Western Blot & ELISA

Western Blot & ELISA
Markus Wagner
Prof. Dr. W. Mutschler
Chirurgische Klinik und Poliklinik · Ludwig-Maximilians-Universität München
Inhalt
1. Western Blot
1.1 SDS-Page
1.2 Transfer
1.3 Immundetektion
1.4 Ergebnis
1.5 Zusammenfassung
1.6 Anwendung
2. ELISA
2.1 Prinzip
2.2 Sandwich ELISA
2.3 Quantitative Bestimmung
2.4 Anwendung
Überblick
• Beide Methoden gehören zu Gruppe der Immunoassays
• Nachweis eines Analyten durch AK-Ag Bindung
• Sowohl AK als auch Ag können der Analyt sein
• Western Blot trennt die Proteine vorher über SDS-PAGE
(im Gegensatz zu ELISA)
1. Western Blot
1.1 SDS-PAGE
• Zellen in Kultur
• Lysieren der Zellen und Extrahieren der Proteine Æ Proteom
• Auftrennen der Proteine nach Größe
1.1 SDS-PAGE
1.1 SDS-PAGE Gel
SDS Gel nach Coomassiestaining
1.2 Transfer
• Übertragung der Proteine vom
Trenngel auf Membran z.B.
Nitrozellulose
• Trennungsmuster bleibt
erhalten
•Proteine auf Membran
zugänglich für Antikörper
1.2 Transfer
Membrane
• Proteine negativ geladen
•Durch Anlegen von
Spannung wandern die
Proteine richtung Membran
1.2 Transfer
1.3 Immundetektion
• Primärer AK bindet an Epitop auf Ag
• Sekundärer AK bindet an FC-Region des Primären AK
• Sekundärer AK an HRP Enzym gekoppelt
•HRP katalysiert Oxidierung von Luminol Æ Chemolumineszenz
1.4 Ergebnis
Proteine in unterschiedlichen Konzentrationen auf Nitrozellulosemembran
1.5 Zusammenfassung
1.6 Anwendung
• Nachweis von Proteinen
• Nachweis von Proteinveränderung
• semiquantitative Analyse
•Nachweis von AK im Serum
2. ELISA
Enzyme Linked Immunosorbent Assay
2.1 Prinzip
• AK oder Ag werden mit Enzym verknüpft
• Unmarkierte Komponente auf einem Träger immobilisiert
• Zugabe der zweiten Komponente
• Auswaschen von nichtgebundenem Material
• Enzymatische Reaktion wandelt farbloses Substrat in farbiges
Produkt um
2.1 Prinzip
1. Zugabe von Markierten AK
2. Auswaschen von nichtgebundenem Material
3. Umwandlung des Substrats in farbiges
Produkt Æ Nachweis Ag
2.2 Sandwich ELISA
1. Antikörper auf Objektträger fixiert
2. Zugabe von Antigenhaltiger Flüssigkeit
3. Auswaschen von ungebundenem Material
4. Zugabe des sekundären markierten AK
2.3 Quantitative Bestimmung
1. Verdünnungsreihe mit bekannter Konzentration
2. Probe mit unterschiedlichen Verdünnungen
3. Bestimmung der Konzentration über Stärke der Färbung
2.4 Anwendung
• Nachweis von Ag im Serum z.B. HIV
• Nachweis von Allergenen im Essen wie Milch, Erdnüsse etc.
• Nachweis von Medikamenten und Drogen
Schluss
Danke für die Aufmerksamkeit!