflösung: Beschreibt solche allelische Unterschiede in der
kodierenden Region der DNA-Sequenz des HLA-Gens, die zu Unterschieden in der
Proteinsequenz führen
172
HLA-A1*010101 – 6 Nummern Auflösung: Beschreibt solche allelische Unterschiede in der
kodierenden Region des HLA-Gens, welche aber wegen der Codon-Degeneration die
Proteinsequenz nicht beeinflussen können
HLA-A1*01010101 – 8 Nummern Auflösung: Sequenz-Unterschiede in den intronischen oder
anderen, nicht-kodierenden Regionen des HLA-Gens
10.2.2.
Methoden der HLA-Typisierung
10.2.2.1. Serologische Methoden:

Mikrozytotoxizitätstest: dieser Test beruht auf einer komplementvermittelten Zytotoxizität,
welche spezifisch gegen die individuellen MHC Varianten eines jeweiligen Patienten ausgelöst
wird. Er wird benutzt für die MHC I Typisierung (HLA-A, -B und -C). Im Laufe des Tests werden
zuerst aus dem Blut des Patienten durch Ficoll-Zentrifugierung Lymphozyten gewonnen. Kleine
Aliquote von diesem Isolat werden dann auf eine 96-Well Platte aufgetragen. Auf der Platte
werden alle Wells mit einem anderen Antikörper inkubiert, die die verschiedenen HLA Serotypen
spezifisch erkennen. Im nächsten Schritt wird zu den Wells Kaninchenserum mit aktivem
Komplement-Inhalt gegeben. Die Komplementproteine zerstören die Zellen in den Wells, wo eine
Antikörperbindung stattgefunden hat. Diese Lyse wird dann mit Exclusionsaassays wie z.B.
Trypanblau sichtbar gemacht und so der HLA-Serotyp des Patienten bestimmt. Trypanbalu ist ein
Farbstoff der die Plasmamembran nicht durchdringen kann.
Abbildung 10.5. Mikrozytotoxizitätstest
Er gelangt also nicht in intakte Zellen, sondern nur nach deren Lyse Der HLA Genotyp/Serotyp
wird hier also anhand der Position der Wells, d.h. die Spezifizität der Antikörper welche eine Lyse
erzeugt haben und Zellfärbung mit Trypan blau ermöglichten, bestimmt. Vorteile des Tests sind
die niedrigen Kosten und dass kein großer Laborhintergrund benötigt wird. Seine Nachteile sind
173
die relativ großen Mengen an Lymphozyten, die zum Test gebraucht werden, und dass es fürs
Labor manchmal schwer ist gegen alle seltene HLA-Serotypen spezifische Antikörper zu finden.

Gemischte Lymphozytenkultur (Mixed Lymphocyte Culture, MLC): dieser Test beruht auf einer
T-Zell-vermittelten Erkennung von individuellen MHC Varianten eines jeweiligen Patienten. Er wird
benutzt für MHC II Typisierung (vor allem HLA-DR und -DQ), und wird typischerweise als
Standardverfahren vor Organtransplantationen ausgeführt. In diesem Fall werden Lymphozyten
des Spenders mit Lymphozyten des Empfängers vermischt, und in eine Zellkultur gebracht, wo
sie typischerweise 48 Stunden lang kultiviert werden. Falls eine MHC Inkompatibilität vorliegt,
werden T Zellen von den fremden MHCs angeregt, was man durch ihre Teilung (mit Hilfe von 3HThymidin Inkorporation) oder Cytokin-Sekretion (mit IFNgamma ELISA) nachweisen kann. Da in
diesem Fall (two-way MLC) nicht klar wird, welche Zellen, d.h. ob die Zellen des Spenders oder
des Empfängers reagiert haben, also ob es nach Transplantation eine Graft vs Host oder Host vs
Graft Reaktion zu erwarten ist, werden manchmal die Zellen des einen Partners mit Bestrahlung
vor dem Test inaktiviert (one-way MLC).
Abbildung 10.6. Gemischte Lymphozytenkultur für HLA-Typisierung
Weiter, wenn der Test zur HLA-Typisierung benutzt wird (Abbildung 10.6.), werden kleine Aliquote
von Lymphozyten des zu testenden Patienten in den Wells einer 96-Well Platte mit Lymphozyten
von bekanntem HLA-Typ z.B. HLA-Dw-1, 2, usw. vermischt, und dann wird die Aktivierung
gemessen. Dies ermöglicht die Bestimmung von speziellen HLA Typen, welche in der Diagnostik
immer in als „HLADw…“ Typen angegeben werden.
10.2.2.2. Molekulare Methoden (DNA Sequenzanalyse)
Diese Techniken tauchten am Ende der ’80-er mit dem RestriktionsfragmentlängenpolymorphismusAnalyse (RFLP) auf, wurden erleichtert in den 90-ern mit der Einführung der Polymerase-
174
kettenreaktion
(PCR),
und
noch
später
mit
der
Verbreitung
der
modernen
einfachen
Sequenzierungsanalysen.

RFLP: Praktisch fast alle genetische Polymorphismen, und so auch die der HLA Gene können mit
RFLP typisiert werden. In der RFLP werden Unterschiede in den Längen der, mit sequenzspezifischen Restriktionsendonukleasen (REs) verdauten DNA, verglichen. REs erkennen und
spalten
bei
typischerweise
4-8
Basenpaaren
lange
DNA
Sequenzen.
Falls
die
Erkennungssequenz durch eine andere allelische Variante geändert wird, findet die Spaltung nicht
statt, und die Länge der DNA Fragment wird geändert. Diese Unterschiede können mit
verschiedenen
Gelelektrophorese-gekoppelten
Techniken
nachgewiesen
und
zur
HLA
Typisierung benutzt werden.

PCR SSOP (PCR Sequenzspezifische-Oligonukleotide-Sonde) HLA-Gensegmente des Patienten
werden mit PCR vermehrt, durch die Primer mit Biotin gekoppelt, und denaturiert. Danach werden
sie auf eine Membran aufgetragen, die in einer bestimmten räumlichen Ordnung (Reihen und
Kolumnen) alle analysierten HLA-Typen in der Form von einzelsträngigen DNA-Sonden
beinhaltet. Die denaturierte, einzelsträngige Biotin-markierte DNA des Patienten wird mit der
einzelsträngigen DNA-Sonde der Membran hybridisiert. Die Positionen der spezifischen
Bindungen an der Membran werden dann mit der Zugabe von einem Avidin-HRP Enzym
Komplexes und letztlich mit der Zugabe eines HRP Substrats sichtbar gemacht. So wird ein
sichtbares Produkt an den Stellen der spezifischen Bindungen entstehen, welche den HLAGenotyp des Patienten angeben.

SSP
(Sequenzspezifische
Primers):
Diese
Methode
bestimmt
den
HLA-Genotyp
mit
sequenzspezifischen PCR Primers, ein PCR Produkt von bestimmter Länge wird erzeugt, falls ein
bestimmtes HLA Allel in der DNA des Patienten vorhanden ist. Meistens werden mehrere PCR
Reaktionen mit jeweils mehreren PCR Primerpaaren gleichzeitig angewandt(Multiplex PCR). Die
Länge der erhaltenen Produkte wird am Ende der PCR mit Hilfe von Gelelektrophorese bestimmt,
und so der Genotyp anhand der Länge der PCR Produkte bestimmt.

SBT (Sequence Based Typing): Die genomische DNA des Patienten wird mit PCR und
nachfolgender Sequenzierung von Base zu Base vollständig abgelesen, und der Genotyp mit Hilfe
von online DNA-Sequenzdatenbanken bestimmt.
10.2.3.
Gewebe- und Organtransplantation
Die Transplantation ist bei vielerlei Krankheiten, wie malignen hämatologischen Krankheiten, vielen
fortgeschrittenen Nierenerkrankungen, schweren Kardiomyopathien usw. eine, meistens zwar für den
Arzt technisch herausfordernde, aber reale Möglichkeit, und oft die letzte therapeutische Chance für
die Patienten. Heute sind schon die technischen Möglichkeiten für eine Transplantation der z.B.
Hornhaut, Lunge, Herz, Bauchspeicheldrüse, Dünndarm, Knochenmark, Haut, Nieren, usw. gegeben.
Die ideale Situation bei Transplantationen ist der Fall in dem der Patient (Empfänger) ein Organ von
einem Spender mit völlig identischen HLA-Allelen erhalten kann. Dies ist der Fall wenn eine isogene
Transplantation zwischen eineiigen Zwillingen, oder seltener, wenn eine allogene Transplantation
175
zwischen HLA-identisches Geschwister ausgeführt werden kann. Solche glücklichen Konstellationen
sind aber extrem selten.
Abbildung 10.7. Vielfalt der klassischen HLA Moleküle an der Oberfläche einer einzelnen
Antigenpresentierende Zelle (APZ), und der genetische Hintergrund dieser Variabilität
Meistens gibt es klare individuelle Unterschiede zwischen den MHC Proteinen des Spenders und des
Empfängers die Transplantationszwischenfälle, sprich eine Abstoßung, auslösen können. Bei den
alltäglichen allogenen Transplantationen wird es also immer ein wichtiges Ziel bleiben solche Spender
zu finden, dessen HLA-Allelkombination am nahesten zu der des Empfängers liegt. Ein begrenztes
Mismatch ist generell akzeptabel, falls es zu keiner großen Reduktion der Halbwertszeit des Organs /
Überleben des Patienten führt, obwohl der Arzt in extrem schweren Fällen auch erhöhte Risiken
eingehen mag. Da HLA Genotypen als Haplotyp vererbt werden, ist es empfehlenswert, nach einem
passenden Spender zuerst in der Verwandtschaft des Empfängers zu suchen. Wenn nämlich z.B.
zwischen zwei Geschwistern ein HLA-Genotyp übereinstimmt, ist die Chance wegen der Haplotype,
dass auch die anderen HLA-Genotypen übereinstimmen, in der selben Familie relativ hoch. Letztlich
muss man auch sehen, dass die relative Wichtigkeit der Übereinstimmung von MHC I und II Proteine
und anderen, z.B. Blutgruppenantigenen bei Abstoßungsreaktionen von Organ zu Organ
unterschiedlich ist. Bei Nierentransplantationen zum Beispiel sind sowohl MHC I als auch MHC II
mehr oder weniger genauso wichtig, aber HLA-DR Mismatches sind extrem kritisch.
Was die andere Seite der Transplantationszwischenfälle, also statt Abstoßung die Graft versus Host
Reaktionen (GVHD) angeht, ist hier die Knochenmarktransplantation bei malignen hämatologischen
Krankheiten eine spezielle Kategorie. Die Übereinstimmung der Blutgruppenantigene ist in diesem
Fall nicht so wichtig, weil nach einer Knochenmark-Transplantation die roten Blutkörperchen des
Empfängers auch ersetzt werden. Andererseits aber, weil die Blutgruppenantigene neben den
Erythrozyten, zwar sehr schwach, aber auch von den Endothelzellen der Kapillaren exprimiert sind(!),
176
ist eine Graft versus Host Reaktion selbst hier nicht vollkommen auszuschließen. Wie bei der
Abstoßung, gilt auch bei der GVHD dass je grösser die Unterschiede in den HLA Genen sind, desto
höher sind die Chancen der Komplikationen.
10.2.4.
HLA Assoziation mit Rheumatoider Arthritis
HLA Typisierung ist eine Analyse die nicht nur bei Transplantationsreaktionen, sondern auch bei
vielen Autoimmunitäten empfehlenswert ist auszuführen. Der Grund für diese Tatsache liegt daran,
dass es schon seit langer Zeit bekannt ist, dass die Mehrheit dieser Krankheiten genetisch bedingt
sind und (unter anderem) auch mit bestimmten HLA-Allelen gekoppelt ist.
HLA-Assoziation ist auch in der RA stark: ungefähr 30% aller Patienten tragen einen bestimmten,
nämlich den HLADRB1 Serotyp. Heute ist dies die stärkste bekannte genetische Assoziation in der
RA, obwohl in der Ära der genomweiten Assoziationsstudien (genome wide asszociation study,
GWAS) man es erwarten kann, dass innerhalb einer kurzen Zeit immer mehr Gene bekannt werden,
die auch in dieser Krankheit von Bedeutung sind. Es ist auch wichtig zu sehen, dass nicht alle, zum
HLA-DRB1 Serotyp gehörenden Genotypen / Allele zur Krankheit mit der selben Wahrscheinlichkeit
assoziiert sind. Ein weiterer interessanter Punkt ist, dass in dem HLA-DRB1 Serotyp, in der dritten
hypervariablen Region der DRβ1 Kette, die Aminosäuren Nr. 70-74 (QKRAA oder QRRAA) zwischen
den HLA-DRB1*01 und HLADRB1*04 Allelen völlig übereinstimmen. Da die zwei Allele auf RA mit
ähnlicher Stärke prädisponieren, geht man davon aus, dass dies den Aminosäuren Nr. 70-74 zu
verdanken ist, die deswegen als “shared epitopes” bezeichnet werden.
Weitere, mit der RA gekoppelte Genpolymorphismen sind z.B. Polymorphismen des protein tirosine
phosphatase non-receptor 22 (PTPN22, eine Komponente der T-Zell-Rezeptor Signalübermittlung)
oder das cytotoxic T-lymphocyte antigen 4 (CTLA-4, ein negativer Kostimulator-Rezeptor auf
aktivierten T Zellen). Generell könnte man sagen, dass Polymorphismen von solchen und ähnlichen
Immungenen meistens nicht nur mit einer, sondern einer Vielzahl von Autoimmunerkrankungen
assoziiert sind, und sehr oft treten sie mit Umweltfaktoren auch in Interaktion. Zum Beispiel wird die
prädisponierende Wirkung von HLADRB1 auf anti-CCP positive RA vom Rauchen deutlich gesteigert.
10.2.5. HLA Assoziation mit Spondylitis ankylosans (SPA, Morbus
Bechterew)
Morbus
Bechterew
ist
eine
Autoimmunkrankheit
die
mit
starken
Entzündungen
in
den
Wirbelsäulengelenken charakterisiert ist. Die chronischen Entzündungen führen in der Regel zu einer
langsamen und schmerzhaften Verschmelzung der Wirbel, eingeschränkter Bewegungsfreiheit und
sogar Brüchen in der Wirbelsäule. Typische radiologische Befunde sind Verknöcherungen des
Wirbelkörperbandapparates, die am Ende die für die Krankheit typische Bambusrohrform der
Wirbelsäule erzeugen. Im Gegensatz zu vielen anderen Autoimmunerkrankungen kommen in der SPA
Autoantikörper nicht vor. Die SPA zeigt familiäre Häufung mit starker HLA-Assoziation (mit HLA-B27).
In der Tat, ungefähr 90% der Weißen mit SPA sind HLA-B27 positiv. Die Prävalenz der Krankheit ist
ca. 0.25-0.5%. Sie betrifft meistens Männer unter 40 Jahren, und ist in Männern durchschnittlich
siebenmal häufiger als in Frauen. Die Patienten werden meistens mit Taillenschmerz diagnostiziert,
177
der nach längerer Inaktivität, Erholung oder morgens schlimmer wird, aber mit Bewegung sich etwas
verbessert. Die Verkalkung der Sehnen und Gelenke ist ein langer Prozess, findet über mehrere
Jahrzehnte hinaus statt, und ist mit typischen zusätzlichen Symptomen gekoppelt, wie Sehnen- und
Gelenkschmerz, Aorteninsuffizienz oder Iritis (Entzündung der Regenbogenhaut).
Die Frage warum HLA-B27 auf die Krankheit prädisponiert, wurde in Tiermodellen analysiert, und es
stellte sich heraus, dass HLA-B27 transgene Tiere, welche das menschliche HLA-B27 Allel exprimiert
haben, mit der Zeit oft auch SPA-ahnliche Symptome zeigten. Wenn die andere Komponente der
MHCI, also B2 Mikroglobulin gentechnologisch entnommen wurde, haben die Tiere die Symptome mit
unveränderter Häufigkeit gezeigt, und in den HLA-B27 positiven Tiermodellen ist die Krankheit selbst
in der vollen Abwesenheit von CD8+ T Zellen aufgetreten. Diese Ergebnisse deuten darauf hin, dass
SPA nicht von CD8+ T Zellen, bzw. nicht durch Antigenpräsentierung des aktiven HLA-B27 Moleküls
abhängig ist.
Die wahrscheinlichste Erklärung für diese Ergebnisse ist die Hypothese, dass in den SPA Patienten in
der Proteinsynthese der HLA-B27 Moleküle die Faltung der schweren Kette falsch ausgeführt wird.
Die Synthese der schweren Kette und ihre Verkopplung mit dem B2 Mikroglobulin findet im ER statt,
noch vor seinem Transport zur Zelloberfläche. Man nimmt an dass die abnormale Faltung des
Proteins inkorrekt positionierte Disulfidbrücken, Kopplung zu einem Chaperon namens BiP, und eine
Akkumulation des HLA-B27 Proteins im ER erzeugt. Diese Akkumulation wird erst unter dem Einfluss
von Cytokinen, die die Expression von MHC Porteinen verstärken, extrem kritisch und erzeugt eine
Stressreaktion des ERs (sog. ”unfolded protein response”), welche die Zellfunktionen beschädigt.
Zweitens, die betroffene Proteine können wahrscheinlich auch MHC-I Dimere bilden (HC-B27
Dimere), und diese vollkommen abnormale Strukturen erzeugen eine inkorrekte Aktivierung von Th
und NK Zellen (Abbildung 7.8). Der Prozess ist deswegen nicht von den CD8+, sondern von CD4+ TZellen und NK-zellen vermittelt.
Abbildung 10.8. Der wahrscheinliche immunologische Pathomechanismus des Morbus bechterews
178
Wie wir es vorher schon erwähnt haben, sind verschiedene HLA Allele
mit mehreren
Autoimmunerkrankungen gekoppelt. Es gibt HLA Allele die mit Typ-1-Diabetes mellitus, RA, Morbus
bechterew, Myasthenia gravis, oder Narkolepsie assoziiert sind. Die Narkolepsie ist eine neuronale
Erkrankung mit unkontrollierbaren, plötzlichen Schlafanfällen und REM-Phasen. Die Patienten leiden
an Schlaflähmung, also Paralyse nach dem Erwachen, Kataplexie, d.h. von Stress induziertem
Tonusverlust und hypnagogen Halluzinationen (in der REM-Phase beginnenden, entweder im Schlaf
oder an der Grenze des Schlafes und Erwachens auftauchende extrem lebensnahe Halluzinationen)
Der Hintergrund der Krankheit ist unbekannt, obwohl in narkoleptischen Patienten man schon AntiOrexin Antikörper gefunden hat, welche, zusammen mit der HLA-Assoziation eine immunologische
Pathogenese verdächtigen. Ein weiteres Beispiel ist Myasthenia gravis, wo die jugendlichen antiAChR positiven Fälle sich stark von anderen, z.B. anti-MuSK positiven Fällen unterscheiden; eine
Tatsache, welche auf die Existenz von unterschiedlichen Pathomechanismen hindeutet.
Übersetzt von Zoltán Pós
179
11. ÜBEREMPFINDLICHKEIT TYP I.: ALLERGIE
(MARIANNA CSILLA HOLUB)
11.1. Die Gruppierung der Überempfindlichkeitsreaktionen
Gell und Coombs haben nach dem Mechanismus, den entstehenden Effektormolekülen, den
beteiligten Zellen und der Zeit der Entwicklung des Prozesses die Hypersensitivitätsreaktionen in zwei
Gruppen aufgeteilt. Da diese Aufteilung meistens in der heutigen klinischen Anwendung verwendet
wird, übernehmen wir sie auch in diesem Handzettel. Sobald jedoch mehr über die Ursachen und die
Mechanismen der Überempfindlichkeitsreaktionen bekannt wird, können sich diese Kategorien auch
noch ändern.
So wird zum Beispiel in der englischen Literatur – aber nicht in der amerikanischen – häufig eine
zusätzliche fünfte Klasse (Gruppe) verwendet. Diese fünfte Klasse entspricht dem Typ II.
Die untenliegende Tabelle ist die Zusammenfassung der vier Überempfindlichkeitsreaktionen nach der
Aufteilung von Gell und Coombs.
Typ
Reaktion
I. Allergie - Anaphylaxie
IgE –vermittelte Antigen-Antikörper Reaktion
II. cytotoxisch
An den Zelloberfläche-Antigene (extrinsic) oder
Gewebsantigene (intrinsic) spezifisch gebundene Ak (IgG)
III. Immunkomplex
Zirkulierende Antigen-Antikörper Komplexe lagern in den
Gewebe ein
IV. Zellvermittelt - verzögerter Typ
T-Zelle Antwort auf die Antigene
Tabelle 11.1. Die 4 Typen von Überempfindlichkeitsreaktionen
Nach der Allergenexposition entstehen die Symptome am schnellsten im Falle einer Typ I
Überempfindlichkeitsreaktion. Zeitlich gesehen folgen Typ II und dann Typ III. In einer Typ IV
Überempfindlichkeitsreaktion vergeht am meisten Zeit, bis es zum Erscheinen von Symptomen
kommt. Man nennt die Typ I. Reaktion eine Sofortreaktion, die Typ II.Reaktion eine späte
Überempfindlichkeitsreaktion. Die Schwierigkeit
der klinischen Symptome verhält sich im
umgekehrten Sinne zur Nummerierung der Type. So können die Symptome einer Sofortreaktion in
einigen Minuten zum Tod führen. Der Arzt hat sehr wenig Zeit diese Symptome zu behandeln.
180
11.2. Die Entstehung der allergischen Reaktionen
Die wichtigste biologische Wirkung des Allergens ist es, eine IgE-vermittelte Th2 Typ Immunantwort
auszulösen. Dadurch wird im Allgemeinen eine Entzündungsreaktion verursacht.
1. Sensitisierung (in genetisch prädisponierten Personen)
Die für das Allergen charakteristischsten Parameter sind die folgenden:

Sehr kleine Mengen lösen schon die Reaktion aus (z.B. ist 1µg/Jahr aus Ambrosia Pollen genug)

Nicht prozessiertes, intaktes Molekül

Soluble Moleküle im Allgemeinen mit kleinem Molgewicht, die in ausgetrockneten Formen sehr
stabil werden können. Solche ist die allergene Komponente des Kots der Milben, das Der p1 mit
15kD Gewicht.

Die Schleimhaut ist am häufigsten der Ort des Eintrittes der Allergene in den Körper oder der Ort
der Allergenexposition (z.B. respiratorisches Epithel), an dem die ausgetrockneten Antigene
wieder löslich werden. Es existieren Allergene, die die Möglichkeit eines Eintrittes durch ihrer
enzymatische Aktivität steigen. Das Der p1 Allergen des Kots der Milben besitzt eine Komponente
mit Cistein-Serin Protease Aktivität. Das Ergebnis ist die Spaltung der Membranproteine
(Okkludin, Klaudin) der tight junctions, wodurch die Membranpermeabilität der Bronchien steigt
und so die Allergene einfacher in die subepitheliale Zone eintreten können.
Abbildung 11.1. Allergische Reaktion – Sensitisierung
Die Allergene können nicht nur ihren einfacheren Eintritt in den Körper fördern, sondern gleichzeitig
auch die Antigenaufnahme, die Antigenpräsentierung und die T-Zell Aktivierung. Das Der p1 Allergen
wirkt auf die PAR-2 Rezeptoren (protease activated receptor 2) der Epithelzellen durch seine
proteolytische Aktivität und löst die Sezernierung der proinflammatorischen Cytokine (IL-6, IL-8, GMCSF) aus. Diese Mikroumgebung erleichtert die Entstehung der Entzündungsprozesse. Der Kot der
Milben besitzt neben den Allergenen solche Moleküle, die als Adjuvantien dienen und die
Antigenaufnahme der dendritischen Zellen fördern. Ein solches Molekül ist die bakterielle DNA, das
181
Endotoxin. Überwiegt das an TLR-4 gebundene Endotoxin, fördert es eine Th2 Typ Antwort, überwiegt
die an das TLR-9 gebundene hypometilierte DNA, wird eine Th1 Typ Antwort gefördert.
Zusammenfassend kann das Allergen seine Aufnahme von dendritischen oder von irgendwelchen
antigenpräsentierenden Zellen (APZ) begünstigen.
Das von APZ und B Zellen aufgenommene und prozessierte Allergen wird den geeigneten Th2 Zellen
präsentiert und von TZR erkannt. Es führt zur Herstellung der IL-4 und IL-13 Cytokine.
IL-4 und IL-13 fördern den Ig- Klasswechsel in der Umgebung der auf das Allergen spezifischen B
Zellen: IgE Antikörper werden hergestellt. IgE kann an seinen hochaffinen Rezeptor (FcRI) binden,
der auf der Oberfläche der Mastzellen, Basophilen und dendritischen Zellen zu finden ist. IgE kann
auch an seinen weniger affinen Rezeptor (FcRII) binden, der sich auf B Zellen befindet. Zur
autokrinen kostimulierenden Wirkung aktiviert dieser Rezeptor die weitere Produktion der IgE.
Das „Der p1“ wirkt auf die Epithelzellen, wodurch es eine direkte Rolle bei der Aktivierung der B und T
Zellen spielt. Durch seine proteolytische Aktivität spaltet es CD23 auf den B Zellen und CD25 auf den
T Zellen.
Einige Allergene – wie „Der p1“ – haben die Fähigkeit die IgE unabhängige IL-4, IL-13 Herstellung in
Mastzellen oder in basophilen Granulozyten auszulösen.
2. Die Sofortreaktion
Im Körper befinden sich allergenspezifische IgE B – Gedächtniszellen und T- Gedächtniszellen (nötig
für die Kostimulierung). Diese werden aktiviert, wenn das Allergen wiedermal im Körper vorkommt und
ihre Aktivierung führt zur Herstellung von IgE in großen Mengen.
Die Sofortreaktion selbst wird durch die Kreuzbindung der Antigene, die an die schon auf den
Mastzellen vorhandenen IgE binden, ausgelöst. Als Folge der Degranulation werden die vorgeformten
(Histamin und Leukotrien) Mediatoren und die neu synthetisierten (Cytokine und Chemokine)
Mediatoren aus den Mastzellen freigesetzt. Diese Mediatoren wirken vor Ort auf das herumliegenden
Gewebe.
Die wichtigsten Wirkungen der Mediatoren:

Steigerung der Gefäßpermeabilität

Kontraktion der glatten Muskulatur der Bronchien

Steigerung der Schleimsekretion der Atemwege

Anziehung der inflammatorischen Zellen zum Ort der Allergenexposition
3. Die späte Reaktion
Die späte Reaktion entwickelt sich einige (2-24) Stunden nach dem Eintritt des Allergens.
Einerseits bedeutet die Mastzellantwort die Aktivierung des Lipoxigenase, Cyklooxigenase Wegs und
die Veränderung der Genexpression. Diese führen zur Freisetzung und Herstellung von
Lipidmediatoren und neuen Th2 Cytokinen, die für die Aufrechterhaltung des Prozesses verantwortlich
sind.
182
Andererseits kann das aus den allergenspezifischen Th Zellen und Mastzellen freisetzende IL-5
Cytokin die Eosinophilen aktivieren und eine Eosinophilie verursachen. Die eosinophilen Granulozyten
stellen weitere proinflammatorische Mediatoren (Leukotriene, kationische Proteine, eosinophile
Peroxidase, eosinophile Neurotoxine) und weitere IL-13 und IL-5 her.
Abbildung 11.2. Die Effektorphase der allergischen Reaktion
11.3. Die Symptome der Allergie
11.3.1.
Die Type der Allergene
Der Typ des Allergen und sein Eintritt in den Körper bestimmen den Ablauf der allergischen Antwort.
Die unterliegende Tabelle ist eine Zusammenfassung.
HÄUFIGE
DER ORT DES
ALLERGENE
EINTRITTES
Kontaktallergie
Kontaktallergene: Haut
(Urticaria)
Insektenstich,
Latex
Nahrungsmittelallergi Erdnuss,
Mund
e
Fische, Muschel,
Milk, Ei
SYNDROM
Allergische Rhinitis - Pollen,
Heuschnupfen
Kot der Milben
Schleimhaut: Nase,
Augen, Bronchien
Allergisches Asthma Tierhaar, Pollen, Einatmung
Kot der Milben
183
ANTWORT
Steigerung des Blutstroms, der
Durchlässigkeit der Gefäße
Brechdurchfall
Diarrhö, Juckreiz
Urtikaria
selten Anaphylaxie
Ödem und Juckreiz der
Schleimhaut der Nase
Schwellung, Reizung und
Schleimbildung in den
Nasenwegen
Allergische Konjunktivitis
Verengung der Atemwege,
gesteigerte Schleimsekretion,
Entzündung der Atemwege
Husten, Dyspnea
Systemische
Anaphylaxie
Medikamente,
Erdnuss,
Tiergift
Intravenös, oder direkt Systemische Steigerung des
durch die Schleimhaut Blutstroms, der Durchlässigkeit
des Mundes
der Gefäße,
Trachealer Verschluss,
Kreislaufkollaps,
Koma, Tod
Tabelle 11.2. Die Type der Allergene
11.3.2.
Wie entstehen die allergischen Symptome?
Die Wirkung der Degranulation der Mastzellen hängt von der Gewebe-Umgebung ab:

Im Gastrointestinaltrakt verursachen die erhöhte Sekretion von Verdauungsenzymen und die
Peristaltika Brechdurchfall, Diarrhö, Krämpfe.

In den Atemwegen verursachen die Einschnürung und die erhöhte Schleimsekretion das Husten,
die pfeifende Atmung, beengende Schmerzen in der Brust und keuchende Atmung.

Der gesteigerte Blutstrom in den Gefäßen und die erhöhte Durchlässigkeit verursachen Ödeme
und Entzündung und der Antigentransport in die Lymphknoten wird wirksamer.
Urticaria und Angiödeme sind gute Beispiele für die Veränderungen in den Geweben Beide entstehen
auf die gleiche Art und Weise: rote juckende Flecken erscheinen temporär. Ihre Ränder sind ohne
scharfe Grenzen und heben sich aus ihrer Umgebung ab. Das Urticaria ist das Ödem der Dermis,
während ein Angiödem das Ödem der Subkutangewebe ist.
Abbildung 11.3. Entstehung der Urticaria.
Als Folge der ins Blut gelangenen Allergene entwickelt sich eine Anaphylaxie, die zwei oder mehrere
Organsysteme betrifft.
Die Permeabilität der Kapillärien wird erhöht, ein Ödém entsteht, die Gewebe (z.B die Zunge)
schwellen, der Blutdruck sinkt und die Sauerstoffversorgung der Gewebe nimmt ab, bis es zum
anaphylaxischer Schock mit Bewusstlossigkeit kommt. Als Folge der Kontraktion der glatten
184
Muskulatur in den Bronchien tritt schwere und keuchende Atmung auf. Wegen der Kontraktion des
Darms können diese Symptome Durchfall und Diarrhö verursachen.
11.3.2.1. Die aus den Mastzellen freigesetzenden Stoffe

Enzyme
z.B. Tryptasen, Kinasen: das Bindegewebe wird reorganisiert wegen des Abbaus der
Bronchus-erweiternden Peptide entsteht ein Bronchospasmus.

Toxische Mediatoren
z.B. Histamin: die Permeabilität der Kapillaren wird erhöht, steigt die glatte Muskelkontraktion,
verursacht Juckreiz in der Haut
z.B Heparin: hemmt die Blutgerinnung.

Cytokine
z.B IL-4, IL-13: stimulieren Th2
z.B. IL-5: stimuliert die eosinophilen Granulozyten
z.B. TNF alfa: wirkend auf das Endothelium und viele Immunzellen, es löst Entzündungen aus.

Chemokine
z.B. CCL3: zieht Monozyte, Makrophage und Neutrophyle an.

Lipidmediatoren
z.B. Leukotriene: steigern die glatte Muskelkontraktion, die Permeabilität der Kapillaren, die
Schleimsekretion
z.B. PAF (platelet activating factor): zieht Leukozyte an, aktiviert die Neutrophilen, die
Eosinophilen und die Blutplättchen.
11.3.2.2. Rezeptoren
Die während der allergischen Reaktionen freigesetzten Stoffe werden von ihren Rezeptoren
wahrgenommen. Die Wirkung wird durch die Rezeptoren ausgelöst und oft verstärken sie den Effekt
zusätzlich untereinander.
Histamin Rezeptoren sind in der Haut, im gastrointestinalen Trakt, im Herz, im Kapillarsystem, in den
glatten Muskeln der Lunge, auf den Zellen des Knochenmarks, auf den Zellen der Milz, auf den
peripheren Sinnesneuronen zu finden. Bei den allergischen Reaktionen spielen drei Typen von
Histamin Rezeptoren eine Rolle, deren wichtigste Wirkungen die folgenden sind:
-
Histamin durch H1 Rezeptor verursacht: Steigerung der Permeabilität der Kapillaren,
Vasodilatation, Tachykardie, die Kontraktion der Bronchien und des Verdauungssystems.
-
Histamin durch H2 Rezeptor verursacht: Steigerung der Permeabilität der Kapillaren, stärkere
Sekretion der Magensäure, stärkere Schleimsekretion des Atemsystems.
-
Histamin durch H4 Rezeptoren: Juckreiz der Haut, die Rekrutierung der Eosinophilen und der
Mastzellen.
(Die H3 Rezeptoren sind im zentralen Nervensystem lokalisiert, sie spielen keine Rolle bei den
allergischen Reaktionen.)
185
Die Lipidmediatoren (Prostaglandin und Leukotrien) wirken auf ihre Rezeptoren, die sich in der Haut,
in der glatten Muskulatur der Lungen und im Kapillarsystem befinden. Die schwerste Folge dieser
Wirkung ist die Kontraktion der glatten Muskulatur der Lungen. Weiterhin sind die Lipidmediatoren –
neben Histamin – an der Entstehung der Urticaria beteiligt.
11.3.3.
Allergische Kreuzreaktion
Das Immunsystem gibt eine gleiche Antwort auf verschiedene, aber nach ihrer molekularen Struktur
ähnliche
Antigene. Diese Antwort
ist nämlich eine
allergische Reaktion.
Die
häufigsten
Kreuzreaktionen entwickeln sich zwischen Latex und Obst, beziehungsweise zwischen Pollen und
Obst.
Einige Beispiele:
Pollen der Buche – Apfel, Birne, Pfirsich, Nuss, Walnuss, Erdnuss, Sellerie
Pollen der Gräser – Orange, Wassermelone, Tomate, Erdnuss
Latex – Banane, Avokado, Kiwi, Maroni, Papaya, Feige.
70% der Patienten mit Nahrungsmittelallergien weisen ein orales allergisches Syndrom wegen einer
Kreuzreaktion auf.
Abbildung 11.4. Beispiel auf die Kreuzreaktion zwischen Nahrungsmittelallergenen und anderen
Allergenen.
In primären Nahrungsmittelallergien ist das sensitisierende (sensibilisierende) und das die allergische
Reaktion auslösende Allergen gleich. Das Allergen gelangt durch den Mund in den Körper, es
sensitisiert als Nahrungsmittelallergen und später, bei einer weiteren Exposition löst es eine orale /
systemische anaphylaktische Reaktion aus.
In sekundären Nahrungsmittelallergien ist das sensitisierende und das die allergische Reaktion
auslösende Allergen unterschiedlich. Das sensitisierende Allergen ist kein Nahrungsmittel, es gelangt
186
in den Körper durch Inhalation oder durch die Haut. Gleichzeitig löst ein strukturell ähnliches, aber
nicht-sensitisierendes Nahrungsmittelallergen durch den Mund mit einer Kreuzreaktion die allergische
Reaktion aus. Oft ist Latex solch ein Allergen, welches eine sekundäre Nahrungsmittelallergie auslöst.
Latex ist in dem natürlichen Gummi vorhanden, ist eine Komponente der Arzthandschuhe und findet
sich oft im Arbeitsumfeld von Personen die im Gesundheitswesen tätig sind. Das Allergen des Latex
ist eine Kitin-bindende hevein Domäne, anwesend im Kitinase Enzym der Avokados z.B. Solche,
evolutionär konservative, Allergie-verursachende Moleküle heißen Panallergene.
11.3.4.
Nahrungsmittelintoleranz und Nahrungsmittelallergie
Nahrungsmittel lösen oft allergische Reaktionen aus, wie auch die Nahrungsmittelintoleranz, welche
ähnliche Symptome aufweisen kann. Jedoch ist Nahrungsmittelintoleranz nicht gleichzusetzen mit
Nahrungsmittelallergie.
1. Überempfindlichkeit; wenn das Immunsystem eine Rolle bei der Reaktion spielt:
- Die echten Nahrungsmittel- Überempfindlichkeitsreaktionen sind meistens mit IgE-vermittelter
Mastzelldegranulation gekoppelt. Die Nahrungsmittelallergie Typ I. kann primär oder sekundär sein.
(schon früher diskutiert)
-
Jedoch
existiert
auch
eine
nicht
IgE,
sondern
T-Zell-vermittelte
Nahrungsmittel-
Überempfindlichkeitsreaktion (glutensensitive Enteropathie / Zöliakie). (Siehe später im Kapitel über
die Typ IV. Überempfindlichkeitsreaktionen!)
2. Intoleranz; wenn Immunsystem keine Rolle bei der Reaktion spielt:
- Die nicht Immunsystem-vermittelte Nahrungsmittel- Überempfindlichkeit kann eine sogenannte
Pseudoallergie sein. Diese Pseudoallergie löst eine von Mastzelldegranulation verursachte
anaphylaktoide Reaktion aus.
- Nahrungsmittelintoleranz kann auch ohne Mastzelldegranulation entstehen.
Ein Beispiel ist dafür die Milchempfindlichkeit. Während die Milchallergie im Säuglingsalter entsteht
und die Ursache eine abnormale, von dem Protein (Kasein) der Krächzenmilch ausgelöste Reaktion
ist, ist die Laktose die Ursache der Milchempfindlichkeit, deren Abbau entlang des Alters langsamer
wird oder vollständig verloren geht. Im Hintergrund steht ein Polymorphismus in der regulatorischen
Region des Gens des Enzyms Laktase.
11.3.5.
Anaphyilaktoide Reaktion / Pseudoallergie
In Pseudoallergien ist das Immunsystem in der Behandlung der Symptome eigentlich nicht beteiligt.
Der die Reaktion auslösende Stoff kann durch IgE-unabhängige Wege Mastzell – und
Basophilendegranulation oder Membranzerstörung initieren, infolgedessen Histamin freigesetzt wird.
Daher wird die Reaktion von dem Antigen bei dem ersten Treffen ausgelöst.
Die unterliegende Tabelle ist eine Zusammenfassung der häufigsten Stoffe, die anaphylaktische oder
anaphylaktoide Reaktion auslösen.
187
Stoffe für Anaphylaktoide direkte
Mastzelldegranulation/ Pseudoallergie
Anaphylaxische/ allergische/ IgEvermittelte Stoffe
 Nahrungsmittel (Nuss, Meeresfrüchte)  Arzneimittel (z.B. NSAID, Aspirin)
 Arzneimittel (z.B. beta-laktam
Antibiotika)
 CT/MR Kontrastmittel
 Insektenstich (Bienen, Wespe,
Ameise)
 Ernährung mit hohem Histamingehalt (Rotwein)
 Latex
 Physikalische Faktoren (Bewegung, Warm, Kalt)
 Bakterieller Abbau des Histidins (Fischvergiftung –
schlecht gelagerter Fisch mit hohem Histidingehalt)
Tabelle 11.3. Der häufigsten Stoffe die Anaphylaxische oder anaphylaktoide Reaktion auslösen
11.3.5.1. Arzneimittel - ausgelöste Pseudoallergie
Die CT und MRI Untersuchungen stellen ein hohes Risiko im klinischen Praktikum dar. Das intravenös
eingegebene Kontrastmittel verursacht bei 10% der Patienten eine anaphylaktoide Reaktion. Der
Mechanismus ist noch nicht bekannt. Es wird vermutet, dass die ionische Zusammensetzung, die
Osmotoxizität und Chemotoxizität die Stabilität der Zellmembranen – auch der Mastzellmembran –
beeinflussen.
Selten können auch nicht-steroidale entzündungshemmende Medikamente (z.B. Ibuprofen) und
Acetylsalicylsäuren (z.B. Aspirin) eine anaphylaktoide Reaktion verursachen. Nach Vermutungen steht
eine
Enzymhemmung
im
molekulären
Hintergrund:
diese
Medikamente
hemmen
die
Prostaglandinsynthese durch Hemmung des COX-1 Enzyms und verschieben den ArachidonsäureMetabolismus in Richtung der Lipoxigenase-vermittelten Leukotriensynthese. Demzufolge vermindert
sich die Menge des antiinflammatorischen Prostaglandins (PGE2) und
die proinflammatorische
Leukotriensynthese (LT-A4, -B4,-C4, -D4) steigt. Synthetische Nahrungsmittelfarbstoffe, die solchen
Medikamenten chemisch ähnlich sind (z.B. Tartrazin/E102), können die gleiche Wirkung hervorrufen.
11.3.5.2. Nahrungsmittel - ausgelöste Pseudoallergie
Pseudoallergien können durch Nahrungsmittel mir hohem Histamingehalt ausgelöst werden. Unter
normalen Umständen wird Histamin im Körper über Aminooxidasen abgebaut. Die Diaminooxidase
(DAO) spielt die größte Rolle bei dem Abbau des in der Ernährung enthaltenden Histamins. DAO wird
großteils im Darm exprimiert. Das Enzym ist fähig Histamin in der extrazellulären Matrix zu
„neutralisieren“ indem es die transepitheliale Absorption des Histamins hemmt. Bei den Personen,
deren DAO-Aktivität niedriger ist oder die kein DAO Enzym exprimieren, gelangt Histamin zusammen
mit der Ernährung in den Kreislauf, wo es die gleiche Wirkung ausübt, wie das endogen freigesetzte
Histamin. Die verminderte Aktivität oder die ungenügende Menge der DAO kann von einem
angeborenem Enzymmangel herrühren, oder es kann das Ergebnis einer gastrointestinalen Krankheit
(z.B. Morbus Crohn) sein. In der Crohn Krankheit stellen die Enterozyten wenig DAO her. DAO
blockierende Medikamente (z.B. cefalosporin Antibiotika) oder Ernährungen (z.B. Rotwein selbst)
können selten für die Histamin-abbauende Fähigkeit verantwortlich gemacht werden. Die
Histaminempfindlichkeit, verursacht durch einen genetisch bedingten funktionellen DAO Mangel, ist
eigentlich eine metabolische Krankheit. Es wurde nachgewiesen, dass bestimmte SNP (single
188
nucleotide polymorphism) im Gen der DAO mit der Ausprägung einiger gastrointestinalen Krankheiten
korrelieren.
(Das in den Kreislauf gelangte und von den Zellen aufgenommene Histamin wird über ein anderes
intrazelluläres Enzym, die Histamin-N-Metiltransferase (HNMT) abgebaut. HNMT ist hauptsächlich in
der Leber zu finden)
Einige Nahrungsmittel erreichen solch einen hohen Histamingehalt, dass es trotz normaler DAO
Aktivität in gesunden Personen zu Vergiftungen kommt. Das häufigste Beispiel dafür ist die
Fischvergiftung. Eine Fischvergiftung soll man nicht mit der echten Allergie gegen Fischproteine und
Meeresfrüchte verwechseln, obwohl die klinischen Symptome in beiden Fällen ähnlich sind. Im Falle
einer Fischvergiftung wird Histidin in Fischen mit hohen Histidingehalt über vermehrte Bakterien
dekarboxiliert, wodurch Histamin entsteht. (Das schon entstandene Histamin kann später nicht mehr
entfernt werden, weder mit kochen noch mit einfrieren oder mit Räuchern.)
Einige Nahrungsmittel mit wenig Histamin (z.B. Zitruspflanzen, Erdbeere) können auch eine
anaphylaktoide Reaktion auslösen. Die Membran der Mastzellen wird irgendwie im Duodenum
destabilisiert, was die gleichzeitige Degranulation der Mastzellen verursacht. Der Mechanismus ist
noch
nicht
bekannt.
Es
ist
sehr
wichtig
zu
betonen,
dass
die
Patienten
die
eine
Histaminempfindlichkeit aufweisen, mit keinen CT und MRI Kontrastmittel behandelt werden dürfen.
Im Falle mangelnder Alternativen, dürfen diese Mittel nur nach geeigneter Antihistamin Behandlung
verwendet werden.
11.3.5.3. Physikalische Faktoren – und psychologische Stress-vermittelte
Pseudoallergie
Physikalische Faktoren – Bewegung, Wärme, Kälte – und Stress können Pseudoallergien
verursachen. In allen Fällen steht eine Mastzelldegranulation im Hinntergrund, obwohl der genaue
Mechanismus noch nicht bekannt ist. Die Symptome werden niemals so schwerwiegend wie im Fall
der durch Arzneimittel oder Nahrungsmittel ausgelösten Reaktionen sein, in denen die Faktoren durch
die Schleimhaut in den Körper eintreten. In solchen Fällen kommt es meistens nur zu Urticaria.
Die so genannte cholinergische Urticaria wird durch Bewegung ausgelöst und es steht in Beziehung
mit der Thermoregulation des Körpers. Die Bezeichnung beruht auf der Erfahrung, dass eine
Acethylcholin-Injektion bei Betroffenen die Urtikaria auch auslösen kann. Zur gleichen Zeit ist man
sich nicht bewusst, welche Rolle Acethylcholin bei der Entstehung der Symptome spielt.
Kälteallergie kann durch jeglichen Kontakt mit einem kalten physikalischen Medium ausgelöst werden:
kaltes Wasser, Klimatisierung, kalte Nahrungsmittel / Getränke, Schwimmen im kalten Wasser und
kalter Schweiß. Wiedermal ist es unklar, warum die Membran der Mastzellen sich destabilisiert.
Wärmeallergie wird durch Kontakt mit einem Medium über 43C ausgelöst, der Mechanismus ist auch
nicht verstanden.
Die wegen psychologischem Stress verursachte Pseudoallergie ist sehr selten.
11.3.6.
Sonnenallergie
189
Obwohl eine Sonnenallergie von physikalischen Faktoren ausgelöst wird, tritt eine IgE-vermittelte
Mastzelldegarnulation auf. Die so genannten Fotoallergene gehören zum breiten Spektrum (290-800
nm). Die Type der Sonnenallergie werden nach den Wellenlängen unterschieden, abhängig davon,
welche Wellenlänge die Reaktion hervorruft.
11.4. Die Diagnose Der Allergie
Die diagnostischen Tests weisen die durch die Mastzelldegranulation freigesetzten Stoffe und die für
das Allergen spezifischen IgE Antikörper nach.
Die IgE unabhängige Pseudoallergie kann durch das Messen des Histaminspiegels und das
gleichzeitige Messen des DAO Spiegels klassifiziert werden.
1. Allergie Tests
Die am häufigsten in der heutigen klinischen Praxis verwendeten Allergie – Tests:
Das Messen des Triptase- Spiegels im Serum
Das Messen des Histamin Spiegels im Urin (nicht im Serum, weil die Halbwertszeit des Histamins im
Serum viel kürzer ist als im Urin.)
2. Hautprobe/ Prick Test: das Antigen wird intradermal eingebracht, danach wird der Grad der
Mastzelldegranulation in vivo in der Haut der sensibilisierten Person gemessen.
Früher wurde das Antigen mit einer Injektionsnadel
eingetragen, heute existieren auch andere
Formen. Z.B. der so genannte Morrow-Brown Nadel, usw. http://www.lincolndiagnostics.com/
Neben den Antigenen werden PBS als negativ Kontrolle und Lösungen mit bekannten
Histaminkonzentrationen als positive Kontrolle verwendet. Ein gewöhnlicher Prick Test enthält 20
verschiedene allgemeine aufgelöste Allergene (regionale Pollen, Katzen- und Hundehaare, Milbe
Mischung, Schimmelpilz, Milch, Ei, Feder). Außerdem existieren es auch spezifische Tests.
(http://www.frank-diagn.hu/main.php?mi=allergen&kod=LOFA )
15 Minuten nach der Auftragung wird die Reaktion abgelesen, während dieser Zeit führt die
Mastzelldegranulation zur Entstehung einer lokalen Schwellung. Der Test ist positiv, wenn der
Durchmesser der Schwellung größer als 3 mm ist.
Die Tabelle zeigt die Beziehung zwischen dem Durchmesser und seiner Darstellung.
+++ = gleicher Durchmesser wie bei der positiven Kontrolle
++++ = größerer Durchmesser als bei der positiven Kontrolle
++ = Durchmesser ist 2/3 der positiven Kontrolle
+ = Durchmesser ist 1/3 der positiven Kontrolle
Es existieren einige Allergien, die nur mit dieser Methode nachgewiesen werden können. (z.B.
Sonnenallergie). Außerdem geben die Reaktion die IgE unabhängige anaphylaktoide Stoffe auch.
Die Anwesenheit der allergenspezifischen IgE Antikörper kann mit mehreren Methoden aus dem
Serum des Patienten nachgewiesen werden.
3. RAST (RadioAllergoSorbent Test): das Messen der allergenspezifischen IgE in vitro
190
Die Blutprobe des Patienten wird mit unterschiedlichen Allergenen in Reaktion gebracht: die Allergene
sind dabei zu einem speziellen Teststäbchen gebunden.
- Der Stab mit Allergenen wird ins Serum des Patienten eingetaucht. Falls vorhanden, binden die
Allergene an die spezifischen IgE Moleküle während der Inkubation.
- Die nichtspezifischen Antikörper werden ausgewaschen.
- Der Stab wird in einer Lösung inkubiert, die radioaktiv markierte anti-IgE sekundäre Antikörper
enthält.
- Die nicht spezifisch bindenden Antikörper werden ausgewaschen.
- Die Radioaktivität des Teststäbchen wird mit einem Geigerzähler gemessen, um die radioaktive
Strahlung verschiedener Allergen-IgE Komplexe bestimmen zu können. Die quantitative Menge von
allergenspezifischen IgE-Antikörpern im Blut korreliert mit der Radioaktivität
(RAST 1-6, der kleinere Wert entspricht einer schwächeren Reaktion. So bezeichnet z.B Stufe 6 eine
starke Allergie.)
Der Vorteil dieser Methode im Vergleich mit dem Prick Test ist, dass sie nicht unangenehm für den
Patienten ist und dass gleichzeitig die Empfindlichkeit gegen viele Antigene untersucht werden kann.
Die Arzneimittelallergien werden am häufigsten mit dieser Methode nachgewiesen.
4. Laterale Immunkromatographie: das Messen der allergenspezifischen IgE in vitro
Die Methode wurde schon im Kapitel 2. beschrieben. In diesem Fall ist das Antigen das lösliche
Detektormolekül, das an das spezifischen IgE des Patienten bindet, wodurch sie als Komplex
wandern. Ein zweiter, an eine Membran gebundener IgE spezifischer Antikörper, fängt den Komplex
ein wodurch es zu einer Farbreaktion (in Form eines Striches) an der Stelle der Membran kommt.
5. Der allergenspezifische sandwich immunoassay ist die modifizierte Form des RAST Tests. Die
Methode wurde schon im Kapitel 2. beschrieben. In diesem Fall sind die zu untersuchenden Allergene
als Antigene auf eine solide Oberfläche gebunden, an die die im Serum des Patienten
vorkommendenen IgE Antikörper binden. Diese werden mit der schon bekannten Methode mit
Sekundärantikörpern detektiert. Der Sekundärantikörper ist Enzym-gekoppelt und gibt eine
Farbreaktion.
6. Allergen microarray: Rekombinante Allergene können durch molekulare Klonierung hergestellt
werden. Sie enthalten die für ein Antigen jeweils Epitope. Diese können dann in multi-allergenen
Testsystemen verwendet werden, wie das „allergen microarray“. Die solubilisierten Allergenepitope
werden an ein Glas gebunden, werden mit den Serum IgE des Patienten inkubiert, und werden
schließlich mit fluorescensmarkierten anti-IgE detektiert. Nach dem Ablesen der Fluorescensintensität,
werden die Angaben mit einer Software ausgewertet. Der Vorteil ist, dass das „Allergenprofil“ des
Patienten mit einer einzigen Untersuchung bestimmt werden kann, und auch die Stärke der Reaktion
nachgewiesen werden kann, d.h welche Epitope die stärkste Antwort auslösen.
191
Abbildung11.5. Allergenprofil mit Microarray
7. Immuno RCA (rolling circle DNA amplification): Die IgE im Serum des Patienten binden an die
solide Oberfläche gebundenen Antigene. Die IgE werden mit einem Oligonukleotidstrang-konjugierten
Antikörper erkannt. Eine komplementäre, zirkuläre DNA wird dem Oligonukleotidstrang zugegeben
und mit DNA Polymerase und Nukleotiden läuft eine DNA –Amplikikation ab, eine PCR Reaktion
eventuell. Als Ergebnis entsteht eine Wiederholung von mehreren hundert kontinuierlichen Strängen,
denen am Ende der Reaktion fluorescensmarkierte komplementäre Proben zugegeben werden. Diese
werden detektiert.
11.5. Die Therapie der Allergie
Der Patient kann oligo- oder polisensitisiert werden, d.h. dass er gegen einzelne / einige oder gegen
viele verschiedene Allergene empfindlich ist.
Bei dem oligosensitisierten Patienten kann die Vermeidung des Allergens, die allergenspezifische
oder die Antikörper-Immuntherapie erfolgreich sein. Bei dem polisensitisierten Patienten ist die
Medikamentöse Therapie gezielt, um die Symptome abzuschaffen.
11.5.1.
Medikamentöse Behandlung
Die Medikamentöse Behandlung hemmt die Mastzelldegranulation, die Wirkung der schon
freigesetzten Stoffe und dreht die schon entwickelten Symptome zurück. Abhängig davon, wie
schwerwiegend die Symptome sind, sollen die Patienten mit unterschiedlichen Medikamenten nach
dem geeigneten Protokoll behandelt werden.
Adrenalin: der einzige antagonistische Wirkstoff, der die dem Histamin entgegengesetzten Prozesse
auslöst und die Symptome dadurch abschafft. Bei einer anaphylaktischen Reaktion ist Adrenalin das
erste zu verabreichende Medikament.
- Als alfa-Rezeptor Agonist kontrahiert es die Gefäße, vermindert das Ödem, hemmt den Juckreiz.
192
- Durch Beta-Rezeptoren entspannt es die glatte Muskulatur, erweitert es die Atemwege, beendet die
gastrointestinalen Koliken, steigert die Kraft der Herzmuskelkontraktion, das Herz schlägt schneller,
erhöht sich der Blutdruck, vermindert sich die Histamin-Permeabilität der Zellmembran, wird die
Freisetzung des Histamins und des Leukotriens gehemmt, wird die inflammatorische Antwort
vermindert.
Da Adrenalin nicht die Wirkung des sich schon im Körper befindlichen und an Zellen gebundenen
Histamins hemmen kann, muss Adrenalin solange verabreicht werden, bis die Wirkung des Histamins
nachlässt.
Bei sehr niedrigem Blutdruck oder falls der Zustand des Kranken sich verschlimmert, muss Adrenalin
intravenös jede 10-15 Minuten injektiert werden.
Antihistaminika: pharmakologische Antagonisten, die an Histaminrezeptoren binden und so die
Bindung von Histamin an seine Rezeptoren hemmen, wodurch die durch Histamin ausgelösten
Prozesse gehemmt werden. Antihistaminika sind Arzneimittel, die die Wirkung von Histamin aufheben.
Die schon entwickelten Histamin-vermittelten Reaktionen laufen weiter ab da sie durch Antihistaminika
nicht
beendet
werden.
Deswegen
sollen
Antihistaminika
(Histamin-Antagoniste)
bei
den
anaphylaktischen Reaktionen nach Adrenalin gegeben werden.
Glukokortikoide: allgemeine immunsuppressive und entzündungshemmende Stoffe (unabhängig von
der Ursache der Entzündung.) Sie hemmen die Synthese der inflammatorischen Cytokine: von IL-1,
IL-2, IL-3, IL-4, IL-5, IL-6, IL-8 , IFN-γ. Sie hemmen die Chemotaxis, die Adhesion, die Wanderung aus
den Gefäßen in die Gewebe, die Phagozytose der Leukozyten und der Entzündungszellen.
Der molekulare Hintergrund ihrer Wirkung:
1. Hemmung der Gene der inflammatorischen Cytokine
2. Induktion der Expression und Sekretion des Annexin-1 (Lipokortin-1) in den Zellen des natürlichen
Immunsystems. Annexin wirkt auf autokrine und parakrine Weise. Es hemmt die Synthese der
Eikosanoide durch die Hemmung der Phospholipase -A2 (PLA2), d.h. dass die Prostaglandin und
Leukotriensynthese aufgehoben wird.
Kalcium und Natrium-Kromoglykate: sie stabilisieren die Membran der Mastzellen und hemmen
dadurch die Degranulation.
Leukotrien-Antagonisten:
sie
sind
Lipoxigenase-
Leukotriensynthese vermindert wird.
193
hemmende
Stoffe,
wodurch
die
Abbildung 11.6. Die Therapie der Allergie mit Arzneimitteln. (Die Wirkungen des Adrenalins sind nicht
hier dargestellt, sieh den Text!.)
11.5.2.
Immuntherapie: (Hyposensitisierung/Desensitisierung)
 allergenspezifische Immuntherapie: sie ist indiziert, wenn der Patient gegen nur einige Antigene
empfindlich ist.
Bei dieser Therapie werden dem Patienten verdünnte Antigen(suspensionen) subkutan injektiert.
Über 12 Wochen wird bei jeder nachfolgenden Impfung die Allergenkonzentration gestiegert.
Danach wird die höchste Allergendosis als aufrechterhaltende Behandlung jeden Monat
über
Jahre (manchmal 3Jahre) dem Patienten gegeben. Die Therapie soll immer im Krankenhaus
durchgeführt werden, wegen der Gefahr der Entstehung einer Anaphylaxie.
Während der Therapie verändert sich die zelluläre und die humorale Immunantwort und Toleranz
entwickelt sich. Es werden verdünnte Allergenmengen injektiert und keine hohen Konzentrationen
welche eine stärke/stärkere Reaktion hervorrufen. Dendritische Zellen, die nun auf Allergenepitope
treffen, reifen auf Grund des mangelnden Entzündungssignals nur unvollständig. Durch die
Steigerung der Dose verändert sich das Verhältnis der T Zellen. Die kostimulierenden Moleküle der
unvollständig reifen dendritischen Zellen
treten in eine tolerogene Wechselwirkung mit den T
Zellen der Lymphknoten. Infolgedessen steigt die Anzahl der funktionellen Treg Zellen (Tr1) – die
in der Peripherie entstehen und IL-10 und TGF-beta sekretieren. (Die Anzahl der Th2 vermindert).
Außerdem, auf die steigende Antigendose steigt die IL-10 Sekretion der Monozyten, der
Makrophagen und der B Zellen. Die vorstehenden Cytokine hemmen die Effektor-T-Zellen, die
Entzündungsreaktionen, aber verschieben den Immunglobulin-Klasswechsel in Richtung der IgA
und IgG. Diese Ig Antikörper kompetieren um die Allergenbindung, wodurch die Entstehung der
194
IgE.vermittelten Sofortreaktion vermindert wird, also die sofort Histaminreaktion und die spätere
eosinophilreaktion.
Es gibt klinische Versuche um eine sublinguale Therapie zu entwickeln in der das Allergen oral
eingenommen wird. Die Methode ist nachgewiesenermaßen sicherer als die subkutane Methode,
da sie keine anaphylaktische Reaktion auslöst. Aber die Wirksamkeit ist kleiner in Erwachsenen als
im Fall der subkutanen Methode. In Milchallergie bei Säuglingen ist die Methode erfolgreich. In der
Mehrheit der Kinder „wächst“ die Nahrungsmittelallergien bis zum Alter von 7 Jahren aus, da die
kontinuierliche Anwesenheit des Allergens in kleinen Dosen die Entstehung der natürlichen
Toleranz vorantreibt. Das Immunsystem der Säuglinge ist unreif, deswegen hilft die zugegebene
Milch in steigenden Konzentrationen der Entstehung der natürlichen Immunität, gleich mit der
Entstehung der Immuntoleranz durch subkatane Methode.
Abbildung 11.7. Allergenspezifische Desensitizierung.
 Prophylaktische Vakzination: Die Immuntherapie der Zukunft. In den Säuglingen kann IgG
spezifische Antikörpersynthese mit hypoallergenen Allergenepitopen hervorgerufen werden,
wodurch ist es möglich ist, die Sensitizierung und die IgE spezifische Reaktion vorzubeugen. Auf
diese Weise bleibt der IgE Spiegel auch in der Anwesenheit des natürlichen Antigens immer
niedrig.
 Antikörper Therapie: Behandlung mit monoklonalen IgE-spezifischen Antikörper: Der Antikörper
bindet an die zirkulierenden IgE Moleküle oder an die in Allergien vorkommenden Cytokine, und
die Entstehung der allergischen Reaktion wird dadurch gehemmt. Anti IgE wird nur bei den
schwierigsten, auf Kortikosteron nicht reagierenden allergischen Asthmatikern angewendet. Die
anti-Cytokin Therapie ist momentan in Untersuchungsstadien.
Übersetzt von Erna Pap
195
12. HYPERSENSITIVITY REACTIONS II: TYPE II-IV
HYPERSENSITIVITY REACTIONS
(MARIANNA CSILLA HOLUB)
Die Überempfindlichkeitsreaktionen vom Typ II und III beruhen ebenfalls auf dem Antikörper-Antigen
Bindungsprinzip. Die Immunkomplexe, die von Antikörpern und Antigenen gebildet werden, entstehen
jedoch auf unterschiedlicher Weise während der beiden Prozesse. Bei einer Typ II Reaktion binden
die Antikörper an Antigene, die auf der Oberfläche der Zelle (oder des Gewebes) fixiert/gekoppelt
sind. In einer Typ III Reaktion ist das Antigen löslich und die Immunkomplexe zirkulieren unabhängig
von den Zellen, in freiem Zustand im Kreislauf.
12.1. Überempfindlichkeitsreaktion vom Typ II
Die Immunkomplexe werden von Zelloberflächen- oder Gewebsantigenen bzw. die auf ihnen
spezifisch gebunden IgG Antikörpern gebildet. Die Antigene können in extrinsische und intrinsische
unterteilt werden. Die in den Körper von außen eintretenden, fremden, aber an eigenen Zellen
bindenden Antigene werden als extrinsisch klassifiziert. Andere sind die intrinsischen Antigene, die auf
der Oberfläche der Zellen erscheinen. Die Bindung von Antikörpern leitet unterschiedliche
Mechanismen ein:

Die Antigen-exprimierenden, mit Antikörpern bedeckten Zellen werden empfindlich gegenüber
der Komplement-vermittelten Lyse, gegen Antikörper-vermittelter zellulärer Zytotoxizität
(ADCC=antibody-dependent cellular cytotoxicity) und/oder gegenüber der Opsonisierung mit
Antikörpern folgenden Phagozytose. Diese Effektormechanismen führen zum Untergang der
Zellen.

Die auf den Zellen exprimierten Antigene, die mit Antikörpern bedeckt sind, lösen eine starke
Phagozytose aus, indem lytische Enzyme von den Phagozyten freigesetzt werden. Infolge
dessen wird nicht nur die gegebene Zelle geschädigt, sondern auch die anderen in ihrer
Umgebung. Es kommt also zu einer Gewebsschädigung.

In bestimmten Fällen kann der Antikörper die Funktion der antigen-exprimierenden Zellen
hemmen oder stimulieren (zB. bei Myasthenia gravis [MG] verhindern die den Acetylcholinrezeptor blockierenden Autoantikörper die Bindung von Acetylcholin an seinem Rezeptor).
Dabei kann auch eine Gewebsschädigung entstehen. (bei MG führt die Zerstörung der
postsynaptischen
Endplatte
zum
Verlust
Depolarisierungsversagen kommt.
196
von
AchR-en,
wodurch
es
zu
einem
12.1.1. Beispiele für eine Typ II Reaktion, die von extrinsischen
Antigenen ausgelöst werden
12.1.1.1. Erythroblastosis fetalis (Morbus haemolyticus neonatorum,
Immunhämolytische Krankheit bei Feten und Neugeborenen)
Pathologischer Zustand bei Neugeborenen, für den die Auflösung von Erythrozyten (Hämolyse)
verantwortlich ist. Obwohl normalerweise keine fötalen Zellen in den mütterlichen Kreislauf während
der Schwangerschaft übertreten sollen, kommt es während der Geburt meistens zur Vermischung
von kindlichem und mütterlichem Blut. Dabei können jene Erythrozyten in den mütterlichen Kreislauf
eintreten, auf denen vom Vater erworbene Antigene liegen, weswegen
sie von der Mutter als
körperfremd erkannt werden. Gegen sie werden von dem Körper der Mutter Antikörper hergestellt, die
durch die Plazenta in den fötalen Kreislauf übertreten. Die Antikörper binden dann an die Rh-positiven
Erythrozyten des Kindes, die dadurch zur Hämolyse kommen. Bei der ersten Schwangerschaft haben
die produzierten Antikörper keine Folgen, sie können nur die Entwicklung weiterer Kinder
beeinflussen. (Ein ähnlicher Vorgang läuft ab, wenn die Schwangeren eine Transfusion mit
körperfremden
Stoffen
bekommen.
Die
Antikörper,
die
gegen
die
natürlich
gebildeten
Blutgruppenantigene gerichtet sind, oder die vorher gebildet wurden, können nach einer Transfusion
auch das erste Kind schädigen.
Die häufigste Ursache der immunhämolytischen Krankheit bei Feten ist die Rh-Unverträglichkeit
zwischen dem Fetus und der Mutter. Die Rh-Blutgruppe wird von den D-Antigen kodierendem RHD
Gen und dem RHCE Gen zusammen bestimmt. Die häufigste ist DCE (D+) unter den Caucasoiden
(Europiden). Die Rh-negativen haben einen cde-Genotyp im Allgemeinen. Die Unverträglichkeiten von
AB0-Antigenen oder Kell-Antigenen (CD238) können die seltene Ursache einer fötalen Hämolyse
sein. In diesen Fällen sind die Symptome viel milder, und sie verschlechtern sich bei den weiteren
Schwangerschaften.
Der Ikterus (Gelbsucht) bei den Neugeborenen, bei dem sie als Symptom für Hämolyse erscheinen,
entsteht
wegen
der
Vermehrung/Einlagerung/erhöhter
Konzentration
von
Bilirubin.
Die
Gallenausscheidung der Leber kann nicht mit dem vermehrten Anfall des Bilirubins Schritt halten, und
eine Gelbfärbung von Haut und der Sklera des Auges wird verursacht. (Die höhere Konzentration des
Bilirubins kann Gehirnschädigung und Taubheit verursachen.) Die Fototerapie, die bei diesen
Neugeborenen angewendet wird, fördert den Abbau des Bilirubins.
12.1.1.2. Typ II Überempfindlichkeit bei der Organtransplantation
Wenn eine Übereinstimmung von AB0-Blutgruppen zwischen Spender und Empfänger vorliegt, kommt
es zu einer sog. Transfusionsreaktion. Die hyperakute Abstoßung wird von allogenem HLA-Typ des
Spenders, als Antigen ausgelöst.
12.1.1.3. Medikamenten-induzierten Typ II Reaktionen
Bei den Medikamenten-induzierten Typ II Reaktionen wird die Schädigung zirkulierender Zellen von
den Medikamentenmoleküle verursacht, die auf den korpuskularen Elemente des Blutes gebunden
sind.
197
-
Hämolytische
Medikament,
Anämie:
das
auf
das
den
Blutkörperchen fixiert ist, ist in der
Regel ein Penizillin-Derivat (seltener
Tetrazyklin oder Erythromycin)
-
Thrombozytopenie: das Medikament
bindet an Blutplättchen, meistens ein
Kinin-Derivat.
-
Agranulozytose:
sie
kann
mit
Anlagerung eines Pirazolon-Derivat
(zB.
Aminophenazon,
Noramino-
phenazon) in Zusammenhang liegen.
(Abbildung 12.1)
Abbildung 12.1. Beispiele für den Medikamenten-induzierten Typ II Reaktionen
12.1.2. Intrinsches Antigen – Beispiele für die von einem
Autoantikörper ausgelöste Krankheit
12.1.2.1. Goodpasture-Syndrom (Hauptsächlich wegen den Autoantikörper
gegen Kollagen Typ IV in den Nieren)
Hier binden die Antikörper an das sog. Goodpasture-Antigen, das die nicht-kollagene Domäne (von
alpha3-Ketten) des Kollagen IV der Basalmembran ist. Da es in den Nierenglomeruli und in den
Lungenalveolen exprimiert ist, werden diese Organe beschädigt.
12.1.2.2. Myasthenia gravis (MG)
Bei Myasthenia gravis (MG) wird ein hemmender Antikörper an den Acetylcholinrezeptoren (AchR) der
postsynaptischen Membran der neuromuskulären Endplatte binden, wodurch die Erregungsleitung
aussetzt. Da die Krankheit in den meisten Fällen in Verbindung mit Thymusneoplasien oder –
hyperplasie vorkommt, vermutet man, dass die Entstehung der Autoantikörper auf die überflüssige
Anwesenheit eines ähnlichen (homologes) Proteins zurückgeführt werden kann, welches nur in
tumorösen Geweben exprimiert wird. Die dagegen sensibilisierten, tumorspezifischen helfer T-Zellen
können die Entstehung von hochaffinen, IgG-produzierenden Plasmazellen fördern. Diese Vermutung
ist auch davon unterstützt, dass eine spontane Produktion von anti-Acetylcholinrezeptor Antikörpern
auch unter den in vitro kultivierten Zellen, die aus dem während der Therapie entfernten Thymus
gewonnen wurden, nachgewiesen werden kann. Unter den Neugeborenen der MG-Mütter können mit
einer Wahrscheinlichkeit von 1:8, vorübergehende (2-3 wochenlang dauernde) Symptome erscheinen,
die auf das Übertreten von Autoantikörpern durch die Plazenta hinweist.
12.1.2.3. Basedow-Krankheit
Ein gegen die TSH-Rezeptoren gerichteter, stimulierender Autoantikörper kann die Wirkung von TSH
vortäuschen, und dadurch die Schilddrüse zu einer überflüssigen Aktivität zwingen, die zu einer
Hyperthyreose führt. Die stimulierenden Antikörper können während der Schwangerschaft über die
Plazenta von der Mutter auf den Embryo übertragen werden, und eine neonatale Hyperthyreose des
Neugeborenen verursachen. Deswegen ist es besonders wichtig, die Hormone- und den
Autoantikörperspiegel von an dieser Krankheit leidenden Müttern zu überwachen.
12.1.3.
1. Der
Diagnose
Nachweis
von
Antikörpern,
die
die
Neugeborenen/Organempfänger/transfundierte
Zellen
bedecken
Person/mit
(im
Körper
Medikament
von
den
behandelter
Patient/Autoimmunpatient)
Agglutinationstest:
-
direkter Coombs-Test (DAT= direct antiglobulin test): Die mit Antikörpernbedeckten Zellen
agglutinieren nach der Reaktion mit Coombs-Reagenz, das aus einer Ziege stammt, und antihuman IgG6/IgM/C3 enthält.
-
Mikrosäule-Test
Die mit Antikörpern bedeckten Zellen werden auf einer Matrix mit hoher Dichte geschichtet.
Durch die Matrix werden sie zentrifugiert und sie werden darunter an den anti-human
IgG6/IgM/C3 Antikörper binden. Bei dem nächsten Zentrifugationsschritt können nur die nichtagglutinierten Zellen das unterliegende Gel passieren. Werden die Zellen mit Antikörpern
bedeckt, agglutinieren sie, und bleiben auf dem oberen Teil der Säule stecken (s. MikrosäuleTest Folien).
2. Nachweis von im Serum frei zirkulierenden Antikörpern (im Körper von Schwangeren/Patienten
vor Organtransplantation/Patienten vor medikamentösen Therapien)
-
indirekte Coombs-Test:
Zum Serum, das die Antikörper enthält, wird zuerst das Blut von Rh-positiven
Patienten/Spendern, dann in einem zweiten Schritt das Coombs-Reagenz zugegeben. Eine
Agglutination weist auf die Präsenz des Antikörpers hin.
12.1.4.
Therapie
Das primäre Ziel ist es, die Bindung von Antikörpern an Antigene zu verhindern. Hiermit wird mit zwei
Beispielen illustriert, welche immunologischen Eingriffe die Symptome beseitigen können.
1. Bei
Rh-Inkompatibilität
wird
anti-D
IgG
(Rh-Immunglobuline)
als
Prophylaxe
in
einer
intramuskulären Injektion der Mutter gegeben, innerhalb 72 Stunden nach der Geburt des ersten
Kindes oder nach einem spontanen oder künstlichen Abortus. In der entsprechenden Phase der
nächsten Schwangerschaft muss die Prophylaxe erneut durchgeführt werden. Die fötalen
Blutkörperchen (Bk), die in die mütterliche Milz gelangen, werden dadurch mit dem künstlich
zugeführten Antikörper bedeckt. Sie werden befördern:
199
-
die Entfernung der fötalen Bk-en durch Phagozytose, so können sie nicht mit den mütterlichen
B-Zellen in Kontakt treten, die für D
Antigen spezifisch sind.
-
wenn
sie
mütterliche
trotzdem
B-Zellen
auf
spezifische
treffen,
sind
die
Epitope von den zugeführten Antikörpern
bedeckt, sodass sie für die mütterlichen
Antikörper nicht zugänglich sind.
-
wenn die mütterlichen B-Zellen trotzdem
auf diese Epitope treffen, hemmen die
gegebenen
Antikörper,
die
auf
der
Oberfläche der Bk-en liegen, die Teilung
der B-Zellen durch das sog. Antikörper
Feedback Phänomen. (Abbildung 12.2)
Abbildung 12.2. Negative Kostimulation
der B-Zellen
2. Bei jenen Krankheiten, die von stimulierenden und hemmenden Autoantikörpern verursacht
werden, können die Ursachen bisher gar nicht oder nur zum Teil behoben werden. Bei Patienten
mit Myasthenia gravis, in der ein hemmender Autoantikörper vorkommt, kann man die Behebung
der Ursache in bestimmten Fällen durch die Entfernung der Thymus erreichen. In anderen Fällen
können
die
Symptome
durch
die
Erhöhung
der
Halbwertzeit
von
endogenen
Acetylcholinesterasen (AchE) durch die Gabe von Cholinesterase-Inhibitoren behandelt werden.
Bei einem schweren Aufflammen der Krankheit können die auslösenden anti-AchR Antikörper
durch Plasmapherese entfernt oder durch die intravenöse Gabe eines hemmenden Antikörpers
inhibiert werden. Natürlich können auch andere, nicht-immunologische medikamentöse Therapien
eingesetzt werden, um die Symptomen zu vermindern.
12.2. Typ III Überempfindlichkeitsreaktion
Die Antigene des Immunkomplexes können exogener (wie z. B. aus Medikamenten, oder aus einem
Erreger stammende) oder endogener (wie z. B. die DNA in dem Lupus erythematodes) Herkunft sein.
Die Menge der Antigene übertrifft in der Regel die Menge der spezifischen Antikörper. Die Antikörper
mit niedriger Affinität bevorzugen die Entstehung einer Immunkomplexkrankheit: es kommt die
mangelnde Eliminierung zum Vorschein, und es begünstigt sie in der Kreislauf zu bleiben und somit
die Neigung zur Bildung eines Komplexes. Die Größe der entstehenden Immunkomplexe kann auch
die Bildung der Krankheit beeinflussen. Die größeren Antikörper werden von den Phagozyten mit
höherer Leistungsfähigkeit einverleibt und aus dem Kreislauf entfernen als die kleineren.
Gewebszerstörende Immunkomplexe:

sie entsehen im Blut, dann treten sie aus dem Kreislauf aus, und setzen sich in den Wänden
der Gefäße fest. Die kationische Antigene enthaltenden Immunkomplexe binden an der
negative-geladenen Basallamina der Gefäßwände und der Nierenglomeruli. Die Ausdehnung
der Ablagerung hängt nicht nur von der Größe der Immunkomplexe (je kleiner sie sind, desto
200
länger bleiben sie in dem Kreislauf, und desto wahrscheinlicher lagern sie sich ab), sondern
auch von ihrer Zusammensetzung ab. Dabei ist aber nicht das Antigen, sondern der
Antikörper entscheidend. Der typischste Antikörper, der eine Gewebsschädigung verursacht,
ist IgG, manchmal IgM, und äußerst selten lassen sich IgA in den Komplexen nachweisen.

sie können auch in situ, an dem Ort der Antigenlokalisierung entstehen.
Ein inflammatorischer Prozess wird von den abgelagerten Immunkomplexen induziert. Von den
Immunkomplexen wird das Komplementsystem aktiviert (die Chemotaxis und die Rekrutierung von
Enzündungszelle erhöht sich dadurch) und die neutrophilen und eosinophilen Granulozyten (durch
FcγRIII), bzw. die Thrombozyten werden angelockt. Die vasoaktiven Amine, die von basophilen
Granulozyten und den Thrombozyten freigesetzt werden, erhöhen die Gefäßpermeabilität. Die zu den
abgelagerten Immunkomplexen wandernden neutrophilen Granulozyten schädigen durch frustrierte
Phagozytose
1
die Zellen und das Gewebe, die in der Umgebung der Ablagerung liegen. Der
Mechanismus der Gewebsschädigung ist unabhängig von dem Ort der Ablagerung.
Die Konsequenzen der Gewebsschädigung hängen jedoch von dem Ort der Ablagerung ab. Nach der
Häufigkeit des Auftretens sind meistens die Haut, seltener die Nieren, das gastrointestinale System
und die Gelenke von den Ablagerungen betroffen. Dadurch kann in den Gefäßwänden eine Vaskulitis,
in der Basalmembran der Nierenglomerulen ein Glomerulonephritis und in der synovialen Membran
der Gelenke eine Arthritis entstehen.
Beispiele für die Krankheiten:

Arthus-Reaktion: sie entsteht in der Haut, typischerweise wegen der Komplexe mit IgG.

Schönlein-Henoch purpura (Kapillarblutung)- die Haut und Nieren sind betroffen,
Immunkomplexe mit IgA

Nach
den
Infektionskrankheiten,
wenn
der
Erreger
nicht
eliminiert
wird.
zB.
poststreptokokkale Glomerulonephritis oder Endocarditis.

SLE: chronische, systemische Autoimmunkrankheit, bei der die Nieren, die Gelenke, die Haut,
die Kapillaren des Herzens, und die serösen Oberflächen betroffen sein können.

Akute Serumkrankheit: systemische Vasculitis, Glomerulonephritis und Arthritis mit IgGenthaltenden Immunkomplexen.
12.2.1.
Eine typische Krankheit für den lokalen Typ III
Farmerlunge – es ist häufig unter den Menschen, die landwirtschaftliche Arbeit haben, und täglich mit
Futtermitteln (Heu für Rindernahrung) in Kontakt kommen, weswegen es so genannt wird. Das
Antigen stammt typischerweise aus
einem
Bakterium, das in
verschimmeltem
Heu lebt
(Thermoactinomyces), und durch Einatmung in den Körper gelangt. Trotz der Typ I Reaktion können
die Antigene in einer großen Menge in der Umwelt des Patienten gefunden werden. Die Symptome
der Krankheit: (lokale) Entzündungssymptome, in diesem Fall die Entzündung der Lunge
(Pneumonitis).
1
Neutrophile sind "frustriert", wenn sie zu große Partikel aufnehmen müssen. In diesem Fall entlassen sie ihre
Granuleninhalt (voll mit Proteasen und Sauerstoffradikalen) einfach nach außen, um evtl. die Errerger zu
zerstören. Dabei verursachen sie aber auch Schäden an Nachbarzellen.
201
Zur immunologischen Diagnose werden die Tests für gegen das Bakterium gerichtete Antikörper, bzw.
bakterielle Antigene verwendet:

Immundiffusion: Prezipitationstest,

Komplementfixation,

Latexagglutination.
12.2.2.
Akute systemische Typ III Hypersensitivitätsreaktion
Serumkrankheit: Das Antigen kann ein Medikament, wie zB. Penicillin sein. Die Symptome entstehen
7-10 Tagen nach der Antigenexposition: Vasculitis, Glomerulonephritis, Arthritis. Die Feststellung der
Diagnose läuft, wie oben (s. lokale Typ III).
12.2.3.
Chronische systemische Typ III Hypersensitivitätsreaktion
SLE: Das Antigen ist ein endogen nukleares Antigen. Da die Krankheit selbst im Rahmen von vorigen
Praktiken erwähnt wurde, kann man die Symptome und die Diagnostik dort finden.
In der Pathogenese der Typ I, II und III Überempfindlichkeitsreaktionen spielen Antikörper ebenso eine
Rolle. In vielen Fällen können sogar die gleichen Antigene die Ursache sein (zB. Penicillin). Es ist
wichtig, die wichtigsten Unterschiede in Tabelle 12.1. zusammenzufassen:
Tabelle 12.1. Typ I-III Überempfindlichkeitsreaktionen
12.2.4.
Therapie
Bei den lokalen und systemischen Erkrankungen ist die Vermeidung auslösender Stoffe am
zweckmäßigsten. Neben der medikamentösen Hemmung der Entzündung, kann man in den schweren
Fällen die Plasmapherese, als ein Verfahren für die Entfernung zirkulierender Antikörper, verwenden.
In chronischen Zuständen (wie zB. SLE) können durch biologische Therapiemaßnahmen B-Zellen
oder andere, in der Kostimulation teilnehmende Zielmoleküle (z. B. CD40L, s. entsprechende Folien),
mit gegen sie gerichteten blockierenden Antikörpern, inaktiviert werden. Dadurch lassen sich die
202
Anzahl der B-Zellen, und unter diesen die für die Autoantikörperproduktion verantwortlichen B-Zelle
reduzieren. Im Rahmen von frühen oder präklinischen Studien werden solche Therapien untersucht,
bei denen die Entwicklung einer Toleranz gegen bekannte Antigene erzielt wird.
12.3. Überempfindlichkeitsreaktion vom Typ IV oder verzögerter
Typ (DTH=delayed type hypersensitivity)
Weil das Auftreten der Symptome mehr als 12 Stunden oder sogar Wochen benötigen kann,
bezeichnet man diese Reaktion auch als Überempfindlichkeitsreaktion vom verzögerten Typ. Das
Antigen bindet nicht an den Antikörper, sondern es löst
eine zelluläre Immunantwort aus: die
Reaktion entwickelt sich mit der Mitwirkung von CD4+, CD8+ T-Zellen, Makrophagen und basophilen
Granulozyten. In der Sensibilisierung spielen die CD4+ Th1-Zellen durch ihre Antigenerkennung eine
wichtige Rolle. Am Ort der Antigen-Exposition werden unterschiedliche Zytokine (wie IFN-gamma, IL2, TNF-beta, TNF-alfa, GM-CSF, IL-3) freigesetzt, die die Rekrutierung und Aktivierung von
Makrophagen
und
von
zytotoxischen
T-Zellen
auslösen,
und
infolgedessen
eine
lokale
Gewebszerstörung verursachen. Die untere Tabelle fasst die Eigenschaften von den 3 Unterklassen
der Überempfindlichkeitsreaktion Typ IV zusammen.
Syndrom
verzögerter Typ der
Überempfindlichkeit (DTH
in engerem Sinne)
ANTIGEN
Folgen
Proteine:
-lokales Hautödem
Insektenproteine
-Erythem (Hautrötung)
mycobakterielle Proteine
(Tuberculin, Lepromin)
-Induration
-zelluläre Infiltration
-Dermatitis
Kontakthypersensitivität
-Haptene:
lokale Hautreaktion:
Pentadeka-katechol (Gift von
Giftsumach), Paraphenylenediamine
-Erythem
-kleine Metallionen:
-intraepitheliale Knötchen
-zelluläre Infiltration
-Blasen
Ni, Cr
Zöliakie
(glutensensitive oder
gluteninduzierte
Enteropathie)
Bestandteile von Gluten in
vielen Getreidesorten
vorkommende Klebereiweiß,
(bei Weizen: Gliadin)
-Zottenatrophie in der
Dünndarmschleimhaut
-Verdauungstörung
-Gedeihstörung
Tabelle 12.2. Unterklassen der Überempfindlichkeitsreaktion Typ IV
12.3.1.
DTH-Hauttests
Die DTH-Hauttests werden in der klinischen Praxis verwendet, um die schon abgelaufene und aktuelle
Infektionen bzw. die von uns zugeführten Antigene nachzuweisen. Wenn der Körper schon früher auf
den Erreger getroffen ist, löst er durch das T-Zellen Gedächtnis eine intensive Hautreaktion auf
203
bestimmte Antigene des Erregers aus. (Mit diesem Untersuchungsverfahren kann man nicht genau
entscheiden, ob das Individuum/der Patient zur Zeit an der Krankheit leidet oder schon überstanden
hat und deshalb eine Immunität besitzt.) Der Stoff, der in dem Test benutzt wird, kann z. B. Tuberculin
(für Nachweis von TB; Mantoux-Test, Lepromin (für Lepra), Histoplasmin (für Histoplasma
capsulatum, hauptsächlich bei Lungeninfektionen), oder Candidin (für Candida-Infektion) zum
Nachweis sein.
Bei den Untersuchungen wird der Extrakt aus dem nicht-pathogenen Mycobakterium tuberculosis
Erreger in die Haut (intracutan) injiziert. Der Extrakt kann OT (=old tuberculin), das ein Konzentrat aus
dem in vitro Kulturmedium in dem M. tuberculosis gezüchtet wurde; oder häufiger PPD (purified
protein derivate), die ebenso aus dem Medium präzipitiert wurden, sein. Die Immunzellen bilden eine
Schwellung an dem Ort der Injektion, die Ausdehnung der begleitenden Entzündung hängt davon ab,
ob die jeweilige Person zur Zeit gesund ist oder früher an TB gelitten hat. Die entzündliche
Veränderung erreicht ihre maximale Ausdehnung später und wird deshalb erst nach 3-5 Tagen
abgelesen und ausgewertet. Wenn bei jemandem die Ansteckung früher erfolgt hat, ist der Körper
empfindlicher, und zeigt eine intensivere Reaktion auf den Erreger, aus dem der Extrakt hergestellt
wurde (T-Zelle Gedächtnis). Auf
der
Haut
des
Gesunden
überschreitet
die
Induration
(verhärtete
und
erhöhte
Hautveränderung)
nicht
den
Durchmesser von 5 mm . Bei
Betroffenen können es aber mehr
als 10 mm sein. Die Rötung allein
zählt nichts.
Ein Beispiel für die diagnostische
Anwendung:
(Mantoux):
Tuberculin-Test
Die
Tuberculose-
Infektion (in Ungarn auch für die
Kontrolle der BCG-Vakzinierung)
kann damit nachgewiesen werden.
Tabelle 12.3. Tuberculin / Mantoux Test
(Abbildung 12.3)
12.3.2.
Kontakthypersensitivität / Kontaktdermatitis
Bei der Kontakthypersensitivität / Kontaktdermatitis binden Haptene (solche kleine Molekülen, die
selbst keine Immunantwort auslösen können) an die eigenen Proteine. Die häufigsten Stoffe die
Dermatitis auslösen:

Metalle, zB. zum Gerben von Leder benutztes Kobalt, Nickel in Kleinod,

pflanzliche Öle, zB. Urushiol oder Pentadeka-katechol (Gift von Giftsumach)
204

synthetische Stoffe, zB. Paraphenylene-diamine (nicht zu vermischen mit purified protein
derivate, die auch PPD abgekürzt wird) für höhere Farbintensität in den kosmetischen
Produkten, Kleidungen und Pelzwaren.
Die dendritischen Zellen nehmen sie auf, und präsentieren sie den CD4+ oder CD8+ T-Zellen, die als
haptenspezifische effektor Zellen aus den Lymphknoten in die Haut wandern. Bei der nächsten
Exposition werden die Hapten-Peptide den lokalen, in der Haut liegenden T-Zellen präsentiert, und
induzieren die Aktivierung der T-Zellen und ihre lokalen effektorischen Wirkungen.
Ein Beispiel für die Diagnostik: epikutane Hauttest (Patch-Test) für Kontaktdermatitis
Bei diesem Verfahren wird ein Pflaster, das mit den häufigsten Allergenen eingetränkt wurde, auf die
Haut des Rückens geklebt und 48 Stunden später wieder entfernt. Das Ergebnis der Reaktion wird 96
Stunden (4.-6. Tagen) später abgelesen.
In den am häufigsten verwendeten diagnostischen Standardreihen werden die häufigsten Stoffe (33
Allergene) getestet. Es gibt auch spezifische Pflastern für z.B. die Materialen, die in der zahnärztlichen
Praxis verwendet werden (15 basis + 8 zusätzliche Allergene), oder ein anderes welches
für
Nachweis einer Metallallergie (die komplette Reihe besteht aus 24 Allergene) geeignet ist. Es gibt
noch weitere Reihen, die Proben aus Medikamenten, Lebensmittelzusatzstoffe, Reinigungsmittel,
Farbstoffe und Duftstoffe beinhalten. Die kommerziellen Standardreihen werden auch als finn
chamber (Finnkammern) zum Verkauf zugelassen. Beim Ablesen sind die Rötung und die örtliche
Schwellung auch in Betracht zu ziehen.
12.3.3.
Zöliakie (glutensensitive oder gluteninduzierte Enteropathie)
Für die Entstehung der Überempfindlichkeit ist ein aus 33 Aminosäuren bestehendes Peptid
verantwortlich, das aus dem Gluten stammt. Das Gluten (Klebereiweiss) befindet sich in den Samen
von bestimmten Getreidearten (Weizen, Gerste, Hafer, Roggen), und diese Eiweißmischung kann
man im Weizen auf Gliadine (Prolaminfraktion) und Glutenine (Glutelinfraktion) unterteilen. Während
der Verdauung wird das Gliadine in ein Peptid aus 33 Aminosäuren gespalten. Dieser Gliadinabschnitt
kann an ein Enzym, die Gewebstransglutaminase (tTG= tissue transglutaminase) binden. Die im
Peptid vorhandene Aminosäure Glutamin wird vom der tTG aus Glutaminsäure gebildet, und die
Veränderung verleiht dem Peptid eine negative Ladung. Dieser Charakter verstärkt die Fähigkeit, an
bestimmten HLA-Typen zu binden, die auf den antigenpräsentierenden Zellen der Lamina propria
exprimiert werden und so den T-Zellen präsentiert werden. Bei den Individuen, die einen bestimmten
Haplotyp (konkreterweise DQ2 oder DQ8, kodiert von HLA-A1 und -B1) haben, werden die glutenreaktiven T-Zellen aktiviert, produzieren Zytokine wie z. B. IFN-gamma, und leiten einen entzündlichen
Vorgang im Darm ein. Während des Vorganges beginnen die Plasmazellen, die sich in der Umgebung
des entzündetes Darmes befinden, Antikörper und Autoantikörper zu produzieren.
Bei einem Verdacht einer Zöliakie werden zuerst serologische Untersuchungen durchgeführt, aber zur
Diagnose
sind
weitere
diagnostische
Maßnahmen
erforderlich,
wie
Dünndarmbiopsie
histologischen Feststellung der Zottenatrophie mit begleitender Entzündung.
Zur Diagnose von Zöliakie verwendete serologische, spezifische Antikörper Nachweisverfahren
Die Tests zielen auf den Nachweis der IgA und IgG Antikörper aus dem Serum:
205
zur

anti-deaminiertes Gliadinpeptid AK (a-DGP)
Der Nachweis von AK, die während der Immunantwort auf Gliadin entstehen, ist wichtig, weil
die
Erkrankung
dadurch
von
anderen
Zottenatrophie-Krankheiten,
die
von
der
Gluteneinnahme unabhängig sind, differenziert werden kann.

anti-Endomysium AK (EMA)
Das Endomysium ist ein Bindegewebsprotein, das die feinen Muskelfasern des Dünndarmes
umhüllt. Der Körper stellt anti-Endomysium-AK als Antwort auf die ständige Zerstörung des
Darmes her. (Den Nachweis kann man auch in den Dünndarmbiopsie-Proben durchführen.)

anti-Transglutaminase AK (a-tTG)
Die (eigene) Transglutaminase bildet mit dem (fremden) Gliadinpeptid eine netzähnliche
Struktur, und ein auf diese Weise entstehendes Autoantigen wird sehr stabil.
Die anti-tTG und anti-EMA Antikörper weisen auf ähnlicher Weise auf eine Gewebszerstörung hin. Die
Konzentration der Antikörper im Blut ist proportional mit dem Schweregrad der Krankheit, und man
kann den Ablauf gut verfolgen. Die IgA-Tests sind viel spezifischer (IgA wird von den lokalen
Plasmazellen produziert), weshalb die IgG-Messung mit der IgA-Messung zu ergänzen ist.
12.3.4.
Terapie
Die wirksamste Therapie ist, wie auch bisher, die Vermeidung des auslösenden Stoffes: der Kontakt
mit bestimmten Metallen ist zu minimalisieren und eine glutenfreie Ernährung sollte eingehalten
werden.
Neben
der
entzündungsstillenden
medikamentösen
Therapie
können
noch
die
immunologische Therapie, wie z.B. die Hemmung der T-Zell- Antwort mit Immunsuppressiva (z. B.
Cyclosporin) eingesetzt werden. Daneben werden jedes Jahr neue Wirkstoffe für die Hemmung der TZell-Antwort entwickelt, die zB. durch das Blockieren des B7 Kostimulationsmoleküls oder des IL-2Rezeptors wirken. Das neueste Ziel ist die Induktion der Toleranz von pathologischen T-Zellen, aber
zur Zeit sind noch keine überzeugenden klinischen Ergebnisse im Zusammenhang damit bekannt.
Übersetzt von Viktor Molnár
206
13. IMMUNTHERAPIE
(GYÖRGY NAGY, ÉVA PÁLLINGER, ZSUZSANNA PÁL)
Die Hauptziele der Medizin sind immer die Heilung oder Vorbeugung von Krankheiten, und falls
möglich, nicht nur die Beseitigung der Symptome, sondern auch der Ursachen der jeweiligen
Krankheit. Im Laufe der mehrere Jahrtausende langen Geschichte der europäischen Medizin wurde
eine unglaubliche Vielzahl von Behandlungsstrategien entwickelt, dessen wichtigstes Prinzip aber
immer die Doktrin des „primum nil nocere”, also „zuerst einmal nicht schaden“ war.
Obwohl sämtliche pharmazeutische Forschung in erster Linie die Entwicklung von effektiven aber
gleichzeitig auch nebenwirkungsfreien Medikamenten erzielt, verfügt selbst die heutige Medizin über
solchen idealen Medikamente nicht, oder kaum. Manchmal sieht es so aus, als wären Wirkung und
Nebenwirkung voneinander untrennbar, selbst wenn der Traum eines jeden Arztes eindeutig eine Welt
ohne jeglichen Nebenwirkungen ist.
Diese Situation scheint sich langsam zu ändern. Die explosionsartige Entwicklung der molekularen
Medizin in den letzten Jahrzehnten, und vor allem das Humangenomprojekt ermöglichten eine vorher
unvorstellbar tiefe Einsicht in die molekularen Pathomechanismen der verschiedenen Krankheiten,
und enthüllten eine fast unverständliche Vielzahl von möglichen therapeutischen Zielen, welche
zusammen die Entwicklung einer neuen Generation von gezielten molekularen Therapien
ermöglichten.
Als nächstes führten die moderne molekulare Genetik und die schnelle Analyse des genetischen
Fingerabdrucks
die
ersten
individualisierten
Beschreibung des menschlichen Genoms
Therapien
ein.
Schließlich
beschleunigte
die
neben der pharmazeutischen Forschung auch die
Genehmigung von neuen Medikamenten und vereinfachte die Verfolgung ihrer wahren Effizienz in der
klinischen Praxis.
13.1. Grundbegriffe
Immuntherapie
Die Immuntherapien sind solche Therapien, die die Funktionen des körpereigenen Immunsystems
ausnutzen um durch gezielte Beeinflussung von immunologischen Mechanismen ein therapeutisches
Ziel
zu erreichen. Sie modifizieren eine Immunantwort
oder
bestimmte Immunfunktionen
(Normalisierung, Stimulation, Suppression, usw.) damit das Immunsystem eine Krankheit besser oder
effizient genug bekämpfen kann.
Modifizierfaktoren von biologischen Antworten (biological response modifiers, BRMs)
BRMs sind vom menschlichen Organismus produzierte natürliche Moleküle, die unter physiologischen
Umständen nur in extrem niedrigen Konzentrationen hergestellt werden, jedoch einen starken
biologischen Einfluss auf die Immunantwort haben, und die für Zwecke einer Immuntherapie relativ
einfach auszunutzen sind. In den Immuntherapien induzieren BRMs die Antwortreaktionen des
207
Immunsystems
auf
verschiedene
immunologische
Herausforderungen.
Ihre
therapeutische
Anwendung wird dadurch ermöglicht, dass sie mit den modernen Labortechniken in industriellen
Mengen, rein, reproduzierbar, und sicher herstellbar geworden sind.
13.2. Gezielte molekulare Therapie (targeted molecular therapy,
TMT)
Eine gezielte molekulare Therapie ist in der Regel gegen solche körpereigenen Strukturen und
Mechanismen gerichtet, die nur unter pathologischen Umständen erscheinen oder aktiviert werden,
also im physiologischen Zustand im Körper nicht vorhanden sind. Im Gegensatz zu der klassischen
pharmazeutischen Therapie, erzielt die TMT durch diese Strategie ausschließlich die kranken
Zielzellen (targets) zu beeinflussen ohne dabei die gesunden Zellen zu beschädigen oder gefährden.
Dies ermöglicht eine starke Einschränkung des Spektrums der Nebenwirkungen und gleichzeitig auch
die Steigerung der therapeutischen Effizienz.
Der Begriff TMT wird meistens in Krebstherapien verwendet, wo TMTs typischerweise essentielle
molekulare
Regulationswege
der
Tumorentwicklung
angreifen,
wogegen
die
klassische
Chemotherapie alle sich intensiv teilenden Zellen des Patienten beschädigt.
Die wichtigsten Instrumente der heute in der Praxis erhältlichen, d.h. für klinische Zwecke
genehmigten TMTs können in zwei Untergruppen geordnet werden: 1) kleine Moleküle (small
molecules) und 2) monoklonale Antikörper.
Die kleinen Moleküle (<500 Dalton) binden mit großer Affinität zu Proteinen, Nukleinsäuren oder
Polysacchariden der Zielzellen und verändern dadurch ihre Aktivität oder Funktion. Ihr kleines
Molekulargewicht ermöglicht eine schnelle Penetranz durch die Plasmamembran, sie können also ihre
Wirkung auch intrazellulär ausüben. In den nachfolgenden Kapiteln beschäftigen wir uns zuerst mit
diesen Therapien. Mit den monoklonalen Antikörpern werden wir uns später, in Kapitel 13.4.1.1.
detailliert auseinandersetzten.
13.2.1.
Biologika oder Biopharmazeutika (biologics)
Biologika sind solche therapeutische Agenzien, die aus einer biologischen Quelle stammen (z.B. mit
Hilfe von rekombinanter DNA Technologie / Gentechnologie / Genmanipulation). Heute sind sie (noch)
meistens Makromoleküle, vor allem Proteine. Wegen ihren vielen Vorteilen sind Biologika die
wichtigsten Wirkungsmittel der neuen TMTs.
13.2.2.
Targeting
Die Mehrheit der heutzutage angewendeten Medikamente erreicht die Stelle ihrer Wirkungszone im
Körper durch die Blutzirkulation. Dies führt dazu, dass sie in relativ hohen Dosen verabreicht werden
müssen, weil sie im Blut stark verdünnt werden. Zweitens wirken sie nicht ausschließlich nur an der
Stelle der erzielten pharmazeutischen Aktivität , da sie durch die Blutzirkulation in vielen Körperteilen
208
auch deponiert werden die mit der Wirkung des Medikaments nichts zu tun haben. Aus diesen
Gründen ist der Anspruch auf einen spezifischen, gezielten Medikamententransfer (Targeting) schon
seit langem entstanden. Dem Prinzip nach sollten diese Medikamente irgendwie so modifiziert
werden, dass ihre Bindung zu den Zielzellen spezifischer wird, mit anderen Worten ihre Wirkung auf
die Zielzellen limitiert wird. Auf diese Weise könnte man die für die therapeutische Wirkung benötigten
Dosen verringern, die Gewebe-Verteilung der Medikamente optimieren und auch die Nebenwirkungen
drastisch vermindern.
13.2.2.1. Targeting mit Nanotechnologie
Die Nanotechnologie spezialisiert sich auf Technologien mit denen Aufbau und Modifikation von
Strukturen in der Größe von einzelnen Atomen bis hin zu der Größenordnung von 100 nm erreichbar
ist. Die darauf bauende Nanomedizin fokussiert sich auf zwei Bereiche: auf die Entwicklung von
Nanomedikamenten und die der neuen medizinischen Bildverarbeitungstechniken.
Das große Versprechen der Nanomedizin ist die Verbesserung der Effizienz der heutigen
Medikamente durch Optimierung ihrer Aufnahme, Freilassung im Körper, und Verteilung in dem
Organismus durch intelligente Änderung der Struktur der heutigen Medikamente in extrem kleine
Maßstäbe. Diese verbesserten Molekularstrukturen sollen viele Probleme, die heutige Medikamente
noch plagen, wie z.B. die oft begrenzte Löslichkeit, die fragliche Stabilität, usw. beseitigen und früher
als kompliziert und umständlich geltende Verabreichungswege ermöglichen (Inhalation oder
intranasale Verabreichung) oder auch eine gewisse Individualisierung der Therapie irgendwie
machbar machen.
Die wichtigsten Gemeinsamkeiten aller Nanomedikamente sind die Multimodularität und die
Multifunktionalität. Multimodularität bedeutet, dass die kleinste voll funktionelle molekulare Einheit der
Nanomedikamente selbst auch aus
vielen
kleineren Modulen besteht, welche funktionell
unterschiedliche Aufgaben erfüllen. Das für die eigentliche therapeutische Funktion verantwortliche
Medikament-Molekül wird z.B. von einer Transporter-Einheit getragen, oder in ihrem Inneren
versteckt. Zum Transporter werden dann weitere Module gekoppelt, die unabhängig voneinander für
die Verbesserung der Absorption, Metabolismus, Verteilung und Targeting des Medikaments
verantwortlich
sind.
Zusätzlich
sind
manche
experimentelle
Nanomedikamente
auch
mit
Markierungsmodulen verkoppelt (z.B. Fluoreszenz), damit ihre Aktivität im Körper besser verfolgt
werden kann.
Von der Nanotechnologie wird in erster Linie in der Therapie der neuropsychiatrischen Erkrankungen
viel erwartet, weil sie durch die Blut-Hirn-Schranke eine bessere Absorption ermöglichen, und dadurch
ein schon seit langer Zeit vorhandenes kritisches Problem lösen sollen.
13.2.2.2. Targeting mit monoklonalen Antikörpern
Die mit Medikamentenmolekülen, Radioisotopen, oder Toxinen gekoppelten monoklonalen Antikörper
können auch als “Zielfinder“ (homing device) fürs Targeting verwertet werden.
209
Abbildung 13.1. Arten der Immuntherapie mit monoklonalen Antikörpern
Sie verbessern die therapeutische Wirksamkeit der Medikamente und minimalisieren den Schaden
der
gesunden
körperlichen
Zellen
ähnlich
zu
den
Nanomedikamenten.
Ihre
möglichen
Nebenwirkungen sind meistens mit denen der zum Antikörper gebundenen Wirkstoffe identisch,
obwohl der Antikörper-Teil selber unter Umständen auch seine eigenen Nebenwirkungen haben kann
(siehe später).
Die Klassifizierung der Therapien in denen monoklonale Antikörper als Lieferanten verwendet werden,
beruht auf den zu transportierten Wirkstoffen. Dementsprechend bezeichnet man die auf mit
Radioisotopen konjugierten Antikörpern basierenden Therapien als Radioimmuntherapien (z.B.
Ibritumomab tiuxetan, Tositumomab), die mit chemotherapeutischen Agenzien gekoppelten Antikörper
als Chemoimmutherapeutika (ist
noch
in
der
experimentellen
Entwicklungsphase),
die
mit
bakteriellen
(Diphtherietoxin,
Pseudomonas
Exotoxin)
oder
pflanzlichen (Rizin A, Saporin)
Toxinen gekoppelten Antikörper
als
Immuntoxintherapien
(z.B.
Gemtuzumab ozogamicin, BL22).
Einige
für
die
Anwendungsmöglichkeiten
von
solchen
wie
folgt:
Beispiele
Antikörpern sind
Abbildung 13.2. Nackte monoklonale Antikörper.
210
Nicht alle monoklonale Antikörper
tragen Konjugate. Die sog nackte
Antikörper werden meistens zur
Neutralisierung eines Ligands oder
Blockade
seines
Rezeptors
verwendet.
Abbildung 13.3. Mono-klonale
Antikörper mit Radionuklide
Radioisotope
chemisch
werden
zu
den
entweder
Antikörpern
gebunden, also mit ihnen direkt
verkoppelt
verabreicht
(einstufige
Therapie),
oder
nach
erst
der
Verabreichung des Antikörpers ins
Blut geführt und mit Hilfe eines
Biotin-Avidin
Systems
Antikörpern,
bzw.
gebunden
Die
(zweistufige
zweite
flexibler,
Strategie
da
es
zu
den
Zielzellen
Therapie).
ist
etwas
unterschiedliche
Isotopen mit dem selben Antikörper
Abbildung 13.4. Monoklonale Enzym-Prodrug Therapie
anwendbar macht, und theoretisch ermöglicht sie auch eine stärkere lokale Dose zu erreichen, ist
aber auch aspezifischer, weil Biotin auch an nicht-gezielten körperlichen Zellen vorkommen kann.
In diesem Fall sind die Antikörper mit einem (meistens nicht-menschlichen) Enzym verkoppelt. Das
Enzym ist in der Lage ein von den Antikörpern unabhängig, in einer zweiten Runde der Therapie
verabreichtes, inaktives und deswegen für gesunde körperliche Zellen harmloses Prodrug
umzuwandeln. Da die Umwandlung
des Prodrugs in ein aktives (z.B.
toxisches
Medikament,
wie
ein
Zytostatikum) nur an den Zielzellen
(z.B. Tumorzellen) stattfindet, wird die
Therapie die Zielzellen gezielt und
effizient, für andere körperliche Zellen
jedoch
besonders
schonend,
und
dadurch fast ohne Nebenwirkungen
beeinflussen.
Abbildung 13.5. Liposom-Therapie ergänzt mit monoklonalen Antikörpern
Liposomen sind relativ leicht mit monoklonalen Antikörpern zu verbinden. Weil sie praktisch alle
Formen von therapeutischen Agenzien verschlossen, von dem Rest des Körpers separiert
transportieren,
und
nur
den
Zielzellen
abgeben
können,
ist
diese
Strategie
besonders
vielversprechend. Liposomen sind oft PEG-modifiziert um ihre Halbwertszeit zu verlängern.
13.2.2.3. Targeting mit Peptiden
Da die Zielpunkte der meisten Medikamente sich im Zytoplasma oder Zellkern befinden, ist/spielt der
Transfer des Wirkstoffes in den intrazellulären Raum eine Schlüsselfrage/Schlüsselrolle in allen
gezielten Therapien. Die Entdeckung der sog. zell-penetrierenden Peptiden (cell penetrating peptides
= CPPs), kleine Peptide wie das z.B. Protein Tat des HIV Virus, haben diese Frage/dieses Thema
stark beeinflusst. Solche Peptide erlauben bzw. sichern eine stark verbesserte Penetranz für
Medikamente oder Markierungsmoleküle durch die sonst nur sehr selektiv durchdringbaren
Plasmamembranen. Die medizinische Benutzung der CCPs hat heutzutage nur noch zwei wichtigere
Bereiche: die medizinische Bildverarbeitung und die molekulare Radiotherapie, obwohl neulich/seit
kurzem immer mehr auch mit gewebespezifischen CPP-Konstruktionen experimentiert wird (z.B:
gewebespezifisch aktivierbare CPPs, usw.).
13.2.2.4. Chemotaktisches targeting (chemotactic drug targeting)
Eine spezielle Form der gezielten immunologischen Therapien ist CDT, bei der die zu behandelnden
Zellen zu den Medikamentenmolekülen geleitet werden, und nicht umgekehrt. Die CDT Konjugate
bestehen aus mehreren Teilen: 1) aus einem carrier, welcher die zelluläre Aufnahme und
Internalisierung des Medikaments bestimmt 2) einem chemotaktisch aktiven Ligand, welcher die
Zielzelle spezifisch, durch seine chemotaktische Wirkung zur Aufnahme des Medikaments anlockt, 3)
dem Mediment-Molekül selbst, und 4) einem spacer, welcher das Medikament zum carrier bindet und
seine Abspaltung vom carrier nach der Aufnahme, innerhalb der Zelle ermöglicht.
13.3. Immuntherapie
Die Immuntherapien werden auch nach mehreren Eigenschaften kategorisiert. Je nachdem, ob die
Immuntherapie auch eine aktive Beteiligung des Immunsystems des Patienten benötigt oder nicht,
werden die aktiven und passiven Immuntherapien voneinander unterschieden. Zweitens, von der
Richtung des Eingriffs abhängig redet man über Immunstimulation, Immunsuppression oder
Immunmodulation. Es ist wichtig zu sehen dass diese zwei möglichen Gruppierungen nicht einander
hierarchisch unter- oder übergeordnet sind, d.h. alle ihrer möglichen Kombinationen sind vorstellbar
(aktive Suppression, passive Immunmodulation, usw.).
13.3.1.
Aktive Immuntherapie
Die aktiven Immuntherapien sind solche medizinischen Einwirkungen, welche dem Immunsystem des
Patienten die benötigten Einsatzbefehle erteilen, gegen eine gewisse Krankheit aufzutreten oder
212
einen gewissen Erreger zu beseitigen, damit der Organismus selber das Problem behandeln kann.
Eine aktive Immuntherapie gegen ein Zielmolekül kann mittels Induktion der Immunantwort (z.B.
Impfung), Verstärkung einer bereits laufenden Immunantwort (z.B. durch Verstärkung der
Antigenpräsentierung), oder sogar durch die Beeinflussung der eingebauten regulatorischen
Mechanismen der Immunantwort (z.B. Aufheben der Toleranz gegen ein Tumorantigen) erzielt
werden. Aktive Immuntherapie wird am häufigsten in akuten und chronischen infektiösen
Erkrankungen, und in manchen nicht-infektiösen chronischen Krankheitsbildern wie Krebs und
Autoimmunität verwendet.
13.3.2.
Präventive (prophylaktische) Impfungen
Gegen potentiell lebensbedrohliche akute Infektionen werden meistens präventive Impfungen
eingesetzt,
welche
getötete
oder
attenuierte
(in
ihrer
Virulenz
künstlich
beschränkte)
Krankheitserreger beinhalten.
Sie sind bei solchen Infektionen von Bedeutung, gegen die ein langfristiges Gedächtnis aufgebaut
werden kann (z.B. Pocken, Tollwut, Typhus, Cholera, HBV, Diphtherie, Tetanus, usw.). Präventive
Impfungen werden in einen gesunden Organismus, noch vor seiner Exposition auf den wahren
Erreger eingeführt, um den klassischen, potentiell tödlichen Verlauf der Infektion vorzubeugen, den
Verlauf dem Patienten zu erleichtern, oder die typischen Schäden und Risiken einzudämmen. (Eine
wichtige Ausnahme dieser Definition ist der Fall der Tollwut, dessen Behandlung unter gewissen
Umständen auch auf einer prophylaktischen Impfung beruht, welche aber nach der Exposition
verabreicht werden kann).
Aktive Immunisierung in oder gegen chronische Krankheitsbilder bzw. Infektionen ist in der Regel
weniger effizient. In diesem Bereich fokussiert sich die heutige Forschung vor allem auf solche
Krebskrankheiten, hinter denen eine Virusinfektion als instrumenteller Faktor bekannt ist: z.B.
Leberzellkarzinom (HBV, HCV), Gebärmutterhalskrebs (HPV), Burkitt- und Hodgkin Lymphom (EBV),
T-Zell-Leukämie und Lymphomen (HTLV-1), usw. Diese, gegen Krebsentwicklung eingesetzten
prophylaktischen
Impfungen
(cancer
preventive
vaccines)
müssen
jedoch
klar
von
den
therapeutischen Impfungen getrennt werden, die gegen einen bereits vorhandenen Krebs angewandt
werden (cancer treatment vaccines).
13.3.3.
Therapeutische Impfungen
Das Ziel der Entwicklung von therapeutischen Impfungen ist die Verbesserung der gängigen
Therapien gegen manche langsam ablaufende chronische Krankheiten, wie bestimmte Krebsarten,
Autoimmunkrankheiten, AIDS, Tuberkulose, Malaria, usw. Therapeutische Impfungen mobilisieren die
zelluläre oder humorale Immunantwort des Patienten, damit die Schwierigkeit der Krankheit etwas
vermindert wird, oder in dem extremen Fall, die Krankheit vollständig geheilt wird. Diese
therapeutischen Impfungen liefern oft die selben Antigene oder Epitope dem kranken Organismus,
gegen die man in einer passiven Immunisierung monoklonale Antikörper verabreichen würde.
Für klinische Zwecke genehmigte therapeutische Impfungen gibt es viele, ein Beispiel dafür ist in dem
Fall der Multiplen Sklerose zu sehen. Die in Schüben verlaufende Multiple Sklerose kann höchst
213
effektiv durch einen Impfstoff unter dem kommerziellen Namen Copaxone beeinflusst werden. Der
Impfstoff beinhaltet ein synthetisches Copolimer namens Glatiramerazetat. das sich dem MyelinBasischen Protein ähnelt, also dem Autoantigen, welches in der MS von dem Immunsystem
angegriffenen wird. Obwohl der Wirkungsmechanismus vom Glatiramerazetat unbekannt ist, wird
angenommen, dass es seine Wirkung wenigstens teilweise durch die Verschiebung des Th1-Th2
Gleichgewichts in die Th2 bzw. eine immunsuppressive Richtung ausübt. Auf diese Weise werden
anti-inflammatorische Mechanismen und für das Glatiramerazetat spezifische Treg Zellen aktiviert.
13.3.3.1. Weiterentwicklung der gängigen Impfungen
13.3.3.1.1.
Anwendung von Adjuvanzien
Eine Schlüsselfrage der Impfstoff-Entwicklung ist immer, wie stark und wie lang die von den Antigenen
ausgelöste Immunantwort sein wird. Ideal wäre selbstverständlich eine lebenslange Immunität zu
erzeugen, aber das ist bei vielen Erregern und Antigenen unmöglich. Die zur Immunisierung
angewandten natürlichen oder rekombinanten Antigene weisen meistens eine relativ niedrige
Immunogenität vor. Deshalb müssen sie im Impfstoff nicht in ihrer reinen Form, sondern zusammen
mit Adjuvanzien, d.h. mit Molekülen welche ihre Immunogenität steigern, eingesetzt werden.
Die Wirkungsmechanismen der Adjuvanzien sind vielseitig, aber sie wirken typischerweise
aspezifisch, also von den Eigenschaften des Antigens des Impfstoffes unabhängig. Zum Beispiel
sorgen viele von ihnen
für eine gleichmäßige und langsame
Freilassung des immunisierenden
Antigens aus dem Impfstoff über die Zeit (Deponierungseffekt), wodurch die Antigenpräsentierung
länger läuft, mehr T Zellen aktiviert werden können, und die Immunantwort auch stabiler bleibt. Solche
Adjuvanzien sind z.B. die Aluminiumhydroxyd oder Aluminiumphosphat Gels, obwohl Wasser-Öl
Emulsionen zu diesem Zweck auch oft eingesetzt werden. Andere Adjuvanzien wirken durch
Stimulierung des natürlichen Immunsystems durch PRRs, Zum Beispiel Aktivierung des TLR2 und
TLR4 durch Adjuvanzien steigert die Sekretion von immunaktivierenden inflammatorischen Zytokinen
wie TNF, verstärkt die Expression von iNOS, und beschleunigt die Migration mancher APCs (DCs und
Makrophage):
sie
aktivieren
also
viele
Verteidigungsmechanismen
gegen
infektiöse
Krankheisterreger.
In den Tumortherapien erhöht die Sekretion von TNF die Permeabilität der Kapillaren des Tumors für
die Chemotherapie, und verstärkt dadurch ihre Wirkung. Eine höhere iNOS Expression führt zur
Freisetzung von NO in hohen Konzentrationen, welche Apoptose induzieren kann selbst in solchen
Tumorzellen die schon Resistenz gegen die Chemotherapie entwickelt haben. Schnellere Wanderung
von DC und Makrophagen in und aus dem Stroma von Tumoren verbessert die Präsentierung von
Tumorantigenen für CD8+ T Zellen. In der Tat gibt es klinische Beweise dafür, dass eine parenterale
Behandlung mit TLR2 und TLR4 das Überleben von Patienten verlängert, selbst wenn sie auf die
konventionelle Chemotherapie nicht mehr antworten können, oder einen Rückfall gehabt haben.
Teilweise führten diese Kenntnisse zu den ersten Versuchen Nanomedikamente mit TLR4 oder TLR7
Agonisten-Gehalt zu entwickeln. Laut den zurzeit erhältlichen Daten erzeugen diese Strategien eine
starke und, in manchen Krankheiten und glücklichen Fällen, sogar lebenslange Immunität.
214
13.3.3.1.2.
Unterstützung der Antigenpräsentierung
Die Stärke der antitumoralen Impfstoffe kann auch durch die Unterstützung der APC in der Ausübung
ihrer Präsentierungsfunktionen verbessert werden. Hierfür gibt es mehrere Möglichkeiten, wie die
Beschleunigung der Teilung der Vorläuferzellen (IL-3, GM-CSF), Beschleunigung der Differenzierung
und Reifung der APCs mit ausgewählten Zytokinen (GM-CSF), Aktivierung der Expression von
kostimulatorischen Molekülen, Interferenz mit negativen Kostimulatoren (z.B. Interferenz mit CTLA-4),
oder Verbesserung der Antigen-Aufnahme der APCs (z.B. ex vivo Auffüllung von DCs mit
synthetischen Antigen-Peptiden, oder sogar ex vivo Fusion von DCs mit Tumorzellen).
13.3.3.1.3.
Verstärkung der Aktivität von T Zellen
Die gegen bestimmte Fremdantigene oder Tumorassoziierte Antigene (TAA) spezifischen T Zellen
können zum Zwecke der Impfung, in erster Linie durch eine verbesserte Aktivierung des TZRs auch
stärker aktiviert werden. Dies kann am einfachsten durch eine Verbesserung der Prozedur der
Antigen-Auswahl erreicht werden. Optimierung der TZR Aktivierung durch verbesserte Antigenpeptide
ist jedoch keine leichte Aufgabe, da ein essentiell wichtiger Teil der Verteidigungsmechanismen von
vielen Krankheitserregern und Tumoren ihre relativ starke Ähnlichkeit zu körpereigenen Antigenen ist.
Für die Verbesserung der TZR-Aktivierung durch intelligent ausgewählte Peptide wurde deshalb in
den letzten Jahren eine ganz neue Wissenschaft, das sog. Epitop-Engineering etabliert.
13.3.3.2. Zytokine in der aktiven Immuntherapie
Wegen ihrer starken und vollkommen natürlichen Wirkung auf die Immunantwort sind Zytokine ideale
BRMs für die Behandlung von einer Vielzahl von Krankheiten in denen das Immunsystem eine
wichtige Rolle spielt. Die Wirkungen von therapeutisch eingesetzten Zytokinen können sehr vielseitig
sein: z.B. in Tumortherapien mögen sie sowohl die antitumorale Antwort verstärken, als auch direkt an
den
Tumorzellen
wirken.
Zum
Beispiel
IFN
alpha,
eines
der
am
besten
bekannten
immuntherapeutischen Zytokine, erhöht die MHC Expression sowohl an DC als auch an Tumorzellen,
unterstützt die Killer-Aktivität von Tcit und NK Zellen, hebt die Toleranz gegen Tumoren auf und treibt
Tumorzellen in die Apoptose. Interleukin-2 (IL-2), ein natürlicher Wachstumsfaktor von T Zellen, kann
in hohen Dosen T Zellen nicht nur zur Teilung anregen sondern sie auch überstimulieren, eine
massive Freisetzung von vielen T-Zell-Zytokinen erzeugen (cytokine storm), extrem starke akute
Entzündungen und Abstoßung von selbst etablierten Tumoren oder volle Regression ihrer Metastasen
hervorrufen. Andere, in der Tumortherapie noch nicht etablierte aber vielversprechende Zytokine sind
TNF und TRAIL, welche auch direkte zytotoxische Wirkungen auf Tumorzellen haben.
13.3.3.3. Manipulation der Immuntoleranz
Die Immuntoleranz ist eine kontrollierte, absichtliche Unfähigkeit des Immunsystems auf bestimmte
Antigene zu reagieren. Die Toleranz ist vor allem gegen körpereigene Strukturen sinnvoll und
dementsprechend wird sie als eine wichtige natürliche und vollkommen physiologische Funktion des
Immunsystems ausgeübt. Interessanterweise wird aber Toleranz auch gegen bestimmte, nichtkörpereigene aber harmlose fremde Antigene, z.B. Antigene der Kommensalen in dem Darmtrakt
215
entwickelt. Toleranz wird nur problematisch, wenn gefährliche Viren, Bakterien, Parasiten und andere
Krankheitserreger, Schritte machen um eine Toleranz gegen sich selbst aktiv hervorzurufen. Ein
Paradebeispiel dafür ist das Mycobacterium leprae, oder wenn die Toleranz gegen körpereigene
Antige in den Autoimmunitäten ausfällt.
Therapeutisch induzierte Toleranz wurde zuerst in der Transplantationsmedizin eingeführt um die
allogen transplantierten Organen vor der Abstoßung zu schützen. Heute wird aber diese Option auch
bei vielen Autoimmunkrankheiten und Hypersensitivitätsreaktionen eingesetzt. Erzeugung der
Toleranz ist durch mehrere Wege möglich: 1) immunsuppressive Steroide (z.B. Prednisolon), 2)
Interferenz mit der DNA-Replikation und Zellteilung der T Zellen (Azathioprin) 3) Interferenz mit der
Signalübermittlung in T Zellen (Tacrolymus) 4) durch Vernichtung der aktivierten T-Zellen mit
monoklonalen Antikörpern (z.B. anti-CD3, anti-CD25), 5) die noch experimentelle Strategie der
Hemmung der Tcit und NK Zellen durch die Verabreichung von solublen MHCI Molekülen oder 6) die
gezielte Induktion von Treg Zellen.
13.3.3.4. Zelluläre Immuntherapien
Das ständig verbesserte Verständnis der Mechanismen der antitumoralen Immunantworten führte zur
Entstehung von solchen Immuntherapien, welche die mit dem Tumor interagierenden Immunzellen
direkt, in situ zu beeinflussen versuchen. Je nach Wirkungsmechanismus können diese Therapien in
drei Gruppen eingeteilt werden: 1) Induktion der antitumoralen Immunantwort 2) Anlockung von
tumorspezifischen Immunzellen an den Ort des Tumors 3) Neutralisierung der tumorvermittelten
Immuntoleranz.
13.3.3.4.1.
Induktion der antitumoralen Immunantwort
In den zellulären Tumorimmuntherapien sind der adoptive Zell-Transfer (ACT) und die DC Impfung
alternative Strategien mit dem selben Ziel, nämlich der Erzeugung einer starken Immunantwort mit
Hilfe von manipulierten Immunzellen.
Beim ACT werden T Zellen, meistens tumor-infiltrierende T Zellen (TILs) aus Krebsläsionen des
Patienten isoliert, und außerhalb des Körpers, unter künstlichen Umständen, in speziellen Zellkulturen
(ex vivo) aktiviert bzw. manipuliert. Die am öftesten benutzte Strategie ist die künstliche Aktivierung
von T-zellen mit Exposition auf Tumorantigene und gleichzeitiger IL-2 Behandlung. Eine andere
Strategie ist die Entnahme von T Zellen und ihre gentechnologische Transfektion mit Vektoren,
welche die Expression von tumorspezifischen TZRs forcieren. In beiden Fällen werden die ex vivo
aktivierten, manipulierten und vermehrten, also gegen den Tumor so stark wie möglich angeregten T
Zellen am Ende des Prozesses dem Patienten in extrem großen Mengen zurückgegeben (adoptiver
Zell-Transfer).
In der DC Impfung werden aus dem peripheren Blut des Patienten Monozyten isoliert und mit einem
speziellen Protokoll ex vivo, meistens mit Hilfe unter anderem, von
IL-4 und GM-CSF zu DC
differenziert. Parallel zur Entnahme des Blutes werden auch Tumorzellen aus dem Patienten isoliert,
lysiert und die DC mit ihren Antigenen und manchen DC Reifungsfaktoren zusammen so lange
inkubiert, bis die DC mit den Tumorantigenen aufgefüllt und vollständig reif sind. Die DC werden dann
216
dem Patienten zurückgegeben um eine tumorspezifische T-Zell-vermittelte Immunantwort zu
erzeugen. Sowohl ACT als auch DC Impfung sind wirksame therapeutische Möglichkeiten, jedoch
sind beide noch in der experimentellen Phase und noch extrem kompliziert in einem regulären
Krankenhaus auszuführen.
13.3.3.4.2.
Anlockung von tumorspezifischen Immunzellen zum Tumor
Zu diesem Zweck werden in erster Linie solche TLR Agonisten benutzt, die eine starke Entzündung
an der Stelle des Tumors erzeugen und dadurch eine so starke Infiltration von Immunzellen jeglicher
Arten erzeugen, dass sie am Ende die tumorerzeugte Toleranz durchbrechen und den Tumor
abstoßen. Ein Beispiel für diese Strategie ist der TLR7 Agonist namens Imiquimod, welcher einfach in
der Form einer Creme auf manchen Hauttumoren wie Basalzellkarzinomen aufgetragen wird, und sie
rasch, parallel zur Entwicklung einer starken Entzündung, abstoßen lässt.
Eine andere Strategie ist die der Anwendung von bispezifischen Antikörpern. Diese entstehen durch
enzymatische Spaltung und Neukopplung, oder durch gentechnologisch erzeugte Antikörper-Chimäre,
deren zwei Fab Teile zwei verschiedene Spezifitäten vorweisen (!). Der eine Fab Teil bindet einen
Marker
der
Tumorzellen,
während der andere
einen
Marker
der
anzulockenden
Immun-zelle,
z.B.
CD3 der T Zellen
erkennt.
Diese
Konstruktion
verbindet
Tumorzellen
also
mit
Immunzellen um die
Erkennung und Vernichtung
Krebszellen
der
zu
Abbildung 13.6. Bispezifische monoklonale Antikörper
begünstigen.
13.3.3.4.3.
Neutralisierung der tumorvermittelten Immuntoleranz
Therapeutische Strategien dieser Art können die systemische Immunsuppresion oder lokale
Immuntoleranz durch das Ausschalten von T-Zell-hemmenden Mechanismen neutralisieren (antiCTLA-4, anti-PD-L1). Eine andere Möglichkeit ist die Sichtbarkeit der Tumorzellen für die Immunzellen
durch die forcierte Expression von bestimmten, stark immunogenen Antigenen (manche TAAs), oder
immunstimulierenden Zytokinen (GM-CSF, IL-2, usw) zu steigern.
217
13.4. Passive Immuntherapie
In einer passiven Immuntherapie wird ein immuntherapeutisches Ziel entweder ohne, oder nur mit
begrenzt aktiver Beteiligung des Immunsystems des Patienten erreicht. Dies bedeutet in erster Linie
die Verabreichung von Medikamenten, zum Beispiel monoklonalen Antikörpern, die dem Patienten
einen fertiggestellten Schutz liefern oder eine therapeutisch nützliche Immunantwort mechanistisch
anregen.
13.4.1.
Monoklonale Antikörper in der Therapie
Die monoklonalen Antikörper wirken genauso wie die Antikörper des Patienten selbst. Sie können
entweder „nackte“, also nicht-modifizierte, nicht-gekoppelte, quasi-native Antikörper, oder chemisch
bzw. gentechnologisch mit irgendeinem Molekül gekoppelte modifizierte Antikörper sein. Die
gekoppelten oder modifizierten Antikörper können Toxine, Radioisotope (typischerweise starke
gamma oder beta-Emitter), Enzyme, Medikamente, immunmodulatorische Moleküle wie z.B. Zytokine
tragen, oder zwei unabhängige Bindungsstellen mit unterschiedlicher Spezifizität vorweisen
(bispezifische Antikörper, siehe vorher, Kapitel 13.3.3.4.2).
13.4.1.1. Herstellung der monoklonalen Antikörper
Die industrielle Herstellung von monoklonalen Antikörpern
Die Erzeugung von monoklonalen Antikörpern wurde erst in den ‘70ern, durch die Entwicklung der
Hybridom-Technik möglich gemacht. Die Technik ist den Forschern Georges J.F. Köhler und César
Milstein zu verdanken, wofür sie beide in 1984 den Nobelpreis in Medizin erhielten. Diese Technologie
ermöglichte zum ersten Mal die Produktion von wortwörtlich unbegrenzten Mengen von Antikörpern
mit einer einzigen, bestimmten Spezifizität, und wird seitdem mit großem Erfolg benutzt für sowohl
diagnostische als auch therapeutisch Zwecke.
Zur Erstellung von monoklonalen Antikörpern wird zuerst ein Tier, meist eine Maus mit dem fraglichen
menschlichen Antigen, wogegen die monoklonalen Antikörper benötigt werden, intravenös
immunisiert. Aus dieser Maus werden dann die durch Immunisierung aktivierten, milz-ständigen BZellen entnommen und in vitro kultiviert. Im nächsten Schritt wird zu diesen B-Zellen eine MyelomZelllinie gegeben, und die zwei werden miteinander vermischt.
Danach werden die Zellen in dieser gemischten Kultur miteinander zu zufälligen Fusionen gebracht.
Die Zellfusion wird meistens mit Polyethylenglykol (PEG) begünstigt, obwohl heute weitere, alternative
Methoden, wie die der elektromagnetischen Fusion, usw. auch immer öfter benutzt werden. PEG ist
ein starker Dipol, der die räumliche Orientierung der Wassermoleküle um die Plasmamembran der
Zellen herum verändert, und dadurch eine Fusion zweier PMs ermöglicht. Da die Fusionen rein
zufällig ablaufen, wird der Anteil der eigentlich gewünschten B-Zell - Myelomzell Fusionszellen, der
sog. Hybridomen, sehr gering, nur ca. 1-2%.
Aus diesem Grund müssen die unerwünschten Zellen (nicht-fusionierte B-Zellen und nicht-fusionierte
Myelomzellen), vor den weiteren Schritten des Prozesses durch Selektion eliminiert werden. Die
Selektion wird mittels eines speziellen Zellkulturmediums, des sog. HAT-Mediums (Hypoxanthin218
Aminopterin-Thymidin) ausgeführt. Das HAT Medium blockiert durch seinen Aminopterin Inhalt den
klassischen Weg des Folsäure-Metabolismus und dadurch die DNA-Synthese. Andererseits aber,
durch die Zugabe von Hypoxanthin und Thymidin, schafft es auch alle Voraussetzungen für einen
alternativen Weg der DNA Synthese (sog. salvage pathway), welcher aber das Enzym ThymidinKinase (TK) benötigt. Da die nicht fusionierten Myelomzellen für genau diesen alternativen
Stoffwechselweg Mangelmutanten sind (TK -/-), sterben sie in diesem Medium rasch ab. Die nicht
fusionierten B-Zellen sterben zwar auch, aber etwas später ab, weil sie wie alle gesunden Zellen, eine
begrenzte Lebensdauer haben. Sie werden also einige Wochen in der Kultur nicht überleben können.
Mit anderen Worten können eine HAT-Selektion nur die immortalisierten und gleichzeitig auch mit
einer aktiven Thymidin-Kinase ausgestattete Zellen, also die Hybridomzellen,
eine längere Zeit
überstehen. Diese Hybridomzellen können dank der Myelomzellen-Gene als jede Zellinie, unbegrenzt
weiter kultiviert und in industriellen Mengen vermehrt werden. Andererseits, dank ihrer B-Zellen-Gene,
werden die Hybridomzellen auch die Antikörper des B-Zell-Fusionspartners kontinuierlich sezernieren.
Diese Antikörper werden die selbe Spezifizität und Isotyp vorweisen, wie die ursprüngliche, mit dem
Antigen in der Maus immunisierte B-Zelle.
Diese Zellen werden dann mit weiteren Techniken weiter selektiert um die besten von ihnen, d.h. die
Antikörper mit der besten Affinität zum Antigen zu finden, und massenweise vermehrt. Dies ist möglich
1) in konventionellen in vitro Kultur der Hybridomzellen 2) in einer Massenkultur mit Hilfe eines
Bioreaktors (auch Fermenter genannt) oder 3) durch Implantation der Hybridomzellen in eine andere
Maus. In den ersten zwei Fällen werden die monoklonalen Antikörper vom Überstand der Kulturen, im
dritten aus der peritonealen Flüssigkeit der Maus zurückgewonnen.
Die Rolle der Gentechnologie in der Herstellung von monoklonalen Antikörpern
Mit gentechnologischen Methoden ist es gelungen, aus monoklonalen Maus-Antikörpern solche
Antikörper zu erzeugen, die in vielen Eigenschaften schon fast menschlich sind. Diese Antikörper sind
entweder in allen Bereichen des Antikörpers bis auf die variablen Domänen, (Chimära-Antikörper)
oder in allen Bereichen des Antikörpers bis auf die CDR Regionen der variablen Domänen,
(humanisierter Antikörper) mit
menschlichen
Sequenzen
ersetzt. Neulich wird auch mit
solchen
Technologien
experimentiert, die vollkommen
menschliche
Antikörper
erzeugen könnten. Im Vergleich
mit
Maus
Antikörpern
monoklonalen
werden
gentechnologisch
diese
veränderten
Antikörper vom menschlichen
Immunsystem viel seltener als
fremd erkannt.
Abbildung 13.7. Klassifizierung und Nomenklatur der
monoklonalen Antikörper nach Herkunft und Ähnlichkeit zu
menschlichen Antikörpern
219
Dies ist ein riesiger Vorteil weil sie deswegen viel weniger Komplikationen erzeugen und im Körper
des Patienten auch nur langsam abgebaut werden.
13.4.1.2. Risiken und Nebenwirkungen der monoklonalen Antikörper-Therapien
Die erste Generation der damals noch vollständig Maus monoklonalen Antikörper hatte noch viele
praktische Probleme welche ihre industrielle Produktion und routinemäßige Anwendung erheblich
komplizierte. Diese Maus Antikörper haben nämlich in den menschlichen Patienten oft starke
Immunreaktionen induziert, welche das Leben der Patienten durch eine akute Hypersensitivität vom
Typ I und einem davon hervorgerufenen anaphylaktischen Schock bedrohte. Zweitens haben diese
Immunreaktionen auch die langfristige Wirksamkeit der der monoklonalen Antikörper gefährdet, weil
gegen sie relativ schnell neutralisierende menschliche anti-Maus Antikörper (HAMA) und ein
immunologisches Gedächtnis entstanden sind.
Um diese Nebenwirkungen und inhärenten Schwierigkeiten der Therapie in den Griff zu bekommen,
hat man einerseits versucht alle, für die therapeutische Funktion unnötigen Teile dieser Antikörper mit
menschlichen Sequenzen zu ersetzen: so entstanden die ersten Chimäre und humanisierten
Antikörper.
Anderseits hat man, wenn möglich, die Maus-Segmente sogar völlig entfernt, wie es bei den
therapeutischen monoklonalen Antikörper-Fragmenten (Fab2 Dimere, Fab Monomere, scFv) der Fall
ist. Die kleine Molekülgröße der Antikörperfragmente hatte auch einen zusätzlichen Vorteil: sie
verbesserte
Penetranz
auch
von
die
diesen
Antikörpern in die Gewebe,
welche sehr wichtig ist in der
Therapie
von
soliden
Tumoren.
Dies
kommt
jedoch zu einem Preis: mit
der
verminderten
Größe
kommt nämlich auch eine
schnellere
Elimination,
welche die Halbwertszeit der
Antikörper
therapeutische
und
ihre
Effektivität
vermindert.
Abbildung 13.8. Klassifizierung Nomenklatur der monoklonalen
Antikörper nach Herkunft und Ähnlichkeit zu menschlichen
Antikörpern
13.4.1.3. Therapeutische monoklonale Antikörper in der Rheumatologie
Monoklonale
Antikörper
werden
neben
der
Onkologie
auch
in
anderen
Bereichen
der
Immunotherapie, wie zum Beispiel in der Immuntherapie der Autoimmunerkrankungen oder der
Rheumatologie mit Erfolg benutzt. In der Rheumatologie ist das Zytokin TNF einer der wichtigsten
Zielpunkte der monoklonalen Antikörper, da er als proinflammatorisches Zytokin in den meisten
rheumatischen Entzündungen eine kritische Rolle spielt, und durch mehrere Mechanismen in der
Lage ist, Entzündungen des synovialen Raumes zu induzieren oder verstärken.
13.4.1.3.1.
Der Pathomechanismus der rheumatoiden Arthritis: die Rolle der
proinflammatorischen Zytokine
Rheumatoide Arthritis (RA) ist eine systemische Autoimmunerkrankung, die sich vor allem mit dem
typischen Gelenkschmerz und Schwellungen der Finger und Zehengelenke manifestiert. Die Patienten
beschweren sich zuerst oft über eine Morgensteifigkeit der Hände, dessen Dauer mit der Aktivität der
Krankheit eine positive Korrelation zeigt. Diese Symptome erscheinen meistens symmetrisch, und
können sich individuell, mit der Zeit, zusätzlich auf die Handgelenken, Ellbogen und Knie ausbreiten.
In den betroffenen Gelenken entstehen chronische Entzündungen, und die dadurch verstärkte
Osteoklasten-Aktivität führt zu typischen Erosionen der Gelenkstruktur, die in Röntgen- oder MRAnalysen leicht erkennbar sind. Interessanterweise bleibt die Wirbelsäule fast immer verschont, bis
auf das Atlantoaxialgelenk, wo das entzündete, proliferierende Gewebe eine Rückenmarkkompression
verursachen kann. In der RA werden eine Vielzahl von Entzündungsmediatoren freigesetzt: zu den
charakteristisch sezernierten proinflammatorischen Zytokinen gehören IL-1, IL-6, IL-17, IL-18, IL-33
und TNF, und die in der RA typischen anti-inflammatorischen Zytokine sind IL-10 und IL-35. In den
aktiven Stadien der RA können meistens erhöhte Blutsenkung und hohe CRP Werte im Serum
gemessen werden. Typisch sind auch Autoantikörper wie z.B. Rheumafaktoren und anti-zyklische
citrullinierte Peptide (anti-CCP: siehe in Kapitel 10 im Detail). Letzten Endes führen diese starken
chronischen Entzündungsprozesse zur Destruktion und begrenzter Funktionalität der Gelenke: die RA
ist eine der häufigsten Ursachen der begrenzten Arbeitsfähigkeit in den europäischen Ländern.
Ungefähr 60-70 Prozent der Patienten sind Frauen, deren ersten Symptome erscheinen meistens im
Alter von 30-40 Jahren. Rauchen ist ein wichtiger Risikofaktor.
13.4.1.3.2.
Die zentrale Rolle des TNFs in der RA
Die Hauptfunktion von TNF ist der Schutz des menschlichen Körpers vor Krankheitserregern durch die
Aktivierung von lokalen und systemischen akuten Entzündungsreaktionen. Der Name TNF
(Tumornekrosefaktor) hat eine lange und komplizierte Geschichte hinter sich. In 1890 ist es dem
Chirurgen William B. Coley in New York zuerst aufgefallen, dass in schweren, inoperablen
Krebspatienten manchmal erstaunliche Heilungen stattgefunden haben, oft gleich nachdem der
krebskranke Patient eine schwere bakterielle oder virale Infektion überstanden hat. Er fing deshalb an,
manche seiner Krebspatienten absichtlich mit solchen Erregern zu infizieren. Coley hat festgestellt,
dass die antitumorale Wirkung dieser akuten Infektionen in bestimmten, seltenen Fällen auch so,
künstlich induzierbar war. Heute weiß man, dass die von schweren Infektionen induzierten akuten
Entzündungen, unter anderem durch die Freilassung von TNF, tatsächlich manchmal die chronische
Entzündung des Tumorstromas und die dadurch erzeugte Immuntoleranz durchbrechen, und eine
Abstoßung des Tumors erzeugen können. Erst in 1985 ist es aber Bruce A. Beutler klar geworden,
dass das hormon-artige Protein namens Cachexin, das die Abmagerung der Tumorpatienten
(Kachexie) erzeugte, und der Schock-induzierende Entzündungsmediator namens TNF, das ein und
221
selbe Molekül sind, und so erhielt der Name TNF endlich seinen Platz im Kanon der Zytokinen. Für
seine Arbeit hat Beutler in 2011 den Nobel Preis in Medizin erhalten.
Neben Infektionen und Krebs ist TNF auch in vielen autoimmun-inflammatorischen Krankheiten, wie
z.B. in der RA überexprimiert. Nichts desto trotz blieb für die Therapie von RA TNF als ein möglicher
Zielpunkt für eine lange Zeit unbekannt, und selbst bis zum Anfang der ‘90er blieben die Steroide, die
nichtsteroidalen Antiphlogistika und die Zytostatika die wichtigsten Mittel in den Händen der Mediziner.
Die ersten Versuche mit einer völlig neuen Methode, die eine Blockade von Zytokinen erzielte um die
Entzündung zu verringern, haben erst in den ’80ern stattgefunden. Marc Feldmann und Sir Ravinder
Maini haben beobachtet, dass die aus RA-Patienten entfernten synovialen Gewebeproben in einer
Zellkultur noch tagelang große Mengen von TNF und IL-1 freigesetzt haben. Ähnlich dem TNF ist IL-1
auch ein Entzündungsmediator, welcher zu den typischen Erosionen der RA auch einen wichtigen
Beitrag leistet. Die Gruppe hat sowohl anti-TNF, als auch anti-IL-1 Antikörper ausprobiert um die
Symptome zu behandeln, und es stellte sich heraus, dass in der Zellkultur die effektivsten die antiTNF Antikörper waren, die sogar auch die Sekretion von IL-1 indirekt hemmen konnten. Später haben
auch klinische Untersuchungen die ausgezeichnete therapeutische Aktivität der anti-TNF Antikörper in
der RA erwiesen, und heute ist die anti-TNF Therapie weltweit etabliert in der Behandlung der RA.
Feldmann und Maini erhielten für ihre Arbeit den Albert Lasker Preis in 2003.
13.4.1.3.3.
Gängige Methoden der TNF Blockade
Die wichtigsten, für die klinische Anwendung genehmigten, TNF-blockierende Medikamente sind 1:
der humanisierte Maus anti-TNF monoklonale Antikörper Infliximab (für i.v. Verabreichung) 2: der
erste vollkommen humane monoklonale
Antikörper, der
Anti-TNF
monoklonale
Antikörper
Adalimumab (s.c. Verabreichung) 3: das PEG-konjugierte monoklonale Fab Antikörper-Fragment
Certolizumab pegol (s.c.), 4: der vollkommen menschliche monoklonale Antikörper Golimumab (s.c.),
5: und der als Fusionsprotein eines löslichen TNF-Rezeptors und eines Immunglobulin Fc-Teils
synthetisierter Etanercept (s.c.) In Europa erhalten jährlich Zehntausenden RA-Patienten anti-TNF
Medikamente, die Therapie wird aber von der Gesundheitskassen oft nur dann unterstützt, wenn
klassische Behandlungen (z.B. Methotrexat) sich als nicht genügend wirksam erstellt haben.
13.4.1.3.4.
Nebenwirkungen von TNF-blockierenden Medikamenten
Die wichtigste Nebenwirkung der TNF-Blockade ist eine erhöhte Anfälligkeit für praktisch allerlei
bakterielle, virale, und Pilzinfektionen, von denen viele zu den opportunistischen Infektionen gehören.
Die häufigsten sind Infektionen der oberen Atemwege, wobei die wichtigste Komplikation die
Tuberkulose ist, vor allem ihre extrapulmonale Form. Das Risiko der Tuberkulose ist soweit erhöht,
dass alle mit anti-TNF Medikamenten behandelten RA Patienten kontinuierlich unter pulmonologischer
Kontrolle stehen müssen. Es wird angenommen, dass die TNF Blockade vor allem durch die indirekte
Hemmung der IFN Expression das Risiko von TBC steigert. Das von aktivierten Th-Zellen
freigesetzte IFN ist von kritischer Bedeutung in der Aktivierung der TBC-infizierten Makrophagen und
in dem Aufbau von Granulomen, also letzten Endes in der Isolierung und erfolgreichen Beseitigung
des Erregers. Bei vielen, mit anti-TNFs behandelten RA Patienten ist ohne diese Funktionen die
Verteidigung des Körpers gegen Tuberkulose grundlegend kompromittiert worden.
222
13.4.1.3.5.
TNF-Blockade in anderen rheumatologischen Erkrankungen
Weil TNF neben RA auch in der Pathogenese von vielen rheumatologischen Krankheiten eine
Schlüsselrolle spielt, wird die TNF-Blockade auch in anderen Bereichen der Rheumatologie in der
täglichen Routine angewandt. Beste Beispiele für solche Krankheiten sind vielleicht die Behandlung
der SPA (Spondylitis ankylosans, für eine detaillierte Beschreibung siehe Kapitel 10.2.5), und die der
juvenilen Arthritis.
13.4.1.3.6.
Entzug von B-Zellen mit Hilfe von anti-CD20 monoklonalen Antikörpern
B-Lymphozyten spielen auch wichtige Rollen in der Pathogenese von RA. Neben ihrer AutoantikörperProduktion, wie die des Rheumafaktors oder der anti-CCP Antikörper, präsentieren sie auch die von
ihnen erkannten Autoantigene für T-Zellen, und sezernieren Zytokine, welche die Krankheit
verstärken. In der RA sind Rheumafaktoren und anti-CCP Antikörper beide prognostische Marker,
aber ihre Konzentration zeigt keine Korrelation mit der stets schwankenden Aktivität der Krankheit
selber. Entzug der B-Zellen durch Antikörper, welche ihre charakteristischen CD20 Marker erkennen,
ist eine ausgezeichnete therapeutische Strategie in RA. Der intravenös verabreichte Maus-Mensch
Chimäre monoklonale anti-CD20 Antikörper Rituximab verursacht eine selektive Suppression der BZellen durch ihre komplement- oder ADCC-vermittelte Lyse. Nach einer Behandlung dauert es einige
Monate, bis CD20+ B-Zellen erneut in relevanten Mengen im Körper auftauchen, weswegen die
Behandlung in der Regel nur zweimal im Jahr durchgeführt werden muss. Da CD20 auf fast allen BZellen, jedoch nicht auf Plasmazellen vorhanden ist, sollte die Therapie komischerweise die
autoantikörper-produzierenden B-Zellen eigentlich nicht einmal eliminieren können. Dennoch wurde
nachgewiesen, dass die Ritumximab-Therapie die Konzentration der Autoantikörper stark verringert,
ohne dabei die meisten physiologischen Antikörper zu beeinflussen. Man vermutet, und es gibt einige
Beweise dafür, dass die Erklärung für diesen Widerspruch einfach eine abnormal hohe Expression
des CD20 auf autoreaktiven Plasmazellen in RA ist, welche sie für die Therapie viel empfindlicher
machen als normale Plasmazellen es sind. Was die Nebenwirkungen angeht, macht die RituximabBehandlung die Patienten auch deutlich empfindlicher für manche Infektionen.
13.4.1.3.7.
Hemmung der T-Zell-Aktivierung mit CTLA-4 Immunglobulin
Fusionsproteinen
T-Lymphozyten sind auch gute therapeutische Zielpunkte in der Immuntherapie der RA. Zu diesem
Zweck wird ein Fusionsprotein bestehend aus CTLA-4 und dem Fc-Teil eines Immunglobulins
angewandt (Abatacept). Der Zugabe des Ig Fc Teils ist benötigt, damit das integrale PlasmamembranProtein CTLA-4 auch als von der Membran separiertes lösliches Serumprotein, also intravenös
verabreichtes Medikament in einer Lösung stabil bleibt. Da der Fc Teil an sich unerwünschte EffektorFunktionen (z.B. Komplement-Aktivierung) auslösen könnte, wurden diese Funktionen in der zweiten
Generation der Abatacept-Therapie durch gezielte Mutationen inaktiviert.
Der Prinzip der Therapie ist relativ einfach: das Fusionsprotein bindet mit seiner CTLA-4 Untereinheit
zum B7 Molekül der antigenpräsentierenden Zellen. Dank der Tatsache, dass CTLA-4 eine höhere
Affinität für B7 vorweist als CD28 auf T Zellen, verringert das Fusionsprotein kompetitiv die
Kostimulation und so die erfolgreiche Aktivierung der T-Zellen (Abbildung 13.9-10.). Abatacept ist
zugelassen für die Therapie von RA, wird als Infusion verabreicht, und wegen ihrer stark suppressiven
223
Wirkung auf T-Zellen erzeugt sie auch eine erhöhte Empfindlichkeit für verschiedene Infektionen in
den behandelten Patienten.
Abbildung 13.9. Prinzip der Abatacept-Therapie
224
Abbildung 13.10. Das Abatacept Fusionsprotein
Übersetzt von Zoltán Pós
225
14. EINIGE IMMUNOLOGISCHE
ANWENDLUNGSMÖGLICHKEITEN DER INFORMATIK
(EDIT BUZÁS)
Dieses Praktikum soll hauptsächlich einen Überblick über das Themaverschaffen, und ein Konzept
versucht über die bioinformatischen und web-Applikationen mit der Hilfe von konkreten Beispielen
vorzustellen.
Ein wichtiger Ausgangspunkt (Startseite) ist die Homepage von National Center for Biotechnology
Information (NCBI, www.ncbi.nlm.nih.gov), die nach der Erkennung der wissenschaftlichen
Bedeutung von computerisierter Datenverarbeitung in der Medizin erstellt wurde. Seit 1988
funktionierte sie als die Abteilung National Library of Medicine (NLM), in den Rahmen von National
Institutes of Health (NIH), die von der US-Regierung unterstützt wird. Das NCBI unter anderen
etabliert Datenbanken, sorgt für das Aufrechterhalten und koordiniert die Zugangsberechtigung für
bestimmte Daten und Software. Durch die standardisierten Datenformen werden die Speicherung und
der Informationsaustausch zwischen den Benutzern ermöglicht.
Auf der Startseite von NCBI soll man oben im Klappfenster „Search“ die PubMed Datenbasis, die eine
Datenbank von publizierten biomedizinischen Artikeln ist, auswählen. Ins unterliegende breite Fenster
tippen wir den gefragte Ausdruck oder Ausdrücke, nach denen wir in der Datenbank suchen möchten.
Sucht man z. B. nach dem Wort „immunity“, findet man zirka 300.000 Übereinstimmungen. Wenn man
den Titel des ersten Artikels anklickt, befindet sich auf der geöffneten neuen Seite eine
Zusammenfassung (das Abstract), und ein auf der oberen rechten Seite liegendes Piktogramm (icon)
leitet zu dem Volltext weiter (kostenlos erreichbar sind z. B. „Free PubMed article in PubMed Central”
oder „Royal Society Publishing fulltext available” usw), dann kann man ihn herunterladen. Natürlich
können nicht alle Artikel auf diese Weise erreicht werden, sondern nur die Abstrakte
(Zusammenfassungen) der Herausgabe können in vielen Fällen gelesen werden.
226
Wenn man sich hauptsächlich über die immunologischen Zeitschriften informieren möchte, steht eine
Liste hier zur Verfügung. Klickt man den Name der Zeitschrift an, gelangtman direkt auf die
Homepage des Journals.
Es ist sogar auch möglich, die sog. Meta-Datenbanken aufzusuchen, die selbst Sammlungenanderer
Datenbanken sind. Ein Beispiel hierfür, im Rahmen derimmunologischen Thematik, ist die BioMed
Central Datenbank, in der man z. B. auf dbMinor (Minor Histocompatibility Knowledge Database) oder
Defensins Knowledgebase spezialisierte Wissensdatenbanken findet. Auf diesen Links können viele
Informationen
(auf
überraschender
Weise)
über
die
Defensine
und
über
minor
Histokompatibilitätsantigene gefunden werden; hier kann die jährlichen Ausdehnung der Fachliteratur
verfolgt werden.
Zahlreiche Allergen-Datenbanken können auch über das Internet erreicht werden. Nach Registrierung
kann man einen eigenen Login-Name und Password erhalten. Suchen wir die vorliegenden
Informationen über Derp1 Allergen auf!
Ein sehr wichtiges Modellsystem sind die genetisch modifizierten Organismen für die in vivo
immunologischen Experimente, in den ein oder gleichzeitig mehrere Gene ausgeschaltet oder
überexprimiert werden, damit die Bedeutung bestimmter Moleküle beurteilt werden kann. Der
häufigste verwendete Modellorganismus ist die Maus in der Immunologie. Auf dieser URL befindet
sich eine Datenbank der genetisch modifizierten Mausstämme, in dem z.B. die beta-2-mikroglobulin
knock-out (KO) Mäuse ausgewählt werden können. Das beta-2-mikroglobulin Protein bindet
üblicherweise an den alpha-Ketten von MHC I oder CD1 Molekülen. Der genetische Mangel
verursacht den Fehler des funktionsfähigen MHC I, was zum Fehlen der CD4-CD8+ zytotoxischen TZellen führt.
227
Die Datenbank für kommerzielle Antikörper kann man in der Praxis sehr gut anwenden: z. B.
http://www.antibodyresource.com/. Wenn man auf den Link klickt, erreicht man nicht nur die Angebote
und die Homepage der Hersteller, die in ihren Katalogen unterschiedliche Antikörper in nichtkonjugierten oder z. B. mit Enzym gekoppelten Formen anbieten, sondern auch solche Hersteller, die
sog. Custom Antibody Serviceleistung zur Verfügung stellen. Diese Firmen stellen solche Antikörper
nach Bedarf der Besteller her, gegen deren spezifischen Zielantigene keine Antikörper auf dem Markt
zur Verfügung stehen. Mit der Benutzung der bioinformatischen Werkzeuge zur Epitop-Prediktion
werden die für gegebenes Protein spezifischen Sequenzen ausgewählt, die voraussichtlich die
stärkste Antigenität zeigen. Aufgrund dieser Informationen wird ein synthetisches Peptidhapten
hergestellt, mit dem Versuchstiere immunisiert werden und mit dessen Hilfe poly- oder monoklonale
Antikörper produziert werden. Es ist auch möglich, das Antigen als rekombinantes Protein zur
Immunisierung zu exprimieren, bzw. DNA-Immunisierung zur Antikörperherstellung durchzuführen.
Fast 200 ähnliche, je nach Bedarf Antikörper herstellende (custom antibody service) Firmen bieten
ihre Serviceleistungen für den Benutzer an. Wenn man nicht aus dem Anwendungsbereich von
„Custom antibody suppliers” wählt, sondern man auf „Catalog antibody suppliers” klickt, wirdwieder ein
umfangreiches Angebot zur Verfügung stehen. Unter diesen bietet z. B. die Firma Abcam mehr als
40.000 Artikeln an, die nach Themen auf der Homepage der Firma gruppiert werden. Nicht nur
einzelne primäre und sekundäre Antikörper und entsprechende Isotypekontrollen, sondern auch z. B.
custom antibody arrays stehen hier zur Verfügung. Im Fall von dieser letzten Möglichkeit wird eine
Matrix von gewählten Antikörpern gegen unterschiedliche Antigene hergestellt. Es ist aber auch
möglich, Probematerial einzuschicken (z.B.: aus >1x10 Zellen, die >100 g Proteinextrakt bedeutet,
6
oder >10 mg Gewebsprobenmaterial, oder >20 l Serum oder >100 g extrahierte Proteinlösung)
mittels dem die Firma ein Antikörperarray erstellt. In so einem Fall, wirkt die Firma als reinen
Dienstleister mit.
Die IMGT (THE INTERNATIONAL IMMUNOGENETICS INFORMATION SYSTEM®) wurde von
Marie-Paule Lefranc in 1989 vorgeführt, um die Immunglobuline, T-Zelle Rezeptoren, MHC-Molekülen
228
in ein informatisches System zu integrierten. Die Datenbanken, Webquellen und online-Dienste
können einen vielfältigen Bedarf decken.
In der Datenbank für Immunglobulin-Strukturen kann man die variablen Regionen (CDR-Regionen)
von leichten Ketten bestimmter monoklonaler Antikörper untersuchen, wie z.B. bei den 17B, 3D6 oder
9E genannten Antikörpern können die Aminosäuresequenzen von CDR1, CDR2 und CDR3 Regionen
mit bunten Buchstaben gezeichnet werden. Die in Klammern stehenden Nummern, z.B. (27-38)
zeigen die Ausdehnung bestimmter CDR-Regionen. Diese CDR1-Region enthält maximal 11
Aminosäuren, die zwischen den 27. und 38. Positionen liegen. Die Sequenz kann z.B. ESVSSD sein
und besteht so aus 6 Aminosäuren. Auf dieser Seite kann man unten sehen, dass dieser Bereich auch
länger sein kann.
Auf einer anderen Seite werden die Antikörper-Moleküle als perlenschnurförmiges (Collier-de-Perles)
2D-Modell dargestellt, in dem die Aminosäuren, die zu den CDR-Regionen gehören, als bunte Perlen
markiert werden. Wird die Länge der Aminosäure-Kette von z.B. CDR3-Regionen verändert, kann das
Modell durch das Klicken auf den Button DRAW wiedergezeichnet werden.
Die Datenbank Immunepitope (IEDB) enthält experimentell verifizierte und charakterisierte Epitope
der B- und T-Zellen und die Ergebnisse der Bindungs- und Ligand Elution-Experimente mit MHC. Hier
werden nicht nur die molekularen Strukturen von den Zellen der adaptiven Immunantwort
zusammengefasst, sondern auch die experimentellen Umstände, unter denen die Daten gewonnen
wurden. In dieser Datenbank finden sich die Epitope des Immunsystems des Menschen, nichtmenschlichen Primaten, Nagetieren, Schweinen, Katzen und noch anderen. Während der letzten vier
229
Jahre wurden 180.978 Experimente nach der publizierten Literatur grundlegend analysiert, die ~ 99 %
von öffentlichen Daten bedeutet. Daneben wurden 129.186 experimentale Daten, die direkt von den
Forschern eingeschickt wurden, auch verarbeitet.
Etliche Anwendungen zu Prädiktion von T-und B-Zelle Epitopen und für die Analyse von Epitopen sind
von der IEBD zur Verfügung gestellt. Im Fall von den letzten ist es möglich, die Populationshäufigkeit
zu extrahieren, eine Analyse von Sequenzkonservation oder Clusteranalyse von denEpitopen
durchzuführen.
Auf der Seite von MBIM (Microbiology and Immunology resources) können unter anderen die
Informationen über CD-Antigene (cluster of differentiation) von CD1 bis CD247 finden. Über die MetaDatenbank von University of Pittsburgh und UPMC können auch viele andere immunologische
Datenbanken und Prädiktions-Servern, wie z.B. EVALLER, die die potenziellen AllergenEigenschaften eines Proteinantigens vorhersagen können, oder IIDB (The Innate Immune Database)
erreicht werden.
In den folgenden konkreten Beispielen wird die Untersuchung einer potentiellen Antigenität illustriert.
Wenn wir uns dafür interessieren, welche Antigene als potenzielle Autoantigene bei Rheumatoider
Arthritis in Frage kommen können, können die publizierte Daten auf der PubMed Webseite
durchsucht werden. Wenn Sie im Suchfenster „candidate autoantigens early rheumatoid arthritis”
eingeben, steht der folgende gefundene Artikel frei zur Verfügung.
Candidate autoantigens identified by mass spectrometry in early rheumatoid arthritis are chaperones
and citrullinated glycolytic enzymes.Goëb V, Thomas-L'Otellier M, Daveau R, Charlionet R, Fardellone
P, Le Loët X, Tron F, Gilbert D, Vittecoq O. Arthritis Res Ther. 2009;11(2):R38. Epub 2009 Mar 10.
(link)
Klicken wir auf den Titel, erreichen wir den Abstrakt des Artikels, in dem die in der frühen Rheumatoid
Arthritis durch Massenspektroskopie identifizierte Autoantigene zusammengefasst werden, unter den
das alpha-Enolase Enzym inbegriffen ist. Brauchen wir mehrere Informationen darüber, wählen wir
den durch die NCBI-Seite erreichbaren Link der Protein Datenbank neben dem Suchfenster. Wenn wir
„alpha-Enolase“ eintragen, werden wireine ziemlich grosse Menge an Treffernbekommen. Unter
diesen soll man die menschliche alpha-Enolase (species: Homo sapiens) auswählen. Auf der
230
geöffneten Seite befindet sich eine standardisierte Bezeichnung vom alpha-Enolase Protein mit der
Anzahl der beteiligten Aminosäure (366), und grundlegenden Publikationen über das Molekül (Titel,
Autor, Zeitschrift, Jahr, Band, Seite und Link). Außerdem kann man auch die verfügbaren
Informationen über die Domän-Struktur des Proteins (wie die Lokalisation von z.B.) und schließlich die
Reinfolge der Aminosäuren finden.
Wenn wir wissen möchten, wie das Protein konserviert ist, um ähnliche mikrobielle Sequenzen zu
finden, die ebenfalls eine Autoimmunreaktion mit alpha-Enolase, auf Grund molekularen Mimikris
auslösen, können wir sie dort finden. Um die Frage zu testen, bleiben wir noch auf der Startseite von
NCBI, und wählen wir unter Säule „Popular resources” rechts denLink von BLAST. BLAST ist ein
Acronym aus den ersten Buchstaben von „Basic Local Alignment Search Tool”, und ermöglicht die
Suche und die Ausrichtung der Sequenzen von Nukleotiden oder Aminosäuren.
Auf der Seite BLAST soll man „Protein blast“ unter der „Basic Blast“ Option heraussuchen, dann soll
man in das geöffnete Fenster „Enter query sequence” unsere Aminosäuresequenz aus der früheren
Seite kopieren. Die Sequenz wird 60 Aminosäuren pro Zeile dargestellt, die am Anfang der Zeile
liegende Nummern stört nicht, also kann man die Sequenz mit ihnen zusammen übernehmen. Klicken
wir auf den Button Blast, wird die Analyse gestartet. Nach kurzer Zeit erscheinen die Suchergebnissen
in der Mitte des Bildschirmes, in einem Rahmen befindet sich die graphische Darstellung. Die große
Anzahl der untereinander liegenden roten durchgezogenen Linien weisen darauf hin, dass sehr viele
komplette Übereinstimmungen vorliegen, also die Aminosäuresequenz von alpha-Enolase während
der Evolution stark konserviert geblieben ist.
Man kann nach ähnlichen Sequenzen in der Hoffnung darauf suchen, dass eine ähnliche
Aminosäureabfolge in den Infektionserregern vorkommen kann, die eine potentielle Rolle mittels eines
molekularen Mimikris in der Entstehung der Autoimmunprozesse spielen können. Da wir mit der
Sequenz von alpha-Enolase eine Blast-Suche gestartet haben, können wir es unter die ähnlichen
Sequenzen überprüfen. In diesem Fall haben wir eine grosse Anzahl von 100% Übereinstimmungen
gefunden, unter denen es aber gar keine prokaryotischen Sequenzen gibt. Wenn man die
Immunantwort gegen alpha-Enolase untersuchen möchte, und es steht kein gereinigtes oder
rekombinantes Protein zur Verfügung, kann die T-Zelle-Antwort auch mit synthetischen Peptiden
231
untersucht werden. Welche Peptidsequenzen muss untersucht werden? Dies kann beantwortet
werden, indem wir auf die Seite CBS (Center of Biological Sequence Analysis, Denmark) gehen.
Wählen wir die Prediction Server Funktion aus, und führen wir eine Epitop-Vorhersage z.B. mit
NetMHCII durch. Hier kann die Sequenz ins Fenster eingeschrieben werden, bestimmte HLA-Allele
ausgewählt werden und die Länge von dem Peptid-Epitop eingestellt werden. Der Algorithmus
betrachtet die möglichen Peptide nacheinander, und sagt die Affinität der Bindung zur HLA voraus
(strong binder, weakbinder). Der NetMHCII 2.2 Server prädiktiert die Bindung des Peptids zu den
HLA-DR, HLA-DQ, HLA-DP Molekülen, durch eine Methode, dieauf dem Prinzip der künstlichen
neuronalen Netzwerke beruht. Die Peptidbindung kann für 14 HLA-DR Allele (damit werden die 9
bekannten sog. HLA-DR Supertypen abgedeckt), und für 6 HLA-DQ und 6 HLA-DP Allele modellieren
werden. Die Prediktionswerte werden in nM IC50 (bei mittlere inhibitorischer Konzentration wird eine
halbmaximale Inhibition beobachtet) angegeben, und Peptide werden neben einer hierarchischen
Zuordnung mit starker oder schwacher Bindung (strong binder, SB vagyweakbinder, WB)
gekennzeichnet.
Kopieren/Einfügen wir die ganze Aminosäuresequenz von alpha-Enolase aus der NCBI-Seite ins
Fenster von NetMHCII 2.2, dann wählen wir das HLA-DRB1*0404 Allel unter den möglichen aus, das
mit der Rheumatoiden Arthritis stark assoziert ist. Klicken wir auf die kleine Box neben dem „sort by
affinity” Befehl, und schicken wir die Aufgabe zu dem CBS Server mit dem Button „submit“. Die
Ergebnisse der Vorhersage werden in Form einer Liste angezeigt, in der die aus 15 Aminosäuren
bestehenden, also zum MHCII-Molekül bindenden Peptide je nach ihrer Affinität geordnet sind. Es ist
zu betonen, dass der Algorithmus insgesamt 5 stark bindende (SB) Peptide inmitten des alphaEnolase Enzyms identifiziert. Unter diesen steht auf dem ersten Platz das an der 43. Position mit
EVILPVPAFNVINGG anfangendePeptid, das am stärksten zu dem bestimmten HLA vorraussichtlich
binden kann. Das Detail „core epitope” von diesem ist VPAFNVING, das für die Erkennung
unerlässlich ist. Die Aminosäuren, die anden N oder C terminalen Bereichen neben dem „core
epitope” liegen, die sog. flanking regions, sind nicht essentiell für die Erkennung einer Peptidsequenz.
232
Also wir haben das EVILPVPAFNVINGG Peptid gewählt. Auf Ähnliche Art und Weise kann eine
Vorhersage von der MHC-Bindung im Fall von anderen Allelen, wie z.B. HLA-DRB1*0101,
durchgeführt werden, und der gleiche Peptid-Treffer, als der am stärksten bindende Abschnitt des
alpha-Enolase Enzyms wird auch enthalten sein.
Die nächste Frage ist, was man im Besitz dieser Information noch weiteres machen kann? Man kann
z. B. die Seite einer Ansammlung besuchen, auf dem die Firmen, die synthetische Peptide auf
Anfrage herstellen, erhältlich sind. Neben dem synthetischen Peptid aus Alpha-Enolase kann man
auch
Kontroll-Peptide
bestellen,
die
z.B.
die
gleiche
Länge,
die
gleiche
Aminosäure-
Zusammensetzung besitzen, aber zufällige Sequenzen von Aminosäuren enthalten oder Peptide, die
von anderen irrelevanten Proteinen stammen. Die hergestellten Proteine können in vitro getestet
werden: wenn die Leukozyten, die aus dem Blut von Kranken oder Kontroll-Individuen isoliert wurden,
mit dem Peptid behandelt werden, ist die Frage, ob es in den Kranken spezifische T-ZellenAktivierung bzw. die Sekretion spezifischer Zytokine induziert. In diesem Fall wird das Antigen von
den Blutzellen der Kranken (z.B. von den Monozyten, von dendritischen Zellen) präsentiert.
Eine Alternative ist, wenn man ein MHC-Tetramer (ein Komplex aus vier MHC-Molekülen, z.B. HLA
DRB1*0101) von einem Hersteller bestellt, der eine solche Konstruktion erzeugt, in dem ein
gegebenes Peptid in den peptidbindenden Teil des MHC-Moleküls enthalten ist, und es auch mit
einem Fluoreszenzfarbstoff markiert. Die T-Zellen, die zum Tetramer binden, können einfach in dem
peripheren Blut identifiziert werden, wenn z.B. das Tetramer mit einem roten, der für die T-Zellen
spezifischen Antikörper (z.B. anti-CD3ε) mit einem grünen Farbstoff
markiert ist.
Wenn wir uns nicht für von der T-Zelle sondern von der B-Zelle
vermittelten Antwort interessieren, dann können wir eine Vorhersage
eines B-Zell Epitopes (Link) durchführen. Diese Prädiktion beruht
auf einem Konsensus zahlreicher Sequenzanalysen, in denen die
Antigenität, die hydrophoben und hydrophilen Eigenschaften, die
Flexibilität bestimmter molekularer Regionen, die sekundäre Struktur
wie β-Faltblatt-Struktur und die physiko-chemischen Parametern
MHC-Tetramer
ebenso in Betracht gezogen werden. Man kennt zwei Typen von B-
(invitrogen.com)
Zelle Epitopen: lineare und Konformationsepitope. Wenn die 3DStruktur des Proteins bekannt ist, ist es auch möglich, das Epitop
durch z.B. Oberfläche-Exposition zu identifizieren. In diesem Fall kann die 3D-Struktur des möglichen
Epitops dargestellt werden. Die Fertigstellung der Vorhersage von linearen Epitopen wird als Service
für den Kunden von der oben genannten Firma angeboten.
Die den prädiktierten Epitopen entsprechenden synthetischen Peptide bzw. ihre konjugierten Formen
mit einem indifferenten Protein (wie KLH=keyhole limpet hemocyanin; aus der Hämolymphe der
Großen
Kalifornischen
Schlüssellochnapfschnecke
gewonnen)
oder
mit
Biotin
werden
für
Immunisierung benutzt, die die Untersuchung der B-Zellen Reaktivität mit einem einfachen ELISA
System ermöglicht.
233
Zur weiteren ist es auch möglich, die Funktionen des Immunsystems (z.B. Virusinfektion oder AIDS)
mit einem Bioinformatik-Werkzeug zu simulieren. Auf der von Immunogrid kann man unter
Simulationen wählen, die verschiedene Vorgänge (z.B. Virus, Tumor, Atherosclerose) beschreiben
und modellieren.
Unter den Virusinfektionen kann die HIV und die EBV Infektionen simuliert werden. Das Tumor
Simulation Modell enthält die Beschreibung des Wachstums und des Brustkrebses. Wenn wir z.B. ein
deskriptives Modell wählen, und wir klicken auf die „lymph node WITHOUT infection” Option, dann auf
„view results”, können wir die Veränderungen der Lymphknoten verfolgen.
Die unterschiedlichen Panele zeigen, wie sich die Anzahlen von dendritischen Zellen, B-Zellen und THelfer-Zellen während des Ablaufs ändern. Das AG stellt die erforderliche Zeit für die Zuführung eines
löslichen Antigens bzw. für die Aufladung von dendritischen Zellen mit einem Antigen dar. Wenn das
Antigen die Lymphknoten erreicht, erhöht sich die Dichte von Lymphozyten wegen der Einströmung
von B- und T-Zellen. Die Mehrheit der Antigene wird von dendritischen Zellen und B-Zellen
aufgenommen, das aus dem plötzlichen Anstieg der Anzahl von antigenpräsentierenden Zellen auch
sichtbar ist. Die dendritischen Zellen induzieren die rasche Proliferation der T-Helfer-Zellen
(gestrichelte Linie auf der Abbildung TH), inzwischen tritt der Anstieg der B-Zellen verzögert auf
(gestrichelte Linie auf der Abbildung B), weil sie von der Kostimulation abhängig sind. Solange das
Immunsystem neue Antigene detektiert, bleibt es aktiv: die gesamte Anzahl von Lymphozyten wächst
monoton fünffach und die Zelle teilen sich, um den verfügbaren Pool aus antigenspezifischen T-Zellen
zu verstärken (lange gestrichelte Linie auf der Abbildungen B und TH).
Im Rahmen des Immunologie-Seminars und –Vorlesungen wurden zahlreiche Krankheiten erwähnt
(wie z.B. CGD: chronic granulomatous disease, asthma bronchiale, APECED-Syndrom: Autoimmune
Polyendocrinopathy-Candidiasis-Ectodermal Dystrophy), deren Beschreibung und Zusammenfassung
von ihren genetischen Hintergründen sich in der OMIM Datenbank (OMIM: Online Mendelian
234
Inheritance in Man) befindet. Es leitet auf die in dem zweiten Semester gelehrter Genetik und
Genomik weiter. Wählen wir auf der NCBI Seite rechts das „popular resources” Link. Hier kann man
nicht nur nach Krankheiten suchen, sondern man kann darüber auch Information erhalten, mit
welchen menschlichen Krankheiten ein gegebenes Protein bzw. sein kodierendes Gen assoziiert ist.
Wenn wir bei unserem Bespiel bleiben, schreiben wir ins Suchfenster alpha-Enolase. Unter vielen
anderen Informationen können wir hier lesen, dass alpha-Enolase als ein mögliches Autoantigen von
Hashimoto-Thyreoiditis sein kann, aber man hat noch keine Assoziation von Polymorphismen mit den
Autoimmunkrankheiten erforscht.
Übersetzt von Viktor Molnár
235
ABKÜRZUNGEN
7TM:
Rezeptoren – Membranrezeptorfamilie aus Sebenpfad
Transmembrandomainen
AChR:
Acetylcholin-Rezeptor
ACT:
Adoptiver Zell-Transfer (adoptive cell transfer)
ADCC:
Antikörperabhängige zellvermittelte Zytotoxizität
AID:
Aktivierungsinduzierte Cytidin-Deaminase
AIRE:
Autoimmune Regulator
ANA:
Antinukleärer Antikörper
APC:
Antigenpräsentierende Zelle (antigen presenting cell)
APECED:
Autoimmune Polyendocrinopathy-Candidiasis-Ectodermal Dystrophy
BALT:
Bronchienassozierte lymphatische Gewebe (bronchus-associated
lymphoid tissue)
BRM:
Modifizierfaktoren von biologischen Antworten (biological response
modifiers)
BZR:
B –Zell-Rezeptor
CCL19:
Makrophag-inflammatorisches Protein -3-beta (MIP-3-beta)
CCL2:
Monozyt-chemotaktisches Protein -1 (MCP-1)
CCL20:
Makrophag-inflammatorisches Protein -3 (MIP-3-alpha)
CCL21:
Sekundäres lymphatisches Gewebe Chemokin (SLC)
CCP:
Zyklisches Citrulliniertes Peptid
CD:
Cluster of Differentiation
CD:
Cluster of differentiation
CD:
Cluster of Differentiation
CD62:
Selektin
CPPs:
Zell-penetrierende Peptide (cell penetrating peptides)
CTLA-4:
Cytotoxic T-lymphocyte antigen 4
CXCL12:
Stromal cell-derived factor-1 (SDF)
CXCL13:
B Lymphozyte chemoattractant (BLC)
DAMP:
Danger associated molecular pattern -
DC:
Dendritische Zelle (dendritic cell)
EALT:
Augenassozierte lymphatische Gewebe (eye-associated lymphoid
tissues): Conjunctiva [CALT], Lacrimal Duct [LDALT] associated
lymphoid tissues)
ELISA:
Enzyme Linked Immunosorbent Assay
ER:
Endoplasmatisches Retikulum
ERK:
Extrazelluläre-signalregulierte Kinase
236
fMLF/fMLP:
Formil Met-Leu-Phe
GAG:
Glucose amino glycane
GALT:
Darmassozierte lymphatische Gewebe (gut-associated lymphoid
tissue )
HAMA:
menschliche anti-Maus Antikörper(human anti-mouse antibodies)
HLA:
Humanes Leukozytenantigen
ICAM:
Interzelluläres Adhäsionsmolekül (CD54)
Ig:
Immunoglobulin
IL:
Interleukin
IL-1b:
Interleukin 1 beta
iNOS:
induzierbare Stickstoffmonoxid-Synthase (inducible nitric oxide
synthase)
IP3:
Inozitol tri-phosphate
IPEX:
Immune dysfunction, Polyendocrinopathy, and Enteropathy, X-linked
JAM:
Junctionales Adhäsionsmolekül
LALT:
Larynx-associated lymphoid tissue
LFA-1:
Lymphozyt-funktionsassoziertes Antigen (CD11a/CD18)
MAC:
Membrane attack complex
MALT:
Darmassozierte lymphatische Gewebe (mucosa-associated lymphoid
tissue )
MAPK:
Mitogen-aktivierte Protein-Kinase
MEK:
MAP Kinase Kinase
MEK3:
MAP Kinase Kinase3
MEKK:
MAP Kinase Kinase Kinase
MG:
Myasthenia gravis
MTT:
3-(4,5-Dimethylthiazol-2-yl)-2,5-diphenyltetrazolium bromide
MuSK:
Muskelspezifische Rezeptor-Tyrosinkinase
MV:
Mikrovezikel
NALT:
Nose-associated lymphoid tissue
NO:
Stickstoffmonoxid (nitric oxide)
PAMP:
Pathogen-associated molecular patterns
PAMP:
Pathogen-assoziertes molekuläres Muster
PD-L1:
Programmed death ligand 1
PECAM-1:
Platelet endothelial cell adhesion molecule (CD31)
PEG:
Polyethylenglykol
PIP2:
Phosphatidylinositol 4,5-bisphosphate
PLC:
Phospholipase C
PRR:
Pattern recognition receptors - Mustererkennungsrezeptoren
PSLG-1:
P-Selektin Glycoprotein Ligand-1 (CD162)
RA:
Rheumatoide Arthritis
237
RA:
Rheumatoide Arthritis
RF:
Rheumafaktor
RFLP:
Restriktionsfragmentlängenpolymorphismus
ROI:
Reaktiver Sauerstoffsintermediär
SALT:
Skin-associated lymphoid tissue
SLE:
(Systemischer) Lupus erythematodes
SPA:
Spondylitis ankylosans, Morbus Bechterew
SPA:
Spondylitis ankylosans (Morbus Bechterew)
SSOP:
sequenzspezifische Oligonukleotid-Probe
SSP:
Sequenzspezifische Primer
TAA:
Tumorassoziierte Antigene
TCR:
T-Zell-Rezeptor
TIL:
Tumor-infiltrierende T Zelle
TLR:
Toll-like Rezeptor
TMT:
Gezielte molekulare Therapie (targeted molecular therapy)
TNF:
Tumornekrosefaktor
TNFa:
Tumor necrosis factor 
TSH:
Thyreoidea-stimulierendes Hormon
VALT:
Vascular-associated lymphoid tissue
VCAM:
Vascular cell adhesion molecule (CD106)
VLA4:
Very late antigen-4 = integrin alpha4beta1 (CD49d/CD29)
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