6 Zusammenfassung - Ruhr
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Zusammenfassung - 138 - 6 Zusammenfassung Um die Pharmakokinetik von Arzneistoffen im Labor zu untersuchen, werden häufig humane Primärhepatozyten eingesetzt. Sie können in Primärkultur aufgrund von Dedifferenzierungsmechanismen jedoch nur für ca. eine Woche ihre typischen biochemischen Funktionen erhalten. Es wurde die 2D-DIGE™-Technik (GE Healthcare) in Verbindung mit DeCyder™ 6.5 (GE Healthcare) zur Quantifizierung und MALDI-MS zur Identifizierung differenzieller Proteine aus zytosolischen Fraktionen unterschiedlich lang in Kultur gehaltener humaner Primärhepatozyten eingesetzt. Zur Verbesserung der Gelanalytik wurde der Gel-warping-Algorithmus RAIN verwendet [Dowsey et al. 2006]. Es ergaben sich 13 in diesem Zusammenhang zum Teil bisher nicht beschriebene Proteine, die durch die Dedifferenzierung der Primärhepatozyten reguliert waren. Weiterhin konnte mittels Western Blotting der Einsatz von MnSOD als möglicher Marker für die Messung des Dedifferenzierungsfortschritts der Zellen untermauert werden. Im gleichen, oben beschriebenen, methodischen Ansatz wurde der Effekt der Behandlung von humanen Primärhepatozyten mit Rifampicin untersucht, einem Antibiotikum, dessen Wirkung auf die Zellen nicht hinreichend geklärt ist. 7 in diesem Zusammenhang bisher nicht beschriebene differenzielle Proteine konnten identifiziert und teilweise validiert werden. Für beide Versuchsteile ergab sich generell, dass die Daten aus der mRNATranskriptanalyse nur selten mit denen aus der 2D-DIGE™-Studie oder Western Blotting-Daten übereinstimmten. Im Weiteren gelang es nicht, eine Methode auf Basis der Pro-Q® DiamondFärbung (Invitrogen) zu entwickeln, um Phosphoproteinspots im 2D-Gel quantitativ auszuwerten. Nichts desto trotz wurde eine Phosphoproteomkartierung vorgenommen, um Hinweise darauf zu erlangen, ob die Regulation einzelner Proteinspots in der 2D-DIGE™-Studie auf die Abundanzänderung phosphorylierter Protein-Isoformen zurückzuführen war. 7 durch die 2D-DIGE™-Studie ermittelte differenzielle Proteine konnten dadurch als potenziell phosphoryliert identifiziert werden. Da sich die membranständigen Cytochrom-P450-Proteine, die hauptverantwortlich für den Metabolismus vieler Pharmaka (so auch Rifampicin) sind, nur unzureichend mittels 2D-PAGE darstellen lassen, und zudem einige Zusammenfassung - 139 - Isoformen aufgrund hoher Homologie und mangelnder Antikörperspezifität nicht mittels Western Blotting untersucht werden können, wurde die Anwendung der Massenspektrometrie an humanen Lebermikrosomen getestet, um zwischen einzelnen CYP-Isoformen unterscheiden zu können. 22 verschiedene CYPs konnten mittels nanoLC-ESI-MS/MS differenziert und sogar semi-quantitativ abgebildet werden, darunter die Isoformen CYP3A4/5/7, CYP2C8/9/18/19, und CYP4F2/3/11/12. Zudem wurde das Phosphorylierungsmuster der CYPs untersucht, da bisher nur wenige humane CYP-Isoformen als phosphoryliert beschrieben sind und der Effekt der Phosphorylierung weiterhin nicht genau geklärt ist. Dazu wurden die phosphorylierten Peptide nach dem Proteinverdau mittels TiO2-Mikrosäulen angereichert und mit nanoLC-ESI-MS/MS vermessen. In einem separaten Versuch zur Untersuchung der Effektivität dieser Anreicherungsmethode ergab sich, dass hauptsächlich monophosphorylierte Peptide, allerdings sehr effizient von den nichtphosphorylierten Peptiden getrennt wurden. Daraufhin wurden 8 CYP- Phosphorylierungsstellen identifiziert von denen 7 bisher nicht beschrieben waren. Um einen möglichen Einfluss der CYP-Phosphorylierung auf die Enzymaktivität zu untersuchen, bedurfte es quantitativer Daten. Auf Grundlage von nanoLC-MRM unter Verwendung von internen Standards zur Normierung einzelner Experimente, wurde eine Methode entwickelt, um CYPs und CYP- Phosphorylierungen in verschiedenen Proben relativ-quantitativ zu erfassen. Die Ergebnisse aus einem Pilotversuch konnten mittels Western Blotting validiert werden. Im Fall von CYP2B6 wurden die Daten mit Enzymumsatzraten verglichen. Daraus ergab sich erstmals ein Hinweis, dass die CYP-Phosphorylierung in vivo zu einer Enzymdeaktivierung führte.
