Vorlesung Immunologie – 7. Teil - Ruhr

Vorlesung Immunologie – 7. Teil
Immunologische Methoden
25. Mai 2011, Ruhr-Universität Bochum
Marcus Peters, [email protected]
In vitro - Nachweis einer Immunreaktion
Humorale Immunität:
Analyse des Antiserums = serologische Tests:
Nachweis von Antikörper, deren Charakterisierung und Menge (Titer)
im flüssigen Überstand geronnenen Blutes eines durch Impfung
immunisierten Individuums
Y
Grundlage der Nachweissysteme:
Ag-Ak-Reaktion
Zellvermittelte Immunität:
Analyse der T-Zellspezifität, Menge und Funktion:
Im Blut oder lymphatischen Organen im Tierexperiment
oder humanen in vitro Zellkulturen
Antikörper
Spezifität: Eigenschaft von Antikörpern mit ihrem Paratop
nur ein bestimmtes Epitop zu erkennen
Affinität:
Bindungsstärke zwischen Antikörper und Antigen
in Bezug auf eine Bindungsstelle
(hoch = wenig Antikörper für Antigenbeseitigung
nötig)
Avidität:
Gesamte Bindungsstärke zwischen Antikörper
und Antigenmolekül
Isotyp:
IgG, IgM, IgE, IgA wichtig für die Wahl des
Detektionsantikörpers
Idiotyp:
Antikörper einer bestimmten Spezifität
Herstellung von Antikörper I: Adjuvantien
Herstellung von Antikörper II: Hybridome
•
Nachweis von Antikörpern mittels Agglutination
•
Antikörper-Messung an Festphasen (ELISA, Blot) und
Fluoreszenzmikroskopie
•
Fluoreszenz-vermittelte Zellanalyse und Zellsortierung
•
Zelluläre Immunität, in-vivo Tests
•
Nachweis von Antikörpern mittels Agglutination
•
Antikörper-Messung an Festphasen (ELISA, Blot) und
Fluoreszenzmikroskopie
•
Fluoreszenz-vermittelte Zellanalyse und Zellsortierung
•
Zelluläre Immunität, in-vivo Tests
Immunpräzipitation
Medizinische Bedeutung:
Ag:Ak-Komplexe = Immunkomplexe (IK)
Lösliche IK können sich an der Basalmembran von kleinen
Blutgefäßen oder an Nierenpodozyten unterhalb der
Membran anlagern und dort zu Schädigungen der
Glomeruli (z.B. bei Lupus erythematodes) oder
Entzündung kleiner Gefäße führen.
Niere: Ausschnitt aus
einem Glomerulus mit
normaler (blauer Pfeil)
und stark verdickter
Basalmembran (roter
Pfeil). Dunkle Komplexe
werden von der Blutseite
her (rechts) abgelagert.
Heidelberger`sche Präzipitationsreaktion
Prinzip:
Verschiedene Mengen an Antigen werden mit
konstanten Ak-Mengen inkubiert.
Die Menge der
präzipitierten Ag-AkKomplexe wird über
Trübung (Turbidimeter),
oder nach
Abzentrifugieren ihr
Gewicht oder der
Proteingehalt bestimmt
Hämagglutination
Prinzip:
Bildung von unlöslichen Antigen-AntikörperKomplexen
Anwendung:
AB0-Blutgruppenbestimmung und
geeignete Spender-Empfänger Zuordnung
bei Bluttransfusionen (Kreuzprobe)
Agglutinationsreaktion durch Quervernetzung mit Antikörpern gegen Blutgruppenantigene auf der Oberfläche von roten
Blutkörperchen
Hämagglutination
Welche der folgenden Spender-EmpfängerKombinationen bei der Transfusion eines gewaschenen
Erythrozyten-Konzentrats führt mit großer
Wahrscheinlichkeit zu einem Transfusionszwischenfall ?
Spender
1)
2)
3)
4)
5)
0
0
AB
A
A
Empfänger
A
AB
AB
AB
0
Welche der folgenden Spender-EmpfängerKombinationen bei der Transfusion eines gewaschenen
Erythrozyten-Konzentrats führt mit größer
Wahrscheinlichkeit zu einem Transfusionszwischenfall ?
Spender
1)
2)
3)
4)
5)
0
0
AB
A
A
Empfänger
A
AB
AB
AB
0
•
Nachweis von Antikörpern mittels Agglutination
•
Antikörper-Messung an Festphasen: ELISA,
Western Blot und Fluoreszenzmikroskopie
•
Fluoreszenz-vermittelte Zellanalyse und Zellsortierung
•
Zelluläre Immunität, in-vivo Tests
ELISA: Prinzip und Durchführung
ELISA = Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay
Indirekter ELISA
1) Beschichtung
mit Probe
Substrat
4) Enzymreaktion
2) Zugabe des
Erstantikörpers
3) Zugabe des Enzym
markierten
Zweitantikörpers
Farbiges
Endprodukt
5) Absorptionsmessung
Zum Beispiel: Nachweis von Allergen-spezifischem IgE
Substrat:
BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat)
+
NBT (Nitroblau-Tetrazoliumchlorid)
Alkalische
Phosphatase
Antigen
(spezifisches Allergen)
+ Serum-IgE
+ Nachweis-AK
(IgG-Anti-IgE)
+ Substrat
Sandwich ELISA zum Nachweis der IgE-Konzentration
Substrat:
BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat)
+
NBT (Nitroblau-Tetrazoliumchlorid)
Alkalische
Phosphatase
Capture-AK
(IgG-Anti-IgE)
+ Serum-IgE
+ Nachweis-AK
(IgG-Anti-IgE)
+ Substrat
Immunoassay Sonderformen
RIA:
Radioimmunassay (radioaktive Markierung der
Nachweissysteme). Sehr sensitiv, z.B. zur
Bestimmung von Hormonspiegeln im Blut
Inhibition: Indirekter ELISA um Aussagen über die
im ELISA Affinität der Antigen-Antikörper-Reaktion
zu treffen
Western Blot (Immunblot)
Zweck: Auftrennung von Proteinen z.B. aus
einem Zelllysat, Untersuchung von Bindungsmustern
Prinzip am Beispiel:
Nachweis von Ak
gegen verschiedene
Bestandteile von HIV
im humanen Serum
Nachweis einer Infektion mit HIV im Western Blot
H.R. Gelderblom
Robert-Koch-Institut, Berlin
Detektion von Antikörperreaktion mittels Lumineszenz
Zytokin-Array
Western-Blot
Was ist Fluoreszenz ?
l=488 nm
Fluorochrom
l=530 nm
Antikörper
Laser (Anregung)
Emission
Häufig verwendete
Fluorochrome
Anregung
(nm)
Photodetektor +
angeschlossenes
Analysesystem (PC)
Abstrahlung
(nm)
Detektion und Analyse der Fluoreszenz
Fluoreszenzmikroskopische Analyse
Lichtquelle: Laser, Quecksilberdampflampe
Immunfluoreszenz I
Prinzip:
Direkte Darstellung von Antigenen in Zellen und Geweben
mittels spezifischer Antikörper, an die Fluoreszenzfarbstoffe
(Fluorochrome) gekoppelt sind.
Makrophagen (grün)
in der Roten Pulpa
der Milz
Immunfluoreszenz II
Nachweis von:
• Aktivierungs-assoziierten Ag (HLA-DR, CD80, CD86)
• Differenzierungs-assoziierten Ag (CD45RA, CD45RO)
• Lymphozyten-Typisierung (CD4/CD8 Verhältnis bei HIVDiagnostik)
• Intrazelluläre Parasiten, Viren und Bakterien
• Krankheits-assoziierten Antigenen (z.B. Tumormarker)
• Intrazellulärer Nachweis von Zytokinen, Enzymen
Klinische Anwendung der Fluoreszenzmikroskopie
Borrelia sp.
•
Nachweis von Antikörpern mittels Agglutination
•
Antikörper-Messung an Festphasen (ELISA, Blot) und
Fluoreszenzmikroskopie
•
Fluoreszenz-vermittelte Zellanalyse und
Zellsortierung
•
Zelluläre Immunität, in-vivo Tests
Isolierung von mononukleären Zellen
(Ficoll-Hypaque-Gradientenzentrifugation)
Thrombozyten
verdünntes
Blut
Ficoll
(Dichte = 1,078)
Zellkultur
in vitro
Mononukleäre Zellen
des peripheren Blutes
(PBMC)
Zentrifugation
Erythrozyten
Granulozyten
Zellanalysen: Durchflußzytometrie
Zellgemisch mit fluoreszierenden Ak
Photodetektoren
Flüssigkeitsstrom mit
Ak-markierten Zellen
grün
1)
Probe wird mit
Überdruck in die
Messküvette
eingeführt
2) Beim Eintreten in
die Messkammer
werden die Zellen
stark beschleunigt
 Aggregate lösen
sich auf 
„Perlenkette“
durch
hydrodynamische
Fokussierung
rot
FSC
Laser
SSC
3) Am Analysepunkt
findet Anregung
mit Laserstrahl
statt  Messung
von Streulicht und
Fluoreszenz
Zellanalysen: Durchflußzytometrie [Prinzip]
Laser
(488 nm)
Vorwärtsstreuung
(FSC)
Zellgröße
Seitwärtsstreuung
(SSC)
Granularität
Detektion des Streulichtes
Erkenntnisse über:
1) Größe (kleine Zellen erzeugen ein
kleines Vorwärtsstreulicht-Signal
(FSC)
2) Granularität (intrazelluläre
Bestandteile), Zellen ohne
Granula erzeugen ein kleines
Seitwärtsstreulicht-Signal (SSC)
Auswertung des Streulichtes
Vorwärts- und Seitwärtstreulicht
werden für jede Zelle gegeneinander
aufgetragen (Dot-Plot)
1) Granulozyten
2) Monozyten
3) Lymphozyten
2-Parameter-Darstellung ( Dot Plot)
Je nach Gerät können neben FSC und SSC noch zahlreiche
Fluoreszenzen gemessen werden.
Detektion der Fluoreszenz
Beispiel:
Analyse von LymphozytenPopulationen
Problem:
Im Streulicht unterscheiden sich
B-Zellen und T-Zellen nicht
Lösung:
Ausnutzung der Fluoreszenz-Detektion.
T-Zellen werden mit einem grün-fluoreszierenden Antikörper markiert
(z.B. FITC anti-CD3; assoziiert mit TCR).
B-Zellen werden mit einem rot-fluoreszierenden Antikörper markiert
(z.B. PE-anti-CD19, Corezeptor, spezifisch für B-Zellen)
Auswertung der Fluoreszenz
Für jede einzelne Zelle wird jeder Parameter
• FSC
• SSC
• 1. Fluoreszenz (grün = T-Zellen)
• 2. Fluoreszenz (rot = B-Zellen)
• ...
B-Lymphozyten
gemessen und gespeichert
T-Lymphozyten
Auswahl bestimmter FSC und
SSC Werte  Selektion von
Lymphozyten = „gaten“
Beispiel 1: Leukämie
Fluoreszenz-Parameter
CD19 = spezifisch für B-Lymphozyten
CD3 = spezifisch für T-Zellen
Erhöhter Anteil B-Lymphozyten, nur sehr wenige T-Lymphozyten
 Wahrscheinlich eine Form der Leukämie
Beispiel 2: HIV-Infektion
CD4 = Co-Rezeptor für MHC II, auf T-Helfer-Zellen, Monozyten und
Makrophagen
CD8 = Co-Rezeptor für MHC I, spezifisch für zytotoxische T-Zellen
Patient hat im Vergleich zur Kontrolle zu wenig CD4+ Th-Zellen
Beispiel 3: Intrazelluläre Zytokin-Färbung
T-Helfer-Zellen wurden in IL-12 und anti-IL-4 kultiviert (oben)
T-Helfer-Zellen wurden in IL-4 und anti-IFN-g kultiviert (unten)
→ hinzufügen von Brefeldin A
→ fixieren in Formaldehyd
→ permeabilisieren in Saponin
→ hinzufügen von anti-IFNg-Fluorescein und anti-IL-4-Phycoerythrin
Präparative Anwendung
Die Durchflußzytometrie wird nicht nur für analytische Zwecke genutzt,
sondern auch zum Sortieren von Zellen
Zellsortierung (FACS =
Fluorescence Assisted Cell
Sorting)
Die Zellen werden unterschiedlich
ionisiert und durch die Ablenkung
zwischen 2 Kondensatorplatten
sortiert
Ablenkplatten
Sortierte
Zellen
Matthias Stiehm, 3.2.2006
Bis zu 10.000 Zellen/s können
isoliert/sortiert werden
Magnetische Zellsortierung (MACS)
Zweck:
Isolierung magnetisch markierter Zellpopulationen aus
einem Zellgemisch zur funktionellen oder phänotypischen Analyse
Prinzip:
Anlegen eines Magnetfeldes
Zellgemisch mit Ak, an die
paramagnetische Partikel
gekoppelt sind
Magnetisch markierte Zellen
werden zurückgehalten
Entfernen des Magneten
gebundene Zellen
werden freigesetzt
•
Nachweis von Antikörpern mittels Agglutination
•
Antikörper-Messung an Festphasen (ELISA, Blot) und
Fluoreszenzmikroskopie
•
Fluoreszenz-vermittelte Zellanalyse und Zellsortierung
•
Zelluläre Immunität, in vivo und in vitro Tests
Nachweis von Immunreaktionen in vivo
(Tuberkulintests)
Prinzip:
Nachweis der zellvermittelten Immunität auf Tuberkuloseerreger
durch Injektion eines Extrakts aus Mycobacterium tuberculosis
Tine-Test
(Mendel-) Mantoux-Test
Tuberkulin
• Antigengemisch von Tuberkuloproteinen, die aus Überständen von
TB-Kulturen durch fraktionierte
Fällung gewonnen werden.
Typ-IV Hypersensitivität
(Spätreaktion)
IFN-g, Chemokine,
TNF-a
Zytokine
TNF-Rezeptor
CD40
Lokale
Entzündungsreaktion
Antigenspezifische
Th1-Zellen
QuantiFERON-TB Gold In-Tube
• Jeweils 1 ml heparinisiertes Vollblut in ein
Röhrchen mit und eins ohne Tb7.7
(Tuberkulinextrakt)
• 16-25 Std. Inkubation bei 37°C.
• Bestimmung des Interferon-g im
Überstand.
• Erhöhung des IFN-g spricht für Infektion
(Nachweis aktivierbarer T-Zellen)
• Sensitivität des IFN-g Test höher als
TST (tuberculin skin test)
Elispot-Assay zum
Nachweis von Zellen,
die bestimmte
Zytokine herstellen
und freisetzen.
Untersuchung der Interaktion von Lymphozyten
mittels Multiphotonen-Mikroskopie
PNAS 2003;100(5):2604-9
Wanderung der B-Lymphozyten im 3D-Raum des
Lymphknotens (FDCs in rot)
Wanderung von B-Lymphozyten zwischen light/dark zone