Vorlesung Immunologie – 7. Teil - Ruhr
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Vorlesung Immunologie – 7. Teil Immunologische Methoden 25. Mai 2011, Ruhr-Universität Bochum Marcus Peters, [email protected] In vitro - Nachweis einer Immunreaktion Humorale Immunität: Analyse des Antiserums = serologische Tests: Nachweis von Antikörper, deren Charakterisierung und Menge (Titer) im flüssigen Überstand geronnenen Blutes eines durch Impfung immunisierten Individuums Y Grundlage der Nachweissysteme: Ag-Ak-Reaktion Zellvermittelte Immunität: Analyse der T-Zellspezifität, Menge und Funktion: Im Blut oder lymphatischen Organen im Tierexperiment oder humanen in vitro Zellkulturen Antikörper Spezifität: Eigenschaft von Antikörpern mit ihrem Paratop nur ein bestimmtes Epitop zu erkennen Affinität: Bindungsstärke zwischen Antikörper und Antigen in Bezug auf eine Bindungsstelle (hoch = wenig Antikörper für Antigenbeseitigung nötig) Avidität: Gesamte Bindungsstärke zwischen Antikörper und Antigenmolekül Isotyp: IgG, IgM, IgE, IgA wichtig für die Wahl des Detektionsantikörpers Idiotyp: Antikörper einer bestimmten Spezifität Herstellung von Antikörper I: Adjuvantien Herstellung von Antikörper II: Hybridome • Nachweis von Antikörpern mittels Agglutination • Antikörper-Messung an Festphasen (ELISA, Blot) und Fluoreszenzmikroskopie • Fluoreszenz-vermittelte Zellanalyse und Zellsortierung • Zelluläre Immunität, in-vivo Tests • Nachweis von Antikörpern mittels Agglutination • Antikörper-Messung an Festphasen (ELISA, Blot) und Fluoreszenzmikroskopie • Fluoreszenz-vermittelte Zellanalyse und Zellsortierung • Zelluläre Immunität, in-vivo Tests Immunpräzipitation Medizinische Bedeutung: Ag:Ak-Komplexe = Immunkomplexe (IK) Lösliche IK können sich an der Basalmembran von kleinen Blutgefäßen oder an Nierenpodozyten unterhalb der Membran anlagern und dort zu Schädigungen der Glomeruli (z.B. bei Lupus erythematodes) oder Entzündung kleiner Gefäße führen. Niere: Ausschnitt aus einem Glomerulus mit normaler (blauer Pfeil) und stark verdickter Basalmembran (roter Pfeil). Dunkle Komplexe werden von der Blutseite her (rechts) abgelagert. Heidelberger`sche Präzipitationsreaktion Prinzip: Verschiedene Mengen an Antigen werden mit konstanten Ak-Mengen inkubiert. Die Menge der präzipitierten Ag-AkKomplexe wird über Trübung (Turbidimeter), oder nach Abzentrifugieren ihr Gewicht oder der Proteingehalt bestimmt Hämagglutination Prinzip: Bildung von unlöslichen Antigen-AntikörperKomplexen Anwendung: AB0-Blutgruppenbestimmung und geeignete Spender-Empfänger Zuordnung bei Bluttransfusionen (Kreuzprobe) Agglutinationsreaktion durch Quervernetzung mit Antikörpern gegen Blutgruppenantigene auf der Oberfläche von roten Blutkörperchen Hämagglutination Welche der folgenden Spender-EmpfängerKombinationen bei der Transfusion eines gewaschenen Erythrozyten-Konzentrats führt mit großer Wahrscheinlichkeit zu einem Transfusionszwischenfall ? Spender 1) 2) 3) 4) 5) 0 0 AB A A Empfänger A AB AB AB 0 Welche der folgenden Spender-EmpfängerKombinationen bei der Transfusion eines gewaschenen Erythrozyten-Konzentrats führt mit größer Wahrscheinlichkeit zu einem Transfusionszwischenfall ? Spender 1) 2) 3) 4) 5) 0 0 AB A A Empfänger A AB AB AB 0 • Nachweis von Antikörpern mittels Agglutination • Antikörper-Messung an Festphasen: ELISA, Western Blot und Fluoreszenzmikroskopie • Fluoreszenz-vermittelte Zellanalyse und Zellsortierung • Zelluläre Immunität, in-vivo Tests ELISA: Prinzip und Durchführung ELISA = Enzyme Linked Immuno-Sorbent Assay Indirekter ELISA 1) Beschichtung mit Probe Substrat 4) Enzymreaktion 2) Zugabe des Erstantikörpers 3) Zugabe des Enzym markierten Zweitantikörpers Farbiges Endprodukt 5) Absorptionsmessung Zum Beispiel: Nachweis von Allergen-spezifischem IgE Substrat: BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat) + NBT (Nitroblau-Tetrazoliumchlorid) Alkalische Phosphatase Antigen (spezifisches Allergen) + Serum-IgE + Nachweis-AK (IgG-Anti-IgE) + Substrat Sandwich ELISA zum Nachweis der IgE-Konzentration Substrat: BCIP (5-Brom-4-chlor-3-indoxylphosphat) + NBT (Nitroblau-Tetrazoliumchlorid) Alkalische Phosphatase Capture-AK (IgG-Anti-IgE) + Serum-IgE + Nachweis-AK (IgG-Anti-IgE) + Substrat Immunoassay Sonderformen RIA: Radioimmunassay (radioaktive Markierung der Nachweissysteme). Sehr sensitiv, z.B. zur Bestimmung von Hormonspiegeln im Blut Inhibition: Indirekter ELISA um Aussagen über die im ELISA Affinität der Antigen-Antikörper-Reaktion zu treffen Western Blot (Immunblot) Zweck: Auftrennung von Proteinen z.B. aus einem Zelllysat, Untersuchung von Bindungsmustern Prinzip am Beispiel: Nachweis von Ak gegen verschiedene Bestandteile von HIV im humanen Serum Nachweis einer Infektion mit HIV im Western Blot H.R. Gelderblom Robert-Koch-Institut, Berlin Detektion von Antikörperreaktion mittels Lumineszenz Zytokin-Array Western-Blot Was ist Fluoreszenz ? l=488 nm Fluorochrom l=530 nm Antikörper Laser (Anregung) Emission Häufig verwendete Fluorochrome Anregung (nm) Photodetektor + angeschlossenes Analysesystem (PC) Abstrahlung (nm) Detektion und Analyse der Fluoreszenz Fluoreszenzmikroskopische Analyse Lichtquelle: Laser, Quecksilberdampflampe Immunfluoreszenz I Prinzip: Direkte Darstellung von Antigenen in Zellen und Geweben mittels spezifischer Antikörper, an die Fluoreszenzfarbstoffe (Fluorochrome) gekoppelt sind. Makrophagen (grün) in der Roten Pulpa der Milz Immunfluoreszenz II Nachweis von: • Aktivierungs-assoziierten Ag (HLA-DR, CD80, CD86) • Differenzierungs-assoziierten Ag (CD45RA, CD45RO) • Lymphozyten-Typisierung (CD4/CD8 Verhältnis bei HIVDiagnostik) • Intrazelluläre Parasiten, Viren und Bakterien • Krankheits-assoziierten Antigenen (z.B. Tumormarker) • Intrazellulärer Nachweis von Zytokinen, Enzymen Klinische Anwendung der Fluoreszenzmikroskopie Borrelia sp. • Nachweis von Antikörpern mittels Agglutination • Antikörper-Messung an Festphasen (ELISA, Blot) und Fluoreszenzmikroskopie • Fluoreszenz-vermittelte Zellanalyse und Zellsortierung • Zelluläre Immunität, in-vivo Tests Isolierung von mononukleären Zellen (Ficoll-Hypaque-Gradientenzentrifugation) Thrombozyten verdünntes Blut Ficoll (Dichte = 1,078) Zellkultur in vitro Mononukleäre Zellen des peripheren Blutes (PBMC) Zentrifugation Erythrozyten Granulozyten Zellanalysen: Durchflußzytometrie Zellgemisch mit fluoreszierenden Ak Photodetektoren Flüssigkeitsstrom mit Ak-markierten Zellen grün 1) Probe wird mit Überdruck in die Messküvette eingeführt 2) Beim Eintreten in die Messkammer werden die Zellen stark beschleunigt Aggregate lösen sich auf „Perlenkette“ durch hydrodynamische Fokussierung rot FSC Laser SSC 3) Am Analysepunkt findet Anregung mit Laserstrahl statt Messung von Streulicht und Fluoreszenz Zellanalysen: Durchflußzytometrie [Prinzip] Laser (488 nm) Vorwärtsstreuung (FSC) Zellgröße Seitwärtsstreuung (SSC) Granularität Detektion des Streulichtes Erkenntnisse über: 1) Größe (kleine Zellen erzeugen ein kleines Vorwärtsstreulicht-Signal (FSC) 2) Granularität (intrazelluläre Bestandteile), Zellen ohne Granula erzeugen ein kleines Seitwärtsstreulicht-Signal (SSC) Auswertung des Streulichtes Vorwärts- und Seitwärtstreulicht werden für jede Zelle gegeneinander aufgetragen (Dot-Plot) 1) Granulozyten 2) Monozyten 3) Lymphozyten 2-Parameter-Darstellung ( Dot Plot) Je nach Gerät können neben FSC und SSC noch zahlreiche Fluoreszenzen gemessen werden. Detektion der Fluoreszenz Beispiel: Analyse von LymphozytenPopulationen Problem: Im Streulicht unterscheiden sich B-Zellen und T-Zellen nicht Lösung: Ausnutzung der Fluoreszenz-Detektion. T-Zellen werden mit einem grün-fluoreszierenden Antikörper markiert (z.B. FITC anti-CD3; assoziiert mit TCR). B-Zellen werden mit einem rot-fluoreszierenden Antikörper markiert (z.B. PE-anti-CD19, Corezeptor, spezifisch für B-Zellen) Auswertung der Fluoreszenz Für jede einzelne Zelle wird jeder Parameter • FSC • SSC • 1. Fluoreszenz (grün = T-Zellen) • 2. Fluoreszenz (rot = B-Zellen) • ... B-Lymphozyten gemessen und gespeichert T-Lymphozyten Auswahl bestimmter FSC und SSC Werte Selektion von Lymphozyten = „gaten“ Beispiel 1: Leukämie Fluoreszenz-Parameter CD19 = spezifisch für B-Lymphozyten CD3 = spezifisch für T-Zellen Erhöhter Anteil B-Lymphozyten, nur sehr wenige T-Lymphozyten Wahrscheinlich eine Form der Leukämie Beispiel 2: HIV-Infektion CD4 = Co-Rezeptor für MHC II, auf T-Helfer-Zellen, Monozyten und Makrophagen CD8 = Co-Rezeptor für MHC I, spezifisch für zytotoxische T-Zellen Patient hat im Vergleich zur Kontrolle zu wenig CD4+ Th-Zellen Beispiel 3: Intrazelluläre Zytokin-Färbung T-Helfer-Zellen wurden in IL-12 und anti-IL-4 kultiviert (oben) T-Helfer-Zellen wurden in IL-4 und anti-IFN-g kultiviert (unten) → hinzufügen von Brefeldin A → fixieren in Formaldehyd → permeabilisieren in Saponin → hinzufügen von anti-IFNg-Fluorescein und anti-IL-4-Phycoerythrin Präparative Anwendung Die Durchflußzytometrie wird nicht nur für analytische Zwecke genutzt, sondern auch zum Sortieren von Zellen Zellsortierung (FACS = Fluorescence Assisted Cell Sorting) Die Zellen werden unterschiedlich ionisiert und durch die Ablenkung zwischen 2 Kondensatorplatten sortiert Ablenkplatten Sortierte Zellen Matthias Stiehm, 3.2.2006 Bis zu 10.000 Zellen/s können isoliert/sortiert werden Magnetische Zellsortierung (MACS) Zweck: Isolierung magnetisch markierter Zellpopulationen aus einem Zellgemisch zur funktionellen oder phänotypischen Analyse Prinzip: Anlegen eines Magnetfeldes Zellgemisch mit Ak, an die paramagnetische Partikel gekoppelt sind Magnetisch markierte Zellen werden zurückgehalten Entfernen des Magneten gebundene Zellen werden freigesetzt • Nachweis von Antikörpern mittels Agglutination • Antikörper-Messung an Festphasen (ELISA, Blot) und Fluoreszenzmikroskopie • Fluoreszenz-vermittelte Zellanalyse und Zellsortierung • Zelluläre Immunität, in vivo und in vitro Tests Nachweis von Immunreaktionen in vivo (Tuberkulintests) Prinzip: Nachweis der zellvermittelten Immunität auf Tuberkuloseerreger durch Injektion eines Extrakts aus Mycobacterium tuberculosis Tine-Test (Mendel-) Mantoux-Test Tuberkulin • Antigengemisch von Tuberkuloproteinen, die aus Überständen von TB-Kulturen durch fraktionierte Fällung gewonnen werden. Typ-IV Hypersensitivität (Spätreaktion) IFN-g, Chemokine, TNF-a Zytokine TNF-Rezeptor CD40 Lokale Entzündungsreaktion Antigenspezifische Th1-Zellen QuantiFERON-TB Gold In-Tube • Jeweils 1 ml heparinisiertes Vollblut in ein Röhrchen mit und eins ohne Tb7.7 (Tuberkulinextrakt) • 16-25 Std. Inkubation bei 37°C. • Bestimmung des Interferon-g im Überstand. • Erhöhung des IFN-g spricht für Infektion (Nachweis aktivierbarer T-Zellen) • Sensitivität des IFN-g Test höher als TST (tuberculin skin test) Elispot-Assay zum Nachweis von Zellen, die bestimmte Zytokine herstellen und freisetzen. Untersuchung der Interaktion von Lymphozyten mittels Multiphotonen-Mikroskopie PNAS 2003;100(5):2604-9 Wanderung der B-Lymphozyten im 3D-Raum des Lymphknotens (FDCs in rot) Wanderung von B-Lymphozyten zwischen light/dark zone
