Western-Analyse Protein-Elektrophorese ELISA Protein-Chip
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Western-Analyse Protein-Elektrophorese ELISA Protein-Chip DNA-RNA-Protein Die Struktur der DNA Ebene der Proteinstruktur Die Gruppen der Aminosäuren Darstellung Räumliche Proteinstrukturen (RöntgenKrystallographie) Proteinisolierung und Aufreinigung • Lyse der Zellen/Gewebe (Detergens, Mechanisch; Hemmung der Proteasen) • Aufreinigung (Zentrifugierung, Chromatographie) • Probevorbereitung •(Hängt von Zwecken ab; Elektrophorese: nativ-denaturierend; Enzymaktivität; Proteomik: 2-D-Elektrophorese) Antigen-Antikörper Antigen: Fremdes Material, welches Wirbeltiere erkennen und dagegen die B-Zellen des Immunsystems hochspezifische Antikörper bilden. „Stärke” der Antigene: Proteine> Polysaccharide > Lipide > Nukleinsaure. Antikörper: Proteine, die aus schwere- und leichte Ketten bestehen. Antikörper bilden spezifische Bindung mit dem Antigen. Nach der Immunisierung kann man sie aus dem gamma-Globulin-Fraktion des Blutserum isolieren. Antikörper-Klassen Kinetik der Antikörperbildung Erzeugung monoklonaler Antikörper Die auf Antigen-Antikörper-Bindung gegründeten Verfahren Direktes Verfahren Primärer Antikörper trägt ein konjugiertes Protein, welches Detektierung ermöglicht Indirektes Verfahren Der sekundäre Antikörper erkennt die schwere Kette des primären Antikörpers und trägt konjugierten Teil (Enzym, fluoreszierende Verbindung) für Detektierung Affinität-Verfahren („sandwich”) Kovalent-Bindung des primaren Antikörpers an Träger Chromatographie der Antigen-Lösung – Bindung Elution des Antigens/Detektierung mit markierten Antikörper Detektierung Antigen-Antikörper Bindung Chromogener Substrat, Farbreaktion Fluorochrom Markierung, Fluoreszenz-Entstehung Die Western-Analyse Während Western-analyse detektieren wir a. Die Grösse des Proteins (kD) b. Die Konzentration des Proteins Poly-Akrylamid-Gelelektrophorese Vorbereitung der Probe: Denaturierung und Reduzierung mit SDS und -Merkapto-Ethanol, 3-5 Min, 90 oC Polyakrylamid-Gelelektrophorese (Sammler-Gel, Trennung-Gel) Elektrischer Transfer der Proteine auf Nitrozellulose (bindet Proteine mit hocher Affinität) A Kontrolle des Transfers (Färbung, Ponceau-red) Polymerisierung von Akrylamid Achtung: Toxisch!!!! Denaturierung von Proteine mit SDS SDS kezelés előtt Töltéssel rendelkező részek Betain-Struktur, Zwitterion Hidrofób részek SDS kezelés után Einheitlich negativgeladenes Protein Vertikale Gelelektrophorese Färbung getrennter Proteine Farbstoff für Färbung Western-Analyse Membran-Blockierung Gesättigung unspezifischer Protein-Bindungsstellen mit Kasein oder BSA Inkubierung mit dem primären Antikörper Erkennung spezifischer Bindungsstellen 3x Waschen Inkubierung mit dem sekundären Antikörper z.B. horse-raddish (Meerretich)-Peroxidase-Konjugat (HRP) 3x Waschen Detektierung Alkalische Phosphatase, HRP, ECL (Chemilumineszenz) Elektro-Transfer Elektro-Transfer Kontrolle des Protein-Transfers: Ponceau-Färbung Ergebnis der Western-Analyse Ponceau: Färbt alle Proteine; Antikörper markiert das Zielprotein ECL-Detektierung Substrat für Alkalische Phosphatase Bestimmung Lyme-Erkrankung mithilfe WesternAnalyse Zecke - Borrelia burgdorferi - bakterielle Proteine aus Blutserum Beispiel für Lyme-Erkrankung Proben: 1: Molekulargewicht-Marker 2-3: Lyme-positiv-Sera 4-7: Diskriminierungsantikörper 8: Positive Kontrolle Bestimmung Dystrophin-Protein Protein-Chip Ligand-Chip: Mit spezifischer AntigenAntikörper-Bindung; ExpressionsmusterBestimmung auf Protein-Ebene (DNA-Chip: Hybridisierung) Antikörper-Bindungen auf Glass-Oberfläche Anwendung: Forschung, Diagnose Protein-Chip:Detektierung AntigenAntikörper Wechselwirkungen Muster von Hefeproteine Chip-Automatisierung ELISA-Verfahren ELISA (Enzyme Linked Immunosorbent Assay, Enzym-gekoppeltes-Immunosorbenz-Verfahren) Antigen wird auf festen Träger (Mikrotiter-Platte) gebunden Reaktion mit Serum der Patienten nach Verdünnungen Anwendung: Klinische Labordiagnose Bestimmung von Bakterien, Viren, Hormone, usw. Die in ELISA angewandten Enzyme und Substrate Enzyme Meerettichperoxidase (HRP) Alkalische Phosphatase (AP) (Konjugiert mit dem AK) Substratmoleküle 3,3',5,5'-Tetramethylbenzidine (HRP) 3,5-Dichloro-2-hydroxybenzenesulfonic acid (HRP) 5-Bromo-4-chloro-3-indoxyl phosphate, BCIP (AP) Indoxyl phosphate (AP) AP-BCIP-Farbreaktion ELISA-Reaktion Quantitative Ergebnisse von ELISA Positive Kontrolle Negatíve Kontrolle 1.689 0.153 Patient A Patient B Patient C TestKontrolle O.055 0.412 1.999 0.123 ELISA-Platte (Mikrotiterplatte) Semiquantitative Bildanalyse Nach der Gelseparation von Proteine und Nukleinsären kann aus der Densität des Bandes (summierung der grauheitsstufen der Bildpunkte) auf dem grauen Gelbild eine quantitative Information gewonnen werden. Densität auf einem Pixel: Grauheitswert auf einem Pixel. 16 bit Graumatrix 32 stufiger Durchgang 8 bit (256 Farben) Durchgang 255 Wert = schwarz 0 Wert= weiss Analyse der farbigen Aufnahmen geschieht aufgrund der Aufteilung auf RGB Farben Rot Grün Blau Densitometrische Analyse des Gelbildes a) Profil Ablauf: Wir stellen das Querschnittprofil des Bandes her, mit der Subtraktion der Grunddensität des Gels kann aus der Flächengrösse unter der Kurve eine quantitative Schlussfolgerung gezogen werden. (Intensität/Pixel) b) Flächenanalyse Wir markieren ein, von dem Band etwas grösseren Gebiet. Wir bestimmen die Densitätsumme der Pixeln mit Grundintensität, welche aus der Summe der Pixeldensitätwerte des aktuellen Bandes subtraktiert wird
