ENZYME
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BIOCHEMIE Elektrophorese, Immunodetektion Regulation von Enzymaktivitäten - Ebene 1 Enzyme können auf folgenden Ebenen reguliert werden Regulation der bestehenden Enzymmenge • Post-translational durch reversible, kovalente Modifikation (Phosphorylierung, Reduktion) • pH-Wert, (Co-)Substratkonzentration • Effektoren • Enzym-Inhibitorprotein-Interaktionen (14-3-3 Proteine) Enzymreinigung Chromatographie Regulation von Enzymaktivitäten - Ebene 2 Regulation der Enzymproteinmenge Genexpression • Transkription (Induktion/Repression) • Splicing, mRNA Stabilität • Translation • Proteolytischer Abbau Enzymproteingehaltsbestimmung Elektrophorese, Blotting Elektrophorese Prinzip „Wanderung eines geladenen Teilchens im elektrischen Feld“ Proteine, DNA, RNA, organische Säuren, Kationen etc. Aminosäuren sind amphotere/zwitterionische Verbindungen Elektrophoretische Trennung von Proteinen Proteine weisen positive und negative Ladungen auf ihrer Oberfläche auf. Matrices bzw. Gele Polyacrylamidgele Stabilisierung der wandernden Proteinbanden in Gelen Matrices bzw. Gele Polyacrylamidgele Die Monomerkonzentrationen bestimmen die Porengrössen der Polyacrylamidgele T [%] = (a + b) * 100 / V C [%] = b * 100 / (a + b) a....Gewicht an Acrylamid b....Gewicht an Methylenbisacrylamid V....Volumen in mL Zusammenhang zwischen Porengrösse und %T sowie %C Fall A C konstant T erhöht Porenweite sinkt Fall B T konstant C erhöht Peakverteilung Minimum bei 4% C, bei höheren und niedrigeren Konzentrationen nehmen die Porengrössen wieder zu Geometrie der Gelelektrophorese Rundgele vs. Flachgele horizontal vs. vertikale Systeme Elektrophorese-Apparaturen Elektrophoretische Trennprinzipien Polyacrylamid-Gelelektrophorese 3 2 1 Isoelektrische Fokussierung Bildung des pH-Gradienten Trägerampholyte sind Oligoaminooligocarboxylsäuren Sie weisen verschiedene Isoelektrische Punkte auf Elektrophoretische Mobilität v Trennung von Proteinen erfolgt aufgrund ihrer elektrophoretischen Mobilität v = E . z / (6p h r) E...elektr. Feld h...Viskosität • Nettooberflächenladung z pH-abhängig • Molekülgrösse, -form r Stoke`scher Radius Anode -+ - + -+ - + + + + - + + + - Kathode - + diskontinuierliche PAGE Kombination aus Isotachophorese und Zonenelektrophorese native PAGE • keine Proteindenaturierung • Proteintrennung auf Basis Oberflächenladung und Grösse d.h. Proteine verschiedener Molekülgrösse können in der nativen PAGE gleich schnell wandern • kann auch zur Reinigung nativer Proteine eingesetzt werden • optimierbar über Pufferzusammensetzung, pH-Wert und Porengrössen SDS-PAGE Sodium dodecylsulphate SDS ist ein anionisches Detergens, das in stöchiometrischem Verhältnis von 1.4 g SDS je an 1 g Protein bindet Hierbei wird die native Konfiguration in eine ellipsoide K. aufgefaltet SDS-PAGE Vorteile • die Oberflächenladungen der Proteine werden maskiert • die Menge der „neuen“ negativen Ladungen korrelieren mit der Masse des Proteins (in Dalton) • alle Proteine besitzen nach der Auffaltung diesselbe Konfiguration • die Trennung erfolgt folglich nach Molekularmasse der Proteine • Ausnahmen: Glykoproteine, Peptide < 15kDa Auswertung des Molekulargewichts Kalibration Relative Mobilität gegen log Molekularmasse ergibt lineare Beziehung Kalibration mit Polypeptiden bekannter Molekularmasse SDS-PAGE Beispiel Gradientengel Coomassiefärbung Porengrössenverteilung im Gel kontinuierlich ansteigend gewährleistet hohe Trennleistung und Schärfe über weiten Molekularmassenbereich von Proteinen Visualisierung unspezifische Färbungen Allgemein erfolgt nach der PAGE eine Fixierung der Polypeptidbanden mit Alkoholen/Säuren oder durch Blotting Färbung Coomassieblau-Färbung (> 1 ng pro Proteinbande) siehe auch Bradford-Assay Silber-Färbung (20-200x sensitiver) # Verstärkung der Ag+-Bindung (Glutaraldehyd) # Ag+-Imprägnierung # Waschung # Entwicklung: Ag+-Reduktion zu Ag am Protein Visualisierung der Polypeptidbanden unspezifische Färbungen Visualisierung weitere Varianten Enzymaktivitätsfärbungen • nur bei nativer PAGE • künstliche Substrate / Cofaktoren • Bildung eines unlöslichen Produktes in der Enzymreaktion Autoradiographie von markierten Proteinen Western-Blotting Prinzip Immobilisierung von Proteinbanden durch Transfer aus dem Gel auf proteinbindende Membranen Transfer wird meist elektrophoretisch durchgeführt (Elektroblotting) Typische Membranen bestehen aus Nitrocellulose, Nylon oder PVDF (Polyvinylidendifluorid) spezifische Polypeptiddetektion auf der Membran meist per Immunodetektion, die in PAGelen nicht möglich wäre (MG) Western Blotting Durchführung Antigen-Antikörper-Reaktion Antikörper -Aufbau -Konfiguration Paratope Antigen-Antikörper-Reaktion Antigen-Determinanten Epitope Immunodetektion Ablauf Nachweisreaktion SekundärerAntikörper Primärer Antikörper Immunodetektion Nachweisreaktion Ausblick
